JP2000103799A - 巨核球の成長と分化を刺激するｍｇｄｆの誘導体とその製造方法 - Google Patents

巨核球の成長と分化を刺激するｍｇｄｆの誘導体とその製造方法

Info

Publication number
JP2000103799A
JP2000103799A JP11231730A JP23173099A JP2000103799A JP 2000103799 A JP2000103799 A JP 2000103799A JP 11231730 A JP11231730 A JP 11231730A JP 23173099 A JP23173099 A JP 23173099A JP 2000103799 A JP2000103799 A JP 2000103799A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
mgdf
polypeptide
polyethylene glycol
leu
group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP11231730A
Other languages
English (en)
Other versions
JP3485842B2 (ja
Inventor
Timothy D Bartley
バートレー，テイモシー・デー
Jakob M Bogenberger
ボーゲンバーガー，ヤコブ・エム
Robert A Bosselman
ボツセルマン，ロバート・エー
Pamela Hunt
ハント，パメラ
Olaf B Kinstler
キンストラー，オアフ・ビー
Babru B Samal
サーマル，バブル・ビー
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Amgen Inc
Original Assignee
Amgen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US08/321,488 external-priority patent/US5795569A/en
Application filed by Amgen Inc filed Critical Amgen Inc
Publication of JP2000103799A publication Critical patent/JP2000103799A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP3485842B2 publication Critical patent/JP3485842B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
    • C07K17/08—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/524—Thrombopoietin, i.e. C-MPL ligand
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/14—Lymphokine; related peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【課題】 【解決手段】 ヒト巨核球の増殖および発達を特異的に
促進し実質上他のヒトタンパクを含まないヒトMGDFポリ
ペプチドに少なくとも１つの水溶性ポリマーが結合され
たMGDF誘導体、その製法、およびMGDF誘導体を含む医薬
組成物。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、巨核球の成長を刺
激し巨核球の分化または成熟を増大させて最終的に血小
板を増大させる新規タンパク質MGDF（Mplリガンドとも
いう）の誘導体、具体的にはMGDF分子が水溶性ポリマー
に付加している新規クラスのMGDF誘導体、より具体的に
はMGDF誘導体が1 つまたはそれ以上のポリエチレングリ
コール(PEG) 基に結合しているMGDF誘導体に関する。ま
た本発明は、該MGDF誘導体の製造方法、および該MGDF誘
導体を含む医薬組成物にも関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決すべき課題】本発明に
は、少なくとも2 つの広範な研究領域が関与している。
最初の領域は巨核球の発生とこれに付随する血小板の産
生に関する領域であり、2 つ目の領域は成長因子受容体
ファミリーのポリペプチド構成因子、すなわち本発明に
おけるMpl レセプターおよびそのリガンドに関する領域
である。以上研究領域のそれぞれについて、次に概説す
る。 A.巨核球からの血小板産生 血液中の血小板は、出血の防止と血液凝固に欠くことの
できない循環細胞である。巨核球は細胞性の血小板供給
源であり、一連の血液細胞を生み出す通常の前駆細胞か
ら発生する。この通常の前駆細胞は、分化可能な幹細胞
またはPPSCとして知られる。
【０００３】巨核球細胞前駆体細胞の階層付けは、適正
な成長因子に反応してからIN VITRO培養系に発生する巨
核球(MK)コロニーの発生するまでの時間と大きさに基づ
いて定義される。バースト形成ユニット巨核球(BFU-MK)
は、もっとも原始的な巨核球前駆体細胞である。BFU-MK
は、きわめて多数のコロニー形成ユニット巨核球(CFU-M
K)を最終的に産生すると考えられており、さらに分化の
進んだMK前駆細胞である。
【０００４】MK細胞は付随する分化過程を進行するにつ
れて有糸分裂能を失い、核内複製能力を獲得していく。
核内複製（または核内分裂）は、細胞分裂の起こらない
状態で核分裂を起こしている細胞に起こる現象である。
核内複製は、最終的に倍数体の巨核球形成を起こす。さ
らなるMKの成熟により、血小板を特徴づける細胞質オル
ガネラと膜構成要素を獲得する。
【０００５】血小板は、現在までにほとんど定義されて
いないMKの生理的断片化の最終的過程又はその他のメカ
ニズムにより、成熟MKから産生される。巨核球内におい
て伸展する膜構造を観察することにより、血小板形成の
モデルをもたらし、前記モデルにおいて、境界線を形作
る膜系は、細胞内の発生期の血小板を形づくっている。
このほかに血小板形成のモデルとしては、巨核球が長い
細胞質の過程であって、おそらくは、血小板の大きさに
相当する間隙から骨髄内および／または肺内の血流圧に
よって収縮される過程を観察することによって発達した
モデルがある。前記の細胞質の過程は、血小板形成にお
ける仮定の役割を反映して、Becker & DeBruynによって
前血小板と命名されている。Becker and DeBruynらにつ
いては、Amer.J.Anat.145:183(1976）を参照。
【０００６】図1 は、巨核球および血小板の発育に関与
するさまざまな前駆細胞の概観を示す。図の左側に描か
れた細胞はPPSCであり、図中でPPSCの右側に位置してい
る細胞はBFU-MK、続いてCFU-MKを示す。核内複製に関わ
る細胞は、図中PPSCのすぐ右側に位置している成熟巨核
球である。核内分裂の結果、この細胞が倍数体となっ
た。その右隣の構造は前記成熟巨核球の倍数体より発生
した長い細胞質過程を含む。図の一番右には、前記細胞
質過程の断片化によって産生された多数の血小板を示
す。
【０００７】以下は、前述した巨核球分化および血小板
産生に関する先行出版物の要約である。 1. Williams,N. and Levine,R.F.,British Journal of
Haematology 52:173-180(1982). 2. Levin,J., Molecular Biology and Differentiation
of Megakaryocytes,pub.Wiley-Liss,Inc.:1-10(199
0). 3. Gewirtz,A.M., The biology of Haematopoiests,pu
b.Wiley-Liss,Inc.:123-132(1990). 4. Han,Z.C.,ET AL.,Int.J.Haematol.54:3-14(1991). 5. Nieuwenhuis,H.K. and Sixma,J., New Eng.J.of Me
d. 327:1812-1813(1992). 6. Long,M.,Stem Cells 11:33-40(1993). B.血小板形成の制御 多数の研究室から出された多大なデータからは、血小板
産生が体液性要因によって制御されていることが示唆さ
れる。この生物学的過程での複雑さは、根本的に予測さ
れておらず、現在、多数のヒト成長因子がこの能力を保
有しているようだ。
【０００８】巨核球の制御は、多様な細胞レベルで生じ
る。多数のサイトカインが前駆細胞のプールを拡大させ
ることによって血小板産生を増強させている。ヒト成長
因子における二つ目のグループが、分化の進んだ細胞に
作用する成熟因子としてはたらき、核内複製を促進す
る。さらに、これら過程を制御する独立した2 つのバイ
オフィードバックのループがあるようだ。
【０００９】いくつかの一族の非特異的造血成長因子
が、MKの成熟に重要な役割を果たしている。顆粒球−マ
クロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、インターロイ
キン 3(IL-3)、IL-6、 IL-11、白血病阻害因子(LIF) 、
およびエリトロポエチン(EPO)は、各々がＭＫの大き
さ、数または倍数性に及ぼす影響により決定づけられる
ように、各々がIN VITROにおいて別個にヒトMKの成熟を
促進する。LIF 、IL-6、およびIL-11 がMKの成熟に及ぼ
す影響は、IL-3が及ぼす影響に対して部分的に相乗効果
を呈する(LIFおよびIL-6) か、または全体的に相乗効果
を呈する(IL-11) かのいずれかである。in vivo のMK成
熟を促進するには、複数のサイトカインを組み合わせる
必要のあることを上記先行文献のデータが示唆してい
る。
【００１０】以下は、巨核球および血小板の産生におけ
る制御に関する先行出版物の要約である。 7. Hoffman,R. et al.,Blood Cells 13:75-86(1987). 8. Murphy,M.J.Hematology/Oncology Clinics of North
America 3(3):465-478(1988). 9. Hoffman,R.,Blood 74(4):1196-1212(1989). 10. Mazur,E.M. and Cohen,j.l.,Clin.Pharmacol.The
r.,46(3):465-478(1988). 11. Gewirtz,A.M. and Calabretta,B., Int.J.Cell Clo
ning 8:267-276((1990). 12. Williams,N.,Progress in Growtj Factor Researc
h 2:81-95(1990). 13. Gordon,M.S. and Hoffman,R.,Blood 80(2):302-307
(1992). 14. Hunt,P. et al.,Exp.Hematol.21:372-281(1993). 15. Hunt,P. et al.,Exp.Hematol.21:1295-1304(1993). また（文献16参照）、ヒト無形成性血清が、IL-3顆粒球
−コロニー刺激因子およびリンパ球のコンディション媒
地中の因子とは明らかに識別される巨核球コロニー刺激
活性を有することも報告されている。しかし、この活性
に関与する分子は、優先する技術において単離されてお
らず、定性も行われていなかった。 16. Mazur,E.m., et al.,Blood 76:290-297(1990). C. Mplレセプター 骨髄増殖型白血病ウイルス(MPLV)は、感染した哺乳動物
に急性白血病を引き起こすネズミ複製欠損型レトロウイ
ルスである。MPLVによって発現される遺伝子は、GM-CS
F、G-CSF およびEPO のレセプター等の、サイトカイン
レセプターファミリーに関連する配列に融合するウイル
スのレトロウイルスエンベロープ （または外部タンパ
ク皮膜）をコードする遺伝子の一部を構成していること
が発見されている。
【００１１】前述のMPLV遺伝子の発現は、様々なタイプ
のマウス前駆細胞に対し、増殖および最終的成熟の両方
とに依存しないような成長因子を、迅速に獲得させると
いう興味深い生物学的特徴を備えている。さらには、MP
LVによって急激に形質転換させた骨髄細胞の培養液は巨
核球を含み、前記MPLV遺伝子と巨核球の成長および分化
との間に、ある種の関係があることが示唆されている。
【００１２】現在では、(V-Mplと呼ばれる) 前記MPLVウ
イルス遺伝子がほ乳類細胞内で相同部分を有することが
認識されており、細胞性Mpl 遺伝子 (またはc-Mpl)と呼
ばれる。V-Mpl 誘導型プローブを使い、ヒトc-Mpl 遺伝
子に対応するcDNAがクローニングされた。PCT 特許出願
公開WO92/07074（1992年4 月30日公開、後述）を参照の
こと。配列の解析により、前記c-Mpl 遺伝子産物がコー
ドしているタンパク質は、相同型v-Mpl 遺伝子産物のよ
うな、高度に保存されたサイトカインレセプターのスー
パーファミリーに属することがわかった。
【００１３】この細胞性遺伝子c-Mpl は、他の組織では
なく正常マウス由来の骨髄、脾臓、胎児肝においてRNas
e プローブ保護試験およびRT-PCR試験により発現が見い
出されたという観察に基づいてみると、造血において機
能的な役割を演じていると考えられる。特に、c-Mpl は
巨核球において発現している。また、ヒト細胞性遺伝子
であるヒトc-Mpl は、精製巨核球および血小板を含むCD
34陽性細胞において発現している。CD34は初期造血性前
駆細胞であることを示す抗原である。さらには、CD34陽
性細胞をc-Mpl mRNA又はメッセージに対しアンチセンス
な合成オリゴデオキシヌクレオチドに曝露すると、CFU-
MK巨核球前駆体のコロニー形成能を有意に阻害するが、
赤芽球または顆粒球マクロファージ前駆体に対して全く
影響を及ぼさない。
【００１４】前述のデータおよび観察から、c-Mpl が、
細胞表面分子すなわちMpl レセプターをコードし、前記
レセプターを活性化するリガンドに結合していると示唆
され、巨核球の産生および／または生育をもたらすと示
唆されている。
【００１５】PCT 特許出願公開WO 92/07074 は、ヒトと
マウス両方のc-Mpl 遺伝子が産生するタンパクのアミノ
産配列に関する。この遺伝子産物は、前述のようにレセ
プターであると考えられており、細胞外ドメイン、膜透
過ドメインおよび細胞内（または細胞質）ドメインの3
つの一般的領域またはドメインからできている。これら
ドメインが一緒付加することにより、無傷(intact)のMp
l レセプターを構成する。このPCT はまた、成熟型c-Mp
l タンパクの細胞外ドメインと実質上対応する可溶性の
形態のレプターにも言及している。細胞内ドメインは、
前記タンパクの細胞外ドメインへ膜透過領域を介して付
着する場合、そのタンパクに全体として凝集しやすくさ
せ、不溶性を帯びさせる疎水性領域を含有している。一
方で、c-Mpl 遺伝子産物の細胞外ドメインは、膜透過ド
メインおよび細胞内ドメインから分離している時には可
溶性を呈し、これによって前記タンパクの細胞外形態は
レセプターの「可溶」型とみなされる。
【００１６】以下は、v-Mpl およびc-Mpl レセプターな
らびに遺伝子類に関する前述の説明に関連した先行出版
物の要約である。 17. Wending,F., et al.,Leukemia 3(7):475-480(198
9). 18. Wending,F., et al.,Blood 73(5):1161-1167(198
9). 19. Souyri,., et al.,Cell 63:1137-1147(1990). 20. Vigon,I., et al., Proc.Natl.Acad.Sci.usa 89:56
40-5644(1992). 21. Skoda,RC., et al., The EMBO Journal 12(7): 264
5-2653 (1993). 22. Ogawa,M.,Blood 81(11):2844-2853(1993). 23. Methia,N, et al.,Blood 82(5):1395-1401(1993). 24. Wending,F, et al.,Blood 80:264a(1993). D.血小板産生刺激能を備えた薬品に対する需要 最近の報告では、北米、西欧および日本の医療施設にお
いて、血小板輸血の割合が増大している。Gordon,M.S.
and Hoffman,R,,Blood 80(2):302-307(1992)を参照のこ
と。血小板輸血の割合がこのように増加している原因
は、医療技術の進歩と、心臓外科手術、骨髄、心肺移植
等の技術へアクセスする機会が増えたことが大きい。癌
患者への交付療法としての集中投与法やHIV-1 の流行も
また、血小板の供給に対する需要を拡大させている。
【００１７】血小板の利用は、同種免疫化（ALLOIMMUNI
ZATION）と同様に、血液を介した感染症を多く伝播する
恐れを増大させている。さらには、精製血小板の製造に
多額の金がかかるため、この血小板の使用が医療費全体
を押し上げている。この結果、人体に適用する血小板を
産生するための、新規かつ改良型の方法が迅速に出現す
るよう望まれている。
【００１８】以下には実例として、血小板産生を増強さ
せる目的で先行しているアプローチが記述されている。
【００１９】米国特許第5,032,396 号は、インターロイ
キン 7（IL-7) に血小板産生を刺激する能力があると報
告している。インターロイキン7 はリンホポエチン−１
としても知られ、骨髄においてＢ−細胞およびＴ−細胞
前駆体の増殖を刺激する能力を備えたリンパ球生成に関
わる成長因子である。1988年10月19日に提出された公開
PCT 特許連番88/03747号、および1988年10月24日に提出
された欧州特許出願第88309977.2号は、組換えDNA 技術
によってほ乳類IL-7タンパク質を産生するためのDNA,ベ
クター、および関連工程を開示している。前記米国特許
に示されたデータは、IL-7が正常マウスおよび致死量に
近い放射線を照射したマウスの循環血小板の量を増大さ
せたと報告している。
【００２０】米国特許第5,087,448 号は、ほ乳動物をイ
ンターロイキン6 で処理することによって、巨核球およ
び血小板の増殖を刺激することが可能であると開示して
いる。ヒト組み換えインターロイキン6 は、多様な生物
活性を備えた分子量26,000の糖タンパクである。上述の
特許が示すデータは、IL-6がIN VITROにおいて巨核球の
コロニーを増大させる効果を有することを示している。
【００２１】前述の特許のいずれにおいても、本発明に
関与するMpl リガンドについては全く言及していない。
【００２２】上記の開示にもかかわらず、哺乳動物にお
いて巨核球および／または血小板の新規な刺激剤への需
要は依然として強い。E.化学的に修飾されたMGDFに関す
る背景組み換えDNA 技術が進歩を遂げた結果、現在で
は、治療目的に利用されるタンパク質類を、適切な形態
で適量入手できるようになりつつある。かかるタンパク
質類の化学修飾体は、タンパク分解性酵素がタンパク質
の構造枠自体と物理的に接触するのを効果的にブロック
して、分解を防ぎ得る。付加的利点には、特定の環境下
において、治療用タンパク質類の安定度と循環時間を増
大させ、免疫原性を低下させる点がある。しかし、特定
タンパク質を修飾した場合の効果を予言するのは不可能
である点に留意すべきである。タンパク質の修飾と融合
タンパクについて記述した総説には、Fransis,Focus on
Growth Factors 3:4-10(May 1992)（Mediscript発行、
Mountview Court, Friern Barnet Lane, London N20, O
LD,UK）がある。
【００２３】ポリエチレングリコール("PEG"または"pe
g")は、治療用タンパク質製品の調製に利用されてきた
化学的部分の1 例である。たとえば、Adagen（登録商
標）は、PEG 化された(pegylated) アデノシンデアミナ
ーゼ処方物であり、重症合併免疫不全症の治療用に許可
されてきた。PEG 化スーパーオキシドジスムターゼは、
頭部傷害の治療を目的とした臨床治験において、PEG 化
α−インターフェロンは肝炎の治療に向けて試験されて
きた。PEG 化グルコセレブロシダーゼおよびPEG 化ヘモ
グロビンは前臨床試験の段階にあると報告されている。
若干のタンパク質向けには、Sada, et al., J.fermenta
tion Bioengineering 71:137-139(1991) において、ポ
リエチレングリコールを付加することにより、タンパク
溶解から保護することが示されており、ある種のポリエ
チレングリコール部分の付加方法を入手できる。 1979
年12月18日発行の米国特許第4,179,337 のDavis et a
l., “Non-Immunogenic Polypeptides”および1977年1
月11日発行の米国特許第4,002,531 号のRoyer,“Modify
ing enzymes with Polyethylene Glycol and Product P
roduced Thereby ”を参照のこと。総説には、Abuchows
ki らのEnzymes as Drugs(J.S.Holcerberg and J.Rober
ts,eds,pp367-383(1981)) がある。
【００２４】エチレングリコール／プロピレングリコー
ルのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキス
トラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリド
ン、ポリ-1,3- ジオキソラン、ポリ-1,3,6- トリオキサ
ン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、およびポリ
アミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのい
ずれか）のような他の水溶性ポリマーが、タンパク質を
修飾するために使われてきている。
【００２５】ポリエチレングリコールでは、ポリエチレ
ングリコール分子をタンパク質に結合させるために様々
な手段が利用されつつある。一般に、ポリエチレングリ
コール分子はタンパク質上に見い出される反応性の基を
介してタンパク質に結合する。リジン残基上のアミノ基
またはＮ末端上のアミノ基のようなアミノ基は、かかる
結合に好都合である。たとえば、Royer ら（米国特許第
4,002,531,前述）では、酵素にポリエチレングリコール
分子を結合させるために還元的アルキル化を提唱して
いる。 1993年4 月28日に公開されたEP O 539 167 （W
right） の“ Peg Imidates and Protein Derivates T
hereof”は、ペプチドおよび遊離アミノ基を伴う有機化
合物が、PEG のイミデート誘導体または関連する水溶性
有機ポリマーで修飾されていると提唱している。1990年
2 月27日に発行されたShawの米国特許第4.904.584 号
は、反応性アミノ基を介してポリエチレングリコール分
子と結合するタンパク質における、リジン残基の数の修
飾に関連する。
【００２６】化学的に修飾された特異的治療用タンパク
質の１つは、顆粒球コロニー刺激因子“G-CSF ”であ
る。欧州特許EP O 401 384，EP O 473,268, およびEPO
335 423 を参照のこと。
【００２７】その他の例としては、PEG 化IL-6であり、
EP O 442 724の標題"Modified hIL-6"(U.S.S.N 07/632,
070 の同時係属特許) では、IL-6に付加したポリエチレ
ングリコールについて開示している。1985年9 月11日に
公告されたEP O 154 316は、リンホカインとポリエチレ
ングリコールのアルデヒドとの反応性について報告して
いる。
【００２８】MGDFの修飾能力については業界において未
知であるが、これは、各々のタンパク質における修飾へ
の感受性が、かかるタンパク質の特異的な構造パラメー
タによって決定されるためである。さらには、各々のタ
ンパク質の生物学的特徴に及ぼすかかる修飾の効果が、
従来技術においては予測不能であるためである。本明細
書において説明されているごとく、MGDFは広く臨床応用
されているために、異なる特徴を備えた誘導体化MGDF産
物が望まれる。かかる分子では、その他の特徴に加え、
半減期が長くなり、および／またはIN VIVO における活
性が増大している。
【００２９】タンパク質分子にPEG を付加すると、その
結果として化学的に修飾されたタンパク質分子の混合物
が発生する。１例では、リジン残基5 個とＮ−末端部に
遊離アミノ基を有するタンパク質分子を前述の方法にお
いて反応させると、ポリエチレングリコール部分6 個、
5 個、4 個、3 個、2 個及び1 個をもつタンパク質分
子、および一つももたないタンパク分子の不均質混合物
が生じる。さらに、いくつかのポリエチレングリコール
部分をもつ分子のなかには、ポリエチレングリコール部
分が異なる分子の同じ位置には結合しないものがでてく
る。実質的に、PEG のような化学的部分の数および／ま
たは位置が様々に異なった被修飾タンパク質種の１つ又
は少数（例えば２〜３）を含むような、均一な産物を得
ることが、頻繁に要求されるようになる。やはり、例え
ばPEG が1 個、2 個、および／または3 個付加した種の
混合物が望まれるか、またはかかる治療適用に耐えう
る。
【００３０】治療用PEG 付加タンパク産物を開発する際
には、ロット間に生じる混合物の差異が欠点となる。か
かる開発においては、生物学的活性の予測性が重要とな
る。たとえば、スーパーオキシドジスムターゼとポリエ
チレングリコールとの非選択的コンジュゲーションの場
合、修飾された酵素のいくつかの画分は全く活性を示さ
なかった（P.McGoff et al., Chem.Pharm.Bull.36:3079
-3091(1988) ）。また、Rose et al.,Bioconjugate Ch
emistry 2:154-159(1991)は、結合基カルボヒドラジド
のタンパク質基質（インシュリン）のＣ−末端部のカル
ボキシル基への選択的結合について報告している。治療
用タンパク質においてロット間で組成の差異が生じるか
否かについて予測することは不可能である。ポリエチレ
ングリコール部分の中にはほかの位置ほどに安定してあ
る位置に結合しないものもあり、この結果、かかるタン
パクからポリエチレングリコール部分が解離することに
なる。もちろん、かかる部分が無作為に結合して、無作
為に解離するならば、治療用タンパク産物の薬動力学を
正確に予測することはできない。
【００３１】また、ポリマー部分およびMGDF部分間に結
合部分がない誘導型MGDF産物も強く望まれている。前述
の方法において問題になるのは、タンパク質とポリエチ
レングリコール分子との間の結合部分を特に必要とする
点にある。これら結合部分は抗原性を帯びており、治療
用タンパクを開発する際にはそれが欠点となる。
【００３２】結合基の関与しない方法については、 Fra
nsis et al., “Stability ofprotein pharmaceut
icals:in vivo pathways of degradation and strate
gies for protein stabilization ”(Eds.Ahern.,T. an
d Manning,M.C.)Plenum,NewYork,1991 年）に記述され
ている。また、Delgado et al.の"Coupling of PEGto P
rotein By Activation Cell Preparation",およびFishe
r et al.,ed.,Separations Biology and Biotechnolog
y,Plenum Press,N.Y.,N.Y.1989 pp.211-213において、
トレシルクロライドの利用について述べられており、こ
こではポリエチレングリコール部分とタンパク部分との
間に結合基の存在しないことが報告されている。この方
法では、トレシルクロライドの利用によって、毒性の副
生成物が生じるため、治療用製品を産生するために利用
することは困難と考えられる。
【００３３】Chamow et al.,は、Bioconjugate Chem.5:
133-140(1994) で、還元性のアルキル化を介したモノ−
メトキシ−ポリエチレン グリコール（“MePEG グリコ
ール”）とCD4 イムノアドヘジン(imunoadhesin)の修飾
について報告している。著者らは、CD4-Igの50% がN-末
端部のα−アミノ基において選択的反応によりmePEG修
飾を受けたとId.137ページで報告している。著者らはま
た、（タンパク質gp120 に対する）修飾CD4-Igのin vit
roでの結合能力が、MePEG 化の程度に相関して低くなっ
ていると報告している。
【００３４】しかるに、MGDF誘導体、特にPEG 化したMG
DFの需要がある。また、かかる誘導体を合成する方法に
ついても需要がある。
【００３５】
【課題を解決するための手段】本発明の１つの態様で
は、巨核球の成長および／または発達（Mpl リガンドま
たは MGDFs）を特異的に促進する、実質的に他のタンパ
ク質、例えばほ乳類を発生源とするMpl リガンドのケー
スのほ乳類タンパク質を含まない（から単離した）新規
ポリペプチドを提供する。かかるタンパクは、自然発生
的または他の因子による誘導時にかかる因子を産生する
細胞源から精製する。また、組み換え遺伝子工学技術に
よっても産生される。Mpl リガンドは、さらに化学技術
により合成されるか、前述した技術の組み合わせによっ
ても合成される。
【００３６】本発明におけるMpl リガンドは、ほ乳類ソ
ースから天然型として取得できる。イヌ無形成性血漿か
ら単離された2 つの実例となるMpl リガンドは、実施例
のセクションに説明されている。しかし、本明細書では
たがいに近似した関係にあるMpl リガンドが、ヒトおよ
びブタソースの両方から得た無形成性血漿中に存在する
ことがその他の実施例で示されている。留意すべきは、
ヒト、ブタ、およびイヌのMpl リガンドの各々の活性
が、ネズミMpl レセプターの可溶化型によって特異的に
阻害されることであり、これらMpl リガンドのすべてが
（ネズミを含むほかのほ乳類ソースからのものと同様
に）構造と活性レベルの両面で密接に関連していること
を示している。
【００３７】ヒト、ブタ、およびその他のほ乳類におけ
るMpl リガンドが、事実上本発明において詳細に記述さ
れている方法により、天然ソースから単離され得ること
が期待されている。実施例10を参照のこと。したがっ
て、本発明は一般に、イヌ、ブタ、ヒト、マウス、ウ
マ、ヒツジ、およびウサギ等のほ乳類Mpl リガンドを含
む。特に、イヌ、ブタ、およびヒトからのMpl リガンド
が望ましい。
【００３８】さらには、ヒトMpl リガンドをコードする
遺伝子は、実施例に記述されているように、ヒト胎児腎
および肝のライブラリーからクローニングされ、塩基配
列が決定されている。２つのヒト由来ポリペプチド配列
が、細胞を基本とするアッセイにおいて活性を有するこ
とが決定されている（実施例４参照）。これら2 つの配
列は長さがことなっているが、アミノ酸配列の広範な部
分において同一性が認められている。この同一部分は、
エリトロポエチンと相同性を有する。Mpl リガンドは
また、本明細書において巨核球の増殖および発育の因子
(MGDFs) として言及されている。Mpl リガンドに関する
総合参考文献はすべ て、MGDFs に関する参考文献とし
ても互いに適用可能である。“MGDFポリペプチド”と
は、巨核球の増殖および／または発育を特異的に刺激ま
たは抑制する活性を有するポリペプチドを意味してい
る。かかるポリペプチドの実例は本発明において開示さ
れている。
【００３９】本発明のMpl リガンドは、後述の実施例２
および実施例４のアッセイにて提示されているように、
巨核球の一族において特異活性を示し、巨核球の成熟お
よび／または増殖を増強する。「特異的に」とは、前記
ポリペプチドが、その他の細胞のタイプと比較して相対
的に大きい巨核球に対する生物学的活性を有することを
意味している。同時に、巨核球に対して刺激性という意
味は、巨核球の成熟および分化を刺激することを介し
て、血小板産生をin vivo において刺激する活性を有す
ることを意味する。
【００４０】イヌをソースとする二つの好適なMpl リガ
ンドは、非還元条件において、ドデシル硫酸ナトリウム
のポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって
測定された見掛分子量が約25kdおよび31kdである。両タ
ンパクは、以下の実施例セクションに詳述したように、
同一の精製プロトコルを通じて精製されている。
【００４１】二つの好適なヒトMpl リガンドであるMGDF
-1およびMGDF-2は、長さがそれぞれ332 アミノ酸および
173 アミノ酸であり、21個のアミノ酸の推定シグナルペ
プチドを含有していない。これら配列、および3 つめの
関連分子MGDF-3を、図11および図12に示す。
【００４２】本発明のさらなる態様は、哺乳動物由来
の、好ましくは全血、血清または血漿由来のMpl リガン
ドまたはそのフラグメントを単離、精製する方法であ
る。無形成性血液、血清又は血漿は原料材料として特に
好ましい。無形成性血液、血清または血漿は、コバルト
−60等の放射線源を用いて400-800rads で哺乳動物を照
射し、それら動物を無形成性にする方法によって得られ
る。かかる方法は、当業界において知られており、以下
の実施例１において引用した出版物において例証され
る。ヒトの場合、放射線照射された血液、血漿、または
血清は、例えば癌治療のために放射線照射を受けた後の
患者から入手し得る。
【００４３】その後、無形成性血液、血清または血漿
は、精製工程にかけられる。本発明において提供される
精製工程は、レクチンアフィニティクロマトグラフィー
およびMpl レセプターアフィニティクロマトグラフィー
のキープロセスから構成される。各々の工程により、イ
ヌの無形成性血漿から25kdおよび31kdのタンパクが約30
0-500 倍に精製される。その他の標準的タンパク精製工
程は、前述の工程に含まれ得、以下に詳述するごとくさ
らにMpl リガンドを高度に精製する。
【００４４】本発明の他の態様には、哺乳動物類Mpl リ
ガンドタンパク質の発現をコードするポリヌクレオチド
も含まれる。かかるDNA 配列は、以下詳述するごとく、
哺乳動物類Mpl リガンドタンパク質の発現をコードする
単離されたDNA 配列を含み得る。このDNA 配列は、Mpl
リガンドコード配列の側面に位置する、5'および3'の哺
乳動物類非コード配列をも含み得る。このDNA 配列は、
さらにアミノ末端シグナルペプチドをもコードし得る。
かかる配列は、完全または部分的な化学的合成法を含む
あらゆる既知の方法によって調製することが可能であ
る。コドンは、発現用に選択した（大腸菌（E.coli）ま
たはCHO 細胞等の）宿主細胞における発現に対して最適
化し得る。
【００４５】本発明においては、組み換えDNA 分子も提
供されており、各々がベクターDNAおよび哺乳動物類Mpl
リガンドをコードするDNA 配列を含む。このDNA 分子
は、選択された宿主細胞内において、Mpl リガンドの複
製と発現に関係し得る制御配列と操作可能に作用するMp
l リガンドＤＮＡを提供する。組み換えMpl リガンドタ
ンパク質を発現させる目的で、かかるDNA 分子を使って
形質転換された宿主細胞（バクテリア、哺乳動物類、昆
虫、酵母、または植物細胞等）もまた、本発明において
提供される。 本発明のDNA 分子および形質転換細胞
は、別の目的で、組み換え哺乳動物類Mpl リガンドタン
パク質またはそのペプチドフラグメントを産生させるた
めの新規な方法に適用される。この方法において、前記
タンパク質の発現を制御する能力をもった適切な制御配
列または発現調節配列と操作可能に作用する関係を保ち
つつ、Mpl リガンドタンパク質またはそのフラグメント
の発現をコードしているDNA 配列（あるいは前述のごと
き組み換えDNA 分子）で形質転換させた細胞系は、組み
換えDNA の発現を可能とする適切な条件下で培養され
る。特許請求されているこの方法は、タンパク質の発現
用の宿主細胞として多数の既知細胞を使用し得る。Mpl
リガンドの産生に好適とされる現在の細胞系は、哺乳動
物類の細胞系（CHO 細胞等）およびバクテリア細胞（E.
coli）等である。
【００４６】Mpl リガンドのE.coli産生にとっては、発
現産物の収率が高まるので、タンパク質のN-末端にMet
及びLys 残基を擁することが好ましい。特に好適な発現
産物は、総数165 個のアミノ酸を有するMet-Lys ヒトMG
DF（即ち、Met-2 - Lys-1 ［1-163 ］MGDF( 成熟タンパ
クの最初のアミノ酸から連番をつけている）である。E.
coli等のバクテリア細胞内において発現した前記産物を
精製したのち、ジペプチダーゼ（例えばカテプシンＣ）
等の酵素による処理によって末端Met-Lys 残基を除去す
る。
【００４７】発現されたMpl リガンドタンパク質を、適
切な慣用手段を使って宿主細胞、細胞溶解物、培養液か
ら回収する。コンディションメディウムを、無形成性血
漿からMpl リガンドを単離した場合と同一の精製工程ま
たはその変法にて加工する（実施例７参照）。
【００４８】さらに、本発明の一態様としては、組み換
えMpl リガンドタンパク質が提供される。これらタンパ
クは、実質上他の哺乳動物類由来物質、特にタンパクを
含まない。本発明のMpl リガンドタンパクはまた、ここ
で説明するような１つ以上の物理的、生化学的、薬学的
または生物学的活性を有することにより特徴付けられ
る。
【００４９】本発明は、少なくとも一つの水溶性ポリマ
ーに結合しているMGDFタンパク部分で構成される化学修
飾MGDFと、かかる組成物の調製法および利用法にも関連
する。特に、本発明は、MGDF種が反応性ポリエチレング
リコール分子と反応して、PEG をMGDFに付加させた化学
修飾したMGDFを含む。かかる付加は、以下論じられるよ
うに、アシル化またはアルキル化等のPEG 化反応によっ
て完成され得る。PEGを使用するアシル化またはアルキ
ル化は、主要生成物がモノPEG 付加またはポリPEG 付加
を呈するような条件下にて行われる。ポリPEG 付加では
一般に、リジン残基のε−アミノ基へPEG が付加し、さ
らにポリペプチドのN-末端部にPEG が付加し得る。モノ
PEG 付加では、好ましくはタンパク質のN-末端にあるα
−アミノ基へPEG が付加する。かかるモノPEG 化反応の
収率および均一性は、MGDFタンパク質部分のN-末端残基
のα−アミノ基を選択的に修飾するような還元的アルキ
ル化を介して増強され、これによりタンパク質のN-末端
に水溶性ポリマーの付加が提供される。これによって、
（ポリエチレングリコールを使うと）、タンパク部分へ
直接結合したポリエチレングリコール部分を有するPEG
付加MGDFタンパク質分子の調製物と同様に、ポリマー／
MGDFタンパク質コンジュゲート分子の実質上均質な製剤
が提供される。
【００５０】本発明のその他の態様では、単離された天
然または組み換え型のMpl リガンドを治療上有効量含む
医薬組成物であって、 Mpl リガンドはポリエチレング
リコール等の水溶性ポリマーで誘導体化されており、組
成物は薬学上受容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を
更に含む医薬組成物が提供される。以上の医薬組成物
は、巨核球および／または血小板の欠損によって特徴づ
けられる疾患状態を、invivo においてMpl リガンドの
欠損によって特徴付けられる疾患状態と同様に治療する
方法において適用され得る。また、（例えば外科手術に
より）、予測される巨核球または血小板の欠乏症を改善
させるために予防的に採用することもできる。
【００５１】しかるに、本発明のMpl リガンドは、（エ
イズ患者または癌化学治療中の患者等の）血小板産生が
不完全な患者において、例えば血小板産生を増加する目
的で、無形成性貧血の治療において利用されうる。Mpl
リガンドは血小板減少症等の血液疾患の治療に利用され
うる。Mpl リガンドは、骨髄移植患者の補助療法に適用
されうる。かかる患者はヒトまたはその他の哺乳動物で
ある。一つの種からのMpl リガンドはまた、別の種にお
いても有効であることが期待される。
【００５２】本発明におけるその他の態様としては、前
述のごとく治療上有効量の医薬組成物を患者に投与し
て、血小板欠損に由来する各種病態を治療する方法を提
供することである。これら治療方法には、Mpl リガンド
と、少なくとも1 つの、上記以外の巨核球コロニー刺激
因子、サイトカイン（例えばEPO ）、可溶化 Mpl レセ
プター、ヘマトポエチン、インターロイキン、成長因
子、または抗体との同時投与または連続的投与を含み得
る。
【００５３】本発明におけるその他の態様には、哺乳動
物類Mpl リガンドまたはリガンドフラグメントに対する
（と反応性の）抗体（例えばポリクローナル、モノクロ
ーナル、ヒト化、組み換え体）、抗体フラグメントの提
供がある。この態様の一部として、かかる抗体を分泌で
きる細胞の提供が含まれる（モノクローナル抗体のケー
スにおけるハイブリドーマ等）、その産生方法、診断ま
たは治療方法における利用がある。
【００５４】本発明におけるその他の態様には、Mpl リ
ガンドの存在下のための体液のアッセイがある。かかる
アッセイでは、単一抗体または「サンドイッチ」フォー
マットによって、Mpl リガンドを特異的に認識する抗体
を使用することが含まれる。かかるアッセイでは、ある
患者においてMpl リガンドを体外から供給することを要
するか否か、および／またはかかる患者が血小板不足ま
たは障害状態を経験しているか否かの検討を行うことが
できる。かかるアッセイは、キット形態としても含ま
れ、陽性対照および陰性対照、抗体（単数および複
数）、その他標準的キット構成要素を含んでいる。
【００５５】
【発明の実施の形態】本発明におけるこのほかの目的お
よび利点としては、以下の好適な実施例について考慮す
ることによって明らかとなるだろう。
【００５６】以下の図面を参照することにより、本発明
が多数の特徴と利点とを備えていることが明らかとなる
だろう。
【００５７】図1 は、巨核球および血小板の発生ならび
に成熟を概説している。
【００５８】図2 は、可溶化マウスMpl レセプターが、
実質上、放射線照射したイヌ（「無形成性のイヌ」、ま
たは「APK9」）の血漿の能力を完全に抑制し、巨核球の
発育を誘導することを示す。巨核球の生育に対するアッ
セイは実施例2 に示した。
【００５９】図3 は、レクチンアフィニティクロマトグ
ラフィーおよび Mpl レセプターアフィニティクロマト
グラフィー（「Mpl リガンド」）によって増幅された活
性が、1A6.1 細胞の増殖を刺激すること及び可溶化マウ
スMpl レセプターがその生育をブロックすることを示
す。
【００６０】図4 は、無形成性のイヌ血漿からの25kdお
よび31kd形態のイヌMpl レセプターの精製に関与する精
製ステップの概説を示す。
【００６１】図5 は、逆相HPLC（RP-HPLC ）によるMpl
リガンドの精製を示す。フラクション21は、高度に精製
した31kdMpl リガンドを、フラクション22は31kdと25kd
のMpl リガンドの混合物を、フラクション23は高度に精
製された25kdのMpl リガンドを含む。
【００６２】図6 は、25kdおよび／または31kdのMpl リ
ガンドタンパク質を含む逆相HPLC(C4 カラム) 画分にお
けるMpl リガンドの活性を比較したものである。
【００６３】図7 は、APK9,Mplリガンドおよび様々なそ
の他の因子で刺激したCD34−選択末梢血の培養液から産
生した巨核球の総数を示す。
【００６４】図8 は、APK9,Mplリガンドおよびその他の
各種因子で刺激した、CD34−選択末梢血細胞の培養から
産生した総白血球の総数を示す。
【００６５】図9 は、APK9,Mplリガンドおよびその他の
各種因子で刺激した、CD34選択末梢血細胞の培養から産
生した巨核球の百分率を示す。
【００６６】図10は、ヒトIL-3がMpl リガンド誘導性の
巨核球の発育に関与していないことを示す。
【００６７】図11は、ヒトMGDF-1およびMGDF-2のcDNAお
よび推論されるアミノ酸配列を示す。
【００６８】図12は、ヒトMGDF-3のcDNAおよび推論され
るアミノ酸配列を示す。
【００６９】図13は、イヌを発生源とする(A) およびマ
ウスを発生源とする(B) MGDF-1と MGDFs（Mpl リガン
ド）との比較を示す。
【００７０】図14は、モノメトキシ−ポリエチレングリ
コールのN-ヒドロキシスクシニミジル(NHS) 活性エステ
ルを使い、MGDFをアシル化してポリPEG 化産物を得た例
を示す。
【００７１】図15は、モノメトキシ−ポリエチレングリ
コールアルデヒドを使い、MGDFを非特異的に還元的アル
キル化してポリーPEG化産物を得た例を示す。
【００７２】図16は、モノ−メトキシ−ポリエチレング
リコールアルデヒドを使い、N-末端残基のα−アミノ基
でMGDFを部位特異的に還元的アルキル化して実質的にモ
ノ−PEG 化産物を得た例を示す。図17は、分子量20kDa
のMePEG の活性化誘導体を使って調製したMePEG-MGDFコ
ンジュゲートをサイズ排除(SEC)HPLC 解析したものを示
す。
【００７３】A:MePEG(PEG11)のNHS エステルでMGDFをア
シル化して調製したポリ−MePEG-MGDFコンジュゲート。
【００７４】B:MePEG アルデヒド(PEG20) でMGDFをアル
キル化して調製したポリ−MePEG-MGDFコジュゲート。
【００７５】C:MePEG アルデヒド(PEG16) でMGDFをアル
キル化して調製したモノ−MePEG-MGDFコンジュゲート。
【００７６】図18は、組み換えヒトMGDFで処理したマウ
ス由来の血小板計数値を示す。黒ダイヤ印＝CHO 由来22
ー353MGDF、白丸印＝PEG の付加していないE.coli 22-18
4 MGDF（すなわち1-163MGDF ）、白丸印＝PEG 化したE.
coli 22-184 MGDF。
【００７７】図19は、r-HuMGDFの精製フローチャートを
示す。
【００７８】図20は、マウスカルボプラチンモデルにお
ける血小板計数値に及ぼすr-HuMGDF(E.coli 1-163)の影
響を示す。Balb/cマウスにDay 0 においてカルボプラチ
ンを単一回腹腔内投与(1.25mg/mouse)した。賦形剤のみ
グループにはカルボプラチンを投与しなかった。24時間
後、カルボプラチン処理マウスへ賦形剤または100ug/kg
の r-HGDF のいずれかを残りの試験期間にわたって連日
皮下投与した。（各群ｎ＝10匹とし、1 回の試験実施時
刻ごとに5 匹から採血した。）図21は、放射線照射後の
マウスにおける血小板計数値に及ぼすr-HuMGDF（E.coli
1-163）の影響を示す。Day 0 でBalb/cマウスにガンマ
線（セシウム線源）を500 ラド単一回照射した。賦形剤
のみのグループには照射しなかった。24時間後、残り
の試験期間にわたって照射マウスに賦形剤または100ug/
kg r- HuMGDFを連日皮下注射した。（各群ｎ＝8 匹と
し、1 回の試験実施時刻ごとに4 匹から採血した。）図
22は、放射線照射およびカルボプラチンの組合せで処理
したマウスにおける血小板計数値に及ぼすr-HuMGDF（E.
coli 1- 163 ）の影響を示す。Balb/cマウスにDay 0 に
おいて500 ラドのガンマ線（セシウム線源）を単一回照
射およびカルボプラチン(1.25mg/mouse)を投与した。24
時間後、残りの試験期間にわたってマウスに賦形剤また
は100ug/kg r-HuMGDF を連日皮下注射した。（各群ｎ＝
8 匹とした。）r-HuMGDFによる補足を行わなかった場
合、マウスのほとんどは試験期間中生存できなかった。
対照群において、8 匹中1 匹が生存した。処理群におい
て、8 匹中8 匹が生存した。
【００７９】図23は、アカゲザルにおける放射線誘導型
血小板減少症に及ぼすr-HuMGDF（E.coli 1-163）の影響
を示す。アカゲザルを （700cGy Co-80の）放射線照射
に曝露した。照射後24時間を経過してから、連続18日
間、r-HuMGDF(n=3) またはヒト血清アルブミン（ｎ＝9
匹）(1匹あたり25ug/kg/day)を皮下投与した。電気血液
細胞解析装置を使って血液細胞を解析した。各記号は平
均値(+/- sem) を示す。
【００８０】図24は、カルボプラチンおよび放射線照射
処理したマウスの血小板計数値に及ぼすPEG 化およびグ
リコシル化r-HuMGDFの効果を示す。図22で行った試験で
説明したように、マウスにカルボプラチンおよび放射線
照射の併用処理を行った。傷害を受けた24時間後より、
指示したr-HuMGDF製剤（50ug/kg/day)の皮下注射を試験
期間中連日行なった。電気的細胞計数装置(Sysmex,Baxt
er) を使って指定した日に血液細胞を計数した。
【００８１】図25は、E.coli最適化コドンを有する組み
換えヒトMGDFの合成遺伝子配列、アミノ酸1-163 を示
す。
【００８２】本発明の付加的な目的および利点として
は、本発明の詳細を記述した以下の説明を考慮すること
によって当業者には明らかとなろう。
【００８３】本発明において提供される、新規な哺乳動
物類巨核球の増殖促進、および／または血小板産生因
子、すなわちMpl リガンドは、その他のタンパク質様物
質を実質的に含まない均一なタンパク質である。このタ
ンパク質がその他のタンパク質に90% 以上制約を受けな
いのが好ましく、さらには、約95% 制約を受けず、さら
にはその他のタンパク質に98% 以上制約を受けないのが
好ましい。これらタンパク質は、治療への適用に有効な
純粋かつ活性なMpl リガンドを大量に産生するために、
組み換え技術を介して産生することが可能である。ある
いは、かかるタンパクを哺乳動物類の無形成性血液、血
漿または血清から、もしくはMpl リガンドを分泌または
発現する哺乳動物細胞系から均一な形状で得ることがで
きる。さらには、Mpl リガンドまたはその活性フラグメ
ントは、化学的に合成され得る。
【００８４】一般には、本発明において使用される「Mp
l リガンド」は、ここに開示されるMpl リガンド及びそ
の活性フラグメントおよびその変異体を示し、以下詳細
に記述される。
【００８５】イヌを発生源としてするMpl リガンドは、
好ましくは、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミ
ド電気泳動(SDS-PAGE)で測定した場合、分子量約25kdお
よび31kdを有する。両タンパクは、実施例のセクション
で詳述されるごとく、同一の精製プロトコルに従って精
製される。しかるに、たとえば、これらMpl リガンドは
共にコムギ胚芽レクチンおよび固定化Mpl レセプターに
結合する。25kdの形態は、以下のアミノ酸配列を含む。 Ala-Pro-Pro-Ala-Xaa-Asp-Pro-Arg-Leu-Leu-Asn-Lys-Me
t-Leu-Arg-Asp-Ser-His-Val-Leu-His-Xaa-Arg-Leu-Xaa-
Gln-Xaa-Pro-Asp-Ile-Tyr （SEQ ID NO（配列番号）:1
）。 31kdの形態は、以下のアミノ酸配列を含む。 Ala−Pro-Pro-Ala-Xaa-Asp-Pro-Arg-Leu-Leu-Asn-Lys-M
et-Leu-Arg-Asp-Ser-His-Val-Leu-His(SEQ ID NO:2）。
【００８６】SEQ ID NOS:1および2 に示した"Xaa" なる
アミノ酸は、確実には分かっていないが、システイン、
セリン、スレオニン、または（可能性は極めて低いが）
トリプトファンであることが予測されている。
【００８７】前述の配列から、31kdのリガンドは少なく
とも25kdの形態の一部によって構成されていることが分
かる。特に、31kdのタンパク質の最初の21個のアミノ酸
は、25kdのタンパク質のアミノ酸と明らかに同一であ
る。これと、特に両タンパク質がMpl リガンド活性のア
ッセイにおいて活性を呈した事実とによって、両タンパ
ク質が極めて近似した構造と活性を有するとの結論に達
する。31kdのタンパク質は25kdのタンパク質とC-末端配
列において異なり、グリコシレーションおよび／また
は、このタンパクをコードしている遺伝子のスプライシ
ングにおいても異なっている。
【００８８】前述の配列情報に加え、（逆相HPLC法によ
る）最終精製段階に先だって行われた25kdのバンドの配
列決定中において、別の配列決定が行われた。この配列
は、非還元的条件において25kdのバンドと関連すること
が判明したが、還元条件下では関連性を認めなかったこ
とから、これは（例えばプロテアーゼによって）25kdの
タンパク質が二つの部分に開裂したことと、二つの部分
がジスルフィド結合によって結合されていることの結果
であることを示唆する。この配列は以下のとおりであ
る。 Thr-Gln-Lys-Glu-Gln-Thr-Lys-Ala-Gln-Asp-Val-Leu-Gl
y-Ala-Val-Ala-Leu(SEQID NO:3)。
【００８９】25kdのタンパク質における上記SEQ ID NO:
3 の正確な位置づけは明らかではないが、エリトロポエ
チン等のほかのサイトカインとのアナロジーによると、
この配列が25kdタンパク質の 114 番目付近のアミノ酸
の位置にくる可能性が支持される。まだ証明されていな
いが、SEQ ID NO:3 は31kdのタンパク質中にも存在し、
おそらく114 番目のアミノ酸付近から始まっていると予
測される。この配列情報については、実施例７において
詳述されている。
【００９０】イヌ由来のリガンドを対象とする初回の精
製実験以来、前に要約したとおり、イヌ由来のリガンド
をコードする遺伝子が現在クローニングされている。こ
の結果、このイヌ由来リガンド全体のアミノ酸配列は、
図13A に示すごとく決定された。分子量計算をもとにす
ると、25Kd及び31kdのイヌ由来リガンドは図13A に示す
全長リガンドのC-末端がプロセシングされた形態である
と予測される。さらに、図13B に示す配列を有するマウ
スMpl リガンドが得られた。
【００９１】かかる精製リガンドは、実施例2 に示すヒ
ト巨核球アッセイにおいて、少なくとも約 5.7×109 巨
核球単位/mg の特異的活性を有することを特徴とする。
巨核球単位とは、実施例２に記述したアッセイを使用し
て、APK9標準対照の1ul に相当する巨核球を産生する物
質の量であると定義される。
【００９２】精製リガンドはまた、実施例４に示すMpl-
依存性の細胞増殖アッセイにおいて、少なくとも約 6.9
×109 細胞増殖単位／mgの特異的活性を示すことで特徴
づけられる。「細胞増殖単位」は、実施例4 のアッセイ
において、200 1A6.1 細胞を増殖させるのに必要なリガ
ンドの量であると定義される。
【００９３】次の表1 は、本発明において実際に調製さ
れた精製イヌMpl リガンドの活性を特異的に計算した付
加例である。
【表１】
【００９４】上記の情報を要約すると、本発明における
例示的なMpl リガンドは、以下に示す生化学的および生
物学的特徴を1 つ以上備えている。
【００９５】(a) かかるイヌ由来リガンドは、イヌの無
形成性血漿から単離される。
【００９６】(b) かかるMpl リガンドは、非還元条件に
おいて12-14%ドデシル硫酸ナトリウムのポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）にて測定すると、約25Kd
および31Kdの見掛分子量を有する。
【００９７】(c) Mpl リガンドは、次に示すアミノ酸配
列を有する。25Kdタンパク質の場合はSEQ ID NO:1 、ま
たは31Kdタンパク質の場合はSEQ ID NO:2 である。
【００９８】(d) Mpl リガンドは、さらにSEQ ID NO:3
（特に25Kdタンパクにおいて望ましい）を含む。
【００９９】(e) Mpl リガンドはコムギ胚芽レクチンに
結合する。
【０１００】(f) Mpl リガンドは固定化した可溶性マウ
スMpl リセプターに結合する。
【０１０１】(g) Mpl リガンドの活性は、in vitroにお
いて可溶性Mpl レセプターによって阻害される。
【０１０２】(h) Mpl リガンドは約8-9 のPHにおいて陰
イオン交換カラムに結合する。
【０１０３】本発明において好適なMpl リガンドの生物
活性は、実施例２における巨核球増殖促進アッセイにお
いて、巨核球の成長と発生を特異的に刺激する活性によ
って示される。このアッセイにおいて、MPL リガンドは
ヒト末梢血CD34+ 細胞（免疫吸着により選択したCD-34
細胞）の分化を、8 日間の培養期間中に刺激する。巨核
球は、特異的抗血小板抗原抗体で染色し同定され、顕微
鏡下で計数される。MPL リガンドはまた、因子依存性細
胞系1A6.1 の増殖を刺激する。Mpl リガンドがない場
合、そ系細胞は死ぬ。1A6.1 細胞の数は、Mpl リガンド
を入れた培養中にて培養2 日後に測定する。
【０１０４】前述したMpl リガンドは、表1 で述べた特
異的活性を有する。 Mpl リガンドの発生源は、無形成
性状態にある哺乳動物類の血液、血漿、または血清中と
決定されてきた。しかし、かかるリガンドの発生源はか
かる既知発生源とするに限定されず、その他の哺乳動物
類における体液、および体液から抽出した細胞も含まれ
得る。
【０１０５】哺乳動物類を発生源とする天然(native) M
plリガンドの精製は、次の2 ステップを基本としてい
る。
【０１０６】(a) 好ましくはコムギ胚芽アグルチニンを
使ったレクチン・アフィニティ・クロマトグラフィー (b) 固定化Mpl レセプターアフィニティ・クロマトグラ
フィー。
【０１０７】タンパク質をさらに精製するためには、イ
オン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフ
ィー、および逆相クロマトグラフィー等の付加的ステッ
プが含まれ得る。
【０１０８】イヌの無形成性血漿からのMpl リガンドを
得るために実際に使用された精製技術は、以下のステッ
プから構成される（実施例７参照）。
【０１０９】(a) レクチンアフィニティ・クロマトグラ
フィー（特にコムギ胚芽アグルチニン・クロマトグラフ
ィーが好ましい）。
【０１１０】(b) 可溶性Mpl レセプター(Mpl-X) アフィ
ニティクロマトグラフィー（固定化マウスMpl-X が好ま
しい）。
【０１１１】(c) イオン（陰イオンまたは陽イオン）交
換クロマトグラフィー（陰イオン交換クロマトグラフィ
ー、特にモノQ カラムを用いるのが好ましい）。
【０１１２】(d) 解離条件におけるゲル濾過クロマトグ
ラフィー(Superdex 200 プラスSDSの使用が好まし
い）。
【０１１３】(e) 逆相クロマトグラフィー（C-4 カラム
を使用するのが好ましい）。
【０１１４】ヒト由来リガンドを含む均一な哺乳動物類
Mpl リガンドは、無形成性血液、血清、または血漿もし
くはその他の哺乳動物類Mpl リガンドの発生源、例えば
細胞または組織源に対して上記精製ステップを応用する
ことによって得られる。ステックスは特定な順序である
必要はないが、一覧した順序はあるほうが好ましい。Mp
l リガンドを産生することが分かっている細胞（または
組織）培養方法は当業者に公知であり、たとえば、反応
開始物質の供給を拡大するために使用することができ
る。
【０１１５】Mpl リガンドまたは一つ以上のそのペプチ
ドフラグメントは、組み換え技術によっても入手するこ
とができる。特定のMpl リガンドにとってのDNA 配列を
得るためには、精製Mpl リガンドを還元し、トリプシン
等のプロテアーゼを使って任意に消化する。慣用技術を
使って酵素処理フラグメントを単離し配列決定する。あ
るいは、実施例において例証したように、無傷の精製タ
ンパクを、入手できるタンパクの量に基づいて可能な範
囲まで直接配列決定し、以下の段階において配列の分か
っているトリプシン処理したフラグメントに対し配列決
定領域を相似的に使用する。遺伝子コードを使ってオリ
ゴヌクレオチドプローブを合成し、配列決定されたフラ
グメントのアミノ酸配列をコードする可能性のある配列
すべての予測に使用する。好ましくは、いくつかの変性
配列は、プローブとして生成される。Mpl リガンド遺伝
子はこれらプローブを使って同定され、哺乳動物類のゲ
ノムライブラリーまたはその他のソースをスクリーニン
グする。あるいは、Mpl リガンドの細胞発生源からのmR
NAを使い、プローブを使ってスクリーニングされ得るcD
NAライブラリーを作り、Mpl リガンドポリペプチドをコ
ードするcDNAを同定す る。さらには、PCR 技術を使っ
て、適切なプラリマー利用によるcDNA配列を伸長させ
る。
【０１１６】これらプローブを使ってゲノムライブラリ
ーをスクリーニングし、DNA クローンを得る。完全な長
さのクローンを得るには、得られたDNA 配列に基づくプ
ローブを使って、ライブラリーを再度スクリーニング
し、完全な長さのMpl リガンドDNA 配列へハイブリダイ
ズする。
【０１１７】Mpl リガンドに対するヒトのcDNAは、完全
な長さのヒトゲノムクローンを発現ベクターにサブクロ
ーニングし、COS 細胞中へ形質移入し、形質移入したこ
れらのCOS 細胞からcDNAライブラリーを作って、Mpl リ
ガンドcDNAとハイブリダイズさせてスクリーニングする
ことによって得ることができる。cDNA全体を一旦同定す
れば、Mpl リガンドの活性フラグメントをコードしてい
るcDNA自体またはその一部を、さまざまな発現ベクター
のなかの一つへ導入して、Mpl リガンドまたはその１つ
以上のそのフラグメントの発現系ができあがる。
【０１１８】かかる組み換え技術を使うことによって、
Mpl リガンドポリペプチドをコードする好適なDNA 配列
を得ることができる。本発明はまた、これらDNA 配列を
含み、これはその他のタンパク質をコードするDNA 配列
を含まず（単離され）、Mplリガンド活性（例えば巨核
球の増殖および／または発育）を備えたMpl リガンドポ
リペプチドの発現をコードする。これらDNA 配列は、Mp
l リガンド全部またはそのフラグメントをコードする配
列と、好ましくは緊縮（ストリンジェント）条件下にお
いてcDNA配列へハイブリダイズする配列を含む［T.Mani
atis et al., Molecular cloning (A Laboratory Manua
l);Cold Spring Harbour Laboratory(1982),387-389 ペ
ージ］。
【０１１９】実例となる緊縮ハイブリダイゼーション条
件は、62−67℃で 4×SSC でのハイブリダイゼーショ
ン、続いて62−67℃における 0.1×SSC での約1 時間の
洗浄である。あるいは、緊縮条件の例となるハイブリダ
イゼーションは、45−55％ホルムアミド、40−45℃で 4
×SSC である。
【０１２０】緩和的(relaxed) ハイブリダイゼーション
の条件下におけるMpl リガンドの配列へハイブリダイズ
し、Mpl リガンドの生物学的特徴を備えたMpl リガンド
ペプチドをコードするDNA 配列は、本発明における新規
なMpl リガンドポリペプチドをもコードしている。かか
る緊縮度を緩和したハイブリダイゼーション条件の例に
は、45−55℃における 4×SSC 、または、40−45℃での
30-40%ホルムアミドでのハイブリダイゼーションがあ
る。たとえば、Mpl リガンドの配列と有意な相同性を有
する領域、すなわちグリコシル化またはジスルフィド結
合部位を有し、１つ以上のMpl リガンドの生物学的特徴
を備えているDNA 配列は、Mpl リガンド配列に厳格にハ
イブリダイズしなくても、明らかにMpl リガンドポリペ
プチドをコードしている。アミノ酸を変化させたりさせ
なかったりするある種の集団内での自然発生的塩基交換
のような、Mpl リガンドのペプチド配列をコードしてい
るDNA 配列の対立遺伝子における多様性は、その類似物
または誘導体と同様に、本発明に含まれる。同様に、Mp
l リガンドペプチドをコードしていても、または、点突
然変異あるいは活性増強、半減期又はそれにコードされ
たポリペプチドの産生のために修飾された誘導によって
Mpl リガンドのDNA 配列において遺伝子コードの縮重変
異が生じた結果、コードの利用法に違いが生じたDNA 配
列であっても、本発明に包含される。
【０１２１】実施例11に示されたクローニング過程は、
引き続いて実施され、その結果ヒトタンパク質MGDF-1,M
GDF-2,およびMGDF-3のアミノ酸およびcDNA配列が合成さ
れる。MGDF-1は図11においてアミノ酸22−353 に相当
し、332 のアミノ酸を含む。MGDF-2は MGDF-1の一部を
欠いた部分であり、図11のアミノ酸22-195に示される。
よってMGDF-2は174 のアミノ酸を含む。MGDF-3は図12の
アミノ酸22-289に示され、268 のアミノ酸を含む。ここ
で開示された各々のMGDFにおいて、シグナルペプチドを
含む分子は、図11および図12の両方でアミノ酸1-21とし
て示され、本発明に置いて発明されたポリペプチドの一
部であるが、巨核球の増殖および提示活性の増大のため
除去されるのが好ましい。要約すると、MGDF1-3 は以下
のように定義される： MGDF-1 アミノ酸 22-353 図11。
【０１２２】MGDF-2 アミノ酸 22-195 図11。
【０１２３】MGDF-3 アミノ酸 22-289 図12。 ここに示すアッセイにおいて、MGDF-3が活性を呈さない
一方で、MGDF-1およびMGDF-2は活性を呈した。
【０１２４】ここに示した活性データに基づくと、ヒト
MGDFがIN VIVO において実質上不活性または可変型Ｃ−
末端アミノ酸を含む活性の小さい前駆体ポリペプチドで
あると仮定される。（シグナルペプチドと同様に）、Ｃ
−末端部アミノ酸の開裂において、この分子の加工され
た形態が活性を呈するか、またはさらに活性が上昇し
た。前述の仮定に基づいて考えると、その活性を発揮す
るためには、MGDF-1が（例えはプロテアーゼによって開
裂されるという）加工を施される必要があると考えられ
る。MGDF-1の一部を欠いた形態(MGDF-2)が活性であると
いう事実が、この仮説を支持している。
【０１２５】ヒト腎由来293 細胞から採取し、MGDF-1遺
伝子で形質転換させたコンディションメディウム（イン
ビトロジェン）は、実施例4 に示す細胞アッセイの活性
を示す。一方、32D 細胞等のほかの細胞系においては、
この分子の活性を認めることはなかった。これは、おそ
らく部分的欠損によって293 細胞がMGDF-1分子を加工す
る能力を有すると仮定され、32D 細胞がこの分子を加工
できないことに対して、この活性に本質的に関わると考
えられる分子が部分的欠損を起こした形態であるとの仮
定される。
【０１２６】上記の仮説をもとにすると、さまざまな活
性化分子がMGDF-1（図11）として説明された配列が一部
欠損した結果生じたと考えられる。エリトロポエチン
（EPO）等のサイトカインファミリー中に保持されてい
る構造特徴には、４本のα−ヘリックスバンドルと4 つ
のシステインがある。MGDF-1配列にあてはめると、Cys1
72は、最も進化の過程で保護され、機能的にみても欠く
ことのできない構造であるＣ−末端エレメントである。
しかるに、MGDF-1にとって好適な部分的欠損による変化
体は、（シグナルペプチドの開裂の他に）アミノ酸 173
-353からのC-末端部分欠損体である。好ましくは、MGDF
-1の配列がＣ−末端から50-185に相当するアミノ酸が除
去され、さらに好ましくは、Ｃ−末端から90-172に相当
するアミノ酸が除去される。ここで開示されるように、
シグナルペプチドの長さは21アミノ酸であると考えられ
る。しかし、MGDF-1の配列に基づいて考えると、シグナ
ルペプチドの長さは23アミノ酸になる。よって、ここに
提示されているものと対応するけれども、図11または図
12の位置24から始まるポリペプチドも、特異的に包含さ
れる。
【０１２７】以下に、活性（巨核球および／または血小
板の増殖を促進する活性；または天然型レセプターに対
する阻害／刺激性活性）を呈し得る好適なMGDF-1の特異
的変異体を若干示す： MGDF-4 アミノ酸 22-172 図11。
【０１２８】MGDF-5 アミノ酸 22-177 図11。
【０１２９】MGDF-6 アミノ酸 22-191 図11。
【０１３０】MGDF-7 アミノ酸 22-198 図11。
【０１３１】MGDF-8 アミノ酸 22-265 図11。
【０１３２】MGDF-11 アミノ酸 22-184 図11。
【０１３３】クローンの中には、MGDF-1配列のアミノ酸
133-136 の部分が欠けたものもあり、前述の配列に対応
する配列は、これらアミノ酸を欠いていても（Ｃ−末端
のアミノ酸番号が4 つ欠けていても）、活性を呈する。
【０１３４】192 の位置に終末コドンを含む1 つのクロ
ーンにおいては、図11の位置191 が示されているよう
に、Thr 残基の代わりに Ala 残基が発見された。しか
るに、本発明は、Thr の代わりにAla が191 の位置にく
るようなMGDF分子の変化体を含んでいる。MGDF-3は、IV
S-5(介在配列-5) と言及される配列を除去してできた配
列であるが、これは、この配列の5 番目のエクソン内に
おいてスプライスされているためである。IVS-5 の5'末
端がコドン中に発生した場合、これの除去によってMGDF
の残りの配列にフレームシフトが発生し、これはMGDF-3
の160 の位置からこの分子の末端部にかけて見ることが
できる。
【０１３５】MGDF-3自体を293 細胞へ形質移入しても、
活性は見い出されず、実施例４の細胞アッセイにおいて
生じたコンディションメディウムを試験しても活性がな
い。明らかにMGDF-1とは異なり、293 細胞はMGDF-3を活
性体へ加工することはできない。にもかかわらず、MGDF
-1に関する前述の部分的欠損の仮説に基づくと、MGDF-3
からＣ−末端のアミノ酸を部分的に欠損させても、活性
が生じることとなる。たとえば、MGDF-3の40ー102アミノ
酸をＣ−末端部において部分的に欠くと、活性を生じ
た。50ー90 アミノ酸が除去されることが望ましい。MGDF
-2について好適な変化体とは、以下のとおりである： MGDF-9 22-179 図12。
【０１３６】MGDF-10 22-190 図12。
【０１３７】前述のMGDFの実例を含み、ここにおいて開
示されているMpl リガンドすべてにおいて、特にかかる
ペプチドがバクテリアの宿主細胞において発現している
場合は、N-末端にはメチオニル残基が存在し得る。
【０１３８】Mpl リガンドポリペプチドは既知の慣用化
学的合成法によっても産生できる。本発明におけるポリ
ペプチドを合成手段によって構築する方法は、当業者に
知られている。合成法によって構築したMpl リガンドポ
リペプチド配列は、1 次、2次、または3 次構造及びコ
ンホーメーション上の特徴をMpl リガンドポリペプチド
と共有しているおかげで、共通のMpl リガンドの生物学
的特徴を備えていることになる。よって、治療上及び免
疫上の過程において、これらペプチドは、天然型または
精製型のMpl リガンドポリペプチドに対して生物学的に
活性な、または免疫的な代替物として扱われ得る。
【０１３９】ペプチドまたはMpl リガンドをコードする
DNA 配列の修飾は、既知の技術を使って当業者が熟知の
方法によって行われる。Mpl リガンド配列中、関心の集
まる修飾としては、コード配列における選択アミノ酸残
基の置換、挿入または欠失があげられる。かかる置換、
挿入または欠失を行うための突然変異誘発技術は、当業
者において周知となっている技術である（米国特許第4,
518,584 参照）。1-20アミノ酸における保守的変化が望
ましい。好適なペプチドは、タンパク溶解酵素または直
接的 化学合成によって発生し得る。かかる変化体
は、本発明のMplリガントポリペプチド及びポリヌクレ
オチドの定義に含まれ得る。
【０１４０】Mpl リガンドポリペプチド配列における特
異的突然変異体は、グリコシル化の起こる部位（セリ
ン、スレオニン、またはアスパラギン等）の修飾も含み
得る。グリコシル化が起こらないか、または部分的なグ
リコシル化しか起こらないのは、アスパラギンが連関し
たグリコシル化認識部位において、あるいはO-結合炭水
化物が付加することによって修飾された分子の部位にお
いて、アミノ酸の置換または欠失が起こった結果であ
る。アスパラギンの連関しているグリコシル化認識部位
は、適切な細胞性グリコシル化酵素によって特異的に認
識されたトリペプチド配列から構成される。このトリペ
プチド配列は、Asn-Xaa-Thr またはAsn-Xaa-Ser であ
り、ここでいうXaa はプロリン以外のあらゆるアミノ酸
が該当する。さまざまなアミノ酸の置換または欠失が、
グリコシル化認識部位の1 番目または3番目のアミノ酸
位置のうちいずれか一方または両方において起こってい
た場合（および／または2 番目の位置においてアミノ酸
欠失がおきていた場合）、修飾されたトリペプチド配列
においてはグリコシル化が起こらない。かかる変化ヌク
レオチド配列は、その部位においてグリコシル化されな
い変化体を発現する。MGDFの付加的アナログ／誘導体 MGDF(Mplリガンド) 配列におけるその他のアナログまた
は誘導体は、全体として、または部分的に（MGDFMpl リ
ガンド）活性を保持しており、本明細書における開示に
より当業者により調製され得る。かかる修飾もまた、本
発明に含まれる。
【０１４１】特に、本発明はまた、化学修飾したMGDF組
成物およびその製造法、ならびに利用法をも含む。この
開示によって、MGDFを修飾し、その特徴を増強させるこ
とが可能になる。
【０１４２】本発明における一つの態様は、少なくとも
1 つの水溶性ポリマー部分に結合したMGDFタンパク質を
含むMGDF産物に関する。本発明におけるもう一つの態様
は、MGDFタンパク質が少なくとも1 つのポリエチレング
リコール分子に結合したMGDF産物に関する。
【０１４３】本発明におけるその他の態様は、アシルま
たはアルキル結合を介して少なくとも1 つのポリエチレ
ングリコール分子に結合したMGDF分子に関する。
【０１４４】MGDFのPEG化は、当業界で周知となってい
るPEG 化反応を利用して達成され得る。たとえば、Focu
s on Growth Factors 3(2):4-10(1992) 、EP O 154 31
6;EPO 401 384 およびその他本発明において引用されて
いるその他のPEG 化関連出版物を参照のこと。好ましく
は、反応性ポリエチレングリコール分子（または類似の
反応性水溶性ポリマー）を用いるアシル化またはアルキ
ル化反応を介して、PEG 化を行うのがよい。ポリエチレ
ングリコールを使用した誘導体化の好ましい手段につい
て、以下に詳細に記述する。アシル化 アシル化によるPEG 化には、一般に、ポリエチレングリ
コール(PEG) の活性エステル誘導体と、MGDFタンパク質
との反応を含む。あらゆる既知または付随して発見され
た反応性PEG 分子は、MGDFのPEG 化に利用され得る。好
適な活性化PEGエステルは、PEG をN-ヒドロキシスクシ
ンイミドへエステル化したものである。ここでいう「ア
シル化」は、MGDFとPEG 、アミド、カルバメート、ウレ
タン等の水溶性ポリマーとの結合型を含むがこれに限定
されない。Bioconjugate Chem.5:133-140(1994) を参照
のこと。反応条件は、PEG 化技術において既知の条件、
またはPEG 化に付随して開発されたあらゆる条件から選
択されるが、修飾すべきMGDF種を不活化するような温
度、溶媒、およびPH等の条件を避けなくてはならない。
MGDFs のPEG 化に一般的に適用される反応条件を、以下
に述べる。モノメトキシ-PEGのNHS エステルとの実例反
応を、図14に概説する。
【０１４５】アシル化によるPEG 付加反応では、一般
に、多数のPEG が付加したMGDF産物が生じ、そこではア
シル結合基を介してリジンε−アミノ基にPEG 付加が起
こる。接続する結合はアミドであることが好ましい。ま
た、生じる産物は、実質上、PEG1個の付加物、PEG2個の
付加物またはPEG3個の付加物のみ (例えば＞95%)である
ことが好ましい。しかし、適用されている特定条件によ
っては、高度にPEG 付加された種（MGDFのリジンにおけ
るε−アミノ酸基への最大付加数と、MGDFのアミノ末端
部のα−アミノ基1 個に付加する数までの）が形成され
得るのが普通である。希望するならば、透析、塩析、限
外濾過法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過ク
ロマトグラフィーおよび電気泳動を含む標準的技術その
他の技術を適用することによって、混合物または未反応
種のなかから、より精製されたPEG付加種が分離され得
る。アルキル化 アルキル化によるPEG 化には、一般に、PEG の末端アル
デヒド誘導体と、MGDF等のタンパク質とを、還元剤の存
在下で反応させることを含む。前述のアシル化のように
反応条件を下記する。
【０１４６】アルキル化によるPEG 付加を行うと、多数
のPEG が付加したMGDFが発生する。ポリPEG 化した産物
を得るためのMGDFとの還元的アルキル化反応の実例を図
15に示す。さらに、前述のごとく、MGDF種のN-末端にあ
るα−アミノ基においてのみ実質的にPEG 化を行う（モ
ノPEG 化された種）ような反応条件に操作することがで
きる。PEG1個が付加した産物を得るためのMGDFとの還元
的アルキル化反応について、その実例を図16に示す。PE
G1個の付加反応、またはPEG が多数付加する反応のいず
れかにおいては、 -CH2-NH-基を介してPEG 基がタンパ
ク質に結合しているのが望ましい。特に -CH2- 基を参
照するにあたり、この結合型をここでは「アルキル」結
合と呼ぶ。
【０１４７】PEG1個が付加した産物を産生するための還
元アルキル化を介した誘導体化では、MGDFの誘導体合成
において利用できる（Ｎ−末端に対するリジンなどの）
異なるタイプの1 級アミノ基の反応性が異なることを利
用する。この反応は、（後述する）PHにおいて、リジン
残基におけるε−アミノ基と、タンパク質におけるN-末
端残基のα−アミノ基との間におけるpKa の値に差があ
ることを利点として実行することができる。かかる選択
的誘導体化法によって、タンパク質へのアルデヒドなど
の反応基を含む水溶性ポリマーの結合を制御する。ポリ
マーとのコンジュゲーションは、タンパク質のN-末端部
において優位に発生し、リジンの側鎖のアミノ基などの
その他の反応基においては有位な修飾が起こらない。本
発明における重要な目的には、実質上、モノポリマー／
MGDFタンパク質コンジュゲート分子の均質な製剤を提供
する（実質上、単一の位置のみ（＞95％）において MG
DFタンパクがポリマー分子に結合することを意味する）
ことがある。さらに特定的には、ポリエチレングリコー
ルを使用するならば、本発明は、抗原性を有し得る結合
基を含まず、MGDFタンパク質へ直接結合するポリエチレ
ングリコール分子を有するPEG 付加MGDFタンパク質を提
供する。
【０１４８】しかるに、本発明において好適な態様は、
PEG 付加したMGDFであって、PEG 基がアシル基またはア
ルキル基を介して結合することに関する。前述のごと
く、かかる産物は、PEG が一つまたは複数結合している
（例えば2-6 個、好ましくは 2-5個のPEG を含むこと
が）。PEG 基は一般にアミノ酸のα−アミノ基またはε
−アミノ基においてタンパク質と結合するが、このPEG
基はタンパク質に結合しているあらゆるアミノ基と結合
することができると予期されており、これは適正な条件
下において十分な反応性を呈し、PEG 基と結合できるよ
うになる。
【０１４９】アシル化とアルキル化の両反応において利
用されているポリマー分子は、水溶性ポリマーまたはそ
の混合物から選択される。選択されたポリマーは、水溶
性でなくてはならず、付加されるタンパク質は生理的環
境のような水溶性の環境において沈殿しない。選択され
たポリマーは、アシル化用の活性エステル、またはアル
キル化用のアルデヒドのように、単一の反応基を有する
よう修飾されなくてはならず、好ましくは、本発明にお
いて示される方法によって重合度が制御される必要があ
る。好適な反応性PEG アルデヒドはポリエチレングリコ
ールプロピオンアルデヒド（水に対して安定）か、また
はそれのモノC1-C10アルコキシまたはアリールオキシ誘
導体である（米国特許第 5,252,714 参照）。ポリマー
は枝分かれしているか、または枝分かれしていないもの
のいずれかとし得る。治療用の最終産物としてのポリマ
ーにおいては、前記ポリマーが薬学上受容されうるもの
とするのが望ましい。水溶性ポリマーは、たとえばポリ
エチレングリコール、モノメトキシ−ポリエチレングリ
コール、デキストラン、ポリ（N-ビニルピロリドン）ポ
リエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリ
マー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポ
リマー、ポリオキシエチル化ポリオール（すなわちグリ
セロール）およびポリビニルアルコールから構成される
グループより選択され得る。アシル化反応に向けては、
単一の反応性エステル基を有するポリマーが選択されな
くてはならない。本発明における還元的アルキル化にお
いては、選択されるポリマーが単一の反応性アルデヒド
を有ななくてはならない。一般に、天然型のグリコシル
残基から水溶性ポリマーが選択されることはないであろ
うが、これは、これらがほ乳動物類の組み換え発現系を
使って簡便に合成されているためである。このポリマー
はいかなる分子量でもよく、枝分かれしていることもあ
るし、枝分かれしていないこともある。
【０１５０】利用する上で特に好適な水溶性ポリマー
は、ポリエチレングリコール、略してPEG である。ここ
で利用されているように、ポリエチレングリコールは、
モノ（C1-C10）アルコキシまたはアリールオキシ−ポリ
エチレングリコール等のほかのタンパク質の誘導体化に
使われてきたPEG のいかなる形態を含むものとする。
【０１５１】ここで利用されるように、MGDFは前述のご
とくあらゆる形態のMGDFを含むものと定義される。たと
えば、完全な長さであるか、または部分欠損されている
か、グリコシル化または非グリコシル化された形態のMG
DFすべてが含まれる。以下は、誘導体化されるべき望ま
しいMGDF分子である（各々の例において、番号づけは図
11に従ってつけられたアミノ酸を示す）： MGDF-1 アミノ酸 22-353 図11。
【０１５２】MGDF-2 アミノ酸 22-195 図11。
【０１５３】MGDF-4 アミノ酸 22-172 図11。
【０１５４】MGDF-11 アミノ酸 22-184 図11。
【０１５５】MGDF-12 アミノ酸 27-353 図11。
【０１５６】MGDF-13 アミノ酸 27-195 図11。
【０１５７】MGDF-14 アミノ酸 27-172 図11。
【０１５８】MGDF-15 アミノ酸 27-184 図11。 前述の好適な種は、グリコシル化、非グリコシル化、ま
たは脱グリコシル化されており、グリコシル化されてい
ないのが好ましい。これらはバクテリア（E.coli等）ま
たは哺乳動物類細胞（CHO 等）を使って遺伝子組み換え
によって得られる。
【０１５９】以下は、本発明において特に好適な化学的
誘導体分子のサブクループである（かかる例において
は、アシル基またはアルキル基を介して結合したモノ−
又はポリ−（例えば 2〜4) PEG部分である）： PEG 付加MGDF-11。
【０１６０】PEG 付加MGDF-4。
【０１６１】PEG 付加MGDF-2。
【０１６２】一般に、生物活性を有する物質と、活性化
ポリマー分子とを反応させるのに使う適正な条件下にお
くことによって化学的誘導体化が行われ得る。PEG 付加
MGDFの調製法は、一般に、(a) MGDFポリペプチドとポリ
エチレングリコール（PEG の反応性エステルまたはアル
デヒド誘導体等）との間の反応を、MGDFが1 個または2
個以上のPEG 基と結合する条件で行なうステップと、
(b) 反応産物を得るステップからなる。一般に、アシル
化反応にとって最適の条件は、既知のパラメータと希望
する結果とによって、ケース・バイ・ケースで決定され
る。たとえば、PEG ：タンパクの比が高くなると、ポリ
PEG 化産物の割合が高くなる。 モノポリマー／MGDFタ
ンパク質コンジュゲート分子の実質上均質な集団を産生
させるための還元的アルキル化反応は、一般に、(a) MG
DFタンパク質と反応性PEG 分子とを適正な還元的アルキ
ル化条件下で、前記MGDFタンパク質のアミノ末端におけ
るα−アミノ基を選択的に修飾するのに適したpHで反応
させるステップと、(b) 反応産物を得るステップとから
構成される。
【０１６３】モノポリマー／MGDFタンパク質コンジュゲ
ード分子の実質上均質である集団にとって、還元性アル
キル化反応の条件では、水溶性ポリマー部分を選択的に
MGDFのN-末端部に結合させることができるものである。
かかる反応条件は、一般に、リジンのアミノ基とN-末端
のα−アミノ基との間にあるpKa に違いをもたらす（pK
a は、アミノ基の50% がプロトン化され、残り50% がプ
ロトン化されていないpHである）。pHはまた、使用すべ
きタンパク質に対するポリマーの比にも影響を及ぼす。
一般に、pHが低い場合、タンパク質に対して過剰のポリ
マーが望まれる（N-末端部のα−アミノ基の反応性が下
がると、最適な条件を達成するためにより多くのポリマ
ーが必要になる）。pHが高くなると、ポリマー：タンパ
ク質の比を高くする必要がなくなる（反応性に富む基が
多くなると、ポリマー分子の必要量が低下する）。本発
明の目的においては、pHが3-9 の間にあり、3-6 であれ
ば好ましい。
【０１６４】さらに重要な考慮点は、ポリマーの分子量
である。一般に、ポリマーの分子量が高くなると、タン
パク質に付加し得るポリマー分子の数が少なくなる。同
様に、これらパラメータを最適化するには、ポリマーの
枝分かれについても考慮しなくてはならない。一般に、
分子量が高くなると（または枝分かれが増えると）、ポ
リマー：タンパクの比が高くなる。一般に、ここで意図
されているPEG 化反応では、好適な平均分子量は約2kDa
から約10kDa である（ここでいう「約」という語は、±
1kDaのことである）。好ましい平均分子量は約5kDaから
約50kDa であり、約12kDa から約25kDa の間であればな
およい。水溶性ポリマー対MGDFタンパク質の比は、一般
に1:1 から100:1 ならよく、（ポリPEG 化の場合）1:1
から20:1、（モノPEG 化では）1:1 から5:1 であればな
およい。
【０１６５】前述の条件を用いて、還元的アルキル化反
応を、ポリマーがアミノ末端部においてα- アミノ基を
有するMGDFタンパク質へ選択的に結合することを提供
し、モノポリマー／MGDFタンパク質コンジュゲートの実
質上均質な製剤を提供する。「モノポリマー／MGDFタン
パク質コンジュゲート」という語は、単一のポリマー分
子がMGDFタンパク1 分子に付加して構成されている組成
物を示す。モノポリマー／MGDFタンパク質コンジュゲー
トは、N-末端部にポリマー分子が付いていれば好適であ
るが、リジンのアミノ側鎖基上でないほうがよい。この
製剤は90% 以上のモノポリマー／MGDFタンパク質コンジ
ュゲートであるのが望ましく、95% 以上のモノポリマー
MGDFタンパク質コンジュゲートならばなおよく、観察可
能な残りの分子は未反応である（ポリマー部分を欠いた
タンパク質）。以下の実施例は、少なくとも90% がモノ
ポリマー／MGDFタンパク質コンジュゲートであり、約10
% が未反応のタンパク質である。モノポリマー／タンパ
ク質コンジュゲートには生物活性がある。
【０１６６】ここでいう還元的アルキル化反応に向けて
は、還元剤が水性溶液中で安定であるべきであり、還元
的アルキル化反応の初反応段階において形成されたシッ
フ塩基のみを還元できるのが好ましい。好適な還元剤
は、ソディウムボロヒドリド、ソディウムシアノボロヒ
ドリド、ジメチルアミン・ボラン、トリメチルアミンボ
ランおよびピリジンボラーンで構成されるグループから
選択されるのがよい。特に望ましい還元剤はソディウム
シアノボロヒドリドである。
【０１６７】その他の溶媒、反応時間、温度などの反応
パラメータ、および産物の精製方法は、タンパクの水溶
性ポリマーによる誘導体化に関する公開情報（本報にお
ける出版物参照）にもとづいて、ケース・バイ・ケース
で決定することができる。実施例の項に具体例を示して
ある。
【０１６８】アシル化および／またはアルキル化法を選
択することによって、ポリマー／タンパク質コンジュゲ
ート分子混合物を製造できるが、ここで提供できる利点
は、混合物中に含まれるモノポリマー／タンパク質コン
ジュゲートの比率を選択できることにある。よって、希
望するならば、結合させるポリマー分子の数（ジ−、ト
リ−、テトラ−など）を変化させて様々なタンパクの混
合物を調製することができ、ここで示す方法を利用し
て、モノポリマー／タンパク質コンジュゲート物質と組
み合わせ、あらかじめ設定したモノポリマー／タンパク
質コンジュゲート比の混合物を調製できる。
【０１６９】以下に提示した実施例は、化学修飾したMG
DF製剤と、アシル化およびアルキル化を介したPEG 化MG
DFの製剤とを提供する。よって、本発明は、これらの製
剤にも関する。一般に、本発明のポリマー／MGDFを投与
することによって軽減または調節され得る条件には、一
般に前述のMGDF分子についての条件が含まれる。しか
し、ここに開示されるポリマー／ MGDF分子には、非誘
導体化分子と比較した場合に、別の活性増強されたまた
は減弱された活性、あるいはほかの特徴を有し得る。
【０１７０】本発明におけるさらに他の態様には、前述
の化学修飾を施したMGDF分子から構成される医薬組成物
の提供がある。かかる医薬組成物は、非誘導体化MGDF分
子に対して特定された成分を含み得る。
【０１７１】さらに詳細な検討が重ねられるにつれて、
多様な患者を対象とした多様な病状の治療に対する適正
な投薬レベルが生み出され、治療上のコンテクスト、被
投薬者の年齢および全身の健康状態を考慮した通常の熟
練作業者は、適正な投与量を確定できると考えられる。
一般に、投薬量は0.01ug/kg体重（タンパク質量のみか
ら計算し、化学修飾を考慮しない場合）から 300ug/kg
（前記と同様）の間であろう。より好適な投薬量は、5u
g/kg体重から100ug/kg体重であり、さらに好適な投薬量
は10ug/kg から75ug/kg の間となる。
【０１７２】本発明はまた、MGDF（すなわちMpl リガン
ド）ポリペプチドまたはその活性フラグメントの産生方
法についても提供している。本発明における一つの方法
には、Mpl リガンドポリペプチドをコードするcDNAを発
現ベクター中へ導入して、Mpl リガンド用の発現系を作
ることにある。選択された宿主細胞をベクターで形質移
入して、培養する。本発明における方法は、既知の制御
配列の制御のもとに、Mpl リガンドポリペプチドの発現
をコードするDNA 配列を形質移入させておいた、適正な
細胞または細胞系を培養することから構成される。制御
配列には、プロモーターフラグメント、終末フラグメン
ト、およびその他の適正な宿主細胞内においてタンパク
の発現を指示／制御する配列が含まれる。発現された因
子は、当業者にとって既知となっている適切手段によっ
て培地から回収され、単離および精製される（細胞内で
発現していれば細胞から）。さらに、米国特許第5,272,
071 号ではまた、本発明のポリヌクレオチド／ポリペプ
チドに応用されるべく意図されている方法が開示されて
いる。適正な細胞または細胞系は、チャイニーズハムス
ター卵巣細胞（CHO ）または3T3 細胞等のほ乳動物類細
胞であり得る。ほ乳動物類由来宿主細胞および形質転換
の方法、培養、増幅、スクリーニングおよび産物の産生
および精製方法の選択は、公知である。Gething and Sa
mbrook,Nature 293:620-625(1981) を参照するか、代わ
りにKaufman et al.,Mol.Cell.Biol.,5(7): 1750-1759
(1985) またはHowley et al.,米国特許第4,419,446 号
を参照のこと。その他の適正なほ乳動物類細胞系として
は、サルCOS-1,COS-7 細胞系、またはCV-1細胞系があ
る。さらに実例となるほ乳動物類細胞系には、形質転換
細胞系を含む霊長類の細胞系およびげっ歯類の細胞系が
ある。正常2 倍体細胞、原発組織のIN VITRO培養由来の
細胞株は、原発性外植片同様に適する。試験候補となる
細胞は選択された遺伝子において遺伝子型的に欠損し得
るか、または優先的に発現する選択遺伝子を含み得る。
その他の適正なほ乳類細胞系には、これに限定されない
が、HeLa、マウスL929細胞、スイス・Balb/cマウス由来
またはNIH 由来の3T3 系、BHK またはHaK ハムスター細
胞系がある。
【０１７３】本発明に適する宿主細胞として、バクテリ
ア由来細胞が同様に有用である。たとえば、バイオテク
ノロジーの分野では、さまざまなE.coliの菌株（HB101,
DH5α、DH10, およびMC1061など）が宿主細胞として周
知になっている。B.Subtilis, Pseudomonas spp., Baci
llus spp. およびStreptomyces spp.,および同様の菌株
も、本法において利用される。
【０１７４】当業者に周知となっている酵母細胞の多く
の菌株も、本発明におけるポリペプチドの発現において
宿主細胞として利用できる。Miller et al.,のGenetic
Engineering 8:277-298(1986) および本明細書で示した
文献を参照のこと。
【０１７５】本発明ではまた、新規Mpl リガンドポリペ
プチドの発現法において利用するための組み換え分子ま
たはベクターを提供する。これらベクターは、Mpl リガ
ンドDNA 配列を含み、そのリガンド配列は単独またはそ
の他の配列との組合せで本発明のMpl リガンドポリペプ
チド又はその活性フラグメントをコードしている（シグ
ナルペプチドを含む場合と含まない場合がある）。ある
いは、前述のごとく被修飾配列を含むベクターはまた、
本発明における具体例の一つをなし、Mpl リガンドポリ
ペプチドを産生する上で有用である。本発明において利
用されているベクターは、本発明のDNA コード配列と作
動可能に結合し選択された宿主細胞内において、複製及
び発現を指示する選択された制御配列をも含む。
【０１７６】1 つのベクターとしてpXM があり、これ
は、特にCOS 細胞内の発現に好ましい［Y.C.Yang et a
l.,Cell 47:3-10(1986)］。ほ乳類細胞例えばCHO 細胞
内における発現に望ましいのはpEMC2B1 である。ここで
開示されているほ乳類細胞発現ベクターは、当業者に周
知の技術を利用して合成され得る。ベクターの構成要
素、例えばレプリコン、選択遺伝子、エンハンサー、プ
ロモーター等は、天然ソースから得るか、または既知の
工程を経て合成され得る。Kaufman et al.,J.Mol.Biol.
159:511-521 (1982)、およびKaufman,Proc.Natl.Acad.S
ci.USA 82:689-693 (1985)を参照のこと。また、あるい
は、ベクターDNA はウシパピローマウイルスのゲノム全
部またはその一部を含み得[Luskyet al.,Cell 36:391-4
01(1984)] 、および安定エピソーム成分としてのC127マ
ウス細胞などの細胞系内において複製され得る。これら
ベクターを適正な宿主細胞へ形質移入すると、Mpl リガ
ンドポリペプチドを発現させることができる。
【０１７７】多様なタイプの適正な発現ベクターは、ほ
乳類、昆虫、酵母、真菌および細菌発現などにおいて公
知であり、この目的を果たすべく利用することができ
る。
【０１７８】本発明における方法および組成物によって
処理される病状は、一般に、現状において巨核球／血小
板を欠損しているか、または将来において巨核球／血小
板の欠損が予測されることを含む（予定された手術のた
め）。かかる諸病状は、通常、in vivo において活性Mp
l リガンドが（一時的または永久に）欠損した結果であ
る。血小板欠損という語は、血小板減少症であり、本発
明の方法及び組成物は一般に血小板減少症の治療に利用
できる。
【０１７９】血小板減少症（血小板欠乏症）はさまざま
な理由により存在し、様々な薬物による化学療法やその
他の治療、放射線療法、外科手術、事故による失血、そ
の他特別な疾病状態をもその理由に含む。血小板減少症
を含み、かつ本発明により治療され得る特異的病態と
は、無形成性貧血、特発性血小板減少症、血小板減少症
を伴なう転移した腫瘍、全身性エリテマトーデス、巨脾
腫症、Fanconi 症候群、ビタミンB12 欠乏症、葉酸欠乏
症、May-Hegglin 奇形、Wiskott-Aldrich 症候群、およ
び近位夜行性ヘモグロビン尿症がある。また、エイズを
対象としてある治療（AZT 等）を行った結果、血小板減
少症に罹患することがある。ある損傷治癒不全に陥った
ことが、血小板の増加にとって有利に作用することがあ
る。
【０１８０】予測される血小板欠損症、たとえば将来の
外科手術が原因となるものには、本発明のMpl リガンド
を、血小板が必要になるのに先だって数日から数時間投
与することが可能である。急性の刺激、例えば不慮の大
量な失血においては、Mpl リガンドが血液または精製血
小板と共に投与される。
【０１８１】本発明のMpl リガンドは、巨核球以外のあ
る細胞タイプが Mpl レセプターを発現することが判明
するならば、その細胞を刺激するのに有効である。Mpl
レセプターを発現するようなかかる細胞に関連する病態
は、Mpl リガンドによる刺激に関わっているのであれ
ば、本発明の範囲内に該当する。
【０１８２】本明細書において示した活性試験アッセイ
において、それ自体が活性でないMGDF分子は、IN VITRO
またはIN VIVO においてMpl レセプターのモジュレータ
（阻害因子または刺激因子）として有用であるといえ
る。
【０１８３】本発明のポリペプチドは、前述のごとく認
識された病態において、単独で用いられるか、またはそ
の他のサイトカイン、可溶性Mpl レセプター、造血因
子、インターロイキン類、成長因子または抗体と組み合
わせて用いられる。
【０１８４】よって、本発明におけるその他の態様に
は、前述の病態に関する治療用組成物がある。かかる組
成物は、薬学上受容しうる担体とともに治療上の薬効量
に相当するMpl リガンドポリペプチド、または治療上有
効なフラグメントから構成される。この担体の材料は、
注射用蒸留水であり得、好ましくは哺乳動物を対象とし
た投与液に慣用のその他の材料を添加したものとするの
が好ましい。代表的には、Mpl リガンド治療薬は、精製
タンパクと一種以上の生理学上受容できる担体、賦形剤
または希釈剤組合せた形態で投与される。中性の緩衝生
理食塩液、または血清アルブミンを混合した生理食塩液
は、適正な担体の例である。前記産物が適正な賦形剤
（ショ糖等）を利用した凍結乾燥品として処方されてい
るのが好ましい。その他の標準担体、希釈剤、および賦
形剤が希望に応じて含まれる。その他の組成物の例に
は、トリス緩衝液pH8.O 、酢酸塩緩衝液pH 5.0が含ま
れ、それらには場合によってはソルビトールも含まれ
る。
【０１８５】本組成物は、非経口法により全身投与す
る。非経口法の代わりとしては、前記組成物を静注また
は皮下法によって投与する。全身投与した場合、本発明
において使用される治療用組成物は、発熱性物質を含ま
ない、非経口で受容される水溶液の形で存在し得る。か
かる薬学上受容できるタンパク溶液の製造は、pH、等張
性、安定性等に関して当業界の技術内である。
【０１８６】前述の病態を治療するための治療法に関与
する投与方法は、薬物の作用を変化させる年齢、病態、
体重、性別および患者の食事状況、あらゆる感染症の重
症度、薬物投与の時間その他臨床上の因子など、様々な
因子を考慮しながら、主治医によって決定される。一般
に、一日投与量は0.1-1000μg のMpl リガンドタンパク
質またはそのフラグメントを体重1kg あたり投与する。
【０１８７】本発明における治療方法、組成物およびポ
リペプチドは、血小板減少と同様、その他の症状によっ
て特徴づけられる疾病状態の治療において、ポリペプチ
ド単独か、またはその他のサイトカイン、可溶性Mpl レ
セプター、造血因子、インターロイキン類、成長因子ま
たは抗体と組み合わせて利用される。Mpl リガンド分子
はIL-3またはGM-CSF等の一般的な造血刺激剤と組み合わ
せて、血小板減少症の病態を治療する上で有用であるこ
とが証明されるであろう。その他の巨核球刺激因子、す
なわちmeg-CSF 、幹細胞因子(SCF) 、白血病阻害因子(L
IF) 、オンコスタチンM(OSM)、または巨核球刺激活性を
呈するその他の分子類もまた、Mpl リガンドと共に用い
られる。さらに併用投与の実例となるサイトカインまた
は造血因子には、α−型IL-1、β−型IL-1、IL-2,IL-3,
IL-4,IL-5,IL-6,IL-11、コロニー刺激因子−1(CSF-1)、
GM-CSF、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF ）、 EPO 、
α−インターフェロン (IFN-α) 、IFN-βまたはIFN-γ
がある。さらに、薬効量に相当する可溶性ほ乳類Mpl レ
セプターを、同時または連続して投与すると、一旦巨核
球が成熟型に到達すれば、巨核球をフラグメントに分裂
させて血小板に到達させる上で有効である。よって、Mp
l リガンドを（成熟巨核球の数を増やすために）投与
し、次いで可溶性Mpl レセプター （リガンドを不活化
させ、成熟巨核球に血小板を産生させるために）を投与
すると、血小板産生を刺激する上で極めて効果的な手段
となると期待される。前述した投薬量は、治療用組成物
に付加する成分を補正するために調整される。治療を受
けた患者における疾病の進行は、慣用試験法によって監
視される。
【０１８８】これら新規ポリペプチドの利用法には、ほ
かに、標準法によって生成した抗体の開発における利用
がある。よって、本発明のMpl リガンドと反応する抗体
は、かかる抗体の反応性フラグメントと同様に本発明と
して意図されている。前記抗体はポリクローナル、モノ
クローナル、組み換え体、キメラ体、一本鎖および／ま
たはバイスペシフィック等であり得る。ここでいう抗体
フラグメントは、Fab,Fab'等の本発明のMpl リガンドと
反応するあらゆるフラグメントであり得る。本発明にお
いては、Mpl リガンドまたはそのフラグメントを選択さ
れた哺乳動物に対する抗原として提供し、続いて動物細
胞（脾臓細胞等）とある種の癌細胞とを融合させ、既知
の技術を利用して生存し続ける細胞系を生成することに
よって発生したハイブリドーマも提供される。かかる細
胞系及び本発明におけるヒト由来Mpl リガンドペプチド
の全部または一部に対する抗体を発生させる方法につい
ても、本発明に含まれる。
【０１８９】前記抗体は、Mpl リガンドとそのレセプタ
ーとの結合を阻害する目的で治療用に使用され得る。更
に、この抗体は、 in vivoおよびin vitroにおける診
断用として、体液中にMpl リガンドが存在するかを検出
するために、標識体の形で利用され得る。
【０１９０】以下の実施例は、本発明をより詳細に説明
するために含まれるものである。さらに、これら実施例
は本発明において好ましい具体例を提供するが、指示の
ない限りは、かかる発明の目的に限定されることはな
い。以下の実施例に記述されている過程の多く、または
適正な代用法は、たとえば、Sambrook et al.,Molecula
r Cloning,Second Edition,Cold Spring Harbour Labor
atory Press(1987) およびAusubel et al.,(Eds),Curre
nt Protocols in Molecular Biology,Greene associate
s/Wiley Interscience,New York(1990) 等において、分
子生物学における周知のマニュアルとして提供されてい
る。
【０１９１】
【実施例】実施例１ 形成不全性イヌ血漿 ヘパリン処理した、形成不全性イヌ血漿“APK9" および
正常イヌ血漿“NK9"は、次の報文にしたがって調製し
た。ただし、検体に対して、450 ラドの全身照射を行な
った。 1.Mazur,E. and South,K. Exp.Hematol.13:1164-1172(1
985) 2. Arriaga,M.,South,K.,Cohen,J.L., and Mazur,E.M.
Blood 69:486-492(1987) 3. Mazur,E., Basilico,D., Newton,J.L., Cohen,J.L.,
Charland, C., Sohl,P. A., and Narendran,A. Blood 76:1771-1782 (1990) 実施例２ ヒト巨核球アッセイ APK9および分画したAPK9は、CD34＋ 始原細胞からヒト
巨核球への発生分化促進能をアッセイした。CD34- 選択
細胞は、報文(Hokom,M.H., Choi,E., Nichol,J.L., Hor
nkohl,A., Arakawa,T., and Hunt,P. Molecular Biolog
y of Haematopoiesis 3:15-31,1994) にしたがって末梢
血細胞から採取し、次に示す培 養液でインキュベート
した：Iscove's modified Dulbecco's medium(IMDM; G
IBCO, Grand Island, NY）に、1%グルタミン Pen-stre
p(Irvine Scientific, Santa Ana, CA) と、10% のヘパ
リン処理・ 血小板乏・ ヒトAB型血漿を添加し、。さら
に、2-メルカプトエタノール (10−４M)、ピルビン酸(1
10μg/ml) 、コレステロール(7.8μg/ml) 、アデノシ
ン、グアニン、シチ ジン、ウリジン、チミジン、2-
デオキシシトシン、2-デオキ シアデノシン、2-デオキ
シグアノシン (以上は各々10μg/ml, Sigma)、 ;ヒト・
組換型(recombinant) ・ インシュリン（10 μg/ml)
、ヒト・ トランスフェリン(300μg/ml) 、大豆油脂(1
%, Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) 、 ;ヒト
・ 組換型・ 塩基性繊維芽細胞成長因子(bFGF, 2ng/ml, G
enzyme, Cambridge, MA)、 ;ヒト・ 組換型・ 上皮成長因
子 (15ng/ml)、；血小板由来成長因子（10ng/ml, Amge
n, Inc., Thousand Oaks, CA ）を加えた培養液。CD34-
選択細胞は、 2×105個/ml(培養液）の濃度で、最終容
量15ulとして、テラサキ型・ マイクロタイター(microti
ter)プレート(Vanguard, Inc., Neptune, NJ）のウェル
(well)に配置(plate) した。細胞は、1%グルタルアルデ
ヒドで直接培地のウェルに固定し、5%CO2 を含む空気
を流した調湿ボックスで、37℃、8 日間、インキュベー
トし、モノクローナル抗体反応溶液（抗GPIb、抗GPIIb
、(Biodesign) と抗 GPIb(Dako, Carpinteria, CA)）
とともにインキュベートした。免疫反応はストレプト・
アビジン- ベータ- ガラクトシダーゼの検出系（HistoM
ark, Kirkegaard and Perry ）で展開した。青色で同定
される巨核球は、100 倍率にした倒立顕微鏡でカウント
した。結果は、ウェル当たりの巨核球数の平均値+/- 平
均標準誤差(SEM) として、示した。場合によって、デー
タは“巨核球ユニット/ml ”で示すことがあり、ここで
は、与えられたサンプルが誘導した巨核球発生分化の度
合いが、APK9のポジティブコントロールに対して正規化
(normalize) される。すなわち、1 ユニットは、1ul の
APK9スタンダードがもたらす巨核球と同じ数の巨核球を
生じる物質の量として、定義する。活性が、もしも5-10
μg/mlの MPL-X（可溶性Mpl レセプター）でブロックさ
れれば、活性がMPL リガンドに基づいていることが認め
られる。
【０１９２】APK9は、ヒト巨核球の発生分化を刺激する
（いくつかの）因子を、この系に含んでいることが示唆
されている。10%NK9で、8 日間インキュベートしたCD34
- 選択細胞は、無視できるぐらいの数の青染色巨核球し
か示さないが、これに対して10%APK9 で、8 日間インキ
ュベートしたCD34- 選択細胞は、非常に多数の青染色巨
核球を示す。
【０１９３】図2 は、ヒト巨核球培養系に加えたMpl-X
の濃度が増大するにつれ、巨核球発生のブロックも増大
していることを示している。Mpl-X の濃度が5 μg/ml以
上で、阻害は完全である。この実験で、CD34- 選択細胞
は、5%APK9で刺激を受けた。これは、Mpl-X(おそらくMp
l リガンド) と相互作用する、ある活性が、ヒト巨核球
の発生分化に必要であることを証明しており、Mpl リガ
ンドはAPK9そのものに含まれていることを意味してい
る。本明細書において、ヒト巨核球の発生分化に必要な
Mpl リガンド活性がAPK9に存在することがさらに示され
る。APK9(135ml）をIscove's培地で6 倍に希釈し、Mpl-
X のアフィニティーカラムに加えた。非結合物質（フロ
ースルー）を集め、アッセイの前に、元のボリュームに
濃縮した。結合物質は10mlの1MNaClで溶出し、プールの
20% をダイアフィルトレーションし、アッセイ用に4 倍
に濃縮した。培地だけでインキュベートしたCD34-選択
細胞は、巨核球に分化しなかった。5%APK9（カラムに加
えたものと同じプール）でインキュベートした細胞は、
ウェル当たり48+/-8個の巨核球に分化した。10% の非結
合物質でインキュベートした細胞は、巨核球に分化しな
かった。10% の溶出プールでインキュベートした細胞
は、ウェル当たり120+/-44個の巨核球に分化した。カラ
ムにロードしたものおよび溶出プールの両活性はとも
に、5 μg/mlのMpl-X でのアッセイで、実質的に完全に
阻害された。
【０１９４】実施例３ マウスおよびヒトMpl レセプターのマウス細胞系 への遺伝子導入 A.マウスMpl レセプター Moloney マウス肉腫ウィルスのLTR に由来する転写プロ
モーターを含んでいる発現ベクターに、完全長のマウス
Mpl レセプターcDNAをサブクローニングした。この構成
物5 μg と、選択マーカープラスミド pWLNeo(Stratage
ne)1μg を、IL-3依存性マウス細胞系(32D, Clone 23;
Greenberger et al., PNAS 80:2931-2936(1983))に、エ
レクトロポレーションした。細胞は、回復のために５日
間培養した後、800 μg/mlのGeneticin(G418，Sigma)と
1ng/mlのマウスIL-3を含む選択培地でインキュベートし
た。生き残っている細胞は、 2×105個づつのプールに
分割し、個々の集団が続いての分析に使えるように生育
するまで培養した。ポリクローナルウサギ抗ペプチド血
清を用いるFACS分析によって、6 個の集団の、Mplレセ
プターの表面発現についてテストした。一つの集団を、
前記と同じ抗ペプチド血清を用いるFACS分別により選ん
だ。10%APK9 とGeneticin の存在下での生育によって、
親細胞系の単細胞クローンを選択した。APK9存在下で35
日間の選択後、細胞を1ng/mlのマウスIL-3存在下で維持
した。サブクローンの一つ、1A6.1 を、この一連の研究
に用いた。 B.ヒトMpl レセプター Moloney マウス肉腫ウィルスの転写プロモーターを含ん
でいる発現ベクター（マウスレセプターの場合と同じベ
クター）中に、完全長のヒトMpl レセプターの配列（Vi
gon,I., et al., PNAS 89:5640-5644(1992) ）をサブク
ローニングした。この構成物6 μg と、両種性のレトロ
ウィルスのパッケージング構成物(Landau,N.R., Littma
n,D.R., J.Virology 66:5110-5113 (1992)) 6 μg を、
CaPO4哺乳動物遺伝子導入キット(Stratagene)を用い
て、 3×106個の293 細胞に遺伝子導入した。同じ細胞
群に、2 日後に再導入し、4 日後にもまた行った。最後
の遺伝子導入の翌日、293 細胞を、IL-3依存性マウス細
胞系（32D, Clone 23;Greenberger et al., PNAS 80:29
31-2936(1983))とともに、共培養した。24時間後、32D
細胞を解放し、BSA 勾配(Path-o-cyte;Miles Inc.)でバ
ンド化した。細胞は1ng/mlのIL-3存在下で増幅され、20
%APK9 存在下での生育によって選択された。細胞は、ポ
リクローナルウサギ抗ペプチド血清を用いるFACSによっ
て、レセプターの細胞表面発現について分別された。こ
れらの細胞は、続いて各種のアッセイに用いた。
【０１９５】実施例４ Mplリガンドのための1A6.1 アッセイ 1A6.1 細胞は、培養液IL-3が無くなるまで洗浄し、テラ
サキ型のマイクロタイタープレートの中の、10% 牛胎児
血清(FCS) 、Geneticin (800μg/ml) およびテストサン
プル用を1:1 で連続希釈した1%pen/strep(Gibco)を添加
したアルファ MEM(Gibco) に再配置した（1000個の細胞
/15ul 総容量／ウェル）。48時間後、ウェル当たりの生
存細胞数を顕微鏡で算定した。活性の1 ユニット(U)
を、ウェル当たり200 の生存細胞数をもたらす活性量と
定義した。アッセイにおいて、もしも5-10μg/mlのMpl-
X で完全にブロックされれば、その活性がMpl リガンド
に基づいているものと定義した。APK9中のMpl リガンド
活性は、形成不全性血漿では、平均4400+/-539 U/ml で
あった。特にことわらない限り、Mpl リガンド活性のユ
ニットは1A6.1 アッセイで定義されているとうりであ
る。ヒトMpl レセプター遺伝子（実施例3B）を導入され
た細胞のアッセイは、1A6.1細胞を用いた方法と基本的
に同様に行った。 実施例５ Mpl リガンドが、マウス、イヌ、ブタそしてヒトの 形成不全性の血漿や血清に存在することの証明 Mpl リガンドは、マウス、イヌ、ブタそしてヒトの形成
不全性の血漿や血清に存在している (表2)。前照射と12
日後の後照射(500ラド) を受けたBDF1マウスから、血漿
を採取した。血漿は1A6.1 アッセイによれば、2000 U/m
l の活性を示し、これは実質的にMpl-X(10ug/ml)で完全
に阻害された。照射を受けたマウスの血漿は、またヒト
巨核球のアッセイでもポジティブで、1833 U/ml の活性
を示した。前照射と10日後の後照射(450ラド）を受けた
イヌから、血漿を採取した。血漿を1A6.1 アッセイとヒ
ト巨核球アッセイの両法でテストした。活性は検出さ
れ、両アッセイにおいてMpl-X(10ug/ml)で完全に阻害さ
れた。前照射と10日後の後照射(650ラド) を受けたブタ
から、血漿を採取した。血漿を1A6.1 アッセイとヒト巨
核球アッセイの両法でテストした。両アッセイにおいて
Mpl リガンド活性（10μg/mlのMpl-X で阻害される）
は、形成不全性のイヌ血漿からの値に匹敵した。形成不
全性のヒトから血清を得た。この血清は骨髄移植患者か
ら集めた。6 名の患者からの血清を、1A6.1 アッセイで
みると、903 U/mlの活性を示したが、Mplリガンド活性
（10ug/ml のMpl-X で阻害される）は、その88% だっ
た。14名の形成不全性の患者から集めた血清も、ヒト巨
核球アッセイでテストした。それらは、群として、実質
的に活性941 meg U/mlを示したが、これは10ug/ml のMp
l-X で完全に阻害される量であった。1A6.1 アッセイの
特異性を証明するために、マウスIL-3のデータを挿入し
た。この組換型・ サイトカインは細胞系の生育を促進す
るが、10ug/ml のMpl-X でブロックされない。
【表２】
【０１９６】実施例６ Mpl リガンドは1A6.1 細胞の成長および巨核球の 発生分化を促進する Mpl リガンド（レクチンおよびアフィニティクロマトグ
ラフィーによって、少なくとも約100,000 倍に活性を強
化した; 実施例７を参照）は、1A6.1 細胞系の成長と、
CD34−選択末梢血細胞から巨核球への発生分化を、投与
量依存的に、促進する。両アッセイにおける活性はMpl-
X によって完全にブロックされるので、図2 と3 に示す
ように、活性の本体はMpl リガンドに起因する。
【０１９７】FACSで純化した末梢血CD34＋細胞を、Mpl
リガンド存在下でインキュベートすると（この場合、10
0 U/mlで9 日間）、表現型としては正常で成熟した巨核
球に分化することも、発明者らによって、すでに明らか
にされている。このことは、純化したMpl リガンドは巨
核球に対してクルードAPK9同じ効果を有することを立証
する。なお、CD34-選択細胞ではCD34＋の純度は一般に3
0-50%しかないのに対して、この実験では純化したCD34
＋細胞(100% CD34＋) を使った。
【０１９８】実施例７ イヌMpl リガンドの精製 I.概要 Mpl レセプターに対するリガンドと予想される活性を現
すタンパク質(25kd と31kd) を精製した。照射されたイ
ヌの血漿から、小麦胚芽凝集素(WGA) ・ アフィニティク
ロマトグラフィー、Mpl レセプター・ アフィニティクロ
マトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲ
ル濾過クロマトグラフィー、そしてC4逆相HPLCという手
順で、これらのタンパク質を精製した。この精製スキー
ムを一覧にまとめた図4 を参照せよ。25kdと31kdのMpl
リガンドは、見かけ上単一にまで高度に純化し、本明細
書に開示した各アミノ酸配列を含有することが確認され
た。 II. 方法 A.血漿の清浄化 照射されたイヌ（実施例 1を参照）の凍結血漿（全20リ
ットル）を、4 ℃で一夜かけて、解凍した; 大きいボト
ルを解凍する際、冷室に入れる前に室温に数時間放置し
た。不溶物は、11,000xg、6 時間の遠心分離によって除
去した。血漿は、リン酸塩でpHを7.3 にあわせた0.01%
アジ化ナトリウム含有生理食塩水(PBS/azide) で希釈
し、1.2μm のフィルターを通して濾過した。清浄化操
作によって、大体、スタート時の約2 倍に希釈された。 B.小麦胚芽凝集素アフィニティクロマトグラフィー 全操作は4 ℃で行った。清浄化血漿(2バッチ) を、PBS/
azide で平衡化した固定化小麦胚芽凝集素のカラム（１
リットル、10×12cm、E Y Laboratories）に加えた。サ
ンプルを添加後、非結合物質はPBS/azide でカラムから
洗い出し、続いて 0.5 M NaClを含む 20 mM Tris-HCl
(pH 8)で洗い出した。WGA カラムに結合したMpl リガン
ド活性は、0.35M N-アセチルグルコサミン(GLcNAc)と0.
5M NaClを含む 20mM Tris-HCl (pH 8) で溶出させた。M
pl リガンド活性は、フロースルーと洗浄フラクション
には検出されなかった。 C. Mpl-Xレセプター・ アフィニティクロマトグラフィー 用いた可溶性のマウスMpl レセプター(Mpl-X) は、Mpl
レセプターの細胞外ドメイン全体から483 位のTrp を減
じたものに相当した(Vigon, et al, 8: 2607-2615 (199
3)を参照) 。Mpl-X レセプター・ アフィニティカラムに
Mpl リガンドを最適に結合させるために、WGA 溶出プー
ルは、メンブレン・ ウルトラフィルター（分子量カット
オフ、10,000、 YM-10, Amicon) を用いて濃縮し、その
後の希釈によってNaCl濃度を0.2 M に調整した。濃縮し
たWGA プールは、20mlのm-Mpl-X(マウスMpl 可溶 性レ
セプター)/CNBr活性化セファロースカラム(2.6 x 4.2c
m,1.5mg m-Mpl-X/ml) に、流速0.9ml/min で通した。カ
ラムを40mlのPBS/azide 、流速1.5ml/min で洗い、続い
て405ml の高塩洗浄(10mM Tris-HCl, 1M NaCl, 1mMCHAP
S，pH 8.0) を行なった。その後、カラムは、20mM CAP
S, 1M NaCl, 5mM CHAPS (pH 10.5) で溶出させた。適当
なフラクションを集めた。pHを中和するために、各フラ
クションにはTrisを加えた。
【０１９９】SDS-PAGEおよび280nm の吸光度によるMpl-
X レセプター・ アフィニティカラムの溶出プロファイル
は、初期のタンパク質のピークをフラクション1-4 に示
すのに対して、Mpl リガンド活性の大部分はフラクショ
ン5 以降に溶出した。 D. Mono-Q 陰イオン交換クロマトグラフィー 数回のMpl-X レセプター・ アフィニティカラムにより得
た、最も純度の高いフラクションを合わせて、濃縮し、
そして20 mM Tris-HCl, 5 mM CHAPS (pH 8.7)によりダ
イアフィルトレーションした。最終液量は58.5mlだっ
た。プールのタンパク質濃度は、280nm の吸光度から、
0.12mg/ml （全タンパク質量は約 7mg）と概算した。こ
のプールを、20mM Tris-HCl, 5mM CHAPS(pH 8.7)で平衡
化したMonoQ HR 5/5 カラム (Pharmacia)に、0.5ml/min
でロードした。カラムは同バッファー中で、27分間
で、0.36M NaClまでの直線勾配で溶出させ、続いて6 分
間で、0.54M NaClまでの勾配で洗浄し、最後に0.9 M Na
Clで洗った。1ml づつのフラクションを集めた。
【０２００】Mono Qカラムの溶出プロファイルは、フロ
ースルーおよび洗浄フラクションには、Mpl リガンドが
全く検出されず、タンパク質もほとんど検出されないこ
とを示している。Mpl リガンド活性の多くは、最初のNa
Cl勾配において、フラクション5-7 に溶出している。活
性の“ショルダー" がフラクション8-10にみられ、続い
て2 番目の大きなピークがフラクション11-15 にみられ
る。
【０２０１】活性フラクションにおいて、SDS-PAGE（非
還元）により、はっきりした25kdのバンドがみられる。
バンドの強さは、フラクション中のMpl リガンド活性に
直接一致する。フラクション3 と4(活性はない) にはバ
ンドもなかった。バンドはフラクション5 と6(1A6.1 活
性ピーク) では特に目立ち、同じように強く染色された
バンドがフラクション11-14(1A6.1 活性ピーク) にあっ
た。フラクション15と16のプールはバンドも薄く、フラ
クション16の、明らかな低活性に一致する。 E.ゲル溶出実験 Mono Qフラクション5 と6 、およびMono Qフラクション
13と14のそれぞれ一部を用いて、ゲル溶出実験を行っ
た。この実験のために、フラクション5 と6 のプール
（各 6μl ）および13と14のプール（各 7.5μl)をつく
り、SDS-PAGEのサンプルバッファー（非還元）と混合
し、12%SDSゲルに加えた。電気泳動の終了直後、興味深
いレーンをスライスし(1mm) ，このスライスをカミソリ
の刃でさいころ状の小片にきざんだ。0.5ml PBS/5 mM C
HAPSの入った1.5ml のマイクロ除去(microfuge) チュー
ブに、この小片を移し、 4℃で一夜、穏やかに撹拌し
た。翌日、チューブを軽く振り、一部を取って、このサ
ンプルを、キャリアタンパク質としてBSA を添加したIs
cove培地に対してダイアフィルトレーションした。ダイ
アフィルトレーションしたサンプルをアッセイに供し
た。
【０２０２】結果として、Mpl リガンド活性の二つのピ
ークが観察できる。一つのピークはゲルの25kd域に一致
し、Mpl リガンド活性の二つ目のピークは31kd域にみら
れる。 F.Superdex 200ゲル濾過 Mono-Q陰イオン交換カラムからのフラクション13-16
を、2 回目のMono-Q分画の同じフラクションと合わせ
て、メンブレン・ ウルトラフィルター(Centricon-10, A
micon)を用いて濃縮した。SDS を終濃度0.1%になるよう
に加え、このサンプルをSuperdex 200HR 10/30 (Pharma
cia)カラムに注入した。カラムは流速0.3ml/min で、50
mM Tris-HCl, 0.1% SDS (pH 7.5)中で平衡化し、室温で
操作した。1分づつフラクションを集めた。結果とし
て、サンプル中のほとんどのタンパク質がフラクション
32-40 に溶出したのに対して、Mpl リガンド活性はフラ
クション42-46 に検出された。フラクションのSDS-PAGE
分析は、活性フラクションにはっきりした25kdバンドを
示した。 G.C4逆相HPLC Superdex 200フラクション43-46 を合わせて、およびフ
ラクション42は単独で、メンブレン・ ウルトラフィルタ
ー(Microcon-10, Amicon) を用いて濃縮した。この濃縮
したプールを、別々に、1 x 100mm C4逆相マイクロボア
(microbore) カラム(SynChropak RP-4) に加えた。カラ
ムは0.04% TFA 水（A バッファー）で平衡化しており、
B バッファーは80% アセトニトリル中0.035%TFA であっ
た。サンプルを注入後、4 分間で45%Bに上げる直線勾配
を実施し、続いて40分間で75%Bに上げる直線勾配を実施
した。流速は75μl/min であった。フラクション42の精
製結果を図5 に掲げる。フラクション21-23 にはっきり
したMpl リガンド活性のピークがみられた。これらのフ
ラクションを、還元および非還元条件下で、14% ポリア
クリルアミドゲルで分析した。フラクション21は単独の
31kdバンドからなり、フラクション23は単独でブロード
な25kdバンドからなり、フラクション22は25kdと31kdの
両バンドを含んでいた。他の明瞭なバンドは見えなかっ
た。先のゲル溶出実験で、Mpl リガンド活性がこれら両
部分にあったことを、思い起こして欲しい。単独でマイ
ナーな高分子量のバンドが、非還元ゲルの全フラクショ
ンにみられたが、還元ゲルでは見えなかった。 H.25kdおよび31kd MplリガンドのN-末端配列分析 活性を有するC4 RP-HPLCのフラクションについてN-末端
配列分析を行った。これらタンパク質の決定された配列
は上記に報告してある。25kdバンド（添加したサンプル
全体の少なくとも90% ）に相当する主な配列に加えて、
配列分析では二つのマイナーな配列（これらは上記のpa
rt Gで述べたマイナーなコンタミネートしたバンドに関
連している）を検出した。既知の配列との比較によっ
て、マイナーな配列はイヌIg重鎖とカッパー鎖（κ）で
あることが分かった。もし必要なら、これらのマイナー
な不純物は、他の精製ステップ、好ましくは例えばゲル
濾過ステップをもう一度行うと、量的にさらに減少させ
ることができる。 I. C4で精製したフラクションにおけるMpl リガンド活
性の比較 C4 RP-HPLCクロマトグラフィーのステップにおけるフラ
クション22と23にある活性は、実質的に同等であること
を示しているデータが図6 である。フラクション22は25
および31kdのバンドの混合物であるのに対し、フラクシ
ョン23は25kdバンドのみを含んでいる。各フラクション
の一部を45000 倍に希釈した。この希釈したフラクショ
ンは、1A6.1 細胞の成長を実質的に等しく促進した（フ
ラクション22がウェル当たり5400細胞; フラクション23
がウェル当たり6000細胞）。この希釈したフラクション
を種々の濃度のMpl-X と共にインキュベートした。フラ
クションはMpl-X による阻害に対して等しく感応し、両
フラクションは7-1.4 μg/ml量で完全にブロックされて
いた。これは、各フラクションにある活性タンパク質が
同等な生物学的活性を有するMpl リガンド種であること
を指し示している。
【０２０３】実施例８ 巨核球の発生分化における、Mpl リガンドと他のファク
ターの比較 多くの組換型ファクターやホルボールミリスティック・
アセテート(PMA) のような有機化合物は、巨核球の成長
や発生分化に、影響を与えると報告されている。それゆ
えに、CD34-選択末梢血細胞に対する、これらファクタ
ーの影響を調べた。ヒト・ 組換型・ インターロイキン3
(IL-3, 1-2 ng/ml)、幹細胞因子(SCF, 50ng/ml) 、イン
ターロイキン6(IL-6, 25 ng/ml) 、エリトロポイエチン
(EPO, 1Unit/ml)、白血球阻止因子(leukemia inhibitor
y factor; LIF, 10 ng/ml) 、そして顆粒球- マクロフ
ァージ・ コロニー- 刺激因子(GM-CSF, 25 ng/ml, Amge
n,Inc.);インターロイキン11(IL-11, 25ng/ml, R+D Sys
tems, Minneapolis, MN);ホルボール・ ミリスティック・
アセテート(PMA, 10−１０M, Sigma) を上記にしめし
たように、培地に加えた。Mpl リガンドは275 U/mlを、
APK9は5%(220 U/mlに等しい) を使った。ファクターを
組み合わせてテストする場合は、個々にテストした場合
と同じ濃度を使った。培養8 日後に、細胞はウェルに直
接固定し、巨核球を染色したり（条件当たりn=6 ウェ
ル）、あるいは全細胞数をカウントした（条件当たりn=
3 ウェル）。データは平均+/-SEMで表した。
【０２０４】図7 は、APK9とMpl リガンドが、ウェル当
たりの最大数の巨核球をもたらしたことを示している。
IL-3もまた、特にSCF との組み合わせにおいて、巨核球
の発生分化に効果を示した。IL-6、IL-11 、およびEPO
は、それぞれ単独でも、あるいはIL-3との組み合わせに
おいても、巨核球数にほとんど効果をもたなかった。PM
A 、LIF 、そしてGM-CSFもほとんど効果をもたなかっ
た。図8 は、同じ実験から得たデータであり、ウェル当
たりにみられた全細胞数（“セルラリティー”）を示し
ている。 APK9とMpl リガンドはセルラリティーにおい
てほとんど効果がないのに対し、IL-3とSCF はわずかに
効果をもっていた。SCF とIL-3の組み合わせは、最大の
効果をもっていた。図7 と8 に示したデータを使って、
ウェル当たりの巨核球をパーセントで表したものが、図
9 である。培地のウェル当たりの巨核球の最大パーセン
トをもたらしているファクターは、明らかに、APK9の活
性成分であるMpl リガンドである。これは、巨核球に対
するMpl リガンドの特異性を指し示している。
【０２０５】実施例９ Mpl リガンドの巨核球発生分化促進活性は、ヒトIL-3に
依存しない Mpl リガンドは、実施例 2に記述したように培地に添加
すると、ヒト巨核球の発生分化を促進する。IL-3は培地
の構成成分ではないが、培地に存在する正常ヒト血漿に
は検出できないぐらいの低レベルで含まれている。しか
し、もしあったとしても、IL-3は、Mpl リガンド- 誘導
性の造巨核球(megakaryopoiesis)にはかかわらない。こ
れを図10に示す。2ng/mlのIL-3は、ヒト・ メガ・ アッ
セイ(human meg assay) において、14,900 meg U/ml
の活性を持つ。この活性の97% が抗IL-3(3.3ug/ml;Genz
yme,Cambridge,MA) によって阻害される。8203 meg U/m
lの活性を持つMpl リガンドは、抗IL-3によって阻害さ
れなかった。
【０２０６】実施例１０ ブタMpl リガンドの分析 I.概要 WGA ・ アフィニティクロマトグラフィー、Mpl レセプタ
ー・ アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロ
マトグラフィー、そしてC4逆相HPLCによって、照射され
たブタの血漿から得た、Mpl リガンド活性をもつタンパ
ク質の特質を明らかにした。この活性の特質は、また、
SDS-ポリアクリルアミド・ ゲルにより得られたスライス
からの溶出によっても明らかにされた。クロマトグラフィー コメント WGA ・アフィニティカラム 添加 ; 4.4X106 U 。
【０２０７】
【０２０８】
【０２０９】 実施例１１ ヒトMpl リガンド、ヒトMGDFのクローニング 二つのアプローチのあらましを次に記述する。 I.一つ目のクローニングアプローチの実例 A.ヒトMGDFプローブの作製 多くの縮重したPCR プライマーを、イヌタンパク質のア
ミノ末端配列をもとに作った。ヒトゲノムDNA からMGDF
遺伝子を増幅させるために、いくつかのプライマーペア
を用いた。イヌタンパク質(SEQ ID NO: 1)の初めの5 ア
ミノ酸をコードしている、5' GCN CCN CCN GCN TGY GA
3'(SEQ ID NO: 4)をセンス・ プライマーとして、SEQ ID
NO: 1の16から21のアミノ酸をコードしている、5' GCA
RTG YAACAC RTG NGA RTC 3'(SEQ ID NO: 5) をアンチ
センス・ プライマーとして、40サイクルの増幅の後、PC
R 産物はTBE バッファー中の2.0%アガロース・ ゲルで泳
動した。
【０２１０】アガロース・ ゲルから63bpバンドを切り出
し、同じプライマーセットで再増幅した。このPCR 産物
を、PCR IIベクター(Invitrogen,San Diego)でクローニ
ングした。多数のコロニーをDNA シーケンシングにより
スクリーニングした。イヌMGDFタンパク質に類似したペ
プチドをコードするプラスミドDNA を、cDNAライブラリ
ーをスクリーニングする放射性プローブ作製のソースと
して用いた。遺伝子フラグメントによって、コードされ
たアミノ酸配列は次のとおりである: Ala-Pro-Pro-Ala-Cys-Asp-Leu-Arg-Val-Leu-Ser-Lys-Le
u-Leu-Arg-Asp-Ser-His-Val-Leu-His (SEQ ID NO: 6) ヒトMGDFを含むアガロースバンドをホットPCR によるプ
ローブ作製に用いた。典型的な100 μl のPCR 反応は、
次のような成分を含んである: テンプレートDNA 2-3 μl 5'プライマー(SEQ ID NO: 4) 1 μl, 20 pmoles 3'プライマー(SEQ ID NO: 5) 1 μl, 20 pmoles 10 X 緩衝液 10 μl dATP (0.1mM) 2 μl dTTP (10 mM) 2 μl dGTP (10 mM) 2 μl dCTP (0.1mM) 2 μl dCTP、 P32 (10 uC/ul) 5 μl dATP、 P32 (10 uC/ul) 5 μl Taq DNA ポリメラーゼ 0.5 μl, 2.5 units 水 77 μl 総量 100 μl 増幅条件は次のとおりである: 初期加熱 94℃, 2 min。
【０２１１】アニーリング 53℃, 30 sec。
【０２１２】伸長 72℃, 30 sec。
【０２１３】変性 94℃, 30 sec。
【０２１４】40サイクルの増幅は、Perkin Elmer GeneA
mp System 9600で行った。
【０２１５】産物はプッシュカラム(Stratagene, San D
iego) を通して精製した。1 μl のプローブを一つシン
チレイション・ カウンターでカウントした。ml当たり1-
3 百万カウントを含むプローブをハイブリダイゼイショ
ン・ ミックスに加えた。 B.胎児肝ライブラリーのコンストラクション ヒト胎児肝 polyA＋RNA は、Clontech laboratories か
ら購入した。約4 μgのRNA をcDNA合成に使った。ラン
ダムヘキサマー、5' GTA CGC GTT CTA GAN NNNNNT 3'(S
EQ ID NO: 7) を、Xba I サイトを含むオリゴに付け
て、プライミングを行った。 ダブルストランドのcDNA
作製には、Gibco-BRL のプロトコールを使った。Eco R
I-Bst X I アダプター（Invitrogen, San Diego ）をダ
ブルストランドのcDNAにライゲーションした後制限酵
素、Xba I でダイジェストした。cDNAのサイズ選択は、
S500 Sephacrylカラム (Life Technologies,Inc.) で
行った。400bp 以上のcDNAを、既にEco R I とXba I で
ダイジェストしてある哺乳動物の発現ベクター、 v19.8
（Martin,F., Cell 63:203-211(1990)）とライゲーショ
ンさせた。受容能力を持つE. coli DH10セルを形質転換
させ、得られたcDNAライブラリーは、100,000cDNA づつ
7 個のプールに分けた。 C.ラムダライブラリーのスクリーニング ラムダgt11に組み込まれた、力価 650×Ｐ106pfu/mlの
ヒト胎児腎ライブラリーを、Clontechから購入した。約
2×106プラークを、PCR で作製したプローブ（上記参
照）を用いて、スクリーニングした。ハイブリダイゼイ
ションは、6XSCC, 5 XDenhardt,0.1%SDS, 100 μg/mlの
シングルストランドサーモンスパーム（Salmon sperm）
DNA 中で、56℃、15時間、行った。何回かのスクリーニ
ングを行った。DNA はシングルプラークから増幅され、
SEQ ID NO: 6の7 から13のアミノ酸をコードしているイ
ンターナル・ プライマー5'AGT TTA CTG AGG ACT CGG AG
G 3'(SEQ ID NO: 8) と、ハイブリダイズされ、真にポ
ジティブと同定された。D.cDNA末端の3 プライム・ ラピ
ッド・ アンプリフィケイション(RACE) ヒト胎児腎および胎児肝からのポリアデニル化RNA は、
Clontechから購入した。オリゴ 5'TTC GGC CGG ATA GGC
CTT TTT TTT TTT TTT 3'(SEQ ID NO: 9) をプライマー
として用いて、1 μg のRNA を逆転写した。
【０２１６】ファーストストランドのcDNAを作製するた
め、 Gibco-BRL cDNA合成キット(Life Technologies,In
c., Cat.#18267-013)を用いた。最終容量は30μl だっ
た。500mM EDTAを終濃度10mMになるように加えて、反応
を止め、-20 ℃に保った。
【０２１７】イニシャルPCR では、反応当たりのテンプ
レートとして0.5 μlのcDNAを使った。SEQ ID NO: 6の
アミノ酸5 から11をコードしているオリゴヌクレオチド
5'TGC GAC CTC CGA GTC CTC AG 3'(SEQ ID NO: 11)をセ
ンス・ プライマーとして用いたのに対し、SEQ ID NO: 9
のプライマーと、オリゴ 5'TTC GGC CGG ATA GGC CTTTT
T TTT TTT TT-P 3'(SEQ ID NO: 10) のコンペティター
を、アンチセンス・ プライマーとして用いた。40サイク
ルの増幅は、次のプロトコールを用いて行った: 94℃で
予め2 分インキュベーションした後、94℃、30sec;65
℃、30sec;72℃、30sec 。増幅は、Perkin Elmer GeneA
mp System 9600で行った。ネスティング(nesting) は、
SEQ ID NO: 6のアミノ酸8 から14をコードしているセン
スプライマー 5'GAG TCC TCA GTA AAC TGC TTC GT 3'(S
EQ ID NO: 12) を用いて行ったが、 SEQ ID NO: 9 とSE
Q ID NO: 10 は、アンチセンス・ プライマーとして作用
した。65℃でアニーリングして、40サイクルの増幅を行
った。PCR産物は0.8%アガロースゲルで泳動し、UV光の
もとで撮影した。バンドは0.8 から1.2kb あたりに見え
た。
【０２１８】PCR 産物は、ベクターPCR II (Invitroge
n) でクローニングされた。それぞれのコロニーを取り
上げ、プラスミドはQiagenのキット、cat # 12143 およ
び12145 を用いて、単離した。ダブルストランドのダイ
プライムド(dye primed)・ シーケンシングは、ベクター
・ プライマーを用いて行った。シーケンスは種々のタイ
プのGCG ソフトウェアで分析した。 E.5'と3'のプライマー・ エクステンション 完全長MGDF遺伝子のシーケンスを単離するために、テン
プレートとして胎児肝ライブラリーの各プールを用い
て、3'と5'のプライマー・ エクステンションを行った。
cDNAの5 のプライマーを増幅させるために、各プールか
ら20ngのcDNAをテンプレートとして使った。SEQ ID NO:
6のアミノ酸12から17をコードしている、MGDFに特異的
なアンチセンス・ プライマー5'GGA GTC ACG AAG CAG TT
T AC 3'(SEQ ID NO: 13)と、5'ベクター v19.8センス・
プライマー5'CCT TTA CTT CTA GGCCTG 3'(SEQ ID NO：1
4) を用いた。53℃でアニーリングして、30サイクルの
増幅を行った。ネスティングは、SEQ ID NO: 6のアミノ
酸1 から6 をコードしているアンチセンス・ プライマー
5'GAG GTC ACA AGC AGG AGG A 3'(SEQ ID NO: 15) と、
ベクター・ プライマーSEQ ID NO: 14 用いて行った。
【０２１９】MGDF cDNA の3'末端のプライマー・ エクス
テションのために、アンチセンス・ベクター・ プライマ
ー 5'GGC ATA GTC CGG GAC GTC G 3'(SEQ ID NO: 16)
と、SEQ ID NO: 6のアミノ酸1 から6 をコードしている
MGDFに特異的なプライマー 5'TCC TCC TGC TTG TGA CCT
C 3'(SEQ ID NO: 17)を、用いた。58℃でアニーリング
して、30サイクルの増幅を行った。
【０２２０】MGDFプライマー SEQ ID NO: 12とベクター
・ プライマー SEQ ID NO: 16を用いて、30サイクルのネ
スティング増幅を行った。PCR IIベクターでクローニン
グされた、プール番号1 、7 および8 に、特異的なバン
ドが現れた。シングルコロニーから精製したプラスミド
は純化され、シーケンシングされた。 F.ヒトMGDFの完全長・ クローンの単離 部分的なMGDFシーケンスをプライミングとネスティング
に用いたので、はじめに取ったクローンの多くはMGDFの
アミノ末端部分を欠いていた。配列を上記の5のプライ
マー・ エクステンション実験で得た、プライマー5' CCA
GGA AGG ATT CAG GGG A 3'(SEQ ID NO: 18)をセンス・
プライマーとして使った。ベクター・ プライマー SEQ I
D NO: 16をアンチセンス・ プライマーとして使った。58
℃でアニーリングして、35サイクルの増幅を行った。Sa
l I サイトとして、MGDFに特異的なプライマー 5'CAA C
AA GTC GAC CGC CAG CCA GAC ACC CCG 3'(SEQ ID NO: 1
9)と、ベクター・ プライマー (SEQ ID NO: 15)を35サイ
クルのネスティングに使った。PCR 産物は、PCR IIベク
ターでクローニングされ、シーケンシングされた。 II. 二つ目のクローニングアプローチの実例 A.イヌMGDFのN-末端cDNAのクローニング 先のセクションに記述したように、縮重したオリゴヌク
レオチドプライマーを、イヌMGDFのＮ- 末端のアミノ酸
配列に基づいてデザインし、MGDFをコードしている cDN
A 配列を増幅させるためのポリメラーゼ・ チェイン・ リ
アクション(PCR) のプライマーとして使った。イヌ腎臓
サンプルから、Chomzynskiと Sacchiのグアニジン・
イソチオシアネート法(Biochem. 162: 156-159 (198
7)) によって、トータルRNA を調製した。ファースト・
ストランドのcDNAは、MoMULV逆転写酵素を用いて、ラン
ダム・ プライマー・ アダプター 5' GGC CGG ATA GGC CA
C TCN NNN NNT 3'(SEQ ID NO: 20) で調製し、次に続く
PCR のテンプレートとして使った。
【０２２１】SEQ ID NO: 1 のアミノ酸1-6 をコードし
ているセンス・ ストランド・ プライマーであるプライマ
ーA 5' GCN CCN CCN GCN TGY GA 3'(SEQ ID NO: 4)と、
SEQID NO: 1のアミノ酸16-21 をコードしているアンチ
センス・ ストランド・ プライマーでありアニール時の安
定性を増強するために5'末端に3 つのエキストラ・ ヌク
レオチドをもっているプライマーB 5' GCA RTG NAG NAC
RTG NGA RTC 3'(SEQID NO: 5) 、またはプライマーC
5' GCA RTG YAA NAC RTG NGA RTC 3'(SEQ ID NO: 21)を
用いて、0.5 μl 、約50ngのcDNAで、PCR を行った。Ta
q ポリメラーゼを用いるPCR は、アガロース・ ゲル電気
泳動分析で産物のバンドが見えるまで、35-45 サイク
ル、行った。初めの2 サイクルのPCR は、再アニーリン
グステップを37℃で、2 分間、行った；あとのサイクル
は、再アニーリングは、50℃で、1分間だった。各反応
において、多重の産物のバンドが見られた。およそ予想
されるサイズ(66bp)のバンドを含んでいるゲルの部分を
パスツールピペットのチップで集め、同じプライマー・
ペアで再増幅させた。DNA 産物を、製造社のインストラ
クションにしたがって、ベクターPCR II(Invitrogen)に
クローニングした。3つのクローンがシーケンスされ、1
つのリーディング・ フレームに、予想されたイヌMGDF
配列の1-21残基をコードすることが分かった。この方法
で、コドン6 の3 番目のヌクレオチドから、コドン15の
3 番目のヌクレオチドまで、領域にわたる、ユニークな
イヌMGDF cDNA を得た。これらクローンの１つを、イヌ
MGDF cDNAのラベル化プローブを調製するためのテンプ
レートとして使った。 B.ヒト胎児肝からのcDNAライブラリーのコンストラクシ
ョン ヒト胎児肝(International Institute for the Advance
ment of Medicine, Exton, PA)から、5.5Mグアニジン・
イソチオシアネートによる組織の溶解およびCsTFA(Phar
macia)遠心分離を経る精製によって、RNA を単離した。
ポリアデニル化RNA は、オリゴ(dT)２５ダイナビーズ(d
ynabeads) (Dynal、製造社の指示にしたがった）を用い
て選択した。ダブルストランドのcDNAを、cDNA合成用 S
uperscript plasmid system (Life Technology, Inc.)
を用いて、このRNA から作った。ただし、別のリンカー
・アダプター：5' TTG GTG TGC ACT TGT G 3'(SEQ ID N
O:22)および5' CAC AAG TGC ACA CCA ACC CC 3' (SEQ I
D NO: 23)を使った。サイズ・セレクションした後、哺
乳動物発現ベクターpBCB（pBCBはプラスミド Rc/CMV か
ら誘導された、Invitrogen，puc19 バックボーン、CMV
プロモーター、BGHポリアデニレーション・サイトを含
んでいる）のBst XIおよびNot I サイトに、このcDNAを
直接挿入した。ライゲートされたDNA はエレクトロ・コ
ンピーテント・バクテリア株10B(Life Technology, In
c.)にエレクトロポアレートされた。 C.MGDFのためのヒト胎児肝cDNAライブラリーのスクリー
ニング ヒト胎児肝cDNAライブラリーのフィルター・レプリカ
を、イヌMGDF N- 末端cDNAの放射活性なラベル化PCR 産
物（5x SSPE, 2x Denhardt's, 0.05% Na pyrophosphat
e, 0.5% SDS, 100μg/ml yeast tRNA lysate and 100μ
g/ml denatured salmon sperm DNA ）と、64℃で、18時
間ハイブリダイズさせた。フィルターは64℃で、5x SSP
E, 0.5% SDS で洗い、一夜感光させた。このプローブと
ハイブリダイズしている２つの異なったクローンが単離
され、分析された。 D.ヒトMGDFのcDNAクローンの発現 MGDF cDNA クローンから精製されたDNA を、293 EBNAセ
ル (Invitrogen)に、遺伝子導入した。1.5 μg のDNA
を7.5ul のLipofectamine (Life Technology,Inc.)
と、100ul の血清 フリーのDMEM中で、混合した。室温
で20分インキュベートした後、このDNA-Lipofectamine
混合物を、400ul のDMEM、1%血清(Fetal Clone II)中の
5×105 細胞／ウェル（24ウェル・スクエマのGreiner
plate)に加え、37℃で6 時間インキュベートした。500
ul のDMEM、20％血清(Fetal CloneII)をこれらの細胞に
加えた。16時間後、培養液を吸い取り、500ul のDMEM、
1％血清(Fetal Clone II)を加えた。72時間後、順化培
地を集め、0.22ミクロンのスピン・フィルターを通し
て、遠心分離した。この順化培地をMGDFの生物学的活性
についてアッセイした。 III.ヒトMGDFクローンの説明と活性 上記のクローニング・ストラテジーに基づいて、図11
（MGDF-1およびMGDF-2:SEQ ID NOS: 24、25；および2
6、27）と図12（MGDF-3; SEQ ID NOS: 28、29）に示し
たヒトcDNAクローンを得た。図のこれら配列の各々は、
アミノ酸1-21の推定されるシグナル・配列を含み、どの
場合にも成熟したタンパク質はアミノ酸22から始まる。
【０２２２】上記、実施例４Ａに記述した、細胞に基づ
くアッセイを用いて、MGDF1-3 の活性をアッセイした結
果を下記の表3 および4 に掲げた。表3 では、各コンス
トラクトを遺伝子導入された 293 EBNAセルから、培養
2 日後に順化培地を集め、1A6.1 細胞(32D/mur-MPL+)+/
-10ug/ml mur-MPL-Xでテストした。表4 では、各コンス
トラクトを遺伝子導入された293 EBNAセルから、培養4
日後に順化培地を集め、32D/mur-MPL+細胞（実施例３
Ａ）および32D/hu-MPL+ 細胞（実施例３Ｂ）でテストし
た。見れば分かるように、ヒトMGDF-1とMGDF-2は、マウ
スおよびヒト型のMpl を発現している細胞系に活性であ
り、MGDF-3は活性でない。マウスMPL レセプターを発現
している細胞系よりも、ヒトMPL レセプターを発現して
いる細胞系は、ヒトMGDF-1とMGDF-2によく感応する。
【表３】
【０２２３】
【表４】
【０２２４】次の表5 は、32D/hu-MPL+ 細胞（実施例 3
B ）に対するヒトMGDF-1とMGDF-2の活性は、可溶性のヒ
トmpl レセプター（hu- MPL-X ）で、実質的に、完全に
阻害されることを示している。Hu-MPL-Xは、タンパク質
を産生しているCHO 細胞から集めた順化培地として存在
した。CHO hu-MPL-X順化培地を120 倍に濃縮し、培養に
6.6 ％になるように加えた。コントロールのCHO 培養か
らの順化培地は、アッセイに効果はなかった。アッセイ
は、生き残った細胞を3 日後に評価したこと以外は、実
施例4Bに記述したように行った。
【表５】
【０２２５】ヒト巨核球アッセイ MGDF-1とMGDF-2は、末梢血CD34- 選択細胞からの巨核球
形成を誘導し、MGDF-3は誘導しなかった。表6 に示した
実験は、末梢血細胞を水簸せずにCD34- 選択したこと
と、培養を7 日後に収集したこと以外は、基本的に実施
例2 に記述したように行った。各293 EBNA MGDF コンス
トラクトからの順化培地は、最終20％ボリューム+/-30u
g/ml mur-MPL-Xで使った。APK9コントロールは、最終6
％ボリュームで使った。
【表６】
【０２２６】実施例１２ この実施例では、12種のPEG 化(pegylated) MGDF分子、
PEG9-PEG12とPEG14-PEG21 の合成について記述する。各
ケースにおいて、PEG 化されたMGDF分子は、E.coli 由
来のMGDF-11(シグナルペプチドの始まりから数えてアミ
ノ酸22-184、あるいは成熟したタンパク質の始まりから
数えてアミノ酸1-163)である。これら全てのPEG 化種に
関する詳細は、下記の表7-10に概略してある。 12.1 MGDF を活性化MePEG 誘導体でアシル化した、poly
-MePEG-MGDF コンジュゲートの調製 poly-MePEG(20kDa)-MGDF コンジュゲート(PEG11) の調
製 0.1M BICINE バッファー、pH8 中の冷却した(4℃)MGDF
(2.5 mg/ml)溶液を、10倍モル過剰の固形 MePEGスクシ
ンイミジルプロピオナート(MW 20kDa)(Shearwater Poly
mers, Inc.) に加えた。ポリマーを穏やかな撹拌によっ
て溶解し、反応は室温でさらに続けた。
【０２２７】反応中におけるタンパク質の修飾度合い
は、 Superdex 200 HR 10/30カラム(Pharmacia Biotec
h) を用いた、サイズ排除 (SEC) HPLCによってモニタ
ーした。溶離は、0.1Mリン酸ナトリウムバッファー、pH
6.9 を用いて、流速0.7ml/min で行った。30分時点での
反応混合物のSEC HPLC分析は、反応混合物中にフリーの
タンパク質は残っていないことを示した。この時点で反
応混合物のタンパク質濃度を、滅菌水を加えて、1mg/ml
に下げ、数滴の0.5M酢酸を滴下して混合物のpHを4 に調
整した。
【０２２８】MePEG-MGDFコンジュゲートは、SP Sepharo
se HP (Pharmacia Biotech) イオン交換樹脂を用いたイ
オン交換クロマトグラフィーによって、過剰のMePEG と
他の反応副生物から分離させた。反応混合物をカラムに
ロード(2.5 mg/ml（樹脂）) した。未反応のMePEG は、
3 カラム容量のスタートバッファーA(20mMリン酸ナトリ
ウム、pH7.2 、15% グリセロール) で溶出させた。その
後、MePEG-MGDFコンジュゲートを、10カラム容量で、エ
ンドバッファーＢ（バッファーＡ中、 1M NaCl）の、0%
から30% の直線勾配を用いて溶出させた。溶出液は280n
m でモニターした。poly-MePEG-MGDF コンジュゲートを
含んでいるフラクションをプールし、濃縮、滅菌濾過し
た。
【０２２９】精製したpoly-MePEG-MGDF コンジュゲート
は、TSK-GEL G4000SWXL とG2000SWXL のゲル濾過カラム
を連結した、HPLC SECで、分析した。タンパク質は280n
m におけるUV吸収によって検出した。球状タンパク質の
分子量マーカーとして、BIO-RAD ゲル・ フィルトレーシ
ョン・ スタンダードを使った。
【０２３０】図17A に見られるように、HPLC SECでは、
調製物には二つの主な成分( およそ2 対1 の割合) が含
まれており、その溶出位置は、それぞれ、370.9kDaと15
5.0kDaの球状タンパク質に相当した。下記の表8 を参照
せよ。
【０２３１】MW=6-50kDaのMePEGsのスクシンイミジル・
エステルによる、MGDFのアシル化で調製した、コンジュ
ゲートPEG9、PEG10 およびPEG12 も同じように行った。
これらの調製に用いた主な反応パラメータは、表7 に要
約してある。
【０２３２】これらのコンジュゲートのHPLC SEC分析の
結果は、表8 に示してある。 12. 2 MGDFをMePEG アルデヒドで還元的アルキル化する
ことによる、poly-MePEG-MGDF コンジュゲートの調製 poly-MePEG(20kDa)-MGDF コンジュゲート(PEG20) の調
製 20mM NaCNBH３ を含む、100mM リン酸ナトリウム、pH
5 、中のMGDF(2ml, 2.5mg/ml) 冷却(4℃) 、撹拌溶液
に、10倍モル過剰のモノメトキシ−ポリエチレングリコ
ールアルデヒド（平均分子量 20kDa）を加えた。反応混
合物の撹拌は、同じ温度で続けた。
【０２３３】反応中におけるタンパク質の修飾度合い
は、 Superdex 200 HR 10/30カラム(Pharmacia Biotec
h) を用いた、SEC HPLCによってモニターした。溶離は
0.1Mリン酸ナトリウムバッファー、pH6.9 を用いて、流
速0.7ml/min で行なった。
【０２３４】16時間後、SEC HPLC分析は、タンパク質の
初めの量の90% 以上が修飾されていることを示した。こ
の時点で反応混合物のタンパク質濃度は、反応混合物を
滅菌水で希釈することによって、1mg/mlに下げ、0.5M酢
酸で混合物のpHを4 に調整した。
【０２３５】MePEG-MGDFコンジュゲートは、SP Sepharo
se HP (Pharmacia Biotech) イオン交換樹脂を用いたイ
オン交換クロマトグラフィーによって、過剰のMePEG と
他の反応副生物から分離させた。
【０２３６】反応混合物をカラムにロード(2.5 mg/ml
（樹脂）) した。未反応のMePEG は、3 カラム容量のス
タートバッファーA(20mMリン酸ナトリウム、pH7.2 、15
% グリセロール) で溶出させた。その後、MePEG-MGDFコ
ンジュゲートは、10カラム容量で、エンドバッファーＢ
（バッファーＡ中、1M NaCl ）の、0%から30% の直線勾
配を用いて溶出させた。溶出液は280nm でモニターし
た。poly-MePEG-MGDF コンジュゲートを含んでいるフラ
クションをプールし、濃縮、滅菌濾過した。
【０２３７】精製したpoly-MePEG-MGDF コンジュゲート
は、TSK-GEL G4000SWXL とG2000SWXL のゲル濾過カラム
を連結した、HPLC SECで、分析した。タンパク質は280n
m におけるUV吸収によって検出した。球状タンパク質の
分子量マーカーとして、BIO-RAD ゲル・ フィルトレーシ
ョン・ スタンダードを使った。
【０２３８】図17B に見られるように、HPLC SECでは、
調製物には二つの主な成分（全量の52% と47% ）が含ま
れており、その溶出位置は、それぞれ、359.4kDaと159.
3kDaの球状タンパク質に相当した。表8 を参照せよ。
【０２３９】MW=6-25kDaのMePEG アルデヒドによる、MG
DFの還元的アルキル化で調製した、コンジュゲートPEG1
8 、PEG19 およびPEG21 も同じように行った。これらの
調製に用いた主な反応パラメータは、表7 に要約してあ
る。
【０２４０】これらのコンジュゲートのHPLC SEC分析の
結果は、表8 に示してある。 12. 3 N-末端α−アミノ基に付着部位を有する、モノメ
トキシ−ポリエチレングリコールMGDFコンジュゲートの
調製 mono-MePEG(20kDa)-MGDF コンジュゲート(PEG16) の調
製 20mM NaCNBH３ を含む、100mM リン酸ナトリウム、pH
5 、中のMGDF(2 ml,2.5 mg/ml)冷却(4℃) 、撹拌溶液
に、5 倍モル過剰のメトキシポリエチレングリコールア
ルデヒド(MePEG)(平均分子量 20kDa) を加えた。反応混
合物の撹拌は、同じ温度で続けた。
【０２４１】反応中におけるタンパク質の修飾度合い
は、 Superdex 200 HR 10/30カラム(Pharmacia Biotec
h) を用いた、SEC HPLCによってモニターした。溶離は
0.1Mリン酸ナトリウムバッファー、pH6.9 を用いて、流
速0.7ml/min で行った。
【０２４２】16時間後、SEC HPLC分析は、タンパク質の
初めの量の約90% が修飾されていることを示した。この
時点で反応混合物のタンパク質濃度は、滅菌水で希釈す
ることによって、1mg/mlに下げ、0.5M酢酸で反応混合物
のpHを4 に調整した。
【０２４３】mono-MePEG(20kDa)-MGDFコンジュゲート
は、 SP Sepharose HP(Pharmacia Biotech) イオン交換
樹脂を用いたイオン交換クロマトグラフィーによって、
過剰のMePEG と他の反応副生物から分離させた。
【０２４４】反応混合物をカラムにロード(2.5 mg/ml
（樹脂）) した。未反応のMePEG は、3 カラム容量のス
タートバッファーA(20mMリン酸ナトリウム、pH7.2 、15
% グリセロール) で溶出させた。その後、MePEG-MGDFコ
ンジュゲートは、20カラム容量で、エンドバッファーＢ
（バッファーＡ中、 1M NaCl）の、0%から25% の直線勾
配を用いて溶出させた。溶出液は280nm でモニターし
た。poly-MePEG-MGDF コンジュゲートを含んでいるフラ
クションをプールし、濃縮、滅菌濾過した。
【０２４５】mono-MePEG-MGDF コンジュゲートの均質性
は、4-20% のプレキャスト・ 勾配・ゲル(NOVEX) を用い
たSDS-PAGE（ナトリウム・ドデシル・スルファート・ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動）で判定した。46.9kDa
のタンパク質の位置に相当する、1 本のメジャーバンド
が現れた。
【０２４６】精製したpoly-MePEG-MGDF コンジュゲート
は、TSK-GEL G4000SWXL とG2000SWXL のゲル濾過カラム
を連結した、HPLC SECで、分析した。タンパク質は280n
m におけるUV吸収によって検出した。球状タンパク質の
分子量マーカーとして、BIO-RAD ゲル・ フィルトレーシ
ョン・ スタンダードを使った。
【０２４７】図17C に見られるように、HPLC SECでは、
調製物には一つの主な成分が含まれており、その溶出位
置は、181.1kDaの球状タンパク質に相当した。表9 を参
照せよ。
【０２４８】MW=6-25kDaのMePEG アルデヒドによる、MG
DFの還元的アルキル化で調製した、mono-MePEG-MGDF コ
ンジュゲートPEG14 、 PEG15 およびPEG17 も同じよう
に行った。これらの調製に用いた主な反応パラメータ
は、表7 に要約してある。
【０２４９】これらのコンジュゲートのHPLC SEC分析の
結果は、表9 に示してある。
【表７】
【０２５０】
【表８】
【０２５１】
【表９】
【０２５２】12. 4 MGDFをメトキシ−ポリ（エチレング
リコール）アルデヒドで還元化アルキル化することによ
る、DiMePEG(12kDa)-MGDF コンジュゲート(PEG22) の調
製 次の操作によって、本明細書でPEG22 と称する、精製さ
れた分子を得た。
【０２５３】5 ℃に保った100mM 酢酸ナトリウム、pH5
中の、2.5 mg/ml のMGDF(E. coli由来、1-163)溶液に、
5 倍過剰モルのメトキ シ−ポリエチレングリコールア
ルデヒド（MePEG; i.e., OHC- （CH2 ）2 O -(CH2 -
CH2 O)ｎ - CH3 ; ここでｎは、分子量が約12kDa
となる繰り返し数である）(Shearwater Polymers) を加
えた。10分間混合した後、十分量のNaCNBH3 （ナトリ
ウム−シアノボロヒドリド）(Aldrich) を、反応混合物
中の濃度が20mMになるように、加えた。
【０２５４】この混合物をおよそ5 ℃で、16時間、撹拌
した。16時間経過後、十分量の純水、USP を加えて、MG
DF濃度を1mg/mlにした。これを0.2 ミクロンの減圧・ フ
ィルターを通して濾過した。このようにして、90mgの反
応生成物を調製した。少量の1.0M−塩基性ホスファート
(monobasic phosphate) と1N NaOH 溶液を、この反応生
成物の混合物に加えて、pH6.8 、10mMのホスファート溶
液にした。
【０２５５】コンジュゲートは、陽イオン交換カラムで
精製した。40mlのSP-Sepharose High Performance カラ
ムを、ベッド高7.5cm で、作成した。カラムは、平衡化
バッファー(10mM ホスファート、pH6.8 、15% グリセロ
ール) で平衡化しておいた。カラムに、2.2 mg/ml （樹
脂）、 0.15CV(カラムボリューム)/分でロードした。ベ
ースラインが安定するまで平衡化バッファーで洗浄し
た。カラムは、バッファーA(20mMホスファート、pH7.2
、15% グリセロール) からバッファーＢ（バッファＡ
中、 0.3M NaCl）への、10カラム容量の直線勾配で溶出
させた。流速は 0.15CV（カラムボリューム）／分を維
持した。溶出液は280nm でモニターした。
【０２５６】SDS-PAGEゲルでフラクションを調べ、DiPE
G コンジュゲートを含んでいるフラクションをプール
し、0.2 ミクロン・ユニットを通して濾過した。
【０２５７】実施例１３ PEG 化MGDF分子の生物学的活性 A. PEG-9 - PEG-12 そして PEG-14 - PEG-21 組換型・ ヒトMGDFを処方されたマウスの血小板数を測定
した、その結果は図18に掲げる。図の記述に指示された
濃度で、CHO 由来22-353（オープンダイヤモンド）、非
PEG 化E.coli22-184（オープンサークル）、そしてPEG
化E.coli22-184（クローズドサークル）の各MGDFを、5
日間、毎日1 回、正常Balb/cマウスに皮下投与した。最
終投与の24時間後、尾静脈の側方を小さくカットして、
出血検体を集めた。血球の分析はSysmexエレクトロニッ
ク・ ブラッド・ セル・ アナライザー(Baxter Diagnostic
s, Inc. Irvine, CA) で行った。データは4 検体の測定
の平均と、+/- 平均標準誤差で表した。総白血球数や赤
血球数のような他の血球パラメータは、この処理で影響
を受けなかった。
【０２５８】組換型・ ヒトMGDFの他のフォームも上記の
ようにテストした。指定したフォームの r-HuMGDF を50
ug/kg/day または10ug/kg/day で処理されたマウスの血
小板数を、次の表10に示してある。データは4 検体の平
均で、平均標準誤差はイタリックで表した。
【表１０】
【０２５９】表10の手引き 上記実施例１２に記述したように、次のそれぞれにおい
て、PEG 化されたMGDF分子は、E. coli 由来のMGDF-11
(シグナルペプチドの始まりから数えてアミノ酸22-18
4、あるいは成熟したタンパク質の始まりから数えてア
ミノ酸1-163)である:
【表１１】
【０２６０】基準値は、何らの物質も投与されていな
い、正常検体からのものである。
【０２６１】組換型・ ヒトMGDFのPEG 化は、実験個体の
血小板数を上げるというこの分子の能力に不利な影響を
与えないことは明らかであり、事実、E. coli 生成物22
-184の活性を上げており、CHO-由来の22-353分子で見ら
れる活性と、同等もしくは上回ると見てよい。 B. PEG-22 PEG-22で得た結果を図24に掲げる。とりわけ、PEG-22に
よる血小板数の正常化は、完全長のCHO-由来MGDF、PEG-
16、あるいはPEG-17よりも、数日も早く起こっている。
【０２６２】実施例１４ 組換型・ ヒトMGDF[1-163] のE. coli での発現 r-HuMGDFをE. coli で発現させるために、成熟タンパク
質の初めの163 アミノ酸をコードしているシーケンス
を、E. coli の最適コドンを使って、化学的に合成し
た。付け加えて、アミノ酸のメチオニンとリジンをコー
ドしているDNA シーケンスを、ジーンの5'末端に加え
た。したがって、このシーケンスがコードしているr-Hu
MGDFタンパク質は、Met-Lys で始まる全長165 アミノ酸
で成っている。このジーンのシーケンスは図25に示して
ある。
【０２６３】r-HuMGDF(1-163) ジーン遺伝子の合成は、
数ステップで達成した。最初に、ジーンの隣接フラグメ
ントに相当する相補的オリゴヌクレオチド (長さ60-70b
p)を、E. coli の最適コドンを使って、化学的に合成し
た。この合成に際して、アミノ酸のメチオニンとリジン
のコドンを、成熟遺伝子の5'末端に置き、ストップ・コ
ドンをジーンの3'末端に置いた。さらに、制限酵素XbaI
と HindIIIの切断サイトを、それぞれ、ジーンの末端の
5'と3'に置き、合成リボゾームの結合部位を、初めのメ
チオニンの上流の、適した場所に置いた。次ぎに、各ジ
ーン・ フラグメントの相補的なオリゴヌクレオチドをア
ニールした。3 番目に、これら個々の合成ジーン・ フラ
グメントを、ポリメラーゼ・ チェイン・ リアクションを
用いて増幅させた。4 番目に、増幅させたフラグメント
を適当なベクターにサブクローニングした。5 番目に、
サブクローニングしたフラグメントのシーケンスを確認
した。6 番目に、完全長のr-HuMGDF(1-163) ジーンをリ
コンストラクトできるように、個々のフラグメントを一
斉にライゲートし、適当なベクターにサブクローニング
した。最後に、リコンストラクトしたジーンのシーケン
スを確認した。
【０２６４】5'と3'末端において、それぞれ、XbaIと H
indIIIの制限部位に隣接している、合成r-HuMGDFジーン
・ フラグメントは、リボゾーム結合部位、ATG スタート
・ コドン、成熟したMet-Lys r-HuMGDFタンパク質をコー
ドしているシーケンス、そしてストップ・ コドンを持っ
ている。
【０２６５】上記のフラグメントを、ラクトース- イン
デューシブル発現ベクターであるpAMG11のXbaIおよび H
indIIIの両サイトにクローニングした。 pAMG11 ベクタ
ーは、pR100-由来の複製起点を持つ、低コピー数のプラ
スミドである。発現プラスミドpAMG11は、PCR 重複オリ
ゴ・ 変位誘発による、一連の部位特異的な塩基変換を作
ることによって、プラスミドpCFM1656(ATCC# 69576，19
94.2.24 供託) から、誘導することができる。プラスミ
ド複製プロモーターPcopB の5'に近接したBglII サイト
（plasmid bp # 180）から始め、プラスミド複製ジーン
に向かうことにより、塩基対の変換は次のようになる:
【表１２】
【０２６６】そして、ユニークなAatII とClaIの切断サ
イト間のDNA シーケンスを、次のオリゴヌクレオチドで
置換すると:
【表１３】
【０２６７】pAMG11にクローニングされたr-HuMGDFの発
現は、以下のシーケンスをもつPs4のような、合成ラク
トース- インデューシブル・ プロモーターによって、推
進される: 5' GACGTCTCATAATTTTTAAAAAATTCATTTGACAAATGCTAAA- -ATTCTTGATTAATATTCTCAATTGTGAGCGCTCACAATTTATCGAT 3'
(SEQ ID NO:34) このPs4 プロモーターは、E. coli lacIジーンの産生物
であるラクトース・ リプレッーサー(LacI)によって、抑
制される。
【０２６８】pAMG11-r-HuMGDF プラスミドは、続いてla
cIｑアレルを含んでいる E. coli K-12 株に形質転換さ
れる。lacIｑアレルは、LacIの発現を増大するlacIプロ
モーター内の変異であり、Ps4 プロモーターからタンパ
ク質の発現のより厳密なコントロールをもたらす。した
がって、この株では、ラクトースがなければ、r-HuMGDF
の発現はLacIによって抑制される。ラクトースを加える
と、Ps4 プロモーターのオペレーター・ サイトに結合し
ているLacIタンパク質が減少し、Ps4 からr-HuMGDFの転
写が始まる。この実施例に使ったE. coli ・ ホスト・ セ
ルは、ATCC# 69717 として、1994.11.30に供託してあ
る。
【０２６９】E. coli ・ ホストATCC# 69717 は、pAMG11
-r-HuMGDF プラスミドで形質転換し、次のような発酵手
法にしたがって、生育させた。Luria 肉汁にイノキュレ
ートされたE. coli 株は、およそ12時間、30℃でインキ
ュベートされる。セルはその後、無菌的にバッチ・ 培地
（20 g/Lイースト・ エキス; 3.4 g/L クエン酸; 15 g/L
K2HPO4 ; 15 ml Dow P2000; 5 g/Lグルコース; 1 g/L
MgSO4・7H2O; 5.5 ml/L 微量金属類; 5.5 ml/Lビタミ
ン類) の入った発酵槽に移される。バッチ・ フェイズの
プロセスは培養が、600nm で5.0+/-1.0 の最適密度に達
するまで続く。流加培養 (fed-batch)・フェイズは、第
１の流動培地（feed medium）(700 g/Lグルコース；
6.75 g/L MgSO4・7H2O)の供給開始で、始められる。流
量は確立されたスケジュールにあわせて2 時間毎に調節
する。培養が600nm で20-25 の最適密度に達すると、第
2 の流動培地(129 g/Lトリプチカーゼ・ ペプトン; 258
g/Lイースト・ エキス) の供給開始が始まる。初めの流
動培地が調節され続けたのに対し、第2 の流動培地は、
一定流量を維持する。全発酵中を通じて、温度はおよそ
30℃を維持する。培養は、必要に応じて、酸や塩基を添
加してpHを7 に維持する。望ましい溶存酸素レベルを、
発酵槽のアジテーション、空気注入および酸素注入の各
速度を調節して維持する。培養の最適密度が600nm で57
-63 に達すると、第3 の流動培地の供給が始まる。第3
の流動培地（300 g/L ラクトース）は一定流量で発酵槽
に導入される; 第１の流動培地の供給は中止し、第2 の
流動培地の流量は新たな一定流量に変える。発酵は第3
の流動培地の供給が始まってから、およそ10時間で終わ
る。発酵の終わりに、培養は15+/-5℃に冷却する。セル
は遠心分離によって収集される。得られたペーストは、
−60℃以下でパックしたまま、保存する。
【０２７０】上記のようにE coliで産生した組換型・MG
DFの精製は次のように行った。1,800gのセル・ ペースト
を約18リットルの 10mM EDTAに懸濁させ、15,000psi で
高圧ホモジナイザーに通した。破砕されたセル懸濁液を
遠心分離し、得られたペレット10リットルの10mM EDTA
に再懸濁させた。懸濁液を遠心分離し、得られた 200g
のペレットを2 リットルの10mM Tris 、8Mグアニジン塩
酸塩、10mMDTT 、5mMEDTA、pH8.7 に溶解させた。この
溶液を、200 リットルの10mM CAPS 、3M尿素、30% グリ
セロール、3mM シスタミン、1mM システイン、pH10.5で
穏やかに希釈した。
【０２７１】希釈した溶液を室温で16時間、穏やかに撹
拌し、pHを6.8 に調節した。pHを調節した溶液を清浄化
して、10mMリン酸ナトリウム、1.5M尿素、15% グリセロ
ール、pH6.8 で平衡化した2 リットルの CM Sepharose
カラムに加えた。ロード後、カラムは10mMリン酸ナトリ
ウム、15% グリセロール、pH7.2 で洗った。MGDFは0か
ら0.5MのNaClの勾配、10mMリン酸ナトリウム、 pH 7.2
で溶出させた。
【０２７２】CM溶出液は、分子量10,000カットオフメン
ブレンを用いて、濃縮し、10mMリン酸ナトリウム、pH6.
5 にバッファー交換した。約2mg/mlに濃縮した溶液をカ
テプシン C（500:1 のモル比）で室温、90分間処理し
た。
【０２７３】この溶液を、10mMリン酸ナトリウム、15%
グリセロール、pH7.2 で平衡化した1.2 リットルの SP
High Performance Sepharoseカラムにロードした。ロー
ド後、MGDFは0.1 から0.25M のNaClの勾配、10mMリン酸
ナトリウム、pH7.2 で溶出させた。
【０２７４】SP High Performance カラムからの溶出液
に、0.6Mになるように硫酸アンモニウムを加えた。この
溶出液を、10mMリン酸ナトリウム、0.6M硫酸アンモニウ
ム、pH7.2 で平衡化した1.6 リットルのPhenyl Toyopea
rl カラムにロードした。MGDFピークは0.6 から0Mの硫
酸アンモニウムの勾配、10mMリン酸ナトリウム、pH7.2
で溶出させた。
【０２７５】Phenyl Toyopearl溶出液は、分子量10,000
カットオフメンブレンを用いて、濃縮し、10mM Tris 、
5%ソルビトール、pH7.5 にバッファー交換した。
【０２７６】実施例１５ r-HuMGDF (E. coli 1-163)のin vivo の生物学的性質 上記の実施例１４で述べたように調製した、r-HuMGDF
（E. coli 1-163）の生物学的効力を、齧歯類で評価し
た。正常メスBalb/cマウスに、種々の用量のr-HuMGDF
を、5 日連続で皮下投与した。用量は15ug/kg/日から15
00ug/kg/日であった。最後の投与から24時間後に、血球
数のカウントをエレクトロニック・ セル・ カウンター(S
ysmex, Baxter)を用いて行った。サイトカインの対数的
濃度増大につれ、血小板数は直線的に増大した。この系
の1500μg/kg/日で、血小板数は基準値の300%に増大し
た。白血球や赤血球およびヘマトクリットのような、他
の血液細胞パラメータは、この処理によって、影響され
なかった。300 μg/kg/日のr-HuMGDF(E.coli 1-163)を
６日間、皮下投与したラットから、血小板を収集して、
ADP に応答する凝集能を評価した。データは、両集団
が、血小板アゴニストである ADP に等しく感応すると
いう点で、処理動物からの血小板が対照動物からの血小
板と実質的に区別がつかなかったことを指し示してい
る。
【０２７７】r-HuMGDFはまた、化学療法や照射に関連す
る血小板減少症への効能について、評価した。人に深刻
な血小板減少症を引き起こす化学療法剤であるカーボプ
ラチン(Carbplatin)をこれらの実験に用いた。この実験
の初めに、Balb/cマウスに、1.25mgのカーボプラチンを
皮下投与した。24時間後から、実験の残りの期間は毎
日、マウスに100ug/kg/日でr-HuMGDF(E.coli 1-163)ま
たは賦形剤を注射投与した。９日以内に、血小板数は、
賦形剤投与マウスでは正常値のおよそ15% に落ちたが、
r-HuMGDF投与マウスでは基準値を維持した（図20を参
照）。照射実験については、マウスは500 ラドの単１線
量のガンマー線（セシウム線源）を照射された。これは
亜致死の線量で、この照射によって11日以内に血小板数
は90% 減少する。血小板数は21日目まで正常値に回復し
ない。照射されたマウスに１日目から20日目まで毎日１
回、r-HuMGDF(E. coli 1-163) を投与(100ug/kg/日)す
ると、血小板数減少はそれほど深刻ではなく、賦形剤を
投与されたマウスよりも早く基準値に回復した（図2
1）。極端で、長引いた血小板減少症のモデルで、r-HuM
GDFをテストするために、カーボプラチンと照射を組み
合わせて適用した（図22）。このような処置によって、
血小板数は極端な低レベル（正常値の3-5%）に落ち、ほ
とんどの検体(7/8) は生き残れなかった。しかし、これ
らの検体にr-HuMGDFを実験期間中毎日、皮下投与(100ug
/kg/日)すると、血小板減少症は著しく改善され、基準
値への回復も早まり、r-HuMGDF投与マウスの全て(8/8)
が生き残った。
【０２７８】r-HuMGDFはまた、アカゲザル(rhesus monk
ey) についても評価した。正常なアカゲザルに、2.5 あ
るいは25μg/kg/日で10日間（０〜９日目）皮下投与し
た。低用量グループでは血小板数は12日目で400%に増
え、高用量グループでは血小板数は12日目で700%に増え
た。投与をやめると、血小板数は25〜30日で正常値に回
復した。白血球数と赤血球数は、この処理で影響されな
かった。
【０２７９】r-HuMGDF(E. coli 1-163) はまた、霊長類
の深刻な血小板減少症モデルでも、テストした（図2
3）。検体は照射（700 ラド、コバルト線源）を受け、
この照射によって血小板数は15日目までに正常の1-2%に
減少した。35〜40日目までに、血小板数は正常値に回復
した。対照的に、毎日、r-HuMGDFを投与（25ug/kg/日）
された照射検体の血小板数は、正常値の10% に落ちたに
過ぎず、平均でも、血小板減少症患者に血小板を輸液す
る臨界値である、20,000／μl 以下にはならなかった。
基準値への回復も、r-HuMGDF投与検体では早く、20日目
までに回復した。
【０２８０】齧歯類と霊長類の実験による、これらのin
vivo データは、r-HuMGDF(E. coli1-163) が、臨床的
に有意味な血小板減少症に明らかに効果を示す可能性を
もつ、有力な治療薬であるという概念を十分に支持して
くれる。
【０２８１】実施例１６ CHO セル・ 培養による、r-HuMGDF 1-332の生産法 ふさわしいプロモーターの存在下、MGDF 1-332のcDNAを
発現している、遺伝子導入されたチャイニーズ・ ハムス
ター・ 卵巣細胞からグリコシル化r-HuMGDF 1-332を産生
し、増殖可能な選択マーカー、DHFRをコードするジーン
とを連結させた。CHO 細胞でのMGDFの発現にふさわしい
プロモーターは、SRαである。Mol. Cell. Biol. 8: 46
6-472 (1988)およびWO 91/13160 (1991)を参照。CHO 細
胞でのMGDFの発現にふさわしいベクターは、pDSRα2 で
ある。WO 90/14363 (1990)を参照。典型的な CHO 細胞
系は、標準的な細胞培地中で、10-20mg/L 程度の分泌(s
ecreted)MGDFを産生できるが、25から100mg/L 程度以上
に増加させることができる。典型的な細胞系でMGDFを産
生するために、関連する生育モードで(in adherentgrow
th mode) 、懸濁培養器中で、又は、組織培養器中で、
継代させることにより培養を拡大することができる。上
記生育モードで用いる培地は、等量のDMEM(Dulbecco's
Modified Eagle's Medium)とDMEM/F12，(Ham's F12, Gi
bco)である。更に、添加物として、5-10% の FBS(ウシ
胎児血清) あるいは透析したウシ胎児血清、そして選択
圧を維持するためのMTX(メトトレキセート)(もし必要な
ら; 典型的なMTX 濃度は200-600nM である) を加える。
この培地には、さらに、非必須アミノ酸(NEAA's)とグル
タミンを添加しなけらばならない。懸濁培養は、 1-4×
105セル/ml のイノキュレーション（分割）密度及び最
大密度約 1×106セル/mlの間で容易に繁殖できる。この
時、特定の分割密度において、培養を初期密度をもった
大容量培養に希釈することで、カルチャーを容易に拡大
できる。
【０２８２】ローラーボトルでMGDFを生産するために
は、（調温環境(37 +/- 1 ℃）に置いたマグネティック
スターラー付きのスピンナー・ ベッセル、あるいは
（機器化され、撹拌などを調節できる）タンク・ バイオ
リアクター・ システムを用いて、適当な容量と細胞密度
で懸濁培養を行わなければならない。（850 cm２ Falc
onローラーボトルのような）ローラーボトルは、 1.5×
107 から 3×107 セル／ボトルの初期密度で細胞をう
えつけ、さらに3-4 日後に、コンフルエント・ モノレイ
ヤーになるのに適した量（ボトル当たり150-300ml)の正
確培地(5-10% FBS,1X NEAA,及び 1X L-グルタミンの入
った、DMEM/F12) を追加しなけばならない。生育培地
は、分圧60-90mmHg の炭酸ガスと平衡を保つように、重
炭酸ナトリウムでpHを6.9 から7.2 に適宜バッファライ
ズしなければならない。ボトルには10%CO２／エアーで
ガスを入れ、ローラー・ ラック（〜1 rpm ）で、37 +/-
1℃で3-4 日、インキュベートする。コンフルエントに
なれば、ローラーボトルに、生育培地を注ぎ入れるか、
吸入するかして、血清フリーのプロダクション・ 培地に
移す；Dulbecco'sフォスフェート・ バッファード・ サリ
ン(D-PBS) のような、アイソトニックバッファーでボト
ルを洗い（ボトル当たり50-100ml）; 続いて、重炭酸塩
でバッファライズされた、血清フリーのDMEM/F12 (1:1)
の適当量 (ボトル当たり200-300ml)を加える。DMEM/F12
にはNEAA'sとL-グルタミン、共有結合的なアグリゲーシ
ョンを抑えるための硫酸銅(1-20 μM)を加えておく。ボ
トルには10%CO2／エアーでガスを入れ、ローラー・ ラッ
ク（〜1 rpm ）で、37 +/- 1℃で6 +/- 1 日、インキュ
ベートするか、あるいは代謝活性によってグルコース・
レベルが0.5 g/L 以下に、もしくはpHが6.6 以下になる
までインキュベートする。コンディション・ 培地は注ぎ
出すか、吸引するかして、ボトルから収集し、追加的な
収集のために上記の血清フリーのプロダクション・ 培地
に換える。この操作は、細胞がそれ以上血清フリーのプ
ロダクションを維持できなくなるまで、そして細胞がロ
ーラーボトルから抜け落ちるまで、続行する。
【０２８３】収集されたコンディション・ 培地は、0.4
5umおよび／又は0.2um のフィルター(Sartorius Sartob
ran pH or Pall)を通すデッド- エンド・ マイクロフィ
ルトレーションによって、精製操作へと移されていく。
濾過されたコンディション・培地は4℃で冷やした後、
一時的に4 ℃で保存するか、またはすぐに濃縮して、ク
ロス- フロー・ ウルトラフィルトレーション・ システム
（例えば、 Filtron YM-50）を用いて、低イオン強度に
なるように透析する。ウルトラフィルトレーションと透
析濾過は、タンパク質の分解を抑えるために、4 ℃で行
う。コンディション・ 培地は、クロマトグラフィーによ
る精製ステップに先立って、バッファー水溶液（例え
ば、10mMリン酸カリウム）で透析しておく。
【０２８４】コンディション・ 培地に含まれるプロダク
トの質は、非還元のSDS-PAGEウェスタン・ ブロットでモ
ニターするのが最適である。この方法では、サンプル中
に存在する、MGDFのアグリゲート、モノマー、（タンパ
ク質分解酵素による）分解物のそれぞれのおよその量を
知ることができる。
【０２８５】CHO 細胞からMGDFを産生する、他の方法
は、MGDFを発現している細胞系をGibco S-SFM IIのよう
な血清フリーの培地に適応させることである。細胞は、
最小限の血清添加あるいは無添加における、連続継代に
よって適応させることができる。もしも、このような培
地中で、妥当な量のMGDFを分泌しながら、維持されつつ
成長する細胞系が見つかれば、連続継代を経て次々に大
きな容量へとスケールアップして、最後には適したサイ
ズのプロダクション・ ベッセル（機器化され、撹拌など
を調節できる、タンク・ バイオリアクター）にイノキュ
レートする接種培地によって、生産を進めることができ
る。また、このような細胞系が見つかれば、最適な生育
コンディション（pH, 栄養素類、温度、酸素、シェア）
で、最適な生息密度で増殖する培養をも、可能にする。
（プロダクトの量と質を実験的に測定して決まる）最適
な産生条件を用いて、培養はバイオリアクターから収集
され、細胞はミクロン- スケール・ デプス・ フィルトレ
ーション、またはサブ- ミクロン・ クロス- フロー・ マ
イクロフィルトレーションによって、コンディション・
培地から除去される。上記の濃縮と透析に先立って、デ
プス・ フィルトレーションを使えば、サブ- ミクロン・
デッド- エンド・ フィルトレーションを使うよりも、培
地をさらに清浄化することができる。
【０２８６】本発明を、一般におよび好ましい実施例に
よって、上記に記したが、上記の記述に照らして、当該
技術者は変更や改良を容易に成しえるものと理解する。
したがって、添付した請求項は、請求する本発明の範囲
内に生じ得る変更の全てをカバーするものとみなす。
【０２８７】さらに、本発明の背景を説明するために引
用した資料と出版物、および特にその実施に関する追加
的詳細を供給する場合には、参考としてここに組み込ま
れる。
【０２８８】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> AMGEN INC. <120> MGDF DERIVATIVES FOR STIMULATING MEGAKARYOCYTE GROWTH AND DIFFERENTIATION AND METHODS FOR PREPARING THE SAME <130> PA99-265K <140> <141> <150> US 08/221,768 <151> 1994-03-31 <150> US 08/252,628 <151> 1994-05-31 <150> US 08/321,488 <151> 1994-10-12 <150> US 08/347,780 <151> 1994-11-30 <160> 34 <170> PatentIn Version 2.0 <210> 1 <211> 31 <212> PRT <213> Canis familiaris <220> <221> UNSURE <223> Xaa at position 5 is unknown. <220> <221> UNSURE <223> Xaa at position 22 is unknown. <220> <221> UNSURE <223> Xaa at position 25 is unknown. <400> 1 Ala Pro Pro Ala Xaa Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Met Leu Arg Asp 1 5 10 15 Ser His Val Leu His Xaa Arg Leu Xaa Gln Xaa Pro Asp Ile Tyr 20 25 30 <210> 2 <211> 21 <212> PRT <213> Canis familiaris <220> <221> UNSURE <223> Xaa at position 5 is unknown. <400> 2 Ala Pro Pro Ala Xaa Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Met Leu Arg Asp 1 5 10 15 Ser His Val Leu His 20 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 3 Thr Gln Lys Glu Gln Thr Lys Ala Gln Asp Val Leu Gly Ala Val Ala 1 5 10 15 Leu <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a sense primer encoding the amino acids 1-5 of SEQ I D NO:1. <400> 4 gcnccnccng cntgyga 17 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is an antisense primer encoding the amino acids 16-21 o f SEQ ID NO:1. <400> 5 gcartgyaac acrtgngart c 21 <210> 6 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp 1 5 10 15 Ser His Val Leu His 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a random hexamer for cDNA synthesis. <400> 7 gtacgcgttc tagannnnnn t 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 agtttactga ggactcggag g 21 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 ttcggccgga taggcctttt tttttttttt 30 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is an antisense primer for human MGDF cloning. <400> 10 ttcggccgga taggcctttt ttttttttt 29 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 tgcgacctcc gagtcctcag 20 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 gagtcctcag taaactgctt cgt 23 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 ggagtcacga agcagtttac 20 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a 5' vector v19.8 sense primer. <400> 14 cctttacttc taggcctg 18 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 gaggtcacaa gcaggagga 19 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is an antisense vector primer for primer extension of t he 3'-end of human MGDF cDNA. <400> 16 ggcatagtcc gggacgtcg 19 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 tcctcctgct tgtgacctc 19 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 ccaggaagga ttcagggga 19 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 caacaagtcg accgccagcc agacaccccg 30 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a random primer adapter. <400> 20 ggccggatag gccactcnnn nnnt 24 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a PCR primer C. <400> 21 gcartgyaan acrtgngart c 21 <210> 22 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a linker adapter. <400> 22 ttggtgtgca cttgtg 16 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a linker adapter. <400> 23 cacaagtgca caccaacccc 20 <210> 24 <211> 1342 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (99)..(1094) <400> 24 cagggagcca cgccagccaa gacaccccgg ccagaatgga gctgactgaa ttgctcctcg 60 tggtcatgct tctcctaact gcaaggctaa cgctgtcc agc ccg gct cct cct 113 Ser Pro Ala Pro Pro 1 5 gct tgt gac ctc cga gtc ctc agt aaa ctg ctt cgt gac tcc cat gtc 161 Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val 10 15 20 ctt cac agc aga ctg agc cag tgc cca gag gtt cac cct ttg cct aca 209 Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr 25 30 35 cct gtc ctg ctg cct gct gtg gac ttt agc ttg gga gaa tgg aaa acc 257 Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr 40 45 50 cag atg gag gag acc aag gca cag gac att ctg gga gca gtg acc ctt 305 Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu 55 60 65 ctg ctg gag gga gtg atg gca gca cgg gga caa ctg gga ccc act tgc 353 Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys 70 75 80 85 ctc tca tcc ctc ctg ggg cag ctt tct gga cag gtc cgt ctc ctc ctt 401 Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu 90 95 100 ggg gcc ctg cag agc ctc ctt gga acc cag ctt cct cca cag ggc agg 449 Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg 105 110 115 acc aca gct cac aag gat ccc aat gcc atc ttc ctg agc ttc caa cac 497 Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His 120 125 130 ctg ctc cga gga aag gtg cgt ttc ctg atg ctt gta gga ggg tcc acc 545 Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr 135 140 145 ctc tgc gtc agg cgg gcc cca ccc acc aca gct gtc ccc agc aga acc 593 Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr 150 155 160 165 tct cta gtc ctc aca ctg aac gag ctc cca aac agg act tct gga ttg 641 Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu 170 175 180 ttg gag aca aac ttc act gcc tca gcc aga act act ggc tct ggg ctt 689 Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu 185 190 195 ctg aag tgg cag cag gga ttc aga gcc aag att cct ggt ctg ctg aac 737 Leu Lys Trp Gln Gln Gly Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn 200 205 210 caa acc tcc agg tcc ctg gac caa atc ccc gga tac ctg aac agg ata 785 Gln Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gln Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg Ile 215 220 225 cac gaa ctc ttg aat gga act cgt gga ctc ttt cct gga ccc tca cgc 833 His Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg 230 235 240 245 agg acc cta gga gcc ccg gac att tcc tca gga aca tca gac aca ggc 881 Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp Ile Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr Gly 250 255 260 tcc ctg cca ccc aac ctc cag cct gga tat tct cct tcc cca acc cat 929 Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gln Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His 265 270 275 cct cct act gga cag tat acg ctc ttc cct ctt cca ccc acc ttg ccc 977 Pro Pro Thr Gly Gln Tyr Thr Leu Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro 280 285 290 acc cct gtg gtc cag ctc cac ccc ctg ctt cct gac cct tct gct cca 1025 Thr Pro Val Val Gln Leu His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro 295 300 305 acg ccc acc cct acc agc cct ctt cta aac aca tcc tac acc cac tcc 1073 Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser 310 315 320 325 cag aat ctg tct cag gaa ggg taaggttctc agacactgcc gacatcagca 1124 Gln Asn Leu Ser Gln Glu Gly 330 ttgtctcgtg tacagctccc ttccctgcag ggcgcccctg ggagacaact ggacaagatt 1184 tcctactttc tcctgaaacc caaagccctg gtaaaaggga tacacaggac tgaaaaggga 1244 atcatttttc actgtacatt ataaaccttc agaagctatt tttttaagct atcagcaata 1304 ctcatcagag cagctagctc tttggtctat tttctgca 1342 <210> 25 <211> 332 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu 1 5 10 15 Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val 20 25 30 His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu 35 40 45 Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu 50 55 60 Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln 65 70 75 80 Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln 85 90 95 Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu 100 105 110 Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe 115 120 125 Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu 130 135 140 Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala 145 150 155 160 Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro Asn 165 170 175 Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser Ala Arg Thr 180 185 190 Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly Phe Arg Ala Lys Ile 195 200 205 Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gln Ile Pro Gly 210 215 220 Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg Gly Leu Phe 225 230 235 240 Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp Ile Ser Ser Gly 245 250 255 Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gln Pro Gly Tyr Ser 260 265 270 Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr Thr Leu Phe Pro Leu 275 280 285 Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu His Pro Leu Leu Pro 290 295 300 Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn Thr 305 310 315 320 Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu Gly 325 330 <210> 26 <211> 1342 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (99)..(621) <400> 26 cagggagcca cgccagccaa gacaccccgg ccagaatgga gctgactgaa ttgctcctcg 60 tggtcatgct tctcctaact gcaaggctaa cgctgtcc agc ccg gct cct cct 113 Ser Pro Ala Pro Pro 1 5 gct tgt gac ctc cga gtc ctc agt aaa ctg ctt cgt gac tcc cat gtc 161 Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val 10 15 20 ctt cac agc aga ctg agc cag tgc cca gag gtt cac cct ttg cct aca 209 Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr 25 30 35 cct gtc ctg ctg cct gct gtg gac ttt agc ttg gga gaa tgg aaa acc 257 Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr 40 45 50 cag atg gag gag acc aag gca cag gac att ctg gga gca gtg acc ctt 305 Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu 55 60 65 ctg ctg gag gga gtg atg gca gca cgg gga caa ctg gga ccc act tgc 353 Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys 70 75 80 85 ctc tca tcc ctc ctg ggg cag ctt tct gga cag gtc cgt ctc ctc ctt 401 Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu 90 95 100 ggg gcc ctg cag agc ctc ctt gga acc cag ctt cct cca cag ggc agg 449 Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg 105 110 115 acc aca gct cac aag gat ccc aat gcc atc ttc ctg agc ttc caa cac 497 Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His 120 125 130 ctg ctc cga gga aag gtg cgt ttc ctg atg ctt gta gga ggg tcc acc 545 Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr 135 140 145 ctc tgc gtc agg cgg gcc cca ccc acc aca gct gtc ccc agc aga acc 593 Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr 150 155 160 165 tct cta gtc ctc aca ctg aac gag ctc c caaacaggac ttctggattg 641 Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu 170 ttggagacaa acttcactgc ctcagccaga actactggct ctgggcttct gaagtggcag 701 cagggattca gagccaagat tcctggtctg ctgaaccaaa cctccaggtc cctggaccaa 761 atccccggat acctgaacag gatacacgaa ctcttgaatg gaactcgtgg actctttcct 821 ggaccctcac gcaggaccct aggagccccg gacatttcct caggaacatc agacacaggc 881 tccctgccac ccaacctcca gcctggatat tctccttccc caacccatcc tcctactgga 941 cagtatacgc tcttccctct tccacccacc ttgcccaccc ctgtggtcca gctccacccc 1001 ctgcttcctg acccttctgc tccaacgccc acccctacca gccctcttct aaacacatcc 1061 tacacccact cccagaatct gtctcaggaa gggtaaggtt ctcagacact gccgacatca 1121 gcattgtctc gtgtacagct cccttccctg cagggcgccc ctgggagaca actggacaag 1181 atttcctact ttctcctgaa acccaaagcc ctggtaaaag ggatacacag gactgaaaag 1241 ggaatcattt ttcactgtac attataaacc ttcagaagct atttttttaa gctatcagca 1301 atactcatca gagcagctag ctctttggtc tattttctgc a 1342 <210> 27 <211> 174 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu 1 5 10 15 Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val 20 25 30 His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu 35 40 45 Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu 50 55 60 Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln 65 70 75 80 Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln 85 90 95 Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu 100 105 110 Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe 115 120 125 Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu 130 135 140 Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala 145 150 155 160 Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu 165 170 <210> 28 <211> 1164 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (97)..(894) <400> 28 agggagcca cgccagccaa gacaccccgg ccagaatgga gctgactgaa ttgctcctcgtg 60 gtcatgcttc tcctaactgc aaggctaacg ctgtcc agc ccg gct cct cct gct 114 Ser Pro Ala Pro Pro Ala 1 5 tgt gac ctc cga gtc ctc agt aaa ctg ctt cgt gac tcc cat gtc ctt 162 Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu 10 15 20 cac agc aga ctg agc cag tgc cca gag gtt cac cct ttg cct aca cct 210 His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro 25 30 35 gtc ctg ctg cct gct gtg gac ttt agc ttg gga gaa tgg aaa acc cag 258 Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln 40 45 50 atg gag gag acc aag gca cag gac att ctg gga gca gtg acc ctt ctg 306 Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu 55 60 65 70 ctg gag gga gtg atg gca gca cgg gga caa ctg gga ccc act tgc ctc 354 Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu 75 80 85 tca tcc ctc ctg ggg cag ctt tct gga cag gtc cgt ctc ctc ctt ggg 402 Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly 90 95 100 gcc ctg cag agc ctc ctt gga acc cag ctt cct cca cag ggc agg acc 450 Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr 105 110 115 aca gct cac aag gat ccc aat gcc atc ttc ctg agc ttc caa cac ctg 498 Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu 120 125 130 ctc cga gga aag gac ttc tgg att gtt gga gac aaa ctt cac tgc ctc 546 Leu Arg Gly Lys Asp Phe Trp Ile Val Gly Asp Lys Leu His Cys Leu 135 140 145 150 agc cag aac tac tgg ctc tgg gct tct gaa gtg gca gca ggg att cag 594 Ser Gln Asn Tyr Trp Leu Trp Ala Ser Glu Val Ala Ala Gly Ile Gln 155 160 165 agc caa gat tcc tgg tct gct gaa cca aac ctc cag gtc cct gga cca 642 Ser Gln Asp Ser Trp Ser Ala Glu Pro Asn Leu Gln Val Pro Gly Pro 170 175 180 aat ccc cgg ata cct gaa cag gat aca cga act ctt gaa tgg aac tcg 690 Asn Pro Arg Ile Pro Glu Gln Asp Thr Arg Thr Leu Glu Trp Asn Ser 185 190 195 tgg act ctt tcc tgg acc ctc acg cag gac cct agg agc ccc gga cat 738 Trp Thr Leu Ser Trp Thr Leu Thr Gln Asp Pro Arg Ser Pro Gly His 200 205 210 ttc ctc agg aac atc aga cac agg ctc cct gcc acc caa cct cca gcc 786 Phe Leu Arg Asn Ile Arg His Arg Leu Pro Ala Thr Gln Pro Pro Ala 215 220 225 230 tgg ata ttc tcc ttc ccc aac cca tcc tcc tac tgg aca gta tac gct 834 Trp Ile Phe Ser Phe Pro Asn Pro Ser Ser Tyr Trp Thr Val Tyr Ala 235 240 245 ctt ccc tct tcc acc cac ctt gcc cac ccc tgt ggt cca gct cca ccc 882 Leu Pro Ser Ser Thr His Leu Ala His Pro Cys Gly Pro Ala Pro Pro 250 255 260 cct gct tcc tgacccttct gctccaacgc ccacccctac cagccctctt 931 Pro Ala Ser 265 ctaaacacat cctacaccca ctcccagaat ctgtctcagg aagggtaagg ttctcagaca 991 ctgccgacat cagcattgtc tcgtgtacag ctcccttccc tgcagggcgc ccctgggaga 1051 caactggaca agatttccta ctttctcctg aaacccaaag ccctggtaaa agggatacac 1111 aggactgaaa agggaatcat ttttcactgt acattataaa ccttcagaag cta 1164 <210> 29 <211> 265 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu 1 5 10 15 Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val 20 25 30 His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu 35 40 45 Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu 50 55 60 Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln 65 70 75 80 Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln 85 90 95 Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu 100 105 110 Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe 115 120 125 Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Asp Phe Trp Ile Val Gly 130 135 140 Asp Lys Leu His Cys Leu Ser Gln Asn Tyr Trp Leu Trp Ala Ser Glu 145 150 155 160 Val Ala Ala Gly Ile Gln Ser Gln Asp Ser Trp Ser Ala Glu Pro Asn 165 170 175 Leu Gln Val Pro Gly Pro Asn Pro Arg Ile Pro Glu Gln Asp Thr Arg 180 185 190 Thr Leu Glu Trp Asn Ser Trp Thr Leu Ser Trp Thr Leu Thr Gln Asp 195 200 205 Pro Arg Ser Pro Gly His Phe Leu Arg Asn Ile Arg His Arg Leu Pro 210 215 220 Ala Thr Gln Pro Pro Ala Trp Ile Phe Ser Phe Pro Asn Pro Ser Ser 225 230 235 240 Tyr Trp Thr Val Tyr Ala Leu Pro Ser Ser Thr His Leu Ala His Pro 245 250 255 Cys Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Ser 260 265 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 gagctcacta gtgtcgacct gcag 24 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 ctgcaggtcg acactagtga gctc 24 <210> 32 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is an oligonucleotide substituted for AatII-ClaI DNA of pAMG11. <400> 32 ctcataattt ttaaaaaatt catttgacaa atgctaaaat tcttgattaa tattctcaat 60 tgtgagcgct cacaatttat 80 <210> 33 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is an oligonucleotide complementary to the oligonucleot ide of SEQ ID NO:32, substituted for AatII-ClaI DNA of pAMG11. <400> 33 cgataaattg tgagcgctca caattgagaa tattaatcaa gaattttagc atttgtcaaa 60 tgaatttttt aaaaattatg agacgt 86 <210> 34 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a synthetic lactose-inducible promoter. <400> 34 gacgtctcat aatttttaaa aaattcattt gacaaatgct aaaattcttg attaatattc 60 tcaattgtga gcgctcacaa tttatcgat 89
【０２８９】
【配列表フリーテキスト】配列番号４：配列番号１のア
ミノ酸１〜５をコードするセンスプライマーを示す。 配列番号５：配列番号１のアミノ酸１６〜２１をコード
するアンチセンスプライマーを示す。 配列番号７：ｃＤＮＡ合成用ランダムヘキサマーを示
す。 配列番号１０：ヒトＭＧＤＦクローニング用アンチセン
スプライマーを示す。 配列番号１４：５’ベクターｖ19.8センスプライマーを
示す。 配列番号１０：ヒトＭＧＤＦクローニング用アンチセン
スプライマーを示す。 配列番号１４：５’バクターｖ19.8センスプライマーを
示す。 配列番号１６：ヒトＭＧＤＦ ｃＤＮＡの３’末端のプ
ライマー伸長用アンチセ ンスベクタープライマーを示す。 配列番号２０：ランダムプライマーアダプターを示す。 配列番号２１：ＰＣＲプライマーＣを示す。 配列番号２２：リンカーアダプターを示す。 配列番号２３：リンカーアダプターを示す。 配列番号３２：ｐＡＭＧ１１のＡａｔＩＩ−ＣｌａＩ
ＤＮＡに代えて置換されたオリゴヌクレオチドを示す。 配列番号３３：ｐＡＭＧ１１のＡａｔＩＩ−ＣｌａＩ
ＤＮＡに代えて置換された配列番号３２のオリゴヌクレ
オチドに相補的なオリゴヌクレオチドを示す。 配列番号３４：合成ラクトース誘導性プロモーターを示
す。
【図面の簡単な説明】
【図1】この図は、巨核球および血小板の発生ならびに
成熟を概説している。
【図2】この図は、可溶化マウスMpl レセプターが、実
質上、放射線照射したイヌ（「無形成性のイヌ」、また
は「APK9」）の血漿の能力を完全に抑制し、巨核球の発
育を誘導することを示す。巨核球の生育に対するアッセ
イは実施例2 に示した。
【図3】この図 は、レクチンアフィニティクロマトグラ
フィーおよび Mplレセプターアフィニティクロマトグ
ラフィー（「Mpl リガンド」）によって増幅された活性
が、1A6.1 細胞の増殖を刺激すること及び可溶化マウス
Mpl レセプターがその生育をブロックすることを示す。
【図4】この図は、無形成性のイヌ血漿からの25kdおよ
び31kd形態のイヌMplレセプターの精製に関与する精製
ステップの概説を示す。
【図5】この図は、逆相HPLC（RP-HPLC ）によるMpl リ
ガンドの精製を示す。フラクション21は、高度に精製し
た31kdMpl リガンドを、フラクション22は31kdと25kdの
Mpl リガンドの混合物を、フラクション23は高度に精製
された25kdのMpl リガンドを含む。
【図6】この図は、25kdおよび／または31kdのMpl リガ
ンドタンパク質を含む逆相HPLC(C4 カラム) 画分におけ
るMpl リガンドの活性を比較したものである。
【図7】この図は、APK9,Mplリガンドおよび様々なその
他の因子で刺激したCD34−選択末梢血の培養液から産生
した巨核球の総数を示す。
【図8】この図は、APK9,Mplリガンドおよびその他の各
種因子で刺激した、CD34−選択末梢血細胞の培養から産
生した総白血球の総数を示す。
【図9】この図は、APK9,Mplリガンドおよびその他の各
種因子で刺激した、CD34選択末梢血細胞の培養から産生
した巨核球の百分率を示す。
【図10】この図は、ヒトIL-3がMpl リガンド誘導性の巨
核球の発育に関与していないことを示す。
【図11】この図は、ヒトMGDF-1およびMGDF-2のcDNAおよ
び推論されるアミノ酸配列を示す。
【図12】この図は、ヒトMGDF-3のcDNAおよび推論される
アミノ酸配列を示す。
【図13】この図は、イヌを発生源とする(A) およびマウ
スを発生源とする(B)MGDF-1と MGDFs（Mpl リガンド）
との比較を示す。
【図14】この図は、モノメトキシ−ポリエチレングリコ
ールのN-ヒドロキシスクシニミジル(NHS) 活性エステル
を使い、MGDFをアシル化してポリPEG 化産物を得た例を
示す。
【図15】この図は、モノメトキシ−ポリエチレングリコ
ールアルデヒドを使い、MGDFを非特異的に還元的アルキ
ル化してポリPEG化産物を得た例を示す。
【図16】この図は、モノ−メトキシ−ポリエチレングリ
コールアルデヒドを使い、N-末端残基のα−アミノ基で
MGDFを部位特異的に還元的アルキル化して実質的にモノ
−PEG 化産物を得た例を示す。
【図17】この図は、分子量20kDa のMePEG の活性化誘導
体を使って調製したMePEG-MGDFコンジュゲートをサイズ
排除(SEC)HPLC 解析したものを示す。 A:MePEG(PEG11)のNHS エステルでMGDFをアシル化して調
製したポリ−MePEG-MGDFコンジュゲート。 B:MePEG アルデヒド(PEG20) でMGDFをアルキル化して調
製したポリ−MePEG-MGDFコジュゲート。 C:MePEG アルデヒド(PEG16) でMGDFをアルキル化して調
製したモノ−MePEG-MGDFコンジュゲート。
【図18】この図は、組み換えヒトMGDFで処理したマウス
由来の血小板計数値を示す。黒ダイヤ印＝CHO 由来22ー3
53MGDF、白丸印＝PEG の付加していないE.coli 22-184
MGDF（すなわち1-163MGDF ）、白丸印＝PEG 化したE.co
li 22-184 MGDF。
【図19】この図は、r-HuMGDFの精製フローチャートを示
す。
【図20】この図は、マウスカルボプラチンモデルにおけ
る血小板計数値に及ぼすr-HuMGDF(E.coli 1-163)の影響
を示す。Balb/cマウスにDay 0 においてカルボプラチン
を単一回腹腔内投与(1.25mg/マウス)した。賦形剤のみ
グループにはカルボプラチンを投与しなかった。24時間
後、カルボプラチン処理マウスへ賦形剤または100ug/kg
の r-HGDF のいずれかを残りの試験期間にわたって連日
皮下投与した。（各群ｎ＝10匹とし、1 回の試験実施時
刻ごとに5 匹から採血した。）
【図21】この図は、放射線照射後のマウスにおける血小
板計数値に及ぼすr-HuMGDF（E.coli 1-163）の影響を示
す。Day 0 でBalb/cマウスにガンマ線（セシウム線源）
を500 ラド単一回照射した。賦形剤のみのグループには
照射しなかった。24時間後、残りの試験期間にわたって
照射マウスに賦形剤または100ug/kg r- HuMGDFを連日皮
下注射した。（各群ｎ＝8 匹とし、1 回の試験実施時刻
ごとに4 匹から採血した。）
【図22】この図は、放射線照射およびカルボプラチンの
組合せで処理したマウスにおける血小板計数値に及ぼす
r-HuMGDF（E.coli 1- 163 ）の影響を示す。Balb/cマウ
スにDay 0 において500 ラドのガンマ線（セシウム線
源）を単一回照射およびカルボプラチン(1.25mg/マウ
ス)を投与した。24時間後、残りの試験期間にわたって
マウスに賦形剤または100μg/kg r-HuMGDF を連日皮下
注射した。（各群ｎ＝8 匹とした。）r-HuMGDFによる補
足を行わなかった場合、マウスのほとんどは試験期間中
生存できなかった。対照群において、8 匹中1 匹が生存
した。処理群において、8 匹中8 匹が生存した。
【図23】この図は、アカゲザルにおける放射線誘導型血
小板減少症に及ぼすr-HuMGDF（E.coli 1-163）の影響を
示す。アカゲザルを （700cGy Co-80の）放射線照射に
曝露した。照射後24時間を経過してから、連続18日間、
r-HuMGDF(n=3)またはヒト血清アルブミン（ｎ＝9 匹）
(1匹あたり25ug/kg/日)を皮下投与した。電気血液細胞
解析装置を使って血液細胞を解析した。各記号は平均値
(+/- sem) を示す。
【図24】この図は、カルボプラチンおよび放射線照射処
理したマウスの血小板計数値に及ぼすPEG 化およびグリ
コシル化r-HuMGDFの効果を示す。図22で行った試験で説
明したように、マウスにカルボプラチンおよび放射線照
射の併用処理を行った。傷害を受けた24時間後より、指
示したr-HuMGDF製剤（50ug/kg/日)の皮下注射を試験期
間中連日行なった。電気的細胞計数装置(Sysmex,Baxte
r) を使って指定した日に血液細胞を計数した。
【図25】この図は、E.coli最適化コドンを有する組み換
えヒトMGDFの合成遺伝子配列、アミノ酸1-163 を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 7/06 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ０７Ｋ 17/08 Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 37/24 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (31)優先権主張番号 ０８／３４７７８０ (32)優先日 平成６年11月30日(1994．11．30) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (72)発明者 ボーゲンバーガー，ヤコブ・エム アメリカ合衆国、カルフオルニア・93010、 カマーリオ、バーバラ・ドライブ・2242 (72)発明者 ボツセルマン，ロバート・エー アメリカ合衆国、カルフオルニア・91362、 サウザンド・オークス、バツカラツト・ ストリート・ 3301 (72)発明者 ハント，パメラ アメリカ合衆国、カルフオルニア・91362、 サウザンド・オークス、マツクレア・ロ ード・2431 (72)発明者 キンストラー，オアフ・ビー アメリカ合衆国、カルフオルニア・91360、 サウザンド・オークス、ノース・オーク ツリー・ ユニツト・エー・533 (72)発明者 サーマル，バブル・ビー アメリカ合衆国、カルフオルニア・93021、 モアパーク、ブロードビユー・ドライ ブ・1136

Claims (63)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ヒト巨核球の増殖および発達を特異的に促
    進し実質上他のヒトタンパクを含まないヒトMGDFポリペ
    プチドに少なくとも１つの水溶性ポリマーが結合された
    MGDF誘導体であって、但しアミノ酸配列が図11に示され
    る22位から184位までのアミノ酸配列からなりN末端にポ
    リエチレングリコール基が結合されているモノPEG化MGD
    Fポリペプチドを包含しない、前記MGDF誘導体。
  2. 【請求項２】前記ポリペプチドが図11のアミノ酸22〜17
    2を含む請求項1 記載のMGDF誘導体。
  3. 【請求項３】前記ポリペプチドが図11のアミノ酸22〜19
    5を含む請求項2 記載のMGDF誘導体。
  4. 【請求項４】前記ポリペプチドがMGDF-2のアミノ酸配列
    を有する請求項3 記載のMGDF誘導体。
  5. 【請求項５】前記ポリペプチドが図11のアミノ酸22〜35
    3を含む請求項1 記載のMGDF誘導体。
  6. 【請求項６】前記ポリペプチドがMGDF-1のアミノ酸配列
    を有する請求項5 記載のMGDF誘導体。
  7. 【請求項７】アミノ酸配列がMGDF-4,MGDF-5,MGDF-6,MGD
    F-7 および MGDF-8からなる群から選択される請求項2
    記載のMGDF誘導体。
  8. 【請求項８】前記ポリペプチドが図11のアミノ酸22〜18
    4を含む請求項1 記載のMGDF誘導体。
  9. 【請求項９】前記ポリペプチドがさらにそのN-末端部に
    おいて配列 Met-Lysを含む請求項1 記載のMGDF誘導
    体。
  10. 【請求項１０】前記ポリペプチドが図11のアミノ酸22〜
    184を含み、さらにそのN-末端に配列Met-Lys を含む請
    求項１記載のMGDF誘導体。
  11. 【請求項１１】前記ポリペプチドが図11のアミノ酸22〜
    353を含み、さらにそのN-末端に配列Met-Lys を含む請
    求項1 記載のMGDF誘導体。
  12. 【請求項１２】さらに図11のアミノ酸1〜12を含む請求
    項１記載のMGDF誘導体。
  13. 【請求項１３】前記MGDFポリペプチドがMGDF-1,MGDF-2,
    MGDF-4,MGDF-11，MGDF-12,MGDF-13,MGDF-14 およびMGDF
    -15 からなる群から選択される請求項12記載のMGDF誘導
    体。
  14. 【請求項１４】前記MGDFポリペプチドがバクテリアの細
    胞内で組み換えによって産生される請求項12記載のMGDF
    誘導体。
  15. 【請求項１５】前記水溶性ポリマーが薬理学上受容可能
    である請求項12記載のMGDF誘導体。
  16. 【請求項１６】前記水溶性ポリマーがデキストラン、ポ
    リ(N- ビニル- ピロリドン）、ポリエチレングリコー
    ル、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロ
    ピレンオキシド/ エチレンオキシドのコポリマー、ポリ
    オキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコールおよ
    びそれらの混合物からなる群から選択される請求項12記
    載のMGDF誘導体。
  17. 【請求項１７】前記水溶性ポリマーがポリエチレングリ
    コールである請求項12記載のMGDF誘導体。
  18. 【請求項１８】前記ポリエチレングリコールがモノメト
    キシ- ポリエチレングリコールである請求項17記載のMG
    DF誘導体。
  19. 【請求項１９】前記ポリエチレングリコールがアシル結
    合またはアルキル結合によって前記MGDFポリペプチドに
    付加している請求項17記載のMGDF誘導体。
  20. 【請求項２０】前記ポリペプチドが図11のアミノ酸22〜
    184のアミノ酸配列を有する請求項17記載のMGDF誘導
    体。
  21. 【請求項２１】ポリエチレングリコール基がポリペプチ
    ドのN-末端部に付加している請求項20記載のMGDF誘導
    体。
  22. 【請求項２２】ポリエチレングリコール基が平均分子量
    10〜50 キロダルトンである請求項21記載のMGDF誘導
    体。
  23. 【請求項２３】前記MGDFポリペプチドが大腸菌（E.col
    i）において産生される請求項22記載のMGDF誘導体。
  24. 【請求項２４】前記ポリペプチドに１つのポリエチレン
    グリコール分子が共有結合されている請求項1〜23のい
    ずれか1 項に記載のMGDF誘導体。
  25. 【請求項２５】前記ポリペプチドに2 つの水溶性ポリマ
    ー分子が共有結合されている請求項1〜23のいずれか1
    項に記載のMGDF誘導体。
  26. 【請求項２６】前記水溶性ポリマー分子が共にポリエチ
    レングリコールである請求項25記載のMGDF誘導体。
  27. 【請求項２７】前記MGDFポリペプチドが図11のアミノ酸
    22〜184を含み、前記ポリエチレングリコールが5〜25キ
    ロダルトンの平均分子量を有する請求項26記載のMGDF誘
    導体。
  28. 【請求項２８】少なくとも１つの水溶性ポリマー分子を
    MGDFポリペプチドへ結合させてなるMGDF誘導体を製造す
    る方法において、前記水溶性ポリマーが単一の反応性ア
    ルデヒド基を有し、 a)前記MGDFポリペプチドと水溶性ポリマーとを前記MGDF
    ポリペプチドのアミノ酸末端におけるα- アミノ基を反
    応性にするのに十分に酸性のpHにおける還元的アルキル
    化条件下で接触させ、 b)MGDFポリペプチドに少なくとも1 つの水溶性ポリマー
    が結合された前記MGDF誘導体を単離することを含む、前
    記方法。
  29. 【請求項２９】前記MGDFポリペプチドがMGDF-1，MGDF-
    2, MGDF-3, MGDF-4, MGDF-5, MGDF-6, MGDF-7, MGDF-8,
    MGDF−9，MGDF-10, MGDF-11, MGDF-12， MGDF-13, MGD
    F-14および MGDF-15のアミノ酸配列からなる群から選択
    されるアミノ酸配列を有するものである請求項28記載の
    方法。
  30. 【請求項３０】前記水溶性ポリマーが、デキストラン、
    ポリ（N-ビニル- ピロリドン）、ポリエチレングリコー
    ル、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロ
    ピレンオキシド/ エチレンオキシドのコポリマー、ポリ
    オキシエチル化ポリオールおよびポリビニルアルコール
    からなる群から選択される請求項28または29記載の方
    法。
  31. 【請求項３１】前記水溶性ポリマーがポリエチレングリ
    コールである請求項30記載の方法。
  32. 【請求項３２】前記pHが約3 から約9 の間である請求項
    28〜31のいずれか1項に記載の方法。
  33. 【請求項３３】前記還元的アルキル化条件にナトリウム
    シアノボロヒドリドが還元剤として関与する請求項28〜
    31のいずれか1項に記載の方法。
  34. 【請求項３４】少なくとも１つの水溶性ポリマー分子を
    MGDFポリペプチドへ結合させてなるMGDF誘導体を製造す
    る方法において、前記水溶性ポリマーが単一の反応性エ
    ステル基を有し、 a)前記MGDFポリペプチドと水溶性ポリマーとを、前記MG
    DFポリペプチドがアシル結合を介して水溶性ポリマーに
    結合する条件下で接触させ、 b)MGDFポリペプチドに少なくとも1 つの水溶性ポリマー
    が結合された前記MGDF誘導体を単離することを含む、前
    記方法。
  35. 【請求項３５】前記MGDFポリペプチドがMGDF-1，MGDF-
    2, MGDF-3, MGDF-4, MGDF-5, MGDF-6, MGDF-7, MGDF-8,
    MGDF−9，MGDF-10, MGDF-11, MGDF-12， MGDF-13, MGD
    F-14および MGDF-15のアミノ酸配列からなる群から選択
    されるアミノ酸配列を有するものである請求項34記載の
    方法。
  36. 【請求項３６】前記水溶性ポリマーが、デキストラン、
    ポリ（N-ビニル- ピロリドン）、ポリエチレングリコー
    ル、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロ
    ピレンオキシド/ エチレンオキシドのコポリマー、ポリ
    オキシエチル化ポリオールおよびポリビニルアルコール
    からなる群から選択される請求項34または35記載の方
    法。
  37. 【請求項３７】前記水溶性ポリマーがポリエチレングリ
    コールである請求項36記載の方法。
  38. 【請求項３８】少なくとも１つのポリエチレングリコー
    ル分子をMGDFポリペプチドへ結合させてなるMGDF誘導体
    を製造する方法において、前記ポリエチレングリコール
    分子が反応性アルデヒド基1 つを有し、 a)前記MGDFポリペプチドと前記ポリエチレングリコール
    分子とを還元的アルキル化の条件下において、前記MGDF
    ポリペプチドのアミノ末端におけるα- アミノ基を反応
    性にするのに十分に酸性のpHで接触させ、 b)PEG 化MGDFポリペプチドからなるMGDF誘導体を取得す
    ることを含む、前記方法。
  39. 【請求項３９】前記MGDFポリペプチドがMGDF-1，MGDF-
    2, MGDF-3, MGDF-4, MGDF-5, MGDF-6, MGDF-7, MGDF-8,
    MGDF−9，MGDF-10, MGDF-11, MGDF-12， MGDF-13, MGD
    F-14および MGDF-15のアミノ酸配列からなる群から選択
    されるアミノ酸配列を有するものである請求項38記載の
    方法。
  40. 【請求項４０】前記ポリエチレングリコール分子が2〜1
    00 キロダルトンの分子量を有する請求項38または39記
    載の方法。
  41. 【請求項４1】請求項38〜40のいずれか1項に記載の方法
    によって製造されたPEG 化MGDFポリペプチド産物であっ
    て、但しアミノ酸配列が図11に示される22位から184位
    までのアミノ酸配列からなりN末端にポリエチレングリ
    コール基が結合されているモノPEG化MGDFポリペプチド
    を包含しない、前記ポリペプチド産物。
  42. 【請求項４２】MGDFポリペプチドのN-末端におけるα-
    アミノ基がモノPEG 化されてなるモノPEG化MGDFポリペ
    プチドを含む製剤。
  43. 【請求項４３】前記MGDFポリペプチドがMGDF-1，MGDF-
    2, MGDF-3, MGDF-4, MGDF-5, MGDF-6, MGDF-7, MGDF-8,
    MGDF−9，MGDF-10, MGDF-11, MGDF-12， MGDF-13, MGD
    F-14および MGDF-15のアミノ酸配列からなる群から選択
    されるアミノ酸配列を有するものである請求項42記載の
    製剤。
  44. 【請求項４４】前記MGDFポリペプチドが平均分子量5〜5
    0キロダルトンを有するポリエチレングリコールでモノP
    EG 化されている請求項42または43記載の製剤。
  45. 【請求項４５】MGDFポリペプチドに少なくとも１つのポ
    リエチレングリコール分子が結合されたPEG 化MGDFポリ
    ペプチドと、薬理学上受容可能な希釈剤、アジュバント
    または担体とを含む医薬組成物。
  46. 【請求項４６】前記MGDFポリペプチドがMGDF-1，MGDF-
    2, MGDF-3, MGDF-4, MGDF-5, MGDF-6, MGDF-7, MGDF-8,
    MGDF−9，MGDF-10, MGDF-11, MGDF-12， MGDF-13, MGD
    F-14および MGDF-15のアミノ酸配列からなる群から選択
    されるアミノ酸配列を有するものである請求項45記載の
    医薬組成物。
  47. 【請求項４７】前記PEG 化MGDFポリペプチドが、モノPE
    G 化MGDFポリペプチドであって、そのポリペプチドのN-
    末端のみに分子量２〜100キロダルトン、好ましくは5〜
    50キロダルトンのポリエチレングリコールが結合されて
    いる、請求項45または46記載の医薬組成物。
  48. 【請求項４８】前記PEG 化MGDFポリペプチドがMGDF-11
    のアミノ酸配列を有するものである請求項45〜47のいず
    れか1項に記載の医薬組成物。
  49. 【請求項４９】水性溶液である請求項45〜48のいずれか
    1項に記載の医薬組成物。
  50. 【請求項５０】凍結乾燥形態の請求項45〜48のいずれか
    1項に記載の医薬組成物。
  51. 【請求項５１】血小板減少病態の患者を治療するための
    ものである請求項45〜48のいずれか1項に記載の医薬組
    成物。
  52. 【請求項５２】前記病態が無形成性貧血、突発性血小板
    減少および薬物服用または放射線照射処置の結果生じた
    血小板減少からなる群から選択される病態である請求項
    51記載の医薬組成物。
  53. 【請求項５３】成熟巨核球の数を増加させるためのもの
    である請求項項45〜48のいずれか1項に記載の医薬組成
    物。
  54. 【請求項５４】血小板数を増加されるためのものである
    請求項45〜48のいずれか1項に記載の医薬組成物。
  55. 【請求項５５】MGDFポリペプチドに１つのポリエチレン
    グリコール分子が結合されたモノPEG 化MGDFポリペプチ
    ドであって、但しアミノ酸配列が図11に示される22位か
    ら184位までのアミノ酸配列からなりN末端にポリエチレ
    ングリコール基が結合されているモノPEG化MGDFポリペ
    プチドを包含しない、前記モノPEG 化MGDFポリペプチ
    ド。
  56. 【請求項５６】ポリエチレングリコール基が平均分子量
    2〜100 キロダルトンを有する請求項55記載のモノPEG
    化MGDFポリペプチド。
  57. 【請求項５７】MGDFポリペプチドのN-末端にポリエチレ
    ングリコール基が結合されている請求項55または56記載
    のモノPEG 化MGDFポリペプチド。
  58. 【請求項５８】MGDFポリペプチドが大腸菌（E.coli）に
    おいて産生されたものである請求項55〜57のいずれか1
    項に記載のモノPEG 化MGDFポリペプチド。
  59. 【請求項５９】水溶性ポリエチレングリコールを、図11
    記載のアミノ酸22〜184を含むMGDFポリペプチドに結合
    させる方法において、 MGDFポリペプチドとポリエチレ
    ングリコールとが結合してモノPEG 化MGDFポリペプチド
    が得られるような条件下で、MGDFポリペプチドとポリエ
    チレングリコールとを接触させることを含む、前記方
    法。
  60. 【請求項６０】MGDFポリペプチドのN-末端におけるα-
    アミノ基を反応性にするのに十分に酸性のpHで、還元的
    アルキル化条件下でMGDFポリペプチドとポリエチレング
    リコールとを結合することを含む請求項59記載の方法。
  61. 【請求項６１】MGDFポリペプチドが平均分子量2〜100
    キロダルトンを有するポリエチレングリコールでモノPE
    G 化されている請求項59または60に記載の方法。
  62. 【請求項６２】MGDFポリペプチドが、図11記載のアミノ
    酸22〜184およびそのN-末端における配列Met-Lys を含
    むポリペプチドをコードするDNA を大腸菌（E.coli）に
    おいて発現させることにより得られた前記ポリペプチド
    から Met-2-Lys -1を開裂することにより作られたMGDFポ
    リペプチドである請求項61記載の方法。
  63. 【請求項６３】前記MGDFポリペプチドが、a)図11記載の
    アミノ酸22〜184と、そのN-末端にあるMet-Lys 配列と
    を含むポリペプチドをコードするDNA を大腸菌（E.col
    i）中において発現させ、b)発現したポリペプチドを単
    離し、c)単離したポリペプチドからMet-2-Lys-1を開裂
    させて製造される請求項61記載の方法。載の医薬組成
    物。
JP23173099A 1994-03-31 1999-08-18 巨核球の成長と分化を刺激するｍｇｄｆの誘導体とその製造方法 Expired - Fee Related JP3485842B2 (ja)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US22176894A 1994-03-31 1994-03-31
US25262894A 1994-05-31 1994-05-31
US08/321,488 US5795569A (en) 1994-03-31 1994-10-12 Mono-pegylated proteins that stimulate megakaryocyte growth and differentiation
US34778094A 1994-11-30 1994-11-30
US08/321488 1994-11-30
US08/347780 1994-11-30
US08/252628 1994-11-30
US08/221768 1994-11-30

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP7525783A Division JP2996415B2 (ja) 1994-03-31 1995-03-30 巨核球の成長と分化を刺激するモノｐｅｇ化ｍｇｄｆポリペプチド

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2000103799A true JP2000103799A (ja) 2000-04-11
JP3485842B2 JP3485842B2 (ja) 2004-01-13

Family

ID=27499246

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP7525783A Expired - Fee Related JP2996415B2 (ja) 1994-03-31 1995-03-30 巨核球の成長と分化を刺激するモノｐｅｇ化ｍｇｄｆポリペプチド
JP23173099A Expired - Fee Related JP3485842B2 (ja) 1994-03-31 1999-08-18 巨核球の成長と分化を刺激するｍｇｄｆの誘導体とその製造方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP7525783A Expired - Fee Related JP2996415B2 (ja) 1994-03-31 1995-03-30 巨核球の成長と分化を刺激するモノｐｅｇ化ｍｇｄｆポリペプチド

Country Status (32)

Country Link
US (1) US5766581A (ja)
EP (3) EP0755263A4 (ja)
JP (2) JP2996415B2 (ja)
KR (2) KR100203824B1 (ja)
CN (2) CN1103782C (ja)
AT (1) ATE169335T1 (ja)
AU (1) AU691606B2 (ja)
BG (1) BG62685B1 (ja)
BR (1) BR9506017A (ja)
CA (1) CA2167090C (ja)
CZ (2) CZ288926B6 (ja)
DE (1) DE69503849T2 (ja)
DK (1) DK0690127T3 (ja)
EE (1) EE9600121A (ja)
ES (1) ES2119250T3 (ja)
FI (1) FI960136A (ja)
GE (1) GEP20002180B (ja)
GR (1) GR3027593T3 (ja)
HK (2) HK1004231A1 (ja)
HU (1) HU218893B (ja)
IL (1) IL113206A0 (ja)
LV (2) LV11783B (ja)
MY (1) MY113048A (ja)
NO (1) NO960111L (ja)
NZ (1) NZ283863A (ja)
PL (1) PL182567B1 (ja)
RO (1) RO115788B1 (ja)
SI (1) SI0690127T1 (ja)
SK (1) SK166695A3 (ja)
TW (3) TW414799B (ja)
WO (1) WO1995026746A1 (ja)
YU (1) YU20095A (ja)

Families Citing this family (87)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5824784A (en) * 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
WO1996017062A1 (en) * 1994-11-30 1996-06-06 Zymogenetics, Inc. Low molecular weight thrombopoietin
US5986049A (en) * 1994-12-30 1999-11-16 Zymogenetics, Inc. Purified thrombopoietin and method of making it
TW387940B (en) * 1995-01-17 2000-04-21 Kirin Brewery Anti-tpo monodonal antibody
CA2212006A1 (en) 1995-02-03 1996-08-08 G.D. Searle & Co. Novel c-mpl ligands
AU691410B2 (en) * 1995-02-15 1998-05-14 Amgen, Inc. MPL ligand analogs
US5989538A (en) * 1995-02-15 1999-11-23 Amgen Inc. Mpl ligand analogs
US5696250A (en) * 1995-02-15 1997-12-09 Amgen Inc. DNA encoding megakaryocyte growth and development factor analogs
TW434020B (en) * 1995-03-15 2001-05-16 Kirin Brewery Methods for preventing adsorption of thrombopoietin (TPO), and stable top-containing compositions
TW434021B (en) * 1995-03-15 2001-05-16 Kirin Brewery Methods for preventing adsorption of thrombopoietin (TPO), and stable TPO-containing compositions
US6251864B1 (en) 1995-06-07 2001-06-26 Glaxo Group Limited Peptides and compounds that bind to a receptor
US5869451A (en) * 1995-06-07 1999-02-09 Glaxo Group Limited Peptides and compounds that bind to a receptor
CN1315870C (zh) 1995-06-07 2007-05-16 葛兰素集团有限公司 结合血小板生成素受体的肽和化合物
TW497972B (en) * 1995-06-08 2002-08-11 Kirin Brewery Stable thrombopoietin (TPO)-containing lyophilized compositions
EP0870027A1 (en) * 1995-10-05 1998-10-14 G.D. Searle & Co. Novel c-mpl receptor agonists
US6066318A (en) * 1995-10-05 2000-05-23 G.D. Searle & Co. Multi-functional hematopoietic fusion proteins between sequence rearranged C-MPL receptor agonists and other hematopoietic factors
US5879673A (en) * 1996-01-25 1999-03-09 Genentech, Inc. Administration of thrombopoietin on a single day only
US7091311B2 (en) 1996-06-07 2006-08-15 Smithkline Beecham Corporation Peptides and compounds that bind to a receptor
CN1142940C (zh) * 1996-10-04 2004-03-24 安姆根有限公司 含有mpl配体的药物组合物
US5914251A (en) * 1996-10-22 1999-06-22 Amgen Inc. Nucleic acid molecules encoding placental-derived growth factors
AU2006201129B2 (en) * 1997-05-21 2008-03-13 Genentech, Inc. Novel administration of thrombopoietin
EP0983082A1 (en) * 1997-05-21 2000-03-08 Genentech, Inc. Novel administration of thrombopoietin
CZ298597B6 (cs) 1998-04-28 2007-11-21 Applied Research Systems Ars Holding N. V. Zpusob postupné vazby polyethylenglykolových skupin na polypeptid
US20030228666A1 (en) 1998-06-30 2003-12-11 Daewoong Pharmaceutical Co., Ltd. Novel human thrombopoietin mutein
HU228582B1 (en) 1998-10-23 2013-04-29 Kirin Amgen Inc Dimeric thrombopoietin peptide mimetics binding to mp1 receptor and having thrombopoietic activity
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
WO2000057891A1 (en) 1999-03-30 2000-10-05 Trustees Of Boston University Compositions and methods for producing platelets and/or proplatelets from megakaryocytes
US20030211094A1 (en) 2001-06-26 2003-11-13 Nelsestuen Gary L. High molecular weight derivatives of vitamin k-dependent polypeptides
DE60142239D1 (de) 2000-08-11 2010-07-08 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd DEN PHOSPHORSÄURE-METABOLISMUS, DEN KALZIUM-METABOLISMUS, VERKALKUNG UND DEN VITAMIN D-METABOLISMUS KONTROLLIERENDE POLYPEPTIDE SOWIE FüR DIESE KODIERENDE DNA-MOLEKÜLE
AU2001280161A1 (en) * 2000-08-24 2002-03-04 Kirin Beer Kabushiki Kaisha C-mpl ligand-containing medicinal compositions for increasing platelets and erythrocytes
UY26317A1 (es) * 2000-08-30 2000-10-31 Alfonso Cayota Carlos Pritsch Sistema de produccion de trombopoyetina humana por celulas de mamiferos en cultivo
EP1234583A1 (en) * 2001-02-23 2002-08-28 F. Hoffmann-La Roche Ag PEG-conjugates of HGF-NK4
US7332474B2 (en) 2001-10-11 2008-02-19 Amgen Inc. Peptides and related compounds having thrombopoietic activity
US20030191056A1 (en) 2002-04-04 2003-10-09 Kenneth Walker Use of transthyretin peptide/protein fusions to increase the serum half-life of pharmacologically active peptides/proteins
US20040028661A1 (en) * 2002-08-07 2004-02-12 Bartelmez Stephen H. Expansion of cells using thrombopoietin and anti-transforming growth factor-beta
AU2003276846A1 (en) * 2002-08-09 2004-02-25 Xencor Thrombopoiesis-stimulating proteins having reduced immunogenicity
ES2462916T3 (es) 2002-09-18 2014-05-26 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Métodos para aumentar la producción de células madre hematopoyéticas y plaquetas
JP2006519170A (ja) * 2002-12-26 2006-08-24 マウンテン ビュー ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、ポリペプチドホルモン、およびレセプター結合活性が保存されたそのアンタゴニストのポリマー結合体
GEP20084486B (en) * 2002-12-26 2008-09-25 Mountain View Pharmaceuticals Polymer conjugates of interferon-beta with enhanced biological potency
BRPI0407401A (pt) * 2003-02-11 2006-02-21 Irm Llc compostos bicìclicos e composições
US20090123367A1 (en) * 2003-03-05 2009-05-14 Delfmems Soluble Glycosaminoglycanases and Methods of Preparing and Using Soluble Glycosaminoglycanases
MXPA05009429A (es) 2003-03-05 2005-12-12 Halozyme Inc Glicoproteina hialuronidasa soluble (shasegp), proceso para preparar la misma, usos y composiciones farmaceuticas que la comprenden.
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US7642340B2 (en) 2003-03-31 2010-01-05 Xencor, Inc. PEGylated TNF-α variant proteins
US7610156B2 (en) * 2003-03-31 2009-10-27 Xencor, Inc. Methods for rational pegylation of proteins
US7587286B2 (en) * 2003-03-31 2009-09-08 Xencor, Inc. Methods for rational pegylation of proteins
SI1675606T1 (sl) 2003-08-28 2017-07-31 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Peptidi in spojine, ki se vežejo na trombopoietinske receptorje
US7723295B2 (en) 2003-08-28 2010-05-25 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Peptides and compounds that bind to a receptor
WO2005035564A2 (en) 2003-10-10 2005-04-21 Xencor, Inc. Protein based tnf-alpha variants for the treatment of tnf-alpha related disorders
RU2542391C2 (ru) 2003-12-30 2015-02-20 Аугустинус БАДЕР Способ регенерации ткани
WO2005118551A2 (en) * 2004-05-28 2005-12-15 Ligand Pharmaceuticals Inc. Thrombopoietin activity modulating compounds and methods
US20060018875A1 (en) * 2004-06-14 2006-01-26 Blatt Lawrence M Interferon compositions and methods of use thereof
US8143380B2 (en) 2004-07-08 2012-03-27 Amgen Inc. Therapeutic peptides
EP1768700B1 (en) * 2004-07-16 2010-12-15 Nektar Therapeutics Conjugates comprising gm-csf and a polymer
CA2583764C (en) 2004-10-25 2009-06-09 Ligand Pharmaceuticals, Inc. Thrombopoietin activity modulating compounds and methods
US8008453B2 (en) 2005-08-12 2011-08-30 Amgen Inc. Modified Fc molecules
US9012605B2 (en) 2006-01-23 2015-04-21 Amgen Inc. Crystalline polypeptides
US7981425B2 (en) 2006-06-19 2011-07-19 Amgen Inc. Thrombopoietic compounds
US8318153B2 (en) * 2006-06-29 2012-11-27 Nalin David R Method of medically treating an individual
CA2687141C (en) 2007-05-22 2014-04-01 Amgen Inc. Compositions and methods for producing bioactive fusion proteins
TWI395593B (zh) 2008-03-06 2013-05-11 Halozyme Inc 可活化的基質降解酵素之活體內暫時性控制
US20100003238A1 (en) 2008-04-14 2010-01-07 Frost Gregory I Modified hyaluronidases and uses in treating hyaluronan-associated diseases and conditions
TWI394580B (zh) 2008-04-28 2013-05-01 Halozyme Inc 超快起作用胰島素組成物
EP3037529B1 (en) 2008-12-09 2019-03-27 Halozyme, Inc. Extended soluble ph20 polypeptides and uses thereof
EP2358790B2 (en) 2008-12-16 2016-09-21 Dow Corning Corporation Preparation of siloxanes
US20110294733A1 (en) 2009-01-20 2011-12-01 Hanall Biopharma Co., Ltd. Modified human thrombopoietin polypeptide fragment and manufacturing method thereof
US8680150B2 (en) * 2009-05-28 2014-03-25 Ligand Pharmaceuticals, Inc. Small molecule hematopoietic growth factor mimetic compounds that activate hematopoietic growth factor receptors
EP3127427B1 (en) 2009-05-29 2020-01-08 Novartis Ag Methods of administration of thrombopoietin agonist compounds
MX2012003282A (es) 2009-09-17 2012-04-30 Baxter Healthcare Sa Co-formulacion estable de hialuronidasa e inmunoglobulina, y metodos de su uso.
WO2011098095A1 (en) 2010-02-09 2011-08-18 Aplagen Gmbh Peptides binding the tpo receptor
KR20130125753A (ko) 2010-07-20 2013-11-19 할로자임, 아이엔씨 항-히알루로난제 투여와 관련된 유해 부작용의 치료
EP2907504B1 (en) 2011-02-08 2017-06-28 Halozyme, Inc. Composition and lipid formulation of a hyaluronan-degrading enzyme and the use thereof for treatment of benign prostatic hyperplasia
BR112013032265A2 (pt) 2011-06-17 2016-12-20 Halozyme Inc métodos de infusão de insulina subcutânea contínua com uma enzima de degradação do hialuronano
US20130011378A1 (en) 2011-06-17 2013-01-10 Tzung-Horng Yang Stable formulations of a hyaluronan-degrading enzyme
US20130071394A1 (en) 2011-09-16 2013-03-21 John K. Troyer Compositions and combinations of organophosphorus bioscavengers and hyaluronan-degrading enzymes, and methods of use
EP2771028A2 (en) 2011-10-24 2014-09-03 Halozyme, Inc. Companion diagnostic for anti-hyaluronan agent therapy and methods of use thereof
JP6067746B2 (ja) 2011-12-30 2017-01-25 ハロザイム インコーポレイテッド Ｐｈ２０ポリペプチド変異体、その製剤および使用
JP6042527B2 (ja) 2012-04-04 2016-12-14 ハロザイム インコーポレイテッド 抗ヒアルロナン剤と腫瘍標的タキサンの組み合わせ治療
WO2014062856A1 (en) 2012-10-16 2014-04-24 Halozyme, Inc. Hypoxia and hyaluronan and markers thereof for diagnosis and monitoring of diseases and conditions and related methods
TW201534726A (zh) 2013-07-03 2015-09-16 Halozyme Inc 熱穩定ｐｈ２０玻尿酸酶變異體及其用途
ES2727137T3 (es) 2014-08-28 2019-10-14 Halozyme Inc Terapia combinada con una enzima de degradación de hialuronano y un inhibidor de puntos de control inmunitario
CA3203273A1 (en) 2014-10-14 2016-04-21 Halozyme, Inc. Compositions of adenosine deaminase-2 (ada2), variants thereof and methods of using same
MX2019015402A (es) 2017-06-22 2020-07-20 Catalyst Biosciences Inc Polipeptidos de serina proteasa 1 de tipo membrana modificada (mtsp-1) y metodos de uso.
WO2019222435A1 (en) 2018-05-16 2019-11-21 Halozyme, Inc. Methods of selecting subjects for combination cancer therapy with a polymer-conjugated soluble ph20
SG11202106244RA (en) 2018-12-28 2021-07-29 Catalyst Biosciences Inc Modified urokinase-type plasminogen activator polypeptides and methods of use
US11613744B2 (en) 2018-12-28 2023-03-28 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Modified urokinase-type plasminogen activator polypeptides and methods of use

Family Cites Families (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4002531A (en) * 1976-01-22 1977-01-11 Pierce Chemical Company Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby
JPS6023084B2 (ja) * 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US4640835A (en) * 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
EP0098110B1 (en) * 1982-06-24 1989-10-18 NIHON CHEMICAL RESEARCH KABUSHIKI KAISHA also known as JAPAN CHEMICAL RESEARCH CO., LTD Long-acting composition
DE3572982D1 (en) * 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
EP0206448B1 (en) * 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
US4810643A (en) * 1985-08-23 1989-03-07 Kirin- Amgen Inc. Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor
US4894440A (en) * 1986-09-17 1990-01-16 Massachusetts Institute Of Technology Method of isolating megakaryocyte stimulatory factor
ZA887773B (en) * 1987-10-26 1989-07-26 Immunex Corp Interleukin-7
US4904584A (en) * 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
US4847325A (en) * 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
CA1340810C (en) * 1988-03-31 1999-11-02 Motoo Yamasaki Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
IL90719A0 (en) * 1988-06-28 1990-01-18 Yissum Res Dev Co Novel nuclei acids and polypeptides encoded thereby
US5128449A (en) * 1988-07-05 1992-07-07 The University Of Tennessee Research Corporation Polypeptide and a method for its production
DE68928138T2 (de) * 1988-09-21 1997-10-02 Meiji Seika Kaisha Neuer megakaryokytischer koloniestimulierender faktor und verfahren zur herstellung
GB8824591D0 (en) * 1988-10-20 1988-11-23 Royal Free Hosp School Med Fractionation process
ATE135370T1 (de) * 1988-12-22 1996-03-15 Kirin Amgen Inc Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor
US5087448A (en) * 1989-02-02 1992-02-11 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Enhancing growth of megakaryocytes in mammals using interleuking 6
US5032396A (en) * 1989-02-17 1991-07-16 Immunex Corporation IL-7 to stimulate platelet production
AU641645B2 (en) * 1989-04-03 1993-09-30 Genetics Institute Inc. Megakaryocyte growth promoting activity
US5260417A (en) * 1989-04-03 1993-11-09 Genetics Institute, Inc. Megakaryocyte growth promoting activity protein
AU5355790A (en) * 1989-04-19 1990-11-16 Cetus Corporation Multifunctional m-csf proteins and genes encoding therefor
DK0487613T3 (da) * 1989-08-08 1996-11-25 Genetics Inst Megakarycytopiesk faktor
US6433142B1 (en) * 1989-08-08 2002-08-13 Genetics Institute, Llc Megakaryocyte stimulating factors
US5215895A (en) * 1989-11-22 1993-06-01 Genetics Institute, Inc. Dna encoding a mammalian cytokine, interleukin-11
JPH04218000A (ja) * 1990-02-13 1992-08-07 Kirin Amgen Inc 修飾ポリペプチド
EP0672684A1 (en) * 1990-05-31 1995-09-20 Meija Seika Kabushiki Kaisha, Ltd. Novel megakaryocyte colony stimulating factor and production thereof
JPH06502621A (ja) * 1990-07-02 1994-03-24 ヒップル　キャンサー　リサーチ　センター ヒトｍｅｇ―ｃｓｆタンパク質と方法
IE912365A1 (en) * 1990-07-23 1992-01-29 Zeneca Ltd Continuous release pharmaceutical compositions
EP0504361A4 (en) * 1990-10-05 1994-08-17 Systemix Inc Megakaryocyte and platelet growth, production and composition
JPH05503302A (ja) * 1990-10-12 1993-06-03 アムジエン・インコーポレーテツド 巨核球成熟因子
WO1992007074A1 (fr) * 1990-10-19 1992-04-30 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Polypeptide de la famille d'un recepteur de facteur de croissance, application au diagnostic et a la therapie des maladies myeloproliferatives
AU646530B2 (en) * 1990-12-28 1994-02-24 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Novel megakaryocyte amplifier and production thereof
JP3283288B2 (ja) * 1991-03-08 2002-05-20 電気化学工業株式会社 生理活性ペプチド製剤
JPH04295500A (ja) * 1991-03-26 1992-10-20 Asahi Chem Ind Co Ltd 新規な巨核球増幅因子とその製法
EP0591420A1 (en) * 1991-06-28 1994-04-13 New England Deaconess Hospital A differentiated megakaryocyte line producing novel megakaryocyte differentiation factors
AU2147192A (en) * 1991-06-28 1993-01-25 Genentech Inc. Method of stimulating immune response using growth hormone
US5250732A (en) * 1991-07-18 1993-10-05 Genentech, Inc. Ketamine analogues for treatment of thrombocytopenia
NZ244778A (en) * 1991-10-21 1994-03-25 Ortho Pharma Corp Peg imidates and protein derivatives thereof
JP3328341B2 (ja) * 1991-12-27 2002-09-24 中外製薬株式会社 新規な巨核球増幅因子
WO1993016106A1 (en) * 1992-02-07 1993-08-19 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Novel megakaryocyte amplifier and production thereof
AU4190893A (en) * 1992-07-17 1994-01-20 Suntory Limited Megakaryocyte differentiation factor
SG47030A1 (en) * 1994-01-03 1998-03-20 Genentech Inc Thrombopoietin
WO1995021919A2 (en) * 1994-02-14 1995-08-17 Kirin Brewery Company, Limited Protein having tpo activity
CN1148408A (zh) * 1994-02-14 1997-04-23 津莫吉尼蒂克斯公司 血细胞生成蛋白及其制造材料和方法
SG79882A1 (en) * 1994-02-14 2001-04-17 Kirin Brewery Protein having tpo activity
WO1995021626A1 (en) * 1994-02-14 1995-08-17 University Of Washington Methods for stimulating erythropoiesis using thrombopoietin
US5547931A (en) * 1994-02-23 1996-08-20 Immtech International Inc. Methods of stimulatory thrombocytopoiesis using modified C-reactive protein
US5571686A (en) * 1994-04-14 1996-11-05 Massachusetts Institute Of Technology Method of using megapoietin for prolonging the survival & viability of platlets

Also Published As

Publication number Publication date
HK1041275B (zh) 2006-07-28
HK1004231A1 (en) 1998-11-20
TW414799B (en) 2000-12-11
ES2119250T3 (es) 1998-10-01
JP3485842B2 (ja) 2004-01-13
TW565568B (en) 2003-12-11
EE9600121A (et) 1997-04-15
GR3027593T3 (en) 1998-11-30
YU20095A (sh) 1998-08-14
DE69503849T2 (de) 1999-04-01
CN1322759A (zh) 2001-11-21
LV11783A (lv) 1997-06-20
GEP20002180B (en) 2000-07-25
EP0675201A1 (en) 1995-10-04
FI960136A0 (fi) 1996-01-11
HU9600059D0 (en) 1996-03-28
HUT74257A (en) 1996-11-28
DK0690127T3 (da) 1999-05-03
MY113048A (en) 2001-11-30
EP0690127A1 (en) 1996-01-03
LV12275A (lv) 1999-05-20
EP0755263A1 (en) 1997-01-29
EP0755263A4 (en) 2005-02-09
CZ288890B6 (cs) 2001-09-12
PL182567B1 (pl) 2002-01-31
BR9506017A (pt) 1997-10-14
JP2996415B2 (ja) 1999-12-27
NZ283863A (en) 1997-12-19
AU691606B2 (en) 1998-05-21
HK1041275A1 (en) 2002-07-05
WO1995026746A1 (en) 1995-10-12
IL113206A0 (en) 1995-06-29
HU218893B (hu) 2000-12-28
LV11783B (en) 1997-12-20
ATE169335T1 (de) 1998-08-15
CN1103782C (zh) 2003-03-26
CZ350595A3 (en) 1997-01-15
BG62685B1 (bg) 2000-05-31
EP0690127B1 (en) 1998-08-05
BG100625A (bg) 1997-04-30
KR100303810B1 (ko) 2001-12-01
RO115788B1 (ro) 2000-06-30
CA2167090C (en) 2002-05-14
FI960136A (fi) 1996-03-11
NO960111D0 (no) 1996-01-10
US5766581A (en) 1998-06-16
KR100203824B1 (ko) 1999-06-15
JPH10510980A (ja) 1998-10-27
CN1229385C (zh) 2005-11-30
CN1137757A (zh) 1996-12-11
SK166695A3 (en) 1997-02-05
AU2230895A (en) 1995-10-23
CZ288926B6 (cs) 2001-09-12
MX9600206A (es) 1998-11-30
DE69503849D1 (de) 1998-09-10
NO960111L (no) 1996-09-24
TW496870B (en) 2002-08-01
PL312577A1 (en) 1996-04-29
CA2167090A1 (en) 1995-10-12
SI0690127T1 (en) 1998-12-31
LV12275B (en) 1999-08-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3485842B2 (ja) 巨核球の成長と分化を刺激するｍｇｄｆの誘導体とその製造方法
US5795569A (en) Mono-pegylated proteins that stimulate megakaryocyte growth and differentiation
CA2178752C (en) N-terminally chemically modified protein compositions and methods
EP0811064A2 (en) Mpl ligand analogs
AU727978B2 (en) MPL ligand analogs
RU2158603C2 (ru) Способы и препараты для стимулирования роста и дифференцировки мегакариоцитов
KR20040069980A (ko) 화학적으로 변형된 프로게니포이에틴 접합체
MXPA96000206A (en) Compositions and methods to stimulate the growth and differentiation of the megacarioci
JP2003024076A (ja) Ｔｐｏ変異体タンパク質
AU2004235682B2 (en) N-Terminally chemically modified protein compositions and methods
AU741659B2 (en) N-terminally chemically modified protein compositions and methods
JPH10212243A (ja) トロンボポエチン蛋白を含有する血小板止血血栓形成能回復促進用組成物
PL183631B1 (pl) Pochodna polipeptydu stanowiącego czynnik wzrostu i rozwoju megakariocytów-(polipeptydu MGDF), sposób jej wytwarzania oraz kompozycja farmaceutyczna zawierająca taką pochodną

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20071024

Year of fee payment: 4

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081024

Year of fee payment: 5

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091024

Year of fee payment: 6

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101024

Year of fee payment: 7

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees