BG100625A - Състави и методи за стимулиране растежа и диференциацията на мегакариоцитите - Google Patents

Състави и методи за стимулиране растежа и диференциацията на мегакариоцитите Download PDF

Info

Publication number
BG100625A
BG100625A BG100625A BG10062596A BG100625A BG 100625 A BG100625 A BG 100625A BG 100625 A BG100625 A BG 100625A BG 10062596 A BG10062596 A BG 10062596A BG 100625 A BG100625 A BG 100625A
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
mgdf
polypeptide
polipeptide
leu
polyethylene
Prior art date
Application number
BG100625A
Other languages
English (en)
Other versions
BG62685B1 (bg
Inventor
Timothy Bartley
Jakob Bogenberger
Robert Bosselman
Pamela Hunt
Olaf Kinstler
Babru Samal
Original Assignee
Amgen Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US08/321,488 external-priority patent/US5795569A/en
Application filed by Amgen Inc. filed Critical Amgen Inc.
Publication of BG100625A publication Critical patent/BG100625A/bg
Publication of BG62685B1 publication Critical patent/BG62685B1/bg

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
    • C07K17/08—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/524—Thrombopoietin, i.e. C-MPL ligand
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/14—Lymphokine; related peptides

Abstract

Изобретението включва нови белтъци, отнасящи се към мегакариоцитите - факторите за растеж и развитие на MGDFs, наречени обобщено MpL лиганди. Тяхнатабиологична активност стимулира растежа и развитието или узряването на мегакариоцитите, при което сеполучават тромбоцити. Изобретението се отнася също до производни на MGDF, включващи MGDF молекули, свързани с водородразтворими полимери като полиетиленгликол, до методите за тяхното получаване и процесите за получаване на MGDFs в хомогенна форма отестествени източници и продуцирането им чрез рекомбинантни генноинженерни техники от бозайници, включително от хора. </P>

Description

WO 95/26746 PCT/US95/03776
No. 100625-BG ТИМОТ Д. БАРТЛИДЖЕЙКЪБ M. БОГЕНБЕРГРОБЕРТ А. БОЗЕЛМАНПАМЕЛАХЪНТОЛАФ Б. КИНСТЛЕРБАРБРУ Б. САМААКАЛИФОРНИЯ, САЩ СЪСТАВИ И МЕТОДИ ЗА СТИМУЛИРАНЕ РАСТЕЖА И ДИФЕРЕНЦИАЦИЯТА НАМЕГАКАРИОЦИТИТЕ I .ОБЛАСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ РАЗГЛЕЖА НОВИ БЕЛТЪЦИ, НАРИЧАНИСИНОНИМНО Мр1 ЛИГАНДИ ИЛИ MGDFs, КОИТО СТИМУЛИРАТ РАСТЕЖА НАМЕГАКАРИОЦИТИТЕ, УСКОРЯВАТ ДИФЕРЕНЦИАЦИЯТА ИЛИ УЗРЯВАНЕТО ИМ ИКАТО КРАЕН ЕФЕКТ УВЕЛИЧАВАТ БРОЯ НА ТРОМБОЦИТИТЕ, ПРЕДСТАВЕНИ САПРОЦЕСИТЕ, ПРИ КОИТО ТЕЗИ БЕЛТЪЦИ СЕ ПОЛУЧАВАТ В ХОМОГЕНЕН ВИД ОТЕСТЕСТВЕНИ ИЗТОЧНИЦИ И ПРОИЗВОДСТВОТО ИМ ЧРЕЗ РЕКОМБИНАНТНИГЕННО ИНЖЕНЕРНИ ТЕХНИКИ. ОТ ДРУГА СТРАНА НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ ПРЕДСТАВЯ ШИРОК ОБЗОР НАНОВ КЛАС ПРОИЗВОДНИ MGDF, ПРИ КОИТО MGDF МОЛЕКУЛАТА Е СВЪРЗАНА СВОДОРАЗТВОТРИМ ПОЛИМЕР, А СЪЩО ТАКА И МЕТОДИТЕ ЗА ПОЛУЧАВАНЕ НАТАКИВА МОЛЕКУЛИ. WO 95/26746 PCT/US95/03776 ОТ ТРЕТА СТРАНА НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ РАЗГЛЕЖДА ПРОИЗВОДНИMGDF, ПРИ КОИТО MGDF МОЛЕКУЛАТА Е СВЪРЗАНА С ЕДНА И ПОВЕЧЕ ГРУПИПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ /PEG/ И МЕТОДИТЕ ЗА ПОЛУЧАВАНЕ НА ТЕЗИ МОЛЕКУЛИ. И, ПРЕДИСТОРИЯ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО В НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ СА ЗАСЕГНАТИ НАЙ-МАЛКО ДВЕ РАЗЛИЧНИНАУЧНИ ОБЛАСТИ. ПЪРВАТА Е СВЪРЗАНА С РАЗВИТИЕТО НА МЕГАКАРИОЦИТИТЕИ ПОСЛЕДВАЩОТО ПРОИЗВОДСТВО НА ТРОМБОЦИТИ, А ВТОРАТА КАСАЕПОЛИПЕПТИДНАТА ЧАСТ ОТ РЕЦЕПТОР ЗА РАСТЕЖЕН ФАКТОР, НАРИЧАН ТУКМр1 РЕЦЕПТОР И НЕГОВИТЕ ЛИГАНДИ. ВСЯКА ОТ ТЕЗИ ОБЛАСТИ НАИЗСЛЕДВАНЕ ЩЕ БЪДЕ РАЗГЛЕДАНА ПО-ДОЛУ. А. ПРОИЗВОДСТВО НА ТРОМБОЦИТИ ОТ МЕГАКАРИОЦИТИТЕ ТРОМБОЦИТЕ СА ЦИРКУЛИРАЩИ КРЪВНИ КЛЕТКИ, КОИТО ИМАТ РЕШАВАЩАРОЛЯ ЗА ПРЕДОТВРАТЯВАНЕТО НА КРЪВОИЗЛИВИ И СЪЩЕСТВЕНО ЗНАЧЕНИЕЗА КОАГУЛАЦИЯТА НА КРЪВТА. МЕГАКАРИОЦИТИТЕ СА КЛЕТЪЧНИЯТ ИЗТОЧНИКЗА ТРОМБОЦИТИТЕ И ПРОИЗХОЖДАТ ОТ ОБЩА КЛЕТКА ПРЕДШЕСТВЕНИК ВКОСТНИЯ МОЗЪК, КОЯТО ДАВА НАЧАЛОТО НА ЦЯЛОТО ХЕМОПОЕТИЧНОКЛЕТЪЧНО РОДОСЛОВИЕ. ТАЗИ КЛЕТКА ПРЕДШЕСТВЕНИК Е ПОЗНАТА КАТОПЛУРИПОТЕНТНА СТВОЛОВА КЛЕТКА ИЛИ PPSC. РАЗВИТИЕТО НА МЕГАКАРИОЦИТНАТА КЛЕТКА ПРЕДШЕСТВЕНИК Е БИЛОПРОСЛЕДЕНО ПО ВРЕМЕТО НА ПОЯВАТА И ФОРМАТА НА МЕГАКАРИОЦИТНИТЕ/МК/ КОЛОНИИ В IN VITRO КЛЕТЪЧНИ СИСТЕМИ В ОТГОВОР НА ПОДХОДЯЩИРАСТЕЖНИ ФАКТОРИ. ВЗРИВООБРАЗНО КОЛОНИЯ-ОБРАЗУВАЩАТА ЕДИНИЦА/BFU-МК/ Е НАЙ-ПРИМИТИВНАТА МЕГАКАРИОЦИТНА КЛЕТКА ПРЕДШЕСТВЕНИК.СЧИТА СЕ, ЧЕ BFU-МК ДАВА НАЧАЛО НА МНОГОБРОЙНИ КОЛОНИЯ-ОБРАЗУВАЩИ ЕДИНИЦИ НА МЕГАКАРИЦИТИТЕ /CFU-МК/, КОИТО СА ПО-ДИФЕРЕНЦИРАНИ МЕГАКАРИОЦИТНИ КЛЕТКИ ПРЕДШЕСТВЕНИЦИ. -2- WO 95/26746 PCT/US95/03776 СЛЕД КАТО МК КЛЕТКИТЕ ПРЕТЪРПЯТ СЛЕДВАЩА ДИФЕРЕНЦИАЦИЯ ТЕЗАГУБВАТ СПОСОБНОСТТА СИ ДА СЕ ДЕЛЯТ ЧРЕЗ МИТОЗА, НО ПРИДОБИВАТСПОСОБНОСТ ДА СЕ ЕНДОРЕБУПЛИЦИРАТ. ЕНДОРЕДУПЛИКАЦИЯ ИЛИЕНДОМИТОЗА Е ЯВЛЕНИЕ, ПРИ КОЕТО В КЛЕТКАТА Е НАЛИЦЕ ДЕЛЕНИЕ НАЯДРОТО БЕЗ ДА ИМА КЛЕТЪЧНО ДЕЛЕНИЕ. КРАЙНИЯТ РЕЗУЛТАТ ОТЕНДОРЕДУПЛИКАЦИЯТА Е МК , КОЙТО Е ПОЛИПЛОИД. ПРИ ПО-НАТАТЪЧНОТОУЗРЯВАНЕ НА МК СЕ ПОЯВЯВАТ ЦИТОПЛАЗМЕНИ ОРГАНЕЛИ И МЕМБРАННИСЪДЪРЖИМИ, КОИТО СА ХАРАКТЕРНИ ЗА ТРОМБОЦИТИТЕ. ТРОМБОЦИТИТЕ СЕ ПОЛУЧАВАТ ОТ УЗРЕЛИ МК ЧРЕЗ ПРОЦЕС, КОЙТО НЕ ЕДОБРЕ ИЗУЧЕН И ЗА КОЙТО СЕ ПРЕДПОЛАГА, ЧЕ Е ПОСЛЕДСТВИЕ ОТФИЗИЧЕСКА ФРАГМЕНТАЦИЯ ИЛИ ДРУГИ МЕХАНИЗМИ. ОБСТОЙНИТЕНАБЛЮДЕНИЯ НА МЕМБРАННИТЕ СТРУКТУРИ В МЕГАКАРИОЦИТИТЕ ДОВЕДОХАДО МОДЕЛ ЗА ТРОМБОЦИТНОТО ОБРАЗУВАНЕ, ПРИ КОИТО ЗАРАЖДАЩИТЕ СЕ ВКЛЕТЪЧНОТО ТЯЛО ТРОМБОЦИТИ СА ОТДЕЛЕНИ С РАЗГРАНИЧИТЕЛНАМЕМБРАНА. ДРУГ МОДЕЛ ЗА ОБРАЗУВАНЕТО НА ТРОМБОЦИТИТЕ Е ПОЛУЧЕН ПРИНАБЛЮДЕНИЕ, ЧЕ МЕГАКАРИОЦИТИТЕ ФОРМИРАТ ЦИТОПЛАЗМЕНИ ГРАНУЛИ,ПРИЩЪПНАТИ НА ИНТЕРВАЛИ С ГОЛЕМИНАТА НА ТОРМБОЦИТ, ОТ КОИТОТРОМБОЦИТИТЕ ВЕРОЯТНО СЕ ОТКЪСВАТ ПОД ДЕЙСТВИЕ НА НАЛЯГАНЕТО НАКРЪВНИЯ ПОТОК В КОСТНИЯ МОЗЪК И/ИЛИ БЕЛИЯ ДРОБ. ЗА ДА ОТБЕЛЕЖАТ © ПРЕДПОЛАГАЕМАТА РОЛЯ НА ТЕЗИ ЦИТОПЛАЗМЕНИ ГРАНУЛИ КАТОПРЕДШЕСТВЕНИЦИ ВЪВ ФОРМИРАНЕТО НА ТРОМБОЦИТИТЕ BECKER ИDEBRUYN ГИ НАРИЧАТ ПРО-ТРОМБОЦИТИ. /ВИЖ. BECKER AND DEBRUYN, AMER.J. ANAT. 145:183. (1976) /. ФИГ. 1. ПРЕДСТАВЛЯВА ПРЕГЛЕД HA РАЗЛИЧНИТЕ КЛЕТКИ ПРЕДШЕСТВЕНИЦИ,УЧАСТВАЩИ В РАЗВИТИЕТО НА МЕГАКАРИОЦИТИТЕ И ТРОМБОЦИТИТЕ.КЛЕТКАТА В КРАЙНАТА ЛЯВА ЧАСТ НА ФИГУРАТА ПРЕДСТАВЛЯВА PPSC, -3- WO 95/26746 PCT/US95/03776 СЛЕДВАЩАТА КЛЕТКА ВДЯСНО ПРЕДСТАВЛЯВА BFU - МК, СЛЕДВАНА ОТ CFU-МК. КЛЕТКАТА, НАМИРАЩА СЕ В ЕНДОРЕДУПЛИКАЦИЯ, КОЯТО Е РАЗПОЛОЖЕНАНЕПОСРЕДСТВЕНО ВДЯСНО ОТ PPSC НА ФИГУРАТА Е ЗРЯЛА МЕГАКАРИОЦИТНАКЛЕТКА. В РЕЗУЛТАТ НА ЕНДОМИТОЗАТА ТАЗИ КЛЕТКА Е СТАНАЛА ПОЛИПЛОИД.СЛЕДВАЩАТА ФИГУРА ВДЯСНО ПОКАЗВА ДЪЛГИТЕ ЦИГОПЛАЗМЕНИ ГРАНУЛИ,ПОЯВЯВАЩИ СЕ ОТ ПОЛИПЛОИДНИТЕ ЯДРА НА ЗРЯЛАТА МЕГАКАРИОЦИТНАКЛЕТКА. В НАЙ-ДЯСНАТА СТРАНА НА ФИГУРАТА СА ПОКАЗАНИ НЯКОЛКОТРОМБОЦИТА, ПОЛУЧЕНИ ЧРЕЗ фРАГМЕНТАЦИЯ НА ЦИТОПЛАЗМЕНИТЕГРАНУЛИ. СЛЕДВА СПИСЪК НА НЯКОИ ПРЕДИШНИ ПУБЛИКАЦИИ, СВЪРЗАНИ С ТУКОПИСАНОТО ЗРЕЕНЕ НА МЕГАКАРИОЦИТИТЕ И ПРОИЗВОДСТВОТО НАТРОМБОЦИТИ: 1. WILLIAMS, N. AND LEVINE, R.F., BRITISH JOURNAL OF HAEMATOLOGY 52: 173-180(1982). 2. LEVIN, J., MOLECULAR BIOLOGY AND DIFFERENTIATION OF MEGAKARYOCYTES,PUB. WILEY-LISS, INC.: 1-10 (1990). 3. GEWIRTZ, A.M., THE BIOLOGY OF HEMATOPOIESIS, PUB. WILEY-LISS, INC. :123-132(1990). 4. HAN, Z.C., ET AL., INT. J. HEMATOL. 54:3-14 (1991). 5. NIEUWENHUIS, H.K. AND SIXMA, J., NEW ENG. J. OF MED. 327 : 1812-1813 (1992). 6. LONG, M., STEM CELLS 11 : 33-40 (1993). -4- WO 95/26746 PCT/US95/03776 Б. РЕГУЛАЦИЯ НА ОБРАЗУВАНЕТО НА ТРОМБОЦИТИ, ГОЛЯМО КОЛИЧЕСТВО ДАННИ, СЪБРАНИ В РЕДИЦА ЛАБОРАТОРИИ, ПОКАЗВАТ,ЧЕ ПРОИЗВОДСТВОТО НА ТРОМБОЦИТИ СЕ РЕГУЛИРА ОТ ХУМОРАЛНИФАКТОРИ. СЛОЖНОСТТА НА ТОЗИ БИОЛОГИЧЕН ПРОЦЕС ПЪРВОНАЧАЛНО НЕ БЕОЦЕНЕНА И В ПОСЛЕДСТВИЕ СЕ ОКАЗА, ЧЕ ТАКАВА СПОСОБНОСТ ПРИТЕЖАВАТГРУПА ЧОВЕШКИ РАСТЕЖНИ ФАКТОРИ. МЕГАКАРИОЦИТНАТА РЕГУЛАЦИЯ СЕ ОСЪЩЕСТВЯВА НА МНОГО КЛЕТЪЧНИНИВА. ГРУПА ЦИТОКИНИ УВЕЛИЧАВА ПРОИЗВОДСТВОТО НА ТРОМБОЦИТИ ЧРЕЗРАЗШИРЯВАНЕ НА КЛЕТЪЧНИЯ ПУЛ НА КЛЕТКИТЕ ПРЕДШЕСТВЕНИЦИ. ВТОРАГРУПА РАСТЕЖНИ ФАКТОРИ ДЕЙСТВАТ КАТО ФАКТОРИ НА ЗРЕЕНЕТО ВЪРХУПО-ДИфЕРЕНЦИРАНИ КЛЕТКИ ИЛИ СПОМАГАТ ЕДНДОРЕДУПЛИКАЦИЯТА. ВДОПЪЛНЕНИЕ СЕ ОКАЗА, ЧЕ ИМА ДВА НЕЗАВИСИМИ БИОЛОГИЧНИ ЦИКЪЛА СОБРАТНА ВРЪЗКА РЕГУЛИРАЩИ ТЕЗИ ПРОЦЕСИ. НЯКОЛКО ЛИНИИ НЕСПЕЦИФИЧНИ ХЕМАТОПОЕТИЧНИ РАСТЕЖНИ ФАКТОРИОКАЗВАТ ВАЖНИ ЕФЕКТИ ВЪРХУ ЗРЕЕНЕТО НА МК. СТИМУЛИРАЩИЯТ ФАКТОРНА ГРАНУЛОЦИТО-МАКРОфАГОВАТА КОЛОНИЯ /GM-CSF/, ИНТЕРЛЕВКИН - 3/IL-З/, IL-6, IL-11, ЛЕВКЕМИЯ ИНХИБИРАЩИЯТ ФАКТОР /LIF/ И ЕРИТРОПОЕТИНА/ЕРО/ ВСЕКИ ПООТДЕЛНО СПОСОБСТВА ЗРЕЕНЕТО НА ЧОВЕШКИТЕ МК, ΚΑΚΤΟЕ ПОКАЗАНО ПО ТЕХНИТЕ ЕФЕКТИ ВЪРХУ ГОЛЕМИНАТА, БРОЯ ИЛИПЛОИДНОСТТА НА МК. ЕФЕКТИТЕ ВЪРХУ МК ЗРЕЕНЕТО НА LIF, IL-6 И IL-11 САИЛИ ЧАСТИЧНО/LIF И IL-б/, ИЛИ НАПЪЛНО /IL-11/ДОПЪЛНИТЕЛНИ КЪМ ТЕЗИ НАIL-З. ИЗПОЛЗВАЙКИ ДАННИ ОТ ПРЕДИШНИ ПУБЛИКАЦИИ МОЖЕ ДА СЕПРЕДПОЛОЖИ, ЧЕ КОМБИНАЦИИ ОТ ЦИТОКИНИ МОЖЕ ДА СЕ ОКАЖЕНЕОБХОДИМА ЗА СПОМАГАНЕ НА МК ЗРЕЕНЕТО IN VITRO. СЛЕДВА СПИСЪК НА НЯКОИ ПРЕДИШНИ ПУБЛИКАЦИИ, СВЪРЗАНИ СРЕГУЛАЦИЯТА НА ПРОИЗВОДСТВОТО НА МЕГАКАРИОЦИТИ И ТРОМБОЦИТИ: 7. HOFFMAN, R. ЕТ AL., BLOOD CELLS 13: 75-86 (1987). -5- WO 95/26746 PCT/US95/03776 8. MURPHY, M.J., HEMATOLOGY/ONCOLOGY CLINICS OF NORTH AMERICA 3 (3):465-478(1988). 9. HOFFMAN, R., BLOOD 74 (4): 1196 -1212 (1989). 10. MAZUR, E.M. AMD COHEN, J. L., CLIN. PHARMACOL. THER., 46 (3): 250 - 256 (1989). 11. GEWIRTZ, A.M. AND CALABRETTA, B., INT. J. CELL CLONING 8: 267- 276 (1990). 12. WILLIAMS, N., PROGRESS IN GROWTH FACTOR RESEARCH 2: 81-95 (1990). 13. GORDON, M.S. AND HOFFMAN, R., BLOOD 80 (2): 302-307 (1992). 14. HUNT, P. ET. AL, EXP. HEMATOL. 21: 372-281 (1993). 15. HUNT, P. ET AL, EXP. HEMATOL. 21:1295-1304 (1993) ДОКЛАДВАНО Е СЪЩО ТАКА /ВИЖ ТОЧКА 16/, ЧЕ ЧОВЕШКИЯТ АПЛАСТИЧЕНСЕРУМ ПРИТЕЖАВА СТИМУЛИРАЩА АКТИВНОСТ СПРЯМО МЕГАКАРИОЦИТНАТАКОЛОНИЯ, РАЗЛИЧНА ОТ ТАЗИ НА IL-3, СТИМУЛИРАЩИЯ ФАКТОР НАГРАНУЛОЦИТНАТА КОЛОНИЯ И ФАКТОРИТЕ, ПРИСЪСТВАЩИ В ЛИМФАТА.МОЛЕКУЛАТА ОТГОВОРНА ЗА ТАЗИ АКТИВНОСТ ОБАЧЕ НЕ Е БИЛА ИЗОЛИРАНА,НИТО ХАРАКТЕРИЗИРАНА В ПРЕДИШЕН ТРУД. 16. MAZUR, Е.М., ЕТ AL., BLOOD 76: 290-297 /1990/ В, Мр1 РЕЦЕПТОР МИЕЛОПРОЛИФЕРАТИВНИЯ ЛЕВКЕМИЧЕН ВИРУС /MPLV/ Е МИШИРЕПЛИКАЦИОННО ДЕФЕКТЕН РЕТРОВИРУС, КОЙТО ПРИЧИНЯВА АКУТНАЛЕВКЕМИЯ В ЗАРАЗЕНИТЕ БОЗАЙНИЦИ. УСТАНОВЕНО Е, ЧЕ ГЕН ЕКСПРЕСИРАН -6- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ОТ MPLV СЕ СЪСТОИ ОТ ЧАСТ ОТ ГЕН, КОДИРАЩ СИНТЕЗАТА НА ВИРУСНАТАОБВИВКА, СВЪРЗАН СЪС СЕГМЕНТ, ОТНАСЯЩ СЕ ДО СЕМЕЙСТВОТО НАЦИТОКИНОВИТЕ РЕЦЕПТОРИ, ВКЛЮЧИТЕЛНО РЕЦЕПТОРИТЕ ЗА GM-CSF, G-CSFИЕРО. ЕКСПРЕСИЯТА НА MPLV ГЕНА, ОПИСАН ПО-ГОРЕ, ПРИТЕЖАВА ИНТЕРЕСНАТАБИОЛОГИЧНА СПОСОБНОСТ ДА ПРЕДИЗВИКВА НЕЗАБАВНО ПРИДОБИВАНЕ НАРАСТЕЖНО-ФАКТОРНА НЕЗАВИСИМОСТ ΚΑΚΤΟ ЗА ПРОАИфЕРАЦИЯТА, ТАКА ИЗА УЗРЯВАНЕТО НА МИШИ КЛЕТКИ ОТ РАЗЛИЧНИ ВИДОВЕ. НЕЩО ПОВЕЧЕ -НЯКОИ КЛЕТЪЧНИ КУЛТУРИ ОТ КОСТЕН МОЗЪК АКУТНО ТРАНСФОРМИРАНИ ОТMPLV СЪДЪРЖАТ МЕГАКАРИОЦИТИ, КОЕТО ПРЕДПОЛАГА, ЧЕ СЪЩЕСТВУВАВРЪЗКА МЕЖДУ MPLV ГЕНА И РАСТЕЖА И ДИФЕРЕНЦИАЦИЯТА НАМЕГАКАРИОЦИТИТЕ. ВЕЧЕ Е УСТАНОВЕНО, ЧЕ ВИРУСНИЯТ ГЕН НА MPLV /НАРИЧАН ТУК V-Mpl/ ИМАХОМОЛОГ В КЛЕТКИТЕ НА БОЗАЙНИЦИТЕ, НАРИЧАН КЛЕТЪЧЕН MPL ГЕН /ИЛИ С-Mpl/. С ПОМОЩТА НА ПРОБИ С V-Mpl ПРОИЗХОД Е КЛОНИРАНА кДНК,СЪОТВЕТСТВАЩА НА ЧОВЕШКИЯ С-MPL ГЕН. ВИЖ РСТ ПУБЛИКУВАНА ЗАЯВКАWO 92/07074 /ПУБЛИКУВАНА НА 30 АПРИЛ 1992; РАЗГЛЕДАНА ПО-ДОЛУ/. РЕДИЦААНАЛИЗИ ПОКАЗАХА, ЧЕ БЕЛТЪКА, КОДИРАН ОТ С-Mpl ГЕНА ПРИНАДЛЕЖИ КЪМСЕМЕЙСТВОТО НА СИЛНО КОНСЕРВАТИВНИЯ ЦИТОКИНОВ РЕЦЕПТОР, СЪЩОКАТО СЪОТВЕТНИЯ V-Mpl ГЕНЕН ПРОДУКТ. СМЯТА СЕ, ЧЕ ТОЗИ КЛЕТЪЧЕН С-Mpl ГЕН ИГРАЕ ФУНКЦИОНАЛНА РОЛЯ ВХЕМОПОЕЗАТА. ТОВА СТАНОВИЩЕ СЕ БАЗИРА НА НАБЛЮДЕНИЕ НАПРАВЕНО СПОМОЩТА НА РНК-ЗАЩИТЕНА ПРОБА И RT-PCR ЕКСПЕРИМЕНТИ, ПОКАЗВАЩИ,ЧЕ Е НАЛИЦЕ ЕКСПРЕСИЯ НА ТОЗИ ГЕН В КОСТЕН МОЗЪК, ДАЛАК И БЯЛ ДРОБ ОТМЪРТВИ МИШКИ, НО НЕ И В ДРУГИ ОРГАНИ. ПО СПЕЦИАЛНО С-Mpl ГЕНА ЕЕКСПРЕСИРАН ВЪРХУ МЕГАКАРИОЦИТИ. СЪЩО ТАКА Е ПОКАЗАНО, ЧЕЧОВЕШКИЯТ С-Mpl КЛЕТЪЧЕН ГЕН Е ЕКСПРЕСИРАН В CD - ПОЗИТИВНИ КЛЕТКИ, -7- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ВКЛЮЧИТЕЛНО ПРЕЧИСТЕНИ МЕГАКАРИОЦИТИ И ТРОМБОЦИТИ. CD Е АНТИГЕН,ПРИСЪЩ НА РАННИ ХЕМАТОПОЕТИЧНИ КЛЕТКИ ПРЕДШЕСТВЕНИЦИ. ОЩЕПОВЕЧЕ ПРИ СМЕСВАНЕТО НА СИНТЕТИЧНИ ОЛИГОДЕЗОКСИНУКЛЕТИДИ,КОИТО СА БЕЗСМИСЛЕНИ ЗА МАТРИЧНАТА РНК НА С-Mpl ЧУВСТВИТЕЛНО СЕИНХИБИРА КОЛОНИЯ ФОРМИРАЩАТА СПОСОБНОСТ НА ПРЕДШЕСТВЕНИЦИТЕНА CFU-M, НО НЕ СЕ ПОВЛИЯВАТ ЕРИТРОЦИТНИТЕ И ГРАНУЛОМАКРОфАГОВИТЕПРЕДШЕСТВЕНИЦИ. ВЪЗ ОСНОВА НА ГОРЕСПОМЕНАТИТЕ НАБЛЮДЕНИЯ МОЖЕ ДА СЕ ПРЕДПОЛОЖИ,ЧЕ С*Мр1 КОДИРА МОЛЕКУЛА ОТ КЛЕТЪЧНАТА ПОВЪРХНОСТ, НАРИЧАНА ТУК Мр1РЕЦЕПТОР, КОЯТО СЕ СВЪРЗВА С ЛИГАНД, АКТИВИРАЩ РЕЦЕПТОРА ИВЕРОЯТНО ТОВА ВОДИ ДО ПРОИЗВОДСТВО И/ИЛИ РАЗВИТИЕ НАМЕГАКАРИОЦИТИ. РСТ ПАТЕНТНАТА ПУБЛИКАЦИЯ НА ЗАЯВКА WP 92/07074 РАЗГЛЕЖДА БЕЛТЪЧНИЯСЕГМЕНТ, ПРОИЗВЕДЕН ОТ С-Mpl ГЕНА ОТ ЧОВЕШКИ И МИШИ ПРОИЗХОД.СМЯТА СЕ, ЧЕ ТОЗИ ГЕНЕН ПРОДУКТ Е РЕЦЕПТОР, ΚΑΚΤΟ БЕШЕ СПОМЕНАТОПО-ГОРЕ И ЧЕ ТОЙ Е ИЗГРАДЕН ОТ ТРИ ГЛАВНИ УЧАСТЪКА ИЛИ ДОМЕНА:ИЗВЪНКЛЕТЪЧЕН ДОМЕН, ТРАНСМЕМБРАНЕН ДОМЕН И ВЪТРЕКЛЕТЪЧЕН ИЛИЦИТОПЛАЗМЕН ДОМЕН. СВЪРЗАНИ ЗАЕДНО ТЕЗИ ДОМЕНИ ОБРАЗУВАТИНТАКТНИЯ Мр1 РЕЦЕПТОР. ТАЗИ РСТ ПУБЛИКАЦИЯ РАЗГЛЕЖДА СЪЩО ТАКАРАЗТВОРИМАТА ФОРМА НА РЕЦЕПТОРА, КОЯТО ВСЪЩНОСТ СЪОТВЕТСТВА НАИЗВЪНКЛЕТЪЧНИЯ ДОМЕН НА С-Mpl ПРОТЕИНА. ВЪТРЕКЛЕТЪЧНИЯТ ДОМЕНСЪДЪРЖА ХИДРОФОБЕН УЧАСТЪК, КОЙТО ПРИ СВЪРЗВАНЕ С ИЗВЪНКЛЕТЪЧНИЯДОМЕН ЧРЕЗ ТРАНСМЕМБРАННИЯ УЧАСТЪК НА БЕЛТЪКА ПРИДАВА НА ЦЕЛИЯБЕЛТЪК НЕРАЗТВОРИМОСТ И СПОСОБНОСТ ЗА АГРЕГАЦИЯ. ОТ ДРУГА СТРАНАКОГАТО ИЗВЪНКЛЕТЪЧНИЯТ УЧАСТЪК НА С-Mpl ГЕННИЯ ПРОДУКТ Е ОТДЕЛЕНОТ ТРАНСМЕМБРАННИЯ ДОМЕН И ВЪТРЕКЛЕТЪЧНИЯ ДОМЕН ТОЙ СТАВАРАЗТВОРИМ, ПОРАДИ КОЕТО ИЗВЪНКЛЕТЪЧНАТА ЧАСТ НА БЕЛТЪКА ЕНАРИЧАНА ТУК „РАЗТВОРИМА“ ФОРМА НА РЕЦЕПТОРА. -8- WO 95/26746 PCT/US95/03776 СЛЕДВА СПИСЪК НА НЯКОИ ПРЕДИШНИ ПУБЛИКАЦИИ, СВЪРЗАНИ С ГОРЕОПИСАНИТЕ V-Mpl И С-Mpl РЕЦЕПТОРИ И ГЕНИ: 17. WENDLING, F., ЕТ AL., LEUKEMIA 3 (7): 475 - 480 /1989/. 18. WENDLING, F. ЕТ AL., BLOOD 73 (5): 1161 -1167 /1989/. 19. SOUYRI, Μ., ET AL, CELL 63:1137 -1147/1990/. 20. VIGON, I., ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 89: 5640 - 5644 /1992/. 21. SKODA, R.C., ET AL., THE EMBO JOURNAL 12 (7): 2645 - 2653 /1993/. 22. OGAWA, M., BLOOD 81 (11): 2844 - 2853 /1993/. 23. METHIA, N.. ET AL., BLOOD 82 (5): 1395-1401 /1993/. 24. WENDLING, F. ET AL., BLOOD 80 : 246 a /1993/. Г. НУЖДАТА ОТ АГЕНТ, СПОСОБЕН ДА СТИМУЛИРА ПРОИЗВОДСТВОТО НА ТРОМБОЦИТИ НАСКОРО БЕ ПУБЛИКУВАНО, ЧЕ ТРАНСфУЗИИ НА ТРОМБОЦИТИ СЕ ПРИЛАГАТВСЕ ПО-ЧЕСТО В МЕДИЦИНСКИ ЦЕНТРОВЕ В СЕВЕРНА АМЕРИКА, ЗАПАДНАЕВРОПА И ЯПОНИЯ. /ВИЖ GORDON, M.S. И HOFFMAN, R., BLOOD 80 (2) : 302 - 307/1992/. ИЗГЛЕЖДА ТОВА СЕ ДЪЛЖИ ДО ГОЛЯМА СТЕПЕН НА НАПРЕДЪКА НАМЕДИЦИНСКАТА ТЕХНОЛОГИЯ И НАЙ-ВЕЧЕ НА ТАКИВА ТЕХНОЛОГИИ КАТОСЪРДЕЧНАТА ХИРУРГИЯ И ТРАСПЛАНТАЦИИТЕ НА КОСТЕН МОЗЪК, СЪРЦЕ ИЧЕРЕН ДРОБ. УВЕЛИЧАВАНЕТО НА ДОЗИТЕ, КАТО СРЕДСТВО ЗА ОБЕЗПЕЧАВАНЕНА ТЕРАПИЯТА НА БОЛНИ ОТ РАК И HIV - 1 ВИРУСОНОСИТЕЛИ СЪЩО ДОВЕЖДАДО УВЕЛИЧАВАНЕ НА НУЖДАТА ОТ СНАБДЯВАНЕ С ТРОМБОЦИТИ. -9- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ПРИ УПОТРЕБАТА НА ТРОМБОЦИТИ СЪЩЕСТВУВА ВЕРОЯТНОСТ ОТ ПРЕДАВАНЕНА МНОГО КРЪВНИ ИНФЕКЦИОЗНИ ЗАБОЛЯВАНИЯ, А СЪЩО ТАКА И ОТАЛОИМУНИЗАЦИЯ. ОЩЕ ПОВЕЧЕ ПРОИЗВОДСТВОТО НА ПРЕЧИСТЕНИТРОМБОЦИТИ Е СКЪПО И ПОРАДИ ТОВА С ПОВИШАВАНЕ НА УПОТРЕБАТА НАТАКИВА ТРОМБОЦИТИ СЕ УВЕЛИЧАВАТ ВСИЧКИ МЕДИЦИНСКИ РАЗХОДИ. КАТОРЕЗУЛТАТ ОТ ТОВА СЪЩЕСТВУВА ОСТРА НУЖДА ОТ НОВИ, ПОДОБРЕНИ МЕТОДИЗА ПРОИЗВОДСТВО НА ТРОМБОЦИТИ ЗА ЧОВЕШКА УПОТРЕБА. СЛЕДВА ОПИСАНИЕ НА ПРЕДИШНИ ПОДХОДИ ЗА ПРОИЗВОДСТВО НАТРОМБОЦИТИ: АМЕРИКАНСКИ ПАТЕНТ No 5,032,396 СЪОБЩАВА, ЧЕ ИНТЕРЛЕВКИН-7 /Ik-7/ПРИТЕЖАВА СПОСОБНОСТ ДА СТИМУЛИРА ПРОИЗВОДСТВОТО НАТРОМБОЦИТИ. ИНТЕРЛЕВКИН-7 Е ПОЗНАТ СЪЩО КАТО КАТО АИМфОПОЕТИН-1 ИЕ ЛИМФОПОЕТИЧЕН РАСТЕЖЕН ФАКТОР, ПРИТЕЖАВАЩ СПОСОБНОСТ ДАСТИМУЛИРА РАСТЕЖА НА ПРЕДШЕСТВЕНИЦИТЕ НА В- И Т - КЛЕТКИТЕ ВКОСТНИЯ МОЗЪК. ПУБЛИКУВАНАТА РСТ ЗАЯВКА No 86/03747, ПОДАДЕНА НА 19ОКТОМВРИ 1988 Г., И ЗАЯВКАТА ЗА ЕВРОПЕЙСКИ ПАТЕНТ No 88309977,ПОДАДЕНА НА 24 ОКТОМВРИ 1988 РАЗГЛЕЖДАТ ДНК-ОВИ, ВЕКТОРНИ И ДРУГИПОДОБНИ ПРОЦЕСИ ЗА ПРОИЗВОДСТВО НА IL-7 БЕЛТЪЦИ ОТ БОЗАЙНИЦИ СПОМОЩТА НА РЕКОМБИНАНТНИ ДНК ТЕХНОЛОГИИ. ДАННИТЕ ПРЕДСТАВЕНИ ВАМЕРИКАНСКИЯ ПАТЕНТ ПОКАЗВАТ, ЧЕ IL-7 МОЖЕ ДА УВЕЛИЧИЦИРКУЛИРАЩИТЕ ТРОМБОЦИТИ В НОРМАЛНИ И СУБЛЕТАЛНО ОБЛЪЧЕНИМИШКИ. АМЕРИКАНСКИ ПАТЕНТ No 5,087,448 ПОКАЗВА, ЧЕ ПРОЛИфЕРАЦИЯТА НАМЕГАКАРИОЦИТИ И ТРОМБОЦИТИ В БОЗАЙНИЦИ МОЖЕ ДА БЪДЕ СТИМУЛИРАНАОТ ИНТЕРЛЕВКИН-6. РЕКОМБИНАНТНИЯТ ЧОВЕШКИ ИНТЕРЛЕВКИН ЕГЛИКОПОРТЕИН-6 С МОЛЕКУЛНА МАСА 26,000 И ПРИТЕЖАВА РАЗНООБРАЗНИБИОЛОГИЧНИ АКТИВНОСТИ. ДАННИТЕ ПРЕДСТАВЕНИ В ТОЗИ ПАТЕНТПОКАЗВАТ, ЧЕ IL-6 ПРИТЕЖАВА СПОСОБНОСТ ДА УВЕЛИЧАВА КОЛОНИИТЕ НА -10- WO 95/26746 PCT/US95/03776 МЕГАКАРИОЦИТИIV VITRO. И В ДВАТА ГОРЕСПОМЕНАТИ ПАТЕНТА НЕ СЕ СЪДЪРЖА ИНФОРМАЦИЯ ЗА Мр1ЛИГАНДИТЕ, КОИТО СА РАЗГЛЕДАНИ В НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ. НЕЗАВИСИМО ОТ ГОРЕСПОМЕНАТОТО ВСЕ ОЩЕ СЪЩЕСТВУВА ОСТРА НУЖДАОТ НОВИ СТИМУЛАТОРИ НА МЕГАКАРИОЦИТИТЕ И/ИЛИ ТОРМБОЦИТИТЕ ПРИБОЗАЙНИЦИТЕ.
Д. ПРЕДИСТОРИЯ НА ХИМИЧНО МОДИФИЦИРАНИТЕ MGDF В ДНЕШНО ВРЕМЕ БЕЛТЪЦИТЕ ЗА ТЕРАПЕВТИЧНИ НУЖДИ СА ДОСПЪПНИ ВПОДХОДЯЩИТЕ ФОРМИ И НЕОБХОДИМИТЕ КОЛИЧЕСТВА БЛАГОДАРЕНИЕ НАНАПРЕДЪКА НА РЕКОМБИНАНТНИТЕ ДНК ТЕХНОЛОГИИ. ХИМИЧНИ ПРОИЗВОДНИНА ТАКИВА БЕЛТЪЦИ ЕФЕКТИВНО МОГАТ ДА БЛОКИРАТ ФИЗИЧЕСКИЯ КОНТАКТМЕЖДУ ПРОТЕОЛЕТИЧЕН ЕНЗИМ И БЕКТЪЧНАТА МОЛЕКУЛА И ПО ТОЗИ НАЧИНДА ПРЕДОТВРАТЯТ РАЗГРАЖДАНЕТО И. ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИ УСЛОВИЯ МОГАТ ДАСЕ ПОЛУЧАТ ДОПЪЛНИТЕЛНИ ПОДОБРЕНИЯ, УВЕЛИЧАВАЩИ СТАБИЛНОСТТА ИЦИРКУЛАЦИОННОТО ВРЕМЕ НА ТЕРАПЕВТИЧНИТЕ БЕЛТЪЦИ И НАМАЛЯВАЩИТЯХНАТА ИМУНОГЕННОСТ. ВЪПРЕКИ ТОВА ТРЯБВА ДА СЕ ОТБЕЛЕЖИ, ЧЕМОДИФИКАЦИЯТА НА ОПРЕДЕЛЕН БЕЛТЪК НЕ МОЖЕ ДА БЪДЕ ТОЧНОПРЕДСКАЗАНА. /FRANCIS, FOCUS ON GROWTH FACTORS 3 : 4 - 10 /MAY 1992/,/ПУБЛИКУВАН ОТ MEDISCRIPT, MOUNTVIEW COURT, FRIERN BARNET LANE,LONDON N20, OLD, UK/, ПРЕДСТВЛЯВА ОБЗОРЕН ТРУД ВЪРХУ МОДИФИКАЦИЯТАНА БЕЛТЪЦИ И ПРОИЗВОДНИ БЕЛТЪЦИ. ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛА /PEG/ Е ТАКЪВ ХИМИЧЕН МОДИфИКАТОР, КОЙТО СЕИЗПОЛЗВА ЗА ПРИГОТВЯНЕТО НА ТЕРАПЕВТИЧНИ БЕЛТЪЧНИ ПРОДУКТИ.НАПРИМЕР ADASEN ® ПРЕДСТАВЛЯВА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ МОДИФИЦИРАНААДЕНОЗИН ДЕЗАМИНАЗА, КОЯТО Е ОДОБРЕНА ЗА ЛЕЧЕНИЕ НА ТЕЖКИ -11- WO 95/26746 PCT/US95/03776 КОМБИНИРАНИ ЗАБОЛЯВАНИЯ НА ИМУНОНЕДОСТАТЪМНОСТ; СУПЕРОКСИДДИЗМУТАЗА МОДИФИЦИРАНА С ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ Е КЛИНИЧНО ИЗПИТАНАЗА ЛЕЧЕНИЕ НА НАРАНЯВАНИЯ В ГЛАВАТА; ААфА-ИНТЕРфЕРОН МОДИФИЦИРАНС ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ Е БИЛ ТЕСТВАН ВЪВ ФАЗА I НА КЛИНИЧНИИЗСЛЕДВАНИЯ ЗА ЛЕЧЕНИЕ НА ХЕПАТИТ; ЗА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛМОДИФИЦИРАНАТА ГЛЮКОЦЕРЕБРОЗИДАЗА И ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛМОДИФИЦИРАНИЯ ХЕМОГЛОБИН Е СЪОБЩЕНО, ЧЕ СА ПРЕДКЛИНИЧНОТЕСТВАНИ. ПОКАЗАНО Е, ЧЕ СВЪРЗВАНЕТО НА НЯКОИ БЕЛТЪЦИ С ПОЛИЕТИЛЕНГЛИКОЛ ГИ ПРЕДПАЗВА ОТ ПРОТЕОЛИЗА, /SADA, ЕТ AL., J. FERMENTATIONBIOENGINEERING 71 :137-139 /1991/, И СА ДАДЕНИ МЕТОДИТЕ ЗАСВЪРЗВАНЕ НА НЯКОИ ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВИ ГРУПИ. ВИЖ АМЕРИКАНСКИПАТЕНТ No 4,179,337, DAVIS ЕТ AL., „NON - IMMUNOGENIC POLYPEPTIDES“,ИЗДАДЕН НА 18 ДЕКЕМВРИ 1979, И АМЕРИКАНСКИ ПАТЕНТ No 4,002,531, ROYER,„MODIFYING ENZIMES WITH POLYETHILENE GLYCOL AND PRODUCTS PRODUCEDTHEREBY“, ИЗДАДЕН HA 11 ЯНУАРИ 1977 . ВИЖ СЪЩО ABUCHOWSK, ЕТ AL., INENZYMES AND DRUGS. /J.S. HOLCERBERG AND J. ROBERTS, EDS. PP. 367-383 /1981//. ДРУГИ ВОДОРАЗТВОРИМИ ПОЛИМЕРИ КАТО КО-ПОЛИМЕРИТЕ НА ЕТИЛЕНГЛИКОЛА /ПРОПИЛЕН ГЛИКОЛ, КАРБОКСИМЕТИЛЦЕЛУЛОЗА, ДЕКСТРАНПОЛИВИНИЛ АЛКОХОЛ, ПОЛИВИНИЛ ПИРОЛИДОН, ПОЛИ- 1, 3-ДИОКСАЛАН,ПОЛИ-1,3,6-ТРИОКСАН, КО-ПОЛИМЕР НА ЕТИЛЕН С МАЛЕИНОВ АНХИДРИД ИПРОИЗВОЛНИ КО-ПОЛИМЕРИ СА БИЛИ ИЗПОЛЗВАНИ ЗА МОДИФИЦИРАНЕ НАБЕЛТЪЦИ. ПРИ ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛА СА БИЛИ ИЗПОЛЗВАНИ РЕДИЦА РАЗЛИЧНИ МЕТОДИЗА СВЪРЗВАНЕ НА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВАТА МОЛЕКУЛА С БЕЛТЪКА. НАЙ-ОБЩО ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВИТЕ МОЛЕКУЛИ СА БИЛИ СВЪРЗВАНИ С БЕЛТЪКАЧРЕЗ РЕАКТИВОСПОСОБНИ ГРУПИ ОТ ПОВЪРХНОСТТА НА БЕЛТЪКА. УДОБНИ ЗАТАКОВА СВЪРЗВАНЕ СА АМИНО ГРУПИ КАТО ТЕЗИ НА ЛИЗИНОВИТЕ ОСТАТЪЦИИЛИ НА N-КРАЯ. НАПРИМЕР ROYER /АМЕРИКАНСКИ ПАТЕНТ No 4,002,0531ЦИТИРАН ПО-ГОРЕ/ ПОКАЗВА, ЧЕ ЗА СВЪРЗВАНЕТО НА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ С -12- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ЕНЗИМ Е БИЛО ИЗПОЛЗВАНО РЕДУКГИВНО АЛКИЛИРАНЕ. ЕР No 0 539 167,ПУБЛИКУВАН НА 28 АПРИЛ 1993 Г. WRIGHT, „PEG IMIDATES AND PROTEINDERIVATES THEREOF“ ПОКАЗВА, ЧЕ БЕЛТЪЦИ ИЛИ СЪЕДИНЕНИЯ СЪС СВОБОДНААМИНО ГРУПА /И/ СА МОДИФИЦИРАНИ С ИМИДНО ПРОИЗВОДНО НА PEG ИЛИПОДОБНИ ВОДОРАЗТВОРИМИ ОРГАНИЧНИ ПОЛИМЕРИ. АМЕРИКАНСКИ ПАТЕНТNo 4,904,584, SHAW, ИЗДАДЕН НА 27 ФЕВРУАРИ 1990, РАЗГЛЕЖДАМОДИФИКАЦИЯТА НА ГРУПА ЛИЗИНОВИ ОСТАТЪЦИ В БЕЛТЪЦИТЕ ЗАПРИКРЕПВАНЕ НА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВИ МОЛЕКУЛИ ЧРЕЗРЕАКТИВОСПОСОБНИ АМИНО ГРУПИ. ЕДИН ОТ СПЕЦИФИЧНИТЕ ТЕРАПЕВТИЧНИ ХИМИЧНО МОДИФИЦИРАНИБЕЛТЪЦИ Е СТИМУЛИРАЩИЯТ ФАКТОР НА ГРАНУЛОЦИТНАТА КОЛОНИЯ „G-CSF“.ВИЖ ЕВРОПЕЙСКИ ПАТЕНТНИ ПУБЛИКАЦИИ ЕР No 0 401 384, ЕР No 0 473,268 И ЕРNO0 335423. ДРУГ ПРИМЕР Е ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН IL-6, ЕР No 0442 724, ОЗГЛАВЕН„MODIFIED HIL-б“, /ВИЖ ОЧАКВАЩ РЕШЕНИЕ U.S.S.N. 07/632,070/, КОЙТОРАЗГЛЕЖДА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВИ МОЛЕКУЛИ ПРИБАВЕНИ КЪМ IL-6. ЕР No0154 316, ПУБЛИКУВАН НА 11 СЕПТЕМВРИ, 1985 СЪОБЩАВА ЗА РЕАКЦИЯТА НАЛИМФОКИН С АЛДЕХИД И ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ. ДО СЕГА В НАУКАТА НЕ Е ИЗВЕСТНА ВЪЗМОЖНОСТТА ЗА МОДИФИЦИРАНЕ НАMGDF, ПОРАДИ ТОВА, ЧЕ ПОДАТЛИВОСТТА НА ВСЕКИ ОТДЕЛЕН БЕЛТЪК КЪММОДИФИЦИРАНЕ Е ОПРЕДЕЛЕНА ОТ СПЕЦИФИЧНИТЕ СТРУКТУРНИ ПАРАМЕТРИНА ТОЗИ БЕЛТЪК. ОЩЕ ПОВЕЧЕ, ЧЕ ЕФЕКТЪТ НА ЕДНА ТАКАВА МОДИФИКАЦИЯВЪРХУ БИЛОГИЧНИТЕ СВОЙСТВА НА БЕЛТЪКА Е НЕПРЕДСКАЗУЕМА. ПОРАДИМНОГОБРОЙНИТЕ КЛИНИЧНИ ПРИЛОЖЕНИЯ НА MGDF, КОИТО БЯХА ПОСОЧЕНИТУК, ПРОИЗВОДЕН MGDF ПРОДУКТ С ПРОМЕНЕНИ КАЧЕСТВА Е НЕОБХОДИМ.ТАКИВА МОКЕКУЛИ МОГАТ ДА ИМАТ УВЕЛИЧЕН ПОЛУЖИВОТ И/ИЛИ АКТИВНОСТIN VIVO, А СЪЩО ТАКА И ДРУГИ КАЧЕСТВА. -13- WO 95/26746 PCT/US95/03776 В РЕЗУЛТАТ НА ОБРАБОТКАТА С ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ НАЙ-ОБЩО ЩЕСЕПОЛУЧИ СМЕС ОТ ХИМИЧНО МОДИФИЦИРАНИ БЕЛТЪЧНИ МОЛЕКУЛИ. АКОВЗЕМЕМ ЗА ИЛЮСТРАЦИЯ БЕЛТЪЧНА МОЛЕКУЛА С 5 ЛИЗИНОВИ ОСТАТЪКА И 3АМИНО ГРУПИ НА N-КРАЯ, ТО РЕЗУЛТАТЪТ ОТ РЕАКЦИЯТА ПО ГОРЕОПИСАНИТЕМЕТОДИ ЩЕ БЪДЕ ХЕТЕРОГЕННА СМЕС, В КОЯТО НЯКОИ МОЛЕКУЛИ ЩЕ ИМАТ 6ПОЛИЕТИЛЕН ГКЛИКОЛОВИ ГРУПИ, НЯКОИ 5, НЯКОИ 4, НЯКОИ 3, НЯКОИ 2,НЯКОИ 1 И НЯКОИ 0. ПРИ МОЛЕКУЛИТЕ С НЯКОЛКО ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВИОСТАТЪКА, ТЕЗИ ОСТАТЪЦИ МОГАТ ДА БЪДАТ СВЪРЗАНИ НА РАЗЛИЧНИ МЕСТА ВРАЗЛИЧНИТЕ МОЛЕКУЛИ. ЧЕСТО Е НУЖНО ДА БЪДЕ ПОЛУЧЕН ХОМОГЕНЕНПРОДУКТ, КОЙТО ДА СЪДЪРЖА ПРАКТИЧЕСКИ ЕДНАКВИ ПО БРОЙ И/ИЛИ ПО С* РАЗПОЛОЖЕНИЕ НА ХИМИЧНИТЕ МОДИфИКАТОРИ /КАТО ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ/ ХИМИЧЕСКИ МОДИФИЦИРАНИ БЕЛТЪЦИ ИЛИ БРОЯ НА ОТЛИЧАВАЩИТЕ СЕ ДАБЪДЕ МАЛЪК /2 - 3/. ВЪПРЕКИ ТОВА СМЕС ОТ МОНО-, ДИ - И/ИЛИТРИПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ МОДИФИЦИРАНИ РАЗНОВИДНОСТИ МОЖЕ ДА БЪДЕНЕОБХОДИМ ИЛИ ПРИЛОЖИМ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИ ТЕРАПЕВТИЧНИ ПОКАЗАНИЯ. ПРИ РАЗРАБОТВАНЕТО НА ТЕРАПЕВТИЧЕН БЕЛТЪЧЕН ПРОДУКТ, МОДИФИЦИРАНС ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ Е НЕБЛАГОПРИЯТНО ДА ИМА РАЗЛИЧИЯ В СЪСТАВА НАСМЕСТТА ПРИ ОТДЕЛНО ПРИГОТВЕНИТЕ КОЛИЧЕСТВА. ПРИ ТАКИВАРАЗРАБОТКИ Е ВАЖНА ПРЕДСКАЗУЕМОСТТА НА БИОЛОГИЧНАТА АКТИВНОСТ.ПОКАЗАНО Е НАПРИМЕР, ЧЕ ПРИ НЕСЕЛЕКТИВНО СВЪРЗВАНЕ НА СУПЕРОКСИД £ ДИЗМУТАЗА С ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ НЯКОЛКО ОТ ПОЛУЧЕНИТЕ ФРАКЦИИ НА ЕНЗИМА СА БИЛИ НАПЪЛНО НЕАКТИВНИ /Р. McGOFF ЕТ AL.CHEM PHARM. BULL.36:3079-3091 /1988//. ВИЖ СЪЩО ROSE ЕТ AL„ BIOCONJUGATE CHEMISTRY 2:154 -159 /1991/, КЪДЕТО СЕ СЪОБЩАВА ЗА СЕЛЕКТИВНО СВЪРЗВАНЕ НА ЛИНКЕРНАГРУПА КАРБОХИДРАЗИД КЪМ С-КРАЙНАТА КАРБОКСИЛНА ГРУПА НА БЕЛТЪЧНИЯСУБСТРАТ /ИНСУЛИН/. НЕ МОЖЕ ДА ИМА ТАКАВА ПРЕДСКАЗУЕМОСТ, АКООТДЕЛНО ПРИГОТВЕНИТЕ КОЛИЧЕСТВА ОТ ТЕРАПЕВТИЧНИЯ БЕЛТЪК СЕРАЗЛИЧАВАТ ПО СЪСТАВ ЕДНО ОТ ДРУГО. ВЪЗМОЖНО Е НЯКОИ ОТПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВИТЕ ГРУПИ ДА БЪДАТ СВЪРЗАНИ НЕ ТОЛКОВА ЗДРАВОС БЕЛТЪЧНАТА МОЛЕКУЛА, КОЛКОТО ДРУГИ И ПОРАДИ ТОВА ДА СЕ ОТДЕЛЯТ ОТ -14- WO 95/26746 PCT/US95/03776 НЕЯ. ОЧЕВИДНО Е, ЧЕ АКО ТАКИВА ГРУПИ СА СЛАБО СВЪРЗАНИ И ПОРАДИ ТОВАЛЕСНО СЕ ОТДЕЛЯТ, ТО ФАРМОКИНЕТИКАТА НА ТЕРАПЕВТИЧНИЯ БЕЛТЪК НЕМОЖЕ ДА БЪДЕ ПРЕДСКАЗАНА ТОЧНО. ДОБРЕ Е СЪЩО ТАКА ДА СЕ ПОЛУЧИ ПРОИЗВОДЕН MGDF ПРОДУКТ, ПРИ КОЙТОНЯМА СВЪРЗВАЩА ГРУПА МЕЖДУ ПОЛИМЕРА И MGDF. ЕДИН ОТ ПРОБЛЕМИТЕПРИ ГОРЕОПИСАНИТЕ МЕТОДИ Е, ЧЕ ПРИ ТЯХ ОБИКНОВЕНО Е НУЖНАСВЪРЗВАЩА ГРУПА МЕЖДУ БЕЛТЪКА И ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВАТА МОКЕКУЛА.ТАЗИ СВЪРЗВАЩА ГРУПА МОЖЕ ДА СЕ ОКАЖЕ АНТИГЕННА, КОЕТО СЪЩО ЕНЕБЛАГОПРИЯТНО ПРИ РАЗРАБОТКАТА НА ТЕРАПЕВТИЧНИЯ БЕЛТЪК. МЕТОД, НЕВКЛЮЧВАЩ СВЪРЗВАЩА Е ГРУПА Е ОПИСАН В FRANCIS ЕТ AL., В:STABILITY OF PROTEIN PHARMACEUTICALS: IN VIVO PATHWAYS OF DEGRADATIONAND STRATEGIES FOR PROTEIN STABILIZATION“ /EDS. AHERN., T. AND MANNING,M.S./ PLEUM, NEW YORK, 1991/. СЪЩО B DELGADO ET AL. „COUPLING OF PEG TOPROTEIN BY ACTIVATION WITH TREZYL CHLORADE, APPLICATIONS INIMMUNOAFFINITY CELL PREPARATION“, B : FISHER ET AL., ED., SEPARATIONS USINGAQUEOUS PHASE SYSTEMS, APPLICATIONS IN CELL BIOLOGY ANDBIOTECHNOLOGY, PLENUM PRESS, N.Y., N.Y. 1989 PP. 211-213 ВКЛЮЧВАЩУПОТРЕБАТА HA ТРЕЗИЛ ХЛОРИД, КОЕТО ВОДИ ДО ОТСЪСТВИЕ НА СВЪРЗВАЩАГРУПА МЕЖДУ ПОЛИТИЛЕН ГЛИКОЛОВАТА ЧАСТ И БЕЛТЪЧНАТА ЧАСТ. МОЖЕ ДАСЕ ОКАЖЕ ТРУДНО ДА СЕ ИЗПОЛЗВА ТОЗИ МЕТОД ЗА ПРОИВОДСТВО НАТЕРАПЕВТИЧНИ ПРОДУКТИ, ТЪЙ КАТО ПРИ УПОТРЕБАТА НА ТРЕЗИЛ ХЛОРИД ЕВЪЗМОЖНО ПОЛУЧАВАНЕТО НА ТОКСИЧНИ СТРАНИЧНИ ПРОДУКТИ. CHAMOW ЕТ AL., BIOCONJUGATE СНЕМ. 5 :133-140 /1994/ СЪОБЩАВА ЗАМОДИФИКАЦИЯТА НА CD4 ИМУНОАДХЕЗИН С АЛДЕХИД НА МОНО-МЕТОКСИ-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ /“MEPEG GLYCOL“/ ЧРЕЗ РЕДУКТИВНО АЛКИЛИРАНЕ.АВТОРИТЕ СЪОБЩАВАТ, ЧЕ 50 % ОТ CD4 -Ig Е БИЛ MEPEG- МОДИФИЦИРАН ЧРЕЗСЕЛЕКТИВНА РЕАКЦИЯ НА α-АМИНО ГРУПАТА НА N-КРАЯ. /ПАК ТАМ СТР. 137/. -15- WO 95/26746 PCT/US95/03776 АВТОРИТЕ СЪОБЩАВАТ СЪЩО ТАКА, ЧЕ СВЪРЗВАЩАТА СПОСОБНОСТ НАМОДИФИЦИРАНИЯ CD4-IG /С БЕЛТЪКА др12О/ IN VITRO НАМАЛЯВА ДО НИВО,СЪПОСТАВИМО СЪС СТЕПЕНТА НА MEPEG - МОфИфИКАЦИЯТА. /ПАК ТАМ /. ПОРАДИ ТОВА СЪЩЕСТВУВА НУЖДА ОТ ПРОИЗВОДНИ MGDF И ПО-СПЕЦИАЛНООТ ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНИ MGDF. СЪЩО ТАКА СА НЕОБХОДИМИ МЕТОДИЗА ПОЛУЧАВАНЕ НА ТАКИВА ПРОИЗВОДНИ.
Ill, РЕЗЮМЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО С» ОТ ЕДНА СТРАНА НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ ДАВА НОВИ ПОЛИПЕПТИДИ,КОИТО СПЕЦИФИЧНО УСИЛВАТ РАСТЕЖА И/ИЛИ РАЗВИТИЕТО НАМЕГАКАРИОЦИТИТЕ /“MPL LIGANDS“ ИЛИ „MGDFS“/, КАТО ТЕЗИ БЕЛТЪЦИ САПРАКТИЧЕСКИ ЧИСТИ ОТ ДРУГИ БЕЛТЪЦИ /Г.Е. В СЛУЧАЯ С MPL ЛИГАНДАБЕЛТЪЦИТЕ ОТ БОЗАЙНИЦИТЕ СА ПОЛУЧЕНИ ОТ ИЗТОЧНИЦИ ОТ БОЗАЙНИЦИ/.ТАКИВА БЕЛТЪЦИ МОГАТ ДА БЪДАТ ИЗОЛИРАНИ ОТ КЛЕТЪЧНИ ИЗТОЧНИЦИ,КОИТО ПРОИЗВЕЖДАТ ФАКТОРИТЕ ИЛИ ПО ЕСТЕСТВЕН ПЪТ, ИЛИ ЧРЕЗИНДУКЦИЯ С ДРУГИ ФАКТОРИ. СЪЩО ТАКА ТЕ МОГАТ ДА БЪДАТ ПРОИЗВЕДЕНИЧРЕЗ ГЕННО ИНЖЕНЕРНИ ТЕХНИКИ. Мр1 ЛИГАНДИТЕ МОГАТ ДА БЪДАТСИНТЕЗИРАНИ ЧРЕЗ ХИМИЧНИ ТЕХНИКИ ИЛИ ЧРЕЗ КОМБИНАЦИЯ ОТГОРЕСПОМЕНАТИТЕ ТЕХНИКИ. В ТОВА ИЗОБРЕТЕНИЕ Мр1 ЛИГАНДИТЕ СА ПОЛУЧЕНИ В ТЯХНАТА НАТИВНАФОРМА ОТ ИЗТОЧНИЦИ ОТ БОЗАЙНИЦИ. В ПРИВЕДЕНИТЕ ТУК ПРИМЕРИ САОПИСАНИ ДВА Мр1 ЛИГАНДА, ИЗОЛИРАНИ ОТ КУЧЕШКА АПЛАСТИЧНА ПЛАЗМА. ВДРУГИ ПРИМЕРИ С ДЕМОНСТРИРАНО, ОБАЧЕ, ЧЕ МНОГО СХОДНИ Мр1 ЛИГАНДИПРИСЪСТВАТ В АПЛАСТИЧНА ПЛАЗМА ОТ ЧОВЕШКИ И СВИНСКИ ИЗТОЧНИЦИ.ОСОБЕНОТО ТУК Е, ЧЕ АКТИВНОСТТА НА ВСЕКИ ОТ ТЕЗИ ВИДОВЕ: ЧОВЕШКИ,СВИНСКИ И КУЧЕШКИ Мр1 ЛИГАНДИ МОЖЕ ДА БЪДЕ ИНХИБИРАНАСПЕЦИФИЧНО ОТ РАЗТВОРИМАТА ФОРМА НА МИШИЯ Мр1 РЕЦЕПТОР, КОЕТОПОКАЗВА, ЧЕ ВСИЧКИ ТЕЗИ Мр1 ЛИГАНДИ, А СЪЩО ТАКА И ТЕЗИ ОТ ДРУГИ -16- WO 95/26746 PCT/US95/03776 БОЗАЙНИЦИ, ВКЛЮЧИТЕЛНО И ОТ МИШКИ, СА ТЯСНО СВЪРЗАНИ ΚΑΚΤΟ ВСТРУКТУРНО ОТНОШЕНИЕ, ТАКА И ПО ОТНОШЕНИЕ НА АКТИВНОСТТА. ПРЕДПОЛГА СЕ, ЧЕ ЧОВЕШКИТЕ, СВИНСКИТЕ Мр1 ЛИЛАНДИ И ТЕЗИ ОТ ДРУГИБОЗАЙНИЦИ МОГАТ ДА БЪДАТ ИЗОЛИРАНИ ОТ ЕСТЕСТВЕНИ ИЗТОЧНИЦИ ЧРЕЗПРОЦЕДУРИТЕ, ОПИСАНИ ТУК. ВИЖ ПРИМЕР 10. СЪОТВЕНО ТОВА ИЗОБРЕТЕНИЕОСНОВНО РАЗГЛЕЖДА Mpt ЛИГАНДИ ОТ БОЗАЙНИЦИ КАТО КУЧЕТА, ПРАСЕТА,МИШКИ, КОНЕ, ОВЦЕ И ЗАЙЦИ. ОСОБЕНО ПРЕДПОЧИТАНИ СА Мр1 ЛИГАНДИТЕОТ КУЧЕТА, ПРАСЕТА И ХОРА. В ДОПЪЛНЕНИЕ ГЕНИТЕ, КОДИРАЩИ ЧОВЕШКИТЕ Мр1 ЛИГАНДИ СА БИЛИКЛОНИРАНИ ОТ ГЕННИ БИБЛИОТЕКИ ОТ ЧОВЕШКИ ЕМБРИОНАЛЕН БЪБРЕК ИЧЕРЕН ДРОБ И СА БИЛИ СЕКВЕНИРАНИ, ΚΑΚΤΟ Е ПОКАЗАНО В ПРИМЕРИТЕ ПО-ДОЛУ. ПРИ КЛЕТЪЧНО БАЗИРАНИ АНАЛИЗИ Е ОПРЕДЕЛЕНО, ЧЕ ЧОВЕШКИТЕПОЛИПЕПТИДНИ СЕКВЕНЦИИ ПРИТЕЖАВАТ АКТИВНОСТ. /ВИЖ ПРИМЕР 4/. ТЕЗИСЕКВЕНЦИИ СА РАЗЛИЧНИ ПО ДЪЛЖИНА, НО ИМАТ СХОДСТВО В ГОЛЯМУЧАСТЪК ОТ ПОЛИПЕПТИДНАТА СИ ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ. В ЕДИНИЧНИУЧАСТЪЦИ СЪЩЕСТВУВА ХОМОЛОГИЯ С ЕРИТРОПОЕТИН. СЪЩО ТАКА Мр1ЛИГАНДИТЕ СА ОПРЕДЕЛЕНИ ТУК КАТО ФАКТОРИ НА РАСТЕЖА И РАЗВИТИЕТОНА МЕГАКАРИОЦИТИТЕ /MGDFS/; НАВСЯКЪДЕ, КЪДЕТО СТАВА ДУМА ЗА Мр1ЛИГАНДИ ТУК ЩЕ СЕ ПРИЛАГА НАЗВАНИЕТО MGDFS И ОБРАТНО. ПОД „MGDFПОЛИПЕПТИД“ ЩЕ СЕ РАЗБИРА ПОЛИПЕПТИД, ПРИТЕЖАВАЩ АКТИВНОСТ <ί СПЕЦИФИЧНО ДА СТИМУЛИРА ИЛИ ИНХИБИРА РАСТЕЖА И/ИЛИ РАЗВИТИЕТО НАМЕГАКАРИОЦИТИТЕ. ТУК СА РАЗГЛЕДАНИ ПРИМЕРНИ ТАКИВА БЕЛТЪЦИ. УСТАНОВЕНО Е, Мр1 ЛИГАНДИТЕ ОТ НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ ПРИТЕЖАВАТСПЕЦИФИЧНА АКТИВНОСТ СПРЯМО МЕГАКАРИОЦИТНОТО РОДОСЛОВИЕ КАТОУСИЛВАТ УЗРЯВАНЕТО И/ИЛИ ПРОЛИфЕРАЦИЯТА НА МЕГАКАРИОЦИТА, ΚΑΚΤΟ ЕПОКАЗАНО В ЕКСПЕРИМЕНТИТЕ ОТ ПРИМЕРИ 2 И 4 ПО-ДОЛУ. ПОД„СПЕЦИФИЧНО“ СЕ РАЗБИРА, ЧЕ ПОЛИПЕПТИДИТЕ ПОКАЗАВАТ БИОЛОГИЧНААКТИВНОСТ В СРАВНИТЕЛНО ПО-ГОЛЯМА СТЕПЕН КЪМ МЕГАКАРИОЦИТИТЕ, ВСРАВНЕНИЕ С МНОГО ДРУГИ КЛЕТЪЧНИ ТИПОВЕ. ПРЕДПОЛАГА СЕ, ЧЕ ТЕЗИ -17- WO 95/26746 PCT/US95/03776 БЕЛТЪЦИ, КОИТО ОКАЗВАТ СТИМУЛИРАЩО ВЪЗДЕЙСТВИЕ ВЪРХУ МЕГАКАРИОЦИТИТЕ, ЩЕ ИМАТ IN VIVO СТИМУЛИРАЩА АКТИВНОСТ И СПРЯМОПРОИЗВОДСТВОТО НА ТРОМБОЦИТИ, ЧРЕЗ СТИМУЛИРАНЕ УЗРЯВАНЕТО ИДИФЕРЕНЦИАЦИЯТА НА МЕГАКАРИОЦИТИТЕ. ДВА ОТ ПРЕДПОЧИТАНИТЕ Мр1 ЛИГАНДА ОТ КУЧЕШКИ ПРОИЗХОД ИМАТМОЛЕКУЛНА МАСА ПРИБЛИЗИТЕЛНО 25 kd И 31 kd, ΚΑΚΤΟ Е ОПРЕДЕЛЕНО ЧРЕЗЕКЕКТРОФОРЕЗА В НАТРИЕВ ДОДЕЦИЛСУЛфАТ ПОЛИАКРИЛАМИДЕН ГЕЛ /SDS-PAGA/ ПРИ НЕРЕДУКЦИОННИ УСЛОВИЯ. ДВАТА БЕЛТЪКА СА ПРЕЧИСТЕНИ ЧРЕЗПРОЦЕДУРИТЕ, РАЗГЛЕДАНИ ПОДРОБНО В ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИЯ РАЗДЕЛ ПО-ДОЛУ. ДВАТА ПРЕДПОЧИТАНИ ЧОВЕШКИ ЛИГАНДА MGDF-1 И MGDF -2 СА С ДЪЛЖИНАСЪОТВЕТНО 332 И 173 АМИНО КИСЕЛИ, БЕЗ ДА СЕ ВКЛЮЧВАТ 21 АМИНОКИСЕЛИНИ ОТ ПРЕДПОЛАГАЕМИЯ СИГНАЛЕН ПЕПТИД. ТЕЗИ МОЛЕКУЛИ, А СЪЩОТАКА И ТРЕТА ПОДОБНА МОЛЕКУЛА MGDF-З СА ПОКАЗАНИ НА ФИГУРИ 11 И 12.СЛЕДВАЩ АСПЕКТ НА НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ СА ПРОЦЕСИТЕ ЗАИЗОЛИРАНЕ И ПРЕЧИСТВАНЕ НА Мр1 ЛИГАНДИТЕ, ОБЕКТ НА НАСТОЯЩОТОИЗОБРЕТЕНИЕ ИЛИ ТЕХНИ ФРАГМЕНТИ, ИЗОЛИРАНИ ОТ ИЗТОЧНИЦИ ОТБОЗАЙНИЦИ, ГЛАВНО КРЪВ, СЕРУМ И ПЛАЗМА. АПЛАСТИЧНАТА КРЪВ, СЕРУМ ИПЛАЗМА СА ОСОБЕНО ПРЕДПОЧИТАНИ ИЗХОДНИ МАТЕРИАЛИ. АПЛАСТИЧНАКРЪВ, СЕРУМ И ПЛАЗМА МОЖЕ ДА СЕ ПОЛУЧИ ЧРЕЗ ПРОЦЕС, ВКЛЮЧВАЩОБЛЪЧВАНЕ НА БОЗАЙНИК С РАДИАЦИОНЕН ИЗТОЧНИК, КАТО КОБАЛТ - 60, ПРИРАДИАЦИОННО НИВО ОТ ОКОЛО 400 - 800 RAD, ТАКА ЧЕ ДА СТАНАТАПЛАСТИЧНИ. ТАЗИ ПРОЦЕДУРА Е ПОЗНАТА В НАУКАТА, ΚΑΚΤΟ ЕИЛЮСТРИРАНО В ПУБЛИКАЦИИТЕ, ЦИТИРАНИ В ПРИМЕР 1 ПО-ДОЛУ. ПРИ ХОРАОБЛЪЧЕНА КРЪВ, СЕРУМ ИЛИ ПЛАЗМА МОЖЕ ДА СЕ ПОЛУЧИ ОТ ПАЦИЕНТИ,ПОДЛОЖЕНИ НА РАДИАЦИОННА ТЕРАПИЯ, Т.Е. ПРИ ЛЕЧЕНИЕ НА РАК. -18- WO 95/26746 PCT/US95/03776 СЛЕД ТОВА АПЛАСТИЧНАТА КРЪВ, СЕРУМ ИЛИ ПЛАЗМА СЕ ПОДЛАГА НАПРЕЧИСТВАЩА ОБРАБОТКА. ПРЕЧИСТВАЩАТА ОБРАБОТКА ПРЕДЛОЖЕНА ВНАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ ВКЛЮЧВА СЛЕДНИТЕ ПРОЦЕДУРИ: ЛЕКТИНАфИНИТЕТНА ХРОМАТОГРАфИЯ И Mpl РЕЦЕПТОР АфИНИТЕТНАХРОМАТОГРАфИЯ. КАТО РЕЗУЛТАТ ОТ ВСЯКА ЕДНА ОТ ТЕЗИ ПРОЦЕДУРИ СЕПОЛУЧАВА ПРИБЛИЗИТЕЛНО 300 - 500 ПРЕЧИСТВАНЕ НА 25 kd И 31 kd БЕЛТЪЦИОТ КУЧЕШКА АПЛАСТИЧНА ПЛАЗМА. ЗА ПО-НАТАТЪЧНО ПРЕЧИСТВАНЕ НА Мр1ЛИГАНДИТЕ ОТ НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ МОГАТ ДА СЕ ВКЛЮЧАТ И ДРУГИСТАНДАРТНИ ПРОЦЕДУРИ ЗА ПРЕЧИСТВАНЕ НА БЕЛТЪЦИ, КОИТО СА ОПИСАНИПО-ДОЛУ. ДРУГ АСПЕКТ НА НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ СА ПОЛИНУКЛЕОТИДИТЕ, КОИТОКОДИРАТ ЕКСПРЕСИЯТА НА Mpl ЛИГАНДНИЯ БЕЛТЪК ПРИ БОЗАЙНИЦИТЕ.ТАКАВА ДНК СЕКВЕНЦИЯ МОЖЕ ДА ВКЛЮЧВА ИЗОЛИРАНА ДНК СЕКВЕНЦИЯ,КОДИРАЩА ЕКСПРЕСИЯТА НА Mpl ЛИГАНДНИ БЕЛТЪЦИ ПРИ БОЗАЙНИЦИТЕΚΑΚΤΟ Е ОПИСАНО ТУК. ДНК СЕКВЕНЦИЯТА МОЖЕ СЪЩО ТАКА ДА ВКЛЮЧВА 5’И 3’ НЕКОДИРАЩА СЕКВЕНЦИЯ, В ДВАТА КРАЯ НА КОДИРАЩАТА Mpl ЛИГАНДНАСЕКВЕНЦИЯ. ДНК СЕКВЕНЦИЯТА МОЖЕ СЪЩО ТАКА ДА КОДИРА АМИНО КРАЕНСИГНАЛЕН ПЕПТИД. ТАКАВА СЕКВЕНЦИЯ МОЖЕ ДА БЪДЕ ПРИГОТВЕНА ЧРЕЗВСЕКИ ПОЗНАТ МЕТОД, ВКЛЮЧИТЕЛНО ЧРЕЗ ПЪЛЕН ИЛИ ЧАСТИЧЕН ХИМИЧЕНСИНТЕЗ. КОДОНИТЕ МОГАТ ДА БЪДАТ ОПТИМИЗИРАНИ ЗА ЕКСПРЕСИЯ ВКЛЕТКАТА ГОСТОПРИЕМНИК, ИЗБРАНА ЗА ЕКСПРЕСИЯ /Е. coll ИЛИ СНОКЛЕТКИ/. В НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ СА ДАДЕНИ СЪЩО ТАКА РЕКОМБИНАНТНИ ДНКМОЛЕКУЛИ, ВСЯКА ОТ КОИТО Е СЪСТАВЕНА ОТ ВЕКТОРНА ДНК И ДНКСЕКВЕНЦИЯ, КОДИРАЩА Mpl ЛИГАНД ПРИ БОЗАЙНИЦИТЕ. ДНК МОЛЕКУЛИТЕОБЕЗПЕЧАВАТ СВЪРЗВАНЕТО НА Mpl ЛИГАНДНАТА ДНК С РЕГУЛАТОРНАСЕКВЕНЦИЯ, КОЯТО ПРИТЕЖАВА СПОСОБНОСТ ДА НАСОЧВА РЕПЛИКАЦИЯТА ИЕКСПРЕСИЯТА НА Mpl ЛИГАНДА В КЛЕТКАТА ГОСТОПРИЕМНИК. КЛЕТКИТЕГОСТОПРИЕМНИЦИ /БАКТЕРИАЛНИ КЛЕТКИ, КЛЕТКИ ОТ НАСЕКОМИ ПОБОЗАЙНИЦИТЕ, ДРОЖДИ, ИЛИ РАСТИТЕЛНИ КЛЕТКИ/ТРАНСФОРМИРАНИ С -19- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ТАКИВА ДНК МОЛЕКУЛИ, ЗА ДА БЪДАТ ИЗПОЛЗВАНИ ЗА ЕКСПРЕСИЯТА НАРЕКОМБИНАНТЕН Мр1 ЛИГАНД СА СЪЩО РАЗГЛЕДАНИ В НАСТОЯЩОТОИЗОБРЕТЕНИЕ. В ДРУГ АСПЕКТ, ДНК МОЛЕКУЛИТЕ И ТРАНСФОРМИРАНИТЕ КЛЕТКИ,РАЗГЛЕДАНИ В ИЗОБРЕТЕНИЕТО, СА АНГАЖИРАНИ В НОВ ПРОЦЕС НАПРОИЗВОДСТВО НА РЕКОМБИНАНТНИ Мр1 ЛИГАНДНИ БЕЛТЪЦИ ИЛИ ТЕХНИПЕПТИДНИ ФРАГМЕНТИ. ПРИ ТОЗИ ПРОЦЕС Е КУЛТИВИРАНА КЛЕТЪЧНА ЛИНИЯ,ТРАНСФОРМИРАНА С ДНК СЕКВЕНЦИЯ КОДИРАЩА ЕКСПРЕСИЯТА НА Мр1ЛИГАНДНИЯ БЕЛТЪК ИЛИ НЕГОВ ФРАГМЕНТ /ИЛИ РЕКОМБИНАНТНА ДНК 0 МОЛЕКУЛА, ΚΑΚΤΟ Е ОПИСАНО ПО-ГОРЕ/, СВЪРЗАНА С ПОДХОДЯЩАРЕГУЛАТОРНА ИЛИ КОНТРОЛОРАЩА ЕКСПРЕСИЯТА СЕКВЕНЦИЯ, СПОСОБНА ДАКОНТРОЛИРА ЕКСПРЕСИЯТА НА БЕЛТЪКА ПРИ ПОДХОДЯЩИ УСЛОВИЯ,ПОЗВОЛВЯВАЩИ ЕКСПРЕСИЯТА НА РЕКОМБИНАНТНАТА ДНК. В ПОСОЧЕНИЯТПРОЦЕС КАТО КЛЕТКИ ГОСТОПРИЕМНИЦИ МОГАТ ДА БЪДАТ ИЗПОЛЗВАНИРЕДИЦА ПОЗНАТИ КЛЕТКИ. ПРЕДПОЧИТАНИ КЛЕТЪЧНИ ЛИНИИ ЗАПРОИЗВОДСТВОТО НА Мр1 ЛИГАНДИ ТУК СА КЛЕТЪЧНИ ЛИНИИ ОТ БОЗАЙНИЦИ/СНО КЛЕТКИ/ И БАКТЕРИАЛНИ КЛЕТКИ /Е Coll/. ЗА ЕКСПРЕСИЯТА НА ПРОТЕИНА В Е. Coli СЕ ПРЕДПОЧИТА ДА СЕ ИЗПОЛЗВАТМЕТИОНИНОВИТЕ И ЛИЗИНОВИТЕ ОСТАТЪЦИ НА N-КРАЯ, ТЪЙ КАТО Q КОЛИЧЕСТВОТО ЕКСПРЕСИРАН ПРОДУКТ ОБИКНОВЕНО Е ГОЛЯМО. ОСОБЕНОПРЕДПОЧИТАН ПРОДУКТ Е ΜΕΤ-LYS ЧОВЕШКИ MGDF СЪСТОЯЩ СЕ ВСИЧКО ОТ165 АМИНО КИСЕЛИНИ / Т.Е. МЕТ-2 L.YZ-2 [1 - 163]/ MGDF, АКО БРОИМ ОТПЪРВАТА АМИНО КИСЕЛИНА ДО КРАЯ НА ЗРЕЛИЯ ПРОТЕИН. СЛЕД ПРЕЧИСТВАНЕНА ПРОДУКТА, ЕКСПРЕСИРАН В БАКТЕРИАЛНА КЛЕТКА КАТО Е. coli КРАЙНИТЕMET-LYZ ОСТАТЪЦИ МОГАТ ДА БЪДАТ ОТДЕЛЕНИ ЧРЕЗ ОБРАБОТКА С ЕНЗИМКАТО ДЕПЕПТИДАЗА /КАТЕПСИН С/. СЛЕД ТОВА ЕКСПРЕСИРАНИЯТ Мр1 ЛИГАНДЕН БЕЛТЪК СЕ ИЗВЛИЧА ОТКЛЕТКАТА ГОСТОПРИЕМНИК, КЛЕТЪЧНИЯТ ЛИЗАТ ИЛИ КУЛТУРАЛНАТА СРЕДА -20- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ЧРЕЗ ПОДХОДЯЩИ СТАНДАРТНИ СРЕДСТВА. СЪОТВЕТНАТА СРЕДА МОЖЕ ДА БЪДЕ ОБРАБОТЕНА ЧРЕЗ СЪЩИТЕ ЕТАПИ НА ПРЕЧИСТВАНЕ ИЛИ ТЕХНИ МОДИФИКАЦИИ КАКВИТО СА ИЗПОЛЗВАНИ ЗА ИЗОЛИРАНЕТО НА Мр1 ЛИГАНДА ОТ АПЛАСТИЧНА ПЛАЗАМА /ВИЖ ПРИМЕР 71. СЛЕДВАЩ АСПЕКТ НА НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ ЗАСЯГА РЕКОМБИНАНТНИ Мр1 ЛИГАНДНИ БЕЛТЪЦИ. ТЕЗИ БЕЛТЪЦИ СА ПРАКТИЧЕСКИ ЧИСТИ ОТ ДРУГИ МАТЕРИАЛИ ХАРАКТЕРНИ ЗА БОЗАЙНИЦИТЕ И ПО-СПЕЦИАЛНО ОТ ДРУГИ БЕЛТЪЦИ. СЪЩО ТАКА Мр1 ЛИГАНДНИТЕ БЕЛТЪЦИ ОТ НАСТОЩОТОф ИЗОБРЕТЕНИЕ СА ХАРАКТЕРИЗИРАНИ ПО ТОВА ДАЛИ ПРИТЕЖАВАТ ЕДНА ИЛИ ПОВЕЧЕ ОТ ФИЗИЧНИТЕ, БИОХИМИЧНИТЕ, ФАРМАКОЛОГИЧНИТЕ И БИОЛОГИЧНИТЕ АКТИВНОСТИ ОПИСАНИ ТУК. ОСВЕН ТОВА НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ РАЗГЛЕЖДА ХИМИЧНО МОДИФИЦИРАНИ MGDF, КОИТО СЕ СЪСТОЯТ ОТ MGDF БЕЛТЪЧНА ЧАСТ, СВЪРЗАНА С НАЙ-МАЛКО ЕДИН ВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИМЕР И МЕТОДИТЕ ЗА ПОЛУЧАВАНЕТО НА ТАКИВА СЪЕДИНЕНИЯ. ПО-СПЕЦИАЛНО НАСТОЯЩОТО
ИЗОБРЕТЕНИЕ КАСАЕ ХИМИЧЕСКИ МОДИФИЦИРАНИ MGDF, ПРИ КОИТО MGDF РЕАГИРАТ С РЕАКТИВОСПОСОБНИ ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВИ МОЛЕКУЛИ, ТАКА ЧЕ ДА СЕ ПОЛУЧИ ВРЪЗКА МЕЖДУ MGDF И PEG. ТАКОВА СВЪРЗВАНЕ МОЖЕ ДАф БЪДЕ ОСЪЩЕСТВЕНО ЧРЕЗ ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ СВЪРЗВАЩИТЕ РЕАКЦИИ, РАЗГЛЕДАНИ ТУК - ТАКИВА КАТО АЦИЛИРАНЕ И АЛКИЛИРАНЕ. АЦИЛИРАНЕ И АЛКИЛИРАНЕ С PEG МОЖЕ ДА СЕ ПРОВЕДЕ ПРИ УСЛОВИЯ, ПРИ КОИТО ОСНОВНИЯТ ПРОДУКТ ДА БЪДЕ МОНО - ИЛИ ПОЛИ - ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН. ПОЛИ - ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНЕТО СЕ СЪСТОИ ГЛАВНО В СВЪРЗВАНЕТО НА PEG КЪМ 8-АМИНО ГРУПИТЕ НА ЛИЗИНОВИТЕ ОСТАТЪЦИ, НО МОЖЕ ДА ВКЛЮЧВА И ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНЕ НА N-КРАЯ НА ПОЛИПЕТИДА. МОНО- ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНЕТО СЕ СЪСТОИ НАЙ-ЧЕСТО В СВЪРЗВАНЕ НА PEG Сα-АМИНО ГРУПАТА НА N- КРАЯ НА БЕЛТЪКА. ДОБИВЪТ И ХОМОГЕНОСТТА ПРИ -21- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ЧРЕЗ ПОДХОДЯЩИ СТАНДАРТНИ СРЕДСТВА. СЪОТВЕТНАТА СРЕДА МОЖЕ ДА БЪДЕ ОБРАБОТЕНА ЧРЕЗ СЪЩИТЕ ЕТАПИ НА ПРЕЧИСТВАНЕ ИЛИ ТЕХНИ МОДИФИКАЦИИ КАКВИТО СА ИЗПОЛЗВАНИ ЗА ИЗОЛИРАНЕТО НА Мр1 ЛИГАНДА ОТ АПЛАСТИЧНА ПЛАЗАМА /ВИЖ ПРИМЕР 7/. СЛЕДВАЩ АСПЕКТ НА НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ ЗАСЯГА РЕКОМБИНАНТНИ Мр1 ЛИГАНДНИ БЕЛТЪЦИ. ТЕЗИ БЕЛТЪЦИ СА ПРАКТИЧЕСКИ ЧИСТИ ОТ ДРУГИ МАТЕРИАЛИ ХАРАКТЕРНИ ЗА БОЗАЙНИЦИТЕ И ПО-СПЕЦИАЛНО ОТ ДРУГИ БЕЛТЪЦИ. СЪЩО ТАКА Мр1 ЛИГАНДНИТЕ БЕЛТЪЦИ ОТ НАСТОЩОТОф ИЗОБРЕТЕНИЕ СА ХАРАКТЕРИЗИРАНИ ПО ТОВА ДАЛИ ПРИТЕЖАВАТ ЕДНА ИЛИ ПОВЕЧЕ ОТ ФИЗИЧНИТЕ, БИОХИМИЧНИТЕ, ФАРМАКОЛОГИЧНИТЕ И БИОЛОГИЧНИТЕ АКТИВНОСТИ ОПИСАНИ ТУК. ТАКИВА МОНО-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАЩИ РЕАКЦИИ МОГАТ ДА БЪДАТ ПОВИШЕНИ ЧРЕЗ ВИД РЕДУКТИВНО АЛКИЛИРАНЕ, КОЕТО СПЕЦИФИЧНО МОДИФИЦИРА α-АМИНО ГРУПАТА НА N-КРАЙНИЯ ОСТАТЪК НА БЕЛТЪКА. ТОВА ОСИГУРЯВА ПРИГОТВЯНЕТО НА ПРАКТИЧЕСКИ ХОМОГЕННА СМЕС ОТ ПОЛИМЕР - MGDF СВЪРЗАНИ БЕЛТЪЧНИ МОЛЕКУЛИ, А СЪЩО ТАКА, ПРИ УСЛОВИЕ, ЧЕ Е ИЗПОЛЗВАН ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ, СЕ ПОЛУЧАВАТ ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНИ MGDF БЕЛТЪЧНИ МОЛЕКУЛИ, ПРИ КОИТО ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВАТА ЧАСТ Еф ДИРЕКТНО СВЪРЗАНА С БЕЛТЪЧНАТА ЧАСТ. В ДРУГ АСПЕКТ ТОВА ИЗОБРЕТЕНИЕ РАЗГЛЕЖДА ФАРМАЦЕВТИЧНИТЕ СЪСТАВИ, СЪДЪРЖАЩИ ТЕРАПЕВТИЧНО ЕФЕКТИВНО КОЛИЧЕСТВО ОТ ИЗОЛИРАНИЯ ОТ ЕСТЕСТВЕНИ ИЗТОЧНИЦИ ИЛИ РЕКОМБИНАНТЕН Мр1 ЛИГАНД, КОЙТО МОЖЕ ДА БЪДЕ МОДИФИЦИРАН С ВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИМЕР КАТО ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ И ФАРМАЦЕВТИЧНО ПРИЕМЛИВ НОСИТЕЛ, РАЗТВОРИТЕЛ ИЛИ ИНЕРТЕН ПЪЛНИТЕЛ. ТЕЗИ ФАРМАЦЕВТИЧНИ СЪСТАВИ МОГАТ ДА БЪДАТ ВКЛЮЧЕНИ В МЕТОДИ ЗА ЛЕЧЕНИЕ НА БОЛЕСТНИ СЪСТОЯНИЯ ИЛИ НАРУШЕНИЯ, ХАРАКТЕРИЗИРАЩИ СЕ
С ДЕФИЦИТ НА МЕГАКАРИОЦИТИ И/ИЛИ ТРОМБОЦИТИ, А СЪЩО ТАКА И ПРИ IN -22- WO 95/26746 PCT/US95/03776 VIVO ДЕФЕКТИ HA Mpl ЛИГАНДИ. СЪЩО ТАКА ТЕ МОГАТ ДА СЕ ИЗПОЛЗВАТПРОФИЛАКТИЧНО ЗА ОБЛЕКЧАВАНЕ НА ОЧАКВАНИ МЕГАКАРИОЦИТНИ ИЛИТРОМБОЦИТНИ ДЕФИЦИТИ ПРИ ОПЕРАЦИИ.
Mpl ЛИГАНДИТЕ ОТ НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ МОГАТ ДА БЪДАТ ВКЛЮЧЕНИ ВЛЕЧЕНИЕТО НА АПЛАСТИЧНИ АНЕМИИ Т.Е. ЗА УВЕЛИЧАВАНЕ ПРОИЗВОДСТВОТОНА ТРОМБОЦИТИ ПРИ ПАЦИЕНТИ С НАРУШЕНО ТАКОВА ПРОИЗВОДСТВО/ПАЦИЕНТИ СЪС СПИН ИЛИ ПОДЛОЖЕНИ НА ХИМИОТЕРАПИЯ ПРИ РАК/. MplЛИГАНГИТЕ МОГАТ ДА СЕ ИЗПОЛЗВАТ ЗА ЛЕЧЕНИЕ НА КРЪВНИ НАРУШЕНИЯКАТО ТРОМБОЦИТОПЕНИЯ. Mpl ЛИГАНДИТЕ МОГАТ ДА СЕ ИЗПОЛЗВАТ КАТОДОПЪЛНИТЕЛНА ТЕРАПИЯ ПРИ ПАЦИЕНТИ С ТРАНСПЛАНТИРАН КОСТЕН МОЗЪК.ТЕЗИ БЕЛТЪЦИ МОГАТ ДА БЪДАТ ОТ ЧОВЕК ИЛИ ОТ ДРУГ БОЗАЙНИК.ПРЕДПОЛГА СЕ, ЧЕ Mpl ЛИГАНДИ ОТ ЕДИН ВИД СА ГОДНИ ЗА ПРИЛОЖЕНИЕ ПРИДРУГ ВИД. В ДРУГ АСПЕКТ ТОВА ИЗОБРЕТЕНИЕ РАЗГЛЕЖДА МЕТОД ЗА ЛЕЧЕНИЕ НА ЕДНИИЛИ ДРУГИ ПАТОЛОГИЧНИ СЪСТОЯНИЯ, ПРИЧИНЕНИ ОТ ТРОМБОЦИТЕНДЕФИЦИТ, ЧРЕЗ ПРИЛАГАНЕ НА ТЕРАПЕВТИЧНО ЕФЕКТИВНО КОЛИЧЕСТВО НАФАРМАКОЛОГИЧНИЯ СЪСТАВ, ΚΑΚΤΟ Е ОПИСАНО ПО-ГОРЕ. ТЕЗИТЕРАПЕВТИЧНИ МЕТОДИ МОГАТ ДА ВКЛЮЧВАТ ЕДНОВРЕМЕННО ИЛИПООТДЕЛНО ПРИЛАГАНЕ НА: Mpl ЛИГАНД; ЕФЕКТИВНО КОЛИЧЕСТВО ОТ НАЙ-МАЛКО ЕДИН СТИМУЛИРАЩ ФАКТОР НА МЕГАКАРИОЦИТНАТА КОЛОНИЯ;ЦИТОКИН /ЕРО/; РАЗТВОРИМ Mpl РЕЦЕПТОР; РАСТЕЖЕН ФАКТОР И АНТИТЯЛО. В ДРУГ АСПЕКТ НА НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ СЕ РАЗГЛЕЖДАТ АНТИТЕЛАТА/ПОЛИКЛОНАЛНИ, МОНОКЛОНАЛНИ, ХУМАНИЗИРАНИ И РЕКОМБИНАНТНИ/ ИТЕХНИ ФРАГМЕНТИ, КОИТО РЕАГИРАТ С Mpl ЛИГАНДА ИЛИ ЛИГАНДЕНФРАГМЕНТ ПРИ БОЗАЙНИЦИТЕ. КАТО ЧАСТ ОТ ТОЗИ АСПЕКТ ИЗОБРЕТЕНИЕТОВКЛЮЧВА КЛЕТКИТЕ СПОСОБНИ ДА СЕКРЕТИРАТ ТАКИВА АНТИТЕЛА/ХИБРИДОМИ, В СЛУЧАЙ НА МОНОКЛОНАЛНИ АНТИТЕЛА/ И МЕТОДИТЕ ЗА -23- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ТЯХНОТО ПРОИЗВОДСТВО И ИЗПОЛЗВАНЕ ЗА ДИАГНОСТИЧНИ И ТЕРАПЕВТИЧНИНУЖДИ. ДРУГ АСПЕКТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО Е АНАЛИЗ НА ТЪКАННА ТЕЧНОСТ ЗА НАЛИЧИЕНА Мр1 ЛИГАНДИ. ТОЗИ АНАЛИЗ МОЖЕ ДА ВКЛЮЧВА АНТИТЕЛА, КОИТОСПЕЦИФИЧНО РАЗПОЗНАВАТ Мр1 ЛИГАНДА, КАТО ТЕ МОГАТ ДА БЪДАТЕДИНИЧНИ ИЛИ ТИП „САНДВИЧ“. ТАКЪВ АНАЛИЗ МОЖЕ ДА СЕ ИЗПОЛЗВА ЗА ДАСЕ ОПРЕДЕЛИ ДАЛИ ПАЦИЕНТА СЕ НУЖДАЕ ОТ ДОПЪЛНИТЕЛНО ВНАСЯНЕ НАМр1 ЛИГАНД ОТВЪН И/ИЛИ ДАЛИ Е ВЕРОЯТНО ТОЗИ ПАЦИЕНТ ДА ПОЛУЧИТРОМБОЦИТЕН ДЕФИЦИТ ИЛИ НАРУШЕНИЕ. ТОЗИ АНЛИЗ МОЖЕ ДА БЪДЕНАПРАВЕН ПОД ФОРМАТА НА КИТ, СЪДЪРЖАЩ ПОЛОЖИТЕЛНИ И ОТРИЦАТЕЛНИКОНТОРЛИ ЗА АНТИТЕЛА И ДРУГИ СТАНДАРТНИ КИТ КОМПОНЕНТИ. ДРУГИ АСПЕКТИ НА НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ И ПОЛЗАТА ОТ НЕГО ЩЕБЪДАТ ОНАГЛЕДЕНИ В ХОДА НА СЛЕДВАЩОТО ПОДРОБНО ОПИСАНИЕ. IV. КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ФИГУРИТЕ МНОГО АСПЕКТИ И ПРЕДИМСТВА НА НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ ЩЕ БЪДАТРАЗБРАНИ ПРИ РАЗГЛЕЖДАНЕТО НА СЛЕДНИТЕ ФИГУРИ: ® ФИГ. 1 ИЗОБРАЗЯВА ПРЕГЛЕД НА РАЗВИТИЕТО И ЗРЕЕНЕТО НАМЕГАКАРИОЦИТИТЕ И ТРОМБОЦИТИТЕ. ФИГ. 2 ПОКАЗВА, ЧЕ РАЗТВОРИМ МИШИ Мр1 РЕЦЕПТОР ПРАКТИЧЕСКИ НАПЪЛНОИНХИБИРА СПОСОБНОСТТА НА ПЛАЗАМА ОТ ОБЛЪЧЕНИ КУЧЕТА/ „APLASTICCANINE“ ИЛИ „АРК 9“/ ДА ИНДУЦИРА МЕГАКАРИОЦИТНО РАЗВИТИЕ. АНАЛИЗЪТНА МЕГАКАРИОЦИТНОТО РАЗВИТИЕ Е ОПИСАН В ПРИМЕР 2. ФИГ.З ПОКАЗВА, ЧЕ ПОВИШЕНАТА АКТИВНОСТ НА АРК9 ЧРЕЗ ЛЕКТИНАфИНИТЕТНА ХРОМАТОГРАФИЯ И Мр1 РЕЦЕПТОР АфИНИТЕТНА -24- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ХРОМАТОРГАФИЯ СТИМИЛИРА РАСТЕЖА НА 1 А6.1 КЛЕТКИ И ЧЕ РАЗТВОРИМИЯМИШИ Mpl РЕЦЕПТОР БЛОКИРА ТОЗИ РАСТЕЖ. ФИГ. 4 ПОКАЗВА СТАДИИТЕ НА ПРЕЧИСТВАНЕ, ИЗПОЛЗВАНИ ПРИПРЕЧИСТВАНЕТО НА 25 И 31 kd ФОРМИТЕ НА КУЧЕШКИЯ Mpl РЕЦЕПТОР ОТАПЛАСТИЧНА КУЧЕШКА ПЛАЗМА. ФИГ. 5 ПОКАЗВА ПРЕЧИСТВАНЕТО НА Mpl ЛИГАНДА ЧРЕЗ R-P - HPLC. ФРАКЦИЯ21 СЪДЪРЖА ВИСОКО ПРЕЧИСТЕН 31 kd Mpl ЛИГАНД, ФРАКЦИЯ 22 СЪДЪРЖА С СМЕС ОТ 31 kd И 21 kd Mpl ЛИГАНДИ И ФРАКЦИЯ 23 СЪДЪРЖА ВИСОКОПРЕЧИСТЕН 25 kd Mpl ЛИГАНД. ФИГ. 6 ПОКАЗВА СРАВНЕНИЕ МЕЖДУ АКТИВНОСТИТЕ НА Mpl ЛИГАНДИ ВЪВ R-PHPLC /С4 КОЛОНА/ ФРАКЦИИ, КОИТО СЪДЪРЖАТ 25 И/ИЛИ 31 kd ЛИГАНДНИБЕЛТЪЦИ. ФИГ. 7 ПОКАЗВА БРОЯ НА МЕГАКАРИОЦИТИТЕ, ПРОИЗВЕДЕНИ В КУЛТУРИ ОТ CD-34 ПЕРИФЕРНИ КРЪВНИ КЛЕТКИ, СТИМУЛИРАНИ С АРК9; Mpl ЛИГАНД ИРАЗЛИЧНИ ДРУГИ ФАКТОРИ. © ФИГ. 8 ПОКАЗВА БРОЯ НА ВСИЧКИ ЛЕВКОЦИТИ, ПРОИЗВЕДЕНИ ОТ КУЛТУРИ ОТCD-34 ПЕРИФЕРНИ КРЪВНИ КЛЕТКИ, СТИМУЛИРАНИ С АРК9; Mpl ЛИГАНД ИРАЗЛИЧНИ ДРУГИ ФАКТОРИ. ФИГ. 9 ПОКАЗВА ПРОЦЕНТНОТО СЪДЪРЖАНИЕ НА МЕГАКАРИОЦИТИТЕ,ПРОИЗВЕДЕНИ В КУЛТУРИ ОТ CD-34 ПЕРИФЕРНИ КРЪВНИ КЛЕТКИ,СТИМУЛИРАНИ С АРК9; Mpl ЛИГАНД И РАЗЛИЧНИ ДРУГИ ФАКТОРИ. ФИГ. 10 ПОКАЗВА, ЧЕ ЧОВЕШКИЯТ IL-3 НЕ Е ВКЛЮЧЕН В Mpl ЛИГАНД-ИНДУЦИРАНОТО МЕГАКАРИОЦИТНО РАЗВИТИЕ. -25- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ФИГ. 11. ПОКАЗВА к ДНК И СЪОТВЕТНИТЕ ФРАГМЕНТИ НА ЧОВЕШКИ MGDF -1 ИMGDF-2. ФИГ. 12. ПОКАЗВА к ДНК И СЪОТВЕТНИТЕ ФРАГМЕНТИ НА ЧОВЕШКИ MGDF -3. ФИГ. 13 ПОКАЗВА СРАВНЕНИЕ МЕЖДУ MGDF-1 И MGDF-2 /Мр1 ЛИГАНДИТЕ/ ОТКУЧЕШКИ /А/ И ОТ МИШИ /В/ ПРОИЗХОД. ФИГ. 14 ПОКАЗВА ПРИМЕР НА АЦЕЛИРАНЕ НА MGDF ЧРЕЗ ИЗПОЛЗВАНЕ НА N-ХИДРОКСИСУКЦИНИМИДИЛ /NHS/ АКТИВНИ ЕСТЕРИ НА МОНО-МЕТОКСИ-ПОАИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ, КРАЙНИЯТ РЕЗУЛТАТ, ОТ КОЕТО Е ПОЛИ-ПОЛИЕТИЛЕНГЛИКОЛИРАН ПРОДУКТ. ФИГ. 15 ПОКАЗВА ПРИМЕР НА НЕСПЕЦИФИЧНО РЕДУКТИВНО АЛКИЛИРАНЕ НА α-АМИНО ГРУПАТА НА N-КРАЙНИЯ ОСТАТЪК, ЧРЕЗ ИЗПОЛЗВАНЕ НА МОНО- МЕТОКСИ-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ АЛДЕХИДИ, КРАЙНИЯТ РЕЗУЛТАТ ОТ КОЕТО ЕМОНО-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН ПРОДУКТ. ФИГ. 16 ПОКАЗВА ПРИМЕР НА МЯСТО-СПЕЦИфИЧНО РЕДУКТИВНО АЛКИЛИРАНЕ НА а-АМИНО ГРУПАТА НА N-КРАЙНИЯ ОСТАТЪК ЧРЕЗ ИЗПОЛЗВАНЕ НА МОНО- МЕТОКСИ-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ АЛДЕХИДИ, КРАЙНИЯТ РЕЗУЛТАТ ОТ КОЕТО ЕМОНО-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН ПРОДУКТ. ФИГ. 17 ПОКАЗВА РАЗМЕРНИ /SEC/ HPLC АНАЛИЗИ НА MEPEG - MGDFКОНЮГАТИ, ПРИГОТВЕНИ С ПОМОЩТА НА АКТИВИРАНИ MW 20 KDA MEPEGПРОИЗВОДНИ. А. ПОЛИ -MEPEG-MGDF СЪЕДИНЕНИЕ ПРИГОТВЕНО ЧРЕЗ АЦЕЛИРАНЕ НА MGDFС NHS ЕСТЕР НА MEPEG /PEG11/. -26- WO 95/26746 PCT/US95/03776 B. ПОЛИ-MEPEG-MGDF СЪЕДИНЕНИЕ ПРИГОТВЕНО ЧРЕЗ АЛКИАИРАНЕ НА MGDFС MEPEG АЛДЕХИД/PEG 20/. C. MOHO-MEPEG-MGDF СЪЕДИНЕНИЕ ПРИГОТВЕНО ЧРЕЗ АЛКИАИРАНЕ НА MGDFС MEPEG АЛДЕХИД /PEG 16/. ФИГ. 18 ПОКАЗВА БРОЯ НА ТРОМБОЦИТИ ОТ МИШКА, ТРЕТИРАНА СРЕКОМБИНАНТНИ ЧОВЕШКИ MGDF: ПРАЗНИ РОМБОИДИ = СНО - ПРОИЗВОДЕН22-353 MGDF; ПРАЗНИ КРЪГОВЕ = 22-184 MGDF ОТ Е. coli, НЕОБРАБОТЕНИ СПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ 1 -163 MGDF; ПЛЪТНИ КРЪГОВЕ = 22-184 MGDF ОТ Е. COli,ОБРАБОТЕНИ С ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ. ФИГ. 19. ПОКАЗВА СХЕМА НА ПЪТЯ НА ПРЕЧИСТВАНЕ НА HuMGDF. ФИГ. 20 ПОКАЗВА ЕФЕКТА ОТ г-HuMGDF /Е. coli 1-163/ ВЪРХУ БРОЯ НАТРОМБОЦИТИТЕ В МИШИ КАРБОПЛАТИНОВ МОДЕЛ. МИШКИ BALB/c БЯХАИНЖЕКТИРАНИ ИНТЕРПЕРИТОНАЛНО С ЕДИНИЧНА ДОЗА КАРБОПЛАТИНА /1,25мд/МИШКА/ В ДЕН 0. НА ОТДЕЛНА ГРУПА НЕ Е ИНЖЕКТИРАНА КАРБОПЛАТИНА, АСАМО ИНЕРТЕН НОСИТЕЛ. СЛЕД 24 ЧАСА ЖИВОТНИТЕ, ТРЕТИРАНИ СКАРБОПЛАТИНА СА ПОДКОЖНО ИНЖЕКТИРАНИ ИЛИ С ИНЕРТНИЯ НОСИТЕЛИЛИ С 100 UG/КГ. г-HuMGDF ДНЕВНО ЗА ОСТАТЪКА ОТ ИЗСЛЕДВАНЕТО. /N=10ЗА ВСЯКА ГРУПА; ОТ 5 ЖИВОТНИ Е ВЗЕМАНА КРЪВ ВЪВ ВСЯКА ТОЧКА ОТВРЕМЕТО./ ФИГ. 21 ПОКАЗВА ЕФЕКТА ОТ г-HuMGDF /Е. coll 1-163/ ВЪРХУ БРОЯ НАТРОМБОЦИТИТЕ ПРИ МИШКИ, ТРЕТИРАНИ С РАДИАЦИЯ. МИШКИ BALB/c БЯХАОБЛЪЧЕНИ С ЕДИНИЧНА ДОЗА ОТ 500 RAD ГАМА-ЛЪЧИ /ЦЕЛЗИЕВ ИЗТОЧНИК/ ВДЕН 0. ОТДЕЛНА ГРУПА ЖИВОТНИ НЕ Е ПОДЛАГАНА НА РАДИАЦИЯ, А ЕПОЛУЧИЛА ОТ ИНЕРТНИЯ НОСИТЕЛ. СЛЕД 24 ЧАСА ОБЛЪЧЕНИТЕ ЖИВОТНИ, СА -27- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ПОДКОЖНО ИНЖЕКТИРАНИ ИДИ С ИНЕРТНИЯ НОСИТЕЛ ИЛИ С 100 UG/КГ. г-HuMGDF ДНЕВНО ЗА ОСТАТЪКА ОТ ИЗСЛЕДВАНЕТО. /N=6 ЗА ВСЯКА ГРУПА; ОТ 4ЖИВОТНИ Е ВЗЕМАНА КРЪВ ВЪВ ВСЯКА ТОЧКА ОТ ВРЕМЕТО./ ФИГ. 22 ПОКАЗВА ЕФЕКТА ОТ r-HuMGDF /Е. coll 1-163/ ВЪРХУ БРОЯ НАТРОМБОЦИТИТЕ ПРИ МИШКИ, ТРЕТИРАНИ ЕДНОВРЕМЕННО С РАДИАЦИЯ ИКАРБОПЛАТИНА. МИШКИ BALB/с БЯХА ОБЛЪЧЕНИ С ЕДИНИЧНА ДОЗА ОТ 500RAD ГАМА-ЛЪЧИ /ЦЕЛЗИЕВ ИЗТОЧНИК/ И БЯХА ТРЕТИРАНИ С КАРБОПЛАТИНА/1.25 мд/МИШКА/ В ДЕН 0. СЛЕД 24 ЧАСА ОБЛЪЧЕНИТЕ ЖИВОТНИ, БЯХА © ПОДКОЖНО ИНЖЕКТИРАНИ ИЛИ С ИНЕРТНИЯ НОСИТЕЛ, ИЛИ С 100 UG/КГ.r-HuMGDF ДНЕВНО ЗА ОСТАТЪКА ОТ ИЗСЛЕДВАНЕТО. /N=8 ЗА ВСЯКА ГРУПА; ОТ4 ЖИВОТНИ Е ВЗЕМАНА КРЪВ ВЪВ ВСЯКА ТОЧКА ОТ ВРЕМЕТО./ ПРИ ОТСЪСТВИЕНА r-HuMGDF ПОВЕЧЕТО ЖИВОТНИ НЕ ОЦЕЛЯВАТ. В КОНТРОЛНАТА ГРУПА 1 ОТ 8ЖИВОТНИ ОЦЕЛЯВА. В ТРЕТИРАНАТА ГРУПА 8 ОТ 8 ЖИВОТНИ ОЦЕЛЯВАТ. ФИГ. 23 ПОКАЗВА ЕФЕКТА НА r-HuMGDF /Е. coll 1-163/ ВЪРХУ РАДИАЦИОННОПРЕДИЗВИКАНА ТРОМБОЦИТОПЕНИЯ В МАЙМУНИ RHEZUZ. RHEZUZ МАЙМУНИБЯХА ПОДЛОЖЕНИ НА РАДИАЦИЯ /700 с Gy Со-80/. 24 ЧАСА СЛЕД ОБЛЪЧВАНЕТОБЕШЕ ИНЖЕКТИРАН r-HuMGDF /п = 3/ ИЛИ ЧОВЕШКИ СЕРУМЕН АЛБУМИН /п =5/./И ДВЕТЕ ПО 25 mg/KG/ ДЕН/, КАТО ПРИЛГАНЕТО ИМ ПРОДЪЛЖИ 18 © ПОСЛЕДОВАТЕЛНИ ДНИ. КРЪВНИТЕ АНАЛИЗИ БЯХА ПРОВЕДЕНИ С ЕЛЕКТРОНЕНАНАЛИЗАТОР НА КРЪВНИ КЛЕТКИ. ВСЕКИ СИМВОЛ ИЗОБРАЗЯВА СРЕДНАСТОЙНОСТ (+/ - СРЕДНАТА ГРЕШКА НА МЕТОДА). ФИГ. 24 ПОКАЗВА ЕФЕКТА НА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН И ГЛИКОЗИЛИРАНr-HuMGDF ВЪРХУ БРОЯ НА ТРОМБОЦИТИТЕ В МИШКИ, ТРЕТИРАНИ СКАРБОПЛАТИНА И РАДИАЦИЯ. МИШКИТЕ СА ПОДЛОЖЕНИ НА КОМБИНИРАНОДЕЙСТВИЕ НА КАРБОПЛАТИНА И РАДИАЦИЯ, ΚΑΚΤΟ Е ОПИСАНО ВОБЯСНЕНИЯТА НА ФИГ. 22.24 ЧАСА СЛЕД ТОВА ТРЕТИРАНЕ ЗАПОЧВА -28- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ПОДКОЖНО ИНЖЕКТИРАНЕ НА r-HuMGDF /50 mg/КГ/ДЕН/, ОБРАБОТЕН ПОГОРЕПОСОЧЕНИТЕ НАЧИНИ. БРОЯТ НА КРЪВНИТЕ КЛЕТКИ ЗА ВСЕКИ ОТПОСОЧЕНИТЕ ДНИ БЕШЕ ОПРЕДЕЛЕН ЧРЕЗ ЕЛЕКТРОНЕН КЛЕТЪЧЕН БРОЯЧSYSMEX /BAXTER/. ФИГ. 25 ПОКАЗВА СИНТЕЗИРАНА ГЕННА СЕКВЕНЦИЯ НА РЕКОМБИНАНТЕНЧОВЕШКИ MGDF, АМИНОКИСЕЛИНИ 1- 163, КОЯТО ИМА Е. coli ОПТИМИЗИРАНИКОДОНИ. V, ПОДРОБНО ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО В СЛЕДВАЩОТО ОПИСАНИЕ, КОЕТО ПОДРОБНО РАЗГЛЕЖДА ПРАКТИЧЕСКАТАЧАСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО ЩЕ БЪДАТ ПОКАЗАНИ НЕГОВИТЕ ДОПЪЛНИТЕЛНИАСПЕКТИ И ПРЕДИМСТВА. НОВИТЕ РАСТЕЖНИ ФАКТОРИ ЗА УВЕЛИЧАВАНЕ МЕГАКАРИОЦИТНИЯ РАСТЕЖИ/ИЛИ ПРОИЗВОДСТВОТО НА ТРОМБОЦИТИ ПРИ БОЗАЙНИЦИТЕ, НАРЕЧЕНИ Мр1ЛИГАНДИ, ПРЕДСТВЕНИ В НА НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ СА ХОМОГЕННИБЕЛТЪЦИ, ПРАКТИЧЕСКИ ЧИСТИ ОТ ДРУГИ БЕЛТЪЧНИ МАТЕРИАЛИ. ЖЕЛАТЕЛНОЕ ТЕЗИ БЕЛТЪЦИ ДА СА 90 % ЧИСТИ ОТ ДРУГИ БЕЛТЪЦИ, ПО-ДОБРЕ Е ДА САОКОЛО 95 % ЧИСТИ ОТ ДРУГИ БЕЛТЪЦИ И НАЙ-ДОБРЕ Е ДА СА ОКОЛО 98 % ИЛИПОВЕЧЕ ЧИСТИ ОТ ДРУГИ БЕЛТЪЦИ. ТЕЗИ БЕЛТЪЦИ МОГАТ ДА БЪДАТПРОИЗВЕДЕНИ ЧРЕЗ РЕКОМБИНАНТНИ ТЕХНИКИ, ТАКА ЧЕ ДА СЕ ПОЧУЧИГОЛЯМА ПО КОЛИЧЕСТВО ПРОДУКЦИЯ ЧИСТИ, АКТИВНИ Мр1 ЛИГАНДИ, КОИТОДА СЕ ИЗПОЛЗВАТ ЗА ТЕРАПЕВТИЧНИ НУЖДИ. АЛТЕРНАТИВНО ТАКИВАБЕЛТЪЦИ МОГАТ ДА БЪДАТ ПОЛУЧЕНИ В ЧИСТ ВИД ОТ АПЛАСТИЧНА КРЪВ,ПЛАЗМА ИЛИ СЕРУМ ОТ БОЗАЙНИЦИ, ИЛИ ОТ КЛЕТЪЧНА ЛИНИЯ ОТ БОЗАЙНИЦИ,КОЯТО СЕКРЕТИРА ИЛИ ЕКСПРЕСИРА Мр1 -29- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ЛИГАНД. СЪЩО ТАКА Mpl ЛИГАНД ИЛИ НЕГОВИ АКТИВНИ ФРАГМЕНТИ МОГАТ ДАБЪДАТ ХИМИЧНО СИНТЕЗИРАНИ. НАЙ-ОБЩО ПОД НАЗВАНИЕТО „Мр1 ЛИГАНДИ“, ИЗПОЛЗВАНО В НАСТОЯЩОТОИЗОБРЕТЕНИЕ СЕ РАЗБИРАТ Mpl ЛИГАНДИ ОПИСАНИ ТУК, А СЪЩО ТАКА ТЕХНИАКТИВНИ ФРАГМЕНТИ И ВАРИАНТИ, КОИТО СА ПОДРОБНО ОПИСАНИ ПО-ДОЛУ. ДВА ПРЕДПОЧИТАНИ Mpl ЛИГАНДА ОТ КУЧЕШКИ ПРОИЗХОД ИМАТ СЪОТВЕТНОМОЛЕКУЛНО ТЕГЛО ПРИБЛИЗИТЕЛНО 25 kd И 31 kd, КОЕТО Е ОПРЕДЕЛЕНО ЧРЕЗ © ЕЛЕКТРОФОРЕЗА В НАТРИЕВДОДЕЦИЛ СУЛФАТ ПОЛИАКРИЛ АМИДЕН ГЕЛ /SDS-PAGE/ ПРИ НЕРЕДУКЦИОННИ УСЛОВИЯ. ДВАТА БЕЛТЪКА СА ПРЕЧИСТЕНИ ЧРЕЗМЕТОДИТЕ ЗА ПРЕЧИСТВАНЕ ПОДРОБНО ОПИСАНИ В ПРИМЕРИТЕ ПО-ДОЛУ.ТАКА НАПРИМЕР И ДВАТА БЕЛТЪКА СЕ СВЪРЗВАТ С ЛЕКТИН ОТ ПШЕНИЧНИЗАРОДИШИ И ИМОБИЛИЗИРАН Mpl РЕЦЕПТОР. 25 kd ФОРМАТА ВКЛЮЧВА АМИНОКИСЕЛНИННА СЕКВЕНЦИЯ ΚΑΚΤΟ СЛЕДВА: АЛА-ПРО-ПРО-АЛА-ХАА-АСП-ПРО-АРГ-ЛЕВ-ЛЕВ-АСН-ЛИЗ-МЕТ-ЛЕВ-АРГ-АСП-СЕР-ХИС-ВАЛ-ЛЕВ-ХИС-ХАА-АРГ-ЛЕВ-ХАА-ГЛН-ХАА-ПРО-АСП-ИЛЕ-ТИР/СЕКВЕНЦИЯ С ИДЕНТИФИКАЦИНЕН N0:1/ © 31 kd ФОРМАТА ВКЛЮЧВА АМИНО КИСЕЛНИННА СЕКВЕНЦИЯ ΚΑΚΤΟ СЛЕДВА: АЛА-ПРО-ПРО-АЛА-ХАА-АСП-ПРО-АРГ-ЛЕВ-ЛЕВ-АСН-ЛИЗ-МЕТ-ЛЕВ-АРГ-АСП-СЕР- ХИС-ВАЛ-ЛЕВ-ХИС /СЕКВЕНЦИЯ С ИДЕНТИФИКАЦИНЕН N0:2/ „ХАА“ АМИНО КИСЕЛИНИТЕ ПОКАЗАНИ В СЕКВЕНЦИИ С ИНДЕНТИфИКАЦИОННИNo: 1 И 2 НЕ СА ИЗВЕСТНИ СЪС СИГУРНОСТ, НО СЕ ПРЕДПОЛГА ЧЕ СА ЦИСТЕИН,ТРЕОНИН, ИЛИ /НАЙ-МАЛКО ВЕРОЯТНО/ТРИПТОфАН. -30- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ОТ ГОРНИТЕ СЕКВЕНЦИИ Е ОЧЕВИДНО, ЧЕ 31 kd ЛИГАНДА СЪДЪРЖА ПОНЕ ЧАСТОТ 25 kd ФОРМАТА. ПО-СПЕЦИАЛНО ПЪРВИТЕ 21 АМИНО КИСЕЛИНИ НА 31 kdФОРМАТА СА АБСОЛЮТНО СЪЩИТЕ КАТО ТЕЗИ НА 25 kd БЕЛТЪКА. ТОЗИОЧЕВИДЕН ФАКТ, И ОСОБЕНО ФАКТА, ЧЕ И ДВАТА БЕЛТЪКА ИМАТ АКТИВНОСТПРИ АНАЛИЗИТЕ ЗА Мр1 ЛИГАНДНА АКТИВНОСТ ПОКАЗАНИ ТУК, ВОДИ ДОИЗВОДА, ЧЕ ДВАТА БЕЛТЪКА СА МНОГО ТЯСНО СВЪРЗАНИ ПО ОТНОШЕНИЕ НАСТРУКТУРА И АКТИВНОСТ. ВЕРОЯТНО 31 kd ФОРМАТА НА БЕЛТЪКА СЕРАЗЛИЧАВА ОТ 25 kd ФОРМАТА ПО РАЗЛИЧНА С-КРАЙНАТА СЕКВЕНЦИЯ,РАЗЛИЧНО ГЛИКОЗИЛИРАНЕ И/ИЛИ РАЗЛИЧЕН СПЛАЙСИНГ НА ГЕНА КОДИРАЩБЕЛТЪЦИТЕ. В ДОПЪЛНЕНИЕ КЪМ ИНФОРМАЦИЯТА ЗА ГОРНАТА СЕКВЕНЦИЯ ПРИСЕКВЕНИРАНЕТО НА 25 kd ПРЕДИ ПОСЛЕДНАТА СТЪПКА НА ПРЕЧИСТВАНЕ ЧРЕЗОБРАТНО ФАЗОВА HPLC Е БИЛА ОПРЕДЕЛЕНА И ДРУГА СЕКВЕНЦИЯ. ТАЗИСЕКВЕНЦИЯ Е БИЛА СВЪРЗАНА С 21 kd ПРИ НЕРЕДУКЦИОННИ УСЛОВИЯ, НО НЕРЕДУЦИРАЩИ УСЛОВИЯ, КОЕТО ЗНАЧИ, ЧЕ ТЯ Е РЕЗУЛТАТ ОТ РАЗДЕЛЯНЕТО НА25 kd БЕЛТЪКА НА ДВЕ ЧАСТИ ЧРЕЗ ПРОТЕАЗА КАТО ТЕЗИ ДВЕ ЧАСТИ САСВЪРЗАНИ С ДИСУЛФИДНА ВРЪЗКА. ТАЗИ СЕКВЕНЦИЯ Е: ТРЕ-ГЛН-ЛИЗ-ГЛУ-ТРЕ-ЛИЗ-АЛА-ГЛН-АСП-ВАЛ-ЛЕВ-ГЛИ-АЛА-ВАЛ-АЛА-ЛЕВ/СЕКВЕНЦИЯ С ИДЕНТИФИКАЦИНЕН N0:3/ ВЪПРЕКИ ЧЕ ТОЧНОТО МЕСТОНАХОЖДЕНИЕ НА СЕКВЕНЦИЯ СИДЕНТИФИКАЦИНЕН N0 3 В СЕКВЕНЦИЯТА НА 25 kd БЕЛТЪКА Е НЕЯСНО,АНАЛОГИЯТА С ДРУГИ ЦИТОКИНИ КАТО ЕРИТРОПОЕТИН ПОДДЪРЖАВЪЗМОЖНОСТТА ТАЗИ СЕКВЕНЦИЯ ДА СЕ НАМИРА ОКОЛО АМИНО КИСЕЛИНА114 В 25 kd БЕЛТЪКА. ТРЯБВА ДА ОТБЕЛЕЖИ, ЧЕ Е ВЕРОЯНО, ВЪПРЕКИ, ЧЕ НЕ ЕДОКАЗАНО, СЕКВЕНЦИЯ N0 3 ДА СЕ СЪДЪРЖА И В 31 kd БЕЛТЪКА, ВЕРОЯТНООТНОВО ЗАПОЧВАЙКИ ОКОЛО АМИНО КИСЕЛИНА 114. ИНФОРМАЦИЯТА ЗА ТАЗИСЕКВЕНЦИЯ Е РАЗГЛЕДАНА В ДОПЪЛНИТЕЛНИ ДЕТАЙЛИ В ПРИМЕР 7. -31- WO 95/26746 PCT/US95/03776 СЛЕД ПЪВОНАЧАЛНИТЕ ЕКСПЕРИМЕНТИ ЗА ПРЕЧИСТВАНЕ НА КУЧЕШКИЛИГАНДИ, РАЗГЛЕДАНО НАКРАТКО ПО-ГОРЕ БЕШЕ КЛОНИРАН ГЕН КОДИРАЩКУЧЕКИ ЛИГАНД. КАТО РЕЗУЛТАТ ПЪЛНАТА ДЪЛЖИНА НА АМИНО КИСЕЛИННАТАПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ НА ТОЗИ КУЧЕШКИ ЛИГАНД БЕШЕ ОПРЕДЕЛЕНА И ЕПОКАЗАНА НА фИГ 13 А. ЧРЕЗ ИЗЧИСЛЕНИЯ БАЗИРАНИ НА МОЛЕКУЛНОТО ТЕГЛОЕ ПРЕДСКАЗАНО, ЧЕ 25 kd И 31 kd СА С-КРАЙНИ ФОРМИ НА ЛИГАНДА, ПОКАЗАНВ ПЪЛНАТА СИ ДЪЛЖИНА НА фИГ. 13 А. В ДОПЪЛНЕНИЕ Е ПОЛУЧЕН МИШИ MplЛИГАНД, ЧИЯТА СЕКВЕНЦИЯ Е ПОКАЗАНА НА фИГ. 13 В. ТАКИВА ПРЕЧИСТЕНИ ЛИГАНДИ МОГАТ ДА БЪДАТ ХАРАКТЕРИЗИРАНИ ПОСПЕЦИФИЧНА АКТИВНОСТ В АНАЛИЗИТЕ НА ЧОВЕШКИ МЕГАКАРИОЦИТИ ВПРИМЕР 2, ПРИ НАЙ-МАЛКО ОКОЛО 5.7 х 10 НА ДЕВЕТА СТЕПЕНМЕГАКАРИОЦИТНИ ЕДИНИЦИ/mg. ЕДНА МЕГАКАРИОЦИТНА ЕДИНИЦА ЕОПРЕДЕЛЕНА КАТО КОЛИЧЕСТВОТО МАТЕРИАЛ, КОЕТО ПРОИЗВЕЖДАТОЛКОВА МЕГАКАРИОЦИТИ, КОЛКОТО 1 МИКРОЛИТЪР АРК9 СТАНДАРТНАКОНТРОЛА ЧРЕЗ АНАЛИЗИТЕ ОПИСАНИ В ПРИМЕР 2. СЪЩО ТАКА ТАКИВА ПРЕЧИСТЕНИ ЛИГАНДИ СА ХАРАКТЕРИЗИРАНИ ПОСПЕЦИФИЧНА АКТИВНОСТ ПРИ АНАЛИЗА НА Mpl - ЗАВИСИМ КЛЕТЪЧЕН РАСТЕЖВ ПРИМЕР 4, ПРИ НАЙ-МАЛКО ОКОЛО 6.9 х 10 НА ДЕВЕТА СТЕПЕН КЛЕТЪЧНАРАСТЕЖНА ЕДИНИЦА/mg. ЕДНА „КЛЕТЪЧНА РАСТЕЖНА ЕДИНИЦА“ ЕДЕФИНИРАНА КАТО КОЛИЧЕСТВОТО ЛИГАНД, НЕОБХОДИМО ЗА ДА СЕ ПОЛУЧИРАСТЕЖ НА 200 1 А6.1 КЛЕТКИ В АНАЛИЗА НА ПРИМЕР 4. СЛЕДВАЩАТА ТАБЛИЦА ПОКАЗВА ДОПЪЛНИТЕЛНИ СПЕЦИФИЧНИ ИЗЧИСЛЕНИЯЗА АКТИВНОСТТА НА ПРЕЧИСТЕНИИ КУЧЕШКИ Mpl ЛИГАНДИ, ПРИГОТВЕНИСПОРЕД ИЗОБРЕТЕНИЕТО: -32- WO 95/26746 PCT/US95/03776
Mpl 1A6.1. АНАЛИЗ АНАЛИЗ HA ЧОВЕШКИ ЛИГАНД /ЕДИНИЦИ/тд/ 31 kd25 kd 6.52 x 10 на девета10.5 х 10 на девета
MEG /ЕДИНИЦИ/mg/ 5.7 х 10 на девета14 х 10 на девета В ОБОБЩЕНИЕ НА ГОРНАТА ИНФОРМАЦИЯ НЯКОИ ПРИМЕРНИ Mpl ЛИГАНДИ ОТНАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ СА ХАРАКТЕРИЗИРАНИ ПО ЕДНО ИЛИ ПОВЕЧЕ ОТСЛЕДНИТЕ БИОХИМИЧНИ И БИОЛОГИЧНИ СВОЙСТВА: а) ТАКИВА Mpl ЛИГАНДИ СА ИЗОЛИРАНИ ОТ КУЧЕШКА АПЛАСТИЧНА ПЛАЗМА; б) ТАКИВА Mpl ЛИГАНДИ ИМАТ СЪОТВЕТНИ МОЛЕКУЛНИ ТЕГЛА ОТПРИБЛИЗИТЕЛНО 25 kd ИЛИ 31 kd, ΚΑΚΤΟ Е ОПРЕДЕЛЕНО ЧРЕЗ ЕЛЕКТРОФОРЕЗАВ 12-14 НАТРИЕВ ДОДЕЦИЛ СУЛФАТ ПОЛИАКРИЛ АМИДЕН ГЕЛ /SDS-PAGE/ ПРИНЕРЕДУКЦИОННИ УСЛОВИЯ. в) Mpl ЛИГАНДИТЕ СЪДЪРЖАТ СЛЕДНАТА АМИНО КИСЕЛИННА СЕКВЕНЦИЯ:СЕКВЕНЦИЯ С ИНДЕНТИФИКАЦИОНЕН: No 1 В СЛУЧАЯ С 25 kd БЕЛТЪКА; ИЛИСЕКВЕНЦИЯ С ИНДЕНТИФИКАЦИОНЕН: No 2 В СЛУЧАЯ С 31 kd БЕЛТЪКА; г) Mpl ЛИГАНДИТЕ СЪДЪРЖАТ АМИНО КИСЕЛИННАТА СЕКВЕНЦИЯ СИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No 3 / ОСОБЕНО ВЕРОЯТНО В 25 kd БЕЛТЪКА/; д) Mpl ЛИГАНДИТЕ СЕ СВЪРЗВАТ С ЛЕКТИН ОТ ПШЕНИЧНИ ЗАРОДИШИ; е) Mpl ЛИГАНДИТЕ СЕ СВЪРЗВАТ С ИМОБИЛИЗИРАН РАЗТВОРИМ МИШИ MplРЕЦЕПТОР. ж) Mpl ЛИГАНДНАТА АКТИВНОСТ МОЖЕ ДА БЪДЕ ИНХИБИРАНА IN VITRO ОТРАЗТВОРИМИЯ Mpl РЕЦЕПТОР; И з) Mpl ЛИГАНДИТЕ СЕ СВЪРЗВАТ КЪМ ЙОНООБМЕННА КОЛОНА ПРИpH ОКОЛО 8-9. -33- WO 95/26746 PCT/US95/03776 БИОЛОГИЧНАТА АКТИВНОСТ НА ПРЕДПОЧИТАНИТЕ Мр1 ЛИГАНДИ ОТНАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ Е ПОКАЗАНА ЧРЕЗ ТЯХНАТА СПОСОБНОСТСПЕЦИФИЧНО ДА СТИМУЛИРАТ РАСТЕЖА И РАЗВИТИЕТО НА МЕГАКАРИОЦИТИ ВАНАЛИЗИТЕ ЗА УСИЛВАНЕ НА МЕГАКАРИОЦИТНИЯ РАСТЕЖ НА ПРИМЕР 2. ПРИТЕЗИ АНАЛИЗИ Мр1 ЛИГАНД СТИМУЛИРА ДИФЕРЕНЦИАЦИЯТА НА ЧОВЕШКИПЕРИФЕРНИ КРЪВНИ CD 34+/CD-34 КЛЕТКИ ИЗБРАНИ ЧРЕЗ ИМУНОАДСОРБЦИЯ/КЛЕТКИ ПРЕЗ 8 ДНЕВЕН КУЛТУРАЛЕН ПЕРИОД. МЕГАКАРИОЦИТИТЕ САРАЗПОЗНАТИ ЧРЕЗ СВЪРЗВАНЕ СЪС СПЕЦИФИЧНИ АНТИ-ТОРМБОЦИТ АНТИГЕНАНТИТЕЛА И СА ПРЕБРОЕНИ МИКРОСКОПСКИ. Мр1 ЛИГАНД СТИМУЛИРА СЪЩОРАСТЕЖА НА фАКТОР-ЗАВИСИМАТА КЛЕТЪЧНА ЛИНИЯ 1А6.1. ПРИ ОТСЪСТВИЕНА Мр1 ЛИГАНД КЛЕТКИТЕ ЩЕ ЗАГИНАТ. БРОЯТ НА 1А6.1 КЛЕТКИТЕ ЕОПРЕДЕЛЕН СЛЕД ДВА ДНИ В КУЛТУРА С Мр1 ЛИГАНД. Мр1 ЛИГАНДИТЕ ОПИСАНИ ПО-ГОРЕ ИМАТ СПЕЦИФИЧНИ АКТИВНОСТИ, ΚΑΚΤΟ ЕПОКАЗАНО В ТАБЛИЦА 1 ПО-ГОРЕ. КАТО ИЗТОЧНИЦИ ЗА Мр1 ЛИГАНДИТЕ СА ОПРЕДЕЛЕНИ АПЛАСТИЧНА КРЪВ,ПЛАЗМА ИЛИ СЕРУМ ОТ БОЗАЙНИЦИ. ОЧАКВА СЕ ОБАЧЕ, ЧЕ ИЗТОЧНИЦИТЕ ЗАТАКИВА ЛИГАНДИ НЕ СА ОГРАНИЧЕНИ ДО ТЕЗИ ПОЗНАТИ ИЗТОЧНИЦИ И МОГАТДА ВКЛЮЧВАТ ДРУГИ ТЪКАННИ ТЕЧНОСТИ ОТ БОЗАЙНИ, КЛЕТКИ ПОЛУЧЕНИ ОТТЯХ И ДР. ПРЕЧИСТВАНЕТО НА НАТИВНИТЕ Мр1 ЛИГАНДИ ОТ БОЗАЙНИЦИ СЕ БАЗИРА НАДВА КЛЮЧОВИ ПРЕЧИСТВАЩИ ЕТАПА. а) ЛЕКТИН АФИНИТЕТНА ХРОМАТОГРАфИЯ, НАЙ-ДОБРЕ ИЗПОЛЗВАЙКИАГЛУТИНИН ОТ ПШЕНИЧНИ ЗАРОДИШИ; И б) ИМОБИЛИЗИРАН Мр1 РЕЦЕПТОР АФИНИТЕТНА ХРОМАТОГРАфИЯ. -34- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ЗА ПО-НАТАТЪЧНОТО ПРЕЧИСТВАНЕ НА БЕЛТЪКА МОГАТ ДА БЪДАТ ВКЛЮЧЕНИДОПЪЛНИТЕЛНИ ЕТАПИ, КАТО ЙОНООБМЕННА ХРОМАТОГРАфИЯ, ГЕЛФИЛТРАЦИОННА ХРОМАТОГРАфИЯ И ОБРАТНОфАЗОВА ХРОМАТОГРАфИЯ. ТЕХНИКИТЕ ЗА ПРЕЧИСТВАНЕ, ИЗПОЛЗВАНИ ЗА ПОЛУЧАВАНЕТО НА Мр1 ЛИГАНДОТ КУЧЕШКА АПЛАСТИЧНА ПЛАЗМА СЪДЪРЖАТ СЛЕДНИТЕ ЕТАПИ /ВИЖ ПРИМЕР 7/: а) ЛЕКТИН АфИНИТЕТНА ХРОМАТОГРАфИЯ /ОСОБЕНО ПРЕДПОЧИТАНА ЕХРОМАТОГРАФИЯ С АГЛУТИНИН ОТ ПШЕНИЧНИ ЗАРОДИШИ/; ф б) РАЗТВОРИМ Мр1 РЕЦЕПТОР /Мр1 - X/ АфИНИТЕТНА ХРОМАТОГРАфИЯ/ПРЕДПОЧИТАНА Е ТАЗИ С ИМОБИЛИЗИРАН МИШИ Мр1-Х/; в) ЙОН /АНИОН ИЛИ КАТИОН/ ОБМЕННА ХРОМАТОГРАфИЯ /ПРЕДПОЧИТАНА ЕАНИЙОН ОБМЕННА ХРОМАТОГРАфИЯ, ОСОБЕНО ТАЗИ С MONO Q КОЛОНА/; г) ГЕЛ ФИЛТРАЦИОННА ХРОМАТОГРАфИЯ ПРИ ДИСОЦИИРАЩИ УСЛОВИЯ/ПРЕДПОЧИТАНА Е ТАЗИ С ИЗПОЛЗВАНЕ НА SUPERDEX 200 ПЛЮС НАТРИЕВДОДЕЦИЛ СУЛФАТ/; И д) ОБРАТНО ФАЗОВА ХРОМАТОГРАфИЯ /ПРЕАДПОЧИТА Е ТАЗИ С ИЗПОЗВАНЕ НАС-4 КОЛОНА/. ХОМОГЕНЕН Мр1 ЛИГАНД ОТ БОЗАЙНИЦИ, ВКЛЮЧИТЕЛНО ЧОВЕШКИ ЛИГАНДМОЖЕ ДА БЪДЕ ПОЛУЧЕН ЧРЕЗ ПРИЛАГАНЕ НА ГОРНИТЕ ПРОЦЕДУРИ ОТАПЛАСТИЧНА КРЪВ, СЕРУМ ИЛИ ПЛАЗМА ИЛИ ДРУГИ ИЗТОЧНИЦИ НА Мр1ЛИГАНДИ ПРИ БОЗАЙНИЦИТЕ - КЛЕТЪЧНИ ИЛИ ТЪКАННИ ИЗТОЧНИЦИ. НЕ ЕЗАДЪЛЖИТЕЛНО ЕТАПИТЕ ДА БЪДАТ ТОЧНО В ТАЗИ ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ, НОИЗБРОЕНАТА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ Е ЗА ПРЕДПОЧИТАНЕ. ПРОЦЕДУРИТЕ ЗАКУЛТИВИРАНЕ НА КЛЕТЪЧЕН /ИЛИ ТЪКАНЕН/ ИЗТОЧНИК, КОЙТО ПРОИЗВЕЖДАМр1 ЛИГАНД СА ПОЗНАТИ И МОГАТ ДА БЪДАТ ИЗПОЛЗВАНИ НАПРИМЕР ЗАУВЕЛИЧАВАНЕ НА ИЗХОДНИЯ МАТЕРИАЛ. -35- WO 95/26746 PCT/US95/03776
Mpl ЛИГАНД ИЛИ ЕДИН ИЛИ ПОВЕЧЕ НЕГОВИ ПЕГГГИДНИ ФРАГМЕНТИ МОГАТ ДАБЪДАТ ПРОИЗВЕДЕНИ СЪЩО ТАКА И ЧРЕЗ РЕКОМБИНАНТНИ ТЕХНИКИ. ЗА ДА СЕПОЛУЧИ ДНК СЕКВЕНЦИЯ ЗА ОПРЕДЕЛЕН Mpl ЛИГАНД, ПРЕЧИСТЕНИЯТ MplЛИГАНДЕН МАТЕРИАЛ Е РЕДУЦИРАН И Е ЖЕЛАТЕЛНО ДА Е НАРЯЗАН СПРОТЕАЗА, КАТО ТРИПСИН НАПРИМЕР. ФРАГМЕНТИТЕ СЕ ИЗОЛИРАТ ИСЕКВЕНИРАТ ЧРЕЗ ОБИЧАЙНИТЕ ТЕХНИКИ. АЛТЕРНАТИВНО, ΚΑΚΤΟ ЕПОКАЗАНО В ПРИМЕРИТЕ ТУК, ИНТАКТНИЯ ПРЕЧИСТЕН БЕЛТЪК МОЖЕ ДА БЪДЕСЕКВЕНИРАН ДИРЕКТНО ДО СТЕПЕН ОПРЕДЕЛЕНА ОТ НАЛИЧНИЯ БЕЛТЪК ИСЛЕД ТОВА СЕКВЕНИРАНИЯ УЧАСТЪК МОЖЕ ДА БЪДЕ ИЗПОЛЗВАНАНАЛОГИЧНО НА СЕКВЕНИРАНИТЕ С ТРИПСИН ФРАГМЕНТИ В СЛЕДВАЩИТЕПРОЦЕДУРИ. ЧРЕЗ ГЕНЕН КОД СА СИНТЕЗИРАНИ ОЛИГОНУКЛЕОТЦДНИ ПРОБИ,ТАКА ЧЕ ДА СЕ ПРЕДСКАЖАТ ВСИЧКИ ВЪЗМОЖНИ СЕКВЕНЦИИ, КОИТОКОДИРАТ АМИНО КИСЕЛИННИТЕ СЕКВЕНЦИИ НА СЕКВЕНИРАНИЯ ФРАГМЕНТ/И/.СЪЗДАДЕНИ СА НЯКОЛКО СЕКВЕНЦИИ, КОЙТО ДА СЕ ИЗПОЛЗВАТ КАТО ПРОБИ.ГЕНЪТ НА Mpl ЛИГАНДА Е ОПРЕДЕЛЕН КАТО ТЕЗИ ПРОБИ СА ИЗПОЛЗВАНИ ЗАПРЕТЪРСВАНЕ /СКРИНИНГ/ НА ГЕНОМНИ БИБЛИОТЕКИ ОТ БОЗАЙНИЗИ ИЛИДРУГИ ИЗТОЧНИЦИ. АЛТЕРНАТИВНО мРНК НА Mpl ЛИГАНДА ОТ КЛЕТЪЧЕНИЗТОЧНИК МОЖЕ ДА ИЗПОЛЗВА ДА СЕ НАПРАВИ кДНК БИБЛИОТЕКА, КОЯТОМОЖЕ ДА БЪДЕ ПРЕТЪРСЕНА С ПРОБИТЕ, ЗА ДА СЕ ОПРЕДЕЛИ ДНК,КОДИРАЩА Mpl ЛИГАНДНИЯ ПОЛИПЕПТИД. СЛЕД ТОВА ДНК МОЖЕ ДА БЪДЕУДЪЛЖЕНА С ПОМОЩТА НА ПОДХОДЯЩИ ЗАЧАТЪЦИ ЧРЕЗ PCR /ПОЛИМЕРАЗНАВЕРИЖНА РЕАКЦИЯ/ ТЕХНИКА. ЧРЕЗ ИЗПОЛЗВАНЕТО НА ТЕЗИ ПРОБИ ЗА ПРЕТЪРСВАНЕ НА ГЕНОМНАБИБЛИОТЕКА Е ПОЛУЧЕН ДНК КЛОН. ЗА ДА СЕ ПОЛУЧИ КЛОН С ПЪЛНАДЪЛЖИНА ПРОБИТЕ БАЗИРАНИ НА ПОЛУЧЕНАТА ДНК СЕКВЕНЦИЯ МОГАТ ДА СЕИЗПОЛЗВАТ ЗА ПОВТОРНО ПРЕТЪРСВАНЕ НА БИБЛИОТЕКАТА И ДА СЕХИБРЙДИЗИРАТ ПО ЦЯЛАТА ДЪЛЖИНА НА ДНК СЕКВЕНЦИЯТА НА Mpl ЛИГАНДА. -36- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ЧОВЕШКАТА ДНК ЗА Mpi АИГАНДА СЪЩО МОЖЕ ДА БЪДЕ ПОЛУЧЕНА ЧРЕЗСУБКЛОНИРАНЕ НА ЦЯЛАТА ДЪЛЖИНА НА ЧОВЕШКИЯ ГЕНЕТИЧЕН КЛОН ВЕКСПРЕСИОНЕН ВЕКТОР, КОЙТО ДА СЕ ВЪВЕДЕ В COS КЛЕТКИ, ДА СЕПРИГОТВИ ДНК БИБЛИОТЕКА ОТ ТЕЗИ КЛЕТКИ И ДА СЕ ПРЕТЪРСИ ЧРЕЗ ДНКХИБРИДИЗАЦИЯ ЗА Mpi ЛИГАНДНА ДНК. СЛЕД КАТО ЦЯЛАТА ДНК ВЕДНЪЖ ЕОПРЕДЕЛЕНА ТЯ ИЛИ ЧАСТ ОТ НЕЯ, КОЯТО КОДИРА АКТИВНИЯ ФРАГМЕНТ НАMpi АИГАНДА, МОЖЕ ДА БЪДЕ ВКЛЮЧЕНА ВЪВ ВСЕКИ ЕДИН ОТ МНОГОТОЕКСПРЕСИОННИ ВЕКТОРИ ЗА ДА СЕ НАПРАВИ СИСТЕМА ЗА ЕКСПРЕСИЯ НА MpiЛИГАНД ИЛИ ЕДИН ИЛИ ПОВЕЧЕ НЕГОВИ ФРАГМЕНТИ. w ЧРЕЗ ИЗПОЛЗВАНЕ НА ТАКИВА РЕКОМБИНАНТНИ ТЕХНИКИ Е ПОЛУЧЕНАПРЕДПОЧИТАНАТА ДНК СЕКВЕНЦИЯ, КОДИРАЩА Mpi ЛИГАНДНИЯ ПОЛИПЕТИД.НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ ВКЛЮЧВА СЪЩО ДНК СЕКВЕНЦИИ, ЧИСТИ ОТ ДНКСЕКВЕНЦИИ, КОДИРАЩИ ДРУГИ БЕЛТЪЦИ И КОДИРАЩИ ЕКСПРЕСИЯТА НА MpiЛИГАНДНИ ПОЛИПЕПТИДИ С Mpi ЛИГАНДНА АКТИВНОСТ /МЕГАКАРИОЦИТЕНРАСТЕЖ И РАЗВИТИЕ/. ТЕЗИ ДНК СЕКВЕНЦИИ ВКЛЮЧВАТ СЕКВЕНЦИИТЕКОДИРАЩИ ЦЕЛИЯ Mpi ЛИГАНД ИЛИ ЧАСТ ОТ НЕГО И ТЕЗИ СЕКВЕНЦИИ, КОИТОХИБРИДИЗИРАТ НАЙ-ВЕЧЕ ПРИ СТРОГИ ХИБРИДИЗАЦИОННИ УСЛОВИЯ С кДНКСЕКВЕНЦИИТЕ [ВИЖ Т. MANIATIS ЕТ. AL., MOLECULAR CLONING (A LABRATORYMANUAL); COLD SPRING HARBOR LABORATORY (1982), CTP. 387 ДО 389]. ПРИМЕРНИ СТРОГИ ХИБРИДИЗАЦИОННИ УСЛОВИЯ СА ХИБРИДИЗАЦИЯ В 4 XSSC ПРИ 62 - 67” С ЗА ПРИБЛИЗИТЕЛНО 1 ЧАС. АЛТЕРНАТИВНИ ПРИМЕРНИСТРОГИ ХИБРИДИЗАЦИОННИ УСЛОВИЯ СА ХИБРИДИЗАЦИЯ В 45 - 55 %ФОРМАМИД, 4 X SSC ПРИ 40 - 45 ° С. ДНК СЕКВЕНЦИИТЕ, КОИТО ХИБРИДИЗИРАТ СЪС СЕКВЕНЦИИТЕ ЗА Mpi ЛИГАНДПРИ ОБЛЕКЧЕНИ ХИБРИДИЗАЦИОННИ УСЛОВИЯ И КОИТО КОДИРАТ MpiЛИГАНДНИ ПЕПТИДИ, ИМАЩИ Mpi ЛИГАНДНИ БИОЛОГИЧНИ СВОЙСТВА, СЪЩО -37- WO 95/26746 PCT/US95/03776 КОДИРАТ НОВИ Mpt ЛИГАНДНИ ПОЛИПЕПТИДИ НА ТОВА ИЗОБРЕТЕНИЕ.ПРИМЕРИ ЗА ТАКИВА ОБЛЕКЧЕНИ ХИБРИДИЗАЦИОННИ УСЛОВИЯ СА 4 X SSCПРИ 45-55°С ИЛИ ХИБРИДИЗАЦИЯ С 30 - 40 % ФОРМАМИД ПРИ 40 - 45°С.НАПРИМЕР ДНК СЕКВЕНЦИЯ, КОЯТО ИМА РАЙОНИ ЗНАЧИТЕЛНО ХОМОЛОЖНИ СMpt ЛИГАНДНИТЕ СЕКВЕНЦИИ КАТО МЕСТАТА ЗА ГЛИКОЗИЛИРАНЕ ИДИСУЛФИДНИ ВРЪЗКИ И КОДИРА БЕЛТЪК ИМАЩ ЕДНА ИЛИ ПОВЕЧЕ Мр1ЛИГАНДНИ БИОЛОГИЧНИ СВОЙСТВА, ОЧЕВИДНО КОДИРА Мр( ЛИГАНДЕНПОЛИПЕПТИД ДОРИ, АКО ТАЗИ ДНК СЕКВЕНЦИЯ НЕ СЕ ХИБРИДИЗИРА СТРОГО СМр1 ЛИГАНДНАТА СЕКВЕНЦИЯ /И/. ф АЛЕЛНИТЕ ВАРИАЦИИ, ЕСТЕСТВЕНО ВЪЗНИКНАЛИ ЗАМЕНИ НА БАЗИ ВЪВВИДОВАТА ПОПУЛАЦИЯ, КОИТО МОГАТ ДА ДОВЕДАТ ДО ЗАМЯНА НА АМИНОКИСЕЛИНИ, НО МОЖЕ И ДА НЕ ДОВЕДАТ, НА ДНК СЕКВЕНЦИИ, КОДИРАЩИПЕПТИДНАТА СЕКВЕНЦИЯ НА Мр1 ЛИГАНДА, ΚΑΚΤΟ И ТЕХНИТЕ АНАЛОЗИ ИПРОИЗВОДНИ СЪЩО СА ВКЛЮЧЕНИ В НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ. СЪЩОТАКА В ИЗОБРЕТЕНИЕТО СА ОБХВАНАТИ ДНК СЕКВЕНЦИИ, КОИТО КОДИРАТ Мр1ЛИГАНДНИ ПЕПТИДИ, НО СЕ РАЗЛИЧАВА ПО ИЗПОЛЗВАНЕТО НА КОДОНИТЕПОРАДИ ИЗРАЖДАНЕ НА ГЕНЕТИЧНИЯ КОД ИЛИ ВАРИАЦИИ В ДНКСЕКВЕНЦИЯТА НА Мр1 ЛИГАНДА, КОИТО СА ПОЛУЧЕНИ ВСЛЕДСТВИЕ ТОЧКОВИМУТАЦИИ ИЛИ МОДИФИКАЦИИ ЗА УВЕЛИЧАВАНЕ НА АКТИВНОСТТА, ПОЛУ-ЖИВОТА ИЛИ ПРОДУКЦИЯТА НА КОДИРАНИТЕ ОТ ТЯХ ПОЛИПЕПТИДИ. ф ЧРЕЗ ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ПРОЦЕДУРИТЕ ЗА КЛОНИРАНЕ, ОПИСАНИ В ПРИМЕР 11 САПОЛУЧЕНИ АМИНО КИСЕЛИННИ И кДНК СЕКВЕНЦИИ НА ЧОВЕШКИТЕ MGOF-1,MGDF-2 И MGDF-З БЕЛТЪЦИ ОПИСАНИ ТУК. MGDF-1 Е ПОКАЗАН КАТО АМИНОКИСЕЛИНИ 22- 353 НА ФИГ. 11 И СЪДЪРЖА 332 АМИНО КИСЕЛИНИ. MGDF-2 ЕСЪКРАТЕНА ЧАСТ ОТ MGDF-1H Е ПОКАЗАН КАТО АМИНО КИСЕЛИНИ 22-195 НАФИГ. 11. MGDF-2 СЪДЪРЖА 174 АМИНО КИСЕЛИНИ. MGDF-З Е ПОКАЗАН КАТОАМИНО КИСЕЛИНИ 22-289 НА ФИГ. 12 И СЪДЪРЖА 268 АМИНО КИСЕЛИНИ. ВЪВВСЕКИ MGDF ОПИСАН ТУК МОЛЕКУЛАТА ВКЛЮЧВАЩА СИГНАЛНИЯ ПЕПТИД, -38- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ПОКАЗАН КАТО АМИНО КИСЕЛИНИ 1-21 НА ДВЕТЕ ФИГУРИ 11 И 12 Е ЧАСТ ОТПОЛИПЕПТИДИТЕ, НО ТЯ Е ОТСТРАНЕНА, ЗА ДА БЪДЕ ПОКАЗАНА АКТИВНОСТТАЗА МЕГАКАРИОЦИТЕН РАСТЕЖ И РАЗВИТИЕ. НА КРАТКО MGDF 1 - 3 САДЕФИНИРАНИ ΚΑΚΤΟ СЛЕДВА: MGDF-1 АМИНО КИСЕЛИНИ 22 - 353 ФИГ. 11MGDF-2 АМИНО КИСЕЛИНИ 22-195 ФИГ. 11MGDF-З АМИНО КИСЕЛИНИ 22 - 289 ФИГ. 12 ф В ПРЕДСТАВЕНИТЕ ТУК АНАЛИЗИ MGDF -1 -И MGDF-2 СА БИЛИ АКТИВНИ,ДОКАТО MGDF- 3 НЕ Е БИЛ. ВЪЗ ОСНОВА НА ДАННИТЕ ЗА АКТИВНОСТТА ПРЕДЛОЖЕНИ ТУК МОЖЕ ДА СЕПРЕДПОЛОЖИ, ЧЕ ЧОВЕШКИЯТ MGDF IN VIVO СЕ ЕКСПРЕСИРА КАТО НАПЪЛНОНЕАКТИВЕН ИЛИ С НАМАЛЕНА АКТИВНОСТ ПОЛИПЕПТИДЕН ПРЕДШЕСТВЕНИК,СЪДЪРЖАЩ РАЗЛИЧНИ С-КРАЙНИ АМИНО ГРУПИ. СЛЕД ПРЕМАХВАНЕ НА С-КРАЙНИТЕ АМИНО ГРУПИ /КАКТО И НА СИГНАЛНИЯ ПЕПТИД/ ОБРАБОТЕНАТАФОРМА НА МОЛЕКУЛАТА ПРИДОБИВА АКТИВНОСТ ИЛИ СТАВА ПО-АКТИВНА.ВЪВ ВРЪЗКА С ТОВА ПРЕДПОЛОЖЕНИЕ СЕ СМЯТА, ЧЕ Е НЕОХОДИМО MGDF-1 ДАПРЕТЪРПИ ПРОЦЕСИНГ НАПР. СРЯЗВАНЕ С ПРОТЕАЗА, ЗА ДА ПОКАЖЕ СВОЯТААКТИВНОСТ. ФАКТЪТ, ЧЕ СКЪСЕНАТА ФОРМА НА MGDF-1 /MGDF-2/ Е АКТИВНАПОТВЪРЖДАВА ТОВА ПРЕДПОЛОЖЕНИЕ. ОБРАБОТЕНА СРЕДА ОТ КЛЕТКИ 293 ОТ ЧОВЕШКИ БЪБРЕК /INVITORGEN/ТРАНСФЕКТИРАНИ С MGDF-1 ГЕН ПОКАЗВА АКТИВНОСТ В КЛЕТЪЧНИТЕАНАЛИЗИ НА ПРИМЕР 4 ПО-ДОЛУ. ОТ ДРУГА СТРАНА В ДРУГИ КЛЕТЪЧНИ ЛИНИИКАТО 32 D КЛЕТКИ НЕ Е ОТКРИТА АКТИВНОСТ НА ТЕЗИ МОЛЕКУЛИ. ПРЕДПОЛГАСЕ, ЧЕ ТОВА ОЗНАЧАВА, ЧЕ Е ВЪЗМОЖНО MGDF-1 ДА ПРЕТЪРПИ ПРОЦЕСИНГ В293 КЛЕТКИТЕ, ВЕРОЯТНО ЧРЕЗ СКЪСЯВАНЕ, ТАКА ЧЕ МОЛЕКУЛАТА, ОСНОВНО -39- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ОТГОВОРНА ЗА АКТИВНОСТТА Е СКЪСЕНА ФОРМА, ОТ КЪДЕТО СЛЕДВА ЧЕ 32 DНЕ ПРИТЕЖАВАТ СПОСОБНОСТ ЗА ПРОЦЕСИНГ НА МОЛЕКУЛАТА. СПОРЕД ГОРНОТО ПРЕДПОЛОЖЕНИЕ В РЕЗУЛТАТ НА СКЪСЯВАНЕ НАСЕКВЕНЦИЯТА ОБОЗНАЧЕНА КАТО MGDF-1 МОГАТ ДА СЕ ПОЛУЧАТ РАЗЛИЧНИАКТИВНИ МОЛЕКУЛИ /ФИГ. 11/. СТРУКТУРНИТЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ СЪХРАНЕНИ ВЦИТОКИНОВАТА ГРУПА, НАПРИМЕР В ЕРИТРОПОЕТИНА /ЕРО/, ВКЛЮЧВАТ 4АЛфА-СПИРАЛНИ СТРУКТУРИ И ЧЕТИРИ ЦИСТЕИНА. ЩО СЕ ОТНАСЯ ДО MGDF-1СЕКВЕЦИЯТА ЦИСТЕИН 172 Е НАЙ С-КРАЙНИЯТ ЕЛЕМЕНТ НА ТЕЗИ © ЕВОЛЮЦИОННО СЪХРАНЕНИ И ФУНКЦИОНАЛНО ВАЖНИ СТРУКТУРИ. ПОРАДИТОВА ПРЕДПОЧИТАНИ СКЪСЕНИ ВАРИАНТИ НА MGDF-1 СА ТЕЗИ, ПРИ КОИТОИМА С-КРАЙНИ СКЪСЯВАНИЯ ОТ АМИНО КИСЕЛИНА 173 ДО 353 /ЗАЕДНО СОТДЕЛЯНЕ НА СИГНАЛНИЯ ПЕПТИД/. ДОБРЕ Е ОТ MGDF-1 СЕКВЕНЦИЯТА ДА САОТДЕЛЕНИ АМИНО КИСЕЛИНИТЕ ОТ 50 ДО 185 ОТ С-КРАЯ, А НАЙ-ДОБРЕ ЕАМИНО КИСЕЛИНИТЕ ОТ 90 ДО 172 ОТ С - КРАЯ. ΚΑΚΤΟ БЕШЕ КАЗАНО ТУКСМЯТА СЕ, ЧЕ СИГНАЛНИЯТ ПЕПТИД Е ДЪЛЪГ 21 АМИНО КИСЕЛИНИ. В MGDF-1СЕКВЕНЦИЯТА ОБАЧЕ СИГНАЛНИЯТ ПЕПТИД МОЖЕ ДА СЪДЪРЖА 23 АМИНОКИСЕЛИНИ. ТАКА ЧЕ ТУК СА РАЗГЛЕДАНИ СЪЩО СЪОТВЕТНИТЕ ПОЛИПЕПТИДИ,КОИТО СА СХОДНИ С ПРЕДСТАВЕНИТЕ ПО-ГОРЕ, НО ЗАПОЧВАТ ОТ ПОЗИЦИЯ 24НА ФИГ. 11 ИЛИ 12. СЛЕДВАТ НЯКОИ СПЕЦИФИЧНИ ПРЕДПОЧИТАНИ ВАРИАНТИ НА MGDF-1, КОИТОМОГАТ ДА ПОКАЖАТ АКТИВНОСТ /Т.Е. СПОСОБНОСТ ЗА УСИЛВАТ РАСТЕЖА НАМЕГАКАРИОЦИТИ И/ИЛИ ТРОМБОЦИТИ; ИЛИ ИНХИБИРАЩА/СТИМУЛИРАЩААКТИВНОСТ ПО ОТНОШЕНИЕ НА ЕСТЕСТВЕНИЯ РЕЦЕПТОР/: MGDF-4 АМИНО КИСЕЛИНИ 22-172 ФИГ. 11MGDF-5 АМИНО КИСЕЛИНИ 22-177 ФИГ. 11MGDF-6 АМИНО КИСЕЛИНИ 22 -191 ФИГ. 11 -40- WO 95/26746 PCT/US95/03776 MGDF-7 АМИНО КИСЕЛИНИ 22 -198 ФИГ. 11 MGDF-8 АМИНО КИСЕЛИНИ 22 - 265 ФИГ, 11 MGDF-11 АМИНО КИСЕЛИНИ 22-184 ФИГ. 11 В НЯКОИ КЛОНОВЕ В MGDF СЕКВЕНЦИЯТА ЛИПСВАТ АМИНО КИСЕЛИНИ 133-136,ТАКА ЧЕ СЕКВЕНЦИИТЕ КОИТО СЪОТВЕТСТВАТ НА ГОРЕПОСОЧЕНИТЕ, НО НЕПРИТЕЖАВАТ ТЕЗИ АМИНО КИСЕЛИНИ /И ПРИ КОИТО БРОЯ НА АМИНОКИСЕЛИНИТЕ НА С-КРАЯ Е НАМАЛЕН С 4/, СЪЩО МОГАТ ДА БЪДАТ АКТИВНИ. В ЕДИН ОТ КЛОНОВЕТЕ, КОЙТО ИМА СТОП-КОДОН В ПОЗИЦИЯ 192 Е ОТКРИТ АЛА- ОСТАТЪК ВМЕСТО ТРЕ-ОСТАТЪК, ΚΑΚΤΟ Е ПОКАЗАНО В ПОЗИЦИЯ 192 НА ФИГ. 11. ПОРАДИ ТОВА ИЗОБРЕТЕНИЕТО ВКЛЮЧВА ВАРИАНТИ НА MGDF МОЛЕКУЛИ,ПРИ КОИТО В ПОЗИЦИЯ 191 ИМА АЛА ВМЕСТО ТРЕ. MGDF-З СЕ ПОЛУЧАВА В РЕЗУЛТАТ НА ОТСТРАНЯВАНЕ НА СЕКВЕНЦИЯ,НАРЕЧЕНА ТУК IVS-5 /INTERVERTING SEQUENCE-5/ И СНАЖДАНЕ В РАМКИТЕ НАПЕТИЯ ЕКЗОН НА СЕКВЕНЦИЯТА. ПОРАДИ ТОВА, ЧЕ 5’ КРАЯТ НА IVS-5УЧАСТВА В КОДОН ПРЕМАХВАНЕТО И ВОДИ ДО ИЗМЕСТВАНЕ НА РАМКАТА НАЧЕТЕНЕ В ОСТАНАЛАТА MGDF СЕКВЕНЦИЯ, КАТО ТОВА ИЗМЕСТВАНЕ ЗАПОЧВАОТ ПОЗИЦИЯ 160 И ПРОДЪЛЖАВА ДО КРАЯ НА МОЛЕКУЛАТА. ВСЕ ОЩЕ НЕ Е ОТКРИТА АКТИВНОСТ НА САМАТА MGDF-З СЛЕД ТРАНСфЕКЦИЯ В293 КЛЕТКИ И ТЕСТУВАНЕ ЗА АКТИВНОСТ НА ПОЛУЧЕНАТА ОБРАБОТЕНА СРЕДАВ КЛЕТЪЧНО БАЗИРАНИТЕ АНАЛИЗИ НА ПРИМЕР 4. ОЧЕВИДНО 293 КЛЕТКИТЕ САНЕСПОСОБНИ ДА ПРОИЗВЕЖДАТ В АКТИВНА ФОРМА MGDF-З, ЗА РАЗЛИКА ОТMGDF-1. ВЪПРЕКИ ТОВА ОСНОВАВАЙКИ СЕ НА ХИПОТЕЗАТА ЗА СКЪСЯВАНЕ,РАЗГЛЕДАНА ПО-ГОРЕ ВЪВ ВРЪЗКА С MGDF-1, ОТДЕЛЯНЕТО НА С-КРАЙНИАМИНО КИСЕЛИНИ ОТ MGDF-З МОЖЕ ДА ДОВЕДЕ ДО АКТИВНОСТ. НАПРИМЕРСКЪСЯВАНЕ НА С-КРАЯТ НА MGDF-З ОТ 40 Д0102 АМИНО КИСЕЛИНИ МОЖЕ ДА -41- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ДОВЕДЕ ДО АКТИВНОСТ. ЗА ПРЕДПОЧИТАНЕ Е ДА СЕ ОТДЕЛЯТ АМИНОКИСЕЛИНИТЕ ОТ 50 ДО 90. ДВА ОСОБЕНО ПРЕДПОЧИТАНИ ВАРИАНТА НА MGDF-2СА: MGDF-9 22-179 ФИГ.12 MGDF-10 22-190 фИГ.12 ВЪВ ВСИЧКИ Мр1 ЛИГАНДИ, РАЗГЛЕДАНИ ТУК, ВКЛЮЧИТЕЛНО В ПРИМЕРНИТЕ,ИЗЛОЖЕНИ ПО-ГОРЕ, МОЖЕ ДА ПРИСЪСТВА МЕТИОНИНОВ ОСТАТЪК НА N-КРАЯ,ОСОБЕНО АКО ТЕЗИ ПОЛИПЕПТИДИ СА ЕКСПРЕСИРАНИ В БАКТЕРИАЛНАКЛЕТКА ГОСТОПРИЕМНИК. Мр1 ЛИГАНДНИ ПОЛИПЕПТИДИ МОГАТ ДА БЪДАТ ПРОИЗВЕДЕНИ СЪЩО ТАКАЧРЕЗ ПОЗНАТ СТАНДАРТЕН ХИМИЧЕН СИНТЕЗ. МЕТОДИТЕ ЗА ИЗГРАЖДАНЕ НАПОЛИПЕПТИДИТЕ ОТ НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ ПО СИНТЕТИЧЕН ПЪТ САПОЗНАТИ НА РАБОТЕЩИТЕ В ТАЗИ ОБЛАСТ. БЛАГОДАРЕНИЕ НА ТОВА, ЧЕСИНТЕТИЧНО ИЗГРАДЕНИТЕ Мр1 ЛИГАНДНИ ПОЛИПЕПТИДНИ СЕКВЕНЦИИ ИМАТСЪЩАТА ПЪРВИЧНА, ВТОРИЧНА И ТРЕТИЧНА СТРУКТУРА, А СЪЩО ТАКА ИКОНФОРМАЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ КАТО ТЕЗИ НА Мр1ЛИГАНДНИТЕ ПОЛИПЕПТИДИ, ТЕ МОГАТ ДА ПРИТЕЖАВАТ СЪЩИТЕ БИОЛОГИЧНИСВОЙСТВА КАТО Мр1 ЛИГАНДНИТЕ БЕЛТЪЦИ, ОПИСАНИ ТУК. СЛЕДОВАТЕЛНО ТЕМОГАТ ЗА БЪДАТ ИЗПОЛЗВАНИ КАТО БИОЛОГИЧНА АКТИВНОСТ ИЛИ КАТОИМУНОЛОГИЧНИ ЗАМЕСТИТЕЛИ НА ЕСТЕСТВЕНИТЕ ПРЕЧИСТЕНИ Мр1 ЛИГАНДНИПОЛИПЕПТИДИ В ТЕРАПЕВТИЧНИ ИЛИ ИМУНОЛОГИЧНИ ПРОЦЕСИ. МОДИФИКАЦИИ В ПЕПТИДИТЕ ИЛИ В ДНК СЕКВЕНЦИЯТА, КОДИРАЩА Мр1ЛИГАНД МОГАТ ДА БЪДАТ НАПРАВЕНИ ОТ ВСЕКИ СПЕЦИАЛИСТ ЧРЕЗПОЗНАТИТЕ ТЕХНИКИ. МОДИФИКАЦИИТЕ, КОИТО ПРЕДСТАВЛЯВАТ ИНТЕРЕСПРИ Мр1 ЛИГАНДНИТЕ СЕКВЕНЦИИ ВКЛЮЧВАТ ЗАМЕСТВАНЕ, ДОБАВЯНЕ ИЛИ -42- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ОТДЕЛЯНЕ HA ИЗБРАН АМИНО КИСЕЛИНЕН ОСТАТЪК В КОДИРАЩАТА СЕКВЕНЦИЯ. МУТАГЕНЕЗНИТЕ ТЕХНИКИ ЗА ТАКОВА ЗАМЕСТВАНЕ, ДОБАВЯНЕ ИЛИ ОТДЕЛЯНЕ СА ДОБРЕ ПОЗНАТИТЕ НА СПЕЦИАЛИСТИТЕ В ТАЗИ ОБЛАСТ.
[ВИЖ АМЕРИКАНСКИ ПАТЕНТ No 4,518,584}. ПРЕДПОЧИТАНИ СА КОНСЕРВАТИВНИТЕ ПРОМЕНИ В АМИНО КИСЕЛИНИ ОТ 1 ДО 20. ПРЕДПОЧИТАНИТЕ ПЕПТИДИ МОГАТ ДА СЕ СЪЗДАДАТ ЧРЕЗ ПРОТЕОЛИТИЧНИ ЕНЗИМИ ИЛИ ЧРЕЗ ДИРЕКТЕН ХИМИЧЕН СИНТЕЗ. ТАКА СЪЗДАДЕНИТЕ ВАРИАНТИ СЪЩО СА ВКЛЮЧЕНИ В ЗНАЧЕНИЕТО НА НАЗВАНИЕТО Мр1 ЛИГАНДНИ ПОПИПЕПТИДИ И ПОЛИНУКЛЕОТИДИ В ТОВА ИЗОБРЕТЕНИЕ, ф СПЕЦИФИЧНИТЕ МУТАЦИИ В СЕКВЕНЦИЯТА НА Мр1 ЛИГАНДНИЯ БЕЛТЪК МОГАТ ДА ВКЛЮЧВАТ МОДИФИКАЦИИ В МЯСТОТО ЗА ГЛИКОЗИЛИРАНЕ /СЕРИН, ТРЕОНИН ИЛИ АСПАРАГИН/. ЛИПСА НА ГЛИКОЗИЛИРАНЕ ИЛИ САМО ЧАСТИЧНО ГЛИКОЗИЛИРАНЕ СЕ ПОЛУЧАВА В РЕЗУЛТАТ НА ЗАМЕСТВАНЕ ИЛИ ОТСТРАНЯВАНЕ НА АМИНО КИСЕЛИНА ВЪВ ВСЯКО ОТ СВЪРЗАНИТЕ С АСПАРАГИН МЕСТА ЗА ГЛИКОЗИЛИРАНЕ ИЛИ НА ВСЯКО МЯСТО В МОЛЕКУЛАТА, КОЕТО Е МОДИФИЦИРАНО ЧРЕЗ ДОБАВЯНЕ НА О-СВЪРЗАН КАРБОХИДРАТ. АСПАРАГИН СВЪРЗАНАТО МЯСТО, РАЗПОЗНАВАНО ЗА ГЛИКОЗИЛИРАНЕ СЕ СЪСТОИ ОТ ТРИПЕПТИДНА СЕКВЕНЦИЯ, КОЯТО СПЕЦИФИЧНО СЕ РАЗПОЗНАВА ОТ СЪОТВЕТНИТЕ КЛЕТЪЧНИ ГЛИКОЗИЛИРАЩИ ЕНЗИМИ. ТЕЗИ ТРИПЕПТИДНИф СЕКВЕНЦИИ СА ИЛИ АСН - ХАА-СЕР ИЛИ АСН-ХАА-СЕР, КЪДЕТО ХАА МОЖЕ ДА БЪДЕ ВСЯКА АМИНО КИСЕЛИНА С ИЗКЛЮЧЕНИЕ НА ПРОЛИН. РАЗНООБРАЗИЕТО В ЗАМЕСТВАНЕТО И ОТСТРАНЯВАНЕТО НА АМИНО КИСЕЛИНИ В ЕДНА ПОЗИЦИЯ ИЛИ ЕДНОВРЕМЕННО В ПЪРВА И ТРЕТА ПОЗИЦИЯ НА МЯСТОТО РАЗПОЗНАВАНО ЗА ГЛИКОЗИЛИРАНЕ И/ИЛИ ОТСТРАНЯВАНЕ НА АМИНО КИСЕЛИНА ВЪВ ВТОРА ПОЗИЦИЯ ВОДИ ДО ОТСЪСТВИЕ НА ГЛИКОЗИЛИРАНЕ В МОДИФИЦИРАНАТА ТРИПЕПТИДНА СЕКВЕНЦИЯ. ПРИ ЕКСПРЕСИЯТА НА ТАКИВА ИЗМЕНЕНИ НУКЛЕОТИДНИ СЕКВЕНЦИИ СЕ ПОЛУЧАВАТ ВАРИАНТИ, КОИТО НЕ СА ГЛИКОЗИЛИРАНИ В ТОВА МЯСТО. -43- WO 95/26746 PCT/US95/03776
ДОПЪЛНИТЕЛНИ ВАРИАНТИ. HA-MGPE ДРУГИ АНАЛОЗИ ИЛИ ПРОИЗВОДНИ НА MGDF /Мр1 ЛИГАНД/ СЕКВЕНЦИИТЕ,КОИТО МОГАТ ДА ПРИТЕЖАВАТ MGDF /Мр1 ЛИГАНДНА/ АКТИВНОСТ МОГАТ ДАБЪДАТ ПРИГОТВЕНИ ОТ ВСЕКИ ПРОФЕСИОНАЛИСТ, ЗАПОЗНАТ С ТОВАИЗОБРЕТЕНИЕ. ТЕЗИ МОДИФИКАЦИИ СА СЪЩО ОБХВАНАТИ ОТ ТОВАИЗОБРЕТЕНИЕ. ПО-СПЕЦИАЛНО, НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ ОБСТОЙНО РАЗГЛЕЖДАХИМИЧНО МОДИФИЦИРАНИ MGDF СЪСТАВИ И МЕТОДИТЕ ЗА ПРИГОТВЯНЕТО ИУПОТРЕБАТА ИМ. НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ ПОКАЗВА, ЧЕ МОДИФИКАЦИЯТАНА MGDF И ПОДОБРЯВАНЕТО НА ТЕХНИТЕ КАЧЕСТВА Е ВЪЗМОЖНО. ОТ ЕДНА СТРАНА НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ СЕ ОТНАСЯ ЗА MGDF ПРОДУКТ,СЪДЪРЖАЩ MGDF БЕЛТЪК, СВЪРЗАН С НАЙ-МАЛКО ЕДНА ГРУПА НАВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИМЕР. ОТ ДРУГА СТРАНА НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ СЕОТНАСЯ ЗА MGDF МОЛЕКУЛИ СВЪРЗАНИ С НАЙ-МАЛКО ЕДНА ПОЛИЕТИЛЕНГЛИКОЛОВА МОЛЕКУЛА ЧРЕЗ АЦИЛНА ИЛИ АЛКИЛНА ВРЪЗКА. ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНЕТО НА MGDF МОЖЕ ДА СЕ ИЗВЪРШИ ЧРЕЗ ЕДНА ОТПОЗНАТИТЕ РЕАКЦИИ ЗА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНЕ. ВИЖ НАПРИМЕР FOCUSON GROWTH FACTORS 3 (2) : 4-10 /1992/; EP No 0154316; EP No 0401384 И ДРУГИТЕОТНАСЯЩИ СЕ ДО ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНЕТО ПУБЛИКАЦИИ ЦИТИРАНИТУК. ПРЕДПОЧИТА СЕ ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНЕТО ДА СЕ ИЗВЪРШИ ЧРЕЗАЦИЛИРАЩА РЕАКЦИЯ И АЛКИЛИРАЩА РЕАКЦИЯ С РЕАКТИВОСПОСОБНАПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВА МОЛЕКУЛА /ИЛИ АНАЛОГИЧЕН РЕАКТИВОСПОСОБЕНВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИМЕР. ТЕЗИ ПРЕДПОЧИТАНИ МЕТОДИ ЗАМОДИФИЦИРАНЕ С ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ ЩЕ БЪДАТ РАЗГЛЕДАНИ ТУК В НАЙ-ПОДРОБНИ ДЕТАЙЛИ. -44- WO 95/26746 PCT/US95/03776 АЦИЛИРАНЕ ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНЕТО ЧРЕЗ АЦИЛИРАНЕ ВКЛЮЧВА НАЙ-ОБЩОРЕАКЦИЯ МЕЖДУ АКТИВЕН ЕСТЕР НА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛА /PEG/ И MGDFБЕЛТЪК. ВСЯКА ПОЗНАТА ИЛИ ОТКРИТА В ПОСЛЕДСТВИЕ РЕАКТИВОСПОСОБНАМОЛЕКУЛА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ МОЖЕ ДА БЪДЕ ИЗПОЛЗВАНА ЗАПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНЕТО НА MGDF. ПРЕДПОЧИТАН АКТИВИРАНПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВ ЕСТЕР Е ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ ЕСТЕРИфИЦИРАН С N-ХИДРОКСИСУКЦИНИМИД /“NHS7. СМИСЪЛЪТ НА ТЕРМИНА „АЦИЛИРАНЕ“ИЗПОЛЗВАН ТУК ВКЛЮЧВА БЕЗ ОГРАНИЧЕНИЯ СЛЕДНИТЕ ВИДОВЕ ВРЪЗКИМЕЖДУ MGDF И ВОДОРАЗТВОРИМ ПОИМЕР КАТО ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ:АМИДНА, КАРБАМАТНА, ИРЕТАНОВА И ДР. ПОДОБНИ. ВИЖ BIOCONJUGATEСНЕМ. 5:133-140 /1994/. РЕАКЦИОННИТЕ УСЛОВИЯ МОГАТ ДА БЪДАТ ИЗБРАНИИЗМЕЖДУ ТЕЗИ, ИЗПОЛЗВАНИ ЗА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНЕТО ИЛИ ТАКИВАРАЗВИТИ ПО-КЪСНО, НО ТРЯБВА ДА СЕ ИЗБЯГВАТ УСЛОВИЯ КАТОТЕМПЕРАТУРА, РАЗТВАРЯНЕ И pH, КОИТО МОГАТ ДА ИНАКТИВИРАТМОДИФИЦИРАНЕТО НА MGDF ГРУПИТЕ. РЕАКЦИОННИТЕ УСЛОВИЯ, КОИТО СЕИЗПОЛЗВАТ ОБИКНОВЕНО ЗА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНЕТО НА MGDF ЩЕБЪДАТ БЪДАТ РАЗГЛЕДАНИ ПО-ДОЛУ. КАТО ПРИМЕРНА РЕАКЦИЯ В ПРИМЕР 14 ЕРАЗГЛЕДАНА ТАЗИ С NHS ЕСТЕР НА МОНОМЕТОКСИ-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ. РЕЗУЛТАТЪТ ОТ ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНЕТО ЧРЕЗ АЦИЛИРАНЕ НАЙ-ОБЩОКАЗАНО ЩЕ БЪДЕ ПОЛИ-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН MGDF, В КОЙТОЛИЗИНОВИТЕ ε-АМИНО ГРУПИ СА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНИ ЧРЕЗ АЦИЛНА СВЪРЗВАЩА ГРУПА. ЗА ПРЕДПОЧИТАНЕ Е СВЪРЗВАЩАТА ГРУПА ДА БЪДЕ АМИД.СЪЩО ТАКА ЗА ПРЕДПОЧИТА Е ПОЛУЧЕНИЯТ ПРОДУКТ ДА БЪДЕ ОСНОВНОД.Е. > 95 %/ МОНО, ДИ- ИЛИ ТРИ- ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН. ВЪПРЕКИ ТОВА ЕНОРМАЛНО ДА СЕ ОБРАЗУВАТ НЯКОИ ВИДОВЕ С ВИСОКО НИВО НАПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНЕ /ДА СЕ ОБХВАНАТ МАКСИМАЛНИЯ БРОЙ НА -45- WO 95/26746 PCT/US95/03776 АИЗИНОВИТЕ ε- АМИНО ГРУПИ НА MGDF ПЛЮС ЕДНА α-АМИНО ГРУПА НА АМИНО КРАЯ НА MGDF/ В КОЛИЧЕСТВА ЗАВИСЕЩИ ОТ ИЗПОЛЗВАНИТЕСПЕЦИФИЧНИ РЕАКЦИОННИ УСЛОВИЯ. АКО Е НЕОБХОДИМО ОТ СМЕСТТАМОГАТ ДА СЕ ОТДЕЛЯТ ПО-ВИСОКО ПРЕЧИСТЕНИ ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНИВИДОВЕ, ПО СПЕЦИАЛНО ТЕЗИ, КОИТО НЕ СА РЕАГИРАЛИ. ТОВА МОЖЕ ДАСТАНЕ ЧРЕЗ СТАНДАРТНИТЕ ТЕХНИКИ ЗА ПРЕЧИСТВАНЕ, ВКЛЮЧИТЕЛНОДИАЛИЗА, ИЗСОЛВАНЕ, УЛТРАфИЛТРАЦИЯ, ЙОНООБМЕННА ХРОМАТОГРАфИЯ,ГЕЛ-ФИЛТРАЦИОННА ХРОМАТОГРАфИЯ И ЕЛЕКТОРфОРЕЗА. АЛКИЛИРАНЕ ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНЕТО ЧРЕЗ АЛКИЛИРАНЕ ВКЛЮЧВА РЕАКЦИЯ НАКРАЙНО АЛДЕХИДНО ПРОИЗВОДНО НА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛА С БЕЛТЪК,КАКЪВТО Е MGDF В ПРИСЪСТВИЕТО НА РЕДУЦИРАЩ АГЕНТ. ΚΑΚΤΟ ПРИАЦИЛИРАНЕТО, ОПИСАНО ПО-ГОРЕ РЕАКЦИОННИТЕ УСЛОВИЯ ЩЕ БЪДАТРАЗГЛЕДАНИ ПО-ДОЛУ. РЕЗУЛТАТЪТ ОТ ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНЕТО ЧРЕЗ АЛКИЛИРАНЕ МОЖЕСЪЩО ДА БЪДЕ ПОЛИ-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН MGDF. ПРИМЕРНА РЕАКЦИЯНА РЕДУКТИВНО АЛКИЛИРАНЕ НА MGDF, ПРИ КОЯТО СЕ ПОЛУЧАВА ПОЛИ-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН ПРОДУКТ Е ПОКАЗАНА НА фИГ. 15. В ДОПЪЛНЕНИЕРЕАКЦИОННИТЕ УСЛОВИЯ МОГАТ ДА БЪДАТ ИЗМЕНЕНИ, ΚΑΚΤΟ Е ОПИСАНО ТУК,ТАКА ЧЕ ДА СЕ БЛАГОПРИЯТСТВА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНЕТО ОСНОВНО НАа-АМИНО ГРУПАТА НА N-КРАЯ НА MGDF ВИДОВЕТЕ /Г.Е. ДА СЕ ПОЛУЧАТ МОНО- ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНИ ВИДОВЕ/. ПРИМЕРНА РЕАКЦИЯ НА РЕДУКТИВНОАЛКИЛИРАНЕ НА MGDF, ПРИ КОЯТО СЕ ПОЛУЧАВА МОНО-ПОЛИЕТИЛЕНГЛИКОЛИРАН ПРОДУКТ Е ПОКАЗАНА НА ФИГ.12. В ДРУГ СЛУЧАЙ НА МОНО-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНЕ ИЛИ ПОЛИ-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНЕПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВИТЕ ГРУПИ СА ПРЕДПОЧИТАТЕЛНО СВЪРЗАНИ С -46- WO 95/26746 PCT/US95/03776 БЕЛТЪКА ЧРЕЗ -СН2 - NH - ГРУПА. ЩО СЕ ОТНАСЯ ДО СН2 - ГРУПАТА, ТОЗИ ТИПВРЪЗКА Е НАРЕЧЕ ТУК „АЛКИДНА“ ВРЪЗКА. РЕДУКТИВНОТО АЛКИЛИРАНЕ КАТО НАЧИН ЗА ПОЛУЧАВАНЕ НА ПРОИЗВОДЕНПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН ПРОДУКТ ИЗПОЛЗВА РАЗЛИЧНАТА РЕАКТИВНАСПОСОБНОСТ НА РАЗЛИЧНИТЕ ВИДОВЕ ПЪРВИЧНИ АМИНО ГРУПИ В MGDF/ЛИЗИНА НА N-КРАЯ/, ДОСТЪПНИ ЗА МОДИФИЦИРАНЕ. РЕАКЦИЯТА ЕПРОВЕДЕНА ПРИ pH /ВИЖ ПО-ДОЛУ/, КОЕТО ПОЗВОЛЯВА ДА СЕ ДАДЕПРЕДИМСТВО НА α-АМИНО ГРУПАТА НА N-КРАЙНИЯ ОСТАТЪК НА БЕЛТЪКА, ПОРАДИ РАЗЛИКИТЕ В рКа МЕЖДУ НЕЯ И 8- АМИНО ГРУПИТЕ НА ЛИЗИНОВИТЕ ОСТАТЪЦИ. ПРИ ТАКОВА СЕЛЕКТИВНО МОДИФИЦИРАНЕ СВЪРЗВАНЕТО НАВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИМЕР, СЪДЪРЖАЩ РЕАКТИВОСПОСОБНА ГРУПА, ТАКАВАКАТО АЛДЕХИДНАТА, КЪМ БЕЛТЪКА Е ПОД КОНТРОЛ: СВЪРЗВАНЕТО СЕИЗВЪРШВА ПРЕДИМНО НА N-КРАЯ НА БЕЛТЪКА, БЕЗ ДА ИМА ЗНАЧИТЕЛНОМОДИФИЦИРАНЕ НА ОСТАНАЛИТЕ РЕАКТИВОСПОСОБНИ ГРУПИ, ТАКИВА КАТОАМИНО ГРУПИТЕ НА ЛИЗИНА. ЕДИН ВАЖЕН АСПЕКТ НА НАСТОЯЩОТОИЗОБРЕТЕНИЕ Е, ЧЕ ДАВА ВЪЗМОЖНОСТ ЗА ПРИГОТВЯНЕ НА ПРАКТИЧЕСКИХОМОГЕННА СМЕС ОТ ПОЛИМЕР-MGDF СВЪРЗАНИ МОЛЕКУЛИ /ИМА СЕ ПРЕДВИДMGDF БЕЛТЪК, КЪМ КОЙТО МОЛЕКУЛАТА НА ПОЛИМЕРА Е СВЪРЗАНАПРЕДИМНО /> 95 % I В ЕДНО МЯСТО НА СВЪРЗВАНЕ. ПО-СПЕЦИАЛНО, АКО ЕИЗПОЛЗВАН ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ, НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ ПРЕДОСТАВЯПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН MGDF БЕЛТЪК, В КОЙТО ЛИПСВА ВЕРОЯТНОАНТИГЕННА ГРУПА, А ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВАТА МОЛЕКУЛА Е ДИРЕКТНОСВЪРЗАНА С MGDF БЕЛТЪКА. ТАКА НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ Е СВЪРЗАНО НАЙ-ВЕЧЕ С ПОЛИЕТИЛЕНГЛИКОЛОРАН MGDF, ПРИ КОЙТО ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВАТА ГРУПА /И/ Е /СА/СВЪРЗАНА ЧРЕЗ АЦИЛНИ ИЛИ АЛКИЛНИ ГРУПИ. ΚΑΚΤΟ БЕШЕ КАЗАНО ПО-ГОРЕТЕЗИ ПРОДУКТИ МОГАТ ДА СА МОНО-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНИ ИЛИ ПОЛИ- -47- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНИ /Т.Е. ДА СЪДЪРЖАТ 2 - 6, ПО-ДОБРЕ 2 - 5ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВИ ГРУПИ/. ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВИТЕ ГРУПИ СА СВЪРЗАНИ С БЕЛТЪКА ОБИКНОВЕНО В а- ИЛИ ε-АМИНО ГРУПИТЕ НА АМИНО КИСЕЛИНИТЕ, НО СЪЩО ТАКА СЕ ПРЕДПОЛАГА, ЧЕ ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВИТЕГРУПИ МОГАТ ДА БЪДАТ СВЪРЗАНИ С ВСЯКА АМИНО ГРУПА, ОТ БЕЛТЪКА, АКОТЯ Е ДОСТАТЪЧНО РЕАКТИВОСПОСОБНА, ЗА ДА СЕ СВЪРЖЕ С ПОЛИЕТИЛЕНГЛИКОЛОВАТА ГРУПА ПРИ ПОДХОДЯЩИ РЕАКЦИОННИ УСЛОВИЯ. МОЛЕКУЛИТЕ НА ПОЛИМЕРИТЕ, ИЗПОЛЗВАНИ И В ДВАТА ПОДХОДА - НААЛКИЛИРАНЕ АЦИЛИРАНЕ МОГАТ ДА БЪДАТ ИЗБРАНИ ИЗМЕЖДУ ПОЗНАТИТЕВОДОРАЗТВОРИМИ ПОЛИМЕРИ, А СЪЩО ТАКА МОГАТ ДА СЕ ИЗПОЛЗВАТ СМЕСИОТ ТЯХ. ИЗБРАНИЯТ ПОЛИМЕР ТРЯБВА ДА БЪДЕ ВОДОРАЗТВОРИМ, ТАКА ЧЕБЕЛТЪКА, ЗА КОЙТО ТОЙ Е СВЪРЗАН ДА НЕ ПРЕЦИПИТИРА ВЪВ ВОДНА СРЕДА,КАКВАТО Е ФИЗИОЛОГИЧНАТА СРЕДА. ИЗБРАНИЯТ ПОЛИМЕР ТРЯБВА ДА БЪДЕМОДИФИЦИРАН ТАКА, ЧЕ ДА ИМА ЕДИНИЧНА РЕАКТИВОСПОСОБНА ГРУПАКАТО: АКТИВНА ЕСТЕРНА ЗА АЦИЛИРАНЕТО И АКТИВНА АЛДЕХИДНА ЗААЛКИЛИРАНЕТО, ЗА ПРЕДПОЧИТАНЕ ТАКИВА, ЧЕ СТЕПЕНТА НАПОЛИМЕРИЗАЦИЯ ДА МОЖЕ ДА БЪДЕ КОНТРОЛИРАНА, ΚΑΚΤΟ БЕ ПОКАЗАНО ВТУК ПОСОЧЕНИТЕ МЕТОДИ. ПРЕДПОЧИТАН РЕАКТИВОСПОСОБЕН АЛДЕХИД ЕПОЕТИЛЕН ГЛИКОЛ ПРОПИОНАЛДЕХИДА, КОЙТО КОЙТО Е ВОДОУСТОЙЧИВ, ИЛИНЕГОВИТЕ МОНО С1 - С10 АЛКОКСИ ИЛИ АРИЛОКСИ ПРОИЗВОДНИ. /ВИЖ АМЕР.ПАТЕНТ No 5,252,714/. ПОЛИМЕРЪТ МОЖЕ ДА БЪДЕ РАЗКЛОНЕН ИЛИНЕРАЗКЛОНЕН. ЗА ПРИГОТВЯНЕТО НА КРАЕН ПРОДУКТ ЗА ФАРМАЦЕВТИЧНАУПОТРЕБА ПОЛИМЕРА ТРЯБВА ДА Е ФАРМАЦЕВТИЧНО ПРИЕМЛИВ.ВОДОРАЗТВОРИМИЯТ ПОЛИМЕР МОЖЕ ДА БЪДЕ ИЗБРАН ОТ ГРУПА СЪСТОЯЩАСЕ НАПРИМЕР ОТ: ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ; МОНОМЕТОКСИ ПОЛИЕТИЛЕНГЛИКОЛ; ДЕКСТРАН; ΠΟΛΠ-Ν-ВИНИЛ ПИРОЛИДОН/ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ;ХОМОПОЛИМЕРИ НА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛА; КОПОЛИМЕР НАПОЛИПРОПИЛЕНОВ ОКИС/ЕТИЛЕНОВ ОКИС; ПОЛИОКСИЕТИЛИРАНИ ПОЛИОЛИ -48- WO 95/26746 PCT/US95/03776 /НАПР. ГЛИЦЕРОЛ/ И ПОАИВИНИЛ АЛКОХОЛ. ЗА РЕАКЦИИТЕ НА АЦИЛИРАНЕИЗБРАНИЯТ ПОЛИМЕР/И/ТРЯБВА ДА ИМА РЕАКТИВОСПОСОБНА ЕСТЕРНА ГРУПА.ЗА РЕДУКТИВНОТО АЛКИЛИРАНЕ ДАДЕНО ТУК ИЗБРАНИЯ ПОЛИМЕР/И/ ТРЯБВАДА ИМА РЕАКТИВОСПОСОБНА АЛДЕХИДНА ГРУПА. НАЙ-ОБЩО КАЗАНОВОДОРАЗТВОРИМИЯТ ПОЛИМЕР НЯМА ДА БЪДЕ ИЗБИРАН ОТ ЕСТЕСТВЕНОПОЛУЧЕНИ ГЛИКОЗИДНИ ОСТАТЪЦИ, ТЪЙ КАТО ТЕ СЕ ПРИГОТВЯТ ПО-УДОБНОЧРЕЗ РЕКОМБИНАНТНИ ЕКСПРЕСИОННИ СИСТЕМИ. ПОЛИМЕРЪТ МОЖЕ ДА БЪДЕС ПРОИЗВОЛНО МОЛЕКУЛНО ТЕГЛО И ДА БЪДЕ РАЗКЛОНЕН ИЛИ НЕРАЗКЛОНЕН. С ОСОБЕНО ПРЕДПОЧИТАН ВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИМЕР ИЗПОЛЗВАН ТУК ЕПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛЪТ, СЪКРАТЕНО PEG. НАЗВАНИЕТО ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛТУК ОБХВАЩА ВСЯКА ФОРМА НА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛА, КОЯТО СЕ ИЗПОЛЗВАЗА МОДИФИЦИРАНЕ НА БЕЛТЪЦИ, КАТО МОНО-(С1 - С10) АЛКОКСИ - ИЛИАРИЛОКСИ-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ. ПОД MGDF СЕ РАЗБИРА ВСЕКИ ОТ ВАРИАНТИТЕ НА MGDF, ОПИСАНИ ТУК:НАПРИМЕР ВСИЧКИ ФОРМИ НА MGDF С ПЪЛНА ДЪЛЖИНА ИЛИ СКЪСЕНИ,ГЛИКОЗИЛИРАНИ И НЕГЛИКОЗИЛИРАНИ. СЛЕДВАТ ПРЕДПОЧИТАНИТЕ MGDF ЗАПОЛУЧАВАНЕ НА ПРОИЗВОДНИ MGDF МОЛЕКУЛИ /ЗА ВСЕКИ ОТ СЛУЧАИТЕНОМЕРИРАНЕТО СЪОТВЕТСТВА НА НОМЕРИРАНЕТО НА АМИНОКИСЕЛИНИТЕ НА ф ФИГ. 11./: MGDF -1 АМИНО КИСЕЛИНИ 22-353 ФИГ. 11 MGDF - 2 АМИНО КИСЕЛИНИ 22-195 ФИГ. 11 MGDF - 4 АМИНО КИСЕЛИНИ 22-172 ФИГ. 11 MGDF-11 АМИНО КИСЕЛИНИ 22-184 ФИГ. 11 MGDF -12 АМИНО КИСЕЛИНИ 27-353 ФИГ. 11 MGDF -13 АМИНО КИСЕЛИНИ 27-195 ФИГ. 11 MGDF-14 АМИНО КИСЕЛИНИ 27-172 ФИГ. 11 MGDF -15 АМИНО КИСЕЛИНИ 27-184 ФИГ. 11 -49- >N0 95/26746 PCT/US95/03776 ГОРЕПОСОЧЕНИТЕ ВИДОВЕ МОГАТ ДА БЪДАТ ГЛИКОЗИЛИРАНИ,НЕГЛИКОЗИЛИРАНИ ИАИ ДЕГЛИКОЗИАИРАНИ, ЗА ПРЕДПОЧИТАНЕНЕГЛИКОЗИЛИРАНИ. ТЕ МОГАТ ДА БЪДАТ ПРИГОТВЕНИ РЕКОМБИНАНТНО ИЛИ ВБАКТЕРИАЛНА КЛЕТКА /Е. coli/ ИЛИ В КЛЕТКИ ОТ БОЗАЙНИЦИ /СНО/. СЛЕДВАТ ОСОБЕНО ПРЕДПОЧИТАНИТЕ ПОДГРУПИ НА ХИМИЧНОМОДИФИЦИРАНИТЕ МОЛЕКУЛИ ОТ ТОВА ИЗОБРЕТЕНИЕ /ВЪВ ВСЕКИ ОТСЛУЧАИТЕ ТЕ СА МОНО- ИЛИ ПОЛИ - ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНИ Т.Е. 2-4ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВИ ГРУПИ СА СВЪРЗАНИ ЧРЕЗ АЦИЛНА ИЛИ АЛКИЛНАГРУПА/: ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН MGDF-11 ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН MGDF - 4 ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН MGDF -2 ХИМИЧНОТО МОДИФИЦИРАНЕ ТРЯБВА ДА БЪДЕ ИЗВЪРШЕНО ПРИ ПОДХОДЯЩИУСЛОВИЯ, ЗА ДА МОЖЕ БИОЛОГИЧНО АКТИВНАТА СУБСТАНЦИЯ ДА РЕАГИРА САКТИВИРАНА МОЛЕКУЛА ПОЛИМЕР. МЕТОДИТЕ ЗА ПРИГОТВЯНЕ НАПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНИ MGDF НАЙ-ОБЩО ВКЛЮЧВАТ ЕТАПИ НА: (а) РЕАКЦИЯ МЕЖДУ MGDF ПОЛИПЕПТИД И ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ/РЕАКТИВОСПОСОБЕН ЕСТЕР ИЛИ АЛДЕХИДНО ПРОИЗВОДНО НА ПОЛИЕТИЛЕНГЛИКОЛА/ ПРИ УСЛОВИЯ, ПРИ КОИТО MGDF СЕ СВЪРЗВА С ЕДНА ИИЛИ ПОВЕЧЕПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВИ ГРУПИ; И (б) ПОЛУЧАВАНЕ НА ПРОДУКТА/ИТЕ/ ОТРЕАКЦИЯТА. ОПТИМАЛНИТЕ РЕАКЦИОННИ УСЛОВИЯ ЗА ВСЯКА РЕАКЦИЯ НААЦИЛИРАНЕ ЩЕ БЪДАТ ОПРЕДЕЛЕНИ ЗА ВСЕКИ ОТДЕЛЕН СЛУЧАЙ, ВЗАВИСИМОСТ ОТ ПОЗНАТИТЕ ПАРАМЕТРИ И ЖЕЛАНИЯ РЕЗУЛТАТ. НАПРИМЕРКОЛКОТО ПО-ГОЛЯМО Е СЪОТНОШЕНИЕТО ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ:БЕЛТЪК,ТОЛКОВА ПО-ГОЛЯМ ЩЕ БЪДЕ ПРОЦЕНТЪТ НА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНИЯТПРОДУКТ. -50- WO 95/26746 PCT/US95/03776 РЕДУКТИВНОТО АЛКИЛИРАНЕ КАТО МЕТОД ЗА ПОЛУЧАВАНЕ НА ХОМОГЕННАПОПУЛАЦИЯ ОТ МОНО-ПОЛИМЕР/MGDF БЕЛТЪК СВЪРЗАНИ МОЛЕКУЛИ НАЙ-ОБЩО ОБХВАЩА ЕТАПИТЕ: (а) РЕАКЦИЯ МЕЖДУ MGDF БЕЛТЪК ИРЕАКТИВОСПОСОБНА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВА ГРУПА ПРИ РЕДУКТИВНОАЛКИЛИРАЩИ УСЛОВИЯ, ПРИ ПОДХОДЯЩО pH, ТАКОВА ЧЕ ДА ПОЗВОЛЯВАСЕЛЕКТИВНОТО МОДИФИЦИРАНЕ НА α-АМИНО ГРУПАТА НА АМИНО КРАЯ НАПОСОЧЕНИЯ MGDF БЕЛТЪК; И (б) ПОЛУЧАВАНЕ НА ПРОДУКТА ОТ РЕАКЦИЯТА. ЗА ПОЛУЧАВАНЕ НА ПРАКТИЧЕСКИ ХОМОГЕННИ ПОПУЛАЦИИ ОТ МОНО-ПОЛИМЕР/ MGDF БЕЛТЪК СВЪРЗАНИ МОЛЕКУЛИ РЕАКЦИОННИТЕ УСЛОВИЯ НАРЕДУКТИВНО АЛКИЛИРАНЕ СА ТАКИВА, ЧЕ ДА ПОЗВОЛЯВАТ СЕЛЕКТИВНОСВЪРЗВАНЕ НА ГРУПАТА НА ВОДОРАЗТВОРИМИЯ ПОЛИМЕР КЪМ N- КРАЯ НАMGDF. ТАКИВА РЕАКЦИОННИ УСЛОВИЯ НАЙ-ОБЩО СЕ ОБЕЗПЕЧАВАТ С рКаРАЗЛИКИ МЕЖДУ ЛИЗИНОВИТЕ АМИНО ГРУПИ И α-АМИНО ГРУПАТА НА N-КРАЯ /рКа Е ТОВА pH, ПРИ КОЕТО 50 % ОТ АМИНО ГРУПИТЕ СА ПРОТОНИРАНИ И 50 %НЕ СА/. pH СЪЩО ВЛИЯЕ ВЪРХУ ИЗПОЛЗВАНОТО СЪОТНОШЕНИЕПОЛИМЕР БЕЛТЪК. НАЙ-ОБЩО, АКО pH Е НИСКО ЩЕ БЪДЕ НЕОБХОДИМ ГОЛЯМИЗЛИШЪК НА ПОЛИМЕРА СПРЯМО БЕЛТЪКА /КОЛКОТО ПО-МАЛКОРЕАКТИВОСПОСОБНА Е N-КРАЙНАТА АМИНО ГРУПА, ТОЛКОВА ПОВЕЧЕПОЛИМЕР ЩЕ БЪДЕ НЕОБХОДИМ, ЗА ДА СЕ ПОСТИГНАТ ОПТИМАЛНИТЕУСЛОВИЯ/. АКО pH Е ВИСОКО, ТО НЕ Е НЕОБХОДИМО СЪОТНОШЕНИЕТОПОЛИМЕРБЕЛТЬК ДА Е ТОЛКОВА ГОЛЯМО /НАЛИЧНИ СА ПОВЕЧЕРЕАКТИВОСПОСОБНИ ГРУПИ, ТАКА ЧЕ СА НЕОБХОДИМИ ПО-МАЛКО МОЛЕКУЛИПОЛИМЕР/. ЗА НУЖДИТЕ НА НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ pH СЕ ДВИЖИ ВГРАНИЦИ 3 - 9, НАЙ-ВЕЧЕ 3-6. ДРУГ ВАЖЕН ФАКТОР Е МОЛЕКУЛНОТО ТЕГЛО НА ПОЛИМЕРА. НАЙ-ОБЩОКОЛКОТО ПО-ВИСОКО Е МОЛЕКУЛНОТО ТЕГЛО НА ПОЛИМЕРА, ТОЛКОВА ПО-МАЛЪК БРОЙ ПОЛИМЕРНИ МОЛЕКУЛИ ЩЕ СЕ СВЪРЖАТ С БЕЛТЪКА. СЪЩО ТАКА -51- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ПРИ ОПТИМИЗИРАНЕ НА ПАРАМЕТРИТЕ ТРЯБВА ДА СЕ ВЗЕМЕ ПОД ВНИМАНИЕРАЗКАОНЕНОСТТА НА ПОЛИМЕРА. НАЙ-ОБЩО КОАКОТО ПО-ВИСОКО ЕМОЛЕКУЛНОТО ТЕГЛО /ИЛИ РАЗКАОНЕНОСТТА/, ТОЛКОВА ПО-ГОЛЯМО ЩЕ ЕСЪОТНОШЕНИЕТО ПОЛИМЕР БЕЛТЪК. ЗА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАЩИТЕРЕАКЦИИ РАЗГЛЕДАНИ ТУК СРЕДНОТО МОЛЕКУЛНО ТЕГЛО Е ОТ ОКОЛО 2 KDaДО 100 kDa „ОКОЛО“ ОЗНАЧАВА ± 1 kDa/. ПРЕДПОЧИТАНОТО СРЕДНОМОЛЕКУЛНО ТЕГЛО Е ОТ ОКОЛО 5 kDa ДО ОКОЛО 50 kDa, НАЙ-ПРЕДПОЧИТАНОТО Е ОТ ОКОЛО 12 kDa ДО ОКОЛО 25 kDa. СЪОТНОШЕНИЕТОВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИМЕР: MGDF БЕЛТЪК ОБИКНОВЕНО Е В ГРАНИЦИТЕ ОТ 1:1ДО 100:1, ПРЕДПОЧИТАНО ЗА ПОЛИ-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНЕТО Е ОТ 1:1 ДО20:1 И ЗА МОНО-ПОЛИЕТИЛЕНГЛИКОЛИРАНЕТО ОТ 1:1 ДО 5:1. ЧРЕЗ ПРИЛАГАНЕ НА УСЛОВИЯТА, ПОСОЧЕНИ ПО-ГОРЕ РЕДУКТИВНОТОАЛКИЛИРАНЕ ЩЕ ДОВЕДЕ ДО СЕЛЕКТИВНО СВЪРЗВАНЕ НА ПОЛИМЕРА КЪМВСЕКИ MGDF БЕЛТЪК ИМАЩ α-АМИНО ГРУПА НА АМИНО КРАЯ И ЩЕ ОБЕЗПЕЧИ ПРИГОТВЯНЕТО НА ПРАКТИЧЕСКИ ХОМОГЕННИ МОНОПОЛИМЕР/MGDF БЕЛТЪКСЪЕДИНЕНИЯ. ПОНЯТИЕТО „МОНОПОЛИМЕР/MGDF БЕЛТЪК СЪЕДИНЕНИЕ“,ИЗПОЗВАНО ТУК, ОЗНАЧАВА СЪЕДИНЕНИЕ, СЪДЪРЖАЩО ЕДИНИЧНАПОЛИМЕРНА МОЛЕКУЛА, СВЪРЗАНА С MGDF БЕЛТЪЧНА МОЛЕКУЛА.ПРЕДПОЧИТА СЕ НОМОПОЛИМЕР/MGDF БЕЛТЪК СЪЕДИНЕНИЕТО ДА ИМАПОЛИМЕРНА МОЛЕКУЛА СВЪРЗАНА НА N-КРАЯ, А НЕ КЪМ СТРАНИЧНИТЕЛИЗИНОВИ АМИНО ГРУПИ. ПРЕДПОЧИТА СЕ СЪЩО ТАКА ДА СЕ ПОЛУЧИ ПОВЕЧЕОТ 90 % МОНОПОЛИМЕР/MGDF БЕЛТЪК СЪЕДИНЕНИЕ, А ОЩЕ ПО-ДОБРЕ Е ДАСЕ ПОЛУЧИ ПОВЕЧЕ ОТ 95 % МОНОПОЛИМЕР/ MGDF БЕЛТЪК СЪЕДИНЕНИЕ, СОСТАТЪК ОТ НЕРЕАГИРАЛИ ГРУПИ /БЕЛТЪК НЯМАЩ ПОЛИМЕРНА ГРУПА/. ПРИПРИМЕРИТЕ ПО-ДОЛУ СЕ ОБЕЗПЕЧАВА ПРИГОТВЯНЕТО НА НАЙ-МАЛКО 90 %МОНОПОЛИМЕР/БЕЛТЪК СЪЕДИНЕНИЕ И ОКОЛО 10 % НЕРЕАГИРАЛ БЕЛТЪК.СЪЕДИНЕНИЕТО МОНОПОЛИМЕР/БЕЛТЪК ПРИТЕЖАВА БИОЛОГИЧНААКТИВНОСТ. -52- WO 95/26746 PCT/US95/03776 РЕДУЦИРАЩИЯТ АГЕНТ ЗА РЕДУКТИВНОТО ААКИЛИРАНЕ, ИЗПОЛЗВАН ТУК, ТРЯБВА ДА БЪДЕ СТАБИЛЕН ВЪВ ВОДЕН РАЗТВОР И ЗА ПРЕДПОЧИТАНЕ ДА БЪДЕ СПОСОБЕН ДА РЕДУЦИРА САМО ШИФОВАТА БАЗА, КОЯТО СЕ ОБРАЗУВА В НАЧАЛНИЯ СТАДИИ НА РЕДУКТИВНОТО АЛКИЛИРАНЕ. ПРЕДПОЧИТАНИТЕ РЕДУЦИРАЩИ АГЕНТИ МОГАТ ДА БЪДАТ ИЗБРАНИ ОТ ГРУПАТА СЪСТОЯЩА СЕ ОТ: НАТРИЕВ БОРОХИДРИД, НАТРИЕВ ЦИАНОБРОМИД, ДИМЕТИЛАМИН БОРАН, ТРИМЕТИЛАМИН БОРАН И ПИРИДИН БОРАН. ОСОБЕНО ПРЕДПОЧИТАН РЕДУЦИРАЩ АГЕНТ Е НАТРИЕВИЯТ ЦИАНОБОРОХИДРИД. ф ДРУГИ РЕАКЦИОННИ ПАРАМЕТРИ КАТО: РАЗТВОРИМОСТ, РЕАКЦИОННО ВРЕМЕ, ТЕМПЕРАТУРА И ДР, ΚΑΚΤΟ И МЕТОДИТЕ ЗА ПРЕЧИСТВАНЕ НА ПРОДУКТИТЕ МОГАТ ДА БЪДАТ ОПРЕДЕЛЕНИ ЗА ВСЕКИ ОТДЕЛЕН СЛУЧАЙ ВЪЗ ОСНОВА НА ПУБЛИКУВАНАТА ИНФОРМАЦИЯ, КАСАЕЩА МОДИФИЦИРАНЕТО НА БЕЛТЪЦИ С ВОДОРАЗТВОРИМИ ПОЛИМЕРИ /ВИЖ ПУБЛИКАЦИИТЕ, ЦИТИРАНИ ТУК/. В РАЗДЕЛА С ПРИМЕРИТЕ ПО-ДОЛУ СА ДАДЕНИ НЯКОИ ДЕТАЙЛИ. ПРИ ПРИГОТВЯНЕТО НА СМЕС ОТ ПОЛИМЕР/БЕЛТЪК СВЪРЗАНИ МОЛЕКУЛИ МОЖЕ ДА СЕ ИЗБЕРЕ ДАЛИ ТОВА ДА СТАНЕ ЧРЕЗ МЕТОДА НА АЦИЛИРАНЕ И/ИЛИ АЛКИЛИРАНЕ. ПРЕДИМСТВОТО, ПРЕДЛОЖЕНО ТУК Е, ЧЕ МОЖЕ ДА СЕ ИЗБЕРЕ СЪОТНОШЕНИЕТО НА МОНОПОЛИМЕР/БЕЛТЪК СЪЕДИНЕНИЯТА, КОИТО ДА СЕф ВКЛЮЧАТ В СМЕСТА. ПО ТОЗИ НАЧИН, АКО Е НЕОБХОДИМО, МОЖЕ ДА СЕ ПРИГОТВИ СМЕС ОТ РАЗЛИЧНИ БЕЛТЪЦИ, ИМАЩИ РАЗЛИЧЕН БРОЙ СВЪРЗАНИ ПОЛИМЕРНИ МОЛЕКУЛИ /ДИ ТРИ-, ΤΕΤΡΑ- И Т.Н.Т./ И ДА СЕ СЪЧЕТАЕ С МОНОПОЛИМЕР/БЕЛТЪК СЪЕДИНЕНИЕТО, ПРИГОТВЕНО ПО ОПИСАНИТЕ МЕТОДИ, ТАКА ЧЕ ДА СЕ ПОЛУЧИ СМЕС С ПРЕДОПРЕДЕЛЕНО СЪОТНОШЕНИЕ НА МОНОПОЛИМЕР/БЕЛТЪК СЪЕДИНЕНИЕТО. ПРИМЕРИТЕ ПО-ДОЛУ ДЕМОНСТРИРАТ ПРИГОТВЯНЕТО НА ХИМИЧНО
МОДИФИЦИРАН MGDF И ПРИГОТВЯНЕТО НА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН MGDF ЧРЕЗ АЦИЛИРАНЕ И АЛКИЛИРАНЕ. ТАКА ДРУГ АСПЕКТ НА НАСТОЯЩОТО -53- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ИЗОБРЕТЕНИЕ Е ПРИГОТВЯНЕТО НА ТЕЗИ ПРОДУКТИ. СЪСТОЯНИЯТА, КОИТО МОГАТ ДА БЪДАТ ОБЛЕКЧЕНИ ИЛИ МОДУЛИРАНИ ЧРЕЗКОНТРОЛИРАНЕ НА ПОЛИМЕР/MGDF НАЙ-ОБЩО ВКЛЮЧВАТ ТЕЗИ ОПИСАНИПО-ГОРЕ ЗА MGDF МОЛЕКУЛИТЕ. ПОЛИМЕР/БЕЛТЪК МОЛЕКУЛИТЕ, ОПИСАНИТУК ОБАЧЕ МОГАТ ДА ИМАТ ДОПЪЛНИТЕЛНИ АКТИВНОСТИ, НАМАЛЕНИ ИЛИЗАСИЛЕНИ АКТИВНОСТИ, А СЪЩО ТАКА И ДРУГИ ХАРАКТЕРИСТИКИ ВСРАВНЕНИЕ С НЕМОДИФИЦИРАНТИТЕ МОЛЕКУЛИ. Ф В СЛЕДВАЩ АСПЕКТ ОТ НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ СА ДАДЕНИФАРМАЦЕВТИЧНИТЕ СЪСТАВИ, ВКЛЮЧВАЩИ ГОРЕПОСОЧЕНИТЕ ХИМИЧНОМОДИФИЦИРАНИ MGDF МОЛЕКУЛИ. ТЕЗИ ФАРМАЦЕВТИЧНИ СЪСТАВИ МОГАТДА СЪДЪРЖАТ И ВСЯКА ОТ ТЕЗИ MGDF МОЛЕКУЛИ В НЕМОДИФИЦИРАН ВИД. С ПРОВЕЖДАНЕ НА ПО-НАТАТЪЧНИТЕ ИЗСЛЕДВАНИЯ ЩЕ СЕ ПОЛУЧИИНФОРМАЦИЯ, ОТНАСЯЩА СЕ ДО ПОДХОДЯЩИТЕ НИВА НА ДОЗИРОВКА ЗАЛЕЧЕНИЕ НА РАЗЛИЧНИ СЪСТОЯНИЯ ПРИ РАЗЛИЧНИ ПАЦИЕНТИ И ВСЕКИСПЕЦИАЛИСТ, ВЗЕМАЙКИ ПРЕДВИД ТЕРАПЕВТИЧНОТО ЗНАЧЕНИЕ НАПРЕПАРАТИТЕ, ВЪЗРАСТТА И ОБЩОТО ЗДРАВОСЛОВНО СЪСТОЯНИЕ НАПАЦИЕНТА ЩЕ МОЖЕ ДА ОПРЕДЕЛИ ПРАВИЛНАТА ДОЗА. НАЙ-ОБЩО КАЗАНО '© ДОЗАТА ЩЕ БЪДЕ МЕЖДУ 0.01 цд/КГ. ТЕЛЕСНО ТЕГЛО И 300 цд/КГ. /ВЗЕМА СЕМАСАТА НА САМИЯ БЕЛТЪК, БЕЗ ХИМИЧНИТЕ МОДИфИКАТОРИ/. ПРЕДПОЧИТАНАДОЗА ОБИКНОВЕНО ЩЕ БЪДЕ ОТ 5 цд/КГ. ТЕЛЕСНО ТЕГЛО ДО 100 цд/КГ.ТЕЛЕСНО ТЕГЛО, А ОЩЕ ПО-ПРЕДПОЧИТАНА ОТ 10 цд/КГ. ТЕЛЕСНО ТЕГЛО ДО 75цд/КГ. ТЕЛЕСНО ТЕГЛО. НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ ПРЕДОСТВЯ СЪЩО ТАКА МЕТОД ЗАПРОИЗВОДСТВОТО НА MGDF /Мр1 ЛИГАНДНИ/ ПОЛИПЕПТИДИ ИЛИ ТЕХНИАКТИВНИ ФРАГМЕНТИ. ЕДИН ОТ МЕТОДИТЕ НА НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ -54- WO 95/26746 PCT/US95/03776 РАЗГЛЕЖДА ВКЛЮЧВАНЕТО НА к ДНК, КОДИРАЩА Мр1 АИГАНДЕН ПОЛИПЕПТИД,ВЪВ ВЕКТОР, ПРИ КОЕТО СЕ ПОЛУЧАВА ЕКСПРЕСИОННА СИСТЕМА ЗА Мр1ЛИГАНД. ВЕКТОРЪТ СЕ ВЪВЕЖДА В ИЗБРНА КЛЕТКА ГОСТОПРИЕМНИК И ТЯ СЕКУЛТИВИРА. СЛЕДОВАТЕЛНО МЕТОДИТЕ НА НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕВКЛЮЧВАТ КУЛТИВИРАНЕТО НА ПОДХОДЯЩА КЛЕТКА ИЛИ КЛЕТЪЧНА ЛИНИЯ ВКОЯТО Е ВЪВЕДЕНА ДНК СЕКВЕНЦИЯ, КОДИРАЩА ЕКСПРЕСИЯТА НА Мр1ЛИГАНДЕН ПОЛИПЕПТИД, ПОД КОНТРОЛА НА ПОЗНАТИТЕ РЕГУЛАТОРНИСЕКВЕНЦИИ. РЕГУЛАТОРНИТЕ СЕКВЕНЦИИ ВКЛЮЧВАТ ПРОМОТОРНИФРАГМЕНТИ, ТЕРМИНАТОРНИ ФРАГМЕНТИ И ДРУГИ ПОДХОДЯЩИ СЕКВЕНЦИИ, 0 КОИТО НАСОЧВАТ ИЛИ КОНТРОЛИРАТ ЕКСПРЕСИЯТА НА БЕЛТЪКА ВСЪОТВЕТНАТА КЛЕТКА ГОСТОПРИЕМНИК. СЛЕД ТОВА ЕКСПРЕСИРАНИЯТФАКТОР СЕ ИЗВЛИЧА, ИЗОЛИРА И ПРЕЧИСТВА ОТ КУЛТУРАЛНАТА СРЕДА /ИЛИОТ КЛЕТКАТА, АКО Е ЕКСПРЕСИРАН ВЪТРЕКЛЕТЪЧНО/ ЧРЕЗ ПОДХОДЯЩИТЕСРЕДСТВА, ПОЗНАТИ НА СПЕЦИАЛИСТИТЕ В ТАЗИ ОБЛАСТ. В ДОПЪЛНЕНИЕ СЕСМЯТА, ЧЕ МЕТОДИТЕ ОПИСАНИ В АМЕРИКАНСКИ ПАТЕНТ No 5,272,071 СЪЩО САПРИЛОЖИМИ ЗА ПОЛИНУКЛЕОТИДИТЕ И ПОЛИПЕПТИДИТЕ ОТ ИЗОБРЕТЕНИЕТО. ПОДХОДЯЩИ КЛЕТКИ ИЛИ КЛЕТЪЧНИ ЛИНИИ СА КЛЕТКИТЕ ОТ БОЗАЙНИЦИ,ТАКИВА КАТО КЛЕТКИ ОТ ЯЙЧНИК НА КИТАЙСКИ ХАМСТЕР /CHINESE HAMSTEROVARY,“СНО“/ ИЛИ ЗТЗ. ПОДХОДЯЩИТЕ ЗА ГОСТОПРИЕМНИЦИ КЛЕТКИ ОТ 0 БОЗАЙНИЦИ, ΚΑΚΤΟ И МЕТОДИТЕ ЗА ТРАНСФОРМАЦИЯ, КУЛТИВИРАНЕ,НАМНОЖАВАНЕ, ОТСЯВАНЕ И ПРОИЗВОДСТВО НА ПРОДУКТ И ПРЕЧИСТВАНЕТОМУ СА ПОЗНАТИ. ВИЖ GETHING AND SOMBROOK, NATURE 293:620-625/1981/;ИЛИ KAUFMAN ЕТ. AL., MOL CELL BIOL, 5(7): 1750 -1759 /1985/. ИЛИ HOWLEY ЕТAL., АМЕРИКАНСКИ ПАТЕНТ No 4,419,446. ДРУГИ ПОДХОДЯЩИ КЛЕТЪЧНИ ЛИНИИОТ БОЗАЙНИЦИ СА МАЙМУНСКИТЕ COS-1 И COS-7 КЛЕТЪЧНИ ЛИНИИ ИКЛЕТЪЧНА ЛИНИЯ CV-1. ПО-НАТАТЪК ПРИМЕРНИТЕ КЛЕТКИ ГОСТОПРИЕМНИЦИОТ БОЗАЙНИЦИ ВКЛЮЧВАТ КЛЕТЪЧНИ ЛИНИИ ОТ ПРИМАТИ И КЛЕТЪЧНИ ЛИНИИОТ ГРИЗАЧИ, ВКЛЮЧИТЕЛНО ТРАНСФОРМИРАНИТЕ КЛЕТЪЧНИ ЛИНИИ.ПОДХОДЯЩИ СА СЪЩО НОРМАЛНИ ДИПЛОИДНИ КЛЕТКИ; КЛЕТЪЧНИ РОДОВЕ, -55- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ПРОИЗЛИЗАЩИ ОТ КУЛТУРИ IN VITRO ИЛИ ПЪРВИЧНИ ТЪКАНИ, А СЪЩО ТАКА И ПЪРВИЧНИ ЕКСПЛАНТИ. КЛЕТКИТЕ МОГАТ ДА БЪДАТ С ГЕНОТИПНА НЕДОСТАТЪЧНОСТ ПО ИЗБРАНИЯ ГЕН ИЛИ МОГАТ ДА ПРИТЕЖАВАТ ДОМИНАНТНО ДЕЙСТВАЩ ИЗБРАН ГЕН. ДРУГИ ПОДХОДЯЩИ КЛЕТЪЧНИ ЛИНИИ ОТ БОЗАЙНИЦИ ВКЛЮЧВАТ, НО НЕ СЕ ОГРАНИЧАВАТ ДО: HELA, МИШИ L929 КЛЕТКИ, ЗТЗ ЛИНИИ ПРОИЗХОЖДАЩИ ОТ SWISS; BALB-C ИЛИ NIH ОТ МИШКА, ВНК ИЛИ НАК КЛЕТЪЧНИ ЛИНИИ ОТ ХАМСТЕР. СЪЩО ТАКА КЛЕТКИ ГОСТОПРИЕМНИЦИ, ПОДХОДЯЩИ ЗА НАСТОЯЩОТОф ИЗОБРЕТЕНИЕ СА БАКТЕРИАЛНИТЕ КЛЕТКИ. НАПРИМЕР РАЗЛИЧНИТЕ ЩАМОВЕ НА E.COli /НВ101; DH9, DH10, МС1061/ СА ДОБРЕ ПОЗНАТИ КАТО КЛЕТКИ ГОСТОПРИЕМНЦИ В ОБЛАСТТА НА БИОТЕХНОЛОГИЯТА. РАЗЛИЧНИ ЩАМОВЕ НА В. SUBTILIS; PSEUDOMONAS SPP; BACILUS SPP; STREPTOMYCES SPP И ДРУДИ ПОДОБНИ СА СЪЩО ВКЛЮЧЕНИ В ТОЗИ МЕТОД. МНОГО РОДОВЕ ДРОЖДЕНИ КЛЕТКИ, ПОЗНАТИ НА СПЕЦИАЛИСТИТЕ В ТАЗИ ОБЛАСТ, СЪЩО МОГАТ ДА СЕ ИЗПОЛЗВАТ ЗА ЕКСПРЕСИЯТА НА ПОЛИПЕПТИДИТЕ ОТ ТОВА ИЗОБТРЕТЕНИЕ. В ДОПЪЛНЕНИЕ АКО Е НЕОБХОДИМО КАТО КЛЕТКИ ГОСТОПРИЕМНИЦИ ЗА МЕТОДИТЕ НА НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ МОГАТ ДА СЕ ИЗПОЗВАТ КЛЕТКИ ОТ НАСЕКОМИ,ф ВИЖ MILLER ЕТ AL., GENETIC ENGINEERING 8: 277-298 /1986/ И ЦИТИРАНИТЕ ТАМ СПРАВКИ. НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ ДАВА СЪЩО ТАКА РЕКОМБИНАНТНИ МОЛЕКУЛИ ИЛИ ВЕКТОРИ, КОИТО ДА СЕ ИЗПОЛЗВАТ В МЕТОДА ЗА ЕКСПРЕСИЯ НА НОВИ Мр1 ЛИГАНДНИ ПОЛИПЕПТИДИ. ТЕЗИ ВЕКТОРИ СЪДЪРЖАТ Мр1 ЛИГАНДНАТА ДНК СЕКВЕНЦИЯ, КОЯТО САМОСТОЯТЕЛНО ИЛИ В КОМБИНАЦИЯ С ДРУГИ СЕКВЕНЦИИ КОДИРА Мр1 ЛИГАНДНИТЕ ПОЛИПЕПТИДИ /С ИЛИ БЕЗ СИГНАЛНИ ПЕПТИДИ/ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО ИЛИ ТЕХНИ АКТИВНИ ФРАГМЕНТИ. ВЕКТОРИТЕ, ВКЛЮЧВАЩИ МОДИФИЦИРАНИ СЕКВЕНЦИИ, ΚΑΚΤΟ Е ОПИСАНО ПО-ГОРЕ СА -56- WO 95/26746 PCT/US95/03776 СЪЩО ВКЛЮЧЕНИ В НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ И СА ПРИЛОЖИМИ ПРИ ПРОИЗВОДСТВОТО НА Mpl ЛИГАНДНИ ПОЛИПЕПТИДИ. ВЕКТОРЪТ ИЗПОЛЗВАН В МЕТОДА СЪДЪРЖА СЪЩО ТАКА ИЗБРАНИ РЕГУЛАТОРНИ СЕКВЕНЦИИ, КОИТО СА В ОПЕРАТИВНА ВРЪЗКА С ДНК КОДИРАЩИТЕ СЕКВЕНЦИИ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО И СА СПОСОБНИ ДА НАСОЧВАТ ТЯХНАТА РЕПЛИКАЦИ И ЕКСПРЕСИЯ В ИЗБРАНИТЕ КЛЕТКИ ГОСТОПРИЕМНИЦИ. ЕДИН ОТ ВЕКТОРИТЕ ОСОБЕНО ПРЕДПОЧИТАН ЗА ЕКСПРЕСИЯ В COS КЛЕТКИ Е РМХ [Y.C. YANG ЕТ AL., CELL:47:3 -10 /1986/]. ДРУГ ВЕКТОР, КОЙТО Еф ПРЕДПОЧИТАН ЗА ЕКСПРЕСИЯ В КЛЕТКИ ОТ БАЗАЙНИЦИ, НАПРИМЕР В СНО КЛЕТКИ Е ЕРЕМС2В1. ВЕКТОРИТЕ, ЕКСПРЕСИРАНИ В КЛЕТКИ ОТ БОЗАЙНИЦИ, ОПИСАНИ ТУК, СА ДОБРЕ ПОЗНАТИ НА СПЕЦИАЛИСТИТЕ В ТАЗИ ОБЛАСТ. КОМПОНЕНТИТЕ НА ВЕКТОРИТЕ, Т.Е. РЕПЛИКОНИТЕ; ИЗБРАНИТЕ ГЕНИ, УСИЛВАТЕЛИТЕ /ЕНХАНСЕРИ/, ПРОМОТОРИ И ДР. МОГАТ ДА БЪДАТ ПОЛУЧЕНИ ОТ ЕСТЕСТВЕНИ ИЗТОЧНИЦИ ИЛИ СИНТЕЗИРАНИ ЧРЕЗ ПОЗНАТИТЕ ПРОЦЕДУРИ. ВИЖ KAUFMAN ЕТ AL., J. MOL. BIOL. 159: 511-521 /1982/, И KAUFMAN, PROC. NATE. ACAD. SCI UUSA 82:689-693 /1985/. ОСВЕН ТОВА ВЕКТОРНАТА ДНК МОЖЕ ДА ВКЛЮЧВА ЦЕЛИЯ ГЕНОМ НА ГОВЕЖДИЯ ПАПИЛОМЕН ВИРУС ИЛИ ЧАСТ ОТ НЕГО [LUSKY ЕТ AL., CELL 36: 391-401 /1984/] И ТОЙ ДА БЪДЕ РЕПЛИЦИРАН КАТО СТАБИЛЕН ЕПИЗОМЕН ЕЛЕМЕНТ В КЛЕТЪЧНИ ЛИНИИ КАТО С127 МИШИ КЛЕТКИ. РЕЗУЛТАТЪТ ОТ ТРАНСФЕКЦИЯТА НА ПОДХОДЯЩИТЕ КЛЕТКИ ГОСТОПРИЕМНИЦИ С ТЕЗИ ВЕКТОРИ Е ЕКСПРЕСИЯТА НА Mpl ЛИГАНДНИ ПОЛИПЕПТИДИ. ЗА ТАЗИ ЦЕЛ МОГАТ ДА БЪДАТ ИЗПОЛЗВАНИ И ДРУГИ ЕКСПРЕСИОННИ ВЕКТОРИ, ПОЗНАТИ В ТАЗИ ОБЛАСТ ЗА ЕКСПРЕСИЯ В КЛЕТКИ НА БОЗАЙНИЦИ, НАСЕКОМИ, ДРОЖДИ, ГЪБИ И БАКТЕРИИ. СЪСТОЯНИЯТА, КОИТО МОГАТ ДА СЕ ЛЕКУВАТ С МЕТОДИТЕ И СЪСТАВИТЕ НА НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ НАЙ-ОБЩО ВКЛЮЧВАТ СЪЩЕСТВУВАЩА МЕГАКАРИОЦИТНА/ТРОМБОЦИТНА НЕДОСТАТЪЧНОСТ ИЛИ ОЧАКВАНА МЕГАКАРИОЦИТНА/ТРОМБОЦИТНА НЕДОСТАТЪЧНОСТ В БЪДЕЩЕ /ПРИ -57- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ПЛАНИРАНИ ОПЕРАЦИИ НАПРИМЕР/. ТЕЗИ СЪСТОЯНИЯ ОБИКНОВЕНО САРЕЗУЛТАТ ОТ НЕДОСТАТЪЧНОСТ /ВРЕМЕННА ИЛИ ПОСТОЯННА/ НА АКТИВЕН Мр1ЛИГАНД IV VIVO. ГЕНЕРИЧНОТО НАЗВАНИЕ НА ТРОМБОЦИТНАТАНЕДОСТАТЪЧНОСТ Е ТРОМБОЦИТОПЕНИЯ И СЛЕДОВАТЕЛНО МЕТОДИТЕ ИСЪСТАВИТЕ НА НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ СА ПОДХОДЯЩИ ЗА ЛЕЧЕНИЕ НАТРОМБОЦИТОПЕНИЯ. ТРОМБОЦИТОПЕНИЯТА МОЖЕ ДА Е РЕЗУЛТАТ ОТ РАЗЛИЧНИ ПРИЧИНИ,ВКЛЮЧИТЕЛНО ХИМИОТЕРАПИЯ, ДРУГИ ТЕРАПИИ С ЛАКАРСТВА, РАДИАЦИОННАТЕРАПИЯ, ХИРУРГИЧНИ ОПЕРАЦИИ, ЗАГУБА НА КРЪВ И ДРУГИ СПЕЦИФИЧНИБОЛЕСТНИ СЪСТОЯНИЯ. НАПРИМЕР СПЕЦИФИЧНИ БОЛЕСТНИ СЪСТОЯНИЯ,КОИТО СЕ ИЗРАЗЯВАТ В ТРОМБОЦИТОПЕНИЯ И МОГАТ ДА СЕ ЛЕКУВАТ ВСЪОТВЕТСТВИЕ С ТОВА ИЗОБРЕТЕНИЕ СА: АПЛАСТИЧНА АНЕМИЯ;ИДИОПАТИЧНА ТРОМБОЦИТОПЕНИЯ; МЕТАСТАЗНИ ТУМОРИ, КОИТОПРЕДИЗВИКВАТ ТРОМБОЦИТОПЕНИЯ, СИСТЕМЕН ЛУПУС ЕРИТЕМАТОЗУС;СПЛЕНОМЕГАЛИЯ; СИНДРОМ НА FAUCONI; НЕДОСТАТЪЧНОСТ НА ВИТАМИН ΒΪ2;НЕДОСТАТЪЧНОСТ НА ФОЛИЕВА КИСЕЛИНА; АНОМАЛИЯ НА MAY-HEGGLIN;СИНДРОМ НА WISKOTT-ALDICH; PARATYSMAL NOCTURAL HEMOGLOBINURIA.ТРОМБОЦИТОПЕНИЯТА МОЖЕ ДА БЪДЕ РЕЗУЛТАТ ОТ НЯКОИ МЕТОДИ ЗАЛЕЧЕНИЕ НА СПИН /НАПР. AZT/. СЪЩО ТАКА НЯКОИ НАРУШЕНИЯ ПРИЗАРАСТВАНЕТО НА РАНИ МОГАТ ДА СЕ ПОВЛИЯЯТ БЛАГОПРИЯТНО СУВЕЛИЧАВАНЕ БРОЯ НА ТРОМБОЦИТИТЕ. ВЪВ ВРЪЗКА С РАЗГЛЕДАНИТЕ СЪСТОЯНИЯ НА ТРОМБОЦИТНАНЕДОСТАТЪЧНОСТ, НАПР. ПРИ БЪДЕЩА ОПЕРАЦИЯ Мр1 ЛИГАНДА ОТНАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ ТРЯБВА ДА СЕ ПРИЛОЖИ ОТ НЯКОЛКО ДНИ ДОНЯКОЛКО ЧАСА ПРЕДИ НУЖДАТА ОТ ТРОМБОЦИТИ. ПРИ ОСТРИТЕ СЪСТОЯНИЯ,НАПРИМЕР ПРИ ВНЕЗАПНА И МАСИВНА КРЪВОЗАГУБА Мр1 ЛИГАНДА МОЖЕ ДАСЕ ПРИЛОЖИ ЗАЕДНО С КРЪВ ИЛИ ПРЕЧИСТЕНИ ТРОМБОЦИТИ. -58- WO 95/26746 PCT/US95/03776
Mpl ЛИГАНДИТЕ ОТ ТОВА ИЗОБРЕТЕНИЕ МОГАТ ДА СЕ ОКАЖАТ ПОЛЕЗНИ ЗАСТИМУЛИРАНЕ И НА НЯКОИ КЛЕТЪЧНИ ТИПОВЕ, РАЗЛИЧНИ ОТМЕГАКАРИОЦИТИТЕ, АКО Е УСТАНОВЕНО, ЧЕ ТЕЗИ КЛЕТКИ ЕКСПРЕСИРАТ MplРЕЦЕПТОР. СЪСТОЯНИЯТА, СВЪРЗАНИ С КЛЕТКИ, ЕКСПРЕСИРАЩИ MplРЕЦЕПТОР СА СЪЩО ОБХВАНАТИ ОТ ТОВА ИЗОБРЕТЕНИЕ. MGDF МОЛЕКУЛИТЕ, КОИТО САМИ ПО СЕБЕ СИ НЕ ПОКАЗВАТ АКТИВНОСТ ВИЗСЛЕДВАНИЯТА ПРЕДСТАВЕНИ ТУК МОГАТ ДА СЕ ИЗПОЛЗВАТ КАТОМОДУЛАТОРИ /ИНХИБИТОРИ ИЛИ СТИМУЛАТОРИ/ НА Mpl РЕЦЕПТОРИТЕ INVITRO ИЛИ IN VIVO. СЪЩО ТАКА ПОЛИПЕПТИДИТЕ ОТ НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ МОГАТ ДА СЕИЗПОЗВАТ САМОСТОЯТЕЛНО ИЛИ В КОМБИНАЦИЯ С ДРУГИ ЦИТОКИНИ;РАЗТВОРИМ Mpl РЕЦЕПТОР; ХЕМАТОПОЕТИЧНИ ФАКТОРИ; ИНТЕРЛЕВКИНИ;РАСТЕЖНИ ФАКТОРИ ИЛИ АНТИТЕЛА ПРИ ЛЕЧЕНИЕ НА ГОРЕСПОМЕНАТИТЕСЪСТОЯНИЯ. ПОРАДИ ТОВА ДРУГ АСПЕКТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО СА ТЕРАПЕВТИЧНИТЕСЪСТАВИ ЗА ЛЕЧЕНИЕ НА ПОСОЧЕНИТЕ ПО-ГОРЕ СЪСТОЯНИЯ. ТЕЗИ СЪСТАВИСЪДЪРЖАТ ТЕРАПЕВТИЧНО ЕФЕКТИВНО КОЛИЧЕСТВО ОТ Mpl ЛИГАНДНИЯПОЛИПЕПТИД ИЛИ НЕГОВ ТЕРАПЕВТИЧНО ЕФЕКТИВЕН ФРАГМЕНТ В СМЕС СФАРМАЦЕВТИЧНО ПРИЕМЛИВ НОСИТЕЛ. НОСИТЕЛЯТ МОЖЕ ДА БЪДЕ ВОДА ЗАИНЖЕКТИРАНЕ, ЗА ПРЕДПОЧИТАНЕ ДОПЪЛНЕНА С ДРУГИ МАТЕРИАЛИ, КОИТОСЕ ИЗПОЛЗВАТ В РАЗТВОРИТЕ ЗА ПРИЛАГАНЕ ПРИ БОЗАЙНИЦИ. ТИПИЧНОТОПРИЛОЖЕНИЕ НА ТЕРАПЕВТИЧНИЯ Mpl ЛИГАНД ЩЕ БЪДЕ ПОД ФОРМАТА НАСЪСТАВ, СЪДЪРЖАЩ ПРЕЧИСТЕН БЕЛТЪК И ЕДИН ИЛИ ПОВЕЧЕ ФИЗИОЛОГИЧНОПРИЕМЛИВИ НОСИТЕЛИ ИЛИ РАЗТВОРИТЕЛИ. ПРИМЕРНИ ПОДХОДЯЩИНОСИТЕЛИ СА СОЛЕВИ БУФЕР ИЛИ СОЛ СМЕСЕНА СЪС СЕРУМЕН АЛБУМИН. ЗАПРЕДПОЧИТАНЕ Е ПРОДУКТЪТ ДА СЕ ПРИГОТВИ ПОД ФОРМАТА НАЛИОФИЛИЗАТ ЧРЕЗ ПОДХОДЯЩИ ИНЕРТНИ НОСИТЕЛИ /НАПР. ЗАХАРОЗА/. ПРИ -59- WO 95/26746 PCT/US95/03776 НЕОБХОДИМОСТ МОГАТ ДА СЕ ВКЛЮЧАТ И ДРУГИ СТАНДАРТНИ НОСИТЕЛИ И РАЗТВОРИТЕЛИ. ДРУГИ ПРИМЕРНИ СЪСТАВИ ВКЛЮЧВАТ ТРИС БУФЕР, pH 8.0 И АЦЕТАТЕН БУФЕР, pH 5.0, КАТО ЗА ВСЕКИ ОТДЕЛЕН СЛУЧАЙ В ТЯХ МОЖЕ ДА СЕ ВКЛЮЧИ ДОПЪЛНИТЕЛНО СОРБИТОЛ. ТЕЗИ СЪСТАВИ МОГАТ ДА БЪДАТ СИСТЕМНО ПРИЛАГАНИ ПАРЕНТЕРАЛНО. ОСВЕН ТОВА СЪСТАВИТЕ МОГАТ ДА БЪДАТ ПРИЛАГАНИ ВЕНОЗНО ИЛИ ПОДКОЖНО. КОГАТО ТЕРАПЕВТИЧНИТЕ СЪСТАВИ НА ТОВА ИЗОБРЕТЕНИЕ СЕ ПРИЛАГАТ СИСТЕМНО ТЕ МОГАТ ДА БЪДАТ ПОД ФОРМАТА НА НЕПИРОГЕНЕНф ПАРЕНТЕРАЛНО ПРИЛОЖИМ ВОДЕН РАЗТВОР. ПРИГОТВЯНЕТО НА ТАКИВА ФАРМАЦЕВТИЧНО ПРИЕМЛИВИ БЕЛТЪЧНИ РАЗТВОРИ С НЕОБХОДИМОТО pH, ИЗОТОНИЧНОСТ И СТАБИЛНОСТ Е ПОЗНАТО В НАУКАТА. РЕЖИМА НА ДОЗИТЕ В МЕТОДА ЗА ЛЕЧЕНИЕ НА ГОРЕСПОМЕНАТИТЕ СЪСТОЯНИЯ ЩЕ БЪДЕ ОПРЕДЕЛЕН ОТ ЛЕКУВАЩИЯТ ЛЕКАР, КАТО СЕ ВЗЕМАТ ПОД ВНИМАНИЕ РАЗЛИЧНИТЕ ФАКТОРИ ОПРЕДЕЛЯЩИ ДЕЙСТВИЕТО НА ЛЕКАРСТВАТА: ВЪЗРАСТ, СЪСТОЯНИЕ, ТЕЛЕСНО ТЕГЛО, ПОЛ, ДИЕТА НА ПАЦИЕНТА, НАЛИЧИЕ НА ИНФЕКЦИЯ, ВРЕМЕ НА ПРИЕМИТЕ И ДРУГИ КЛИНИЧНИ ФАКТОРИ. НАЙ-ОБЩО ДНЕВНАТА ДОЗА ТРЯБВА ДА БЪДЕ В РАМКИТЕ ОТ 0.1 ДО 1000 МИКРОГРАМА Мр1 ЛИГАНДЕН БЕЛТЪК НА КИЛОГРАМ ТЕЛЕСНО ТЕГЛО. ви» ** ТЕРАПЕВТИЧНИТЕ МЕТОДИ, СЪСТАВИ И ПОЛИПЕПТИДИ ОТ НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ МОГАТ СЪЩО ТАКА ДА БЪДАТ ВКЛЮЧЕНИ САМОСТОЯТЕЛНО ИЛИ В КОМБИНАЦИЯ С ДРУГИ ЦИТОКИНИ, РАЗТВОРИМ Мр1 РЕЦЕПТОР, ХЕМОПОЕТИЧНИ ФАКТОРИ, ИНТЕРЛЕВКИНИ, РАСТЕЖНИ ФАКТОРИ ИЛИ АНТИТЕЛА В ЛЕЧЕНИЕ НА БОЛЕСТНИ СЪСТОЯНИЯ, ХАРАКТЕРИЗИРАЩИ СЕ С ДРУГИ СИМПТОМИ. УСТАНОВЕНО Е, ЧЕ Мр! ЛИГАНДНАТА МОЛЕКУЛА В КОМБИНАЦИЯ С ДРУГИ СТИМУЛИРАЩИ ХЕМОПОЕЗАТА ФАКТОРИ КАТО IL ИЛИ GM CSF, СЕ ОКАЗВА ПОЛЕЗНА ЗА ЛЕЧЕНИЕ НА НЯКОИ ФОРМИ ТРОМБОЦИТОПЕНИЯ. ДРУГИ СТИМУЛИРАЩИ ФАКТОРИ НА МЕГАКАРИОЦИТИТЕ -60- WO 95/26746 PCT/US95/03776
КАТО Meg-CSF, ФАКТОРА HA СТВОЛОВИТЕ КЛЕТКИ /STEM CELL FACTOR,„SCF“/; ЛЕВКЕМИЯ ИНфИБИРАЩИЯТ ФАКТОР /LEUKEMIA INHIBITORY FACTOR,„LIF“/, ОНКОСТАИН M /ONKOSTATIN M, ,,OSM“/ ИЛИ ДРУГИ МОЛЕКУЛИ,ПРИТЕЖАВАЩИ СТИМУЛИРАЩА АКТИВНОСТ СПРЯМО МЕГАКАРИОЦИТИТЕСЪЩО МОГАТ ДА БЪДАТ ИЗПОЛЗВАНИ ЗАЕДНО С Мр1 ЛИГАНДА. ДРУГИЦИТОКИНИ ИЛИ ХЕМОПОЕТИЧНИ ФАКТОРИ ЗА ТАКОВА ЕДНОВРЕМЕННОПРИЛАГАНЕ СА НАПРИМЕР: IL-1 АЛФА, IL-1 БЕТА, IL-2, IL-3, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6,IL-11, КОЛОНИЯ СТИМУЛИРАЩ ФАКТОР -1 /G-CSF/, ЕРО, ИНТЕРфЕРОН -АЛФА/IFN - АЛФА/, ИНТЕРФЕРОН -БЕТА, ИНТЕРфЕРОН -ГАМА. СЪЩО ТАКА МОЖЕ ДА СЕОКАЖЕ ПОЛЕЗНО ЕДНОВРЕМЕННОТО ИЛИ ПОСЛЕДОВАТЕЛНО ПРИЛАГАНЕ НАЕФЕКТИВНО КОЛИЧЕСТВО РАЗТВОРИМ Мр1 РЕЦЕПТОР ОТ БОЗАЙНИЦИ, КОЙТОПРЕДИЗВИКВА ФРАГМЕНТАЦИЯ НА ТРОМБОЦИТИТЕ В МЕГАКАРИОЦИТИТЕ,КОГАТО МЕГАКАРИОЦИТИТЕ ДОСТИГНАТ ЗРЯЛА ФОРМА. ОЧАКВА СЕ ОСОБЕНОЕФЕКТИВНО СРЕДСТВО ЗА СТИМУЛИРАНЕ ПРОИЗВОДСТВОТО НА ТРОМБОЦИТИДА БЪДЕ ПРИЛАГАНЕТО НА Мр1 ЛИГАНД /ЗА УВЕЛИЧАВАНЕ БРОЯ НА ЗРЕЛИТЕМЕГАКАРИОЦИТИ/ ПОСЛЕДВАНО ОТ ПРИЛАГАНЕ НА РАЗТВОРИМ Мр1 РЕЦЕПТОР/ЗА ИНАКТИВИРАНЕ НА ЛИГАНДА И ЗА ДА ПОЛЗВОЛИ ПРОИЗВОДСТВОТО НАТРОМБОЦИТИ/. ДОЗАТА ЦИТИРАНА ПО-ГОРЕ ТРЯБВА ДА БЪДЕ КОРИГИРАНА, ЗАДА СЕ КОМПЕНСИРАТ ТЕЗИ ДОПЪЛНИТЕЛНИ КОМПОНЕНТИ В ТЕРАПЕВТИЧНИЯСЪСТАВ. ПОДОБРЕНИЕТО В СЪСТОЯНИЕТО НА ЛЕКУВАНИЯ ПАЦИЕНТ МОЖЕ ДАБЪДЕ УСТАНОВЕНО ЧРЕЗ СТАНДАРТНИТЕ МЕТОДИ. ДРУГО ПРИЛОЖЕНИЕ НА ТЕЗИ НОВИ ПОЛИПЕПТИДИ Е В РАЗРАБОТВАНЕТО НААНТИТЕЛА, СЪЗДАДЕНИ ЧРЕЗ СТАНДАРТНИ МЕТОДИ. РАЗЛГЕДАНИ СААНТИТЕЛА, КОИТО РЕАГИРАТ С Мр1 ЛИГАНДИТЕ НА НАСТОЯЩОТОИЗОБРЕТЕНИЕ, А СЪЩО И РЕАКТИВОСПОСОБНИ ФРАГМЕНТИ ОТ ТАКИВААНТИТЕЛА. АНТИТЕЛАТА МОГАТ ДА БЪДАТ ПОЛИКЛОНАЛНИ, МОНОКЛОНАЛНИ,РЕКОМБИНАНТНИ, ХИМЕРНИ, ЕДНОВЕРИЖНИ И/ИЛИ БИСПЕЦИФИЧНИ И ДР.ФРАГМЕНТИТЕ ОТ АНТИТЕЛА МОГАТ ДА БЪДАТ ВСИЧКИ ФРАГМЕНТИ, КОИТОРЕАГИРАТ С Мр1 ЛИГАНДА ОТ НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ КАТО Fab, И ДР. В -61- WO 95/26746 PCT/US95/03776 НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ СА ДАДЕНИ СЪЩО ХИБРИДОМИТЕ, ПОЛУЧЕНИЧРЕЗ ПРЕДСТАВЯНЕ НА Мр1 ЛИГАНД ИЛИ НЕГОВ ФРАГМЕНТ КАТО АНТИГЕН ВИЗБРАН БОЗАЙНИК, ПОСЛЕДВАНО ОТ СЛИВАНЕТО НА КЛЕТКИТЕ ОТЖИВОТНОТО С ОПРЕДЕЛЕНИ РАКОВИ КЛЕТКИ С ПОМОЩТА НА ПОЗНАТИТЕТЕХНИКИ, ЗА ДА СЕ ПОЛУЧАТ БЕЗСМЪРТНИ КЛЕТЪЧНИ ЛИНИИ. В ТОВАИЗОБРЕТЕНИЕ СА РАЗГЛЕДАНИ СЪЩО МЕТОДИТЕ ЗА СЪЗДАВАНЕ НА КЛЕТЪЧНИЛИНИИ И АНТИТЕЛА, НАСОЧЕНИ СРЕЩУ ЦЕЛИЯ ЧОВЕШКИ Mpi ЛИГАНДЕНПОЛИПЕПТИД ИЛИ ЧАСТИ ОТ НЕГО. АНТИТЕЛАТА МОГАТ ДА БЪДАТ ИЗПОЛЗВАНИ ТЕРАПЕВТИЧНО ЗА ИНХИБИРАНЕСВЪРЗАНЕТО МЕЖДУ Mpl ЛИГАНДА И НЕГОВИЯ РЕЦЕПТОР. ОСВЕН ТОВААНТИТЕЛАТА МОГАТ ДА БЪДАТ ИЗПОЛЗВАНИ ЗА ДИАГНОСТИЧНИ ЦЕЛИ IN VIVO ИIN VITRO, НА ПРИМЕР ЗА ПРИГОТВЯНЕ НА ТЕСТ ЗА УСТАНОВЯВАНЕ НАЛИЧИЕТОНА Mpl ЛИГАНД В ТЪКАННИ ТЕЧНОСТИ. ЗА ПО-ПЪЛНА ИЛЮСТРАЦИЯ НА НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕ СА ВКЛЮЧЕНИСЛЕДВАЩИТЕ ПРИМЕРИ. В ДОПЪЛНЕНИЕ ТЕЗИ ПРИМЕРИ ПОКАЗВАТ НАЙ-ВАЖНИТЕ АСПЕКТИ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО, БЕЗ ДА ОГРАНИЧАВАТ ТЕХНИЯОБХВАТ, ОСВЕН АКО ТОВА НЕ Е ИЗРИЧНО ОТБЕЛЯЗАНО. СТАНДАРНИТЕ МЕТОДИЗА ВСЯКА ОТ ПРОЦЕДУРИТЕ, ОПИСАНИ В СЛЕДВАЩИТЕ ПРИМЕРИ ИЛИПОДХОДЯЩИТЕ АЛТЕРНАТИВНИ ПРОЦЕДУРИ СА ПРЕДСТАВЕНИ В ШИРОКОИЗВЕСТНИТЕ РЪКОВОДСТВА ПО МОЛЕКУЛЯРНА БИОЛОГИЯ, КАТО: SAMBROOKЕТ AL., MOLECULAR CL1NING, SECOND EDITION; COLD SPRING HARBORLABORATORY PRESS /1987/; AUSHBEL ET AL., /EDS/, CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY, GREENE ASSOCIATES. WILEY INTERSCIENCE, NEWYORK /1990/. -62- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ПРИМЕР 1 АПЛАСТИЧНА КУЧЕШКА ПЛАЗМА ХИПАРИНИЗИРАНА КУЧЕШКА ПЛАЗМА /“АРК9“/ ИЛИ НОРМАЛНА КУЧЕШКАПЛАЗМА БЕШЕ ПОЛУЧЕНА СПОРЕД МЕТОДИТЕ ОПИСАНО В СЛЕДВАЩИТЕПУБЛИКАЦИИ, КАТО Е ПРОМЕНЕНО ТОВА, ЧЕ РЕЦИПИЕНТИТЕ СА ПОЛУЧИЛИ 450rad РАДИАЦИЯ НА ЦЯЛОТО ТЯЛО: 1. MAZUR, Е. AND SOUTH, К. EXP. HEMATOL. 13:1164-1172 /1985/. 2. ARRIAGE, M., SOUTH K., CONEN, J.L. AND MAZUR, E.M. BLOOD 69:486-492/1987/. ПРИМЕР 2 ИЗСЛЕДВАНЕ HA ЧОВЕШКИ МЕГАКАРИОЦИТИ
APK9 И ФРАКЦИОНИРАНА АРК9 БЯХА ИЗСКЕДВАНИ БЯХА ИЗСЛЕДВАНИ ЗАСПОСОБНОСТТА ИМ ДА СТИМУЛИРАТ РАЗВИТИЕТО НА ЧОВЕШКИМЕГАКАРИОЦИТИ ОТ CD34+ КЛЕТКИ ПРЕДШЕСТВЕНИЦИ. СО34-ИЗБРАНИКЛЕТКИ БЯХА ПОЛУЧЕНИ ОТ ПЕРИФЕРНИ КРЪВНИ КЛЕТКИ ΚΑΚΤΟ Е ОПИСАНО/НОКОМ, т., AND HUNT, Р. MOLECULAR BIOGOLY OF HAEMOTOPOESIS 3:31/1994/ И БЯХА ИНКУБИРАНИ В СЛЕДНАТА КУЛТУРАЛНА СРЕДА:! SCOVEМОДИФИЦИРАНА DULBECCO СРЕДА /IMDM; G ВСО, GRAND ISLAND, N.Y./ КЪМКОЯТО Е ДОБАВЕНО: 1% ГЛУТАМИН PEN-STREP /IRVINE SCIENTIFIC, SOUTHANA, СА/ И 10 % ХИПАРИЗИРАНА, БЕДНА НА ТРОМБОЦИТИ ЧОВЕШКА АБПЛАЗМА. СЪЩО ТАКА СА ДОБАВЕНИ: 2-МЕРКАПТОЕТАНОЛ /10 М/; PYRUVIC
КИСЕЛИНА /110 цд/т!/; ХОЛЕСТЕРОЛ 7.8 gg/ml/; АДЕНИН; ГУАНИН; ЦИТИДИН;УРИДИН; ТИМИДИН; 2 ДЕЗОКСИ ЦИТОЗИН; 2 ДЕЗОКСИ АДЕНОЗИН; 2 ДЕСОКСИГУАНОЗИН /ПО 10 gg/ml ОТ ВСЯКА, SIGMA/; ЧОВЕШКИ РЕКОМБИНАНТЕ ИНСУЛИН/10 цд/т!/; ЧОВЕШКИ ТРИСфЕРИН /300 цд/т!/; СОЕВИ ЛИПИДИ /1%, BOEHRINGER -63- WO 95/26746 PCT/US95/03776 MANUHEIM; FUDIANA POLIS, IN/; ЧОВЕШКИ РЕКОМБИНАНТЕН ОСНОВЕНФИБРОБААСТЕН РАСТЕЖЕН ФАКТОР /2 ng/ml, GEUZYME; CAMBRIDGE; МА/;ЧОВЕШКИ РЕКОМБИНАНТЕН ЕПИДЕРМАЛЕН РАСТЕЖЕН ФАКТОР /5 ng/ml/,ТРОМБОЦИТЕН РАСТЕЖЕН ФАКТОР /10 ng/ml, AMGEN INC, THOUSAND OAKS,СА/. CD-34 -ИЗБРАНИТЕ КЛЕТКИ БЯХА ПОСТАВЕНИ В 2 х 10 ml КУЛТУРАЛНАСРЕДА, 15 ill КРАЕН ОБЕМ, В МИКРОТИТЪРНИ СЪДОВЕ ВИД TERASAKI/VAUDUARD, INC., NEPTUNE, NJ/. КЛЕТКИТЕ БЯХА ИНКУБИРАНИ ПРИ 37 0 С ЗА 8ДНИ В ОВЛАЖНИТЕЛНИ БОКСОВЕ, ПРИ 5 % СО2 ВЪВ ВЪЗДУХА, ФИКСИРАНИДИРЕКТНО ВЪРХУ СЪДОВЕТЕ С 1 % ГЛУТАРАЛДЕХИД И ИНКУБИРАНИ СЪС СМЕСОТ МОНОКЛОНАЛНИ АНТИТЕЛА [АНТИ- GPIb, АНТИ -GPIIb, /BIODESIGN/ И АНТИ-GPIb /DAKO; CARPINTERIA, СА/. ИМУННАТА РЕАКЦИЯ Е РАЗВИТА ВСТРЕПТАВИДИН-БЕТА-ГАЛАКТОЗИДАЗА ДЕТЕКТОРНА СИСТЕМА /HUSTOMARK,KIKEGAARD AND PERRY/. МЕГАКАРИОЦИТИТЕ, СИНИ НА ЦВЯТ СА ПРЕБРОЕНИ СОБРАТНО ФАЗОВ МИКРОСКОП ПРИ 100 X УВЕЛИЧЕНИЕ. РЕЗУЛТАТИТЕ БЯХАПРЕДСТАВЕНИ КАТО СРЕДНИЯ БРОЙ НА МЕГАКАРИОЦИТИТЕ ЗА СЪД ±СТАНДАРТНАТА ГРЕШКА НА МЕТОДА. В НЯКОИ СЛУЧАИ ДАННИТЕ САПРЕДСТАВЕНИ КАТО МЕГАКАРИОЦИТНИ ЕДИНИЦИ/m», КЪДЕТО НИВОТО, ДОКОЕТО ДАДЕНА ПРОБА УВЕЛИЧАВА МЕГАКАРИОЦИТНОТО РАЗВИТИЕ БЕШЕСРАНДАРТИЗИРАНО С ПОЛОЖИТЕЛНИЯ АРК9 КОНТРОЛ ЗА ТОЗИЕКСПЕРИМЕНТ. ЕДНА ЕДИНИЦА Е ДЕФИНИРАНА KOTO КОЛИЧЕСТВОТОМАТЕРИАЛ, КОЕТО ДАВА СЪЩОТО КОЛИЧЕСВО МЕГАКАРИОЦИТНИ КЛЕТКИКАТО 1 ul ОТ АРК9 СТАНДАРТА. АКТИВНОСТТА БЕ ПРИЕТА КАТО ТАЗИ НА Мр1ЛИГАНДА, АКО ТОЙ МОЖЕ ДА БЪДЕ БЛОКИРАН С 5 - 10 gg/ml Mpl-X /РАЗТВОРИММр1 РЕЦЕПТОР/. В ТАЗИ СИСТЕМА Е ПОКАЗАНО, ЧЕ АРК9 СЪДЪРЖА фАКТОР/И, КОЙТОСТИМУЛИРА РАЗВИТИЕТО НА ЧОВЕШКИТЕ МЕГАКАРИОЦИТИ. CD 34- ИЗБРАНИТЕКЛЕТКИ, ИНКУБИРАНИ С 10 NK ЗА 8 ДНИ ДАВАТ НЕЗНАЧИТЕЛЕН БРОЙ СИНЬООЦВЕТЕНИ МЕГАКАРИОЦИТИ. -64- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ФИГ. 2 ПОКАЗВА, ЧЕ НАРАСТВАЩИ КОНЦЕНТРАЦИИ Мр1-Х, ПРИБАВЕНИ КЪМКУЛТУРАЛНАТА СИСТЕМА ОТ ЧОВЕШКИ МЕГАКАРИОЦИТИ НАРАСТВАЩОБЛОКИРАТ РАЗВИТИЕТО НА МЕГАКАРИОЦИТИТЕ. ПРИ КОНЦЕНТРАЦИИ НА Мр1-ХНАД 5 ид/т1 ИНХИБИРАНЕТО Е ПЪЛНО. В ТОЗИ ЕКСПЕРИМЕНТ CD-34-ИЗБРАНИТЕ КЛЕТКИ БЯХА СТИМУЛИРАНИ С 5 %АРК9. ТОВА ПОКАЗВА, ЧЕ ЗА РАЗВИТИЕТО НА ЧОВЕШКИТЕ МЕГАКАРИОЦИТИ ЕНЕОБХОДИМА АКТИВНОСТ, КОЯТО ВЗАИМОДЕЙСТВА С Mpl - X / ПРЕДПОЛАГАЕМMpl ЛИГАНД/ И ПОКАЗВА, ЧЕ Mpl ЛИГАНДА ПРИСЪСТВА В САМАТА АРК9. ПО-НАНАТЪК БЕШЕ ПОКАЗАНО, ЧЕ Mpl ЛИГАНДНАТА АКТИВНОСТ, НЕОБХОДИМАЗА РАЗВИТИЕТО НА ЧОВЕШКИТЕ МЕГАКАРИОЦИТИ ПРИСЪСТВА В АРК9. АРК9/135 ml/ БЕШЕ РАЗРЕДЕНА 6 ПЪТИ СЪС СРЕДА ISCOVE И ПУСНАТА ПРЕЗ Мр1-ХАФИНИТЕТНА КОЛОНА. НЕСВЪРЗАНИЯТ МАТЕРИАЛ БЕШЕ СЪБРАН ИКОНЦЕНТРИРАН ДО ОРИГИНАЛНИЯ ОБЕМ ОТ НАЧАЛОТО НА ИЗСЛЕДВАНЕТО.СВЪРЗАНИЯТ МАТЕРИАЛ БЕШЕ ОТМИТ/ЕЛЮИРАН/ С 10 ml 1М NaCI И 20 % ОТ ТОВАКОЛИЧЕСТВО БЕШЕ ДИАфИЛТРИРАНО И КОНЦЕНТРИРАНО 4 ПЪТИ. CD-34 -ИЗБРАНИТЕ КЛЕТКИ, ИНКУБИРАНИ САМО В КУЛТУРАЛНА СРЕДА НЕ СЕРАЗВИВАТ ДО МЕГАКАРИОЦИТИ. КЛЕТКИТЕ ИНКУБИРАНИ В 5 % АРК9 /СЪЩАТАКАТО ТАЗИ ПУСНАТА ПРЕЗ КОЛОНАТА/ СЕ РАЗВИВАТ ДО 48 ± 8 МЕГАКАРИОЦИТАНА СЪД. КЛЕТКИТЕ, ИНКУБИРАНИ В 10 % ОТ НЕСВЪРЗАНИЯТ МАТЕРИАЛ НЕ СЕРАЗВИВАТ ДО МЕГАКАРИОЦИТИ. КЛЕТКИТЕ, ИНКУБИРАНИ В 10 % ОТ ОТМИТИЯМАТЕРИАЛ /ЕЛУАТА/ СЕ РАЗВИВАТ ДО 120 ±44 МЕГАКАРИОЦИТА НА СЪД. ИДВЕТЕ АКТИВНОСТИ - ТАЗИ НА ПЪРВОНАЧАЛНАТА АРК9, КОЯТО Е ПУСНАТАПРЕЗ КОЛОНАТА И ТАЗИ НА ЕЛУАТА СЕ ИНХИБИРАТ ПРАКТИЧЕСКИ НАПЪЛНО ОТ5 ml Mpl-X. -65- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ПРИМЕР 3 ТРАНСФЕКЦИЯ НА МИШИ ИЛИ ЧОВЕШКИ Mpl РЕЦЕПТОР В МИША КЛЕТЪЧНАЛИНИЯ А. МИШИ Мр1 РЕЦЕПТОР ЦЯЛАТА ДЪЛЖИНА НА кДНК НА МИШИЯ Mpl РЕЦЕПТОР БЕШЕ СУБКЛОНИРАНА ВЕКСПРЕСИОНЕН ВЕКТОР, СЪДЪРЖАЩ ТРАНСКРИПЦИОНЕН ПРОМОТОР,ПРОИЗХОЖДАЩ ОТ ДЪЛГИТЕ ТЕРМИНАЛНИ ПОВТОРИ /LTR/ НА MOLONEY МИШИСАРКОМА ВИРУС. 5 цд ОТ ТОЗИ ВЕКТОР И 1 цд ОТ МАРКЕРЕН ПЛАЗМИД pWLNeoБЯХА КО-ЕЛЕКТРОПОРИРАНИ В IL-3 ЗАВИСИМА МИША КЛЕТЪЧНА ЛИНИЯ /32D, © КЛОН 23, GREENBERGER ЕТ AL., PNAS 80:2931-2936 (1983)/. КЛЕТКИТЕ БЯХАКУЛТИВИРАНИ 5 ДНИ, ЗА ДА СЕ ВЪЗСТАНОВЯТ ОТ ПРОЦЕДУРАТА, СЛЕД КОЕТОБЯХА ИНКУБИРАНИ В СЕЛЕКТИВНА СРЕДА, СЪДЪРЖАЩА 800 ng/ml GENETICIN /G418, SIGMA/ И 1 ng/ml МИШИ IL-3. ОЦЕЛЕЛИТЕ КЛЕТКИ БЯХА РАЗДЕЛЕНИ НАГРУПИ ОТ ПО 2 х 105 КЛЕТКИ И БЯХА КУЛТИВИРАНИ ДОКАТО БЕШЕ ПОЛУЧЕНАПОПУЛАЦИЯ, КОЯТО МОЖЕ ДА БЪДЕ ИЗСЛЕДВАНА ПО-НАТАТЪК. ШЕСТПОЛУЛАЦИИ БЯХА ИЗСЛЕДВАНИ ЗА ПОВЪРХНОСТНА ЕКСПРЕСИЯ НА Мр1РЕЦЕПТОР ЧРЕЗ FACS АНАЗИЗИ /FACS - СОРТИРАНЕ НА ФЛУОРЕСЦЕНТНОАКТИВИРАНИ КЛЕТКИ/, С ПОМОЩТА НА ПОЛИКЛОНАЛЕН ЗАЕШКИ АНТИГЕНЕНСЕРУМ. ЕДНА ОТ КОЛОНИИТЕ БЕШЕ ИЗБРАНА ЗА FACS АНАЛИЗ ЧРЕЗ СЪЩИЯАНТИГЕНЕН СЕРУМ. КЛОНОВЕ ОТ ЕДИНИЧНИ КЛЕТКИ ОТ РОДИТЕЛСКАТА © КЛЕТЪЧНА ЛИНИЯ БЯХА ИЗБРАНИ ЧРЕЗ КУЛТИВИРАНЕ В 10 % АРК9 И GENETICIN. СЛЕД СЕЛЕКЦИЯТА В АРК9 ЗА 35 ДНИ КЛЕТКИТЕ БЯХА ПОДДЪРЖАНИ В 1 ng/mlМИШИ IL-3 . ЕДИН ОТ СУБКЛОНОВЕТЕ 1.А6.1 БЕШЕ ИЗПОЛЗВАН ЗА РАБОРА. ЧОВЕШКИ Mpl РЕЦЕПТОР ЦЯЛАТА ДЪЛЖИНА НА СЕКВЕНЦИЯТА НА ЧОВЕШКИЯ Mpl РЕЦЕПТОР /VIGON, I.ET.AL.PNAS 89: 5640-5644 (1992)/. БЕШЕ СУБКЛОНИРАНА В ЕКСПРЕСИОНЕНВЕКТОР, СЪДЪРЖАЩ ТРАНСКРИПЦИОННИЯ ПРОМОТОР НА MOLONEY МИШИ -66- WO 95/26746 PCT/US95/03776 CAPKOMEH ВИРУС /СЪЩИЯТ ВЕКТОР ИЗПОЛЗВАН ПРИ ПРИ МИШИЯ РЕЦЕПТОР/.ШЕСТ цд ОТ ТАКА КОНСТРУИРАНИЯ ВЕКТОР И 6 цд ОТ ИЗГРАДЕН ЕЛЕМЕНТ НААМФОТРОПИЧНАТА РЕТРОВИРУСНА ОБВИВКА /LANDAN; N.R., LITTMAN P.R.J.,VIROLOGY 66: 5110 - 5119 (1992)/ БЯХА ВНЕСЕНИ В 3 х 10® 293 КЛЕТКИ СПОМОЩТА НА СаРО КИТ ЗА ТРАНСфЕКЦИЯ ПРИ БОЗАЙНИЦИ /STRATAGENE/.ТРАНСФЕКЦИЯТА НА ТЕЗИ КЛЕТКИ БЕШЕ ИЗВЪРШЕНА СЛЕД 2 И СЛЕД 4 ДНИ. ВДЕНЯ СЛЕД ПОСЛЕДНАТА ТРАНфЕКЦИЯ 293 КЛЕТКИТЕ БЯХА КУЛТИВИРАНИЗАЕДНО С IL-3 ЗАВИС1МА МИША КЛЕТЪЧНА ЛИНИЯ /32D, КЛОН 23;GREENBERGGER ЕТ AL., PNAS 80: 2931-2936 (1983)/. СЛЕД 24 ЧАСА КЛЕТКИТЕБЯХА ОТДЕЛЕНИ И СВЪРЗАНИ С BSA ГРАДИЕНТ /РАТН-OCYTE; MILES INC./.КЛЕТКИТЕ БЯХА ПОСТАВЕНИ В 1 ng/ml МИШИ IL-3 И СЛЕД ТОВА БЯХА ИЗБРАНИЗА РАЗСТЕЖ В 20 % АРК9. КЛЕТКИТЕ БЯХА СОРТИРАНИ ПО ЕКСПРЕСИЯТА НАРЕЦЕПТОР НА КЛЕТЪЧНАТА ПОВЪРХНОСТ ЧРЕЗ FACS С ПОМОЩТА НАПОЛИКЛОНАЛЕН ЗАЕШКИ АНТИПЕПТИДЕН СЕРУМ. ТЕЗИ КЛЕТКИ ВПОСЛЕДСТВИЕ БЯХА ИЗПОЛЗВАНИ В ИЗСЛЕДВАНИЯТА. ПРИМЕР 4 1А6.1 ИЗСЛЕДВАНЕ ЗА Мр! ЛИГАНД КЛЕТКИ 1 А6.1 БЯХА ОТМИТИ ОТ КУКТУРАIL-3 И ПРЕПОСЯТИ В /1000 КЛЕТКИ 15 μΙПЪЛЕН ОБЕМ/СЪД/ В МИКРОТИТЪРНИ СЪДОВЕ ВИД TERASAK, В АЛфА МЕМ/GIBCO/, ДОПЪЛНЕНА С 10 % ФЕТАЛЕН ТЕЛЕШКИ СЕРУМ /FCS/, GENETICIN/800 цд/т1/ И 1% PEN/STREP /GIBCO/, В 1:1 СЕРИЙНИ РАЗРЕЖДАНИЯ НАПРОБИТЕ. СЛЕД 48 ЧАСА БРОЯТ НА ЖИЗНЕСПОСОБНИТЕ КЛЕТКИ БЕШЕОПРЕДЕЛЕН МИКРОСКОПСКИ. ЕДНА ЕДИНИЦА АКТИВНОСТ БЕШЕ ДЕФИНИРАНАКАТО ТОВА КОЛИЧЕСТВО АКТИВНОСТ, РЕЗУЛТАТЪТ ОТ КОЕТО Е 200ЖИЗНЕСПОСОБНИ КЛЕТКИ НА СЪД. АКТИВНОСТТА БЕШЕ ДЕФИНИРАНА КАТОТАЗИ НА Мр1 ЛИГАНД, АКО ТЯ МОЖЕ ДА БЪДЕ НАПЪЛНО БЛОКИРАНА ЧРЕЗВКЛЮЧВАНЕ НА 5 -10 цд/т! Мр1-Х В ИЗСЛЕДВАНЕТО. Мр1 ЛИГАНДНАТА -67- WO 95/26746 PCT/US95/03776 АКТИВНОСТ В АРК9 БЕ ПРИБЛИЗИТЕЛНО 4400 + 539 ЕДИНИЦИ/ml АПЛАСТИЧНАПЛАЗМА. ЕДИНИЦИТЕ Mpl ЛИДАНДНА АКТИВНОСТ СА ОПРЕДЕЛЕНИ В АРК9ИЗСЛЕДВАНЕ, ОСВЕН АКО НЕ Е ОТБЕЛЯЗАНО ДРУГО. ИЗСЛЕДВАНИЯТА С КЛЕТКИ ТРАНСфЕКТИРАНИ С ГЕН НА ЧОВЕШКИ Мр1РЕЦЕПТОР /ПРИМЕР ЗВ/ СА ПРОВЕДЕНИ ПО АБСОЛЮТНО СЪЩИЯ НАЧИН ΚΑΚΤΟС 1А6.1 КЛЕТКИ. ПРИМЕР 5 ОНАГЛЕДЯВАНЕ НА ПРИСЪСТВИЕТО НА Mpl -ЛИГАНД В АПЛАСТИЧНА С ПЛАЗМАИЛИБЕЯАОТМИШИ.КУЧЕШКИ.СВИНСКИЕкЧОВЕШКИ ИЗТОЧНИЦИ
Mpl ЛИГАНД ПРИСЪСТВА В АПЛАСТИЧНАТА ПЛАЗМА ОТ МИШИ, КУЧЕШКИ,СВИНСКИ И ЧОВЕШКИ ИЗТОЧНИЦИ /ТАБЛИЦА 2/. ПЛАЗМА БЕШЕ СЪБРАНА ОТМИШКА BDF1 ПРЕДИ ОБЛЪЧВАНЕ И 12 ДНИ СЛЕД ОБЛЪЧВАНЕТО /500 rad/.ПЛАЗМАТА БЕШЕ ТЕСТУВАНА В 1А6.1 АНАЛИЗ, КЪДЕТО ПОКАЗА 2000ЕДИНИЦИ/ml АКТИВНОСТ, КОЯТО БЕШЕ ПРАКТИЧЕСКИ НАПЪЛНО ИНХИБИРАНАОТ Mpl-X /Юид/ml/. ОБЛЪЧЕНАТА МИША ПЛАЗМА ДАДЕ ПОЛЖИТЕЛЕН РЕЗУЛТАТ ИВ ЧОВЕШКИЯ МЕГАКАРИОЦИТЕН АНАЛИЗ, КЪДЕТО ПОКАЗА АКТИВНОСТ 1833ЕДИНИЦИ/ml. ПЛАЗМА БЕШЕ СЪБРАНА ОТ КУЧЕТА ПРЕДИ ОБЛЪЧВАНЕО И 10 ДНИ С СЛЕД ОБЛЪЧВАНЕТО /450 rad/. ПЛАЗМАТА БЕШЕ ТЕСТУВАНА И В ДВАТА АНАЛИЗА1А6.1 И ЧОВЕШКИЯ МЕГАКАРИОЦИТЕН. И В ДВАТА АНАЛИЗА БЕШЕ ОТКРИТААКТИВНОСТ, КОЯТО БЕШЕ НАПЪЛНО ИНХИБИРАНА ОТ Mpl-X /Юид/ml/. ПЛАЗМАБЕШЕ СЪБРАНА ОТ ПРАСЕТА ПРЕДИ ОБЛЪЧВАНЕТО И 10 ДНИ СЛЕДОБЛЪЧВАНЕТО /650 rad/. ПЛАЗМАТА БЕШЕ ТЕСТУВАНА И В ДВАТА АНАЛИЗА -1А6.1 И ЧОВЕШКИЯТ МЕГАКАРИОЦИТЕН. И В ДВАТА АНАЛИЗА ТЯ ПОКАЗА MplЛИГАНДНА АКТИВНОСТ /КОЯТО СЕ ИНХИБИРА ОТ Mpl-X /10ид/т1/.,СЪПОСТАВИМА С ТАЗИ, УСТАНОВЕНА В АПЛАСТИЧНАТА КУЧЕШКА ПЛАЗМА. -68- WO 95/26746 PCT/US95/03776 БЕШЕ ПОДУЧЕНА SERA ОТ АПЛАСТИЧНИ ХОРА. ТОЗИ МАТЕРИАЛ БЕШЕ СЪБРАНОТ ХОРА С ТРАНСПЛАНТИРАН КОСТЕН МОЗЪК. SERA ОТ 6 ПАЦИЕНТИ БЕШЕАНАЛИЗИРАНА В 1А6.1 АНАЛИЗА, КЪДЕТО ТЯ ПОКАЗА АКТИВНОСТ 903ЕДИНИЦИ/ml, 88 % ОТ КОЯТО СЕ ДЪЛЖЕШЕ НА Mpl ЛИГАНД /КОЯТО СЕИНХИБИРА ОТ Mpl-X /10ид/т1/. СЪЩО ТАКА БЕШЕ ТЕСТУВАНА SERA ОТ 14ПАЦИЕНТИ В ЧОВЕШКИЯ МЕГАКАРИОЦИТЕН АНАЛИЗ. ТЯ ПОКАЗА ОБЩААКТИВНОСТ 941 МЕГАКАРИОЦИТНИ ЕДИНИЦИ/ml, КОЯТО БЕШЕ НАПЪЛНОИНХИБИРАНА ОТ 10ug/ml. Mpl-X. ВКЛЮЧЕНИ СА ДАННИ ЗА МИШИ IL-3, ЗА ДА СЕДЕМОНСТРИРА СПЕСИФИЧНОСТТА НА 1А6.1 АНАЛИЗА. ВЪПРЕКИ, ЧЕ ТОЗИРЕКОМБИНАНТЕН ЦИТОКИН УСИЛВА РАСТЕЖА НА КЛЕТЪЧНАТА ЛИНИЯ, ТОЙ НЕ © СЕ БЛОКИРА ОТ 10 ug/mIMpl-X. ТАБЛИЦА 2 ВИДОВЕ 1А6.1 АНАЛИЗ /ЕДИНИЦИ/ml/ ЧОВЕШКИ МЕГАКАРИОЦИТЕН АНАЛИЗ /МЕГАКАРИОЦИТНИ ЕДИНИЦИ/ml/ НОРМАЛНА МИША СРЕДА 0+/-0 + Mpl-X 0+/-0 СРЕДА 0+/-0 + Mpl-X 0+/-0 АПЛАСТИЧНА МИША 2000 0 1833 НЕ Е ПРАВЕНО НОРМАЛНА КУЧЕШКА 0+/-0 0+/-0 0+/-0 0+/-0 АПЛАСТИЧНА КУЧЕШКА 4400+/-539 0+/-0 792+/-128 0+/-0 НОРМАЛНА СВИНСКА 0+/-0 0+/-0 0+/-0 0+/-1 АПЛАСТИЧНА СВИНСКА 3866+/-1136 0+/-0 1284+/-182 10 +/-10 НОРМАЛНА ЧОВЕШКА 0+/-0 0+/-0 0+/-0 0+/-0 АПЛАСТИЧНА ЧОВЕШКА 903+/-64 0+/-0 941+/-178 0+/-0 МИШИ IL3 6000+/-565 6000+/-565 НЕ Е ПРАВЕНО НЕ Е ПРАВЕНО -69- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ПРИМЕР 6 МрГАИГАН ДА СТИМУЛИРАРАСТЕЖА HA1A6.1 КЛЕТКИ И РАЗВИТИЕТО HAЧОВЕШКИТЕ МЕГАКАРИОЦИТИ Мр1 ЛИГАНД /КОНЦЕНТРИРАН ПОНЕ 100,000 ПЪТИ СЛЕД ПРОЦЕДУРИ НА ЛЕКТИНИ АфИНИТЕТНА ХРОМАТОГРАфИЯ /ВИЖ ПРИМЕР 7/ СТИМУЛИРА РАСТЕЖА НА1А6.1 КЛЕТКИ И РАЗВИТИЕТО НА ЧОВЕШКИ МЕГАКАРИОЦИТИ ОТ CD34 -ИЗБРАНИ ПЕРИФЕРНИ КРЪВНИ КЛЕТКИ ПО ДОЗА-ЗАВИСИМ НАЧИН.АКТИВНОСТТА ОТГОВОРНА ЗА ТОВА СЕ ДЪЛЖИ НА Мр1 ЛИГАНД, ΚΑΚΤΟ Е © ПОКАЗАНО НА ФИГ. 2 И 3, СЛЕД КАТО АКТИВНОСТИТЕ И В ДВАТА НАЛИЗА МОГАТ ДА БЪДАТ НАПЪЛНО БЛОКИРАНИ A Mpl-X. СЪЩО ТАКА ИЗОБРЕТАТЕЛИТЕ ПОКАЗАХА, ЧЕ КОГАТО CD34+ ПЕРИФЕРНИКРЪВНИ КЛЕТКИ, ПРЕЧИСТЕНИ ЧРЕЗ FACS СЕ ИНКУБИРАТ С Мр1 ЛИГАНД /100ЕДИНИЦИ/ml ЗА 9 ДНИ В СЛУЧАЯ/ ТЕ СЕ РАЗВИВАТ ВЪВ ФЕНОТИПНО НОРМАЛНИ,ЗРЕЛИ МЕГАКАРИОЦИТИ. ТАКА СЕ УСТАНОВЯВА, ЧЕ ПРЕЧИСТЕНИЯ Мр1 ЛИГАНДОКАЗАВА СЪЩИЯ ЕФЕКТ ВЪРХУ МЕГАКАРИОЦИТИТЕ, КАКЪВТО ИМАНЕОБРАБОТЕНАТА АРК9. В ДОПЪЛНЕНИЕ В ТОЗИ ЕКСПЕРИМЕНТ БЯХАИЗПОЛЗВАНИ ПРЕЧИСТЕНИ СО34+КЛЕТКИ /100 % CD34-W ЗА СЪПОСТАВКА СС034-ИЗБРАНИТЕ КЛЕТКИ, КОИТО СА ОКОЛО 30-50 % CD34+. ПРИМЕР 7 ПРЕЧИСТВАНЕ НА КУЧБЦЖИ Мр1 ЛИГАНД
LPE3JOME БЯХА ПРЕЧИСТЕНИ БЕЛТЪЦИТЕ 25 kd И 31 kd, КОИТО ПОКАЗВАТ АКТИВНОСТ,ОЧАКВНА ЗА ЛИГАНДА НА Мр1 РЕЦЕПТОРА. ТЕЗИ БЕЛТЪЦИ БЯХА ПРЕЧИСТЕНИ -70- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ОТ ПЛАЗМА НА ОБЛЪЧЕНИ КУЧЕТА ПО СХЕМА, ВКЛЮЧВАЩА АГЛУТИНИН ОТПШЕНИЧНИ ЗАРОДИШИ АфИНИТЕТНА ХРОМАТОГРАфИЯ, Мр1 РЕЦЕПТОРАфИНИТЕТНА ХРОМАТОГРАфИЯ, ЙОНООБМЕННА ХРОМАТОГРАфИЯ, ГЕЛФИЛТРАЦИОННА ХРОМАТОГРАфИЯ И С4 ОБРАТНО фАЗОАВА HPLC. ВИЖ ФИГ. 4 ,ЗА ОНАГЛЕДЯВАНЕ НА ТАЗИ СХЕМА ЗА ПРЕЧИСТВАНЕ. Мр1 ЛИГАНДНИТЕ 25 kd И31 kd БЯХА ВИСОКО ПРЕЧИСТЕНИ ДО ПРАКТИЧЕКИ ХОМОГЕННИ И БЕШЕОПРЕДЕЛЕНО, ЧЕ ТЕ СЪДЪРЖАТ АМИНО КИСЕЛИННИТЕ СЕКВЕНЦИИРАЗГЛЕДАНИ ТУК. И.МЕТОДИ А. ПРЕЧИСТВАНЕ НА ПЛАЗМА ЗАМРАЗЕНА ПЛАЗМА /ОБЩО 20 ЛИТРА/ ОТ ОБЛЪЧЕНИ КУЧЕТА /ВИЖ ПРИМЕР 1/БЕШЕ РАЗМРАЗЕНА В ТЕЧЕНИЕ НА ЕДНА НОЩ ПРИ 4 °C. РАЗМРАЗЯВАНЕТО НАГОЛЕМИТЕ БУТИЛКИ ЗАПОЧНА ПРИ СТАЙНА ТЕМПЕРАТУРА ЗА НЯКОЛКО ЧАСА,ПРЕДИ ПОСТАВЯНЕТО ИМ В СТУДЕНАТА СТАЯ. НЕРАЗТВОРИМИЯ МАТЕРИАЛБЕШЕ ОТСТРАНЕН ЧРЕЗ ЦЕНТРОФУГИРАНЕ ЗА 4 ЧАСА ПРИ 11.000 хд. ПЛАЗМАТАБЕШЕ РАЗРЕДЕНА С РАЗТВОР НА ФОСФАТЕН БУФЕР, pH 7.3, СЪДЪРЖАЩ 0.01 %НАТРИЕВ АЗИД /PBS/АЗИД/, И ФИЛТРИРАНА ПРЕЗ 1.2 цт ФИЛТЪР. РЕЗУЛТАТЪТОТ ТАЗИ ПРОЦЕДУРА НА ПРЕЧИСТВАНЕ БЕШЕ ПРИБЛИЗИТЕЛНО ДВА ПЪТИ © КОНЦЕНТРИРАНЕ НА ИЗХОДНИЯ МАТЕРИАЛ. Б. АГЛУТИНИН ОТ ПШЕНИЧЕНИ ЗАРОДИШИ АФИНИТЕТНА ХРОМАТОГРАФИЯ ВСИЧКИ ОПЕРАЦИИ БЯХА ПРОВЕДЕНИ ПРИ 4 °C. ПРЕЧИСТЕНАТА ПЛАЗМА/РАЗДЕЛЕНА В ДВЕ ПРОБИ/ БЕШЕ ПУСНАТА ПРЕЗ КОЛОНА С ИМОБИЛИЗИРАНАГЛУТИНИН ОТ ПШЕНИЧЕНИ ЗАРОДИШИ /1 ЛИТЪР, 10 х 12 CM, EYLABORATORIES/, КАЛИБРИРАНА С PBS/АЗИД. СЛЕД КАТО ПРЕМИНАХА ПРОБИТЕНЕСВЪРЗАНИЯ МАТЕРИАЛ БЕШЕ ОТМИТ С PBS/АЗИД, С ПОСЛЕДВАЩО -71- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ОТМИВАНЕ C 0.5 M NaCI В 20 mM TRIS-HCI, pH 8. Mpl ЛИГАНДНАТА АКТИВНОСТ,СВЪРЗНА B WGA КОЛОНАТА БЕШЕ ЕЛЮИРАНА С 0.35 М N-АЦЕТИЛГЛЮКОЗАМИН/GIcNAc/, 0.5 М NaCI, 20 mM TRIS-HCI, pH 8. В ИЗТЕКЛИТЕ ИАИ ОТМИТИТЕФРАКЦИИ НЕ БЕШЕ УСТАНОВЕНА Mpl АИГАНДНА АКТИВНОСТ. В. Mpl-Х РЕЦЕПТОР АФИНИТЕТНА ХРОМАТОГРАФИЯ РАЗТВОРИМИЯТ Mpl РЕЦЕПТОР /Mpl-Х/, КОЙТО БЕШЕ ИЗПОЛЗВАН,СЪОТВЕТСТВА НА ЦЕЛИЯ ИЗВЪНКЛЕТЪЧЕН ДОМЕН НА Mpl РЕЦЕПТОРА МИНУСТРИПТОФАН В ПОЗИЦИЯ 483 /ВИЖ VIGON, ЕТ AL, 8:2607 - 2615 (1993)/. ЗА ДА © СЕ ОПТИМИЗИРА СВЪРЗВАНЕТО НА Mpl ЛИГАНДА КЪМ Mpl-Х РЕЦЕПТОРАФИНИТЕТНАТА КОЛОНА КОЛИЧЕСТВОТО, ЕЛЮИРАНО ОТ WGA БЕШЕКОНЦЕНТРИРАНО С ПОМОЩТА НА МЕМБРАНЕН УЛТРАфИЛТЪР /ДО 10,000МОЛЕКУЛНО ТЕГЛО, YM-10, AMICON/ И NaCI, ДОВЕДЕН ДО 0.2 М ЧРЕЗПОДХОДЯЩИ РАЗРЕЖДАНИЯ. КОНЦЕНТРИРАНОТО WGA КОЛИЧЕСТВО БЕШЕПУСНАТО ПРЕЗ 20 ml m-Mpl-X (РАЗТВОРИМ МИШИ Mpl РЕЦЕПТОР)/СИВгАКТИВИРАНА SEPHAROSE КОЛОНА /2,6 х 4.2 СМ., 1,5 mg m-Mpl-X НА ml СМОЛА/ПРИ СКОРОСТ НА ПОТОКА 0.9 ml/ МИН. КОЛОНАТА БЕШЕ ПРОМИТА С 40 mlPBS/АЗИД ПРИ 1,5т1/МИН, ПОСЛЕДВАНО ОТ СОЛЕВО ОТМИВАНЕ С 10 mM TRIS-HCI, 1М NaCI, 1тМ CHAPS, pH 8.0. СЛЕД ТОВА КОЛОНАТА БЕШЕ ЕЛЮИРАНА С 20mM CAPS, 1М NaCI, 5тМ CHAPS, pH 10.5. СЪОТВЕТНИТЕ ФРАКЦИИ БЯХА 0 СЪБРАНИ. КЪМ ВСЯКА ОТ ФРАКЦИИТЕ БЕШЕ ПРИБАВЕН TRIS ЗАНЕУТРАЛИЗАЦИЯ НА pH. ЕЛУАЦИОННИЯ ПРОФИЛ НА Mpl-Х РЕЦЕПТОРАФИНИТЕТНАТА КОЛОНА, ИЗСЛЕДВАН ЧРЕЗ SDS-PAGE И АДСОРБЦИЯ ПРИ 280пт ПОКАЗАВА РАНЕН БЕЛТЪЧЕН ПИК ВЪВ ФРАКЦИИ 1-4, И ПО-ГОЛЯМА MplЛИГАНДНА АКТИВНОСТ ЕЛЮИРАНА СЛЕД ФРАКЦИЯ 5. Г. МОНО-О АНИОН ОБМЕННА ХРОМАТОГРАФИЯ НАЙ-ПРЕЧИСТЕНИТЕ ФРАКЦИИ ОТ НЯКОЛКО Mpl-Х РЕЦЕПТОР АфИНИТЕТНИ -72- WO 95/26746 PCT/US95/03776 КОЛОНИ БЯХА ОБЕДИНЕНИ, КОНЦЕНТРИРАНИ И ДИАфИЛТРИРАНИ СРЕЩУ 20 тМTRIS-HCI, 5тМ CHAPS, pH 8.7 ДО КРАЕН ОБЕМ 58.5 ml. ЧРЕЗ АБСОРБЦИЯ ПРИ 280пт БЕШЕ УСТАНОВЕНО, ЧЕ БЕЛТЪЧНАТА КОНЦЕНТРАЦИЯ В СРЕДАТА Е 0.12 mg/ml/ПРИБЛИЗИТЕЛНО 7 mg БЕЛТЪК/. ТОВА КОЛИЧЕСТВО БЕШЕ ПУСНАТО ПРИ0.5т1/МИН ПРЕЗ MONO Q HR 5/5 КОЛОНА /PHARMACIA/, КАЛИБРИРАНА С 20 тМTRIS-HCI, 5 тМ CHAPS, pH 8.7. КОЛОНАТА БЕШЕ ЕЛЮИРАНА С ЛИНЕЕНГРАДИЕНТ ОТ 0,36 М NaCI В СЪЩИЯ БУфЕР ПОВЕЧЕ ОТ 27 МИНУТИ. СЛЕД ТОВАКОЛОНАТА БЕШЕ ПРОМИТА С 6 МИНУТЕН ГРАДИЕНТ ОТ 0.54 М NaCI И НА КРАЯСТЪПАЛОВИДНО ОТМИТА С 0,9 М NaCI. БЯХА СЪБРАНИ ФРАКЦИИ ОТ 1 ml. С ЕЛУАЦИОННИЯТ ПРОФИЛ НА MONO Q КОЛОНАТА ПОКАЗВА, ЧЕ В ИЗТЕКЛИТЕПРЕЗ КОЛОНАТА И ОТМИТИТЕ ФРАКЦИИ НЕ СЕ ОТКРИВА Мр1 ЛИГАНД. МНОГООТ Мр1 ЛИГАНДНАТА АКТИВНОСТ СЕ ПОЯВЯВА ВЪВ ФРАКЦИИ 5-7, В НАЧАЛНИТЕСТАДИИ НА NaCI ГРАДИЕНТА. РАМО НА АКТИВНОСТ СЕ НАБЛЮДАВА ВЪВФРАКЦИИ 8-10, ПОСЛЕДВАНО ОТ ВТОРИ ГОЛЯМ ПИК , ВКЛЮЧВАЩ ФРАКЦИИ 11- 15. В АКТИВНИТЕ ФРАКЦИИ СЕ ВИЖДА ЯСНА 25 led ИВИЦА ПРИ SDS-PAGE/НЕРЕДУКЦИОННА/. ИНТЕНЗИВНОСТТА НА ИВИЦАТА СЪОТВЕТСТВА НА Мр1ЛИГАНДНАТА АКТИВНОСТ ВЪВ ФРАКЦИИТЕ. ИВИЦАТА ЛИПСАВАШЕ ВЪВФРАКЦИИ 3 И 4 /НЯМА АКТИВНОСТ/. ТЯ БЕШЕ ЗНАЧИТЕЛНА ВЪВ ФРАКЦИИ 5 И 6/ПИК НА АКТИВНОСТ НА 1А6.1/ И ПОДОБНА ИНТЕНЗИВНА ИВИЦА ПРИСЪСТВАШЕВЪВ ФРАКЦИИ 11-14 /ПИК НА АКТИВНОСТ НА 1А6.1/. ИВИЦАТА Е СЛАБА ВЪВФРАКЦИИ 15 И 16, В СЪОТВЕТСТВИЕ СЪС ЗНАЧИТЕЛНО НИСКАТА АКТИВНОСТ НАФРАКЦИЯ 16. Д. ЕКСПЕРИМЕНТИ НА ГЕЛНО ЕЛЮИРАНЕ ЕКСПЕРИМЕНТИТЕ НА ГЕЛНО ЕЛЮИРАНЕ БЯХА ПРОВЕДЕНИ С АЛИКВОТНИТЕЧАСТИ НА MONO Q ФРАКЦИИ 5 И 6 ИЛИ MONO Q ФРАКЦИИ 13 И 14. ЗА ТЕЗИ -73- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ЕКСПЕРИМЕНТИ ФРАКЦИИ 5 И 6 /6 μΙ ВСЯКА/ ИЛИ 13 И 14 /7,5 μΙ ВСЯКА/ БЯХАСМЕСЕНИ СЪС СТАНДАРТЕН SDS-PAGE БУФЕР /НЕРЕДУЦИРАЩ/ И ВНЕСЕНИ В12 % SDS ТЕЛОВЕ. СЛЕД ЗАВЪРШВАНЕ НА ЕЛЕКТРОФОРЕЗАТА ИВИЦИТЕ, КОИТОПРЕДСТАВЛЯВАХА ИНТЕРЕС БЯХА ИЗРЯЗАНИ /1 mm/ И ПОЛУЧЕНИТЕ СЛОЕВЕБЯХА НАРЯЗАНИ НА МАЛКИ ПАРЧЕТА С БРЪСНАРСКО НОЖЧЕ. ТЕЗИ ПАРЧЕТАБЯХА СЛОЖЕНИ В 1.5 ml МИКРОЕПРУВЕТКИ СЪДЪРЖАЩИ 0.5 ml PBS /5т CHAPS/И БЯХА РАЗКЛАЩАНИ ВНИМАТЕЛНО В ПРОДЪЛЖЕНИЕ НА ЕДНА НОЩ ПРИ 4 ° С.НА СЛЕДВАЩИЯТ ДЕН ЕПРУВЕТКИТЕ БЯХА ЦЕНТРОФУГИРАНИ ЗА КРАТКО,АЛИКВОТНАТА ЧАСТ БЕШЕ ОТДЕЛЕНА И ПРОБАТА БЕШЕ ДИАфИЛТРИРАНАСРЕЩУ СРЕДА ISCOVE, КЪМ КОЯТА КАТО НОСЕЩ БЕЛТЪК БЕШЕ ДОБАВЕН BSA.ДИАФИЛТРИРАНИТЕ ПРОБИ БЯХА ИЗСЛЕДВАНИ. РЕЗУЛТАТИТЕ ПОКАЗАХА НАЛИЧИЕ НА ДВА ПИКА НА Мр1 ЛИГАНДНА АКТИВНОСТ.ЕДИНИЯТ ПИК СЪОТВЕТСТВА НА 25 kd УЧАСТЪКА В ТЕЛА, А ВТОРИЯ ПИК НА Мр1ЛИГАНДНА АКТИВНОСТ Е ОТКРИТ В 31 kd УЧАСТЪКА. Е, SUPERDEX200 ГЕЛНА ФИЛТРАЦИЯ ФРАКЦИИ 13-16 ОТ MONO Q АНИОН ОБМЕННАТА КОЛОНА, ΚΑΚΤΟ И ДВЕАНАЛОГИЧНИ ФРАКЦИИ ОТ ВТОРО РАЗДЕЛЯНЕ С MONO Q БЯХА СЪБРАНИ ИКОНЦЕНТРИРАНИ С ПОМОЩТА НА МЕМБРАНЕН УЛТРАфИЛТЪР /CENTRICON-10, © AMICON/. БЕШЕ ДОБАВЕН НАТРИЕВ ДОДЕЦИЛ СУЛФАТ В КРАЙНАКОНЦЕНТРАЦИЯ 0,1 % И ПРОБАТА БЕШЕ ИНЖЕКТИРАНА В SUPERDEX 200 HR10/30 /PARMACIA/ КОЛОНА. КОЛОНАТА БЕШЕ КАЛИБРИРАНА С 50 mMTRIS-HCI,0.1 % НАТРИЕВ ДОДЕЦИЛ СУЛФАТ, pH 7,5 ПРИ СКОРОСТ НА ПОТОКА 0.3 ml/МИН,ПРИ СТАЙНА ТЕМПЕРАТУРА. НА ВСЯКА МИНУТА БЯХА СЪБИРАНИ ФРАКЦИИ.РЕЗУЛТАЪТ Е, ЧЕ ПОВЕЧЕТО ОТ БЕЛТЪКА ОТ ПРОБИТЕ ЕЛЮИРА ВЪВ ФРАКЦИИ32-40, ДОКАТО Мр1 ЛИГАНДНАТА АКТИВНИОСТ Е УСТАНОВЕНА ВЪВ ФРАКЦИИ 42- 46. SDS-PAGE АНАЛИЗИТЕ НА ФРАКЦИИТЕ ПОКАЗВАТ ЯСНА 25 kd ИВИЦА В активните Фракции. -74- WO 95/26746 PCT/US95/03776
Ж. C4 ОБРАТНО ФАЗОВА HPLC SUPERDEX200 ФРАКЦИИ 43-46 СЪБРАНИ ЗАЕДНО ИЛИ ФРАКЦИЯ 42 ВЗЕТАОТДЕЛНО БЯХА КОНЦЕНТРИРАНИ С ПОМОЩТА НА МЕМБРАНЕН УЛТРАфИЛТЪР/MICROCON-Ю, AM1CON/. КОНЦЕНТРИРАНИТЕ КОЛИЧЕСТВА БЯХА ПУСНАТИПООТДЕЛНО ПРЕЗ 1 х 100 mm С4 ОБРАТНО ФАЗОВА MICROBORE КОЛОНА/SYNCHROPAC RP-4/. КОЛОНАТА БЕШЕ СТАНДАРТИЗИРАНА С 0.04 % TFA ВЪВВОДА /БУФЕР А/; БУфЕР Б БЕШЕ 0.035 % TFA В 80 % АЦЕТОНИТРИЛ. СЛЕДИНЖЕКТИРАНЕ НА ПРОБАТА БЕШЕ НАПРАВЕН ЛИНЕЕН ГРАДИЕНТ ОТ 45% ЗАПОВЕЧЕ ОТ 4 МИН., ПОСЛЕДВАН ОТ ЛИНЕЕН ГРАДИЕНТ ОТ 75 % ЗА ПОВЕЧЕ ОТ40 МИН. СКОРОСТА НА ПОТОКА БЕШЕ 75 μΙ/МИН. РЕЗУЛТАТИТЕ ОТПРЕЧИСТВАНЕТО НА ФРАКЦИЯ 42 СА ПОКАЗАНИ НА фИГ. 5. ЯСНИ ПИКОВЕ НАМр1 ЛИГАНДНА АКТИВНОСТ СА ВИДИМИ ВЪВ ФРАКЦИИ 21-23. ТЕЗИ ФРАКЦИИБЯХА АНАЛИЗИРАНИ В 14 % ПОЛИАКРИЛАМИДЕН ГЕЛ ПРИ РЕДУЦИРАЩИ ИНЕРЕДУЦИРАЩИ УСЛОВИЯ. ФРАКЦИЯ 21 БЕШЕ СЪСТАВЕНА САМО ОТ 31 kdИВИЦА, ФРАКЦИЯ 23 БЕШЕ СЪСТАВЕНА ОТ ШИРОКА 25 kd ИВИЦА И ФРАКЦИЯ 22СЪДЪРЖАШЕ ЕДНОВРЕМЕННО ИВИЦИТЕ НА 25 kd И 31 kd РАЙОНИТЕ. ДРУГИВАЖНИ ИВИЦИ НЕ БЯХА УСТАНОВЕНИ. ОБЪРНЕТЕ ВНИМАНИЕ, ЧЕ РАННИТЕЕКСПЕРИМЕНТИ НА РАЗТВАРЯНЕ В ГЕЛ, ПОКАЗАХА Мр1 ЛИГАНДНА АКТИВНОСТ ИВ ДВАТА РАЙОНА. ЕДИНИЧНАТА ПО-ВИСОКО МОЛЕКУЛНА ИВИЦА БЕШЕНАБЛЮДАВАНА ВЪВ ВСИЧКИ ФРАКЦИИ НА НЕРЕДУЦИРАЩИЯТ ГЕЛ, НО НЕ БЕШЕ Ф ЗАБЕЛЯЗАНА В РЕДУЦИРАЩИЯТ ГЕЛ. 3. АНАЛИЗИ НА N-КРАЙНИТЕ СЕКВЕНЦИИ НА 25 kd И 31 kd АИГАНДИ АНАЛИЗЪТ НА N-КРАЙНИТЕ СЕКВЕНЦИИ БЕШЕ ПРОВЕДЕН С С4 RP-HPLCФРАКЦИИТЕ, СЪДЪРЖАЩИ АКТИВНОСТ. СЕКВЕНЦИИТЕ ОПРЕДЕЛЕНИ ЗА ТЕЗИБЕЛТЪЦИ СА ПОСОЧЕНИ ПО-ГОРЕ. В ДОПЪЛНЕНИЕ КЪМ ГЛАВНАТА СЕКВЕНЦИЯ,СЪОТВЕТСТВАЩА НА 25 kd ИВИЦАТА /НАЙ-МАЛКО 90 % ОТ ПРОБАТА/ ПРИСЕКВЕНИРАНЕ БЯХА ОТКРИТИ ДВЕ МАЛКИ СЕКВЕНЦИИ /КОИТО СА СВЪРЗАНИ С -75- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ГЛАВНАТА ИВИЦА НА ЗАМЪРСЯВАНИЯТА, ОПИСАНА В ЧАСТ Е ПО-ГОРЕ/.СРАВНЕНИЕТО С ПОЗНАТИ СЕКВЕНЦИИ ПОКАЗА, ЧЕ МАЛКИТЕ СЕКВЕНЦИИ САКУЧЕШКИ ИМУНОГЛОБОЛИНОВА ТЕЖКА ВЕРИГА И КАПА ВЕРИГА. АКО Е НУЖНОКОЛИЧЕСТВОТО НА ТЕЗИ МАЛКИ ЗАМЪРСЯВАНИЯ МОЖЕ ДА БЪДЕ НАМАЛЕНОЧРЕЗ ПРИЛАГАНЕ НА СЛЕДВАЩ ЕТАП НА ПРЕЧИСТВАНЕ, КАТО ЗАПРЕДПОЧИТАНЕ Е ДРУГ ГЕЛ ФИЛТРАЦИОНЕН ЕТАП. И. СРАВНЕНИЕ НА Мр1 ЛИГАНДНИТЕ АКТИВНОСТИ В С4 ПРЕЧИСТЕНИТЕ ФРАКЦИИ ИЗЛОЖЕНИТЕ НА фИГ. 6 ДАННИ ПОКАЗВАТ, ЧЕ АКТИВНОСТИТЕ, ПРИСЪСТВАЩИВЪВ ФРАКЦИИ 22 И 23 НА С4 RP-HPLC ХРОМАТОГРАфИЯТА СА ПРАКТИЧЕСКИЕДНАКВИ. ФРАКЦИЯ 22 СЪДЪРЖАШЕ СМЕС ОТ 25 И 31 kd ИВИЦИТЕ, ДОКАТОФРАКЦИЯ 23 СЪДЪРЖАШЕ САМО ИВИЦА 25 kd. АЛИКВОТНИТЕ ЧАСТИ НА ВСЯКАФРАКЦИЯ БЯХА РАЗРЕДЕНИ 1 : 45 000. РАЗРЕДЕНИТЕ ФРАКЦИИ СТИМУЛИРАХАПОЧТИ ЕДНАКВО РАСТЕЖА НА 1А6.1. КЛЕТКИ /ФРАКЦИЯ 22, 5400 КЛЕТКИ НАСЪД; ФРАКЦИЯ 23, 6000 КЛЕТКИ НА СЪД/. РАЗРЕДЕНИТЕ ФРАКЦИИ БЯХАИНКУБИРАНИ С НАРАСТВАЩИ КОНЦЕНТРАЦИИ НА Mpl-Х. ФРАКЦИИТЕ БЯХАЕДНАКВО ЧУВСТВИТЕЛНИ КЪМ ИНХИБИРАНЕТО С Mpl-X, И ДВЕТЕ БЯХАНАПЪЛНО БЛОКИРАНИ С 7-1.4 ug/ml. ТОВА ПОКАЗВА, ЧЕ АКТИВНИТЕ БЕЛТЪЦИВЪВ ВСЯКА ОТ ФРАКЦИИТЕ СА ВИДОВЕ Мр1 ЛИГАНДИ С ЕДНАКАВА БИОЛОГИЧНА С АКТИВНОСТ. ПРИМЕР 8 СРАВНЕНИЕ МЕЖДУ Мр1 И ДРУГИ ФАКТОРИ НА МЕГАКАРИОЦИТНОТОРАЗВИТИЕ БЕШЕ ДОКЛАДВАНО, ЧЕ ГРУПА РЕКОМБИНАНТНИ ФАКТОРИ ИЛИ ОРГАНИЧНИСЪСТАВКИ, КАТО PHORBAL MYSTIRIC ACETATE /ИНА/, ВЪЗДЕЙСТВАТ ВЪРХУ -76- WO 95/26746 PCT/US95/03776 МЕГАКАРИОЦИТНИЯ РАСТЕЖ И РАЗВИТИЕ. СЪОТВЕТНО БЕШЕ ИЗСЛЕДВАНЕФЕКТА НА ТЕЗИ ФАКТОРИ ВЪРХУ CD-34-ИЗБРАНИ ПЕРИФЕРНИ КРЪВНИКЛЕТКИ. ЧОВЕШКИ РЕКОМБИНАНТЕН ИНТЕРЛЕВКИН 3 /IL-3; 1 - 2 ng/ml/; ФАКТОРНА СТВОЛОВИТЕ КЛЕТКИ /SCF, 50 ng/ml/; ИНТЕРЛЕВКИН 6 /IL-6, 25 ng/ml/;ЕРИТРОПОЕТИН /ЕРО, 1 ЕДИНИЦИ/ml/; ЛЕВКВМИЯ ИНХИБИРАЩИЯТ ФАКТОР /LIF,10 ng/ml/; ГРАНУЛОЦИТО-МАКРОфАГОВИЯ КОЛОНИЯ СТИМУЛИРАЩ ФАКТОР /GM-CSF, 25 ng/ml, AMGEN., INC./; ИНТЕРЛЕВКИН 11 /IL-11, 25 ng/ml, R-Ю SYSTEMS,MINNEAPOLIS, MN/; PHORBAL MYRISTIC ACETATE /РМА, 10 M, SIGMA/ БЯХАДОБАВЕНИ В КУЛТУРИТЕ ΚΑΚΤΟ Е ОТБЕЛЯЗАНО. БЕШЕ ИЗПОЛЗВАН Мр1 ЛИГАНД € 275 ЕДИНИЦИ/ml И АРК9 5% /РАВНО 220 ЕДИНИЦИ/ml. В КОМБИНАЦИЯ ФАКТОРИТЕ БЯХА ТЕСТВАНИ В СЪЩИТЕ КОНЦЕНТРАЦИИ, ΚΑΚΤΟ КОГАТО БЯХАИЗСЛЕДВАНИ ИНДИВИДУАЛНО. СЛЕД 8 ДНИ В КУЛТУРА КЛЕТКИТЕ БЯХАФИКСИРАНИ ДИРЕКТНО ВЪРХУ СЪДОВЕТЕ И ОЦВЕТЕНИ ЗА МЕГАКАРИОЦИТИ./п=6 СЪДА/ ИЛИ БЕШЕ ПРЕБРОЕН ПЪЛНИЯ КЛЕТЪЧЕН БРОЙ /п=3 СЪДА/.ДАННИТЕ СА ПРЕДСТАВЕНИ + СТАНДАРТНАТА ГРЕШКА НА ПРОБАТА. ФИГ. 7 ПОКАЗВА, ЧЕ ПРИ Mpl ЛИГАНДА И АРК9 ИМА НАЙ-ГОЛЯМ БРОЙМЕГАКАРИОЦИТИ НА СЪД. РЕЗУЛТАТЪТ ОТ IL-3 Е СЪЩО МЕГАКАРИЦИТНОРАЗВИТИЕ, ОСОБЕНО АКО ТОЙ Е В КОМБИНАЦИЯ С SCF. IL-6, IL-11 И ЕРОСАМОСТОЯТЕЛНО ИЗПОЛЗВАНИ ИЛИ В КОМБИНАЦИЯ С IL-3 ИМАТ МАЛЪК ЕфЕКТВЪРХУ МЕГАКАРИОЦИТНИЯ БРОЙ. РМА, LIF И GM-CSF ИМАТ СЪЩО МАЛЪК Ф ЕФЕКТ. НА ФИГ. 8 СА ДАДЕНИ ДАННИТЕ ОТ СЪЩИЯ ЕКСПЕРИМЕНТ ЗА ОБЩИЯБРОЙ КЛРТКИ НА СЪД /“КЛЕТЪЧНОСТ“/. АРК9 И Mpl ЛИГАНДА ИМАТ МАЛЪКЕФЕКТ ВЪРХУ КЛЕТЪЧНОСТТА, ДОКАТО IL-3 И SCF ИМАТ УМЕРЕН ЕФЕКТ. SCF ИIL-3 В КОМБИНАЦИЯ ИМАТ НАЙ-ГОЛЯМ ЕфЕКТ. ДАННИТЕ, ПОКАЗАНИ НА ФИГ. 7 И8 БЯХА ИЗПОЛЗВАНИ, ЗА ДА СЕ ИЗЧИСЛИ ПРОЦЕНТНОТО СЪДЪРЖАНИЕ НАМЕГАКАРИОЦИТИТЕ ЗА СЪД, ΚΑΚΤΟ Е ПОКАЗАНО НА ФИГ. 9. ВИЖДА СЕ, ЧЕФАКТОРЪТ, КОЙТО ДАВА НАЙ-ГОЛЯМ ПРОЦЕНТ МЕГАКАРИОЦИТИ НАКУЛТУРАЛЕН СЪД Е Mpl ЛИГАНДА, АКТИВНАТА СЪСТАВКА НА АРК9. ТОВАПОКАЗВА СПЕЦИФИЧНОСТТА НА Mpl ЛИГАНДА СПРЯМО МЕГАКАРИОЦИТИТЕ. -77- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ПРИМЕР 9 АКТИВНОСТТА НА Mpl ЛИГАНДА ЗА СПОМАГАНЕ РАЗВИТИЕТО НАМЕГАКАРИОЦИТИТЕ НЕ Е ЗАВИСИМА ОТ IL-3.
Mpl ЛИГАНДА СТИМУЛИРА РАЗВИТИЕТО НА ЧОВЕШКИТЕ МЕГАКАРИОЦИТИ,КОГАТО Е ИЗПОЛЗВАН КАТО ДОБАВКА КЪМ КУЛТУРАЛНАТА СРЕДА, ОПИСАНА ВПРИМЕР 2. ВЪПРЕКИ, ЧЕ IL-3 НЕ Е СЪСТАВНА ЧАСТ НА СРЕДАТА ТОЙ МОЖЕ ДАПРИСЪСТВА В ПРЕНЕБРЕЖИМО МАЛКИ КОЛИЧЕСТВА В НОРМАЛНАТА ЧОВЕШКАПЛАЗМА, ПРИСЪСТВАЩА В СРЕДАТА. ДОРИ И ДА ПРИСЪСТВА ОБАЧЕ IL-3 НЕ ЕВКЛЮЧЕН В Mpl ЛИГАНД-ИНДУЦИРАНАТА МЕГАКАРИОЦИТОПОЕЗА. ТОВА ЕПОКАЗАНО НА ФИГ. 10. ПРИ 2 ng/ml IL-3 СЪДЪРЖА АКТИНОСТ 14,900МЕГАКАРИОЦИТНИ ЕДИНИЦИ В АНАЛИЗА НА ЧОВЕШКИ МЕГАКАРИОЦИТИ. ТАЗИАКТИВНОСТ СЕ ИНХИБИРА 97 % С AHTH-IL-3 /3.3 ug/ml, GENZYME,CAMBRIDGE,МА/. ПРИ 8203 МЕГАКАРИОЦИТНИ ЕДИНИЦИ/ml Mpl ЛИГАНДА НЕ СЕИНХИБИРА ОТ AHTH-IL-3. ПРИМЕР 10 АНАЛИЗ НА СВИНСКИЯ Mpl АИГАНД I. РЕЗЮМЕ БЕЛТЪЦИ ОТ ОБЛЪЧЕНА СВИНСКА ПЛАЗМА С Mpl ЛИГАНДНА АКТИВНОСТ БЯХАХАРАКТЕРИЗИРАНИ ЧРЕЗ WGA АфИНИТЕТНА ХРОМАТОГРАфИЯ, Mpl РЕЦЕПТОРАфИНИТЕТНА ХРОМАТОГРАФИЯ, ЙОНООБМЕННА ХРОМАТОГРАфИЯ И С4ОБРАТНОФАЗОВА HPLC. АКТИВНОСТТА БЕШЕ ХАРАКТЕРИЗИРАНА СЪЩО ЧРЕЗЕЛЮИРАНЕ ОТ ПАРЧЕТА НАТРИЕВ ДОДЕЦИЛ-СУЛфАТ-ПОЛИАКРИЛАМИДЕН ГЕЛ. -78- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ХРОМАТОГРАФИЯ КОМЕНТАР 4.4 х 10® WGA АфИНИТЕТНА КОЛОНА единици внесени 3.4x10® единици получени 2.7x10® Мр1 КОЛОНА единици внесени 2.4x10® единици получени 2.4 х 10® MONO S ЙОНООБМЕННА КОЛОНАрН6.0 единици внесени 4.4x10® единици получени ЕКСПЕРИМЕНТИ НА ЕЛЮИРАНЕОТ ГЕЛ ЯСНО ОПРЕДЕЛЕНИ ДВЕАКТИВНОСТИ, ЕДНАТА ПРИ ПРИБЛИЗИТЕЛНО 18 kd, ДРУГАТАПРИ ПРИБЛИЗИТЕЛНО 28 kd ПРИМЕРИ
КЛОНИРАНЕ НА ЧОВЕШКИЯТ Мр1 ЛИГАНД, ЧОВЕШКИ MGDF СЛЕДВА ОПИСАНИЕ НА ДВА ПОДХОДА: I. ПЪРВИ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЕН ПОДХОД ЗА КЛОНИРАНЕ А. СЪЗДАВАНЕ НА ПРОБА ЧОВЕШКИ MGDF. НА БАЗАТА НА АМИНО КРАЙНАТА СЕКВЕНЦИЯ НА КУЧЕШКИЯ ПРОТЕИН БЯХАПРОЕКТИРАНИ НЯКОЛКО PCR ЗАЧАТЪКА. ЗА НАМНОЖАВАНЕТО НА MGDF ГЕНА -79- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ОТ ЧОВЕШКА ГЕНОМНА ДНК БЯХА ИЗПОЛЗВАНИ ИЗПОЛЗВАНИ РАЗЛИЧНИДВОЙКИ ЗАРОДИШИ. СЛЕД 40 ЦИКЪЛА НА НАМНОЖАВАНЕ ЧРЕЗ ИЗПОЛЗВАНЕТОНА СМИСЛЕНИТЕ ЗАЧАТЪЦИ 5’ GCN CCN GCN TGY GA 3’ /СЕКВЕНЦИЯ No 4/,КОДИРАЩИ ПЪРВИТЕ 5 АМИНО КИСЕЛИНИ ОТ КУЧЕШКИЯ БЕЛТЪК /СЕКВЕНЦИЯNo 1/ И НЕСМИСЛЕНИЯ ЗАЧАТЪК 5’ GCA RTG YAA CAC RTG NGA RTC 3’/СЕКВЕНЦИЯ No 5/, КОДИРАЩ АМИНО КИСЕЛИНИ 12 - 21 НА СЕКВЕНЦИЯ No 1,PCR ПРОДУКТЪТ БЕШЕ ПОСТАВЕН В 2.0 % АГАРОЗЕН ГЕЛ В ТВЕ БУФЕР. ИВИЦАТА 63 бд БЕШЕ ОТРЯЗАНА ОТ АГАРОЗНИЯ ГЕЛ И НАМНОЖЕНА ОТНОВОЧРЕЗ СЪЩАТА ГРУПА ЗАРОДИШИ. PCR ПРОДУКТЪТ БЕШЕ КЛОНИРАН В PCR IIВЕКТОР /INVOTROGEN, SAN DIEGO/. ГРУПА КОЛОНИИ БЯХА ПРЕТЪРСЕНИ ЧРЕЗДНК СЕКВЕНИРАНЕ. ПЛАЗМИДНАТА ДНК, КОДИРАЩА БЕЛТЪК, ПОДОБЕН НАКУЧЕШКИЯ MGDF БЕЛТЪК, БЕШЕ ИЗПОЛЗВАНА КАТО ИЗТОЧНИК ЗА СЪЗДАВАНЕНА РАДИОАКТИВНА ПРОБА ЗА ПРЕТЪРСВАНЕ НА ДНК БИБЛИОТЕКА. АМИНОКИСЕЛИННАТА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ, КОДИРАНА ОТ ГЕННИЯ ФРАГМЕНТ ЕСЛЕДНАТА: АЛА-ПРО-ПРО-АЛА-ЦИС-АСП-ЛЕВ-АРГ-ВАЛ-ЛЕВ-СЕР-ЛИЗ-ЛЕВ- ЛЕВ-АРГ-АСП-СЕР-ХИС-ВАЛ-ЛЕВ-ХИС /СЕКВЕНЦИЯ No 6/. АГАРОЗНАТА ИВИЦА, СЪДЪРЖАЩА ЧОВЕШКИ MGDF БЕШЕ ИЗПОЗВАНА ЗАСЪЗДАВАНЕ НА ПРОБА ЧРЕЗ ГОРЕЩА PCR. 100 μΙ ОТ ТИПИЧНАТА PCR РЕАКЦИЯСЪДЪРЖАШЕ СЛЕДНИТЕ СЪСТАВКИ: МАТРИЧНА ДНК5’ ЗАРОДИШ /СЕКВ. No 4/3’ ЗАРОДИШ /СЕКВ. No 5/10 X БУФЕР дАТф/0.1 тМ/дТТф/10 тМ/д ГТФ /10 тМ/ 2-3μΙ 1 μΙ, 20 рмола 1 μΙ, 20 рмола10 μΙ 2 μΙ2μΙ2 μΙ 80- WO 95/26746 PCT/US95/03776 2 μΙ 5 μΙ 5 μΙ 0,5 μΙ, 2,5 ЕДИНИЦИ 77 μΙ д ЦТФ /0.1 тМ/д ЦТф, р 32/10 uC/ul/дАТф, р 32/10 uC/ui/Tag ДНК ПОЛИМЕРАЗАВОДА ПЪЛЕН ОБЕМ 100 μΙ УСЛОВИЯТА ЗА НАМНОЖАВАНТО БЯХА СЛЕДНИТЕ: © НАЧАЛНО ЗАГРЯВАНЕ 94 °C, 2 МИН. ТЕМПЕРИРАНЕ 53 ° С , 30 СЕК. УДЪЛЖАВАНЕ 72 ° С , 30 СЕК. ДЕНАТУРАЦИЯ 940 С , 30 СЕК. БЯХА ПРОВЕДЕНИ 40 ЦИКЪЛА НА НАМНОЖАВАНЕ В PERKIN ELMER GENE AMP.SYSTEM 9600. ПРОДУКТА БЕШЕ ПРЕЧИСТЕН ЧРЕЗ ПРОПУСКАНЕ ПРЕЗ НАПОРНА КОЛОНА/STRATAGENE, SAN DIEGO/. ПРОБА ОТ 1 μΙ БЕШЕ ПРЕБРОЕНА ВСЦИНТИЛАЦИОНЕН БРОЯЧ. ПРОБИТЕ СЪДЪРЖАЩИ ОТ 1 ДО 3 МИЛИОНАИМПУЛСА ЗА ml БЯХА ДОБАВЕНИ КЪМ ХИБРИДИЗАЦИОННАТА СМЕС.
Q Б. СЪЗДАВАНЕ НА БИБЛИОТЕКА ОТ ЕМБРИОНАЛЕН ЧЕРЕН ДРОБ ОТ ЛАБОРАТОРИИТЕ CLONTECH БЕШЕ ЗАКУПЕНА ЧОВЕШКА ЕМБРИОНАЛНАЧЕРНОДРОБНА ПОЛИ А* РНК. ЗА СИНТЕЗАТА НА ДНК БЕШЕ ИЗПОЛЗВАНАОКОЛО 4 μθ РНК. КАТО ЗАРОДИШ БЕШЕ ИЗПОЛЗВАН ПРОИЗВОЛЕН ОЛИГОХЕКСАМЕР 5’ GTA CGC GTT СТА GAN ΝΝΝ ΝΝΤ 3’ /СЕКВЕНЦИЯ No 7/,СЪДЪРЖАЩ X Ьа I МЯСТО. -81- WO 95/26746 PCT/US95/03776
ЗА ИЗГРАЖДАНЕТО НА ДВОЙНОВЕРИЖНАТА ДНК БЕШЕ ИЗПОЛЗВАН МЕТОДЪТGIBCO-BRL. КЪМ ДВОЙНОВЕРИЖНАТА кДНК БЕШЕЛИГИРАН АДАПТОРЪТ Eco R l-Bst X I /INVITROGEN, SAN DIEGO/, СЛЕД КОЕТО ТЯ БЕШЕ НАРЯЗАНА СРЕСТРИКЦИОННИЯ ЕНЗИМ ХЬа I. РАЗПРЕДЕЛЕНИЕТО НА кДНК ПО РАЗМЕРИБЕШЕ НАПРАВЕНО В S 500 SEPHACRYL КОЛОНА /LIFE TECHNOLOGIES, INC/.ФРАГМЕНТИТЕ кДНК ПО-ГОЛЕМИ ОТ 400 бд БЯХА ЛИГИРАНИ В ЕКСПРЕСИОНЕНВЕКТОР V19.8 /MARTIN, F., CELL 63: 203-211 (1990)/, КОЙТО ПРЕДВАРИТЕЛНОБЕШЕ СРЯЗАН С Eco I И Xba I. КОМПЕТЕНТНИ Е. coll DH 10 КЛЕТКИ БЯХАТРАНСФОРМИРАНИ И ПОЛУЧЕНАТА кДНК БЕШЕ РАЗДЕЛЕНА НА 7 ЧАСТИ ОТ ПО100,000 кДНК ВСЯКА. В. ПРЕТЪРСВАНЕ НА ЛАМБДА БИБЛИОТЕКА ОТ CLONTECH БЕШЕ ЗАКУПЕНА БИБЛИОТЕКА ОТ ЧОВЕШКИ ЕМБРИОНАЛЕНБЪБРЕК В ЛАМБДА gt11, С ТИТЪР 650 МИЛИОНА pfu/ml. С ПРОБИ ПОЛУЧЕНИ ЧРЕЗPCR /ВИЖ ПО-ГОРЕ/ БЯХА ПРЕТЪРСЕНИ ОКОЛО 2 МИЛИОНА ПЛАКИ.ХИБРИДИЗАЦИЯТА БЕШЕ ПРОВЕДЕНА В GX SSC, 5 X DENHARDT, 0,1 % SDS, 100pg/ml ЕДНОВЕРИЖНА ДНК ОТ СПЕРМА ОТ СЬОМГА ЗА 15 ЧАСА ПРИ 560 С. БЯХА ПРОВЕДЕНИ МНОГОКРАТНИ ЦИКЛИ НА ПРЕТЪРСВАНЕ. ЗА УСТАНОВЯВАНЕНА ВЕРНИТЕ СЕКВЕНЦИИ ДНК БЕШЕ НАМНОЖЕНА ОТ ЕДИНИЧНИ ПЛАКИ И БЕШЕХИБРИДИЗИРАНА СЪС ЗАЧАТЪКА 5’AGT ТТА CTG AGG ACT CGG AGG 3’/СЕКВЕНЦИЯ No 8/, КОДИРАЩ АМИНО КИСЕЛИНИ ОТ 7 ДО 13 В СЕКВЕНЦИЯ No 6. Г. 3 ПРИМ БЪРЗО НАМНОЖАВАНЕ НА кДНК КРАИЩАТА /RACE/. ОТ CLONTECH БЕШЕ ЗАКУПЕНА ПОЛИАДЕНИЛИРАНА РНК ОТ ЧОВЕШКИЕМБРИОНАЛЕН БЪБРЕК И ЕМБРИОНАЛЕН ЧЕРЕН ДРОБ. ЕДИН МИКРОГРАМ РНКБЕШЕ ОБРАТНО ПРЕЗАПИСАНА, КАТО ЗА ЗАРОДИШ БЕШЕ ИЗПОЛЗВАН ОЛИГО 5’ТТС GGC CGG АТА GGC СТТ ТТТ ТТТ ТТТ ТТТ 3’ /СЕКВЕНЦИЯ No 9/. -82- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ЗА ИЗГРАЖДАНЕ НА ПЪРВАТА ВЕРИГА ДНК БЕШЕ ИЗПОЛЗВАН GIBCO-BRL кДНКСИНТЕЗИОНЕН КИТ /LIFE TECHNOLOGIES INC., CAT # 18267-013/. КРАЙНИЯТОБЕМ БЕШЕ 30 μΙ. РЕАКЦИЯТА БЕШЕ СПРЯНА ЧРЕЗ ДОБАВЯНЕ НА 500 mM EDTAДО КРАЙНА КОНЦЕНТРАЦИЯ 10 тМ И ПОДДЪРЖАНА ПРИ - 20 ° С. ЗА НАЧАЛНАТА PCR КАТО МАТРИЦА БЕШЕ ИЗПОЛЗВАНА 0.5 μΙ кДНК.ЗАРОДИШЪТ СЪС СЕКВЕНЦИЯ No 9 И КОНКУРИРАЩИЯТ ГО ОЛИГО 5’ ТТС GGCCGG АТА GGC СТТ ТТТ ТТТ ТТТ ТТ-Р 3’ /СЕКВЕНЦИЯ No 10/ БЯХА ИЗПОЛЗВАНИКАТО БЕЗМИСЛЕНИ ЗАРОДИШИ, ДОКАТО ОЛИГОНУКЛЕОТИДА 5’ TGC GAC СТСCGA GTC STS AG 3’ /СЕКВЕНЦИЯ No 11/, КОДИРАЩ АМИНО КИСЕЛИНИТЕ ОТ ОТ 5ДО 11 В СЕЛВЕНЦИЯ No 6 БЕШЕ ИЗПОЛЗВАН КАТО СМИСЛЕН ЗАРОДИШ. БЯХАПРОВЕДЕНИ 40 ЦИЛЪЛА НА НАМНОЖАВАНЕ ЧРЕЗ ПРЕМИНАВАНЕ ПРЕЗСЛЕДНИТЕ ЕТАПИ: НАЧАЛНО ИНКУБИРАНЕ 2 МИН, ПРИ 94 ° С ; 94 ° С, 30 СЕК.;65 0 С, 30 СЕК.; 72 ° С, 30 СЕК. ЗА НАМНОЖАВАНЕТО БЕШЕ ИЗПОЛЗВАНАСИСТЕМА PERKIN ELMER GENEAMP SYSTEM 9600. ВГРАЖДАНЕТО БЕШЕ ПРОВЕДЕНО ЧРЕЗ ИЗПОЛЗВАНЕ НА СМИСЛЕНИЯЗАРОДИШ 5’ GAG ТСС ТСА GTA AAC TGC ТТС GT 3’ /СЕКВЕНЦИЯ No 12/,КОДИРАЩ АМИНО КИСЕЛИНИ ОТ 8 ДО 14 В СЕКВЕНЦИЯ No 6, А СЕКВЕНЦИЯ No 9И СЕКВЕНЦИЯ No 10 СЛУЖЕХА КАТО БЕЗСМИСЛЕНИ ЗАРОДИШИ. БЯХАПРОВЕДЕНИ 40 ЦИКЪЛА НА НАМНОЖАВАНЕ С ТЕМПЕРИРАНЕ ПРИ 65 0 С. PCRПРОДУКТИТЕ БЯХА ПОСТАВЕНИ В 0.8 % АГАРОЗЕН ГЕЛ И СЛЕД ТОВА ЗАСНЕТИ СПОД УВ СВЕТЛИНА. ПОЛУЧИХА СЕ ВИДИМИ ИВИЦИ ОТ 0.8 Д01.2 кб. СЛЕД ТОВА PCR ПРОДУКТИТЕ БЯХА КЛОНИРАНИ ВЪВ ВЕКТОРА PCR II/INVITROGEN/. БЯХА ВЗЕТИ ЕДИНИЧНИ КОЛОНИИ И ПЛАЗМИДИТЕ БЯХАИЗОЛИРАНИ С ПОМОЩТА НА QIAGEN КИТОВЕ CAT #12143 И 12145. ДВОЙНОВЕРИЖНОТО СЕКВЕНИРАНЕ БЕШЕ НАПРАВЕНО С ПОМОЩТА НА ВЕКТОРНИТЕЗАРОДИШИ. СЕКВЕНЦИИТЕ БЯХА АНАЛИЗИРАНИ С РАЗЛИЧНИ ВИДОВЕ GCGСОФТУЕЪР. -83- >N0 95/26746 PCT/US95/03776 Д. УДЪЛЖАВАНЕ НА 5’ И 3 ‘ ЗАРОДИШИТЕ ЗА ДА СЕ ИЗОЛИРА СЕКВЕНЦИЯ С ПЪЛНАТА ДЪЛЖИНА НА MGDF ГЕНА БЕШЕПРОВЕДЕНО УДЪЛЖАВАНЕ НА 3’ И 5' ЗАРОДИШИТЕ, КАТО ЗА МАТРИЦА БЯХАИЗПОЛЗВАНИ РАЗЛИЧНИ ЧАСТИ ОТ БИБЛИОТЕКАТА НА ЕМБРИОНАЛЕН ЧЕРЕНДРОБ. КАТО МАТРИЦА ЗА НАМНОЖАВАНЕГО НА 5 ‘ ЗАРОДИША НА кДНК БЯХАИЗПОЛЗВАНИ ОКОЛО 20 ng кДНК ОТ ВСЯКА ЧАСТ. БЯХА ИЗПОЛЗВАНИ MGFDСПЕЦИФИЧЕН БЕЗСМИСЛЕН ЗАРОДИШ 5’ GGA GTC ACG AAG CAG ТТТ АС 3’/СЕКВЕНЦИЯ No 13/, КОДИРАЩ АМИНО КИСЕЛИНИ ОТ 12 ДО 17 НА СЕКВЕНЦИЯNo 6 И СМИСЛЕН ЗАРОДИШ ОТ ВЕКТОР V19.8 5’ ССТ ТТА СТТ СТА GGC CTG 3’ © /СЕКВЕНЦИЯ No 14/. НАМНОЖАВАНЕТО БЕШЕ ИЗВЪРШЕНО ЗА 30 ЦИКЪЛА СТЕМПЕРИРАНЕ ПРИ 53 0 С. ВГРАЖДАНЕТО БЕШЕ ИЗВЪРШЕНО ЗА 30 ЦИКЪЛА СБЕЗСМИСЛЕНИЯ ЗАРОДИШ 5’ GAG GTC АСА AGC AGG AGG А 3’ /СЕКВЕНЦИЯ No15/, КОДИРАЩ АМИНО КИСЕЛИНИ ОТ 1 ДО 6 НА СЕКВЕНЦИЯ No 6 И ВЕКТОРНИЯЗАРОДИШ СЕКВЕНЦИЯ No 14. ЗА УДЪЛЖАВАНЕТО НА 3’ КРАИЩАТА НА кДКН БЯХА ИЗПОЛЗВАНИБЕЗСМИСЛЕНИЯ ВЕКТОРЕН ЗАРОДИШ 5’ GGC АТА GTC CGG GAC GTC G 3’/СЕКВЕНЦИЯ No 16/ И MGDF СПЕЦИФИЧЕН ЗАРОДИШ 5’ ТСС ТСС TGC TTG TGAССТ С 3’ /СЕКВЕНЦИЯ No 17/ КОДИРАЩ АМИНО КИСЕЛИНИ ОТ 1 ДО 6 ВСЕКВЕНЦИЯ No 6. НАМНОЖАВАНЕТО БЕШЕ ПРОВЕДЕНО ЗА 30 ЦИКЪЛА С © ТЕМПЕРИРАНЕ ПРИ 58 ° С. ВГРАЖДАНЕТО БЕШЕ НАПРАВЕНО ЗА 30 ЦИКЪЛА КАТО БЯХА ИЗПОЛЗВАНИ MGDFЗАРОДИША СЕКВЕНЦИЯ No 12 И ВЕКТОРНИЯ ЗАРОДИШ СЕКВЕНЦИЯ No 16.СПЕЦИФИЧНИ ИВИЦИ БЯХА ПОЛУЧЕНИ В ЧАСТИ НОМЕР 1, 7 И 8, КОИТО БЯХАКЛОНИРАНИ В PCR II ВЕКТОР. ПРЕЧИСТЕНАТА ПЛАЗМИДНА ДНК ОТ ЕДИНИЧНИКОЛОНИИ БЕШЕ ПРЕЧИСТЕНА И СЕКВЕНИРАНА. -84- WO 95/26746 PCT/US95/03776 БИЗОЛИРАНЕН/1ЧОВЕШКИМООЕКЛОВОВЕЛ11ЪЛНАДЪЛЖИНА В МНОГО ОТ КЛОНОВЕТЕ ЛИПСВАШЕ ЧАСТ ОТ АМИНО КРАЯ НА MGDF, ТЪЙ КАТОЧАСТ ОТ MGDF СЕКВЕНЦИЯТА БЕШЕ ИЗПОЛЗВАНА ЗА ЗАРОШИ И ЗАВГРАЖДАНЕ. ЗАРОДИШЪТ 5’ CCA GGA AGG ATT CAG GGG А 3’ /СЕКВЕНЦИЯ No18/, ЧИЯТО СЕКВЕНЦИЯ БЕШЕ ПОЛУЧЕНА ОТ ЕКСПЕРИМЕНТИТЕ НА 5’ЗАРОДИШНО УДЪЛЖАВАНЕ, ΚΑΚΤΟ Е ОПИСАНО ПО-ГОРЕ, БЕШЕ ИЗПОЛЗВАНКАТО СМИСЛЕН ЗАРОДИШ. ВЕКТОРНИЯТ ЗАРОДИШ СЕКВЕНЦИЯ No 16 ПОСЛУЖИКАТО БЕЗСМИСЛЕН ЗАРОДИШ. БЯХА ПРОВЕДЕНИ 35 ЦИКЪЛА НА НАМНОЖАВАНЕС ТЕМПЕРИРАНЕ ПРИ 58° С. MGDF СПЕЦИФИЧНИЯТ ЗАРОДИШ 5’ CAA CAA GTCGAC CGC CAG CCA CCA GAC ACC CCG 3’ /СЕКВЕНЦИЯ No 19/ С Sal I МЯСТО ИВЕКТОРНИЯ ЗАРОДИШ СЕКВЕНЦИЯ No 15 БЯХА ИЗПОЛЗВАНИ ЗА ВГРАЖДАНЕ ЗА35 ЦИКЪЛА. PCR ПРОДУКТЪТ БЕШЕ КЛОНИРАН В PCRII ВЕКТОР И СЕКВЕНИРАН. II. ВТОРИ ПРИМЕРЕН ПОДХОД НА КЛОНИРАНЕ А. КЛОНИРАНЕ НА КУЧЕШКА MGDF N-КРАЙНА кДНК НА БАЗАТА НА КУЧЕШКАТА MGDF N-КРАЙНА АМИНО КИСЕЛИННА СЕКВЕНЦИЯ,ОПИСАНА В ПРЕДИШНИЯ РАЗДЕЛ БЯХА КОНСТРУИРАНИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНИЗАРОДИШИ, КОИТО БЯХА ИЗПОЛЗВАНИ КАТО ЗАРОДИШИ В ПОЛИМЕРАЗНИВЕРИЖНИ РЕАКЦИИ /PCRs/ ЗА НАМНОЖАВАНЕ НА кДНК СЕКВЕНЦИИ,КОДИРАЩИ MGDF. ЦЯЛАТА РНК БЕШЕ ПРИГОТВЕНА ОТ ПРОБИ ОТ КУЧЕШКИБЪБРЕК ЧРЕЗ ГУАНИДИН ИЗОТИОЦИАНАТЕН МЕТОД НА CHOMZYNSKI И SACCH1/В1ОСНЕМ. 162: 156-159 (1987)/. ПЪРВАТА ВЕРИГА ДНК БЕШЕ ПРИДОТВЕНА СПРОИЗВОЛЕН ЗАРОДИШ-АДАПТОР 5’GGC CGG АТА GGC CAC TCN NNN NNT 3’/СЕКВЕНЦИЯ N0 20/ ЧРЕЗ MoMULV ОБРАТНА ТРАНСКРИПТАЗА И БЕШЕИЗПОЗВАНА КАТО МАТРИЦА В СЛЕДВАЩИТЕ PCRs. PCR БЕШЕ ПРОВЕДЕНА С 0.5 МИКРОЛИТРА, ОКОЛО 50 ng кДНК, КАТО БЕШЕ -85- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ИЗПОЛЗВАН ЗАРОДИШ A 5’ GCN CCN CCN GCN TGY GA 3’ /СЕКВЕНЦИЯ No 4/,СМИСЛЕН ВЕРИЖЕН ЗАРОДИШ КОДИРАЩ АМИНО КИСЕЛИНИ 1-6 В СЕКВЕНЦИЯNo 1 И ЗАРОДИШ Б 5’ GCA RTG NAG NAC RTG NGA RTC 3’ /СЕКВЕНЦИЯ No 5/ ИЛИЗАРОДИШ В 5’ GCA RTG YAA NAC RTG NGA RTC 3’ /СЕКВЕНЦИЯ No 21/, КОИТОСА НЕСМИСЛЕНИ ВЕРИЖНИ ЗАРОДИШИ КОДИРАЩИ АМИНО КИСЕЛИНИ 16-21 НАСЕКВЕНЦИЯ No 1 С ТРИ ДОПЪЛНИТЕЛНИ НУКЛЕОТИДА НА 5’ КРАЯ ЗАПОВИШАВАНЕ НА СТАБИЛНОСТТА КЪМ НАГРЯВАНЕ. БЕШЕ ПРОВЕДЕНА PCR СTag ПОЛИМЕРАЗА ЗА 35 ДО 45 ЦИКЪЛА, ДОКАТО ИВИЦИТЕ НА ПРОДУКТАСТАНАХА ВИДИМИ В АГАРОЗНИЯ ГЕЛ НА ЕЛЕКТЕОФОРЕТИЧНОТО ИЗСЛЕДВАНЕ.ЗА ПЪРВИТЕ ДВА ЦИКЪЛА НА PCR ЕТАПА НА ТЕМПЕРИРАНЕ БЕШЕ ПРОВЕДЕНПРИ 37° С ЗА 2 МИНУТИ.; ЗА ОСТАНАЛИТЕ ЦИКЛИ ТЕМПЕРИРАНЕТО БЕШЕ ПРИ50° С ЗА 1 МИНУТА. ПРИ ВСЯКА РЕАКЦИЯ БЯХА ВИДИМИ МНОГОБРОЙНИ ИВИЦИПРОДУКТ. ЧАСТИТЕ ОТ ΓΕΛΑ, СЪДЪРЖАЩИ ИВИЦИ С ПРИБЛИЗИТЕЛНООЧАКВАНАТА ГОЛЕМИНА /66 бд/ БЯХА СЪБРАНИ С ТИП НА ПИПЕТА PASTEUR ИПОВТОРНО НАМНОЖЕНИ СЪС СЪЩАТА ДВОЙКА ЗАРОДИШИ. ДНК ПРОДУКТИТЕБЯХА КЛОНИРАНИ ВЪВ ВЕКТОР PCR II /INVITORGEN/, СПОРЕД УКАЗАНИЯТА НАПРОИЗВОДИТЕЛЯ. ТРИ КЛОНА БЯХА СЕКВЕНИРАНИ И ЗА ТЯХ БЕШЕ УСТАНОВЕНОЧЕ КОДИРАТ, В ЕДНА РАМКА НА ЧЕТЕНЕ, ОЧАКВАНАТА КУЧЕШКА MGDFСЕКВЕНЦИЯ, ОСТАТЪЦИ 1-21. ПО ТОЗИ НАЧИН БЕШЕ ПОЛУЧЕНА УНИКАЛНАКУЧЕШКА MGDF ИДНК СЕКВЕНЦИЯ, ОБХВАЩАЩА УЧАСТЪКА ОТ ТРЕТИЯНУКЛЕОТИД НА КОДОН 6 ДО ТРЕТИЯ НУКЛЕОТИД НА КОДОН 15. ЕДИН ОТ ТЕЗИКЛОНОВЕ ПОСЛУЖИ КАТО МАТРИЦА ЗА ПРИГОТВЯНЕТО НА БЕЛЯЗАНА ПРОБАКУЧЕШКА MGDF кДНК. Б. КОНСТРУИРАНЕ НА кДНК БИБЛИОТЕКА ОТ ЧОВЕШКИ ЕМБРИОНАЛЕН ЧЕРЕНДРОБ. РНК ОТ ЧОВЕШКИ ЕМБРИОНАЛЕН ЧЕРЕН ДРОБ /INTERNATIONAL INSTITUTEFOR THE ADVANCEMENT OF MEDICINE, EXTON, РА/ БЕШЕ ИЗОЛИРАНА ЧРЕЗЛИЗИРАНЕ НА ТЪКАН В 5.5 М ГУАНИДИН ТИОЦИАНАТ И БЕШЕ ПРЕЧИСТЕНА ЧРЕЗ -86- WO 95/26746 PCT/US95/03776
CsTFA /PHARMACIA/ ЦЕНТРОФУГИРАНЕ. ПОЛИАДЕНИЛИРАНАТА PHK БЕШЕОТБРАНА C ПОМОЩТА HA ОАИГО /еГТ/ 25 DINABEADS /DYNAL, СПОРЕДУКАЗАНИЯТА HA ПРОИЗВОДИТЕЛЯ/. ДВОЙНОВЕРИЖНАТА ДНК БЕШЕПРОИЗВЕДЕНА ОТ ТАЗИ PHK С ПОМОЩТА НА SUPERSCRIPT ПЛАЗМИДНАСИСТЕМА ЗА СИНТАЗ НА кДНК /LIFE TECHNOLOGIES, INC./ С ИЗКЛЮЧЕНИЕ НАИЗПОЛЗВАНИТЕ РАЗЛИЧНИ СВЪРЗВАЩИ АДАПТОРИ: 5’ TTG GTG TGC ACT TGT G3’ /СЕКВЕНЦИЯ No 22/ И 5’ CAC AAG TGC АСА CCA ACC СС 3’ /СЕКВЕНЦИЯ No 23/.СЛЕД РАЗДЕЛЯНЕТО ПО ГОЛЕМИНА ТАЗИ кДНК БЕШЕ ДИРЕКТНО ВКЛЮЧЕНА ВBst XI И Not I НА ЕКСПРЕСИОНЕН ВЕКТОР ПРИ БОАЙНИЦИТЕ рВСВ /рВСВ ЕПОЛУЧЕН ОТ ПЛАЗМИДА Rc/CMV, INVITROGEN, ВКЛЮЧВАЩ pud9 СКЕЛЕТ, CMV ® ПРОМОТОР И BGH МЯСТО ЗА ПОЛИАДЕНИЛИРАНЕ. ДНК БЕШЕЕЛЕКТОПОРИРАНА В ЕЛЕКРО КОМПЕТЕНТЕН БАКТЕРИАЛЕН ЩАМ 10Б /LIFETECHNOLOGIES, INC./.
В. ПРЕТЪРСВАНЕ НА кДНК БИБЛИОТЕКА ОТ ЧОВЕШКИ ЕМБРИОНАЛЕН. ЧЕРЕНДРОБ ЗА MGDF ФИЛТЪРНИТЕ ОТПЕЧАТЪЦИ НА БИБЛИОТЕКА ОТ ЧОВЕШКИ ЕМБРИОНАЛЕНЧЕРЕН ДРОБ БЯХА ХИБРИДИЗИРАНИ С РАДИОАКТИВНО БЕЛЯЗАН С КУЧЕШКИMGDF N-KPAEH кДНК PCR ПРОДУКТ /5х SSPE, 2 х DENHADT’S, 0.05 % NaПИРОфОСфАТ, 0.5 % SOS, 100 gg/ml ЛИЗАТ ОТ ДРОЖДЕВА тРНК И 100 pg/ml © ДЕНАТУРИРАНА ДНК ОТ СПЕРМА ОТ СЬОМГА/ ПРИ 64° С ЗА 18 ЧАСА. ФИЛТРИТЕ БЯХА ПРОМИТИ ПРИ 64° С В 5х SSPE, 0.5 % SDS И ЕКСПОНИРАНИ ЗА ЕДНА НОЩ.БЯХА ИЗОЛИРАНИ И АНАЛИЗИРАНИ ДВА РАЗЛИЧНИ КЛОНА ХИБРИДИЗИРАЩИ СТАЗИ ПРОБА. Г. ЕКСПРЕСИЯ НА ЧОВЕШКИТЕ MGDF кДНК КЛОНОВЕ. ПРЕЧИСТЕНАТА ДНК ОТ MGDF кДНК КЛОНОВЕТЕ БЕШЕ ВНЕСЕНА В 293 EBNAКЛЕТКИ /INVITORGEN/. 1.5 цд ДНК БЕШЕ СМЕСЕНА С 7.5 ul ЛИПОфЕКТАМИН -87- WO 95/26746 PCT/US95/03776 /LIFE TECHNOLOGIES, INC./ B 100 ul DMEM ЧИСТ ОТ СЕРУМ. СЛЕД 20 МИНУТНОИНКУБИРАНЕ ПРИ СТАЙНА ТЕМПЕРАТУРА СМЕСТА ДНК-ДИПОфЕКТАМИН БЕШЕПРИБАВЕНА КЪМ 5 х 10 5КЛЕТКИ/СЪД /24 КРЪГЛИ СЪДА GREINER/ В 400 ul DMEM,1% СЕРУМ /ЕМБРИОНАЛЕН КЛОН II/ И ИНКУБИРАНИ ЗА 6 ЧАСА ПРИ 37° С. КЪМКЛЕТКИТЕ БЕШЕ ДОБАВЕНО 500 ul DMEM, 20 % СЕРУМ /ЕМБРИОНАЛЕН КЛОН II/.СЛЕД 16 ЧАСА СРЕДАТА БЕШЕ АСПИРИРАНА И БЕШЕ ДОБАВЕНО 500 ul DMEM, 1 %СЕРУМ /ЕМБРИОНАЛЕН КЛОН II/. СЛЕД 72 ЧАСА ПОЛУЧЕНИТЕ СРЕДИ БЯХАСЪБРАНИ И ЦЕНТРОФУГИРАНИ ПРЕЗ 0.22 МИКРНЕН ФИЛТЪР. ПОЛУЧЕНИТЕСРЕДИ БЯХА ИЗСЛЕДВАНИ ЗА MGDF БИОЛОГИЧНА АКТИВНОСТ. III. ОПИСАНИЕ НА АКТИВНОСТТА НА ЧОВЕШКИТЕ MGDF КЛОНОВЕ НА БАЗАТА НА ГОРЕОПИСАНИТЕ КЛОНИРАЩИ МЕТОДИ БЯХА ПОЛУЧЕНИЧОВЕШКИ кЦНК КЛОНОВЕ, ПОКАЗАНИ НА фИГ. 11 / MGDF-1 И MGDF-2; СЕКВ. No24, 25 И 26, 27/ И ФИГ. 12 / MGDF-З; СЕКВ. No 28 И 29/. ВСЯКА ОТ СЕКВЕНЦИИТЕ,ПОКАЗАНА НА ФИГУРИТЕ СЪДЪРЖА ПРЕДПОЛАГАЕМА СИГНАЛНА СЕКВЕНЦИЯОТ АМИНО КИСЕЛИНИ 1-21, ТАКА ЧЕ ЗРЕЛИЯТ БЕЛТЪК ЗАПОЧВА ОТ АМИНОКИСЕЛИНА 22 ВЪВ ВСЕКИ ЕДИН ОТ СЛУЧАИТЕ. РЕЗУЛТАТИТЕ ОТ ИЗСЛЕДВАНИЯТА НА АКТИВНОСТТА ПРОВЕДЕНИ В КЛЕТЪЧНОБАЗИРАНИТЕ ИЗСЛЕДВАНИЯ , ОПИСАНИ В ПРИМЕР 4А ПО-ГОРЕ С MGDF 1-3 САПРЕДСТАВЕНИ В ТАБЛИЦИ 3 И 4 ДОЛУ. ЗА ТАБЛИЦА 3 ПОЛУЧЕНАТА СРЕДА ОТ293 EBNA КЛЕТКИ, ТРАНСфЕКТИРАНИ С ВСЕКИ КЛОН БЕШЕ СЪБРАНА СЛЕД 2ДНИ В КУЛТУРА И СЛЕД ТОВА ТЕСТУВАНА В 1 А6.1 КЛЕТКИ /32D/mur-MPL+/ +/-10ug/ml mur-MPL-X. ЗА ТАБЛИЦА 4 ПОЛУЧЕНАТА СРЕДА ОТ 293 EBNA КЛЕТКИ,ТРАНСФЕКТИРАНИ С ВСЕКИ КЛОН БЕШЕ СЪБРАНА СЛЕД 4 ДНИ В КУЛТУРА ИТЕСТУВАНА В 32D/mur-MPL+ КЛЕТКИ /ПРИМЕР ЗА/ И 32D/hu-MPL+ КЛЕТКИ/ПРИМЕР ЗБ/. ΚΑΚΤΟ СЕ ВИЖДА MGDF-1 И MGDF-2, НО НЕ И MGDF-З САПОКАЗАЛИ АКТИВНОСТ В КЛЕТЪЧНИТЕ ЛИНИИ, ЕКСПРЕСИРАЩИИ И ДВЕТЕ -88- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ФОРМИ HA Mpl - МИШАТА И ЧОВЕШКАТА. КЛЕТЪЧНАТА ЛИНИЯ ЕКСПРЕСИРАЩАЧОВЕШКИЯ MPL РЕЦЕПТОР Е ПО-ПОДДХОДЯЩА ЗА ЧОВЕШКИЯ MGDF-1 И MGDF-2, ОТКОЛКОТО КЛЕТЪЧНАТА ЛИНИЯ, ЕКСПРЕСИРАЩА МИШИЯ Mpl РЕЦЕПТОР. КЛОН СРЕДА РВСО /КОНТРОЛЕН ПЛАЗМИД/MGDF-1 MGDF-1 /ПОВТОРЕНО/ MGDF-2 MGDF-2/ПОВТОРЕНО/ MGDF-3 MGDF-1 /ПОВТОРЕНО/ АРК9 КОНТРОЛА ТАБЛИЦА^ЕДИНИЦИ/ml( mur-MPL-X) 0 0 12,800 12,800 4525 12800 0 0 4400+/-400 ЕДИНИЦИ/ml (+mur-MPLX) 0 0 800 566 400 1131 0 0 0 КЛОН © MGOF-1MGDF-2 MGDF-2 /ПОВТОРЕНО/ ТАБЛИЦА 4 ЕДИНИЦИ/ml32D/ mur-MPL+ 1600 6400 6400 ЕДИНИЦИ/ml32D/ hu-MPL+ 25,600 50,000 50,000-100,000 СЛЕДВАЩАТА ТАБЛИЦА 5 ПОКАЗВА, ЧЕ АКТИВНОСТИТЕ НА ЧОВЕШКИТЕ MGDF-1И MGDF-2 В КЛЕТКИ 32D/hu-MPL+ /ПРИМЕР ЗБ/ СА ПРАКТИЧЕКИ НАПЪЛНОИНХИБИРАНИ ОТ РАЗТВОРИМИЯ ЧОВЕШКИ Mpl РЕЦЕПТОР (hu-MPL-X). Hu-MPL-X ПРИСЪСТВАШЕ КАТО СРЕДА, СЪБРАНА ОТ СНО КЛЕТКИ, ПРОИЗВЕЖДАЩИБЕЛТЪКА. СНО hu-MPL-X СРЕДАТА БЕШЕ КОНЦЕНТРИРАНА 120 ПЪТИ И -89- >N0 95/26746 PCT/US95/03776 ДОБАВЕНА КЪМ КУЛТУРАТА В 6.6 %. СРЕДАТА ОТ КОНТРОЛНИ СНО КУЛТУРИ НЕПОКАЗА ЕФЕКТ ПРИ ИЗСЛЕДВАНИЯТА. ИЗСЛЕДВАНИЯТА БЯХА ПРОВЕДЕНИΚΑΚΤΟ Е ОПИСАНО В ПРИМЕР 4Б, С ИЗКЛЮЧЕНИЕ НА ТОВА, ЧЕЖИЗНЕСПОСОБНИТЕ КЛЕТКИ БЯХА ОЦЕНЕНИ СЛЕД 3 ДНИ. ТАБЛИЦА 5 ЕДИНИЦИ/ml ЕДИНИЦИ/ml КЛОН (- Hu-MPL-X) (+Hu -MPL-X) MGDF-1 570 0 MGDF-2 270 0 ИЗСЛЕДВАНИЯ НА ЧОВЕШКИ МЕГАКАРИОЦИТИ MGDF-1 И MGDF-2, НО НЕ И MGDF-3 ИНДУЦИРАХА ФОРМИРАНЕТО НАМЕГАКАРИОЦИТИ ОТ ПЕРИФЕРНИ КРЪВНИ CD-34-ИЗБРАНИ КЛЕТКИ.ЕКСПЕРИМЕНТА, ОПИСАН В ТАБЛИЦА 6 БЕШЕ ПРОВЕДЕН ОСНОВНО ΚΑΚΤΟ ЕОПИСАНО В ПРИМЕР 2 С ИЗКЛЮЧЕНИЕ НА ТОВА, ЧЕ ПЕРИФЕРНИТЕ КРЪВНИКЛЕТКИ БЯХА СО34-ИЗБРАНИ БЕЗ ПРОМИВАНЕ И КУЛТУРАТА БЕШЕ СЪБРАНАСЛЕД 7 ДНИ. ПОЛУЧЕНАТА СРЕДА ОТ ВСЕКИ 293 EBNA MGDF БЕШЕИЗПОЛЗВАНА В КРАЕН ОБЕМ ОТ 20 % +/- 30 ug/ml mur-MPL-X. АРК9 КОНТОЛАБЕШЕ ИЗПОЛЗВАНА В 6% КРАЕН ОБЕМ. -90- WO 95/26746 ТАБЛИЦА 6 PCT/US95/O3776 МЕГАКАРИОЦИТИ МЕГАКАРИОЦИТИ КЛОН ЗА СЪД (-mur-MPL-X) ЗА СЪД (+mur-MPL-X) ВЕКТОРНА КОНТРОЛА 0 0 АРК9 КОНТРОЛА 100+/-3 0 MGDF-1 142 +/- 48 17+/- 2 MGDF-2 100 +/-3 6+/-2 MGDF-1 ПОВТОРЕНО 86 +/-10 0 MGDF-3 2+/-2 0 ПРИМЕР 12 СЛЕДВАЩИЯТ ПРИМЕР ОПИСВА СИНТЕЗАТА НА 12 РАЗЛИЧНИ ПОЛИЕТИЛЕНГЛИКОЛИРАНИ MGDF МОЛЕКУЛИ, PEG 9 - PEG 12 И PEG 14 - PEG 21. ВЪВ ВСЕКИОТ СЛУЧАИТЕ MGDF МОЛЕКУЛАТА БЕШЕ ПРОИЗВЕДЕНА В Е. COli MGDF-11(АМИНО КИСЕЛИНИ 22-184, АКО БРОИМ ОТ НАЧАЛОТО НА СИГНАЛНИЯ ПЕПТИДИЛИ АМИНО КИСЕЛИНИ 1-163, АКО БРОИМ ОТ НАЧАЛОТО НА ЗРЕЛИЯ БЕЛТЪК).ПОДРОБНОСТИТЕ ЗА ВСИЧКИ ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНИ ВИДОВЕ САОБОЩЕНИ В ТАБЛИЦИ 7-10 ДОЛУ. 12.1. ПРИГОТВЯНЕ НА ПОЛИ-MePEG-MGDF КОНЮГАТИ ЧРЕЗ АЦИЛИРАНЕНА MGDF С АКТИВИРАНИ Me-PEG ПРОИЗВОДНИ. ПРИГОТВЯНЕ НА ПОЛИ- MePEG(20 kDa)-MGDF КОНЮГАТ (PEG11). ОХЛАДЕН /4° С/ РАЗТВОР НА MGDF /2.5 mg/ml/ В 0.1 М BICINE БУфЕР, pH 8, БЕШЕ -91- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ПРИБАВЕН КЪМ 1О-ПЪТИ МОЛАРЕН ИЗЛИШЪК ОТ ТВЪРД MePEG СУКЦИНИМИДИЛПРОПИОНАТ /МТ 20 kDa/ /SHEARWATER POLYMERS, INC./. ПОЛИМЕРЪТ БЕШЕРАЗТВОРЕН ЧРЕЗ ВНИМАТРЛНО РАЗБЪРКВАНЕ, СЛЕД КОЕТО РЕАКЦИЯТАПРОДЪЛЖИ ПРИ СТАЙНА ТЕМПЕРАТУРА. НИВОТО НА МОДИФИКАЦИЯ НА БЕЛТЪКА В ХОДА НА РЕАКЦИЯТА БЕШЕПРОСЛЕДЕНО ЧРЕЗ SEC HPLC, С SUPERDEX 200 HR 10/30 КОЛОНА/PHARMACIA BIOTECH/, ЕЛЮИРАНА С 0.1 М НАТРИЕВО ФОСФАТЕН БУФЕР pH 6.9ПРИ 0.7 ml/мин. SEC HPLC АНАЛИЗИТЕ НА РЕАКЦИОННАТА СМЕС В 30 МИНУТА ПОКАЗАХА, ЧЕ ВРЕАКЦИОННАТА СМЕС НЕ Е ОСТАНАЛ СВОБОДЕН БЕЛТЪК. В ТАЗИ ТОЧКА ОТВРЕМЕТО КОНЦЕНТРАЦИЯТА НА БЕЛТЪКА В РЕАКЦИОННАТА СМЕС БЕШЕНАМАЛЕНА ДО 1 mg/ml ЧРЕЗ ПРИБАВЯНЕ НА СТЕРИЛНА ВОДА И pH БЕШЕДОВЕДЕНО ДО 4 С НЯКОЛКО КАПКИ 0.5 М ОЦЕТНА КИСЕЛИНА.
MePEG-MGDF КОНЮГАТА БЕШЕ ОТДЕЛЕН ОТ ИЗЛИШЪКА ОТ MePEG И ДРУГИТЕСТРАНИЧНИ РЕАКЦИОННИ ПРОДУКТИ ЧРЕЗ ЙОНООБМЕННА ХРОМАТОГРАфИЯ,ЗА КОЯТО БЕШЕ ИЗПОЛЗВАНА SP SEPHAROSE /PHARMACIA BIOTECH/ЙОНООБМЕННА СМОЛА. РЕАКЦИОННАТА СМЕС БЕШЕ ПОСТАВЕНА В КОЛОНАТА /2.5 mg/ml СМОЛА/ ИНЕРЕАГИРАЛИТЕ MePEG БЯХА ЕЛЮИРАНИ С ТРИ ОБЕМА НА КОЛОНАТА ОТНАЧАЛНИЯ БУФЕР А /20 тМ НАТРИЕВ ФОСФАТ, pH 7.2, 15 % ГЛИЦЕРОЛ/. СЛЕДТОВА MePEG-MGDF КОНЮГАТА БЕШЕ ЕЛЮИРАН С ЛИНЕЕН ГРАДИЕНТ ОТ 0 % ДО30 % В 10 ОБЕМА НА КОЛОНАТА ОТ КРАЙНИЯТ БУфЕР Б /1 М NaCI В БУфЕР А/.ЕЛУАТА БЕШЕ ИЗСЛЕДВАН ПРИ 280 nm. ФРАКЦИИТЕ СЪДЪРЖАЩИ MePEG-MGDFКОНЮГАТА БЯХА СЪБРАНИ, КОНЦЕНТРИРАНИ И СТЕРИЛНО ФИЛТРИРАНИ. -92- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ПРЕЧИСТЕНИЯТ ПОЛИ- MePEG-MGDF КОНЮГАТ БЕШЕ АНАЛИЗИРАН ЧРЕЗ HPLCSEK, КАТО БЯХА ИЗПОЛЗВАНИ TSK-GEL G40000SWXL И G2000SWXL ГЕЛФИЛТРАЦИОННИ КОЛОНИ, СВЪРЗАНИ В СЕРИИ. БЕЛТЪЦИТЕ БЯХА ОТКРИТИЧРЕЗ UV АБСОРБЦИЯ ПРИ 280 nm. КАТО МАРКЕРИ ЗА МОЛЕКУЛНОТО ТЕГЛО НАГЛОБУЛАРНИ БЕЛТЪЦИ БЯХА ИЗПОЛЗВАНИ BIO-RAD ГЕЛ ФИЛТРАЦИОННИСТАНДАРТИ. ΚΑΚΤΟ СЕ ВИЖДА НА фИГ. 17 A HPLC SEC ПОКАЗВА ДВА ОСНОВНИКОМПОНЕНТА /В СЪОТНОШЕНИЕ ОКОЛО 2 КЪМ 1/, ЕЛУАЦИОННИТЕ ПОЗИЦИИ НАКОИТО ОТГОВАРЯТ СЪОТВЕТНО НА 370.9 kDa И 155.0 kDa ГЛОБУЛАРНИ БЕЛТЪЦИ.ВИЖ СЪЩО ТАБЛИЦА 8 ДОЛУ. КОНЮГАТИТЕ PEG 9, PEG 10 И PEG 12 ПРИГОТВЕНИ ЧРЕЗ АЦИЛИРАНЕ НА MGDFСЪС СУКЦИНИМИДИЛОВИ ЕСТЕРИ НА MePEG С МОЛЕКУЛНИ ТЕГЛА =6 - 50 kDaБЯХА ПОЛУЧЕНИ ПО СЪШИЯ НАЧИН. ОСНОВНИТЕ ПАРАМЕТРИ НА РЕАКЦИЯТА САОБОБЩЕНИ В ТАБЛИЦА 7. РЕЗУЛТАТИТЕ ОТ HPLC SEC АНАЛИЗИТЕ НА ТЕЗИ КОНЮГАТИ СА ПОКАЗАНИ ВТАБЛИЦА 8. 12.2. ПРИГОТВЯНЕ НА ПОЛИ-MePEG-MGDF КОНЮГАТИ ЧРЕЗ РЕДУКТИВНО АЛКИЛИРАНЕ НА MGDF С АКТИВИРАНИ Me-PEG АЛДЕХИДИ ПРИГОТВЯНЕ НА ПОЛИ- MePEG(20 KDa)-MGPF КОНЮГАТ (PEG 20). КЪМ ОХЛАДЕН /4° С/, РАЗБЪРКАН РАЗТВОР НА MGDF /2 mg/ml/ В 100 mM НАТРИЕВФОСФАТ, pH 5, СЪДЪРЖАЩ 20 mM NaCNBH3 БЕШЕ ПРИБАВЕН 10-ПЪТИМОЛАРЕН ИЗЛИШЪК ОТ МОНОМЕТОКСИ-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВ АЛДЕХИД/MePEG/ /ПРИБЛИЗИТЕЛНО МОЛЕКУЛНО ТЕГЛО 20 kDa/ И РАЗБЪРКВАНЕТО НАРЕАКЦИОННАТА СМЕС ПРОДЪЛЖИ ПРИ СЪЩАТА ТЕМПЕРАТУРА. -93- WO 95/26746 PCT/US95/03776 НИВОТО HA МОДИФИКАЦИЯ HA БЕЛТЪКА В ХОДА НА РЕАКЦИЯТА БЕШЕПРОСЛЕДЕНО ЧРЕЗ SEC HPLC, С SUPERDEX 200 HR 10/30 КОЛОНА/PHARMACIA BIOTECH/, ЕЛЮИРАНА С 0.1 М НАТРИЕВО ФОСФАТЕН БУфЕР pH 6.9ПРИ 0.7 ml/мин. СЛЕД 16 ЧАСА SEC HPLC АНАЛИЗИТЕ ПОКАЗАХА, ЧЕ ПОВЕЧЕ ОТ 90 % ОТНАЧАЛНОТО КОЛИЧЕСТВО БЕЛТЪК Е МОДИФИЦИРАНО. В ТОЗИ МОМЕНТКОНЦЕНТРАЦИЯТА НА БЕЛТЪКА В РЕАКЦИОННАТА СМЕС БЕШЕ ДОВЕДЕНА ДО1 mg/ml. ЧРЕЗ РАЗРЕЖДАНЕ НА РЕАКЦИОННАТА СМЕС СЪС СТЕРИЛНА ВОДА И pHБЕШЕ ДОВЕДЕНО ДО 4 /0.5 М ОЦЕТНА КИСЕЛИНА/.
MePEG-MGDF КОНЮГАТА БЕШЕ ОТДЕЛЕН ОТ ИЗЛИШЪКА ОТ MePEG И ДРУГИТЕСТРАНИЧНИ РЕАКЦИОННИ ПРОДУКТИ С ПОМОЩТА НА ЙОНООБМЕННАХРОМАТОГРАФИЯ, ЗА КОЯТО БЕШЕ ИЗПОЛЗВАНА SP SEPHAROSE /PHARMACIABIOTECH/ ЙОНООБМЕННА СМОЛА. РЕАКЦИОННАТА СМЕС БЕШЕ ПОСТАВЕНА В КОЛОНАТА /2.5 mg/ml СМОЛА/ ИНЕРЕАГИРАЛИТЕ MePEG БЯХА ЕЛЮИРАНИ С ТРИ ОБЕМА НА КОЛОНАТА ОТНАЧАЛНИЯ БУФЕР А /20 тМ НАТРИЕВ ФОСФАТ, pH 7.2, 15 % ГЛИЦЕРОЛ/. СЛЕДТОВА MePEG-MGDF КОНЮГАТА БЕШЕ ЕЛЮИРАН С ЛИНЕЕН ГРАДИЕНТ ОТ 0 % ДО30 % С 10 ОБЕМА НА КОЛОНАТА ОТ КРАЙНИЯТ БУфЕР Б /1 М NaCl В БУфЕР А/.ЕЛУАТА БЕШЕ ИЗСЛЕДВАН ПРИ 280 nm. ФРАКЦИИТЕ СЪДЪРЖАЩИ MePEG-MGDFКОНЮГАТА БЯХА СЪБРАНИ, КОНЦЕНТРИРАНИ И СТЕРИЛНО ФИЛТРИРАНИ. ПРЕЧИСТЕНИЯТ ПОЛИ- MePEG-MGDF КОНЮГАТ БЕШЕ АНАЛИЗИРАН ЧРЕЗ HPLCSEK, КАТО БЯХА ИЗПОЛЗВАНИ TSK-GEL G40000SWXL И G2000SWXL ГЕЛФИЛТРАЦИОННИ КОЛОНИ, СВЪРЗАНИ В СЕРИИ. БЕЛТЪЦИТЕ БЯХА ОТКРИТИЧРЕЗ UV АБСОРБЦИЯ ПРИ 280 nm. КАТО МАРКЕРИ ЗА МОЛЕКУЛНОТО ТЕГЛО НАГЛОБУЛАРНИ БЕЛТЪЦИ БЯХА ИЗПОЛЗВАНИ BIO-RAD ГЕЛ ФИЛТРАЦИОННИСТАНДАРТИ. -94- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ΚΑΚΤΟ СЕ ВИЖДА НА ФИГ. 17В HPLC SEC ПОКАЗВА ДВА ОСНОВНИКОМПОНЕНТА /ПРЕДСТАВЛЯВАЩИ 52 % И 47 % ОТ ПЪЛНИЯ ОБЕМ/,ЕЛУАЦИОННИТЕ ПОЗИЦИИ НА КОИТО ОТГОВАРЯТ СЪОТВЕТНО НА 359.4 kDa И 159.3 kDa ГЛОБУЛАРНИ БЕЛТЪЦИ. ВИЖ СЪЩО ТАБЛИЦА 8. КОНЮГАТИТЕ PEG 18, PEG 19 И PEG 21, ПРИГОТВЕНИ ЧРЕЗ РЕДУКТИВНОАЛКИЛИРАНЕ НА MGDF С MePEG АЛДЕХИДИ С МОЛЕКУЛНИ ТЕГЛА =6 - 25 kDaБЯХА ПОЛУЧЕНИ ПО СЪШИЯ НАЧИН. ОСНОВНИТЕ ПАРАМЕТРИ НА РЕАКЦИЯТА САОБОБЩЕНИ В ТАБЛИЦА 7. РЕЗУЛТАТИТЕ ОТ HPLC SEC АНАЛИЗИТЕ НА ТЕЗИ КОНЮГАТИ СА ПОКАЗАНИ ВТАБЛИЦА 8. 12.3. ПРИГОТВЯНЕ НА МОНОМЕТОКСИ ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ-MGDF КОНЮГАТИ С МЯСТО НА СВЪРЗВАНЕ В N-КРАЙНАТА α-АМИНО ГРУПА- ПРИГОТВЯНЕ НА ПОЛИ- MePEG( 20 kPa)-MGDF КОНЮГАТ (PEG 20), КЪМ ОХЛАДЕН /4° С/, РАЗБЪРКАН РАЗТВОР НА MGDF / 2 ml, 2.5 mg/ml/ В 100 mMНАТРИЕВ ФОСФАТ, pH 5, СЪДЪРЖАЩ 20 mM NaCNBH3 БЕШЕ ПРИБАВЕН 5-ПЪТИМОЛАРЕН ИЗЛИШЪК ОТ МЕТОКСИПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ АЛДЕХИД /MePEG//ПРИБЛИЗИТЕЛНО МОЛЕКУЛНО ТЕГЛО 20 kDa/ И РАЗБЪРКВАНЕТО НАРЕАКЦИОННАТА СМЕС ПРОДЪЛЖИ ПРИ СЪЩАТА ТЕМПЕРАТУРА. НИВОТО НА МОДИФИКАЦИЯ НА БЕЛТЪКА В ХОДА НА РЕАКЦИЯТА БЕШЕПРОСЛЕДЕНО ЧРЕЗ SEC HPLC, С SUPERDEX 200 HR 10/30 КОЛОНА /PHARMACIABIOTECH/, ЕЛЮИРАНА С 0.1 М НАТРИЕВО ФОСФАТЕН БУфЕР pH 6.9 ПРИ 0.7ml/мин. -95- WO 95/26746 PCT/US95/03776 СЛЕД 16 ЧАСА SEC HPLC АНАЛИЗИТЕ ПОКАЗАХА, ЧЕ ОКОЛО 90 % ОТНАЧАЛНОТО КОЛИЧЕСТВО БЕЛТЪК Е МОДИФИЦИРАНО. В ТОЗИ МОМЕНТКОНЦЕНТРАЦИЯТА НА БЕЛТЪКА В РЕАКЦИОННАТА СМЕС БЕШЕ ДОВЕДЕНА ДО 1mg/ml ЧРЕЗ РАЗРЕЖДАНЕ НА РЕАКЦИОННАТА СМЕС СЪС СТЕРИЛНА ВОДА И pHНА РЕАКЦИОННАТА СМЕС БЕШЕ ДОВЕДЕНО ДО 4 /0.5 М ОЦЕТНА КИСЕЛИНА/. MOHO-MePEG(20 kDa) MGDF КОНЮГАТА БЕШЕ ОТДЕЛЕН ОТ ИЗЛИШЪКА ОТMePEG И ДРУГИТЕ СТРАНИЧНИ РЕАКЦИОННИ ПРОДУКТИ ЧРЕЗ ЙОНООБМЕННАХРОМАТОГРАФИЯ, ЗА КОЯТО БЕШЕ ИЗПОЛЗВАНА SP SEPHAROSE /PHARMACIABIOTECH/ ЙОНООБМЕННА СМОЛА. РЕАКЦИОННАТА СМЕС БЕШЕ ПОСТАВЕНА В КОЛОНАТА /2.5 mg/ml СМОЛА/ ИНЕРЕАГИРАЛИТЕ MePEG БЯХА ЕЛЮИРАНИ С ТРИ ОБЕМА НА КОЛОНАТА ОТНАЧАЛНИЯ БУФЕР А /20 тМ НАТРИЕВ ФОСФАТ, pH 7.2, 15 % ГЛИЦЕРОЛ/. СЛЕДТОВА MePEG-MGDF КОНЮГАТА БЕШЕ ЕЛЮИРАН С ЛИНЕЕН ГРАДИЕНТ ОТ 0 % ДО25 % С 20 ОБЕМА НА КОЛОНАТА ОТ КРАЙНИЯТ БУфЕР Б /1 М NaCI В БУфЕР А/.ЕЛУАТА БЕШЕ ИЗСЛЕДВАН ПРИ 280 nm. ФРАКЦИИТЕ СЪДЪРЖАЩИ ПОЛИ-MePEG-MGDF КОНЮГАТА БЯХА СЪБРАНИ, КОНЦЕНТРИРАНИ И СТЕРИЛНОФИЛТРИРАНИ. ХОМОГЕННОСТТА НА МОНО- MePEG-MGDF КОНЮГАТИТЕ БЕШЕ ОПРЕДЕЛЕНАЧРЕЗ ЕЛЕКТРОФОРЕЗА В НАТРИЕВ ДОДЕЦИЛ СУЛФАТ ПОЛИАКРИЛАМИДЕН ГЕЛ,КАТО БЯХА ИЗПОЛЗВАНИ 4-20 % ПРЕДВАРИТЕЛНО ИЗЛЯТИ ГРАДИЕНТНИ ТЕЛОВЕ/NOVEX/. БЕШЕ ОТКРИТА ЕДНА ОСНОВНА ИВИЦА, СЪОТВЕТСТВАЩА НАПОЗИЦИЯТА НА 46,9 kDa БЕЛТЪКА. ПРЕЧИСТЕНИЯТ ПОЛИ-MePEG-MGDF КОНЮГАТ БЕШЕ АНАЛИЗИРАН ЧРЕЗ HPLCSEK, КАТО БЯХА ИЗПОЛЗВАНИ TSK-GEL G40000SWXL И G2000SWXL ГЕЛФИЛТРАЦИОННИ КОЛОНИ, СВЪРЗАНИ В СЕРИИ. БЕЛТЪЦИТЕ БЯХА ОТКРИТИЧРЕЗ UV АБСОРБЦИЯ ПРИ 280 nm. КАТО МАРКЕРИ ЗА МОЛЕКУЛНОТО ТЕГЛО НА -96- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ГЛОБУААРНИ БЕЛТЪЦИ БЯХА ИЗПОЛЗВАНИ BIO-RAD ГЕЛ ФИЛТРАЦИОННИСТАНДАРТИ. ΚΑΚΤΟ СЕ ВИЖДА НА ФИГ. 17С HPLC SEC ПОКАЗВА ЕДИН ОСНОВЕНКОМПОНЕНТ, ЕЛУАЦИОННИТЕ ПОЗИЦИИ НА КОИТО ОТГОВАРЯТ НА 181.1 kDa НАГЛОБУЛАРНИЯ БЕЛТЪК. ВИЖ СЪЩО ТАБЛИЦА 9. MOHO-MePEG-MGDF КОНЮГАТИТЕ PEG 14, PEG 15 И PEG 17 ПРИГОТВЕНИ ЧРЕЗРЕДУКТИВНО АЛКИЛИРАНЕ НА MGDF С MePEG АЛДЕХИДИ С МОЛЕКУЛНИ ТЕГЛА=6 - 25 kDa БЯХА ПОЛУЧЕНИ ПО СЪШИЯ НАЧИН. ОСНОВНИТЕ ПАРАМЕТРИ НАРЕАКЦИЯТА СА ОБОБЩЕНИ В ТАБЛИЦА 7. РЕЗУЛТАТИТЕ ОТ HPLC SEC АНАЛИЗИТЕ НА ТЕЗИ КОНЮГАТИ СА ПОКАЗАНИ ВТАБЛИЦА 9.
-97- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ТАБЛИЦА 7 ОБОБЩЕНИЕ НА ПАРАМЕТРИТЕ НА MGDF МОДИФИЦИРАЩИТЕ РЕАКЦИИ КОД РЕАКТИВ MePEG РЕАКЦИОННИ УСЛОВИЯ ВИД МТ MGDF PH Темпе- Време Моларно концентр. ратура маса съотношение mg/ml °C MePEG/MGDF PEG 9 NHS 6 KDa 2.5 8 С.Т. 0.5 15 естер PEG 10 NHS 6 KDa 2.5 8 С.Т. 0.5 10 естер PEG 11 NHS 20 KDa 2.5 8 С.Т. 0.5 10 естер PEG 12 NHS 50 KDa 2.5 8 С.Т. 0.5 5 естер PEGU АЛДЕ- 6 KDa 2.5 5 4°С 16 5 ХИД PEG 15 АЛДЕ- 12 KDa 2.5 5 4°С 16 5 ХИД PEG 16 АЛДЕ- 20 KDa 2.5 5 4°С 16 5 ХИД PEG 17 АЛДЕ- 25 KDa 2.5 5 4° С 16 10 ХИД PEG 18 АЛДЕ- 6 KDa 5 5 4°С 16 10 ХИД PEG 19 АЛДЕ- 12 KDa 5 5 4°С 16 10 ХИД PEG 20 АЛДЕ- 20 KDa 5 5 4° С 16 10 ХИД PEG 21 АЛДЕ- 25 KDa 5 5 4°С 16 10 ХИД -98- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ТАБЛИЦА 8
ОБОБЩЕНИЕ НА ПОЛИ-MePEG-MGDF ХАРАКТЕРИСТИКИТЕ ЧРЕЗ SEC HPLC КОД РЕАКТИВ MePEG MT УСТАНОВЕНО ЧРЕЗ SEC, kDa MT УСТАНОВЕНОЧРЕЗ SDS PAGE , kDa ВИД мт PEG 14 АЛДЕ- 6 KDa 44.5 27.7 ХИД PEG 15 АЛДЕ- 12 KDa 104.7 38.3 хид PEG 16 АЛДЕ- 20 KDa 181.1 46.9 хид PEG 17 АЛДЕ- 25 KDa 226.4 55.5 хид ТАБЛИЦА 8
ОБОБЩЕНИЕ НА ПОЛИ-MePEG-MGDF ХАРАКТЕРИСТИКИТЕ ЧРЕЗ SEC HPLC КОД РЕАКТИВ MePEG MT УСТАНОВЕНО ЧРЕЗ SEC, kDa MT УСТАНОВЕНОЧРЕЗ SDS PAGE , kDa вид MT PEG 14 АЛДЕ- ХИД 6 KDa 44.5 27.7 PEG 15 АЛДЕ- ХИД 12 KDa 104.7 38,3 PEG 16 АЛДЕ- ХИД 20 KDa 181.1 46.9 PEG 17 АЛДЕ- ХИД 25 KDa 226.4 55.5 12.4. ПРИГОТВЯНЕ НА DiMePEG (12 kDa)- MGDF КОНЮГАТИ ЧРЕЗ РЕДУКТИВНОАЛКИЛИРАНЕ НА MGDF С МЕТОКСИ ПОЛИ (ЕТИЛЕН ГЛИКОЛ) АЛДЕХИД (PEG 22). -99- WO 95/26746 PCT/US95/03776 В РЕЗУЛТАТ НА СЛЕДВАЩИТЕ ПРОЦЕДУРИ БЕШЕ ПОЛУЧЕНА ПРЕЧИСТЕНАМОЛЕКУЛА, НАРЕЧЕНА ТУК PEG 22. 5-ПЬТИ ИЗЛИШЪК НА МЕТОКСИ ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВ АЛДЕХИД /MePEG; Т.Е.ОНС-(СН2)2О-(СН2-СН2О)п-СН3; КЪДЕТО п=ПОВТОРЕНИЕ, ТАКОВА, ЧЕМОЛЕКУЛНОТО ТЕГЛО Е 12 kDa) (SHEARWATER POLYMERS), БЕШЕ ДОБАВЕНКЪМ 2.5 mg/ml РАЗТВОР НА MGDF /ПОЛУЧЕН В Е. coli, 1-163) В 100 тМ НАТРИЕВАЦЕТАТ, pH 5.0, ПРИ 5° С. СЛЕД СМЕСВАНЕ ЗА 10 МИН. БЕШЕ ДОБАВЕНОДОСТАТЪЧНО КОЛИЧЕСТВО НАТРИЕВ ЦИАНОБОРОХИДРИД /ALDRICH/, ТАКА ЧЕ ф ДА СЕ ДОСТИГНЕ 20 тМ КОНЦЕНТРАЦИЯ В РЕАКЦИОННАТА СМЕС. СМЕСТТА БЕШЕ РАЗБЪРКВАНА 16 ЧАСА ПРИ ПРИБЛИЗИТЕЛНО 5 0 С. СЛЕД ТОВАБЕШЕ ДОБАВЕНО ДОСТАТЪЧНО КОЛИЧЕСТВО ПРЕЧИСТЕНА ВОДА, ЗА ДА СЕ ДОВЕДЕ КОНЦЕНТРАЦИЯТА НА MGDF ДО 1 mg/ml. ТАКА ПОЛУЧЕНАТА СМЕСБЕШЕ ФИЛТРИРАНА ПРЕЗ 0.2 МИКРОНЕН ВАКУУМЕН ФИЛТЪР. ПО ТОЗИ НАЧИНБЯХА ПРИГОТВЕНИ 90 mg ОТ РЕАКЦИОННИЯ ПРОДУКТ. КЪМ СМЕСТТА НАРЕАКЦИОННИЯ ПРОДУКТ БЯХА ДОБАВЕНИ МАЛКИ КОЛИЧЕСТВА ОТ РАЗТВОРИНА 1.0 М ЕДНООСНОВЕН ФОСФАТ И 1N НАТРИЕВ ХИДРООКИС, ЗА ДА СЕ ПОЛУЧИРАЗТВОР НА 10 тМ ФОСФАТ, pH 6.8. <1 КОНЮГАТИТЕ БЯХА ПРЕЧИСТЕНИ В КАТИОН ОБМЕННА КОЛОНА. БЕШЕПРИГОТВЕНА 40 ml SP-SEPHAROSE HIGH PERFORMANCE КОЛОНА С ВИСОЧИНА 7.5 СМ. КОЛОНАТА БЕШЕ КАЛИБРИРАНА С КАЛИБРИРАЩ БУФЕР /10 тМ ФОСФАТ,pH 6.8, С 15 % ГЛИЦЕРОЛ/. В КОЛОНАТА БЕШЕ ПУСНАТА 2.2 mg/ml СМОЛА ПРИ £15ОБЕМА НА КОЛОНАТА /CV/ ЗА МИН. ТОВА БЕШЕ ПОСЛЕДВАНО ОТ ПРОМИВАНЕ СКАЛИБРИРАЩИЯТ БУфЕР ДОКАТО БЕШЕ ПОЛУЧЕНА БАЗОВА ЛИНИЯ. КОЛОНАТАБЕШЕ ЕЛУИРАНА С 10 ОБЕМА НА КОЛОНАТА ЛИНЕЕН ГРАДИЕНТ ОТ БУФЕР А /20тМ ФОСФАТ, pH 7.2 С 15 % ГЛИЦЕРОЛ/ ДО БУФЕР Б /БУФЕР А ПЛЮС 0.3 М NaHI/. -100- WO 95/26746 PCT/US95/03776 БЕШЕ ПОДДЪРЖАНА СКОРОСТ НА ПОТОКА ОТ 0,12 CV ЗА МИНУТА. ЕЛУАТА БЕШЕИЗСЛЕДВАН ПРИ 280 nm. ФРАКЦИИТЕ БЯХА ПУСНАТИ В SDS-PAGE ТЕЛОВЕ И ТЕЗИ, КОИТО СЪДЪРЖАХАDIPEG КОНЮГАТИТЕ БЯХА СЪБРАНИ И ФИЛТРИРАНИ ПРЕЗ 0.2 МИКРОНЕНФИЛТЪР. ПРИМЕР 13 БИОЛОГИЧНА АКТИВНОСТ НА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНИТЕ MGDF МОЛЕКУЛИ A. PEG-9 - PEG12 И PEG-14-PEG-21 БЕШЕ ОПРЕДЕЛЕН БРОЯ НА ТРОМБОЦИТИТЕ ОТ МИШКИ, ТРЕТИРАНИ СРЕКОМБИНАНТЕН ЧОВЕШКИ MGDF И РЕЗУЛТАТИТЕ БЯХА ПРЕДСТАВЕНИ НА фИГ.18. MGDF ПОЛУЧЕН В СНО 22 -353 /НЕЗАПЪЛНЕНИ РОМБОИДИ/, НЕ ПОЛИЕТИЛЕНГЛИКОЛИРАН, ПОЛУЧЕН В Е. coli 22-184 /НЕЗАПЪЛНЕНИ КРЪГОВЕ/ И ПОЛИЕТИЛЕНГЛИКОЛИРАН, ПОЛУЧЕН В Е. COli 22-184 /ЗАПЪЛНЕНИ КРЪГОВЕ/ ВКОНЦЕНТРАЦИИ ПОСОЧЕНИ В ОПИСАНИЕТО НА ФИГУРИТЕ ПО-ГОРЕ, БЕШЕИНЖЕКТИРАН ПОДКОЖНО В НОРМАЛНИ МИШКИ Balb/C ВЕДНЪЖ НА ДЕН, ВПРОДЪЛЖЕНИЕ НА 5 ДНИ. 24 ЧАСА СЛЕД ПОСЛЕДНАТА ИНЖЕКЦИЯ БЯХАСЪБРАНИ ПРОБИ КРЪВ ОТ МАЛЪК НАПРЕЧЕН СРЕЗ НА ОПАШНАТА ВЕНА.АНАЛИЗИТЕ НА КРЪВНИТЕ КЛЕТКИ БЯХА ПРОВЕДЕНИ С ЕЛЕКТРОНЕНАНАЛИЗАТОР НА КРЪВНИ КЛЕТКИ SYSMEX /BAXTER DIAGNOSTICS, INC.IRVINE,СА/. ДАННИТЕ СА ПРЕДСТАВЕНИ, КАТО СРЕДНА СТОЙНОСТ ОТ 4ЖИВОТНИ +/- СТАНДАРТНАТА ГРЕШКА НА МЕТОДА. ДРУГИТЕ ПАРАМЕТРИ НАКРЪВНИТЕ КЛЕТКИ КАТО ОБЩ БРОЙ НА БЕЛИТЕ КРЪВНИ КЛЕТКИ ИЛИ БРОЙ НАЧЕРВЕНИТЕ КРЪВНИ КЛЕТКИ НЕ БЯХА ЗАСЕГНАТИ ОТ ТОВА ВЪЗДЕЙСТВИЕ. ДОПЪЛНИТЕЛНИ ФОРМИ НА РЕКОМБИНАНТЕН ЧОВЕШКИ MGDF БЯХА -101- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ТЕСТУВАНИ, ПО НАЧИНА ПОСОЧЕН ПО-ГОРЕ. НА ФИГ 10 Е ПОКАЗАН БРОЯТ НАТРОМБОЦИТИТЕ ОТ МИШКА, ТРЕТИРАНА ИДИ С 50 ug/КГ./ДЕН, ИЛИ С 10ug/КГ./ДЕН, ОТ ПОСОЧЕНАТА ФОРМА r-HuMGDF. ДАННИТЕ СА ПРЕДСТАВЕНИКАТО СРЕДНА СТОЙНОСТ ОТ 4 ЖИВОТНИ И СТАНДАРНИТЕ ГРЕШКИ САПОДЧЕРТАНИ. ТАБЛИЦА 10 50ид/КГ/ДЕН Wug/КГ/ДЕН ФОРМА Средна стойностn=4 стандартнагрешкана метода Средна стойностп=4 стандартнагрешкана метода СНО 22-353 4343 309 2571 80 Е. COli 22-184 2021 29 1439 18 PEG 9 2728 56 2369 34 PEG 10 2431 291 1556 126 PEG 11 3778 59 1861 73 PEG 12 3885 156 1740 88 PEG 14 3567 80 2020 63 PEG 15 4402 57 2843 99 PEG 16 4511 239 3215 11 PEG 17 4140 188 3113 261 PEG 18 4586 59 2931 129 PEG 19 3980 330 4189 80 PEG 20 3942 285 3054 339 PEG 21 4195 145 4002 91 БАЗОВА ЛИНИЯ 939 25 ОБЯСНЕНИЕ КЪМ ТАБЛИЦА 10 ВЪВ ВСЕКИ ОТ СЛЕДВАЩИТЕ СЛУЧАИ MGDF МОЛЕКУЛАТА, КОЯТ<> ЕПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНА Е Е. coll MGDF-11 /АМИНО КИСЕЛИНИ 22-184, АКОБРОИМ ОТ НАЧАЛОТО НА СИГНАЛНИЯ ПЕПТИД ИЛИ АМИНО КИСЕЛИНИ 1-163,АКО БРОИМ ОТ НАЧАЛОТО НА ЗРЕЛИЯ БЕЛТЪК/, ΚΑΚΤΟ Е ОПИСАНО В ПРИМЕР 12ГОРЕ: -102- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ИМЕ ПОЛИЕТИЛЕН СРЕДНО МТ РЕАКТИВНА PEG ГЛИКОЛИРАНЕ НА PEG МОЛЕКУЛА ЗА СИНТЕЗА PEG 9 полиполиетилен 6kDa NHS естер на MePEG гликолиран PEG 10 полиполиетилен 6kDa NHS естер на MePEG гликолиран PEG 11 полиполиетилен 20kDa NHS естер на MePEG гликолиран PEG 12 полиполиетилен 50kDa NHS естер на MePEG гликолиран PEG 14 монополиетилен 6kDa Алдехид на MePEG гликолиран PEG 15 монополиетилен 12kDa Алдехид на MePEG гликолиран PEG 16 монополиетилен 20kDa Алдехид на MePEG гликолиран PEG 17 монополиетилен 25kDa Алдехид на MePEG гликолиран PEG 18 полиполиетилен 6kDa Алдехид на MePEG гликолиран PEG 19 полиполиетилен l2kDa Алдехид на MePEG гликолиран PEG 20 полиполиетилен 20kDa Алдехид на MePEG гликолиран PEG 21 полиполиетилен 25kDa Алдехид на MePEG гликолиран БАЗОВАТА ЛИНИЯ Е БРОЯ В НОРМАЛНИ ЖИВОТНИ, НА КОИТО НЕ СА ПРИЛАГАНИНИКАКВИ ВЕЩЕСТВА. ОЧЕВИДНО ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНЕТО НА ЧОВЕШКИЯ MGDF НЕ ВЛИЯЕОТРИЦАТЕЛНО ВЪРХУ СПОСОБНОСТТА НА МОЛЕКУЛАТА ДА УВЕЛИЧАВА БРОЯНА ТОРМБОЦИТИТЕ В ЖИВОТНИТЕ ГОСТОПРИЕМНИЦИ И МОЖЕ ДОРИ ДА УСИЛИАКТИВНОСТТА НА Е. coll ПРОДУКТА 22-184, ТАКА ЧЕ ТЯ ДА СТАНЕ ГОЛЯМАКОЛКОТО ТАЗИ НА СНО МОЛЕКУЛАТА 22-353 ИЛИ ДОРИ ПО-ГОЛЯМА. -103- WO 95/26746 PCT/US95/03776 Б. PEG *22 РЕЗУЛТАТИТЕ C PEG-22 СА ПРЕДСТАВЕНИ HA ФИГ. 24. ОСОБЕНОТО Е, ЧЕНОРМАЛИЗИРАНЕТО НА БРОЯ НА ТРОМБОЦИТИТЕ С PEG-22 НАСТЪПВАНЯКОЛКО ДНИ ПО-КЪСНО, ОТКОЛКОТО С ПОЛУЧЕН В СНО ПЪЛНОВЕРИЖЕНMGDF, PEG-16, ИЛИ PEG-17. ПРИМЕР 14 ЕКСПРЕСИЯ НА РЕКОМБИНАНТНИЯ ЧОВЕШКИ MGDF [1-163] В Е. СОП. ЗА ЕКСПРЕСИЯТА НА r-HuMGDF В Е. COli СЕКВЕНЦИЯТА, КОДИРАЩА ПЪРВИТЕ163 АМИНО КИСЕЛИНИ НА ЗРЕЛИЯ БЕЛТЪК БЕШЕ СИНТЕЗИРАНА ПО ХИМИЧЕНПЪТ, КАТО БЯХА ИЗПОЛЗВАНИ ОПТИМИЗИРАНИ КОДОНИ НА Е. coli. ВДОПЪЛНЕНИЕ ДНК СЕКВЕНЦИИТЕ, КОДИРАЩИ АМИНО КИСЕЛИНИТЕМЕТИОНИН И ЛИЗИН, БЯХА ДОБАВЕНИ КЪМ 5’ КРАЯ НА ГЕНА. ПОРАДИ ТОВА г-HuMGDF БЕЛТЪКА, КОДИРАН ОТ ТАЗИ СЕКВЕНЦИЯ Е ДЪЛЪГ 165 АМИНОКИСЕЛИНИ И ЗАПОЧВА С МЕТ-ЛИЗ. СЕКВЕНЦИЯТА НА ТОЗИ ГЕН Е ПОКАЗНА НАФИГ.25. СИНТЕЗАТА НА r-HuMGDF /1-163/ ГЕНА БЕШЕ ИЗВЪРШЕНА НА НЯКОЛКО ЕТАПА.ПЪРВО, С ПОМОЩТА НА ОПТИМИЗИРАНИ Е. coli КОДОНИ БЯХА СИНТЕЗИРАНИКОМЛПЕМЕНТАРНИ ОЛИГОНУКЛЕТИДИ /ДЪЛГИ 60 -70 дб/, ПРЕДСТАВЛЯВАЩИФРАГМЕНТИТЕ НА ГЕНА. ПО ВРЕМЕ НА ТОЗИ СИНТЕЗ КОДОНИТЕ ЗА АМИНОКИСЕЛИНИТЕ МЕТИОНИН И ЛИЗИН БЯХА ПОСТАВЕНИ НА 5’ КРАЯ НА ЗРЕЛИЯ ГЕНИ ЕДИН СТОП КОДОН БЕШЕ ПОСТАВЕН НА 3’ КРАЯ НА ГЕНА. В ДОПЪЛНЕНИЕМЕСТАТА ЗА СРЯЗВАНЕ С РЕСТРИКТАЗНИТЕ ЕНЗИМИ Xbal И Hindlll БЯХАПОСТАВЕНИ СЪОТВЕТНО В 5’ И 3 ‘ КРАИЩА НА ГЕНА, А МЯСТОТО ЗА СВЪРЗВАНЕС РИБОЗОМАТА БЕШЕ ПОСТАВЕНО НА СЪОТВЕТНОТО РАЗСТОЯНИЕ СЛЕДНАЧАЛНИЯ МЕТИОНИН. ВТОРО, КОМПЛЕМЕНТАРНИТЕ ГЕННИ -104- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ОЛИГОНУКЛЕОТИДИ ЗА ВСЕКИ ГЕНЕН ФРАГМЕНТ БЯХА ТЕМПЕРИРАНИ. ТРЕТО,ТЕЗИ САМОСТОЯТЕЛНИ СИНТЕТИЧНИ ГЕННИ ФРАГМЕНТИ БЯХА НАМНОЖЕНИЧРЕЗ ПОЛИМЕРАЗНА ВЕРИЖНА РЕАКЦИЯ. НАМНОЖЕНИТЕ ЕЛЕМЕНТИ БЯХАСУБКЛОНИРАНИ В ПОДХОДЯЩ ВЕКТОР. ПЕТО, БЯХА ПРОВЕРЕНИ СЕКВЕНЦИИТЕНА СУБКЛОНИРАНИТЕ ФРАГМЕНТИ. ШЕСТО, САМОСТОЯТЕЛНИТЕ ФРАГМЕНТИБЯХА СВЪРЗАНИ ЗАЕДНО И СУБКЛОНИРАНИ В ПОДХОДЯЩ ВЕКТОР,ВЪЗПРОИЗВЕЖАЩ r-HuMGDF ГЕН С ПЪЛНА ДЪЛЖИННА. НАКРАЯ, СЕКВЕНЦИЯТАНА КОНСТРУИРАНИЯ ГЕН БЕШЕ ПРОВЕРЕНА. СИНТЕТИЧНИЯТ r-HuMGDF ГЕНЕН ФРАГМЕНТ, СЪДЪРЖАЩ РЕСТРИКЦИОННИМЕСТА Xbal И Hindlll СЪОТВЕТНО В 5’ И 3’ КРАИЩАТА, СЪДЪРЖАШЕ МЯСТО ЗАСВЪРЗВАНЕ С РИБОЗОМАТА, НАЧАЛЕН АГГ КОДОН, СЕКВЕНЦИЯ, КОДИРАЩАЗРЕЛИЯ МЕТ-ЛИЗ r-HuMGDF БЕЛТЪК И СТОП КОДОН. ГОРЕПОСОЧЕНИЯ ФРАГМЕНТ БЕШЕ СВЪРЗАН В Xbal И Hindlll МЕСТАТА НАЛАКТОЗА-ЗАВИСИМИЯ ЕКСПРЕСИОНЕН ВЕКТОР pAMG11. ВЕКТОРЪТ pAMG11 ЕПЛАЗМИД С МАЛЪК БРОЙ КОПИЯ И ИМА НАЧАЛО НА РЕПЛИКАЦИЯ,ПРОИЗХОЖДАЩО ОТ pR100. ЕКСПРЕСИОННИЯТ ПЛАЗМИД pAMG11 МОЖЕ ДАБЪДЕ ПОЛУЧЕН ОТ pCFM1656 /АТСС # 69576, ДЕПОЗИРАН НА 24 ФЕВРУАРИ1994/ ЧРЕЗ СЕРИЯ ОТ МЯСТО-НАСОЧЕНИ ПРОМЕНИ НА БАЗИ ЧРЕЗ ДУБЛИРАЩАОЛИГО МУТАЗЕНЕЗАТА PCR. АКО ЗАПОЧНЕМ ОТ Bgl II МЯСТОТО / дб #180 В W ПЛАЗМИДА/ НЕПОСРЕДСТВЕНО НА 5’ КЪМ РЕПЛИКАЦИОННИЯ ПРОМОТОР НАПЛАЗМИДА РсорВ И ПРОДЪЛЖИМ КЪМ РЕПЛИКАЦИОННИТЕ ГЕНИ НА ПЛАЗМИДАЗАМЕНИТЕ НА ДВОЙКИ БАЗИ СА ΚΑΚΤΟ СЛЕДВА: -105- WO 95/26746 PCT/US95/03776
pamgii bp ♦ bp in pcfmi656 bp changed to in pAMGll # 204 T/A C/G # 428 A/T G/C 5 # 509 . G/C A/T # 617 - - insert two G/C bp # 679 G/C T/A # 980 T/A C/G # 994 G/C A/T 10 # 1004 A/T C/G # 1007 C/G T/A # 1028 A/T T/A # 1047 C/G T/A # 1178 G/C T/A 15 # 1466 G/C T/A # 2028 G/C bp deletion # 2187 C/G T/A * 2480 A/T T/A 20 # 2499-2502 AGTG GTCA TCAC CAGT # 2642 TCCS&amp;GC bp deletion AGGCTCG 25 # 3435 G/C A/T # 3446 G/C A/T # 3643 A/T T/A 30 # 4489-4512 insert bps
GAGCTCACTAGTGTCGACCTGCAG
CTCGAGTGATCACAGCTGGACGTC /СЕКВЕНЦИЯ No30,31/ ЗАМЯНА HA ДНК СЕКВЕНЦИЯТА МЕЖДУ РЕСТРИКЦИОННИТЕ МЕСТА Aatll И ClalЕ СЪС СЛЕДНИТЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДИ: -106- WO 95/26746 PCT/US95/03776
Aatll (#4358) 5’ CTCATAATTTTTAAAAAATTCATTTGACAAATGCTAAAATTCTT- 3’ TGCAGAGTATTAAAAATTTTTTAAGTAAACTGTTTACGATTTTAAGAA- -GATTAATATTCTCAATTGTGAGCGCTCACAATTTAT 3’ -CTAATTATAAGAGTTAACACTCGCGAGTGTTAAAATAGC 5’
Cla I (#4438) /СЕКВЕНЦИИ No 32,33/ ЕКСПРЕСИЯТА HA r-HuMGDF, КЛОНИРАН B pAMG11 Е ПРОВЕДЕНА ЧРЕЗСИНТЕТИЧЕН ААКТОЗА-ЗАВИСИМ ПРОМОТОР, КАТО Ps4, КОЙТО ИМА СЛЕДНАТАСЕКВЕНЦИЯ: 5’ GACGTCTCATAATTTTTAAAAAATTCATTTGACAAATGCTAAA- -ATTCTTGATTAATATTCTCAATTGTGAGCGCTCACAATTTATCGAT 3’ /СЕКВЕНЦИЯ No 34/ ПРОМОТОРЪТ PS4 СЕ ПОДТИСКА ОТ ЛОКТОЗЕН РЕПРЕСОР /Lad/, ПРОДУКТ ОТЕ. coli lad ГЕНА. ПААЗМИДЪТ pAMG11r-HuMGDF БЕШЕ ВЪВЕДЕН В Е. coli ЩАМ К-12, ИМАЩlac I4 АЛЕЛ. lac I4 АЛЕЛЪТ Е МУТАЦИЯ В ГРАНИЦИТЕ НА lac I ПРОМОТОРА, КОЯТОУСИЛВА ЕКСПРЕСИЯТА НА Lad И ВОДИ ДО ПО-СТРОГ КОНТРОЛ НАЕКСПРЕСИЯТА НА БЕЛТЪКА ОТ Ps4 ПРОМОТОРА. ПОРАДИ ТОВА В ТОЗИ ЩАМПРИ ЛИПСА НА ЛАКТОЗА ЕКСПРЕСИЯТА НА r-HuMGDF Е ПОДТИСНАТА ОТ Lacl.СЛЕД ДОБАВЯНЕ НА ЛАКТОЗА Lac I БЕЛТЪКА, СВЪРЗАН С МЯСТОТО НАОПЕРАТОРА В PS4 ПРОМОТОРА СЕ ОТДЕЛЯ И ЗАПОЧВА ТРАНСКРИПЦИЯТА НА г-HuMGDF ОТ PS4. КЛЕТКИТЕ ГОСТОПРИЕМНИЦИ Е. coli, ИЗПОЛЗВАНИ В ТОЗИПРИМЕР СА ЗАПАЗЕНИ ПОД АТСС # 69717 ОТ 30 НОЕМВРИ 1994. -107- WO 95/26746 PCT/US95/03776 КЛЕТКА ГОСТОПРИЕМНИК Е. COli ATCC # 69171 БЕШЕ ТРАНСФОРМИРАНА СpAMG11-r-HuMGDF ПЛАЗМИД И БЕШЕ РАЗМНОЖЕНА СПОРЕД СЛЕДНОТООПИСАНИЕ НА ФЕРМЕНТАЦИЯТА. ЩАМЪТ Е. coll БЕШЕ ПОСТАВЕН ВХРАНИТЕЛНА СРЕДА LURIA И ИНКУБИРАН ПРИ 37° С ЗА ПРИБЛИЗИТЕЛНО 12ЧАСА. СЛЕД ТОВА КЛЕТКИТЕ БЯХА ПРЕНЕСЕНИ АСЕПТИЧНО ВЪВФЕРМЕНТАТОР, СЪДЪРЖАЩ СЛОЖНА СРЕДА (20 g/L ДРОЖДЕН ЕКСТРАКТ; 3.4 g/LЛИМОНЕНА КИСЕЛИНА; 15 g/L К2НРО4 ; 15 ml DOW Р2000; 5 g/L ГЛУКОЗА; 1 g/LMgSO4.7H2O; 5.5 ml/L СЛЕДИ ОТ МЕТАЛИ; 5.5 ml/L ВИТАМИНИ). ТАЗИ ФАЗА НАПРОЦЕЦА ПРОДЪЛЖИ ДОКАТО КУЛТУРАТА ДОСТИГНА ОПТИЧНА ПЛЪТНОСТ 5.0±1.0 ПРИ 600 nm. СЛЕД ТОВА ЗАПОЧНА ФАЗАТА НА ПОДАВАНЕ НА СРЕДА С © ВНАСЯНЕТО НА ПЪРВАТА СРЕДА (700 g/L ГЛЮКОЗА; 6.75 g/L MgSO4 . 7Н2О).СКОРОСТТА НА ПОДАВАНЕ БЕШЕ РЕГУЛИРАНА НА ВСЕКИ ДВА ЧАСА ПОУСТАНОВЕНА СХЕМА. ВНАСЯНЕТО НА ВТОРАТА ХРАНИТЕЛНА СРЕДА (129 g/LTRYPTICASE ПЕПТОН; 258 g/L ДРОЖДЕН ЕКСТРАКТ) ЗАПОЧНА, КОГАТОКУЛТУРАТА ДОСТИГНА ОПТИЧНА ПЛЪТНОСТ 20-25 ПРИ 600 nm. ЗА ВТОРАТАСРЕДА БЕШЕ ПОДДЪРЖАНА ПОСТОЯННА СКОРОСТ НА ПОТОКА, ДОКАТОСКОРОСТТА НА ПЪРВАТА ХРАНИТЕЛНА СРЕДА ПРОДЪЛЖИ ДА СЕ РЕГУЛИРА. ПОВРЕМЕ НА ЦЯКАТА ФЕРМЕНТАЦИЯ БЕШЕ ПОДДЪРЖАНА ТЕМПЕРАТУРА ОКОЛО30° С. В КУЛТУРАТА БЕШЕ ПОДДЪРЖАНО pH 7 ЧРЕЗ ДОБАВЯНЕ СПОРЕДНУЖДАТА НА КИСЕЛИНА ИЛИ ОСНОВА. ЖЕЛАНОТО НИВО НА РАЗТВОРЕНИЯКИСЛОРОД БЕШЕ РЕГУЛИРАНО ЧРЕЗ РАЗБЪРКВАНЕ И СКОРОСТТА НА © ПОДАВАНЕ НА ВЪЗДУХ И КИСЛОРОД ВЪВ ФЕРМЕНТАТОРА. КОГАТО ОПТИЧНАТАПЛЪТНОСТ НА КУЛТУРАТА ДОСТИГНА 57-63 ПРИ 600 nm ЗАПОЧНА ДОБАВЯНЕТО*НА ТРЕТАТА ХРАНИТЕЛНА СРЕДА. ТРЕТАТА ХРАНИТЕЛНА СРЕДА (300g/LЛАКТОЗА) БЕШЕ ПОДАВАНА ВЪВ ФЕРМЕНТАТОРА С ПОСТОЯННА СКОРОСТ НАПОТОКА; ДОБАВЯНЕТО НА ТРЕТАТА ХРАНИТЕЛА СРЕДА Е ПРЕУСТАНОВЕНО ИСКОРОСТТА НА ПОТОКА НА ВТОРАТА ХРАНИТЕЛНА СРЕДА Е ПРОМЕНЕНА НАНОВА ПОСТОЯННА СКОРОСТ. ФЕРМЕНТАЦИЯТА ПРОДЪЛЖИ ПРИБЛИЗИТЕЛНО 10ЧАСА СЛЕД ВНАСЯНЕ НА ТРЕТАТА ХРАНИТЕЛНА СРЕДА. В КРАЯ НА -108- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ФЕРМЕНТАЦИЯТА КУЛТУРАТА Е ОХЛАДЕНА ДО 15 ± 5° С. КЛЕТКИТЕ БЯХАОТДЕЛЕНИ ЧРЕЗ ЦЕНТРОФУГИРАНЕ. ПОЛУЧЕНАТА МАСА БЕШЕ ОПАКОВАНА ИСЪХРАНЯВАНА ПРИ < - 60 0 С. ПРЕЧИСТВАНЕТО НА РЕКОМБИНАНТНИЯ MGDF, ПРОИЗВЕДЕН В Е. coll, ΚΑΚΤΟ ЕОПИСАНО ПО-ГОРЕ, БЕШЕ ПРОВЕДЕНО ΚΑΚΤΟ СЛЕДВА. ХИЛЯДА ИОСЕМСТОТИН ГРАМА ОТ КЛЕТЪЧНАТА МАСА БЕШЕ СУСПЕНДИРАНА В ОКОЛО 18ЛИТРА 10 mM EDTA И ПУСНАТА ПРЕЗ ХОМОГЕНИЗАТОР ПОД ВИСОКО НАЛЯГАНЕПРИ 15,000 psi. СУСПЕНЦИЯТА ОТ РАЗРУШЕНИ КЛЕТКИ БЕШЕ ЦЕНТРОФУГИРАНАИ УТАЙКАТА БЕШЕ СУСПЕНДИРАНА В 10 ЛИТРА 10 mM EDTA. СУСПЕНЗИЯТА © БЕШЕ ЦЕНТРОФУГИРАНА И 200 д. УТАЙКА БЕШЕ РАЗТВОРЕНА В 2 ЛИТРА 10 тМТРИС, 8 М ГУАНИДИН ХИДРОХЛОРИД, 10 mm DTT, 5 mM EDTA, pH 8.7. ТОЗИРАЗТВОР БЕШЕ ПРИБАВЕН БАВНО КЪМ 200 ЛИТРА 10 mM CAPS, 3 М УРЕЯ, 30 %ГЛИЦЕРОЛ, 3 тМ ЦИСТАМИН, 1 тМ ЦИСТЕИН, рН10.55. РАЗРЕДЕНИЯТ РАЗТВОР БЕШЕ РАЗБЪРКВАН БАВНО 16 ЧАСА ПРИ СТАЙНАТЕМПЕРЕТУРА И СЛЕД ТОВА pH БЕШЕ ДОВЕДЕНО ДО 6.8. РАЗТВОРЪТ СКОРИГИРАНО pH БЕШЕ ПРЕЧИСТЕН И ПУСНАТ В 2 ЛИТРОВА CM SEEPHAROSEКОЛОНА, КАЛИБРИРАНА С 10 тМ НАТРИЕВ ФОСФАТ, 1,5 М УРЕЯ, 15 % ГЛИЦЕРОЛ,pH 6.8. СЛЕД ТОВА КОЛОНАТА БЕШЕ ПРОМИТА С 10 тМ НАТРИЕВ ФОСФАТ, 15 %ГЛИЦЕРОЛ pH 7.2. MGDF БЕШЕ ЕЛУИРАН С ГРАДИЕНТ ОТ 0 ДО 0.5 М НАТИРЕВ © ХЛОРИД, 10 тМ НАТРИЕВ ФОСФАТ, pH 7.2. СМ ЕЛУАТА БЕШЕ КОНЦЕНТРИРАН И БУфЕРИРАН С 10 тМ НАТРИЕВ ФОСФАТ,pH 6.5 ЧРЕЗ МЕМБРАНА С РАЗДЕЛИТЕЛНА СПОСОБНОСТ 10.000 МОЛЕКУЛНОТЕГЛО. КОНЦЕНТРИРАНИЯТ ДО ОКОЛО 2 mg/ml РАЗТВОР БЕШЕ ТРЕТИРАН СCATEPCIN С (500 КЪМ 1 МОЛАРНО СЪОТНОШЕНИЕ) ЗА 90 МИНУТИ ПРИТЕМПЕРАТУРАТА НА СРЕДАТА. -109- WO 95/26746 PCT/US95/03776 РАЗТВОРЪТ БЕШЕ ПУСНАТ В 1.2 АИТРОВА SP HPSC КОЛОНА, КАЛИБРИРАНА С 10тМ НАТРИЕВ ФОСФАТ, 15 % ГЛИЦЕРОЛ, pH 7.2. MGDF БЕШЕ ЕЛЮИРАН СГРАДИЕНТ ОТ 0.1 ДО 0.25 М НАТИРЕВ ХЛОРИД, 10 тМ НАТРИЕВ ФОСФАТ, pH 7.2. КЪМ ЕЛУАТА ОТ SP НРС БЕШЕ ДОБАВЕН 0.6 М АМОНИЕВ СУЛфАТ. ЕЛУАТЪТБЕШЕ ПУСНАТ В 1.6 АИТРОВА PHENIL TOYOPEARL КОЛОНА, КАЛИБРИРАНА С 10тМ НАТРИЕВ ФОСФАТ, 0.6 М АМОНИЕВ СУЛфАТ, pH 7.2. MGDF БЕШЕ ЕЛУИРАН СГРАДИЕНТ ОТ 0.6 ДО 0 М АМОНИЕВ СУЛфАТ, 10 тМ НАТРИЕВ ФОСФАТ, pH 7.2. PHENIL TOYOPEARL ЕЛУАТА БЕШЕ КОНЦЕНТРИРАН И БУфЕРИРАН С МЕМБРАНА СРАЗДЕЛИТЕЛНА СПОСОБНОСТ 10.000 МОЛЕКУЛНО ТЕГЛО В 10 тМ ТРИС, 5 %СОРБИТОЛ, pH 7.5. ПРИМЕР 15 IN VIVO БИОЛОГИЧНИ СВОЙСТВА НА r-HuMGDF/Е, coli 1-1637 БИОЛОГИЧНАТА ЕФЕКТИВНОСТ НА r-HuMGDF /Е. coll 1-163/, ПРИГОТВЕН ΚΑΚΤΟЕ ОПИСАНО В ПРИМЕР 14 ГОРЕ, БЕШЕ ОЦЕНЕНА В ГРИЗАЧИ. НОРМАЛНИЖЕНСКИ МИШКИ Balb/C БЯХА ИНЖЕКТИРАНИ ПОДКОЖНО ЗА 5 ДНИ СНАРАСТВАЩИ ДОЗИ r-HuMGDF. ДОЗИТЕ ВАРИРАХА ОТ 15 ug/КГ/ДЕН ДО 1500ug/КГ/ДЕН. ДВАДЕСЕТ И ЧЕТИРИ ЧАСА СЛЕД ПОСЛЕДНАТА ИНЖЕКЦИЯ БРОЯТНА КРЪВНИТЕ КЛЕТКИ БЕШЕ ОПРЕДЕЛЕН С ЕЛЕКТРОНЕН БРОЯ НА КЛЕТКИ/SYSMEX, BAXTER/. БЕШЕ УСТАНОВЕНО, ЧЕ ПРИ ЛОГАРИТМИЧНО УВЕЛИЧАВАНЕНА ДОЗИТЕ НА ЦИТОКИНА, УВЕЛИЧЕНИЕТО НА БРОЯ НА ТРОМБОЦИТИТ| ЕЛИНЕЙНО. ПРИ 1500 ug/КГ/ДЕН В СИСТЕМАТА БРОЯТ НА ТРОМБОЦИТИТЕНАРАСТНА ДО 300 % ОТ ОСНОВНОТО НИВО. ПАРАМЕТРИТЕ НА ДРУГИТЕ КРЪВНИКЛЕТКИ КАТО БРОЙ НА БЕЛИТЕ И ЧЕРВЕНИТЕ КРЪВНИ КЛЕТКИ И ХЕМАТОКРИТАНЕ БЯХА ЗАСЕГНАТИ ОТ ТОВА ТРЕТИРАНЕ. ОТ ЗАЙЦИ, ИНЖЕКТИРАНИ ПОДКОЖНО С 300 ug/КГ/ДЕН r-HuMGDF /Е. coll 1 -163/ЗА 6 ДНИ БЯХА СЪБРАНИ ТРОМБОЦИТИ И ОЦЕНЕНИ ЗА СПОСОБНОСТТА ИМ ДА -110- WO 95/26746 PCT/US95/03776 АГРЕГИРАТ В ОТГОВОР НА ADP. ДАННИТЕ ПОКАЗВАТ, ЧЕ ТРОМБОЦИТИТЕ НАТРЕТИРАНИТЕ ЖИВОТНИ СА ПРАКТИЧЕСКИ НЕРАЗЛИЧИМИ ОТ ТЕЗИ НАКОНТРОЛНИТЕ ЖИВОТНИ. И ДВЕТЕ ПОПУЛАЦИИ СА ЕДНАКВО ЧУВСТВИТЕЛНИKbMADP. СЪЩО ТАКА r-HuMGDF БЕШЕ ОЦЕНЕН ПО СПОСОБНОСТТА МУ ДАПРОТИВОДЕЙСТВА НА ТРОМБОЦИТОПЕНИЯ, ПОЛУЧЕНА ВСЛЕДСТВИЕХИМИОТЕРАПИЯ И/ИЛИ ОБЛЪЧВАНЕ. В ТЕЗИ ИЗСЛЕДВАНИЯ БЕШЕ ИЗПОЛЗВАНАКАРБОПЛАТИНА - ХИМИОТЕРАПЕВТИКА, КОЙТО ПРЕДИЗВИКВАТРОМБОЦИТОПЕНИЯ ПРИ ХОРА. МИШКИ Balb/C БЯХА ПОДКОЖНО © ИНЖЕКТИРАНИ С 1.25 mg КАРБОПЛАТИНА В НАЧАЛОТО НА ИЗСЛЕДВАНЕТО.СЛЕД 24 ЧАСА И ЗА ОСТАТЪКА НА ИЗСЛЕДВАНЕТО МИШКИТЕ БЯХАИНЖЕКТИРАНИ ВСЕКИ ДЕН С 100 ug/КГ/ДЕН r-HuMGDF /Е. coli 1 - 163/, ИЛИИНЕРТЕН НОСИТЕЛ. ДО 9 ДЕН БРОЯТ НА ТРОМБОЦИТИТЕ В МИШКИТЕ,ТРЕТИРАНИ С ИНЕРТНИЯ НОСИТЕЛ БЕШЕ НАМАЛЯЛ ДО ПРИБЛИЗИТЕЛНО 15 % ОТНОРМАЛНОТО, НО БЕШЕ ОСТАНАЛ В НОРМАЛНИ ГРАНИЦИ ПРИ МИШКИТЕТРЕТИРАНИ С r-HuMGDF /ВИЖ фИГ. 20/. ЗА РАДИАЦИОННИТЕ ИЗСЛЕДВАНИЯМИШКИТЕ БЯХА ОБЛЪЧЕНИ С ЕДИНИЧНА ДОЗА ОТ 500 RAD ГАМА-РАДИАЦИЯ/ЦЕЛЗИЕВ ИЗТОЧНИК/. ТОВА Е СУБЛЕТАЛНА ДОЗА, В РЕЗУЛТАТ НА КОЯТО СЕПОЛУЧАВА НАМАЛЕМНИЕ НА ТРОМБОЦИТИТЕ С 90 % ДО ДЕН 11. БРОЯТ НАТРОМБОЦИТИТЕ НЕ СЕ ВЪЗСТАНОВИ В НОРМАЛНИ ГРАНИЦИ ДО ДЕН 21. КОГАТОф НА ОБЛЪЧЕНИТЕ МИШКИТЕ БЕШЕ ПРИЛОЖЕН r-HuMGDF /Е. coli 1 - 163/ ВЕДНЪЖ НА ДЕН /100 ug/КГ/ДЕН/ ОТ ДЕН 1 ДО ДЕН 20, НАМАЛЯВАНЕТО НА БРОЯ НА»ТРОМБОЦИТИТЕ БЕШЕ ПО-СЛАБО И ВЪЗСТАНОВЯВАНЕТО ДО НОРМАЛНИГРАНИЦИ ПО-БЪРЗО, ОТКОЛКОТО ПРИ МИШКИТЕ, ТРЕТИРАНИ С ИНЕРТНИЯНОСИТЕЛ. /ФИГ.21/. ЗА ДА БЪДЕ ТЕСТВАН r-HuMGDF В МОДЕЛ СЪС СИЛНА ИПРОДЪЛЖИТЕЛНА ТРОМБОЦИТОПЕНИЯ, КАРБОПЛАТИНАТА И РАДИАЦИЯТАБЯХА ПРИЛОЖЕНИ В КОМБИНАЦИЯ /фИГ.22/. ПРИ ТЕЗИ ОБСТОЯТЕЛСТВА БРОЯТНА ТРОМБОЦИТИТЕ СПАДНА ДО ИЗКЛЮЧИТЕЛНО НИСКИ НИВА /3-5 % ОТНОРМАЛНОТО/ И ПОВЕЧЕТО ОТ ЖИВОТНИТЕ (7/8) НЕ ОЦЕЛЯХА СЛЕД ТОВА -111- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ТРЕТИРАНЕ. КОГАТО ОБАЧЕ НА ЖИВОТНИТЕ БЯХА ПРИЛАГАНИ ЕЖЕДНЕВНИПОДКОЖНИ ИНЖЕКЦИИ С 100 ug/КГ/ДЕН r-HuMGDF ЗА ПЕРИОДА НАИЗСЛЕДВАНЕТО, ТРОМБОЦИТОПЕНИЯТА БЕШЕ ЗНАЧИТЕЛНО ОБЛЕКЧЕНА,ВЪЗСТАНОВЯВАНЕТО НА НОРМАЛНИЯ БРОЙ БЕШЕ ПО-БЪРЗО И ВСИЧКИТРЕТИРАНИ С r-HuMGDF ЖИВОТНИ (8/8) ОЦЕЛЯХА. r-HuMGDF БЕШЕ ОЦЕНЕН И В МАЙМУНИ RHESUS. НОРМАЛНИ МАЙМУНИ RHESUSБЯХА ПОДКОЖНО ИНЖЕКТИРАНИ ИЛИ С 2.5 ИЛИ С 25 ug/КГ/ДЕН ЗА 10 ДНИ (ДНИ0 - 9). ПРИ ГРУПАТА, ПОЛУЧИЛА ПО-НИСКА ДОЗА БРОЯТ НА ТРОМБОЦИТИТЕ СЕУВЕЛИЧИ С 400 % ДО ДЕН 12, А ПРИ ГРУПАТА, ПОЛУЧИЛА ПО-ВИСОКАТА ДОЗА ТЕСЕ УВЕЛИЧИХА СЪС 700 % ДО ДЕН 12. СЛЕД КАТО ИНЖЕКЦИИТЕ БЯХА СПРЯНИБРОЯТ НА ТРОМБОЦИТИТЕ СЕ ВЪЗСТАНОВИ ДО НОРМАЛНИЯ ДО ДЕН 25-30.БРОЯ НА БЕЛИТЕ И НА ЧЕРВЕНИТЕ КРЪВНИ КЛЕТКИ НЕ БЕШЕ ПОВЛИЯН ОТ ТОВАТРЕТИРАНЕ. r-HuMGDF /Е. coif 1 - 163/ БЕШЕ ТЕСТВАН И В МОДЕЛ НА ПРИМАТ С ТЕЖКАТРОМБОЦИТОПЕНИЯ (фИГ. 23). ЖИВОТНИТЕ БЯХА ПОДЛОЖЕНИ НА РАДИАЦИЯ(700 RAD, КОБАЛТОВ ИЗТОЧНИК), В РЕЗУЛТАТ НА КОЕТО ДО 15 ДЕН БРОЯ НАТРОМБОЦИТИТЕ НАМАЛЯ ДО 1-2 % ОТ НОРМАЛНО. ДО ДЕН 35-40 БРОЯТ НАТРОМБОЦИТИТЕ СЕ ВЪЗСТАНОВИ ДО НОРМАЛНИЯ. В КОНТРАСТ С ТОВА БРОЯТНА ТРОМБОЦИТИТЕ В ОБЛЪЧЕНИ ЖИВОТНИ, ТРЕТИРАНИ С 25 ul/КГ/ДЕНr-HuMGDF ДНЕВНО НАМАЛЯ САМО С 10 % ОТ НОРМАЛНОТО И ВЗЕТО СРЕДНО НЕПАДНА ПОД 20,000/ul, НИВОТО ОТ КОЕТОЗАПОЧВАТ ДА СЕ ПРАВЯТ ВЛИВАНИЯТАТРОМБОЦИТИ НА ХОРА С ТРОМБОЦИТОПЕНИЯ. СЪЩО ТАКАВЪЗСТАНОВЯВАНЕТО НА БРОЯ ДО НОРМАЛНОТО НИВО БЕШЕ ПО-БЪРЗО ПРИТРЕТИРАНИТЕ С r-HuMGDF ЖИВОТНИ, ДО ДЕН 20. ТЕЗИ IN VIVO ДАННИ ОТ ИЗСЛЕДВАНИЯТА С ГРИЗАЧИ И ПРИМАТИ НАПЪЛНОПОДКРЕПЯТ ИДЕЯТА, ЧЕ r-HuMGDF /Е. coli 1 - 163/ Е МОЩЕН ТЕРАПЕВТИЧЕНАГЕНТ, СПОСОБЕН ЗНАЧЙТЕЛНО ДА ВЪЗДЕЙСТВА НА ТРОМБОЦИТОПЕНИИ. -112- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ПРИМЕР 16 МЕ10Д^ПРОИЗВОДСТВОЬАг-НиМОаГ1-332
ГАИКОЗИАИРАНИЯ r-HuMGDF 1-332 Е ПРОИЗВЕДЕН ОТ ТРАНСФЕКТИРАНИКЛЕТКИ ОТ ЯЙЧНИК НА КИТАЙСКИ ХАМСТЕР, ЕКСПРЕСИРАЩИ кДНК ЗАr-HuMGDF 1-332 ПРИ ПОДХОДЯЩ ПРОМОТОР И СВЪРЗАН С ГЕН, КОДИРАЩСЕЛЕКЦИОНЕН МАРКЕР DHFR. ПОДХОДЯЩ ПРОМОТОР ЗА ЕКСПРЕСИЯТА НАr-HuMGDF В КЛЕТКИ СНО Е SRa. ВИЖ MOL. CELL. BIOL. 8:466-472 (1988) И WO © 91/13160 (1991). ПОДХОДЯЩ ВЕКТОР ЗА ЕКСПРЕСИЯТА НА r-HuMGDF В СНО КЛЕТКИ Е pDSRa2. ВИЖ WO90/14363 (1990). ПРИМЕРНИ ЛИНИИ ОТ СНО КЛЕТКИМОГАТ ДА ПРОИЗВЕЖДАТ В СТАНДАРТНА КУЛТУРАЛНА СРЕДА СЕКРЕТИРАНMGDF В РАМКИТЕ НА 10-20 mg/L, КАТО ТОВА КОЛИЧЕСТВО МОЖЕ ДА БЪДЕУВЕЛИЧЕНО ДО 25 - > 100 mg/L. ЗА ПРОИЗВОДСТВО НА MGDF В ТИПИЧНАКЛЕТЪЧНА ЛИНИЯ КУЛТУРАТА МОЖЕ ДА БЪДЕ РАЗШИРЕНА ЧРЕЗ ПАСИРАНЕ ВСУСПЕНЗИЯ ИЛИ В СЪДОВЕ ЗА ТЪКАННИ КУЛТУРИ, ЧРЕЗ МЕТОДА НАПРИЛЕПВАНЕ И С ИЗПОЛЗВАНЕТО НА СРЕДА, СЪСТАВЕНА ОТ ЕДНАКВИ ЧАСТИOULBECCO МОДИФИЦИРАНА EAGLE СРЕДА (DMEM) И HAM'S 12 (DMEM/F12,GIBCO), КЪМ КОЯТО Е ДОБАВЕН 5 -10 % ЕМБРИОНАЛЕН ТЕЛЕШКИ СЕРУМ (FBS)ИЛИ ДИАЛИЗИРАН ЕМБРИОНАЛЕН ТЕЛЕШКИ СЕРУМ И METHOTREXATE /МТХ/ © /ТИПИЧНАТА КОНЦЕНТРАЦИЯ НА МТХ 200-600 пМ/ ЗА ПОДДЪРЖАНЕ НАСЕЛЕКЦИОННО НАЛЯГАНЕ. КЪМ ТАЗИ СРЕДА ТРЯБВА ДА БЪДАТ ДОБАВЕНИ^ ВИЗЛИШЪК НЕЗАМЕНИМИ АМИНО КИСЕЛИНИ /DEAA/ И ГЛУТАМИН.СУСПЕНЗИОННИТЕ КУЛТУРИ МОГАТ ДА СЕ РАЗМНОЖАВАТ СВОБОДНО МЕЖДУПЪРВОНАЧАЛНАТА /РАЗДЕЛИТЕЛНА/ ПЛЪТНОСТ 1-4 х 105 КЛЕТКИ/mL ИМАКСИМАЛНАТА ПЛЪТНОСТ ОТ КОЛО 1 х 106 КЛЕТКИ/ mL, ПРИ ДОСТИГАНЕТО НАКОЯТО КУЛТУТРИТЕ СЕ РАЗШИРЯВАТ ЧРЕЗ РАЗРЕЖДАНЕ В ПО-ГОЛЕМИ ОБЕМИ СПЪРВОНАЧАЛНА ПЛЪТНОСТ НА КЛЕТКИТЕ ДО ДОСТИГАНЕ НА СПЕЦИФИЧНИРАЗДЕЛИТЕЛНИ ПЛЪТНОСТИ. -113- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ЗА ПРОИЗВОДСТВОТО НА MGDF В БУТИЛКИ ЗА КЛАТАЧКА СЪОТВЕТНИЯ ОБЕМ ИКЕТЪЧНА ПЛЪТНОСТ НА СУСПЕНЗИЯТА МОГАТ ДА БЪДАТ ПОСТИГНАТИ ИЛИ ЧРЕЗИЗПОЛЗВАНЕ НА СЪДОВЕ С ВЪРТЯЩА СЕ МАГНИТНА БЪРКАЛКА, ПОСТАВЕНИТЕМПЕРАТУРНО КОНТРОЛИРАНА СРЕДА (37 ± 1 0 С), ИЛИ ЧРЕЗ КОНТРОЛИРАНАБИОРЕАКТОРНА СИСТЕМА, СНАБДЕНА С КОНТРОЛНО-ИЗМЕРВАТЕЛНИУСТРОЙСТВА И БЪРКАЧКА. В БУТИЛКИТЕ ЗА КЛАТАЧКА, ( КАТО 850 см2 БУТИЛКИЗА КЛАТАЧКА FALKON) ТРЯБВА ДА БЪДАТ НАПРАВЕНИ ПОСЯВКИ С НАЧАЛНАПЛЪТНОСТ ОТ 1.5 ДО 3 х 107 КЛЕТКИ НА БУТИЛКА И ДА БЪДЕ ДОБАВЕНАДОПЪЛНИТЕЛНА ХРАНИТЕЛНА СРЕДА (DMEM/F12 С 5-10 % FBS, 1Х NEAA И 1Х L-ГЛУТАМИН) В КОЛИЧЕСТВА, ПОДХОДЯЩИ ЗА СЪЗДАВАНЕТО НА ПЛЪТЕН Ф МОНОСЛОЙ ЗА 3-4 ДНИ (150 - 300 mL НА БУТИЛКА). ХРАНИТЕЛНАТА СРЕДАТРЯБВА ДА БЪДЕ ПОДХОДЯЩО БУфЕРИРАНА С НАТРИЕВ БИКАРБОНАТ ДОДОСТИГАНЕ НА pH ОТ 6.9 ДО 7.2 В РАВНОВЕСИЕ С ВЪГЛЕРОДЕН ДВУОКИС ПРИПАРЦИАЛНО НАЛЯГАНЕ ОТ 60 ДО 90 mm Hg. БУТИЛКИТЕ ТРЯБВА ДА БЪДАТАЕРИРАНИ С 10 % СО2 /ВЪЗДУХ И ИНКУБИРАНИ НА КЛАТАЧКИ /ОКОЛО 1 ОБОРОТЗА МИНУТА/ ПРИ 37 ± 1 ° С ЗА 3 - 4 ДНИ. СЛЕД СЛИВАНЕТО СРЕДАТА В БУТИЛИТЕТРЯБВА ДА БЪДЕ СМЕНЕНА СЪС СРЕДА НЕСЪДЪРЖАЩА СЕРУМ ЧРЕЗ ИЗЛИВАНЕИЛИ АСПИРИРАНЕ НА РАСТЕЖАТА СРЕДА, ПРОМИВАНЕ НА БУТИЛКИТЕ СИЗОТОНИЧЕН БУФЕР, КАКЪВТО Е РАЗТВОРА НА DULBECCO ФОСФАТНИЯ БУфЕР(D-PBS), 50-100 ml НА БУТИЛКА; СЛЕДВА ДОБАВЯНЕ НА СЪОТВЕТНОТОКОЛИЧЕСТВО БУфЕРИРАН С БИКАРБОНАТ, НЕСЪДЪРЖАЩ СЕРУМ DMEM/F12 С (1:1) (200-300 ml НА БУТИЛКА), КЪМ КОЕТО СА ДОБАВЕНИ И NEAA, L-ГЛУТАМИН И МЕДЕН СУЛФАТ (1-20 μΜ) ЗА НАМАЛЯВАНЕ НА КОВАЛЕНТНАТА АГРЕГАЦИЯ.БУТИЛКИТЕ ТРЯБВА ДА БЪДАТ АЕРИРАНИ С 10 % СО2 /ВЪЗДУХ И ИНКУБИРАНИ^НА КЛАТАЧКИ /ОКОЛО 1 ОБОРОТ ЗА МИНУТА/ ПРИ 37 ± 1 ° С ЗА 6+ 1 ДНИ ИЛИДОКАТО МЕТАБОЛИТНАТА АКТИВНОСТ ДОВЕДЕ НИВОТО НА ГЛЮКОЗАТА ДО ПО-НИСКО ОТ 0,5 g/L И/ИЛИ НИВОТО НА pH ПОД 6.6. ПОЛУЧЕНАТА СРЕДА ТРЯБВАДА БЪДЕ СЪБРАНА ОТ БУТИЛКИТЕ ЧРЕЗ ИЗЛИВАНЕ ИЛИ АСПИРИРАНЕ И ТРЯБВАДА БЪДЕ ЗАМЕНЕНА С НОВА, НЕСЪДЪРЖАЩА СЕРУМ СРЕДА, ΚΑΚΤΟ Е ОПИСАНОПО-ГОРЕ, ЗА ДА СЕ СЪБЕРАТ ДОПЪЛНИТЕЛНИ КОЛИЧЕСТВА. ТОВА МОЖЕ ДА -114- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ПРОДЪЛЖИ ДОКАТО КЛЕТКИТЕ СТАНАТ НЕСПОСОБНИ ЗА НЕВКЛЮЧВАЩОТОСЕРУМ ПРОИЗВОДСТВО И СЕ ОТДЕЛЯТ ОТ БУТИЛКИТЕ. СЪБРАНАТА СРЕДА МОЖЕ ДА БЪДЕ ПОДЛОЖЕНА НА ПРЕЧИСТВАНЕ ЧРЕЗМИКРОФИЛТРАЦИЯ ПРЕЗ 0.45 цт И/ИЛИ 0,2 цт ФИЛТРИ (SARTORIUSSARTOBRAN pH ИЛИ PALL). ФИЛТРИРАНАТА СРЕДА ТРЯБВА ДА БЪДЕ ОХЛАДЕНАДО 4 0 С ИЛИ ВЕДНАГА КОНЦЕНТРИРАНА И ДИАЛИЗИРАНА ПРИ НИСКА ЙОННАСИЛА ЧРЕЗ УЛТРАФИЛТРАЦИОННА СИСТЕМА С КРЪСТОСАНИ ПОТОЦИ (НАПР.FILTRON YM-50). УЛТРАфИЛТРИРАНЕТО И ДИАфИЛТРИРАНЕТО ТРЯБВА ДА СЕПРОВЕДАТ ПРИ 4 ° С, ЗА ДА СЕ НАМАЛИ ДО МИНИМУМ РАЗГРАЖДАНЕТО НАБЕЛТЪКА. ПРЕДИ ЕТАПИТЕ НА ПРЕЧИСТВАНЕ С ХРОМАТОГРАфИЯ ПОЛУЧЕНАТАСРЕДА ТРЯБВА ДА БЪДЕ ДИАЛИЗИРАНА С ВОДЕН БУФЕРЕН РАЗТВОР (НАПР. 10тМ КАЛИЕВ ФОСФАТ, pH 6.8). КАЧЕСТВОТО НА ПРОДУКТА В ПОЛУЧЕНАТА СРЕДА МОЖЕ ДА БЪДЕ ОЦЕНЕНОНАЙ-ДОБРЕ ЧРЕЗ НЕРЕДУКЦИОННИ SDS-PAGE WESTERN BLOTS, КОИТОПОКАЗВАТ ОТНОСИТЕЛНИТЕ КОЛИЧЕСТВА НА АГРЕГИРАЛИТЕ, МОНОМЕРНИТЕ ИПРОТЕОЛИТИЧНО РАЗГРАДЕНИТЕ MGDF В ПРОБИТЕ. ДРУГ МЕТОД ЗА ПРОИЗВОДСТВО НА MGDF ОТ СНО КЛЕТКИ Е АДАПТИРАНЕТОНА КЛЕТЪЧНА ЛИНИЯ, ЕКСПРЕСИРАЩА MGDF КЪМ НЕСЪДЪРЖАЩА СЕРУМ Сг СРЕДА, КАКВАТО Е GIBCO S-SFM II. КЛЕТКИТЕ МОГАТ ДА БЪДАТ АДАПТИРАНИЧРЕЗ СЕРИЙНИ ПАСАЖИ В СРЕДА, СЪДЪРЖАЩА МИНИМАЛНИ КОЛИЧЕСТВАСЕРУМ ИЛИ НЕСЪДЪРЖАЩА СЕРУМ. СЛЕД КАТО СЕ УСТАНОВИ, ЧЕ КЛЕТЪЧНАТА*ЛИНИЯ МОЖЕ ДА РАСТЕ В ТАКАВА СРЕДА И ДА ПРОИЗВЕЖДА ДОСТАТЪЧНИКОЛИЧЕСТВА ОТ СЕКРЕТИРАНИЯ MGDF ПРОИЗВОДСТВОТО МОЖЕ ДАПРОДЪЛЖИ ЧРЕЗ МАЩАБИРАНЕ НА НАЧАЛНАТА КУЛТУРА ЧРЕЗ СЕРИЙНИПАСАЖИ В НАРАСТВАЩИ ОБЕМИ НА КУЛТУРАТА, СЛЕД КОЕТО ДА СЕ НАПРАВИПОСЯВКА В ПОДХОДЯЩ ПРОИЗВОДСТВЕН СЪД /КОНТРОЛИРАН БИОРЕАКТОР,СНАБДЕН С КОНТРОЛНО-ИЗМЕРВАТЕЛНИИ ПРИБОРИ И БЪРКАЧКА/ И ДА СЕ -115- WO 95/26746 PCT/US95/03776 ОСТАВИ КУЛТУРАТА ДА ДОСТИГНЕ МАКСИМАЛНА ПЛЪТНОСТ ПРИ ОПТИМАЛНИРАСТЕЖНИ УСЛОВИЯ (pH, ХРАНИТЕЛНИ ВЕЩЕСТВА, ТЕМПЕРАТУРА, КИСЛОРОД,РАЗБЪРКВАНЕ). В ТОЧКАТА НА ОПТИМАЛНО ПРОИЗВОДСТВО/ЕКСПЕРИМЕНТАЛНО ОПРЕДЕЛЕНА ЧРЕЗ ИЗМЕРВАНЕ НА КОЛИЧЕСТВОТО ИКАЧЕСТВОТО НА ПРОДУКТА/ КУЛТУРАТА МОЖЕ ДА БЪДЕ ИЗВАДЕНА ОТБИОРЕАКТОРА, КЛЕТКИТЕ ДА СЕ ОТДЕЛЯТ ОТ СРЕДАТА ЧРЕЗ МИКРОННАДЪЛБОЧИННА ФИЛТРАЦИЯ ИЛИ СУБ-МИКРОННА МИКРОфИЛТРАЦИЯ В ОБРАТНИПОТОЦИ. АКО СЕ ИЗПОЛЗВА МИКРОННА ФИЛТРАЦИЯ НА СРЕДАТА, ТО ТЯТРЯБВА ДА БЪДЕ ДОПЪЛНИТЕЛНО ПРЕЧИСТЕНА ЧРЕЗ СУБ-МИКРОННА DEAD-END ФИЛТРАЦИЯ ПРЕДИ КОНЦЕНТРАЦИЯТА И ДИАЛИЗАТА ΚΑΚΤΟ Е ОПИСАНО Ф ПО-ГОРЕ. * * * ПО-ГОРЕ Е ПРЕДСТАВЕНО ОБЩОТО ОПИСАНИЕ НА НАСТОЯЩОТО ИЗОБРЕТЕНИЕИ СЛУЧАИТЕ, В КОИТО ТО НАМИРА ПРИЛОЖЕНИЕ. РАЗБИРАЕМО Е, ЧЕ ЗАРАБОТЕЩИТЕ В ТАЗИ ОБЛАСТ ЩЕ ВЪЗНИКНАТ ВАРИАНТИ И МОДИКАЦИИ НАГОРНОТО ОПИСАНИЕ. ПОРАДИ ТОВА СЕ ПРЕДПОЛГА, ЧЕ ПРИЛОЖЕНИТЕПРЕТЕНЦИИ ПОКРИВАТ ВСИЧКИ ТАКИВА ВАРИАНТИ, ВЪЗНИКНАЛИ ОТ Ф РАЗГЛЕЖДАНЕТО НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО ВЪВ ТОЗИ МУ ВИД. В ДОПЪЛНЕНИЕ, ПУБЛИКАЦИИТЕ И ДРУГИТЕ МАТЕРИАЛИ, ЦИТИРАНИ ТУК, ЗА ДАИЛЮСТРИРАТ ПРЕДИСТОРИЯТА НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО И ПО-СПЕЦИАЛНО ВСЛУЧАИТЕ КОГАТО СЕ ДАВАТ ДОПЪЛНИ ДЕТАЙЛИ, КАСАЕЩИ НЕГОВОТОПРИЛОЖЕНИЕ СА ВКЛЮЧЕНИ ТУК КАТО СПРАВКА. -116- WO 95/26746 PCT/US95/03776
SEQUENCE LISTING (1) GENERAL INFORMATION: (i) APPLICANT: Bartley, Timothy D.
Bogenberger, Jakob M.
Bosselman, Robert A.
Hunt, PamelaKinstler, Olaf B.
Samal, Babru B. (ii) TITLE OF INVENTION: Compositions and Methods for StimulatingMegakaryocyte Growth and Differentiation (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 34 (iv) CORRESPONDENCE ADDRESS: (A) ADDRESSEE: Amgen Inc. (B) STREET: 1840 Dehavilland Drive (C) CITY: Thousand Oaks (D) STATE: California
(E) COUNTRY: USA (F) ZIP: 91320-1789 (v) COMPUTER READABLE FORM: (A) MEDIUM TYPE: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (vi) CURRENT APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: <B) FILING DATE: (C) CLASSIFICATION: (viii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION: (A) NAME: Cook, Robert R.
(C) REFERENCE/DOCKET NUMBER: A-290-C (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:1: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 31 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:1:
Ala Pro Pro Ala Xaa Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Met Leu Arg Asp15 10 15 117 WO 95/26746 PCT/US95/03776
Ser His Val Leu His Xaa Arg Leu Xaa Gin Xaa Fro Asp He Tyr20 25 30 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:2: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 21 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:2:
Ala Pro Pro Ala Xaa Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Met Leu Arg Asp15 10 15
Ser His Val Leu His20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:3: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 17 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:3:
Thr Gin Lys Glu Gin Thr Lys Ala Gin Asp Val Leu Gly Ala Val Ala15 10 15
Leu (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:4: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 17 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:4:
GCNCCNCCNG CNTGYGA 17 118 4iO9SI2G146 PCT/US95/03776 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:5: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 21 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:5:
GCARTGYAAC ACRTGNGART C 21 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:6: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 21 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:6:
Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp15 10 15
Ser His Val Leu His20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:7: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 21 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:7:
GTACGCGTTC TAGANNNNNN T 21 119 WO 95/26746 PCT/US95/03776 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:8: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 21 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:8: AGTTTACTGA GGACTCGGAG G 21 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:9: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 30 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: CDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:9: TTCGGCCGGA TAGGCCTTTT TTTTTTTTTT 30 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:10: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 29 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:10: TTCGGCCGGA TAGGCCTTTT TTTTTTTTT 29 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:11: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA 120 WO 95/26746 PCT/US95/03776 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:11: TGCGACCTCC GAGTCCTCAG 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:12: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 23 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:12: GAGTCCTCAG TAAACTGCTT CGT 23 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:13: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:13: GGAGTCACGA AGCAGTTTAC 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:14: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 18 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:14: CCTTTACTTC TAGGCCTG 18 121 WO 95/26746 PCT/US95/03776 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:15: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 19 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi, SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:15: GAGGTCACAA GCAGGAGGA 19 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:16: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 19 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:16: GGCATAGTCC GGGACGTCG 19 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:17: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 19 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:17: TCCTCCTGCT TGTGACCTC 19 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:18: (i, SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 19 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear
(ii, MOLECULE TYPE: CDNA WO 95/26746 PCT/US95/03776 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:18: CCAGGAAGGA TTCAGGGGA 19 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:19: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 30 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:19: CAACAAGTCG ACCGCCAGCC AGACACCCCG 30 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:20: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 24 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:20: GGCCGGATAG GCCACTCNNN NNNT 24 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:21: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 21 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:21: GCARTGYAAN ACRTGNGART C 21 123 WO 95/26746 PCT/US95/03776 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:22: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 16 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:22:
TTGGTGTGCA CTTGTG (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:23: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:23:
CACAAGTGCA CACCAACCCC (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:24: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 1342 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA 16 20 (ix, FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS (B) LOCATION: 99..1094 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:24:
CAGGGAGCCA CGCCAGCCAA GACACCCCGG CCAGAATGGA GCTGACTGAA TTGCTCCTCG TGGTCATGCT TCTCCTAACT GCAAGGCTAA CGCTGTCC AGC CCG GCT CCT CCTSer Pro Ala Pro Pro 1 5 60 113 124 WO 95/26746 PCT/US95/03776
GCT Ala TGT GAC CTC Leu CGA GTC CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC 161 Cys Asp Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val 20 10 15 CTT CAC AGC AGA CTG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA 209 Leu His Ser Arg Leu Ser Gin Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr 25 30 35 CCT GTC CTG CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC 257 Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr 40 45 50 CAG ATG GAG GAG ACC AAG GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC CTT 305 Gin Met Glu Glu Thr Lys Ala Gin Asp lie Leu Gly Ala Val Thr Leu 55 60 65 CTG CTG GAG GGA GTG ATG GCA GCA CGG GGA CAA CTG GGA CCC ACT TGC 353 Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gin Leu Gly Pro Thr Cys 70 75 80 85 CTC TCA TCC CTC CTG GGG CAG CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC CTT 401 Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gin Leu Ser Gly Gin Val Arg Leu Leu Leu 90 95 100 GGG GCC CTG CAG AGC CTC CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC AGG 449 Gly Ala Leu Gin Ser Leu Leu Gly Thr Gin Leu Pro Pro Gin Gly Arg 105 110 115 ACC AC A GCT CAC AAG GAT CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA CAC 497 Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala He Phe Leu Ser Phe Gin His 120 125 130 CTG CTC CGA GGA AAG GTG CGT TTC CTG ATG CTT GTA GGA GGG TCC ACC 545 Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr 135 140 145 CTC TGC GTC AGG CGG GCC CCA CCC ACC ACA GCT GTC CCC AGC AGA ACC 593 Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr 150 155 160 165 TCT CTA GTC CTC ACA CTG AAC GAG CTC CCA AAC AGG ACT TCT GGA TTG 641 Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu 170 175 180 TTG GAG ACA AAC TTC ACT GCC TCA GCC AGA ACT ACT GGC TCT GGG CTT 689 Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu 185 190 195 CTG AAG TGG CAG CAG GGA TTC AGA GCC AAG ATT CCT GGT CTG CTG AAC 737 Leu Lys Trp Gin Gin Gly Phe Arg Ala Lys He Pro Gly Leu Leu Asn 200 205 210 CAA ACC TCC AGG TCC CTG GAC CAA ATC CCC GGA TAC CTG AAC AGG ATA 785 Gin Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gin lie Pro Gly Tyr Leu Asn Arg lie - 215 220 225 125 WO 95/26746 PCT/US95/03776
CAC HiS 230 GAA CTC TTG AAT GGA ACT CGT GGA СТС TTT CCT GGA CCC TCA CGC Glu Leu Leu Asn Gly235 Thr Arg Gly Leu Phe 240 Pro Gly Pro Ser Arg245 AGG ACC CTA GGA GCC CCG GAC ATT TCC TCA GGA ACA TCA GAC ACA GGC Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp lie Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr Gly 250 255 260 TCC CTG CCA CCC AAC CTC CAG CCT GGA TAT TCT CCT TCC CCA ACC CAT Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gin Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His 265 270 275 CCT CCT ACT GGA CAG TAT ACG CTC TTC CCT CTT CCA CCC ACC TTG CCC Pro Pro Thr Gly Gin Tyr Thr Leu Phe· Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro 280 285 290 ACC CCT GTG GTC CAG СТС CAC CCC CTG CTT CCT GAC CCT TCT GCT CCAThr Pro Val Val Gin Leu His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro 295 300 305 ACG Thr 310 CCC ACC CCT ACC AGC CCT CTT CTA AAC ACA TCC TAC ACC CAC TCC Pro Thr Pro Thr Ser 315 Pro Leu Leu Asn Thr Ser320 Tyr Thr His Ser 325 CAG AAT CTG TCT CAG GAA GGG TAAGGTTCTC AGACACTGCC GACATCAGCA Gin Asn Leu Ser Gin Glu Gly 330
TTGTCTCGTG TACAGCTCCC TTCCCTGCAG GGCGCCCCTG GGAGACAACT GGACAAGATT
TCCTACTTTC TCCTGAAACC CAAAGCCCTG GTAAAAGGGA TACACAGGAC TGAAAAGGGA
ATCATTTTTC ACTGTACATT ATAAACCTTC AGAAGCTATT TTTTTAAGCT ATCAGCAATA
CTCATCAGAG CAGCTAGCTC TTTGGTCTAT TTTCTGCA
833 881 929 977 1025 1073 1124 1184 1244 1304 1342 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:25: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 332 and.no acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:25: Ser 1 Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp 5 Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu10 15 Arg Asp Ser His Val Leu His Ser20 Arg Leu Ser Gin Cys Pro Glu Val25 30 His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu35 40 Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu45 126 WO 95/26746 PCT/US95/03776
Gly Glu Trp Lys Thr Gin Met Glu Glu Thr Lys Ala Gin Asp He Leu 50 55 60 Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gin 65 70 75 80 Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gin Leu Ser Gly Gin 85 90 95 Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gin Ser Leu Leu Gly Thr Gin Leu 100 105 110 Pro Pro Gin Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala He Phe 115 120 125 Leu Ser Phe Gin His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu 130 135 140 Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala 145 150 155 160 Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro Aan 165 170 175 Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser Ala Arg Thr 180 185 190 Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gin Gin Gly Phe Arg Ala Lys lie 195 200 205 Pro Gly Leu Leu Asn Gin Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gin He Pro Gly 210 215 220 Tyr Leu Asn Arg He His Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg Gly Leu Phe 225 230 235 240 Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp lie Ser Ser Gly 245 250 255 Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gin Pro Gly Tyr Ser 260 265 270 Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gin Tyr Thr Leu Phe Pro Leu 275 280 285 Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gin Leu His Pro Leu Leu Pro 290 295 300 Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn Thr 305 310 315 320 Ser Tyr Thr His Ser Gin Asn Leu Ser Gin Glu Gly 325 330 127 WO 95/26746 PCT/US95/03776 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:26: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 1342 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA (ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS (B) LOCATION: 99..621 . * (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:26: CAGGGAGCCA CGCCAGCCAA GACACCCCGG CCAGAATGGA GCTGACTGAA TTGCTCCTCG 60 TGGTCATGCT TCTCCTAACT GCAAGGCTAA CGCTGTCC AGC CCG GCT CCT CCT 113
Ser Pro Ala Pro Pro 1 5 GCT Ala TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CATSer His 20 GTC Val 161 Cys Asp Leu Arg 10 Val Leu Ser Lys Leu 15 Leu Arg Asp CTT CAC AGC AGA CTG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA 209 Leu His Ser Arg Leu Ser Gin Cya Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr 25 30 35 CCT GTC CTG CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC 257 Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr 40 45 50 CAG ATG GAG GAG ACC AAG GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC CTT 305 Gin Met Glu Glu Thr Lys Ala Gin Asp lie Leu Gly Ala Val Thr Leu 55 60 65 CTG CTG GAG GGA GTG ATG GCA GCA CGG GGA CAA CTG GGA CCC ACT TGC 353 Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gin Leu Gly Pro Thr Cys 70 75 80 85 CTC TCA TCC CTC CTG GGG CAG CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC CTT 401 Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gin Leu Ser Gly Gin Val Arg Leu Leu Leu 90 95 100 GGG GCC CTG CAG AGC CTC CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC AGG 449 Gly Ala Leu Gin Ser Leu Leu Gly Thr Gin Leu Pro Pro Gin Gly Arg 105 110 115 ACC ACA GCT CAC AAG GAT CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA CAC 497 Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala lie Phe Leu Ser Phe Gin His • 120 125 130 128 WO 95/26746 PCT/US95/03776 TG СТС CGA GGA AAG GTG CGT TTC CTG ATG CTT GTA GGA GGG TCC ACC 545
Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Sec Thr 135 140 145 CTC TGC GTC AGG CGG GCC CCA CCC ACC ACA GCT GTC CCC AGC AGA ACC 593
Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr 150 155 160 165 TCT CTA GTC CTC ACA CTG AAC GAG СТС C CAAACAGGAC TTCTGGATTG 641
Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu 170 TTGGAGACAA ACTTCACTGC CTCAGCCAGA ACTACTGGCT CTGGGCTTCT GAAGTGGCAG 701 CAGGGATTCA GAGCCAAGAT TCCTGGTCTG CTGAACCAAA CCTCCAGGTC CCTGGACCAA 761 ATCCCCGGAT ACCTGAACAG GATACACGAA CTCTTGAATG GAACTCGTGG ACTCTTTCCT 821 GGACCCTCAC GCAGGACCCT AGGAGCCCCG GACATTTCCT CAGGAACATC AGACACAGGC 881 TCCCTGCCAC CCAACCTCCA GCCTGGATAT TCTCCTTCCC CAACCCATCC TCCTACTGGA 941 CAGTATACGC TCTTCCCTCT TCCACCCACC TTGCCCACCC CTGTGGTCCA GCTCCACCCC 1001 CTGCTTCCTG ACCCTTCTGC TCCAACGCCC ACCCCTACCA GCCCTCTTCT AAACACATCC 1061 TACACCCACT CCCAGAATCT GTCTCAGGAA GGGTAAGGTT CTCAGACACT GCCGACATCA 1121 GCATTGTCTC GTGTACAGCT CCCTTCCCTG CAGGGCGCCC CTGGGAGACA ACTGGACAAG 1181 ATTTCCTACT TTCTCCTGAA ACCCAAAGCC CTGGTAAAAG GGATACACAG GACTGAAAAG 1241 GGAATCATTT TTCACTGTAC ATTATAAACC TTCAGAAGCT ATTTTTTTAA GCTATCAGCA 1301 ATACTCATCA GAGCAGCTAG CTCTTTGGTC TATTTTCTGC A 1342 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:27: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 174 amino acids (B) TYPE: amino acid(D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:27:
Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu 1 5 10 15 Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gin Cys Pro Glu Val 20 25 30 His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu 35 40 45 129 WO 95/26746 PCT/US95/03776
Gly Glu Trp Lys Thr Gin Met Glu Glu Thr Lys Ala Gin Asp He Leu 50 55 60 Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gin 65 70 75 80 Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gin Leu Ser Gly Gin 85 90 95 Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gin Ser Leu Leu Gly Thr Gin Leu 100 105 110 Pro Pro Gin Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala He Phe 115 120 • 125 Leu Ser Phe Gin His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu 130 135 140 Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala 145 150 155 160 Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu 165 170 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:28: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 1164 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA (ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS (B) LOCATION: 97..894 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:28: AGGGAGCCAC GCCAGCCAGA CACCCCGGCC AGAATGGAGC TGACTGAATT GCTCCTCGTG 60 GTCATGCTTC TCCTAACTGC AAGGCTAACG CTGTCC AGC CCG GCT CCT CCT GCT 114
Ser 1 Pro Ala Pro Pro 5 Ala TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC CTT 162 Cys Asp Leu Arg 10 Val Leu Ser Lys Leu 15 Leu Arg Asp Ser His 20 Val Leu CAC AGC AGA CTG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA CCT 210 His Ser Arg 25 Leu Ser Gin Cys Pro 30 Glu Val His Pro Leu 35 Pro Thr Pro 130 WO 95/26746 PCT/US95/03776 GTC CTG CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC CAG 258 Val Leu Leu40 Pro Ala Val Asp Phe45 Ser Leu Gly Glu 50 Trp Lys Thr Gin ATG GAG GAG ACC AAG GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC CTT CTG 306 Met Glu Glu Thr Lys Ala Gin Asp He Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu 55 60 65 70 CTG GAG GGA GTG ATG GCA GCA CGG GGA CAA CTG GGA CCC ACT TGC CTC 354 Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gin Leu Gly Pro Thr Cys Leu 75 80 85 TCA TCC CTC CTG GGG CAG CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC CTT GGG 402 Ser Ser Leu Leu Gly Gin Leu Ser Gly Gin Val Arg Leu Leu Leu Gly 90 95 100 GCC CTG CAG AGC CTC CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC AGG ACC 450 Ala Leu Gin Ser Leu Leu Gly Thr Gin Leu Pro Pro Gin Gly Arg Thr 105 110 115 ACA GCT CAC AAG GAT CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA CAC CTG 498 Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala He Phe Leu Ser Phe Gin His Leu 120 125 130 CTC CGA GGA AAG GAC TTC TGG ATT GTT GGA GAC AAA CTT CAC TGC CTC 546 Leu Arg Gly Lys Asp Phe Trp He Val Gly Asp Lys Leu His Cys Leu 135 140 145 150 AGC CAG AAC TAC TGG CTC TGG GCT TCT GAA GTG GCA GCA GGG ATT CAG 594 Sec Gin Asn Tyr Trp Leu Trp Ala Ser Glu Val Ala Ala Gly He Gin 155 160 165 AGC CAA GAT TCC TGG TCT GCT GAA CCA AAC CTC CAG GTC CCT GGA CCA 642 Ser Gin Asp Ser Trp Ser Ala Glu Pro Asn Leu Gin Val Pro Gly Pro 170 175 180 AAT CCC CGG ATA CCT GAA CAG GAT ACA CGA ACT CTT GAA TGG AAC TCG 690 Asn Pro Arg lie Pro Glu Gin Asp Thr Arg Thr Leu Glu Trp Asn Ser 185 190 195 TGG ACT CTT TCC TGG ACC CTC ACG CAG GAC CCT AGG AGC CCC GGA CAT 738 Trp Thr Leu Ser Trp Thr Leu Thr Gin Asp Pro Arg Ser Pro Gly His 200 205 210 TTC CTC AGG AAC ATC AGA CAC AGG CTC CCT GCC ACC CAA CCT CCA GCC 786 Phe Leu Arg Asn He Arg His Arg Leu Pro Ala Thr Gin Pro Pro Ala 215 220 225 230 TGG ATA TTC TCC TTC CCC AAC CCA TCC TCC TAC TGG ACA GTA TAC GCT 834 Trp He Phe Ser Phe Pro Asn Pro Ser Ser Tyr Trp Thr Val Tyr Ala 235 240 245 CTT CCC TCT TCC ACC CAC CTT GCC CAC CCC TGT GGT CCA GCT CCA CCC 882 Leu Pro Ser Ser Thr His Leu Ala His Pro Cys Gly Pro Ala Pro Pro 250 255 260 131 WO 95/26746 PCT/US95/03776 CCT GCT TCC TGACCCTTCT GCTCCAACGC CCACCCCTAC CAGCCCTCTT 931
Pro Ala Ser 265 CTAAACACAT CCTACACCCA CTCCCAGAAT CTGTCTCAGG AAGGGTAAGG TTCTCAGACA 991 CTGCCGACAT CAGCATTGTC TCGTGTACAG CTCCCTTCCC TGCAGGGCGC CCCTGGGAGA 1051 CAACTGGACA AGATTTCCTA CTTTCTCCTG AAACCCAAAG CCCTGGTAAA AGGGATACAC 1111 AGGACTGAAA AGGGAATCAT TTTTCACTGT ACATTATAAA CCTTCAGAAG CTA 1164 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:29:, (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 265 amino acids (B) TYPE: amino acid(D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:29:
Ser 1 Pro Ala Pro Pro 5 Ala Cys Asp Leu Arg 10 Val Leu Ser Lys Leu 15 Leu Arg Asp Ser His 20 Val Leu His Ser Arg 25 Leu Ser Gin Cys Pro 30 Glu Val His Pro Leu 35 Pro Thr Pro Val Leu 40 Leu Pro Ala Val Asp 45 Phe Ser Leu Gly Glu 50 Trp Lys Thr Gin Met 55 Glu Glu Thr Lys Ala 60 Gin Asp lie Leu Gly 65 Ala Val Thr Leu Leu 70 Leu Glu Gly Val Met 75 Ala Ala Arg Gly Gin 80 Leu Gly Pro Thr Cys 85 Leu Ser Ser Leu Leu 90 Gly Gin Leu Ser Gly 95 Gin Val Arg Leu Leu 100 Leu Gly Ala Leu Gin 105 Ser Leu Leu Gly Thr 110 Gin Leu Pro Pro Gin 115 Gly Arg Thr Thr Ala 120 His Lys Asp Pro Asn 125 Ala lie Phe Leu Ser 130 Phe Gin His Leu Leu 135 Arg Gly Lys Asp Phe 140 Trp lie Val Gly Asp 145 Lys Leu His Cys Leu 150 Ser Gin Asn Tyr Trp 155 Leu Trp Ala Ser Glu 160 Val Ala Ala Gly He Gin Ser Gin Asp Ser Trp Ser Ala Glu Pro Asn 165 170 175 132 WO 95/26746 PCT/US95/03776
Leu Gin Val Pro Gly Pro Asn Pro Arg lie Pro Glu Gin Asp Thr Arg 180 185 190 Thr Leu Glu. Trp Asn Ser Trp Thr Leu Ser Trp Thr Leu Thr Gin Asp 195 200 205 Pro Arg Ser Pro Gly His Phe Leu Arg Asn lie Arg His Arg Leu Pro 210 - 215 220 Ala Thr Gin Pro Pro Ala Trp lie Phe Ser Phe Pro Asn Pro Ser Ser 225 230 235 240 Tyr Trp Thr Val Tyr Ala Leu Pro Ser Ser Thr His Leu Ala His Pro 245 250 255 Cys Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Ser 260 265
(2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:30: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 24 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:30:
GAGCTCACTA GTGTCGACCT GCAG (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:31: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 24 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:31:
CTGCAGGTCG ACACTAGTGA GCTC (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:32: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 80 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 24 24 133 WO 9S/26746 PCT/US95/03776
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:32: CTCATAATTT TTAAAAAATT CATTTGACAA ATGCTAAAAT TCTTGATTAA TATTCTCAAT. 60 TGTGAGCGCT CACAATTTAT 80 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:33: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 86 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: CDNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:33: CGATAAATTG TGAGCGCTCA CAATTGAGAA TATTAATCAA GAATTTTAGC ATTTGTCAAA 60 TGAATTTTTT AAAAATTATG AGACGT 86 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:34: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 89 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:34: GACGTCTCAT AATTTTTAAA AAATTCATTT GACAAATGCT AAAATTCTTG ATTAATATTC 60 TCAATTGTGA GCGCTCACAA TTTATCGAT 89
133-A

Claims (83)

WO 95/26746 PCT/US95/03776 ПРЕТЕНЦИИТЕ СА: Ν°· 100625-bg·
1. ЧОВЕШКИ MGDF ПОЛИПЕПТИД, КОЙТО СПЕЦИФИЧНО УСИЛВА РАСТЕЖА ИРАЗВИТИЕТО НА ЧОВЕШКИТЕ МЕГАКАРИОЦИТИ И Е ПРАКТИЧЕСКИ ЧИСТ ОТДРУГИ ЧОВЕШКИ БЕЛТЪЦИ.
2. ПОЛИПЕПТИД, СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 1, КЪДЕТО ЦИТИРАНИЯ ПОЛИПЕПТИДСЪДЪРЖА АМИНО КИСЕЛИНИ 22-171 ОТ фИГ. 11.
3. ПОЛИПЕПТИД, СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 2, КЪДЕТО ЦИТИРАНИЯ ПОЛИПЕПТИДСЪДЪРЖА АМИНО КИСЕЛИНИ 22-192 ОТ фИГ. 11.
4. ПОЛИПЕПТИД, СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 3, ИМАЩ АМИНО КИСЕЛИННАТАПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ НА MGDF-2.
5. ПОЛИПЕПТИД, СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 1, КЪДЕТО ЦИТИРАНИЯ ПОЛИПЕПТИДСЪДЪРЖА АМИНО КИСЕЛИНИ 22-353 ОТ фИГ. 11.
6. ПОЛИПЕПТИД, СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 5, ИМАЩ АМИНО КИСЕЛИННАТАПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ НА MGDF-1.
7. ПОЛИПЕПТИД, СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 2, КОЙТО ИМА АМИНО КИСЕЛИННАТА© ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ НА ИЗБРАН ПРЕДСТАВИТЕЛ ОТ ГРУПАТА, СЪСТОЯЩА СЕ ОТ MGDF-4, MGDF-5, MGDF-6, MGDF-7 И MGDF-8.
8. ПОЛИПЕПТИД, СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 1, КЪДЕТО ЦИТИРАНИЯ ПОЛИПЕПТИДСЪСДЪРЖА АМИНО КИСЕЛИНИ 22-184 ОТ фИГ. 11.
9. ПОЛИПЕПТИД, СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 1, КЪДЕТО ЦИТИРАНИЯ ПОЛИПЕПТИДСЪСДЪРЖА ОЩЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ МЕТ-ЛИЗ НА N- КРАЯ СИ. -134- WO 95/26746 PCT/US95/03776
10. ПОЛИПЕПТИД, СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 1, КЪДЕТО ЦИТИРАНИЯ ПОЛИПЕПТИДСЪСДЪРЖА АМИНО КИСЕЛИНИ 22-184 ОТ фИГ. 11 И СЪДЪРЖА ОЩЕПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ МЕТ-ЛИЗ НА N-КРАЯ СИ.
11. ПОЛИПЕПТИД, СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 1, КЪДЕТО ЦИТИРАНИЯ ПОЛИПЕПТИДСЪДЪРЖА АМИНО КИСЕЛИНИ 22-535 ОТ ФИГ. 11 И СЪДЪРЖА ОЩЕПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ МЕТ-ЛИЗ НА N-КРАЯ СИ.
12. ПОЛИПЕПТИД, СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 1, СЪДЪРЖАЩ ОЩЕ АМИНО КИСЕЛИНИ 1-21 ОТ ФИГ. 11.
13. ИЗОЛИРАН ПОЛИНУКЛЕОТИД, КОДИРАЩ ЧОВЕШКИ MGDF БЕЛТЪК.
14. ИЗОЛИРАН ПОЛИНУКЛЕОТИД, СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 13, КОДИРАЩ ЧОВЕШКИMGDF ПОЛИПЕПТИД, СПОРЕД ВСЯКА ОТ ПРЕТЕНЦИ 1 -12.
15 ИЗОЛИРАН ПОЛИНУКЛЕТИД , СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 14, ПРЕДСТАВЛЯВАЩ ДНКСЕКСЕНЦИЯ.
16. ДНК СЕКВЕНЦИЯ, СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 15, КОЯТО Е кДНК СЕКВЕНЦИЯ.
17. кДНК СЕКВЕНЦИЯ СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 16, КОЯТО ИМАПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ ΚΑΚΤΟ Е ПОКАЗАНО НА ФИГ 11 И12.
18. ДНК ВЕКТОР, СЪДЪРЖАЩ ДНК СЕКВЕНЦИЯ СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 15.
19. ВЕКТОРЪТ ОТ ПРЕТЕНЦИЯ 18, КЪДЕТО ЦИТИРАНАТА ДНК СЕКВЕНЦИЯ ЕОПЕРАТИВНО СВЪРЗАНА С ДНК СЕКВЕНЦИЯ, КОНТРОЛИРАЩА ЕКСПРЕДИЯТА. -135- WO 95/26746 PCT/US95/03776
20. КЛЕТКА ГОСТОПРИЕМНИК ТРАНСФОРМИРАНА ИЛИ ТРАНСфЕКТИРАНА СДНК СЕКВЕНЦИЯ, СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 15.
21. КЛЕТКА ГОСТОПРИЕМНИК СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 20, КОЯТО ЕКСПРЕСИРАЦИТИРАНИЯ MGDF ПОЛИПЕПТИД, КОДИРАН ОТ ЦИТИРАНАТА ДНКСЕКВЕНЦИЯ..
22. МЕТОД ЗА ПРОИЗВОДСТВО НА ЧОВЕШКИ MGDF ПОЛИПЕПТИД, ВКЛЮЧВАЩРАСТЕЖ НА КЛЕТКА ГОСТОПРИЕМНИК, СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 21 В ПОДХОДЯЩАХРАНИТЕЛНА СРЕДА И ИЗОЛИРАНЕ НА ПОСОЧЕНИЯ MGDF ПОЛИПЕПТИД ОТПОСОЧЕНАТА КЛЕТКА ИЛИ ПОСОЧЕНАТА ХРАНИТЕЛНА СРЕДА.
23. МЕТОД ЗА ПРОИЗВОДСТВО НА ЧОВЕШКИ MGDF ПОЛИПЕПТИД, СПОРЕДПРЕТЕНЦИЯ 22, КЪДЕТО ЦИТИТРАНАТА КЛЕТКА ГОСТОПРИЕМНИК Е Е. coliКЛЕТКА.
24 МЕТОД ЗА ПРОИЗВОДСТВО НА ЧОВЕШКИ MGDF ПОЛИПЕПТИД, СПОРЕДПРЕТЕНЦИЯ 22, КЪДЕТО ЦИТИТРАНАТА КЛЕТКА ГОСТОПРИЕМНИК Е СНОКЛЕТКА.
25. АНТИТЯЛО, РЕАГИРАЩО С ЧОВЕШКИЯ MGDF, СПОРЕД ВСЯКА ОТПРЕТЕНЦИИ 1-12.
26. МОНОКЛОНАЛНО АНТИТЯЛО СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 25.
27. РЕКОМБИНАНТНО АНТИТЯЛО СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 25.
28. ФАРМАЦЕВТИЧНИ СЪСТАВИ, ВКЛЮЧВАЩИ ЧОВЕШКИ MGDF ПОЛИПЕПТИД,СПОРЕД ВСЯКА ОТ ПРЕТЕНЦИИ 1-12, СВЪРЗАН С ФАРМАЦЕВТИЧНО ПРИЕМЛИВРАЗТВОРИЛТЕЛ, АДЖУВАНТ ИЛИ НОСИТЕЛ. -136- WO 95/26746 PCT/US95/03776
29. ФАРМАЦЕВТИЧЕН СЪСТАВ, СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 28, ВЪВ ВОДЕН РАЗТВОР.
30. ФАРМАЦЕВТИЧЕН СЪСТАВ, СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 28, В АИОфИАИЗИРАНАФОРМА.
31. МЕТОД ЗА ЛЕЧЕНИЕ НА ПАЦИЕНТ, С НЕДОСТАТЪЧНОСТ НА ЧОВЕШКИ MGDFПОЛИПЕПТИД, КОЙТО ВКЛЮЧВА ПРИЛАГАНЕ НА ЕФЕКТИВНО КОЛИЧЕСТВОЧОВЕШКИ MGDF ПОЛИПЕПТИД, СПОРЕД ВСЯКА ОТ ПРЕТЕНЦИИ 1-12 НАЦИТИРАНИЯ ПАЦИЕНТ.
32. МЕТОД ЗА ЛЕЧЕНИЕ НА ПАЦИЕНТ, С НЕДОСТАТЪЧНОСТ НА ЧОВЕШКИ MGDFПОЛИПЕПТИД, КОЙТО ВКЛЮЧВА ПРИЛАГАНЕ НА ЕФЕКТИВНО КОЛИЧЕСТВОЧОВЕШКИ MGDF ПОЛИПЕПТИД, СПОРЕД ВСЯКА ОТ ПРЕТЕНЦИИ 1-12 НАЦИТИРАНИЯ ПАЦИЕНТ.
33. МЕТОД СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 32, КЪДЕТО ЦИТИРАНОТО СЪСТОЯНИЕ ЕИЗБРАНО ОТ ГРУПА, СЪСТОЯЩЯ: СЕ ОТ АПЛАСТИЧНА АНЕМИЯ, ИДИОПАТИЧНАТРОМБОЦИТОПЕНИЯ И ТРОМБОЦИТОПЕНИЯ ПОЛУЧЕНА В РЕЗУЛТАТ НАМЕДИКАМЕНТОЗНО И ЛЪЧЕВО ЛЕЧЕНИЕ.
34. МЕТОД ЗА УВЕЛИЧАВАНЕ БРОЯ НА ЗРЕЛИТЕ МЕГАКАРИОЦИТИ В ПАЦИЕНТ,КОЙТО ИМА НУЖДА ОТ ТАКОВА УВЕЛИЧЕНИЕ, ВКЛЮЧВАЩ ПРИЛАГАНЕ НАЕФЕКТИВНО КОЛИЧЕСТВО ЧОВЕШКИ MGDF ПОЛИПЕПТИД СПОРЕД ВСЯКА ОТПРЕТЕНЦИИ 1-12 НА ТОЗИ ПАЦИЕНТ.
35. МЕТОД ЗА УВЕЛИЧАВАНЕ БРОЯ НА ТРОМБОЦИТИТЕ В ПАЦИЕНТ, КОЙТОИМА НУЖДА ОТ ТАКОВА УВЕЛИЧЕНИЕ, ВКЛЮЧВАЩ ПРИЛАГАНЕ НА ЕФЕКТИВНОКОЛИЧЕСТВО ЧОВЕШКИ MGDF ПОЛИПЕПТИД СПОРЕД ВСЯКА ОТ ПРЕТЕНЦИИ 1-12 КЪМ ТОЗИ ПАЦИЕНТ. -137- WO 95/26746 PCT/US95/03776
36. ПРОИЗВОДЕН MGDF, СЪСТОЯЩ СЕ ОТ MGDF ПОЛИПЕПТИД СВЪРЗАН С НАЙ-МАЛКО ЕДИН ВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИМЕР.
37. ПРОИЗВОДЕН MGDF ОТ ПРЕТЕНЦИЯ 36, КЪДЕТО ЦИТИРАНИЯ MGDFПОЛИПЕПТИД Е ИЗБРАН ОТ ГРУПАТА СЪСТОЯЩА СЕ ОТ MGDF-1, MGDF-2,MGDF-4, MGDF-11, MGDF-12, MGDF-13, MGDF-14 И MGDF-15.
38. ПРОИЗВОДЕН MGDF ОТ ПРЕТЕНЦИЯ 36, КЪДЕТО ЦИТИРАНИЯ MGDFПОЛИПЕПТИД Е РЕКОМБИНАНТНО ПРОИЗВЕДЕН В БАКТЕРИАЛНА КЛЕТКА.
39. ПРОИЗВОДЕН MGDF ОТ ПРЕТЕНЦИЯ 36, КЪДЕТО ЦИТИРАНИЯ ВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИМЕР Е ФАРМАЦЕВТИЧНО ПРИЕМЛИВ.
40. ПРОИЗВОДЕН MGDF ОТ ПРЕТЕНЦИЯ 36, КЪДЕТО ЦИТИРАНИЯ ВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИМЕР Е ИЗБРАН ОТ ГРУПАТА СЪТОЯЩА СЕ ОТ:ДЕКСТРАН, ПОЛИ(1Ч-ВИНИЛ-ПИРОЛИДОН), ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИ,ПОЛИПРОПИЛЕН ГЛИКОЛ ХОМОПОЛИМЕРИ, ПОЛИПРОПИЛЕНОВОКИС/ЕТИЛЕНОВ ОКИС КО-ПОЛИМЕРИ, ПОЛИОКСИЕТИЛИРАНИ ПОЛИОЛИ,ПОЛИВИНИЛ АЛКОХОЛИ И СМЕСИ от тях.
41. ПРОИЗВОДЕН MGDF ОТ ПРЕТЕНЦИЯ 36, КЪДЕТО ЦИТИРАНИЯВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИМЕР Е ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ.
42. ПРОИЗВОДЕН MGDF СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 41, КЪДЕТО ЦИТИРАНИЯТПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ Е МОНОМЕТОКСИ-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ.
43. ПРОИЗВОДЕН MGDF СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 41, КЪДЕТО ЦИТИРАНИЯТПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ Е СВЪРЗАН С ЦИТИРАНИЯ MGDF ПОЛИПЕПТИДПОСРЕДСТВОМ АЦИЛНА ИЛИ АЛКИЛНА ВРЪЗКА. -138- >N0 95/26746 PCT/US95/03776
44. ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН MGDF ПОЛИПЕПТИД, ИМАЩ АМИНОКИСЕЛИННАТА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ СПОРЕД ВСЯКА ОТ ПРЕТЕНЦИИ 1-12.
45. ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН MGDF, СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 44, КОЙТО ИМААМИНО КИСЕЛИННА СЕКВЕНЦИЯ ОТ АМИНО КИСЕЛИНИ 22-184 НА ФИГ. 11.
46. ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН MGDF ПОЛИПЕПТИД СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 45,КЪДЕТО ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВТА ГРУПА Е СВЪРЗАНА С НЕГОВИЯ N- КРАЙ.
47. ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН MGDF ПОЛИПЕПТИД СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 46,КЪДЕТО ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВАТА ГРУПА ИМА ПРИБЛИЗИТЕЛНОМОЛЕКУЛНО ТЕГЛО ОТ 10 ДО 50 КИЛОДАЛТОНА.
48. ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН MGDF ПОЛИПЕПТИД СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 47,КЪДЕТО ЦИТИРАНИЯ MGDF ПОЛИПЕПТИД Е ПРОИЗВЕДЕН В Е. coli.
49. МОНОПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН MGDF ПОЛИПЕПТИД, ИМАЩ АМИНОКИСЕЛИННА СЕКВЕНЦИЯ СПОРЕД ВСЯКА ЕДНА ОТ ПРЕТЕНЦИИ 1-12.
50. ПРОИЗВОДЕН MGDF, СЪСТАВЕН ОТ MGDF ПОЛИПЕПТИД СПОРЕД ВСЯКАЕДНА ОТ ПРЕТЕНЦИИ 1-12, КОВАЛЕНТНО СВЪРЗАН С ДВЕ МОЛЕКУЛИВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИМЕР.
51. ПРОИЗВОДЕН MGDF СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 50, КЪДЕТО И ДВЕТЕ ЦИТИРАНИМОЛЕКУЛИ ВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИМЕР СА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ.
52. ПРОИЗВОДЕН MGDF СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 51, КЪДЕТО MGDF ПОЛИПЕПТИДАСЪДЪРЖА АМИНО КИСЕЛИНИ ОТ 22 ДО 184 НА ФИГ.11 И ЦИТИРАНИТЕПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИ ИМАТ ОТНОСИТЕЛНИ МОЛЕКУЛНИ ТЕГЛА ОТ 5 ДО 25КИЛОДАЛТОНА. -139- WO 95/26746 PCT/US95/03776
53. МЕТОД ЗА СВЪРЗВАНЕ НА ВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИМЕР КЪМ MGDFПОЛИПЕПТИД СПОРЕД ВСЯКА ОТ ПРЕТЕНЦИИ 1-12, КЪДЕТО ЦИТИРАНИЯВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИМЕР ИМА РЕАКТИВНА АЛДЕХИДНА ГРУПА. ТОЗИ МЕТОДВКЛЮЧВА: (а) СЪПРИКОСНОВЕНИЕ НА ЦИТИРАНИЯ MGDF ПОЛИПЕПТИД СВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИМЕР ПРИ РЕДУКЦИОННИ АЛКИЛИРАЩИ УСЛОВИЯ, ПРИДОСТАТЪЧНО КИСЕЛО pH , ТАКОВА ЧЕ ДА ПОЗВОЛЯВА α-АМИНО ГРУПАТА НААМИНО КРАЯ НА ЦИТИРАНИЯ MGDF ПЕПТИД ДА БЪДЕ РЕАКТИВНА; И (б) ИЗОЛИРАНЕ НА ЦИТИРАНИЯ MGDF ПОЛИПЕПТИД СВЪРЗАН С НАЙ-МАЛКОЕДИН ВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИМЕР.
54. МЕТОД ЗА СВЪРЗВАНЕ НА ВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИМЕР КЪМ MGDFПОЛИПЕПТИД СПОРЕД ВСЯКА ОТ ПРЕТЕНЦИИ 1-12, КЪДЕТО ЦИТИРАНИЯВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИМЕР ИМА ЕДИНИЧНА РЕАКТИВНА ЕСТЕРНА ГРУПА.ТОЗИ МЕТОД ВКЛЮЧВА: (а) СЪПРИКОСНОВЕНИЕ НА ЦИТИРАНИЯ MGDF ПОЛИПЕПТИД СВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИМЕР ПРИ ТАКИВА УСЛОВИЯ, ЧЕ ЦИТИРАНИЯТ MGDFПОЛИПЕПТИД ДА СЕ СВЪРЖЕ С ВОДОРАЗТВОРИМИЯ ПОЛИМЕР ЧРЕЗ АЦИЛНАВРЪЗКА; И (б) ИЗОЛИРАНЕ НА MGDF ПОЛИПЕПТИД СВЪРЗАН С НАЙ-МАЛКО ЕДИНВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИМЕР.
55. МЕТОД ЗА ПРЕТЕНЦИЯ 53 ИЛИ 54, КЪДЕТО ЦИТИРАНИЯ ПОЛИМЕР ЕФАРМАЦЕВТИЧНО ПРИЕМЛИВ. -140- WO 95/26746 PCT/US95/03776
56. МЕТОД ЗА ПРЕТЕНЦИЯ 53 ИЛИ 54, КЪДЕТО ЦИТИРАНИЯ ВОДОРАЗТВОРИМПОЛИМЕР Е ИЗБРАН ОТ ГРУПАТА СЪТОЯЩА СЕ ОТ : ДЕКСТРАН, ΠΟΛΗ(Ν-ΒΗΗΗΛ-ПИРОЛИДОН), ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИ, ПОЛИПРОПИЛЕН ГЛИКОЛХОМОПОЛИМЕРИ, ПОЛИПРОПИЛЕНОВ ОКИС/ЕТИЛЕНОВ ОКИС КО-ПОЛИМЕРИ,ПОЛИОКСИЕТИЛИРАНИ ПОЛИОЛИ, ПОЛИВИНИЛ АЛКОХОЛИ.
57. МЕТОД ЗА ПРЕТЕНЦИЯ 53 ИЛИ 54, КЪДЕТО ЦИТИРАНИЯ ВОДОРАЗТВОРИМПОЛИМЕР Е ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ.
58. МЕТОД ЗА ПРЕТЕНЦИЯ 53, КЪДЕТО ЦИТИРАНОТО pH Е МЕЖДУ ОКОЛО 3 ИОКЛО 9.
59. МЕТОД ЗА' ПРЕТЕНЦИЯ 53, КЪДЕТО ЦИТИРАНИТЕ УСЛОВИЯ НАРЕДУКТИВНО АЛКИЛИРАНЕ ВКЛЮЧВАТ УПОТРЕБАТА НА НАТРИЕВЦИАНОБОРОХИДРИД КАТО РЕДУЦИРАЩ АГЕНТ.
60. МЕТОД ЗА СВЪРЗВАНЕ НА МОЛЕКУЛА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ КЪМ MGDFПОЛИПЕПТИД, СПОРЕД ВСЯКА ОТ ПРЕТЕНЦИИ 1 -12, КЪДЕТО ЦИТИРАНАТАМОЛЕКУЛА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ ИМА ЕДНА РЕАКТИВНА АЛДЕХИДНА ГРУПА.ТОЗИ МЕТОД ВКЛЮЧВА: (а) СЪПРИКОСНОВЕНИЕ НА ЦИТИРАНИЯ MGDF ПОЛИПЕПТИД С ЦИТИРАНАТАW ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВА МОЛЕКУЛА ПРИ РЕДУКЦИОННИ АЛКИЛИРАЩИ УСЛОВИЯ, ПРИ ДОСТАТЪЧНО КИСЕЛО pH, ТАКОВА ЧЕ ДА ПОЗВОЛЯВА а-АМИНО ГРУПАТА НА АМИНО КРАЯ НА ЦИТИРАНИЯ MGDF ПЕПТИД ДА БЪДЕРЕАКТИВНА; И (б) ПОЛУЧАВАНЕ НА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНИЯ MGDF ПОЛИПЕПТИД. -141- WO 95/26746 PCT/US95/03776
61. МЕТОД СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 60, КЪДЕТО ЦИТИРАНАТА МОЛЕКУЛАПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ ИМА МОЛЕКУЛНО ТЕГЛО ОТ 2 ДО 100 КИЛОДАЛТОНА.
62. ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН ПРОДУКТ, ПРОИЗВЕДЕН ПО МЕТОДА НАПРЕТЕНЦИЯ 60.
63. ПРИГОТВЯНЕ НА ПРАКТИЧЕСКИ ХОМОГЕНЕН MGDF ПОЛИПЕПТИД СПОРЕДВСЯКА ОТ ПРЕТЕНЦИИ 1 -12, МОНО-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН В а-АМИНОГРУПАТА НА N-КРАЯ НА ЦИТИРАНИЯ MGDF ПОЛИПЕПТИД.
64. ПРИГОТВЯНЕ НА ПРЕТЕНЦИЯ 63, КЪДЕТО ЦИТИРАНИЯ MGDF ПОЛИПЕПТИДЕ МОНО-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН С ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ, КОЙТО ИМАОТНОСИТЕЛНО МОЛЕКУЛНО ТЕГЛО ОТ 5 ДО 50 КИЛОДАЛТОНА.
65. ФАРМАЦЕВТИЧЕН СЪСТАВ СЪДЪРЖАЩ ПРОИЗВОДЕН MGDF СПОРЕДПРЕТЕНЦИИ 41-49, 51 ИЛИ 52 И ФАРМАЦЕВТИЧНО ПРИЕМЛИВ РАЗТВОРИТЕЛ,АДЖУВАНТ ИЛИ НОСИТЕЛ.
66. ФАРМАЦЕВТИЧЕН СЪСТАВ, СЪДЪРЖАЩ: (а) ПРАКТИЧЕСКИ ХОМОГЕННОПРИГОТВЕН МОНОПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН MGDF ПОЛИПЕПТИД СПОРЕД ф ПРЕТЕНЦИЯ 63, КЪДЕТО ЦИТИРАНИЯ МОНОПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН MGDFПОЛИПЕПТИД СЪДЪРЖА ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ С МОЛЕКУЛНО ТЕГЛО ОТ 5 ДО50 КИЛОДАЛТОНА, СВЪРЗАН ЕДИНИЧНО КЪМ N-КРАЯ НА MGDF ПОЛИПЕПТИДАЧРЕЗ АЛКИЛНА ВРЪЗКА И (б) ФАРМАЦЕВТИЧНО ПРИЕМЛИВ РАЗТВОРИТЕЛ,АДЖУВАНТ ИЛИ НОСИТЕЛ.
67. МОНО-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН MGDF ПОЛИПЕПТИД, СЪДЪРЖАЩАМИНО КИСЕЛИНИ 22-184 НА фИГ. 11. -142- WO 95/26746 PCT/US95/03776
68. МОНО-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН MGDF ПОЛИПЕПТИД СПОРЕДПРЕТЕНЦИЯ 67, КЪДЕТО ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВАТА ГРУПА Е СВЪРЗАНА КЪМN-КРАЯ НА ПОЛИПЕПТИДА.
69. МОНО-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН MGDF ПОЛИПЕПТИД СПОРЕДПРЕТЕНЦИЯ 68, КЪДЕТО ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛОВАТА ГРУПА Е СЪС СРЕДНОМОЛЕКУЛНО ТЕГЛО ОТ 2 Д0100 КИЛОДАЛТОНА.
70. МОНО-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН MGDF ПОЛИПЕПТИД СПОРЕДПРЕТЕНЦИИ 67, 68 ИЛИ 69, КЪДЕТО MGDF ПОЛИПЕПТИДА Е ПРОИЗВЕДЕН В Е.
71. МЕТОД ЗА СВЪРЗВАНЕ НА ВОДОРАЗТВОРИМ ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ КЪМMGDF ПОЛИПЕПТИД СЪДЪРЖАЩ АМИНО КИСЕЛИНИ 22 -184 НА фИГ. 11, КАТОТОЗИ МЕТОД ВКЛЮЧВА КОНТАКТ МЕЖДУ MGDF ПОЛИПЕПТИДА СПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛ ПРИ ТАКИВА УСЛОВИЯ, ЧЕ ПРИ СВЪРЗВАНЕТО НА MGDFПОЛИПЕПТИДА С ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛА ДА СЕ ПОЛУЧИ МОНО-ПОЛИЕТИЛЕНГЛИКОЛИРАН MGDF ПОЛИПЕПТИД.
72. МЕТОД СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 71, КЪДЕТО ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛА ЕСВЪРЗАН С MGDF ПОЛИПЕПТИДА ПРИ РЕДУКЦИОННО АЛКИЛИРАЩИ УСЛОВИЯ,ПРИ ДОСТАТЪЧНО КИСЕЛО pH, ТАКОВА ЧЕ ДА ПОЗВОЛЯВА α-АМИНО ГРУПАТАНА АМИНО КРАЯ НА ЦИТИРАНИЯ MGDF ПЕПТИД ДА БЪДЕ РЕАКТИВНА.
73. МЕТОД СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 71 ИЛИ 72 КЪДЕТО MGDF ПОЛИПЕПТИДА ЕМОНО-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАН С ПОЛИЕТИЛЕН ГЛКИКОЛ, ИМАЩ СРЕДНОМОЛЕКУЛНО ТЕГЛО ОТ 2 ДО 100 КИЛОДАЛТОНА. -143- WO 95/26746 PCT/US95/03776
74. МЕТОД СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 73, КЪДЕТО MGDF ПОЛИПЕПТИДА ЕПРИДОТВЕН ЧРЕЗ ОТДЕЛЯНЕ НА MET2 - ЛИЗ'1 ОТ ПЕПТИДА , ПРОИЗВЕДЕН В Е.coli КЛЕТКА ЧРЕЗ ЕКСПРЕСИЯ НА ДНК, КОДИРАЩА ПОЛИПЕПТИД, СЪДЪРЖАЩАМИНО КИСЕЛИНИ 22-184 НА ФИГ. 11 И СЕКВЕНЦИЯТА МЕТ-ЛИЗ НА НЕГОВИЯ N-КРАЙ.
75. МЕТОД, СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 73, КЪДЕТО MGDF ПОЛИПЕПТИДА ЕПРИГОТВЕН ЧРЕЗ: (а) ЕКСПРЕСИЯ В Е. coli НА ДНК, КОДИРАЩА ПОЛИПЕПТИД, СЪДЪРЖАЩф АМИНО КИСЕЛИНИ 22 -184 НА ФИГ. 11 И СЕКВЕНЦИЯТА MET - ЛИЗ НА НЕГОВИЯ N-КРАЙ, (б) ИЗОЛИРАНЕ НА ЕКСПРЕСИРАНИЯ ПОЛИПЕПТИД, И (в) ОТДЕЛЯНЕ НА MET2 - ЛИЗ"1 ОТ ИЗОЛИРАНИЯ ПОЛИПЕПТИД.
76. ФАРМАЦЕВТИЧЕН СЪСТАВ СЪДЪРЖАЩ МОНО-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНMGDF СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 69 И ФАРМАЦЕВТИЧНО ПРИЕМЛИВ РАЗТВОРИТЕЛ,АДЖУВАНТ ИЛИ НОСИТЕЛ. _„
77. ФАРМАЦЕВТИЧЕН СЪСТАВ, СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 76 ВЪВ ВОДЕН РАЗТВОР, ф
78. ФАРМАЦЕВТИЧЕН СЪСТАВ, СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 76 В ЛИОФИЛИЗИРАНФОРМА.
79. МЕТОД ЗА ТРЕТИРАНЕ НА ПАЦИЕНТ С MGDF ПОЛИПЕПТИДНАНЕДОСТАТЪЧНОСТ, КОЙТО ВКЛЮЧВА НАЗНАЧАВАНЕ НА ЕФЕКТИВНОКОЛИЧЕСТВО ОТ МОНО-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНИЯ MGDF ПОЛИПЕПТИДСПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 69 НА ЦИТИРАНИЯ ПАЦИЕНТ. -144- WO 95/26746 PCT/US95/03776
80. МЕТОД ЗА ТРЕТИРАНЕ НА ПАЦИЕНТ С ТРОМБОЦИТОПЕНИЧНО СЪСТОЯНИЕ,КОЙТО ВКЛЮЧВА НАЗНАЧАВАНЕ НА ЕФЕКТИВНО КОЛИЧЕСТВО ОТ МОНО-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНИЯ MGDF ПОЛИПЕПТИД СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 69 НАЦИТИРАНИЯ ПАЦИЕНТ.
81. МЕТОД СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 80, КЪДЕТО ЦИТИРАНОТО СЪСТОЯНИЕ ЕИЗБРАНО ОТ ГРУПА СЪСТОЯЩА СЕ ОТ: АПЛАСТИЧНА АНЕМИЯ, ИДИОПАТИЧНАТРОМБОЦИТОПЕНИЯ И ТРОМБОЦИТОПЕНИЯ ПОЛУЧЕНА. В РЕЗУЛТАТ ОТМЕДИКАМЕНТОЗНО ИЛИ РАДИАЦИОННО ЛЕЧЕНИЕ. ф
82. МЕТОД ЗА УВЕЛИЧАВАНЕ БРОЯ НА ЗРЕЛИТЕ МЕГАКАРИОЦИТИ ПРИПАЦИЕНТ НУЖДАЕЩ СЕ ОТ ТЯХ, КОИТО ВКЛЮЧВА НАЗНАЧАВАНЕ НАЕФЕКТИВНО КОЛИЧЕСТВО ОТ МОНО-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНИЯ MGDFПОЛИПЕПТИД СПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 69 НА ЦИТИРАНИЯ ПАЦИЕНТ.
83. МЕТОД ЗА УВЕЛИЧАВАНЕ БРОЯ НА ТРОМБОЦИТИТЕ ПРИ ПАЦИЕНТНУЖДАЕЩ СЕ ОТ ТЯХ, КОИТО ВКЛЮЧВА НАЗНАЧАВАНЕ НА ЕФЕКТИВНОКОЛИЧЕСТВО ОТ МОНО-ПОЛИЕТИЛЕН ГЛИКОЛИРАНИЯ MGDF ПОЛИПЕПТИДСПОРЕД ПРЕТЕНЦИЯ 69 НА ЦИТИРАНИЯ ПАЦИЕНТ. -145-
BG100625A 1994-03-31 1996-05-30 Състави и методи за стимулиране растежа и диференциацията на мегакариоцитите BG62685B1 (bg)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US22176894A 1994-03-31 1994-03-31
US25262894A 1994-05-31 1994-05-31
US08/321,488 US5795569A (en) 1994-03-31 1994-10-12 Mono-pegylated proteins that stimulate megakaryocyte growth and differentiation
US34778094A 1994-11-30 1994-11-30
PCT/US1995/003776 WO1995026746A1 (en) 1994-03-31 1995-03-30 Compositions and methods for stimulating megakaryocyte growth and differentiation

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BG100625A true BG100625A (bg) 1997-04-30
BG62685B1 BG62685B1 (bg) 2000-05-31

Family

ID=27499246

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG100625A BG62685B1 (bg) 1994-03-31 1996-05-30 Състави и методи за стимулиране растежа и диференциацията на мегакариоцитите

Country Status (32)

Country Link
US (1) US5766581A (bg)
EP (3) EP0755263A4 (bg)
JP (2) JP2996415B2 (bg)
KR (2) KR100303810B1 (bg)
CN (2) CN1103782C (bg)
AT (1) ATE169335T1 (bg)
AU (1) AU691606B2 (bg)
BG (1) BG62685B1 (bg)
BR (1) BR9506017A (bg)
CA (1) CA2167090C (bg)
CZ (2) CZ288926B6 (bg)
DE (1) DE69503849T2 (bg)
DK (1) DK0690127T3 (bg)
EE (1) EE9600121A (bg)
ES (1) ES2119250T3 (bg)
FI (1) FI960136A (bg)
GE (1) GEP20002180B (bg)
GR (1) GR3027593T3 (bg)
HK (2) HK1004231A1 (bg)
HU (1) HU218893B (bg)
IL (1) IL113206A0 (bg)
LV (2) LV11783B (bg)
MY (1) MY113048A (bg)
NO (1) NO960111L (bg)
NZ (1) NZ283863A (bg)
PL (1) PL182567B1 (bg)
RO (1) RO115788B1 (bg)
SI (1) SI0690127T1 (bg)
SK (1) SK166695A3 (bg)
TW (3) TW414799B (bg)
WO (1) WO1995026746A1 (bg)
YU (1) YU20095A (bg)

Families Citing this family (87)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5824784A (en) * 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
AU4163196A (en) * 1994-11-30 1996-06-19 Zymogenetics Inc. Low molecular weight thrombopoietin
US5986049A (en) * 1994-12-30 1999-11-16 Zymogenetics, Inc. Purified thrombopoietin and method of making it
TW387940B (en) * 1995-01-17 2000-04-21 Kirin Brewery Anti-tpo monodonal antibody
US6254870B1 (en) 1995-02-03 2001-07-03 G. D. Searle & Co. Thrombopoietin: IL-3 fusion protein
AU691410B2 (en) * 1995-02-15 1998-05-14 Amgen, Inc. MPL ligand analogs
US5989538A (en) * 1995-02-15 1999-11-23 Amgen Inc. Mpl ligand analogs
US5696250A (en) * 1995-02-15 1997-12-09 Amgen Inc. DNA encoding megakaryocyte growth and development factor analogs
TW434020B (en) * 1995-03-15 2001-05-16 Kirin Brewery Methods for preventing adsorption of thrombopoietin (TPO), and stable top-containing compositions
TW434021B (en) * 1995-03-15 2001-05-16 Kirin Brewery Methods for preventing adsorption of thrombopoietin (TPO), and stable TPO-containing compositions
US5869451A (en) * 1995-06-07 1999-02-09 Glaxo Group Limited Peptides and compounds that bind to a receptor
CN1966520B (zh) 1995-06-07 2012-07-11 葛兰素集团有限公司 结合血小板生成素受体的肽和化合物
US6251864B1 (en) 1995-06-07 2001-06-26 Glaxo Group Limited Peptides and compounds that bind to a receptor
TW497972B (en) * 1995-06-08 2002-08-11 Kirin Brewery Stable thrombopoietin (TPO)-containing lyophilized compositions
EP0870027A1 (en) * 1995-10-05 1998-10-14 G.D. Searle & Co. Novel c-mpl receptor agonists
US6066318A (en) 1995-10-05 2000-05-23 G.D. Searle & Co. Multi-functional hematopoietic fusion proteins between sequence rearranged C-MPL receptor agonists and other hematopoietic factors
US5879673A (en) * 1996-01-25 1999-03-09 Genentech, Inc. Administration of thrombopoietin on a single day only
US7091311B2 (en) 1996-06-07 2006-08-15 Smithkline Beecham Corporation Peptides and compounds that bind to a receptor
AU4344697A (en) * 1996-10-04 1998-04-24 Amgen, Inc. Pharmaceutical compositions containing an mpl ligand
US5914251A (en) * 1996-10-22 1999-06-22 Amgen Inc. Nucleic acid molecules encoding placental-derived growth factors
AU2006201129B2 (en) * 1997-05-21 2008-03-13 Genentech, Inc. Novel administration of thrombopoietin
JP4562815B2 (ja) * 1997-05-21 2010-10-13 ジェネンテック， インコーポレイテッド トロンボポエチンの新規な投与
IL139286A (en) * 1998-04-28 2005-12-18 Applied Research Systems Polyol-ifn-beta conjugates, their preparation and use
US20030228666A1 (en) 1998-06-30 2003-12-11 Daewoong Pharmaceutical Co., Ltd. Novel human thrombopoietin mutein
ME00238B (me) 1998-10-23 2011-02-10 Kirin Amgen Inc Mimičko vezivanje dimernog trombopoitetinskog peptida za mp1 receptor sa trombopoietičkom aktivnošću
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
WO2000057891A1 (en) 1999-03-30 2000-10-05 Trustees Of Boston University Compositions and methods for producing platelets and/or proplatelets from megakaryocytes
US20030211094A1 (en) * 2001-06-26 2003-11-13 Nelsestuen Gary L. High molecular weight derivatives of vitamin k-dependent polypeptides
TWI224620B (en) 2000-08-11 2004-12-01 Kirin Brewery Polypeptides controlling phosphoric acid metabolism, calcium metabolism, calcification and vitamin D metabolism and DNAS encoding the same
WO2002015926A1 (fr) * 2000-08-24 2002-02-28 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Compositions medicinales contenant des ligands c-mpl, destinees a l'augmentation des plaquettes et des erythrocytes
UY26317A1 (es) * 2000-08-30 2000-10-31 Alfonso Cayota Carlos Pritsch Sistema de produccion de trombopoyetina humana por celulas de mamiferos en cultivo
EP1234583A1 (en) * 2001-02-23 2002-08-28 F. Hoffmann-La Roche Ag PEG-conjugates of HGF-NK4
US7332474B2 (en) 2001-10-11 2008-02-19 Amgen Inc. Peptides and related compounds having thrombopoietic activity
US20030191056A1 (en) 2002-04-04 2003-10-09 Kenneth Walker Use of transthyretin peptide/protein fusions to increase the serum half-life of pharmacologically active peptides/proteins
US20040028661A1 (en) * 2002-08-07 2004-02-12 Bartelmez Stephen H. Expansion of cells using thrombopoietin and anti-transforming growth factor-beta
AU2003276846A1 (en) * 2002-08-09 2004-02-25 Xencor Thrombopoiesis-stimulating proteins having reduced immunogenicity
WO2004026332A1 (en) 2002-09-18 2004-04-01 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Methods of increasing platelet and hematopoietic stem cell production
WO2004060300A2 (en) * 2002-12-26 2004-07-22 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity
ES2389183T3 (es) * 2002-12-26 2012-10-23 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Conjugados de polietilenglicol de interferón-beta-1b con potencia biológica in vitro potenciada
AU2004210697B2 (en) * 2003-02-11 2007-10-18 Irm Llc Novel bicyclic compounds and compositions
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
PL1603541T5 (pl) 2003-03-05 2013-06-28 Halozyme Inc Rozpuszczalna glikoproteina o aktywności hialuronidazy (sHASEGP), sposób jej wytwarzania, zastosowanie i zawierające ją kompozycje farmaceutyczne
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US20090123367A1 (en) * 2003-03-05 2009-05-14 Delfmems Soluble Glycosaminoglycanases and Methods of Preparing and Using Soluble Glycosaminoglycanases
US7587286B2 (en) * 2003-03-31 2009-09-08 Xencor, Inc. Methods for rational pegylation of proteins
US7610156B2 (en) * 2003-03-31 2009-10-27 Xencor, Inc. Methods for rational pegylation of proteins
US7642340B2 (en) 2003-03-31 2010-01-05 Xencor, Inc. PEGylated TNF-α variant proteins
US7723295B2 (en) 2003-08-28 2010-05-25 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Peptides and compounds that bind to a receptor
SI1675606T1 (sl) 2003-08-28 2017-07-31 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Peptidi in spojine, ki se vežejo na trombopoietinske receptorje
AU2004279895A1 (en) 2003-10-10 2005-04-21 Xencor, Inc Protein based TNF-alpha variants for the treatment of TNF-alpha related disorders
RU2542391C2 (ru) 2003-12-30 2015-02-20 Аугустинус БАДЕР Способ регенерации ткани
WO2005118551A2 (en) * 2004-05-28 2005-12-15 Ligand Pharmaceuticals Inc. Thrombopoietin activity modulating compounds and methods
WO2005123113A2 (en) * 2004-06-14 2005-12-29 Intermune, Inc. Interferon compositions and methods of use thereof
MX2007000216A (es) 2004-07-08 2007-03-15 Amgen Inc Peptidos terapeuticos.
AU2005275108B2 (en) * 2004-07-16 2011-05-12 Nektar Therapeutics Conjugates of a GM-CSF moiety and a polymer
BRPI0516883A (pt) * 2004-10-25 2008-09-23 Ligand Pharm Inc compostos e métodos para modulação da atividade de trombopoietina
US8008453B2 (en) 2005-08-12 2011-08-30 Amgen Inc. Modified Fc molecules
WO2007102946A2 (en) 2006-01-23 2007-09-13 Amgen Inc. Crystalline polypeptides
US7981425B2 (en) 2006-06-19 2011-07-19 Amgen Inc. Thrombopoietic compounds
US8318153B2 (en) * 2006-06-29 2012-11-27 Nalin David R Method of medically treating an individual
CA2687141C (en) 2007-05-22 2014-04-01 Amgen Inc. Compositions and methods for producing bioactive fusion proteins
TWI395593B (zh) 2008-03-06 2013-05-11 Halozyme Inc 可活化的基質降解酵素之活體內暫時性控制
SG187427A1 (en) 2008-04-14 2013-02-28 Halozyme Inc Modified hyaluronidases and uses in treating hyaluronan-associated diseases and conditions
TWI394580B (zh) 2008-04-28 2013-05-01 Halozyme Inc 超快起作用胰島素組成物
SG172064A1 (en) 2008-12-09 2011-07-28 Halozyme Inc Extended soluble ph20 polypeptides and uses thereof
WO2010074831A1 (en) 2008-12-16 2010-07-01 Dow Corning Corporation Preparation of siloxanes
US20110294733A1 (en) 2009-01-20 2011-12-01 Hanall Biopharma Co., Ltd. Modified human thrombopoietin polypeptide fragment and manufacturing method thereof
US8680150B2 (en) * 2009-05-28 2014-03-25 Ligand Pharmaceuticals, Inc. Small molecule hematopoietic growth factor mimetic compounds that activate hematopoietic growth factor receptors
AU2010254046C1 (en) 2009-05-29 2014-03-06 Novartis Ag Methods of administration of thrombopoietin agonist compounds
EA026112B1 (ru) 2009-09-17 2017-03-31 Бакстер Хелскэа, С.А. Стабильная композиция, содержащая гиалуронидазу и иммуноглобулин, и способы ее применения
WO2011098095A1 (en) 2010-02-09 2011-08-18 Aplagen Gmbh Peptides binding the tpo receptor
US9878046B2 (en) 2010-07-20 2018-01-30 Halozyme, Inc. Adverse side-effects associated with administration of an anti-hyaluronan agent and methods for ameliorating or preventing the side-effects
ES2634669T3 (es) 2011-02-08 2017-09-28 Halozyme, Inc. Composición y formulación lipídica de una enzima de degradación de hialuronano y uso de la misma para el tratamiento de la hiperplasia benigna de próstata
US20130011378A1 (en) 2011-06-17 2013-01-10 Tzung-Horng Yang Stable formulations of a hyaluronan-degrading enzyme
WO2012174480A2 (en) 2011-06-17 2012-12-20 Halozyme, Inc. Continuous subcutaneous insulin infusion methods with a hyaluronan degrading enzyme
US20130071394A1 (en) 2011-09-16 2013-03-21 John K. Troyer Compositions and combinations of organophosphorus bioscavengers and hyaluronan-degrading enzymes, and methods of use
WO2013063155A2 (en) 2011-10-24 2013-05-02 Halozyme, Inc. Companion diagnostic for anti-hyaluronan agent therapy and methods of use thereof
SI3130347T1 (sl) 2011-12-30 2020-02-28 Halozyme, Inc. Variante polipeptida PH20, formulacije in uporabe le-teh
MX360092B (es) 2012-04-04 2018-10-19 Halozyme Inc Terapia de combinación con un agente antihialuronano y un taxano orientado a tumor.
US9278124B2 (en) 2012-10-16 2016-03-08 Halozyme, Inc. Hypoxia and hyaluronan and markers thereof for diagnosis and monitoring of diseases and conditions and related methods
TW201534726A (zh) 2013-07-03 2015-09-16 Halozyme Inc 熱穩定ｐｈ２０玻尿酸酶變異體及其用途
TR201907471T4 (tr) 2014-08-28 2019-06-21 Halozyme Inc Bir hiyalüronan ayrıştırıcı enzim ve bir bağışıklık kontrol noktası inhibitörüyle kombinasyon terapisi.
BR112017007765B1 (pt) 2014-10-14 2023-10-03 Halozyme, Inc Composições de adenosina deaminase-2 (ada2), variantes do mesmo e métodos de usar o mesmo
SG11201912071QA (en) 2017-06-22 2020-01-30 Catalyst Biosciences Inc Modified membrane type serine protease 1 (mtsp-1) polypeptides and methods of use
WO2019222435A1 (en) 2018-05-16 2019-11-21 Halozyme, Inc. Methods of selecting subjects for combination cancer therapy with a polymer-conjugated soluble ph20
JP2022516725A (ja) 2018-12-28 2022-03-02 カタリスト・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド 改変ウロキナーゼ型プラスミノゲンアクティベータポリペプチドおよび使用方法
US11613744B2 (en) 2018-12-28 2023-03-28 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Modified urokinase-type plasminogen activator polypeptides and methods of use

Family Cites Families (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4002531A (en) * 1976-01-22 1977-01-11 Pierce Chemical Company Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby
JPS6023084B2 (ja) * 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US4640835A (en) * 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
DE3380726D1 (en) * 1982-06-24 1989-11-23 Japan Chem Res Long-acting composition
DE3572982D1 (en) * 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
EP0206448B1 (en) * 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
US4810643A (en) * 1985-08-23 1989-03-07 Kirin- Amgen Inc. Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor
US4894440A (en) * 1986-09-17 1990-01-16 Massachusetts Institute Of Technology Method of isolating megakaryocyte stimulatory factor
ZA887773B (en) * 1987-10-26 1989-07-26 Immunex Corp Interleukin-7
US4904584A (en) * 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
US4847325A (en) * 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
CA1340810C (en) * 1988-03-31 1999-11-02 Motoo Yamasaki Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
IL90719A0 (en) * 1988-06-28 1990-01-18 Yissum Res Dev Co Novel nuclei acids and polypeptides encoded thereby
US5128449A (en) * 1988-07-05 1992-07-07 The University Of Tennessee Research Corporation Polypeptide and a method for its production
US5258324A (en) * 1988-09-21 1993-11-02 Meiji Seika Kaisha, Ltd. Megakaryocyte colony stimulating factor and process for its preparation
GB8824591D0 (en) * 1988-10-20 1988-11-23 Royal Free Hosp School Med Fractionation process
CA2006596C (en) * 1988-12-22 2000-09-05 Rika Ishikawa Chemically-modified g-csf
US5087448A (en) * 1989-02-02 1992-02-11 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Enhancing growth of megakaryocytes in mammals using interleuking 6
US5032396A (en) * 1989-02-17 1991-07-16 Immunex Corporation IL-7 to stimulate platelet production
US5260417A (en) * 1989-04-03 1993-11-09 Genetics Institute, Inc. Megakaryocyte growth promoting activity protein
AU641645B2 (en) * 1989-04-03 1993-09-30 Genetics Institute Inc. Megakaryocyte growth promoting activity
AU5355790A (en) * 1989-04-19 1990-11-16 Cetus Corporation Multifunctional m-csf proteins and genes encoding therefor
US6433142B1 (en) * 1989-08-08 2002-08-13 Genetics Institute, Llc Megakaryocyte stimulating factors
EP0487613B1 (en) * 1989-08-08 1996-10-30 Genetics Institute, Inc. A megakaryocytopoietic factor
US5215895A (en) * 1989-11-22 1993-06-01 Genetics Institute, Inc. Dna encoding a mammalian cytokine, interleukin-11
JPH04218000A (ja) * 1990-02-13 1992-08-07 Kirin Amgen Inc 修飾ポリペプチド
CA2084074A1 (en) * 1990-05-31 1991-12-01 Keita Matsunaga Megakaryocyte colony stimulating factor and production thereof
JPH06502621A (ja) * 1990-07-02 1994-03-24 ヒップル　キャンサー　リサーチ　センター ヒトｍｅｇ―ｃｓｆタンパク質と方法
IE912365A1 (en) * 1990-07-23 1992-01-29 Zeneca Ltd Continuous release pharmaceutical compositions
WO1992006178A1 (en) * 1990-10-05 1992-04-16 Systemix, Inc. Megakaryocyte and platelet growth, production and composition
AU8868891A (en) * 1990-10-12 1992-05-20 Amgen, Inc. Megakaryocyte maturation factors
WO1992007074A1 (fr) * 1990-10-19 1992-04-30 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Polypeptide de la famille d'un recepteur de facteur de croissance, application au diagnostic et a la therapie des maladies myeloproliferatives
AU646530B2 (en) * 1990-12-28 1994-02-24 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Novel megakaryocyte amplifier and production thereof
JP3283288B2 (ja) * 1991-03-08 2002-05-20 電気化学工業株式会社 生理活性ペプチド製剤
JPH04295500A (ja) * 1991-03-26 1992-10-20 Asahi Chem Ind Co Ltd 新規な巨核球増幅因子とその製法
WO1993000433A1 (en) * 1991-06-28 1993-01-07 New England Deaconess Hospital A differentiated megakaryocyte line producing novel megakaryocyte differentiation factors
WO1993000109A1 (en) * 1991-06-28 1993-01-07 Genentech, Inc. Method of stimulating immune response using growth hormone
US5250732A (en) * 1991-07-18 1993-10-05 Genentech, Inc. Ketamine analogues for treatment of thrombocytopenia
NZ244778A (en) * 1991-10-21 1994-03-25 Ortho Pharma Corp Peg imidates and protein derivatives thereof
JP3328341B2 (ja) * 1991-12-27 2002-09-24 中外製薬株式会社 新規な巨核球増幅因子
AU3463493A (en) * 1992-02-07 1993-09-03 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Novel megakaryocyte amplifier and production thereof
AU4190893A (en) * 1992-07-17 1994-01-20 Suntory Limited Megakaryocyte differentiation factor
GB2285446B (en) * 1994-01-03 1999-07-28 Genentech Inc Thrombopoietin
WO1995021626A1 (en) * 1994-02-14 1995-08-17 University Of Washington Methods for stimulating erythropoiesis using thrombopoietin
WO1995021919A2 (en) * 1994-02-14 1995-08-17 Kirin Brewery Company, Limited Protein having tpo activity
EP0668352A1 (en) * 1994-02-14 1995-08-23 Kirin Brewery Company, Ltd. Protein having TPO activity
AU691828B2 (en) * 1994-02-14 1998-05-28 University Of Washington Hematopoietic protein and materials and methods for making it
US5547931A (en) * 1994-02-23 1996-08-20 Immtech International Inc. Methods of stimulatory thrombocytopoiesis using modified C-reactive protein
US5571686A (en) * 1994-04-14 1996-11-05 Massachusetts Institute Of Technology Method of using megapoietin for prolonging the survival & viability of platlets

Also Published As

Publication number Publication date
AU2230895A (en) 1995-10-23
ATE169335T1 (de) 1998-08-15
EP0755263A4 (en) 2005-02-09
CZ350595A3 (en) 1997-01-15
GR3027593T3 (en) 1998-11-30
JP3485842B2 (ja) 2004-01-13
HUT74257A (en) 1996-11-28
ES2119250T3 (es) 1998-10-01
LV11783A (lv) 1997-06-20
CN1229385C (zh) 2005-11-30
WO1995026746A1 (en) 1995-10-12
IL113206A0 (en) 1995-06-29
BG62685B1 (bg) 2000-05-31
EP0755263A1 (en) 1997-01-29
DE69503849D1 (de) 1998-09-10
FI960136A (fi) 1996-03-11
CN1137757A (zh) 1996-12-11
EP0675201A1 (en) 1995-10-04
DK0690127T3 (da) 1999-05-03
EP0690127B1 (en) 1998-08-05
BR9506017A (pt) 1997-10-14
LV11783B (en) 1997-12-20
CN1322759A (zh) 2001-11-21
CA2167090C (en) 2002-05-14
CZ288890B6 (cs) 2001-09-12
GEP20002180B (en) 2000-07-25
EE9600121A (et) 1997-04-15
JP2996415B2 (ja) 1999-12-27
PL312577A1 (en) 1996-04-29
HU9600059D0 (en) 1996-03-28
LV12275A (lv) 1999-05-20
EP0690127A1 (en) 1996-01-03
JPH10510980A (ja) 1998-10-27
KR100303810B1 (ko) 2001-12-01
NO960111L (no) 1996-09-24
AU691606B2 (en) 1998-05-21
US5766581A (en) 1998-06-16
YU20095A (sh) 1998-08-14
LV12275B (en) 1999-08-20
RO115788B1 (ro) 2000-06-30
TW414799B (en) 2000-12-11
CA2167090A1 (en) 1995-10-12
TW565568B (en) 2003-12-11
DE69503849T2 (de) 1999-04-01
HK1041275B (zh) 2006-07-28
FI960136A0 (fi) 1996-01-11
SI0690127T1 (en) 1998-12-31
HK1041275A1 (en) 2002-07-05
MX9600206A (es) 1998-11-30
SK166695A3 (en) 1997-02-05
HU218893B (hu) 2000-12-28
KR100203824B1 (ko) 1999-06-15
PL182567B1 (pl) 2002-01-31
MY113048A (en) 2001-11-30
NZ283863A (en) 1997-12-19
CN1103782C (zh) 2003-03-26
NO960111D0 (no) 1996-01-10
JP2000103799A (ja) 2000-04-11
TW496870B (en) 2002-08-01
CZ288926B6 (cs) 2001-09-12
HK1004231A1 (en) 1998-11-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BG100625A (bg) Състави и методи за стимулиране растежа и диференциацията на мегакариоцитите
DE69934425T2 (de) Thrombopoietin substitute
US5795569A (en) Mono-pegylated proteins that stimulate megakaryocyte growth and differentiation
JP4949844B2 (ja) エリスロポエチン受容体に結合する新規ペプチド
JP2005523682A (ja) 血小板新生活性を有するペプチド及び関連化合物
TW201138831A (en) Modified granulocyte colony stimulating factor (G-CSF)
AU727978B2 (en) MPL ligand analogs
CN101142234A (zh) 结合红细胞生成素受体的新肽
RU2158603C2 (ru) Способы и препараты для стимулирования роста и дифференцировки мегакариоцитов
TWI327149B (en) Peptides and related compounds having thrombopoietic activity
RO118299B1 (ro) Polipeptida trombopoietina, secventa adn care o codifica, procedeu pentru prepararea polipeptidei trombopoietine si compozitie farmaceutica cu aceasta
TWI344964B (en) Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor
MXPA96000206A (en) Compositions and methods to stimulate the growth and differentiation of the megacarioci
MXPA00002467A (en) Mpl ligand analogs