TW414799B - Compositions and methods for stimulating megakaryocyte growth and differentiation - Google Patents

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笋34 1 03273號專利申請辜 甲文説明書修正頁（85年12月 A? )B7 五、發明説明（ίθ 414799 二-是否變更原實質内容 經濟部中夹螵準局員工消f合作社印製 迸有關其搡作的其他细節等所引述的文獻和其他資料都併 於太文中Η為參考。 礅牛物於台滢》寄存 蒈鳄P B C B ( Η [] D F 2 )(於大_桿菌/\1)|6(：中）已於84年3月28 日寄存於食品工業發展研究所（F [ R D [)，寄存编號：CC ΙΪ C 9 4 0 0 8 6 ^ 詈體P B C B ( H G D F 1 ϊ ί於大辑桿-菌A b ί㊀C中）已於S 4年3月2 S 曰寄存於FIR DI，寄存編號：CCRC 9 40087。 < 表現質體 pAM「； llR-Hu He_t‘Ly：s HGDF (於大腸桿菌 FM15 中*已於8 4年3月2 8日寄存於F i R D Γ，寄存編號i C C R C 940088 - - 大暖捍_K12 FM15已於84年3月28日寄存於FIRDI，寄存 竭襌：Γ. C R C 9 5 0 0 0 2。 中國倉鼠®!巢细朐株P00U β〇ηΜ已於84年3月28日寄存 於 F I R D [，寄存编號：C C S C (J 6 0 0 2 5。 10β - 本舐铁尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X 297公釐） ί ---------Ί-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ?99 A7 B7 經濟部中央榉隼局—工消费合作社印製 五、發明説明（1 ) 發职箱a 本發明係有鼷新親蛋白質，於本文中同義地稱為Mpl S 體或MGDFs ·其可剌激巨核妞胞的生長並增加巨核细胞的 分化或成热，最终效應為增加血小扳的數目。此外•也提 出從天然來源取得均質形式的蛋白質與烴由重姐遺傳工程 技術製備彼等之方法。 於另一部份中，本發明概括地有醑新顆的MGDF衍生物類 別*其中該HGDF分子係接署到水溶性聚合物者.•及製_彼 等分子的方法。於又另一部份中*本發明偽有《 MGDF衍生 物•其¥ HGDF分子係接到一或多種聚乙二酵（"PEG”）者· 及其製備方法。 琎明背暑 本發明包含至少兩種廣Μ的研究領域。第一種係有tt巨 核细胞的發育及其播後產生血小板•而第二種係有醑生長 因子受《族的多肽成員*本文稱之為Mp)受«者•及其K 體。下文即分別《述埴些研究領域。 A.從苷坊龕牛咖小诟 血小板為循瓖细胞，其對於流血的遏止和血液凝结具有 重要性。巨核细胞為血小板的细胞源且供源自共同的#髓 前臑細胞-其可衍生成所有的造血细胞糸。該共同的前體 細胞稱為多種作用性幹细胞或PPSC。 巨核细胞前身鈕胞的曆糸偽Μ在活«外(in vitro)對 應於逋當生長因子的培養系铳中所出現的巨核细胞（MK) 群辖之出現時間和尺寸為基礎的。釋放形成單位巨核细胞 裝-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（(：?《)八4規格（21()/ 297公釐} 經濟部中夬標準局員工消费合作社印製 414799 A7 A7 B7五、發明説明（2 ) (BFU-ΜΚ)為最原始的巨核餌胞前身细胞。BFU-ΜΚ被謀為 到最後會產生眾多群落形成性單位巨核细胞（CFU-MK) · 其為更分化的KK前身细胞。 «著HK畑胞進行後鑛的分化•其即失去進行有躲分裂的 陡力但取得核內再複製的能力。核内再複製（或核内有絲 分裂）為在沒有细胞分裂時•细胞内發生核分裂之現象。 核内再複製到最後會専致成為多倍雅的MK。進一步的MK成 熟化促成構成血小板特徴的捆胞質小器官和膜.等姐成物之 取得。 血小'板係烴由未確定濟楚的程序從成热產生的，該程 序烴推測為MK钧理裂殖•或其他檐制之结果。巨核细胞内 大量膜構造的顥察導致血小板形成棋型，其中一界埭_糸 統在P胞B内《括出析生態血小板。另一種血小板形成棋 堃係由下述觀察發展出者•亦即•巨核细胞會形成限制在 血小板尺寸間段的長细胞質突起•由該突起*血小板可能 因#«!及/或肺内的血潦壓力而分離出來。逭些畑胞質突 起即為Becker和DeBruyn所稱的前血小板Μ反映其所假設 的在血小板形成中的前《角色。參看Becker and DeBruyn, A^er. J. Anat. 145:18.3 (1976)。 園1表出巨核緬胞和血小板發展的各種前《餌胞之總鸞 。中最左邊的细胞為PPSC *而中在PPSC右邊的其他緬 胞為BFU-MK ·接著為CFU-HK。釀中緊接在PPSC右邊正進行 核内再複製的畑胞為成熟的巨核细胞。由於核内有躲分裂 的结果*該细胞已變成多倍髓。緊接其右邊的構造《包含 I---------ί衣------，w------^ -· -(請先閉讀背面之注意事項再填寫本頁) —5 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X 297公釐） ^14799 A7 B7 五、發明説明（_ 3 ) 從成熟巨核佃胞的多倍Η核發出的長细胞質突起。於Η中 «右邊為细胞質突起經裂殖所產生的許多血小板。下列有«上面對於巨核畑胞成热和血小板產生的說明之 某些先前文獻摘列： 1. Williams, N. and Levine, R.F., British Journal of Haematology 52:.. 173-180 (19825 . 2. Levin, J., Molecular Biology and Differentiation of Megakaryocytes, pub. Wiley-Liss, Inc.: 1-10 (1990). 3. " Gewirtz, A.M., The Biology of Hematopoiesis, pub. Wiley-Liss, Inc.: 123-132 (1990). 5.
Han, Z.C., et al., Int. J. Hematol. 54: 3-14 (1991). . Mis u we π hu ί s / H. K. end Sixma, J. t Ns w En g. J. ojf Med. 327: 1812-1813 (1992). ^ 裝-- • - (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央橾準局員工消費合作社印製 6. Long, Μ. , Cells li: 33-40 (1993).B . ifiL小板嵌成的鏞前 '* 許多實驗室所產生的大ft數據顯示血小板的產生係受g 所 調節。這種生物程序的複雜性原先尚未了解，而 .一 一〜一· 在目前顧示有許多人類都具有埴種能力。 巨核细胞調節發生在多重细胞層次。有許多姐鏃介( Cytokines ),可烴由擴大前身细胞池而增進血小板的產生 一 6 一 本紙張尺度適用中國國家標羋（CNS ) A4规格（210X 297公嫠） 良 414799 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（4) 。第二姐通液生長因子係用為作用在更為分化的细胞以促 進核内再複製之成热化因子。此外*似乎有兩種獨立的生 物回鎖迴路來調節這些程序。 有幾種譜糸的非特定性造血生長因子對Hit成热化腌加重 要的影響。粒性jgJB _巨雙胞一群箜剌JLB·子(GH-CSF) ，間白素-3 (IL-3) ，IL-6· U-11 ，白血病抑制因子（ LIF) *和促紅血球生長素（EPO)等分別俚別地依其對 尺寸·數目或倍數性等之影響而在活體外躡示促進人類 MK成热化。LIF ，IL-6 ·和IL-11等的MK成热化效懕相對 於IL-3有部份加成性者（LIF和IL-6)或完全加成性者（ IL-Π )。從這些先前文獻所得瑄類數據可推測在活體内 (in νίχο )可能需要姐嫌介素姐合K促進Μ成热化。 下列所列為一些Η於巨核细胞調節和血小板產生的先前 文獻之摘述： 7· Hoffman, R. et al., Blood Cells 13: 75-86 (1987). 8. Murphy, M.J., Hematology/Oncology Clinics of North America 3 (3): 465-47S (1988). 9. Hoffman, R., Blood 74 (4): 1196-1212 (1989). 10. Mazur, E.M. and Cohen, J.L., Clin. Phariuaco』. Ther.] *6 (3): 250-256 (1989). 11. Gewirt2, A.M. and Calabretta, B., Int. J. Cell Cloning 8: 267-276 (1990). 12. Williams, N., Progress in Growth Factor Research 2: 31-95 (1990). -7- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標率（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 414799 Λ7 B7 五、發明説明（5) 13. Gordon, M.S. and Hoffman, R., Blood 80 (2): 302-307 (1992). 14, Hunt, P. et al” Exp. Hematol· 21: 372-281 {1993) 15, Hunt/ P- et al*, Exp Sematol* 21: 1295-1304 (1993). 此外.也有《導（參看金考資料16)提及在人類 經濟部中央標準局負工消费合作社印製 能性血i中含有興於IL-3，粒性细胞群落剌激因子•和烴 淋巴捆胞調理過的培養基中所含因子等之巨核细胞群落剌 激活性。不遘，促成該活性的分子並未被分_出或在先前 技藝中被難定遇。 16.· Mazur, E.M., et al.. Blood 76^290-297 (1990) ° C·Mo 1夸髑 胥«增生性白血病病毒（MPLV)為一種老鼠複製缺陷性 逆_錄_病毒·其會引起被感染哺乳動物發生急性白血病 。捶發現MPLV所表現的箋因中有一部份繾礞著飆合到與姐 嫌介素受體族*包含GH-CSF，G-CSF ·和ΕΡ0等的受Η相 »連的序列之病赛所具逆轉錄_病毒被鎮（或外蛋白質》 )° 上述MPLV基因的表規具有一有趣的生物學性霣·亦即會 引起各種類型的老隊前身细胞立即取得對增生輿終蠼成热 化的生長因子無Μ性。再者》有些被MPLV急性轉形的骨《 «胞掊養物中含有巨核细胞•顯示HPLV基因與巨核細胞生 長/分化之間有某種W聯。 目前巳被公認者* MPLV病毒基因（稱為v-Mpl )在《轧 -8- 本紙乐尺度適用中國國家標率（CNS ) Α4規格（2丨0 X 297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁)
*1T % A74I47C9 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 五、發明説明（6 ) Λ ζ· f _物细胞中有一同糸物，其被稱為细胞Mpl基因（或 c-Mpl )。使用 v-Hpl-衍生 (探_ 可遘殖出對»於人類 c-MpI基因的cDNA。金看PCT公開申請W0 92/07074 ( 199 2年4月30日公拥·•於下文討論之）。序列分析證明被 c-Mpl基因產钧所ffl碣的蛋白質*躭像同糸的v-MpI基因 產物一般·靨於高度保守性姐嫌介質受嫌超族（ superfaaily ) ° 埴種细胞基因* ，基於經由RHAse 保耀和 «Τ-PCR等《驗發現在正常小鼠的骨« ·脾和胎肝等之中有 其表現、但在其他姐嫌内則沒有表現之结果被趄為其在埴 血中扮有機能性角色。特別者，c-Mpl係在巨核细胞上進 行表現。此外也證實人類细胞基因*人類c-Mpl ，偽在 CD34陽性细胞，包括纆纯化的巨核細胞和血小板等之内進 行表現。CD3 4為顯示早期造血前身细胞的抗原。此外•將 CD34隈性緬胞接觴對c-Mpl ·ΚΝΑ或訊息呈反義（ anti-sense)的寡去氧核苷酸時會明顳地抑制CFII-ΜΚ巨核 细胞前身的群落形成能力，但對於紅血球與粒巨噬细胞等 的前身則沒有影響。 由上述數據和觀察结果推斷c-Mpl纗碣一细胞表面分子 ，在本文稱之為Mpl受«，其结合到一配g而活化該受Η •可能導致巨核细睢的產生及/或發育。 PCT專利公開V0 92/07074係有闢從來自人類和老鼠兩 種來源的c-Mpl產生之蛋白質序列。該基因產物如上面解 釋遇者被認為是一受贈·其係由至少三饀共同g或域所構 -9- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 訂 - 五、發明説明（7 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 成，一細胞外域* —璲膜域*及一緬胞内（或畑胞霣）域 。連接在一起時，這三域即構成完整的Mpl受傾。該PCT 公報也提出一種可溶性的受體形式，其實質地對應於成熟 c-MpI蛋白質的ffi胞外域。其细胞内域含有一疏水性區· 其在經由透膜g連接到該蛋白質的细胞外域時，即促使整 e蛋白霣圈聚而不溶。相反地*當C-Mpl基因產物的ffl胞 外域與該透膜域和细胞内域分開時*其即變成可溶*因此 *該蛋白質的细胞外形式被稱為該受體的”可溶”形式。 下列為某些與上述V-Mpl和c-Mpl受體與基因栢Μ嫌的 說明之先前文獻： 17‘ Wendling, F., et al., Leukemia 3 (7)： 475-480 (1989) . _ ’ 18. Wendling, F., et al., Blood 73 {5): 1161-1167 (1989). 19. Souyri, M., et al., Cell 63: 1137-1147 (1990). 20. Vigon, I·, et al., Proc. Matl Acad. Sci. USA 89: 5640-5644 (1992). 21· Skoda, R.C., et al., The EMBO Journal 12 {7): 2645-2653 (1993). 22. Ogawa, M., Blood 81 (11): 2844-2853 (1993). 23. Methia, N., et al., Blood 52 (5): 1395-1401 (1993). 24. Wendling, F, et al., Blood 80: 246a (1993). 一 1 0 _ 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4说格（210 X 297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央榡準局員Η消費合作社印製 4X4799 at B7_五、發明説明（8) D .辟钳刺潇ιίίτ小诟齑半的碱萌^薷蓉 最近有報専提及在北美，西歐和曰本等境内的Β療中心 正Μ逐漸的速率實晦版.小板灌翰。參看Gordon, M,S, and Hoffman, R·, Blood 80(2) : 302-307 (1992)。埴 種增加大半是因B學技術的進步及下述技術的更大幅增加 *例如·心臓手術及骨«，心*和肝等的移植等。朗量加 強作為癌症患者和HIV-1流行性的繪送治療手段也助長血 小板供姶的《最需求。 血小板的使用伴釀著許多血液性感染病及同種異«I免疫 的傅J8可能性。此外，純化血小板的製備為昂貴的努力* 因而這種血小板的增加使用會增高轚髓翳療费用。因此之 故，對於製備供人類用的血小板之新穎且改良的方法存在 著緊急爾要。 增加血小板製備的範例先前作法分述如下： 美國専利第5,032,396號報導間白素-7(11^-7)能夠剌 激血小板產生》間白素-7也稱為淋巴細胞生成素-1且為一 種促淋巴细胞生成性生長因子•能树剌激册Μ内的B-和 Τ-衄胞前身之生長。公開的PCT申請序號88/03747 ( 198 8年10月19日申請〉和19 88年10月24日申謫的歡洲專利 申誧第88 3 09 977.2號都掲示烴由重姐DNA’s技術製備晡乳 動物IL-7的DHA ·載《I*和相»的方法。於該美國專利中 提出的數據顯示IL-7可增加正常和半致死地照射遇的小鼠 之循環血小板。 美國専利第5,037,448號揭示經由用間白素-6處治哺乳 n^i ^lptr， 士^^^^1 ΐ- - nmn --=1 I、一-- _ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 414799 A7 B7 經濟部令央標準局負工消費合作杜印製 五、發明説明（9 ) 動物可剌激巨核细胞和血小板的增生。重组人類間白素為 -種具有多重生物活性的26,00 0分子量_蛋白。該専利中 提出的数據顧示IL-6具有在活體外增加巨核细胞群落的效 懕。 上述専利沒有提及任何有Μ本發明所提的Mpl配體。 雖然有上述諸掲示，對於晡乳動物體内的巨核细胞及/ 或血小板之新剌激劑仍有強烈霈求存在。 E.有BMh畢ft g MfiDF的背音 由於重姐DK A技術的進展结果使得目前治療用蛋白質可 取得遘#形式且充分的供懕量。這些種蛋白質的化學衍生 物可K有效地阻斷蛋白水解酵素以免與蛋白質主鏈本身行 物理接觸，因而防止降解。其他的優點包括•在某些情況 下*增加治療性蛋白質的安定性和循環時間及減低抗原性 。不遇，必須提及者特殊蛋白質的改質效應是無法預拥的 。有一篇說明蛋白質改質和融合蛋白質的評論文隼為 Francis, "Focus on Growth Factors" 3：4-10 (Hay 1992) Mediscript, Hountviev Court, Friern Barnet Lane, London N20， OLD, UK所出版）。 聚乙二B ("PEG”或” pes”）為己用於治療性蛋白質產物 的製備之一種埴類化學品。例如· Adagen*®，一種經聚乙 二酵化的胨苷脫胺_方劑即經許可用以治療嚴霣的併發性 免疫缺乏疾病；聚乙二酵化的超氧物歧化W已在臨床實作 中用K治療頭部創傷；聚乙二酵化a 播素巳被試用於 第I期肝炎臨床治療中；聚乙二酵化的葡耱腦苷胞海和聚 I---------^-- . i (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 414799 A7 經濟部中央樣準局員工消費合作社印製 _B7_____ 五、發明説明（1Q) 乙酵化的血紅素都巳報導處於臨床前試驗中。對於某些蛋 白«•接著聚乙二酵後s證明可對抗蛋ΰ水解作用’ Sada, et al., J. Ferientation Bioengineering 71 ： 137-139 (1991 )，且已有接著某些聚乙二醉部份體之方法 可用。參看美國專利第4,179,337號，Davis et al.· ”Kon-Is*unogenic Polypeptides” ， （1979年12月 18曰核 發）；和美國專利第 4,002,531 號，Royer, "Modifying Enzyies vith Polyethylene Glycol and Product Produced Thereby”，（1977年 * 1 月 11 日核發）。有關的 評論可# 看 Abuchowski et al..於"Enzynes as Drugs”中 (J . S . Holcerberg and J. Roberts , eds. p p. 367-383 (1981))。 别的水溶性聚合物也巳被用來改質蛋白質*例如* Z·二 醇/丙二酵共聚物•羧甲基纖維素·葡聚耱•聚乙烯醇· 聚乙烯基吡咯烷酮•聚-1,3-二嗦茂烷•聚-1,3,6-三氧 陸睡，乙烯/顧丁烯二酸酐共聚物，及聚胺基酸（均聚物 或無規共聚物）等。 以聚乙二酵而言*巳有多種手段被用來將聚乙二酵分子 接著到蛋白質上。通常係垤由蛋白質上的反應性基將聚S 二酵連接到蛋白質。胺基》和嫌胺酸殘基上或Η-皤上者， 即為方便供這種接著所用者。例如· Royer (上列美B專 利第4,00 2,531號）提及使用进原性烷基化將聚乙二醇分 子接著到酵素。1993年4月28日公開的VrUht, EP 0 539 167, n Peg Iaidates and Protein Derivates ----------^------π------t_ -- (諳先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) -13- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 414799 A7 _____B7_五、發明説明（11 ) Thereof”中提及用PEG的醯亞胺醱衍生物或相Μ的水溶性 有櫬聚合物改霣具有自由胺基的肽和有機化合物》1990年 2月27日核發姶Sha*的美園専利第4.904.584號係有Η用 Κ經由反應性胺基接著聚乙二酵分子而將蛋白質所含許多 離胺酸殘基予以改霣之方法。 一種纆化學改質遇的特殊治療性蛋白霣為粒性细胞群落 剌檄因子，”G-CSF” 9參看歐洲専利公報ΕΡ 0 401 384， ΕΡ 0 473 268* 和ΕΡ 0 335 423等。 另一例子為聚乙二酵化的IL-6，ΕΡ 0 442 72 4，發明名 稱為改質hU-δ” （#看共同申請中的H.S.S.H. 07/632,0 70) ·其掲示加到IL-6中聚乙二醉分子。1985年 9月11日公開的ΕΡ 0 154 316提及用淋巴細胞活與聚乙二 醇醛反應。 改質HGDF的能力在技S中係未知者·其原因在於各《別 蛋白霣對改質的感受性係決定於該蛋白質的特定構造參數 之故。再者，這種改霣對各蛋白質所具生物學性質的影響 從技S上是不可預测者。如本文所述者，由於MGDF的許多 臨床應用•因此W要有改變性霣的衍化MGDP產物。彼等分 子可能具有在活體内增加的半生期及/或活性，及其他性 質等。 蛋白質分子經聚乙二酵化後通常會導致化學改質蛋白質 分子混合物。舉例而言•具有5個離胺酸殘基和在蟠的 —«自由胺基以上述諸方法反應後可導致異霣混合物•有 些具有6俚聚乙二酵部份體，有些具有5届*有些3届， - - I ^^1 - II - 11 —II - - —i^i _1 ^^1 I— -- ill - I --° - > -《請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -14- 本紙乐尺度適用中囷困家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局負工消费合作社印製 414799 A7 ____B7__五、發明説明（12 ) 有些2俚，有些1届而有些則無。此外，於具有幾倨的分 子中*其聚乙二酵部份®可能在不同分子上不接著到相同 的位置。常霈要的是得到均質產钧，其中含有全部只有一 種或少數種（如2-3 )改質蛋白質物種_其在化學物種， 如PEG的數目及/或位置等有變異。話雖如此，對於某一 治療微不而言，如單一，二一及或三—聚乙二酵化物種的 滔合物可能為班當者或可容忍者。 每批潘合钧的變異性在開發治療性聚乙二醇化蛋白霣產 物時可能為不利者。於埴種開發中·生钧活性的可預測性 是重要隹素。例如*果經證明者*有超氧物歧化B與聚乙 二酵的非選擇性結合之情況中•有幾偁部份的改質_素係 完全無活性者（P，M c G 〇 f f e t a 1 _ , C h e b . P h a r . Bull. 38 : 3079-3091 (1988))。亦參看，Rose et al.， Bioconjugate Chemistry 2:154-159 (1991)，其中 報専聯结劑基羰釀肼對蛋白質基質（胰島素）C-端羧基的 選揮性速接。若治療性蛋白質的姐成每批不同時*就不能 具有埴種預测性。有些聚乙二酵部份體在某些位置上可鏟 不像在其他位置结合得一樣安定*而埴種情形可能導致彼 等部份體從蛋白霣上解雛出來。當然•若埴種部份顦係無 規地接著且可能因而無規地解離時•則該治療性蛋白質的 蕖物動力學就不能正確地預澍。 另外高度霈要者為衍化MGDF產物中在聚合物部份體與 MGDF部份體之間沒有聯结部份體者。上文所述方法的一項 問題在於其典型地褥要在蛋白質與聚乙二醇分子之間有一 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本買) 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2I0X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 414799 A7 B7五、發明説明（13 ) 嫌结部份體。埴些雄结部份體可能具抗原性，埴黏在開發 洎療性蛋白質時也是不利者。 一種不含》结基的方法載於Francis et al., "Stability of Protein Phanaceut ica Is · in vivo pathways of degradation and strategies for protein stabilization" (Eds. Ahern*, T. and Manning, M-C· ) Pleiui爾，Nev York, 1991)之中。此外 •在 Fisher et al.，篇輯的” Separations Using Aqueous Phase Systeas, Applications In Cell Biology and Biotechnology. Plenun Press, H.Y.* H.Y. 1989 pp. 211-213 中· Delgado et al.的 "Coupling of PEG to Protein By Activation with Tresyl Chloride, Applications In Iaiunoaffinity Cell Preparation” 一文中提及使用 tresyl chloride ， 其可等致聚乙二酵部份《與蛋白質部份體之間沒有雄结基 。由於tresy〗 chloride的使用可能產生毒性副產物•因 此該方法可能難Μ用來製成治療性龕物》 Chaaov et al.. Bioconjugate Che·. 5：133-140 (1994)報導到用一甲氣基一聚乙二酵（"MePEG二酵）醛埋由 适原性烧基化改霣_CD4免疫吸附素（CD4 iiBunoadhesin )。作者捤及有50X的CD4-Ig經由在M-皤的α-胺基之堪 擇性反懕而被《ePEG-改質（上引資料•第137頁）。此外 *該作者也提及該改質CD4-Ig (對蛋白質gp 120)的活體 外结合能力會以與MePEG化程度相Μ聯的速率減低（同上 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -16- 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) Α4規格（210+Χ297公釐） 414799 A7 B7五、發明説明（14) 經济部中夬標準局負工消費合作社印製 烷上所述，對於MGDF衍生物存在著一種箝求，且•更特 定言之，對聚乙二酵化MGDF有所锊求》此外，也存在著對 於進行這種衍化的方法之需求。 琎明《Ε怵 於一部份中*本發明提出一種多肽，其可特定地促進巨 核细胞生長及/或發育（”Mpl配S”或”MGDFs”） ·且其 實質地不含（亦即•分離出者）其他蛋白質（如·於得自 哺乳動物來海的配g之情況中，哺乳動物萑白霣）。 逭種蛋'白霣可從經由天然地或用其他因子誘等下產生因子 的细胞來涯鈍化出。其亦可用重姐遺傅工程技術產生。 MpI配體更可烴由化學技術，或上述技術的姐合合成而得 Ο 本發明Mpl配fi可從哺乳動物源Μ其固有形式製得。本 發明實施例節段中述及從犬的再生不能性血漿中分離出範 例Mpl配钃。不邊•在本發明其他實豳例中也證明從人類 和豬等兩來源的再生不能性血漿中也存在著密切相Μ的 Mpl配《。值得注意者•人•豬和狗等的MP1配腰的铒別 活性都會被老》Hpl受顥的可溶形式所特定地抑制•顯示 所有埴些MpI配《(及來自其他哺乳動物·包括老鼠等來 源者）在構造和活性水平上都密切相關著。 人•豬和其他哺轧動物MpI配體預枓都可從天然來源烴 由本文詳述之程序分雛而得。參看實施例10。綜上所述， 本發明《Κ括地包含哺乳動物MpI配髖，例如得自狗，豬， ---------¾衣------ΪΓ------,,i - - t I (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） Ϊ14799 Α7 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 _Β7__五、發明説明（15 ) 人•小留*禺，羊和兔子等者。特別較佳的Mp 1配體是得 自狗，豬和人者。 此外，也從人胎腎和肝摩遘殖出編磯人頚MpI £艚的基 因並定其顚序，如後面實施例中所說明者。定出在细胞基 分析中具有活性的兩律_人類多肽序(參看實狍例4 )。 埴兩序列的長度彼此不同*但在其胺基酸順序中有一大段 是相同者。該相同的部份對紅血球生成素具同系性。該 MpI ES9在本文內也稱為巨核細胞生長和發琴因子（ MGDFs);對於MpIKB的所有一般參考資料也應用於本 文所稱的HGDP·且反之亦然。” MGDF多肽”一飼的意思為具 有可特定地剌激或抑制巨核细胞生長及/或發育的活性之 多肽•本文要掲示逭種多肽的範例。 本發明MpI配體烴發琨在巨核细胞品糸中具特定活性* 可增大巨核细胞的成热作用及/或增殖•如後面的實施例 2和4分析中所顯示者。”特定地"一餺意為相對於許多其 他细胞類型而言•該多肽對巨核细胞顧示出相對較大程度 的生物活性。對於巨核佃胞具有剌激性者·預期可纆由對 巨核细胞的成热化和分化等之利激而具有在活體内剌激血 小板產生之活性。 兩種得自犬源的較佳MpI配髑具有烴十二烷基碕酸納聚 丙烯醯胺凝膠鼋泳法（SDS-PAGE)在非堪原性條件下測得 約25 kd和31 kd的表覼分子量。於後面實施例中詳述的相 同純化程序中鈍化出兩種蛋白質。 兩種較佳的人類配膜· MGDF-1和MGDF-2·長度分別為 ------ - I -士5"- -- - - - -1 T _ ____ _ US. 、-°V. - 1 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 一 18 — 本紙張尺度適用中國國家糅準（CNS ) Μ規格（2ϋ297公釐） 414799 A7 B7 五、發明説明（16 ) 經濟部中央標準局員工消费合作社印裝 332 ;和173 _基酸，不包括21届胺基酸的擬定信號肽。道 些序列，/第三種相期分子，MGDF-3，皆示於圓11和12。 / 本發明的另一部份為從哺乳動物源，較佳者全血液，血 清或血漿分雕和純化本發明MpI配體或其片段的方法。再 生不能性血液•血淸或血漿為特別較佳的起始物。再生不 陡性血液，血清成血漿可由下述方法取得；用辐射源，例 如鈷-60 · Μ約400-800雷得（Rad)的輻射水平照射哺乳 動物使其再生不能。逭種程序係技《中已知者*如下文實 腌例1中所引文獻中所說明者。於人類的情況中·經照射 的血液\血漿或血淸可得自輻射治療，如治療癌症後的患 者。 之後•對該再生不能性血液，血淸或血漿施Μ纯化程序 。本發明所提出的纯化方法包括下列W鍵程序：外源《集 索親和靥析術和ΜρΙ受體親和雇析術〇埴些程序都可導致 得自犬再生不陡性血漿的25至31 kd兩蛋白質達到約 300-500倍的銪化。其他的標準蛋白質纯化程序也可與上 述程序一些包含在本發明方法中以進一步純化本發明的 MdI配體，如下文詳细說明的程序。 本發明的另一部份包括編碼晡乳動物MpI配體蛋白霣的 表現之多核苷酸。埴種DHA序列可能包括编碼本文所述哺 乳動物HpI配腰蛋白質表現的經離析DHA序列。彼等DNA 序列也包括在該HpI配體密磚序列兩側的5'和3'晡乳勖物 非密碼序列。彼等DNA序列可更編碣胺基端信號肤。彼等 序列可烴由已知方法製得，包括完全或部份的化學合成。 — 19™ 本紙伕尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（2!ΟΧ：297公釐） (請先閱請背面之注意事項再填寫本頁} 裝
、1T 414799 A7 __B7 五、發明説明（17 ) 該等密礓子可烴最《化以在經埋揮用來表現的宿主细胞内 進行表現[如大腸桿菌（EL. C〇m或CH0畑胞）。 此外，本發明也提出®姐DHA分子•各包括載體DNA ( vector DHA)和孀碼一哺乳動物Mpl配《的DNA序列。該 DHA分子提供Hpl配體DNA與能夠導引Mp〗配體在所遘宿 主细胞内的複製與表琨之調節性序列一起J8於搡嫌締合狀 態。本發明也提出用K表現里姐MpI配體蛋白質的纆埴種 DH A分子轉形遇的宿主细胞（如，细菌细胞•晡乳ft物细 胞•昆蟲细胸*酵母佃胞或植物细胞等）。 本發明的DNA分子和烴轉形细胞都用於另一部份中•一 捶新穎的製備重姐晡乳動物MpI配應蛋白質，或其肽片段 之方法。於該方法中•用以掮碼Mpl蛋白質或其片段的表 現之DNA序列（或如上所述之重姐DHA分子）與一能抅控 制蛋白質表現的遘當調節性或表現控制性序列霣於搡嫌鏵 合狀態而轉形所得细胞糸於可使重姐DH A進行表現的逋當 條件下進行培養。該専利申餹方法可以採用許多已知的》 胞作為蛋白質表現用之宿主细胞。本發明較缠合於產生 Mpl配體的细胞糸為乳動物细胞糸（如，CH细胞）和细 菌细胞（如•大陽桿菌）。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 {讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 用大腸桿菌生產HpI配髓時*較佳者為採用在要表現的 蛋白質N-嫱之Het和Lys殘基•因其所得表琨產物的產率 典型地較高之故。特別較佳的表現產物為全部具有165個 胺基酸的Met-Lys人類MGDF (亦即· Met*2-Lys-1 [卜163] MGDF (從成热蛋白質的第一俚胺基酸開始钃號） -20- 本紙張尺度適用中國國家標牟（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（18) 。將在细菌细胞*如大腸桿菌之内表現所得產物予以纯化 出之後，可用酵素》例如二肽酶（如•姐織蛋白酶c)等 處理而脸除掉鍵皤Met-Lys殘基。 然後•以逋當的傅统手段從宿主细胞•细胞溶裂物或培 餐基内收取表現出的Mpl配醚蛋白質。調理邊的掊餐基可 纆由相同的纯化步嫌或其修改步》·如從再生不能性血漿 中分離Mpl配體所用者予以處理（參看實雎例7 )。 於本發明另一部份中*提出重姐HpI配體蛋白質。這些 蛋白質實質地不含其他哺乳動物物質*尤其是蛋白質。本 «明MpI K«蛋白霣的其他特徵在於含有一或多種本文所 述的物理•生化學 > 蕖學或生物等活性。 本發明也有Μ由MGDF蛋白霣部份餺連接到至少一種水溶 性合物所構成的化學改霣MGDF，Μ及這棰姐合物的製備方 法及其使用。特別者*本發明包括化學改質MGDF，其中該 MGDF物種係與反應性聚乙二酵分子反應而使PEG接著到 MGDF。埴種接著可用本文討論過的聚乙二酵化反應予Μ完 成*例如•用醢基化或烷基化反應等。用PEG進行醸基化 或烷基化反K可在主要產物為一聚乙二醇化或多聚乙二酵 化之條件下進行。多聚乙二醇化通常包括將PEG接著到離 胺酸殘基的e-胺基且可另外包括在多呔的Η-播聚乙二酵 化。一聚乙二酵化較佳者包括將PEG接著在蛋白質Η-端的 ct -胺基。該一聚乙二酵化反應的產率和均一性可埋由一 種堪原性烷基化予以埔進·該種反應係將MGDF蛋白質部份 B N-端殘基的α -胺基予K選擇性地改質*賴而促成水溶 ---------裝------訂------旅 r < - . (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -21 - 本纸張尺度適用中國國家標隼（CNS ) Μ規格（210乂297公釐） 經濟部中央標準局貝工消費合作杜印製 A7 ___B7_五、發明説明（19) 性聚合物部份體選擇性接著到蛋白質的H-端。如此可得實 霣均一的聚合物/MGDF蛋白質结合g分子的製備及（若使 用聚乙二醇時）使聚乙二酵部份體直接偁合到蛋白質部份 體的聚乙二酵化MGDP蛋白質分子之製備。 本發明的另一部份提出«藥姐合物•其含有治療有效量 的纆_析之天然發生或重姐Mpl配鱧·其可用水溶性聚合 物*例如聚乙二酵予K衍化過；及轚藥可接受的載《，稀 鞸翔，或贜形魍。逭種S蕖姐合物可用於治療_其特徵為巨 核細胞及/或血小板缺乏K及活體内（in vivo>Mpl S腰 缺乏等的疾病狀態或疾病之方法中。其亦可預防性地用來 改菩預测的巨核細胞或血小板缺乏（例如•因手術而致者 )° 依此*本發明的Mpl配體可以用來治療再生不能性贫血 症•例如，增強血小板產生受損患者的血小板產生（例如 ，AIDS思者或正進行癌症化學治療的患者）》«p1 S體可 用來治療血硖疾病*例如*血小板減少症。ΗρΙ配體可用 於脅髓移植患者的輔助治療。這類患者可為人類或其他哺 乳動物。得自一物種的MpI配體也預期可用於另一物種。 所K，本發明的另一部份為一種治療用血小板缺乏所等 致的逭些和其他病理狀態之方法，其包括給患者眼用治療 有效霣的上述B第姐合物埴種治療方法可包括與MpI S 體同時或順序地姶用有效最的至少一種別的巨核»胞群落 剌激因子，组嫌介素（如EPO )，可溶性Mpl受體，造血 素，間白素*生長因子•或抗體等。 n I -1 n Ϊ - I 通 I - I I— - I - -1 L '- -(請先閱讀背面之注意事項再填寫木頁) -22- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210〆297公釐〉 經濟部中央標準局負工消費合作社印裝 414799 A7 __B7_五、發明説明（20 ) 本發明的另一部份提出抗體（多株•單株，人化•和重 姐等型）*和抗髓片段•其係對抗哺乳»物MplKffl或配 鱷片段者（亦即，對彼等具反應性者）。所Μ，本發明該 部份中的一部份包括能夠分泌瑄種抗體的细胞（如，在單 株抗體情況中的雜種® (hybridonas) ·及其製備方法與 其在診斷或治療程序中的用途等。 本發明的另一部份為B液含有Mpl配體之分析。逭種分 析可採用以軍一抗«或"三明治”（sandwich)格式特定地 辨讖MpI fi體之抗«。逭種分析可以用來判定患者是否需 要由外k給用ΜρΙ配體及/或這種患者是否可能經歷血小 板缺乏或疾病。這種分析可能包含在配套藥方式中•內含 限性和陰性的對照*抗通·及其他探準配套藥劑成份。 本發明的其他部份和檯點可從後面較佳實施例的詳细說 明而獲得Η明。 繪之篚雉明 本發明的許多特性和優點可從繪匯的閱鸞而變得明霣· 其中： 釀1所示為巨核迪胞和血小板的發育和成热化之綜K。. 麵2所示為可溶性老鼠HpI受通實質地完全抑制受照射 狗血漿（”再生不能性犬血漿”或” APK9”）誘専巨核细胞發 贲之能力。巨核细胞發育的分析述於實施例2中。 國3所示為APK9jg外滬擬集素和MpI受S兩種親和層析 術程序增強的活性（”Mp1配體”）剌激1A6.1细胞的生長 及可溶性老氟Mpl受體阻斷該生長之情形。 (請先閱讀背面之注意15項再填寫本頁) 一 2 3 — 本紙疾尺H用中國國家標準（CNS }Α4ϋ1Τ〇Χ 297公釐） 414799 A7 B7 經濟部中央標準局負工消費合作社印聚 五、發明説明（21 ) H4所示為從再生不能性犬血漿纯化25和31 kd兩形式 的犬Mpl受饅所包含的純化步驟級騭。 圓5所示為用逆相HPLC(RP-HPLC)純化Mpl配體。洗提 份21含有高度纯化的31 kd Mp】SH ;洙提份22含有31 ltd和25 fed兩種MpI S體的港合物；而洗提份2 3含有高 度純化的25 kd MpI配體。 B6所示為含有25及/或31 kd兩種Mpl Efi蛋白質的 逆相HPLC ( C4管柱）洗提份中之Mpl配Η活性的比較。 Η7所示為纆CD34-理揮遇的周圍血液细胞培養物用 ΑΡΚ9，ί(ρ1 S«和各種其他因子予Μ剌激所產生的巨核细 胞之數目。 圃8所示為經CD34-選擇遇的周園血液細胞培養物用 ΑΡΚ9 *Kpl配髏和各種其他因子予以剌激而產生的總白血 球數目。 圓9所示為經CD34-理擇過的周圃血液细胞培養物用 ΑΡΚ9，Hpl配體和各種其他因子予以剌激而產生的巨核细 胞百分比。 _10所示為未參與在Hp卜SK-誘導巨核细胞發育中的 人類IL-3。 圔11所示為cDHA和推演所得人類MGDF-1和HGDF-2的肢基 酸順序 B 12所示為cDHA和推演所得人類MGDF-3的胺基酸顢序。 画13所示為MGDF-1與得自犬源（A>和老規源（B)的 MGDFs (MpIS»)之間的比較。 -24- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（2[〇X297公釐） {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 414799 經濟部中央標準局負工消費合作.社印裝 A7 B7五、發明説明（22 ) 圈14所示為用一甲氧基-聚乙二酵的N-羥基丁二醢亞胺 基（KHS)活性酯將MGDF醢化等到聚乙二酵化產物之言豳例 Ο 圖15所示為用一甲氧基一聚乙二酵醛進行非特定性 MGDF遢原性烷基化得到多聚乙二酵化產物之例子。 圓16所示為用一甲氧基一聚乙二酵醛在N-端殘基的《-胺基進行部位待定性MG DF堪原性焼基化導致實質的單聚乙 二酵化產物之實例〇 園17所示為用MV 20kDa MePEG活化衍生均製得的 MePEG-MGDF结合物之粒度排外（SEC) HPLC分析结果； A. 用KePEG (PEG 11)的HHS賭將MGDF醯化製成的多 -MePEG-MGDF-结合物； B. 用HePEG醛（PEG 20)將MGDF烷基化製成的多 -MePEG-MGDF-结合物； C. 用MePEG醛（PEG 16)將MGDF烷基化製成的軍 -HePEG-MGDF-结合物。 圖U所示為用重姐人類HGDF處理小親後的血小板計数之 空心菱形=CH〇-衍生22-353 MGDF ;空心圓=未聚乙二酵 化的大腸桿菌22-184 MGDP (亦即，卜163 MGDF);及空 心H =聚乙二酵化的大腸桿菌22-1 84 MGDF。 園19所示為7 -HuMGDF的純化流程圔。 圃20所示為在老鼠CarbopUtU棋型中7 -HuHGDF (大 腸桿菌1-163 )對血小板計敝的影響*於第0日時*用單, 劑的CarbopUtin (1.25¾克/小鼠烴腹臟内注射 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) _ 2 5 _ 本紙張尺度適用中国國家標準（CNS ) A4規格（210乂2?7公釐） 4147Q9 A7 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 B7五、發明説明（23) Ba丨b/c小蜞。只有《形劑的姐則不加Car bop 1 at in 。於 24小時後•於研究的其餘天败内毎天用賦形劑或100 w g/kg -HuMGDF烴皮下注射jgCarboplatin-處理的勖物 。（每一姐，n = 10;於每隔一時點，將5隻動物放血）。 麵21所示為^ -HuMGDF的（大腸桿菌卜163 )對於經照 射處理過的小》所具血小板計数的影響。在第0天用500 雷得7 -輻射（緦源）單劑量照射Ba lb/c小蠹。只含賦形 爾的姐未受照射。於24小時後•在其餘的研究天數内每天 用赋形劑或100 «s/kg 7-HuMGDF經皮下注射受照射動物 (每一 = 8 ;於每隔一時點時將4隻動物放血）。 圈22所示為7 -HuMGDF的（大腊桿菌卜163 )對於烴照 射和CarboplaUn姐合處理逢的小鼠所具血小板計數之影 響。於第0天時，用500 ®得7 -輻射（雄源）照射 Ba丨b/c小鼠並給用Carboplatin (1.25¾克/小竄）於 24小時後*在其餘研究夭數中每天用賦形繭或100 w g/kg 7 -HuMGDF纆皮下注射試驗動钧（毎姐η = 8 ) »沒有 7 -HuHGDF的支撐時*大部份的動物在此研究中都不能殘 存。於對照姐中·8隻動物中有1隻殘存。於處理姐中， 8隻動物中8隻都存活。 画23所示為7 -HuMGDF的（大腸稈菌1-163 )對於恆河 獬照射誘導血小板減少症之影響。使恆河猴接受照射（ 700 cGy Co-80 )。於照射後24小時起的18連鑛天中，纆 皮下給用7-HuMGDF(n = 3)或人類血清白蛋白（n = 9)(各 為25微克/公斤/天）。用電子血球分析儀進行血球分析 ，裝 訂 〆 : ---- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁〕 —26- 本紙張尺度適用中國國家標準（CMS > A4規格（2丨0X297公釐） 4147S9 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（24 ) 。每一符《代表平均值（+/- se·)。 麵24所示為經聚乙二酵化與糖苷化的7 -HuHGDF對於纆 CarboplaUn和照射等處理過的小鼠所具血小板計數之影 響。依豳22進行的研究所述對小鼠施WCar boplat in和照 射之姐合處理。於S理後24小時開始的天數中•每天烴皮 下注射所示7 -HuMGDF製劑（50撖克/公斤/夫）。用電 子血球計敝器（Sys*ex* Baxter)於所示天進行血球計數 0 画25所示為具有大睡桿菌最遘化密碣子的重姐人類 HGDF* ΐϊ基酸1-163之合成基因序列。 窃明乏註钿論明 本發明的其他部份和優貼可由諳於此技者從思考下列詳 述本發明搡作的說明中明顯得知。 本發明所提出的新穎哺乳動物巨梭细胞生長促進•及/ 或血小板產生因子》稱為Μρ】配體者為實霣地不與其他 31種含蛋白質物質締合之均一蛋白質。較佳者•該蛋白質 中有約90!ϊ不為其他蛋白霣，特別較佳者•有約95Χ不為 其他蛋白質·且最佳者約有^98：(不為其他蛋白霣。埴些 蛋白質可經由重姐技術產生，以大量製備供治療應用所用 的纯活性Mp] Kfi。另外，這棰蛋白質可從晡乳動物再生 不能性血液•血漿或血淸，或從能分狢或表現Mpl配體的 晡乳動物细胞糸等K均勻形式取得。再者，也可纆由化學 合成得到Hpl配Μ或其活性片段。 概括而言，本發明所用"ΗρΙ配體”之意為本發明所掲示 -27 - 本紙浪尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公瘦） ---------裝-- (諸先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
*1T t線 414799 A7 Β7 經濟部中央標準局w：工消費合作社印裝 五、發明说明（25 ) 的，於下文較詳细說明的MpI配體及其活性片段和變化形 式。 得自犬源的兩種較佳MpI K體具有用十二烷碴酸納聚丙 烯釀胺凝謬霣泳（SDS-PAGB；)在非堪原條件下测定的表觀 分子躉•·約25 kd和31 kd。這兩種蛋白霣都是用後面實腌 例節段中詳述的相同純化程序予Μ钝化.。例如，兩種Mpl 配黷都結合麥芽外源凝集素並固定化MpI受艚。該25 kd 形式包含下示胺基酸序列： Aia-Pro-Pro-Aia-Xaa-Asp-Pro-Arg-Leu-Leu-Asn-Lys-Met-Leu-Arg-Asp-Ser-His-Val-Leu-His-Xaa-Arg^Leu-Xaa-Gln-Xaa-Pro- Asp-Ile-Tyr (SEQ ID NO: 1)·. 該31 .M形式包含下示胺基酸序列：. Ala-Pro-Pro-Ala-Xaa-Asp-Pro-Arg-Leu-Lou-Asn-Lys-Met-Leu-Arg-Asp-Ser-His-Val-Leu-His (SZQ ID NO: 2). SEQ ID N0S:1和2中的"Xaa”胺基酸為不能確定地得知者 •不逢預料其為半胱肢酸，躲胺酸·蘇胺酸，或（較不可 徒者）色胺酸。 從上示兩序列可K看出該31 kd K體包含至少一部份的 25 kd形式。特別者，該31 kd蛋白霣的前面21儸胺基酸 與25 kd蛋白«所含者完全相同。此證據•及特別者*兩 種蛋白質在本文所提Hp丨配體活性分析中都具有活性之事 實•可Μ推斷兩種蛋白霣在構造和活性上有非常密切的醑 -28- 本纸張尺度適用中國國家榇準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） ----------¾衣-- ,(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 414799 ΑΊ Β7五、發明説明（26 ) 明。該31 kd形式的蛋白質與該25 kd彤式在餒磚彼等蛋 白質的基因之差示C -嫌顒序，差示糖基化及/或差示接合 等方两可能有不同。 除了上述序列資料外，在最化纯化步思（用逆相HPLC) 之前•對25 kd分離帶的序列分析中測定出另一序列。該 序列經發現係在非堪原條件下而不是在堪原性條件下與 25 kd格締合，顯示其為該25 kd蛋白質被切斷成兩部份 (如•經由蛋白醐作用者）的鑌果，該兩部@係由二疏鐽 雎轚在一起的。該序列為： Thr-Gln-Lys-Glu-Gln-Thr-Lys-Ala-Gln-Asp-Val-Leu-Gly^Ala- Val-Ala-Leu (5EQ ID NO: 3) 雎然SEQ ID H0:3在25 kd蛋白霣序列中的正確位置尚 不清礎*不過，類似於其他细胞活素，例如促紅血球生成 索等者•該序列可能發生於25 fcd蛋白質中胺基酸114之 附近》必須提及者，有可能，雖則肖未證明者· SEQ ID HO: 3也發生於該31 kd蛋白霣内，也許同樣地從肢基酸 114附近起始。該序列資科在實施例7中會另外予权詳细 討論。 自從如上文概述者•犬g體的初始鈍化實驗之後，至今 已埋殖出纗碼該犬配賵的基因。其结果為巳定出如圖13A 所示的該犬配β的全長度胺基酸順序。基於分子量計蓴* 可預测該25 kd和31 kd犬Ε强為圓13Α所示全長度配髏 的C-端處理形式。另外也得到一種老鼠Μρι配Η，其具有 --------—裝------訂β------旅 Τ * - . 請先閣讀背面之注意事項再填寫本頁) -29- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 414799 at _______ B7五、發明説明（27 ) _ 13B所示之顧序。 彼等纯化配體也可K用實施例2所述人類巨核细胞分析 予K鑑定其比活性*而為至少約5.7 X 10β巨核细胞單位 /¾克。一β巨核细胞軍位的定義為導致產生與1微升 ΑΡΚ9穰準對照用實旌例2所述分析法所得一樣多的巨核细 胞之物質量》 埴種純化配體的其他持部[為其在實施例4的Ηρ卜依頼性 细胞生長分析中所得比活性至少約6.9 X 10'»胞生長單 位/奄克。”细胞生長單位”的定義為在實施例.4分析中導 致200 '1Α6, 1佃胞生長所霈配體量。 下面的表1列出根據本發明實際鈍化所得犬Mpl S體的 其他恃殊活性計算： (諳先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 表 1 MpI配體 1A6. 1分析 人類Meg分析 f霣位/毫克） ί簠枋/«京） 31 kd 6.52 X 10β 5.7 X 10β 25 kd 10.5 X 10® 14 X 10° 總括上述資料，本發明的一些範例MpI配《具有下列一 或多項生化和生物性質： (a)彼等MpI KH係從犬的再生不能性血漿分離出來的 « (b>彼等Hpl ffijB具有依12-14X十二烷疏酸納聚丙烯醢 -30- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 2们公釐） 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 414799 A7 __B7五、發明説明（28 ) 胺凝膠電泳法（SDS-PAGE)在非埋原性條件下相得之約 25 kd或31 kd的表觀分子量； (c) 彼等HpI S B包含下列胺基酸序列： 於25 kd蛋白霣的情況中· SEQ ID K0:1 ;或 於31 kd蛋白質的情況中，SEQ ID M0:2 ; (d) 彼等MpI EB另包含胺基酸序列SEQ ID N0:3 (特 別較佳者為在25 kd蛋白質内者）； (e) 彼等Mpl配髓會结合到麥穿外源凝集索； (f) 彼等Mpl KB會结合到經固定化的可溶型老》MpI 受體ί _ U)彼等Mpl配《的活性在活髏外（in vitro)會被可 溶性MpI受B所抑制；及 (h)彼等MpI配體在約8-9的pH值下會结合到険囍子交 換管柱上。 本發明較佳HpI配體的生钧活性係Μ其在實施例2的巨 核细胞生長促進分析中特定地剌激巨核细胞生長和發甭之 能力而展現的。於該分析中•在8天培養期間，MpI SB 剌激人類周圍血液CD 34*细胞（亦即•择免疫吸附所遘出.. 的CD-34畑胞）的分化。巨核细胞偽用特定的抗一血小板 抗原抗體予Μ染色鑑定並以顧微術計數者。MpI KB也剌 激因子—依頓性细胞糸*1A6.1 ，之生長。於沒有MpI配 «之情況中胞會死亡。在用Mp 1 K體培養2天後•估 算1A6 . 1细胞數。 上述MpI配體具有如上面表1所列之比活性。 ---------¾衣------’玎------^ • * ^ - (請先閣讀背面之注意事項再填寫本頁) -31- ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 414799 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（29) MP1配體瀛B被瀏定遇為再生不能性晡乳動物血液•血 ® _或血淸。不過•彼等配«的來源並不預期受限於這些 已知來源而可能包括其他的晡乳動物鼉液*從彼等所得细 胞等。 從哺乳動物源純化天然Hpl £體的程序係根據下列兩種 Μ鍵性纯化步《 : (a) 外源凝集素親和雇析術，較佳者係用麥芽凝集素； 及 0>>經固定化的MpI受體親和層析術。 此外'，可以包括其他步《Μ進一步纯化蛋白質·例如雕 子交換層析術，膠濾層析術•和逆相曆析術等。 實際上用Μ從犬再生不能性癜漿取得MpI配體的純化技 術包含下列步R(#看*實施例7): (a>外源凝槊素親和曆析術（麥芽凝集素曆析術為特別 較佳者）； (b) 可溶性MpI受體（Mp卜X)親和層析術（較佳者，使 用經固定化的老鼠Mp卜X); (c) 難子（陰雛子或陲饑子）交換層析術（較佳者•用 陰嫌子交換曆析術：特別較佳者*用Mono Q管柱）； (d) 膠》靥析術•係在解離狀況下進行的（較佳者•使 用 Suoerdex 200 + SDS);及 (e) 逆相層析術（較佳者*使用C-4管柱）。 對再生不能性血液，血淸或血漿，或其他哺乳動物Mpl KS源•例如•钿胞或姐織等來源腌Μ上面的鈍化程序即 --------A------ΐτ------Λ I I* (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) —32 — 本紙張尺度適用中國國家4準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 414799 A7 B7 一· — - — -- .—厂_ 五、發明説明（30) 可得到均一的囀乳動物Mpl配《 *包括人類配體。逭些步 驟绝不要求以特殊顧序進行，不過仍以上面所列頫序較為 逋當。培養可用來產生Mp丨配體的油胞（或組纗源）之程 序係諸於此技者所已知且可用來*例如•擴大起始物的供 姶者。 MM SIS或其一或多種肽片段也可MS由重姐技術來產 生。為了得到特別ΚρΙ配费的DHA序列，要將純化tipi配 «物予以堪原並視需要蛋白_ *如胰蛋白_予以消化。用 傅统技術分》出酵素分解片段並定其顧序。另外，如本發 明實ssT例所奉例銳明者，可將«僑鈍化蛋白霣根據可得蛋 白質的蚤直接定其序列到可能的程度•然後K類似於下述 程序中的已定顚序之胰蛋白_分解片段使用該B定顒序的 匾段。用逍傳密碥合成寡核苷酸探頭Μ預拥編碥巳定類序 的片段所具胺基酸顚序之所有可能頤序。較佳者，產生幾 種簡併性序列以作為探頭。用瑄些探頭篩遘晡乳動物基因 姐庳或其他來源而篇別出Mpl配體基因。此外，也可Κ用 取自MpI配體细胞源的aRHA製備cDHA庫，然後用探頭對其 進行篩遘Μ艦別钃《Μρΐ配體多肽的cDNA。再者，可Μ用 «當的引物KPCR技術來擴充cDMA序列。 使用逭些探頭篩選基因姐庫後，即可得到DNA糸（ clone)。為了得到全長度系•可以用根據所得DHA序列之 探頭再篩适該庫並雜交到全長度HpI SflBDHA序列。
MpI S饍的人類cDHA也可Μ纆由將全長度人類基因姐糸 分殖到表現媒體内•將其轉移感染到COS細胞中 > 用瑄些 -33- 本紙乐尺度適用ϋ國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐〉 --------丨裝，------.玎------.^ (請先閱背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印策 4147S9 at B7五、發明説明（31 ) 轉移感染COS緬胞製佾cDNA庫並烴由雜交Mp〗配體cDHA進 行_選等程序製得〇在完轚cDHA烴鑑定出後*可將該 cDNA或其鑷碼ΚρΙ配通活性片段的任何部份専到多種表現 媒通中的任何一種之内而製備成該MpI配»或其一或多種 片段之表現糸統。 經由重姐技術的埴種使用*可得到蹁碼HpI配體多肽的 較佳DNA序列。本發明也包括逭些DNA序列，其不和編磚 其他蛋白霣的DHA序列相締合（亦即*其為隔離者）·且 其煸碼具有Mol配應活性（亦即*巨核ffi胞生長及/或發 展）的ί(ρ1配髓多肽之表現。埴些DKA序列包括鑷碣整俚 Mpl ®體或其片段的序列及雑交*較佳者在Κ緊雜交狀態 下雜交到cDNA序列之序列〔#看，T. Maniatis et al.， Molecular Cloning (A Laboratory Manual)； Cold S p r i n g H a r b o r I· a b o r a t o r y ) 19 8 2) , 3 8 7 至 3 8 9 頁〕。 拥例K緊雑交條件為在62-67 TO下，於4 X SSC中嫌交 ，接著在62-67 X!下•於0.1 X SSC中洗約1小時。另外 •範例嚴緊雑交條件為在40-45 t：下•於45-5 5Χ甲醢肢， 4 X SSC中雜交。 於鬏弛雜交條件下雜交到Mpl配》的序列且《碥具有 Mpl S雅生物性質的MpI K體肽之DNA序列也編碼本發明 新穎MpI配應。這種纆鬆弛嚴緊雜交條件的例子為在 45-55 X：下，4 X SSC ，或用 30-40* 甲醢胺在 40-45 1C 下 雜交。例如，與MpI配«序列共有明顏同糸性匾域*例如 *糖基化或二硫鍵结等部位且S碼具有一或多種MpI配體 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) —34 — 本紙張尺度適用中國國家標率（CNS ) A4規格（210X297公釐） 414799 A7 經濟部中央標準局員工消費合作·杜印製 B7五、發明説明（η) 生物性質的蛋白質等之DHA序列顧然地®«Hp1配髓多肽 ，即使瑄種DHA序列不會嚴緊地雜交到該MpI配體序列亦 然。 此外•本發明也包括编碼Hpl配Η肽序列的DKA序列之 對偁基本變興髏（在物種群中自然發生的可能會或不會導 致胺基酸變化的鑣變化）•及其類似物或衍生物。類似地 ，本發明也包含编碣Mpl配體多肽但因遺傅密碭簡併性促 成密碣子使用的不同之DHA序列，或因點突變或誘導改質 拜以增進所鏞碣多肽的活性•半生期或產生等所引起的 Mp卜配體DKA序列之變異體。 理從後面實施例11所述遘殖程序而導致本文所揭示的人 類蛋白霣MGDF-1 · MGDF-2，和MGDF-3的胺基酸序列和 cDHA序列。MGDF-1為國11所示的胺基酸22-353且含有332 個胺基酸。MGDF-2和HGDF-1的截取部份·而為在_11中所 列的胺基酸22-195。所Μ * MGDF-2含有174蜃胺基酸。 MGDF-3為·12中所列的胺基酸22-289而含有268儸胺基酸 。於本發明所掲示的毎一 MGDF中*包含信號肽的分子，例 如圈11和12兩者之中的胺基酸卜21也為本發明多肽的一部 份，不過•對於要展現的巨核细胞生長和發If活性而言， 最好將其脫除掉。摘要而言》MGDF W的定義如下： MGDF-1 胺基酸 HGDF-2 胺基酸 MGDF-3 胺基酸 於本發明所提諸分析中 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 装_ 訂 22-353 圈 11 22-195 圈 11 22-2^9 MGDF-1和HGDF-2皆具活性而λ 35 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4現格（210X297公釐） 414799 A7 B7 五、發明説明（33
經濟部中央標準局員工消費合作社印装 MGDF-3則否。 所提活性败雄，假設人 in vivo )表現成實霣地非活性或較 其含有可變的C-端胺基酸。於切去C-)之後，該經處理形式的分子即持有 。從上述傾說看來，相信HGDF-1為展 理（如*用蛋白酶切》)。截取形式 MGDF-2)具有活性之事實即可支持此 用HGDF-1基因轉染遇的人類β 293 基（活Η外原）在後面霣施例4的细 活性。另一方面*在其他细胞系，如 看到該分子的活性。據信•逭種结果 夠處理MGDF-1分子*也許是烴由截取 活性的分子為經截取之形式*而321) 子。 自上述辰說來看，從MGDF-1序列（ 専致多種活性分子。在细胞活素族· (ΕΡ0)内保守住的構造特黏包括四條 胱胺酸。參看MGDF-1序列，Cys 172 旦櫬能性必要的構造之最C-纗元件。 MGDF-1截取變形體為具有胺基酸173 (伴随切斷）考 去9立至_丄?！ 一辱_晚*酸。如本發明所揭 類MGDF偽在活 低活性的前雅 端胺基酸（及 活性或《得更 現其活性可能 的 MGDF-1 (即 假說。. 细胞之烴調理 胞分析中確實 32D细胞之中 可能代表293 *使得基本上 细胞則不能處 «内（ 多肽， 信號肽 具活性 需要庳 遇培養 展現出 •則未 细胞能 促成該 理該分 鼷11)經截取後可能 如•促紅血球生成索 cc - «旋束和四届半 為埴些演化性地保守 所Κ *較佳的 至353的C-编辑取段 較佳者· HGDF-1序列 ，· ....... ............. 別較佳者•從C端除 -.一 --. 示者*信號肽的長度 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -36 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210X297公釐） 414799 A7 B7 五、發明説明（34 ) 被認為是基酸；不逄，根據HGDF-1的頹序，該信號 肽可能具有23偁胺基酸。綜上所述，本發明也特別包括對 應於本文所提但從画11或12的位置24起始之多肽。 下面所列為可能具有活性（亦即，促成巨核细胞及/或 血小板生長的能力；或對自然受體的抑制/剌激活性等） 的某些特別較佳之MGDF-1變睹： (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 於某些纯条中，不含MGDF-1序列中的胺基酸133-136 ， 因此•對應於上面所列，但不含這些胺基酸（而其C-孀胺 基酸鏞號向下減4調S)之序列也可能具有活性》 於一純糸中，在位置192具有一终止密碼子•因此在圈 11中的位置191處偽以Ala殘基取代Thi*殘所Μ ♦本 發明包括MGDF分子中，位置191偽MAla取代The*之變Β. 〇 MGDF-3係因脫除掉本文稱之為IVS-5 (間插序列-5)的 序列後所得者，Μ該序列是接合在原序列的第五外顯子内 之故。由於IVS-5的5’皤係發生在一密碼子之内》其脫除 會導致剌餘MGDF序列的移《 *其可看出是從MGDF-3的位置 160開始發生到該分子的末端為止。 —37 一 MGDF-4 胺基酸 22-172 圈η HGDF-5 胺基酸 22-177 圓11 MGDF-8 胺基酸 22-191 麵11 MGDF-7 胺基酸 22-198 圈11 HGDF-8 胺基酸 22-265 钃11 HGDF-11 胺基酸 22-184 圖11 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 414799 a7 ___B7 五、發明説明（35) 至今為止，將MGDF-3本身轉染到293细胞内並用實施例 4的细胞基分析檢驗所得S調理培養基的活性時，皆未發 現有活性。顯然地*不像HGDF-1者· 293细胞不能夠將 HGDF-3處理成活性形式。雖然如此，根據上文與HGDF-1相 Μ的截取假說，從MGDF-3截取掉C-端胺基酸也可能専致活 性。例如，將MGDF-3截取掉C-端40至102俚胺基酸即可等 致活性。較佳者，除掉50至90個胺基酸。兩種特別較佳的 MGDF-2變體為： HGDF-9 胺基酸 22-179 圓 12 HGDF-10 胺基酸 22-190 圈 12 於本文所掲示的所有ΜρΙ配體，包括上列範例MGDFs在 内，H-通可能含甲碕胺釀殘基*尤其是在彼等多肽係在畑 菌宿主畑胞内表現者之時。 。以合成手段構成本發明多呔的方法係諸於此技者所知悉 者。經由合成方法構成的HpI配臑多肽序列•藉者與Hpl 配魍多肽共有的一级*二级或三鈒樽造與構像特性•也可 能具有與彼等相同的Mpl配體生物性質。因此，其可做為 天然纆鲔化Mp丨配體多肽的生物活性或免疫學替代物K用 於治療和免疫等程序中。 呔或埔《ΜρΙ配《的DHA序列等之中的改質可由諸於此 技者用已知技術完成。ΜρΙ配體序列中的檁的改質可包括 密礓序列中所選胺基酸殘基的替換•嵌入或爾除。彼等替 換*嵌入或刪除所用突變形成技術皆為諸於此技者所热知 一 3 8 — 本纸掁尺度適用中國國家標準（CNS } Α4規格（210 X 297公釐） --,-------裝------訂------線 * ·-- (諳先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 414799 A7 B7 五、發明説明（36 經濟部中央橾準局貞工消費合作社印装 者〔參看，例如•美國專利第4,518,584號〕。最好是在 1至20胺*酸之保守性费化。較佳的肽可經由蛋白分解酵 素，或垤由直接化學合成而產生。這些種變體也包括在本 發明MpI配賵多肽和多核苷酸之意義内。 MpI配餵多呔序列的特殊突變可能包括糖基化部位（如 *絲胺酸，蘇胺酸，或天冬胺_胺）之改質。在任何天冬 胺醢胺-聯结糖基化辨識部位或在分子上纆由添加0-職结 餹而改質的任何部位等所發生的胺基酸替換或.刪除可等致 糖基化的不存在或只部份糖基化。天冬胺醢胺一脚结的糖 基化辨ΪΚ部位包括被遘當的細胞糖基化酵素所特定地辨識 之三肽序列。疽些三呔序列可為Asn-Xaa-Thr或 As「-Xaa-Ser ，其中Xaa可為Pro Μ外的任何其他胺基酸 。在耱基化辨識部位的第一或第三或兩者的胺基酸位置發 生的多種胺基酸替換或_除（及/或在第二位置的胺基酸 脚除）會導致該經改質三肽序列的非糖基化。彼等變質核 苷酸序列的表現會產生在該等位置未發生糖基化之變體。 其他的MGDF顏似物/衍牛物 MI3DF序列UpI S體）的其他類似物和衍生物，其可保. 留全部或部份的MGDIMMpI配體）活性者•也可以由諳於 此技者從本發明揭示而製備成。彼等改質也包括在本發明 之内。 更特別者，本發明也概括地包括化學改質MGDF姐成物及 製備和使用彼等之方法。本揭示顯露出可以改質MGDF並增 進其性質。 -39- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） - - I I - — ---- _ I I -I - ) _ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) --5 i線 414799 經濟部中央樣準局員工消費合作社印製 A7 B7五 '發明説明（37 ) 於一部份中，本發明係有翡MGDF產物·其係由MGDF蛋白 質明结到至少一種水溶性聚合物部份贈所構成者。 於另一部份中*本發明係有鼷MGDF產物·其中該MGDF蛋 白質係明结到至少一悝聚乙二酵分子。 於另一部份中•本發明偽有鷗經由醸基或烷基鍵结接著 到至少一俚聚乙二酵分子的HGDF分子。 MGDF的聚乙二酵化可用技藉中已知的任何聚乙二酵化反 K 進行。參看•例如："Focus on Growth Factors 3(2) :4-10 (1992) EP 0 154 316; EP 0 401 384 ;及本文所 引與聚k二酵化相翡的其他文獻。較佳者·該聚乙二酵化 偽用反應性聚乙二醇分子（或類似的反應性水溶性聚合物 )經由醣基化反應或烷基化反應進行的。至此於下文要更 詳细>地討論聚乙二酵衍化的瑄些較佳手段。 烴由醯基化的聚乙二酵化通常包括用聚乙二酵（PEG)的 活性酯衍生物與MGDF蛋白霣之反應。任何種已知的或Μ後 發規的反應性PEG分子都可用來進行MGDF的聚乙二酵化。 較佳的活化PEG _為_化到N-羥基丁二醯亞胺（"HHS”）之. PEG 。如本文所用者•”醯基化”意欲包括但不镯限於下述 類似的MGDF與水溶性聚合物，如PEG之間的鍵结：醣胺， 肢甲酸酷，胺酷等。參看Bioconjugate Chea. 5:133-140 (1994)。其反懕條件可選自聚乙二醉化技藝中 己知者或以後開發出者*不過必須楚開會使要改質的 MGDF物種抑活化之條件：如溫度，溶劑和pH等。下文要說 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) —40 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210/297公釐） 經濟部中央標隼局貞工消費合作社印製 414799 A7 ___B7_五、發明説明（38 ) 明一般用於MGDFs的聚乙二酵化之反應條件。臞14示出用 一甲氧基-PEG的KHS酯進行的範例反®。 烴由醢基化進行的聚乙二醇化通常會導致多聚乙二醇化 MGDF產物，其中«胺酸的£ -胺基係經由》基聯結基被聚 乙二酵化者。較佳者，該連接鍵结為醯胺。另外較佳者* 所得產物寅質地僅為（如*迄955!)--，二一或三一聚 乙二酵化。不« *通常會K與所用的特殊反懕條件有«之 量形成某些具有較高聚乙二醇化程度之均種（.最高達到 KGDF所含離胺基ε -胺基的最大數目加上MGDF胺基嫌的一 ficr -胺基）。必要時•可用標準鈍化技術*包括•例如 ，透析，鹽析，超濾，雕子交換層析術•隳濾層析術和霣 泳等從混合物•特別者未反應物種之中分濉出更純化的聚 乙二酵化物種。 烷基化 烴由烷基化的聚乙二醇化通常包括用PEG的末端醛衍生 物與蛋白質，如MGDF，在堪原劑存在中反應。如上文討論 的釀基化一般，要在下文說明其反應條件。 烴由烷基化的聚乙二酵化也可能導致多一聚乙二醇化 MGDF。_ 15示出MGDF的範例堪原性烷基化反應*其產生多 聚乙二酵化產物。此外•可Μ経由搡縱本文所述反應條件 Μ使聚乙二酵化有利於實質地只發生於MGDF物種Ν-端的α -胺基（亦即|單—聚乙二酵化物種）。圚16示出MGDF的 一個簕例埋原性烷基化反應，其產生單一聚乙二醇化產物 。於單一聚乙二酵化或多一聚乙二醇化任一情況中，該 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 一 41 _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4現格（210_Χ297公釐） 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 414799 A7 B7五、發明説明（39 ) PEG基最好是經由-CH2-N Η-基接著到蛋白質上。特別指 -CH2-基時*這類鐽结在本文中稱之為”烷基"鍵结。 經由堪原性烷基化K產生單_聚乙二醇化產物之衍化反 應係利用MGDF中可供衍化的不同類型一鈒胺基所具差別反 應性（離胺酸相對於N-端）。該反懕係在可利用離胺酸殘 基的e -胺基與蛋白質端殘基的ct -胺基之間的pKa差 異之pH值下進行的（參看下文）。經由瑄種理擇性衍化* 即可控制具反應性基，如醛基的水溶性聚合物對蛋白質之 接著：與該聚合物的接合主要偽在蛋白質的N-端進行而對 其他反k性基，如離胺酸的側鍵胺基 > 則未發生明顧的改 質。於一重要部份中·本發明提出一聚合物/MGDF蛋白質 接合分子（意即MGDF蛋白霣上賁質地只在單一位置（如· 盆95X )接著一聚合物分子）之實質均一製備。更特定言 之*若使用聚乙二酵時•本發明也提出一種聚乙二酵化 «GDF蛋白質，其不具可能的抗原性脚结劑，且其係K聚乙 二酵分子直接偁合到HGDF蛋白質上而形成者。 綜上所述•於一較佳部份中，本發明偽有W聚乙二酵化 MGDF，其中該PEG基係嬅由釀基或烷基而接著的。如上文 討論過者*這種產物可為——聚乙二酵化或多一聚乙二酵 化者（亦即*含有2-6倕*較佳者，2-5届PEG者）。該 PEG通常是接著到蛋白霣所含胺基酸的aSe胺基，不過 •也包括PEG接著到蛋白質所含任何胺基之上者；彼等胺 基可在逋當反應條件下具有足夠反懕性而接著到PEG基。 本發明一聚乙二醇化MGDF為一特別較佳的分子姐合。相 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 一 42 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印策 414799 A7 —B7五、發明説明（4〇 ) 對於多聚乙二醇化MGDF衍生物而言· 一聚乙二醇化衍生物 就多種理由看來都是較有利者。 一聚乙二酵化衍生物比多聚乙二醇化衍生物較容易純化 •因而通常更為均一。如上所述者· 一聚乙二酵化反懕可 Κ進行得使聚乙二酵部份體只接著到端胺基酸的α -胺 基。於MGDF所含幾俚《胺酸殘基中的任何一個，及可能的 其他部位都可能發生額外的聚乙二酵接著。所以，多聚乙 二酵化MGDF衍生物傾向於為更非均一混合物。一聚乙二酵 化衍生物的產率通常也高於多聚2*二酵化衍生物的產率。 於酺基化和烷基化兩者之中所用的聚合物分子可S自水 溶性聚合物或其混合物之中。所埋聚合物必須是水溶性者 *使其所接著的蛋白質不會在水環境•例如在生理環埦中 沉溉。所選聚合物最好必須烴過改霣Κ具有單一反應性基 •例如供醸基化的活性酸•或供烷基化的醛，使得如本發 明方法所提出者•可Κ控制聚合度。較佳的反應性PEG醛 為聚二酵丙醛•其具有水安定性I或其烷氧基或 芳氧基衍生物（參看•美Η専利第5,252,714號）〇該聚 合物可為分支成不分支者。較佳者，對於末嫱產物製薄的 治療用途而言，該聚合物須為轚藥可接受者。該水溶性聚 合物可選自下列所成姐合之中：聚乙二酵，一甲氧基_聚 乙二酵•葡聚糖，聚（Ν-乙烯基吡咯烷酮）聚乙二醇，丙 二酵均聚物•聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物*多氧乙基化 多元酵（如，丙三酵）和聚乙烯酵等。對於豳基化反應· 所埋聚合物必須具有單一反懕性酯基。而對於本發明堪原 I I I訂i 旅 '--I 一 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) —43 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央橾準局員工消費合作社印製 A7 _____B7 五、發明説明（4Ί ) 性烷基 化而 » 所 選 聚 合 物必須 具 有 單 —^. 反 想 性 薛 基 Q 通 常，該 水溶 性 聚 合 物 不 會 選自天 然 發 生 的 糖 基 殘 基 * Η 其 一般而 言， 可 用 晡 乳 動 物 重姐表 現 系 統 更 方 便 ift 製 得 之 故 。該聚 合物 可 具 任 何 分 子 量*且 可 為 分 支 或 未 分 支 者 0 可供 本發 明 所 用 的 — 特 別較佳 之 水 溶 性 聚 合 物 為 聚 乙 二 酵•締 寫為 PEG 0 如 本 發 明所用 者 * 聚 乙 二 醇 意 欲 包 括 已 被用來 衍化 其 他 蛋 白 霣 之 任何形 式 的 PEG » 例 如 1 ' (Cx-C 1 〇 ) 烷 氧 基 - 或 芳 氧基- 聚 乙 二 酵 〇 如本 發明 所 用 者 f MGDF係定義 為 包 括 本 發 明 所 述 MGDF 的 各種形 式。 例 如 全 長 度 或經截 取 者 » 糖 基 化 或 未 糖 基 化 等形式 的MGDF都 包 括 在 内 。下面 所 列 為 要 衍 化 的 較 佳 MGDF 分 子（ 於 各 例 中 » 其 纊號都 是 根 據 圓 11的 胺 基 酸 m 號 HGDF-1 胺 基 酸 22-353 國 11 HGDF -2 肢 基 酸 22-195 國 11 HGDF -4 胺 基 酸 22-172 圈 11 HGDF -11 胺 基 酸 22-184 a 11 HGDF -12 胺 基 酸 22-353 圈 11 HGDF -13 胺 基 酸 27-195 鼷 11 HGDF -14 胺 基 酸 27-172 國 11 HGDF -15 胺 基 酸 27-164 圔 11 上述 較佳 物 種 可 為 纆 糖 基化· 未 择 耱 基 化 » 或 去 糖 基 化 等者* 最好 是 未 經 耱 基 化 者。其 可 用 佃 菌 ( 如 ♦ 大 腸 桿 菌 )或醺 乳動 物 ( 如 t CHO )细胞 等 思 重 组 方 式 製 成 〇 一 44 — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） A7
414799 五、發明説明（42 ) 下面所列為本發明特別較佳的化學衍化分子小姐（於各 例中*其為有纆由醢基或烷基而接著的——或多一，如 2-4俚PEG部份體）： 聚乙二酵化MGDF-U 聚乙二酵化MGDF-4 聚乙二酵化KGDF-2。 ~般而言•化學衍化可在用K使生物活性物質與活化聚 合物分子進行反應之任何逋當條件下進行。製備聚乙二酵 化MGDF的方法《括地包含下列步》·· (a>用MGDP多肽與聚 乙二酵（钶如PEG的反瘛性酿或醛衍生物）在可使HGDF接 到一或多俚PEG基之條件下反應*及（b)取得該反懕產物 。通常•醢基化反應所用的最佳反磨條件係依僑菜根據已 知#數和所欲结果而定者。例如· PEG :蛋白質比例越大 ，則多聚乙二醇化產物的百分比越大。 製備®質均一群的一一聚合物/ MGDF蛋白質接合分子所 用之堪原性烷基化通常包括下列步驟：（a)用MGDF蛋白霣 與反應性PEG分子在堪原性烷基化條件下反«•其中所用 pH值係通合於使該HGDF蛋白質胺基端的α-胺基發生遘擇 性改霣者：及（b)取得反應產物〇 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -17 為了得到實質均一群的一-聚合物/ MGDF蛋白霣接合分 子，該堪原性烷基化反應條件為可使水溶性聚合物部份賭 選擇性地接著到MGDF N-端者。這種反應條件通常可提供 離胺酸胺基與H-端α-胺基之間的ρΚβ差異（ΡΚβ為50!1! 的胺基被質子化而另外50Χ為否之pH值）。pH值也會影響 一 45 一 本紙浪尺度適用中國國家標準（CNS) Μ規格U10X297公釐） Α7 Β7 經濟部4-央橾準局員工消費合作社印製 五、發明説明（43) 所用的聚合物/蛋白霣比例。Λ括而言，若pH愈低，則霈 要用到較大超量的聚合物/蛋白質比例（亦即，N-端α -胺基的反應性愈低*拥箱要愈多的聚合物Κ達到最逋條件 )。若pH越高*就不需要這種大的聚合物：蛋白質比例（ 亦即，可得愈多反應性基時，就需要較少的聚合物分子） 。對本發明目的而言，該pH通常你在3-9 ，較佳者3-6範 釀之内。 另一項重要的考處為聚合物的分子量。通常.，聚合物分 子最越高•可接到蛋白質的聚合物分子數目愈少。同樣地 •在最i化彼等參數之時，也必須考慮聚合物的分支。概 括而言*分子量越高（或分支越多）*則聚合物：蛋白質 比例越高。一般而言*對於本發明所涵蓋的聚乙二酵化反 應•較遘當的平均分子量為約2kDa至約lOOkDa (”約 "―字代表±lkDa)。較佳的平均分子最為約5kDa至 約50 kDa，特別較佳者為約12 kDa至約25 kDa。水溶性聚 合物對MGDF蛋白質的比例通常為1U至100U ，較佳者（ 對於多一聚乙二酵化而言）為1:1至20:1及（對於--聚 乙二酵化而言）1:1至5:1 » 使用上述條件時|堪原性烷基化可使聚合物選擇性地接 著到Η嬙具有α -胺基的任何MGDF蛋白質，且提供實質均 一的一聚合物/MGDF蛋白質接合物之製備。"一聚合物/ MGDF蛋白質接合物”一詞在此係用以指含有單一涸聚合物 分子接著到一俚MGDF蛋白質分子之姐成物◊該一聚合物/ MGDP蛋白質接合物較佳者具有一《接到Ν-端而非離胺酸所 一 46 - 本紙張尺度通用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (丨裝- /1Τ 414799 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（44 ) 具胺基側基上之聚合物分子。該製傅較佳者有大於90X的 -聚合物/MGDP蛋白質接合物•且更佳者有大於95X的一 聚合物/ MGDF蛋白質接合物*其餘可觀測到的分子為未反 應者（亦即，沒有聚合物部份體的蛋白質）。下面的實施 例提供含有至少約90S； —聚合物/蛋白質接合物•和含 10X未反«蛋白質之製備物。該一聚合物/蛋白®接合物 具有生物活性。 對於本發明堪原性烷基化而言•該埋原劑必須是在水溶 液中具安定性者且較佳者為只能夠堪原在該堪原性烷基化 初始程¥中形成的#夫（Schiff)酸。較佳的堪原劑為選 自》氩化納，氰礓氫化納，二甲烷基礓烷•三甲胺基躕烩 和吡啶磡烷等之中者。特別較佳的堪原劑為氰確氫化納。 其他反應參數》例如容劑，反應時間，溫度等|及產物 純化手段，都可根據公開的有翻用水溶性聚合物衍化蛋白 質之資料依倨案分別決定（#看本文所引文獻）。範例细 節將在下面的實施例節段中說明。 可K環擇烴由®基化及/或烷基化方法來製備聚合物/ 蛋白質接合分子，且本發明所提供的儍黏可以選擇混合物 所含一聚合物/蛋白質接合物比例。因此，必要時，可以 製備接著不同败目的聚合物分子之各種蛋白質的混合物（ 如，二一 •三一，四一，等）並與用本發明方法製成的一 聚合物/蛋白霣接合物姐合在一起*而得具有預定比例的 --聚合物/蛋白質接合物。 下面的撕作實施例濟示化學改質J1GDF之製備和經由醢基 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -47 — 本紙張尺度適用中國國家標率i CNS ) A4規格（210X297^$ ) 414799 A7 B7 經濟部中央標準局員工消背合作杜印製 五、發明説明（45 ) 化與烷基化予K聚乙二酵化的MGDF之製镨。因此•本發明 的其他部份係有»埴些製備。 概括而言*烴由姶用本發明聚合物/ MGDF可K減鑀或舒 解的病況包括上文有W MGDF分子通盤說明中提及者》不遇 •本發明揭示的聚合物/ HGDF分子比未衍化分子而言可具 有其他的活性，增加或減低的活性，或其他特性。 於本發明另一部份中*提出含有上述化學改霣MGDF分子 的B藥姐合物。這種酱藥組合物可含有本文所.載有醑未衍 化MGDF分子的任何成份。 除著後鑕研究的進行|有關治療不同病人的不同病況所 痛逋當劑悬水平之資料會陸續出琨•且一般热練工作者於 考盧接受者的抬療情況*年龄和一般《康情形等》即可確 定適當的劑最。概括而言》其劑量為0.01微克/公斤«重 (只計算蛋白質的質量•未包括化學改霣）至300撤克/ 公斤（同上）之間。較遘當的繭最通常為5微克/公斤® 重至100微克/公斤播重*特別較佳者為10微克/公斤體 重至75微克/公斤體里。 本發明也提出製傅MGDF (亦即* MpI配« )多肽或其活、 性片段之方法。本發明的一種方法包括將傾碼ΜρΙ配《多 肽的cDHA等到表現媒體中以製備成Mpl配埔表規系铳。用 該媒體轉染所選宿主细胞並予以培養。因此，本發明方法 包括培養逋當的油胞或细胞糸•其係用對於在已知調節序 列的控制下進行MpI E體多肽的表現有編碼之DHA序列轉 染遇者。該等調節序列包括放動區序列，终止區片段及導 ---------t.------ΐτ------.^ ··III· (诗先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) —4 8 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） A7 B7 訂 4799 i、發明説明（46 ) 引/控制蛋白質在《當宿主细胞内的表現之其他逋當序列 。然後從焙養基（或若係在细胞内表現時，從佃胞）Μ諳 於此技者所热知的恰當手段收取*分«和鈍化表現出來的 因子。此外*美國専利第5,272,071號中揭示的方法也預 期可用於本發明多核苷酸/多肽》 逋當的细胞或姻胞糸可為晡乳動物细胞，例如田鼠卵巢 细胞（CH0)或3Τ3細胞》逋用哺乳動物宿主细胞的選擇及 轉化•培養，擴大*篩理和產物生產與純化等.方法都是技 β中已知者。參看，例如，G e t h i n g a n d S a b r ο 〇 k , Hature 293 : 620-625 (1981);或另外，Kaufuan et al., Mol. Cell Biol·, 5 ⑺：1750-1759 (1985)或 Howl ey et al·，美B専利第4,419,446號。其他遴用的哺 乳動物细胞系為猴子C0S-1和C0S-7细胞糸，及CV-1细胞 糸。其他典型晡乳動物宿主细胞包括霣長類細胞系和轚齒 類细胞糸•包括經轉化细胞糸在内。正常二倍體錮胞，初 级姐嫌活體化（in vitro)培養所衍生的佃胞品系，K及 原植物等也都遘合所甩。候選细胞可為在埋揮基因中有基 因型地缺乏者*或可含有顧性作用選擇基因者。其他遘當 的哺乳動物细胞系包括但不限於HeLa，小鼠L胃929细胞· 衍生自瑞士 Balb-c或NIH小鼠的3T3系，BHK或HaK倉鼠 细胞糸等。 類似地可用為逋合於本發明的宿主细胞者為细菌细胞。 例如*各種大腸桿菌品糸（如·ΗΒ101 ，DH5a · DH10 · 和MC1061等）皆為生物技術領域中所热知的宿主细胞。另 -49- 本紙張尺度適用中國國家標隼ί CNS ) A4規格（2iOX297公釐） ^^1 ^iil· »^—^1 tn i^i I m ^^1· I ^^^1-*»i -»- 1 1-- I ^^^1 i — I 1 I I - I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中夬樑準局—工消費合作社印製 414799 A7 ________B7___ 五、發明説明（47 ) 外，枯草桿菌（suhtms )，辰單胞菌羼（ Pseudomonas S Ρ ρ Ί) •其他的桿菌羼（Bacillus SPP.) •鍵微菌颶（Strep t. payees s p P .)等的各種品糸也可M 用於本發明方法中。 諸於此技者所知悉的多種酵母细胞品条也可用為宿主细 胞以表現本發明的多肽。另外，於必要時，也可以用昆fi 细胞作為本發明方法中的宿主细胞。參看，例如，
Hiller et al., Genetic Engineering 277-298 ( 1986)及其中所引參考文獻。 本發明也提出重姐#子或媒體Μ用於新穎Mpl S饍多肽 的表現方法中。這些媒體含有Hpl £體DNA序列且其單獨 地或與其他序列姐合地纒碼本發明MpI配體多肽（有或筹 信號肽者）或其活性片段。另外，摻合上逑改質序列的 «也為本發明的實施例且可用於產生Mpi配體多肽。本發 明方法所用的媒體也含有烴選擇的調節序列，其與纗磚本 發明序列的DN A處於操作締合狀態且能夠在所選宿主钿胞 中導引其複製和表現。 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 有一媒S為PXM ，其特別遘合於在COS畑胞中的表現〔 Y, C. Yang et al. , Cel 1 47:3-10 (1986)〕。另一種遘 合於在晡乳動物细胞，如* CH0钿胞之中的表現之媒體為 PEMC2B1 。本發明所述哺乳動物細胞表現媒體可甩諳於此 技者所热知的技術予Μ合成。諸媒S3所含諸成份，例如， 複製子，埋擇基因，強化因子，放動匾等*都可得自天然 來源或用巳知程序合成。參看* Kaufian et al., J, 一 5 0 一 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210 X 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 414799 A7 -^一__B7__ 五、發明説明（48 )
Mol. Biol. 159 ： 51 1 -521 (1982);和〖3(^霣311,卩1*〇(：· Hatl. Acad. Sci. USA 82:689-693 (1985)。此外，媒體 DHA可包含全部或部份的牛乳頭狀瘤病毒基因姐〔Lusky et al., Cell 36:391-401 (.1984)〕且可在细胞糸，如 Cl27小鼠佃胞等之内複製成穩定的附加體元素。逭些媒體 轉染到«當的宿主细胞後可導致Mpl配體多肽的表現。 有眾多類型係技S中已知用於晡乳動物*昆篇I，酵母， 真菌和细菌等的表現者之其他逋當表現媒體也.可以用於該 目的° 本發Ϊ9方法和組合物所要治療的病況通常為包含既存的 巨核细胞/血小板缺乏或預期未來有巨核细胞/血小板缺 乏者（例如•因為已計晝的手術者）。彼等病況通常具活 13内活性Mpl fi髓缺乏（暫時性或永久性）的结果。血小 板缺乏的一般術語為血小板減少症*因此·本發明方法和 姐合物概括地可用K治療血小板減少症。 血小板減少症（血小板缺乏）可因嫌種原因而發生•包 括用各種第物進行的化學治療和其他治療•放射治療，手 術•意外事故血液損失•與其他特殊的疾病情況等。包含 血小板減少症且可根據本發明予Μ治療的代表性特殊病況 有：再生不能性貧血，自發性血小板減少症•會導致血小 板減少症的轉移性匾瘸，糸统性紅斑狼瘡，脾腫大，方康 尼氏微候群（Fa neon i Syndrome) ，維生素Β12缺乏•葉 酸缺乏，梅-黑格林畸型（May-Hegglin anonaly)， Wiskott-Aldrich徵候群•和陣發性睡眠性血紅蛋白尿症 -51 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項苒填寫本頁) •I —裝 *
-1T 414799 A7 ________B7 五、發明説明） 等。此外，對於AIDS的某些治療也會導致血小板減少症（ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ^ * AZT )。某些創傷通合症也可能從血小板數目的增加 受益。 有Μ預期的血小板缺乏，例如，因未來的手術所致，可 Μ在需要血小板之前的幾天到幾小時，先眼用本發明的 ΜρΙ Ε體。對於緊患情況，如，意外事故和大量流血•可 Μ將該MpI配體與血液或純化血小板一起給用。 本發明MpI配體也可K用來剌激巨核细胞蚁外的某些细 胞類別，只要埴種细胞係可表琨MpI受《者。與逭種表現 «ΡΓ受强的细胞相醑瞄·且其對MP1配體的剌激有反應之 病況也在本發明範圍之内。 在本發明所提活性分析中本身不具活性的MGDF分子可在 活體外或活Η內用為Mpl受體的調整爾（如，抑制_或剌 激劑）。 本發明多肽可單獮使用•或與其他细胞活性•可溶性 MpI受«•造血因子*間白素生長因子或抗《等姐合使 用於上述病況的治療之中。 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 琮上所述，本發明的另一部份為用K治療上述病況的治-療組合物。這種姐合物包含治療有效量的MpI配體多肽或 其具治療效用的片段•與翳槩可接受載劑。該載_物質可 為注射水》較佳者•補充其他常給哺乳動物施用的溶液所 用物質。典型者，MpI配Μ治療劑可用由純化蛋白質配合 一或多種生理可接受的載劑，賦形劑•或稀釋劑所構成的 姐合物形式進行給第。中性緩衝盥水或混合著血清白蛋白 — 52 — 本紙張尺度適用中國國家標準（cns > α4規格（2 ι〇χ297公釐） 414799 A7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 B7五、發明説明（5。） 的鹽水皆為代表性遘當載劑。較佳者•該產品係調配成與 逋當賦形劑（如，蔗糖）一起的冷凍乾燥物。其他標準載 劑•稀釋爾，和赋形繭等也可視需要加人〇別的代表性姐 合物有Tr is嫒衝劑* pH 8.0和乙酸嫌媛銜劑· pH 5.0，其 於各例中，可更包含山梨糖酵。 本發明姐合物可Μ非經腸地糸統性給藥。另外•本發明 姐合物可經靜脈内或皮下姶藥。以糸统性給藥時，本發明 所用治療姐合物可為無热原，非經腸地可接受.之水溶液形 式。埴種轚藥可接受的蛋白質溶液之製衡•就其pH*等滲 性，’安^性等而言•都是技藝所及者。 治療上述病況的方法中所用劑量之道決定於主治轚師* 考慮可能改變槩物作用的各種因素後決定之，彼等因素包 括•例如，病人年齡，病況•體重，性別和食物*任何感 染的嚴重性·給藥時間和其他臨床因素等。一般而言*每 日劑畺要在0.卜1000微克MpI配髓蛋白霣或其片段/公斤 體重。 本發明治療方法*姐合物和多肽等也可以用來*單獮地 或與其他細胞活素，可溶性Mp丨受體，造血因子，間白素 ，生長因子或抗艚等S合而用於治療具有其他徴候及血小 扳缺乏等特微之病況。據預期者· Mol配體分子纆證明可 與一般造Λ性剌激覿•如IL-3或GM-CDF等組合而用K治療 某些形式的血小板減少症。其他巨核妞胞剌激因子•如， eg-CSF *幹细胞因子（SCF)，白血症抑制因子（LIF) * 制瘤素M (0SM)，或其他具有巨核细胞剌激活性的分子等 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) _ 5 3 — 本纸張尺度適用中國國家標準（CMS > Α4規格（210Χ297公釐） 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 414799 A7 B7五、發明説明（51 ) 也可以與HpI配埋一起使用°可用於這種共同施藥的其他 代表性《胞活素或造血因子包括Π -1 α，IL -1/3，IL - 2 * IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-11 ·群落剌激因子-1 (CSF-1)，CM-CSF，粒吠緬胞群落剌激因子（G-CSF)， EPO，干援索- a ( IFH- α ) ，IFH-冷，或 IFH-7 等。另 外，可以同時地或依次地腌用有效量的可溶性W乳動物 MpI受腰，其似乎具有使到逹成热形式的巨核细胞斷片成 血小板之效應。依此，施用Mpl S體（K增進成熟巨梭细 胞的数目），接著施用可溶性HpI受體（將配體抑活化並 使成热巨核细胞產生血小板）預期可為特別有效的剌激血 小板產生之手段。上述劑量可經調整以補償治療姐合物中 的這種附加成份。被治療病人的進展可用傅统方法來監测 0 埴些新潁多肽的其他用途在於開發用標準方法產生的抗 賵。例如，包括可與本發明MpI配體反應的抗«I及彼等抗 Η的反應性片段。彼等抗腰可為多株，單株，重姐，嵌合 型，單鍵及/或雙特定性等者。彼等抗體片段可為對本發 明Μΐ>1 Κβ具有反應性的任何片段*例如，Fab’Fab’·等 。此外，本發明也提出雜交》，其偽用MpI配體或其片段 作為抗原給所選哺乳動物•接著用巳知技術將該動物的细 梅（如•脾细胞）與某些種癌佃胞融合而產生永生化的细 胞糸。本發明也包括產生這種细胞糸所用的方法及對抗本 發明人類Hpl配體多肽的金部或部份之抗賴。 該抗箱可具有抬療用途•例如抑制Mp丨配體與其受趙的 I —裝 i 訂 I I ^ '-j-* (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} — 54 — 本紙張尺度適用中國國家標率（CNS ) A4規格（210 _X 297公釐） 經濟部中央標準局負工消費合作社印裝 414799 A7 _ B7___五、發明説明（52) 结合等。該抗腰更可用於活艄内（in νίνο )和活體外（ in vitro )診斷用途•例如，以標示形式偵檢《液中 Mpl配體之存在。 本發明提出下面的實施例K更完整地闞釋本發明。另外， ，逭些實施例也提出本發明的較佳實施例，但除非另外指 示•否朗，逭些賁拖例並不意欲用Μ限制本發明的篛園。 下面實施例述及的許多程序所用標準方法，或《當的取代 程序*皆在廣被公認的分子生物學手冊中有所.提及，例如 * Sa^brooiT et al·, "Molecular Cloning” ，第2 版， Cold Spring Harbor Laboratory Press (1987)和 in Ausube 1 et a 1.,(編輯）"Current Protoco 1 s .i n Molecular Biology", Greene associates/Viley I n t e r s c i e n c e，N e w Y o r k (19 9 0 > 等。 實豳例1 亩牛不砝神士命雄 依下面文獻中所述，但K 45 0雷得的全身照射施加於接 受者以製備烴肝燐脂處理的犬再生不能性血漿（"APK9”） 或正常犬血漿（"HK9”）： 1. Mazur, E. and South, K. Exp. Hematol. 13:1164-1172 (1985). 2. Arriaga, M., South, K., Cohen, J.L., and Mazur, E.M. Blood 69: 486-492 (1987)., ---------裝-----P1T------戒 - - > f I - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) _ 5 5 — 本紙乐尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2l〇+X 297公釐） 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 414799 A7 B7五、發明説明（53 ) 3. Mazur, E., Basilico, D., Newton, J.L., Cohen, J.L., Charland, C., Sohl, P.A., and Narendran, A. Blood 76: 1771-1782 (1990). 實施例2 人騸曰核钿朐分圻 分析APK9和分段APR9剌激從CD34·前身细胞的人類巨核 细胞之發展。运CD34-遘過的细胞係依所述得自周鼸血液 细胞（Hoko·, M.H·· Choi, E.· Hichol, Hornkoh1, A., Arakava, T., and Hunt. P. Molecular Biology of Hae戮atopoiesis 3:15-31，1994 )並接注在 下面的培養基中：Iscove、改霣Dulbecco*s培養基（ IHDH; GIBC0 * Grand Island, ，其中補充著 IX 毅胺 路胺 P e η - S t r e p (I r v i n e S c i e n t i f i c，S a n t a A n a , C A ) M 和10X肝燐素處理遇*血小板貧乏性人類AB血漿。另外也 包含2-»庙基乙酵（10_4»()，丙嗣酸（110微克/奄升 )•艚固酵（7.8嫌克/奄升）*腺苷，鳥嘌呤*胞嘧啶 核苷*尿嘧啶核苷*胸腺嘧啶核苷· 2-去氧胞嗉啶，2-去 氧腺嗉呤·2-去氧烏嘌呤（各10微克/亳升*SUia); 人類重姐胰fi素（10微克/毫升）*人類锇傳埋蛋白（ 300微克/毫升）*大豆脂質（U，Boehringer M a η n h e i ，I n di a n a ρ ο 1 i s，IN);人類重姐鹼性纖維母细 胞生長因子（2奈克（ng) /奄克.，Genzyne, Caibridse，MA);人類重姐上皮细胞生長因子（15奈克 /奄升）》血小板（衍生）生長因子（10奈克/奄升· . -裝 訂 U ^ _ *11-(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁〕 一 5 6 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨OX297公釐） 414109 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（54 ) A g β η , I n c . , T h 〇 u s a n d 0 a k s 丨 C A)。將 C D 3 4 _ 埋擇细胞 置於2 X 10B竃升培養基，15微升最後B積，的 T e r a s a k i -型微滴板（V a n g u a r d，I n c，，H e p t u n e，H J ) 。將细胞置於37Ό * 5X C〇2/空氣的溼氣箱内，直接用 IX戊二醛固定到培養洞，並接注單株抗髓諝合物（抗 -GPIb * 抗-GPIIb， （Biodesign )和抗-GPIb (Dako, Carpinteria, CA )後一起溫育8天。用鐽铒生物素蛋白 -/9-半乳糖苷_偵檢系铳（HistoMark ，Kirl^gaard and Perry )展開免疫反應。在逆相顧微鏡下以ΙΟΟχ放大 率計數k藍色鑑別出來的巨核细胞。其结果表成平均巨核 细胞败/润土平均值檷準誤差（SEM)。於某些例子中•將 數據表成"巨核细胞單位/奄升”，其中偽將某樣品誘導 的巨核细胞發育程度相對於該實驗的陽性APK9檷準樣而歸 -化。一單位係定義成可等致與1微升APK9標準樣相同巨 核细胞數目所需物質置。若其可被5-10微克/毫升HPL-X (克溶性MpI受髓）阻斷時•其活性即被認可偽來自HPL S艚者。 APK9係已被證明在該糸统中含有可剌激人類巨核细胞發 育的因子。CD3 4選擇佃胞與1 OK NK9培育8天後，顯示可忽 略數目的藍色染色巨核畑胞，而CD 34-選擇畑胞與10X APK9溫菏8天後，顯示非常大數目的藍色染色巨核细胞。 醒2顯示出將逐增濃度的Mp卜X.加到人類巨核細胞培養 糸統時可逐增地阻斷巨核细胞發育。於Hp卜X濟度大於5 嫌克/奄升時》即完全抑制。於該實驗中*係用5X APK9 I I I 裝 訂 II 泉 - ' 」 ，t I - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -57- 本纸尺度通用中國國家梂準（CNS ) A4规格{ 2】0X297公釐） 4U799 A7 B7 夂、發明説明（55 ) 剌激CD34-埋擇细胞。其结果證明與Mp1-X (假定的Mol 配體> 交互作用的活性對於人類巨核细胞發育係必霈者， 且顯示APK9本身含有HpI配體。 另外在此也誔明對於人類巨核畑胞發育為必需的MpI配 體活性存'在於APK9中。將APK9 ( 135奄升）稀釋6-倍到 IScove培養基中*施加到Mp卜X親和管柱上。未结合物（ 流出物）綬收集並濃箱到原雅積後♦才進行分析。將结合 物洗提到10¾升的1M NaCl中，取20X集液g透析並濃箱 4-倍後•進行分析。CD3 4-遘擇细胞單獮培育在該培養基 之中時十發育成巨核油胞。與5JS Af>K9 —起培育的细胞（ 加到管柱的相同集液）則發育成48 土 8届巨核细胞/洞。 在10X未结合物中培育的畑胞不會發育成巨核细胞。在 10X洗提集液中培育的细胞發展成120±44届巨核细胞/ 洞。管柱腌加物與洙提集液兩者的活性都會被5微克/橐 升Mp1-X在該分析中實質完全地抑制。 實施例3 膊去&成人思M〇丨夸«_染到老鼠齟胞枭内 a . 老a md 1 夸鵂 將全長度老氟Mpl受髓cDNA分殖到含有衍生自Moloney 氏老鼠肉瘸病毒LTR的轉錄敢動區之表現載膀中。取5撤 克該構成物與1微克可選擇標記質Si pWLNeo (Stratasene )共一«孔洞培養到IL-3依賴性老留细胞系之中（32D · 純系 2 3 ; G「e e n b e r g e r* e t a 1 . P M S 8 0 : 2 9 31 - 2 9 3 6 (198 3))。將迪胞培養五天後，從程序中回收，再置於含 —58 一 本纸張尺度逋用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .I ί 裝. •1Τ 經濟部中夬標率局員工消費合作社印裝 414799 A7 B7 五、發明説明（56
經濟部中央標準局負工消費合作.社印製 有 800 微克/¾ 升 GeneUcin (G418, SU*a> 和 1 奈克 / 奄升老鼠IL-3的薄擇培養基中溫甭。接著將存活妞胞分成 2 X 10B细胞庫並培養到長出可供進一步分析的群落為止 。取六份群落用多株兔子抗肽血清以FACS分析進行Hpl受 糖表面表現檢驗》薄出一份群落用上述相同抗肽血清進行 FACS揀選。g由在10X APK9和Geneticin中生長而适擇出 母细胞糸的單烟胞炖糸。在APK9中理擇35天後•將细胞保 持在1奈充/邂升老鼠IL-3之中。用其中的一分殖糸* 1A6.1 *於該研究體中。 B . 人箱1夸鵲 將全長度人類Hpl受理序列（VUon, I. et al., PHAS 89:5640-5644 (1992))分殖到含有 Holoney 氏老鼠 肉痼病奏轉錄放動區的表現載傾内（輿老K受體相同的載 體）。取8微克該構成物和6微克的兼性營養逆轉錄酶病 毒包装構成物 (Landau, N.R., Litt^an» D.R.. J. Virology 66:5110-5113 (1992))用 CaP(K 哺乳動物轉染 配套藥9! (Stratag：ene>轉染到3 x 10β 293细胞中。於 2天後及再度於4天後對相同的细胞重轉染。於最後轉染 後的當天，將該293细胞與IL-3依賴性老鼠佃胞系（32D •滅糸 23 ί Greenberger et a 1.· PNAS 80:2931-2936 (1983))共同培養。於24小時後•在BSA梯度中分離出 32D 畑胞箝（Path-o-cyte; Miles Inc.)。將該细胞於 1奈克/毫升老鼠IL-3中擴大，然後在20X APK9中選擇生 長。用多株兔子抗肽血淸M FACS進行該佃胞的受箱细胞表 —5 9 一 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 414709 經濟部中央標隼局貝工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（57 ) 面表現之揀适。所得细胞所鼸後即用於分析中。 實施例4 1 Afi 1 丨 «9 分析 將1Α6.1细胞洙除IL-3培養物並在Terasaki-型微滴板 中於補充10X胎牛血清（FCS) ，Geneticin ( 800微克/毫 升），和 lXpen/strep (Gibco)的 otMEM (Gibco)中 K 1:1系列試樣稀釋進行再平板培養（ 1000细胞/15微升總 K稹/洞）。於48小時後•用顧微術測定每洞的活细胞数 。一活性單位的定義於分析中加入5-10微克/ ¾升Μρ1·Χ 即可完全阻醱時·即視為係來自Mpl配Η者。在ΑΡΚ9中的 Mpl配粗活性平均為4400± 539單位/毫升再生不能性血 後。除非另外指出，否則MpI配粗活性犟位係在1A6.1分 析中定義者。 用人類Μι>1受髓基因感染過的细胞進行的分析（實施例 3Β)基本上係Μ與用1Α6.1细胞者相同的方式進行。 實施例5 小篇.·抱》Hi和人镅笨枣通的苒牛笫桩桦咖醣成血清中含 右MdI -B «之Sff明 Μρ 1配體存在於小S，犬·豬和人類來源的再生不能性 血漿或血淸中（表2 )。従預照射及12天的後照射（500 雷得）後之BDF1小鼠採集血漿。M1A6.1分析檢驗該血漿 證實有2000單位/¾升的活性，其可被Mp卜X (10微克/ 奄升）實質完全地抑制。经照射小鼠的血漿也在人類巨核 佃胞分析中圼(«性*顧示出有1833單位/ «升之活性。從 I.-------—裝------訂------線 V · - * * (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) —80 — 本紙張尺度適用中國國家標率（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 414799 A 7 B7 五、發明説明（58 ) 預照射和10天後照射（ 450笛得 > 處理遇的狗採取血漿。 於1A6.1分析和人類巨核细胞分析中檢驗該血漿。兩分析 中都偵檢出活性且會被Mp1-X (10微克/奄升）芫全抑制 。從預照射及10天後照射（ 650雷得）處理過的豬收集血 漿。於1A6.1分析和人類巨核细胞分析中檢驗該血漿。於 兩分析中*都顯示出相當於犬再生不能性血漿中所發琨的 Mpl K體活性（可被10微克/毫升的Mp卜X所抑制）。取 得人類再生不能性血清。該物偽從脅«移植病人身上取得 者。將取自6悝病人的血清K1A6.1分析檢驗·顬示出 903單位/ ¾升之活性·其中有88X係來自MpI S «(可 用10微克/奄升的Mp卜X予以抑制）。此外•也用取自 14涸再生不能性病人的血清以人類巨核细胞分析檢驗之。 整體地*其顯示出實質的活性* 914巨核细胞單位/毫升 ，其可被10微克/奄升的Mp卜X予K完全抑制。另外加入 小鼠IL-3數據Μ顯示出1A6.1分析的特定性。雖然這種重 姐细胞活性可誘専該细胞糸的生長，但其不被10微克/毫 升的所阻斷。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ——裝- 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 — 61 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格< 210x297公釐） 414709 A7 B7 五、發明説明（59 ) 1A6.1畑胞分析 人類巨核畑胞分析 (霣份/豪并） (巨坊aw睢圏枋/畜»1 怯着某 + Hol-X 法着尨 +Μ〇1-Χ 正常小鼠 〇+/-〇 〇♦/-〇 0./-0 0+/-0 再生不能性小思 2000 0 1833 未苴施 正常犬 0+/-0 0+/-0 0+/"0 0+/-0 再生不能性犬 4400+/-539 0♦/-0 792+/-128 0+/-0 正常豬 0./-0 0+/-0 0+/-0 0+/-1 再生不能性豬 / 0 0 1 8 + - 8 0/1 0+/-0 0+/-0 0+/-0 0*/-0 再生不能性人 903+/-64 114+/-33 941+/-178 0♦/-0 aurIL3 6000+/-565 6000+/-565 未實施 未S施 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 S施例6
MdI g «刺潇1Α6.1 Μ睢牛苒好人箱g坊拥育
Mpl S體（於外源凝集素與親和層析術等程序後增澹至 少約100,000-倍|參看實腌例7)可剌激：^6.1曲胞糸的 生長和來自CD34-選擇過的周國血球之人類巨核细胞發展 •其係劑量相闢性方式者。画2和3顯示出來自MpI配JB 的可反應出活性，因在兩分析中，其活性皆可被Mpl-X所 -62 - 本紙張尺度適用中國國家鉍準（CNS > A4規格（210X297公楚） --------ft.------·ΐτ------^ - -- -· {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 4U799 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（60) 完全阻斷之故。 此外，本某發明人也證明FACS纯化過的周園血液CD34 + 细胞在與Mpl配髑一靼培育（於此例中為100單位/奄升 ，9天）時|會發育成基因型地正常成熟巨核细胞。此即 確定纯化Mpl配思具有與粗APK9相同的對巨核细胞之政應 。此外•本賁驗使用的是烴纯化的CD34♦细胞（100X CD34*)，而非通常只含30-503S CD34*的SCD34-理擇之 細胞。 實施例7 戈MdI ffi «夕妹化 I . » 述- 纯化出對Mpl受體顧示出配體預期的活性之蛋白霣（ 25 kd和31 kd) »從受照射犬的血漿以採用麥芽凝集素 (VGA)親和層析術< Mp〗受體親和靥析術*除離子交換層 析術•膠籌層析術•和C4逆相曆析術等的程序純化出蛋白 質。參看鼷4有»該純化程序的烷R。該25 kd和31 kd MpI £理悌經高度鈍化到表観均一性且經澍定為含有本文 所揭示的胺基酸序列者。 I . 卞浓 A.血雄的箱瀋化 將榑自被照射狗的冷凍血漿（纽共20升）（參看實梅例 1 )在4 t：解凍隔夜；較大瓶子的解凍係在室溫起始數小 時後•才放在冷房内。K11,0 00 5t g雛心6小時脫除不溶 物。用含有0.0U疊氮化钠的磷酸蘧級衡鹽水，PH 7.3 ( (請先鬩讀背面之注意事項再填寫本頁) —裝 訂 本紙張尺度適用申國國家標導（CNS) A4規格（210X297公釐） 414799 A7 _ B7_ 五、發明説明 PBS /曩氮鹽）稀釋該血漿並以1.2微米濾器遇濾。該涅 濟化程序典型地導致起始物約2-倍的稀釋。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) B . 赛珐溉隼表银筘暱析a? 所有操作都在4 TC下進行。將經涅清化的血漿（分成兩 批）加到己在PBS /叠氮鹽中平衡逢的固定化麥芽凝集素 管柱（1升*10 3ί 12公分*EY實驗室）〇於加上樣S後 •用PBS / *氮鹽從管柱洗出未结合物·接著用0.5 Η HaCI/20 ·Η Tris-HCl · pH 8 洗提。然後，甩 0.35 Μ Μ-乙醢基葡耱胺（GlcHAc) ，0.5 M HaCl· 20 ·Μ Tris-HCl ，pH 8洗提出被VGA管柱结合住的Kpl配體活性》在預流 «或洗出液份中都不能偵檢出MpI S®活性。 C. MP〗-X孕Μ翅和隨析a? 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 所用的可溶性老SUpI受B (Mp卜X )你對患於該Mpl 受體的整届细胞外域滅去位置48 3的T「p (#看· VU〇n, et al·, 8 :2607-2815 (1 993))。為了使 MpI 配艚對 Mp1-X受體親和管柱的结合最逋化，將VGA洗提集液用薄 嫫超》器（10,000分子量截止值*丫>)-10*4*丨(：〇11)及依 序稀釋調轚到0.2 Η的HaCl予以濃縮。將濃縮後的VGA集. 液以0.9¾升/分的涑速施加到20奄升a-Mpl-X (老鼠 Mpl可溶性受體）/CNBr活化Sepharose管柱上（2·6 X 4.2公分，1.5奄克·~Μρ卜X /奄升樹脂 > 。用40¾升 PBS /疊»邇以1.5奄升/分洗該管柱，接著用10 ·Μ Tris-HCl，1 M NaCl· 1 ·Μ CHAPS，pH 8.0進行高鹽洗滌 (405 毫升）。然後用 20 CAPS，1 H NaCl，5 ·Μ -64 - 本紙張尺;用中國國家標準（cNS)A4規格（210x297公釐） 414799^ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7_五、發明説明（62 ) CHAPS* pH 10.5洗提該管柱。收集適當的液份。於每一 液份加人TrisW中和其pH。 受體親和管柱的洗提曲線烴SDS-PAGE和280η· 吸光度分析都顧示在卜4液份有早期蛋白霣尖蜂，而主要 的Hpl配體活性係在第5液份後洗提出者》 D. MnnD-ΟΙ»艚芊空梅鼸析窬 將幾隻Mp卜X受糖親和管柱的最高钝度洙提份合併•漘 缩並相對於20屋》11>13-11(：1，5鼸》1(：1^?3，》>118.7透»到 58.5奄升的最後體積。M280 η·吸光度估测集液的蛋白霣 濃度為0.12奄克/毫升（約7亳克總蛋白質）。將該集液 Κ0.5奄升/分麻加到已平衡在20 ·Μ Tris-HCl，5 CHAPS，pH 8,7 之中的 Hono Q HR 5/5 管柱（Pharmacia )。於27分鐘期間，用在相同嫒街液中達到0.36 M HaCl 的»形梯度洗提該管柱。然後用到0.54 M Hal的6分鏡梯 度洙該管柱，且最後以0.9 M HaCI進行一步«洗滌。K1 «升洗提液份進行收集。 Mono Q管柱的洗提分佈願示於預流液和洗滌液份中未偵 檢到Mp丨配艚•而只偵檢到可忽略的蛋白質。大部份的 Mp丨配《活性是在起始HaCl梯度階段中的洗提液份5-7中 洗提出。在洗提份8-10«察到活性”肩”*接著在洗提份 11-15出現第二届主要尖峰。 於活性洗提份中以SDS-PAGE (非還原性）観察到一明顯 的25 kd傅。該帶的強度直接對應於洗提份中的Mpl配體 活性。於洙提液份3和4中不含該帶（_活性）。於洗提 --------.枯衣------1T------it * * (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) π - _ 6 5 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 414799 A 7 B7 經濟部中央標準局貝工消費合作杜印製 五、發明説明（63 ) 份5和6中有明顯活性（1A6.1活性峰）且在洗提份 1卜14中有類似的強染色洧（1A6.1活性峰）。於洗提份 15和16的集液中有弱帶*其對懕於洗提份16中的明顧較低 活性。 E. iB B洗提啻驗 用Mono Q洗提份5和6或Mono Q洗提份13和14的莪份進 行凝膠洗提實驗。為瑝些寅驗，製儋洗提份5和6 (各6微 升）或13和14(各7.5嫌升）的集液，與305??典0£樣品« 街液（非堪原性）涓合後，加到12XSDS凝膠上。於霣泳 完華後•切出檷的轚泳道（1奄米）並用刮鬍刀將該切條 切成小片。將該切片轉移到1.5奄升激戆心管内*其内已 先裝著0.5 «升PBS/5 ·Μ CHAPS ，再於4 ΐ：下ffl和攪拌 隔夜。於第二天，稍歃旋轉彼等管後》取出液份·再將該 樣品相對於補充BSA作為載體蛋白質的Iscove氏培養基進 行透》。經透滅後的漾品即用於分析中。 其结果顯示出有兩BMpI S體活性尖峰。一尖峰對應於 凝謬的25 kd Ε ·而第二βΜρΙ配體活性尖峰則出現在 31 kd Κ 内。 F . Su&erdex 200B 濂 將Mono Q陰雛子交換管柱所得13-16洗提液份·及第二 Mono Q分鐮所得兩饀相同洗提液份等合併並用薄醭超濉器 (Centricon-10· A*icon)予以濃縮。加人 SDS 到 0.1Χ 的 最後澹度•並將該樣品注射到Superdex 200 HR 10/30 (Pharmacia)管柱上。用0.3奄升/分流速將該管柱平衡 (請先閲請背面之注意事項再填寫本頁) 袈 ,-" 線 本紙張尺度逋用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 414799 A7 B7 五、發明説明（64 ) 到50*»<卜〖3-11£：1，0.1!(505，？117.5之中，並在室溫下 搡作。收集1分鏟洗提液。其结果為樣品中的大部份蛋a 霣係在洗提份32-40中洗提出，而在洗提份42-46偵檢到 MpI配髏活性。SDS-PAGE洙提份分析期示在活性洗提份中 有明顥的25 kd帶。
G. 广4擗向HPI.C 將Superdex 200洗提份43 -46合併液或單獨的洗提份 42用薄膜超ίβ器（Microcon-10 * AeicorO予.K濟缩。將 濃縮集液分別施加到1 X 100奄米C4逆相微孔涓管柱（ SynChr〇i>ak RP-4 )上。將該管柱平衡在0.04X TFA /水 中（嫒銜液A ):鍰®液B為0.035X TFA/80X乙腈。於 注射樣品之後，於4分鐘期埔實雎到45X B的線形梯度· 接著，於40分雄期間雎Μ到75)； B的線形梯度。其滾速為 7 5微升/分。洗提份42的鲔化结果表於匾5中。在其洗提 份21-23中Κ察到明顯的KpI S»活性尖峰》用埴些洗捤 份在14X聚丙烯酿胺凝膠上·於非适原與埋原兩種條件下 分析。洗捉份21含有單一 31 kd帶；洗提份23含有一單一 霣25 kd帶；而洗提份22同時含25 kd和31 kd兩匾的帶 。未看到其他明顥的帶。要提及者，早期凝繆洗提簧驗已 錤為兩S部有MpI配體活性。於非堪原性凝膠的所有洗提 份都観察到小的高分子量帶•但在堪原性凝膠中朗未能看 到〇 H. 25 lfHft 31 kd Mi>l g « 的 H-皤席拥分析 在含有活性的C4 RP-HPLC洗提份上進行Η-端序列分析》 —67 _ 本紙張尺度通用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） n I - - n n I - I - - D 1J m I T 1^1 n ( i - n 、-a • ·ί~-· (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局負工消費合作社印裝 4147D9 A7 B7 五、發明説明（65 ) 埴些蛋白霣测出的序列都已列於前文。除了對K於25 kd 箝的主要序列（為所加樣品纽最的至少90X > •序列分析 另偵檢到兩《少量序列（其係與上面G中所述小雜質帶相 结合者）。與巳知序列比對之後顯示出該兩少霣序列的犬 Ig重鐽和k鍵。必要時，可Μ施用另一纯化步«，例如* 較佳者•另一膠滤步驟·使埴些少量雜質的量進一步«低 〇 I . 仆浼描份中HdI Κ «活神± Η·.鰣 B6數據顯示C4 RP-HPLC靥析步》所得洗提份22和23中 的活性^實質地相等的。洗提份22含有25 kd和31 kd兩 帶的混合物，而洗提份23只含有25 kd帶。取各洗提份的 液份予Μ稀釋1:45000 。稀釋後的洗提份實質地同樣可剌 激1Α6.1细胞生長（洗提份22» 5 400细胞/洞；洗提份 23，6000细胞/洞）。將稀釋後的洗提份與逐埔濃度的 Mpl-X —起溫育。該等洗提份對Μρ1-Χ的抑制作用有同等 的敏感性•兩者都含被7-1.4微克/毫升所完全阻斷。疸 種结果顬示毎一洗提份中的活性蛋白霣為具有同等生物活 性的Hpl配腥物種。 實腌例δ 14|>丨對於萁他W芊斟戸坊油胞發裔之fch» 有許多重姐因子或有機化合物•例如大戟二萜酵肉豆蔻 酸乙酸酯（PMA)等據報等會影響巨核细胞生長或發育》因 此·乃研究這些因子對於CD3 4-選擇周圍血球的影礬。於 培養物中依所示加入人類霣姐間白素3 (IL-3，l-2奈克 —68 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） --------^------ΐτ------A - · "Jr, (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 414799 A 7 B7 經濟部中央標準局負工消贤合作社印製 五、發明説明（66 ) 升> *幹细胞因子（SCF · 50奈克/毫升），間白素 β (IL-6，25奈克/毫升）·促紅血球生成素（ΕΡΟ ·1 單位/ ¾升），白血病抑制因子（LIF ，10奈克/毫升） ，和粒狀细胞一巨唼细胞群落一剌激因子（GM-CSF，25奈 克/¾升 * Awen, Inc.);間白素 11 (IL-11 ，25奈克 / 奄升，R + D 系铳，Minneapolis, HH )，大戟二 ¢5 酵肉 豆蔻酸乙酸釀（PMA ，l〇-1(>M，Sigia)等。Mpl配體的 用最為275單位/奄升· APK9的用量為5X (相當於220軍 位/橐升）。姐合試驗的因子係以俚別試驗時的相同濃度 使用。k培養8天後，將细胞直接固定在消中並染色巨核 细胞（P6洞毎狀況）或計数總细胞數目（η = 3洞每狀況 )。數據係表為平均值士 SEM 。 鼷7鼷示ΑΡΚ9和Mpl配體都可導致最大數目的巨核细胞 /洞。IL-3也等致巨核细胞發展•尤其是與SCF姐合使用 時。Π-6·Η-Π ，或ΕΡ0等，於單獨時或與IL-3姐合時 ，對巨核细胞數目都很少影響。PMA * LIF和GM-CSF都很 少影響。團8為來自相同ΐ驗的數據*顧示出每洞所得總 细胞數（”细胞率”（Cellularity)) 。ΑΡΚ9和ΜρΙ配膪對 緬胞率影響很少，而IL-3和SCF具有中等影響。SCF與 U-3姐合時具有最大影響。用圔7和3所示數據來計算每 洞的巨核细胞百分比*如圏9中所示者。顯然地，可等致 每培養洞最大巨核细胞百分比的因子為MpI配體一APK9中 的活性成份。這種结果顯示出Μρΐ Κ»對巨核细胞的特定 性。 一 6 9 _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2! 0 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· -55 五、 發明説明（「 A7 B7
霣旌例9 1 SRW的曰坊钿胞辟谁活拌與人類IL-3itM
Up 1配體在用為實腌例2所逑培養基的補充物時 人類巨核细胞的發甭。雖然IL-3不是該培養基的成 其在該培養基所含正常人類也漿中仍以不能測得之 存在。不遇，即使在其存在，IL-3亦不涉及Hpl配 等巨核细胞生成之中。此點示於圈10之中。2奈克 的IL-3在人類巨核细胞分析中可導致14,900巨.核细 /¾升之活性》此活性會被抗-IL-3 (3.3微克/奄 5 β n z y e , C a 暹 b r i d g e，Η A)抑制 9 7 V。8 2 0 3 巨核细 /奄升的MpI Kfi不會被抗-IL-3所抑制。 實施例10 箱MdI Βΐ «I夕分析 I · «谏 具有Mpl配_活性的受照射豬血漿所得蛋白質纆 和層析術* Mpl受體親和層析術*離子交換層析術 相HP LC等予Μ鑑定。該活性也烴由從SDS-聚丙烯釀 的切條洗提出來進行鑑定。 可剌激 份，但 低水平 雔一誘 / «升 胞軍位 升； 胞軍位 VGA親 和C4逆 胺凝膠 --- - ϋ ----1 - 士氏____ n ϋ τ---— υ _ ^ 0¾ 、V5 / -- J'·.* (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央棣準局員工消費合作社印製 靥析術 VGA親和管柱 MpI受《I管柱 Mono Q離子交換 註釋 施加4.4 X 10β單位 回收3.4 X 10β單位 施加2 . 7 X 1〇β單位 回收2·4 X 10β軍位 施加2.4 X 10β單位 70 本纸張尺度適用中國國家標準{ CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 414799 經濟部中央標準局員工消費合作社印装 A7 B7五、發明説明（68 ) Pfl 6,0 回收4.4 X 10β軍位 C4逆相HPLC 於洗提份23-25回收到活性 凝膠洗提實驗 明顯區別出兩活性，其一出現在 約18 kd *另一在約28 kd。 實施例11 λ镅Md W，人箱MfinF之费箱 下面《述出兩種作法： I.笛一蒱代羌抻欲箱作浓 A . 人镅MGDF推萌夕紊Φ 根據^蛋白質的胺基端序列設計許多簡併性PCR引物。 用不同的引物配對從人類基因體DKA擴大該MGDP基因。在 用有義引物5' GCH CCN CCN GCH TGTf GA 3’ （SEQ ID H0:4) ·其鑷碼犬蛋白霣的前五届胺基酸（SEQID «0:1 )及反袭引物：5’ GCA RTG YAA CAC RTG KGA RTC 3’ （SEQ ID H0:5) * 其編碼 SEQ ID K0:1 的胺基酸 16 至 21·進行40β籌大循環之後，將PCR產物於2.0Χ瓊脂糖凝 驂上於ΤΒΕ缓衝液中洗捤。 從瓊脂糖凝驂切出63 bp帶並用相同的引物姐再攘大。 將該PCR產物選殖在PCR II載體中（Invitrosen，San Diego)。埋由DMA序列分析締選出眾多純系。使用編碣類 似於犬HGDF蛋白霣的肽之質體DNA作為起源K產生用Μ曄 選cDH Α庫的放射性探頭。該基因所撝碭的胺基酸序列如下 所示： ---------¾-------訂------Λ {諳先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) -71 - 本紙張尺度適用中國囷家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 414799 A7 _B7_ 五、發明説明（69)
Ala-Pro-Pro-Ala-Cya-Asp-Leu-Arg-Val-Leu-Ser-Lys-Leu-Leu-Arg-Asp-Ser-His-VaJL-Leu-tiis (SEQ IQ NO: 6} 用含有人類MGDF的瓊脂糖帶以热PCS產生該探頭。典型 的100微升PCR反懕含有下列成份。 1— -» ^^^1 —1 .» —^^1 -ί —I— 1 ^11^1 ^^^1 US, **f·* (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 攘大反應條件如下所列： 經濟部中央標準扃員工消費合作社印製 起始加热 94t： • 2分鐘 冷卻配對 53TC • 30秒 擴展 T2V ，30秒 變性 94TC ，30秒 -72- 棋板DNA 2- 3 u 1 5 ’ 引物（SEQ ID H0：4) 1 β 1 , 20 proles 3 ’ 引物（SEQ ID H0：5) 1 u 1 , 20 P〇 1 es 10 X 緩街液 10 u 1 dATP (0.1 纖M) 2 u 1 dTTP (10 ·Η) · 2 · u 1 dGTP (10 hH) 2 u ] dCTP (0.1 iH) 2 u 1 dCTP, p32 (10 uC/u 1) 5 u 1 dATP, P32 (10 uC/u 1) 5 β 1 Taq DHA聚合梅 0. 5 u 1.： L5單β 7k 77 _
總嫌稹 100 u I 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS } A4規格（210 X 297公釐） 4U7d9 A7 B7五、發明説明（7〇) 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 在 Perkin El^er GeneAep Syste· 9600 中進行 40 個掮大循 環。 將產物通過一推進管柱（Stratagene, San Diego > 。 取1微升的探頭置於閃爍計數器内計數。於雜交混合物中 加入含有1至3百萬計數/毫升之探頭。 B . 梢IFF瘇夕繼成 人類胎肝聚A+ RNA係購自Clontech實驗室。.用約4微克 的RHA進行cDHA合成》其中偽用接著到含有3(ba I部位的 寡核苷Ϊ8之無規六箱物，5· GAT CGC GTT CTA GAN NHH ΚΚΤ 3’，（SEQ ID Ν0:7)進行引發。 使用Gibco-BRL程序來產生雙股cDNA。將Eco R I-Bst X I轉接子（Invitrogen, San Diego )連接到雙股 cDNA ·接著用限制酵素* Xba I ，消化。在S500 Sephacryl 管柱（Life Technologies, Inc·)上進行 cDNA的尺寸薄擇。將大於400 bp的cDNA達接到B用Eco ίίΐ和Xba I消化遇的晡乳動物表現載體V19.8 (Hartin, F., Cell 63:203-211 (1990))。將勝任的大腸稈菌 DH10细胞轉化並將所得cDNA庳分派成各為100,000 cDHA的 7個摩。 C. 嫌播λ窿 從Clontech購得在入gtll中的人類胎BF庠·效價為650 百萬Pfu /亳升。用PCR產生的探頭（參看上文）篩選約 2百萬倨菌斑。於561C下*在6 X SSC ，5 X Denhardt· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -73- 本紙張尺度遑用中國國家標準（CNS > Mg (―210X297公嫠} 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝
414799 A7 B7五、發明説明（71 ) 0.1X SDS，100微克/ ¾升•軍股鲑精DHA之中進行雄交 1 5小時。 進行多次篩遘。從軍一菌斑擴大DHA並用纗碼SEQ ID H0:6中胺基酸7至13的内引物5* AGT TTA CTG AGG ACT CGG AGG 3’ （SEQ ID H0:8)進行雜交Μ鑑定真正的正樣。 D . 凿的’袂涑 «士（iiACFJ 人類眙S和胎肝的聚腺苷酸化RNA偽購自Clontech。取 1 微克的 RKA 用寡5’ TTC GGC CGG ATA GGC (；TT TTT ΤΤΤ ΤΤΤ ΤΤΤ 3' (DEQ ID Η0:9)作為引物進行逆轉錄。 用 Gi“o-BRL cDNA 合成 IS 套藥繭（Life Technologies Inc., Cat. ft 18267-013)產生第一股 cDNA。最後 «積為 30教升。添加500 «Μ EDTA到10 ·ϊ(最後濃度W停止該反 應並保持在-20 。 對於初始PCR ·每反應係用0.5微升的cDHA作為棋板。 用引睡SEQ ID N0:9和競爭物寡5* TTC GGC CGG ΑΤΑ GGC CTT ΤΤΤ ΤΤΤ ΤΤΤ ΤΤ-Ρ 3，（SEQ ID Η0:10)作為反義 引物*而用纗碭SEQ ID HO :6所含胺基酸5到11的寡核苷 酸5* TGC GAC CTC CGA GTC CTC AG 3， （SEQ ID 作為有義引物。用前述程序：94t：起始培育2分鏡後•在 9代，30秒；65t：，30秒；72t!，30秒；進行40届擴大循 環。使用 Perkin Elier GeneABP Syste· 9600進行該掮大 Ο 用有義引物，«碭SEQ ID Η0 :6所含胺基酸8到14的 5' GAG TCC TCA GTA AAC TGC TTC GT 3' (SEQ ID (請先間讀背面之注意事項再填寫本頁) —7 4 一 本紙張尺度逋用中國國家橾隼i CNS ) A4規格（2!0〆297公釐〉 414709 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 A7 B7五、發明説明（72 ) HO : 12)，而用SEQ ID HO: 9和SEQ ID HD: 10作為反義引物 進行重疊。進行40届擴大循環，其中冷卻配對係在65·〇下 實腌。在0.8Χ瓊脂糖凝膠上進行該PCI{產物的分離，並在 UV光下照相。可看到在0.δ至1.2 kb附近有分*帶。 然後將PCR產物理殖到載HPCR II (Invitrosen)之中 。挑堪出俚別群落並用Qiagen配套蕖爾cat »12143和 12145分離質«。用載體引物完成«股染料引發的序列分 析。使用各種類型的GCG软®分析該序列。 E . V筘.HI物楠思 為了 ^鼸出全長度MGDF基因的序列•乃用不同的胎肝庫 姐合作為横板進行3·和5’引物伸展。對於cDMA 5’引物的 擴大，係從每一姐合各取約20奈克的cDH A作為棋板。使用 對MGDF具特定性* iSSlSEQ ID N0:6所含胺基酸12至17的 反義引物 5' GGA GTC ACG AAG CAG TTT AC 3* (SEQ ID H0:13 )與 5'載 βν19.8 有義引物 5’ CCT TTA CTT CTA GGC CTG 3· (SEQ ID Ν0:14)。進行30鋸擴大循環，其中 冷卻配對係在53t：實施。用纗碼SEQ ID Ν0:6所含胺基酸 1 至 6 的反義引物 V GAG GTC ACA AGC AGG AGG A 3’ (SEQ ID N0:15 )和載體引物SEQ ID H0:14進行30届里鑾 循環。 對於MGDF cDKAs 3'埔的引物伸展•係使用反義載體引 物 5’ GGC ATA GTC CGG GAC GTC 3· (SECl ID N0:16 > 與 對MGDF具特定性•編碼SEQ ID H0:6所含胺基酸1至6的 引物 5 · TCC TCC TGC TTG TGA CCT C 3’ （SEQ ID H0:17 - ^^^1 n ^^^1 1 n ^^^1 ϋ m l^i tn 1^1 In 1J 0¾ 、v5 (讀先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 一 7 5 _ 本紙珉尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央橾準局員工消費合作社印製 414799 Λ7 Α7 ____五 '發明説明（73 ) )。進行30届擴大循琅，其中冷卻配對係在58C實施。 用HGDF引物SEQ ID N0:12和載體引物SEQ ID N0:16進行 30β循環的重叠掮大。特定性帶出現於組合編號1 ，7和 8中，將其選殖於PCR II載體内。從單一群落鈍化所得質 體DHA再經纯化並分析出序列。 F . 令#麻人镅MfiDF妹奂夕令》 有許多起始純条缺乏MGDF胺基镅的一部份，係因使用部 份的MGDF序列進行引發和重叠之故。用依上迷5’引物伸展 實驗得到的序列一引物5’ CCA GGA AGG ATT CAG GGG A 3 ^ (SE^ ID HO :18)作為有義引物。用載體引物SEQ ID M0:16作為反義引物。進行3 5俚循環的擴大•其中冷卻配 對係在58它下進行。接著*使用對HGDF具特定性，含有 Sal I 部位的引物 5’ CAA CAA GTC GAC CGC CAG CCA GAC ACC CCG 3’ （SEQ ID H0:19)與載 Η 引物（SEQ ID K0:15 )進行35個循環的重叠。將所得PCR產物選殖於 PCR II載體中並定其序列。 I .第二《代弟件馕埔作苗 Α. 犬HGDF Η-端cDHA之费壙 根據前面節段中所述犬MGDF H-端胺基酸序列設計簡併 性寡核苷酸引物並用於聚合醐鍵型反應（PCRs)中作為引物 Μ擴大編碼MGDF的cDNA序列〇用犬腎揉品MChoazynsk丨和 Sacchi 的異硫氰酸胍法（Biochea. 162:156-159 (1987) )製備總RNA 。用《機引物-轉接子5' GGC CGG ΑΤΑ GGC CAC TCH ΝΝΗ ΗΗΤ 3’ （SEQ ID N0:20) MMoMULV逆轉 表紙張尺度逍用中國國家標準（CNS ) A4規格（210乂297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝- 、-e .'^ 經濟部中央標準局™;工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（74 ) 錄梅製偁第一股cDKA並作為棋版用於後鑛PCRs中。 PCR係在0.5微升，約50奈克的cDH A上進行，其中使用 编碼SEQ ID N0:1所含胺基酸卜6的有義股引物一引物A 5’ GCH CCH CCN GCN TGY GA 3* (SEQ ID N0:4) ·及引物 β 5' GCA RTG HAG HAC RTG NGA RTC 3' (SEQ ID H0：5) 或引物C 5’ GCA RTG YAA HAC RTG HGA RTC 3’ （SEQ ID H0:21 > ·其為編碼SEQ ID N0:1所含胺基酸16-21的反 義股引物*其在5'蟠有加上三«額外的核苷酸以增加冷卻 配對安定性。用Taq聚合酶的PCR係進行35至45隹循環* 直到在h脂耱凝謬霣泳分析上有明顯產物帶為止。對於前 面兩fiPCIi循瓖·其冷卻K對步骤係在37t；下進行2分鐘 :對於其餘的循環，係在50¾下冷卻配對1分鏡。於每次 反應中都觀察到多重產物帶。用巴斯梅氏吸管尖皤收集包 含具有大略預期尺寸（68 bp)的帶之凝膠部份並用相同的 引物配對再擴大。根據製造商的說明將DH A產物選殖到載 雎PCR II (Invitrosen)之內。定出三純系序列並發琨其 係在一讀礓內*纗碼預期的犬MGDFcDHA ，殘基卜21。於 埴種方式得到獨特的犬MGDF cDHA序列*其跨越密碼子6 的第三核苷酸到密碼子15的第三俚核苷酸。用埴些纯系之 一作為棋板以製辑經檷示的犬MGDF cDNA探頭。 B 人费眙 用人胎肝（I n t e r n a t i ο n a 1 111 s t i t u t e f 〇 r t h e Advanceaent of Hedicine，Exton, PA)经由將姐雄溶裂 於5.5 M硫氣酸胍中並MCsTFA (Pharmacia)離心純化而 -77- 本纸蒗尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1. I II ί u , t# _{請先閱t背而之注意事項再填寫本頁) A7 B7 414799 五、發明説明（75 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 分離出RNA 。用寡（dT)2B dynabeads選擇出聚腺苷酸化 RHA(Dynal·根據製造商的說明）。用該RNA Μ供cDNA合 成用的 S u p e r s c r i p t 質 IB 糸统（L i f e T e c h η ο 1 〇 g i e s， Inc.)製傅雙股cDHA·但不同處在於使用不同的聯结子轉 接子：5· TTG GTG TGC ACT TGT G 3· (SEQ ID Η0，·22)和 5， CAC AAG TGC ACA CCA ACC CC 3’ （SEQ ID Ν0:23卜 於尺寸選擇之後*將該cDH A取向地嵌到晡乳動物表現載β pBCB的Bst XI和Not I部位（pBCB偽衍生自質體Rc/CHV， InHtrogen，其含有pu<?19主鍵，CMV放動聚胨 苷酸化&位）。將埋接後的DKA電嵌入到電勝任性細菌株 10B (Life Technologies» Inc.)之中。
C. 人盼BF ρΠΗΑ鏟欲MGDP 將人胎肝库的滤器複製應於641C下與放射標示犬MGDF Η-蹯cDNA PCR產物雜交1M、時（5 X SSPE，2 X Denhardt's，0.05X 焦磷酸納，0.5X SDS· 100 微克 / 毫 升酵母tRHA溶解產物和100微克/毫升的變性鮭精DHA ) 。將濾器置於64它下* 5 X SSPE，0.5X SDS之中洗滌並靜 置隔夜。分離出雜交到該探頭的兩種不同纯系並分析之。 將從MGDF cDHA純糸所純化出的DNA轉染到293 EBNA细 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ( Iuvitrogen)内。用1.5微克的DHA與7.5微升的 ..i tTipof ectani ne ( L i f e Tec h no 1 og i e s » I nc ·)在 1 〇〇 微 升無血清DMEM中混合。在室溫下灌育20分鏟後•將該 DKA-Upofectaeine混合物加到400微升DMEM，IX血清（ —7 8 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨OX297公釐） 經濟部中央標率局員工消費合作社印製 414799 A7 _ B7_五、發明説明（76 ) Fetal Clone II)中達5 X 10s细胞/润（24洞正方形 Greiner培養板）並在37P培育6小時。將500微升的 DMEM* 20X血淸（Fetal Clone II)加到细胞上。16小時 之後，吸取出培養基並加人5 00微升的DMEM* IX血清（ Feta I Clone II) 。72小時後，收集調理過的培養基並離 心通逢0,22微米旋轉蒸發。分析該調理培養基所含MGDF生 物活性。 I .人g UnDF妹集的描诚和洼袢 根據上述邇殖程序，得到圈11 (MGDF-1和HGDF-2; SEQ ID Η 0 ： 2 4 > 25;和 26 - 27)與匾 12 ( HGDF-3 ； SEQ ID H0:28 ，29)所示的人類cDNA純系。圔中所示這些序列各 含一胺基酸1-21的推定信號序列，所K *各情況中，成热 蛋白質係從胺基酸22開始的。 用上面實梅例4A所述细胞基分析KMGDF 1-3進行活性分 析之结果列於下面的表3和4中。於表3中•用各構成物 轉染遇的293 ΕΒΗ A细胞》在2天培養後收集其調理培養基 •並在 1A6.1 细胞（32D/*ur-HPL*) +/- 10 微克 / 毫升 ur-MPL-X之上進行試驗。於表4中，用各構成物轉染遢 的293 EBHA细睢*在4天培養後，收集其調理培養基並在 32D/Bur-MPL* 佃胞（實梅例 3A)和 32D/hu-MPL* 油胞（簧 施例3B)之上試驗，可K看出，人類MGDF-1和MGDF-2對於 表現老&和人類南種形式的MpI之钿胞系都有活性，而 «0 0卩-3則無》表現人類）^1受體的细胞系對於人類 MGDF-1和MGDF-2的反應性大於表現老鼠Μι>!受體的畑胞系 -----—-------I 士¢1--- ! - I T ____I _ K ^ , --- (請先¾讀背面之注意事項再填寫本頁) -79 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 414799 A7 B7 五、發明説明（77 ) 之反應性° 經濟部中央樣準局員工消費合作社印製 表3 11/*1 (-mir-MPL-X) U/*l ί+ *ur-HPLX) 培養基 0 0 MC0 (對照霣II ) 0 0 MCDF-1 12,800 .800 MGDF-1 (重複） 12,800 566 MGDF-2 4525 400 HGDF-2 (重複） 12800 1131 MGDF-3 0 0 KGDF-3 (重複） 0 0 APK9對照 4400+/-400 0 表 4 U/>1 υ/·ι 埔為 32H/»ur-HPL+ ” η/ΐι«-ΜΡΐ， MGDF-1 1600 25,600 MGDF-2 6400 50,000 HGDF-2 (重複） 6400 50,000-100,000 下面的表5顧示出人類MGDF-1和MGDF-2對32D/hu-MPL + 细胞（實豳例3B)的活性會被可溶性人類Mpl受體（ _ 80 - 本紙張尺度適中國國家榡準（CNS ) A4規格（210X297公釐） - '裝 訂 J τ , · ' ·- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 414799 A7 B7 五、發明説明（78 ) hu-HPL-X) 所實 m 完 全 地 抑 制。Hu -MPL-X侏 存 在於 從 產 生 該蛋白質的 1 CH0 细 胞 收 集 到 的調理 培 養基內 〇 該CH0 hu-MPL-X調 丨理培 養 基 係 經 濃 路 120- 倍 後*再 加 到培 養 物 内 *滬度為6 .6X 〇 從 對 照 姐 CH0培餐 物 收集到 的 調理 掊 養 基 對分析沒有 影響 0 該 分 析 侏 依實施 例 4B所示 進 行· 不 同 處 在於係在3 天後 才 評 估 存 活 细胞。 表 5 U/奄升 ϋ/ 奄升 妹奂" (-Hu -HPL-X)_ ί + Η.ι- HPL- X) MGDF-1 530 0 MGDF-2 270 0 人镅P核拥 析 «GDF-Ι和 HQDF -2都 可 誘 導 周圍血 液 CD34- m 擇细 胞 形 成 巨核佃胞， 但 HGDF -3則 杏 〇 表6中 所 述實驗 基 本上 是 依 實 豳例2中所 述者 進·行 1 不 同 處在於 該 周園血 球 偽埋 CD34 - 遘擇遇但未 洗淨 者 且 該 培 養 物係在 7 天後收 取 者0 從 毎 種 293 EBHA HGDF 構 成 物 所 得 諝理培 養 基係以 20X最 後 體 積 +/- 30微克 /« 升 BU r - HPL- X之條 件 使用β APK9 對 照 樣 係 Μ 6X最後《I積使用。 --------1¾------1T--------線 • f ' - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本莧) 經濟部中央標準扃員工消費合作社印装 -81- 本紙乐尺度逋用t國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0乂297公釐> 414799 A7 B7 五、發明説明（79 ) 表 6 巨核细胞/洞 巨核细胞/洞 a ik f- BUT- MPL-X) i + iur-ΗΡΙ.-ΧΊ 載體對照樣 - 0 0 APK9對照樣 100 + /- 3 0 HGDF-1 142 + /- 48 17 ♦/- 2 HGDF-2 100 +/- 3 6 + / - 2 MGDF-2重禊 86 + /- 10 0 MGDF-3 2 +/- 2 0 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央樣準扃員工消費合作社印装 實施例12 下面的賁施例說明12種不同的聚乙二酵化HGDF分子* PEG9-PEG12和PEG14-PEG21 ，之合成。於各例中，被聚乙 二酵化的MGDF分子為大腸稈菌衍生的HGDF-11 (從信號肽 開始煽號時為胺基酸22-U4;從成热蛋白質開始鑛號時為 胺基酸'卜：163 )。下面的表7-10摘要出有»全部逭些聚乙 二酵化物種的细節。 12.1 用菝化HflPRG衍牛物1猫化HGDF而脚«名-ΜαΡΚΠ-MGHF梅会物 名-MiiPEfi f20lfHa)-MGDF捺会物 f PKfi 夕脚楢 將冷卻過（4 t!)的MGDF(2.5奄克/奄升）/0.1 Η BICIHE缓銜液* pH 8之溶液加到10-倍萁耳超量的固體 MePEG 丁二醻亞胺基丙酸酷（HV 20 kDa) (Shearwater Polyiers, Inc.)之中。溫和播捽以溶解該聚合物並在室 溫下纖績進行反應。 於反應JS程中的蛋白質改霣程度偽用粒度排斥（SEC) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 414799 A7 B7五、發明説明（8〇 ) HPLC 予 ME 测，其係使用 Superdex 200 HR 10/30 管柱（ Pharaacia Biotech ) > M0.1 Μ 明酸.納埋街液 pH 6.9, 流速0.7毫升/分進行的。 在30分鐘時黏進行反應混合物的SEC HPLC分析時顯示反 應混合物中未留下自由蛋白質。於該時貼·加入無菌水使 反K混合物中的蛋白質濃度減低到1毫克/毫升並用數滴 0.5 Μ乙酿將混合物的pH值調整到4 。 然後用 SP Sepharose HP (Pharnacia Biot.ech)離子交 換樹脂M離子交換層析術從過剌的MePEG和其他反應副.產 物中分'離出MePEG-MGDF接合物。 將反應混合物加到（2.5奄克/亳升樹脂）管柱上•用 3俚管柱體積的起始媛衝液A (20 bM磷酸納· pH 7.2 · 15X甘油）洗提出未反應的Me PEG 。之後，用10俚管柱體 積，0X至303!終端緩断液B (1 M NaCl/鍰街液A)的線形 梯度洗提出HePEG-MGDF接合物。於280 η·監拥洗提液。將 含有多-MePEG-HGDF接合物的洗提液合併，溻縮並_瀘遘 籌。 將該純化過的多-MePEG-MGDF接合物用TSK-GEL G4000SWXL和G2000SVXL兩串接在一起的膠濾管柱進行 SEC HPLC分析。K 280 η*的11V吸光度偵檢蛋白®。用 BI0-RAD除《棵準品作為球形蛋白質分子量標誌物。 從圔17Α可Μ看出，SEC HPLC顯露出製備物中有兩届主 要成份（的圼2比1比例），其洗提位置分別對應於 370.9 kDa和155.0 kDa球形蛋白質。亦#看下面的表8 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -83- 本纸張尺度適用中国國家標隼（CNS ) A4規格（210X297公釐5 414799 A7 B7五、發明説明（81 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 用MV = 6-50 kDa的MePEGs之丁二醯亞肢基醋進行MGDF醢 化製備成的接合物PEG 9 ，PEG 10和PEG 12也是Μ類似方 式進行。表7摘列出埴些製備所用的主要反應參数。 表8列出埴些接合物的SEC HPLC分析结果。 12.2 Β ΜρΡΙΪΠ » 皤 届 ft 榇某介 IS 檐劣-HfiPRfi- MGT)F格会物 j&-MftPRnf2Q]rt)a)-HfinF^^-«1 fPKfi ?0ΐ ，Κ 锻 於纆冷卻<4t) *»拌中的MGDF ( 2奄升* 2.5毫克 /«升）/M00羼Μ磷酸納· pH 5/20 ·Μ MaCHBH3溶液中 加入10-倍莫耳遇量的一甲氧基一聚乙二酵醛（MePEG ) (平均分子最20 kDa)並膊反應混合物置於相同溫度下繼 鑛攪拌。 於反應遇程中的蛋白質改質程度偽用SEC HPLC監澜者， 其中使用 S u p e r d e X 2 0 0 H R 1 0 / 3 0 管柱（P h a r a c i a Biotech ) · MO.1 M磷酸納嫒衡液pH 6.9, 0.7亳升/ 分搲理進行洗提。 於16小時後，SEC HPLC分析顕示有起始量90¾ Μ上的蛋 白霣被改質。此時•用無菌水稀釋反懕混合物使反應混合 物中的蛋白霣濃度成為1奄克/毫升並將其pH值調整到4 (0.5 Μ 乙酸）。 用 SP Sepharose HP (Pharmacia. Biotech)廉子交換樹 脂Μ*子交換曆析術從剌餘的MePEG和其他反應副產物中 分離出MePEG-MGDF接合物。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 經濟部中央標準局貝工消費合作社印装 414799 A7 ________B7五、發明説明（82 ) 將反應混合物施加到管柱上（2.5¾克/奄升樹胞）並 用3届管柱體積的起始級銜液A (20 磷酸納> pH 7.2， 15X甘油）洗提出未反應MePEG 。之後，用10®管柱拥稹 ♦ 0X至30X終端媛街液B (1 M HaCl /瑗街液A)的燎形梯 度洗提出HePEG-HGDF接合物。於280 nB監澜洗提液。將含 有多-HePEG-MGDF接合钧的洗提液合併，濃縮及麵菌過濾 Ο 用串接在一趦的TSK-GEL G4000SWXL和G20()0SVXL膠濾 管柱對烴纯化的多-MePEG-HGDF接合物進行SEC HPLC分析 。Μ 280 η· UV吸光度偵檢蛋白質。用BIO-RAD膠籌標準 品作為球形蛋白霣分子量檷誌物。 從圚17Β可>乂看出· SEC HPLC揭β出該製備物中有阐種 主要成份（分別佔全量的52Χ和47Χ)，其洗提位置分刖對 應於359.4 kDa和159.3 kDa球形蛋白質。亦參看表8 。 以類似方式*用MV = 6-25 kDa的HePEG醛進行MGDF的埋 原性烷基化而製備得接合钧PEG 18* PEG 19和PEG 21。表 7摘列出這些製備所用的主要反應參數。 表8列出逭些接合钧的SEC HPLC分析结果。 12.3 接著部位在Η-ίΒα -防某除的一申氬某一聚Z二醵 -MGDF捽合物少脚借 -——HrPRG (20ki)a )-HGtiF梅会物I fPRt} 1 脚儀 於烴冷卻（4 1C) ·攒拌中的HGDF (2奄升* 2.5奄克 / 毫升）/100 ·Ηβ{酸納，pH 5/20 ·Μ NaCKBH3 溶液中 加入5-倍萁耳超霣的一甲氣基一聚乙酵醛（MePEG )(平 . 11. 种衣 I 訂 . 線 广 1 -- 『" (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -85 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 414VG8 A7 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 B7五、發明説明（83) 均分子量20 kDa)並於相同溫度下繼續攪拌反®混合物。 於反懕過程中的蛋白霣改質程度偽用SEC HPLC監測者* 其中使用 Superdex 200 HR 10/30 管柱（Pharmacia Biotech ) ，Μ〇·1 Η磷酸紡煖街液pH 6.9，0.7毫升/ 分流速進行洗提。 於16小時後，SEC HPLC分析顯示有起始量90X Μ上的蛋 白質被改霣。此時，用無菌水稀釋反應潖合物使反應混合 钧中的蛋白質濃度減低到1亳克/毫升並將反應混合物的 pH值調整到4 ( 0.5 Μ乙酸）。 用 SP'Sepharose HP (Pharmacia Biotech)離子交換樹 脂以離子交換層析術從剌餘的MePEG和其他反應副產物中 分鐮出MePEG-KGDF接合物。 將反應混合物豳加到管柱上（2.5奄克/奄升樹胞）並 用3俚管柱髓積的起始緩衝液A (20 nM磷酸納，pH 7,2， 15X甘油）洗提出未反應的MePEG 。之後*用20®管柱《 積· 0X至25X的终端級衝液B (1 M HaCl /嫒衝液A>搽形 梯度洗提出HePEG-MGDF接合物。於230 nB監拥洗提液。將 含有多-MePEG-MGDF接合物的洗提液合併，濃縮及無菌遇 濾。 用4-20X預澆鑄梯度凝膠（N0VEX) Μ十二烷基磙酸納聚 丙烯醢胺凝膠電泳法澜定--MePEG-MGDF接合物之均一性 。顯示出一個對應於46,9 kDa蛋白霣位置的主要帶。 用串接在一起的TSK-GEL G4000SVXL和G2000SWXL暖滅 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) _ 8 6 — 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS > A4規格（2丨0X297公釐） 414799 A7 B7五、發明説明（84 ) 管柱對经鈍化的多-HePEG-MGDF接合物進行SEC HPLC分析 。以280 ti· iJV吸光度偵檢蛋白質。用BIO-RAD膠濾禰準 品作為球形蛋白質分子量棵誌物。 從圔17C可Μ看出，SEC H PLC揭露出該製備物中有一届 主要成份，其洗提位置對應於181.1 kDa球形蛋白質。亦 參看表9 。 以類似方式，用MV = 6-25 kDa的MePEG ®進行HGDF的逷 原性烷基化而製備得一-MePEG-MGDF接合物Ρξ〇 14» PEG 15和PEG 17»表7摘列出逭些製備所用主要反應參數。 表9 &出逭些接合物的SEC HPLC分析结果。 ------i- ------，訂------^ (請先聞讀背面之注意事項苒填寫本頁) 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 —8 7 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 29了公釐） 414799 A7 B7 五、發明説明（85 ) 表 7HGDF改質反應參數摘要 溢碾 反膊拌 MePEG_反鼷條件_類別 MW MGDF pH溫度，時間，莫耳比 cone. t： 小畤.MePEG /
(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 —8 8 — 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 4147Q8 A7 B7 五、發明説明（ 86 表8 SEC HPLC鑑定多-MePEG-HGDF特性摘要 钃碣 反應性 MePEG 表SMh 成份量，
PEG 9 HHS 6kDa 87.9 75
PEG 10 NHS 6kDa 69,2 14(shoulder) (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝-----
PEG 11 NHS 20kDa 370.9 68
PEG 12 NHS 50fcDa 865.6 53 PEG 18 醛 6 kD a 84.6 60 PEG 19 醛 12kDa 218. 59 r - I I 1 ~J - -- In — I - - 1 Ji fev PEG 20 m 20kDa 359.4 52 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 peg 2i m 25kDa 450.5 54 89 本紙張尺度遗用中國國家標準（CNS ) A4規格（210XM7公釐） 414798 A7 B7 五、發明説明（8乃 表 9 一 -MePEG-MGDF接合物的表觀分子量 纗碣 反應性 HePEG 表觀》IV by 表觀MV by SKC. kDn sns PARK.kDs »酣 UU PKfi 1 4 路 β IcDa 44.5 27.7 PKG 15 SS 1 2kDa 104.7 PKfi Iff 路 20kDa 181-1 4R.<1 PRfi 17 SS JRIrDn 9.2R . 4 _55.5_ 12.4 闬 田氬某聚 ί乙二醵 )SLJtlMGDFlB原性烷某化而教 備 二 HaPEG ί12 kDa)- MfiDF培会物 經濟部中央榇準局員工消費合作衽印裝 下述程序導致本文稱之為PEG 22的鈍化分子。 將5-倍過最的甲氧基聚乙二酵醛（HePEG ;亦即， ΟΗ(：-((：Η2)2〇-αΗ2-(：Η2〇)η-εΗ3 ;式中 n =重複數使其分子 量約為 12 kDa) (Shearwater Polymers )加到保持在5 C下的2.5毫克/ ¾升MGDF溶液（大腸桿菌衍生物， 1-163) / 100 ·Η Z·酸納，oH 5.0之中。於混合10分鏟後 •加入足量的佩砸氬化納（Aldrich )使其在反懕混合物 內霣到20 ·Η滬度》 將該混合物置於約5 t：下攪拌16小時。於該時間结束時 *加入足量的鈍化水，USP ·使MGDF澹度成為1奄克/¾ --------1¾衣------，訂--------^ . -- : (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -90- 本紙張尺度適用令國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 414799 A7 B7 經濟部中央橾準局負工消費合作社印製 五、發明説明（88) 升。將其滤過0.2微米興空譫器。Μ這種方式製得90«充 的反懕產物。於該反應產物混合物中加入少霣的1.0 Μ 價磷酸藤和IKS氧化納等溶液使其達到10 aH磷酸鹽* pH 6.8溶液。 將該接合物在陽離子交換管柱上鈍化。製備具有7.5公 分床高的40毫升SP-Sepharose高性能管柱。用平衡圾瘡液 (10 aM鳞酸鹽，pH 6.9，含15X甘油）平衡該管柱。K 0.15苷柱體積（CV) /分鏟的速率装填管柱到2.2毫克/ 毫升樹脂。接著用平衡嫒街液洗到基嫌。用10®管柱體稹 的後衝联A ( 20 ·Κ磷酸鼸，pH 7.2*含15X甘油}到猨衡 液B (縵街液A加0.3 M HaCl)嫌形梯度洗提該管柱。流 速都保持在前後皆為0.〗5 CV /分。於280 η·監拥洗提液 Ο 以SDS-PAGE凝膠分析洗提份，將含DiPEG接合物的洗提 份合併再癉遇〇.2微米單元。 實施例13 聚乙二蹢枳ΜΓ,ΠΡ分孑的牛物择桦 A. PEG-9-PEG-12和 PEG-14-PEG-21 洒量用重狙人類HGDFfg理過的小鼠之血小板計數，其结 果列於園18中。將上圏說明所示濃度的未聚乙二酵化CH0 一衍生22-353 (空心菱形），未聚乙二醇化的大腸桿菌 22-184 (空心固）和--聚乙二酵化的大腰桿菌22-184 ( 實心圓）等烴皮下注射到正常Balb/c小鼠内，每天一次， 注射5夭。本實驗所用的聚乙二酵化MGDF為PEG 16 (亦即 --------i------IT----=---J. . - ·- : (請先閲請背面之注意事項再填寫本百；) -91 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS丨A4規格（2 ί 0 X 297公釐） 經濟部中央標準局員工消资合作社印製 414799 A7 _B7_ 五、發明説明（89 ) * 20 kd的--聚乙二酵化MGDF 22-184 (圃1)，係產生 自大腸桿菌者）。於最後一次注射的24小時後，從尾部靜 赈的小供切口採集試驗血液。用Sys «ex電子血球分析儀（ Baxter Diagnostics, Inc，Irvine, CA )進行血球分析 。數據係表成4隻動钧的測定平均值"-平均值的標準俱 差。其他血球參數•例如*總白血球計數或紅血球計數等 不受埴種處理所影響。 其他形式的重姐人類MGDF亦如上述進行檢驗。下面的表 10列出用50微克/公斤/天或10撖克/公斤/天的所示形 式之7 -HuMGDF盧理«的小鼠之血小板計數。數據4隻動 物的平均值*其播準誤差K斜體表示。 表 10 5 〇»京/公/壬 1 0 »克/公斤/子 承倌 ίΗ=4) mttfg fH=4) ca/77 CHO 22-353 4343 309， 2571 80 E. coii 22-184 2021 29 1439 18 PEG 9 2728 '56 2369 34 PEG 10 2431 291 1556 126 PEG 11 3778 59 18 61 73 PEG 12 3885 156 1740 88. PEG 14 3567 80 2020 63 PEG 15 4402 57 2834 99 PEG 16 4511 239 3215 11 PEG 17 4140 188 3113 261 PEG 18 4586 59 2931 129 PEG 19 3980 -330 4189 80 PEG 20 3942 285 3054 339 PEG 21 4195 145 4002 91 基埭 939 ) 25 ~ S2- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X297公釐} --------—种衣------1τ-------^ ^ * I _ · (請先閏讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央樣準局貝工消費合作社印製 基線計数為沒有雎用任何物霣的正常動物所得值。 414739 A7 __B7 _ 五、發明説明（9D ) 寿10詳鳙 於下面所列中，被聚乙二酵化的MGDF分子為大腸桿菌衍 生的《0 0?-11(從信號肽两始纗瑪時的胺基酸22-184，或 為從成热蛋白質開始煸號的胺基酸卜163 )，如前面實腌 例12中所述者。 名稱 聚乙二酵化 PEG平均 分孑* 合成用的反«性 PRfi分芊 PEG 9 多聚己二酵化 6 kDa HePEG的 HHSfig PEG 10 多聚乙二酵化 6 kDa MePEG的 NHSSg PEG 11 多聚乙二酵化 20kDa HePEG的 NHS酯 PEG 12 多聚乙二酵化 50k D a MePEG的 HHS_ PEG 14 一-聚乙二醉化 6 kDa MePEG醛 PEG IS 一-聚乙二酵化 12kDa MePEG醛 PEG 16 一-聚乙二酵化 20kDa MePEG醛 PEG 17 --聚乙二酵化 25kDa MePEG發 PEG 18 多-聚乙二醇化 6 kDa HePSG醛 PEG 19 多-聚乙二酵化 12kDa HePEGS PEG 20 多-聚乙二酵化 20kDa MePEG醛 PEG 21 多-聚乙二醉化 25kDa MePEG醛 ™ 9 3 — 本紙珉尺度適用中國國家—準（CNS ) A4g( 210X297公釐） -In m - In κ υ f n { n ____ τ __ I _ : I : n ，νί'" - . --(諳先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 414799 A7 ___B7_ 五、發明説明（91 ) 顕然地*重姐人類MGDF的聚乙二酵化對於該分子增加接 受動物的血小板計數之能力沒有不良影響，且事實上可能 使大腸桿菌產物22-184的活性增高到輿CHO-衍生22-353分 子的活性同大或較大。 B. PKG-22 圓24列出PEG-22所得结果。值得注意者* PEG-22所得血 小板計數的正常化對全長度（：110衍生料0卩，？£0-16或 PEG-17等都«早數天即發生。 實施例14 重坩人费MGDF 「1-1 fni # t睡坦«中的夷担 要在大腸桿菌内表現7 -HuMGDF時，要將编碼成热蛋白 霣前163届胺基酸的序列用最佳的大腸桿Μ密碼子予以化 學合成。此外，在基因的5'灌加入》碼胺基酸一甲碇胺酸 和離胺基-的DNA序列。如此*該序列所纗碼的7 -HuMGDF蛋白霣長度為從Met-Lys拥始的165居胺基酸。 7-HuMGDF (1-163)基因的合成分幾個步驟完成。第一 •用最佳的大颶桿《密碼子化學合成表出基因接合片段的 互補寡核苷酸（長度δΟ-70 bp)。於該合成期間*在成熟 基因的5’皤加上甲硫胺酸和雕胺酸兩胺基酸的密碣子而在 基因的3’蟠放置一停止密碼子。此外，分別在基因的極 5’和Y嫱加上供限制酵素Xbal和Hind III用的切斷部位， 且在起始甲硫胺酸上游镰當距«處加上一合成核糖體结合 部位。第二，將各基因片段的互補寡核苷酸予K冷卻K對 。第三，用聚合酶鍵型反應擴大這些届別合成基因片段。 一 94 一 ^^尺度適用中國國家標率（CNS ) A4規格（210X297公釐} ' i衣 訂 I 線 , -. : {諳先閱讀背面之注意事項再填寫本買) 414799 A7 B7五、發明説明（92) 第四•然後將經擴大的片段分殖到適當載體内。第五，確 定分殖Η段的序列。第六，將個別片段逋接在一起並再分 殖到遘當載體内*重新構成全長度7 -HuHGDF (1-163)基 因。最後•確認重嫌成基因的序列》 在5’和3’兩端分別側接Xba I和Hind III限制部位的合 成7 -HuMGDF基因片段含有核糖髏结合部位· ATG起始密 瑪子*纗91成熟Met Lys 7 -HuMGDF蛋白質的序列•及停 止密碼子。 將上述片段選殖到乳糖誘辱性表現戧艚PAMG11的Xba I 和Hind III兩部位。該pAMGll載體為具有pR 100-衍生複製 源的低複本數質睡。表現質體pAMG 11可Μ從霣顦 PCFM1656 (ATCC # 69576 * 1994年 2 月 24日登錄）烴由 PCR重疊寡突變形成製造一糸列部位導向鐮基變化而衍生 成。從緊接到質艚複製放動MPcopB的5’之Belli部位（ 質體bp tt 180)開始且向霣體複製基因進展，其鐮對變動 如下： (請先閏讀背面之注意事項再填寫本買) 丨裝. 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印装 一 9 5 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 414799 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 A7 B7 五、發明説明（93) t>CFMl?56中的bp 改變成pAMGII中的bp # 204 T/A C/G * 428 A/T G/C * 509 G/C A/T # 617 -— 嵌入兩個G/C bp 679 G/C T/A 鲁 980 T/A C/G * 994 G/C A/T # 1004 A/T C/G # 1007 C/G T/A # 1028 A/T T/A # 1047 C/G T/A * 1178 G/C T/A * 14 66 G/C T/A # 2028 G/C bp麵除 爹 2187 C/G T/A # 2480 A/T T/A # 2499-2502 AGTG GTCA TCAC CAGT # 2642 TCCGAC-C bp »(除 AGGCTCG * 3435 G/C A/T 3446 G/C A/T * 3643 A/T T/A # 4489-4512 - ~ 嵌入 ..bps GAGCTCACTAGTGTCG^CCTGCAG CTCGAGTGATCACAGCTGGACGTC (SZQ ID NOS: 30 和31) —96 - ^^^^1 ί^ι I 1—l^^i T.^4^— —.， 1^1^1 >^pif m^i BlIi^i _ 0¾ 、-6'^- - -- -, (請先閒讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 414799 A7 B7 五、發明説明（μ) 且胖獨特的Aatll和Clal兩限制部位之間的DNA序列用下 示寡核苷酸予Μ取代：
Aatll (#4353) 5 ' CTCATAATTTTTAAAAAATTCATTTGACAAATGCTAAAATTCTT-3 * TGCAGAGTATTAAAAATTTTTTAAGTAAACTGTTTACGATTTTAAGAA- -GATTAATATTCTCAATTGTGAGCGCTCACAATTTAT 3 -CTAATTATAAGAGTTAACACTCGCGAGTGTTAAATAGC 5'
Clal (#4438) (SEQ ID NOS: 32 和 33) 邐·殖拜pAHGll内的7 -HuMGDF之表規係由具有下示序列 的合成乳糖誘導性放動B，如，Ps 4 ，所驅動者： 5' GACGTCTCATAATTTTTAAAAAATTCATTTGACAAATGCTAAA- -ATTCTTGATTAATATTCTCAATTGTGAGCGCTCACAATTTATCGAT 3'. (SEQ ID NO： 34) 該F*s4敗動匾會被大睡桿菌lac I基因的產物•乳糖阻通物 (' \ _ ( LacI)所阻通。ρ Θ \ 接著JI^pAMGII- -HuHGD^^艚轉形到含有lacl*1等位基 .因的大鵑掉—i K-12品糸中。一Tacli等位基因為lacl故動區 内的一突變•其可增加LacI的表現，旦等致Ps4啟動區的 蛋白質表現之更巖緊控制。所以，在該品糸中，於沒有乳 耱之情況中· 7-HuHGDF的表規會被LacI所II瑾。於添加 -97- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（ZlOxm公釐） --------1¾衣------tr------^ . ·- {諳先閣讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局負工消費合作社印裝 414799 A7 _B7 _五、發明説明（95) 乳糖後<LacI蛋白質對Ps4啟勡區上的操縱基因（ operator)部位之结合會滅低，因而起始從Ps4的γ -HuMGDF之轉錄。本實施树所用大腰桿菌宿主细胞係在 Ιδ^κίΐ月 30日登錄為达TCC # 69717f。r 1 用PAMG11-7 -HuMGDF質體轉形該大瞄桿菌宿主ATCC # 69717並根捶下列醱酵說明予Μ生長。將大腸桿菌品系接 種到Luria肉湯中*然後在301：下培育約12小時。接著將 該细胞無菌地轉移到装著批料培養基（20克/升酵母萃取 物；3.4克/升檸樺；15克/升K2HP〇4; 15奄升Do» P2000 ; 5 克/升葡萄糖；1 克/升 HSS04.7H20; 5.5 笔 升/升微量金覼· 5.5亳升/升的维生素）的醱酵器内。 該程序的批次相《嫌到培養物在600 ηι的光密度為5.0 土 1.0為止。然後用第一進料培養基（ 700克/升蔔萄糖； 6.75克/升MeS(U.7H2〇)起始而開始進料一批次相。於每 一確定時程中每限2小時調整進料速率。當培養物在600 η·的光密度到逹20- 25時，即拥始第二進料培養基（129 克/升胰蛋白_脒：258克/升酵母萃取物）的起始。將 第二進料培養基保持在固定流速*而第一進料培養基則要· 繼鑛諝整。於鳌届醒酵過程中的溫度都保持在約30 υ下。 該培養物於需要時•添加酸或鐮以維持在約ΡΗ 7。經由調 轚醑酵器内的攫動及空氣鎗入速率和氣氣轆入速率Μ維持 所爵的溶氧水平。當培養物在600 nn的光密度到達57-63 時，起始第三進料培養基的添加。Μ固定流速將第三進料 培養基（ 300克/升乳糖）導到醱酵器内；中斷第一進料 --------1¾衣------ίτ------攻： • - I -- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -98 - 本紙乐尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2丨0 X 297公釐） ^14799 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製
A7 __B7__五、發明説明（96 ) 培養基的添加並將第二進科掊養基的流速改成新的固定速 率。於第三進料培養基起始添加後*持續醱酵10小時β於醱 酵结束時 > 將培餐物冷卻到15 士 5 t：。«心收取细胞。將 所得佃胞期包装後，貯存在< -60 1C。 依上文所述在大腸桿菌中生產的重姐MGDF，其純化係依 下文所述進行。將1800克的细胞糊懸浮在約18升的10 ·Μ EDTA中•並M15,000 psi通遇高壓勻化器。將破裂的佃胞 懸浮液雕心並將沉著九再》浮於10升的10 iM EDTA中。離 心該想浮液並將200克的沉普九溶解在2升的10 «Μ Tris* 8 H 胍氫氯化物，10 屋M DTT ， 5 ·Μ EDTA ， pH 8.7之中。將該溶液慢慢地稀釋到20 0升的10 ·Μ CAPS* 3 Η胨，30X甘油，3 ·Μ胱胺，1 ·Η光晄胺酸，pH 10.5 之中。 在室溫下*將稀釋溶液慢慢搔拌〗6小時後•將pH值钃整 到6.8 。將已調整pH的溶液澄淸化後*加到已用10 ·Μ磷 酸納· 1.5 Μ腺，1.5 X甘油，pH 6.8平衡遇的2升CM Sepharose苷柱上。於加完後•用10 ·Μ磷酸納，15X甘 油，pH 7.2洗該管柱。然後，用0至0.5 Μ «化納梯度， 10 ·Μ磷酸納· pH 7.2洗提MGDF。 將CM洗提液瀟縮後•用10, 〇〇〇分子量截止率的薄膜與 10 _馥納，pH 6.5進行緩街液交換。對所得濃度約2 «克/奄升的澹縮溶液用姐鵰蛋白酶C在周溫下處理90分 鐮（500比1莫耳比）。 然後將該溶液加到已用10 ·Μ磷酸納· 15!(甘油· pH —99 — 本紙張尺度適用中國囷家標车（CNS ) A4规格（210.X 297公釐） (討先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) i丨裝- 訂 414709 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ____B7五、發明説明P ) 7.2平衡遇的1.2升SP高性能Sepharuse管柱上。加完後 ，用0.1至0.25 I(氣化納梯度· 10 ·Μ璘酸钠，pH 7.2洗 提出MGDF。 於SP高性能管柱的洗提液中加入硫酸銨至0.6M 。將洙 提液加到已用10 *M钃酸納，0.6 Μ庙酸銨，PH 7.2平衡 逢的1 · 6升P h e n y 1 T 〇 y 〇 p e a r 1管柱上。用0.6至0 Μ硪酸 按梯度，10 ·Μ級酸納· pH 7.2洙提出MGDF尖峰。 將該Phenyl Toyopearl洗提液濃縮並用10,Q〇〇分子量截 止薄膜進行級街液交換至10 ·Μ Tr is· 5X山梨糖酵· pH 7.5之中。 實腌例15 y -HuMGDF (士睡揑菌1 的沃腰由Φ物桦醤 用依上面實施例14所述製得的7-HuMGDF (大腸稈菌 卜163 )進行老鼠S内的生物效能評估。於五傾連鑛天內 以逐增劑量的7 -HuMGDF皮下注射到正常的雄Balb/c小鼠 賸内。所用劑Λ範圃為15微克/公斤/天到1500微克/公 斤/天。於最後注射後24小時*用霣子血球計數器（ Sysiex，Baxter)簡躉血球計數。结果觀察到嫌著畑胞活 素濃度對數地遞増•其血小板計數有線型增加。在該糸妹 中*血小板計數在1500微克/公斤/天時增加到基線值的 300X°其他血球參數，例如白血球或紅血球等的計数，或 踫球容稹等都不受此處理所影響。 從皮下注射300微克/公斤/天7-HuMGDF (大腸稈菌 卜163 )六天的老氦收取血小板並評估其對應於ADP的凝 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -100 - 本紙浪尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（21^X297公釐） 經濟部中央標準局負工消費合作社印裝 ^14799 A7 B7五、發明説明（98 ) 集能力。其數據顕示取自被處理動物的血小板與取自對照 動物的血小板實際上是不能匾別者•其中兩姐群對於血小 板激動爾，ADP |都有同等的敏感性。 此外*也評估7 -HuMGDF涝除與化學治療及/或辐射相 Μ的血小板減少症之能力。於這些研究中使用會引起人類 明顧血小板減少症的化學治療劑* carboplatin 。於研究 開始時•用1.25奄克carboplatin皮下注射Balb/c小鼠。 於2 4小時後•在研究的剌餘天数，每天用100.微克/公斤 /天7 -HuHGDF (大腸稈菌1-163 ) ·或賦形劑，注射小 鼠。到天時，賦形劑處理的小鼠之血小板計数降到正 常值的約15X ，但用7 -HuMGDF處理的小藏•則仍保留在 基埭水平（圖20)。對於照射研究，對小鼠施K 500笛得 7-韉射（緦源）之單一劑量。其為次致死劑量，可在第 11天時*等致90X血小板計数減低程度。到第21天為止》 血小板計數仍未0復到正常值。在第1天到第20天中，每 天給被照射小氟給用7 -HuMGDF (大腸桿菌卜163) ( 100 嫌克/公斤/天）時，血小板計数降低情況比用賦形劑處 理的小»較不嚴重且更快速回復到基線水平（圔21)。為 了在極端且長期血小板減少模式中試驗7-HuMGDF ·乃姐 合腌用Carboplatin和糈射（圃22)。在這種情況中，血 小板計數降低到極低水平•（正常值的3-5X) ·且大部份 的動物（7/8)在此處理中都不能存活。不遇，當研究期 間，每天以皮下注射100微克/公斤/天的7 -HuMGDF處 理這些動物時，血小板減少症有明顯地消除，更快速地回 —裝 I 訂 線 - ·- - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -101 - 本紙張尺度適用中國國家榇準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作.社印装 414799 A7 B7五、發明説明（99 ) 復到基線計數*且所有經7 -HuHGDF-處理的動物（8/8)都 存活。 另外•也在恆河猴體内評估7-HuMGDF 。於10天（第0 天至第9天）期間*對正常恆河猴胞以皮下注射2.5或 25嫌克/公斤/天。於較低劑量姐中，血小板計數在第 12天增加400X *而在較高劑量姐中•其亦在第12天增加 700X。於停止注射後•在第25-30天，血小板計數回復到 正常值。白血球計數和紅血球計數都不受此虏理所影響。 其外丨也在«重血小板減少症的《長類棋型中試驗7 (大臈桿菌卜163)(圃23)。動物接受照射（ 7 00雷得•鈷灌）後，在第15天専致血小板計數減低到正 常值的卜2X。到第35-40天時*血小板計数回復到正常值 。相反地*每天用*y-HuMGDF (25微克/公斤/天）處理 的烴照射動物*其血小板計数只降低到正常值的10X且平 均不低於20,000/微升一血小板減少症病人進行血小板注 输的制動點。於經7 -HuHGDF -處理動物中，也更快速回 後到基媒計數值；在第20天即發生。 轚齒類和靈長類兩種研究所得瑄些活體内數據可完全地. 支持下述植念》亦即7 -Hu HGDF (大腸桿菌卜163)為一種 強力治療劑 > 具有明顯地影響臨床相U性血小板減少症之 能力。 實施例16 CH0 Μ脚按着在牛1 -HuMGDF Ί -Μ? ^方法 用可表現編碣MGDF1-332的cDNA之垤轉染田鼠卵巢细胞 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 丨裝.
•1T -102- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐} 414798 經濟部中央榡準局員工消費合作社印製 A 7 ____B7_五、發明説明（10t)) 在遍當放«匾並脚结到鏞爾可擴大選擇標誌，DHFR >的基 因等之下產生糖基化7 -HuMGDF 1-332 。可供CHO细胞内 表現出MGDF的遘當放動區為SRcr»參看Mol. Cell. Biol. 8:466-472 (1988)和 WO 91/13160 (199Ό。可供 CH0细胞内表現出MGDF的·當載體i/pDSR a 2、。參看VO 90/14363 (1990)。代表性CH0细胞糸可在搮準細胞培養 基内產生分狢出的MGDF*其產量可為10-20奄克/升，不 S可增加到25至S100毫克/升。要用典型細.胞糸來產生 MGDF時，可將培養液擴大，其方式為將其Μ黏附生長方式 -通入具有下列姐成的培養基之懸浮液或姐鳙培養容器内： 等比例的Dulbecco氏改質Eagle氏培養基（DMEM)和 Haa、F12 (DHEM/F12, Gibco)，加上 5 到 10X 胎牛血清 (FBS)或烴透析胎牛血清和Methotrexate (MTX)(必要時 :MTX的典型濃度為200-600 nM) Μ維持選擇壓力。該培 養基必須補充額外的非必需胺基醆（KEAA’s)和毅胺鼸胺 。懸浮焙養物可从容易地從接種（分配）密度卜4 X 10B «胞/ «升繁殖到最大密度〜1 X 10β细胞/ ¾升•於該 酤將培養液經由稀釋到較大暖稹，使起始细胞濃度為所指 定的分配密度而擴大培養。 要在滾瓶中產生MGDF時•必須用磁攪拌旋轉容器放置到 溫控環境（37 ±lt!)，或有儀器設備•纆控制的播拌槽 生物反應器糸铳中以產生遘當的懸浮液髓積和钿胞密度。 滾》瓶（例如* 850立方公分Fa Icon滾動瓶）必須Μ每瓶 1.5至3 X 107细胞的起始密度接種並補充添加生長培養 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) —10 3 — 本紙乐又度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 經濟部中央橾準局負工消費合作社印51 414799 A7 B7五、發明説明（1G1 ) 基（DHEM/F12 ，加 5-10X FBS * 1 X NEAA和 1 X L-毅胺 醢胺 >，其量要遴合於在3-4天内產生匯集單靥（ 150-300 ¾升/瓶）。該生長培養基必須用碳酸籮納遘當 地級街到pH 6.7至7.2以與60-90 nnHg分壓的二氧化碳平 衡。瓶子必須迪入10X CtU /空氣並置於滾動架（〜1 γρ·)上，於37 ±1 t：下培養3-4天。於睡集後·須將滾 動瓶經由傾注或抽吸生長培養基而縛換成無血濟的生產培 養基；用等滲埋衝液•例如Dulbecco's璘酸期級街鹽水（ D-PBS) |洗滌該瓶* 50-100奄升/瓶；然後加入遘當膀積 的碳酸k鹽級衝，無血清DMEH/F12 (1 : 1) ( 200-300毫升 /瓶）·其中補充著NEA A’s和6-穀胺醯胺及硫酸钃K減少 共價聚集（1-20 WM)。瓶子必須通入10X C02 /空氣並 在滾動架（〜1 γρ·)上*37±1 υ下培甭6±1天，或直 到代謝活性鼷使葡萄耱水平到低於0.5克/升及/或pH水 平低於6為止。從瓶内倒出或抽出Μ收集調理培養基並 補充如上所逑的新鲜無血清生產培養基Κ供其他的收集之 用。埴種程序可進行到該细胞不再持續無血滂生產及滾動 瓶泥廢為止。 收集到的調理培養基可择由通過0.45微米及/或0.2微 米滅器（S a r t 〇 r i u s S a r t 〇 b r a η p H 〇 r Ρ 〇 Π )進行間端微 濾鈍化處理。濾後的調理培養基必須冷卻到4 υ，然後· 暫時貯存在4 Ό，或立即用交叉流動超濾系铳（如* Fi ltron ΥΜ-50 )予Μ濃縮和透析到低離子強度。超濾和 透濾必須在4 Ό下進行Κ減少蛋白質降解。調理培養基必 (旖先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -104- 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS ) Α4規格（2丨0X297公釐） 414799 經濟部中央榡準局貝工消費合作社印裝 A7 B7五、發明説明（102) 須用缓衝水溶液（如_ 10 bM璘酸鉀，pH 6.8)透析後才 進行層析術纯化步软。 調理培養基中的產物品質可用非堪原性SDS-PAGE西方黏 染法予以監測；該法可顬S出樣品中的含聚集，單體，和 蛋白分解降解MGDF的相對霣。 另一種用CH0细胞產生MGDF的方法為將表現MGDF的細胞 系調邊到無血濟培養基：如Gibco S-SFM II之中。可K經 由糸列地通到含有最低或無血清補充的培養基.内而調理细 胞。若該细胞糸可在埴種培養基内持讀生長同時產生充分 里的分泌MGDF時，即可烴由糸列地通入遞增地較大培養體 稹内擴大接種培養，然後接注到逋當生產容器内（儀控搔 拌槽生钧反懕器）並在最佳生長條件（pH，養份·溫度， 氧氣，剪切速率）之下增生到其最大存活密度而進行生產 。於最佳生產點（垤由拥纛產物量和品質而實驗地決定） •即從該生物反應器收集培養物，並利用微米一尺寸深度 遇濾或次微米交叉流動微濾而從調理培養基脫除掉细胞。 若將用深度過濾時，必須用次微米間纗遇濾將培養基進一 步涅潸後*才依上文所述予K濃箱和透析。 也 山 甲 ▼ ， 雖然本發明已在上文烴概括地及Κ其較佳實腌例而說明 過*不過•要了解者·諸於此技蕕者可從上述說明而加以 變異和修改。所以，後附申謅専利範圍意欲將所有逭些變 異涵蓋在本發明所申請的専利範園之内。 此外*為了闞明有明本發明的背景及於特別情況中*提 ---------1¾------iT-----0 - - : (諳先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -105- 本紙張尺度適用t國囷家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 笋34 1 03273號專利申請辜 甲文説明書修正頁（85年12月 A? )B7 五、發明説明（ίθ 414799 二-是否變更原實質内容 經濟部中夹螵準局員工消f合作社印製 迸有關其搡作的其他细節等所引述的文獻和其他資料都併 於太文中Η為參考。 礅牛物於台滢》寄存 蒈鳄P B C B ( Η [] D F 2 )(於大_桿菌/\1)|6(：中）已於84年3月28 日寄存於食品工業發展研究所（F [ R D [)，寄存编號：CC ΙΪ C 9 4 0 0 8 6 ^ 詈體P B C B ( H G D F 1 ϊ ί於大辑桿-菌A b ί㊀C中）已於S 4年3月2 S 曰寄存於FIR DI，寄存編號：CCRC 9 40087。 < 表現質體 pAM「； llR-Hu He_t‘Ly：s HGDF (於大腸桿菌 FM15 中*已於8 4年3月2 8日寄存於F i R D Γ，寄存編號i C C R C 940088 - - 大暖捍_K12 FM15已於84年3月28日寄存於FIRDI，寄存 竭襌：Γ. C R C 9 5 0 0 0 2。 中國倉鼠®!巢细朐株P00U β〇ηΜ已於84年3月28日寄存 於 F I R D [，寄存编號：C C S C (J 6 0 0 2 5。 10β - 本舐铁尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X 297公釐） ί ---------Ί-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝
^47C9 A7 B7五、發明説明（1G4) 序列表 (1) 一般資訊： (i )申諳人：AMGEH IHC. (U)發明名稱：剌激巨核细胞生長與分化之姐合物與方法 (m)序列数：34 (iv) 通訊地址： (A) 收信人：Angen Inc· (B) 街名：1840 Dehavilland Drive (C) 市名：Thousand Oaks (D) 州名：加利佛尼亞 (E) 國名：美國 (F) 郵遞區號：91320-1789 (v) 計算桷可_形式 (A) 媒體類型：软碟 (B) 計算拥：IBM PC可相容 (C) 揲作糸统：PC-D0S/MS-D0S (D) IfcjS · Patentln Release #1.0, Version #1.25 (vi) 現有申誧數據： (A) 申饒號： (B) 申請日期： (Ο分類： (vifl)代理人/事務所資訊： (A)名稱：Cook, Robert R. (C) 參考/椹號：A-290-C (#先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -107- 本纸張尺度適用令國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 414799 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（105 ) (2) SEQ ID H0:1 的資料 *· (i )序列特性： (A) 長度：31胺基酸 (B) 頬型：胺基酸 (C) 股型：單股 <D)拓撲學：線型 (ii)分子類別：蛋白質 (xi)序列說明：SEQIDH0:1: Ala Pro Pro Ala Xaa Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Met Leu Arg Asp 15 10 15 Ser His Val Leu His Xaa Arg Leu Xaa Gin Xaa Pro Asp lie Tyr 20 25 30 (2) SEQ ID N0:2 的資料： (i) 序列特性： (A) 長度：21胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (C) 股型：單股 (D) 拓樸學：線型 (ii) 分子類別：蛋白霣 (xi)序列說明：SEQ ID H0:2: -108- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2I0X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 414799 經濟部中央標準局—工消費合作社印裝
五、發明説明（Ί06) Ala Pro Pro Ala Xaa Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Met Leu Arg Asp 15 10 15 Ser His Val Leu His 20 (2) SEQ ID HO :3 的資料： (i )序列特性： (A) 長度：17胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (C) 股型：單股 (D) 拓樸學：埭型 (ϋ)分子類別：蛋白質 (xi)序列說明：SEQ ID H0:3: Thr Gin Lys Glu Gin Thr Lys Ala Gin Asp Val Leu Gly Ala Val Ala 15 10 15 Leu (2) SEQ ID H0:4 的資料： (i )序列特性： (A) 長度：17麯對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓撲學：埭型 (ii)分子類別：cDNA -109- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 414799 A7 B7 五、發明説明（ 107、
(xi)序列說明：SEQ ID H0:4: GCHCCHCCMG CNTGYGA 17 (2) SEQ ID K0:5 的資料： (i )序列特性： (A) 長度：21驗對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓楔學：埭形 (ii)分子類別：cDNA (xi)序列說明：SEQIDN0:5: GCARTGYAAC ACRTGHGART C (2) SEQ ID K0:6 的資料： (i )序列特性： (A) 長度：21胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (C) 股型：單股 21 {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (D)拓樸學 (ii)分子類別 (xi)序列說明 繚形 蛋白霣 SEQ ID H0：6： 經濟部中央標準局舅工消費合作社印製
Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp 1 5 Ser His Val Leu His 20 15 110- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2!0X297公釐） 414799 經濟部中央橾準局員工消費合作杜印策 A7 B7五、發明説明（1Q8) (2) SEQ ID H0:7 的資科： (i )序列特性： (A) 長度：21鹹對 (B) 頬型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓樸學：線形 (ii)分子類別：cDHA (χί)序列說明：SEQIDH0:7: GTACGCGTTC TAGANNNHNH T 21 (2> SEQ ID H0:8 的資料： (i )序列特性： (A) 長度：21鹺對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓樸學：埭形 (η)分子類別：cDHA (xi)序列說明：SEQ ID H0:8: AGTTTACTGA GGACTCGGAG G 21 (2) SEQ ID H0:9 的資科： (i )序列特性： (A) 長度：30«t對 (B) 類型：核酸 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} —Ill — 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐） 414799 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 A7 B7五、發明説明（1〇9 ) (c)股型：單股 (D)拓撲學：線形 (U)分子類別：cDHA Od)序列說明：SEQ ID N0:9: TTCGGCCGGA TAGGCCTTTT TTTTTTTTTT 30 (2) SEQ ID NO: 10 的資料： (i )序列特性： (A) 長度：29«[對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓僕學：揲形 (ϋ)分子類別：cDNA (xi)序列說明：SEQ ID N0:10: TTCGGCCGGA TAGGCCTTT TTTTTTTTT 29 (2) SEQ ID N0:11 的資料： (i )序列特性： (A) 長度：20鲰對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓撲學：線形 (ii)分子類別：cDHA (xi)序列說明：SEQIDH0:11: (請先閱讀背面之：^意事項再填寫本頁) -112- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4^格（2I〇X 297公釐） 414799 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（11G) TGCGACCTCC GACTCCTCAG 20 (2> SEQ ID H0:12 的資料： (i )序列特性·· (A) 長度：23鐮對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (!))拓撲學：鐮形 (ii)分子類別：cDNA (xi)序列說明：SEQIDN0:12: GAGTCCTCAG TAAACTGCTT CGT 23 (2) SEQ ID N0:13 的資料： (i )序列特性： (A) 長度：20緻對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓撲學：線形 (ii)分子類別：cDHA (xi)序列說明：SEQ ID N0:13: GGAGTCACGA AGCAGTTTAC 20 (2) SEQ ID H0:14 的資枓： (i )序列特性： -113- 本纸張尺度適用中國國家標準{ CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
• - I - - - i it 士·IJ—1 I
、1T I.~ 旅-- 414799 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（m) (A) 長度：18熱對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓樸學：線形 (ii)分子類別：cDHA (xi)序列說明：SEQ ID H0:14: CCTTTACTTC TAGGCCTG 18 (2) SEQ ID HO:15 的資料： (i )序列特性： (A>長度：19鐮對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓撲學：線形 (ii)分子類別·· cDHA (xi)序列說明：SEQ ID K0:15: CAGGTCACAA GCAGGAGGA 19 (2) SEQ ID 00:16 的資料： (i )序列特性： (A) 長度；19餘對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓楔學：埭形 -114- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (诗先"讀背面之注意事項再填寫本頁) rfl^i^i ^m— nt^i m^— HI ^ J .HLIC f—ϋ 0 m^i J -'f V. A7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 B7五、發明説明（112) (ii)分子類別：cDHA (xi)序列説明：SEQ ID H0:16: GGCATAGTCC GGGACGTCG 19 (2) SEQ ID HO :17 的資料： (i>序列特性： (A) 長度：19鑣對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓撲學：埭形 (ϋ>分子類別：cDNA (xi)序列說明：SEQ ID H0:17: TCCTCCTGCT TGTGACCTC 19 (2) SEQ ID HO: 1& 的資料·· (i >序列特性： (A) 長度：19鍮對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓樸學：線形 (ii)分子類別：cDNA (xi)序列說明：SEQ ID N0:18: CCAGGAAGGA TTCAGGGGA 19 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁 I I种衣 訂 旅 —115 — 本紙張尺度適;ίΐ中國國家標準（CNS ) A4it格（210X25»7公釐） 414799 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（113) (2} SEQ ID H0:19 的資料 ί (i) 序列特性： (A) 長度：30籲對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：軍股 (D) 拓撲學：線形 (ii) 分子類別：cDHA (xi)序列說明：SEQ ID M0:19: CAACAAGTCG ACCGCCAGCC AGACACCCCG 30 (2) SEQ ID HO:20 的資科： (i )序列特性： (A) 長度：24«[對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓樸學：線形 (ii)分子類別：cDHA (xi)序列說明：SEQ ID H0:20: GGCCGGATAG GCCACTCHHH NMHT 24 (2) SEQ ID HO:21 的資料： (i)序列特性： (A) 長度：21鹺對 (B) 類型：核酸 ..* {請先閣讀背面之注意事項再填寫本頁) -- 1- I - I I- ί—Γ ------ - ^FE . 二 _ - -1 - .^1 --I - - i 1 - - - « - I - -i --1.....1 - 116— 本紙張尺度適用中國國家標隼{ CNS ) A4規格（210X297公釐} 414799 a7 B7 經濟部中夬標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（”4) (C) 股型：單股 (D) 拓樸學：垛形 (ii)分子類別：cDNA (xi)序列說明：SEQ ID N0:21: GCA8TGYAAN ACRTGNGART C 21 (2) SEQ ID H0:22 的資料： (i )序列特性： (A) 長度：16«(對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓樸學：線形 (ii)分子類別：cDHA 6d> 序列說明：SEQ ID M0:22: TTGGTGTGCA CTTGTG 16 (2) SEQ ID NO:23 的資料： (i)序列特性： (A) 長度：20驗對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓撲學：線形 (ϋ)分子類別：cDNA (xi)序列說明：SEQ ID H0:23: -117- 本紙乐尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210 X 29"?公釐） (讀先閱讀背面之注意婁j項再填寫本頁) 414799 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（ns) CACAAGTGCA CACCAACCCC 20 (2) SEQ ID N0:24 的資料： (i )序列特性： (A) 長度：1342鹺對 (B) 類型：梭_ ， (C) 股型：單股 (D) 拓樸學：埭形 U)分子類別：cDHA (ix)特點： (Α)名稱/W鐽詞：CDS (B)位置：99-1094 (xi)序列說明：SEQ ID N0:24: _ CAGGGAGCCA CGCCAGCCAA GACACCCCGG CCAGAATGGA GCTGACTGAA TTGCTCCTCG 60 TGGTCATGCT TCTCCTAACT GCAAGGCTAA CGCTGTCC AGC CCG GOT CCT CCT 113 Ser Pro Ala Pro Pro --------丨私衣------1T.·-------^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) —11δ— 本紙悵A度適用中國國家標準（CNS ) Α4ϋ格（2丨OX297公釐） I 414799 A7 B7 五、發明説明（116) 經濟部中央榇準局員工消費合作杜印製 GCT TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC 161 Ala Cya A3p Leu Arg Vai Leu Ser Lya Leu Leu Arg Asp Ser His Val 10 15 20 CTT CAC AGC AGA CTG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CC7 ACA 209 Leu His Ser Arg Leu Ser Gin Cya Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr 25 30 35 CCT GTC CTG CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC 257 Pro Vai Lea Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lya Thr 40 45 50 CAG ATG GAG GAG ACC AAG GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GXG ACC CTT 305 Gin Met Glu Glu Thr Lys Ala Gin A3p lie Leu Giy Ala Val Thr L€U 55 60 65 CTG CTG GAG GGA GTG ATG GCA GCA CGG GGA CAA CTG GGA CCC ACT TGC 353 Leu Leu Glu Glv Val Met Ala Ala Arg Gly Gin Leu Gly Pro Thr Cys 70 75 80 85 CTC TCA TCC CTC CTG GGG CAG CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC CTX 401 Leu Ser Ser Leu Leu Glv Gin Leu Ser Giv Gin Val Arg Leu Leu Leu 90 95 100 广内〇>» GCC CTG CAG AGC CTC CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC AGG 443 Glv Ala Leu Gin Ser Leu Lea Gly Thr Gin Leu Pro Pro GLn GX^ Arg 105 110 115 ACC ACA GCT CAC AAG GAT ccc AAT 广产r1* ATC CTG AGC TTC CAA CAC 497 Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala lie ?he Leu Ser Phe Gin His 120 125 130 CTG CTC CGA GGA AAG GTG CGT TTC CtG 二一 CTT GTA GGA GGG TCC ACC 545 Leu Leu Arg Glv Lys Val A:g Ptie Leu Ms: Leu Val Gly Gly Ser Thr 135 140 145 CTC TGC GTC AQG CGG GCC CCA CCC ACC ΛΟλ GCT GTC CCC AGC AGA ACC 593 Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Λ.Ι3. Vai Pro Ser Arg Thr 150 155 150 165 TC7 CTA GTC CTC ACA CTG AAC GAG C-C CC-r« AAC AGG ACT TCi GGA TTG 641 Ser Leu Val Leu Thr Leu λΞΠ Glu Le^ ?rc Λ5Π Arg Thr Ser Gly Leu 170 ::Ξ 130 L ▲ O GAG ACA AAC TTC ACT GCC TCA GCC ΛόΛ 1| _ ACT GGC TCT CTT 639 Leu Giu Thr Aaa ?he Thr Ala Ser Ala Azr —u _ Thr Gly Ser Glv Leu 135 ：5〇 135· ^ VJ ΛΛ0 TGG CAG CXG GGA T -C AGA GCC AAG ATT CCT GGT CTG CTG AAC 737 Leu Lvs Trp Gin Gin Gly ?he Arg AI^ 二 ys Us Pro Gly Leu Leu Asa 200 205 210
t >? ue τ 1 ,··*- An c G c V. o --•3 2 G Λ 2 G u T e CL Ur c e F- s -? 0 r A A u-c e t々s c r 5 chi AT2 An -1 c G TAG CTG AAC i.GG ΑΤλ 785 C-Iv Tyr Leu λ5π Arg lie 225 - -119-本紙張度適用中國國家橾準（CNS > A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝. 訂 A7 B7 經濟部中央標準局負工消費合作社印裝 414799 五、發明説明（117) CAC GAA CrC TTG AAT GGA ACT CGT GGA CTC ~T CCT GGA CCC TCA CGC 833
His Glu Leu Leu Asn GIv Thr Arg Giy Leu ?-e ?ro Gly Pro Ser Arg 230 235 ' 240 ‘ 245 AGG ACC CTA GGA GCC CCG GAC ATT TCC TCA GC；A ACA TCA GAC ACA GGC 331
Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp He Ser Ser Gly Thr Ser Asp T!ir Giy 250 255 2S0 * TCC CXG CCA CCC AAC CTC CAG CCT GGA TAT TCT CCT TCC CCA ACC CAT 929
Ser Leu Pro Pro Aan Leu Glrv Pro Gly Tvr Ser Pro Ser Pro Thr Hia 265 270 * 275 CCT CCT ACT GGA CAG ΤΛΊ ACG CTC TTC CCt CTT CCA CCC ACC TTG CCC 977
Pro Pro Thr Gly Gin Tyr Thr Leu ?he Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro 2S0 -235. 290 ACC CCT GTG GTC CAG CTC CAC CCC CTG CTT CCT GAC CCT TCT GCT CCA . 1Q25
Thr Pro Val Val Gin Leu His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro 295 300 305 ACG CCC ACC CCT ACC AGC CCT CTT CTA AAC ACA TCC TAC ACC CAC TCC 1073
Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn T^r Ser Tyr Thr Hi3 Ser 210 " 315 320 325 CAG AAT CTG TCT CAG GAA GGG TAAGGT*TCTC AGACACTGCC GACATCAGCA 1124
Gin A^n Leu Ser Gin Glu Gly 330 TTGTCTCGTG TACAGCTCCC TTCCCTGCAG GGCGCCCCTG GGAGACAACT GGACAAGATT 11Θ4 - > TCCTACTTTC TCCTGAAACC CAAAGCCCTG GTA-w.GGGA TACACAGGAC TGAAAAGGGX 1244 ATCATTTTTC ACTG7ACATT ATAAACCTTC AGAAGCTATT TTTTTAAGCT ATCAGCAATA 1304 CTCATCAGAG CAGCTAGCTC TTTGGTCTAT TTTCTGCA 1342 (2) SEQ ID HO:25 的資科： ' (i )序列特性： (A) 長度：332胺基酸 (B) 類型•♦睃基酸 (D)拓襆學：嫜形 (ii)分子類別：蛋白霣 (xi)序列說明：SEQ ID H0:25:
Ser Pro Ala =r〇 Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Lau 1 5 10 15
Arg Asp Ser His Vai Lau His Ser Arg Leu Ser Gin Cys Pro C-iu Val 20 25 30
His ?r〇 Le’j ?j：。：卜‘r Leu ?:。Aia Val Asp ?he Ser Leu 35 . 40 45 —120 - 本紙張尺度適用中國國家樣华（CNS ) A4規格（21 〇 X 297公釐） -----------一裝------訂------線 v 1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 9 9 7 4 彳**· 4 五、發明説明（118) Glv GIu Xro Lys Thr Gin Met Glu G：- Thr Lys Ala Gin A3p lie Leu 50 5S 60 請 Glv Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Arg Gly Gin 先 65 70 75 80 聞 14 Leu Glv Pro Thr Cy3 Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gin Leu Ser G,v 如 1 85 90 95 Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Glr: Ser Leu Leu Gly Thr Gin Leu 意 100 105 110 事 x§ Pro Pro Gin Gly Arg Thr Thr Ala Hi: Lys Asp Pro Asn Ala lie Phe -¾ 115 120 125 填 寫 Leu Ser Phe Gin His Leu Leu Arg Glv Lys Val Arg Phe Leu Met Leu -g 130 135 140 V--- Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala 145 150 155 160 Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu A^n Glu Leu Pro Asn 155 170 175 Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser Ala Arg Thr ISO 135 190 Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys- Trp Gin Gin Gly Phe Arg Ala Lys He 195 200 205 Pro Gly Leu Leu Asn Gin Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gin lie Pro Gly 210 215 220 Tyr Leu Asn Arg He Hi3 Glu Leu Leu Asn Glv Thr Arg Gly Leu Phe 225 230 235 240 Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Glv Ala. Pro Asd He Ser Ser Gly 245 250 255 Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Α3Π Leu Gin Pro Glv Tvr Ser 260 265 270 Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Glv Gin Tvr Thr Leu Phe Pro Leu r L. 275 280 285 % Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val 31n leu His Pro Leu Leu Pro 290 295 300 Asp ?rc Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Ser Pro Leu Leu Asn Thr Ϊ 305 310 315 320 ^ Ser Tyr Th: His Ser Gin Asn Leu Ser Gin Glu Gly ? 325 330 1 -121- 本紙張尺度適用中國國家橾準·（ CNS M4規洛（210X297公釐> --—装------訂------線 414799 A7 B7 五、發明説明（n9) (2> SEQ ID N0:26 的資科： (i )序列特性： (A)長度：1342 ϋ對 (Β)類型：核酸 (C) 股型：單肢 (D) 拓僕學‘•線型 (ii)分子類別：cDHA (ix)特黏： (A)名稱/W鍵飼：CDS (B> 位置：99..621 (xi> 序列說明：SEQ ID H0:26: 經濟部*-央榡準局員工消費合作社印製 CAGGGAGCCA CGCCAGCCAA GACACCCCGG CCAGAATGGA GCTGACTGAA TTGCTCCTCG 60 TGGTCATGCT TCXCCTAACT GCAAGGCTAA CSCTG'CC AGC CCG GOT CCT CCT 113 , Ser Pro Ala Pro Pro 1 5 GCT TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT ΑΑΛ CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC 161 Ala Cys Asp Leu Arg val Leu· Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val 10 ' 15 20 CTT CAC AGC AGA CTG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA 209 Leu His Ser Arg Leu Ser Gin Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr 25 30 35 .‘ CCT GTC CTG CTG CCT GCT GTG GAC 'Γ'ΤΤ AGC 77G GGA GAA TGG AAA ACC 257 ?ro Val Leu. Leu Pro Ala Val Asd ?he Ser Leu Glv Glu Trc. Lvs Thr 40 45 50 ^ CAG ATG GAG GAG ACC AAG GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC CTT 305 Gin Met Glu Glu Thr Lys Ala Gin Asp lie Leu Gly Ala Val Thr Leu 55 60 * 65 CTG CTG GAG GGA GTG ATG GCA GCA CGG GGA CAA CTG GGA CCC ACT TGC 353 ieu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Glv 31n Leu Gly Pro Thr Cys 70 75 80 85 CTC TCA ~CC CTC CTG GGG CAG CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC CTT 401 ΐ-eu Ser Ser Leu Leu Gly Gin Leu Ser Gly Gin Val Arg Leu Leu Leu 90 95 100 -122- 一.— 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X2?7公釐） --------ά------iT----—1 - - -(請先間讀背面之注意事項再填寫本頁) 414799 A7 B7 五、發明说明（12Q) GG<3 GCC CTG CAG KGC CTC CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC AGG Gly Ala Leu Gin Ser Leu Leu Gly Thr Gin Leu Pro Pro Gin Gly Arg 105 110 1:5 ACC ACA GCT CAC AAG GAT CCC AAT GCC ΛΤΟ TTC CTG AGC TTC CAA C^C Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asu Ala lie ?he Leu Ser Phe Gin His 120 " 125 130 449 497 經 濟 部 中 央 標 準 負 工 合 作 社 印 製
TG CTC CGA GGA AAG GTG CGT TTC CTG ATG CTT GTA GGA GGG TCC ACC Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr 135 140 145 CTC TGC GiC AGG CGG GCC CCA CCC ACC ACA GCT GTC CCC AGC AGA ACC Leu Cya Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr 150 155 160 165 TCT CTA GTC CTC ACA CTG AAC GAG CTC C CAAACAGGAC TTCTGGATTG Ser Leu Val Leu Thr Leu Αθη Glu Leu 170 TTGGAGACAA ACTTCACTGC CTCAGCCAGA ACTACTGGCT CTGGGCTTCT GAAGTGGCAG CAGGGATTCA GAGCCAAGAT TCCTGGTCTG CTGAACCAAA CCTCCAGGTC CCTGGACCAA ATCCCCGGAT AgCTGAACAG GATACACGAA CTCTTGAATG GAACTCGTGG ACTCTTTCCT GGACCCTCAC GCAGGACCCT AGGAGCCCCG GACATTTCCT CAGGAACATC AGACACAGGC TCCCTGCCAC CCAACCTCCA GCCTGGATAT TCTCC7TCCC CAACCCATCC TCCTACTGGA CAGTATACGC TCTTCCCTCT TCCACCCACC TTGCCCACCC CTGTGGTCCA GCTCCACCCC CTGCXTCCTG ACCCTTCTGC TCCAACGCCC ACCC™ACCA GCCCTCTTCT AAACACAXCC TACACCCACT CCCAGAATCT GTCTCAGGAA GGG7AAGGTT CTCAGACACT GCCGACATCA GCATTG^CTC GTGTACAGCT CCCTTCCCTG CAGGGCC-CCC CTGGGAGACA ACTGGACAAG ATTTCC7ACT T7C7CCTGAA ACCCAAAGCC CTC^7A.=L^.G GGATACACAG GACTGAAAAG GGAATCATTT "TCACTGTAC ATTATAAACC TTCAGAAGCT ATT^TTTTAA GCCATCAGCA ATACTCATCA GAGCAGCTAG CTCTTTGGTC TATT~CTC-C A 545 593 641 701 7S1 821 831 941 1001 1061 1121 1131 1241 ’1301 1342 a 先 閱 讀 背 面 之 注 意 事 項 再 填 寫 本 頁 裝 訂 —123 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（21〇'〆297公楚） 經濟部中央標隼局員工消費合作杜印製 414798 A7 B7 _______ 五、發明说明（U1) (2) SEQ ID H0:27 的資料： (i )序列特性： (A) 長度：U4胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (D)拓撲學：嫌形 (U)分子類別：萑白質 (Xi>序列說明：SEQ ID刖:27:
Ser Pro A丄a Pro Pro Ala Cys Asp Leu Ar^ Val Leu Ser Lys Leu Lau 1 5 ID 15
Arg Aso Ser His Val Leu His Ser Arz Ser Gin Cvs Pro Glu Val 20 2； * 30
His Pro Leu Pro Thr Pro, Val Leu Leu Ala Val Asp Phe Ser Leu 35 # 40 45’
Gly Glu Trp Lya Thr Gin MeC Glu Glu Thr Lys Ala Gin Asp lie Leu SO 55 50 '
Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gin 65 70 75 80
Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gin Leu Ser Gly Gin 85 90 95
Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gin Ser Leu Leu Gly Thr Gin Leu 100 105 110
Pro Pro Gin Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Aap Pro Asn Ala lie Phe US 120 ' 125
Leu Ser Phe Gin His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu 130 135 140
Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Vai Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala
145 150 155 ISO
Val ^ro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Lea Aan Glu Leu 165 170 -124- 本紙張尺度通用中國國家標準（CNS ) A4規格（0x297公康）
414798 at B7 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 五、發明説明（122) <2) SEQ ID «0:23 的資料： (Ϊ )序列特性： (A) 長度：1164鐮對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓僕學：埭形 (2)分子類別：cDHA (lx)特點： (A)名稱/W鐽詞：CDS ⑻位置：97,,894 (xi)序列說明：SEQ ID HO:28: AGGGAGCCAC GCCAGCCAGA CACCCCGGCC .1GAATC-G--.GC TGACTGAATT GCTCCTCGTG 60 GTCXTGCTTC TCCTAACTGC AAGGCTAACG CIGTCC AGC CCG GCT CCT CCT GCT 114 Ssr Pro Ala Pro. Pro Ala • 1 5 TGT C-AC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC CTT 152 Cvs A3D Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu .-_rg Asp Ser His Val Leu 10 15 20 CAC AGC AGA CTG AGC CAG TGC CCA GAG GTT C--.C CCT TTG CCT ACA CCT 210 His Ser Arg Leu Ser Gin Cys Pro GIu Val His Pro Leu Pro Thr Pro 25 * 3〇 35 GTC CTG CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC CAG 258 Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Glv Glu Trp Lya Thr Gin 45 50 ATG GAG GAG ACC AAG GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC CTT CTG 3〇6 Met Glu Glu Thr Lys Ala Gin Asp lie Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu 55 60 65 70 CTG GAG GGA GTG ATG GCA GCA CGG GGA CAA CTG GGA CCC ACT TGC CTC 354 Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gin Leu Gly Pro Thr Cys Leu 75 · 80 85 TCA TCC CTC CTG GGG CAG CTT TCT GGft. CAG GTC CGT CTC CTC CTT GGG 402 Ser Ser Leu Leu Gly Gin Leu Ser Gly Gin Val Arg Leu Leu Leu Gly 90 95 100 -125- 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4規格（2丨〇><297公楚：） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝. 丁__ ---t 414799 A7 B7 五、發明説明（123) GCC CTG CAG AGC CTC CTT QQh ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC AGG ACC Ala Leu Gin Ser Leu Leu Glv Thr Gin Leu Pro Pro Gin Gly Arg Thr 105 110 115 ACA GCT CAC AAG GAT CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA CAC C7G Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala lie Phe Leu Ser Phe Gin Ηιλ Leu 120 ' 125 130 CTC CGA GGA AAG GAC TTC TGG ATT GTT GGA GAC ΛΑΑ CTT CAC TGC CTC Leu Arg G丄y Lys Asp Phe Trp lie Val Gly A^p Lys Leu Hia Cy3 Leu 135 140 ‘ 145 150 AGC CAG AAC TAC TGG CTC TGG GCT TCT GAA GTG GwV GCA GGG ATT CAG Ser Gin Aan Tyr Trp Leu Tip Ala Ser Glu Val Ala Ala Gly lie Gin 155 150 165 AGC CAA GAT TCC TGG TCT GCT GAA CCA AAC CTC CAG GTC CCT GGA CCA Ser Gin Asp Ser Trp Ser Ala Glu Pro Asn Lea Gin Val Pro Gly Pro ，170 " 175 130 AAT .CCC CGG ATA CCT GAA CAG GAX ACA C^A AC7 CTT GAA TGG AAC TCG Asn Pro Arg He Pro Glu Gin Asp Thr Arg thr Leu Glu Trp Asn Ser L85 190 195 TGG ACT CTT TCC TGG ACC CTC ACG C^G GAC CCt AGG AGC CCC GGA CAT Trp Thr Leu Ser Trp Thr Leu Thr Gin Pro Arg Ser Pro Giy Hi5 200 205 210 TTC CrC AGG AAC ATC AGA CAC AGG C?C C:: GC：： ACC CAA CCT CCA GCC ?he Leu Arg Asn lie Arg Kis Arg Leu Ala Thr Gin Pro Pro Ala 215 220 225 230 TGG ATA TTC TCG TTC CCC AAC CCA TCC CCC TAC TGG ACA GTA TAC GC7 Trp He ?he Ser Phe Pro Asn Pro Ser £er Tyr Trp Thr Val Tyr Ala 235 240 245 CTT CCC TCT rcc ACC CAC CTT GCC CAC CCC TGT GGT CCA GCT CCA C2C Leu ?ro Ser 5er Thr His Leu Ala His Cvs Giy Pro Ala ?ro ?rn ：Ξ0 255 ' 250 經濟部中央標準局員Η消費合作社印製 CCT GCT TCC TGACCCTTCT GCTCCAACC Pro Ala Ser 2S5
CTAAACACAT CCTACACCCA CTCCCAGAAT CrGTCTCAGG AAGGGTAAGG TTCrCAGACA CTGCCGACAT CAGCATTGTC TCGTGTACAG CCCCCTtCCC TGCAGGGCGC CCC7GGGAGA CAACTGGACA AGATTTCCTA CTTTCTCCTG AA^CCCAAAG CCCTGGTAAA AGGGATACAC AGGACTGAAA AGGGXATCAT TTTTCACTGT ΛΟλΤΤΧΓΐΛΑ CCTTCAGAAG CTA 450 498 546 594 642690 738 786 S34 332 931 391 1051 1L11 1164 {請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝 訂 126— 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) 格（2i〇χπ7公釐） 414799 經濟部中夬樣準局員工消費合作社印製 A7 B7__ 五、發明説明（124 ) (2) SEQ ID N0:29 的資料： (i )序列特性： (A) 長度：265賅基酸 (B) 類型：胺基酸 (D)拓撲學：線形 (ii)分子類別·•蛋白質 Oti)序列說明：SEQ ID H0:29: Ser Pro Ala Pro' Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu 1-5 10 15 Arg Asp Ser Hia VaL Leu Ris Ser .\=g Leu 5er Gin Cys Pro Glu Val 20 25 30 His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala. Val Asp Phe Ser Leu 35 4〇 45 Gly Glu Trp Lys Thr Gin Met Glu Glu Thr Lvs Ala Gin Asp lie Leu 5〇 55 * 60 Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly C-ln 55 70 ' 75 80 j-eu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gin Leu Ser Gly Gin 85 90 95 Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gin Ser Leu Leu Gly Thr Gin Leu 100 105 110 P_o Pro Gin Gly Arg Tiir Thr Ala His Lvs A'sp Pro Asn Ala lie Phe 115 120 * 125 Leu Ser ?he Gin His Leu Leu Arg Gly Lys Asp Phe Trp lie Val Gly 130 135 140 Asp Lys Leu His Cys Leu Ser Gin Asa Tyr Tro Leu Tru Ala Ser Glu 145 150 155 ‘ 160 Val Ala Ala Gly ne Gin Ser Gin Asp Ser Trp Ser Aia Glu Pro Asn 155 170 175 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本買) ---------------装------訂—— -1 !—---1 1 -- -127- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 經濟部中夬標準局員工消費合作社印裝 414799 A7
At _ B7_ 五、發明説明（125)
Leu Gin Vai Pro Gly Pro Asn Pro Arg lie Pro Glu Gin Asp Thr Arg ISO 185 190
Thr Leu Glu Trp Asn Ser Trp Thr Leu Ser Trp Thr Leu Thr Gin Aap 195 200 * 205 、
Pro Arg Ser Pro Giy His Phe Leu Arg Asn lie Arg His Arg Leu Pro 210 2X5 220
Ala Thr Gin Pro Pro Ala Trp lie Phe Ser Phe Pro Asn Pro Ser Ser 225 230 235 240
Tyr Trp Thr Val Tyr Ala Leu Pro Ser Ser Thr His Leu Ala His Pro 245 250 255
Cya Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Ser 260 2S5 (2> SEtl ID N0:30 的資料： u)序列特性： ⑻長度：2犧對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股
(D) 拓撰學：嫌形 (ii)分子類別：cDHA (xi)序列說明：SEQ ID H0:30: GAGCTCACTA GTGTCGACCT GCAG 24 (2) SEQ ID H0:31 的資料： (i)序列特性： (A)長度：24鏡對 ⑻類型：核酸 (C)股型：單股 ~ 128— 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4^t格（210X297公釐） ---------¾衣------1T------2 * (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 414799 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7_五、發明説明（126 ) (D)拓撲學：線型 (ϋ )分子類別：cDHA (xi)序列說明：SEQ ID H0:31: CTGCAGGTCG ACACTAGTGA GCTC 24 (2> SEQ ID N0:32 的資料： (i )序列特性： (A) 長度：80鹼對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓樸學：線形 (ii)分子類別：cDNA (xi)序列說明：SEQ ID H0:32: CTCATAATTT TTAAAAAATT CATTTGACAA ATGCTAAAAT TCTTGATTAA TATTCTCAAT 60 TGTGAGCGCT CACAATTTAT 80 (2) SEQ ID N0:33 的資料： (i )序列特性： (A) 長度：86«(對 (B) 類型：核酸 (Ο股型：單股 (D)拓樸學：線形 U)分子類別：cDHA (xi)序列說明：SEQ ID H0:33: τ I ΐ衣 . * 訂 旅 - J (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -129- 本紙珉尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨OX 297公釐） 414798 A7 B7 五、發明説明（127 ) CGATAAATTG TGAGCGCTCA CAATTGAGAA TATTAATCAA GAATTTTAGC ATHGTCAAA 60 TCAATTTTTT AAAAATTATG AGACGT 86 (2) SEQ ID N0:34 的資料： (i )序列特性： (A) 長度：89鐮對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股
(D) 拓撲學：線形 (ii)分子類別：cDHA (xi)序列說明：SEQ ID HO:34: GACGTCTCAT AATTTTTAAA AAATTCATTT GACAAATGCT AAAATTCTTG ATTAATATTC 60 TCAATTGTGA GCGCTCACAA TTTATCGAT 89 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 130- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 2ί>7公釐>

Claims (1)

  1. A8 B8 C8 D8 等34103273號專利申請察 中文申請專利範圍蔭正本(.38年7月）
    經濟部中央標準局員工消費合作社印製 —種單聚乙二醇化巨核堀跑生長發育（MG D F )多肽，其具 有下示胺基酸序列（圏1 i〗中第2 2 - 1 S 4個之胺基酸且聚乙 二gf基圑降連接於該多钕之N端： 圖 1 CAGGGAGCCACGCCAGCCAAGACACCCCGGCCAGAATGGAGCTGACTGAATTGCTCCTC 59 1 MetGluLeuThrGluLeuLeuLeu 8 6 0 GTGGTCATGCTTCTCCTAACTGCAAGGCTAACGCTGTCCAGCCCGGCTCCTCCTGCTTGT 119 9 ValValMetLeuLeuLeuThrAlaArgLeuThrLeuSerSerProAlaProProAlaCys 28 ’ r 120 GACCTCCGAGTCCTCAGTAAACTGCTTCGTGACTCCCATGTCCTTCACAGCAGACTGAGC 179 29 AspLeuArgYalLeuSerLysLeuLeuArgAspSerHisValLeuKisSerArgLeuSer 48 ； -180 CAGTGCCCAGAGGTTCACCCTTTGCCTACACQTGTCCTGCTGCCTGCTGTGGACTTTAGC 239 49 GlnCysProGluValHisProLeuProThrProValLeuLeuProAlaValAspPheSer 68 240 TTGGGAGAATGGAAAACCCAGATGGAGGAGACCAAGGCACAGGACATTCTGGGAGCAGTG 299 69 LeuGlyGluTrpLysThrGlnMetGluGluThrLysAlaGlnAspIleLeuGlyAlaVal 88 v ' 300 ACCCTTCTGCTGGAGGGAGTGATGGCAGCACGGGGACAACTGGGACCCACTTGCCTCTCA 359 89 ThrLeuLeuLeuGluGlyValMetAlaAlaArgGlyGlnLeuGlyProThrCysLeuSer 108 360 TCCCTCCTGGGGCAGCTTTCTGGACAGGTCCGTCTCCTCCTTGGGGCCCTGCAGAGCCTC- 419 109 SerLeuLeuGlyGlnLeuSerGlyGlnValArgLeuLeuLeuGlyAlaLeuGlnSerLeu 128 420 CTTGGAACCCAGCTTCCTCCACAGGGCAGGACCACAGCTCACMGGATCCCAATGCCATC 479 129 LeuGlyThrGlnLeuProProGlnGlyArgThrThrAlaHisLysAspProAsnAlalle 148 480 TTCCTGAGCTTCCAACACCTGCTCCGAGGAAAGGTGCGTTTCCTGATGCTTGTAGGAGGG '539 149 pheLeuSerPheGlnHisLeuLeuArgGlyLysValArgPheLeuMetLeuValGlyGly 168 540 TCCACCCTCTGCGTCAGGCGGGCCCCACCCACCACAGCTGTCCCCAGCAGAACCTCTCTA 599 169 SerThrLeuCysValArgArgAlaProProThrThrAlaValProSerArgThrSerLeu '188 600 GTCCTCACACTGAACGAGCTCCCAAACAGGACTTCTGGATTGTTGGAGACAAACTTCACT 659 189 ValLeuThrLeuAsnGluLeuProAsnArgThrSerGlyLeuLeuGluThrAsnPheThr 208 660 GCCTCAGCCAGAACTACTGGCTCTGGGCTTCTGAAGTGGCAGCAGGGATTCAGAGCCAAG 719 209 AlaSerAlaArgThrThrGlySerGlyLeuLeuLysTrpGlnGlnGlyPheArgAlaLys 228 本紙張尺度逍用中國國家標準（^5)八4規格（21〇乂297公«) I —— -1 !| -- - I -I I II —I ! i— - I . *1τ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) A8 B8 C8 D8 等34103273號專利申請察 中文申請專利範圍蔭正本(.38年7月）
    經濟部中央標準局員工消費合作社印製 —種單聚乙二醇化巨核堀跑生長發育（MG D F )多肽，其具 有下示胺基酸序列（圏1 i〗中第2 2 - 1 S 4個之胺基酸且聚乙 二gf基圑降連接於該多钕之N端： 圖 1 CAGGGAGCCACGCCAGCCAAGACACCCCGGCCAGAATGGAGCTGACTGAATTGCTCCTC 59 1 MetGluLeuThrGluLeuLeuLeu 8 6 0 GTGGTCATGCTTCTCCTAACTGCAAGGCTAACGCTGTCCAGCCCGGCTCCTCCTGCTTGT 119 9 ValValMetLeuLeuLeuThrAlaArgLeuThrLeuSerSerProAlaProProAlaCys 28 ’ r 120 GACCTCCGAGTCCTCAGTAAACTGCTTCGTGACTCCCATGTCCTTCACAGCAGACTGAGC 179 29 AspLeuArgYalLeuSerLysLeuLeuArgAspSerHisValLeuKisSerArgLeuSer 48 ； -180 CAGTGCCCAGAGGTTCACCCTTTGCCTACACQTGTCCTGCTGCCTGCTGTGGACTTTAGC 239 49 GlnCysProGluValHisProLeuProThrProValLeuLeuProAlaValAspPheSer 68 240 TTGGGAGAATGGAAAACCCAGATGGAGGAGACCAAGGCACAGGACATTCTGGGAGCAGTG 299 69 LeuGlyGluTrpLysThrGlnMetGluGluThrLysAlaGlnAspIleLeuGlyAlaVal 88 v ' 300 ACCCTTCTGCTGGAGGGAGTGATGGCAGCACGGGGACAACTGGGACCCACTTGCCTCTCA 359 89 ThrLeuLeuLeuGluGlyValMetAlaAlaArgGlyGlnLeuGlyProThrCysLeuSer 108 360 TCCCTCCTGGGGCAGCTTTCTGGACAGGTCCGTCTCCTCCTTGGGGCCCTGCAGAGCCTC- 419 109 SerLeuLeuGlyGlnLeuSerGlyGlnValArgLeuLeuLeuGlyAlaLeuGlnSerLeu 128 420 CTTGGAACCCAGCTTCCTCCACAGGGCAGGACCACAGCTCACMGGATCCCAATGCCATC 479 129 LeuGlyThrGlnLeuProProGlnGlyArgThrThrAlaHisLysAspProAsnAlalle 148 480 TTCCTGAGCTTCCAACACCTGCTCCGAGGAAAGGTGCGTTTCCTGATGCTTGTAGGAGGG '539 149 pheLeuSerPheGlnHisLeuLeuArgGlyLysValArgPheLeuMetLeuValGlyGly 168 540 TCCACCCTCTGCGTCAGGCGGGCCCCACCCACCACAGCTGTCCCCAGCAGAACCTCTCTA 599 169 SerThrLeuCysValArgArgAlaProProThrThrAlaValProSerArgThrSerLeu '188 600 GTCCTCACACTGAACGAGCTCCCAAACAGGACTTCTGGATTGTTGGAGACAAACTTCACT 659 189 ValLeuThrLeuAsnGluLeuProAsnArgThrSerGlyLeuLeuGluThrAsnPheThr 208 660 GCCTCAGCCAGAACTACTGGCTCTGGGCTTCTGAAGTGGCAGCAGGGATTCAGAGCCAAG 719 209 AlaSerAlaArgThrThrGlySerGlyLeuLeuLysTrpGlnGlnGlyPheArgAlaLys 228 本紙張尺度逍用中國國家標準（^5)八4規格（21〇乂297公«) I —— -1 !| -- - I -I I II —I ! i— - I . *1τ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 414799 Α8 ΒΒ C8 D8 六、申請專利範圍 720 ATTCCTGGTCTGCTGAACCAAACCTCCAGGTCCCTGGACCAAATCCCCGGATACCTGAAC 779 229 IleProGlyLeuLeuAsnGlnThrSerArgSerLeuAspGlnlleProGlyTyrLeuAsn 248 780 AGGATACACGAACTCTTGAATGGAACTCGTGGACTCTTTCCTGGACCCTCACGCAGGACC ^839 249 ArglleHisGluLeuLeuAsnGlyThrArgGlyLeuPheProGlyProSerArgArgThr 268 840' CTAGGAGCCCCGGACATTTCCTCAGGAACATCAGACACAGGCTCCCTGCCACCCAACCTC 899 269 LeuGlyAlaProAspIleSerSerGlyThrSerAspThrGlySerLeuProProAsnLeu 288 900 CAGCCTGGATATTCTCCTTCCCCAACCCATCCTCCTACTGGACAGTATACGCTCTTCCCT 959 289 GlnProGlyTyrSerProSerProThrHisProProThrGlyGlnTyrThrLeuPhePro 308 960 CTTCC^CCCACCTTGCCCACCCCTGTGGTCCAGCTCCACCCCCTGCTTCCTGACCCTTCT 1019 309 LeuProProThrLeuProThrProValValGlnLeuHisProLeuLeuProAspProSer_ 328 10 2 0 GCTCCAACGCCCACCCCTACCAGCCCTCTTCTAAACACATCCTACACCCACTCCCAGAAT 1079 329 AlaProThrProThrProThrSerProLeuLeuAsnThrSerTyrThrHisSerGlnAsn 348 0 9 0 0 0 0 8 4 4 0 6 2 0 3 12 2 3 r—I τ*—f rH 1—I τΉ CTGTCTCAGGAAGGGTMGGTTCTCAGACACTGCCGACATCAGCATTGTCTCGTGTACAG. 1139 LeuSerGlnGluGlyEnd - 353 CTCCCTTCCCTGCAGGGCGCCCCTGGGAGACAACTGGACAAGATTTCCTACTTTCTCCTG 1199 AAACCC AAAGCCCTGGTAAMGGGATACACAGGACTGAAAAGGGAATCATTTTTCACTGT 1259 ^CATTATAAACCTTCAGAAGCTATTTTTTTAAGCTATCAGCAATACTCATCAGAGCAGCT 1319 AGCTCTTTGGTCTATTTTCTGCA 1342 Λ 2 . 根據申請專利範圍第1項之單聚乙二醇化M G D F多肽，其 中該聚乙二醇基具有2至100千道耳頓的平均分子量； 3 . 根據申請專利範圍第1或2項之單聚乙二醇化MG DF多呔， 其中多眯部份ί糸已於大腸桿菌中生產者二 (請先Η讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央椟率局員工消費合作、社印m 本紙張尺度逋用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨OXM7公釐）
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