PL182567B1 - Polipeptyd stanowiący czynnik wzrostu i rozwoju megakaricytów-(polipeptyd MGDF), wyizolowany polinukleotyd kodujący ten polipeptyd, wektor DNA obejmujący ten polinukleotyd, komórka gospodarza transformowana lub transfekowana tym polinukleotydem oraz sposób produkcji polipeptydu MGDF - Google Patents

Abstract

-polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-195 przedstawio­ nych na rysunku fig 11, okreslany jako MGDF-2; - polipeptyd o sekwencj i aminokwasów 22-172 przedstawio­ nych na rysunku fig 11, okreslany jako MGDF-4; - polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-177 przedstawio­ nych na rysunku fig 11, okreslany jako MGDF-5, - polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-191 przedstawio­ nych na rysunku fig 11, okreslany jako MGDF-6, - polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-198 przedsta­ wionych na rysunku fig 11, okreslany jako MGDF-7 oraz - polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-265 przedstawio­ nych na rysunku fig 11, okreslany jako MGDF-8 2 Wyizolowany polinukleotyd kodujacy polipeptyd stano­ wiacy czynnik wzrostu i rozwoju megakariocytów - MGDF, wybra­ ny z grupy polipeptydów obejmujacej - polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-195 przedstawio­ nych na rysunku fig 11, okreslany jako MGDF-2, - polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-172 przedstawio­ nych na rysunku fig 11, okreslany jako MGDF-4, -polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-177 przedstawio­ nych na rysunku fig 11, okreslany jako MGDF-5, - polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-191 przedstawio­ nych na rysunku fig 11, okreslany jako MGDF-6, - polipeptyd o sekwencj i aminokwasów 22-198 przedstawio­ nych na rysunku fig 11, okreslany jako MGDF-7 oraz ... . FIG IIA PL PL PL PL PL PL PL

Description

Niniejszy wynalazek dotyczy protein - polipeptydów stanowiących czynnik wzrostu i rozwoju megakariocytów - MGDF, określanych w niniejszym tekście synonimowo jako ligandy Mpl lub MGDF, które stymulują wzrost megakariocytów i zwiększają różnicowanie lub dojrzewanie megakariocytów, z ostatecznym efektem w postaci wzrostu liczby płytek. Wynalazek dotyczy także otrzymywania protein w postaci jednorodnej ze źródeł naturalnych i wytwarzania ich rekombinacyjnymi technikami inżynierii genetycznej.

W niniejszym wynalazku są zaangażowane co najmniej dwie szerokie dziedziny badań. Pierwsza dotyczy rozwoju megakariocytów i następnie wytwarzania płytek, natomiast druga dotyczy członu polipetydowego rodziny receptora czynnika wzrostu, zwanego w niniejszym tekście receptorem Mpl - oraz jego ligandów. Każda z tych dziedzin badawczych zostanie obecnie omówiona w zarysie.

A. Tworzenie płytek z megakariocytów

Płytki krwi są cyrkulującymi komórkami, które odgrywają decydującą rolę w zapobieganiu krwawieniu i koagulacji krwi. Megakariocyty są komórkowym źródłem płytek i powstająz komórki prekursora zwykłego szpiku kostnego, z którego powstają wszystkie hemopoetyczne (tj krwiotwórcze) linie komórkowe. Ta pospolita komórka prekursora znana jest jako komórka macierzysta ze zdolnością wielokierunkowego różnicowania się lub też PPSC.

Hierarchię komórek progenitora megakariocytowego określono w oparciu o czas pojawienia się oraz wielkość kolonii megakariocytów (MK) pojawiających się w układach hodowli in vitro w odpowiedzi na odpowiednie czynniki wzrostu. Najprymitywniejsząkomórkąprogenitora megakariocytowego jest megakariocyt jednostki tworzącej pęknięcie (ang: burst-forming unit; BFU-MK). Uważa się, że BFU-MK wytwarza się ostatecznie liczne megakariocyty jednostki tworzącej kolonię (CFU-MK), które są bardziej zróżnicowanymi komórkami progenitora MK.

W trakcie gdy komórki MK podlegająkolejnemu różnicowaniu, tracą one zdolność by podlegać mitozie, lecz nabywają zdolność do endoreduplikacji. Endoreduplikacja (lub endomitoza) jest zjawiskiem podziału jądrowego w komórkach w nieobecności podziału komórki. Endoreduplikacja ostatecznie dajew wyniku MK, który jest poliploidem. Dalsze dojrzewanie MKdaje w wyniku nabycie organelli cytoplazmowych i składników błony, które charakteryzują płytki.

Płytki są wytwarzane z dojrzałych MK przez słabo określony proces, co do którego zasugerowano, żejestkonsekwencjąfizycznej fragmentacji MKlub innych mechanizmów. Obserwacje rozległych struktur błonowych w obrębie megakariocytów doprowadziły do modelu tworzenia płytek, w którym układ błony demarkacji zarysowuje powstające płytki w obrębie substancji komórki. Inny model tworzenia płytek powstał na podstawie obserwacji, wedle których megakariocyty będą tworzyć długie wyrostki cytoplazmowe ograniczone przedziałami zależnymi od wymiaru płytek, z których płytki, jak można przypuszczać, wydostają się wskutek ciśnień przepływu krwi w szpiku i/lub w płucach. Te wyrostki cytoplazmowe zostały przez Beckera i De

182 567

Bruyna nazwane propłytkami, by uwypuklić ich zakładaną rolę prekursora w tworzeniu płytek. Zob. Becker i De Bruyn, Amer. J. Anat. 1345: 183 (1976).

Na załączonym rysunku fig. 1 przedstawia widok z góry różnych komórek prekursora związanych z rozwojem megakariocytów i płytek. Komórka skrajnie z lewej strony figury przedstawia PPSC, a dodatkowe komórki na prawo od PPSC przedstawiają BFU-MK, a po nim CFU-MK. Komórka podlegająca endoreduplikacji, umiejscowiona bezpośrednio na prawo od PPSC, jest dorosłą komórką megakariocytu. W wyniku endomitozy, komórka ta została poliploidem. Następna struktura na prawo obejmuje długie wyrostki cytoplazmowe wynurzające się z jądra poliploidu dojrzałej komórki megakariocytu. Skrajnie z prawej strony figury pokazano pewną liczbę płytek wytworzonych przez fragmentację wyrostków cytoplazmowych.

Poniżej podsumowano pewne publikacje ze stanu techniki dotyczące powyższego opisu dojrzewania megakariocytów i wytwarzania płytek:

1. Williams, N., Levine, R. F., British Journal of Haematology 52: 173-180 (1982).

2. Levin, J., Molecular Biology and Differentiation of Megakaryocytes, publ. Wiley-Liss, Inc. 1-10(1990).

3. Gewirtz, A.M., The Biology of Haematopoesis, publ. Wiley-Liss, Inc.. 123-132 (1990).

4. Han, Z.C., et al., Int. J. Hematol. 54: 3-14 (1991).

5. Nieuwenhuis, H.K., Sixma, J., New Eng. J. ofMed. 327: 1812 1813 (1912).

6. Long, M., Stern Cells 11:33-40 (1993).

B. Regulacja tworzenia płytek

Znaczna ilość danych uzyskanych w wielu laboratoriach wskazuje, że wytwarzanie płytek jest regulowane przez czynniki humoralne. Złożoności tego procesu biologicznego z początku nie doceniano i obecnie okazuje się, że czynniki wzrostu posiadają tę zdolność.

Regulacja megakariocytów odbywa się na wielu poziomach komórkowych. Pewna liczba cytokin poprawia wytwarzanie płytek przez rozszerzenie puli komórki progenitora. Druga grupa humoralnych czynników wzrostu służy jako czynnniki dojrzewania działające na bardziej zróżnicowane komórki, by promować endoreduplikację. Ponadto, okazuje się, że istnieją dwie niezależne pętle biosprzężenia zwrotnego regulujące te procesy.

Kilka niespecyficznych hemopoetycznych lineażowych czynników wzrostu wywiera ważny wpływ na dojrzewanie MK. Czynnik stymulowania kolonii granulocyt-makrofag (GMCSF), interleukina-2 (IL-3), IL-6, IL-11, czynnik inihibitujący leukemię (LIF) i erytropoetyna (EPO), każde indywiduwalnie sprzyjają dojrzewaniu ludzkiego MK, jak określono in vitro przez ich wpływ na wielkość, liczbę MK lub ploidów. Związany z dojrzewaniem MK wpływ LIF, IL-6 i IL-11 jest cząstkowo (LIF i IL-6) lub całkowicie (IL-11) addytywny do wpływu IL-3. Dane z publikacji według stanu techniki sugerują że kombinacja cytokin może być niezbędna, by sprzyjać dojrzewaniu MK in vivo.

Poniżej podano pewne publikacje ze stanu techniki odnoszące się do regulacji wytwarzania megakariocytów i płytek:

7. Hoffman, R. et al., Blood Cells 13: 75-86 (1987)

8. Murphy, M.J., Hematology/Oncology Clinics of North America 3 (3): 465-478 (1988).

9. Hoffman, R., Blood 74 (4): 1196-1212 (1989).

10. Mazur, E.M., Cohen, J. L., Clin. Pharmacol. Ther., 46 (3): 250-256 (1989).

11. Gewirtz, A.M., Calabretta, B., Int. J. Celi Cloning 8: 267-276 (1990).

12. Williams, N., Progress in Growth Factor Research 2: 81-95 (1990).

13. Gordon, M.S. i Hoffman, R., Blood 80 (2): 301-307 (1992).

14. Hunt, P. et al., Exp. Hematol. 21: 372-281 (1993).

15. Hunt, P. et al., Exp. Hematol. 21: 1295-1304 (1993).

Podawano również (zob. odsyłacz 16), że aplastyczna surowica ludzka zawiera kolonię megakariocytów stymulującą aktywność różną od IL-3, czynnika stymulującego kolonię granulocytów, i czynników obecnych w ośrodku uwarunkowanym limfocytami. Jednak cząsteczki odpowiedzialnej za tę aktywność nigdy nie wyodrębniono ani nie scharakteryzowano.

16. Mazur, E.M., et al., Blood: 290-297 (1990)

182 567

C. Receptor Mpl

Wirus mieloproliferacyjny leukemii (MPLV) jest mysim retrowirusem o niepełnej replikacji, powodującym ostrą leukemię u zakażonych ssaków. Odkryto, że gen ekspresjonowany przez MPLV składa się z części genu kodującej otoczkę retrowirusową(lub zewnętrzną otoczkę proteinową) wirusa złączonąz sekwencjąpokrewnąrodzinie receptora cytokinowego, włączając w to receptory dla GM-CSF, G-CSF i EPO.

Ekspresja genu MPLV opisanego powyżej ma interesującą właściwość biologiczną powodowania, by mysie komórki progenitora różnych typów bezpośrednio zyskiwały niezależność czynnika wzrostu zarówno proliferacji, jak i końcowego dojrzewania. Ponadto, pewne hodowle komórek szpiku kostnego ostro transformowane przez MPLV zawierały megakariocyty, co sugerowałoby związek miedzy genem MPLV a wzrostem i różnicowaniem megakariocytu.

Obecnie uznano, że gen wirusowy MPLV (nazywany v-Mpl) ma homolog w komórkach ssaków, nazywany genem komórkowego Mpl (lub też c-Mpl). cDNA odpowiadające ludzkiemu genowi c-Mpl sklonowano przy użyciu sond pochodzących z v-Mpl. Porównaj publikację zgłoszenia PCT nr WO 92/07074 (opublikowane 30 kwietnia 1992; omawiane poniżej). Analiza sekwencyjna pokazała, że proteina zakodowana przez produkt genu c-Mpl należy do superrodziny wysoce zachowanego receptora cytokinowego, podobnie do homologicznego produktu genu v-Mpl.

Uważa się, że ten gen komórkowy, c-Mpl, odgrywa rolę czynnościową w hemopoezie, co jest oparte na obserwacji, że jego ekspresję stwierdzono w szpiku kostnym, śledzionie i wątrobie płodu u normalnych myszy przez zabezpieczenie sondy RNAzy i doświadczenia RT-PCR, lecz nie stwierdzono jej w innych tkankach. W szczególności, c-Mpl jest ekspresjonowany na megakariocytach. Pokazano również, że gen komórki ludzkiej, ludzki c-Mpl, jest ekspresjonowany w komórkach pozytywnych CD34, w tym w oczyszczonych megakariocytach i płytkach. CD34 jest antygenem wskazującym na komórki progenitora wczesnej homopoezy. Ponadto, wystawienie komórek pozytywnych CD34 na syntetyczne oligodeoksynukleotydy antysensowne względem c-Mpl mRNA lub informacji znacząco inhibituje zdolność tworzenia kolonii progenitorów megakariocytów CFU-MK, lecz nie ma wpływu na progenitory erytroidu lub granulomakrofagu.

Powyższe dane i obserwacje sugerują, że c-Mpl koduje cząsteczkę powierzchni komórki, nazywaną w niniejszym tekście receptorem Mpl, która wiąże się ligandem, aktywującym receptor, potencjalnie prowadząc do wytwarzania i/lub rozwoju megakariocytów.

Publikacja zgłoszenia PCT nr WO 92/07074 jest ukierunkowana na sekwencję proteiny wytwarzaną przez gen c-Mpl, zarówno z organizmu człowieka jak i myszy. Ten produkt genu, o którym uważa się, że jest receptorem, jak objaśniono powyżej, składa się z co najmniej trzech zasadniczych obszarów lub domen: domeny zewnątrzkomórkowej, domeny śródbłonowej oraz domeny wewnątrzkomórkowej (lub cytoplazmatycznej). Te domeny połączone razem tworzą cały receptor Mpl. Wspomniana publikacja PCT dotyczy również rozpuszczalnej formy receptora, która zasadniczo odpowiada zewnątrzkomórkowej domenie dojrzałej proteiny c-Mpl. Wewnątrzkomórkowa domena zawiera obszar hydrofobowy, który w przypadku dołączenia przez śródbłonowy obszar do zewnątrzkomórkowej domeny proteiny, powoduje, że cała proteina podlega agregacji i staje się nierozpuszczalna. Z drugiej strony, gdy zewnątrzkomórkowa domena produktu genu c-Mpl jest oddzielona od domeny śródbłonowej i domeny wewnątrzkomórkowej, staje się rozpuszczalna, zatem zewnątrzkomórkowa forma proteiny jest nazywana „rozpuszczalną” formą receptora.

Poniżej podano zestawienie niektórych publikacji ze stanu techniki odnoszących się do powyższego opisu genów i receptorów v-Mpl i c-Mpl:

17. Wendling, F., et al., Leukemia 3 (7): 475-480 (1989)

18. Wendling, F., etal., Blood 73 (5): 1161-1167 (1989).

19. Souyri, M., et al., Celi 63: 1137-1147(1990).

20. Vigon, L, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5640-5644 (1992).

21. Skoda, R.C., et al., The EMBO Journal 12 (7): 2645-2653 (1993).

22. Ogawa, M., Blood 81 (11): 2844-2853 (1993).

23. Methia, N., et al., Blood 82 (5): 1395-1401 (1993).

182 567

23. Methia, N., etal., Blood 82 (5): 1395-1401 (1993).

24. Wendling, F., et al., Blood 80: 246a (1993).

D. Zapotrzebowanie na czynnik zdolny do stymulowania wytwarzania płytek

Ostatnio donoszono, że coraz częściej wykonuje się transfuzje płytek w ośrodkach medycznych w Ameryki Płn. Europy Zach, i Japonii Zob. Gordon, M.S. and Hoffman, R., Blood 80 (2): 302-307 (1992). Wydajesię, że wzrost wynika w znacznej mierze z postępów w technice medycznej i większego dostępu do takich technik, jak operacja na sercu oraz transplantacja szpiku kostnego, serca i wątroby. Intensyfikacja dawek jako sposób prowadzenia terapii chorych na raka i HIV-1 również przyczyniły się do wielkiego zapotrzebowania na dostarczanie płytek.

Użycie płytek niesie z sobą możliwość przeniesienia wielu przenoszonych przez krew chorób zakaźnych, jak też alloimmunizacji, to jest immunizacji antygenami allogenicznymi (pochodzącymi od genetycznie odmiennego osobnika tego samego gatunku). Ponadto, wytwarzanie oczyszczonych płytek jest kosztownym przedsięwzięciem, a zatem zwiększone stosowanie takich płytek podwyższa całkowicie koszty medyczne. Wskutek tego istnieje palące zapotrzebowanie na nowe i ulepszone metody wytwarzania płytek dla stosowania u ludzi.

Przykładowe dotychczasowe podejścia do ulepszania wytwarzania płytek opisanych w następujących pozycjach:

W opisie patentowym USA 5,032,396 podaje się, że interleukina-7 (IL-7) jest zdolna do stymulowania wytwarzania płytek. Interleukina-7 jest również znana jako limfopoetyna-1 i jest limfopoetycznym czynnikiem wzrostu zdolnym do stymulowania wzrostu progenitorów komórek B i T w szpiku kostnym. Opublikowane zgłoszenie PCT o numerze seryjnym 88/03747, zgłoszone 19paździemika 1988 i europejskie zgłoszenie patentowe numer 88309977.2, zgłoszone 24 października 1988 ujawniają wektory DNA i związane z tym procesy wytwarzania protein IL-7 ssaków techniką rekombinacyjnego DNA. Dane przedstawione w opisie patentowym USA pokazują, że IL-7 może zwiększyć cyrkulowanie płytek u myszy normalnych i subletalnie napromieniowanych.

Opis patentowy USA 5,087,448 ujawnia, że megakariocyty i płytki można stymulować do proliferacji u ssaków przez działanie na nie interleukiną-6. Rekombinacyjna ludzka interleukina-6 jest glikoproteiną o ciężarze cząsteczkowym 26000 i licznych działaniach biologicznych. Dane przedstawione w tym opisie patentowym pokazują, że IL-6 wpływa na zwiększanie kolonii megakariocytów in vitro.

Żaden z cytowanych wyżej opisów patentowych nic nie wspomina o Ugandach Mpl, o których mowa w niniejszym wynalazku.

Pomimo powyższych ujawnień, pozostaje paląca potrzeba nowych stymulatorów megakariocytów i/lub płytek u ssaków.

E. Stan techniki w odniesieniu do chemicznie modyfikowanego MGDF

Proteiny do stosowania w terapii są obecnie dostępne w odpowiednich formach i ilościach w znacznej mierze w wyniku postępów technik rekombinacyjnego DNA. Chemiczne pochodne takich protein mogą skutecznie blokować przed kontaktem fizycznym enzymu proteolitycznego z głównym łańcuchem samej proteiny i tym samym zapobiegać degradacji. Dodatkowe korzyści mogą obejmować, w pewnych okolicznościach, zwiększanie stabilności i czasu cyrkulacji terapeutycznej proteiny i zmniejszanie immunogenności. Jednak, należy zaznaczyć, że nie można przewidzieć wpływu modyfikacji konkretnej proteiny. Artykuł przeglądowy opisujący modyfikujący proteiny i fuzję protein: Francis, Focus on Growth Factors, 3: 4-10 (May 1992) (opublikowany: Mediscript, Mountview Court, Frien Bamet Lane, London N20 OLD, UK).

Glikol polietylenowy („PEG” lub „peg”) jest jednym z takich indywiduów chemicznych stosowanych w wytwarzaniu proteinowych produktów terapeutycznych. Np. Adagen^R, preparat pegylowanej deaminazy adenozynowej jest zatwierdzony w leczeniu poważnej choroby złożonego niedoboru odpornościowego; pegylowana dysmutaza nadtlenkowa jest w fazie badań klinicznych odnośnie leczenia urazu głowy; pegylowany alfa-interferon badano w fazie I badań klinicznych odnośnie leczenia wirusowego zapalenia wątroby; podano, że pegylowana glukoceramidaza i pegylowana hemoglobina są w badaniach przedklinicznych. W przypadku pewnych protein,

182 567 wykazano, że dołączenie glikolu polietylenowego chroni przed proteolizą, zob. Sada, et al.; J. Fermentation Bioengineering 71: 137-139 (1991), i są dostępne metody dołączenia pewnych reszt glikolu polietylenowego. Zob. opis patentowy USA nr 4,179,337, Davis et al., „NonImmunogenic Polypeptides” wydany 18 grudnia 1979; i opis patentowy USA nr 4,002,531, Royer, „Modyfying Enzymes with Polyethylene Glykol and Produced Thereby”, wydany 11 stycznia 1977. Odnośnie przeglądu zob.: Abuchowski et. al., w: Enzymes as Drugs (J.S. Holcerberg i J. Roberts, eds. pp. 367-383 (1981)).

Stosowano inne rozpuszczalne w wodzie polimery do modyfikacji protein, takie jak kopolimery glikolu etylenowego i glikolu propylenowego, karboksymetyloceluloza, dekstran, alkohol poliwinylowy, pirolidon poliwinylowy, poli-1,3-dioksolan, poli-1,3,6-trioksan, kopolimer etylenu i bezwodnika maleinowego oraz poliaminokwasy (homopolimery lub kopolimery losowe).

W przypadku glikolu polietylenowego, stosowano szereg sposobów dla przyłączenia cząsteczek glikolu polietylenowego do proteiny. W ogólnym przypadku, cząsteczki glikolu polietylenowego są dołączane do proteiny przez reaktywną grupę w proteinie. Do takiego przyłączenia są odpowiednie grupy amino, takie jak w resztach lizynowych lub na końcu N. Np. Royer (Patent USA nr 4,002,531, powyżej) podaje, że redukcyjne alkilowanie zastosowano do przyłączenia cząsteczki glikolu polietylenowego do enzymu. EP 0539167, opublikowany 28 kwietnia 1993, Wright, „Peg Imidates and Protein Derivates Thereof’ podaje, że peptydy i związki organiczne o wolnej grupie (wolnych grupach) amino są modyfikowane pochodną imidynowąPEG lub związanymi z tymi rozpuszczalnymi w wodzie polimerami organicznymi. Opis patentowy USA nr 4,904,584, Shaw, wydany 27 lutego 1990 dotyczy modyfikacji liczby reszt lizynowych w proteinach dla dołączenia cząsteczki glikolu polietylenowego przez reaktywne grupy amino.

Jedną z konkretnych terapeutycznych protein, którą chemicznie zmodyfikowano jest czynnik stymulowania kolonii granulocytów, „G-CSF.”; zob. europejskie opisy patentowe EP 0401 384, EP 0473,268, i EP 0335,423.

Innym przykładem jest pegylowana IL-6; zob. opis patentowy EP 0442 724, zatytułowany „Modified hIL-6”, (zob. współbieżne zgłoszenie patentowe USA nr seryjny 07/632,070) który ujawnia cząsteczki glikolu polietylenowego dodane do IL-6. Opis patentowy EP 0154316, opublikowany 11 września 1985, opisuje reakcję limfokiny z aldehydem glikolu polietylenowego.

Zdolność modyfikowania MGDF jest nieznana w stanie techniki, ponieważ podatność każdej konkretnej proteiny na modyfikację jest określona przez specyficzne parametry strukturalne tej proteiny. Ponadto, wpływ takiej modyfikacji na właściwości biologiczne każdej proteiny jest nieprzewidywalny według stanu techniki. Ze względu na wiele klinicznych zastosowań MGDF, jak wyłożono w niniejszym tekście, jest pożądany produkt w postaci pochodnej MGDF o zmienionych właściwościach. Takie cząsteczki mogą mieć zwiększony okres półtrawania i/lub aktywność in vivo, jak również inne właściwości.

Pegylowanie cząsteczki proteiny daje w ogólnym przypadku mieszaninę chemicznie zmodyfikowanych cząsteczek proteiny. Np. cząsteczki proteiny o pięciu resztach lizynowych i wolnej grupie amino na końcu N poddane reakcji według powyższych metod mogą dać w wyniku heterogenną mieszaninę, o sześciu resztach glikolu polietylenowego, częściowo pięciu, częściowo czterech, częściowo trzech, częściowo dwóch, częściowo jednym i częściowo zeru. Spośród cząsteczek o kilku takich resztach, reszty glikolu polietylenowego mogąnie być dołączone w tym samym miejscu w różnych cząsteczkach. Często będzie pożądane otrzymanie produktu homogennego zawierającego zasadniczo w każdym przypadku jedno lub małą liczbę (np. 2-3) zmodyfikowanych cząsteczek proteiny, różniących się liczbą i/lub umiejscowieniem reszt chemicznych, takich jak PEG. Niemniej, mieszaniny np. mono-, di i/lub tri-pegylowanych indywidów mogą być pożądane lub tolerowane dla danego wskazania terapeutycznego.

Zmienność mieszaniny od partii do partii byłaby niekorzystna przy opracowywaniu produktu terapeutycznego w postaci pegylowanej proteiny. Przy takim opracowywaniu, ważną rzeczą jest przewidywalność aktywności biologicznej. Np. wykazano, że w przypadku nieselektywnego sprzęgania dysmutazy nadtlenkowej z glikolem polietylenowym, kilka części zmody

182 567 fikowanego enzymu było zupełnie nieaktywnych (P. Mc Golff et al. Chem. Pharm. Buli. 36:3079-3091 (1988)). Zob. też: Rosę et al., Bioconjugate Chemistry 2: 154-159 (1991), który opisuje selektywne dołączenie karbohydrazydu grupy linkera do C-końcowej grupy karboksylowej substratu proteiny (insulina). Takiej przewidywalności nie ma, gdy terapeutyczna proteina różni się składem od partii do partii. Pewne z indywidów glikolu polietylenowego mogą nie być związane tak trwale w pewnych miejscach jak inne i to może spowodować, że takie reszty dysocjują od proteiny. Oczywiście, jeśli takie reszty są dołączone losowo i tym samym losowo dysocjują, farmakokinetyka terapeutycznej proteiny nie może być dokładnie przewidywalna.

Jest także wysoce pożądany produkt w postaci pochodnej MGDF, w której brak reszty łączącej resztę polimeru z cząsteczką MGDF. Problem związany z powyższymi metodami polega na tym, że wymagają one w typowym przypadku reszty łączącej między proteiną i cząsteczką glikolu polietylenowego. Te reszty łączące mogą być antygenowe, co jest także niekorzystne przy opracowywaniu terapeutycznej proteiny.

Metodę nie związaną z użyciem grupy wiążącej opisano w: Francis: et al., In: „Stability of protein pharmaceuticals in vivo pathways of degradation and strategies for protein stabilization” (Eds. Ahem., T., Manning, M.C.) Plenum, New York, 1991). Także: Delgado et al. „Couplin of PEG to Protein By Activation with Tresyl Chloride, Applications In Immunoaffinity Celi Preparation” w: Fisher et al., ed., Separations Using Aqueous Phase Systems, Applications In Celi Biology and Biotechnology, Plenum Press, N.Y., N.Y. 1989, str. 211-213 dotyczy zastosowania chlorku tresylu, co daje w wyniku braku grupy łączącej między resztami glikolu polietylenowego i proteiny. Metoda ta może być trudna do zastosowania, by wytwarzać terapeutyczne produkty, ponieważ użycie chlorku tresylu może wytwarzać toksyczne produkty uboczne.

Chamów et al., Bioconjugate Chem. 5: 133-140 (1994) opisują modyfikację immunoadhezyny CD4 aldehydem glikolu monometoksypolietylenowego („glikol MePEG”) przez redukcyjne alkilowanie. Autorzy podają, że 50% CD4-Ig było zmodyfikowane mePEG przez selektywną reakcję przy grupie alfa-aminowej końca N.Id. na str. 137. Autorzy także podają, że zdolność wiązania in vitro zmodyfikowanego CD4-Ig (do proteiny gp 120) spadła w stopniu skorelowanym ze stopniem mepegylowania. Ibid.

Zatem istnieje zapotrzebowanie na pochodne MGDF, a zwłaszcza, zapotrzebowanie na pegylowane MGDF. Istnieje także zapotrzebowanie na metody otrzymywania takich pochodnych.

Celem obecnego wynalazku jest opracowanie rozwiązania zaspakajającego to zapotrzebowanie.

Cel wynalazku zrealizowano dzięki opracowaniu rozwiązania według wynalazku.

Wynalazek obejmuje polipeptyd stanowiący czynnik wzrostu i rozwoju megakariocytów MGDF, wybrany z grupy polipeptydów obejmującej:

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-195 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-2;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-172 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-4;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-177 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-5;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-191 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-6;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-198 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-7 oraz

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-265 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-8.

Wynalazek obejmuje również wyizolowany polinukleotyd kodujący polipeptyd stanowiący czynnik wzrostu i rozwoju megakariocytów - MGDF, wybrany z grupy polipeptydów obejmującej:

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-195 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-2;

182 567

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-172 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-4;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-177 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-5;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-191 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-6;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-198 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-7 oraz

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-265 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-8.

Korzystnie, wyizolowany polinukleotyd jest sekwencjąDNA, a najkorzystniej sekwencją DNA jest sekwencja cDNA.

Korzystna sekwencja cDNA odpowiada sekwencji przedstawionej na rysunku fig. 11 lub 12.

Wynalazek obejmuje także wektor DNA obejmujący wyizolowany polinukleotyd kodujący polipeptyd stanowiący czynnik wzrostu i rozwoju megakariocytów - MGDF, wybrany z grupy polipeptydów obejmującej:

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-195 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-2;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-172 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-4;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-177 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-5;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-191 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-6;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-198 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-7 oraz

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-265 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-8, stanowiący sekwencję DNA, będącą sekwencją cDNA.

Korzystnie wektor DNA ma sekwencję DNA jest operacyjnie związanąz sekwencjąDNA zdolną do kierowania ekspresją.

Wynalazek dotyczy również komórki gospodarza trwale transformowaną lub transfekowaną wyizolowanym polinukleotydem kodującym polipeptyd stanowiący czynnik wzrostu i rozwoju megakariocytów - MGDF, wybrany z grupy polipeptydów obejmującej:

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-195 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-2;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-172 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-4;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-177 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-5;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-191 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-6;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-198 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-7 oraz

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-265 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-8, stanowiącym sekwencję DNA, będącąsekwencjącDNA.

Korzystna komórka gospodarza według wynalazku ma zdolność ekspresji polipeptydu MGDF kodowanego wskazaną sekwencją DNA.

Wynalazek obejmuje też sposób produkcji polipeptydu stanowiącego czynnik wzrostu i rozwoju megakariocytów - MGDF, wybranego z grupy polipeptydów obejmującej:

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-195 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-2;

182 567

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-172 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-4;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-177 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-5;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-191 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-6;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-198 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-7 oraz

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-265 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-8, w którym prowadzi się hodowlę komórki gospodarza w odpowiedniej pożywce, a następnie izoluje się wytworzony związek z tej komórki lub z pożywki, cechujący się tym, że prowadzi się hodowlę komórki gospodarza trwale transformowanej lub transfekowanej wyizolowanym polinukleotydem kodującym polipeptyd stanowiący czynnik wzrostu i rozwoju megakariocytów - MGDF, wybrany z grupy polipeptydów obejmującej:

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-195 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-2;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-172 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-4;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-177 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-5;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-191 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-6;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-198 przedstawionych ha rysunku fig. 11, określany jako MGDF-7 oraz

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-265 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-8, stanowiącym sekwencję DNA, będącą sekwencją cDNA mającej zdolność ekspresji polipetydu MGDF kodowanego wskazaną sekwencją DNA, a następnie izoluje się wskazany polipeptyd MGDF z tej komórki lub tej pożywki.

W sposobie według wynalazku, jako komórkę gospodarza korzystnie stosuje się komórkę E. coli lub komórkę jajnika chomika - CHO.

Pochodne polipetydu stanowiącego czynnik wzrostu i rozwoju megakariocytów MGDF, są przedmiotem zgłoszenia nr P-345107 z dnia 30.03.1995 r.

Nadmienić należy, że znanymi sposobami otrzymać można przeciwciało ukierunkowane na (tzn. reaktywne z) polipeptyd stanowiący czynnik wzrostu i rozwoju megakariocytów - MGDF według wynalazku, korzystnie - przeciwciało monoklonalne bądź rekombinantowe.

Jak wskazano wyżej, niniejszy wynalazek dostarcza nowe polipetydy, które specyficznie sprzyjają wzrostowi i/lub rozwojowi megakariocytów („Ligandy Mpl” lub „MGDFs”), które są zasadniczo pozbawione (tzn, wyodrębnione od) innych protein (tzn. protein z organizmu ssaków w przypadku ligandu Mpl otrzymanego z organizmu ssaków). Takie proteiny mogą być wyodrębnione ze źródeł komórkowych wytwarzających czynniki naturalnie lub po indukcji innymi czynnikami. Można je także wytwarzać rekombinacyjnymi technikami inżynierii genetycznej. Ligandy Mpl można ponadto syntetyzować technikami chemicznymi lub przez kombinację wyżej wymienionych technik.

Ligandy Mpl według niniejszego wynalazku można otrzymać w ich formie rodzimej z organizmu ssaków. Dwa przykładowe ligandy Mpl wyodrębnione z aplastycznego osocza psa opisano w sekcji przykładów niniejszego tekstu. Jednak, w innych przykładach w niniejszym tekście pokazano, że blisko spokrewnione ligandy Mpl są obecne w osoczu aplastycznym zarówno z organizmu człowieka jak i świni. Zwłaszcza aktywność każdego z ligandów Mpl (z organizmu człowieka, świni i psa) jest specyficznie inhibitowalna przez rozpuszczalną formę receptora Mpl z organizmu myszy, pokazując, że wszystkie z tych ligandów Mpl (jak również te z innych organiz

182 567 mów ssaków, w tym myszy) są ściśle spokrewnione zarówno na poziomie strukturalnym, jak i aktywności.

Można się spodziewać, że ligandy Mpl z organizmu człowieka, świni i innych ssaków da się wyodrębnić ze źródeł naturalnych według procedur zasadniczo takichjak wyszczególnione w nieniejszym tekście. Porównaj przykład X. Zgodnie z tym, niniejszy wynalazek w ogólnym przypadku obejmuje ligandy Mpl z organizmu ssaków, takich jak z psów, świń, ludzi, myszy, koni, owiec i królików. Szczególnie korzystne są ligandy Mpl od psów, świń i człowieka.

Ponadto, geny kodujące ludzkie ligandy Mpl sklonowane z bibliotek nerek i wątroby płodu ludzkiego i sekwencjonowano, jak wyłożono z sekcji przykładów poniżej. Określono, że dwie ludzkie sekwencje polipeptydowe wykazują aktywność w próbie opartej na komórce (porównaj przykład IV). Sekwencje te różnią się co do długości, lecz są identyczne na dużym odcinku ich sekwencji aminokwasów. Części identyczne wykazują homologię do erytropoetyny. Ligandy Mpl są także w niniejszym tekście określane jako czynniki wzrostu i rozwoju megakariocytów (MGDF); wszystkie ogólne odniesienia do ligandów Mpl powinny stosować się do nazywanych w niniejszym tekście jako MGDF i vice versa. Przez „polipeptyd MGDF” rozumie się polipeptyd o aktywności specyficznego stymulowania lub inhibitowania wzrostu i/lub rozwoju megakariocytów. Przykładowe takie polipeptydy ujawniono w niniejszym tekście.

Stwierdzono, że ligandy Mpl według niniejszego wynalazku są specyficznie aktywne przy lineażu, zwiększeniu dojrzewania i/lub proliferacji megakariocytówJak pokazano w badaniach w przykładach U i IV poniżej. Przez „specyficznie” rozumie się, że polipeptydy wykazująaktywność biologiczną w stosunkowo większym stopniu wobec megakaricytów w porównaniu z innymi rodzajami komórek. Można się spodziewać, że te, które stymuluj ąmegakariocy ty, wykazują in vivo aktywność stymulowania wytwarzania płytek, przez stymulowanie dojrzewania i zróżnicowania megakariocytów.

Dwa korzystne ligandy Mpl z organizmu psa mająpozomy ciężar cząsteczkowy około 25 kd i 32 kdjak określono przez elektroforezę żelową (SDS-PAGE) przy użyciu siarczanu dodecylowosodowego i poliakryloamidu w warunkach nieredukujących. Obydwie proteiny oczyszczono według tego samego protokołu oczyszczania, który wyszczególniono w sekcji przykładów poniżej.

Dwa korzystne ludzkie ligandy, MGDF-1 i MGDF-2, majądługość 3321 174 aminokwasy, odpowiednio, nie włączając sygnałowego próbnego peptydu 21-aminokwasowego. Te sekwencje i trzecią spokrewnioną cząsteczkę, MGDF-3 przedstwiono na rysunku fig. 11 i 12.

Ponadto dalszym aspektem niniejszego wynalazku są procesy wyodrębniania i oczyszczania ligandów Mpl według niniejszego wynalazku lub ich fragmentów z organizmów ssaków, korzystnie całej krwi, surowicy lub osocza. Aplastyczna krew, surowica lub osocze są szczególnie korzystnymi materiałami wyjściowymi. Aplastycznąkrew, surowice lub osocze można otrzymać w procesie związanym z napromieniowaniem organizmu ssaka źródłem promieniowania, takim jak kobalt-60, przy poziomie promieniowania około 400-800 radów, tak by uczynić je aplastycznymi. Taki sposób postępowaniajest znany według stanu techniki Jak przytoczono w publikacji cytowanej w przykładzie I poniżej. W przypadku ludzi, napromieniowaną krew, osocze lub surowicę można otrzymać od pacjenta po leczeniu promieniowaniem, np. leczeniu raka.

Następnie, aplastyczna krew, surowica lub osocze są poddawane procesowi oczyszczania. Proces oczyszczania obejmuje następujące kluczowe procedury: chromatografia powinowactwa do lektyny i chromatografia powinowactwa do receptora Mpl. Każda z tych procedur daje w wyniku w przybliżeniu 300-500-krotne oczyszczenie protein 25 o 31 kd z aplastycznego osocza psa. Do powyższych procedur można włączyć inne standardowe procedury oczyszczania protein, by dalej oczyszczać ligandy Mpl według niniejszego wynalazku, takie jak procedury wyszczególnione poniżej.

Inny aspekt niniejszego wynalazku obejmuje polinukleotydy, kodujące ekspresję proteiny ligandu Mpl z organizmu ssaka. Takie sekwencje DNA mogą obejmować wyodrębnioną sekwencję DNA, która koduje ekspresję protein ligandu Mpl z organizmu ssaka Jak opisano w niniejszym tekście. Sekwencje DNA mogą także obejmować niekodujące sekwencje 5' i 3'z or

182 567 ganizmu ssaków ograniczające sekwencję kodującą ligand Mpl. Sekwencje DNA mogąponadto kodować sygnałowy peptyd o końcu amino. Takie sekwencje można wytworzyć dowolną znaną metodą włączając w to całkowitą lub częściową syntezę chemiczną. Kodony można optymalizować względem ekspresji w komórce gospodarza wybranej do ekspresji (np. E. coli lub w komórkach jajnika chomika - CHO).

Jak już wzmiankowano, niniejszy wynalazek dostarcza również cząsteczki rekombinacyjnego DNA, z których każda obejmuje wektor DNA i sekwencję DNA kodującąligand Mpl z organizmu ssaka. Cząsteczki DNA dostarczają DNA ligandu Mpl w operacyjnym związku z regulacyjną sekwencją zdolną do kierowania replikacją i ekspresją ligandu Mpl w wybranej komórce gospodarza. Komórki gospodarza (np. komórki bakteryjne, ssaków, owadów, drożdży lub roślinne) transformowane takimi cząsteczkami DNA do stosowania przy eksprosjonowaniu proteiny rekombinacyjnego ligandu Mpl są także dostarczone przez niniejszy wynalazek.

Cząsteczki DNA i transformowane komórki według wynalazku są użyte w innym aspekcie, nowym procesie wytwarzania proteiny rekombinacyjnego ligandu Mpl ssaków lub jej fragmentów peptydowych. W tym procesie, linia komórkowa transformowana sekwencją DNA kodującą ekspresję proteiny ligandu Mpl lub jej fragmentu (lub cząsteczki rekombinacyjnego DNA jak opisano powyżej) w operacyjnym związku z odpowiednią, regulacyjną lub kontrolującą ekspresję, sekwencją zdolną do kontrolowania ekspresji proteiny jest hodowana w odpowiednich warunkach umożliwiających ekspresję rekombinacyjnego DNA. Ten zastrzegany obecnie proces może wykorzystywać pewną liczbę znanych komórek jako komórki gospodarza dla ekspresji proteiny. Obecnie korzystnymi liniami komórkowymi dla wytwarzania ligandu Mpl są linie komórkowe z organizmu ssaków (np., komórki jajnika chomika - CHO) i komórki bakteryjne (np., E. coli).

Dla wytwarzania ligandu Mpl przy użyciu E. coli, korzystne jest użycie reszt Met i Lys na końcu N proteiny poddawanej ekspresji, ponieważ wydajność produktu ekspresji jest w typowym przypadku wyższa. Szczególnie korzystnym produktem ekspresji jest ludzki MGDF Met-Lys o ogółem 165 aminokwasach, tzn. reszty Met-Lys przyłączone są do końca 1-163 MGDF (MGDF-11; aminokwasy 1 -163 z sekwencji SEQ ID NO: 25). Po oczyszczaniu produktu ekspresjonowanego w komórce bakteryjnej, takiej jakK coli, końcowe reszty Met-Lys można usunąć przez działanie enzymem, takim jak dipeptydaza (np. katepsyna C).

Ekspresjonowana proteina ligandu Mpl jest następnie zbierana z komórki gospodarza, lizatu komórki lub ośrodka hodowli za pomocą konwencjonalnych sposobów. Kondycjonowany ośrodek można przetwarzać za pomocą tych samych etapów oczyszczania lub innych modyfikacji stosowanych do wyodrębnienia liganduMpl z aplastycznego osocza (zob. przykład VII).

Według jeszcze innego aspektu niniejszego wynalazku, są dostarczone proteiny rekombinacyjnego ligandu Mpl. Te proteiny są zasadniczo pozbawione innych substancji z organizmów ssaków, zwłaszcza protein. Proteiny ligandu Mpl według niniejszego wynalazku cechują się także występowaniem jednego lub więcej spośród fizycznych, biochemicznych farmakologicznych działań opisanych w niniejszym tekście.

Zatem, ligandy Mpl według niniejszego wynalazku można zastosować (ewentualnie po zmodyfikowaniu chemicznym) w leczeniu anemii aplastycznych, np. by zwiększyć wytwarzanie płytek u pacjentów o upośledzonym wytwarzaniu płytek (takich jak chorzy na AIDS lub przechodzący chemoterapię nowotworu). Ligand Mpl można stosować do leczenia zaburzeń krwi, takich jak trombocytopenia. Ligand Mpl można stosować jako leczenie wspomagające u chorych, którym transplantuje się szpik kostny. Tacy chorzy mogą być ludźmi lub innymi ssakami. Można się spodziewać, że ligand Mpl z jednego gatunku jest także przydatny u innego gatunku.

Polipetyd stanowiący czynnik wzrostu i rozwoju megakariocytów według wynalazku znajduje zastosowanie w leczeniu wskazanych wyżej i innych stanów patologicznych wynikających z niedoboru płytek. Metody terapii mogą obejmować podawanie, równocześnie lub następczo ligandu Mpl, skutecznej ilości co najmniej jednego innego czynnika stymulującego

182 567 kolonię megakariocytów, cytokin (np. EPO), rozpuszczalnego receptora Mpl, hemopoetyny, interleukiny, czynnika wzrostu lub przeciwciała.

Możliwe jest przeprowadzenie próby płynu ustrojowego na obecność ligandu Mpl. Taka próba wymaga stosowania przeciwciał, które specyficznie rozpoznają ligand Mpl, w formacie pojedynczego przeciwciała lub „sandwicha”. Taką próbę można by zastosować do określenia, czy chory potrzebuje zewnętrznego podawania ligandu Mpl i/lub czy taki chory prawdopodobnie cierpi na niedobór lub zaburzenie dotyczące płytek. Możliwe jest przygotowanie zestawu do prób, obejmującego kontrolę pozytywnąi negatywną, przeciwciało (przeciwciała) i inne standardowe składniki zestawu.

Inne korzyści wynikające z niniejszego wynalazku będą widoczne po rozważeniu następującego szczegółowego opisu jego korzystnych wykonań.

Liczne cechy i zalety obecnego wynalazku staną się zrozumiałe po zapoznaniu się z rysunkami na których:

Figura 1 przedstawia ogólny schemat tworzenia i dojrzewania megakariocytów oraz płytek.

Figura 2 wykazuje, że rozpuszczalny mysi receptor Mpl niemal całkowicie inhibituje zdolność plazmy napromieniowanego psa („aplastyczna psia plazma” lub „APK9”) do indukowania rozwoju megakaricytów. Próbę na tworzenie megakariocytów opisano w przykładzie II.

Figura 3 pokazuje, że zwiększona aktywność z APK9 w procedurach chromatograficznych („ligandy Mpl”) przez pokrewieństwo lektyn i mysiego receptora Mpl stymuluje wzrost komórek 1A6.1 oraz że rozpuszczalny mysi receptor Mpl blokuje ten wzrost.

Figura 4 ukazuje ogólny schemat procesu oczyszczania dotyczący oczyszczania form 25 kd i 31 kd psiego receptora Mpl z aplastycznej psiej plazmy.

Figura 5 demonstruje oczyszczanie ligandu Mpl metodą HPLC z odwróconą fazą (RP-HPLC). Frakcja 21 zawiera w wysokim stopniu oczyszczony ligand Mpl 31 kd, frakcja 22 zawiera mieszaninę ligandówMpl 31 kd i 25 kd; a frakcja 23 zawiera wysoce oczyszczony ligand Mpl 25 kd.

Figura 6 porównuje aktywność ligandu Mpl we frakcjach zawierających białka ligandów 25 i/lub 31 kd metodą HPLC z fazą odwróconą (kolumna C4).

Figura 7 przedstawia liczbę megakariocytów pochodzących z hodowli wyselekcjonowanych komórek CD34 z krwi obwodowej stymulowanej APK9, ligandem Mpl i różnymi innymi czynnikami.

Figura 8 przedstawia całkowitą liczbę leukocytów otrzymywanych z hodowli wyselekcjonowanych CD34 komórek z krwi obwodowej stymulowanej APK9, ligandem Mpl i różnymi innymi czynnikami.

Figura 9 przedstawia procent megakariocytów otrzymywanych z hodowli wyselekcjonowanych CD34 komórek z krwi obwodowej stymulowanej APK9, ligandem Mpl i różnymi innymi czynnikami.

Figura 10 wykazuje, że ludzka IL-3 nie jest zaangażowana w tworzenie i rozwój megakariocytów indukowanych przez ligandy Mpl.

Figura 11 przedstawia cDNA i przypuszczalną sekwencję aminokwasową ludzkiego MGDF-1 orazMGDF-2.

Figura 12 przedstawia cDNA i przypuszczalną sekwencję aminokwasową ludzkiego MGDF-3.

Figura 13 przedstawia porównanie pomiędzy MGDF-1 a innymi MGDF (ligandy Mpl) pochodzącymi od psa (A) i od myszy (B).

Figura 14 obrazuje liczbę płytek mysich traktowanych rekombinantowym MGDF pochodzenia ludzkiego: kwadraty = pochodne CHO 22-353 MGDF; kółka = niepegylowane 22-184 MGDF wytworzone przezE. coli (tj. 1-163 MGDF); i kropki = pegylowane 22-184 MGDF wytworzone przez E. coli.

Figura 15 przedstawia schematycznie proces oczyszczania dla r-HuMGDF.

Figura 16 przedstawia wpływ r-HuMGDF {E. coli 1-163) na liczbę płytek w przypadku mysiego modelu karboplatynowego. Balb/c mice były dootrzewnowo injektowane pojedynczą dawką karboplatyny (1,25 mg/mysz) w dniu zero. Grupa, której podano sam nośnik nie

182 567 otrzymała karboplatyny. Po upływie 24 godzin leczone karboplatyną zwierzęta otrzymywały podskórne injekcje albo z nośnikiem, albo z dawką 10 pg/kg r-HuMGDF na dzień, przez pozostałe dni prowadzenia badań. (n=10 dla każdej z grup; 5 zwierząt skrwawiano w każdym pomiarowym punkcie czasowym).

Figura 17 przedstawia wpływ r-HuMGDF (E. coli 1-163) na liczbę płytek u myszy poddanej napromieniowaniu. Myszy Balb/c naświetlano pojedynczą dawką 500 radów promieniowaniem gamma (źródło cezowe) w dniu zero. Grupa, której podawano sam nośnik nie była naświetlana. Po upływie 24 godzin napromieniowanym zwierzętom wstrzykiwano albo nośnik, albo dawkę 100 pg/kg r-HuMGDF na dzień, do końca okresu badań (n=8 dla każdej grupy); 4 zwierzęta skrwawiano w każdym pomiarowym punkcie czasowym).

Figura 18 przedstawia wpływ r-HuMGDF (E. coli 1-163) na liczbę płytek u myszy poddawanych jednoczesnemu napromieniowaniu i podawaniu karboplatyny. Myszy Balb/c były naświetlane pojedynczą dawką 500 radów promieniowania gamma (źródło cezowe) i otrzymały dawkę karboplatyny (1,25 mg/mysz) w dniu zero. Po upływie 24 godzin zwierzętom tak potraktowanym podskórnie wstrzykiwano albo nośnik, albo dawkę 100 pg/kg r-HuMGDF na dzień, do końca prowadzenia badań (n=8 dla każdej grupy). Bez wsparcia HuMGDF większość zwierząt nie przeżyło tych badań. W kontrolnej grupie przeżyło 1 zwierzę na 8. W grupie poddanej testowej, której podawano badany środek przeżyło 8 na 8 zwierząt.

Figura 19 przedstawia wpływ r-HuMGDF (E. coli 1-163) na indukowaną naświetlaniem trombocytopenię u małp rezusów. Małpy te poddano naświetlaniu (700 cGy Co-80). Następnie podawano podskórnie r-HuMGDF (n=3) bądź albuminy ludzkiego osocza (n=9) w dawce 25 pg/kg/dzień przez kolejne 18 dni począwszy od 24 godziny po napromieniowaniu. Analizę komórek krwi przeprowadzono w elektronicznym urządzeniu do analizy krwi. Każdy z symboli reprezentuje wartość średnią (+/-sem).

Figura 20 przedstawia sekwencję syntetycznego genu rekombinantowego ludzkiego MGDF, aminokwasy 1-163, zawierającego optymizowane kodony E. coli.

Dodatkowe aspekty i korzystne cechy wynalazku będą widoczne dla specjalistów, którym znany jest stan techniki, po rozważeniu następującego opisu wyszczególniającego praktykę wynalazku.

Nowe megakariocyty czynniki z organizmu ssaków sprzyjające wzrostowi, i/lub wytwarzaniu płytek, nazywane ligandami Mpl, dostarczone przez niniejszy wynalazek są homogennymi proteinami zasadniczo pozbawionymi asocjacji z innymi materiałami białkopodobnymi. Korzystnie, proteiny są w około 90% pozbawione innych protein, szczególnie korzystnie w około 95% pozbawione innych protein, a zwłaszcza w około> 98% pozbawione innych protein. Proteiny te można wytwarzać technikami rekombinacyjnymi umożliwiając wytwarzanie dużych ilości czystego aktywnego ligandu Mpl przydatnego do zastosowań terapeutycznych. Alternatywnie można takie proteiny otrzymać w postaci homogennej z aplastycznej krwi, osocza lub surowicy organizmu ssaków lub z linii komórkowej z organizmu ssaków wydzielającej lub ekspresjonującej ligand Mpl. Ponadto, ligand Mpl lub jego aktywne fragmenty można syntetyzować chemicznie.

Ogólnie, termin „ligandy Mpl” jak to się stosuje w przypadku niniejszego wynalazku oznacza ligandy Mpl ujawnione w niniejszym tekście, jak również ich aktywne fragmenty i odmiany, które opisano bardziej szczegółowo poniżej.

Dwa korzystne ligandy Mpl z organizmu psa mają pozorne ciężary cząsteczkowe w przybliżeniu 25 kd i 31 kd jak określono przez elektroforezę żelową z siarczanem dodecylowo-sodowym i poliakryloamidem (SDS-PAGE) w warunkach nieredukujących. Obie proteiny oczyszczono podczas tego samego protokołu oczyszczania, który wyszczególniono w sekcji przykładów poniżej. Zatem np. obydwa te ligandy Mpl wiążą lektynę kiełka pszenicy i immobilizowany receptor Mpl. Forma o 25 kd obejmuje następującą sekwencję aminokwasową:

Al-Pro-Pro-Ala-Xa-a-Asp-Pro-Arg-Leu-Leu-Leu-Asn-Lys-Met-LeuArg-Asp-Ser-His-Val-Leu-His-Xaa-Arg-Leu-Xaa-Gln-Xaa-ProAsp-Ile-Tyr (SEQ ID NO: 1).

182 567

Forma o 31 kd obejmuje następującą sekwencję aminokwasową:

Ala-Pro-Pro-Ala-Xaa-Asp-Pro-Arg-Leu-Asn-Lys-Met-LeuArg-Asp-Ser-His-Val-Leu-His (SEQ ID NO: 2).

Aminokwasy „Xaa” podane w SEQ ID NO : 1 i 2 nie są znane z pewnością lecz można się spodziewać, że jest to cysteina, seryna, treonina lub (mniej prawdopodobnie tryptofan.

Z powyższych sekwencji widać, ze ligand o 31 kd obejmuje co najmniej część formy o 25 kd. W szczególności, pierwsze 21 aminokwasów z proteiny o 31 kd są dokładnie takie same jak w przypadku proteiny o 25 kd. Ten fakt, a zwłaszcza to, że obydwie proteiny wykazują aktywność w próbach aktywności ligandu Mpl przedstawianych w niniejszym tekście, prowadzi do konkluzji, że obydwie proteiny sąbardzo ściśle pokrewne w kategoriach struktury i aktywności. Jest prawdopodobne, że forma proteiny o 31 kd różni się od formy o 25 kd różną sekwencjąkońca C, różną glikozylacją i/lub różnym cięciu i sklejaniu genu kodującego proteiny.

Oprócz powyższej informacji sekwencyjnej, podczas sekwencjonowania pasma 25 kd przed etapem końcowego oczyszczania (przy użyciu HPLC z odwróconymi fazami) określono jeszcze jedną sekwencję. Stwierdzono, że ta sekwencja była związana z pasmem 25 kd w warunkach nieredukujących lecz nie w redukujących, wskazując, że jest to wynikiem rozszczepienia na dwie części (np. przez proteazę) proteiny o 25 kd, której części są utrzymywane razem wiązaniem dwusiarczkowym. Sekwencja ta jest następująca:

Thr-Gln-Lys-Glu-Gln-Thr-Lys-Ala-Gln-Asp-Val-Leu-Gly-AlaVal-ALa-Leu (SEQ ID NO:3)

Chociaż dokładne umiejscowienie SEQ ID NO: 3 w sekwencji proteiny o 25 kd jest niejasne, analogia z innymi cytokinami, takimi jak erytropoetyny, potwierdza możliwość, że sekwencja występuje wokół aminokwasu numeru 114 w proteinie o 25 kd. Należy zaznaczyć, że jest prawdopodobne, choć nieudowodnione, że SEQ ID NO: 3 także występuje w proteinie o 31 kd, prawdopodobnie znów zaczynając się wokół aminokwasu numer 114. Ta informacja o sekwencji jest omawiana ponadto szczegółowo w przykładzie VII.

Od czasu początkowych doświadczeń z oczyszczaniem ligandów z organizmu psa, podsumowanych powyżej, sklonowano gen kodujący ligand z organizmu psa. W wyniku tego, określono sekwencję aminokwasową pełnej długości wspomnianego ligandu z organizmu psa i podano ją na rysunku fig. 13 A. Na podstawie obliczeń ciężaru cząsteczkowego, przewidziano, że ligandy z organizmu psa o 25 kd i 31 kd są C-końcowymi przetworzonymi postaciami ligandu o pełnej długości pokazanego na rysunku fig. 13A. Dodatkowo, otrzymano ligand Mpl z organizmu myszy o sekwencji podanej na fig. 13B.

Takie oczyszczone ligandy mogą także być scharakteryzowane przez specyficzną aktywność w próbie ludzkich megakariocytów z przykładu II co najmniej około 5,7 x 10⁹ jednostek megakariocytów/mg. Jednostka megakariocytu jest określona jako ilość materiału, która daje w wyniku wytwarzanie tylu megakariocytów jak w przypadku 1 mikrolitra standardowej próbki kontrolnej APK9 przy użyciu próby opisanej w przykładzie II.

Takie oczyszczone ligandy są także scharakteryzowane przez specyficzną aktywność w próbie wzrostu komórki zależnego od Mpl z przykładu IV co najmniej około 6,9 x 10⁹ jednostek wzrostu komórki/mg. „Jednostkę wzrostu komórki” określa się jako ilość ligandu wymaganą do uzyskania wzrostu 200 1 A6.1 komórek w próbie w przykładzie IV.

Następująca tabela 1 pokazuje dodatkowe konkretne obliczenia aktywności faktycznego oczyszczonego ligandu Mpl z organizmu psa wytworzonego zgodnie z niniejszym wynalazkiem:

Tabela 1

Ligand Mpl	Próbka 1A6.1 (jedn./mg)	Próbka ludzkiego Meg (jedn./mg)
31 kd 25 kd	6,52 x 109 10,5 x 10’	5,7 x 10’ 14 x 109

182 567

W podsumowaniu powyższych informacji, pewne przykładowe ligandy Mpl według niniejszego wynalazku są scharakteryzowane przez jedną lub więcej następujących właściwości biochemicznych i biologicznych:

(a) takie ligandy Mpl są wyodrębnione z aplastycznego osocza psa;

(b) takie ligandy mają pozorne ciężary cząsteczkowe w przybliżeniu 25 kd lub 31 kd jak określono przez elektroforezę żelową z 12-14% siarczanem dodecylowo-sodowym i poliakryloamidem (SDS-PAGE) w warunkach nieredukujących;

(c) ligandy Mpl obejmują następujące sekwencje aminokwasowe:

SEQ ID NO: 1, w przypadku proteiny o 25 kd; lub

SEQ ID NO: 2, w przypadku proteiny o 31 kd:

(d) ligandy Mpl dodatkowo obejmują sekwencję aminokwasowąSEQ ID NO: 3 (zwłaszcza korzystną w proteinie o 25 kd);

(e) ligandy Mpl wiążą się do lektyny kiełków pszenicy;

(f) ligandy Mpl wiążą się do immobilizowanego rozpuszczalnego receptora Mpl z organizmu myszy:

(g) aktywność ligandu Mpl można inhibitować in vitro za pomocą rozpuszczalnego receptora Mpl; i (h) ligandy Mpl wiążą się do kolumny anionowymiennej przy pH około 8-9.

Aktywność biologiczna korzystnych ligandów Mpl według niniejszego wynalazku jest wykazana przez ich zdolność do specyficznego stymulowania wzrostu i rozwoju mgakariocytów w próbie sprzyjania wzrostowi megakariocytów z przykładu Π. W tej próbie, ligand Mpl stymuluje różnicowanie ludzkich komórek krwi obwodowej CD34+ (tzn. komórek CD-34 wybranych przez immunoadsorpcję) podczas 8-dniowego okresu hodowli. Megakariocyty identyfikuje się przez barwienie przy użyciu specyficznych przeciwciał antygenów antypłytkowych i zlicza się je mikroskopowo. Ligand Mpl stymuluje także wzrost linii komórkowej zależnej od czynnika, 1A6.1. W nieobecności ligandu Mpl, komórki zginą. Liczba komórek 1A6.1 jest oceniana po 2 dniach w hodowli z ligandem Mpl.

Ligandy Mpl opisane wyżej mająspecyficznąaktywność jak opisano w tabeli 1 powyżej.

Określono, że źródłami ligandów Mpl są: aplastyczna krew, osocze lub surowica z organizmu ssaków. Jednak należy się spodziewać, że źródło takich ligandów nie jest ograniczone do takich znanych źródeł i może obejmować inne płyny ustrojowe z organizmu ssaków, komórki z nich otrzymane itp.

Oczyszczanie rodzimych ligandów Mpl z organizmu ssaków jest oparte na dwóch kluczowych etapach oczyszczania:

(a) lektyny, korzystnie przy użyciu aglutyniny z kiełków pszenicy; oraz (b) chromatografia powinowactwa immobilizowanego receptora Mpl.

Można włączyć dodatkowe etapy, by dalej oczyścić proteinę, takie jak chromatografia jonowymienna, chromatografia z filtracją żelową i chromatografia z odwróconymi fazami.

Techniki oczyszczania faktycznie zastosowane przy otrzymywaniu ligandu Mpl z aplastycznego osocza psa obejmują następujące etapy (porównaj przykład VII):

(a) chromatografia powinowactwa lektyny (zwłaszcza korzystna j est chromatografia aglutynina kiełków pszenicy);

(b) chromatografia powinowactwa rozpuszczalnego receptora Mpl (Mpl-X) (korzystnie, przy użyciu immobilizowanego Mpl-X z organizmu myszy);

(c) chromatografia jonowymienna (aniono- lub katiowymienna) (korzystnie, chromatografia jonowymienna; szczególnie przy użyciu kolumny Mono Q);

(d) chromatografia z filtracjążelowąw warunkach dysocjacji (korzystnie, przy użyciu Superdex 200 plus SDS); i (e) chromatografia z odwróconymi fazami (korzystnie, przy użyciu kolumny C-4).

Homogenny ligand Mpl z organizmu ssaków, w tym ligand z organizmu człowieka, można otrzymać przez zastosowanie powyższych procedur oczyszczania do aplastycznej krwi, surowicy lub osocza lub innych źródeł ligandu Mpl z organizmu ssaków, np. źródeł komórkowych lub

182 567 tkankowych. Nie jest wymagane, by te etapy były w konkretnej kolejności, lecz korzystna jest podana kolejność. Procedury prowadzenia hodowli źródła komórkowego (lub tkankowego), które można użyć do wytworzenia ligandu Mpl są znane specjalistom i można je zastosować np. do rozszerzenia zasobów materiału wyjściowego.

Ligand Mpl lub jeden, lub więcej z jego fragmentów peptydowych mogą także być wytwarzane technikami rekombinacyjnymi. Aby otrzymać sekwencję DNA dla konkretnego ligandu Mpl, oczyszczony materiał ligandu Mpl jest zredukowany ewentualnie wytrawiony proteazą, takąjak trypsyna. Fragmenty enzymatyczne są wyodrębnione i sekwencjonowane technikami konwencjonalnymi. Alternatywnie, jak podano w przykładach w niniejszym tekście, cała oczyszczona proteina może być sekwencjonowana bezpośrednio w możliwym stopniu w oparciu o ilość dostępnej proteiny, a następnie sekwencjonowany obszar może być analogicznie użyty do sekwencjonowanych fragmentów trypsynowych według następującej procedury. Sondy oligonukleotydowe są syntetyzowane przy użyciu kodu genetycznego, by przewidzieć wszystkie możliwe sekwencje kodujące sekwencje aminokwasowe sekwencjonowanych fragmentów (fragmentu). Korzystnie, kilka degenerowanych sekwencji tworzy się jako sondy. Gen ligandu Mpl jest identyfikowany przy użyciu tych sond przez skrining biblioteki genomowej organizmu ssaków lub innego źródła. Alternatywnie, mRNA ze źródła komórkowego ligand Mpl można użyć do wykonania biblioteki cDNA, która można skrinować sondami w celu zidentyfikowania cDNA kodującego polipeptyd ligandu Mpl. Ponadto, można użyć techniki PCR, by rozszerzyć sekwencję cDNA, przy użyciu odpowiednich primerów.

Przy użyciu tych sond do skrinowania biblioteki genomowej, otrzymano klon DNA. Aby otrzymać klon o pełnej długości, sondy oparte na otrzymanej sekwencji DNA można zastosować do powtórnego skriningu biblioteki i hybrydyzowania do pełnej długości sekwencji DNA ligandu Mpl.

Ludzki cDNA dla ligandu Mpl można otrzymać przez subklonowanie ludzkiego klonu genomowego o pełnej długości w wektor ekspresji, transfekując go do komórek COS, przygotowując bibliotekę cDNA z tych transfekowanych komórki COS i skrinując przez hybrydyzację do cDNA ligandu Mpl. Gdy cały cDNA jest zidentyfikowany, DNA lub jego dowolną część kodującą aktywny fragment Mpl można wprowadzić do dowolnego z całego szeregu wektorów ekspresji tworząc układ ekspresji dla ligandu Mpl lub jednego lub więcej jego fragmentów.

Takimi technikami rekombinacyjnymi otrzymuje się korzystne sekwencje DNA kodujące polipeptyd ligandu Mpl. Niniejszy wynalazek obejmuje także te sekwencje DNA, pozbawione asocjacji z sekwencjami DNA kodującymi inne proteiny (tzn. wyodrębnione) i kodowanie dla ekspresji polipeptydów ligandu Mpl o aktywności ligandu Mpl (np. wzrost i/lub rozwój megakariocytu). Te sekwencje DNA obejmują sekwencje kodujące cały lub fragment ligandu Mpl oraz sekwencje, które hybrydyzują korzystnie w „ścisłych” warunkach hybrydyzacji do sekwencji cDNA; [Zob., T. Maniatis et. al., Molecular Cloning (A Laboratory Manuał); Cold Spring Harbor Laboratory (1982), str. 387 do 389].

Przykładowe „ścisłe” warunki hybrydyzacji to hybrydyzacja w 9 X SSC w 62-67°C, a następnie przemywanie w 0.1 X SSC w 62-67°C przez w przybliżeniu godzinę. Alternatywnie, pizykładowe „ścisłe” warunki hybrydyzacji to hybrydyzacja w 45-55% formamidzie, 4 X SSC w 40-45°C.

Sekwencje DNA, które hybrydyzują do sekwencji dla ligandu Mpl w „zgładzonych” warunkach hybrydyzacji i które kodują peptydy ligandu Mpl o właściwościach biologicznych ligandu Mpl również kodują nowe polipeptydy ligandu Mpl według niniejszego wynalazku. Przykładami takich „złagodzonych” warunków hybrydyzacji są 4 X SSC w 45-55°C lub hybrydyzacja z 30-90% formamidem w 40-45°C. Np. sekwencja DNA, która ma obszary znaczącej homologii, np. miejsca glikozylowania lub połączeń disiarczkowych, z sekwencjami ligandu Mpl i koduje proteinę o jednej lub więcej biologicznych właściwościach ligandu Mpl wyraźnie koduje polipeptyd ligandu Mpl nawet, gdyby taka sekwencja DNA nie hybrydyzowała w warunkach „ścisłych” do sekwencji ligandu Mpl.

182 567

Allelowe odmiany (występujące naturalnie zmiany zasad w populacji gatunku, co może powodować zmiany aminokwasów lub może ich nie powodować) sekwencji DNA kodujących sekwencje peptydowe ligandu Mpl są także ujęte w niniejszym wynalazku, jak również ich analogi lub pochodne. Podobnie, sekwencje DNA, które kodują polipeptydy ligandu Mpl lecz różnią się użyciem kodonów wskutek degeneracji kodu genetycznego lub odmian w sekwencji DNA ligandu Mpl, które spowodowane mutacjami punktowymi wywoływanymi modyfikacjami, by zwiększyć aktywność, okres półtrwania lub produkcję polipeptydów zakodowanych przez niego są także objęte w niniejszym wynalazku.

Wykonano procedurę klonowania jak wyłożono w przykładzie XI poniżej i otrzymano aminokwas i sekwencje cDNA ludzkich protein MGDF-1, MGDF-2 i MGDF-3 ujawnione w niniejszym tekście. MGDF-1 pokazano jako aminokwasy 22-353 na rysunku fig. 11 i zawiera 332 aminokwasy. MGDF-2 jest uciętą częściąMGDF-1 i jest pokazany jako aminokwasy 22-195 na fig. 11. MGDF-2 zawiera zatem 174 aminokwasy. MGDF-3 jest pokazane jako aminokwasy 22-286 na fig. 12 i zawiera 265 aminokwasów. W każdym MGDF ujawnionym w niniejszym tekście, cząsteczka zawierająca peptyd sygnałowy, pokazana jako aminokwasy 1-21 na rysunku fig. 11 i 12 jest także częścią niniejszych innowacyjnych polipeptydów, lecz jest korzystnie usuwany dla wykazania aktywności wzrostu i rozwoju megakariocytów. W podsumowaniu, MGDF 1 -3 są określone jak następuje:

MGDF-1 aminokwasy 22-353 fig. 11

MGDF-2 aminokwasy 22-195 fig. 11

MGDF-3 aminokwasy 22-286 fig. 12.

W próbach przedstawionych w niniejszym tekście, MGDF-1 i MGDF-2 były aktywne podczas gdy MGDF-3 nie był.

W oparciu o dane aktywności przedstawione w niniejszym tekście, jest wysunięta hipoteza, że ludzki MGDF jest ekspresjonowany in vivo jako zasadniczy prekursor polipetydu nieaktywnego lub mniej aktywnego, który zawiera zmienne C-końcowe aminokwasy. Po rozszczepieniu C-końcowych aminokwasów (jak również peptydu sygnałowego), przetwarzana forma (formy) cząsteczki zachowuje aktywność lub staje się bardziej aktywna. Wskutek powyższej hipotezy, zakłada się że MGDF-1 może wymagać przetwarzania (np. rozszczepienie proteazą) aby uwidocznić jego aktywność. Fakt, że ucięta forma MGDF-1 (tzn. MGDF-2) jest aktywna podtrzymuje tę hipotezę.

Kondycjonowany ośrodek z 293 komórek ludzkiej nerki (Invitrogen) transfekowany genem MGDF-1 wykazuje aktywność w próbie komórkowej z przykładu IV poniżej. Z drugiej strony, w innych liniach komórkowych, np. 32 komórkach D nie stwierdzono aktywności dla tej cząsteczki. Wysuwa się hipotezę, że to może oznaczać, iż 293 komórki są zdolne do przetwarzania cząsteczki MGDF-1, przypuszczalnie przez obcięcie, tak że cząsteczka w pierwszym rzędzie odpowiedzialna za aktywność jest formą obciętą, podczas gdy 32 komórki D są niezdolne do przetwarzania cząsteczki.

Wskutek powyższej hipotezy, różne aktywne cząsteczki mogą wyniknąć z obcięć sekwencji wyłożonej jako MGDF-1 (fig. 11). Cechy strukturalne zachowane w rodzinie cytokin, takich jak erytropoetyny (EPO), obejmują cztery wiązki α-helikalne i cztery cysteiny. Odnosząc się do sekwencji MGDF-1, Cys 172 jest najbardziej C-końcowym elementem tych ewolucyjnie zachowanych i czynnościowo zasadniczych struktur. Zatem, korzystne warianty obcięcia MGDF-1 są dowolnymi spośród takich, które mają C-końcowe obcięcia z aminokwasów 173 do 353 (wraz z rozszczpieniem peptydu sygnałowego). Korzystnie, sekwencja MGDF-1 będzie usunięta z niego od 50 do 185 aminokwasów z końca C, szczególnie korzystnie od 90 do 172 aminokwasów od końca C. Jak ujawniono w niniejszym tekście, uważa się że peptyd sygnałowy ma długość 21 aminokwasów; jednak peptyd sygnałowy może mieć 23 aminokwasy, oparte na sekwencji MGDF-1. Zgodnie z tym, polipeptydy odpowiadające przedstawionym w niniejszym zgłoszeniu lecz takie, które startują w pozycji 24 z fig. 11 lub 12 są także specyficznie rozważane.

182 567

Poniżej podano pewne specyficzne korzystne warianty MGDF-1, które mogą wykazywać aktywność (tzn. zdolność do sprzyjania wzrostowi megakariocytów i/lub płytek; lub aktywność inhibitującą/stymulującą względem naturalnego receptora):

MGDF-4 aminokwasy 22-172 fig. 11

MGDF-5 aminokwasy 22-177 fig. 11

MGDF-6 aminokwasy 22-191 fig. 11

MGDF-7 aminokwasy 22-198 fig. 11

MGDF-8 aminokwasy 22-265 fig. 11

MGDF-11 aminokwasy 22-184 fig. 11

W pewnych klonach, aminokwasy 139-136 w sekwencji MGDF-1 były nieobecne, tak że sekwencje odpowiadające wyłożonym powyżej, lecz w których tych aminokwasów brakuje (i numer aminokwasu przy końcu C jest obniżony o 4) mogą być aktywne.

W jednym klonie, który miał kodon kończący w pozycji 192, znaleziono resztę Ala zamiast reszty Thr, jak pokazano w pozycji 191 na fig, 11.

MGDF-3 wynika z usunięcia sekwencji nazywanej w niniejszym tekście IVS-5 (sekwencji interweniującej 5) ponieważ ta sekwencja jest cięta i sklejana w ramach piątego egzonu w sekwencji. Ponieważ koniec 5' IVS-5 występuje w ramach kodonu jego usunięcie daje w wyniku przesunięcie ramy pozostałej sekwencji MGDF, co można stwierdzić począwszy od pozycji 160 MGDF-3 do końca cząsteczki.

Nie stwierdzono dotąd aktywności samego MGDF-3 po transfekcji do 293 komórek i badaniu uzyskanego kondycjonowanego ośrodka na aktywność w próbie opartej na komórce z przykładu IV. Widocznie, w przeciwieństwie do MGDF-1, 293 komórki są niezdolne do przetworzenia MGDF-3 w formę aktywną. Niemniej, opierając się na hipotezie obcięcia wyłożonej powyżej w związku z MGDF-1, obcięcia C-końcowych aminokwasów z MGDF-3 mogą także w rezultacie nadać aktywność. Np. C-końcowe obcięcia MGDF-3 od 40 do 102 aminokwasów mogą nadać aktywność.

Korzystnie, usuwa się od 50 do 90 aminokwasów. Dwa specyficzne korzystne warianty MGDF-2 są następujące:

MGDF-9 22-179 fig. 12

MGDF-10 22-190 fig. 12

We wszystkich ligandach Mpl ujawnionych w niniejszym zgłoszeniu, włączając w to przykładowe MGDF wyłożone powyżej, resztę metionylową można przedstawić na końcu N, zwłaszcza gdy takie polipetydy sąekspresjonowane w bakteryjnych komórkach gospodarza.

Polipeptydy ligandu Mpl można także wytwarzać znanymi konwencjonalnymi metodami syntezy chemicznej. Metody konstruowania polipetydów według niniejszego wynalazku na drodze syntetycznej są znane specjalistom według techniki. Syntetycznie skonstruowane sekwencje polipetydu ligandu Mpl, z racji wspólnych pierwszorzędowych, drugorzędowych lub trzeciorzędowych cech strukturalnych i konformacyjnych z polipetydami ligandu Mpl mogą mieć wspólne z nim biologiczne właściwości ligandu Mpl. Zatem, można je zastosować jako aktywne biologicznie lub immunologiczne substytuty w miejsce naturalnych, oczyszczonych polipetydów ligandu Mpl w procesach terapeutycznych i immunologicznych.

Modyfikacje w peptydach lub sekwencjach DNA kodujących ligand Mpl może wykonać specjalista z dziedziny techniki przy użyciu znanych technik. Rozpatrywane modyfikacje sekwencji ligandu Mpl mogą obejmować zamianę, wstawianie lub usuwanie wybranych reszt aminokwasowych kodowanych sekwencji. Technika mutagenezy przy takiej zamianie, wstawianiu lub usuwaniu sądobrze znane specjaliście według stanu techniki. [Zob. np., opis patentowy USA nr 4,518,584], Zachowawcze zmiany w od 1 do 20 aminokwasach są korzystne. Korzystne peptydy można wytworzyć przez enzymy proteolityczne lub bezpośrednią syntezę chemiczną. Takie warianty są ujęte w ramach znaczenia polipetydów i polinukleotydów ligandów Mpl według niniejszego wynalazku.

Specyficzne mutacje sekwencje polipetydu ligandu Mpl mogą wiązać się z modyfikacjami miejsca glikozylowania (np. seryny, treoniny lub asparaginy). Nieobecność glikozylowania lub

182 567 jedynie częściowe glikozylowanie wynika z podstawienia lub usuwania aminokwasu w dowolnym miejscu rozpoznawania glikozylowania połączonym z asparaginą lub w dowolnym miejscu cząsteczki zmodyfikowanym przez dodanie węglowodanu połączonego z O. Miejsce rozpoznawania glikozylowania połączone z asparaginą obejmuje trójpeptydową sekwencję, która jest specyficznie rozpoznawana przez odpowiednie komórkowe enzymy glikozylowania. Te sekwencje trójpeptydowe sąto: Asn-Xaa-Thr lub Asn-Xaa-Ser, gdzie Xaa może być dowolnym aminokwasem innym niż Pro. Różnorodność podstawień lub usuwań aminokwasów w jednej lub obydwu pozycjach pierwszego lub trzeciego aminokwasu w miejscu rozpoznawania glikozylowania (i/lub usuwania aminokwasu w drugiej pozycji) daje w wyniku nieglikozylowanie w zmodyfikowanej sekwencji trójpeptydowej. Ekspresja takich zmienionych sekwencji nukleotydowych wytwarza warianty, które nie są glikozylowane w tym miejscu.

Inne analogi i pochodne sekwencji MGDF (ligandów Mpl), które mogą zachować aktywność MGDF (ligand Mpl) w całości lub w części może także wytworzyć specjalista w dziedzinie techniki na podstawie niniejszych ujawnień.

W znaczeniu stosowanym w niniejszym zgłoszeniu, MGDF jest określone jako obejmujące dowolnąz różnych form MGDF opisanych w niniejszym zgłoszeniu. Np. objęte sąformy o pełnej długości lub obcięte, glikozylowane lub nieglikozylowane. Następujące cząsteczki MGDF korzystne do przeprowadzenia w pochodne ( w każdym przypadku numeracja odnosi się do aminokwasów numerowanych zgodnie z fig. 11):

MGDF-1 aminokwasy 22-353 fig. 11

MGDF-2 aminokwasy 22-195 fig. 11

MGDF-4 aminokwasy 22-172 fig. 11

MGDF-11 aminokwasy 22-184 fig. 11

MGDF-12 aminokwasy 22-353 fig. 11

MGDF-13 aminokwasy 27-195 fig. 11

MGDF-14 aminokwasy 22-172 fig. 11

MGDF-15 aminokwasy 22-184 fig. 11

Powyższe korzystne indywidua mogą być glikozylowane, nieglikozylowane lub deglikozylowane, korzystnie nieglikozylowane. Można je otrzymywać rekombinacyjnie w komórkach bakteryjnych (np. E. coli) lub ssaków (np. CHO).

Ponieważ są prowadzone dalsze badania nad leczniczym działaniem polipetydów według wynalazku pojawi się informacja na temat odpowiednich poziomów dawkowania w leczeniu różnych stanów u różnych chorych i typowy specjalista, rozważając kontekst terapeutyczny, wiek i ogólny stan zdrowia biorący, będzie w stanie ustalić właściwe dawkowanie. W ogólnym przypadku, dawka będzie wynosić między 0,01 pg/kg ciężaru ciała (obliczając masę samej proteiny, bez chemicznej modyfikacji) i 300 pg/kg (oparte na tym samym). Korzystna dawka wyniesie w ogólnym przypadku od 5 pg/kg ciężaru ciała do 100 pg/kg ciężaru, zwłaszcza od 10 pg/kg ciężaru ciała do 75 pg/kg ciężaru ciała.

Niniejszy wynalazek dostarcza także sposobu produkcji polipetydów lub ich aktywnych fragmentów MGDF (tzn. ligandu Mpl). Jedna metoda według niniejszego wynalazku wiąże się z wprowadzeniem cDNA kodującego polipeptyd ligandu Mpl do wektora ekspresji, by utworzyć układ ekspresji dla ligandu Mpl. Wybraną komórkę gospodarza transfekuje się wektorem i prowadzi hodowlę. Zatem sposób według wynalazku obejmuje hodowlę odpowiedniej komórki lub linii komórkowej, którą transfekowano sekwencją DNA kodującą na ekspresję dla polipeptydu ligandu Mpl pod kontrolą znanych sekwencji regulacyjnych. Sekwencje regulacyjne obejmuje fragmenty promotora, fragmenty terminatora i inne odpowiednie sekwencje, które kieruj ą/kontrolująekspresję proteiny w odpowiedniej komórce gospodarza. Następnie ekspresjonowany czynnik jest odzyskiwany, wyodrębniany i oczyszczany z ośrodka, w którym prowadzono hodowlę (lub z komórki, jeśli ekspresja odbywała się wewnątrzkomórkowo) odpowiednim sposobem znanym specjalistom zgodnie ze stanem techniki. Dodatkowo, metody ujawnione w opisie patentowym USA 5,272,071 są także rozważane jako stosowalne do innowacyjnych polinukleotydów/polipetydów.

182 567

Odpowiednie komórki lub linie komórkowe mogą pochodzić z organizmów ssaków, takie jak komórki jajnika chomika (CHO) lub mysie komórki 3T3 - stosowane typowo w laboratoriach do ekspresji rekombinacyjnego DNA. Wybór odpowiednich komórek gospodarza z organizmu ssaków i metody transformacji, hodowli, wzmacniania, skriningu oraz wytwarzania i oczyszczania produktu są znane w stanie techniki. Zob., np. Gething i Sambrook, Naturę 293: 620-625 (1981) lub alternatywnie, Kaufinan et al., Mol. Celi. Biol., 5 (7): 1750-1759 (1985) lub Howley et al., U.S. Pat. No. 9,919,446. Inne odpowiednie linie komórkowe z organizmów ssaków to małpie COS-1 i COS-7 oraz linia komórkowa CV-1. Dalsze przykładowe komórki gospodarza - pochodzące od ssaka obejmująlinie komórkowe naczelnych i linie komórkowe gryzoni, włączając w to transformowane linie komórkowe. Normalne komórki diploidalne, szczepy komórkowe otrzymane z hodowli tkanki pierwotnej in vitro, jak również jako pierwotne eksplanty, są także odpowiednie. Komórki będące kandydatami mogą genotypowo mieć deficyt genu selekcyjnego lub mogą zawierać działający dominująco gen selekcyjny. Inne odpowiednie linie komórkowe z organizmów ssaków obejmująlecz nie ograniczają się do HeLa, mysie komórki L-929, linie 3T3 uzyskane z myszy Swiss, Balb-c lub ΝΊΗ, linie komórkowe z chomika BHK lub HaK.

Podobnie przydatne jako komórki gospodarza odpowiednie w niniejszym wynalazku są komórki bakteryjne. Np. różne szczepy E. coli (np., HB101, DH5 alfa, DH10, i MC1061) są dobrze znane jako komórki gospodarza w dziedzinie biotechnologii. Różne szczepy B. subtilis, Pseudomonas spp., inne Bacillus spp., Streptomyces spp. i tym podobne można także użyć w tej metodzie.

Wiele szczepów komórek drożdży znanych specjalistom jest także dostępnych jako komórki gospodarza dla ekspresji polipeptydów według niniejszego wynalazku. Dodatkowo, o ile jest to pożądane, komórki owadów można wykorzystać jako komórki w sposobie według niniejszego wynalazku. Zob. np. Miller et al., Genetic Engineering 8:277-298 (1986) i odsyłacze tam cytowane.

Niniejszy wynalazek także zapewnia rekombinacyjne cząsteczki lub wektory do stosowania w metodzie ekspresji nowych polipeptydów ligandu Mpl. Te wektory zawierają sekwencje DNA ligandu Mpl i które same lub w połączeniu z innymi sekwencjami kodują polipeptydy ligandu Mpl (z lub bez peptydów sygnałowych) według wynalazku lub jego aktywne fragmenty. Alternatywnie, wektory włączające zmodyfikowane sekwencje jak opisano powyżej są również wykonaniami niniejszego wynalazku i są przydatne w wytwarzaniu polipeptydów ligandu Mpl. Wektor zastosowany w tym sposobie również zawiera wybrane sekwencje regulacyjne w funkcjonalnym powiązaniu z sekwencjami kodującymi DNA według wynalazku i zdolne do kierowania ich replikacją i ekspresją w wybranych komórkach gospodarza.

Jednym wektorem jest pXM, który jest szczególnie pożądany dla ekspresji w komórkach COS [Y.C. Yang et al., Celi 47:3-10 (1986)]. Innym wektorem, któiy jest pożądany dla ekspresji w komórkach z organizmu ssaków, np., komórkach CHO, jest pEMC2Bl. Wektory ekspresji z organizmów ssaków opisane w niniejszym tekście można zsyntetyzować technikami dobrze znanymi specjalistom z tej dziedziny techniki. Składniki wektorów, np. replikony, geny selekcyjne, enhancery, promotory i tym podobne można otrzymać ze źródeł naturalnych lub zsyntetyzować znanymi metodami. Zob., Kaufinan et al., J. Mol. Biol. 159: 511-521 (19B2); i Kaufman, Proc. NatL Acad. Sci. USA 82: 689-693 11985). Alternatywnie, wektor DNA mogą zawierać cały lub część genomu brodawczaka bydlęcego [Lusky etal., Celi 36:391-401 (1984)] i być replikowany w liniach komórkowych takich, jak komórki myszy C127, jako trwały element episomalny. Transfekcja tych wektorów do odpowiednich komórek gospodarza może spowodować ekspresję polipeptydów ligandu Mpl.

Inne odpowiednie wektory ekspresji, z których liczne są znane w stanie techniki do ekspresji w komórkach z organizmów ssaków, owadów, grzybów i bakterii - można również stosować do tego celu.

Stany jakie mogą być leczone polipeptydami według wynalazku są generalnie takie, z którymi wiąże się istniejący niedobór megakariocytów/płytek lub spodziewany w przyszłości niedobór megakariocytów/płytek (np. ze względu na planowaną operację). Takie warunki będą

182 567 zwykle wynikiem niedoboru (czasowego lub trwałego) aktywnego ligandu Mpl in vivo. Terminem ogólnym odnoszącym się do niedoboru płytek jest trombocytopenia, a zatem polipeptydy według wynalazku są generalnie przydatne do leczenia trombocytopenii.

Trombocytopenie (niedobory płytek) mogą występować z różnych powodów, włączając w chemoterapię i inną terapię szeregiem leków, terapię promieniowaniem, operacje, przypadkową utratę krwi i inne szczególne stany chorobowe. Przykładowe specyficzne stany chorobowe, które wiążąsię z trombocytopenią i mogą być leczone zgodnie z niniejszym wynalazkiem są: anemia aplastyczna, trombocytopenia idiopatyczna, guzy przerzutowe, które powodują trombocytopenię, ogólnoustrojowy liszaj rumieniowaty, splenomegalia, syndrom Fanconiego, niedobór witaminy BI2, niedobór kwasu foliowego, anomalia May-Hegglina, syndrom Wiskott-Aldricha i napadowa hemoglobinuria nocna. Także pewne terapie na AIDS powodują trombocytopenię (np. AZT). Zwiększenie liczby płytek może mieć korzystny wpływ na pewne zaburzenia związane z leczeniem ran.

Ze względu na spodziewane niedobory płytek, np. wskutek przyszłych operacji, ligand Mpl według niniejszego wynalazku mógłby być podawany na kilka dni do kilku godzin przed zapotrzebowaniem na płytki. Ze względu na ostre przypadki, np. utrata krwi w dużych ilościach i w wypadkach, ligand Mpl mógłby być podawany wraz z krwią lub oczyszczonymi płytkami.

Ligandy Mpl według niniejszego wynalazku mogą być także przydatne w stymulowaniu pewnych typów komórek innych niż megakariocyty, jeśli okazuje się, że takie komórki ekspresjonują receptor Mpl. Warunki związane z takimi komórkami, które dokonują ekspresji receptora Mpl, które odpowiadają na stymulację ze strony ligandu Mpl, również mieszczą się w ramach niniejszego wynalazku.

Cząsteczki MGDF, które same nie są aktywne w próbach aktywności przedstawionych w niniejszym opisie, mogą być przydatne, jako modulatory (np. inhibitory lub stymulatory) receptorów in vitro lub in vivo.

Polipeptydy według niniejszego wynalazku mogą być także zastosowane same lub w połączeniu z innymi cytokinami, rozpuszczalnym receptorem Mpl, czynnikami wzrostu lub przeciwciałami, w leczeniu wyżej zidentyfikowanych stanów.

Zatem, polipeptydy według wynalazku nadają się jako składnik aktywny terapeutycznych kompozycji do leczenia wyżej wymienionych stanów. Takie kompozycje obejmująterapeutycznie skuteczną ilość polipeptydu ligandu Mpl lub terapeutycznie skutecznego fragmentu tego polipetydu z dodatkiem farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika. Nośnikiem może być woda do iniekcji, korzystnie uzupełniona innymi materiałami występującymi zwykle w roztworach do podawania ssakom. W typowym przypadku, terapeutyczny ligand Mpl będzie podawany w formie kompozycji zawierającej oczyszczoną proteinę w połączeniu z jednym lub więcej fizjologicznie dopuszczalnymi nośnikami, zarobkami lub rozcieńczalnikami. Obojętny buforowany roztwór soli lub roztwór soli zmieszany z albuminą osocza są przykładowymi odpowiednimi nośnikami. Korzystnie, produkt jest formułowany jako liofilizat przy użyciu odpowiednich zarobek (np. sacharozy). O ile jest to pożądane, można włączyć inne standardowe nośniki, rozcieńczalniki i zarobki. Inne przykładowe kompozycje to bufor Tris, pH 8,0 i bufor octanowy, pH 5,0, które w każdym przypadku mogą ponadto zawierać sorbitol.

Powyższe kompozycje można ogólnoustrojowo podawać pozajelitowo. Alternatywnie, kompozycje te można podawać dożylnie lub podskórnie. W przypadku podania ogólnoustrojowego, kompozycje terapeutyczne mogą być w postaci apriogennego, dopuszczalnego pozajelitowo roztworu wodnego. Wytwarzanie takich farmaceutycznie dopuszczalnych roztworów protein ze względu na pH, izotoniczność, trwałość itp. mieści się w ramach możliwości biegłych w sztuce.

Schemat dawkowania związany z metodą leczenia wyżej opisanych stanów zostanie określony przez lekarza prowadzącego leczenie, przy uwzględnieniu różnych czynników, które modyfikują działanie leków, np. wiek, stan, ciężar ciała, płeć i dieta pacjenta, ostrość infekcji, czas podawania i inne czynniki kliniczne. W ogólnym przypadku, dawkowanie dzienne powinno mieścić się w zakresie od 0,1 do 1000 mikrogramów proteiny lub jej fragmentu na kilogram wagi ciała.

182 567

Metody terapeutyczne, oparte na zastosowaniu polipetydów według wynalazku mogą być także użyte, same lub w połączeniu z innymi cytokinami, rozpuszczalnym receptorem Mpl, czynnikami hemopoetycznymi, interleukinami, czynnikami wzrostu lub przeciwciała w leczeniu stanów chorobowych cechujących się innymi symptomami jak również niedoborami płytek. Można się spodziewać, że cząsteczka ligandu Mpl okaże się przydatna w leczeniu pewnych form trombocytopenii w połączeniu z ogólnymi stymulatorami hemopoezy, takimi jak IL-3 lub GM-CSF. Inne megakariocytowe czynniki stymulacji, tzn. meg-CSF, czynnik komórki macierzystej (SCF), czynnik inhibitowania leukemii (LIF), onkostatyna M (OSM) lub inne cząsteczki wykazujące aktywność stymulowania megakariocytów można także zastosować do ligandu Mpl. Dodatkowe przykładowe cytokiny lub czynniki hemopoetyczne dla takiego współpodawania obejmująIL-1 alfa, IL-1 beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, czynnik-1 stymulowania kolonii (C5F-1), GM-CSF, czynnik stymulowania kolonii granulocytów (C-CSF), EPO, interferon-alfa (INF-alfa), INF-beta lub INF-gamma. Ponadto może być przydatne podawanie równocześnie lub kolejno, skutecznej ilości rozpuszczalnego receptora Mpl z organizmu ssaków, który wydaje się mieć wpływ na to, by megakariocyty ulegały fragmentacji na płytki, gdy megakariocyty osiągnęły postać dojrzałą. Zatem podawanie ligandu Mpl (by zwiększyć liczbę dojrzałych megakariocytów), następnie podawanie rozpuszczalnego receptora Mpl (by deaktywować ligand i umożliwić, by dojrzałe megakariocyty wytwarzały płytki) wydaje się być szczególnie skutecznym sposobem stymulowania wytwarzania płytek. Wyżej podana dawka byłaby dopasowana, by skompensować takie dodatkowe składniki w kompozycji terapeutycznej. Postęp w leczeniu pacjenta można monitorować konwencjonalnymi metodami.

Inne zastosowania tych nowych polipeptydów polegają na opracowywaniu przeciwciał tworzonych standardowymi metodami. Przeciwciała można stosować terapeutycznie, by inhibitować wiązanie ligandu Mpl i jego receptora. Przeciwciała można ponadto stosować in vivo i in vitro do celów diagnostycznych, takich jak w postaci znaczonej, by wykryć obecność ligandu Mpl w płynie ustrojowym.

Następujące przykłady pełniej ilustrują wynalazek, a ponadto podaj ąkorzystne wykonania wynalazku. Nie należy ich rozumieć jako ograniczenia zakresu wynalazku, o ile nie wskazano inaczej. Standardowe metody dla wielu procedur opisane są w poniższych przykładach, a odpowiednie procedury alternatywne podane sąw powszechnie uznanych podręcznikach biologii molekularnej, takichjak np. Sambrook et al., Molecular Cloning, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1987) i w Ausubel et al., (Eds), Current Protocols in Molecular Biology, Greene associates/Wiley Interscience, New York (1990).

Pr zykład I. Aplastyczna psia plazma

Heparynizowaną aplastyczną psią plazmę („APK9”) lub normalną psią plazmę („NK9”) wytworzono jak opisano w następujących publikacjach, oprócz tego, że biorców poddano działaniu dawki 450 radów w celu całkowitego napromieniowania ciała:

1. Mazur, E., South, K., Exp. Hematol. 13:1164-1172 (1985).

2. Arriaga, M., South, K., Cohen, J.L., Mazur, E.M., Blood 69: 486-492 (1987).

3. Mazur, E., Basilici, D., Newton, J.L., Cohen, J.L., Charland, C., Sohl, P.A., Narendran, A. Blood 76: 1771-1782 (1990).

Przykład II. Doświadczenia z megakariocytami pochodzenia ludzkiego

APK9 i frakcjonowany APK9 poddano próbom na zdolność stymulowania rozwoju ludzkich megakariocytów z komórek progenitora CD34⁺. Wyselekcjonowane komórki CD34 otrzymywano z komórek krwi obwodowej, jak to opisano (Hokkom, M.H., Choi, E. Nichol, J.L., Homkohl, A., Arakawa, T., i Hunt, P. Molecular Biology of Haematopoiesis 3:15-31, 1994) i inkubowano w hodowli o następującym składzie: medium Iscove'a modyfikowane przez Dulbecco (IMDM; GIBCO, Grand Island, NY), z dodaniem 1% glutaminy Pen-strep (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) i 10% ubogiej w płytki, heparynizowanej, ludzkiej plazmy AB. Składnikami hodowli były również: 2-merkaptoetanol (ΙΟ*⁴ M), kwas pirogronowy (110 pg/ml), cholesterol (7,8 pg/ml), adenozyna, guanina, cytydyna, urydyna, tymidyna, 2-dezoksycytozyna, 2-dezoksyadenozyna, 2-dezoksyguanozyna (10 pg/ml każdej, Sigma); rekombinantowa ludzka

182 567 insulina (10 pg/ml), ludzka transferyna (300 pg/ml), tłuszcz z ziaren soi (1%, Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN); ludzki rekombinantowy podstawowy fibroblastowy czynnik wzrostu (2 ng/ml, Genzyme, Cambridge, MA); ludzki rekombinantowy naskórkowy czynnik wzrostu (15 ng/ml), czynnik wzrostu pochodzący z płytek (10 ng/ml, Amgen, Inc., Thousand Oaks, CA). Wyselekcjonowane komórki CD34 poddawano hodowli na płytkach w pożywce w stężeniu 2 x 10⁵/ml, 15 μΐ końcowej objętości, we wgłębieniach do skali mikro (microtiter plates) typu Terasaki (Yanguard, Inc., Neptune, NJ). Komórki poddawano inkubacji w temperaturze 37°C przez 8 dni w nasyconych wilgocią komorach, w atmosferze o zawartości 5% CO₂, zamocowanych bezpośrednio do wgłębień z hodowlami, za pomocą 1% glutaraldehydu i inkubowano z mieszaniną przeciwciał monoklonalnych (anty-GPIb, anty-GPIIb, (Biodesign) i anty-GPIb (Dako, Carpinteria, CA). Reakcję immunologiczną prowadzono w detekcyjnym układzie przy użyciu streptawidyno-p-galaktozydazy (Histomark, Kirkegaard and Perry). Megakariocyty, identyfikowane przez kolor niebieski, policzono stosując mikroskop z odwróconąfaząprzy 100-krotnym powiększeniu. Rezultaty prezentowano w postaci średniej liczby megakariocytów we wgłębieniu, ± standardowy błąd (SEM). W niektórych przypadkach dane były prezentowane w postaci Jednostki megakariocytów/ml”, gdzie stopień, w jakim dana próbka indukuje rozwój megakariocytów, była normalizowana w porównaniu z pozytywną kontrolą APK9 dla tego eksperymentu. Jedna jednostka została zdefiniowana jako ilość substancji, której działanie daje taką samą ilość megakariocytów jak 1 pl, standardowego APK9. Przyjęto, że za aktywność odpowiedzialny jest ligand MPL, jeśli możliwe było zablokowanie przy zastosowaniu 5-10 pg/ml MPL-X (rozpuszczalny receptor Mpl).

Wykazano, że APK9 zawiera czynnik(ki) stymulujące rozwój ludzkich megakariocytów w tym systemie. Wyselekcjonowane komórki CD34 inkubowane z 10% NK9 prze 8 dni wykazują pomijalną ilość niebiesko zabarwionych megakariocytów, podczas gdy wyselekcjonowane komórki CD34 inkubowane przez 8 dni z 10% APK9 wykazująbardzo dużąilość błękitnie zabarwionych megakariocytów.

Na rysunku fig. 2 pokazano, że wzrost stężenia Mpl-X dodawanego do hodowlanego medium ludzkich megakariocytów w sposób wzrastający powoduje blokowanie rozwoju megakariocytów. Przy stężeniu Mpl-X większym niż 5 pg/ml inhibitowanie jest całkowite. W tym doświadczeniu, wyselekcjonowane komórki CD34 stymulowano 5% APK9. Wskazuje to, że aktywność, która ma wpływ na Mpl-X (prawdopodobnie ligandy Mpl), jest niezbędna dla rozwoju ludzkich megakariocytów, oraz implikuje, że ligand Mpl jest obecny w APK9.

Jak zostało to dalej wykazane w niniejszym opisie, ligand Mpl, którego aktywność konieczna jest dla rozwoju ludzkich megakariocytów, jest obecny w APK9. 135 ml APK9 rozcieńczono 6-krotnie w medium hodowlanym Iscoyća i umieszczono w kolumnie sorpcyjnej Mpl-X. Niezwiązane substancje oddzielono (przeszły przez kolumnę) i zatężono do początkowej objętości przed doświadczeniem. Związany materiał eluowano w 10 ml IM NaCl, i 20% całości zdializowano i zatężono 4-krotnie do dalszych prób. Wyselekcjonowane komórki CD34 inkubowane w samych pożywkach nie były zdolne do rozwoju do megakariocytów. Komórki inkubowane w 5% APK9 (taka sama próbka jaką umieszczono w kolumnie) wytworzyły do 48 ± 8 megakariocytów na wgłębienie. Komórki inkubowane w 10% niezwiązanego materiału nie rozwinęły się do megakariocytów. Komórki inkubowane w 10% eluatu rozwinęły się do 120 ± 44 megakariocytów na wgłębienie. Aktywności w obu przypadkach, substancji wprowadzonych na kolumnę i eluatu, były zasadniczo całkowicie inhibitowane przy użyciu 5pg/ml Mpl-X w doświadczeniu.

Przykład III. Transfekowanie mysiego lub ludzkiego receptora Mpl do linii komórek mysich

A. Receptor Mpl z organizmu myszy

Pochodzący od myszy, pełnej długości, Mpl receptor cDNA subklonowano do wektora ekspresji zawierającego promotor transkrypcjonowany pochodzący z wirusa LTR Sarcoma myszy z rodziny Moloney. Następnie ko-elektroporowano 5 pg tej konstrukcji i i 1 pg wybieralnego markerowego plazmidu pWLNeo (Stratagene ) do mysiej linii komórkowej zależnej od IL-3 (32 D, klon 23; Greenberger i współpracownicy, PNAS 80:2931-2936 (1983)). Następnie

182 567 komórki poddawano hodowli przez 5 dni, przy czym inkubowano w selekcyjnym 800 pg/ml genecytyny (G418, Sigma) oraz 1 ng/ml pochodzącego od myszy IL-3. Komórki, które przeżyły ten zabieg podzielono na porcje zawierające po 2 χ 10⁵ komórek i hodowano do czasu rozrośnięcia się populacji, która mogłaby być dalej analizowana. Sześć populacji poddano badaniu na powierzchniową ekspresj ę receptora Mpl poprzez analizę FACS przy użyciu poliklonalnej antypeptydowej króliczej surowicy. Jedną populację wybrano do sortowania FACS przy użyciu tej samej, jak poprzednio antypeptydowej surowicy. Klony pojedynczo komórkowe z macierzystej linii komórkowej oddzielono przez wzrost w 10% APK9 i genetycynie. Po selekcji w APK9 przez 3 5 dni, komórki utrzymywano w 1 ng/ml pochodzącego od myszy IL-3. Jeden z subklonów, 1A6.1, użyto w ciągu tych badań.

B. Receptor Mpl pochodzenia ludzkiego

Receptor MP1 pochodzenia ludzkiego o sekwencji pełnej długości (Vigon, I. i współpracownicy, PNAS 89: 5640-5644 (1992)) subklonowano do wektora ekspresji zawierającego promotor transkrypcjonowany wirusa Sarcoma myszy z rodziny Moloney (Moloney Murine Sarcoma) (taki sam wektor jak w przypadku mysiego receptora). Sześć mikrogramów takiego fragmentu i 6 pg amfotropowego retro wirusowego fragmentu opakowanego (Landau, N.R., Littman., D.R., J. Virology 66: 5110-5113 (1992)) transfekowano do 3 χ 10⁶ 293 komórek przy użyciu zestawu transfekującego pochodzącego od ssaków, zawierającego CaPO₄ (Stratagene). Takie same komórki retransfekowano po upływie 2 dni i ponownie po 4 dniach. W dzień po ostatniej transfekcji 293 komórki współhodowano z zależną od IL-3 linią komórkową pochodzącą z organizmu myszy (32D, klon 23; Greenberger i współpracownicy, PNAS 80: 2931-2936 (1983)). Po upływie 24 godzin komórki 32D były uratowane i podzielone na pasma w gradiencie BSA (Path-o-cyte; Miles Inc.). Następnie komórki ekspandowano w 1 ng/ml mysiej IL-3, po czym oddzielono dla wzrostu w 20% APK9. Komórki posortowano do komórkowej ekspresji powierzchniowej receptora przez FACS przy użyciu poliklonowanej króliczej surowicy antypeptydowej. Takie komórki użyto następnie do badań.

Przykład IV. Próba z 1A6.1 dla ligandu Mpl

Komórki 1A6.1 przemyto aby usunąć hodowlę IL-3 i ponownie umieszczono (1000 komórek/15pl całkowitej objętości/wgłębienie) we wgłębieniu płytki typu Terasaki w pożywce alphaMEM (Gibco)), z dodatkiem 10% cielęcej surowicy płodowej (FCS), genetycynę (800 pg/ml) i 1 % pen/strep (Gibco) w seryjnym rozcieńczeniu 1:1 badanych próbek. Po 48 godzinach ilość zdolnych do życia komórek przypadających na wgłębienie określono przy pomocy mikroskopu. Za jedną jednostkę aktywności przyjęto taką ilość aktywności, która powoduje istnienie 200 zdolnych do życia komórek na wgłębienie. Uznawano, że za aktywność odpowiedzialny jest ligand Mpl jeśli możliwe było całkowite zablokowanie przy włączeniu do próby 5-10 pg/ml Mpl-X. Aktywność ligandu Mpl w APK9 wynosiła przeciętnie 4400 +/- 539 jednostek/ml aplastycznej plazmy. Jeśli nie zaznaczono inaczej, jednostki aktywności ligandu Mpl definiuje się w próbie 1A6.1.

Próby z komórkami transfekowanymi z genem ludzkiego receptora Mpl (przykład IIIB) prowadzono zasadniczo w ten sam sposób, jak z komórkami 1A6.1.

Przykład V. Wykazanie, że ligand Mpl jest obecny w aplastycznej plazmie lub surowicy pochodzącej od myszy, psa, świni i człowieka.

Ligand Mpl jest obecny w aplastycznej palzmie pochodzącej od myszy, psa, świni i człowieka (tabela 2). Plazmę pobierano od myszy BDF1 przed napromieniowaniem i w 12 dni po napromieniowaniu (500 radów). Plazmę badano w próbie z 1A6.1 i uzyskano aktywność 2000 jednostek/ml, która zasadniczo całkowicie ulegała zablokowaniu za pomocąMpl-X (10 pg/ml). Plazma od naświetlanych myszy była również pozytywna w próbie z ludzkim megakariocytem, gdzie przejawiała aktywność 1833 jednostki/ml. Plazmę pobierano od psów przed naświetlaniem i 10 dni po naświetlaniu (450 radów). Plazmę badano w dwóch próbach, z 1A6.1 i ludzkim megakariocytem. Badano aktywność i stwierdzono całkowite zablokowanie przez Mpl-X (10 pg/ml) w obu próbach. Plazmę pobierano od świń przed naświetlaniem i 10 dni po naświetlaniu (650 radów). Osocze badano w dwóch próbach, z 1A6.1 i ludzkim megakariocytem. Obie próby

182 567 wykazały aktywność ligandu Mpl (blokowanie przy 10 pg/ml) dającą się porównać z oznaczoną dla aplastycznej psiej plazmy. Otrzymano surowice od aplastycznych ludzkich pacjentów. Materiał ten wydzielono ze szpiku kostnego pacjentów poddawanych transplantacji. Surowice od 6 pacjentów poddano próbom z 1 A6.1 i uzyskano aktywność 903 jednostki/ml, z czego 88% odpowiadało aktywności ligandu Mpl (zablokowanie 10 μg/ml). Surowicę od 14 aplastycznych pacjentów poddano również badaniom w doświadczeniach z ludzkim megakariocytem. W całej grupie wykazano istotną aktywność, 941 jednostek meg/ml (całkowite blokowanie przez 10 pg/ml Mpl-X). Dane dotyczące mysiego IL-3 zawarto w celu przedstawienia specyficzności doświadczeń z 1A6.1.1 chociaż ta rekombinantowa cytokina indukuje wzrost linii komórkowej, to nie jest blokowana przez 10 pg/ml Mpl-X.

T ab e1a2

Osobnik	Próba z komórkami 1A6.1 (jednostki/ml)	Próba z ludzkim Meg (jednostki meg/ml)
Pożywka	+ Mpl-X	Pożywka	+Mpl-X
zdrowa mysz	0±0	0±0	0±0	0±0
mysz aplastyczna	2000	0	1833	nie mierzono
zdrowy pies	0±0	0±0	0±0	0±0
pies aplastyczny	4400 ± 5390	0±0	792±128	0±0
zdrowa Świnia	0±0	0±0	0±0	0±0
Świnia aplastyczna	3866±1136	0±0	1284± 181	10± 10
zdrowy człowiek	0±0	0±0	0±0	0±0
człowiek aplastyczny	903 ± 64	114 ±33	941±178	0±0
murIL3	6000 ±565	6000 ± 565	nie mierzono	nie mierzono

Przykład VI. Ligand Mpl stymuluje wzrost komórki 1A6.1 i rozwój ludzkiego megakariocytu

Ligand Mpl (wzbogacony co najmniej około 100.000-krotnie w wyniku zastosowania procedury lektynowej i chromatografii sorpcyjnej; patrz przykład VII) stymuluje wzrost linii komórkowej 1A6.1 i powoduje rozwój ludzkich megakariocytów z wyselekcjonowanych komórek CD34 z krwi obwodowej w sposób zależny od dawki. Za aktywność odpowiedzialny jest ligand Mpl, jak pokazano na rysunkach fig. 2 i 3, ponieważ aktywności w obu przypadkach mogąbyć całkowicie zablokowane za pomocą Mpl-X.

Jak również zostało wykazane przez obecnych twórców wynalazku, oczyszczone metodą FACS komórki CD34⁺ z krwi obwodowej, po inkubacji w ligandzie Mpl (100 jednostek /ml przez 9 dni w obecnym przypadku) rozwinęły się w fenotypicznie normalne, dojrzałe megakariocyty. To pozwala ustalić, że oczyszczony ligand Mpl wykazuje taki sam wpływ ma megakariocyty, jak surowy APK9. Ponadto, do tego eksperymentu użyto oczyszczone komórki CD34⁺ (100% CD34⁺) w przeciwieństwie do wyselekcjonowanych komórek CD34, w których komórki CD34⁺ stanowią generalnie tylko 30-50%.

Przykład VII. Oczyszczanie psiego ligandu Mpl

I. Streszczenie

Proteiny (25 kd i 31 kd), które przejawiają aktywność przewidywaną dla ligandu dla receptora Mpl, poddano oczyszczeniu. Proteiny oczyszczono z plazmy napromieniowanych psów, zgodnie ze schematem opartym na zastosowaniu agluteniny z kiełków pszenicy (WGA) w chromatografii sorpcyjnej, chromatografii sorpcyjnej receptoraMpl, chromatografii aniono-wymiennej, żelowej chromatografii filtracyjnej, oraz chromatografii HPLC na kolumnach C4 z odwrócona fazą. Patrz: rysunek fig. 4 - ogólny schemat tego postępowania puryfikacyjnego. Ligandy Mpl 25 kd i

182 567 kd zostały wysoce oczyszczone do stanu pozornej homogeniczności i ustalono, że zawierają sekwencje aminokwasowe ujawnione w niniejszym opisie

II. Metody

A. Klarowanie plazmy

Zamrożoną plazmę (całość 20 litrów) od napromieniowanych psów (patrz przykład I) poddano rozmrożeniu przez noc w temperaturze 4°C; rozmrażanie większych butelek rozpoczęto w temperaturze pokojowej kilka godzin przed umieszczeniem w zimnym pomieszczeniu. Nierozpuszczone substancje usunięto przez odwirowanie przez 6 godzin przy 11,000 xg. Plazmę rozcieńczono roztworem solanki w buforze fosforanowym o pH = 7,3 zawierającym 0,01% azydku sodu (PBS/azide) i przesączono przez filtr 1,2 pm. Procedura klarowania prowadziła zazwyczaj do około dwukrotnego rozcieńczenia wyjściowego materiału.

B. Chromatografia sorpcyjna z aglutyniną z kiełków pszenicy (WGA)

Wszystkie operacje wykonywano w temperaturze 4°C. Sklarowaną plazmę (w dwóch porcjach) załadowano do kolumny wypełnionej nieruchomo aglutyninąz kiełków pszenicy - WGA (1 litr, 10 x 12 cm, E Y Laboratories), zrównoważonej PBS/azydkiem. Po dodaniu próbki niezwiązany materiał wypłukano z kolumny PBS/azydkiem, a następnie roztworem 0,5 M NaCl w 20 mM Tris-HCl, o pH= 8. Aktywny ligand Mpl, związany przez kolumnę WGA, eluowano roztworem 0,35 M N-acetyloglukozoaminy (GlcNAc), 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, o pH = 8. Aktywność ligandu Mpl nie można było wykryć ani w cieczy przechodzącej przez kolumnę ani we frakcjach z przemywania.

C. Chromatografia sorpcyjna z receptorem Mpl

Rozpuszczalny mysi receptor Mpl (Mpl-X), który użyto odpowiednio do nieuszkodzonej zewnątrzkomórkowej domeny receptora Mpl minus Trp w pozycji 483 (patrz Vigon i współpracownicy, 8: 2607-2615 (1993)). W celu zoptymalizowania wiązania ligandu Mpl z kolumną sorpcyjną receptora Mpl-X, cały eluat WGA zatężono przy użyciu ultrafiltracji membranowej (odcięcie frakcji o masie cząsteczkowej = 10.000, YM-10, Amicon) i doprowadzono do stężenia 0,2 M stosując NaCl, przez następne rozcieńczenie. Zatężony cały eluat z WGA podano na aktywowaną 20 ml m-Mpl-X (rozpuszczalny mysi receptor Mpl)CNBr kolumnę sefarozową(Sepharose, 2,6 x 4,2 1,5 mg m-Mpl-X na 1 ml żywicy) z szybkością przepływu 0,9 ml/min. Kolumnę przemyto 40 ml roztworu PBS/azydek z szybkością 1,5 ml/min, a następnie 405 ml roztworu o dużej zawartości soli -10 mM Tris-HCl, IM NaCl, 1 mM CHAPS o pH=8. Następnie eluowano kolumnę roztworem zawierającym 20 mM CAPS, IMNaCl, 5 mM CHAPS, o pH=l 0,5. Odpowiednie frakcje zebrano. Dodano bufor Tris do każdej frakcji w celu zneutralizowania pH.

Zarówno analiza SDS-PAGE jak i absorbancja przy 280 nm profilu eluowania z kolumny sorpcyjnej z receptorem Mpl-X ujawniły wczesny pik proteinowy we frakcjach 1 -4, podczas gdy główną aktywność ligandu MP1 wymywano po frakcji 5.

D. Anionowymienna chromatografia Mono-Q

Frakcje o najwyższej czystości z kilku kolumn sorpcyjnych receptora Mpl połączono, zatężono i zdializowano wobec 20 mM Tris-HCl, 5 mM CHAPS, pH = 8,7, do końcowej objętości 58,5 ml. Stężenie proteiny w całej puli określono metodąpomiaru absorbancji przy 280 nm na poziomie jako równe 0,12 mg/ml (około 7 mg protein oznaczonych sumarycznie). Całość podano, z szybkością0,5 ml/min na kolumnie Mono Q HR 5/5 (Pharmacia), zrównoważonej w 20 mM Tris-HCl, 5 mM CHAPS, o pH=8,7. Kolumnę eluowano przy stałym liniowym gradiencie do 0,36 M NaCl takim samym buforem przez 27 minut. Następnie kolumnę przemyto przy 6 minutowym gradiencie do 0,54 M NaCl, a w końcu jednorazowo przemyto 0,9 M NaCl. Zbierano 1 ml frakcje.

Profil eluatu z kolumny Mono-Q pokazuje że ani we frakcjach przechodzących przez kolumnę ani we frakcjach z przemywania nie można stwierdzić obecności ligandu Mpl, przy występujących w nim jedynie pomijalnych ilości protein. Najwięcej aktywnego ligandu Mpl wypływa we frakcjach 5-7, podczas początkowego stadium wymywania z gradientem NaCl. Uboczną aktywność obserwowano we frakcj ach 8-10, a następnie drugi wyraźny pik aktywności odpowiadał frakcjom 11-15.

182 567

Odrębne pasmo 25 kd obserwowano w analizie metodą SDS-PAGE (nieredukcyjnej) we frakcjach aktywnych. Intensywność pasma bezpośrednio odpowiada aktywności ligandu Mpl w tych frakcjach. Pasma tego nie obserwuje się we frakcjach 3 i 4 (brak aktywności). Wyraźnieje obserwowano w przypadku frakcji 5 i 6 (1A6.1 pik aktywności) i podobne, intensywnie zabarwione pasmo wystąiło w przypadku frakcji 11-14(1A6.1 pik aktywności). Słabojest ono widoczne w połączonych frakcjach 15 i 16, co odpowiada istotnie niższej aktywności we frakcji 16. E. Doświadczenia z eluowania żelu

Doświadczenia z eluowaniem żelu przeprowadzono przy użyciu podwielokrotności Mono Q frakcji 5 i 6 lub Mono Q frakcji 13 i 14. Dla tych doświadczeń przygotowano połączone frakcje 5 i 6 (6 μΐ każda) bądź 13 i 14 (7,5 μΐ każda), zmieszano je z buforem SDS-PA-Ge (nieredukujący) i naniesiono na 12% żel SDS. Po zakończeniu elektroforezy wycięto i pokrajano interesujące części (1 mm), te z kolei rozdrobniono nożykiem do golenia. Kawałki przeniesiono do 1,5 ml probówek do mikrowirowania zawierających 0,5 ml PBS/5 mM CHAPS i delikatnie mieszano przez noc w temperaturze 4°C. Następnego dnia probówki krótko obracano, roztwór usunięto i próbki zdializowano wobec medium Iscove'a uzupełnionego BSA jako nośnikiem protein. Dializowane próbki przekazano do oceny.

W rezultacie okazało się, że można zaobserwować dwa piki aktywności ligandu Mpl. Jeden z pików koresponduje z obszarem 25 kd żelu, podczas gdy drugi pik aktywności ligandu Mpl jest zauważany w obszarze 31 kd.

F. Filtracja na żelu Superdex 200

Frakcje 13-16 otrzymane z kolumny aniono-wymiennej Mono Q, jak również dwie równoważne frakcje z drugiego Mono Q frakcjonowania, połączono i zatężono przy użyciu ultrafiltracji membranowej (Centricon-10, Amicon). Następnie dodano SDS do końcowego stężenia 0,1%, i próbkę wstrzyknięto na kolumnę Superdex 200 HR 10/30 (Pharmacia). Kolumnę zrównoważono roztworem 50 mM Tris-HCl, 0,1% SDS, o pH=7,5, przy szybkości przepływu 0,3 ml/min, i dalsze postępowanie prowadzono w temperaturze pokojowej. Odbierano frakcje co minutę. W rezultacie największą zawartość białka stwierdzono we frakcjach 32-40, podczas gdy aktywność ligandu Mpl stwierdzono we frakcjach 42-46. Analiza frakcji SDS-PAGE wykazała odrębne pasmo 25 kd we frakcjach aktywnych.

G. Chromatografia z odwróconąfazą C4 HPLC

Frakcje 43-46 z chromatografii na Superdex 200 połączono i zatężono, lub pojedynczą frakcję 42 zatężono, przy użyciu ultrafiltracji membranowej (Microcon-10, Amicon). Zatężone roztwory oddzielnie umieszczono w mikro-kolumnach C4 do chromatografii z odwróconą fazą, 1 x 100 mm C4 (SynChropak RP-4). Kolumnę zrównoważono w 0,04% TFA w wodzie (Bufor A); Buforem B był roztwór 0,035% TFA w 80% acetonitrylu. Po wstrzyknięciu próbki przez 4 minuty wytwarzano liniowy gradient do 45% B, a następnie liniowy gradient do 75% B przez 40 minut. Szybkość przepływu wynosiła 75 μΐ/rnin. Wyniki oczyszczania frakcji 42 przedstawiono na rysunku fig. 5. Wyraźne piki aktywności ligandu Mpl obserwowano we frakcjach 21-23. Frakcje powyższe analizowano na 14% żelu poliakryloamidowym w nieredukujących i redukujących warunkach. Frakcja 21 składała się z pojedynczego pasma 31 kd. Frakcja 23 składała się z jednego, szerokiego pasma 25 kd; a frakcja 22 zawierała pasma w obu obszarach 25 kd i 31 kd. Żadnego innego ważnego pasma nie zaobserwowano. Trzeba zauważyć, że we wcześniejszych doświadczeniach z eluowaniem żelu przyporządkowano aktywność ligandu Mpl w obu tych obszarach. Pojedyncze małe wysokocząsteczkowe pasmo obserwowano w przypadku wszystkich frakcji na żelu nieredukującym, ale nie mogło być zauważone na żelu redukującym.

H. Analizy sekwencji na końcach N ligandów Mpl 25 kd oraz 31 kd

Analiza sekwencji N-końcowych aktywnych frakcji przebiegała metodą chromatografii C4 RP-HPLC. Sekwencje określono dla tych protein omówiono powyżej. W dodatku, dla głównej sekwencji odpowiadającej pasmu 25 kd (co najmniej 90% użytej próbki), znaleziono kolejne dwie małe sekwencje (które były związane z dwoma małymi nieistotnymi pasmami opisanymi powyżej w części C). Porównania ze znanymi sekwencjami ujawniającymi, że małe sekwencje pochodziły od psiego Ig ciężkiego łańcucha i kappa łańcucha. Jeżeli to konieczne, to te

182 567 małe zanieczyszczenia mogły być następnie redukowane ilościowo przez zastosowanie innego etapu oczyszczania, takiego jak preferowany inny etap filtrowania na żelu.

I. Porównanie aktywności ligandu Mpl w oczyszczonych frakcjach C4

Na rysunku fig. 6 przedstawiono dane mówiące o tym, że aktywności obecne we frakcjach 22 i 23 z etapu chromatografii C4 RP-HPLC, są zasadniczo równoważne. Frakcja 22 zawierała mieszaninę pasm 25 i 31 kd, podczas gdy frakcja 23 zawierała tylko pasma 25 kd. Podwielokrotności każdej z tych frakcji rozcieńczono w stosunku 1:45000. Rozcieńczone frakcje stymulowały zasadniczo jednakowo wzrost komórki 1A6.1 (frakcja 22 -5400 komórek na wgłębienie; frakcja 23 - 6000 komórek na wgłębienie). Rozcieńczone frakcje inkubowano z rosnącym stężeniem Mpl-X. Frakcje były tak samo czułe na inhibitowanie przez Mpl-X, i obie zostały całkowicie zablokowane przy 7-1,4 pg/ml. Wskazuje to, że aktywna proteina (proteiny) w każdej frakcji są Mpl Ugandami o różno ważnej biologicznej aktywności.

Przykład VIII. Porównanie ligandu Mpl z innymi czynnikami rozwoju megakariocytów

Opisano wpływ kilku rekombinantowych czynników lub organicznych związków, takich jak octan forbolowy kwasu mirystynowego (PMA) na wzrost megakariocytów lub ich rozwój. Zgodnie z tym badano wpływ tych czynników na wyselekcjonowane CD34 z komórek krwi obwodowej. Rekombinacyjna ludzka interleukina 3( IL-3,1-2 ng/ml), czynnik komórki wyjściowej (stem) (SCF, 50 ng/ml), interleukina 6 (IL-6, 25 ng/ml), erytropoetyna (EPO, 1 jednostka/ml), czynnik inhibitujący leukemię (LIF, 10 ng/ml), czynnik stymulowania hodowli granulocytmakrofag (GM-CSF, 25 ng/ml, Amgen, Inc.) interleukina 11 (IL-11, 25 ng/ml, R + D System, Minneapolis, MN); octan forbolowy kwasu mirystynowego (PMA, 10'¹⁰M, Sigma); wymienione składniki dodawano do hodowli jak wskazano. Ligand Mpl użyto w ilości 275 jednostek/ml, APK9 użyto w postaci 5% (równoważny 220 jednostkom/ml). Badane w kombinacji czynniki były w takim samym stężeniu jak w przypadku testów indywidualnych. Po 8 dniach hodowli komórki umieszczono bezpośrednio we wgłębieniach naczynek i zabarwiono na obecność megakariocytów (n=6 wgłębień zgodnie z warunkami), lub zliczano całkowitą ilość komórek. Dane są prezentowane jako wynik średni +/- SEM.

Na rysunku fig. 7 pokazano, że APK.9 i ligand Mpl miały największy wpływ na ilości megakariocytów na jedno wgłębienie. IL-3 również miała wpływ na rozwój megakariocytów, zwłaszcza w kombinacji z SCF. IL-6, IL-11 lub EPO wykazały mały wpływ na ilość megakariocytów, tak pojedynczo jak i w kombinacji z IL-3. PMA, LIF i GM-CSF wykazały mały wpływ. Na rysunku fig. 8 umieszczono dane z tego samego eksperymentu ukazujące całkowitą ilość komórek znalezionych we wgłębieniu („komórkowość”). APK9 i ligand Mpl miały niewielki wpływ na „komórkowość”, podczas gdy IL-3 i SCF miały skromny wpływ. SCF oraz IL-3, w kombinacji, miały największy wpływ. Dane pokazane na rysunkach fig. 7 i 8 posłużyły do procentowego określenia liczby megakariocytów na wgłębienie, jak to pokazano na rysunku fig. 9. Jest oczywiste, że czynnikiem, którego wpływ jest największy na procentową ilość megakariocytów w hodowli we wgłębieniu jest ligand Mpl, aktywny składnik w APK9. Wykazuje to specyficzność ligandu Mpl w oddziaływaniu na megakariocyty.

P r z y k 1 a d IX. Aktywność ligandu MP1 w kierunku promocji megakariocytów nie zależy od ludzkiej IL-3

Ligandy Mpl stymulują rozwój ludzkich megakariocytów, jeżeli są stosowane jako dodatek do hodowli medium, jak to opisano w przykładzie II. I chociaż IL-3 nie jest składnikiem medium, to może być obecna w niewykrywalne małej ilości w normalnym ludzkim osoczu obecnym w medium. Jednocześnie nawet gdy jest obecna, IL-3 nie jest zaangażowana w indukowaną ligandem Mpl megakariopoezę. Pokazano to na rysunku fig. 10. IL-3 w ilości 2 ng/ml posiada aktywność w próbie z ludzkim meg równą 14.900 jednostek meg/ml. Aktywność ta inhibitowana jest w 97% za pomocą anty-IL-3 (3,3 pG/ML; Genzyme, Cambridge, MA). Ligand MPL przy 8203 jednostkach meg/ml nie był inhibitowany za pomocą anty-IL-3.

182 567

Przykład X. Analizy ligandu Mpl pochodzącego od świni I. Streszczenie

Białka pochodzące z nienaświetlonego świńskiego osocza z aktywnościąligandu Mpl były charakteryzowane metodą chromatografii sorpcyjnej z WGA, opartej na powinowactwie do aglutyniny z kiełków pszenicy (WGA) chromatografii sorpcyjnej receptora Mpl, chromatografii jonowymiennej i chromatografii z odwróconymi fazami C4 HPLC. Aktywność charakteryzowano również przez eluowanie z kawałków z żeli SDS-polakryloamiodowych.

Chromatografia	Omówienie
Kolumna sorpcyjna z WGA	naniesiono 4,4 x 106 jednostek odzyskano 3,4 χ 106 jednostek
Kolumna z receptorem Mpl	naniesiono 2,7 x 106 jednostek odzyskano 2,4 x 106 jednostek
Wymiana jonowa Mono S; pH 6,0	naniesiono 2,4 χ 106 jednostek odzyskano 4,4 χ 106 jednostek
HPLC z odwróconą fazą - C4 Doświadczenia z elucją żelu	aktywność we frakcjach 23-25 dwa wyraźnie rozróżnialne pasma aktywne, jedno przy około 18 kd a drugie przy około 28 kd.

Przykład XI. Klonowanie ludzkiego ligandu Mpl, ludzkiego MGDF Zastosowano dwa następujące podejścia:

I. Pierwsze przykładowe podejście do klonowania

A. Generowanie próbki ludzkiego MGDF

Kilka zdegenerowanych PCR primerów zaznaczono bazując na amino-końcowej sekwencji białek pochodzących od psa. Różne pary primeru użyto do amplifikacji genu MGDF z ludzkiego genomicznego DNA. Po 40 cyklach amplifikacji, stosując sensowne primery 5' GCN CCN CCN GCN TGY GA 3' (SEQ ID NO: 4), kodujące pierwszych pięć aminokwasów z psiej proteiny (SEQ ID NO: 1) i antysensowny primer: 5' GCA RTG YAA CAC RTG NGA RTC 3' (SEQ ID NO: 5), kodujący aminokwasy 16 do 21 (SEQ ID NO: 1), produkt PCR wytworzono na 2% żelu agarowym w buforze TBE.

Pasmo 63 bp odcięto z żelu agarowego i reamplifikowano przy użyciu tej samej jednostki primeru. PCR produkt klonowano w wektorze PCR II (Invitrogen, San Diego). Kilka kolonii skręcono przez sekwencję DNA. Plazmid DNA kodujący peptyd podobny do psiej MGDF proteiny użyto jako źródło do generowania radioaktywnej próbki do skriningu wytworzonych cDNA. Sekwencja aminokwasowa kodowana przez ten fragment genu była następująca:

Ala-Pro-Pro-Ala-Cys-Asp-Leu-Arg-Val-Leu-Ser-Lys-Leu-LeuArg-Asp-Ser-His-Val-Leu-His (SEQ ID NO: 6)

Pasmo agarozowe zawierające ludzki MGDF wykorzystano do wygenerowania próbki metodąPCR na gorąco. Typowa mieszanina reakcyjna PCR w 10 μΐ zawierała następujące składniki:

szablon DAN 5' primer (SEQ ID NO: 4) 3' primer (SEQ ID NO: 5) 10 X bufor dATP (0,1 mM) dTTP(lOmM) dGTP(lOmM) dCTP (0,1 mM) dCTP,p32( 10 pC/μΙ dATP, p32(10 pC/pl Taq DNA polimeraza woda	2-3 μΐ 1 μΐ, 20 pmoli 1 μΐ, 20 pmoli 10 μΐ 2 μΐ 2 μΐ 2 μ] 2 μΐ 5μ1 5μ1 0,5 μΐ, 2,5 jednostek 77 ul
całkowita objętość	100 μΐ

182 567

Warunki amplifikacji były następujące:

ogrzewanie początkowe 94°C, 2 min wygrzewania 53°C, 30 sek przedłużanie 72°C, 30 sek denaturacja 94°C, 30 sek cykli amplifiklacji prowadzono w systemie Perkin Elmer GeneAmp System 9600.

Produkt oczyszczano przez przepuszczenie przez kolumnę z wymuszonym przepływem (Stratagene, San Diego). Jeden 1 μΐ próbki poddawano odczytom w liczniku scyntylacyjnym. Próbki zawierające od 1 do 3 milionów zliczeń na mililitr dodawano do mieszanki hybrydyzacyjnej. B. Konstrukcja serii wątroby płodowej

PoliA⁺ RNA ludzkiej wątroby płodowej zakupiono w laboratoriach firmy Clontech. Około 4 μg RNA użyto do syntezy cDNA, w której primerem był losowy heksamer, 5' GTA CGC GTT CTA GAN NNN NNT 3' (SEQ ID NO: 7) przyłączony do oligo zawierającego centrum Xba I.

Stosowano protokół Gibco-BRL aby wygenerować dwuniciowy cDNA. Adaptor Eco R I-Bst X I (Invitrogen, San Diego) ligowano do dwuniciowego cDNA, a następnie trawiono enzymem restrykcyjnym Xba I. Selekcję rozmiarów wytworzonego cDNA przeprowadzono na kolumnie Sephacryl S500 (Life Technologies, Inc.) cDNA większe niż 400 bp ligowano wektorem ekspresji pochodzącym od ssaków vl9.8 (Martin, FCell 63 203-211 (1990)), który uprzednio trawiono przy użyciu Eco RI i Xba I. Kompetentne komórki DH10 E. coli transformowano i otrzymaną serię cDNA podzielono na 7 porcji po 100,00 cDNA każda.

C. Skrining serii lambda

Serię ludzkiej nerki płodowej w lambda gtll pobrano z firmy Clontech z mianem 650 milionów pfu/ml. Około 2 milionów płytek poddano skriningowi z próbką wygenerowaną metodą PCR (patrz wyżej). Hybrydyzacja przebiegała w 6 X SSC, 5X Denhardt, 0,1 % SDS, 100 pg/ml jednoniciowego DNA ze spermy łososia przez 15 godzin w temperaturze 56°C.

Dokonano wielokrotnego powtórzenia przebiegu skriningu. DNA poddano amplifikacji z pojedynczych płytek i hybrydyzacji z wewnętrznym primerem 5' AGT TTA CTG AGG ACT CGG AGG 3' (SEQ ID NO: 8) kodującym aminokwasy 7 do 13 w SEQ ID NO 6, aby zidentyfikować prawdziwe pozytywy.

D. 3 pierwsze gwałtowne amplifikacje końców cDNA (RACE)

Poliadenylowane RNA z ludzkiej nerki płodowej i wątroby płodowej pobrano z firmy Clontech. Jeden mikrogram RNA transkrybowano odwrotnie stosując oligo 5' TTC CGC CGG ATA GGC CTT TTT TTT TTT TTT 3' (SEQ ID NO: 9) jako primer.

Stosowano zestaw Gibco-BRL do syntezy cDNA (Life Technologies Inc., Cat # 18267013) do wygenerowania pierwszej nitki cDNA. Końcowa objętość wynosiła 30 μΐ. Reakcję przerwano przez dodanie 500 mM do końcowego stężenia 10 mM i utrzymywano w temperaturze -20°C.

Do początkowego PCRużyto 0,5 μΐ cDNA jako szablon do reakcji. Primer SEQ ID NO: 9 i konkurencyjny oligo 5' TTC GGC CGG ATA GGC CTT TTT TTT TTT TT-P 3' (SEQ ID NO: 10) stosowano jako antysensowne primery, podczas gdy oligonukleotyd 5' TGC GAC CTC CGA GTC CTC AG 3' (SEQ ID NO: 11) kodujący aminokwasy 5 do 11 do SEQ ID NO: 6, stosowano jako primer sensowny. Czterdzieści cykli amplifikacji przeprowadzono przy użyciu następującego protokołu: 94°C, 30 sek; 65°C, 30 sek; 72°C, 30 sek; po początkowej 2 minutowej inkubacji w temperaturze 94°C. Do amplifikacji stosowano system Perkin Elmer GeneAmp System 9600.

Budowanie serii prowadzono stosując ten sam primer sensowny 5' GAG TCC TCA GTA AAC TGC TTC GT 3' (SEQ ID NO: 12) kodujący aminokwasy 8 do 14 SEQ ID NO: 6, podczas gdy SEQ ID NO: 9 i SEQ ID NO: 10 stosowano jako primery antysensowne. Czterdzieści cykli amplifikacji przeprowadzono z wygrzewaniem w temperaturze 65°C. Produkty PCR wytworzono na 0,8% żelu agarowym a następnie fotografowano w świetle UV. Pasma około 0,8 i 1,2 kb były widoczne.

Produkty PCR następnie klonowano w wektorze PCR Π (Invitrogen). Indywidualne kolonie wybrano i wyodrębniono z nich plazmidy stosując zestawy Qiagen, nr katalogowy 12143 i

182 567

12145. Stosując wektorowe primery przeprowadzono sekwencjonowanie z barwieniem dwuniciowych fragmentów. Sekwencje analizowano stosując różne typy oprogramowania GCG E. Przedłużanie primerów 5' i 3'

W celu wyizolowania sekwencji pełnej długości genu MGDF, przeprowadzono przedłużenie primerów 3' i 5' stosując różne zbiory serii płodowej wątroby jako szablony. Do amplifikacji primeru 5 cDNA, użyto około 20 ng cDNA z każdego zbioru jako szablonu. Zastosowano MGDFspecyficzny antysensowny primer 5' GGA GTC ACG AAG CAG TTT AC 3' (SEQ ID NO: 13) kodujący aminokwasy 12 do 17 SEQ ID NO: 6 oraz 5'wektor v 19,8 sensownego primera 5' CCT TTA CTT CTA GGC CTG 3' (SEQ ID NO: 14). Amplifikację prowadzono w ciągu 30 cykli z wygrzewaniem w temperaturze 53°C. Budowanie serii przeprowadzono w 30 cyklach z antysensownymi primerami 5' GAG GTC ACA AGC AGG AGG A 3' (SEQ ID NO: 15) kodującymi aminokwasy 1 do 6 do SEQ ID NO: 6 wektorowym primerem SEQ ID NO: 14.

Do przedłużenia primeru końców 3’ cząstek cDNA MGDF, zastosowano antysensowny wektorowy primer 5' GGC ATA GTC CGG GAC GTC G 3' (SEQ ID NO: 17) kodujący aminokwasy 1 do 6 SEQ ID NO: 6. Amplifikację przeprowadzono w ciągu 30 cykli z wygrzewaniem w temperaturze 58°C.

Amplifikacja budowania serii w ciągu 30 cykli przeprowadzona została przy użyciu primera MGDF SEQ ID NO: 12 i wektorowego primera SEQ ID NO: 16. Specyficzne pasma pojawiły się w grupach 1, 7 i 8, które poddano klonowaniu w wektorze PCRII. Oczyszczony plazmid DNA z poszczególnych kolonii poddawano oczyszczaniu i sekwencjonowaniu.

F. Izolowanie klonów pełnej długości ludzkiego MGDF

W dużej ilości początkowych klonów brak było części odpowiadającej końcowi N MGDF, ponieważ sekwencja MGDF wykorzystana została przy tworzeniu primerów oraz budowaniu serii. Primer 5' CCA GGA AGG ATT CAG GGG A 3' ((SEQ ID NO: 18), którego sekwencję otrzymano w doświadczeniach z przedłużania primera 5, opisanych powyżej stosowany był jako primer sensowny. Wektorowy primer SEQ ID NO: 16, służył jako primer antysensowny. 3 5 cykli amplifikacji przeprowadzono z wygrzewaniem w temperaturze 58°C. Zastosowano MGDFspecyficzny primer 5' CAA CAA GTC GAC CGC CAG CCA GAC ACC CCG 3' (SEQ ID NO: 19) z centrum SA11 wektorowy primer (SEQ ID NO: 15) do budowania serii przez 35 cykli. Produkt PCR klonowano w wektorze PCR II i sekwencjonowano.

II. Drugie przykładowe podejście do klonowania

A. Klonowanie cDNA końca Npsiego MGDF

Zaprojektowano zdegenerowane oligonukleotydowe primery w oparciu sekwencję aminokwasowąkońca N psiego MGDF, opisanąw poprzedniej części i użyto w polimerazowej reakcji łańcuchowej (PCRs) aby zamplifikować sekwencję cDNA kodującąMGDF. Całkowity RNA otrzymano z próbek psiej nerki metoda guanidyno-izotiozyjanianową według Chomzyńskiego i Sacchi (Biochem. 162:156-159 (1987)). Pierwszą nitkę cDNA przygotowano z przypadkowym adapterem primera 5' GGC CGG ATA GGC CAC TCNNNNNNT 3' 9SEQ ID NO: 20) przy użyciu MoMULV odwrotnej transkryptazy i zastosowano jako szablon w następujących potem reakcjach PCR.

PCR prowadzono przy użyciu 0,5 mikrolitrów, około 50 ng, cDNA stosując Primer A 5' GCN CCN CCN GCN TGY GA 3' (SEQ ID NO: 4), sensowny niciowy primer kodujący aminokwasy 1-6 SEQ ID NO: 1, oraz także Primer B 5' GCA RTG NAG NAC RTG NGA RTC 3' (SEQ ID NO: 5) lub primer C 5' GCA RTG YAA NAC RTG NGA RTC 3' (SEQ ID NO: 21), które są antysensownymi niciowymi primerami kodującymi aminokwasy 16-21 SEQ ID NO: 1, z trzema dodatkowymi nukleotydami na końcu 5' w celu zwiększenia stabilności wygrzewania. PCR z polimeraząTaą prowadzono przez 35 do 45 cykli, aż do pasma produktu uwidoczniły się na żelu agarozowym w czasie analizy elektroforetycznej. Dla pierwszych dwóch cykli PCR etap ponownego wygrzewania przeprowadzono w temperaturze 37°C przez dwie minuty; w pozostałych cyklach ponowne wygrzewanie zachodziło w temperaturze 50°C przez jedną minutę. Wielokrotne pasma produktu obserwowano w każdej reakcji. Te części żelu, które zawierały pasma w przybliżeniu odpowiadające spodziewanej wielkości (66 par zasad) zebrano przy uży

182 567 ciu czubka pipety Pasteura i reamplifikowano z tą samą parą primerów. Produkty DNA klonowano do wektora PCR II (Invitrogen) według zaleceń producenta. Trzy klony sekwencjonowano i stwierdzono, że kodują przy jednokrotnym odczycie spodziewaną sekwencję psiego MGDF reszty 1-21. Na tej drodze unikalna sekwencja cDNA psiego MGDF została otrzymana pokrywając region od trzeciego nukleotydu kodonu 6 do trzeciego nukleotydu kodonu 15. Jeden z tych klonów służył jako szablon do przygotowania znakowanej próbki cDNA psiego MGDF.

B. Konstrukcja serii cDNA z ludzkiej wątroby płodowej

Wyizolowano RNA z ludzkiej wątroby płodowej (International Institute for the Advancement of Medicine, Exton, PA) na drodze lizy tkanki w 5,5 M roztworze tiocyjanianu guanidyny i czyszczenia przez odwirowanie w wirówce z CsTFA (Pharmacia). Poddany poliadenylowaniu RNA wyselekcjonowano przy użyciu oligo (dT)₂₅dynabeads (Dynal, zgodnie z instrukcją producenta). Dwuniciowy cDNA otrzymano z powyższego RNA przy użyciu systemu plazmidowego Superscript dla syntezy cDNA (Life Technologies, Inc.), za wyjątkiem tego, że użyto innego adaptera linkera: 5' TTG GTG TGC ACT TGT G 3' (SEQ ID NO: 22) oraz 5' CAC AAG TGC ACA CCA ACC CC 3' (SEQ ID NO: 23). Po selekcji co do wielkości cDNA wprowadzono w sposób kierowany do centrów Bst XI i Not I wektora ekspresji pBCB pochodzącego od ssaków (pBCB pochodzi od plazmidu Rc/CMV, Invitrogen, zawierającego trzon puc 19, promoter CMV i centrum poliadenylacji BGH). DNA po ligowaniu został elektroporowany do elektrokompetentnego szczepu bakteryjnego 10B (Life Technologies Inc.).

C. Skrining serii ludzkiego cDNA z wątroby płodowej pod kątem MGDF

Filtrowe repliki serii ludzkiej wątroby płodowej poddano hybrydyzacji do znakowanego radioaktywnie produktu PCR w postaci cDNA końca N psiego MGDF (5x SSPE, 2x Denhardfs, 0,05 pirofosforan Na, 0,5 SDS, 10 pg/ml lizatu drożdżowego tRNA i 100 pg/ml zdenaturowanego DNA ze spermy łososia) w temperaturze 64°C przez 18 godzin. Filtry przemyto w temperaturze 64°C w 5x SSPE, 0,5% SDS i pozostawiono na noc. Oddzielono i zanalizowano dwa różne klony hybrydyzujące do tej próbki.

D. Ekspresja klonów cDNA ludzkiego MGDF

Oczyszczony DNA z klonów cDNA MGDF transfekowano do komórek 293 EBNA (Invitrogen). Zmieszano 1,5 pg DNA z 7,5 μΐ Lipofektaminy (Life Technologies, Inc.) w 100 μΐ wolnego od surowicy DMEM. Po 20 minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej mieszaninę DNA-Lipofektaminy dodano do hodowli 5 χ 10⁵ komórek/wgłębienie (24-dołkowa płytka) w 400 μΐ DMEM, 1 % surowicy (Fetal Clone Ii) i inkubowano przez 6 godzin w temperaturze 37°C. Do komórek dodano 500 μΐ DMEM, 20% surowicy (Fetal Clone Π). Po 16 godzinach pożywki odpowietrzono i dodano 500 μΐ DMEM, 1% surowicy (Fetal Clone II). Po dalszych 72 godzinach otrzymane pożywki zebrano i odwirowano przez spinowy filtr 0,22 mikronów. Kondycjonowane pożywki oznaczono na biologiczną aktywność właściwą MGDF.

III. Opis i właściwości klonów ludzkiego MGDF

W oparciu o powyżej opisane strategie klonowania, otrzymano klony ludzkiego cDNA pokazane na rysunku fig. 11 (MGDF-1 i MGDF-2; SEQ ID NOS: 24,25; oraz 26,27) oraz fig. 12 (MGDF-3; SEQID NOS: 28,29). Każda z tych sekwencji na rysunkach zawiera przypuszczalnie sygnalną sekwencję aminokwasów 1-21, tak, że dojrzałe białka zaczynają się przy aminokwasie 22, w każdym przypadku.

Wynik badań na aktywność prowadzonych przy użyciu testów opartych na komórkach opisanych w przykładzie IVA powyżej, z MGDF 1 -3 przedstawiono w tabeli 3 i 4, poniżej. W tabeli 3 kondycjonowane pożywki z komórek 293 EBNA transfekowanych każdym wytworzonym fragmentem zebrano po 2 dniach hodowli, a następnie zbadano na komórkach 1A6.1 (32D/murMPL=) +/-10 pg/ml mur-MPL-X. W tabeli 4, kondycjonowane pożywki z komórek 293 EBNA transfekowanych każdym wytworzonym fragmentem zebrano po 4 dniach hodowli i zbadano zarówno na komórki 32D/mur-MPL+ (przykład IIIA) jak i 32D/hu-MPL+ (przykład IIIB). Jak można zauważyć ludzkie MGDF-1 i MGDF-2 lecz nie MGDF-3 są aktywne w liniach komórkowych ekspresjonujących zarówno mysie jak i ludzkie formy Mpl. Linie komórkowe ekspresjo

182 567 nujące ludzki receptor MPL daje lepszą odpowiedź na ludzki MGDF-1 i MGDF-2 niż linia komórkowa ekspresjonująca mysi receptor Mpl.

Tabela 3

Klon	U/ml (- mur-MPL-X)	U/ml (+ mur-MPLX)
Pożywki	0	0
PBCO (plazmid kontrolny)	0	0
MGDF-1	12.800	800
MGDF-1 (powtórzenie)	12.800	566
MGDF-2	4525	400
MGDF-2 (powtórzenie)	12.800	1131
MGDF-3	0	0
MGDF-3 (powtórzenie)	0	0
APK9 kontrolny	4400 ±400	0

T a b e 1 a 4

Klon	U/ml 32D/mur-MPL+	U/ml 32D/hu-MPL+
MGDF-1	1600	25,600
MGDF-2	6400	50,000
MGDF-2 (powtórzenie)	6400	50,000-100,000

W poniższej tabeli 5 wykazano, że aktywności ludzkich MGDF-1 oraz MGDF-2 w komórkach 32D/hu-MPL+ (przykład ΠΙΒ) jest zasadniczo całkowicie zahamowana rozpuszczalnym ludzkim receptorem mpl(hu-MPL-X). Hu-MPL-X zawarty był w kondycjonowanych pożywkach zebranych z komórek CHO produkujących to białko. Kondycj onowaną pożywkę CHO hu-MPL-X zatężono 120-krotnie a następnie dodano do hodowli w ilości 6,6%. Kondycj onowane pożywki z kontrolnych hodowli CHO nie miały żadnego skutku w tym teście. Próbę prowadzono jak opisano w przykładzie IVB, z tym jedynie wyjątkiem, że ilość żywych komórek oceniano po 3 dniach.

Tabela 5

Klon	U/ml (-Hu-MPL-X)	U/ml (+Hu-MPL-X)
MGDF-1	530	0
MGDF-2	270	0

Próba na ludzkie megakariocyty

MGDF-1 i MGDF-2 lecz nie MGDF-3 indukują tworzenie megakariocytów z komórek CD34 wyselekcjonowanych z krwi obwodowej. Doświadczenie opisane w tabeli 6, prowadzone było zasadniczo jak opisano w przykładzie II, z tą jedynie różnicą że komórkami krwi obwodowej były CD-34-selekcjonowane bez elutritacji, a hodowle zbierano po 7 dniach. Stosowano kondycj onowane pożywki z każdego konstruktu MGDF z 293 EBNA w ilości 20% końcowej objętości +/- 30 pg/ml mur-MPL-X. Kontrola APL9 stosowana była w ilości 6% końcowej objętości.

182 567

Tabela 6

Klon	Megakariocyty/dołek
(-mur-MPL-X)	(+mur-MPL-X)
wektor kontrolny	0	0
APK9 kontrolny	100 ± 3	0
MGDF-1	142 ±48	17 ± 2
MGDF-2	100 ± 3	6±2
MGDF-2 (powtórzenie)	86 ± 10	0
MGDF-3	2± 2	0

Przykład XH. Ekspresja rekombinantowego ludzkiego MGDF (1-163) w E. coli

Aby zrealizować ekspresję r-HuMGDF w E. coli, sekwencję kodującą pierwsze 163 aminokwasy dojrzałego białka zsyntetyzowano chemicznie stosując optymalne kodony E. coli. Dodatkowo, sekwencje DNA kodujące aminokwasy metioninę i lizynę dołączono do końca 5'genu. Zatem, białko r-HuMGDF, kodowane przez te sekwencję zawiera 165 aminokwasów na długość zaczynających się od Met-Lys. Sekwencja tego genu przedstawiona jest na rysunku fig, 25.

Syntezę genu r-HuMGDF (1-163) przeprowadzono w kilku etapach. Najpierw komplementarne oligonukleotydy (o długości 60-70 par zasad) reprezentujące stykające się fragmenty genu zostały chemicznie zsyntetyzowane stosując optymalne kodony E. coli. Podczas tych syntez kodony aminokwasów metionina i lizyna został przyłączone do końca 5' dojrzałego genu, a na końcu 3' tego genu umieszczono kodon stop. W dodatku, miejsca cięcia dla enzymów restrykcyjnych Xha\ i HindH\ umieszczono odpowiednio na ekstremalnych końcach 5' i 3' genu a miejsce przyłączenia syntetycznego rybozomu umieszczono w górę od początkowej metioniny. Następnie, komplementarne oligonukleotydy każdego fragmentu genu wygrzewano. Z kolei wskazane indywidualne syntetyczne fragmenty genu zamplifikowano stosując polimerazę reakcji łańcuchowych. Po czwarte, zamplifikowane fragmenty poddano subklonowaniu do odpowiednich wektorów. Po piąte, sekwencje subklonowanych fragmentów zweryfikowano. Po szóste, pojedyncze fragmenty poddano ligacji miedzy sobą i subklonowaniu do odpowiedniego wektora, rekonstruując pełnowymiarowy gen r-HuMGDF (1163). W końcu sekwencję skonstruowanego genu poddano weryfikacji.

Syntetyczny fragment genu r-HuMGDF, sflankowany miejscami restrykcyjnymi Xbal i HincEW, odpowiednio na końcach 5'i 3', zawiera miejsca wiązania rybosomów, kodon startu ATG, sekwencję kodującą dojrzałą proteinę Met-Lys r-HuMGDF oraz kodon stop.

Powyższy fragment poddano klonowaniu w miejscach Xba\ i Hindlll indukowanego laktozą wektora ekspresyjnego pAMGl 1. Wektor pAMGl 1 jest plazmidem ekspresji o niskiej liczbie kopii, z pochodzącym z pRIOO źródłem replikacji. Plazmid ekspresji pAMGl 1 można wyprowadzić z plazmidu pCFM1656 (ATCC# 69576, zdeponowany 24 lutego 1994 roku) dokonując serii zmian zasad w określonych miejscach na drodze oligo mutagenezy PCR w obszarach zachodzących na siebie. Wychodząc z miejsca Bgl Π (zasada nr 180 plazmidu) bezpośrednio 5' do promotera replikacji plazmidu P_copB oraz prowadząc proces w kierunku genów replikacji plazmidu, zmiany par zasad są następujące:

pAMGl 1 para zasad nr	para zasad wpCFM1656	para zasad zmieniona w pAMGl 1
1	2	3
204	T/A	C/G
428	A/T	G/C

182 567 ciąg dalszy

1	2	3
509	G/C	A/T
617	—	wbudowane dwie pary G/C
679	G/C	T/A
980	T/A	C/G
994	G/C	A/T
1004	A/T	C/G
1007	C/G	T/A
1028	A/T	C/G
1047	C/G	T/A
1178	G/C	T/A
1466	G/C	T/A
2028	G/C	usunięcie pary zasad
2187	C/G	T/A
2480	A/T	T/A
2499-2502	AGTG TCAC	GTCA CAGT
2642	TCCGAGC AGGCTCG	usunięcie pary zasad
3435	G/C	A/T
3446	G/C	A/T
3643	A/T	T/A
4489-4512	—	wprowadzone pary zasad

GAGCTCACTAGTGTCGACCTGCAG

CTCGAGTGATCACAGCTGGACGTC (SEQ ID Numery:30,31) i przez podstawienie sekwencji DNA pomiędzy unikalnymi miejscami restrykcji Aatll i Ciał w następujących oligonukleotydach:

Aatn (nr 4358)

5’ CTCATAATTTTTAAAAAATTCATTTGACAAATGCTAAAATTCTT3’ TGCAGAGTATTAAAAATmTTAAGTAAACTGTTTACGATTTTAAGAA-GATTAATATTCrCAATTGTGAGCGCTCACAATTTAT 3’ -CTAATTATAAGAGTTAACACTCGCGAGTGTTAAATAGC 5’ Ciał (#4438) (SEQ ID Numery: 32, 33)

182 567

Ekspresja r-HuMGDF, klonowanego do pAMGl 1, zachodzi pod wpływem syntetycznego indukowalnego laktozą promotora, takiego jak Ps4, mającego następującą sekwencją:

5’ GACGTCTCATAATTTTTAAAAAATTCATTTGACAAATGCTAAA-ATTCTTGATTAATATTCTCAATTGTGAGCGCTCACAATTTATCGAT 3’ (SEO ID Nr: 34)

Promotor Ps4 represjonuje się represorem laktozy (Lad), produktem genu laclE. coli

Plazmid pAMG 11-r-HuMGDF był następnie transformowany do szczepu K-12 E. coli, zawierającego alleje lacF. Allela LacF stanowi mutację w obrębie promotora lacl, która zwiększa ekspresję Lacl i prowadzi do ściślejszej kontroli ekspresji proteiny z promotora Ps4. Dlatego też w tym szczepie, pod nieobecność laktozy, ekspresja r-HuMGDF jest represjonowana przez Lad. Pod wpływem dodania laktozy, związanie proteiny Lacl do miejsca operatora w promotorze Ps4 ulega redukcji i rozpoczyna się transkrypcja r-HuMGDF z Ps4. Komórka gospodarza E. coli wykorzystana w tym przykładzie została zdeponowana pod numerem ATCC # 69717 dnia 30 listopada 1994 roku.

Komórkę gospodarza E. coli ATCC # 69717 transformowano plazmidem pAMGll-rHuMGDF i prowadzono jej hodowlę w myśl następującego opisu fermentacji. Szczep E. coli zaszczepiono do brzeczki Luria, a następnie inkubowano w temperaturze 30°C przez około 12 godzin. Następnie komórki w aseptycznych warunkach przeniesiono do fermentatora, który zawierał pożywkę o następującym składzie: 20 g/L ekstraktu drożdży; 3,4 g/L kwasy cytrynowego; 15 g/L K₂HPO₄; 15 ml Dow P2000; 5 g/1 glukozy; 1 g/L MgSO₄ x 7 H₂O; 5,5 ml/L mikroelementów metalicznych; 5,5 ml/L witamin. W tym środowisku proces przebiega do chwili, kiedy hodowla osiąga gęstość optyczną 5,0± 1,0 przy 600 nm. Następnie rozpoczyna się faza doprowadzania dodatkowych pożywek i najpierw wprowadza się pierwszą pożywkę uzupełniającą(700 g/L glukozy; 6,75 g/L MgSO₄ x 7 H₂O). Szybkość wprowadzania dostosowuje się co 2 godziny zgodnie z ustalonym schematem. Początek wprowadzania drugiej pożywki uzupełniającej (129 g/L peptonu triptykazy; 258 g/L ekstraktu drożdży) rozpoczyna się gdy hodowla osiągnęła gęstość optyczną 20-25 przy 600 nm. Drugą pożywkę doprowadza się ze stałą prędkością, podczas gdy nadal okresowo dostosowuje się ilość podawanej pierwszej pożywki uzupełniającej. Temperaturę podczas całej fermentacji utrzymuje się na poziomie około 30°C. Hodowlę utrzymuje się w środowisku o pH około 7 dodając, w miarę potrzeb, kwasu lub zasady. Pożądany poziom rozpuszczonego tlenu utrzymuje się przez mieszanie oraz dostosowywanie stosunku ilości doprowadzanego do fermentatora powietrza do ilości doprowadzanego tlenu. Kiedy gęstość optyczna hodowli osiąga wartość 57-63 przy 600 nm, rozpoczyna się dodawanie trzeciej pożywki uzupełniającej. Trzecią pożywkę (300 g/1 laktozy) wprowadza się do fermentatora ze stałąprędkością; przerywa się dodawanie pierwszej pożywki, a szybkość podawania drugiej pożywki zmienia się na inną stałą wielkość. Fermentacja trwa około 10 godzin od rozpoczęcia podawania trzeciej pożywki. Przy końcu fermentacji hodowlę oziębia się do temperatury 15 ± 5°C. Komórki zbiera się przez odwirowanie. Końcową pastę pakuje się i przechowuje w temperaturze <-60°C.

Oczyszczanie rekombinantowego MGDF wytworzonego przez E. coli, jak to opisano powyżej, prowadzono jak następuje. 1800 gramów pasty komórkowej zawieszono w około 18 litrach 10 mM EDTA i przepuszczano przez wysokociśnieniowy homogenizer pod ciśnieniem 15.000 psi. Zawiesinę porozrywanych komórek odwirowano i części stałe ponownie rozprowadzono do uzyskania zawiesiny w 10 litrach 10 mM EDTA, Zawiesinę tę odwirowano i 200 g otrzymanych części stałych rozpuszczono w 2 litrach roztworu 10 mM Tris, 8 M chlorowodorku guanidyny, 10 mM DTT, 5 mM EDTA, pH=8,7. Roztwór ten powoli rozcieńczono w 200 litrach roztworu 10 mM CAPS, 3M mocznika, 30% glicerolu, 3mM cystaminy, 1 mM cysteiny, pH=10,5.

182 567

Rozcieńczony roztwór mieszano powoli przez 16 godzin w temperaturze pokojowej, a następnie doprowadzono pH do wartości 6,8. Roztwór o wyrównanym pH sklarowano i wprowadzono na 2-litrową kolumnę wypełnioną CM Sepharose, doprowadzono do równowagi roztworem 10 mM fosforanu sodu, 1,5 mocznika, 15% glicerolu, pH=6,8. Po załadowaniu, kolumnę przemyto roztworem 10 mM fosforanu sodu, 15% glicerolu, pH=7,2. MDGF eluowano roztworem 10 mM fosforanu sodu, pH = 7,2 z gradientem od 0 do 0,5 M chlorku sodu.

Eluat CM zatężono i dokonano wymiany buforu na 10 mM fosforanu sodu pH=6,5 stosując membranę odcinającą cząstki o ciężarze cząsteczkowym 10.000. Zatężony roztwór do około 2 mg/ml zadano katepsynąC (stosunek molowy 500:1) przez 90 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie roztwór wprowadzono na wysoko wydajną 1,2 litrową kolumnę wypełniona SP Sepharose, doprowadzoną do równowagi roztworem 10 mM fosforanu sodu, 15% glicerolu, pH=7,2. Po załadowaniu, MGDF eluowano roztworem 10 mM fosforanu sodu, o pH=7,2 z gradientem od 0,1 do 0,25 M chlorku sodu.

Następnie do eluatu z wysoko wydajnej kolumny SP dodano siarczan amonowy, do stężenia 0,6 M. Eluat ten wprowadzono na 1,6 litrową kolumnę typu Phenyl Toyopearl doprowadzoną do równowagi roztworem 10 mM fosforanu sodu, 0,6 M siarczanem amonu, o pH=7,2. Pik MGDF wyeluowano roztworem 10 mM fosforanu sodu o gradiencie siarczanu amonu od 0,6 do 0 M.

Eluat z powyższej kolumny zatężono i dokonano wymiany buforu na 10 mM TRIS, 5% sorbitolu, pH=7,5, stosując membranę odcinającą cząstki o ciężarze cząsteczkowym 10.000.

Przykład XIII. Biologiczne właściwości r-HuMGDF (E. coli 1-163), in vivo r-HuMGDF (E. coli 1-163), otrzymany jak opisano w przykładzie XII, badano na biologiczną skuteczność względem gryzoni. Zdrowym, żeńskim osobnikom myszy Balb/c, wstrzykiwano podskórnie przez 5 kolejnych dni rosnące dawki r-HuMGDF. Dawki zwiększono od 15 pg/kg/dzień do 1500 pg/kg/dzień. 24 godziny po ostatniej iniekcji, zliczono ilość komórek krwi przy użyciu elektronicznego licznika komórek (Sysmex, Baxter). Liniowy wzrost liczby płytek obserwowano przy logarytmicznym wzroście stężenia cytokiny. Ilość płytek wzrosła do 300% wielkości początkowej przy dawce 1500 pg/kg/dzień, w tym ukłądzie. Inne parametry kamionek krwi, takie jak ilość białych lub czerwonych komórek krwi, lub hematokryt, nie uległy zmianie w wyniku tych zabiegów.

Wyodrębniono płytki od szczurów, którym wstrzykiwano podskórnie r-Hu-MGDF (E. coli 1 -163) w dawce 300 pg/kg/dzień przez 6 dni i oceniono ich zdolność agregowania w odpowiedzi na ADP. Wyniki wykazywały, że płytki zwierząt poddanych zabiegom były całkowicie nieodróżnialne od płytek pochodzących od zwierząt grupy kontrolnej pod tym względem, że obie grupy były jednakowo wrażliwe na antagonistę płytek - ADP.

Dokonano również badania r-HuMGDF na zdolność znoszenia stanu trombocytopenii, związanego z zastosowaniem chemioterapii i/lub napromieniowania. Karboplatynę, chemoterapeutyczny środek powodujący silna trombocytopenię u człowieka, używano w tych badaniach. Myszom Balb/c wstrzyknięto podskórnie 1,25 mg karboplatyny na początku badań. Począwszy od 24 godziny, myszom wstrzykiwano codziennie 100 pg/kg/dzień r-HuMGDF (E. coli 1-163), lub sam nośnik, przez pozostałe dni badań. Po 9 dniach liczba płytek spadła z grubsza do 15% normalnej ilości u myszy, którym podawano sam nośnik, lecz pozostała na poziomie wyjściowym u myszy, którym podawano r-HuMGDF (patrz rysunek fig. 16). W badaniach z naświetlaniem, myszy traktowano jedna dawką 500 radów promieniowania gamma (źródło cezowe). Jest to dawka subtelna, która powoduje 90% redukcję liczby płytek po 11 dniach. Liczba płytek nie powraca do normalnej wartości do 21 dnia. Kiedy naświetlonym myszom podawano r-HuMGDF (E. coli 1-163) raz dziennie (100 pg/kg/dzień) od 1 do 20 dnia od naświetlania, spadek liczby płytek był mniej drastyczny oraz powrót do wartości wyjściowej szybszy niż w przypadku myszy traktowanych samym nośnikiem (fig. 21). W celu zbadania r-HuMGDF w modelu ektremalnej i przedłużonej trombocytopenii, zastosowano karboplatynę i naświetlanie łącznie (fig. 22). W tych warunkach liczba płytek spadła do ekstremalnie niskiego poziomu (3-5% normalnej wartości) i większość zwierząt (7/8) nie przeżyło tych prób. Jednakże, gdy zwierzętom tym wstrzykiwano

182 567 codziennie podskórnie r-HuMGDF w dawce 100 pg/kg/dzień przez cały czas badań, trombocytopenia w znaczący sposób ustąpiła, powrót do wyjściowego poziomu liczby płytek nastąpił szybciej, a wszystkie (8/8) zwierzęta traktowane r-HuMGDF przeżyły.

Przeprowadzono również badanie r-HuMGDF na małpach rezusach. Zdrowym małpom rezusom wstrzykiwano podskórnie 2,5 bądź 25 pg/kg/dzień, przez 10 dni (dni 0-9). W grupie zadawanej mniejsząilościąpreparatu ilość płytek wzrosła o 400% w 12 dniu, a w grupie przyjmującej większą dawkę - o 700%, również w 12 dniu. Po zaprzestaniu iniekcji ilość płytek wróciła do normalnej liczby w 25-30 dniu. Białe i czerwone komórki nie uległy zaburzeniom pod wpływem tego zabiegu.

Wykonano badania r-HuMGDF (E. coli 1-163) również na modelu ciężkiej trombocytopenii u naczelnych (fig. 23). Zwierzęta poddano naświetlaniu (700 radów, źródło kobaltowe), w wyniku czego w 15 dniu liczba płytek uległa redukcji do 1-2% wartości normalnej. W 35-40 dniu ilość płytek wróciła do normalnej wartości. Dla kontrastu liczba płytek u napromieniowanych zwierząt, którym codziennie podawano r-HuMGDF (25 pg/kg/dzień), spadła tylko do 10% wartości normalnej i średnio nie zeszła poniżej wartości 20.000/pl- tj. wartości przy której dokonuje się transfuzji płytek w przypadku trombocytopenii u ludzi. Powrót do wyjściowej liczby płytek był również szybszy u zwierząt, którym podawano r-HuMGDF i następował do 20 dnia.

Powyższe dane z badań in vivo na gryzoniach i naczelnych, w pełni potwierdzają koncepcje, że r-HuMGDF (E. coli 1-163) jest środkiem terapeutycznym o dużych możliwościach i zdolności istotnego oddziaływania na klinicznie doniosła trombocytopenie.

Przykład XTV. Sposób otrzymywania r-HuMGDF 1-332 na drodze hodowli komórek CHO

Glikozylowany dzień r-HuMGDF 1 -332 wytwarza się z transfekowanych komórek jajnika chomika (CHO) dokonujących ekspresji cDNA dla MGDF 1-332 pod wpływem odpowiedniego promotora i powiązanego z kodowaniem genu amplifikowalnego markera selekcji - DHFR. Stosowanym promotorem dla ekspresji MGDF w komórkach CHO jest SRa. Patrz: Mol.Cell.Biol. 8: 466-472 (1988) oraz WO 91/13160 (1991). Stosowanym wektorem dla ekspresji MGDF w komórkach CHO jest pDSRa2. Patrz WO 90/14363 (1990). Przykładowa linia komórkowa CHO może wytwarzać wydzielany MGDF w zakresie 10-20 mg/L w standardowej pożywce do hodowli komórkowej, ale zakres ten można podwyższyć od 25 do 100 mg/L. W celu wytwarzania MGDF za pomocą typowej linii komórkowej, hodowlę można rozszerzyć przez wprowadzenie do pojemnika do hodowli tkankowej lub hodowli w zawiesinie w sposób właściwy dla wzrostu, stosując pożywkę składającą się w równych częściach z DMEM - pożywki Eagle modyfikowanej przez Dulbecco i DMEM/F12 - F12 Hama (Gibco) uzupełniona 5-10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) lub dializowanej płodowej surowicy bydlęcej i metotreksanu (ΜΤΧ) (jeśli zachodzi potrzeba; typowo stężenia ΜΤΧ wynosi 200 -600 nM) aby utrzymać ciśnienie selekcji. Pożywka ta powinna być uzupełniona dodatkowymi nieistotnymi aminokwasami (NEAA'S) i glutaminą. Hodowle w zawiesinie mogą propagować z łatwością pomiędzy gęstościami szczepienia (rozdzielenia) rzędu 1-4 χ 10⁵ komórek/mL i maksymalnymi gęstościami około 1 χ 10⁶ komórek/mL, w którym to momencie hodowle ekspanduje się przez rozcieńczenie do większych objętości z początkowymi gęstościami komórek na poziomie wyszczególnionych gęstości rozdzielania.

W celu wytwarzania MGDF w butelkach walcowych konieczne jest wygenrowanie odpowiedniej objętości hodowli w zawiesinie o odpowiedniej gęstości komórkowej, stosując albo obrotowe pojemniki z mieszadłem magnetycznym umieszczone w warunkach kontrolowanej temperatury (37 ± 1°C), albo układ oprzyrządowanego, sterowanego bioreaktora zbiornikowego z mieszaniem. Walcowe butelki (takie jak walcowe butelki o objętości 850 cm² typu Falkon) powinny być zaszczepione przy początkowych gęstościach rzędu 1,5 do 3 χ 10⁷ komórek na butelkę i uzupełnione dodatkową odżywką wzrostową (DMEM/F12 z 5-10% FBS, IX NEAA i IX L-glutaminą) w ilości odpowiedniej do wygenerowania współbieżnej monowarstwy w ciągu 3-4 dni (150-300 ml na butelkę). Pożywka wzrostowa powinna być stosownie zbuforowana roztworem kwaśnego węglanu sodu do pH od 6,9 do 7,2 w równowadze z dwutlenkiem węgla po cząstkowym ciśnieniem od 60 do 90 mm Hg. Butelki powinny być napełnianie gazem o zawar

182 567 tości 10% CO₂ w powietrzu i inkubowanie zjednoczesnym obracaniem (= 1 rpm) w temperaturze 37 ± 1°C przez 3-4 dni. Po zlaniu, walcowe butelki powinny być przeniesione do wolnej od surowicy pożywki produkcyjnej przez wylanie lub odessanie pożywki wzrostowej; przemywanie butelek izotonicznym buforem jakim jest solanka w buforze fosforanowym produkcji Dulbecco (D-PBS), w ilości 50-100 ml na butelkę; a następnie dodanie odpowiedniej objętości zbuforowanej kwaśnym węglanem, wolnej od surowicy pożywki DMEM/F12 (1:1) (200-300 ml na butelkę), uzupełnionej dodaniem NEAA i L-glutaminy oraz siarczanu miedzi w celu zminimalizowania agregacji kowalentnej (1-10 μΜ). Butelki powinny być napełnione powietrzem z dodatkiem 10% CO₂ i inkubowano przez 6 ± 1 dni w temperaturze 37 ± 1 °C z obracaniem (około 1 obrót na minutę), albo do momentu aż aktywność metaboliczna obniży poziom glukozy do poniżej 0,5 g/L i/lub poziom pH poniżej 6,6. Kondycjonowane pożywki mogą być zebrane przez zlanie lub odessanie z butelek i zastąpione świeżą, pozbawioną surowicy pożywką produkcyjną j ak opisana wyżej, dla dodatkowych zbiorów. Tak można postępować aż komórki stracą zdolność produkcji w wolnym od surowicy środowisku i wypadną z walcowanych butelek.

Zebrana kondycjonowana pożywka może być poddana przeróbce w celu oczyszczenia na drodze mikrofiltracji do punktu końcowego przez filtry 0,45 pm i/lub 0,2 pm (Sartorius Sartobran pH lub ΡΑΠ). Przesączona kondycjonowana pożywka powinna być ochłodzona do temperatury 4°C, po czym albo przechowywana krótko w temperaturze 4°C, lub natychmiast zatężona i zdializowana do niskiej mocy jonowej przy użyciu poprzecznego przepływowego systemu ultrafiltrującego (np. Filtron YM-50). Ultrafiltrację i dializowanie należy prowadzić w temperaturze 4°C w celu zminimalizowania degradacji białek. Kondycjonowana pożywka powinna być poddana dializie z buforowanym roztworem wodnym (np. 10 mM fosforanu potasu, pH=6,8) przed etapami oczyszczania chromatograficznego.

Jakość produktu w kondycjonowanej pożywce najlepiej monitoruje się stosując nieredukcyjne bibułki SDS-PAGE Western, która to metoda ujawnia względne ilości zagregowanego, monomerycznego i proteolitycznie zdegradowanego MGDF w próbkach.

Inny sposób otrzymywania MGDF z komórek CHO może polegać na adaptacji linii komórkowej ekspresjonującej MGDF do wolnej od surowicy pożywki, takiej jak Gibco S-SFMII. Adaptację komórek można przeprowadzić przez seryjne przepuszczenie w pożywce zawierającej lub nie minimalny dodatek surowicy. Jeżeli linia komórkowa okaże się rosnąć nieprzerwanie w takiej pożywce z jednoczesnym wydzielaniem odpowiedniej ilości MGDF, produkcja może przebiegać poprzez zwiększanie skali inokulowanej hodowli, przez serię przejść w stopniowo zwiększanej objętości hodowli, następnie inokulację odpowiedniego pojemnika produkcyjnego (oprzyrządowanego, sterowanego bioreaktora zbiornikowego z mieszaniem) i pozwolenie hodowli na proliferację do jej maksymalnej gęstości z zachowaniem żywych komórek w warunkach optymalnych dla wzrostu (pH, środki odżywcze, temperatura, tlen, zbiory). W optymalnym momencie produkcji (określanym doświadczalnie przez pomiar ilości i jakości produktu) można dokonywać zbioru hodowli z bioreaktora i oddzielać komórki od kondycjonowanej pożywki przez filtrację wgłębną w skali mikronowej lub submikronową filtrację membranową z przepływem poprzecznym. Jeżeli stosuje się filtrację wgłębną, pożywkę należy dodatkowo sklarować na drodze submikronowej filtracji do punktu końcowego przed zatężaniem i dializowaniem, jak opisano powyżej.

Podczas gdy obecny wynalazek opisano wyżej zarówno w formie ogólnej jak i ze wskazaniem korzystnych przykładów realizacji, jest zrozumiałe, że odmiany i modyfikacje będą możliwe do wykonania przez fachowców z tej dziedziny techniki po zapoznaniu się z powyższym opisem. Intencją zatem jest, aby załączone zastrzeżenia obejmowały wszystkie takie odmiany i modyfikacje wynikające z zakresu zastrzeganego wynalazku.

Dodatkowo, publikacje i inne materiały cytowane w celu naświetlenia podstaw wynalazku, a w szczególności wskazania dodatkowych szczegółów z zakresu praktycznej realizacji, przywoływane są na zasadzie odnośnika literaturowego i stanowią część dokumentacji.

Claims (12)

1. Polipeptyd stanowiący czynnik wzrostu i rozwoju megakariocytów - MGDF, wybrany z grupy polipetydów obejmującej:

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-195 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-2;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-172 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-4;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-177 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-5;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-191 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-6;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-198 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-7 oraz

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-265 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-8.

2. Wyizolowany polinukleotyd kodujący polipeptyd stanowiący czynnik wzrostu i rozwoju megakariocytów - MGDF, wybrany z grupy polipeptydów obejmującej:

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-195 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-2;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-172 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-4;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-177 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-5;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-191 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-6;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-198 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-7 oraz

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-265 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-8.

3. Wyizolowany polinukleotyd według zastrz. 2, znamienny tym, że jest sekwencjąDNA.

4. Wyizolowany polinukleotyd według zastrz. 3, znamienny tym, że jest sekwencją cDNA.

5. Wyizolowany polinukleotyd według zastrz. 4, znamienny tym, że jest sekwencja cDNA odpowiada sekwencji przedstawionej na rysunku fig. 11.

6. Wektor DNA obejmujący wyizolowany polinukleotyd kodujący polipeptyd stanowiący czynnik wzrostu i rozwoju megakariocytów - MGDF, wybrany z grupy polipeptydów obejmującej:

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-195 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-2;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-172 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-4;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-177 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-5;

182 567

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-191 przedstawionych na rysunku fig, 11, określany jako MGDF-6;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-198 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-7 oraz

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-265 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-8, stanowiący sekwencję DNA, będącą sekwencją cDNA.

7. Wektor DNA według zastrz. 6, znamienny tym, że wskazana sekwencja DNA jest operacyjnie związana z sekwencją DNA zdolna do kierowania ekspresją.

8. Komórka gospodarza trwale transformowana lub transfekowana wyizolowana polinukleotydem kodującym polipeptyd stanowiący czynnik wzrostu i rozwoju megakariocytów MGDF, wybrany z grupy polipeptydów obejmującej:

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-195 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-2;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-172 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-4;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-177 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-5;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-191 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-6;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-198 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-7 oraz

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-265 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-8, stanowiący sekwencję DNA, będącą sekwencją cDNA.

9. Komórka gospodarza według zastrz. 8, znamienna tym, że ma zdolność ekspresji polipeptydu MGDF kodowanego wskazaną sekwencją DNA.

10. Sposób produkcji polipeptydu stanowiącego czynnik wzrostu i rozwoju megakariocytów - MGDF, wybranego z grupy polipeptydów obejmującej:

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-195 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-2;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-172 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-4;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-177 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-5;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-191 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-6;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-198 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-7 oraz

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-265 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-8, w którym prowadzi się hodowlę komórki gospodarza w odpowiedniej pożywce, a następnie izoluje się wytworzony związek z tej komórki lub z pożywki, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę komórki gospodarza trwale transformowanej lub transfekowanej wyizolowanym polinukleotydem kodującym polipeptyd stanowiący czynnik wzrostu i rozwoju megakariocytów - MGDF, wybrany z grupy polipeptydów obejmującej:

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-195 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-2;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-172 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-4;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-177 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-5;

182 567

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-191 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-6;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-198 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-7 oraz

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-265 przedstawionych na rysunku fig. 11, określany jako MGDF-8, stanowiącym sekwencję DNA, będącą sekwencją cDNA mającej zdolność ekspresji polipetydu MGDF kodowanego wskazaną sekwencją DNA, a następnie izoluje się wskazany polipeptyd MGDF z tej komórki lub tej pożywki.

11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że jako komórkę gospodarza stosuje się komórkę E. coli.

12. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że jako komórkę gospodarza stosuje się komórkę jajnika chomika - CHO.