JPH06502621A

JPH06502621A - ヒトｍｅｇ―ｃｓｆタンパク質と方法

Info

Publication number: JPH06502621A
Application number: JP3512921A
Authority: JP
Inventors: マーフィ，マーチン　ジェイ; パーチメント，ラルフ　イー; エリクソン―ミラー，コニー　エル; ダイ，ウェイ; ツァン，ツァオ―ゲン; リオッタ，ランス　エイ; クルツシュ，ヘンリー
Original assignee: ヒップル　キャンサー　リサーチ　センター
Priority date: 1990-07-02
Filing date: 1991-07-02
Publication date: 1994-03-24
Also published as: EP0540575A4; EP0540575A1; KR930701475A; WO1992000319A1; AU8215591A; FI925983A; CA2086248A1; FI925983A0

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトＭＥＧ−ＣＳＦタンパク質と方法発明の利用分野本出願は、１９９０．７．２に出願された合衆国特許請求通し番号５４７．５７３の続報である。上記発明の全体の記述はそれ全体をｔＳすることにより具体化される。　一本発明は単離されたヒト巨核球コロニー刺激因子タンパク質（ｈＭｅｇ−ＣＳＦ）　、前述の因子を包括する薬学上の明確な説明、そしてその生成、単離に関する方法に関するものである。

発明の背景ヒトにおいて、増血システムすなわち血液形成システムは、骨髄と血液とを含む。骨髄は、血液の細胞質をつくる因子である。ホ乳動物（ヒトを含む）の血液は、血小板あるいはスロンボサイトと呼ばれている微細な細胞フラグメントと、赤血球（エリスロサイト）と呼ばれている高度に分化した細胞と、血漿中に懸濁されているすべての白血球（ロイコサイト）とから構成されている。血小板はホ乳動物の凝固システムにおいて不可欠な機能をする。それは創誘発化学物質中の反応において、それらは血液の凝固をもたらすという機能である。赤血球はその特徴的な深い赤色を血液にもたらし、さらに酸素（０２）とその他の栄養とを人体の細胞へと輸送している。その細胞では、０２とその他の栄養分とは二酸化炭素（ＣＯ２）　と余剰生成物とに交換されている。

一方、白血球は感染に対して身体を防御している。なぜならば、身体中の血液は一定の動き、すなわち血管の閉じたネットワークを通じ循環しており、血小板と血液細胞との両方とも通常血漿中で良く懸濁されているからである。

成熟光、白血球、および血小板、すなわち血液の細胞質成分は、ヒト骨髄中で形成された原始未分化前駆細胞から形成される。これらの未分化前駆細胞は、プルリボテント（ｐｌｕｌｉｐｏｔｅｎｔ　）幹細胞、あるいはプロジェニター　（ｐｒｏｇｅｎ　１ｔｏｒ）細胞としてさまざまに呼ばれている。それらの幹細胞は、成熟エリスロサイト（赤血球細胞〉、ロイコサイト（白血球）、または巨撞球（小板生成物）のいずれかに分化、および発生させる能力を有している。このため、幹細胞は成熟赤血球、白血球、および目積球に対して、原始プルリボテント（ｐｌｕｌｉｐｏｔｅｎｔ　）前駆体とみなされる。いいかえれば、造血／ステムの高位特異血液細胞は、図６中に描かれたように骨髄中で生成された原始未分化幹細胞から発達される。

幹細胞成長と血液細胞への分化、すなわち赤血球、白血球、あるいは目積球のいずれかへの分化は、適切な造血素により調整されていると今日では一般に認められている。造血素もまた一般的には血液細胞成長因子として知られており、プルリボテント幹細胞の成熟血液細胞への成長と分化を促進する、分化した糖タンパク質のグループに分化される。図６参照。コロニー刺激因子（ＣＳＦＳ）は造血成長因子、あるいはタノバク質の特殊なりラスに属しており、それらは前駆細胞増殖と異なる種類の発達した血液細胞への分化を開始する能力があると信じられている。言い換えると、ＣＳＦ５は特異血液細胞系にしたがって、原始未分化前駆細胞が単分化へと発達することを誘因する因子になると信じられている。すなわち赤血球、白血球、または目積球系のいずれかへと単分化すると信じられている。したがって、原始未分化前駆細胞から生ずる成熟血液細胞の特異型は、造血素のタイプに依存して幹細胞エンカウンター（ｅｎｃｏｕｎｔｅｒｓ）となる。

例えばエリスロヂエティ７　（ＥＰＯ）は、骨髄中の原始未分化前駆細胞に赤血球系を犯すよう誘因する。すなわち赤血球に分化そして成熟させるのに対して、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は前駆細胞を顆粒球および単球と呼ばれる白血球の特異皇へと分化そして成熟させると信じられている。

小板は目積球分化の基幹生成物である。目積球もまた、図６に描かれたように、骨髄の原始未分化前駆細胞から発生している。骨髄中の幹細胞から造られた早期に認められる目積球の仲間は、顆粒芽球く諧ｅｇａｋａｒｙｏｂｌａｓｔｓ　）であり、それは最小数の１１粒細胞を有する好塩基性細胞質中にはめこまれた未熟核を有している。上記顆粒芽球と目積球とは、未分化細胞表面マーカー：マウス細胞中のアセチルコリ／ステラーゼと、ヒト細胞中のＩＩ　ｂ／ＩＩｌ　ｂにより見分けることができる。複雑な成熟過程を通して、顆粒芽球は顆粒球へと成熟する：その過程は、図６に示されたように、分葉された倍数体積の形成と、独特の高度に特異化された細胞質性顆粒球とを伴っている。成熟した目積球はそれらの細胞質のフラグメントをもぎとり、そしてそれらを循環する血液中へ放出することにより、図６に描かれたように、まだ良く理解されていない過程により血小板を形成する。

以上示したように、小板は血液凝固を調整する臨界の瞬間の細胞質性フラグメントである。循環段階の血小板の消耗は、血小板減少症（ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎ　ｔａ）と呼ばれ、様々な臨床状態と病気とにおいて起こる。この血小板減少症は危険である。なぜなら、この状態の患者は、容易に出血状態が制御されなくなるからである。もし血小板減少症の原因が外的発作や損傷（目積球と血小板との生成、または成熟における無秩序に対抗するような）であると、傷や発作（化学的な）取り除かれた場合、血小板の水準はたいてい短い時間（ひとにおいでは４から５日程度）で回復される。しかし、もし血小板疾病がこの状態の下にあるなら、それは疾病が残っている間持続し、しばしば患者の生命を奪う。残っている時間での唯一の治療では、それが伴うすべての付随した危険（その範囲は感染から免疫反応までである）を伴うが、頻繁に血小板の輸血がなされてきた。

合衆国中のほぼ２４．０００の血小板減少症徹者が化学療法を受けている。加えて、癌でなはいその他の疾病である５、　００００の徹者も血小板減少症である。したがって、より多くの人が一刻も早く確認手段の技術と、ヒトにおける血小板生成の促進方法とを、開発するようにと望んでいる。

目積球−血小板特異造血素を鑑定することにおいて、発展がなされているが、目積球新生、すなわち目積球生成物の調整に関しては余り発展していない。いくつかの体液因子は、目積球の成熟を制御できるであろうと仮定されてきた。最近得られたある物質は、スロンボボエテイン（ｔｈｒｏ■ｂｏｐｏｉｅｔｉｎ　：　ＴＰＯ）あるいは血小板刺激因子　（ＴＳＦ）と呼ばれ、活性が誘因される素に依存している。最近、１つ以上の調整因子を含んでいる目積球刺激因子の２元的なレベルの調整があることの証拠が蓄積されている。最近のデータは、目積球新生第一段階において目積球コロニー刺激因子（Ｍｅｇ−ＣＳＦ）が含まれることを示唆している。このＭｅｇ−ＣＳＦは、成熟未分化前駆細胞が、骨髄中で目積法線（ｌｉｎｅａｇｅ）　盟細胞へと単分化そして分化する因子であることを示している。最近ので一夕はまた、目積球新生の第２段階、すなわち重分化細胞の十分分化されるための成熟モして目積球成熟は、スロンボブラスチンにより調整されることを示唆している。　そして事実、スロンボポエティンの血液濃縮は、循環血小板の水準の変化により順次影響されている。例えば、マーフィー、ＭＪｌ、他、（文献：アクタヘマトル　日本）４６（７）：１３８０−１３９６　（１９８３）；ホフマン、Ｒ６、他、（文献：　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　１ｎｖ＊ｓｔ、）７５；１１７４−１１８２　（１９８５）；クリヤ、Ｓ１他、（文献：血液細胞）　ｉ２＋２３３−２４７　（１９８６）Ｘヤング、Ｙ−Ｃ，、他、（文献、ｊ。

Ｃ１１ｎ、ＩｎｖＣ３ｉ、＞　７７　：　ｌ　８７３−１８８０　（１９８６）　：クリャ、Ｓ、他、（文献：Ｅｘｐｌ、Ｃｅ１１．８ｉｏ！、）　５　５　：　２５７−２６４　（１９８７）　；ヒラメ、Ｔ５、（文献：　Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃｅ１１．Ｃｌｏｎｉｎｇ、８　（Ｓｕｐｐｌｅ、ｌ）　：　１５５−１６７　（１９８９）　；ホフマン、Ｒ１他、（文献：ヘマトール１０ｎｃｏｌ　クリエックス　Ｎ、　Ａｉ＋ｓｒ、　Ｈｅｍａｔｏｌ、　０ｎｃｏ１．）３　（３）：４６５−４７８　（１９８９）；そして、オが夕、Ｌ、％Ｒｈ、（文献　Ｉｎ＋、、１．ｃ＋＋ｌｌ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　８　：　＋　０３−１　２０　（１９９０）　を！ＩＩ照。

それより１１は過去において、Ｍｅｇ−ＣＳＦを含む数腸の造血素の確認と単離とが試みられた。例えば、テラムラ、Ｍ、他、（文献：　ＥｙｐＪｅ＋＋ａｔｏ１．１６　：　８４３−８４８　（１９８８））は、インターロイキン−３（ＩＬ−３）タンパク質について開示している。このタンパク質は、約１４−２８，０００ドルトンの分子量を有しており、約４゜ｓ−ｇ、ｏに等しい等電ポイント（Ｐｉ）を有している。さらに、このＩＬ−３タンパク質は、生体内で、顆粒球、マクロファージ、赤血球、目積球コロニーの骨髄からの形成を刺激する能力を有することが報告されている。

また、ＩＬ−３のヒト型は橿−特異性であり、ある生体外でのマウスフィブリン凝血検定では目積球生成不能であったということも報告されている。

ウィリアムス、に１、他、（文献：Ｅｘｐ、Ｂｅｍａｔｏｌ、）　ｌ　２　：　７３４−７４０　（１９８４）、はエリスロポエティン（ＥＰＯ）の反応を報告している。このＥＰＯはそれぞれ等電点的３．１−３．５と４．４−４．９とで２つのび−りを有しており、そして分子量は約３４−３９．ＯＱＯダルトンである。加えてＥＰＯは、生体外で骨髄から赤血球と巨咳球コロニーと形成を刺激する能力があると信じられている。カワキタ、Ｍ１他、（文献：目積球形成と機能中の、ヒト尿巨核細胞コロニーと血小板新生−刺激因子、２０１−２０８　（１９８６）；イノパン、Ｔ７、他、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｓｎｔ、　７９　：２８６−２８９　（１９８７））：そしてサカグチ、輩１、他、（文献：　Ｅｘｐ、　［Ｉｅｍａｔ。

１．１５：１０２８−１０３４　（１９８７））を参照。しかしながら、ＥＰＯは生体内では、血小板製造を刺激しない。

マズール、ＥＭ他、（文献　Ｅｘｐヘマトールｌｓ＋１１２８−１１３３（１９８７））は、顆粒細胞／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質の単離を報告している。ＧＭ−ＣＳＰは、分子量がおよそ＋４−３５．［１００ダルトノの酸性のタンパク質であり、ＰＩは４５から５３（遊離した状１から得られた時）または４．０から４６（含有されている状態から得られた時）に等しいと報告されている。ＧＭ−Ｃ３Ｆは、生体外では大食細胞のｍ粒細胞と、骨髄からの目積球コロニーとの形成を刺激するものであり、特殊な種類であると報告されている。同様にイノパン、Ｔ池、（文献：血液７５：１４３３−１４３８（１９９０））をＩＩ照。

インターロイキン−６（ＩＬ−６）タンパク質は、すでに文献で報告されている。

＋１．−６は、およそ２１−２６．０００ダルトンの分子量を有しており、骨髄腫の成長因子のクロマトフォーカ／ングによって決定される、ＰＩはほぼ６．２ −６．４に等しい。ＩＬ−６は成熟巨核球のサイズ、高位ブロイディー（ｐｌｏｉｄｙ）を有する巨槓球の数、そして生体内における目積球コロニー内の細胞（それらは皆成熟した様相の作用をする）の数を増大させる能力を有すると報告されているが、既報のＩＬ−６は生体外における目積球コロニーを生成する能力に欠けているとも報告されている。たとえば、ロテムＪ、他（文献：血液？４：１５４Ｓ−１５５１（１９８９１）　；　インバシＴ、他　（文献：ＰｒＮａＬｌ、Ａｅａｄ、Ｓｃｉ、　Ｈ＋５９５３ −５９５７（１９ｇ９））　：およびブルーノＥ、他　（文献：　Ｅｘｐ、　Ｈｅｍａｔｏｌ、　１７＋１０３８−１０４３（１９８９））をＩＩ照。

イシバン７．他　（文献：　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８６：５９５３−５９５７（１９８９））はスロンボポエティン（ＴＰＯＩの遊離について報告している。このＴＰｏタンパク質は、およそ１５．０００ダルトンの分子量を有する好酸性タンパク質であり、そのＰｉは４．５に等しい。加えてスロンボポエティンタンパク質は２−メルヵブートエタノールで安定している。このＴＰＯは、目積球の直径および成熟タイプの機能を増大させるが、生体外において、骨髄からの目積球コロニーの形成を刺激することはできないと報告されている。マクドナルド、　Ｔ、Ｐ、Ｉｆｈ、　（文献：ＩｎＬＪ、セルクロー二ングフ：１３９−１（１９８９））　：　ライ！Ｊ　７　Ａズ」、他、（文献：Ｅｘｐ、ヘマトール、１２ニア３４−７４０（１９８４））　：ウィリアムｘ、Ｈ他（文献：　血液細胞５：４３（１９７９））　；　レビンＪ、他、（文献：血液６０９８９（１９１１２））　：およびストラネバ、　Ｊ、　Ｅ、　、他、（文献：　Ｅｘｐ、　ヘマトール、１）：１１２２−１１２７（１９８９））参照。

ローゼンバーグ、Ｒ，Ｄ、は、彼の合衆国特許Ｎｏ、　４．８９４．４４０において目積球刺激因子（ＭＳＦ　）について開示している。ローゼンパーグはさらに、このＭＳＦは分子量が約Ｉ５．０００ダルトンであり、かつＰＩが５１の酸性のタンパク質であることを報告しているが、Ｍｅｇ−ＣＳＦの活性については提示していない（合衆国特許Ｎ０１４．８９４゜４４０　ｃｕｔ、　３．６５− ６８行）。すなわち、ローゼンバーグのＭＳＦは、血小板の合成因子４（Ｐｒ４　）と、目積球細胞質の成熟度合いとを増大させるとされているが、生体外においてｆｔＮからの目積球コロニーの組織を刺激することは出来ない。グリーンバーグ、ＳＭ他、（文献：　Ｊ、、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋＋、２６２：３２６９−３２７７（１９８７））　：およびタイレン。

Ｇ、他、（文献：　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔ　２６２：３２ｆ＋２−３２ｆｉ８（１９８７））を参照。

ヤング、　ｙ−ｃ、、ＩＩ！！、　（文猷：血液７４」８８０−１８８４＜１９８９））は、インターイキンー９（ＩＬ−９）タンパク質について報告している。ＩＬ−９は、およそ２０−３０．０００ダルトンの分子量、あるいはマウスｐ４０、ヒトのＩＬ−９のマウス同族体の情報を元にしては３２−３９．０００ダルトノの分子１を有し、ウインテンホフ、Ｃ１他（文献：　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、ＡｃａｄＳｅｉ、８５：６９３４−６９３８（１９８８））にて報告されているように、ｐｉはｐＨ９，５におけるセフ０色層検定よりおよそｌＯであると報告されている。ＩＬ−９タンパク質は、生体外において赤色のコロニー組織を刺激する可能性を持っていると報告されている。ヤ／グ、　Ｙ−Ｃ，他、（文献：血液７４（Ｓｕｐｐｌ、　ｌ）＋１１６ａ（＋９８９））を参照。しかし、生体外における目積球コロニーの組織を刺激する可能性はないと報告されている。

ドナフ！、Ｒ，Ｅ他、（文献：　Ｂｌｏｏｄ、　１９９０．７５＋２２７１−２２７５）を参照。

ウィリアムス、Ｎ、他は目積球ボテンンエイター、つまりそれ自体の生成、およびいくつかの生化学的特徴について研究している。文献く目積球の発達と作用。

ｐ、　９ｌ−１０３（１９８６））では分子量およそ２１．０００ダルトンであり、Ｐｉはそれぞれ約４０．５．０．６．０という３つの頂点を育するメグボテン／エイタータンパク質について報告している。メグボテン／エイタータンパク質は、成熟タイプ機能、目積球のプオイディーを増大させるが、生体外では目積球コロニー形成を刺激しないということが報告されている。スパロー、ｔＬ、、ａ、（文献：ルーケミアレス　ＩＩ・３ｌ−３８（＋９８７＞）を参照。

上記に加えて、研究書違は仮定のＭｅｇ−ＣＳＦ型のタンパク質について報告している。例えば、カワキク１Ｍ９．他、（文献：　Ｂｒ、　Ｊ、ハエマトール　５２：４２９−４３Ｂ（１９８２＞）は、約１５５，０００ダルトン、ゲル濾過（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２００）　Ｌり場合７６．０００ダルトン、６Ｍのグアニジンを用いてゲル濾過した場合４５、（ＪＯＯダルトンである分子量を有しているタンパク質について報告している。カワキク、Ｍ、池（文献：目積球の発達と作用、ｐｐ、　２０１−２０８（１９８６１中のヒトの尿の目積球コロニー、そして刺激因子のスクンボポエ／ス）は、仮定ノＭｅｇ−ｃｓｒ　ｔｖ生物学上特性の存在、および再生不良性貧血患者の尿から得られたＴＳＦ盟タンパク質をについて報告している。その中で、カヮキタは、血漿凝固培養物によるＩＥＦ検定試験後の仮定のＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質は、二つのはっきりした頂点を持ち、その中の最初の頂点はＰＩ３．１−３．５の間で溶出し、第２の頂点はＰＩ４．７−４．９での膚を伴４４で溶出すると舟摘している。このデータは、この仮定のＭｅｇ−ＣＳＦｆｉタンパク質構成物質は７／アーロ−ＥＰＯを含んでいるということを示唆している。ポフマン、Ｒ１他、（文献：Ｊ、Ｃｌ１ｎ、１ｎｖｅｓｔ、　７５：＋１７４−１１８２＜１９８５＞）は、５ＤＳ−ＰＡＧＥによって定量された場合、分子量が４６．ＯＱＯダルトンである仮定均−Ｍｅｇ− ＣＳＦ型タンパク質についてい報告している。しかしながら、後の文献（ホフマン、　ｎ、、血液７４：１１９６−１１８２（１９８５））では、このタンパク質物質は正確なアミノ酸の配列を認められるほど純粋な状態には無いということが報告されている。オガタ、に、他、（文献：　Ｅｘｐ。

Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、　Ｓ７＋１９２６（１９８Ｇ））は、ＥＰＯを伴って大半が汚染されてはいるが、部分的には精製されているタンパク質について報告している。さらに、マズール、Ｅ、Ｍ。

他（文献：　ＥＸｐへ？　ト−ル、　１３：１１６４−１１７２（１９８５））は、セフ　ｙ　’）　’Ｊ　ル５−３００１ｍより測定される、分子量およそ１７５．０００ダルトンを有する、部分的に精製されたイヌ科物質のタンパク質について報告している。マズール、Ｅ、Ｍ他はその中で、タンパク質物質は、トリプシンによって不活性化された、５層ＭＤＴ丁、６Ｍグアニジン、そして８Ｍ尿素について報告している。

本発明の発明者らもまた仮定のＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質の存在を報告しており、過去において、純粋な同様のヒトのＭｅｇ−ＣＳＦ型タンパク質の存在を確証すること、そしてその単離および／または特性を明らかにするための不成功な試みを行なってきた。キヨ二キ、０．他、（文献：　Ｉｎｔ、ＪＡｒル／１ｒｙ− ニング８：ＩＯ３−１２０（１９９０１）　：マーフィー、　Ｍ、Ｊ、、　（文献：ヘラトール／オンコル、クリニクスＮ、アメル　３（３１４６５−４７８（１９８９））　：クリャ、Ｓ−１，，他、（文献：Ｅｘｐ、ヘマトール　＋５＋８９６−９０１　（＋９８７））、クリヤ、　Ｓ−１，、他、（文献：　ＥＸｐＩセルパイオル　５５２５フー２６４　（１９ｇ？））　：マーフィー、Ｍ、Ｊ、、他、（文献：アクタへマトール、　Ｊｐｎ、、　４６：１３８０−１３９６　（１９ｇり）　：さらにミャケ、Ｔ、他、（文献：ステムセルス２：１２９− １４４　（１９８２））を膠原。

国際特許出願Ｎｏ　９１１０２００１１９９＋年２月２１日発表は、骨髄移植患者から端離した仮定ヒト巨核球刺激因子の精製を目的としているとされ、マウス繊維系の凝固およびＭｅｇ−ＣＳＰ検定により、目積球コロニーを刺激することを可能にすることを目的としているとされている。５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（１２％）によって単離されたものの分子量は、還元下では２０−２７にＤの範囲であり、他方非還元下では２ｇ−３８ＫＤの範囲に入るとされている。このタンパク質は“均一組織（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）″であると言われているが、この言葉が何を意味するのかという基準は無い。さらに重要なことは、ｈＭｅｇ−ＣＳＦと同様の活動をすると知られているＥＰＯやＧＭ−ＣＳＦのように、この因子は実際他のサイトカインから遊離されたものであるという実証が無いということである。ゲノミックＤＮＡの配列（およびアミノ酸に相当すると推測されている配列）もまた、Ｗｏ　９１１０２００１において明らかにされており、それらには前述の因子を暗号化した配列がどこかに含まれていると推測されている。これらのＤＮＡの配列は、１０９１１０２００１の処置にしたがって単離された、仮定のＭｅｇ−ＣＳＦ因子のトリブ／ンの７ラグメントから導かれたＤＮＡ試験に基づいて単離された物である。しかし、たとえば既になされたＮ−ターミナルと同一のものであるとの同定はなされておらず、Ｍｅｇ−ＣＳＦの活性を有するポリペプチドの暗号化を確認できたことが明らかになっている配列はない。加えて、ＩＦｏ　９＋１０２００１の精製体系は、下記に明らかにされる体系と比較して、異なるステップとコンデイン１ンとを冑している。

したがって、これまできわめて数多くの研究者が、Ｍｅｇ−ＣＳＦタンパク質の単離を突き止めるために研究を試みたが、この仮定されたＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質（あるいは複数のタンパク質）の存在、正体、構造、そして生化学的活性は現在に至っても依然として捕え所がなく、論争の余地を残している。結果として、科学そして医学の共同社会においては、ヒトのＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質の存在、正体、そしてその活性を確Σする、そして血小板減少症との戦い、およびいっそうの理解を目的とした単離、配列、同種の再生の確証、さらに血小板製造のメカニズムを確証するという重要なニーズがある。

ｉ肌立ｌ丘本発明は、上記に言及された単離されたヒトの目積球コロニー刺激因子とそれを得る方法という新規の発見を通しである時点での技術水準の欠点を緩和するものである。

一つの解釈において、本発明は単離精製されたヒトの目積球刺激因子関するものであり、この因子は下記特性を有するものである。その特性とは、ａ）検出可能なＥＰＯとＧＭ−ＣＳＦの活性がない、ｂ〉単一アミノ末端アミノ酸配列の存在によって決定される均−組織であり、そしてドデ／ル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル上の電気泳動の後、単−帯として泳動できる能力を有している、Ｃ）生体外におけるマウスの繊維素の凝固検定において、血清を添加することなしに、単位を形成している目積球コロニー形成をもたらす能力を持っている。

そして単−Ｎ−末端アミノ酸配列は部分的には明かとなっており、このト末端配列を持つ種類の分子量は、５Ｏ−７０ｋＤの範囲内での活動をともない、典型的に５２−５５ｋＤである。同様な活動をするその他のより小さい種は分子量２４ −３５ｋＤを有しており、そしてそれらはときに、とくに還元下ではより大きい種の均一組織の製剤中に共在している。

別の見地では、本発明は、以下に示すことを特徴とする、少なくとも９０％の前述のタンパク質からなり、単離精製されたヒト巨核球コロニー刺激因子調剤法に関するものである。その特徴とは、り　ＥＰＯｌＧＭ−ＣＳＦ、　ＩＬ−３、ＩＬ−９、ＩＬ−６、および他すべての複製された細胞分裂（ｅｙｔｏｋｉｎｅ）活性がない、ｂ）生体外でのマウス繊維素顔ペイ検定におけるユニットを形成する目積球コロニー生成を誘発する能力を備えること。この高度に精製されてはいるが、不均一なｈＭｅｇ−ＣＳＦフラグメントは、血小板生成の機構と同様に、ｈＭｅｇ−ＣＳＦ配列を解明するために用いることができる。

このような殆ど純粋な両分におけるヒトＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質の分子量は、タンパク質がグリコ／レイト型、および／アレイト型（ｓｌａｌｙａｔｅｄ　ｆｏｒｍ　）にあるとき、両方とも５ＯＳ−ＰＡＧＥによる定量では、より小さい化学種は約２４，０００ダルトノと約３５．０００ダルトン、そしてより大きな化学種は約ｓｏ、　ｏｏｏダルトンと７０．０００ダルトンの範囲内にある。その等電点は、両方の化学種の等電フォーカ７ングによる定量では、約７２と７４との範囲内にある。均一で、かつ高度に精製された（事実上純粋である）画分型のｈＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質は、ｈＭｅｇ−ＣＳＦにとって均一であり、ｌ＋Ｍｅｇ−ＣＳＦを池の造血タンパク質からの識別に用いられる特性を有している。

本出願のさらなる見地は、ヒト巨核球コロニー刺激因子活性を有する再結合ポリペプチドの単離精製と、この因子を含むＤｌｌ＾を単離する方法とに関するものである本出願の別な見地は、単離精製されたヒト巨咳球コロニー刺激因子タンパク質を含む血小板の生成に関連した疾病にかかったホ乳動物に調剤の処方を施すことに関するものであり、前述のタンパク質は以下の特性を備える：り　ＥＰＯおよびＧＭ−ＣＳＦ活性がない、ｂ）単アミン末端アミノ酸配列を備えること、およびドデ／ル硫酸ナトリウムポリペプチドゲル中の電気泳動の後、７ングルバンドとして移動することにより定量されるように均一であること；およびＣ）生体外でマウス繊維素面間ペイ中の単位を形成する目積球コロニーの生成を刺激する能力を備えること。

本出願のさらなる見地は、ヒト巨核球コロニー刺激因子を有する単禦精製されたポリペプチドを含み、そのアミノ末端ではアミノ酸配列Ｘ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｙ　（配列中、ＸとＹとはアミノ酸残基に規定されない）を含んでいる血小板の形成に関連した疾病にかかったホ乳動物へ与える調剤の処方に関するものである。

より小さい化学種は、大きい化学種の代わりに、あるいはさらに加えて用いられるということが注目されるであろう。

本出願のさらに他の見地は、ヒ）　Ｍｅｇ−ＣＳＦタンパク質画分の単離の方法に関するもので、その画分は少なくとも９０％のタンパク質含有量を有し、ＥＰＯとＧＭ−ＣＳＦ活性がない。前述の方法は以下のステップを含んでいる：ａ）尿中にＭｅｇ−ＣＳＦ活性を持つ患者（すなわち、再生不良性貧血患者）の尿を濃縮する、ｂ）′ａ縮された尿の脱塩、Ｃ）脱塩された濃縮尿中に含まれる非イオン性の成分にイオン交換担体を適用し、前述の担体からヒトＭｅｇ−ＣＳＦを含んでいる不純なタンパク質画分を溶出することで、非イオン性成分を除去する、ｄ）不純なタンパク質画分を調剤ポリアセチルアミド電気泳動ゲルに非変性状態下で適用し、前述のゲルからだいたい純粋なＭｅｇ−ＣＳＦ画分を単離する；ｅ）前述のだいたい純粋なＭｅｇ−ＣＳＦ画分を、以下からなるグループから選択されたステップによりさらに精製する、１）３級、４級アミンの代わりにゲルを用いたクロマトフオーカンングクロマトグラフィー２）陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーカラムを用いるイオン交換クロマトグラフィー：そして３）約３５からｌＯの間のＰＩＴ勾配溶液でゲル電気泳動をし、そしてさらに精製されたＭｅｇ−ＣＳＦ画分を得る：ｆ）前述のさらに精製された画分を、逆側高速液体クロマトグラフィーにかけ、少なくとも９０％のタンパク質を含み、ＥＰＯとＧＭ−ＣＳＦ活性がないｈＭｅｇ−ＣＳＦ画分を再度得る。

ステップｅ）でのクロマトフォーカンングからなる精製なしのノ（リエーン讐ン、そしてさらにステップｇ）、つぎのステップｆ）の陽イオン交換＋１ＰＬｃは、ヒトＭｅｇ−ＣＳＦを与える（それは大きな化学種単体と、大きなものと小さな化学種の複合体とのいずれかを含んでいる）。

本発明のこれらの所見および所見は、本発明の詳細な説明、特許請求の範囲、および図面により、当業者にとって明かとなるであろう。

ｌΔ１阻望説皿図ＩＡと１８とは、本出願の発明において用いられた発明のステップを示す概略図である。本出願の発明は、再生不良性貧血患者性の尿から、大体純粋な、事真上純粋な、機能性が均一である均−梨のｈＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質を単離するためのものである。

図２は、本発明の方法（図１＾に示す）にしたがって、再生不良性貧血徹者から得られ、以下に示されている未精製尿抽出液の調剤的５％ポリアセチルアミドゲル電気泳動で再び得られるフラク／Ｉンを含んでいる様々なＭｅｇ−ＣＳＦを示す図である。図２もまた、タンパク質画分により刺激される多くのＣＰＵ−ＭｅｇとＣＰＵ−Ｍｅｇとの７０ニーを視覚的に描いている。大体純粋なＣＦＬＩ− Ｍｅｇタンパク質は画分１から５である。

図３はＤＥＡＥ−セルロースイオン交換担体と、ＩＥＦ経路とを用いる図１＾に示された方法にしたがって、ｐ　Ｈ３，５−１ｏの範囲で電気泳動ゲルを走らせることにより単離された様々なタンパク質のグラフをしめす図である。図３はまた、画分当りのタンパク質含有割合をグラフに描いており、多くのＣＦＵ−Ｍｅｇコロニーはそれぞれのタンパク質画分、そしてそれぞれのタンパク質画分のｐ旧こよって刺激を受ける。事実上純粋なｈＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質は画分番号１６である。タンパク質画分番号１６は生体外で多数のＣＦＵ−ｋｌｅｇコａニーの形成を刺激しく図３に描かれたように他の画分に比較して）そして約７．２ −７．４の間のｐＨを持つ。

図４は、２８０ｒｖの吸収を示すグラフの図であり、形成された多数のＣＦＵ− Ｍｅｇコロニー、そしてグループのｐＨは図１＾の方法にしたがって、ＣＭ−セファロースイオン交換担体とモノＰクロマトフォーカ／ング経路とから単離されたグループのｐＨを示している。事実上純粋なｈＭｅｇ−Ｃ３Ｆタンパク質は、グループ番号５である。

タンパク質グループ番号５は、最も多数のＣＦＵ−Ｍｅｇコロニーの形成を刺激し、約７０−７５のｐＨを有している。グループ番号５以下のタンパク質画分は、３つの主要なタンパク質のピークを持つ。

図５は形成された多数のＣＦＵ−Ｍｅｇコロニーのグラフの図であり、溶媒（アセトニトリル）の百分率と、Ｃトセファロー　スオン交換担体により得られたタンパク質画分の２８０ｎ園における吸収を示しており、さらに本発明（図ＩＡ）の方法にかかるモノＰと、Ｃ１８逆相１１ＰＬＣ経路とを示している。単離されたｈＭｅｇ−ＣＳＦタンパク貫は画分番号３２から３４である。タンパク質画分番号３２から３４は、より多数のＣＦＬＩ−Ｍｅｇコロニーを刺激し、図示されているように、２つの吸収ピークの間に降下する。

図６は、赤血球線（ＨｎｅＢｅｓ）　、０血法線、および目積法線にしたがって原始前駆体から単離されたプルリボテント幹細胞からの血液の様々な成分の発生と単離とを概略で描いている図である。図６は、背景となる高かの為に、そしてより詳細な描写の為に、そして骨髄中の幹細胞からより高度に分化された血液細胞と血小板との生成を教授する為に、ケーりフグ／サントス薬学歴ｌ９９０中の写真から引用、複写されている。

図７は、本発明の精製されたＭｅｇ−ＣＳＦ含有製剤の銀染色５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真であり、垂直線で標本された”画分番号３２から３４”、さらに単離された機能的に均一なｈＭｅｇ−ＣＳＦ橿のタンパク質バンドを示している。銀で染色された１２％検定的５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（バイオ　ラド、リックモード、ＣＡ）により定員された場合、一方は約２４．　Ｇ。

０−３５．０００ダルトンの分子量を有しており、他方は約５０．０００−７０．０００ダルトンの分子量を有している。この図７中に表された５つの垂直のレーンは、図１の方法に従い生じたＣ１１ｌ逆相ＨＰＬＣからの画分を含んでいる。分子量マーカー（［１）は、５つの画分レーンの右に示されている。この図７中のｈＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質は、トセファロースイオン交換担体、そして本発明の方法にかかるモノＰとＣ１８逆ｍｎｐＬｃ経路を経て単離される。

図８は−ｅｇ−ＣＳＦの不動ＰＶＤＦ膜への移動の結果を示しており、特にシングルバンドは均−ｈＭｅｇ−ＣＳＦの５ＤＳ−ＰＡＧＥ上に得られ（図ＩＡ手順と同様に生成される）、そして不動ＰＶＤＦ膜へ移動している。このシングルバンドは、高位な霞ｗ＄ｉである。

下位の１１゜種は明らかではない。

図９はポリアスパラギン酸ＵＩＣＸ）　ＩＩＰＬＣカラム上でのＭｅｇ−ＣＳＦ生成のクロマトグラフィーの外形である。吸収は０．１吸収率位で２８ｏｎ−でモニターされた。流量は１ｍｌ／■１ｎである。初めのカラム平衡は０．０５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６、ｏである。

ＮａＣ１を含む勾配溶出液は、波線で示されている。２，５■ｌの両分が以下のように集められ、溜められた：プール　画分Ａ　ｌ−６Ｂツー１１Ｃ＋２−ＩｓそれぞれのプールのＣＦＵ−ＭＥＧ活性は、以下で報告される。

図１０Ａはコントリコン１０（アミフン：ダンバース、ＣＡ）により濃縮された２つのＷＣＸカラムからの、Ｈ６−２１８の個々の画分の銀染色された５ＤＳ− ＰＡＧＥカラムの写真である。個々の両分の一部は、５ＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液（非還元状聾）中に入れられ、そして１２％検定用５ＤＳ−ＰＡＧＥへと流される。分子量マーカーは以下のようであるニゲルの右に示したように５．＋１０．０００．８４．０００．４７．０００．３３．００１＋、２４．００Ｇ、　＋７．０ＱＯ０５０−７０にＤＭだけは、約５２ＫＤで、７ングルバンドとしての泳動を示す。図１０Ｂは、２つのＨＰＬＣＷＣＸカラムからの、１６−３０それぞれの両分の他の一部分のＭｅｇ−ＣＳＦ活性の棒グラフである。上記カラム上では無菌で濾過され、そして尿フィブリン凝血検定により生物活性が検定される。

図１１Ａは、ゲルの切片位置の機能として、５ＤＳ−ＰＡＧＥ溶離の５ＤＳ−ＰＡＧＥ活性概形を示す棒グラフである。ＷＣ３陽イオン交換クロマトグラフィーからのプールＤＩＥ　（画分番号１６−２８）は、１２％５ＯＳ−ＰＡＧＥ中に流され、ゲルレーンは薄切りされ、そしてそれぞれの切片は１ＭＤＭ＋ｌ［１％ＦＣＳ　（１ｍｌ／ｃ＋＋ゲル）中に溶出され、蒸留水中で２日間透析され、無菌で濾過され、そして生物活性が検定される。この図は、それぞれの切片の生物学的活性と、その非還元状態下の５ＤＳ−ＰＡ（ｉＥの後の相当分子量とについて示している。図１１Ｂは、非還元状態下の５ＯＳ−ＰＡＧＥの後に発生する同タイプのグラフである。高位■、１種から低位種への活性の転移が見られ、そしてそれは、２４−２５）ｆＤ欅は５０−７０にＤｆｉのフラグメントがモノマーであろうということを示す。　図１２は、ポリメラーゼノーケンス反応により生成されたＤＮＡのオートラジオグラフィーである。胎盤ゲノムＤＮＡは、バーキンーエルマーセータスー社（ＣＡ）から購入した。１μｇのＤＮＡは、バーキンエメレマーセータス社により市販されている実験尉画書にしたがってオリゴ１とオリゴ３とを使い増幅される。増幅された生成物（１，６Ｓｋｂｐと３００ｂｐ）は、ジェネクリー７　（Ｂｉｏ　１０１、Ｉｎｃ、　ＣＡ）で溶出され、そしてその１０μｇがＰＣＨにより再増幅される。ＰＣＲ生成物は、１％テガロースゲル電気泳動により検定される。レーン１から３は、提案のオリゴ２単独、オリゴ３単独、そしてオリゴ２および３の存在によってそれぞれ増幅された３００ｂｐＤＮ＾を示す。レーン４から６は、２つのＭｇＭ縮を用い、オリゴ２単独、オリゴ３単独、オリゴ２および３で増幅された１、　７ＫｂｐＤＮＡを示す。レーン７はサイズマーカーを含んでいる。レーン９およびｌＯは、各々オリゴ１および３で再増幅された３００ｂｐと１１Ｋｂｐフラグメントを示す。レーン１１は、オリゴ１および３を使用したゲノムＤＨＡの第一の増幅生成物を示す。レーン８は、分子マーカー（それはＷｂラダー、　ＢＲＬ）を示している。

昼Ｘ五立正皿髪説皿本明細書でＩＩ％！されたすべての文献引用書、特許出願、および特許はその全体の引用によりここに具体化される。

本明細書中、′ホ乳動物”は増結／ステムを有し、血小板減少症に関連した疾病にかかり易い全ての生命体を意味し、人間を含むと定義される。

また、本明細書中、”機能性均一ヒ）　Ｍｅｇ−ＣＳＦ”は均一となるように精製されてはいない、他の検出可能な造血素（標準活性試験による検定として）　ｈＭｅｇ−ＣＳＦ画分として定義される。：エリトロポエチン汚染が無いということは、クリスタルＧ、（文献：Ｅｘｐ、　Ｉｌｅｍａｔｏｌ、＋　９８３．１１　：　８４９−６４３）にかかるマウススプリーン細胞検定によって評定され、それは０．１）５ｕｎｉ　ｔｓ／■ｌくらいのＥＰＯ活性として認められる；　ＣＭ−ＣＳＦ、　ＩＬ−３およびＩＬ−９が存在しないということは、アバンノー、Ｇ、Ｃ，，他、（文献：　Ｊ、ＧＥＬＬ、　Ｐｈ１ｓｉｏ１．　、１９９０．１４５＋４５８−４６８）にしたがってトＯフーＣパイオアｙセイにより評定され、それは２．５ｕｎｉｔｓ／ｍｌの感度限界において、ルー３にとってＩＧＭ−ＣＳＦ６ｕｎｉｔｓ／ｍｌを有し、ＩＬ−９にとっては５ｕｎｉｔｓ／ｍｌを有している。；　ＩＬ−６と他のサイトカインが存在しないということは、クオ／テイカインによるエリザ（ＥＬＩＳＡ　（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネアポリス、ＭＮ）　）により検定され、それはＩＬ−６の６ｐｇ／■ｌおよびＩＬ− １アルフアーの３１ｊｂｐ／■ｌと同じくらい少なく、そして他のサイトカインと匹敵する量であると認められる。図ＩＡの手順に関連した機能性均一フラクンッンは配列できる、すなわちこの画分中のｈＭｅｇ−ＣＳＦタン１４り質は、以下の実施例５に示されるように、得られるアミン末端アミノ酸配列を発生させるために使われ、それは小さい橿（ｏ−３５１Ｄ）もその製剤中に存在してＬＸたとしても、大きい樗（５０−７０［Ｄ）から単離される。小さい種はアミノ末端を持って（１な（蒐か、それが押さえられている（すなわち遊離していない）か、または入手可能な量では小さい曙からＮ−末端を配列させるのに十分でな（１゜（″機能性均一“である図７に示されている製剤は、ｈＭｅｇ−ＣＳＦ活性を存する２つの種に加え、他のノインドも含有するということを注目すべきであろう。それゆえ、ここでは２つのｈＭａｇ−ＣＳＦ橿だけが機能性均一組成製剤中にあるであろうということを意味しなＬＸ）”均一ヒ）　Ｍｅｇ−ＣＳＦ”は、本明細書中ではヒトＩｌｌｅｇ−ＣＳＦ活性を有し、５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上のンングルバンドとして移動し、そしてＰＶＤＦインモビロン（１■■ｏｂｉｌｏｎ＞　１１への転移の後には単一アミノ末端アミノ酸配列を有するポリペプチドであると定義されている。この定義は、高次１．１種の立場からは適当に配列されている（ｅｘｓｔ）が、低次１．Ｗ橿が共存すると不均一性であるとして説明されるであろう。２４−３５種は、それ自身ｈＭｅｇ−ＣＳＦ活性を有する。それは図１１Ｂに示されている。さらには両方の種を含む製剤は、９機能性均一組成”であり、その他のサイトカインを持たないという事実は、下位ｔｗ、種が不純物であるという可能性を打ち消す。この点において、２つの種の間の関係は確実には実証されていない。例えば、下位橿はフラグメント、またはモノマーである（図１１＾とＩＩＢに示すように）、ある−１はｈＭｅｇ−ＣＳＦ活性を有するように誘発させる全く池の単純なタンｌくり質であるかは知られていない。

ヒトＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質（両方の分子量のいずれか）は、再生不良性貧血にかかっている虫者（あるいは骨髄移植や尿中にＭｅｇ−ＣＳＦ活性の無いことによる他に由来の血小板減少症のような）の尿から単離されるが、治療用途の為には、均一に生成されるべきである。配列される以前に、または再合成ｈＭｅｇ −ＣＳＦ　（すなわちモノクロナール抗体生成）を生成するための合成技術、または再合成製剤に使用される前に、天然起源に由来するｈＭｅｇ−ＣＳＦもまた、機能性均一物あるいは均−物へと精製されるべきである。マウスとヒトとの橿相互作用活性のため、本発明のｈＭｅｇ−ＣＳＦは、そのような治療を要するべ、トのような（すなわち化学治療を施していない）他のホ乳動物の治療に有効であろうと予セされる。

ヒトＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質の両方の種は弱塩基性タンパク質橿であり、生体内で目積法線タイプ細胞および血小板生成物の増殖を刺激することに対して特異的である。本発明のｈＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質は、等電フオーカンングによる定量で約７，２−７４であるＰｌを有し、また図７に描かれたように、ｈＭｅｇ −ＣＳＦタンパク質がグリコリル型とンアル酸盟との時、　５ＤＳ−ＰＡＧＥによる定量で約ｓｏ、　ｏｏｏ−フｏ、　ｏｏｏダルトン（あるいは小さい種では約２４．　Ｇｏｏ−３５，０００ダルトン）の間の分子量範囲を有している。

パイアテンナリー（ｂｉａｔｔｅｎｎａｒｙ）炭水化物構造を含む炭水化物残渣は、エンドグリコンダーゼＦ、エンドグリコシダーゼＨ１およびＮ−グリカナーゼのような、適当なグリコンダーゼを経て、ｂＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質く両方の種）から分裂されると信じられている。このｈＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質のシアリン酸部分は、ノイラミンダーゼの処理により除かれる。炭水化物とシアリン酸部分とが本発明のｈＭｅｇ−Ｃ３Ｆタンパク質（両種）から分裂し、裸のｈＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質を形成する時ですら、それは生体外での生物学的活性を保持している。

好ましくは均一に精製されている本発明の新規なｈＭｅｇ−Ｃ８Ｆタンパク質は、目積球新生と血小板生成とを調整する能力を持っている。そのうえ特に、本発明の新規なｈＭｅｇ−Ｃ３Ｆタンパク質は、生体内での目積球の増殖と血小板の生成とを刺激する能力を持っており、そのうえ目積球線型の細胞を刺激する能力を有している。すなわち、メガカリオプラス７内においてユニットを形成しているコロニー、血清フリーンステムと同様に、生体外におけるマウスの目積球集団を形成しているフィブリンの凝血検定を刺激する能力を有している。（マーフィー、Ｍ、Ｊ　他、　Ｊ、　Ｔｉ５ｓ　Ｃｕ１ｔ、Ｍｅｔｈ、　、　１９９１．１３　＋８３−８８．を参照。）言い換えれば、それぞれの種は、骨髄内の初期の前駆細胞を誘発させ、また目積球リネージにしたがって発生、分化させることができる。科学用語では、これまで科学的医学的コミユニティを回避してきた本発明は、新規のヒトへマトポイエティンや血液細胞成長因子、すなわち、少なくともヒト巨核球新生の第一面を含むと信じられてきたヒトの目積球コロニー刺激因子、の確証された発見（加えて単離や精製、そして特性記述）に基づいているレイマン技術用語によれば、本発明はヒトによって生成され、特に血液の血小板の生成の中に含まれる独特のタンパク質の発見に基づいている。

本発明の高分子ｈＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質は、等電フオーカソング、５ＤＳ− ＰＡＧＥ、クロマトフォーカ／ノグによって均一組成のタンノイク質と判断され、Ｃ−ｔＳ逆相そしてＷＣｘ陽イオノ交換ＨＰＬ’Ｃにより単−Ｎ末端アミノ酸シーケンスＸ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−ＶａｉＧｌｕ−Ｓａｒ−ＰｒｏＪａｌ−Ｐｒｏ −ＹＳＸとＹはまだ同定されていないアミノ酸の残基を意味している、を持っていると特性が明らかにされている。新規のｈＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質は、アミデー／冒ンまたはノイラミニダーゼ処理の後、生体外において血小板の総数と目積球数とを増大させる能力を保持しており、そシアそれは５．５．−ジチオビス　２−ニトロベンゼン酸（ＤＴＮＢ）の処理後はよりいくらかの活性が失われることが確かめられている。発明におけるｈＭｅｇ−ＣＳＦの減少は、それ０身によるものではなく、それは活動の大部分がより小さい種ヘンフトすることが原因となっている不活性化によるものである。しかしながら、（ヨードアセトアミドを伴う）アルキルあるいは（水銀塩化物を伴う）水銀との結合に続いて起きる（ディ／オスレイトールによる）減少は、減少後に主要な種となるより小さい種の不活性化が原因である。加えて、本発明における新規のｈＭｅｇ−ＣＳＦタノバク質の生物学的活性は、約３０％以上のアミノ酸の残基がそれについてカルノクミン酸化したときに失われると信じられている（カーバミレイン３ンが減少より前に行われたため、両種はすでに不活性化されていると推定される）。これらの発見は公表されている不純なｈＭｅｇ−ＣＳＦの特性に一致し、本発明の、単離精製された活性はｈＭｅｇ−ＣＳＦの活性をもつ方法の不純な生成物の存在において同一であり、他に報告されているヘマトボイエテインの活性とは同一ではない。

本発明のｈＭｅｇ−ＣＳＦり／バク質はさらに、パイアンテナリな炭水化物と末端あるいは前末端糖のガラクトーゼ残基をもつ糖タンパク体とし特性が記述されている。本発明の新規のｈＭａｇ−ＣＳＦは、さらにンアル酸を含んでいると特性が記述されている。これらの特性は、ｈＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質が、シアレイト型あるいはディ／アレイト盟の、ＲＣＡ　ｌ　アガロース、Ｃｏｎ　Ａセファロース、そしてレンチイルレクチ７カラムに結合されているという特性によって確２されている。ンアリエイテト梨では、およそ１６％のｈＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質活性がＲＣＡ　ｌ　アガロースのカ　ラムに結合され、約５％のｈＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質活性がＣａｎ＾セファロースのカラムに結合され、およそ２８％のｈＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質活性がレンチイルレクチンカラムに結合されている、ということが確認されている。しかしながら、デイノアレト型では、およそ５６％のｈＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質の活性がＲＣＡ　Ｉアガロースのカラムに結合され、約４１％のｈＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質の活性がＣｏｎ　Ａセファロースのカラムに結合され（１５ｄアルフアーメチルグルフサイドで抽出した場合的　３１％の活性が得られ、あるいは約１０％の活性が、約２００　ｍＭアルファーメチルグルコシドで抽出した場合、焼く１０％の活性が得られる）、そしておよそ４５％のｈＭｅｇ−ＣＳＦタン／イク質活性がレンチイルレクチンカラムに結合されている。それぞれの橿に起因していると思われる結合された活性の部分はまだ同定されていない。

ｈＭｅｇ−Ｃ５Ｆの単離についての二つの異なる方法は以下の頁に記述されて（する。両方の方法とも、予備ＰＡＧＥステップにおよぶ同一の藁−面をもっている。一つの実施例において、２機能的均一組成″ｈＭｅｇ−ＣＳＦはの生成されるのに対して他の実施例では、（図ＩＡ）　、純粋な”均一組成”のｈＭｅｇ− ＣＳＦが生成される（図、ＩＢ）、どちらの単離方法も、さらに下記に詳しく示されているように、アミノ酸シークエンンングおよび哺乳動物への投薬に使用されるそれぞれ有益な”機能性均一組成の”そして、純粋な”均一組成”　ｈＭｅｇ−ＣＳＦのフラグメント（それらの均一組成の一部分は両方またはどちらか一つの種を含む）を提供する。まだ”実質上純粋な’　ｈＭｅｇ−Ｃ３Ｆ　（つまり、最終ステップをのぞくスキームＩＡにかかる生成物）（よ、同様に使用されていると信じられている。

本発明はまた、本発明のｈＭｅｇ−ＣＳＦタンノくり質を単離する新規な方法をも考察している。一つの実施例において、ｈｌｌＩｅｇ−ＣＳＦが、好ましくは機能性均一組成の型で、血小板減少症患者の尿から得られた。機能性均一組成内からｈＭｅｇ−ＣＳＦを単離する望ましい手段は概略がｌ＾に示され、２つの相で特有の作業ば行われる。第１相において、ＥＰＯそしてＧＭ−ＣＳＦタンパク質が不純物として含有され、さら１こｈＭｅｇ−ＣＳＦが含有されているタンパクの質留分が得られる。第２相にお一＼て、機能性均一組成のタンパク質が発見された。しかし、単離された機能性均一組成のｈＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質が得られるよりも先に、十分に純粋なｈＭｅｇ−ＣＳＦタン／ずり貫留分力（、ｊＰ＋２相の予備ＰＡＧＥステップの後生成される。′十分に純粋なｈＭｅｇ−ＣＳＦタン／４り質留分１という言葉は、以下にあるように少なくとも５０電のｈｌｌｌｅｇ−ＣＳＦタンｔ４り質を含んでいると信じられており、本質的にはＥＰＯそしてＧＭ−Ｃ５Ｐタンノ（り貰に汚染されていない、と定義されている。“ 本質的にはＥＰＯそしてＧＭ−ＣＳＦタンｔ４り質に汚染されていない”とは、以下にあるように、ｌ■ｇタンタンク貫中に１００ユニットＧＭ−ＣＳＰ以下、１ｍｇタノバク質中に０５ユニ／トＥＰＯ以下であると定義されても）る。それは、マウスのンモサイト（ＥＰＯ）を使ったクリスタル検定（クリスタル、Ｇ、Ｅｘｐ。

ヘマトール　１９８３．１１＋６４９−６６０）　、そして、デ、　、　Ｄ−Ｌ、他インベスト新薬、１９９１　、９＋１４９−１５７に従ったマウスのＣＦ［Ｉ−０Ｍ検定（ＧＭ−ＣＳＦ）によって測定されてｔする。しかしながら、他のりイトカインは、今だおそら（製剤中に”本質的に存在しない”とされている１例えば、実施例１、段階りの物質はタンｔ４り質１−ｇ中におよそ１−２Ｘ１０４ユニットトＣＳＦと、Ｃ−Ｃ５Ｆを含んでいる。言い換えれば、方法論における第２相の予＠ＰＡＧＥのステップは、生成された十分に純粋なｈＭｅｇ−ＣＳＦタン１＜り實留分から、汚染されたＥＰＯやＧＭ−ＣＳＦタンノイク質の主要部分を他の汚染物質と同様に除去する原因になっている、と信じられている。

以下は後の選択的段階、すなわち方法論における第２相のイソエレクトリ、クフォーカンング（ＩＥＦ）あるいはモノＰクロマトグラフィー、またはＷＣＸ　ＩＩＰＬＣクロマトグラフィーでは、かなり純粋なｈＭｅｇ−ＣＳＦタン１＜り質部分が生成されてもＸる。しかし、選択的な等電フオーカノング、ＭｏｎｏＰあるいはＷＣｘ陽イオン交換１’１ＰＬｃステアブが、図ＩＡに示されているように、以下の予備ＰＡＧＥのステップにおい”Ｃ選択されるであろう。１ｄＯｎｏＰ段階は、流れに添って単離されたｈＭｅｇ−Ｃ３Ｆタンパク質の雪と活性との増大を起こすと考えられている。

”実質上純粋なｈＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質留分留分いう言葉は、以下にあるように、少なくとも約９０％のタンパク質を含んでおり、実質的に、仮に全てではなくとも、汚染されたＥＰＯやＧＭ−ＣＳＦを含んでいないタン／マク質留分であると定義されてｔする。汚染されたＥＰＯやＧＭ−ＣＳＦタンパク質は、すべてが実質的に純粋なｈＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質部分からが削られたもの、であると信じられており、この実質的に純粋なｈＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質部分はこの時点において、構造的均一性にまでは精製されていない。さらに“機能性均一組成“のシーワエンス可能なｈＭｅｇ−ＣＳＦ留分は逆相１１ＰＬＣ後生成される（図ＩＡＩＩ照）。機能性均一組成の７−ワエンスンーケ／ス可能なｈＭｅｇ −ＣＳｐは、およそ５０％のアセトニトリルと約０．１％のＴＥＡを伴ってこのカラムから抽出される。、二の機能性均一組成の７−ケンス可能なｈＭｅｇ−ＣＳＰは、純粋なレベルにあり、それは後の実施ｌｌ１１５に示されているように、ンーフェンスのフィールドから標準的な手法を通して正確なＮ−ター　ミナルアミノ酸／−ケンスを認めることができる。さらに、この最後の機能性均一組成のｈＭｅｇ−ＣＳＦは、少なくともおよそｌ＋＋ｇタンパク質中４　Ｘ　１０３のＣＦＵ−ｍｅｇコロニーと言う特殊な活性を持っている（この形憶は小さい種と大きい種との両方の総合的活性である）。

本発明の望ましい実施例では、均一組成のｈＭｅｇ−ＣＳＦが完全に生成される（２４−３５ｋＤそして５ｏ−７（ｌｋＤのどちらかまたは両方の種を含んでいる）。先の予備ＰＡＧＥのステップの後で、ｈＭｅｇ−、ＣＳＦは逆相、および陽イオン交換ＨＰＬＣの後（さきに記述された）　ＭｏｎｏＰカラム利用してクロマトフォーカスされる。均一組成になるよう純粋な単離されたｈＭｓｇ−ＣＳＦは、図、ｌＢの方法論示されているように、ＩＩＰＬＣ，および陽イオン交換１１ＰＬｃ段階の後この具体物の中で生成されると考えられている。言い換えれば、実質的に純粋なｈＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質留分留分の最小量の汚染物質の存在は、図、ＩＢに説明されているように逆相ＨＰＬＣ，ＷＣＸ陽イオン交換＋１ＰＬｃ、およびクロマトフオーカシングにより、単離された純粋な均一組成のｈＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質を生成するために、削除されると考えられている。

本発明のいずれかの実施例においてｈＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質を単離するために量が再生不良性貧血の患者から採集され、このましくは限外濾過による濃縮されている。また選択的に、凍結乾燥と透析とが尿の濃縮に用いられている。限外濾過用に八ｍ１ｃｏｎ　ＹＭＩＧを使用することはとくに好まれている（アミコン、ビバリー、鮎）。尿の塩分は分子篩クロマトグラフィーによって削除される（例えば、セファデックス　Ｇ−５０濾過、ファーマシア、ビス力タウエイ、ＮＪを使用する）。その他の分子篩カラムは、たとえばバイオゲルＰ−１ｏ　（バイオラブド、リブチモンド、ＣＡ）、バイオゲルＰ−３０（バイオラッド）、あるいはセフアゾＩクスＧ−２５等も使用することができる。頂点でのｐＨおよび塩濃度は、分子篩カラムからあつめられたタンパク質が調整され、その物質は陰イオンの交換の保持体に用いられる。

それはたとえば、ＤＥＡＥセルロース（ワＩトマン、クリノトン、ＮＪ）　、あるいはＤＥＡＥバイオゲルＡ（バイ　オラノド、リッチモ／ド、ＣＡ）等である。目的は、非イオン物１［（結合されていない）の除去である。したがって、すなわち結合されていないタンパク質は例尤ばｈＭｅｇ−ＣＳＦを含む結合タン７＋り實ではなｔ１リン酸緩衝剤とのすすぎで除去されＱ、　Ｉｓ　１１ＮａＣＩにより抽出される。選択的に、分子量により分離された中から再回収された留分は、例えばＣＭ−セファロース（ファーマ／ア・ビス力タウエイ、Ｎ　Ｊ　：　Ｐｈａｒ■５Ｃｉｒ、　Ｉ’１ｓｅａｔａｖａｙ、　ｌ［Ｊ）　ｓまなｉｔ　ＣＭノイイオゲルＡ（バイオラッド、リッチモンド、ＣＡ　：　Ｂｉｏ　Ｒａｄ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ）を使用して陽イオン交換保持体に使用することができる。ｈＭｅｇ−ＣＳＦもまた与えられた状況下ではこれらの保持体に結合されており、それは同様な手法１こより抽出される。Ｃト陽イオン交換を利用することは、より多くのｈＭｅｇタンノイク質を得ることができるので、望ましい。

一つの実施例において、いずれかのイオン交換担体よって回収された活性物質は、なるべく妨害する塩を除去するために広範囲に透析され、凍結乾燥、リサスペンドされ、そしてさらなる精製工程のために！ＩＩ備する。これらの工程は、そのまま（不洗浄性の）の状態で用いる標定ポリアクリルアミド　ゲル電気泳動を含んでいる。それはかなり純粋なｈＭｅｇ−ＣＳＦタンｔ４り質画分を生成する。これは、かなり純粋なｈＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質画分を生成するために、その弱塩基性のｐＨに基づき、残りの不純物からかなり純粋なｈＭｅｇ−ＣＳＦタンノ（り賀画分を分難するとｔｌう工程に続いている。この工程は、液体、あるいは固定相、望ましいＭｏｍｏＰの（１ずれかの中の、いずれかのＩＥＦによってなされる。ＭｏｎｏＰクロマトグラフィーは溶離緩衝溶液のｐｌ＋が７０〜７．５の時に殆ど純粋なｈＭｅｇ−ＣＳＦタン１＜り貫画分の再生をもたらす。殆ど純粋なｈＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質画分は、ＰＨＨＩ３２〜約７４の間で変動して（するＩＥＦゲルの中で検出される。ＭｏｎｏＰあるいはＩＥＦ、ＷＣＸ　ＩＩＰＬｃのし）ずれかから得られる。

実質上純粋なｈＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質画分は、図ＩＡに示されている、Ｃ１８逆相１１ＰＬｃ（例えば、べｙクマンインストウルメンツ、フレルトン、ＣＡ）　を用％Ｘることで、さらに精製される。　選択的にＣ８，Ｃ４あるいは０１逆相１１ＰＬＣカラムは、ブラウンリー　ＲＰ−４，ブラウンリーアクアボアＲＰ−３００又は、ブラウンリー　ＲＰ−８（ライネン、つψブルン、鋪＾）、ノルイブ／りＣ−４タン／（り質／′ベブタイドカラム、）＼イブ１り　Ｃ−８（ライネン）、バックマン　ウルトラスフイア　オクテイル力ラム（ライネン）、あるいはＣ１＋Ｃ４カラム（ファーマシア、アブブサラ、スエーデン）に用いられている。ｈＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質は機能的に均一組成のｈＭｅｇ−ＣＳＦ　（すなわち検出されたヘマトボイエテイノク活性だけがｂＭｅｇ−ＣＳＦであるが、それは本質的に均一組成ではない）の生成のために、およそ５０％のアセト　ニトリルと約０．１％のＴＥＡ（トリフルオロ酢酸）をともなってＣ１８カラムから溶離される。機能的に均一組成のｈＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質は後の例５に説明されているように、配列フィールドでの標準的手法によって、正確なアミノ酸配列が認められる純粋なレベルにある。　本発明の提出された実施例において、均一組成のｈＭｅｇ−ＣＳＦは生成される。先の標定されたＰＡＧＥ工程からのｈＭｅｄ−ＣＳＦタンパク質の再生後、タンｔｆり質はＭｏｎｏＰＨＲ５／２０カラム（ファーマンア）を用いて、クロマトフォーカスされる。ｈＭｅｇ −ＣＳＦの活性に含まれる両分は、ボリアスバテイトＩＩＣＸ陽イオン交換［ＩＰＬＣに続＜　Ｃ１８カラ　ムを用いた、逆相ＨＰＬＣのクロマトグラフィーによってさらに精製される。

均一組成のｂＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質は、ボリアスフ＜ティトＷＣＸ陽イオン交１１ｉ［ＩＰＬｃカラムへの結合、実際に０．１５Ｍ以上のＮａＣ１を伴う溶離がのちに認められる。選択的に、それら優れた技術であるその他の逆相や陽イオン交換ＨＰＬＣは利用可能であることが認められることであろう。緩衝溶液やコンデイン賛ンは変わるであろうが、それらは一般的な技術による規定の実験によってのみ明確にされるであろう。

本発明の選択的な提出された具体物において、簡素化された精製はｈＭｅｇ−Ｃ５Ｆの単離に利用することができる。この処理は均一組成のｈＭｅｇ−ＣＳＦの生成を導くが、タンパク質の操作をなおさら必要とする。再生不良性貧血の尿の濃度は、プロアターゼ抑制剤ロイベブティン２マイクログラム／■ｌを含む、０．８Ｍ尿素のＬｏｌｌ　■１中に溶解される記録が得られている。その物質はオメガセル（フィルトロンテクノロジー　コーポレーシ嘗ン、クリントン、Ｍ＾）のように分子量ｌＯの６乗のカットオフ膜上で濃縮される。膜上で保たれている物質は棄てられ、流出物は１０の５乗の力・、トオフ膜上に集められて、濃縮される。流出物は１０４のカプトオフ膜上に集められ、濃縮される。＋０４から１０５の両分に含まれるｈＭｅｇ−ＣＳＦは、何間も繰り返されているボリアスパーティック酸ＷＣＸ陽イオン交換カラムを用ｔするクロマトグラフィーによってさらに精製される。ｈＭｅｇ−ＣＳＦはカラムからの０．５　Ｍ　ＮａＣ１以上で溶離される。能率化した単離処理によって得られるその物質は、ｈＭｅｇ−ＣＳＦの生化学的活性のよりよい再生を与え、５ＤＳ−ＰＡＧＥ上において単一バンドを形成することができる、と思われている。

本発明のｂｋｌｅｇ−ＣＳＦは、哺乳動物の治療の方法に利用できる。それは、血小板減少症や動脈硬化の患者内の血小板の生成を可能にしたり、けがの治療、血小板の抗体を持つ患者、薬の増強すること、血小板機能の改造あるいは低下等である。

例えば、構造的な類似物質は、それは純種でｈＭｒｇ−ＣＳＦの類似物質であるが、ｈＭｅｇ−ＣＳＦの細胞のレセプターへの結合という特徴の詳細な記述に基づき、精製される。これらの類似物質はレセプターの活性化を伴うことなく密に結合する、従ってｈＭｅｇ−ＣＳＦの生体活性を妨げる。

ｈＭｅｇ−ＣＳＦはへマトポイティック細胞のレベルの減少により特徴つけられる、特に目積球系のそれらにおいての疾病の治療に用いられるであろう。それはやはり直接的にはに目積球や血小板の生成の刺激に、間接的にはヘマトボイティ、り系の刺激に利用されることと思われる。本発明におけるｈＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質の処理に影響され安いコディ／ヨンの中での血小板減少症は、抹消血液の中の循環している血小板の置の減少である。血小板減少症は特定ウィルス、薬品、放射線の照射によって誘発される。それはしばしば癌あるいはエイズ治療の様々な形の副作用となり、すなわち化学療法の薬剤の照射である。ｈＭｅｇ−ＣＳＦ化合物を伴う血小板減少症の治療上の処置は、現在の有効な薬品をもちいた治療が原因となる好まざる副作用を回避できるであろう。使用されるであろうｈＭｅｇ−ＣＳＦの総量はもちろん、治療状態の笥酷さ、選択された投薬の手順、ｈＭｅｇ−ＣＳＦの特別な活性、そして患者個人のレセプターのｈＭｅｇ−ＣＳＦタ／バク質への反応による。そして最後には、医者あるいは獣医への通院によって決まる。医者あるいは獣医への通院によって決まるそのようなｈＭａ４−ＣＳＦタ／バク質の総量は又、この様な理由から”治ｒＭ効果”あるいは”治療上の効果の総量”に帰因している。ｈＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質の治療効果の典璽的な総量は、３〜６０日の課程においては、あるいはむしろ１５〜４５日では、約０．１〜１００の転回、あるいはむしろ約１〜５０、さらに望むべきは２〜１５ユニ、トのｈＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質／ｋｇ　体重である、と考察されている。申請された単離された純粋な均一組成のｈＭｅｇ−Ｃ５Ｆタンパク質の、ヒトを含む哺乳動物の治療のための、はとんど純粋なあるいは機能性均一組成のｈＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質画分、そして薬剤となるそれは本発明において、これらのｈＭｅｇ−ＣＳＦタノバク質画分は又、利用しているビロゲ／をフリーにできると考察されている。例えば、ポリミキ７ンＢ樹脂は内毒素（仮に存在した場合）を除去するとして、現在の技術ではく知られている。いずれかあるいは両方の高位と低位１．１種は用いることができる。

単体で、あるいは他のへマトボイエティンとの組み合わせで、ｈＭｅｇ−ＣＳＦはへマトボイエシスを増強させる。本発明はまた池の血液細胞の欠乏、あるいは貧血（赤色細胞の欠乏）における、単体あるいは他のへマトポイエティンとの組み合わせを用いるであろう。そのような治療上の化合物もヒトの他の因子との組み合わせにおいて処理される。ＧＭ−ＣＳＦ、　Ｇ−ＣＳＦ、　Ｍ−ＣＳＦ、　ＸすＸＣ＋ボイエティ７　（ＥＰＯ）　、　ＩＬ−１、ルー２．　ＩＬ−３，ＩＬ−４，ＩＬ−５，ＩＬ−６，ＩＬ−７（７ムゲン、サウザンド　オークス、ＣＡがらすべて利用出来る）、そしてルー９（ヤング、Ｙ−Ｃ他、血液　７４．１８１１０−１８８４．１９１９の記述より得られる）等を含む本発明のｈＭｅｇ −ＣＳＦタンパク質を伴う相互作用のための、ＣＳＦやインターロイキンを含んでいる他の適当なヘマトロイエティンのリスト。他の特有な因子はアクティビンス（ａｃｔｉｖｉｎｓ）とインブラント（１ｎｈｉｂｉｎｓ）の制限を伴うことなく（ゲネンテック、サウスサンフラッジスコ、ＣＡ）　、ＴＰＯ／ＴＳＦ（７クドナルド、ＴＰ、他、Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａ１ｌクローニング　７：１３９− １５５．１９８９の記述より得られる）　、ＩＬ−１１（ポール、ＳＦ３他、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ８７＋７５１２−７５１６．１９９０（１り記述より得られる）　、　ＬＩＦ　（７Ａゲン）そして５ＣＦ（７−７−イン他、細胞　６３：２０３−２１１．１９９０＋７）記述より得られる）含む。ｈＭｅｇ−Ｃ３Ｆノ他の利用については、患者の治療において、化学療法、治療放射線、骨髄移植からの回復、手術の間でのあるいは熱傷患者主要血液の凝固能力の増強である。ｈＭｅｇ−ＣＳＦはまた、診断上の一般的な方法で生成される、モノクローナル抗体とポリクローナル抗体を明らかにし、ｈＭｅｇ−ＣＳＦ遺伝子治療上の用途、または調査試薬の用途（例えば、ｈＭｅｇ−ＣＳＦ遺伝子の確認、ｈＭｅｇ−ＣＳＦによって生成された微生物の組み替えの選別）に用いられる。

従って、さらに発明の他の観点は、前述に帰因する状態の治療のための薬学上の処方箋、あるいは施薬方法を導いている。そのような製剤の処方箋は本発明におけるｈＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質の治療上効果的な童から成り立ち、薬学上受容性のキャリア、すなわち無菌水、無菌の正常塩、デキストラン、パラベン、クエン酸塩、ステアリン酸カル／ウムあるいはそのほかの類似物質と混和している。

そのような化合物は非経口で、静脈内、あるいは皮下に体形的に施されている。

仮に流用すると、経口で、あるいは吸入されて胃の周囲からもたらされる、タンパク質の保護に適当な機能が考察されている。例は、Ｌｌ、Ｓ、Ｐ、Ｎｏ４．９２５．６７３；　４，６２４．２５Ｌ：そして３．７０３．１７３である。体系的に施されるとき、出願の発明の用途の製剤の処方箋は、ピロゲン−フリーの形で望ましい、非経口の受容性水溶液である。

その様な等１点、等優性、安定性を有している非経口的に許容可能なタンパク貰溶液の製剤は当業者にとって周知である。新規のｈＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質にとり、純粋な均一タンパク質、機能性均一組成、あるいは事実上純粋なタンパク質画分として投与されることも可能であるが、一般に薬剤の処方や調合として存在することが好ましい。

家畜治療と人間との両方用の本発明の製剤は、それゆえ、前に示した様に、その一つあるいはそれ以上の薬剤的に受容性のある媒介体や希釈物や補形剤、そして任意の池の治療の成分に加えて、ｈＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質を含む。媒介体くら）は、もしその受容者にとって有害でなく、薬剤の他の成分に適合するという意味においては、生理的に“受容性”でなくてはならない。望ましくは、製剤は酸化剤と不適合であるとして知られるペプチドを持った他の物貰を含むべきではない。製剤は都合よく単位投薬形態で存在し、そして薬学の技術中で良く知られているどの方法によっても調合されるであろう。それらのすべての方法は、媒介物にとって活性要素を結合させる工程を含み、それは一つつあるいはそれ以上の成分からなるものである。一般に、製剤は一様に、そして精密に、活性成分、例えばｈＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質と、液体媒介物や微細に分割された固体媒介物やその両方と結合させることにより調合される。もし必要なら、化合物を所望の形状に形成する。本出願の薬学上の製剤に使用できる牛ヤリャーの例としては、ただしこれらに限定されることはないが、ヒト血清アルブミン、デキストランーインベノティド　ｈＭｅｇ−ＣＳＦ、あるいは生体中で分解されるその他の生物適合ポリマー等を例示できる。時間毎に、および継続してインブラントされた製剤を供給するような／ステムも使用することができる。新しい遺伝子治療もまた、ｈＭｅｇ−ＣＳＦのために遺伝子（遺伝子の複数）をオートロゴス血液細胞へ挿入するのに使用でき、それは生体内の合成場所として患者に注射される。ｑ− ゼンバーグ、Ｒ，Ｄ、　、他製剤は非経口投薬として好都合であり、活性成分の無菌の水溶液、つまり単離された純粋な均−ｈＭｅｇ−ＣＳＦり／バク賞、機能的に均一なまたは実質上純粋なｈＭｅｇ−Ｃ３Ｆタンパク質画分と、患者の血液に対して好ましい等浸透圧の溶液とを有している。そのような処方箋は水溶液を作るためには、水中に固形ｈＭｅｇ−ＣＳＦを溶解し、そして前述の溶液を無菌にすることで調製されるだろう。その結果得られた溶液は、−個あるいは複数服用量の容器、例えば密封されたアンプルやガラスビン中に入れられるだろう。本出願の薬学上の製剤、あるいは投薬法においては、出願の発明のｈＭｅｇ−ＣＳＦの有効量を含む必要のないことは有り難いであろう。それはその様な有効量は、製剤を多数投与したり、投薬法を変えることにより達成される。

本出願はまた、ｈＭｅｇ−ＣＳＦの生物学的活性フラグメントの用途を意図している。

ｈＭｅｇ−ＣＳＰの生物学的活性フラグメント（すべてのｈＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質分子よりもおおいに小さい）は、例えばｈＭｓｇ−ＣＳＦタンパク質の制限された蛋白質分解消化（前に述べた技術を用いて均一に精製される（実施例７以下に述べたように精製された再合成タンパク質、またはさきに説明された技術を使用して均一にする）により得られる。この時１、例えば、トリプシン、パパイン、キモトリブ／ン、■−８プロテアーゼ、エンドプロテアーゼ、および当業者にとって周知の他のプロテアーゼや、臭化／アノーゲンのような池の薬品（それはメチオニン残基の後に分裂する）を用いる。ついで、単離の後にｈＭｅｇ− ＣＳＦ活性を試験する、すなわち実施例３以下の生体外マウスフィブリン凝血検定をする。すべてのｈＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質分子よりもおおいに小さいｈＭｅｇ−ＣＳＰタンパク質の活性フラグメントは単離されることが期待される。また、一度全長のｃＤＮＡエンコーディングｈＭｅｇ−ＣＳＰが、以下に示す実施例６に述べられているように得られると、例えばＢＡＬ−３１ヌクレアーゼを使用した制限のあるｃＤＮＡのヌ　フレアーゼ消化が行われ、そしてその結果得られた生成物は複製され、例６−８以下に検討されたように表現される。タンパク質生成物は活性が試験され、活性ｈＭｅｇ−ＣＳＦフラグメントの単離を導く。

以下に示される例において、ｈＭｅｇ−ＣＳＦの遊離アミノ末端アミノ酸配列（ ″機能性均一均一“タンパク質画分を使用することで得られる）が示される。その上、ｈＭｅｇ−ＣＳＦの配列を完成する方法、および本発明のｈＭｅｇ−ＣＳＦの遺伝子エンフードを明らかにし、エンコードし、そして再合成ｈｌｌｅｇ− ＣＳＦを発現させる方法を開示する。加えてデータは、出願の発明の方法に従い生成されたそれを復製し、ｈｌｌｅｇ−ＣＳＦ純枠純粋示すことを示す。

多くの異なる異種生命体（他のバクテリア、酵母や、や哺乳類の細胞を含む）や以下に詳しく説明されている他のベクターが、単離、復製、そして再合成ｈＭｅｇ−ＣＳＰに使用することができるということは当業者にとって明かである。そのような生命体やベクターは、例えば、サムロック、Ｊ、他、モリキニラー　クローニング：研究室マニニアル第二版、コールドスプリング　ｌ＼−バー　出版、ＮＹ、　１９８９中に見いだされる。しかし、それらに限定されることはない。

出願の発明は、さらに以下に示された特殊な実施例によりさらに詳しく説明される。しかし本発明の範躊は、それに限定されることはない。

１：　蔦　の　か゛の　−ンパク　の再生不良性貧血の患者から日々の尿が集められ、約５０％フェノールのエタノールと混合し、約０１％フェノールの最終濃度とする。再生不良性貧血患者は減少性細胞（ｈｙｐｏｃｅｌｌｕｌａｒ）骨髄の汎減少症を持ち、体組織や泌尿器系疾患の兆候が無い。血小板数は、約２０．０００／■１３以下、白血球数は約１．５００７ｍｍ３以下であり、ヘモグロビン濃度は輸血によりおよそ６ｇ／ｄｌに維持される。

図ＩＡ中の精製計画は以下に述べる精製ステップを概略的に示している。

ＡＪＬ外皇過収集された尿は、限外濾過によりＹＭＩＯフィルター（１０、ＯＯＯ分子量不遇、アミコン、ベベリイ、ＭＡより入手）を用いて濾過され濃縮される。

ル　・クロマトブーツ　− 限外濾過された尿は、セファロースＧ−５０のＩＯＸ　１００ｃｍカラム（ファーマンアビスカタウェイＮＹから入手（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｐｉｓｅａｔａｗａｙ）　）を用い蒸留された。初期のタンパク質ピーク（排他溶出液）が収集された。

イオノ　りロマトグーフ　− Ｇ−５０プールは、約０．０２Ｍリン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）と、塩化ナトリウム（ＮａＣＩ）により、ｐＨ４，８−５，Ｏに調整された。約０．０２５Ｍ　ＮａＨ２ＰＯ４で平衡にされたＤＥＡＥセルａ　−２（ＤＥ−２２，７ツトマン、クリット７．ＮＹから入手）は、Ｇ−５ｏプールに加えられ（約１ｇ乾燥粉末／尿１１）、そして３０分間撹拌された。混合物は約２時間かけて、約４℃で沈殿させ、弱い吸引操作でカラム中へ注ぎ込まれた。吸引されたタンパク質画分は、約０．０５Ｍリン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）と、約０゜１５Ｍ　ＮａＣ１とにより抽出される。抽出された試料は、乾燥のため凍結乾燥され、約−７０℃で貯蔵される。

一方、ａ−ＳＯカラムで蒸留された尿の濃縮物は、ＣＭ−セファクース速流カラム（ファーマンアから入手）に詰められ、約ｐＨ５，５のＯ，０１Ｍリン酸緩衝溶液により平衡に保たれる。結合イオン性タンパク質物質（ｈｌｊｅｇ−ＣＳＦタンパク質を含む）は、約０．０５ＭＩＪン酸二水素ナトリウＡ　（ＮａＨ２ＰＯ４）と、約［１，１５ＭＮａＣ１とで抽出される。抽出された物質は、透析され、凍結乾燥される。

と１丘上記ステップにより得られた粗製の尿抽出物は、約３ｏ閤１／ｇに溶解され、約２日間約４１の水　（その水は１日に３回交換される）で透析される。それは、約１０ＩＤｉの分子量不透のスペクトラ／ポア（スペクトル医療産業、Ｉｎｃ− −ロサンジェルス、ＣＡ）のような透析管を用いて行われる。透析後、その物質は為凍結乾燥され、約−７０℃で貯蔵される。タンパク質成分は、尿抽出物のサンプルを対象だバイオラドの方法（ブラッドフォード、Ｍ、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｔ７２．：２４８．１！７６）を使用して測定された。

Ｅ、ポリアクリルアミドゲルもとのままの標定ポリアクリルアミドゲルは、約０．０５Ｍ　トリス−ｔｌｅｌ　（ＰＨ６，ｌｌ）中の約５％のポリアクリルアミドゲル（約３０％丁と約２．６％Ｃ）内にある。

１４ｘ　１６ｘ　０．３　ｃ■ゲルは非積相ゲルであり、そして新しく透析、凍結乾燥された抽出物の約０．５ｇの乾燥粉末がゲルに対して加えられる。上下の溜緩衝溶液は、約０、０２５Ｍのトリスーグリコンン（ｐＨ８，３＞を含んでいる。

ゲルは、先端から約１３ｃ＋＋まで、ゲルに対し約５０ｍＡで泳動される。ゲルは、装置から除去され、約１ｅ−に薄く切られ、それは均一組成にされている。

そしてタンパク質は、均一組成にされたゲルに対して約２０−１の水を加えることで溶離させ、−昼夜的４℃で定温処理する。上澄みを取り除き、約２０１１の水を再び一昼夜流す。両方の上澄み溜め、２日間透析し、凍結乾燥する。かなり純粋なｈＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質画分を含む切片番号＃２−５は、溜められ、次のステップに用いられる。図２は、かなり純粋なｈＭｅｇ−ＣＳＦタンパクｉｉｔ画分と、５％ＰＡＧＥの１ｃｌＩ切片の生物活性とをゲルの頂点にある画分＃１とともに示している。

「）　−カ／ノグ等電フォーカ／／グ（ＩＥＦ）は、ｐＨ範囲約３．５−１０で行なわれ、グリコルイト型と／アレイト’Ｍ　（ｓｉａｌｙａｔｅｄ　ｆｏｒｗｓ　）とのｈＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質のＰＩ（等電点）は、約７．２−７．４である（図３　）　ｏ　１１５ｘ　ｏ２ｘ　２５ｃｍのゲルは、ゲルの構成の一部分として、５４％のアクリルアミドと、約０１４４％のビス−アクリルアミドと、アンホリンズ（ａｍｐｈｏｌ　１ｎｅｓ）とで構成される。

０　クロマトグラフ　− Ｍｏｎｏ　Ｐ　ＨＲ５／２０カラム（ファルマノア）は、Ｏ，１１２５Ｍ　トリメチルアミン（酢酸で約ｐＨ８，３にされた）を用い、約１ｍｌ／ｗｉｎの流量で平衡にされている。試料、つまり予１ｉＰＡＧＥステップから得られた約７０ｍｇのかなり純粋なｈＭｅｇ−ＣＳＦり／バク質は好ましくは、濾過（０，２２ミクロン）され、カラムに充填される。約９％ポリバ１ファー９６（ファルマ／ア）と、約０．２１％ファルマライト（ファルマ／ア）とからなる抽出緩衝液はｐ　Ｈ８−１ｏ、　５、（酢酸でｐＨ約６０に調整された）であり、約１１７嘗ｉｎの流速で開始される。これは約８−６のｐＨ勾配溶液を与光る。画分は、４０分間毎分収渠される。かなり純粋なｈＭｅｇ−ＣＳＦタンパク貫を含む１６− ２０分の画分の溶出液は、ｐＨは約７．０−７．５である（図４）。これらの画分は、２日間透析され、そして凍結乾燥される。

Ｈ，ポリアスパラギン　Ｗ　ｘ　イオン　ＨＰＬＭｏｎｏＰカラムからのｈ−Ｍｅｇ−Ｃ３Ｆタンパク質画分（約０．５ｍｇ）は、約０．０５Ｍリン酸緩衝溶液（約６．４５のｐＨ）中に再＠Ａ濁され、濾過される（０．２２ミクロン）。試料はポリアスパラ＃；／酸　ＷＣＸ　１（ＰＬＣカラム（Ｔｈｅ　Ｎｅｓ　ｔ　Ｇｒｏｕｐ、サウスボロ、マサチュウセノノ州４゜６ｍｍｘｌＯｃｍ）に注入され、そして約５分の約０．０５Ｍリン酸緩衝溶液の０．５−］ＭＮａｃｌ　勾配溶液に続き、約３０分の約０．０５Ｍリン酸緩衝溶液中のＯ−０，０５ＭＮａｃｌ勾配溶液は、画分＃１３−１７（すなわち、約０．５−ＩＭ　Ｎａｃ　ｌ）中にあるｈＭｅｇ−Ｃ９Ｆタンパク質の画分を溶離するのに使われる。

１、Ｃ１８°　ＨＰＬＣＭｏｎｏＰカラムから得られた実質上純粋なｈＭｅｇ−Ｃ３Ｆタンパク質画分は、水中で約０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）水溶液中に再＠濁される。

試料濾過され（約０．２２ミクロン）、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラム（カリフォルニア州すンラモンのＢｅｅｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製、Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ　ＯＤ　Ｓ　、　４　、　６ｍｍｘ２４ｃｍ）に注入される。カラムは約０．１％ＴＦＡと約３０％アセトニトリルとの混合液で１０分間平衡にされて、タンパク質は約１ｍｌ／毎分で０゜１％Ｔ　Ｆ　Ａ　ニより、３０−７０％アセトニトリルの勾配溶液中焼く３０分で溶離される。１分の画分が集められる。３２分から３４分に溶離された画分（＃３２−３４）は機能性向−ｈＭｅｇ −ＣＳＦ蛋白を含んでおり（図５を見よ）、それらは溜められ、凍結乾燥される。

本発明の選択された好ましい他の実施例のなかでは、このｈＭｅｇ−ＣＳＦは上記のＡ−Ｚのステップを使って精製される。予＠ＰＡＧＥステップ（ステップＥ）は上記のＧで述べられたＭｏｎｏＰ　ＨＲ５／２０カラムを使ったクロマトフオーカシングに続いて行われる。予備ＰＡＧＥステップからの画分は溜められ、少なくとも２日間蒸留水中に透析され、凍結乾燥され、ｐＨ８，３の０．０２５Ｍトリメタ／−ルアミノ中にＵ濁され、ＭｏｎｏＰカラムへの注入の前に濾過（０２２ミクロン）される。これは、先に示したステップ■とＨとにおいて述べられているようなＣ１８逆相そしてＷＣｘポリアスパラギン陽イオン交換ＨＰＬＣＭｏｎｏＰ　ＨＲ５／２０カラムを使ったクロマトフォーカ／ングは上記のステップＧに述べられたように実施される。両分は溜められ、透析され、凍結乾燥され、再ｓａｄされる。

Ｇ’Ｃ１８ＨＰＬＣＭｏｎｏＰ　ＨＲ５／２０　カラムから再回収されたｈＭｅｇ−Ｃ３Ｆは、上記の様に処置される。データは５図に示されている。

Ｈ′ポリアスパラギン　ＷＣｘ　イオン　ＰＣＣ１８逆相　ＨＰＬＣカラムからのｈＭｅｇ−Ｃ３Ｆタンパク質画分は、約１　ｍ　ｇ　７”　１すｔトルという濃度となるように凍結乾燥され、約０．０５Ｍ　リン酸緩衝溶液（ｐ　Ｈは約６．４５）の中で再＠濁される。サンプルはポリアスパラギン酸ＷＣＸ　ＨＰＬＣカラム（ｔｈｅ　Ｎｅ５ｔ　Ｇｒｏｕｐ　）の中に注入され、上記ステップＨに述べられた様に処理される。

ＷＣｘカラムから溶離された物質は透析され、凍結乾燥され、そして１２％非還元５ＤＳＰＡＧＥゲルの単一レーンに導かれ、電気泳動され、固定化ＲＶＤＦＩＲ（ミリボアＣｏｒｐ、、べ、ドフォード、ＭＡ）へ移動され、そしてコーマン〜ブルー　（Ｃｏｏ曽ａｓｉａ　ｂｌｕｅ）で着色される。結果として生じたゲルの頂点から２．８ｃｍの単一バンドは図８に示されるように、およそ５Ｏ−７０Ｋｄの分子量で泳動する。これはゲルが泳動される非還元状℃下による二量体ｄ１ｍｅｒを示だろう′、しかし、Ｍｅｇ　−Ｃ８Ｆ活性を持つ他の化学種または残留物をも示す。

見立層−ユ五二ニロ」；工付ユゴニ」Ｉｌ法均−ｈＭｅｇ−Ｃ５Ｆは以下の方法で得られるであろう：ｌ外慮Ｌし濃縮された再生不良性式血尿５０リットルは、プロテアーゼ阻害ロイペプチン（ペーリノガーマンハイムから得た）の２　／Ｊ　ｇ　／　ｍ　１を含む０．８Ｍ尿素の１００ｍ１中に溶解される。その物質はｌＯ粉子装除去膜くオメガセル、フィルトンテクノロジー株式会社、クリット：／、ＭＡ）上で濃縮される。１ｏ８１ｉ上から得られた物質は捨てられる。通過したものは収集され、＋０５排除膜上で濃縮される。通過したものは収集され、１０４＠去膜上で濃縮される。それぞれのステ、ブでの濃縮物は、この濃縮物の体積の３倍の体積を有する０、８Ｍ尿素と、２μｇｍ１ロイベブチ／とからなる液体で洗浄される。ヒト巨核球コロニー１１１＆活性は、ｔｏ！５−ｔｏｅ画分とｌｏ”１０５［１分中に得られた。１０５−１０６画分はまた、エリスロポエチンとＧＭ−Ｃ３Ｆ活性を含むことが発見された。１０４−１０噛分中に含まれる物質はポリアスパラギン酸ＷＣｘカラム（Ｔｈｅ　Ｎｅ５ｔ　Ｇｒｏｕｐ。

サウスボロ、ＭＡ）を用いた弱陽イオン交換ＨＰＬＣによりさらに精製される。

ロマトｌ］≦−仁ユ１０４−１０５画分は、ＷＣＸ　ＩＩＰＬｃカラム中に注入される前にｐＨ６，０の調整される。そのカラム（１００ｘ４．６ｍｍ；５ミクａン）は、０．０５Ｍ！Ｉン酸ナトリウムにより、ｐｉｉａ、０で平衡化される。流量は１．０ｍｌ／ｍｉｎである。

不純物タンパク質が２０分以上かけて除去されたｐＨ６，０での０．０５Ｍリン酸ナトリウム中の０から０．５Ｍ　Ｎａｃｌの２相勾配はただちに続けて、ｈＭｅｇ−Ｃ３Ｆを溶離するために５分以上、リン酸緩衝溶液中の０．５からＩＭＮａ（Ｉの勾配に移される。２．５ｍ１ｌｉ１分が収集される。ｈＭｅｇ−ＣＳＦ活性は図９中に図解したように、プールＡ（画分番号１−６）、プールＤ（画分番号１６−２１）、そしてプールＥ（画分番号２２−２８）中に検出できる。さらには、２つのＨＰＬＣから流れる物の個々の画分は、凍結乾燥　により濃縮され、ｈＭｅｇ−Ｃ３Ｆ活性は図１０８中に示すように、両分番号１６−２１．２０の画分から再回収される画分番号１９．２０および２１の画分において、ピーク活性を有するより０．５Ｍ　Ｎａｃｌより濃い液体で抽出される。

ＣＤ５−ＷＣＸ　ＨＰＬＣカラムからの画分番号１６−２１からの物質の収集された物質は、還元（５％　２−メルカプトエタノール）と、非還元状態下とで、１２％検定用５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動される。ゲルは、１と０．５ｃｍ切片に薄く切られ、そしてタンパク質はＩＭＤ）ｉｔ培質＋１％ＦＣ５（１ｍｌ／ｃｍゲルにつき）中で４℃の定温を２昼夜続けられることにより抽出される。事前に着色された分子量標準物質は、分子量を定置するため隣接したレーン中に流される。この特別な実験において、約５７−６６ＫＤの大きさの範囲に及ぶ単一バンドは、図１０Ａに示すように、予想されるｈＭｅｇ−Ｃ３Ｆ活性の５Ｏ−７０ＫＤの範囲の中に検出される。く他の実験は、５２−５５ＫＤ単一バンド中に結果を持つ。〉溶離された培質は溜められ、２日間蒸留水に透析され、そして生物学的活性が検定される。図１１Ａに示すように、Ｍｅｇ−Ｃ５Ｆは非還元状態下で約２４−３５ＫＤａとの約５Ｏ−７０ＫＤａの分子量両方で検出されるが、最大の活性は、５Ｏ−７０ＫＤ化学橿と関連がある。同じ物質の還元状管（２− メルカプトエタノールを加えた）下でも、ｈＭｅｇ−Ｃ５Ｆは図１１８に示すように、約２４−３５ＫＤａと約５Ｏ−７０ＫＤａとで検出される。しかし、還元状態下では活性の大部分は高分子量化学種から低分子量化学種へと移動しているヒトの尿は、Ｍｅｇ−Ｃ５Ｆに加え、他のサイトカインおよび、ＥＰＯ，Ｍ−ＣＳＦ、そしてＧ−ＣＳＦを含む成長因子（ダス、Ｓ、に、他、血液　５ｇ　＋　６３０−６４１゜１９１１１　；ミャケ、Ｒ他、Ｊ、ＢＩｏｌ、　Ｃｈｅｔ　２５２　：　５５５８２−５５６４．１９８７　：　コハヤン、−他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ８０　：　３８０２−３８０６．１９８３）を含んでいる。各精製ステ、プからのＭｅｇ−Ｃ３Ｆ製剤中にある活　性の体系的な調査が行なわれた。結果はここに、ＭｏｎｏＰステップを経て精製されたＭｅｇ−Ｃ３Ｆは、実質上純粋であり、生物学的活性だけが）Ｊｅｇ−Ｃ３Ｆに検定を行なうことで検出された。特異的活性は以下に表１中に掲載する。

表−上特異的活性精製’Ｘ　ｆ　ｙプ　Ｍｅｇ−ＣＳＦ　ｍｕｃＦＵ−ｇｍ＋　ＩＬ−６ＥＰＯ（Ｕ／−ｇ）　（コロニー／ｍｇ）　（ｔｌ／■ｇ）　（ｎｇ／ｍｇ）粗製の原油出物　１．７ｘｌＯ’　ｌ１ｘ１０４　０．３４　２．０予＃ＰＡＧＥ　４．７ ×ＩＯ’　１．５Ｘ１０４　２，５４　０．２（かなり純粋）ＭｏｎｏＰ＜０．０５　７．　ＬＸ　１０２Ｉ　ｎ、　１（実買上純粋）Ｃ１ａ　ＨＰＬＣ１，２ＸＩＱ３　＊　ｎ、ｔ、　＜０．０５（機能的均一組成）ｎ、ｔ　試験未実施本　マウスＣＦＵ−ｇｍ：＋ロニーのパブクグラウノドレベル＃　ＥＰＯ推論可能性の低限＋　マウス額粒球／マクロファージ　コロニー形ｆｆ　１１　位実施された検定は：率アバンノー、Ｇ、Ｃ，（文献：他、Ｊ、Ｃｅ１１．Ｐｂｙｓｉｏｌ、、１９９０．１４５：４５８−４６４）　ニ従ったＭ−０７−ｅａこの検定はＧＭ−Ｃ５Ｆの１２．５ｕ／ｍｌ、Ｉ　Ｌ−３の６ｕ／ｍｌ、そしてＩ　Ｌ−９の５ｕ／ｍｌの微量を検出する。

＋ｋＤｕ　Ｄ−Ｌ　（文献：他Ｉｎｖｅｓｔ二ａ−ドラ１ゲス、１９９１．９：１４９−１５７．）に従ったＣＦＵ−ｇｍ検定（これはＧ−ＣＦＳとＭ−ＣＳＦとの約ＩＱｕ／ｍ１以下を検出した）＊クウオンティカイン（ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＴＭ：　Ｒ＆Ｄ　／ステムズ、ミ＊７＋＋！＋７ス、ＭＮ）これはＩ　Ｌ−８の６６−５ｐ／ｍｌと、ＩＬ−１アルフアーの３１．ａｐｇ／ｍｌとの微量を検出できる。

＊　Ｏ，ＯＳμ／ｍｌ程度の微量を検出する方法であるクリスタル（Ｋｒｙｓｔａｌ　Ｇ、ＥＸＰ、ヘマトール、１９８３．１１＋６４９−６６０）に従ったＥＰＯ検定。

クロマトグラフィー操作によって分離された再生不良性貧血患（Ａ＾）泌尿器の抽出物と画分とは、ＥＰＯにマウススプレノサイト（ｉｐｌｅｎｏｃｙｔｅ）　３　Ｈ−チミダイン検定（クリスタル、Ｇ、ＥＸＰ、ヘマトール、１９８３）　、を用いることでＥＰＯ活性が試験さ　れた。ＥＰＯは多量で最も厄介な不純物を有している。Ｍｅｇ−Ｃ８Ｆの弱塩基性を利用する同様の手法は、Ｍ　ｅ　ｇ　−ＣＳ　ＦとＥＰＯ（約３．５のＰｌを持つ）とを分離する。ｏ、０７Ｕ／ｍｇ程度の微量は、フィブリン凝血検定中で目積球コロニー刺激をするのに十分な量であることが示された。０．０３Ｕ／　ｍ　ｇ　Ｅ　Ｐ　Ｏは単独では巨横球コロニーを刺激しないが、ＩＥＦで精製されたＭｅｇ−Ｃ５Ｆと共に加えられたとき、コロニー数を増やす。それゆえ、表１の予＠ＰＡＧＥでさえ、ＣＦＵ−Ｍｅｇ活性を与えることを試験することで、ＥＰＯ汚染ｈＭｅｇ−Ｃ’ＪＦｌａ１４にとって、高特異活性となるのに十分であると判断できる量のＥＰＯを含んでいる。しかしＭｏｎｏＰとＣ１８ステップでは、巨核球刺激活性はＭｃｇ−Ｃ３Ｆにのみ起因している。

３・　Ｉ　におするｈｏｅ　−Ｃ３Ｆマウスのフィブリン凝血培養／ステムは、クリヤ、Ｓ−１，他、（文献：　Ｅｘｐｌｌｅｍａｔｏｌ、　Ｉｓ　：８９６−９０１．１９８７）中に記述されているように、目積球後代（ＣＦＵ−Ｍｅｇ）を検出されるために用いられる。

詳しくは、ダルベメコ培地のイソコープ（ｌ５ｏｃｏｖｅ’　ｓ）型一時変異（［ＭＤＭ、／グマケミカ　ルＣＯ１、セントルイス、ＭＯ）と試料とは、約２０％の牛の胎児の血漿（ＦＣＳ、ハイクロンＢｙｃｄｏｎｅ研究所、ローガン、ＩＩＴ）　、骨髄細胞（最終温度約５　ｘ　ｌ　０５１１胞／ｍり、約２０％フィブリノーゲン（シグマケミカルＣ０８）と、約１０％トロンビン（／グマケミカル　Ｃｏ、　）と共に混合された。約Ｑ、４ｍｌのアリコー）　（ａｌｉｑｕｏｔｓ）は３５ｍｍの皿の中央に注ぎ入れられ、そして凝血が固形になったとき、約０．６ｍｌのＩＭＤＭがそれらの周囲に配置される。６日後、ブイプリン凝血は乾燥され、例えば、カルノブスキー１Ｍ１．他、（文献：　Ｊ、　Ｈ４５ｔｏｅｈｅｔ　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、　１２：２１９（１９６４）とノヤクソン、　Ｃ，Ｗ、血液４２：４１３（１９７３））で記され石ようにアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈ　Ｅ）の活性を汚損する。３またはそれ以上のＡＣｈＥ−陽性細胞を含むコロニーが係数された。平均値との基本的な誤差は、三重プレートとして定量された。

試料のタンパク質含有量が定量され、凍結乾燥された試料はアイソコープの培地中に約１ｍｇ／ｍ＋の濃度で再＠濁され、濾過法（０，２２μｍ）によって殺菌された。試料は３橿の濃度で試験される：約６．７．３，３、そして０．６７マイクログラム／ｍ＋検定混合物。その結果は、下記表２に示す。

以下、余白。

表２　Ｍｅｇ−Ｃ３Ｆ４！翼活性のマウス生体検定の結果１髪五ヱ一二　丘１区主１本発明にしたがってＤＥＡＥセルロース　１．７Ｘ　１０４から得られた試料２）本発明にしたがってＤＥＡＥセルロースと　４．３ｘ　１０４予備ＰＥＡＧとから得られた試料３）本発明にしたがってＤＥＡＥセルロースと、？、ｌＸ１０２予＠ＰＥＡＧと、ＭｏｎｏＰ経路とから得られた試料１　一つのユニットは、３０のマウスフィブリン凝血検定における１つの目積球コロニーとして明示されている。ＤＥＡＥセルロース試料（１）と予ＩＰＥＡＧ試料（２）の特異活性とは、Ｍ　Ｏｎ　ＯＰおよびＣｌ８ＨＰＬＣ試料（それぞれ、３と４）より大きな活性を有していると表２中に報告される。これはＤＥＡＥセルロースと予＠ＰＥＡＧ試料（それぞれ、１および２）とにおいて、ＥＰＯ、’ＧＭ−Ｃ３Ｆ、３５その他のような汚染しているタンパク質によると信じられている。

４）本発明にしたがってＤＥＡＥセルロースと、予備ＰＥＡＧと、Ｍ　ｏ　ｎ　ｏ　ＰおよびＣ１８逆相　４．０Ｘ１０４ＨＰＬＣ経路とからから得られた試料（図ＩＡ）５）本発明にしたがってＤＥＡＥセルロースと予＠ＰＥＡＧと、　− 一−ＭｏｎｏＰクロマトフォーカ／ング、および（タンパク質濃度が、Ｃ１８逆相およびＷＣＸＨＰＬＣ経路からから得られた測定には低くすぎた）試料（図ＩＢ）４：　におζ　ｈＭ　−ＦｈＭｅｇ−Ｃ３Ｆの生体内における生物学的検定は、クリヤ、Ｓ９、他、（文献：Ｅｘｐ、　Ｃｏ１１．　Ｂｉｏｌ、　５５＋２５７−２６４．１９８７）と、クリヤ、Ｓ、池、（文献：エクスペリメノタル　ヘマトロノートウ　ディ、バウムＳ、　Ｊ、　、　ｍ、　ａｄｓ、　ｐｐ、　３３−３８．スブリンガ一一ベルラーク、ニューヨー　り、　＋９１１５）に述べられる規定にしたがって行なわれるだろう。上記引用された７考文献において、天然のｈＭｅｇ−ＣＳＦ　（” 粗製の泌尿器抽出物”型中に存在する）は、塩類注射された制御と比較したとき、明かにラット中の循環血小板の数を増化させた。血小板の大きさに変化は無かった。

５匹のラットのグループは、マウスＣＦＵ−Ｍｅｇ検定において、２Ｘ１０５細胞当たり約２０−３０コロニーを生ずる服用量で腹空内に注射されるであろう。

注射は３０続けて投与されるであろう。２４時間後、動物は尾の静臓から採血され、血小板の数と大きさとはクールターカウンターによって測定される。対象１ｍｌは：　１　）　ｈＭｅｇ−ＣＳＦ　ＤＮＡ中でトランスフェクトされて無い細胞の上澄みやライセイト（１ｙｓａｔｅｓ）：２）生理的食塩水；および／′ あるいは３）刺激ＣＦＵ−Ｍｅｇとして知られる他のサイトカインを欠く非−ヒトｈＭｅｇ−ＣＳＦ含有画分：を注射された動物から構成されている。

生体内活性は、ｈＭｅｇ−ＣＳＦでの治療後のマウスらの目積球子孫（ｐｒｏｇｅｎｊｔｏｒ）細胞の数の計量によっても定置することができる。５匹のマウスは精製された天然のあるいは再結合されたｈＭｅｇ−ＣＳＦの一服用量が注射されるだろう。動物は接種の２．４、そして６日後に犠牲にされ、それらの肺臓と大腿部とが無菌で除去される。単−細胞墾濁液は、粉砕された膵臓と大腿部とから流出する髄液から作られる。そして細胞は、マウスの骨髄細胞の代わりにフィブリン凝血検定中に板状化（ｐｌａｔｅｄ）され、培地（ＰＷＭ−ＳＣＭ）で凋警されたアメリカヤマゴボウマイトノエノ胛臓およびＭｅｇ−Ｃ５Ｆのソースで刺激される。”粗製の泌尿器抽出物”であるＭｅｇ−Ｃ３Ｆは、マウス肺臓巨核球子孫Ｐｒｏｇａｎｉ　ｔｏｒｓの数を増加するということは以前に示されている（クリヤ５Ｓ、、他、スーブラ）。それは塩分を含んだ制＆、こ比較した肺臓細胞により精製されたコロニー中の増加によって立証されるようである。骨髄目積球子孫中では増加が無いが、多分用いられたＭｅｇ−Ｃ３Ｆの低濃魔に拠っている。それゆえ、本発明の精製されたｈＭｅｇ−ＣＳＦ　（天然に得られたｈＭｅｇ−Ｃ３Ｆと、再結合したものとの両方）は肺臓巨核球子孫の数を増やし、また、本発明のｈＭｅｇ−Ｃ３Ｆを受容する動物中の骨髄巨核球子孫細胞の数を数を増加すると予想される。

：　ｈＭｅ　−ンバク　のノー　エツジング先に述べられているｈＭｅｇ−Ｃ５Ｆタンパク質画分は、Ｍｅｇ−Ｃ３Ｆに含まれるであろうと推定されるｎ−末端アミノ酸／−クエ／スを決定するために使用される。したがって、本発明の製剤が、ｈＭｅｇ−Ｃ３Ｆを７−クニンスするために有用であるということを立証している。

タンパク質／−ケンスは、ヒニーイプク、　Ｒ，Ｍ、他、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔ　２５６　＋７９９０−７９９７−１９８１中の述べられるでいるような気相ニドマフ　Ｅｄｗ＊ａｎシーケンスノー５ｅｑｕｅｎｃ［ｎｇを用いている、マノダイラ、　Ｐ、　、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔ　２６２：１００３５ −１１１０３８．１９８７とフン力フィラー１Ｍ９．他、メツノット　イン　エンザイモル９１：２２）−２３６，１９８３、中に述べられるように述べられている。装置はポートン型２０２０気相タンパク質ンーケンサー（タルツアナＴａｒｚａｎａ、　ＣＡ）　Ｓ　Ｄ　Ｓ　−Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅから電気泳動された（非還元状態下で電気泳動される）後、前に述べられたように、ＰｖＤＦ膜上に固定されたタンパク質から決定される。

Ｎ−末端アミノ酸シーケンスはＸ−Ａｓｐ−ＰｒｏＪａ　ｌ−Ｇ　１ｕ−Ｓｅｒ −Ｐｒｏ−ｖａ　１−Ｐｒｏ−Ｙであり、Ｘ−とＹ−は未決定残基である。このように部分的にノーケンスされた化学種は、高分子量（５０−７０ＫＤ）化学種である。

・　トＭｅ　−Ｆ　ｃＤＮＡの　′　゛れた　シーケンス極端に低レベルのＭｅｇ−ＣＳＦ発現により、生物化学的研究や臨床試験の為に天然　材料からサイトカインをえることは実際的ではない。しかしながら、前記実施例５中に示したように、ｈＭｅｇ−ＣＳＦを均一に精製すること、およびＭｅｇ−ＣＳＦへのアミノ酸ノーケンス情報はＭｅｇ−Ｃ３Ｆへアミノ酸シーケンスをエンコードするＤＮＡ９−ケンスの分子クローニングの方法として公開されている。複製は以下に示すような例で実行される：１）Ｎ−末端アミノ酸ノーケンスの全てのコドンの組み合わせに一致する退化デオキ／すりゴヌクレオチドノーケンス（ＤＯ９）は、ポリメラーゼノーケンス反応（ＰＣＲ）によりＭｅｇ−ＣＳＦ　特異ｍＲＮＡを拡大する誘因剤として、そして遮蔽物と最終的クローンＭｅｇ−Ｃ３Ｆ　ｃＤＮＡのプローブ（検出子ｐｒｏｂｅｓ）として使用されるだろう。

２）Ｎ−末端Ｍｅｇ−ＣＳＦに一致するペプチドは合成され、そして輸送分子と接合されるだろう。仇役したポリペプチドは幾何真性（ａｎｔｉ−）−ペプチド抗体を作るのに用いられるだろう。それは、当業者に周知の技術を用いてｈＭｅ　ｇ−Ｃ５Ｆを確認する。それは、ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライプ５リ表現の免疫学的スクリーニングを経てＭｅｇ−ＣＳＦ　ｅＤＮＡｔ−得る代わりの方法をも与えるだろう。

四恥コ′ローフ　今ロー二／グル　い　−ｃＮノＰＣ特特約的全長くあるいは全長に近い）ｃＤＮＡの選択的増幅と続くクロー二／グは、以下のステップにより成し遂げられる：　（１）第一ノーケンス合或はオリゴ−ｄＴプライマー（誘因剤ｐｒｉｍｅｒ）　（それは真核生物のｍＲＮＡ上に見いだされるポリへの末端に結合している）の使用により開始され、第二ノーケンスＣＤ　Ｎ　Ａ合成はＤＮＡポリメラーゼ１．のクリ１ノーＫｌｅｎｏｗフラグメントにより無し遂げられる。（２）特異的ＤＯＳプライマーとオリゴ−ｄＴＴｉイマーを使用するＰＣＲは、問題のｃＤＮＡを、Ｍ１３フＴ−ノあるいは他のベクターへのクローニングより先に増幅するのに用いられる。（３）特異的ＣＤＮＡライブラリーは、３２Ｆ−探’：！されたＤＯＳプライマーにより遮蔽され、そして陽性クローンは制限地図と７−ケンスとにより特徴付けられる（この方法の変形では、系−ｅＤＮＡの合成を引き起こす為にランダムプライマーを用いられるだろう）。第二／ −ケンスはそして前述と同じ方式において合成され、二重シーケンスｃＤＮＡは適当なベクターく例えば、ラムグＺＡＰ２ベクター、（ストラータジェン、１、Ａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）　）中ヘクローンされる。その後、ＤＮＡは全ラムダＺＡＰ２　ｃＤＮＡライブラリから分離され、そしてＭｅｇ−Ｃ３Ｆ特異的クローンは特異的ＤＯ３とベクターに基づくプライマーを用いたＰＣＨにより増幅されるだろう。

増幅された生成物は、そして例えば、Ｍ１３ベクター（Ｇ　Ｉ　ＢＣＯ／ＢＲＬ　ライフテクノロジー、ＮＣ，ガイセルスベルク、ＭＤ）中ヘクローンされ、特徴付けられる。この技術は、サム口、り、」、他、スープラ中に述べられている。

Ｍ−Ｎの　−クローニングＭｅｇ−ＣＳＦ　■Ｒ１１Ａ信号増幅に用いられるプライマーペアは、センス（ｓｅｎｓｅ＞８１に結合している第−鎖オソゴーｄＴ１ｙ”一般的な”プライマー、およびアンチセンス鎖に結合している特異的プライマー（ＤＯＳ　Ａ）になるであろう。ＤＯＳ　Ａは、Ｍｅｇ−ＣＳｐのＮ−末端アミノ酸配列から得られる全コドン組み合わせに一致する１７−メア（ｍａｒ）であり、配列　ＤＯＳＡｌ：ＧＡｃ／Ｔ　ＣＣＩＩ　ＧＴＮ　Ｇ＾＾／Ｇ　ＴＣＮ　ｃｃ；ＤＯＳＡ　２・ＧＣＴ／ＣＣＣＮ　ＧＴＮ　ＧＡＡ　Ｇ　ＴＧＣ／Ｔ　ＣＣただし、選択可能な第三塩基は斜線（Ｃ／ＴはＣあるいはＴを意味する）により発現され、モしてＮは４つの塩基のいずれかを意味する。加えて、他の特異的プライマー（［ｌＯＳ　Ｂ）の配列はＤＯＳ　Ａプライマーに隣接したアミノ酸、および下流の伸縮性に拠っており、確証された交配プローブとして合成され、そして用いられる。

ＤＯＳ　Ｂ配列は、Ｔｅｌ　ＣＣＮ　ＧＴＮＣＣＮ　ＧＡＧ／Ａ、但し１はイノ７ン酸を示す、である。

Ｍｅｇ−ＣＳＦ発現の起源の情報は、この要素の上手なりローニングが決定的に重要である。それゆえ、Ｔｉ１ｌｌ胞と牌ｆａ細胞（オガタ、に、他、血液７４：　（Ｓｕｐｐｌｅ、１）　３３Ｑａ、１９８９）とは、Ｍｅｇ−ＣＳＦを生ずる可能性のある、内皮組織、胎盤、赤血球基質細胞と他のＭａｔ（例えば、肝Ｉｔ）と共に、キ＋７トレル、他（文献：　ＰＮＡＳ　（ＵＳＡ）　８７４５１２ −１６．１９９０）　；ベネ／トら、（文献：ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、８２＋６２ＳＯ−５４，１９８５）　；マーチン他、（文厭：セル　６３：２０３−２１１．１９９０）に従ってそれらのＭｅｇ−ＣＳＦ　ｍＲＮＡ発現が調べるられるだろう。

Ｍｅｇ−ＣＳＦ遺伝子発現のありそうな低しペ、ルに拠り、Ｍｅｇ−ＣＳＦ特異的信号は、検知される前、ＰＣＲにより増幅されるだろう。全ＲＮＡは異なる組織から得られ（シルグビン、　Ｊ、　Ｍ、　、池１文献：　Ｂｉｏｅｈｅｔ　１８＋５２９４−９９．１９７９）　、そしてポリＡ”ＲＮＡはオリゴ−ｄＴセルロースカラム（サムロック、Ｊ、ＬＬ分子クローニンク：研究室マニュアル、第二版、コールドスプリングハーバ−出版、ＮＹ、　１９ｇ９）上のクロマトグラフィーの２つのサイクルにより分離されるだろう。箪１　ｊｌｃＤＮＡは、オリゴ−ｄＴＴｉイマーと共にマウスモロニーロイケミアウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）逆転写酵素を用い、そして第２鎖はガルバーとホフマン法（ガルバー、Ｕ他、遺伝子　２５：２６３−２６９．Ｉｎ２　：ダイ、Ｗ他、Ｂｉｏｅｈｅｔ　、　Ｂ＋ｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｔｓ、　１６８　：Ｉ−８，１９９＋１）を用いて合成される。

そして２を鎖ｃＤＮＡは、ＤＯＳＡとオリゴ−ｄＴＴｉイマーを用いる記述された方法（サイ亭、　Ｒ，ｆ、　ｌ証すイエンス　２３９ｔ８７−４９１．１９８８　；ギレンステン、　Ｕ、　Ｂ、池、Ｐｒｏｃ、Ｎａ口Ａｃａｄ、Ｓｅｉ、ＵＳＡ　８Ｓニア６５２−７６５６．１９８８　；　＊−、Ｅ、Ｙ、、他、サイエンス　２４３＋２１７−２０．１９Ｈ；クーパー、　Ｄ、　Ｌ、　、他、バイオテクニックス　９：６［＋−６５，１９９０；ドルツマ／０Ｍ。

他、バイオテクニックス　７；５６８−５７０．１９８９）から採用されたような、　ＰＣＲ（バー牛ノーエルマー　Ｃａｔｕｓｌ増幅の３０サイクルに拠るだろう。寓なる組織源からのＰＣト増幅ｃＤＮＡは、ド／トープロットｄｏＬ−ｂｌｏＬ法かアガロースゲル電気泳動によす、続いてンユライカーさ／ニール、キーン、ＮＨから入手可能なような強化ニトロセルロース膜上へのブ０／ティングによって分析されるだろう。８０℃で２時間真空下テ焼成した後、ニトロセルロースプロットは、３２Ｐ−標識されたＤＯＳ　ＡとＢとで連続的にプローブされる。最も強い特異的信号をプローブＤＯＳ＾とＤＯＳ　Ｂとに与える組織は、Ｍｅｇ−ＣＳＦ　ｃＤＮＡの最初の起源として用いられるだろう。

前に述べられたような合成そして増幅された２重鎖ｃＤＮＡは、Ｅｃｏ　Ｒ１メチラーゼでメチル化され、フリユノー（Ｋｌｅｎｏマ）酵素とｄＮＴＰとの培養によりプラント−エンドされ、モしてＥｃｏリンカ−（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ　ライフ　チクノロシーズ）で結合される。ＥｃｏＲｌでの消化の後、ｃＤＮＡはアガロースゲル上での大きさによって分離される。最小のコーディング配列より大きいｅＤＮＡは、電気的溶離により溶離され、Ｅｃｏ　Ｒ１で切断されたＭ１３　ｍｐ１９ファ−ノベクターで結合され、そして脱リン酸される。結合された生成物は、ＣａＣ−処理されたＥ、Ｃｏ１１　ＪＭ　ｌｏｔ細胞中に移動させられ、ＹＴ／ＩＰＴＯ／Ｘ−ｇａｌプレート上に配置されるｏ　Ｍｅｇ−ＣＳＦ　ｅＤＮＡクローンの検出は、両方のＤＯＳプローブ（ＤＯＳＡとＢ）のハイブリグイゼータ１ンによりなされるであろう。−昼夜成長させた笥工３マクロファージプラークは、ニトロセルロース膜上に配！される。膜はさきに述べられた（亭ヤプラン、　Ｈ，Ｓ、他、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ■１９９０、２５３：３３２−３３９．１９８８　：ダイ、Ｗ（也、文Ｍ、　：　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　＋９９０．２６５　：　１９８７１−P９１１７７）ようＩこ処理され、そして３２Ｐ−ＡＴＰＩｊ！！されたＤＯＳプローブで交雑される。両プローブを交雑させるプラークが選択される。−木調ＭＩ３　ａｐ１９ＤＮＡは陽性クローンからテ／プレートとして調製され、チオキシヌクレオチド末端法（サンガー、Ｆ他。

文献：　Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４：５４６３−５４６７、１９７７）により配列される。この配列情報は推定されるＭｅｇ−ＣＳＦクローノと同一を確証するだろう。

すｃ１１ライブラｊ−か゛の　−Ｓ　ｌの　産前方法の変形として、ランダムプライマーは第−鎖ｃＤＮＡの合成のために用いられるだろう。−ｅｇ−ＣＳＦ　ｍＲＮＡの大きさが３Ｋｂ以上であれば、この方法は特別な重要性がある。メチル化、す／カー添加、モしてＥｃｏ　Ｒ１消化の後、二重鎖ｃＤＮＡは完全なｃＤＮＡライブラリを作るために、ラムダＺＡＰ　２ベクター（ストラタノーン）中に結合されるだろう。全ｃＤＮＡライブラリはＤＮＡ単離のために一度増幅され、増幅されたファーシライブラリ−は溶離される。再結合ファージＤＮＡが調製され（サムロック、Ｊ、７他、スーブラ）　、Ｉ’ＣＲ増幅の開始物質としてもちいられる。ラムダＺＡＰ２ベクター中で増幅されたＭｅｇ−ＣＳＦ特異ｃＤＮ＾クローンは、特ｊｉＤＯｓ　Ａプライマーを用いている３０サイクルのＰＣＨにより増幅され、モしてラムダＺＡＰ　２フア一ノ配列（マルチクローニングサイトでバインド３　（Ｂｉｎｄ　ＩＩＩ）サイトを含んでいる）に相当する竿ニプライマーは、ｌａｃ　ｚ遺伝子中に配置されるだろう。増殖の後、ＤＮＡはｄＮＴＰの存在下でクリ二ノー（Ｈｅｎｏｗ）酵素でプラント−エンドされるだろう。そしてプラント−エンドされたＤＮＡは、バインド３　（ｌｌｌｎｄ　ＩＩＩ）で切断され、Ｍ１３ファージベクター（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ　ライフチクノロノー）を切断するバインド３　／５ｅａｌに結合される。結合された生成物は、Ｅ、Ｃｏ１１　ＪＭ　ｌｏｔ拮抗細胞中に移され、再結合されたファージは、前に述べられたように、Ｍｅｇ−ＣＳＦ　ｃＤＮＡ挿入物ｔｎｓｅｒｔｓを検出するだろう。陽性クローンからの重複しているｃＤＮＡ挿入物は、Ｍｅｇ−ＣＳＦにとって全長のｃＤＮＡクローンを組み立てるためにもちいられる。

ペプチド　本　い　ｃＥｉ　イブーリ　の精製されたＭｅｇ−ＣＳＦｏ）Ｎ−末端アミ／＃配列に対するポリクロナール抗ペプチド抗血清は、クーパー、Ｂ、Ｍ、他、（文ｒｄ＝カレント　プロトコルインモリキュノーバイ　オロジー）、アウスベル、ＩＭ他、（文献：　ｅｄｓジッンウイリー　ア／ドサ／ズ、Ｎ、　Ｙ、　１９９０）中で明らかにされているように、ネズミの免疫化により得られる。抗ペプチド抗体を作るために、ペプチドはレーナーＲ，Ａ　（文献：　ネイチャー　２９９：５９２−５９６．１９８２）中で明らかにされているように複合されるべきである。

さらには、そのペプチドは、タム（文献：Ｊ、Ｐ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８５：５４０９−５４１３．１９８８＞で明らかにされているように、リジン核上で合成されるだろう。

この抗ペプチド抗体は、Ｍｅｇ−ＣＳＦ　ｃＤＮＡクローンを検出する別の方法を与えるであろう・ラムダＺＡＰ２　ｃＤＮＡライブラリの免疫学的検出は、記述されているように（ヒュンフ、　Ｔ、　Ｖ、　ｆｉｌｌ、グローバー中、Ｄ、Ｍ、（Ｅ、Ｄ、）　ＤＮＡ　りｏ−ニングＶＯ１，，１，ＩＲＬ　出版。

ワンシト７．　Ｄ、　Ｃ，＋９１＋５　；ダイＪ、、Ｐｈ、Ｄゼー／ス、プルデユー大学、ラファイエテイー、インディアナ、　１９８１１）本質的には行なわれる。詳しくは、ＬＢプレート上で４時間４２℃で成長され再結合されたファージは、ｈＭイ７プロビルーベーターチすガラクトビラノンド（ＩＰＴＯ）で飽和したニトクセルロースフィルター（シグマケミタンパク質のための発現／ステムに対する理想的なＥ、ＣＯｌ、の２つの特徴的は、フードする短い合成オリゴヌクレオチドと結合され、プロパー末端をクローニンノ酸の接合点で特異的に“ハンドル”の確認と分裂をする）によって除去するこ履される。

ビューティティブ再合成ウィルスからタンパク質を分析するため、Ｓｆ９細胞は５１の完全な培地中に２．５　Ｘ　１０６／２Ｓｃ論フラスコの１ｌｌｌｆで接種され、細胞がつくまで２１℃で約３時間保持される。血清遊離完全培地（５Ｘ１０３粒子）中の個々の貯蔵物からのビｊ−テイテイブ再合成バクロウィルスは、接種された細胞へ加えられる。３から５日間ｇ染後、細胞は静かにフラスコから離され、遠心分離（１，ＯＯＯＸｇ。

１０分、４℃）するために遠心管へ移される。Ｍｅｇ−ＣＳＦは分泌されたタンパク質であり、分泌のためにリーダーペプチド（″７曳ンドル”しないペプチド配列がＮ−末端に接合される時）を有するべきであるから、培養の上澄み（および細胞リーセイト）は以下に述べられるように、初めにＭｅｇ−ＣＳＦ抗原と活性とが分析される。（代わりに、他のタンパク質の分泌信号をエンコードするＤＮＡはＭｅｇ−ＣＳＦｉｌ伝子ニ接合され、また対応する信号配列は続いて分裂される。）ワイルド−タイプバクロウィルスで感染された細胞は、陰性制御として用いられる。Ｍｅｇ−ＣＳＰ活性を示し高いタイターを与える再合成バクロウィルスの貯蔵物は、さらに進んだ研究のために貯蔵される。

五金成氷左二江へ１製再合成Ｍｅｇ−ＣＳＦの最終的な精製は、例えば以下の技術のいくつか、あるいは全てを用いることで実施されるニゲル排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イオン交Ｗｋ液体りクマトグラフイーかＩＩＰＬＣ，疎水性相互作用クロマトグラフィー、クロマトフオーカシング、標定ポリアクリルアミド電気泳動、ノイイオアフィニティークロマトグラフイ−（例丸ば、モノクロナールか他の抗体カラム、レクチンカラムとそのようなもの）であり、それは当業者にとって周知の技術であり、文献（再合成タンパク質の精製と分析、マーセルデツカ −、Ｉｎｃ、　、　ＮＹ、　１９９１中のノーサラム＋１他、（ｅｄｓ、）　；ドイツチャー、ｌＪ、Ｐ、、メソッドインエノザイモロジ−Ｖｏｌ、　＋１１２．タンパク質精製のガイド、アカデミツク出版、ＮＹ、１９９０ニアウスベル、Ｆ、Ｍｆｍ　（ｅｄｓ）　、カ　レシト　プロトコルインモリキュラーノイイオロジー、）冒ン　ウィリー　アンドサンズ、ニューヨーク１９９Ｇ）中に開示されている、例えば細胞タイプとクローニノグベクターに従って使われる精製技術が採用される。例えば、ＩＩＰＬｃはモチツキ、ＤＹ他（文献：　Ｊ、　ｌｍ５ｎｏ１．１３６：３７０６−３７０９．１９８６）中に使われるよ）に、酵母細胞から得たＣＭ−ＣＳＦの精製のために使用され、チェーボ、ＣＭ他（文献：　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６１：　５ｇ５Ｍ−５８６５，１９８６）中に示されているような酵母分泌コンセンサスインターフェロンノ精製のためのクロマトフオーカシング、ヤノンフ＾他（＾ｔＩｌｅｖ、　Ｒａ５ｐ、　Ｄｉｓ１３３　：３Ｓ３−３５６．１９８６）により示されているような酵母由来のアルファ１プロテナーゼ抑制物質を精製するための陽イオン交換とゲル濾過である。

加えて、バクロウィルス由来のｈＭｅｇ−ＣＳＦは、サマーズ、Ｍ、Ｄ、他、　（文献：”ア　マ二二アル　オブ　バクロウィルスベクター　アンド　インサートセル　カルチャーズ１．プルチンｔｓｓｓ、テキサス　アグリカルチュラル　エン　スベリメンタル　ステージ嘗ン、カブレジ　スティン冒ン、ＴＸ、　１９１１７）中に示されている技術を用いて精製されるだろう。

天然のｈＭｅｇ−ＣＳＦのグリコシレーノッンは、特にイオン交換カラム上でその挙動に重要な効果をもつ。それゆえ、ノーサラム、Ｒ他、（スープラ）中に示されるように、それはＥ、フリー中に発現された再結合物貰の精製の別な方法を用いるのに必要であり、それはアングリコンレイトするだろう。それらは融合タンパク質として発現している再結合タンパク質を含む。それは、前述の″Ｉ−ンドル”ペプチドに有効な抗体（カミ１ネクスＩｎｃ、　／アトル、Ｗ＾）を用るアフィニティ一工程、シーサラム、Ｒ他、（スープラ）中に示されるような限外濾過、あるいは前述された当業者にとって明らかなソリューシ曹ンベースクロマトフオーカンングにより単離可能である。

以前の例中に概略された精製計画の全て、または一部は、再合成ｈＭｅｇ−ＣＳＦの精製において有効であると期待される。

：ハ　の日　に°（−の本発明の均−ｈＭｅｇ−ＣＳＦは、目積球新生（ｍａｇａｋａｒｙｏｅｙｔｏｐｏｉｅｓｔｓ）中のＭａｇ−ＣＳＰのロール（ｒｏｌ　ｅ）解明するため、ヒトかマウスの骨髄を用いる実験に用いられる。以下に示す疑問が問われる：　Ｍｅｇ−ＣＳＦは、そのためにより多くの目積球が生成される骨髄プロジェニターの増殖をもたらすか？それにより血小板の数及びあるいは生成される速度に影響する、プロジェニターの目積球への分化をもたらすか？他のサイトカインと相互作用し目積球の増殖および／あるいは分化を増加させるか？それらの疑問を調べるための実験は、Ｍｅｇ−ＣＳＦ分析中の骨髄が用いられるだろう。１１ａｇ−Ｃ３Ｆは同時または連続的に他の因子〈前か後）に、幹細胞の巨接球系統への分化を促進する対ＣＦＬＩ−Ｍｅｇ増殖を動かす対血小板生成と放出するための成熟を増加する因子を定置するために加えられる。生成されたＣＦＵ−Ｍｅｇの数が定量さ　−れる。それらが対照培養以上に増殖されるかどうかも定置される。目積球の数が他のサイトカインで生成されたそれら以上に増殖したなら定量される。ＣＦｔｌ−Ｍｅｇ分析に代わるものが、液体培養培地と骨髄成長のためのラン胎児血清と生成された目積球の数の計数とに用いられる。

本発明にかかり生成されるＭｅｇ−Ｃ３Ｆは、より多くの目積球（ＣＦＵ−Ｍｅｇ分析において、目積球コロニーの数及びあるいはコロニー　あたりの目積球細胞の数は計測できる）を生成するためには、；Ｌ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、　ＩＬ− ３、ＥＰＯｌＩＬ−１１、ＳＣＦ、　ＬＩＦ、アクティビンズ／インヒビンズ、またはＴ　ＯＰ　／　Ｔ　Ｓ　Ｆのような他のサイトカイ／のみがよいか、またはＭｅｇ−ＣＳＦとそのようなサイトカインとによる方がよいかが決定される。

最後に、その結果得られる目積球のマチ１リテイーはその大きさにより、特異的ＤＮＡ　１色により測定される特異的血小板タンパク質への着色の強さくマウスにはアセチルコリンステラーゼ；フｔン　ウィルブランドの因子＋　ｇｂ　ｌｌｂ／ｌ１ｌａ、ヒト巨核球には因子Ｖｌ１１のような）と、プローディー　（ｐｌｏｉｄｙ）と、フローサイトメトリーとが定量される。

）】えて、それら因子と、そのなかで最適な目積球コロニー生成を与えるＭｅｇ −ＣＳＦとの組み合わせとが決定される。もしくは、液体培養において最大数の目積球を与える組み合わせが決定される。

Ｗ…−ヨ誌郊≦ＪＬ２ηの６　におＩ　”に　の　１　の分子クローニング／確認とｈＭｅｇ−ＣＳＦにコーディングする最終的ｃＤＮＡｌｌＩｌとを促進するため、ＰＣＴ出願番号ＷＯ９１１０２００１出願日：　１９９１．２．２１中に示されているＤＮＡ配列に従って、３つのスト１ノツチ（ｓｔｒｅｔｃｈｅｓ）に対応するオリボデオキ／ヌクレオチド（オリゴｌ；５−５７４６−５７６９〜３゛、オリゴ２．５−５９２２−５９６５−３°１そしてオリゴ３．５°−７４４６−７４１４−３’　）がＰＣＲ増幅研究において採用された。目的は、本発明のｈＭｅｇ−ＣＳＦ遺伝子のｓＮを促進させるプローブとして用いられ、比較的低いストリンツエン／−（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）状ｇ（一つ以上のｈＭｅｇ −ＣＳＦをコードするいくつかの遺伝子が存在するなら）下での融合を経て、あるいは高いストリンツエンシー融合を経て、遺伝子に本当にｈＭｅｇ−Ｃ５Ｆタンパク質、とりわけ本発明のｂＭｅｚ−Ｃ５Ｆの両種のいずれかをエンコードすることであり、それはＰＣＴ　ＷＯ９＋１０２００１が述べているものと同様であるとは信じられていない。遺伝子フラグメントは、提供者（パーキン　エルマーセータス、　Ｉｎｃ、ノーオー　り、コネチカット）により提供されるプロトコル（こ従ってヒト胎盤遺伝子ＤＮＡライブラリから増幅される。１ｐｇのＤＮＡが図１２中に明記されたようにブラーマーベアを用いる最終反応体積１００μ ｌ中に用いられた。ＰＣＲは９４℃で１分間、４５℃で２分間、５０℃で２分間、そして７２℃で３分間、４０以上のサイクルで行なわれる。増幅された生成物は、図１２に示されるように１％アガロースゲル上で分析される。オリゴ番号１と３を用いて、アガロースゲル電気泳動は、図１２に示されるように１．６５ｋｂｐと３００ｂ１１との分子の大きさで２つの特異的生成物が増幅されたことを示した。特異性を確認するために２つの画分がアガロースゲルから溶離され、オリゴ２と３を用いるＰＣＲ増幅の２回めの循環に与えられる。同ｊｊ図に示されるように、大きいフラグメントはその特異性と分子との大きさの範囲において予想されるように増幅される。しかしながら、小さいそれ（３００ｂｐ）はプライマーとしてのオリゴ２と３では増幅可能でないが、オリゴ１と２により特異的に増幅される（図１２、レーン９）。そのことはそれゆえ（以下を）明らかにする＝（１）２つかそれ以上のＭｅｇ−ＣＳＦ遺伝子は、３００ｂｐフラグメントへ上昇させるＭｅｇ−ＣＳＦ遺伝子が少なくともオリゴ２配列の一部を奪うところの一倍体りロモソーム上で対立遺伝子あるいは異なる遺伝子を示すことができる。この場合、ＷＯ９１１０２００１はその一部を導くが一方はそうではない：（２）　１１０９１１０２００１はｈＭｅｇ−ＣＳＦのさらに別の種にエンフードするＤＮＡ配列を導く。その場合、これの例１２中に述べたように増幅された（例えば、３００ｂｐフラグメント）　ＤＮＡは、それを念むくそれは１０９１１０２０Ｇ＋により単離されたどのＤＮＡとも異なる）遺伝子の同定と単離とのプローブとして有効であり、ｔ、ａｓｂｐフラグメントは低いストリンツエンシー（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）状響下で融合された出願のｈＭｅｇ−ＣＳＦを同定するのに有効であると期待される。

第１Ａ図第１Ｂ図槙画分番号７Ｉｌ！１！１１＋　ピ　ｉシ１画分番号第７図ＭＷ第８図第９図両分ヨ＃＋６１７１８　＋９２０２１２２２３Σ２４２５２６２７２８２９　ｋＤ第１０Ａ図面分番号第１０Ｂ図第１１Ａ図第１１Ｂ図Ｍｅｑ−Ｃ５Ｆ遺伝子！オリゴ冒ｌ　オリゴｎ２３’−−−５’ １．６５ｋｂｐ　フラグメントＭｅｑ−Ｃ９Ｆ　遺伝子■ オリゴＩ１１オリゴｎａ３’−−−５’　第１２図０．３　ｋｂｐ国際調査報告フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｐ　２１１０２　Ｈ８２１４−４Ｂ（７２）発明者　パーチメント、ラルフ　イーアメリカ合衆国　オハイオ　４５４１９　ディ（７２）発明者　エリクソノーミラー、コニ−エルアメリカ合衆国　オハイオ　４５４５８　センターヴイル　ワシントン　クリーク　２０８４（７２）発明者　ダイ、ウェイアメリカ合衆国　オハイオ　４５０９６　ウェスト　チェスター　ミーティング　ストリート　エイピーティ　シャープ１０７　８２３３Ｉ（７２）発明者　ツァン、ツァオーゲン中華人民共和国　北京　１００８５０　ピーオーボックス　１３０　（３）　（番地ない（７２）発明者　リオッタ、ランス　エイアメリカ合衆国　メアリーランド　２０８５４ポートマツク　ミストウッド　ドライブ（７２）発明者　クルツシュ、ヘンリーアメリカ合衆国　メアリーランド　２０８１７ベゼズダ　デボール　ドライブ　９７０４

Claims

【特許請求の範囲】

１．以下に示す特性を有する単離精製されたヒト巨核球コロニー刺激因子、ａ）検出可能なＥＰＯおよびＧＭ−ＣＳＦ活性を有していない、ｂ）単一アミノ末端アミノ酸シーケンスの存在によって決定される均一組織であり、そしてドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル上の電気泳動の後、単一帯として泳動できる能力を有している、ｃ）生体外におけるマウスの繊維素の凝固検定において、ユニットを形成している巨核球コロニー形成をもたらす能力を持っている。
２．哺乳動物に投与されたとき、血小板生成を刺激する能力を有している請求項１記載の因子。
３．グリコシレイト型、およびシアレイト型である時、約５０，０００ダルトンから７０，０００ダルトンの間の範囲にある分子量を有する請求項２記載の因子。
４．グリコシレイト型、およびシアレイト型である時、等電フォーカシングによって測定した場合、約７．２から約７．４の幅の等電ポイントを有する請求項３記載の因子。
５．生体外でのマウスフィブリン凝血検定において、１ｍｇタンパク質当り少なくとも約４０００の巨核球コロニー形成を刺激する能力を有する請求項４記載の因子。
６．弱塩基性タンパク質からなる請求項５記載の因子。
７．以下に示す特性を有し、少なくとも約９０％のタンパク質からなる単離精製されたヒト巨核球コロニー刺激因子製剤、８）検出可能なＥＰＯおよびＧＭ−ＣＳＦ活性を有していない、ｂ）グリコシレイト型、およびシアレイト型である時、約７．２から７．４の間のｐＩを有する、ｃ）生体外におけるマウスの繊維素の凝固検定において、ユニットを形成している巨核球コロニー形成をもたらす能力を持っている。
８．グリコシレイト型、およびシアレイト型である時、以下に示される特性を有する単離精製された実質上純粋なヒトＭｅｇ−ＣＦＳタンパク質留分であって、ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定されたとき、（ｉ）約２４，０００ダルトンまたは約３５，０００ダルトン、（ｉｉ）約５０，０００ダルトンおよび約７０，００ダルトンからなるグループから選択される少なくとも一つの範囲内の分子量、ｂ）等電フォーカシングによって測定された場合、約７．２から７．４の範囲の等電ポイント、上記留分が、少なくとも約９０％のタンパク質を含み、さらに検出可能なＥＰＯおよびＧＭ−ＣＳＦ活性を有しておらず、そして生体外におけるマウスのフィブリン凝血検定でユニットを形成する巨核球コロニー形成をもたらす能力を有している。
９．ヒト巨核球コロニー刺激因子活性を有し、その遊離アミノ末端において、アミノ酸シーケンス【配列があります】を有する単離精製されたポリペプチド。
１０．必須的に前記ポリペプチドの生物学上の活性フラグメントからなる請求項９記載のポリペプチド。
１１．単離精製され、組換えされたヒト巨核球コロニー刺激因子。
１２．単離精製されたヒト巨核球コロニー刺激因子タンパク質からなり、このタンパク質が以下に示されている特性を有する、血小板形成に関連した疾病にかかった哺乳動物に投与するための薬学上の製剤ａ）検出可能なＥＰＯおよびＧＭ− ＣＳＦ活性を有していない、ｂ）単一アミノ末端アミノ酸シーケンスを有することから均一とされ、そしてドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した後、単一帯として泳動できる、ｃ）生体外におけるマウスの繊維素の凝固検定において、ユニットを形成している巨核球コロニー形成を刺激する能力、および薬学上許容可能なキャリヤーまたは希釈液を有している。
１３．単離精製されたヒト巨核球コロニー刺激因子活性からなり、その遊離アミノ末端において、アミノ酸シーケンス【配列があります】、および薬学上許容可能なキャリヤー、または希釈液を有する、血小板形成に関連した疾病にかかった哺乳動物に投与するための薬学上の製剤。
１４．以下に示すステップからなる、少なくとも９０％のタンパク質成分を有し、検出可能なＥＰＯおよびＧＭ−ＣＳＦ活性を有していないヒトＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質留分を単離する方法、ａ）再生不良性貧血患者からの尿を濃縮する、ｂ）濃縮された尿を脱塩する、ｃ）脱塩された濃縮尿の中に含まれる非イオン性不純物を、イオン交換保持体に保持させ、上記保持体からヒトＭｅｇ−ＣＳＦを含む不純なタンパク質留分を抽出することによって除去する、ｄ）不純なタンパク質留分を非変性状況下で、不純なタンパク質留分を予備ポリアクリルアミド電気泳動させ、上記ジェルからかなり純粋なＭｅｇ−ＣＳＦ留分を単離する、ｅ）上記かなり純粋なＭｅｇ−ＣＳＦ留分を、以下に示すステップからなるグループから選択されるさらなる精製ステップに移す、そのグループとは、ｉ）従来から行われているイオン交換クロマトグラフィー、ｉｉ）陽イオン交換高速液体クロマトグラフイーカラムを使用したイオンコウカンクロマトグラフィー、ｉｉｉ）ｐＨ勾配が約３．５から約１０でのジェル電気フォーカシング、およびさらに純粋なＭｅｇ−ＣＳＦ留分を再度得る、ｆ）上記さらに純粋な留分を逆相高速液体クロマトグラフィーにかけ、そして少なくとも９０％タンパク質を含有し、検出可能なＥＰＯおよびＭｅｇ−ＣＳＦ活性を有さない、実費上純粋なｈＭｅｇ−ＣＳＦ留分を再度得る。
１５．さらにステップ（ｄ）より前のステップ（ｃ）で得られた前記不純なタンパク質留分を透析する請求項１４記載の方法。
１６．さらに透析されたタンパク質留分を凍結乾燥し、凍結乾燥した留分を再懸濁した後、再びステップ（ｄ）を行う請求項１５記載の方法。
１７．前記ステップ（ｃ）におけるイオン交換保持体が、ＤＥＡＥ−セルロースカラム、およびＣＭ−セファローズカラムからなるグループから選択される請求項１４記載の方法。
１８．前記ステップ（ｅ）（ｉ）におけるイオン交換クロマトグラフィーが、ＭｏｎｏＰクロマトグラフの保持体を有する請求項１４記載の方法。
１９．前記陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーがＷＣＸポリアスパラギン酸クロマトグラフ保持体を有する請求項１４記載の方法。
２０．前記逆相高速液体クロマトグラフィーが、Ｃ１８カラムを使用して行われる請求項１４記載の方法。
２１．前記ステップ（ｆ）のｈＭｅｇ−ＣＳＦ留分が透析される請求項１４記載の方法。
２２．前記透析ステツプの生成物が凍結乾燥される請求項２１記載の方法。
２３．前記ステップ（ａ）がＹＭＩＯメンプランを使用した限外濾過からなる請求項１４記載の方法。
２４．前記脱塩ステップがＧ−２５ゲルを使用したゲル濾過からなる請求項１４記載の方法。
２５．前記予備ポリアクリルアミドゲルが５％ポリアクリルアミドゲルである請求項１４記載の方法。
２６．以下に示すステップからなる、均一ヒト巨核球刺激因子（ｈＭｅｇ−ＣＳＦ）タンパク質を単離する方法。ａ）ｈＭｅｇ−ＣＳＦを含有する尿を限外濾過によって濃縮する、ｂ）濃縮された尿をゲル濾過により脱塩する、ｃ）イオン交換クロマトグラフ保持体を利用し、そして上記支持体からヒトＭｅｇ−ＣＳＦを含有する不純なタンパク質留分を抽出することにより、脱塩された尿の中に含まれている非イオン性不純物を除去する、ｄ）変性させない状況下で、不純なタンパク質留分を予備ポリアクリルアミド電気泳動ゲルにかけ、ついでかなり純粋なＭｅｇ−ＣＳＦ留分を単離する、ｅ）さらにクロマトフォーカシングにより前記かなり純粋なｈＭｅｇ−ＣＳＦを精製する、ｆ）上記さらに精製された留分を、逆相高速液体クロマトグラフィーにかけ、単離されたｈＭｅｇ−ＣＳＦ留分を再回収する、ｇ）上記単離されたｈＭｅｇ−ＣＳＦ留分を、陽イオン高速液体クロマトグラフィーにかけ、均一ｈＭｅｇ−ＣＳＦタンパク質を再回収する。
２７．前記ステップ（ｄ）より前のステップ（ｃ）において得られる前記タンパク質留分を透所することからなる請求項２６記載の方法。
２８．前記過析されたタンパク質留分をさらに凍結乾燥することからなる請求項２７記載の方法。
２９．前記ステップ（ｃ）におけるイオン交換保持体が、ＤＥＡＥ−セルロースおよびＣＭセファロースからなるグループから選択される請求項２６記載の方法。
３０．前記ステップ（ｅ）（ｉ）におけるイオン交換クロマトグラフィーが、ＭｏｎｏＰクロマトグラフィーカラムを有する請求項２６記載の方法。
３１．前記予備ポリアクロルアミドゲルが、５％ポリアクリルアミドゲルである請求項２６記載の方法。
３２．前記クロマトフォーカシングが、ＭｏｎｏＰＨＲ５／２０カラムを使用して行われる請求項２６記載の方法。
３３．前記クロマトフォーカシングが、約ｐＨ８から約ｐＨ６のｐＨの間で、ポリパッファー勾配を使用して行われる請求項３２記載の方法。
３４．前記陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーが、ＷＣＸポリアスパラギン酸カラムを使用して行われる請求項２６記載の方法。
３５．前記ＷＣＸ高速液体クロマトグラフィーが、ｐＨ６．４２で行われる請求項３４記載の方法。
３６．単離構製されたヒト巨核球コロニー刺激因子タンパク質を治療に必要な効果的な量を哺乳動物に投与することことからなり、この因子が以下に示されている特性を有する、血小板形成に関連した疾病にかかった哺乳動物を治療するための方法、ａ）検出可能なＥＰＯおよびＧＭ−ＣＳＦ活性を有していない、ｂ）単一アミノ末端アミノ酸シーケンスの存在により均一とされ、そしてドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した後、単一バンドとして泳動する、ｃ）生体外におけるマウスの繊維素の凝固検定において、ユニットを形成している巨核球コロニー形成を刺激する能力を有している。
３７．グリコシレイト型、およびシアレイト型の時、以下の条件を有する、単離された実質上純粋なヒトＭｅｇ−ＣＳＦの治療に必要な効果的な量を哺乳動物に投与することことからなる、血小板形成に関連した疾病にかかった哺乳動物を治療するための方法、ａ）分子量が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定された場合、約２４，０００ダルトン、約３５，０００ダルトン、約５０，０００ダルトン、約７０，０００ダルトン、およびそれらの組合せからなるグループから選択される範囲内の分子量、ｂ）等電フォーカシングにより測定されたとき、約７．２から７．４の範囲内の等電ポイント、上記留分は、約９０％のタンパク質を含有し、そして検出可能なＥＰＯおよびＧＭ−ＣＳＦ活性を有さず、生体外におけるマウスの繊維素の凝固検定において、ユニットを形成している巨核球コロニー形成をもたらす能力を有している。
３８．以下に示す特性を有する単離精製されたヒト巨核球コロニー刺激因子ａ）検出可能なＥＰＯおよびＧＭ−ＣＳＦ活性を有していない、ｂ）ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル上の電気泳動の後、少なくとも２つのバンドのうち一つが泳動することによって、均一であるとされ、グリコシレイト型およびシアレイト型の時、上記バンドの一つは約５０から約７０ｋＤの分子量範囲内の因子の種に一致し、そして他のバンドは、約２４から３５ｋＤの分子量範囲内の種に一致する。ｃ）生体外におけるマウスの繊維素の凝固検定において、ユニットを形成している巨核球コロニー形成をもたらす能力を存している。
３９．前記因子が、ＥＰＯ≧０．０５μ／ｍｌ；ＧＭ−ＣＳＦ≧１２．５μ／ｍｌ；ＩＬ−３≧６μ／ｍｌ：ＯＬ−９≧５μ／ｍｌ；Ｇ−ＣＳＦおよびＭ−ＣＳＦがそれぞれ≧１０μ／ｍｌ；ＩＬ−６≧６２．５ｐｇ／ｍｌ；およびＩＬ−１アルファーが３１．３ｐｇ／ｍｌである請求項１記載の因子。
４０．ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定されたとき、（ｉ）約２４，０００ダルトンまたは約３５，０００ダルトン、および（ｉｉ）約５０，０００ダルトンおよび約７０，０００ダルトンからなるグループから選択される少なくとも一つの範囲内の分子量を有する請求項７記載の製剤。
４１．非還元状況下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて約５０から約７０ｋＤの分子量範囲から、非還元状況下で約２４から約３５ｋＤの分子量範囲へ、そのＭＥＧ −ＣＳＦ活性のパルクにおいて、シフトする特性を有する請求項１記載の因子。
４２．ＧＡＣＣＣＮＧＴＮＧＡＡＴＣＮＣＣ、ＧＡＴＣＣＮＧＴＮＧＡＡＴＣＮＣＣ、ＧＡＴＣＣＮＧＴＮＧＡＧＴＣＮＣＣ、およびＧＡＣＣＮＮＧＴＮＧＡＧＴＣＮＣＣ、ただしＮはすべて４つのヌクレオチドを示す、からなるグループから選択される式を有するオリゴヌクレオチド。
４３．ＴＣＩＣＣＴＧＴＮＣＣＮＧＡＧ、およびＴＣＩＣＮＮＧＴＮＣＣＮＧＡＡ、ただしＮはイノシンを示すＣ、Ｔ、Ａ、Ｇ、およびＩのヌクレオチドのいずれか一つを示す、からなるグループから選択される式を有するオリゴヌクレオチド。
４４．ＧＣＮＣＣＮＧＴＮＧＡＹＴＧＺＣＣ、ただしＷはＴまたはＣであり、ＹはＡまたはＧであり、ＺはＣまたはＴであり、そしてＮ歯、フクレオチドＣ、Ｔ、ＡまたはＧのいぞれか一つを示す、からなるグループから選択きれる式を有するオリゴヌクレオチド。
４５．特許請求の範囲４２，４３または４４にかかる少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを有する検査されているヒトゲノム性ＤＮＡと、上記オリゴヌクレオチドと交雑する選択されたヒトゲノム性ＤＮＡシーケンスとからなる遺伝子エンコーディングｈＭｅｇ−ＣＳＦを厩しい状況下で単離する方法。
４６．オリゴヌクレオチドシーケンスＣＡＴＧＧＡＧＴＧＣＴＧＣＣＣＴＧＡＴＴＴＣＡＡＧＡＧＡＧＴＣＴＧＣＡＣＴＧＣＧＧＧＴＡではなく、オリゴヌクレオチドシーケンスＴＣＴＣＴＣＴＣＡＣＣＡＡＧＴＧＧＣＴＴＧＴＣ；およびＴＧＡＧＡＧＴＡＴＴＡＧＣＣＣＴＧＴＣＧＴＧＡＡＣＡＧＴＡＴによって示される特性を有するゲノム性ヒトＤＮＡの単離生成された３００ｂｐ断片。