JP2008515896A - Ｉｌ−１５によるｂ細胞増殖の増強 - Google Patents

Abstract

胚中心におけるＢ細胞の成長、増殖、および／または分化の調整のための組成物および方法を開示し、ＩＬ−１５のインヒビター、アンタゴニスト、およびアゴニストの使用を含む。組成物および方法は、Ｂ細胞関連障害（Ｂ細胞系列の新生物が含まれる）の治療で使用される。ＩＬ−１５受容体複合体のβサブユニットまたはγサブユニットのいずれかによってＩＬ−１５の細胞へのシグナル伝達を防止し、それにより、胚中心におけるＢ細胞に対するＩＬ−１５の生物活性を拮抗することに、ＩＬ−１５アンタゴニストは有効である。

Description

（発明の分野）
本発明は、Ｂ細胞の成長および／または増殖のＩＬ−１５関連調整分野にある。

（発明の背景）
（関連技術の説明）
抗原活性化Ｂ細胞は、胚中心（「ＧＣ」）中で増殖および分化する。Ｂ細胞は、侵入微生物に対して最適な親和性を有する抗体の産生によって防御する（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。しかし、Ｂ細胞は、Ｂ細胞前駆体の無制御の成長および増加によって特徴づけられる無数の新生物性状態（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）にも関与する。ＧＣは、特定の微小環境を提供する。この微小環境におけるＧＣ−Ｂ細胞の活発な増殖を調節する因子がいくつかの初期のクローンおよび体細胞超変異（様々な高親和性Ｂ細胞受容体（「ＢＣＲ」）の十分なプールが得られるプロセス）の拡大に重大である。同時に、確実に免疫応答を自己抗原に指向させないために、ＧＣ内の選択過程を調節する因子も重要である（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。これらのＧＣ反応に重要であることが公知のＢＣＲによって受けられたシグナルが調査されている（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０）。しかし、ＧＣ微小環境由来の補因子は、明確に理解されていない。

ＧＣ微小環境因子の主な産生者（ｐｒｏｄｕｃｅｒ）は、濾胞樹状細胞（ＦＤＣ）であり、これは、リンパ濾胞中に存在し、これらの生物の間質細胞に属する（非特許文献９；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４）。ＦＤＣは、その表面上に抗原を長期間保持し、ＧＣ−Ｂ細胞に天然の抗原を提示することが最初に知られた（非特許文献１５；非特許文献１６）。ＦＤＣは、ＧＣ−Ｂ細胞がＩＬ−２、ＩＬ−４、およびＩＬ−１０などのサイトカインでの刺激の際にｉｎ ｖｉｔｒｏで生存および増殖するために不可欠である（非特許文献６；非特許文献１７）。直接的な細胞−細胞接触および分泌された可溶性因子の両方によるＧＣ−Ｂ細胞の生存および増殖を支持する特別な能力に注目したＦＤＣの調査にもかかわらず（非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０；非特許文献２１）、同定された因子は今まで完全にＦＤＣ効果に代わることが示されていなかった（非特許文献１３；非特許文献２０；非特許文献２２）。したがって、Ｂ細胞関連状態（Ｂ細胞由来新生物、自己免疫疾患、およびＢ細胞欠損が含まれる）の治療のためにＧＣ−Ｂ細胞の生存および増殖を調整するための新規の組成物および方法が当該分野で必要である。
ＭａｃＬｅｎｎａｎ，Ｉ．Ｃ．Ｍ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２：１１７ Ｌｉｕ，Ｙ．−Ｊ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｖ．（１９９７）１５６：１１１ Ｍａｎｓｅｒ，Ｔ．、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００４）１７２：３３６９ Ｌｉｎｄｈｏｕｔ，Ｅ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ（１９９７）１８：５７３ Ｐｕｌｅｎｄｒａｎ，Ｂ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ（１９９７）１８：２７ Ｃｈｏｅ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９６）１５７：１００６ Ｌｉｕ，Ｙ．−Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４２：９２９ Ｋｅｌｓｏｅ，Ｇ．、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９６）４：１０７ Ｈａｂｅｒｍａｎ，Ａ．Ｍ．ら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００３）３：７５７ Ｈａｎｄｅ，Ｓ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９８）８：１８９ Ｌｉ，Ｌ．ら、Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００２）１４：２５９ ｖａｎ Ｎｉｅｒｏｐ，Ｋ．ら、Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００２）１４：２５１ Ｌｉｎｄｈｏｕｔ，Ｅ．ら、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｊ（１９９５）２７：１６７ Ｔｅｗ，Ｊ．Ｇ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｖ（１９６４）１５６：３９ Ｎｏｓｓａｌ，Ｇ．Ｊ．ら、１９６４．Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．４２：３１１ Ｋｏｓｃｏ−Ｖｉｌｂｏｉｓ，Ｍ．Ｈ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９５）２０１：６９ Ｚｈａｎｇ，Ｘ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００１）１６７：４９ Ｔｅｗ，Ｊ．Ｇ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｖ．（１９９０）１１７：１８５ Ｇｒｏｕａｒｄ，Ｇ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９５）１５５：３３４５ Ｋｉｍ，Ｈ．−Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９５）１５５：１１０１ Ｋｏｓｃｏ−Ｖｉｌｂｏｉｓ，Ｍ．Ｈ．、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００３）３：７６４ ｖａｎ Ｅｉｊｋ，Ｍ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９９）１６３：２４７８

（発明の要旨）
本発明は、ＩＬ−１５アンタゴニストおよびＢ細胞関連ヒト疾患の治療のためのアンタゴニストの使用方法に関する。詳細には、このような治療は、Ｂ細胞系列の新生物細胞の増殖の阻害を含む。ＩＬ−１５受容体複合体のβサブユニットまたはγサブユニットのいずれかによってＩＬ−１５の細胞へのシグナル伝達を防止し、それにより、胚中心におけるＢ細胞に対するＩＬ−１５の生物活性を拮抗することに、ＩＬ−１５アンタゴニストは有効である。

本発明は、天然のＩＬ−１５と免疫反応してＩＬ−１５受容体複合体へのシグナル伝達を防止するモノクローナル抗体を含む。本発明は、さらに、ＩＬ−１５受容体複合体のβサブユニットまたはγサブユニットへのＩＬ−１５の結合を阻害または防止することができるヒト化抗体およびヒト抗体を含む。本発明は、なおさらに、ＩＬ−１５Ｒαを遮断するアンタゴニスト（この受容体サブユニットに対する抗体が含まれる）を含む。

本発明のアンタゴニストには、可溶性ＩＬ−１５およびＩＬ−１５がＩＬ−１５受容体複合体のβサブユニットまたはγサブユニットへの結合で役割を果たす１つまたは複数のアミノ酸残基または領域で変異誘発されている成熟（すなわち天然の）ＩＬ−１５のムテインが含まれる。このようなムテインは、ＩＬ−１５受容体複合体のβサブユニットまたはγサブユニットのいずれかによるＩＬ−１５の細胞へのシグナル伝達を防止する一方で、ＩＬ−１５Ｒαに対するＩＬ−１５の高親和性を維持する。典型的には、このようなムテインを、配列番号１および２にそれぞれ示すサルおよびヒトＩＬ−１５の重要な位置（例えば、Ａｓｐ^５６またはＧｌｎ^１５６）での付加、欠失、または置換によって作製する。Ａｓｐ^５６がＩＬ−１５受容体複合体のβサブユニットとの結合に影響を与え、Ｇｌｎ^１５６がＩＬ−１５受容体複合体のγサブユニットとの結合に影響を与えると考えられる。

ＩＬ−１５Ｒαへの結合能力が保持されるが、ＩＬ−１５受容体複合体のβサブユニットおよび／またはγサブユニットに対する親和性が実質的に減少しているか全くない修飾ＩＬ−１５分子が本発明の範囲内にさらに含まれる。修飾ＩＬ−１５分子は、通常、標的結合部位またはその付近での修飾によって結合を妨害するか防止するような様式で修飾されている限り、任意の形態を取ることができる。このような修飾ＩＬ−１５分子の例には、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５受容体結合を立体的に妨害する１つまたは複数の化学基に共有結合によって抱合した天然のＩＬ−１５またはムテインＩＬ−１５が含まれる。例えば、天然のＩＬ−１５は、部位特異的グリコシル化を含み得るか、ＩＬ−１５受容体複合体のβ鎖またはγ鎖へのＩＬ−１５の結合を妨害する一方でＩＬ−１５Ｒαに対するＩＬ−１５の高親和性を維持することができるＩＬ−１５分子上の特異的部位でポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）、デキストラン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリアミノ酸（ポリＬ−リジンまたはポリヒスチジンなど）、アルブミン、ゼラチンなどの基に共有結合することができる。基の立体障害特性の活用により、特異的受容体サブユニットへの結合を拮抗することができる。ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、アスパラギン、免疫グロブリン、およびヘモグロビンなどのタンパク質へのＰＥＧ鎖の抱合の他の利点は、当該分野で公知である。例えば、ＰＥＧによってｉｎ ｖｉｖｏでの循環半減期が延長され（Ｄｅｌｇａｄｏら、，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒ．Ｓｙｓｔ．，９：２４９（１９９２）を参照のこと）、可溶性が増加し（Ｋａｔｒｅら、，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８４：１４８７（１９８７）を参照のこと）、免疫原性が減少する（Ｋａｔｒｅ，Ｎ．Ｖ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４４：２０９（１９９０）を参照のこと）。

本発明はまた、Ｂ細胞上でのＩＬ−１５活性の減少が望ましい疾患または状態の治療方法でのアンタゴニストの使用に関する。このような疾患には、白血病およびＢ細胞リンパ腫が含まれる。

したがって、本発明の目的は、抗ＩＬ−１５抗体を使用したＢ細胞悪性疾患の治療方法を提供することである。

本発明のさらなる目的は、抗ＩＬ−１５抗体の投与に治療タンパク質（免疫抱合体または抗体融合タンパク質など）の投与または化学療法薬の投薬計画が捕捉されたＢ細胞悪性疾患の多様な治療方法を提供することである。

これらおよび他の目的は、本発明の１つの実施形態にしたがって、Ｂ細胞悪性疾患を罹患した被験体に抗ＩＬ−１５抗体および薬学的に許容可能なキャリアを投与する工程を含むＢ細胞悪性疾患の治療法を提供することによって達成される。

（発明の詳細な説明）
序論
本発明によれば、ＩＬ−１５は、濾胞樹状細胞（ＦＤＣ）によって産生され、ＦＤＣ／ＨＫ細胞の表面上に存在し、ＩＬ−１５Ｒαによって補足され、ＧＣ−Ｂ細胞に移動する（ｔｒａｎｓｐｒｅｓｅｎｔ）。ｉｎ ｖｉｖｏ ＧＣ反応を模倣するｉｎ ｖｉｔｒｏ実験モデルを使用して、ＧＣ−Ｂ細胞およびＦＤＣに対するＩＬ−１５の機能を研究した。ＧＣ−Ｂ細胞は、ＩＬ−１５Ｒαを発現しないが、シグナル伝達複合体ＩＬ−２／１５ＲβおよびＲγを発現する。ＦＤＣ／ＨＫ細胞膜上に存在するＩＬ−１５は生物学的に活性であり、ＣＤ４０Ｌ刺激後にＧＣ−Ｂ細胞の増殖を同時刺激する。この機構の同定により、本発明は、ＧＣ−Ｂ細胞の正常および異常な増殖を調整する新規の手段を提供する。

ＧＣ−Ｂ細胞のＩＬ−１５刺激
ＩＬ−１５を介したＧＣ−Ｂ細胞の刺激機構の発見は、ＧＣ起源のＢ細胞腫瘍が特にＩＬ−１５媒介性Ｂ細胞刺激のインヒビターを使用した治療の影響を受けることを示す。このようなインヒビターを、本明細書中でより完全に考察する。このような腫瘍の例には、前駆Ｂ細胞急性リンパ性白血病（「ＡＬＬ」）およびリンパ腫が含まれる。

いくつかの病状におけるＢ細胞の役割を解明することがこれまで困難であったので、本明細書中に示すデータは重要である。例えば、遺伝子操作されたマウスにおいて、ＩＬ−１５が消失しているか発現が強制されたマウスは野生型マウスと比較してＢ細胞応答の明らかな相違が示されないので、Ｂ細胞におけるＩＬ−１５の機能についての以前の研究は妨げられている（Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｍ．Ｋ．ら、２０００．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９１：７７１；Ｌｏｄｏｌｃｅ，Ｊ．Ｐ．ら、１９９８．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ９：６６９；Ｍａｒｋｓ−Ｋｏｎｃｚａｌｉｋ，Ｊ．ら、２０００．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９７：１１４４５）。ＩＬ−１５は、ヒト末梢Ｂ細胞の増殖およびＩｇ分泌を増強し（Ａｒｍｉｔａｇｅ，Ｒ．Ｊ．ら、１９９５．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５４：４８３．；Ｂｅｒｎａｓｃｏｎｉ，Ｎ．Ｌ．ら、２００２．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９８：２１９９．；Ｌｉｔｉｎｓｋｉｙ，Ｍ．Ｂ．ら、２００２．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３：８２２．）、抗ＩｇＭによって誘導されるアポトーシスを阻害し（Ｂｕｌｆｏｎｅ−Ｐａｕｓ，Ｓ．ら、１９９７．Ｎａｔ Ｍｅｄ ３：１１２４．）、悪性Ｂ細胞の増殖を誘導する（Ｔｉｎｈｏｆｅｒ，Ｉ．ら、２０００．Ｂｌｏｏｄ ９５：６１０．；Ｔｒｅｎｔｉｎ，Ｌ．ら、１９９７．Ｌｅｕｋ Ｌｙｍｐｈｏｍａ ２７：３５）。しかし、ＧＣ反応におけるＩＬ−１５の生物学的機能は証明されていない。ＩＬ−１５の役割を解明し、それにより、ＩＬ−１５のこの効果を調整するための組成物および方法を開発するために、いくつかの研究を本明細書中に記載する。これらの研究により、濾胞樹状細胞がＩＬ−１５を産生し、ＩＬ−１５が濾胞樹状細胞の表面上に存在することが初めて明らかになっている。この細胞表面存在形態では、ＩＬ−１５は、細胞接触によってＢリンパ球増殖を増強する。対照的に、ＩＬ−１５の可溶性形態は、標的Ｂリンパ球に対して検出可能な効果がない。下記および実施例に詳述の一連の実験によってこれらが発見された。

第１に、ＧＣ内のＩＬ−１５の細胞供給源を試験した。ＩＬ−１５ｍＲＮＡおよび少量の可溶性ＩＬ−１５がｉｎ ｖｉｔｒｏ培養ＦＤＣによって産生されることが報告されているにもかかわらず（Ｈｕｓｓｏｎ，Ｈ．ら、２０００．Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０３：１３４．）、タンパク質レベルでのＦＤＣによるＩＬ−１５の産生は以前に証明されていなかった。ＩＬ−１５ｍＲＮＡはほぼ遍在的に発現され、タンパク質の産生および分泌は、主に、複雑且つ非効率的な翻訳後機構によって調節される（Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｔ．Ａ．ら、１９９９．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １７：１９．；Ｆｅｈｎｉｇｅｒ，Ｔ．Ａ．ら、２００１．Ｂｌｏｏｄ ９７：１４．３３，３４）。本明細書中に開示のデータにより、新たに単離したＦＤＣクラスターの免疫蛍光（「ＩＦ」）染色によって示されるように、ＦＤＣがＩＬ−１５を産生することが明らかである。このｉｎ ｖｉｖｏ所見は、ＦＤＣ細胞株（ＦＤＣ／ＨＫ細胞）がＩＬ−１５を産生することを示す本明細書中のデータによって確認された。ＩＬ−１５タンパク質は、ＦＤＣ／ＨＫ細胞の表面上で検出された。膜結合ＩＬ−１５の特異性を、競合ＦＡＣＳ分析およびＣＴＬＬ−２バイオアッセイの遮断実験によって確認した。しかし、ＩＬ−１５は、ＥＬＩＳＡによってＦＤＣ／ＨＫ培養上清中で検出されず、これを、ＣＴＬＬ−２アッセイを使用してさらに確認した。

表面ＩＬ−１５発現が行われる機構に拘束されないが、酸処理後のＩＬ−１５染色の完全な喪失および外因性ＩＬ−１５とのインキュベーション後の結合の増強により、ＩＬ−１５の別の膜形態よりもむしろ受容体繋留機構が強く示唆される。膜貫通形態の変性に起因する酸処理後にＩＬ−１５を検出できない可能性を完全に除外することができないにもかかわらず、ＦＤＣ／ＨＫ細胞中でのＩＬ−１５Ｒαの特異的ｍＲＮＡの発現もこの機構を支持する。

ＧＣにおけるＩＬ−１５シグナル伝達の生物学的関連性を、ＩＬ−１５の除去または添加によるＧＣ−Ｂ細胞増殖に対するＩＬ−１５の効果の測定によって本明細書中に証明する。図５に示すように、ＧＣ−Ｂ細胞成長は、抗ＩＬ−１５遮断ｍＡｂの存在下で有意に減少し、ＩＬ−１５を添加した場合に増強された。飽和用量のＩＬ−１５（１００ｎｇ／ｍｌ）を含む培養物中のＧＣ−Ｂ細胞の回収率は、内因性ＩＬ−１５活性が遮断ｍＡｂによって枯渇した培養物の回収率の４倍であった。

ＩＬ−１５は、ｉｎ ｖｉｖｏでＧＣ中のＦＤＣ上に存在し、ＦＤＣ／ＨＫ細胞由来の内因性ＩＬ−１５は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、Ａｂの遮断によって内因性ＩＬ−１５が除去された場合に（図５Ａの左の最初のバーの４．２×１０^５対図５Ｂの右端のバーの２．９×１０^５）外因性ＩＬ−２のみに匹敵するかそれより高いレベルでＧＣ−Ｂ細胞増殖を支持した。さらに、ＧＣ−Ｂ細胞は、ＩＬ−１５の存在下で増殖し、ＩＬ−１５を使用せずに培養した細胞よりも迅速に分裂した。まとめると、これらの結果は、ＩＬ−１５シグナル伝達が、ｉｎ ｖｉｖｏでのＧＣの迅速な中心芽球の増殖を担う機構の１つであり得ることを示す。

ＦＤＣによるＩＬ−１５提示がリンパ腫発生の開始における重要な誘因であり得るので、ＧＣ−Ｂ細胞増殖におけるＩＬ−１５活性のターゲティングによって免疫調整を行うことができる。この機構はまた、胚中心中でのＩＬ−１５シグナル伝達阻害によってＢ細胞リンパ腫の適切な治療法が得られることを示す。

Ｂ細胞のＩＬ−１５刺激の調整による治療の影響を受けやすい状態
胚中心で刺激されたＢ細胞は、種々の発達経路を取ることができ、そのような経路の中には正常な経路と病的な経路がある。本発明の方法による調整のために選択された経路および関連する病状により、ＩＬ−１５のアンタゴニスト、刺激因子、またはアゴニストを使用すべきかどうかが決定される。本明細書中に記載の方法による調整に適切な状態および障害を以下に列挙し、その後に詳細に考察する：Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞起源の白血病、抗体免疫不全障害、複合型抗体媒介性（Ｂ細胞）および細胞媒介性（Ｔ細胞）免疫不全障害、および自己免疫疾患。

これらの障害に加えて、本発明はまた、胚中心におけるＩＬ−１５を介したＢ細胞刺激の調整が役割を果たす任意の他の障害の治療を提供する。

Ｂ細胞リンパ腫
ＧＣ−Ｂ細胞のＩＬ−１５媒介性増殖による治療に適切なリンパ腫には、非ホジキンリンパ腫（非産生性免疫グロブリン遺伝子が再編成された胚中心Ｂ細胞由来）；Ｂ細胞リンパ腫（米国で最も一般的な非ホジキンリンパ腫）；ホジキンリンパ腫；小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ／ＣＬＬ）；マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）；濾胞性リンパ腫；辺縁細胞リンパ腫（結節外またはＭＡＬＴリンパ腫が含まれる）；節性リンパ腫または単球様Ｂ細胞リンパ腫；脾リンパ腫；びまん性大細胞リンパ腫；バーキットリンパ腫；高悪性度バーキット様リンパ腫；およびリンパ芽球性リンパ腫が含まれる。少なくとも６つの形態学的変異形（ｖａｒｉａｎｔ）（中心芽球型、免疫芽細胞型、Ｉ細胞組織球が豊富な型、肉芽腫性リンパ腫症型、未分化型、および血漿芽球性型）のうちの１つならびに少なくとも３つのサブタイプ（縦隔（すなわち胸腺）リンパ腫；原発性滲出性リンパ腫；および血管内リンパ腫（以前に悪性血管内皮リンパ腫と呼ばれていた））のうちの１つとして存在し得るびまん性大細胞リンパ腫も含まれる。

ホジキンリンパ腫（ホジキン病）自体が、ＷＨＯ分類体系下で以下のいくつかのカテゴリーに分類される：結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫；古典的ホジキンリンパ腫（結節性硬化型ホジキンリンパ腫；リンパ球豊富型ホジキンリンパ腫が含まれる）；混合細胞型ホジキンリンパ腫；およびリンパ球減少型ホジキンリンパ腫。

Ｂ細胞増殖障害。本明細書中に記載の治療に適切なＢ細胞増殖障害には、移植後リンパ球増殖症（ＰＴＬＤ）が含まれる。この障害の初期病変には、形質細胞性過形成、異型リンパ組織過形成、および伝染性単核球症様ＰＴＬＤが含まれる。他のカテゴリーには、多形ＰＴＬＤおよび単形ＰＴＬＤが含まれる。これらの状態がしばしば自発的または移植後免疫抑制の減少にともなって後退するにもかかわらず、これらは致命的であり得る。

抗体（Ｂ細胞）免疫不全障害。Ｂ細胞の分化および増殖の欠損に関連する抗体障害は、ＩＬ−１５誘導性ＧＣ−Ｂ細胞増殖の増強による治療の影響を受けやすい。これらの障害には、以下が含まれる：Ｘ連鎖低ガンマグロブリン血症（先天性低ガンマグロブリン血症）；乳児期一過性低ガンマグロブリン血症；分類不能型免疫不全（ｃｏｍｍｏｎ，ｖａｒｉａｂｌｅ，ｕｎｃｌａｓｓｉｆｉａｂｌｅ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）（後天性低ガンマグロブリン血症）；高ＩｇＭ免疫不全；低ガンマグロブリン血症を伴う好中球減少；多糖類抗原無応答性；選択的ＩｇＡ欠損症；選択的ＩｇＭ欠損症；ＩｇＧサブクラスの選択的欠乏；薬物、タンパク質漏出性状態に関連する二次的Ｂ細胞免疫不全；およびＸ連鎖リンパ球増殖症。

複合型抗体媒介性（Ｂ細胞）および細胞媒介性（Ｔ細胞）免疫不全障害。Ｂ細胞免疫不全障害のためのこれらの疾患のＢ細胞成分の増強を上記考察のように行うことができる。このような疾患には、以下が含まれる：重症複合免疫不全症（常染色体劣性Ｘ連鎖散発性）；免疫グロブリン産生異常を伴う細胞性免疫不全（ネゼロフ症候群）；毛細管拡張性失調症を伴う免疫不全；湿疹および血小板減少症を伴う免疫不全（ウィスコット・オールドリッチ症候群）；胸腺腫を伴う免疫不全；短肢小人症を伴う免疫不全；アデノシンデアミナーゼ欠乏症を伴う免疫不全；ヌクレオシドホスホリラーゼ欠乏症を伴う免疫不全；ビオチン依存性マルチプルカルボキシラーゼ欠損症；移植片対宿主（ＧＶＨ）病；および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）。

自己免疫疾患。Ｂ細胞は、免疫グロブリンを産生し、抗体媒介自己免疫で重要な役割を果たす。出生時からの抗μ抗体の投与によって産生されたＢ細胞欠損マウスは、いくつかの自己免疫疾患（実験的自己免疫性脳髄膜炎および自然発症インスリン依存型糖尿病が含まれる）に耐性を示した。（Ｌｏｏｎｅｙ，Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．６１：８６３。）遺伝的にＢ細胞が欠損したマウスも、自己免疫疾患を発症する傾向が比較的低い場合がある。例えば、Ｃｈａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：５１−５９（１９９８）に記載のように、Ｂ細胞欠損マウスでは、自己抗体が存在せず、リンパ器官中のＴ細胞の増加が防止された。抗ＣＤ−２０抗体を使用したＢ細胞の枯渇は、自己免疫性血球減少症などの自己免疫疾患の治療で治療効果を示し得る。潜在的病原性抗体の減少に加えて、Ｂ細胞の減少により、Ｔ細胞活性を調整し、自己抗原に対する免疫応答をさらに減少させることができる（Ｇｏｒｏｚｎｙら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ．Ｔｈｅｒ．５：１３１−１３５，２００３）。

自己免疫疾患の誘導および進行におけるＢ細胞の重要な役割の実質的証拠が存在する。したがって、本発明の方法は、Ｂ細胞発生の阻害およびそれによる患者における病原性自己抗原レベルの減少または防止による自己免疫疾患の治療で使用される。このような治療に影響を受けやすい自己免疫疾患には、多発性硬化症、重症筋無力症、自己免疫性神経障害（ギラン・バレーが含まれる）、および自己免疫性ぶどう膜炎などの神経系疾患が含まれる。胃腸管疾患には、クローン病、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、および自己免疫性肝炎が含まれる。血液関連疾患には、自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血、および自己免疫性血小板減少症が含まれ、血管に影響を与える疾患には、側頭動脈炎、抗リン脂質抗体症候群、血管炎（ウェゲナー肉芽腫症およびベーチェット病が含まれる）が含まれる。内分泌腺疾患には、Ｉ型または免疫介在性糖尿病、グレーブス病、橋本甲状腺炎、自己免疫性卵巣炎および精巣炎、ならびに副腎の自己免疫疾患が含まれる。皮膚疾患には、乾癬、疱疹状皮膚炎、尋常性天疱瘡、および白斑が含まれる。最後に、多臓器に影響を与える疾患（結合組織疾患とも呼ばれる）には、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、強皮症、多発性筋炎および皮膚筋炎、脊椎関節症（強直性脊椎炎が含まれる）、ならびにシェーグレン症候群が含まれる。

Ｂ細胞白血病。急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）もＢ細胞のＩＬ−１５刺激の阻害を使用した治療の影響を受けやすい。ＡＬＬは、成熟が停止したリンパ様前駆細胞のクローン増殖に起因する悪性細胞障害である。ＡＬＬは、Ｂ細胞白血病、Ｔ細胞白血病、および混合細胞型白血病を発症するＢ系列またはＴ系列の細胞に由来し得る。Ｂ細胞白血病および混合細胞型白血病は、本明細書中の方法を使用した治療に適切である。成人では、ＡＬＬは、白血病の約２０％（Ｂｒｉｎｃｋｅｒ，Ｈ．，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｍａｅｍａｔｏｌ．２９：２４１−２４９，１９８２）、全がんの約１〜２％（Ｂｏｒｉｎｇ，ＣＣ．ら、，Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．Ｃｌｉｎ．４４：７−１６，１９９４）を構成する。Ｂ細胞関連ＡＬＬ分類には、初期プレＢ細胞ＡＬＬ；プレＢ細胞ＡＬＬ；一過性プレＢ細胞ＡＬＬ；および成熟Ｂ細胞ＡＬＬが含まれる。成熟Ｂ細胞ＡＬＬは、バーキットリンパ腫の白血病段階（ｐｈａｓｅ）を示す（Ｍａｇｒａｔｈ，Ｉ．Ｔ．ら、，Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｒｅｓ．４：３３−５９，１９７９）。

ＩＬ−１５アンタゴニスト。胚中心においてＩＬ−１５効果を調整することができる本発明のＩＬ−１５アンタゴニストには、（ａ）胚中心Ｂ細胞のＩＬ−１５βおよび／またはγ受容体サブユニットへのＩＬ−１５−Ｒα結合ＩＬ−１５の結合を遮断すると予想される可溶性ＩＬ−１５、（ｂ）ＩＬ−１５受容体のαサブユニットに結合してＩＬ−１５受容体複合体のβおよび／またはγサブユニットを介したシグナルを伝達できなくする成熟（すなわち、天然の）ＩＬ−１５のムテイン、（ｃ）ＩＬ−１５がＩＬ−１５受容体複合体のβおよび／またはγサブユニットを介してシグナル伝達するのを妨げるＩＬ−１５に対するモノクローナル抗体、および（ｄ）ＩＬ−１５がＩＬ−１５受容体複合体のβまたはγサブユニットのいずれかによってシグナル伝達する能力を妨害するが、ＩＬ−１５ＲαへのＩＬ−１５結合を妨害しない化学基と共有結合するＩＬ−１５分子が含まれる。上記のムテインをコードするポリヌクレオチドも本発明の範囲内に含まれる。

「ＩＬ−１５ムテイン」または「ＩＬ−１５のムテイン」は、ＩＬ−１５のアンタゴニストを産生するように本発明にしたがって変異されている配列番号１のアミノ酸４９〜１６２の配列を有する成熟（すなわち、天然）サルＩＬ−１５分子または配列番号２のアミノ酸４９〜１６２の配列を有するヒトＩＬ−１５分子をいう。このようなＩＬ−１５ムテインは、ＩＬ−１５Ｒαサブユニットに結合することができ、ＩＬ−１５受容体複合体のβまたはγサブユニットを介したシグナルを伝達することができない。

Ｇｒａｂｓｔｅｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６４：９６５（１９９４）（本明細書中で参考として援用される）に記載の手順に従うか、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの従来の手順によってヒトまたはサルＩＬ−１５を得ることができる。アンタゴニストを産生することができる多数の可能なＩＬ−１５の変異が存在する。βまたはγサブユニットシグナル伝達を担うと考えられる特定のアミノ酸部位でこのような変異を行うことができるか、βまたはγサブユニットのシグナル伝達に必要と見なされるＩＬ−１５の全領域にわたって変異させることができる。典型的には、アミノ酸残基の付加、置換、または欠失として変異させることができる。好ましくは、置換および欠失ムテインが好ましく、置換ムテインが最も好ましい。

Ａｓｐ^５６はＩＬ−１５受容体複合体のβサブユニットとの結合に影響を与え、Ｇｌｎ^１５６はＩＬ−１５受容体複合体のγサブユニットとの結合に影響を与えると考えられる。Ａｓｐ^５６およびＧｌｎ^１５６部位付近またはこれらの部位での他の天然に存在するアミノ酸残基の付加または置換は、ＩＬ−１５受容体複合体のβまたはγサブユニットのいずれかまたは両方へのＩＬ−１５の結合に影響を与え得る。例えば、負電荷のアスパラギン酸残基の除去および別の負電荷の残基との置換は、アスパラギン酸を正電荷のアミノ酸（アルギニンなど）または非荷電残基（セリンまたはシステインなど）と置換した場合ほど受容体結合の遮断で有効でないかもしれない。

ＩＬ−１５ムテインの組換え産生には、ＩＬ−１５ムテインをコードするＤＮＡクローン（すなわち、ｃＤＮＡ）の単離が最初に必要である。ｃＤＮＡクローンは、哺乳動物ＩＬ−１５ポリペプチドを発現する初代細胞または細胞株に由来する。最初に総細胞ｍＲＮＡを単離し、その後にｃＤＮＡライブラリーを逆転写によってｍＲＮＡから作製する。上記の異種間ハイブリッド形成のプローブまたはＰＣＲプライマーをデザインするために本明細書中に提供したＤＮＡ配列情報を使用してｃＤＮＡクローンを単離し、同定することができる。このようなｃＤＮＡクローンは、配列番号１および配列番号２の配列を有する。ＩＬ−１５ムテインの組換え産生は、米国特許第６，１７７，０７９号（参考として援用される）に記載されている。

アミノ酸の残基もしくは配列の種々の付加もしくは置換または活性に不要な末端もしくは内部の残基もしくは配列の欠失をコードする透過なＤＮＡ構築物は、本発明の方法に有用である。例えば、ＩＬ−１５のＮ−グリコシル化部位を、グリコシル化を排除し、哺乳動物および酵母の発現系で炭水化物アナログの発現を減少させるように修飾することができる。真核生物ポリペプチド中のＮ−グリコシル化部位は、アミノ酸トリプレットＡｓｎ−Ｘ−Ｙ（式中、ＸはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸であり、ＹはＳｅｒまたはＴｈｒである）によって特徴づけられる。サルＩＬ−１５タンパク質は、配列番号１のアミノ酸１２７〜１２９および１６０〜１６２に２つのこのようなトリプレットを含む。ヒトＩＬ−１５タンパク質は、配列番号２のアミノ酸１１９〜１２１、１２７〜１２９、および１６０〜１６２に３つのこのようなトリプレットを含む。これらのトリプレットをコードするヌクレオチド配列の適切な置換、付加、または置換により、Ａｓｎ側鎖での炭水化物残基の結合が防止される。Ａｓｎが異なるアミノ酸と置換されるように選択された１つのヌクレオチドの変化は、例えば、Ｎ−グリコシル化部位の不活化に十分である。タンパク質中のＮ−グリコシル化部位の不活化に公知の手順には、米国特許第５，０７１，９７２号および欧州特許第２７６，８４６号（本明細書中で参考として援用される）に記載の手順が含まれる。

組換え発現ベクターには、ＩＬ−１５ムテインをコードする合成またはｃＤＮＡ由来のＤＮＡフラグメントが含まれる。ＩＬ−１５ムテインをコードするＤＮＡは、適切な転写もしくは翻訳調節配列または構造ヌクレオチド配列（哺乳動物、細菌、ウイルス、または昆虫の遺伝子由来の配列など）に作動可能に連結される。調節配列の例には、例えば、遺伝子発現の調節の役割を果たす遺伝子配列（例えば、転写プロモーターまたはエンハンサー）、転写を調節するための任意選択的なオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボゾーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の開始および終結を調節する適切な配列が含まれる。ヌクレオチド配列は、調節配列が構造遺伝子と機能的に関連する場合に作動可能に連結される。例えば、シグナルペプチドが前駆アミノ酸配列の一部として発現し、ＩＬ−１５ムテイン分泌に関与する場合、シグナルペプチドのＤＮＡ配列（分泌リーダー）は、ＩＬ−１５ムテインの構造遺伝子ＤＮＡ配列に作動可能に連結することができる。さらに、プロモーターヌクレオチド配列が構造遺伝子のヌクレオチド配列の転写を調節する場合、プロモーターヌクレオチド配列は、コード配列（例えば、構造遺伝子ＤＮＡ）に作動可能に連結する。なおさらに、リボゾーム結合部位が翻訳を促進するようにベクター内に存在する場合、リボゾーム結合部位は、構造遺伝子のヌクレオチドコード配列（例えば、ＩＬ−１５ムテイン）に作動可能に連結することができる。

ＩＬ−１５ムテインの発現に適切な宿主細胞には、適切なプロモーターの調節下での原核生物、酵母、または高等真核細胞が含まれる。原核生物には、グラム陰性生物またはグラム陽性生物（例えば、大腸菌またはバチルス）が含まれる。形質転換に適切な原核生物宿主細胞には、例えば、大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌、およびシュードモナス属、ストレプトマイセス属、およびスタフィロコッカス属の範囲内の種々の他の種が含まれる。適切な宿主細胞の例には、出芽酵母などの酵母、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞、または昆虫細胞も含まれる。無細胞翻訳系を使用し、本明細書中に開示のＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを使用して、ＩＬ−１５ムテインを産生することもできる。細菌、昆虫、酵母、および哺乳動物細胞宿主と共に使用される適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓ ら、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８５に記載されている。

ＩＬ−１５ムテインを酵母宿主細胞中で発現する場合、ＩＬ−１５ムテインをコードするヌクレオチド配列（例えば、構造遺伝子）は、リーダー配列を含み得る。リーダー配列は、酵母宿主細胞によって翻訳されたポリペプチドの細胞外分泌を改良することができる。

ＩＬ−１５ムテインを調製および精製する方法は、米国特許第６，１７７，０７９号（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。好ましくは、ＩＬ−１５（配列番号１に示すアミノ酸残基４９〜１６２の配列を有するサルＩＬ−１５または配列番号２に示すアミノ酸残基４９〜１６２の配列を有するヒトＩＬ−１５）のアミノ酸残基Ａｓｐ^５６またはＧｌｎ^１５６の少なくとも１つが欠失されているか異なる天然に存在するアミノ酸残基と置換されているＩＬ−１５のムテインを使用する。置換および／または欠失を任意に組み合わせることができる。例えば、Ａｓｐ^５６を欠失させる一方で、Ａｓｐ^５６を任意の他のアミノ酸に置換するか、Ａｓｐ^５６およびＧｌｎ^１５６の両方をそれぞれ同一または異なるアミノ酸部分と置換することができる。さらに、Ａｓｐ^５６を任意のアミノ酸と置換する一方で、Ｇｌｎ^１５６を欠失させることができる。一般に、置換ムテインが好ましく、ＩＬ−１５分子の天然の折り畳みに重大な影響を与えない置換ムテインがより好ましい。置換ムテインには、好ましくは、Ａｓｐ^５６がセリンまたはシステインに置換されているか、Ｇｌｎ^１５６がセリンまたはシステインに置換されているか、Ａｓｐ^５６およびＧｌｎ^１５６の両方がそれぞれセリンまたはシステインに置換されている置換ムテインが含まれる。欠失ムテインの例には、成熟ＩＬ−１５のＡｓｐ^５６およびＧｌｎ^１５６の両方が欠失しているか、Ａｓｐ^５６のみが欠失しているか、Ｇｌｎ^１５６のみが欠失している欠失ムテインが含まれる。Ａｓｐ^５６およびＧｌｎ^１５６のいずれかの領域中の他のアミノ酸残基を置換または欠失させ、ＩＬ−１５受容体複合体のβまたはγサブユニットのいずれかまたは両方を介したシグナル伝達の防止効果をさらに有し得ることが可能である。したがって、本発明は、さらに、Ａｓｐ^５６およびＧｌｎ^１５６の領域内のアミノ酸残基が置換または欠失しており、且つＩＬ−１５アンタゴニスト活性を有するムテインを使用する。このようなムテインを、本明細書中に記載の方法を使用して作製することができ、従来の方法を使用してＩＬ−１５アンタゴニスト活性をアッセイすることができる。本発明で使用されるＩＬ−１５ムテインを作製するために使用することができる方法のさらなる説明は、米国特許第６，１７７，０７９号に記載されている。

本明細書中で使用される成熟ＩＬ−１５ポリペプチド（配列番号１のアミノ酸４９〜１６２の配列を含む成熟サルＩＬ−１５および配列番号２のアミノ酸残基４９〜１６２の配列を有する成熟ヒトＩＬ−１５分子）およびＩＬ−１５ムテインを、他の化学部分との共有結合性抱合体または凝集抱合体の形成によって修飾することができる。このような部分には、ＩＬ−１５受容体複合体のβ鎖またはγ鎖へのＩＬ−１５の結合を妨害する一方で、ＩＬ−１５Ｒαに対するＩＬ−１５の高親和性を維持することができるＩＬ−１５分子上の特定の部位にＰＥＧ、ｍＰＥＧ、デキストラン、ＰＶＰ、ＰＶＡ、ポリアミノ酸（ポリ−Ｌ−リジンまたはポリヒスチジンなど）、アルブミン、およびゼラチンが含まれる。さらに、ＩＬ−１５を、ＩＬ−１５受容体複合体のβ鎖またはγ鎖へのＩＬ−１５の結合を妨害する一方で、ＩＬ−１５Ｒαに対するＩＬ−１５の高親和性を維持することができる部位で特異的にグリコシル化することができる。抱合に好ましい基は、ＰＥＧ、デキストラン、およびＰＶＰである。ＰＥＧが本発明での使用に最も好ましく、ＰＥＧの分子量は、好ましくは、約１，０００〜約２０，０００である。ＩＬ−１５の抱合での使用には分子量約５０００が好ましいが、他の分子量のＰＥＧ分子も適切であろう。種々のＰＥＧ形態が本発明での使用に適切である。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏで水素結合に感受性を示すエステル結合が得られるコハク酸スクシンイミジルＰＥＧ（ＳＳ−ＰＥＧ）、ｉｎ ｖｉｖｏでウレタン結合が得られ、加水分解に対して安定な炭酸スクシンイミジルＰＥＧ（ＳＣ−ＰＥＧ）、ｉｎ ｖｉｖｏで安定なエーテル結合が得られるプロピオン酸スクシンイミジルＰＥＧ（ＳＰＡ−ＰＥＧ）、ビニルスルホンＰＥＧ（ＶＳ−ＰＥＧ）、およびマレイミドＰＥＧ（Ｍａｌ−ＰＥＧ）の形態（全てＳｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａ）から市販されている）を使用することができる。一般に、ＳＳ−ＰＥＧ、ＳＣ−ＰＥＧ、およびＳＰＡ−ＰＥＧは、ポリペプチド中のリジン残基と特異的に反応するのに対して、ＶＳ−ＰＥＧおよびＭａｌ−ＰＥＧはそれぞれ遊離システイン残基と反応する。しかし、Ｍａｌ−ＰＥＧは、アルカリｐＨでリジン残基と反応する傾向がある。好ましくは、ＳＣ−ＰＥＧおよびＶＳ−ＰＥＧが好ましく、ＳＣ−ＰＥＧは、そのｉｎ ｖｉｖｏ安定性およびリジン残基との特異性のために最も好ましい。

ＰＥＧの巨大な分子サイズを活用するために、戦略上重要な部位内でＰＥＧ部分をＩＬ−１５に結合させることができる。米国特許第６，１７７，０７９号に記載のように、タンパク質中に天然に存在するリジン残基またはシステイン残基の使用または部位特異的ＰＥＧ化によってＰＥＧ部分をＩＬ−１５に結合させることができる。１つの部位特異的ＰＥＧ化法は、システイン残基またはリジン残基を特定のアミノ酸位置でＩＬ−１５に移入するタンパク質操作法による。ＩＬ−１５に抱合したＰＥＧ鎖の巨大な分子サイズは、ＩＬ−１５受容体複合体のβおよび／またはγサブユニットに結合するがαサブユニットに結合しないＩＬ−１５領域を遮断すると考えられる。ＰＥＧをＩＬ−１５を含む塩基性溶液に添加する添加反応によって抱合することができる。典型的には、（１）約ｐＨ９．０およびＳＣ−ＰＥＧのリジン残基に対する分子比が約１：１〜１００：１またはそれ以上、または（２）約ｐＨ７．０およびＶＳ−ＰＥＧのシステイン残基に対する分子比が約１：１〜１００：１またはそれ以上のいずれかでＰＥＧ化する。

あるいは、本発明のアンタゴニストは、ＩＬ−１５受容体複合体の任意のβまたはγサブユニットへのＩＬ−１５の結合を妨害するＩＬ−１５に対するモノクローナル抗体の形態を取ることができる。本発明の１つの態様内で、ＩＬ−１５（その誘導体が含まれる）およびＩＬ−１５などのこれらのタンパク質の一部またはフラグメントを使用して、ＩＬ−１５に特異的に結合する抗体を調製することができる。本発明の文脈内で、用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、そのフラグメント（Ｆ（ａｂ’）２およびＦａｂフラグメントなど）、および組換えによって産生された結合パートナーが含まれると理解すべきである。当業者は、モノクローナル抗体または結合パートナーの親和性を容易に決定することができる（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，５１：６６０−６７２（１９４９））を参照のこと）。このようなモノクローナル抗体の特定の例には、Ｍ１１０、Ｍ１１１、およびＭ１１２と指定されたクローンによって産生される抗体（ＩｇＧ１モノクローナル抗体である）が含まれる。ハイブリドーマ産生モノクローナル抗体であるＭ１１０、Ｍ１１１、およびＭ１１２を、１９９６年３月１３日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．，ＵＳＡ（ＡＴＣＣ）に寄託し、アクセッション番号ＨＢ−１２０６１、ＨＢ−１２０６２、およびＨＢ−１２０６３をそれぞれ割り当てられた。ブダペスト条約の条項に従って全ての寄託を行った。

一般に、ＩＬ−１５に対するモノクローナル抗体を、以下の手順を使用して米国特許第６，１７７，０７９号に記載のように生成することができる。簡潔に述べれば、精製ＩＬ−１５、そのフラグメント、合成ペプチド、またはＩＬ−１５を発現する細胞を使用し、それ自体が公知の技術（例えば、米国特許第４，４１１，９９３号に記載の技術）を使用して、ＩＬ−１５に対するモノクローナル抗体を生成することができる。マウスを、フロイント完全アジュバントまたはＲＩＢＩアジュバント（ＲＩＢＩ Ｃｏｒｐ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔ．）に乳化した免疫原としてＩＬ−１５で免疫化し、１０〜１００μｇの範囲の量で皮下または腹腔内に注射する。１０〜１２日後、免疫化動物を、フロイント不完全アジュバントに乳化したさらなるＩＬ−１５で追加免疫する。その後、１週間〜２週間ごとの免疫化スケジュールで定期的に追加免疫する。眼窩後出血またはテールチップ（ｔａｉｌ−ｔｉｐ）切除によって血清サンプルを定期的に採取し、ドットブロットアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、またはＣＴＬＬ−２細胞上のＩＬ−１５活性の阻害によってＩＬ−１５抗体を試験する。

適切な抗体力価の検出後、陽性動物に、ＩＬ−１５を含む生理食塩水をさらに静脈内注射する。３〜４日後、動物を屠殺し、脾細胞を採取し、脾細胞をマウス骨髄腫細胞株（例えば、ＮＳ１またはＰ３ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８０））と融合する。融合物はハイブリドーマ細胞を生成し、これらを、非融合骨髄腫細胞および骨髄腫ハイブリッドの増殖を阻害するためのＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン）選択培地を含む多マイクロタイタープレート中にプレートする。

Ｅｎｇｖａｌｌら、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．８：８７１，１９７１および米国特許第４，７０３，００４号に開示の技術を適合させたＥＬＩＳＡによって、精製ＩＬ−１５に対する反応性についてハイブリドーマ細胞をスクリーニングする。好ましいスクリーニング技術は、Ｂｅｃｋｍａｎｎら、（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４４：４２１２，１９９０）に記載の抗体捕捉技術である。陽性ハイブリドーマ細胞を、同系Ｂａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注射して、高濃度の抗ＩＬ−１５モノクローナル抗体を含む腹水を産生することができる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、種々の技術によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでフラスコまたはローラーボトル中にて成長させることができる。マウス腹水中に産生されたモノクローナル抗体を、硫酸アンモニウム沈殿およびその後のゲル排除クロマトグラフィによって精製することができる。あるいは、ＩＬ−１５への結合に基づいてアフィニティクロマトグラフィを行うことができるので、プロテインＡまたはプロテインＧへの抗体の結合に基づいたアフィニティクロマトグラフィを使用することもできる。

本明細書中で参考として援用される開示および材料を使用して他の抗体を調製することができ、これらは本発明で有用である。ヒト化抗体の生成のために使用される手順を、米国特許第４，８１６，５６７号、同第６，５００，９３１号、およびＷＯ ９４／１０３３２号（全て本明細書中で参考として援用される）に見出すことができる。ヒト抗体の生成手順（ヒト抗体タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現するマウスまたは他の哺乳動物の使用など）は、例えば、米国特許第６，０７５，１８１号；同第６，１１１ ，１６６号；同第６，６７３，９８６号；同第６，６８０，２０９号；および同第６，６８２，７２６号（全て本明細書中で参考として援用される）に開示されている。マイクロボディ（ｍｉｃｒｏｂｏｄｙ）の生成手順を、ＷＯ ９４／０９８１７号に見出すことができ、トランスジェニック抗体のさらなる生成手順を、英国特許第２ ２７２ ４４０号（全て本明細書中で参考として援用される）に見出すことができる。

本発明の方法で使用されるさらなるアンタゴニストには、ＩＬ−１５Ｒαサブユニットに対するアンタゴニストが含まれる。このようなアンタゴニストは、例えば、米国特許第５，５９１，６３０号（本明細書中で参考として援用される）に開示されている。

モノクローナル抗体がアンタゴニストであることを決定するために、スクリーニングアッセイの使用が好ましい。この目的にはＣＴＬＬ−２増殖アッセイが好ましい。Ｇｉｌｌｉｓ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｎａｔｕｒｅ ２６８：１５４（１９７７）（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。簡潔に述べれば、モノクローナル抗体、ＰＥＧ化ＩＬ−１５、およびＩＬ−１５ムテインのアンタゴニスト活性を、修正ＣＴＬＬ−２細胞^３Ｈチミジン組み込みアッセイを使用して評価することができる（Ｇｉｌｌｉｓら、，Ｉｄ．）。アンタゴニストを９６ウェル平底組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）中の最終体積５０μｌのＤＭＥＭ培地（５％ＦＣＳ、ＮＥＡＡ、ＮａＰｙｒｕｖａｔｅ、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、２−ｍｅ、ＰＳＧを補足）で連続希釈することができる。次いで、サンプルの連続希釈後および細胞の添加前に、最適以下の（ｓｕｂｏｐｔｉｍａｌ）量のＩＬ−１５（最終濃度２０〜４０ｐｇ／ｍｌ）を全てのアッセイウェル（５μｌ／ウェル）に添加する。洗浄したＣＴＬＬ−２細胞を添加し（５０μｌ中に約２０００個／ウェル）、プレートを、１０％ＣＯ^２大気の加湿雰囲気下にて３７℃で２４時間インキュベートする。これの後に、０．５μＣｉの^３Ｈ−チミジン（２５Ｃｉ／ｍＭｏｌ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＩＩ）と５時間インキュベートした。次いで、培養物をガラス繊維フィルターで回収し、多検出ダイレクトβカウンター（Ｍａｔｒｉｘ ９６，Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｅｒｉｄｉｅｎ，Ｃｏｎｎ．）またはβシンチレーションカウンターのいずれかによるａｖａｌａｎｃｈｅガスイオン化によって計数する。アッセイによって得た１分あたりの数（ＣＰＭ）を、阻害率に変換し、滴定した各アンタゴニストサンプルの阻害率の値を使用して、単位／ｍｌでのアンタゴニスト活性を計算する。

ＣＴＬＬ阻害アッセイで４０ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１５を中和するのに必要な濃度を示すデータを、以下の表Ｉに示す。以下の表ＩＩは、ＣＴＬＬおよびＣＴＬＬ阻害アッセイにおけるＩＬ−１５活性（アゴニスト活性）およびＩＬ−１５アンタゴニスト活性を示す。

ＯＤ＝２８０ｎｍでの光学密度の吸光度；減衰係数１．３５、ＡＡＡ＝アミノ酸分析、ＰＥＧｆ−ｓ−ＩＬ１５＋ＰＥＧ化フラッグサルＩＬ−１５。

Ｑ１５６Ｃ＝Ｃｙｓと置換したＧｌｎ^１５６
Ｑ１５６Ｓ＝Ｓｅｒと置換したＧｌｎ^１５６
Ｄ５６Ｃ＝Ｃｙｓと置換したＡｓｐ^５６
Ｄ５６Ｓ＝Ｓｅｒと置換したＡｓｐ^５６
ＮＡ：アッセイせず。

本発明のアンタゴニストは、上記および以下により詳述するように、ＧＣ起源のＢ細胞腫瘍および胚中心でのＢ細胞増殖の阻害が望ましい状態の治療で使用される。

上記のように、本発明の別の実施形態は、本発明のＩＬ−１５ムテインをコードする核酸を使用する。このような核酸は、配列番号１の１４４〜４８６および配列番号２の１４４〜４８６のヌクレオチド配列を有するＲＮＡまたはｃＤＮＡのいずれかを含む。ＩＬ−１５ムテインをコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターおよびこのような発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞が本発明の範囲内にさらに含まれる。形質転換宿主細胞は、標準的な手順を使用して組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされている細胞である。発現した哺乳動物ＩＬ−１５は、宿主細胞および宿主細胞に挿入された遺伝子構築物の性質に依存して、宿主細胞内に存在し、そして／または培養上清に分泌されるであろう。任意の上記ＩＬ−１５アンタゴニストを含む薬学的組成物は、本発明に含まれる。

ＩＬ−１５のアンタゴニストの投与。本発明は、適切な希釈剤またはキャリア中に有効量のＩＬ−１５アンタゴニストを含む薬学的組成物の使用方法を提供する。本発明のＩＬ−１５アンタゴニストを、薬学的に有用な組成物の調製のために使用される公知の方法にしたがって処方することができる。ＩＬ−１５アンタゴニストを、唯一の活性材料（ａｃｔｉｖｅ ｍａｔｅｒｉａｌ）として、もしくは他の公知の活性材料とともにのいずれかで、薬学的に適切な希釈剤（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、防腐剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、乳化剤、可溶化剤、アジュバント、および／またはキャリアと混合物に組み合わせることができる。適切なキャリアおよびその処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄ．１９８０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．に記載されている。さらに、このような組成物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、金属イオンと複合体形成しているか、高分子化合物（ポリ酢酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲルなど）に組み込まれているか、リポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、単層または多層小胞、赤血球ゴースト、またはスフェロブラストに組み込まれているＩＬ−１５アンタゴニストを含み得る。このような組成物は、ＩＬ−１５アンタゴニストの物理的状態、可溶性、安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ放出速度、ｉｎ ｖｉｖｏクリアランス速度に影響を与える。ＩＬ−１５アンタゴニストを、組織特異的受容体に対する抗体、リガンド、または抗原に抱合するか、組織特異的受容体のリガンドにカップリングすることもできる。

本発明のＩＬ−１５アンタゴニストを、局所、非経口、直腸、または吸入によって投与することができる。用語「非経口」には、皮下注射、静脈内、筋肉内、槽内への注射、または注入技術が含まれる。これらの組成物は、典型的には、有効量のＩＬ−１５アンタゴニストを単独または有効量の任意の他の活性材料と組み合わせて含む。組成物中に含まれるこのような投薬量および所望の薬物濃度は、多数の要因（意図する用途、患者の体重および年齢、ならびに投与経路が含まれる）によって種々に変化し得る。動物試験によって予備用量を決定することができ、ヒト投与のための投薬量を当該分野で許容された慣習にしたがって増減することができる。

好ましくは、抗ＩＬ−１５抗体を、低タンパク質用量（２０〜１００ｍｇタンパク質／投与など）で、１回または繰り返し非経口投与する。あるいは、抗ＩＬ−１５抗体を、３０〜９０ｍｇタンパク質／投与、４０〜８０ｍｇタンパク質／投与、または５０〜７０ｍｇタンパク質／投与の用量で投与する。

本発明の抗ＩＬ−１５抗体の成分、免疫抱合体、および融合タンパク質を、薬学的に有用な組成物を調製するための公知の方法にしたがって配合し、それにより、治療タンパク質を薬学的に許容可能なキャリアとの混合物に組み合わせることができる。レシピエント患者がその投与に耐えることができる場合、組成物は、「薬学的に許容可能なキャリア」であるといわれる。滅菌リン酸緩衝化生理食塩水は、薬学的に許容可能なキャリアの一例である。他の適切なキャリアが当業者に周知である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ Ｅｄ．（１９９５）を参照のこと。

治療目的のために、抗体成分（または免疫抱合体／融合タンパク質）および薬学的に許容可能なキャリアを、治療有効量で患者に投与する。投与量が生理学的に有意である場合、抗体成分の組成物（任意選択的に免疫抱合体／融合タンパク質を含む）と薬学的に許容可能なキャリアとの組み合わせを、「治療有効量」で投与するという。その存在によってレシピエント患者の生理学的性質が検出可能に変化する場合、薬剤は生理学的に有意である。本文脈では、その存在によって標的腫瘍細胞の成長が阻害される場合、薬剤は生理学的に有意である。

リンパ腫治療のために、現在使用されている抗リンパ腫療法（放射線療法、化学療法、および／または生物学的療法が含まれる）と組み合わせてＧＣ−Ｂ細胞のＩＬ−１５刺激の阻害を行うことができる。生物学的療法は、一般に、インターフェロン療法およびモノクローナル抗体から構成される。インターフェロン療法は、ＮＨＬで研究された最初の生物学的治療であった。無痛性リンパ腫の治療のために欧州で広く使用されているが、米国ではまれにしか使用されていない。インターフェロン維持療法使用についてのデータにより、無疾患生存の延長が示唆されるが、一貫した全延命効果は示唆されない（Ｈａｇｅｎｂｅｅｋら、，Ｂｌｏｏｄ ９２（Ｓｕｐｐｌ．１：３１５ａ，１９９８）。したがって、無痛性リンパ腫患者におけるインターフェロン療法の役割は、臨床評価段階にある。したがって、本明細書中に記載のＩＬ−１５療法を、インターフェロン療法の補助として使用することができる。モノクローナル抗体は、Ｂ細胞リンパ腫の治療にも使用される。Ｂ細胞リンパ腫治療で現在使用されているか調査中のいくつかのモノクローナル抗体には、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）；ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ（ヒト化ＩｇＧ１）；トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒｒ）；イブリツモマブチウキセタン（Ｚｅｖａｌｉｎ）；エピラツズマブ；ベバシズマブ；およびＬｙｍ−１（Ｏｎｃｏｌｙｍ）が含まれる。これらの療法は、主に、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ５２、およびＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）をターゲティングする。これらのうちでＧＣ中でＩＬ−１５またはＩＬ−１５刺激Ｂ細胞成長を特異的にターゲティングするものは存在しない。

上記の本発明は、以下の実施例を参照してより容易に理解される。実施例は、例示の目的で記載するものであり、本発明を制限することを意図しない。

（実施例のための材料と方法）
抗体
抗ＩＬ−１５ｍＡｂ（Ｍ１１０およびＭ１１１：ＩｇＧ_１；Ｍ１１２：ＩｇＧ_２ｂ）を、一般に、米国特許第５，７９５，９６６号に記載のように生成した。簡潔に述べれば、Ｂａｌｂ／ｃマウスを、１０μｇのヒト（ｈ）ＩＬ−１５フラッグを含むＲＩＢＩアジュバント（Ｒｉｂｉ Ｃｏｒｐ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）で２回追加免疫した。最後の追加免疫から３ヶ月後、１匹の動物に３μｇのｈＩＬ−１５を含むＰＢＳで静脈内に追加免疫した。３日後、脾臓を取り出し、５０％ＰＥＧ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用してＡｇ８．６５３と融合した。融合細胞を、ＨＡＴ上清を含むＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）を含む９６ウェルプレートにプレートした。抗体捕捉アッセイによってハイブリドーマ上清をスクリーニングした。簡潔に述べれば、９６ウェルプレートに、１０μｇ／ｍｌのヤギ抗マウスＩｇで一晩コーティングした。３％ＢＳＡでのブロッキング後、５０μｌの細胞上清を各ウェルに添加した。１時間後、プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄した。ヨウ化ｈＩＬ−１５をプレートに１時間添加した。洗浄後、プレートを、ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒプレートに３時間曝露した。陽性を検出するための類似のスクリーニングを使用して、陽性細胞を２回クローン化した。

ＩＬ−１５遮断活性を決定するためにＣＴＬＬ−２細胞増殖アッセイも行った。これらのｍＡｂの特異性は、以前に試験し、使用されている（米国特許第５，７９５，９６６号；Ｔｉｎｈｏｆｅｒ，Ｉ．ら、２０００．Ｂｌｏｏｄ ９５：６１０．；Ｍｕｓｓｏ，Ｔ．ら、１９９９．Ｂｌｏｏｄ ９３：３５３１）。アイソタイプコントロールのためのマウスＩｇＧ_１（ＭＯＰＣ ２１）およびＩｇＧ_２ｂ（ＭＯＰＣ １４１）を、Ｓｉｇｍａから得た。抗ＩＬ−１５ｍＡｂ（ＭＡＢ２４７、マウスＩｇＧ_１）、ヤギポリクローナル抗ＩＬ−１５およびヤギ正常コントロールＩｇを、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から得た。ＰＥ抱合抗ＣＤ２０ ｍＡｂおよびＦＩＴＣ抱合ヤギ抗マウスＡｂを、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から得た。ＤＲＣ１ ｍＡｂ（マウスＩｇＧ_１）を、ＤＡＫＯ（Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）から得た。Ａｌｅｘａ ５９４抱合ヤギ抗マウスＡｂを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から得た。ＦＩＴＣ抱合ロバ抗ヤギＡｂを、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）から得た。

サイトカインおよび試薬
使用した培養培地は、１０％ＦＣＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補足したＩＭＤＭ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎｔａ Ａｎａ，ＣＡ）およびＲＰＭＩ １６４０（Ｓｉｇｍａ）であった。使用したサイトカインは、ＩＬ−２（Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｃ．，Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ）およびＩＬ−４（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｕｎｉｏｎ，ＮＪ）であった。組換え三量体ヒトＣＤ４０リガンド（Ｌ）およびＩＬ−１５を、以前に記載のように調製した（Ｇｒａｂｓｔｅｉｎ，Ｋ．Ｈ．ら、１９９４．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４：９６５．；Ａｒｍｉｔａｇｅ，Ｒ．Ｊ．ら、１９９５．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５４：４８３．；Ｍｏｒｒｉｓ，Ａ．Ｅ．ら、１９９９．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４：４１８．）。ＰｅｒｃｏｌｌおよびＦｉｃｏｌｌを、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）から得て、ＢＳＡをＳｉｇｍａから得た。

ＦＤＣクラスターの免疫蛍光染色
ヒト扁桃ＦＤＣを以前に記載のように単離した（Ｋｉｍ，Ｈ．−Ｓ．ら、１９９４．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５３：２９５１．）。単離細胞を、スライドガラス上で７００ｒｐｍで５分間サイトスピンした（Ｃｙｔｏｓｉｎｅ２（登録商標）、Ｓｈａｎｄｏｎ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）。サイトスピンスライドを、冷アセトン（−２０℃）で５分間固定し、必要になるまで−７０℃で保存した。スライドを、ＰＢＳにて室温で１０分間水和し、湿室中にて２５℃で１時間遮断溶液（ＤＡＫＯ）とインキュベートした。スライドを、適量のヤギ抗ＩＬ−１５ＡｂまたはコントロールヤギＩｇにて４℃で一晩染色した。次いで、スライドを、３回洗浄し、ＦＩＴＣ抱合抗ヤギＩｇと室温で１時間インキュベートした。同時染色のために、ＤＲＣ−１ ｍＡｂ（図１ＡおよびＣ）またはＰＥ抱合抗ＣＤ２０ｍＡｂ（図１Ｂ）を、一次Ａｂと共に添加した。ＤＲＣ−１染色を、二次Ａｌｅｘａ−５９４抱合抗マウスＡｂ染色によって視覚化した。単一ＦＤＣ染色（図１Ｄ）のために、スライドを、核対比染色のためにＤＡＰＩ溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）中でインキュベートし、次いで、マウス抗ＩＬ−１５またはコントロールｍＡｂで染色し、その後、ＦＩＴＣ抱合ヤギ抗マウスＡｂで染色した。スライドを洗浄し、退色防止蛍光封入剤（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を使用してマウントした。解析顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ；Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｉｍａｇｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）にて画像を収集した。ｓｌｉｄｅｂｏｏｋソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎ １．６．５８７；Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ，Ｄｅｎｖｅｒ，ＣＯ）およびＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ７．０（Ａｄｏｂｅ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して画像を処理した。

フローサイトメトリー分析
ＦＤＣ／ＨＫ細胞を、以前に記載のように１０％ＦＣＳ ＲＰＭＩ培地中で培養した（Ｋｉｍ，Ｈ．−Ｓ．ら、１９９４．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５３：２９５１）。４〜９世代のＦＤＣ／ＨＫ細胞を、実験に使用した。ＦＡＣＳ分析のために、ＦＤＣ／ＨＫ細胞を、無酵素細胞分離液（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｍｅｄｉａ，Ｐｈｉｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）を使用して回収した。以前に記載の増幅手順を修正した表面ＩＬ−１５検出のために全ＦＡＣＳ染色を行った（Ｊｕｎｇ，Ｊ．ら、２０００．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３０：２４３７）。簡潔に述べれば、細胞を冷ＦＡＣＳ緩衝液（０．０５％ＦＣＳ、０．０１％ＮａＮ_３を含むＰＢＳ）中で洗浄し、その後に適切な濃度の抗ＩＬ−１５ｍＡｂ（Ｂ２４７）と４℃で１５分間インキュベートした。冷ＦＡＣＳ緩衝液での洗浄後、Ｆｌｏｗ−Ａｍｐ（登録商標）キット（Ｆｌｏｗ−Ａｍｐ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を使用した増幅手順を、製造者の説明書にしたがって行った。競合研究のために、抗ＩＬ−１５抗体を、３００ｎｇ／ｍｌの組換えＩＬ−１５と４℃で３０分間インキュベートし、その後にＦＡＣＳ染色を行った。サンプルを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）およびＣｅｌｌＱｕｅｓｔ−Ｐｒｏ（登録商標）プログラムを使用して分析した。蛍光値を対応するコントロールの蛍光値から引くことによって特定の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を得た。

ＩＬ−１５の酸ストリッピングおよび結合
前に結合したＩＬ−１５の酸ストリッピングを、記載のように行った（Ｄｕｂｏｉｓ，Ｓ．ら、２００２．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １７：５３７．；Ｋｕｍａｋｉ，Ｓ．ら、１９９６．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２６：１２３５．）。簡潔に述べれば、ＦＤＣ／ＨＫ細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄した後、グリシン緩衝液（２５ｍＭグリシン、１５０ｍＭ ＮａＣＩ（ｐＨ３））と４℃で１０分間インキュベートした。次いで、細胞を回収し、冷ＰＢＳで２回洗浄し、ＦＡＣＳ染色に供した。結合実験のために、ＦＤＣ／ＨＫ細胞またはＧＣ−Ｂ細胞を回収し、冷ＰＢＳで２回洗浄した後、飽和用量のＩＬ−１５（１００ｎｇ／ｍｌ）と４℃で３０分間インキュベートし、冷ＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳ分析のために染色した。

ＣＴＬＬ−２細胞アッセイ
ＣＴＬＬ−２細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓａｓ，ＶＡ）を、１０％ＦＣＳ、ＩＬ−２（３０Ｕ／ｍｌ）、および２−ＭＥ（５×１０^−５Ｍ，Ｓｉｇｍａ）を含むＲＰＭＩ １６４０培地中で維持した。ＦＤＣ／ＨＫ細胞の連続希釈物（２×１０^４細胞／ウェルからなし／ウェルまで）を、９６ウェルプレート中で５％ＣＯ_２インキュベーターにて１日間培養した。次いで、プレートを、洗浄し、１％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ中にて４℃で１時間固定し、その後に冷ＰＢＳ中で十分に洗浄した。ＣＴＬＬ−２細胞（５×１０^３細胞／ウェル）を含む維持培地を固定ＦＤＣ／ＨＫ細胞でコーティングした９６ウェルプレートに３連で添加し、抗ＩＬ−１５ｍＡｂまたはアイソタイプコントロールｍＡｂと培養した。培養２０時間後、細胞を０．５μＣｉの［^３Ｈ］ＴｄＲ（２０Ｃｉ／ｍＭ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）にてさらに４時間パルスした。培養物を、ガラス繊維フィルター上に回収し、［^３Ｈ］ＴｄＲ組み込みを、液体シンチレーションカウンター（Ｒａｃｋｂｅｔａ；ＬＫＢ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）によって測定した。結果を、３連の培養物の平均ｃｐｍ±ＳＥＭとして示した。

ＲＴ−ＰＣＲ
ＩＬ−１５Ｒα、ＩＬ−２Ｒα、ＩＬ−２Ｒβ、およびＩＬ−２Ｒγの発現を試験するために、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して細胞から全ＲＮＡを抽出した。１μｇアリコートのＲＮＡを、ランダムオリゴ−ｄＴおよびＭ−ＭＬＶ ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して転写した。相補ＤＮＡを、２００μＭの各ｄＮＴＰ、５００ｎＭのプライマー、および２．５Ｕ Ｔａｑポリメラーゼを含む２５μｌの反応混合物中で増幅した。各ｃＤＮＡサンプルの増幅を、以下の条件下で行った：９４℃で５０秒間の変性、５７℃で５０秒間のアニーリング、７２℃で５０秒間の伸長。ヒトＧＡＰＤＨを使用して、同等のサンプルローディングを確実にした。ネガティブコントロールとして機能させるために偽ＰＣＲを行った。増幅ＰＣＲ産物を、１．５％アガロースゲルにて分離し、臭化エチジウム染色によって視覚化した。使用プライマーを以下に示す：ＩＬ−１５Ｒαについては、５’−ＧＴＣＡＡＧＡＧＣＴＡＣＡＧＣＴＴＧＴＡＣ−３’（配列番号３）および５’ＣＡＴＡＧＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＣＡＧＴＴＴＴＣ−３’（配列番号４）；ＩＬ−２Ｒαについては、５’−ＡＡＧＣＴＣＴＧＣＣＡＣＴＣＧＧＡＡＣＡＣＡＡＣ−３’（配列番号５）および５’−ＴＧＡＴＣＡＧＣＡＧＧＡＡＡＡＣＡＣＡＧＣ−３’（配列番号６）；ＩＬ−２Ｒβについては、５’−ＡＣＣＴＣＴＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＡＧＣ−３’（配列番号７）および５’−ＣＴＣＴＣＣＡＧＣＡＣＴＴＣＴＡＧＴＧＧ−３’（配列番号８）；ＩＬ−２Ｒγについては、５’−ＣＣＡＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＣＡＣＴＡＴＣ−３’（配列番号９）および５’−ＧＴＧＧＡＴＴＧＧＧＴＧＧＣＴＣＣＡＴ−３’（配列番号１０）；ＧＡＰＤＨについては、５’−ＣＣＣＴＣＣＡＡＡＡＴＣＡＡＧＴＧＧＧＧ−３’（配列番号１１）および５’−ＣＧＣＣＡＣＡＧＴＴＴＣＣＣＧＧＡＧＧＧ−３’（配列番号１２）。

ヒト扁桃ＧＣ−Ｂ細胞の調製および培養
記載のように（Ｃｈｏｅ，Ｊ．ら、１９９６．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５７：１００６）、ＧＣ−Ｂ細胞を、ＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）によって扁桃Ｂ細胞から精製した。ＣＤ２０およびＣＤ３８の発現によって評価したところ、純度は９５％超であった。ＧＣ−Ｂ細胞細胞（２×１０^５細胞／ウェル）を、照射ＦＤＣ／ＨＫ細胞（２×１０^４細胞／ウェル、５，０００Ｒａｄ）、ＣＤ４０Ｌ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−２（３０Ｕ／ｍｌ）、およびＩＬ−４（５０Ｕ／ｍｌ）の存在下にて２４ウェルプレート中で培養した。ＩＬ−２を含まない培養物の総回収率が非常に低いので、図５Ｂのための実験を除いて感度を増大させるためにＩＬ−２を含めた（Ｃｈｏｅ，Ｊ．ら、１９９６．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５７：１００６）。ブロッキング実験のために、抗ＩＬ−１５またはアイソタイプコントロールｍＡｂ（他で示さない限り、１０μｇ／ｍｌ）を３０分間インキュベートし、その後にＧＣ−Ｂ細胞を添加した。いくつかのブロッキングｍＡｂおよび対応するコントロールｍＡｂは、使用濃度で０．００００２％未満のアジ化ナトリウムを含んでおり、これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系で毒性を示し始めるアジ化ナトリウム濃度の１／１００であった。さらなる実験のために（図５Ｂ）、ＩＬ−１５（１〜１００ｎｇ／ｍｌ）を３０分間添加し、その後にＧＣ−Ｂ細胞を添加した。細胞分裂実験のために、ＧＣ−Ｂ細胞を、ＣＦＳＥ（Ｓｉｇｍａ、５μＭ／ｍｌを含むＰＢＳ）にて３７℃で１０分間標識した。ＦＣＳを添加して染色を停止させ、次いで、標識した細胞を培養培地で洗浄した。培養後、ＣＦＳＥ強度を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標）によって測定し、ＭｏｄＦｉｔ ＬＴ（登録商標）ソフトウェア３．０（Ｖｅｒｉｔｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｈｏｕｓｅ，Ｉｎｃ．Ｔｏｐｓｈａｍ，ＭＥ）によって分析した。回収した生存細胞を、トリパンブルー排除法によって計数した。

（実施例１ ＩＬ−１５は、ＦＤＣによって産生されたが、Ｂ細胞によって産生されなかった）
胚中心中のＩＬ−１５の細胞供給源を同定するために、新たに単離したＦＤＣ−Ｂ細胞クラスターのＩＬ−１５に対する特異的Ａｂでの染色によって、ＩＬ−１５のｉｎ ｖｉｖｏ発現を試験した（図１）。ＦＤＣクラスターは、巨大な細胞質を有する典型的なＦＤＣおよび１０個を超えるＢ細胞からなる細胞凝集体であった（Ｌｉ，Ｌ．ら、２０００．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９１：１０７７）（図１Ａ〜Ｃ）。ＩＬ−１５はＦＤＣクラスター中で発現し、ｉｎ ｖｉｖｏでのＩＬ−１５の存在が示唆された（図１ＡおよびＢ）。ＦＤＣクラスター中のＩＬ−１５の細胞供給源を決定するために、ＦＤＣ特異的マーカーであるＤＲＣ−１ ｍＡｂまたはＢ細胞特異的マーカーである抗ＣＤ２０ｍＡｂを、それぞれヤギ抗ＩＬ−１５Ａｂで同時染色した（Ｌｉ，Ｌ．ら、２０００．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９１：１０７７．；Ｎａｉｅｍ，Ｍ．ら、１９８３．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３６：１６７．）。抗ＩＬ−１５Ａｂ（緑色）は、ＤＲＣ−１ｍＡｂで同時染色されたが（赤色；同時染色：黄色、図１Ａ）、抗ＣＤ２０ｍＡｂで同時染色されず（赤色、図１Ｂ）、このことは、ＤＲＣ−１陽性ＦＤＣがＩＬ−１５を産生し、Ｂ細胞は産生しないことが示唆された。ヤギコントロールＡｂおよびＤＲＣ−１Ａｂで同時染色されたサンプルで同時染色されなかったので、染色はＩＬ−１５に特異的であった（図１Ｃ）。いくつかのＦＤＣ（１０〜２０％）はＢ細胞とクラスター形成しなかったが、その豊富な細胞質および頻繁な二重仁（ｄｏｕｂｌｅ ｎｕｃｌｅｉ）によって同定することができる（ｖａｎ Ｎｉｅｒｏｐ，Ｋ．ら、２００２．Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４：２５１）（図１Ｄ）。これらの単一ＦＤＣは、マウス抗ＩＬ−１５ｍＡｂ（ＭＡＢ２４７）によって染色されたＩＬ−１５も発現し、上記結果が確認された。同様に、マウスコントロールｍＡｂおよびＤＡＰＩで染色されたサンプル中で緑色の染色は認められなかったが、青色核染色のみが認められた（１Ｄ挿入図）。

（実施例２ ＩＬ−１５は、ＩＬ−１５Ｒαに結合したＦＤＣ／ＨＫ細胞の表面上に存在した）
多数のＦＤＣの特徴（ＧＣ−Ｂ細胞の生存および増殖を支持する能力が含まれる）を共有することが示されている初代ＦＤＣ細胞株ＦＤＣ／ＨＫによるＩＬ−１５の産生（Ｌｉ，Ｌ．ら、，Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：２５９，２００２；Ｋｉｍ，Ｈ．−Ｓ．ら、，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１１０１，１９９５）を調査した。ＥＬＩＳＡ（アッセイ感度は１９ｐｇ／ｍｌ以上）によってＦＤＣ／ＨＫ細胞（２×１０^５細胞／ｍｌ）の培養上清中にＩＬ−１５が検出されなかったので、ＩＬ−１５の表面発現を、報告されている方法を使用して研究した（Ｍｏｒｒｉｓ，Ａ．Ｅ．ら、１９９９．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４：４１８；Ｋｉｍ，Ｈ．−Ｓ．ら、１９９４．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５３：２９５１；Ｎａｉｅｍ，Ｍ．ら、１９８３．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３６：１６７；Ｂｕｌｆｏｎｅ−Ｐａｕｓ，Ｓ．ら、１９９７．Ｎａｔ Ｍｅｄ ３：１１２４）。トリアミン増幅法（Ｆｌｏｗ−Ａｍｐ（登録商標））を使用した高感度の表面ＦＡＣＳ染色法を使用して、ＩＬ−１５を検出した。図２Ａに示すように、ＩＬ−１５はＦＤＣ／ＨＫ細胞上で検出されたのに対して、ＧＣ−Ｂ細胞は陰性であった（図２Ａ）。これらの結果は、ＦＤＣ−Ｂ細胞クラスターに関する以前のＩＦ染色データと一致する。ＦＤＣ／ＨＫ上でのＩＬ−１５の特異的染色を、可溶性ＩＬ−１５との競合によって検証した。抗ＩＬ−１５ｍＡｂを過剰量のＩＬ−１５でプレインキュベートした場合、ＦＤＣ／ＨＫ細胞の表面上でのＩＬ−１５の染色は、アイソタイプコントロールの染色まで完全に減少した。これらの結果は、３つの個別の実験で再現された。

表面ＩＬ−１５は、別の膜型のＩＬ−１５分子の存在（Ｍｕｓｓｏ，Ｔ．ら、１９９９．Ｂｌｏｏｄ ９３：３５３１）または分泌ＩＬ−１５の再結合（Ｄｕｂｏｉｓ，Ｓ．ら、２００２．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １７：５３７．；Ｓｃｈｌｕｎｓ，Ｋ．Ｓ．ら、２００４．Ｂｌｏｏｄ １０３：９８８．）に起因したかもしれなかった。以前に記載のように酸処理を使用して（Ｄｕｂｏｉｓ，Ｓ．ら、２００２．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １７：５３７）、グリシン緩衝液（ｐＨ３．０）での処理後に、ＦＤＣ／ＨＫ細胞の表面からＩＬ−１５をコントロールｍＡｂでの染色レベルまで完全に除去した（図２Ｃ）。この結果は、別の膜型のタンパク質よりもむしろ分泌ＩＬ−１５の再結合を示す。

ＩＬ−１５Ｒαは高親和性でＩＬ−１５に結合するので（Ｇｉｒｉ，Ｊ．Ｇ．ら、１９９５．Ｅｍｂｏ Ｊ １４：３６５４）、ＦＤＣ／ＨＫ細胞中のＩＬ−１５Ｒαの存在を試験した。ＲＴ−ＰＣＲ実験では、ＩＬ−１５Ｒαの特異的結合がＦＤＣ／ＨＫ細胞およびポジティブコントロールプラスミドのｃＤＮＡから増幅されたのに対して、内部ネガティブコントロールとしての機能を果たすために含めたＩＬ−２Ｒαの特異的結合は増幅されなかった（図２Ｃ）。この結果は、ＦＤＣ／ＨＫ細胞がＩＬ−１５ＲαのｍＲＮＡを発現することを示す。

（実施例３ ＦＤＣ／ＨＫ表面上の膜結合ＩＬ−１５は生物学的に活性である）
ＦＤＣ／ＨＫ細胞上の表面結合ＩＬ−１５の生物活性を試験するために、ＩＬ−２およびＩＬ−１５依存性ＣＴＬＬ−２細胞アッセイを使用した。可溶性ＩＬ−１５がＥＬＩＳＡによって検出されなかったにもかかわらず、ＦＤＣ／ＨＫ細胞を１％パラホルムアルデヒドで固定して、可溶性ＩＬ−１５による偽陽性の結果を排除した。培養物中に存在する固定ＦＤＣ／ＨＫ細胞数に比例してＣＴＬＬ−２細胞によるトリチウム化チミジンの組み込みが増加した（図３Ａ）。ＦＤＣ／ＨＫ細胞と対応するＣＴＬＬ−２細胞との比が４：１で、ｃｐｍ値はネガティブコントロールのほぼ３倍であった（７，５００に対して２１，０００）。固定ＦＤＣ／ＨＫ細胞コントロールウェルを使用しないＣＴＬＬ−２細胞の比較的高いバックグラウンド増幅（７，５００ｃｐｍ）は、アッセイ感度を増加させるために添加した最適以下の用量のＩＬ−２に帰し得る。結果は、再結合ＩＬ−１５が細胞表面上で機能的に活性であるという以前の報告と一致する（Ｍｏｒｒｉｓ，Ａ．Ｅ．ら、１９９９．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４：４１８．；Ｋｉｍ，Ｈ．−Ｓ．ら、１９９４．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５３：２９５１．；Ｎａｉｅｍ，Ｍ．ら、１９８３．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３６：１６７．；Ｂｕｌｆｏｎｅ−Ｐａｕｓ，Ｓ．ら、１９９７．Ｎａｔ Ｍｅｄ ３：１１２４．）。ＦＤＣ／ＨＫ細胞から放出される可溶性ＩＬ−１５の可能な効果を試験するために、最も高濃度のＦＤＣ／ＨＫ細胞（２×１０^４／ウェル）由来の培養上清を、同一培養物に添加した。コントロール培地の培養物とＦＤＣ／ＨＫ細胞培養物上清の培養物との間にｃｐｍ値の有意差は存在せず、培養上清中にＩＬ−１５が存在しないことを示し、これは、ＥＬＩＳＡの結果と一致する。

ＣＴＬＬ−２細胞に対する刺激効果がＩＬ−１５によって媒介されることを確認するために、ＩＬ−１５に対する特異的遮断ｍＡｂおよびアイソタイプコントロールｍＡｂを培養物に添加した。図３Ｂに示すように、抗ＩＬ−１５ｍＡｂの添加により、固定ＦＤＣ／ＨＫ細胞によって増強されたＣＴＬＬ−２細胞の増殖が完全に遮断されるのに対して、コントロールｍＡｂは効果がなかった。

（実施例４ ＧＣ−Ｂ細胞は、ＩＬ−１５シグナル伝達の受容体成分を発現するが、高親和性結合の受容体成分を発現しない）
ＦＤＣによるＩＬ−１５の産生は、ＩＬ−１５がおそらくＧＣ−Ｂ細胞上でのＧＣ反応において生物機能を有するかもしれないことを意味していた。したがって、本発明者らは、ＧＣ−Ｂ細胞におけるＩＬ−１５シグナル伝達に必要な特異的受容体の発現プロフィールを試験した（図４Ａ）。ＩＬ−１５ＲαｍＲＮＡ（高親和性結合の受容体成分）の発現はＲＴ−ＰＣＲで実質的にごくわずかであり、これは、新たに単離したＧＣ−Ｂ細胞（ネガティブコントロール）におけるＩＬ−２ＲαのｍＲＮＡへの類似のわずかな結合を示していた。対照的に、ＩＬ−２ＲβおよびＩＬ−２ＲγのｍＲＮＡ（シグナル伝達の主成分）の発現は、新たに単離されたか培養されたかにかかわらず、ＧＣ−Ｂ細胞で明白であり、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの両方でのＧＣ−Ｂ細胞におけるＩＬ−１５またはＩＬ−２のシグナル伝達受容体成分の存在が示唆された。

ＩＬ−１５ＲαｍＲＮＡの非存在を、ＧＣ−Ｂ細胞のＦＡＣＳ染色におけるＩＬ−１５Ｒαタンパク質検出の失敗およびＩＬ−１５結合の欠如によっても確認した（図４Ｂ）。強いＩＬ−１５結合を示したＦＤＣ／ＨＫ細胞と対照的に、過剰なＩＬ−１５とのインキュベーション後のＧＣ−Ｂ細胞表面上に有意なＩＬ−１５結合は検出されず、表面上にＩＬ−１５Ｒαが存在しないことが証明された。可溶性ＩＬ−１５はその分裂促進シグナルを伝達するためのＩＬ−１５αが必要であるので（Ｌｕ，Ｊ．ら、，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８：３８７７，２００２）、結果により、ＧＣ−Ｂ細胞が可溶性ＩＬ−１５に応答することができないことが示唆される。この結論は、ＦＤＣ／ＨＫ細胞の非存在下での可溶性ＩＬ−１５がＧＣ−Ｂ細胞回収率の顕著な相違を示さなかったという所見と一致する。

（実施例５ ＩＬ−１５はＧＣ−Ｂ細胞増殖を増加させる）
上記のように、ＧＣ−Ｂ細胞を、ＦＤＣ／ＨＫ細胞およびサイトカインと共に培養した。異なる量の抗ＩＬ−１５ｍＡｂを添加した場合、ＧＣ−Ｂ細胞増殖は用量依存性様式で顕著に阻害され（図４Ａ）、ＩＬ−１５がＧＣ−Ｂ細胞増殖を増強することが示唆された。１０日目に、抗ＩＬ−１５ｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ）を含む培養物中の生存ＧＣ−Ｂ細胞数は、アイソタイプコントロールｍＡｂを含む培養物の１７％であった。しかし、ＩＬ−１５の遮断は、表面マーカーおよびＩｇ分泌によって測定される培養細胞の分化に影響を与えなかった。この結果は、４つの個別の実験で再現された。ＩＬ−１５に対する他のｍＡｂ（クローンＭ１１１、Ｍ１１２、およびＭＡＢ２４７）を使用した実験でも類似の阻害が認められた。

他の実験では、ＩＬ−２の間接的影響の可能性を排除し、枯渇実験におけるＩＬ−１５の効果を検証するためにＩＬ−２を省いた。図４Ｂに示すように、ＦＤＣ／ＨＫ細胞上の表面ＩＬ−１５の量は、外因性ＩＬ−１５とのインキュベーションによってさらに増加した。したがって、コーティングしたＦＤＣ／ＨＫ細胞を、異なる量のＩＬ−１５（１〜１００ｎｇ）とインキュベートし、その後にＩＬ−１５効果を増大させるためにＧＣ−Ｂ細胞培養物とインキュベートした。ＦＡＣＳによる表面ＩＬ−１５のＭＦＩは、添加したＩＬ−１５に比例して増加した（１００ｎｇについては、図４Ｂの右のパネル）。培養１０日目に回収した細胞数は、用量依存性様式で増加した（図５Ｂ）。１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５の存在下で、生存ＧＣ−Ｂ細胞数は、コントロール培養物の２．５倍に増加した。ＧＣ−Ｂ細胞がＩＬ−１５Ｒαを発現しないならば、これらの結果は、ＦＤＣ／ＨＫ細胞上の表面ＩＬ−１５がＧＣ−Ｂ細胞増殖を増強することを強く示唆したものである。この結果は、４つの個別の実験で再現された。

本出願を通して、種々の刊行物が参照される。これらの刊行物の開示は、その全体が本明細書中で参考として援用される。上記の説明は、当業者が本発明の実施を可能にするのに十分であると見なされる。本発明は、本明細書中に記載の実施例によってその範囲が制限されるべきではない。実際、本明細書中に示し、説明した発明に加えて、上記説明から本発明の種々の修正形態が当業者に明らかとなり、この修正形態は、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれる。

ＩＬ−１５はヒト扁桃ＦＤＣで発現するが、Ｂ細胞で発現しない。ヒト扁桃ＦＤＣクラスターのサイトスピン調製物を、ヤギポリクローナル抗ＩＬ−１５Ａｂ（ＡおよびＢ：緑色）、マウス抗ＩＬ−１５ｍＡｂ（Ｄ：緑色）、対応するコントロールＡｂ（ＣおよびＤの挿入図：緑色）で染色した。スライドを、ＦＤＣについてはＦＤＣ特異的ＤＲＣ−１ｍＡｂ（ＡおよびＣ：赤色）、Ｂ細胞については抗ＣＤ２０ｍＡｂ（Ｂ：赤色）、および核についてはＤＡＰＩ（Ｄ：青色）で同時染色した。元の倍率は４００倍である。 ＦＤＣ／ＨＫ細胞は、ＩＬ−１５Ｒαに結合したその表面上にＩＬ−１５を発現する。（Ａ）ＦＡＣＳによるＩＬ−１５の表面発現。特異的ｍＡｂまたはコントロールｍＡｂでの表面ＦＡＣＳ染色物を、Ｆｌｏｗ−Ａｍｐキット（それぞれ太線および点線）で増幅した。特異的ｍＡｂをＩＬ−１５（３００ｎｇ）と氷上で３０分間インキュベートし、その後に細胞を染色することによって競合実験を行い、特異性を確認した（細線）。（Ｂ）酸ストリッピング（ａｃｉｄ ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ）後の表面ＩＬ−１５の変化。ＦＤＣ／ＨＫ細胞を、氷上にて冷グリシン緩衝液（ｐＨ３．０）中で１０分間インキュベートし、次いで特異的ＡｂまたはアイソタイプコントロールＡｂで染色した（酸処理：太線、未処理：細線、アイソタイプコントロール：点線）。（Ｃ）ＦＤＣ／ＨＫ細胞中でのＩＬ−１５ＲαｍＲＮＡの発現。ＩＬ−１５ＲαおよびＩＬ−２Ｒα（内部コントロール）のＲＴ−ＰＣＲを、同一条件下で同量のＦＤＣ／ＨＫ細胞ｍＲＮＡを使用して行った。 ＦＤＣ／ＨＫ表面上の膜結合ＩＬ−１５は生物学的に活性である。異なるＦＤＣ／ＨＫ細胞数（２×１０^４／ウェルからなし／ウェルへの２倍希釈）を、９６ウェルプレート中で１日培養し、１％パラホルムアルデヒドで固定した。ＣＴＬＬ−２細胞（５×１０^３細胞／ウェル）を、３連で１０％ＦＣＳ、１Ｕ／ｍｌのＩＬ−２、および２−ＭＥを含むＲＰＭＩ培地中にてＦＤＣ／ＨＫ細胞をコーティングした９６ウェルプレート上で１日培養した。細胞を、０．５μＣｉの［^３Ｈ］ＴｄＲ（２０Ｃｉ／ｍＭ）にて少なくとも４時間パルスした。［^３Ｈ］ＴｄＲの組み込みを、液体シンチレーションカウンターによって測定した。結果を、３連の培養物の平均ｃｐｍ±ＳＥＭとして示す。（Ａ）一定数のＣＴＬＬ−２細胞に添加した種々の数のＦＤＣ／ＨＫ細胞中のＣＴＬＬ−２細胞の増殖（なし：コーティングしたＦＤＣ／ＨＫを含まない１０％ＦＣＳ ＲＰＭＩ培地コントロール；ｓｐｎ：ＦＤＣ／ＨＫ培養上清）。（Ｂ）特異的抗ＩＬ−１５ｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ）による増強されたＣＴＬＬ−２細胞増殖の阻害。点線は、ＦＤＣ／ＨＫ細胞またはＡｂを含まない培養ＣＴＬＬ−２細胞のｃｐｍ値を示す。これらの結果を、２つの独立した実験で再現した。 ＩＬ−１５およびＩＬ−２受容体のＧＣ−Ｂ細胞発現。（Ａ）材料と方法に記載のように新たに単離または培養したＧＣ−Ｂ細胞由来のｍＲＮＡを使用して、ＲＴ−ＰＣＲを行った（（＋）コントロール：各遺伝子を含むプラスミド；ＧＣＢ ｄ０：新たに単離したＧＣＢ細胞；ＧＣ−Ｂ ｄ４：ＧＣ−Ｂ細胞を４日間培養した；ＤＷ：ネガティブコントロールとしての役割を果たす蒸留水）。（Ｂ）ＩＬ−１５結合アッセイのＦＡＣＳプロフィール。新たに単離したＧＣ−Ｂ細胞およびＦＤＣ／ＨＫ細胞を、飽和用量のＩＬ−１５（１００ｎｇ）と氷上で３０分間インキュベートし、次いで抗ＩＬ−１５ｍＡｂで染色した。 ＦＤＣ／ＨＫ細胞上のＩＬ−１５は、ＦＤＣ／ＨＫ細胞およびサイトカインと培養した場合に、ＧＣ−Ｂ細胞回収率が増加する。（Ａ）抗ＩＬ−１５ｍＡｂの添加量に対応して生存細胞の回収率が減少した。ＧＣ−Ｂ細胞（２×１０^５細胞／ウェル）を、表示の量の特異的ｍＡｂと共にＦＤＣ／ＨＫ細胞（２×１０^４細胞／ウェル、５，０００Ｒａｄ）、ＣＤ４０Ｌ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−２（３０Ｕ／ｍｌ）、およびＩＬ−４（５０Ｕ／ｍｌ）を含む２４ウェルプレート中で１０日間培養した。１０日目に細胞を採取し、トリパンブルー排除法によって計数した。（Ｂ）生存細胞数は、ＩＬ−１５の添加量に比例して増加した。表示量のＩＬ−１５を、ＧＣ−Ｂ細胞培養物に添加した。ＩＬ−２は、この実験に含まれなかった。４つの個別の実験由来の代表的な結果を示す。 ＩＬ−１５により、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＧＣ−Ｂ細胞増殖が増強される。単離ＧＣ−Ｂ細胞を、ＣＦＳＥ（５μＭ／ｍｌ）で標識し、次いで、ＦＤＣ／ＨＫ細胞とサイトカインとの組み合わせの存在下で、ＩＬ−１５（１００ｎｇ／ｍｌ）、抗ＩＬ−１５（１０μｇ／ｍｌ）、またはコントロールｍＡｂと６日間培養した。採取した細胞を計数し、ＦＡＣＳ分析に供してＣＦＳＥ強度を測定した。結果を、ＭｏｄＦｉｔソフトウェアを使用して分析した。（Ａ）生存細胞数の比較。（Ｂ）各区分中の比率による回収細胞のＣＦＳＥプロフィールの比較（Ｄ：区分）。 ＦＤＣ／ＨＫ表面上のＩＬ−１５レベルは、ＧＣ−Ｂ細胞またはＴＮＦαによって増強される。ＦＤＣ／ＨＫ細胞を、以下に示す種々の誘導条件下で１０％ＦＣＳ ＩＭＤＭ培地中にて３日間インキュベートした：培地のみ（培地）、ＩＬ−２、ＩＬ−４、およびＣＤ４０Ｌ（２４Ｌ）；ＧＣ−Ｂ細胞を含むＩＬ−２、ＩＬ−４、およびＣＤ４０Ｌ（２４Ｌ＋ＧＣ−Ｂ）；ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）。採取した細胞を、ＦＡＣＳ分析のために染色した。括弧内の数字は、各サンプルのＭＦＩを示す。ＭＦＩを、特異的ｍＡｂの値からコントロールの値を引くことによって計算する（それぞれ、点線および実線）。

Claims (25)

1. 胚中心起源のＢ細胞腫瘍を治療する方法であって、薬学的に許容可能なキャリアおよび少なくとも１つのＩＬ−１５のアンタゴニストを含む治療組成物を該Ｂ細胞腫瘍を有するヒト被験体に投与する工程を含む、方法。
2. 前記アンタゴニストが抗ＩＬ−１５抗体である、請求項１に記載の方法。
3. 前記抗ＩＬ−１５抗体が、非ヒト霊長類抗体、マウスモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、およびヒト化抗体からなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
4. 前記抗ＩＬ−１５抗体を、１用量あたり３０〜９０ｍｇのタンパク質の投薬量で非経口投与する、請求項２に記載の方法。
5. 前記被験体が、１用量あたり５０〜９０ｍｇのタンパク質の反復非経口投薬量として、抗ＩＬ−１５抗体を受容する、請求項２に記載の方法。
6. 前記抗ＩＬ−１５抗体が、Ｍ１１０抗体、Ｍ１１１抗体、およびＭ１１２抗体からなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
7. 前記アンタゴニストがＩＬ−１５のムテインである、請求項１に記載の方法。
8. 前記ＩＬ−１５ムテインが、ＩＬ−１５Ｒαサブユニットに結合することができ、ＩＬ−１５受容体複合体のβサブユニットまたはγサブユニットを介してシグナルを伝達することができない、請求項７に記載の方法。
9. 前記ムテイン中の配列番号２のＩＬ−１５のアミノ酸残基Ａｓｐ^５６またはＧｌｎ^１５６の少なくとも１つが、欠失するか、異なる天然に存在するアミノ酸残基に置換される、請求項７に記載の方法。
10. 前記ムテインが、化学部分（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｉｅｔｙ）に抱合している、請求項７に記載の方法。
11. 前記ムテインがポリエチレングリコールに抱合している、請求項１０に記載の方法。
12. 前記アンタゴニストが可溶性ＩＬ−１５である、請求項１に記載の方法。
13. 前記可溶性ＩＬ−１５が、化学部分に抱合している、請求項１２に記載の方法。
14. 前記可溶性ＩＬ−１５がポリエチレングリコールに抱合している、請求項１３に記載の方法。
15. 前記Ｂ細胞腫瘍が、ホジキンリンパ腫；非ホジキンリンパ腫；Ｂ細胞リンパ腫；小リンパ球性リンパ腫；マントル細胞リンパ腫；濾胞性リンパ腫；辺縁細胞リンパ腫；単球様Ｂ細胞リンパ腫；脾リンパ腫；びまん性大細胞リンパ腫；バーキットリンパ腫；高悪性度バーキット様リンパ腫；リンパ芽球性リンパ腫；およびびまん性大細胞リンパ腫からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
16. 前記Ｂ細胞腫瘍が非ホジキンリンパ腫である、請求項１５に記載の方法。
17. 治療タンパク質または化学療法処置を投与する工程をさらに包含し、該治療タンパク質が、抗体、免疫抱合体、抗体−免疫調節因子融合タンパク質、および抗体−毒素融合タンパク質からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
18. 前記治療タンパク質または前記化学療法処置を、前記ＩＬ−１５抗体の投与前に投与する、請求項１７に記載の方法。
19. 前記治療タンパク質または前記化学療法処置を、前記抗ＩＬ−１５抗体の投与と同時に投与する、請求項１７に記載の方法。
20. 前記治療タンパク質または前記化学療法処置を、前記抗ＩＬ−１５抗体の投与後に投与する、請求項１７に記載の方法。
21. 前記化学療法処置が、シクロホスファミド、エトポシド、ビンクリスチン、プロカルバジン、プレドニゾン、カルムスチン、ドキソルビシン、メトトレキサート、ブレオマイシン、デキサメタゾン、酪酸フェニル、ブロスタチン−１、およびロイコボリンからなる群より選択される少なくとも１つの薬物の投与からなる、請求項１７に記載の方法。
22. 前記治療組成物が、サイトカイン部分をさらに含み、該サイトカイン部分が、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、インターフェロン−γ、インターフェロン−β、およびインターフェロン−γからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
23. 前記治療タンパク質が、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、ヤマゴボウ抗菌（ａｎｔｉｂｉｒａｌ）タンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、およびシュードモナス内毒素からなる群より選択される毒素を含む免疫抱合体または抗体−毒素融合タンパク質である、請求項２２に記載の方法。
24. 前記免疫抱合体または前記抗体−毒素融合タンパク質が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、およびＣＤ２２からなる群より選択される抗原に結合する抗体または抗体フラグメントを含む、請求項２３に記載の方法。
25. 前記治療タンパク質が、免疫抱合体または融合タンパク質であり、前記免疫抱合体または融合タンパク質が、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、およびリンホトキシンからなる群より選択される免疫調節因子部分を含む、請求項２４に記載の方法。

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