CN101148476A - 炎症相关疾病靶向治疗融合蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程药物领域，涉及一种炎症相关疾病靶向治疗融合蛋白的构建与制备。本发明的特征在于针对补体激活位点设计制备了靶向补体免疫抑制蛋白CR2DAF，通过利用补体受体CR2作为“载体”，补体抑制物促衰变因子DAF作为“弹头”，将两者基因融合表达，构建了人源靶向补体抑制物CR2DAF，获得用于炎症治疗的基因工程靶向蛋白药物。本发明的特点在于，构建的靶向补体抑制物CR2DAF，有效提高了补体抑制物对炎症的治疗效果，降低其毒副作用，可作为新的类风湿性关节炎等炎症相关疾病靶向治疗的基因工程药物进行产业化开发和应用，为炎症的防治提供新的策略和产品。

Description

炎症相关疾病靶向治疗融合蛋白

技术领域

本发明属于基因工程药物领域，涉及一种可作为类风湿性关节炎等炎症相关疾病靶向治疗的基因工程药物的具有补体激活位点特异性的靶向补体免疫抑制融合蛋白CR2DAF的构建与制备。

背景技术

炎症是人类疾病中最常见而复杂的病理过程，可以发生于机体的任何部位和任何组织，炎症也是人类最早认识的疾病现象，随着现代分子生物学理论和技术的发展和应用，对炎症的认识也有了长足的进步。预防和治疗炎症及相关综合症始终是医学领域的棘手问题，炎症也严重威胁着人类的健康。例如类风湿性关节炎(RA)在全世界被视为影响人类健康的五大疾病(心血管病、关节炎病、阿尔茨海默病、癌症及艾滋病)之一，它是一种以关节病变为主，能引起肢体严重畸形的慢性、全身性、免疫性疾病。使数以百万计的病人丧失生活和工作能力，严重的还会导致死亡。据WHO提供的数字，全球有1％的人患有类风湿性关节炎病，据卫生部第二次国家卫生服务调查结果统计，我国类风湿性关节炎患病率为0.34％～0.36％，全国约有400～500万类风湿性关节炎患者，因此，类风湿性关节炎(RA)也是严重危害我国人民健康的疾病之一。

目前已有大量的研究表明类风湿性关节炎(RA)是免疫系统调节功能紊乱所致的炎症反应性疾病[Baecklund E，Iliadou A，Askling J，Ekbom A，BacklinC，Granath F，Catrina AI，Rosenquist R，Feltelius N，Sundstrom C，Klareskog L.Association of chronic inflammation，not its treatment，with increased lymphomarisk in rheumatoid arthritis.Arthritis Rheum.2006 Mar；54(3)：692-701.]，不仅有体液免疫紊乱，细胞免疫紊乱亦参与作用。RA的滑膜及其附近组织有淋巴细胞和浆细胞浸润，滑液中有变性的IgG和类风湿因子组成的免疫复合物，由于免疫复合物沉积在关节滑膜上，激活了机体的补体系统，使大量的中性粒细胞向滑膜和关节腔内渗入引起炎症。但在炎症及相关综合症的治疗和预防方面，目前还没有特效的药物及方法。提高疗效的关键在于不断寻找疾病治疗的新靶位及新途径。对于炎症发生机制与调控因素的研究并有针对性进行药物设计，是目前研究的重要领域。

现已有很多证据证明炎症的发生与补体的激活[Molina H.Complementand immunity.Rheum Dis Clin North Am.2004 Feb；30(1)：1-18]，尤其是类风湿性关节炎、红斑狼疮、中风以及创伤引起的神经损伤等多种疾病的炎症反应均与补体系统的激活有关[Molina H.Complement and immunity.Rheum DisClin North Am.2004 Feb；30(1)：1-18]。

补体系统的主要生理功能是促进吞噬和溶解靶细胞，因此，是机体免疫防御机制的重要组成部分，对消除外来抗原的侵害，维护机体内环境的平衡具有重要作用。但另一方面，在一些非免疫性因素的刺激下，补体系统的活化又可产生炎症反应，并影响凝血及纤溶系统，导致机体正常组织细胞的损伤。因此，补体既是生理性的防御物质，又是造成病理性损伤的介质。补体系统由34种以上蛋白质组成，经连锁相互反应产生不同的生物学效应，补体系统的激活为一种级联反应，但受到多种调节分子的严格控制，其反应的程度和单一成分的反应都是在生物反馈控制下而进行的，从而限制了活化的扩大化，以维持补体水平的平衡。调节作用包括两个方面，即自身衰变失活及一些抑制物的灭活作用。前者指已活化的补体分子均不稳定，如不及时与靶细胞膜结合即迅速衰变失活；后者是通过补体抑制物的作用而使已活化的分子失去活性。补体系统成分缺乏或异常活化均可导致疾病。

针对补体激活路径的多种补体抑制物蛋白正在研制中[Mollnes TE，Kirschfink M.Strategies of therapeutic complement inhibition.Mol Immunol.2006 Jan；43(1-2)：107-21.]，在治疗炎症性疾病临床研究中，均已取得很好的治疗效果。在美国已有CR1和抗C5a的单克隆抗体进入II、III期临床。美国纽约大学医学中心的Wang Yi利用胶原诱导的类风湿性关节炎小鼠模型，证明抗补体分子C5a的单克隆抗体对于炎症的预防和治疗均有显著作用[Wang Y，Kristan J，Hao L，Lenkoski CS，Shen Y，Matis LA.A role for complement inantibody-mediated inflammation：C5-deficient DBA/1 mice are resistant tocollagen-induced arthritis.J Immunol.2000 Apr 15；164(8)：4340-7.Wang Y，Rollins SA，Madri JA，Matis LA.Anti-C5 monoclonal antibody therapy preventscollagen-induced arthritis and ameliorates established disease.Proc Natl Acad SciUSA.1995 Sep 12；92(19)：8955-9]。美国科罗拉多大学健康科学中心Banda证实类风湿性关节炎小鼠在注射补体抑制物Crry-Ig后，不仅临床症状明显改善，并且自身抗体以及各种炎性因子均得到明显抑制[Banda NK，Kraus D，Vondracek A，Huynh LH，Bendele A，Holers VM，Arend WP.Mechanisms ofeffects of complement inhibition in murine collagen-induced arthritis.ArthritisRheum.2002 Nov；46(11)：3065-75]。

但上述系统性的补体抑制，虽然改善了炎症反应，由于补体系统是机体免疫防御机制的重要组成部分，同时全身性的补体抑制，也会造成感染等潜在的副作用。为了充分发挥抗炎药物的治疗作用，降低不良反应，人们正在积极探索只作用于炎症反应部位而无损于正常免疫系统的靶向治疗药物。

为了提高提出补体抑制蛋白的抗炎功能，同时又降低感染等潜在的副作用，我们设计了一种更为有效的策略：针对补体激活位点的靶向补体抑制物。本项研究通过CR2作为载体，补体抑制物作为“弹头”，将两者基因融合表达，构建了人源靶向补体抑制物CR2DAF，获得了针对炎症治疗的基因工程靶向蛋白，可有效提高补体抑制物的疗效，降低其毒副作用，为研究新的类风湿性关节炎等炎症相关疾病靶向治疗的基因工程药物奠定了基础。其依据是：C3分子的激活成分在补体激活位点具有调理素的作用，是各种C3受体的配体，其中之一就是CR2分子，表达于成熟B细胞和树突状细胞表面，其配体为iC3b、C3dg和C3d，均为C3分子的裂解成分，当C3分子激活时，其裂解成分C3b产生并沉积在激活细胞表面，并很快转化为无活性的iC3b，其进一步裂解为C3dg，于是在补体激活位点会产生和沉积大量的C3分子的产物，比如在各种人肾小球肾炎的肾小球就发现有大量C3分子的产物沉积。因此，利用CR2作为靶向载体，和补体激活抑制物进行连接，构建CR2介导的补体免疫抑制药物。我们已经构建了人源靶向补体抑制物CR2DAF，通过体外实验证明：靶向补体抑制物和非靶向补体抑制物相比，抑制补体介导的细胞裂解的效能大大提高，最高提高了20倍；动物实验证明：靶向补体抑制物CR2DAF可在免疫损害部位高度聚集；并且利用小鼠感染模型检测，靶向补体抑制物CR2DAF比非靶向系统补体抑制物造成感染的副作用降低了近10倍。我们同时进行了靶向补体抑制物在胶原诱导的类风湿性关节炎小鼠模型中的治疗效果的实验研究，也证明靶向补体抑制物对类风湿性关节炎有显著的治疗作用。上述工作显示运用基因工程技术构建表达靶向补体抑制物，可有效避免系统抑制物的缺点，对于研究和开发类风湿性关节炎的新的治疗方法开辟了新的途径。

发明内容

本发明的目的是设计并制备一种新型的具有补体靶向性的用于炎症治疗的融合蛋白。利用CR2作为靶向载体，和补体激活抑制物DAF进行连接(顺反结构)，构建了CR2DAF靶向补体免疫抑制蛋白。

本发明所构建的CR2DAF靶向补体免疫抑制蛋白，含有人源补体受体CR2和人源补体抑制物DAF，两者通过一个含有9个氨基酸的连接肽进行连接。

本发明将上述人源补体受体CR2、连接肽和人源补体抑制物DAF的基因融合，构建到真核表达载体pBM上，转染CHO细胞进行表达，用亲和层吸方法纯化融合蛋白。

本发明通过体外实验(补体裂解抑制、流式细胞分析、生物传感器亲和力分析等)和体内实验(生物学分布和免疫组化)，对所构建的CR2DAF靶向补体免疫抑制蛋白进行了药效学功能评价。体外实验证明：CR2DAF靶向补体抑制物和非靶向补体抑制物相比，抑制补体介导的细胞裂解的效能大大提高，最高提高了20倍。动物实验证明：靶向补体抑制物CR2DAF可在免疫损害部位高度聚集。利用小鼠感染模型检测，证明靶向补体抑制物CR2DAF比非靶向系统补体抑制物造成感染的副作用降低了近10倍。利用胶原诱导的类风湿性关节炎小鼠模型，证明靶向补体抑制物CR2DAF对类风湿性关节炎有显著的治疗作用。

本发明针对补体激活位点设计和研制的CR2DAF靶向补体抑制物可作为一种潜在的类风湿性关节炎治疗药物进行产业化研究和开发，并有可能应用于红斑狼疮、中风以及创伤引起的神经损伤等多种炎症性疾病的治疗。

附图说明

图1为CR2DAF蛋白的SDS-PAGE和WESTERN-BLOT结果

图2为CR2DAF和其配体C3分子的SPR亲和力实验

图3为CR2DAF的补体裂解抑制实验

图4为CR2DAF的小鼠体内生物学分布

图5为免疫荧光

具体实施方式

本发明提出的CR2DAF靶向补体免疫抑制蛋白的构建与制备实施方式如下：

首先克隆人源补体受体CR2和人源补体抑制物DAF基因，两者通过一个含有9个氨基酸的连接肽进行连接，将融合基因构建到真核表达载体pBM上，获得了含有目的基因的真核表达载体pBM-CR2DAF。接着将含有目的基因的真核表达载体pBM-CR2DAF转染CHO细胞，表达和纯化出CR2DAF融合蛋白。通过体外实验(补体裂解抑制、流式细胞分析、生物传感器亲和力分析等)和体内实验(生物学分布和免疫组化)，对所构建的CR2DAF靶向补体免疫抑制蛋白进行药效学功能评价。

本发明更详细的实施方法可参见实施例，本实施例是用于解释、而不是以任何方式限制本发明。

实施例1、人源补体受体CR2DAF基因的克隆和测序

1.1引物：P1：5’---CTA GCT AGC ATT TCT TGT GGC TCT CCT CCG---3’

         P2：5’---CTA GCT AGC CTA TTA TCT GCA TTC AGG TGG TGG GCC---3’

         L1：5’---GGA TCC GCC GCC ACCCGA CCC ACC TCC ACA TAC TGG CAT TTT GGT CCA---3’

         L2：5’---GGA GGT GGG TCG GGT GGC GGC GGA TCC GAC TGT GGC CTT CCC CCA G---3’

1.2通过重叠延伸PCR获得CR2DAF基因，克隆到pMD 18-T载体测序正确。

1.2.1合成CR2DAF基因

在GeneAmp PCR System 2400型PCR以上进行如下反应：

第一轮PCR分别合成CR2和DAF：

反应体系50μl：10×PCR buffer(without MgCL2)5μl，MgCL2(25mmol/L)5μl，dNTPs(10mmol/L)4μl，引物(P1/L1)(20μmol/L)1μl，引物(L2/P2)(20μmol/L)1μl，Taq DNA Polymerase(2.5U/μl)1μl，灭菌蒸馏水33μl(TaqDNA聚合酶、Buffer、dNTPs均购自于Tacara生物技术有限公司)。

反应条件：95℃1分钟(95℃1分钟，56℃1分钟，72℃30秒)循环30次，

72℃5分钟，4℃∞

第二轮PCR合成CR2DAF：

反应体系50μl：10×PCR buffer(without MgCL2)5μl，MgCL2(25mmol/L)5μl，dNTPs(10mmol/L)4μl，引物(3)(20μmol/L)1μl，引物(4)(20μmol/L)1μl，Taq DNA Polymerase(2.5U/μl)1μl，模板(CR2和DAF稀释10倍)1μl，灭菌蒸馏水32μl

反应条件：95℃1分钟(95℃1分钟，56℃1分钟，72℃1分钟)循环32次，

72℃ 10分钟，4℃∞

1.2.2纯化CR2DAF

取5μl CR2DAF跑1.2％琼脂糖凝胶电泳作分子量鉴定，之后将全部剩余CR2和DAF跑1.2％琼脂糖凝胶制备电泳，切胶，用博大泰克公司的PCR产物胶回收试剂盒，回收CR2DAF。步骤：紫外灯下切下CR2DAF亮带，放入1.5ml离心管，加入溶胶液700μl/100μg胶，12000rpm离心30s，重复离心一次，加入500μl washing buffer，12000rpm离心30s，重复空离心一次，加入35μl灭菌蒸馏水，37℃放置5分钟，12000rpm离心，既得纯化后的CR2和DAF溶液。

1.2.3插入连接pMD 18-T载体

取灭菌PCR管加入Ligation Solution I 5μl，灭菌双蒸水3μl，纯化后的CR2DAF1μl，pMD 18-T载体1μl，放16℃过夜。

1.2.4转化

无菌取100μl感受态细胞(DH5α菌株按《分子克隆》—科学出版社，第二版的CaCl2方法制备)，至于冰浴中，加入连接产物10μl，轻轻旋转以混匀内容物，在冰浴中放置30分钟，立即转移到42℃水浴中静置2分钟，然后每管加入0.5ml不加抗生素的LB培养基，37℃水浴15分钟后，37℃摇床轻摇45分钟；取200μl转化菌体，均匀涂布于含有100mg/ml氨苄的琼脂平板培养基上，在超净工作台吹干约10分钟，37℃倒置培养过夜。从平板中挑取菌落约10个，分别接种于含100mg/ml氨苄LB培养基中(5ml/管)，37℃摇床培养过夜。

1.2.5菌落PCR初步鉴定CR2DAF

取0.5μl过夜培养菌10倍稀释液用PCR法进行初步鉴定，引物选用P6两端序列1.1和1.2。用PCR仪进行PCR扩增，扩增体系为：10×PCR Buffer(without MgCL2)2.5μl，MgCL2(25mmol/L)2.5μl，P1、P2(均为20μmol/L)各0.5μl，dNTPs(2.5mM)2μl，Taq DNA聚合酶(2.5U/μl)0.5μl，加水至25μl。(Taq DNA聚合酶、Buffer、dNTPs均购自于Tacara生物技术有限公司)。扩增条件：95℃1分钟(95℃1分钟，56℃1分钟，72℃1分钟)循环30次，72℃10分钟，4℃∞

1.2.6挑两个菌测序

挑取2号和6号菌去三博公司测序，结果两者均含有正确的靶向分子的基因。

1.2.7用碱变性法提取测序正确的质粒pMD 18-T-CR2DAF

按照博大泰克公司质粒快速提取试剂盒的说明操作：(1)收集菌液于1.5ml灭菌Eppendorf管中，12000rpm离心，去掉上清；(2)加入150μl溶液I，振荡至彻底悬浮；(3)加入150μl溶液II，立即轻柔颠倒数次，使菌体裂解，室温放置1-2分钟；(4)加入300μl溶液III，立即轻柔颠倒数次，室温放置5分钟，12000rpm离心12分钟；(5)向离心吸附柱中预先加入400μl结合缓冲液，然后加入上步离心的上清，混匀，12000rpm离心30秒，废液弃去；(6)加入750μl离心漂洗液于离心吸附柱中，12000rpm离心30秒，废液弃去；(7)重复一次第6步，然后空离心2分钟，彻底去除漂洗液；(8)小心取出离心吸附柱，将其放入备好的1.5ml灭菌Eppendorf管中，加入35μl灭菌蒸馏水，37℃放置2-5分钟，12000rpm离心30秒，取掉吸附柱，获取的质粒溶液于-20℃保存。

1.2.8 CR2DAF基因和氨基酸序列，全长1530bp

ATT TCT TGT GGC TCT CCT CCG CCT ATC CTA AAT GGC CGG ATT AGT 45

I   S   C   G   S   P   P   P   I   L   N   G   R   I   S

TAT TAT TCT ACC CCC ATT GCT GTT GGT ACC GTG ATA AGG TAG AGT 90

Y   Y   S   T   P   I   A   V   G   T   V   I   R   Y   S

TGT TCA GGT ACC TTC CGC CTC ATT GGA GAA AAA AGT CTA TTA TGC 135

C   S   G   T   F   R   L   I   G   E   K   S   L   L   C

ATA ACT AAA GAC AAA GTG GAT GGA ACC TGG GAT AAA CCT GCT CCT 180

I   T   K   D   K   V   D   G   T   W   D   K   P   A   P

AAA TGT GAA TAT TTC AAT AAA TAT TCT TCT TGC CCT GAG CCC ATA 225

K   C   E   Y   F   N   K   Y   S   S   C   P   E   P   I

GTA CCA GGA GGA TAC AAA ATT AGA GGC TCT ACA CCC TAC AGA CAT 270

V   P   G   G   Y   K   I   R   G   S   T   P   Y   R   H

GGT GAT TCT GTG ACA TTT GCC TGT AAA ACC AAC TTC TCC ATG AAC 315

G   D   S   V   T   F   A   C   K   T   N   F   S   M   N

GGA AAC AAG TCT GTT TGG TGT CAA GCA AAT AAT ATG TGG GGG CCG 360

G   N   K   S   V   W   C   Q   A   N   N   M   W   G   P

ACA CGA CTA CCA ACC TGT GTA AGT GTT TTC CCT CTC GAG TGT CCA 405

T   R   L   P   T   C   V   S   V   F   P   L   E   C   P

GCA CTT CCT ATG ATC CAC AAT GGA CAT CAC ACA AGT GAG AAT GTT 450

A   L   P   M   I   H   N   G   H   H   T   S   E   N   V

GGC TCC ATT GCT CCA GGA TTG TCT GTG ACT TAC AGC TGT GAA TCT 495

G   S   I   A   P   G   L   S   V   T   Y   S   C   E   S

GGT TAC TTG CTT GTT GGA GAA AAG ATC ATT AAC TGT TTG TCT TCG 540

G   Y   L   L   V   G   E   K   I   I   N   C   L   S   S

GGA AAA TGG AGT GCT GTC CCC CCC ACA TGT GAA GAG GCA CGC TGT 585

G   K   W   S   A   V   P   P   T   C   E   E   A   R   C

AAA TCT CTA GGA CGA TTT CCC AAT GGG AAG GTA AAG GAG CCT CCA 630

K   S   L   G   R   F   P   N   G   K   V   K   E   P   P

ATT CTC CGG GTT GGT GTA ACT GCA AAC TTT TTC TGT GAT GAA GGG 675

I   L   R   V   G   V   T   A   N   F   F   C   D   E   G

TAT CGA CTG CAA GGC CCA CCT TCT AGT CGG TGT GTA ATT GCT GGA 720

Y   R   L   Q   G   P   P   S   S   R   C   V   I   A   G

CAG GGA GTT GCT TGG ACC AAA ATG CCA GTA TGT GGA GGT GGG TCG 765

Q   G   V   A   W   T   K   M   P   V   C   G   G   G   S

GGT GGC GGC GGA TCC GAC TGT GGC CTT CCC CCA GAT GTA CCT AAT 810

G   G   G   G   S   D   C   G   L   P   P   D   V   P   N

GCC CAG CCA GCT TTG GAA GGC CGT ACA AGT TTT CCC GAG GAT ACT 855

A   Q   P   A   L   E   G   R   T   S   F   P   E   D   T

GTA ATA ACG TAC AAA TGT GAA GAA AGC TTT GTG AAA ATT CCT GGC 900

V   I   T   Y   K   C   E   E   S   F   V   K   I   P   G

GAG AAG GAC TCA GTG ATC TGC CTT AAG GGC AGT CAA TGG TCA GAT 945

E   K   D   S   V   I   C   L   K   G   S   Q   W   S   D

ATT GAA GAG TTC TGC AAT CGT AGC TGC GAG GTG CCA ACA AGG CTA 990

I   E   E   F   C   N   R   S   C   E   V   P   T   R   L

AAT TCT GCA TCC CTC AAA CAG CCT TAT ATC ACT CAG AAT TAT TTT 1035

N   S   A   S   L   K   Q   P   Y   I   T   Q   N   Y   F

CCA GTC GGT ACT GTT GTG GAA TAT GAG TGC CGT CCA GGT TAC AGA 1080

P   V   G   T   V   V   E   Y   E   C   R   P   G   Y   R

AGA GAA CCT TCT CTA TCA CCA AAA CTA ACT TGC CTT CAG AAT TTA 1125

R   E   P   S   L   S   P   K   L   T   C   L   Q   N   L

AAA TGG TCC ACA GCA GTC GAA TTT TGT AAA AAG AAA TCA TGC CCT 1170

K   W   S   T   A   V   E   F   C   K   K   K   S   C   P

AAT CCG GGA GAA ATA CGA AAT GGT CAG ATT GAT GTA CCA GGT GGC 1215

N   P   G   E   I   R   N   G   Q   I   D   V   P   G   G

ATA TTA TTT GGT GCA ACC ATC TCC TTC TCA TGT AAC ACA GGG TAC 1260

I   L   F   G   A   T   I   S   F   S   C   N   T   G   Y

AAA TTA TTT GGC TCG ACT TCT AGT TTT TGT CTT ATT TCA GGC AGC 1305

K   L   F   G   S   T   S   S   F   C   L   I   S   G   S

TCT GTC CAG TGG AGT GAC CCG TTG CCA GAG TGC AGA GAA ATT TAT 1350

S   V   Q   W   S   D   P   L   P   E   C   R   E   I   Y

TGT CCA GCA CCA CCA CAA ATT GAC AAT GGA ATA ATT CAA GGG GAA 1395

C   P   A   P   P   Q   I   D   N   G   I   I   Q   G   E

CGT GAC CAT TAT GGA TAT AGA CAG TCT GTA ACG TAT GCA TGT AAT 1440

R   D   H   Y   G   Y   R   Q   S   V   T   Y   A   C   N

AAA GGA TTC ACC ATG ATT GGA GAG CAC TCT ATT TAT TGT ACT GTG 1485

K   G   F   T   M   I   G   E   H   S   I   Y   C   T   V

AAT AAT GAT GAA GGA GAG TGG AGT GGC CCA CCA CCT GAA TGC AGA 1530

N   N   D   E   G   E   W   S   G   P   P   P   E   C   R

实施例2、pBM-CR2DAF真核表达载体的构建

我室构建了真核表达载体PBM，CMV启动子，G418筛选，在克隆位点NheI前插入信号肽(sig)序列，在信号肽下游插入靶向分子CR2DAF的基因序列，就可以获得pBM-CR2DAF真核表达载体。

酶切：上述用碱变性法提取的质粒pMD 18-T-CR2DAF和我室构建的pBM载体质粒，分别用NheI酶切。酶切体系：5μl的10×NEBbuffer3，10u/μl的NheI 2μl，100×BSA 0.5μl，质粒30μl，加水至总体积50μl，37℃水浴8小时。酶切后产物割胶回收目的片段，具体方法同上参见1.2.2纯化CR2DAF一项。

插入连接：取灭菌PCR管加入双酶切纯化后的质粒pBM片段和CR2DAF基因片段各1μl，10×T4 DNA连接缓冲液1μl，T4 DNA连接酶(12u/μl)1μl，加灭菌双蒸水至10μl，16℃过夜。

转化：具体步骤同上参见1.2.4转化

鉴定：具体步骤同上参见1.2.5菌落PCR，和1.2.6

酶切鉴定：用上述碱变性法提取的质粒pBM-CR2DAF，用NheI酶切。酶切体系：2μl的10×NEBbuffer3，20u/μl的NheI 1μl，10×BSA 2μl，质粒14μl，总体积20μl，37℃水浴6小时。产物取15μl进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。

基因测序鉴定：基因测序证明有正确的CR2DAF基因插入pBM通用载体中，至此，获得了正确的pBM-CR2DAF。用promega公司的质粒提取试剂盒WizardPureFection Plasmid DNA Purification System提取转染级质粒pBM-CR2DAF。

实施例3、CR2DAF的表达与纯化

用上述载体pBM-CR2DAF转染CHO细胞，筛选获得稳定表达CR2DAF的CHO细胞株。转染步骤按Invitrogen公司的Lipofectamine2000 Reagent说明书进行。分别取1μg质粒，用无双抗DMEM培养基稀释到250μl，为A液；另取7μl Lipofectamine2000用无双抗DMEM培养基稀释到250μl，为B液，将B液室温放置5分钟后，立即将A液B液轻轻混匀，为C液，室温放置20分钟。取出96孔板用新鲜培养基洗一次后，每孔加入0.1ml新鲜培养基。将C液分别加入到各孔中，混匀，置CO2培养箱培养。转染48小时后，至细胞密度达到50-70％融合时，弃培养液，换用含有G-418(400μg/ml)培养基进行抗性筛选，同时用未转染的细胞作对照。当对照细胞几乎全部死亡时，G-418的浓度降至200μg/ml以维持筛选作用。待2wk左右出现阳性细胞克隆时，挑取阳性细胞克隆稀释扩大培养进行后续筛选实验。取上清用ELISA方法鉴定蛋白表达水平(anti-DAF mAb 1H4和多抗为鉴定抗体)。稳定表达CR2DAF的CHO细胞株用DMEM培养基培养5～7天，收集上清，利用标记anti-DAF mAb 1H4的亲和柱进行纯化，SDS-PAGE和WESTERN-BLOT进行鉴定，结果见图1所示。

实施例4、CR2DAF和其配体C3分子的亲和力实验

采用表面等离子共振(SPR)技术，定量检测CR2DAF和其配体C3分子结合的亲和力和相关动力学(解离常数(Kd)和结合常数(Ka))的检测与应用。仪器采用BIAcore 3000(Biacore AB，Uppsala，Sweden)，人源C3dg-biotin固定于传感器亲和素streptavidin标记的芯片上，缓冲液为0.5×PBS(pH 7.4)含0.05％Tween 20，CR2DAF蛋白浓度测定范围为15.6-500nM，具体操作参阅仪器说明书。所有的实验数据用BlAevaluation软件(version4，1，Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden)分析，BIAevaluation软件所采用的数值积分算法对初始参数的设置很敏感，容易造成拟合数据与真实值之间的偏差，偏差的产生一般是由于溶液中物质到芯片表面的传质效应以及结合位点的异质性，为了尽量减小或避免偏差，我们用直接的全局曲线拟合方法(globally fiting)分析数据，我们分别用1∶1 Langmuir模型(式1)对SPR响应曲线进行拟合，根据残差分布随机而且A，值小的原则评判合适的动力学模型。通过软件分析和计算得到CR2DAF与C3dg结合的结合速率常数(Ka＝2.07×10⁴ M^-1S^-1)，以及解离速率常数(Kd＝1.16×10^-1S^-1)。用Biacore的SPR技术分析CR2DAF与C3dg相互作用的传感图见图2。

实施例5、CR2DAF的补体裂解抑制实验

DMEM培养基悬浮CHO细胞至浓度106，然后加入10％兔抗CHO细胞膜抗血清，4℃孵浴30分钟，离心去上清，15％正常人血清(NHS)悬浮CHO细胞，同时加入不同浓度CR2DAF蛋白，37℃孵浴60分钟，胎盘蓝染色，计算细胞存活率。结果显示：靶向补体抑制物CR2DAF和非靶向补体抑制物DAF相比，保护补体介导的细胞裂解的效能提高了20倍。不同浓度CR2DAF蛋白抑制补体介导的细胞裂解见图3。

实施例6、CR2DAF的小鼠体内生物学分布

I125标记靶向补体抑制物CR2DAF和非靶向补体抑制物DAF，分别通过尾静脉注射入雌性NZB/W F1小鼠(自发性红斑狼疮肾炎小鼠模型，8周龄未发病，34周龄发病)，24小时和48小时分离小鼠各脏器，进行体内生物学分布评价，结果显示靶向补体抑制物CR2DAF在有肾炎的肾组织高度聚集，在非肾炎的肾组织则没有聚集性，非靶向补体抑制物DAF在有肾炎的肾组织和非肾炎的肾组织都没有聚集性。说明靶向补体抑制物CR2DAF对于炎症损害部位具有很好的靶向作用。结果见图4。

实施例7、免疫荧光

靶向补体抑制物CR2DAF和非靶向补体抑制物DAF，分别通过尾静脉注射入24周龄肾小球肾炎MRL/lpr小鼠，24小时分离肾组织，抗人DAF单克隆抗体1H4和抗鼠IgG-FITC进行反应，荧光显微镜检测，结果显示靶向补体抑制物CR2DAF高度聚集于炎性肾小球(图5a)，未见非靶向补体抑制物DAF聚集于炎性肾小球(图5b)，证明靶向补体抑制物CR2DAF对于炎症损害部位具有明确的靶向作用。结果见图5。

Claims (8)

1.一种可作为类风湿性关节炎等炎症相关疾病靶向治疗的具有补体激活位点特异性的靶向补体免疫抑制蛋白CR2DAF的构建与制备。

2.按照权利要求1靶向补体抑制蛋白CR2DAF，含有人源补体受体CR2和人源补体抑制物DAF，两者通过一个含有9个氨基酸的连接肽进行连接。

3.按照权利要求2，靶向补体抑制蛋白中的人源补体受体CR2，作为靶向载体，与补体C3d分子结合。

4.按照权利要求2，靶向补体抑制蛋白中的源补体抑制物DAF，作为效应分子，抑制补体的激活途径。

5.按照权利要求2，靶向补体抑制蛋白中含有9个氨基酸的连接肽，连接人源补体受体CR2和人源补体抑制物DAF，有利于使上述两种分子各自保持生物学活性。

6.按照权利要求1靶向补体抑制蛋白CR2DAF，也可以以核酸形式发挥作用。

7.按照权利要求1靶向补体抑制蛋白CR2DAF，也可以将其中的靶向分子CR2、连接肽、效应分子DAF进行改造或用其它分子进行替换发挥作用。

8.按照权利要求1靶向补体抑制蛋白CR2DAF的制备方法，其特征在于：

1)首先克隆人源补体受体CR2和人源补体抑制物DAF基因，两者通过一个含有45个氨基酸的连接肽进行连接，将融合基因构建到真核表达载体pBM上，获得了含有目的基因的真核表达载体pBM-CR2DAF。

2)接着将含有目的基因的真核表达载体pBM-CR2DAF转染CHO细胞，表达和纯化出CR2DAF融合蛋白。

3)通过体外实验(补体裂解抑制、流式细胞分析、生物传感器亲和力分析等)和体内实验(生物学分布和免疫组化)，对所构建的CR2DAF靶向补体免疫抑制蛋白进行药效学功能评价。

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