CN104231085A

CN104231085A - 靶向特异性补体系统抑制剂、其制备方法及应用

Info

Publication number: CN104231085A
Application number: CN201410114646.2A
Authority: CN
Inventors: 胡维国; 乔倩; 张鑫
Original assignee: Fudan University Shanghai Cancer Center
Current assignee: Shanghai Kang Jing Bio Medical Science and Technology Co., Ltd.
Priority date: 2013-09-05
Filing date: 2014-03-25
Publication date: 2014-12-24
Anticipated expiration: 2034-03-25
Also published as: AU2014317705A1; US20160326231A1; JP2016535062A; AU2014317705B2; WO2015032167A1; CN104231085B; US9862757B2

Abstract

本发明属生物制药领域，具体涉及靶向特异性补体系统抑制剂,还包括靶向特异性补体抑制剂的设计、制备和临床应用。本发明通过能与补体成分C3激活后形成的片段C3b和/或iC3b结合而产生靶向作用的CRIg，与具有补体抑制效果的另一组分例如H因子（factor H）直接相连或利用柔性肽段（Gly4Ser）3等方式间接相连，通过基因工程等方法制备一种融合蛋白，最终达到靶向性抑制补体激活的效果。该类型药物可应用于多种与补体异常激活有关的人类疾病的治疗和预防。

Description

靶向特异性补体系统抑制剂、其制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术和制药领域，具体涉及靶向特异性补体抑制剂的设计、制备和临床应用。

背景技术

补体系统是固有免疫的主要组成部分，也是获得性免疫的重要调节者，发挥着重要的免疫监视作用，不仅可以清楚入侵的病原菌微生物和宿主细胞碎片，还可以协调整个免疫和炎症过程（Ricklin D et al.,Nat Immunol2010;11:785-797;Morgan BP et al.,Immunology letters2005;97:171-179）。补体可通过经典途径、替补途径及凝集素途径激活，其发挥生理功能主要通过激活后形成的产物进行，包括C3b/iC3b沉积于被攻击细胞膜表面，招募单核细胞等免疫效应细胞通过吞噬作用而清除靶细胞；C3a/C4a/C5a等过敏毒素引起局部炎症；以及补体膜攻击复合物（Membrane Attack Complex,MAC，即C5b-9n）在靶细胞膜表面形成孔洞而最终裂解靶细胞。在此过程中，为了防止补体激活后对正常宿主细胞的“误伤”效应，机体在进化过程中形成了10余种调控蛋白，包括存在于血液循环中的C1-INH（C1inhibitor，C1抑制蛋白）、C4BP（C4binding protein，C4结合蛋白）、factor I（I因子）、factor H（H因子）、S-protein（S蛋白）和Clusterin（簇集蛋白）；以及表达与细胞膜表面的补体膜调控蛋白CD35/CR1、CD46/MCP、CD55/DAF和CD59（Zhou,X.,et al.,The Oncologist2008;13:954-966），以及近期发现的另一种补体膜调控蛋白CRIg（Helmy KY et al.,Cell.2006;124:915-927;Wiesmann C et al.,Nature,2006,444:217-220），在补体酶级联反应的不同阶段抑制补体的激活，使得补体系统在激活和抑制之间维持一种精妙的平衡，机体处于健康状况。但是，这种平衡一旦被打破，人体的很多疾病的发生、发展和治疗均与此密切相关，例如大量研究表明，补体系统的过度激活不同程度不同阶段参与其他疾病的发生与发展，例如自身溶血性贫血、自身免疫性血小板减少、再生障碍性贫血、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、动脉粥样硬化、帕金森氏病、阿尔茨海默病（老年性痴呆）、哮喘、过敏、银屑病、重症肌无力、多发性硬化、克隆氏肠病等。因此，以补体系统为治疗靶点的药物研发，包括补体系统抑制剂重新受到重视（Ricklin D et al.,Nat Immunol2010;11:785-797），研发补体系统抑制剂，尤其是靶向性抑制剂具有巨大的社会和经济价值。

研发补体系统抑制剂在领域内经过了数十年的探索，包括与C3结合的蛋白质Compastatin（Georgopoulos LJ,et al.,Mol Immunol,2009;46:2911-7）以及抗C5的重组单抗Eculizumab（依库珠，Soliris，由亚力兄制药公司Alexion Pharmaceuticals生产）（Rother RP et al.,Nat Biotechnol,2007;25:1256-1264），但仍然存在一些明显的不足。Compastatin已经进入临床前期试验，但是由于抑制所有部位C3的功能而存在潜在的导致感染的风险。另外，尽管依库珠已经成功用于治疗治疗阵发性睡眠性（夜间）血红蛋白尿（Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria，PNH），但知识产权为国外拥有，价格异常昂贵，使用一年的价格是409,500美元，2009年，Soliris销售额为2.95亿美元，2010年销售额5.41亿美元。PNH是一种后天获得性溶血性疾病,主要由于PIG-A基因的突变导致CD55和CD59这两种正常通过糖基磷肌酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol,GPI）锚定于红细胞膜上的补体膜调控蛋白不再锚定于PNH患者的血细胞膜上,所以PNH患者的血细胞对补体的攻击异常敏感，极易产生白细胞下降导致的感染、红细胞破裂造成的溶血，以及血小板被激活，最终导致反复感染、溶血、血栓形成、肾功能衰竭、骨髓衰竭和肺动脉压升高等，疾病进行性加重，在依库珠单抗出现之前基本无药可治，从而严重威胁患者的生命（Parker C et al.,Blood,2005;106:3699-3709）。依库珠的作用机理是与C5结合后，在补体级联反应的末期抑制补体的激活，从而阻止MAC在血细胞膜上的沉积和对血细胞尤其是对红细胞的裂解，临床上对PNH患者的治疗收到了较好的疗效，显著减少血栓形成，66%的患者在治疗一年内不需再输血（Kelly RJ et al.,Blood,2011;117:6786-6792）。然而，理论上应用依库珠单抗后PNH患者的病情仍然无法得到完全缓解，因为补体级联反应的C3水平仍然存在激活，产生C3b/iC3b并沉积与血细胞表面，使这些血细胞被单核细胞吞噬，最终造成血管外溶血（Risitano AM et al.,Blood,2009;113:4094-4100），这也是依库珠单抗治疗并不十分满意的原因。因此，在补体激活更早期的C3水平，而不是像依库珠单抗的末期C5水平，阻止补体的激活，将有效同时阻止MAC介导的血管内和C3b/iC3b介导的血管外溶血，从而产生更好的疗效。

发明内容

本发明的目的是提供一种靶向特异性补体抑制剂。

本发明的另一个目的是提供上述靶向特异性补体抑制剂在制备抑制补体激活药剂中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明经过数以千记的实验和反复的测试，发现CRIg可以用于作为本发明靶向特异性补体抑制剂的基础。

CRIg最早发现表达于巨噬细胞膜表面的一种C3b/iC3b受体，结合后可吞噬病原体或其他颗粒（Helmy KY et al.,Cell.2006;124:915-927）。进一步结构生物学研究还发现CRIg可通过特异性识别C3b并抑制C3转换酶的激活，从而在补体级联反应的早期即产生抑制效应——这种抑制作用为针对补体的替补激活途径，但其抑制效果低于经典的补体替补途径抑制剂factor H；同时，CRIg的功能位点位于胞外区（Wiesmann C et al.,Nature,2006,444:217-220）。查阅发现至今未有CRIg用于补体抑制的应用报道，更未有利用其与C3b/iC3b结合的特性研发靶向性补体抑制剂的报道。

本发明利用CRIg这两种独特的特性，克隆其胞外功能区基因并与其他补体调控蛋白融合表达，制备成一种通过CRIg与C3b/iC3b特异性结合的靶向作用，把重组联接的补体调控蛋白运送至局部补体激活部位，从而达到抑制补体激活，预防或治疗疾病的目的。CRIg的胞外功能部位的基因序列见序列表的SEQ ID NO9，氨基酸序列见序列表SEQ ID NO10。另外，与CRIg相连的其他部分包括所有能抑制补体激活的成分，例如补体调控蛋白C1-INH、C4BP、factor I、factor H、S-protein、Clusterin、CD35/CR1、CD46/MCP、CD55/DAF和CD59、甚至CRIg本身等的全长或部分序列，其中相连的方式包括直接相连，以及通过其他物理、化学和生物等手段通过其他分子间接相连。

本发明以CRIg功能性胞外区与fH功能区直接或通过柔性连接肽(Ser1Gly4)3间接相连为例，描述该重组蛋白CRIg-fH及CRIg-L-fH的靶向补体抑制效果。

本发明提供了一种蛋白质，它编码具有抑制补体激活功能的蛋白，并且包含CRIg和补体抑制剂的序列。

CRIg与不同的补体抑制剂，包括存在于血液循环中的C1-INH（C1inhibitor，C1抑制蛋白）、C4BP（C4binding protein，C4结合蛋白）、factor I（I因子）、factor H（H因子）、S-protein（S蛋白）和Clusterin（簇集蛋白）；以及表达与细胞膜表面的补体膜调控蛋白CD35/CR1、CD46/MCP、CD55/DAF和CD59甚至CRIg本身，以及其他具有补体抑制功能的物质进行连接。

CRIg与其他补体抑制剂的连接方式，包括：

（1）CRIg与其他补体抑制剂直接相连，两者之间没有任何其他连接物。

（2）CRIg与其他补体抑制剂通过生物方法连接。

（3）CRIg与其他补体抑制剂通过化学方法连接。

例如，该蛋白质由CRIg和factor H组成。

在本发明的一个实施例中，该蛋白质由CRIg胞外区、factor H以及两者间的连接物组成。

所述的补体抑制功能区可以是factor H、C1-INH、C4BP、factor I、S-protein、Clusterin、CD35/CR1、CD46/MCP、CD55/DAF、CD59或者CRIg的功能片段或全长。

在本发明的另一个实施例中，该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO2或者SEQ ID NO4所示。

本发明提供了编码上述蛋白质的核酸。

较好的，其核苷酸编码序列如SEQ ID NO1或者SEQ ID NO3所示。

本发明还提供了一种含上述核酸的载体。以CRIg-fH和CRIg-（Gly4Ser）3–fH为例，该载体含有核酸的碱基序列如SEQ ID NO1或者SEQ ID NO3所示。

本发明还提供了一种含上述核酸的细胞。

本发明的蛋白质可以利用基因工程技术，连接CRIg蛋白质和factor H蛋白质；

所述的CRIg蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO6所示；

所述的factor H蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO8所示。

也可以按照蛋白质的序列依次连接氨基酸残基。

本发明的核酸也可以利用基因工程技术，连接CRIg蛋白质和factor H蛋白质的编码序列；或者按照核酸的序列依次连接碱基。

本发明提供了靶向特异性补体系统抑制剂，即上述蛋白质在制备抑制补体激活的药物中的应用。也可以用于制备保护细胞免受补体攻击并提高红细胞压积的药物。

本发明提供了上述蛋白质在制备保护阵发性夜间血红蛋白尿患者血细胞的药物中的应用，也可用于制备其他疾病中使遭受补体攻击的细胞免受补体攻击的药物或者药剂。

另一方面，本发明提供了一种药物，所述药物的活性成分为上述蛋白质，即含有CRIg和factor H的功能域。

例如，该药物是抑制补体激活的药物。

又如，该药物产生含有氨基酸序列如SEQ ID NO2或者SEQ ID NO4所示的蛋白质。

上述药物的给药方式包括：

（1）直接给药。

（2）通过能携带或表达该药物的载体系统给药。

本发明通过能与补体成分C3激活后形成的片段C3b和/或iC3b结合而产生靶向作用的CRIg，与具有补体抑制效果的另一组分例如H因子（factor H）直接或利用柔性肽段（Gly4Ser）3等方式相连，通过基因工程的方法制备一种融合蛋白，最终达到靶向性抑制补体激活的效果。该类型药物可应用于多种与补体异常激活有关的人类疾病的治疗和预防。

附图说明

图1为CRIg-fH和CRIg-L-fH的表达与纯化。

图2为CRIg-L-fH与C3活化和降解产物C3b、iC3b、C3c、C3d相互作用的动力学分析和结合力测定。

图3为CRIg-fH与C3活化和降解产物C3b、iC3b、C3c、C3d相互作用的动力学分析和结合力测定。

图4为CRIg-L-fH对补体替补途径诱导的七例PNH患者红细胞的溶血起保护作用。

图5为CRIg-L-fH对补体经典途径诱导的七例PNH患者红细胞的溶血起保护作用。

图6为CRIg-L-fH对Thy-1N大鼠肾炎引发的血清尿素氮升高病理症状的缓解作用。

图7为CRIg-L-fH对Thy-1N大鼠肾炎引发的血清肌酐升高病理症状的缓解作用。

图8为CRIg-L-fH对Thy-1N大鼠肾炎引发的尿液总蛋白渗漏病理症状的缓解作用。

图9为CRIg-L-fH对Thy-1N大鼠肾炎引发的血尿病理症状的缓解作用。

图10为免疫荧光检测各组大鼠肾脏冰冻切片的IgG、C3片段、MAC和CRIg-L-fH的沉积。

其中，*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001;n=4。

具体实施方式

实施例1

CRIg-fH及CRIg-L-fH蛋白表达载体的构建、真核表达和纯化

1.仪器与材料：

Mastercycler pro-Eppendorf PCR仪（德国Eppendorf公司），DK-8D型电热恒温水槽（上海精宏实验设备有限公司），IQ350凝胶成像系统（美国GE Healthcare公司），CO₂细胞培养箱（美国Thermo Scientific公司），FR-980A生物电泳图像分析系统（复日科技公司）、BioRAD Mini protein Tera system（美国BioRAD公司）、NanoVue RNA/DNA浓度/纯度检测仪（德国IKA公司）

2.实验方法：

2.1基因克隆和载体构建

Trizol法（invitrogen）提取人淋巴瘤U937细胞的总RNA，反转录为cDNA（promegareverse transcription kit），PCR扩增CRIg基因的胞外结构域（G19-K137）；Trizol法提取人肝癌细胞系Hep3B细胞的总RNA，反转录后PCR扩增factorH基因的SCR1-5结构域（E19-K323）。

设计同时包含CRIg胞外结构域和factor H SCR1-5结构域以及linker序列(L,(Ser₁Gly₄)₃)（TCTGGTGGCGGTGGCTCCGGCGGAGGTGGGTCCGGTGGCGGCGGA）的引物，应用重叠PCR（Overlapping PCR）的方法将CRIg胞外结构域基因和factorH SCR1-5基因连接起来，插入到pHLsec真核表达载体中，双向测序鉴定插入序列，载体命名为pHLsec-CRIg-fH和pHLsec-CRIg-L-fH。

CRIg核酸序列(SEQ ID NO5)

ATGGGGATCTTACTGGGCCTGCTACTCCTGGGGCACCTAACAGTGGACACTTATGGCCGTCCCATCCTGGAAGTGCCAGAGAGTGTAACAGGACCTTGGAAAGGGGATGTGAATCTTCCCTGCACCTATGACCCCCTGCAAGGCTACACCCAAGTCTTGGTGAAGTGGCTGGTACAACGTGGCTCAGACCCTGTCACCATCTTTCTACGTGACTCTTCTGGAGACCATATCCAGCAGGCAAAGTACCAGGGCCGCCTGCATGTGAGCCACAAGGTTCCAGGAGATGTATCCCTCCAATTGAGCACCCTGGAGATGGATGACCGGAGCCACTACACGTGTGAAGTCACCTGGCAGACTCCTGATGGCAACCAAGTCGTGAGAGATAAGATTACTGAGCTCCGTGTCCAGAAACTCTCTGTCTCCAAGCCCACAGTGACAACTGGCAGCGGTTATGGCTTCACGGTGCCCCAGGGAATGAGGATTAGCCTTCAATGCCAGGCTCGGGGTTCTCCTCCCATCAGTTATATTTGGTATAAGCAACAGACTAATAACCAGGAACCCATCAAAGTAGCAACCCTAAGTACCTTACTCTTCAAGCCTGCGGTGATAGCCGACTCAGGCTCCTATTTCTGCACTGCCAAGGGCCAGGTTGGCTCTGAGCAGCACAGCGACATTGTGAAGTTTGTGGTCAAAGACTCCTCAAAGCTACTCAAGACCAAGACTGAGGCACCTACAACCATGACATACCCCTTGAAAGCAACATCTACAGTGAAGCAGTCCTGGGACTGGACCACTGACATGGATGGCTACCTTGGAGAGACCAGTGCTGGGCCAGGAAAGAGCCTGCCTGTCTTTGCCATCATCCTCATCATCTCCTTGTGCTGTATGGTGGTTTTTACCATGGCCTATATCATGCTCTGTCGGAAGACATCCCAACAAGAGCATGTCTACGAAGCAGCCAGGGCACATGCCAGAGAGGCCAACGACTCTGGAGAAACCATGAGGGTGGCCATCTTCGCAAGTGGCTGCTCCAGTGATGAGCCAACTTCCCAGAATCTGGGCAACAACTACTCTGATGAGCCCTGCATAGGACAGGAGTACCAGATCATCGCCCAGATCAATGGCAACTACGCCCGCCTGCTGGACACAGTTCCTCTGGATTATGAGTTTCTGGCCACTGAGGGCAAAAGTGTCTGTTAA

CRIg蛋白序列(SEQ ID NO6)

MGILLGLLLLGHLTVDTYGRPILEVPESVTGPWKGDVNLPCTYDPLQGYTQVLVKWLVQRGSDPVTIFLRDSSGDHIQQAKYQGRLHVSHKVPGDVSLQLSTLEMDDRSHYTCEVTWQTPDGNQVVRDKITELRVQKLSVSKPTVTTGSGYGFTVPQGMRISLQCQARGSPPISYIWYKQQTNNQEPIKVATLSTLLFKPAVIADSGSYFCTAKGQVGSEQHSDIVKFVVKDSSKLLKTKTEAPTTMTYPLKATSTVKQSWDWTTDMDGYLGETSAGPGKSLPVFAIILIISLCCMVVFTMAYIMLCRKTSQQEHVYEAARAHAREANDSGETMRVAIFASGCSSDEPTSQNLGNNYSDEPCIGQEYQIIAQINGNYARLLDTVPLDYEFLATEGKSVC

Factor H核酸序列(SEQ ID NO7)

ATGAGACTTCTAGCAAAGATTATTTGCCTTATGTTATGGGCTATTTGTGTAGCAGAAGATTGCAATGAACTTCCTCCAAGAAGAAATACAGAAATTCTGACAGGTTCCTGGTCTGACCAAACATATCCAGAAGGCACCCAGGCTATCTATAAATGCCGCCCTGGATATAGATCTCTTGGAAATGTAATAATGGTATGCAGGAAGGGAGAATGGGTTGCTCTTAATCCATTAAGGAAATGTCAGAAAAGGCCCTGTGGACATCCTGGAGATACTCCTTTTGGTACTTTTACCCTTACAGGAGGAAATGTGTTTGAATATGGTGTAAAAGCTGTGTATACATGTAATGAGGGGTATCAATTGCTAGGTGAGATTAATTACCGTGAATGTGACACAGATGGATGGACCAATGATATTCCTATATGTGAAGTTGTGAAGTGTTTACCAGTGACAGCACCAGAGAATGGAAAAATTGTCAGTAGTGCAATGGAACCAGATCGGGAATACCATTTTGGACAAGCAGTACGGTTTGTATGTAACTCAGGCTACAAGATTGAAGGAGATGAAGAAATGCATTGTTCAGACGATGGTTTTTGGAGTAAAGAGAAACCAAAGTGTGTGGAAATTTCATGCAAATCCCCAGATGTTATAAATGGATCTCCTATATCTCAGAAGATTATTTATAAGGAGAATGAACGATTTCAATATAAATGTAACATGGGTTATGAATACAGTGAAAGAGGAGATGCTGTATGCACTGAATCTGGATGGCGTCCGTTGCCTTCATGTGAAGAAAAATCATGTGATAATCCTTATATTCCAAATGGTGACTACTCACCTTTAAGGATTAAACACAGAACTGGAGATGAAATCACGTACCAGTGTAGAAATGGTTTTTATCCTGCAACCCGGGGAAATACAGCAAAATGCACAAGTACTGGCTGGATACCTGCTCCGAGATGTACCTTGAAACCTTGTGATTATCCAGACATTAAACATGGAGGTCTATATCATGAGAATATGCGTAGACCATACTTTCCAGTAGCTGTAGGAAAATATTACTCCTATTACTGTGATGAACATTTTGAGACTCCGTCAGGAAGTTACTGGGATCACATTCATTGCACACAAGATGGATGGTCGCCAGCAGTACCATGCCTCAGAAAATGTTATTTTCCTTATTTGGAAAATGGATATAATCAAAATCATGGAAGAAAGTTTGTACAGGGTAAATCTATAGACGTTGCCTGCCATCCTGGCTACGCTCTTCCAAAAGCGCAGACCACAGTTACATGTATGGAGAATGGCTGGTCTCCTACTCCCAGATGCATCCGTGTCAAAACATGTTCCAAATCAAGTATAGATATTGAGAATGGGTTTATTTCTGAATCTCAGTATACATATGCCTTAAAAGAAAAAGCGAAATATCAATGCAAACTAGGATATGTAACAGCAGATGGTGAAACATCAGGATCAATTACATGTGGGAAAGATGGATGGTCAGCTCAACCCACGTGCATTAAATCTTGTGATATCCCAGTATTTATGAATGCCAGAACTAAAAATGACTTCACATGGTTTAAGCTGAATGACACATTGGACTATGAATGCCATGATGGTTATGAAAGCAATACTGGAAGCACCACTGGTTCCATAGTGTGTGGTTACAATGGTTGGTCTGATTTACCCATATGTTATGAAAGAGAATGCGAACTTCCTAAAATAGATGTACACTTAGTTCCTGATCGCAAGAAAGACCAGTATAAAGTTGGAGAGGTGTTGAAATTCTCCTGCAAACCAGGATTTACAATAGTTGGACCTAATTCCGTTCAGTGCTACCACTTTGGATTGTCTCCTGACCTCCCAATATGTAAAGAGCAAGTACAATCATGTGGTCCACCTCCTGAACTCCTCAATGGGAATGTTAAGGAAAAAACGAAAGAAGAATATGGACACAGTGAAGTGGTGGAATATTATTGCAATCCTAGATTTCTAATGAAGGGACCTAATAAAATTCAATGTGTTGATGGAGAGTGGACAACTTTACCAGTGTGTATTGTGGAGGAGAGTACCTGTGGAGATATACCTGAACTTGAACATGGCTGGGCCCAGCTTTCTTCCCCTCCTTATTACTATGGAGATTCAGTGGAATTCAATTGCTCAGAATCATTTACAATGATTGGACACAGATCAATTACGTGTATTCATGGAGTATGGACCCAACTTCCCCAGTGTGTGGCAATAGATAAACTTAAGAAGTGCAAATCATCAAATTTAATTATACTTGAGGAACATTTAAAAAACAAGAAGGAATTCGATCATAATTCTAACATAAGGTACAGATGTAGAGGAAAAGAAGGATGGATACACACAGTCTGCATAAATGGAAGATGGGATCCAGAAGTGAACTGCTCAATGGCACAAATACAATTATGCCCACCTCCACCTCAGATTCCCAATTCTCACAATATGACAACCACACTGAATTATCGGGATGGAGAAAAAGTATCTGTTCTTTGCCAAGAAAATTATCTAATTCAGGAAGGAGAAGAAATTACATGCAAAGATGGAAGATGGCAGTCAATACCACTCTGTGTTGAAAAAATTCCATGTTCACAACCACCTCAGATAGAACACGGAACCATTAATTCATCCAGGTCTTCACAAGAAAGTTATGCACATGGGACTAAATTGAGTTATACTTGTGAGGGTGGTTTCAGGATATCTGAAGAAAATGAAACAACATGCTACATGGGAAAATGGAGTTCTCCACCTCAGTGTGAAGGCCTTCCTTGTAAATCTCCACCTGAGATTTCTCATGGTGTTGTAGCTCACATGTCAGACAGTTATCAGTATGGAGAAGAAGTTACGTACAAATGTTTTGAAGGTTTTGGAATTGATGGGCCTGCAATTGCAAAATGCTTAGGAGAAAAATGGTCTCACCCTCCATCATGCATAAAAACAGATTGTCTCAGTTTACCTAGCTTTGAAAATGCCATACCCATGGGAGAGAAGAAGGATGTGTATAAGGCGGGTGAGCAAGTGACTTACACTTGTGCAACATATTACAAAATGGATGGAGCCAGTAATGTAACATGCATTAATAGCAGATGGACAGGAAGGCCAACATGCAGAGACACCTCCTGTGTGAATCCGCCCACAGTACAAAATGCTTATATAGTGTCGAGACAGATGAGTAAATATCCATCTGGTGAGAGAGTACGTTATCAATGTAGGAGCCCTTATGAAATGTTTGGGGATGAAGAAGTGATGTGTTTAAATGGAAACTGGACGGAACCACCTCAATGCAAAGATTCTACAGGAAAATGTGGGCCCCCTCCACCTATTGACAATGGGGACATTACTTCATTCCCGTTGTCAGTATATGCTCCAGCTTCATCAGTTGAGTACCAATGCCAGAACTTGTATCAACTTGAGGGTAACAAGCGAATAACATGTAGAAATGGACAATGGTCAGAACCACCAAAATGCTTACATCCGTGTGTAATATCCCGAGAAATTATGGAAAATTATAACATAGCATTAAGGTGGACAGCCAAACAGAAGCTTTATTCGAGAACAGGTGAATCAGTTGAATTTGTGTGTAAACGGGGATATCGTCTTTCATCACGTTCTCACACATTGCGAACAACATGTTGGGATGGGAAACTGGAGTATCCAACTTGTGCAAAAAGATAG

FactorH蛋白序列(SEQ ID NO8)

MRLLAKIICLMLWAICVAEDCNELPPRRNTEILTGSWSDQTYPEGTQAIYKCRPGYRSLGNVIMVCRKGEWVALNPLRKCQKRPCGHPGDTPFGTFTLTGGNVFEYGVKAVYTCNEGYQLLGEINYRECDTDGWTNDIPICEVVKCLPVTAPENGKIVSSAMEPDREYHFGQAVRFVCNSGYKIEGDEEMHCSDDGFWSKEKPKCVEISCKSPDVINGSPISQKIIYKENERFQYKCNMGYEYSERGDAVCTESGWRPLPSCEEKSCDNPYIPNGDYSPLRIKHRTGDEITYQCRNGFYPATRGNTAKCTSTGWIPAPRCTLKPCDYPDIKHGGLYHENMRRPYFPVAVGKYYSYYCDEHFETPSGSYWDHIHCTQDGWSPAVPCLRKCYFPYLENGYNQNHGRKFVQGKSIDVACHPGYALPKAQTTVTCMENGWSPTPRCIRVKTCSKSSIDIENGFISESQYTYALKEKAKYQCKLGYVTADGETSGSITCGKDGWSAQPTCIKSCDIPVFMNARTKNDFTWFKLNDTLDYECHDGYESNTGSTTGSIVCGYNGWSDLPICYERECELPKIDVHLVPDRKKDQYKVGEVLKFSCKPGFTIVGPNSVQCYHFGLSPDLPICKEQVQSCGPPPELLNGNVKEKTKEEYGHSEVVEYYCNPRFLMKGPNKIQCVDGEWTTLPVCIVEESTCGDIPELEHGWAQLSSPPYYYGDSVEFNCSESFTMIGHRSITCIHGVWTQLPQCVAIDKLKKCKSSNLIILEEHLKNKKEFDHNSNIRYRCRGKEGWIHTVCINGRWDPEVNCSMAQIQLCPPPPQIPNSHNMTTTLNYRDGEKVSVLCQENYLIQEGEEITCKDGRWQSIPLCVEKIPCSQPPQIEHGTINSSRSSQESYAHGTKLSYTCEGGFRISEENETTCYMGKWSSPPQCEGLPCKSPPEISHGVVAHMSDSYQYGEEVTYKCFEGFGIDGPAIAKCLGEKWSHPPSCIKTDCLSLPSFENAIPMGEKKDVYKAGEQVTYTCATYYKMDGASNVTCINSRWTGRPTCRDTSCVNPPTVQNAYIVSRQMSKYPSGERVRYQCRSPYEMFGDEEVMCLNGNWTEPPQCKDSTGKCGPPPPIDNGDITSFPLSVYAPASSVEYQCQNLYQLEGNKRITCRNGQWSEPPKCLHPCVISREIMENYNIALRWTAKQKLYSRTGESVEFVCKRGYRLSSRSHTLRTTCWDGKLEYPTCAKR

CRIg胞外结构域

核酸序列（357bps）(SEQ ID NO9)

ggccgtcccatcctggaagtgccagagagtgtaacaggaccttggaaaggggatgtgaatcttccctgcacctatgaccccctgcaaggctacacccaagtcttggtgaagtggctggtacaacgtggctcagaccctgtcaccatctttctacgtgactcttctggagaccatatccagcaggcaaagtaccagggccgcctgcatgtgagccacaaggttccaggagatgtatccctccaattgagcaccctggagatggatgaccggagccactacacgtgtgaagtcacctggcagactcctgatggcaaccaagtcgtgagagataagattactgagctccgtgtccagaaa

蛋白序列（119aa）(SEQ ID NO10)

GRPILEVPESVTGPWKGDVNLPCTYDPLQGYTQVLVKWLVQRGSDPVTIFLRDSSGDHIQQAKYQGRLHVSHKVPGDVSLQLSTLEMDDRSHYTCEVTWQTPDGNQVVRDKITELRVQK

FactorH SCR1-5结构域

核酸序列（915bp）(SEQ ID NO11)

gaagattgcaatgaacttcctccaagaagaaatacagaaattctgacaggttcctggtctgaccaaacatatccagaaggcacccaggctatctataaatgccgccctggatatagatctcttggaaatgtaataatggtatgcaggaagggagaatgggttgctcttaatccattaaggaaatgtcagaaaaggccctgtggacatcctggagatactccttttggtacttttacccttacaggaggaaatgtgtttgaatatggtgtaaaagctgtgtatacatgtaatgaggggtatcaattgctaggtgagattaattaccgtgaatgtgacacagatggatggaccaatgatattcctatatgtgaagttgtgaagtgtttaccagtgacagcaccagagaatggaaaaattgtcagtagtgcaatggaaccagatcgggaataccattttggacaagcagtacggtttgtatgtaactcaggctacaagattgaaggagatgaagaaatgcattgttcagacgatggtttttggagtaaagagaaaccaaagtgtgtggaaatttcatgcaaatccccagatgttataaatggatctcctatatctcagaagattatttataaggagaatgaacgatttcaatataaatgtaacatgggttatgaatacagtgaaagaggagatgctgtatgcactgaatctggatggcgtccgttgccttcatgtgaagaaaaatcatgtgataatccttatattccaaatggtgactactcacctttaaggattaaacacagaactggagatgaaatcacgtaccagtgtagaaatggtttttatcctgcaacccggggaaatacagcaaaatgcacaagtactggctggatacctgctccgagatgtaccttgaaa

蛋白序列（305aa）(SEQ ID NO12)

EDCNELPPRRNTEILTGSWSDQTYPEGTQAIYKCRPGYRSLGNVIMVCRKGEWVALNPLRKCQKRPCGHPGDTPFGTFTLTGGNVFEYGVKAVYTCNEGYQLLGEINYRECDTDGWTNDIPICEVVKCLPVTAPENGKIVSSAMEPDREYHFGQAVRFVCNSGYKIEGDEEMHCSDDGFWSKEKPKCVEISCKSPDVINGSPISQKIIYKENERFQYKCNMGYEYSERGDAVCTESGWRPLPSCEEKSCDNPYIPNGDYSPLRIKHRTGDEITYQCRNGFYPATRGNTAKCTSTGWIPAPRCTLK

1.1真核蛋白表达系统的建立

取对数生长期的293FT细胞，以每皿1.2X10⁷的细胞密度均匀铺在直径15cm的细胞培养皿中，PEI法分别转染pHLsec-CRIg-fH和pHLsec-CRIg-L-Fh大抽质粒，在37℃，5%CO₂培养箱中培养6小时后更换293表达培养基（invitrogen），继续培养三天后收取细胞上清，离心去除细胞及细胞碎片。

1.2蛋白亲和纯化、透析和蔗糖浓缩

应用Ni²⁺柱亲和纯化的方法，将细胞上清中CRIg-fH和CRIg-L-fH纯化洗脱至洗脱缓冲液中，转移至透析管中（Novagen），透析法将缓冲液更换为PBS，蔗糖法吸水浓缩后再用PBS透析。

2.实验结果：

通过上述方法应用真核系统诱导表达和纯化得到CRIg-fH和CRIg-L-fH两种融合蛋白，PAGE电泳检测为单一条带（图1），浓缩后浓度可达到1～2mg/ml。

所涉及相关序列如下：

CRIg-fH核酸序列(SEQ ID NO1)

ATGGGCCGTCCCATCCTGGAAGTGCCAGAGAGTGTAACAGGACCTTGGAAAGGGGATGTGAATCTTCCCTGCACCTATGACCCCCTGCAAGGCTACACCCAAGTCTTGGTGAAGTGGCTGGTACAACGTGGCTCAGACCCTGTCACCATCTTTCTACGTGACTCTTCTGGAGACCATATCCAGCAGGCAAAGTACCAGGGCCGCCTGCATGTGAGCCACAAGGTTCCAGGAGATGTATCCCTCCAATTGAGCACCCTGGAGATGGATGACCGGAGCCACTACACGTGTGAAGTCACCTGGCAGACTCCTGATGGCAACCAAGTCGTGAGAGATAAGATTACTGAGCTCCGTGTCCAGAAAGAAGATTGCAATGAACTTCCTCCAAGAAGAAATACAGAAATTCTGACAGGTTCCTGGTCTGACCAAACATATCCAGAAGGCACCCAGGCTATCTATAAATGCCGCCCTGGATATAGATCTCTTGGAAATGTAATAATGGTATGCAGGAAGGGAGAATGGGTTGCTCTTAATCCATTAAGGAAATGTCAGAAAAGGCCCTGTGGACATCCTGGAGATACTCCTTTTGGTACTTTTACCCTTACAGGAGGAAATGTGTTTGAATATGGTGTAAAAGCTGTGTATACATGTAATGAGGGGTATCAATTGCTAGGTGAGATTAATTACCGTGAATGTGACACAGATGGATGGACCAATGATATTCCTATATGTGAAGTTGTGAAGTGTTTACCAGTGACAGCACCAGAGAATGGAAAAATTGTCAGTAGTGCAATGGAACCAGATCGGGAATACCATTTTGGACAAGCAGTACGGTTTGTATGTAACTCAGGCTACAAGATTGAAGGAGATGAAGAAATGCATTGTTCAGACGATGGTTTTTGGAGTAAAGAGAAACCAAAGTGTGTGGAAATTTCATGCAAATCCCCAGATGTTATAAATGGATCTCCTATATCTCAGAAGATTATTTATAAGGAGAATGAACGATTTCAATATAAATGTAACATGGGTTATGAATACAGTGAAAGAGGAGATGCTGTATGCACTGAATCTGGATGGCGTCCGTTGCCTTCATGTGAAGAAAAATCATGTGATAATCCTTATATTCCAAATGGTGACTACTCACCTTTAAGGATTAAACACAGAACTGGAGATGAAATCACGTACCAGTGTAGAAATGGTTTTTATCCTGCAACCCGGGGAAATACAGCAAAATGCACAAGTACTGGCTGGATACCTGCTCCGAGATGTACCTTGAAATAA

CRIg-fH蛋白序列(SEQ ID NO2)

MGRPILEVPESVTGPWKGDVNLPCTYDPLQGYTQVLVKWLVQRGSDPVTIFLRDSSGDHIQQAKYQGRLHVSHKVPGDVSLQLSTLEMDDRSHYTCEVTWQTPDGNQVVRDKITELRVQKEDCNELPPRRNTEILTGSWSDQTYPEGTQAIYKCRPGYRSLGNVIMVCRKGEWVALNPLRKCQKRPCGHPGDTPFGTFTLTGGNVFEYGVKAVYTCNEGYQLLGEINYRECDTDGWTNDIPICEVVKCLPVTAPENGKIVSSAMEPDREYHFGQAVRFVCNSGYKIEGDEEMHCSDDGFWSKEKPKCVEISCKSPDVINGSPISQKIIYKENERFQYKCNMGYEYSERGDAVCTESGWRPLPSCEEKSCDNPYIPNGDYSPLRIKHRTGDEITYQCRNGFYPATRGNTAKCTSTGWIPAPRCTLKStop

CRIg-L-fH核酸序列(SEQ ID NO3)

ATGGGCCGTCCCATCCTGGAAGTGCCAGAGAGTGTAACAGGACCTTGGAAAGGGGATGTGAATCTTCCCTGCACCTATGACCCCCTGCAAGGCTACACCCAAGTCTTGGTGAAGTGGCTGGTACAACGTGGCTCAGACCCTGTCACCATCTTTCTACGTGACTCTTCTGGAGACCATATCCAGCAGGCAAAGTACCAGGGCCGCCTGCATGTGAGCCACAAGGTTCCAGGAGATGTATCCCTCCAATTGAGCACCCTGGAGATGGATGACCGGAGCCACTACACGTGTGAAGTCACCTGGCAGACTCCTGATGGCAACCAAGTCGTGAGAGATAAGATTACTGAGCTCCGTGTCCAGAAATCTGGTGGCGGTGGCTCCGGCGGAGGTGGGTCCGGTGGCGGCGGAGAAGATTGCAATGAACTTCCTCCAAGAAGAAATACAGAAATTCTGACAGGTTCCTGGTCTGACCAAACATATCCAGAAGGCACCCAGGCTATCTATAAATGCCGCCCTGGATATAGATCTCTTGGAAATGTAATAATGGTATGCAGGAAGGGAGAATGGGTTGCTCTTAATCCATTAAGGAAATGTCAGAAAAGGCCCTGTGGACATCCTGGAGATACTCCTTTTGGTACTTTTACCCTTACAGGAGGAAATGTGTTTGAATATGGTGTAAAAGCTGTGTATACATGTAATGAGGGGTATCAATTGCTAGGTGAGATTAATTACCGTGAATGTGACACAGATGGATGGACCAATGATATTCCTATATGTGAAGTTGTGAAGTGTTTACCAGTGACAGCACCAGAGAATGGAAAAATTGTCAGTAGTGCAATGGAACCAGATCGGGAATACCATTTTGGACAAGCAGTACGGTTTGTATGTAACTCAGGCTACAAGATTGAAGGAGATGAAGAAATGCATTGTTCAGACGATGGTTTTTGGAGTAAAGAGAAACCAAAGTGTGTGGAAATTTCATGCAAATCCCCAGATGTTATAAATGGATCTCCTATATCTCAGAAGATTATTTATAAGGAGAATGAACGATTTCAATATAAATGTAACATGGGTTATGAATACAGTGAAAGAGGAGATGCTGTATGCACTGAATCTGGATGGCGTCCGTTGCCTTCATGTGAAGAAAAATCATGTGATAATCCTTATATTCCAAATGGTGACTACTCACCTTTAAGGATTAAACACAGAACTGGAGATGAAATCACGTACCAGTGTAGAAATGGTTTTTATCCTGCAACCCGGGGAAATACAGCAAAATGCACAAGTACTGGCTGGATACCTGCTCCGAGATGTACCTTGAAATAA

CRIg-L-fH蛋白序列(SEQ ID NO4)

MGRPILEVPESVTGPWKGDVNLPCTYDPLQGYTQVLVKWLVQRGSDPVTIFLRDSSGDHIQQAKYQGRLHVSHKVPGDVSLQLSTLEMDDRSHYTCEVTWQTPDGNQVVRDKITELRVQKSGGGGSGGGGSGGGGEDCNELPPRRNTEILTGSWSDQTYPEGTQAIYKCRPGYRSLGNVIMVCRKGEWVALNPLRKCQKRPCGHPGDTPFGTFTLTGGNVFEYGVKAVYTCNEGYQLLGEINYRECDTDGWTNDIPICEVVKCLPVTAPENGKIVSSAMEPDREYHFGQAVRFVCNSGYKIEGDEEMHCSDDGFWSKEKPKCVEISCKSPDVINGSPISQKIIYKENERFQYKCNMGYEYSERGDAVCTESGWRPLPSCEEKSCDNPYIPNGDYSPLRIKHRTGDEITYQCRNGFYPATRGNTAKCTSTGWIPAPRCTLKStop

实施例2CRIg-fH及CRIg-L-fH与C3活化和降解片段相互作用的动力学分析和亲和力测定

1.仪器与材料：

Biacore T200(GE Healthcare)、Series S Sensor Chip NTA、CRIg-L-fH蛋白溶液、C3活化和降解的蛋白组分(C3b、iC3b、C3c、C3d,Complement Technology)、HBS-N溶液(GEHealthcare)

2.实验方法

表达纯化的CRIg-L-fH用HBS-N running buffer稀释为0.2ug/ml作为配体偶联在NTA芯片上，C3fragments以一系列浓度梯度稀释（如图所示）作为流动的分析物，应用BiacoreT200仪器测定动力学曲线并经过Biacore T200Software v2.02分析。亲和常数、解离常数和平衡解离常数如表1所示。

表1

3.实验结果显示，CRIg-L-fH和CRIg-fH与C3b、iC3b和C3c都有不同程度的结合，但是CRIg-L-fH的结合力更强，因此后续的功能实验和动物模型选用CRIg-L-fH。

实施例3

CRIg-L-fH保护PNH红细胞免受补体替补途径和经典途径诱导的溶血反应

1.仪器与材料：

七例PNH患者红细胞、正常人血清、CVF（1mg/ml，comptech公司）、抗人红细胞多抗（Rockland）、Bio-Tek synergy HT多功能酶标仪（芬兰Labsystems公司）、Minispin台式高速离心机（德国Eppendorf公司）、DK-8D型电热恒温水槽（上海精宏实验设备有限公司）

2.实验方法：

2.1CRIg-L-fH对补体替补途径诱导的PNH红细胞溶血的抑制作用

七例PNH患者末端采血收集红细胞，PBS洗三遍（5000rpm，离心3min），配成4%RBC溶液；200ul反应体系，加入4%RBC25ul（终浓度1%），CRIg-L-fH蛋白溶液倍比稀释后加入体系构建终浓度为0-3μM的系列浓度梯度，CVF（100μg/ml）4μl，正常人血清20ul（10%终浓度），同时设置blank和total lysis的对照，37℃水浴30min，10,000rpm离心1min，取100ul上清，酶标仪检测OD414nm吸光值。

2.2CRIg-L-fH对补体经典途径诱导的PNH红细胞溶血的抑制作用

七例PNH患者末端采血收集红细胞，PBS洗三遍（5,000rpm，离心3min），配成4%RBC溶液；200μl反应体系，加入4%RBC25μl（终浓度1%），CRIg-L-fH蛋白溶液倍比稀释后加入体系构建终浓度为0-3μM的系列浓度梯度，anti-human RBC antibody（5mg/ml）2ul，正常人血清20μl（10%终浓度），同时设置blank和total lysis的对照，37°C水浴30min，10,000rpm离心1min，取100μl上清，酶标仪检测OD414nm吸光值。

2.3统计学处理方法

数据用均数±标准差（mean±SD）表示。图表绘制应用Excel软件。

3.实验结果：

体外溶血实验结果表明，CRIg-L-fH蛋白对补体的替补途径和经典途径诱导的PNH红细胞溶血都有一定的抑制作用，其中对于补体替补途径的抑制作用更为显著。

实施例4

CRIg-L-fH对Thy-1N大鼠肾炎症状的缓解作用

1.仪器与材料：

Bio-Tek synergy HT多功能酶标仪（芬兰Labsystems公司）、激光共聚焦显微镜FV500（日本Olympus公司）、BCA蛋白定量试剂盒（Thermo Fisher）、Cobas6000analyzer(Roche)、SD大鼠、anti-C3b/iC3b-FITC抗体、anti-SC5b-9抗体、anti-His抗体、rabbit anti-mouseIgG-FITC抗体

2.实验方法：

2.1Thy-1大鼠肾炎模型的建立

SD大鼠饲养于SP级动物房，用标准饲料和饮水喂养至约200g体重。大鼠随机分为三组，NRS组腹腔注射正常兔血清（1ml/100g体重），ATS组腹腔注射大鼠胸腺细胞抗血清（1ml/100g体重），CRIg-L-fH/ATS组腹腔注射大鼠胸腺抗血清并尾静脉注射CRIg-L-fH（10mg/kg体重）。

2.2各组大鼠肾炎指标的检测

注射后，三组大鼠饲养于大鼠代谢笼，分别于注射后24、48、72小时尾静脉采集血液并收集每个时间点的24小时尿液。应用全自动生化分析仪检测各时间点各组血清中的尿素氮和肌酐。应用BCA蛋白定量试剂盒检测尿液中的总蛋白含量，应用多功能酶标仪检测尿液中的血红蛋白（OD414nm吸光值）。

2.3免疫荧光检测各组大鼠肾脏冰冻切片的IgG、C3片段、CRIg-L-fH的沉积

乙醚麻醉后颈椎脱臼法处死大鼠，取左侧肾脏，PBS冲洗，液氮短暂固定后，OCT包埋、冰冻切片。4%多聚甲醛固定15min，PBS漂洗。10%正常羊血清封闭，分别用anti-C3b/iC3b、anti-His、anti-SC5b-9抗体4度孵育过夜。次日，PBS漂洗三遍后二抗孵育。PBS漂洗，封片，镜检。

3.实验结果：

CRIg-L-fH治疗的Thy-1N大鼠相比未治疗组血清中的尿素氮和肌酐含量下降，尿液中的蛋白总量和血红蛋白量减少，同时有大量的CRIg-L-fH沉积在肾小球系膜去，并且几乎没有C3b/iC3b的沉积，可见CRIg-L-fH能一定程度的缓解大鼠的Th-1N肾炎症状。

SEQUENCE LISTING

<110> 复旦大学附属肿瘤医院

<120> 靶向特异性补体系统抑制剂、其制备方法及应用

<130> 201386

<160> 12

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 1278

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 1

atgggccgtc ccatcctgga agtgccagag agtgtaacag gaccttggaa aggggatgtg 60

aatcttccct gcacctatga ccccctgcaa ggctacaccc aagtcttggt gaagtggctg 120

gtacaacgtg gctcagaccc tgtcaccatc tttctacgtg actcttctgg agaccatatc 180

cagcaggcaa agtaccaggg ccgcctgcat gtgagccaca aggttccagg agatgtatcc 240

ctccaattga gcaccctgga gatggatgac cggagccact acacgtgtga agtcacctgg 300

cagactcctg atggcaacca agtcgtgaga gataagatta ctgagctccg tgtccagaaa 360

gaagattgca atgaacttcc tccaagaaga aatacagaaa ttctgacagg ttcctggtct 420

gaccaaacat atccagaagg cacccaggct atctataaat gccgccctgg atatagatct 480

cttggaaatg taataatggt atgcaggaag ggagaatggg ttgctcttaa tccattaagg 540

aaatgtcaga aaaggccctg tggacatcct ggagatactc cttttggtac ttttaccctt 600

acaggaggaa atgtgtttga atatggtgta aaagctgtgt atacatgtaa tgaggggtat 660

caattgctag gtgagattaa ttaccgtgaa tgtgacacag atggatggac caatgatatt 720

cctatatgtg aagttgtgaa gtgtttacca gtgacagcac cagagaatgg aaaaattgtc 780

agtagtgcaa tggaaccaga tcgggaatac cattttggac aagcagtacg gtttgtatgt 840

aactcaggct acaagattga aggagatgaa gaaatgcatt gttcagacga tggtttttgg 900

agtaaagaga aaccaaagtg tgtggaaatt tcatgcaaat ccccagatgt tataaatgga 960

tctcctatat ctcagaagat tatttataag gagaatgaac gatttcaata taaatgtaac 1020

atgggttatg aatacagtga aagaggagat gctgtatgca ctgaatctgg atggcgtccg 1080

ttgccttcat gtgaagaaaa atcatgtgat aatccttata ttccaaatgg tgactactca 1140

cctttaagga ttaaacacag aactggagat gaaatcacgt accagtgtag aaatggtttt 1200

tatcctgcaa cccggggaaa tacagcaaaa tgcacaagta ctggctggat acctgctccg 1260

agatgtacct tgaaataa 1278

<210> 2

<211> 425

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 2

Met Gly Arg Pro Ile Leu Glu Val Pro Glu Ser Val Thr Gly Pro Trp

1 5 10 15

Lys Gly Asp Val Asn Leu Pro Cys Thr Tyr Asp Pro Leu Gln Gly Tyr

20 25 30

Thr Gln Val Leu Val Lys Trp Leu Val Gln Arg Gly Ser Asp Pro Val

35 40 45

Thr Ile Phe Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asp His Ile Gln Gln Ala Lys

50 55 60

Tyr Gln Gly Arg Leu His Val Ser His Lys Val Pro Gly Asp Val Ser

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Thr Leu Glu Met Asp Asp Arg Ser His Tyr Thr Cys

85 90 95

Glu Val Thr Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn Gln Val Val Arg Asp Lys

100 105 110

Ile Thr Glu Leu Arg Val Gln Lys Glu Asp Cys Asn Glu Leu Pro Pro

115 120 125

Arg Arg Asn Thr Glu Ile Leu Thr Gly Ser Trp Ser Asp Gln Thr Tyr

130 135 140

Pro Glu Gly Thr Gln Ala Ile Tyr Lys Cys Arg Pro Gly Tyr Arg Ser

145 150 155 160

Leu Gly Asn Val Ile Met Val Cys Arg Lys Gly Glu Trp Val Ala Leu

165 170 175

Asn Pro Leu Arg Lys Cys Gln Lys Arg Pro Cys Gly His Pro Gly Asp

180 185 190

Thr Pro Phe Gly Thr Phe Thr Leu Thr Gly Gly Asn Val Phe Glu Tyr

195 200 205

Gly Val Lys Ala Val Tyr Thr Cys Asn Glu Gly Tyr Gln Leu Leu Gly

210 215 220

Glu Ile Asn Tyr Arg Glu Cys Asp Thr Asp Gly Trp Thr Asn Asp Ile

225 230 235 240

Pro Ile Cys Glu Val Val Lys Cys Leu Pro Val Thr Ala Pro Glu Asn

245 250 255

Gly Lys Ile Val Ser Ser Ala Met Glu Pro Asp Arg Glu Tyr His Phe

260 265 270

Gly Gln Ala Val Arg Phe Val Cys Asn Ser Gly Tyr Lys Ile Glu Gly

275 280 285

Asp Glu Glu Met His Cys Ser Asp Asp Gly Phe Trp Ser Lys Glu Lys

290 295 300

Pro Lys Cys Val Glu Ile Ser Cys Lys Ser Pro Asp Val Ile Asn Gly

305 310 315 320

Ser Pro Ile Ser Gln Lys Ile Ile Tyr Lys Glu Asn Glu Arg Phe Gln

325 330 335

Tyr Lys Cys Asn Met Gly Tyr Glu Tyr Ser Glu Arg Gly Asp Ala Val

340 345 350

Cys Thr Glu Ser Gly Trp Arg Pro Leu Pro Ser Cys Glu Glu Lys Ser

355 360 365

Cys Asp Asn Pro Tyr Ile Pro Asn Gly Asp Tyr Ser Pro Leu Arg Ile

370 375 380

Lys His Arg Thr Gly Asp Glu Ile Thr Tyr Gln Cys Arg Asn Gly Phe

385 390 395 400

Tyr Pro Ala Thr Arg Gly Asn Thr Ala Lys Cys Thr Ser Thr Gly Trp

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Ile Pro Ala Pro Arg Cys Thr Leu Lys

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<210> 3

<211> 1323

<212> DNA

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gtacaacgtg gctcagaccc tgtcaccatc tttctacgtg actcttctgg agaccatatc 180

cagcaggcaa agtaccaggg ccgcctgcat gtgagccaca aggttccagg agatgtatcc 240

ctccaattga gcaccctgga gatggatgac cggagccact acacgtgtga agtcacctgg 300

cagactcctg atggcaacca agtcgtgaga gataagatta ctgagctccg tgtccagaaa 360

tctggtggcg gtggctccgg cggaggtggg tccggtggcg gcggagaaga ttgcaatgaa 420

cttcctccaa gaagaaatac agaaattctg acaggttcct ggtctgacca aacatatcca 480

gaaggcaccc aggctatcta taaatgccgc cctggatata gatctcttgg aaatgtaata 540

atggtatgca ggaagggaga atgggttgct cttaatccat taaggaaatg tcagaaaagg 600

ccctgtggac atcctggaga tactcctttt ggtactttta cccttacagg aggaaatgtg 660

tttgaatatg gtgtaaaagc tgtgtataca tgtaatgagg ggtatcaatt gctaggtgag 720

attaattacc gtgaatgtga cacagatgga tggaccaatg atattcctat atgtgaagtt 780

gtgaagtgtt taccagtgac agcaccagag aatggaaaaa ttgtcagtag tgcaatggaa 840

ccagatcggg aataccattt tggacaagca gtacggtttg tatgtaactc aggctacaag 900

attgaaggag atgaagaaat gcattgttca gacgatggtt tttggagtaa agagaaacca 960

aagtgtgtgg aaatttcatg caaatcccca gatgttataa atggatctcc tatatctcag 1020

aagattattt ataaggagaa tgaacgattt caatataaat gtaacatggg ttatgaatac 1080

agtgaaagag gagatgctgt atgcactgaa tctggatggc gtccgttgcc ttcatgtgaa 1140

gaaaaatcat gtgataatcc ttatattcca aatggtgact actcaccttt aaggattaaa 1200

cacagaactg gagatgaaat cacgtaccag tgtagaaatg gtttttatcc tgcaacccgg 1260

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taa 1323

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<212> PRT

<213> Artificial

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Gly Asn Val Ile Met Val Cys Arg Lys Gly Glu Trp Val Ala Leu Asn

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275 280 285

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210 215 220

Ile Val Lys Phe Val Val Lys Asp Ser Ser Lys Leu Leu Lys Thr Lys

225 230 235 240

Thr Glu Ala Pro Thr Thr Met Thr Tyr Pro Leu Lys Ala Thr Ser Thr

245 250 255

Val Lys Gln Ser Trp Asp Trp Thr Thr Asp Met Asp Gly Tyr Leu Gly

260 265 270

Glu Thr Ser Ala Gly Pro Gly Lys Ser Leu Pro Val Phe Ala Ile Ile

275 280 285

Leu Ile Ile Ser Leu Cys Cys Met Val Val Phe Thr Met Ala Tyr Ile

290 295 300

Met Leu Cys Arg Lys Thr Ser Gln Gln Glu His Val Tyr Glu Ala Ala

305 310 315 320

Arg Ala His Ala Arg Glu Ala Asn Asp Ser Gly Glu Thr Met Arg Val

325 330 335

Ala Ile Phe Ala Ser Gly Cys Ser Ser Asp Glu Pro Thr Ser Gln Asn

340 345 350

Leu Gly Asn Asn Tyr Ser Asp Glu Pro Cys Ile Gly Gln Glu Tyr Gln

355 360 365

Ile Ile Ala Gln Ile Asn Gly Asn Tyr Ala Arg Leu Leu Asp Thr Val

370 375 380

Pro Leu Asp Tyr Glu Phe Leu Ala Thr Glu Gly Lys Ser Val Cys

385 390 395

<210> 7

<211> 3696

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 7

atgagacttc tagcaaagat tatttgcctt atgttatggg ctatttgtgt agcagaagat 60

tgcaatgaac ttcctccaag aagaaataca gaaattctga caggttcctg gtctgaccaa 120

acatatccag aaggcaccca ggctatctat aaatgccgcc ctggatatag atctcttgga 180

aatgtaataa tggtatgcag gaagggagaa tgggttgctc ttaatccatt aaggaaatgt 240

cagaaaaggc cctgtggaca tcctggagat actccttttg gtacttttac ccttacagga 300

ggaaatgtgt ttgaatatgg tgtaaaagct gtgtatacat gtaatgaggg gtatcaattg 360

ctaggtgaga ttaattaccg tgaatgtgac acagatggat ggaccaatga tattcctata 420

tgtgaagttg tgaagtgttt accagtgaca gcaccagaga atggaaaaat tgtcagtagt 480

gcaatggaac cagatcggga ataccatttt ggacaagcag tacggtttgt atgtaactca 540

ggctacaaga ttgaaggaga tgaagaaatg cattgttcag acgatggttt ttggagtaaa 600

gagaaaccaa agtgtgtgga aatttcatgc aaatccccag atgttataaa tggatctcct 660

atatctcaga agattattta taaggagaat gaacgatttc aatataaatg taacatgggt 720

tatgaataca gtgaaagagg agatgctgta tgcactgaat ctggatggcg tccgttgcct 780

tcatgtgaag aaaaatcatg tgataatcct tatattccaa atggtgacta ctcaccttta 840

aggattaaac acagaactgg agatgaaatc acgtaccagt gtagaaatgg tttttatcct 900

gcaacccggg gaaatacagc aaaatgcaca agtactggct ggatacctgc tccgagatgt 960

accttgaaac cttgtgatta tccagacatt aaacatggag gtctatatca tgagaatatg 1020

cgtagaccat actttccagt agctgtagga aaatattact cctattactg tgatgaacat 1080

tttgagactc cgtcaggaag ttactgggat cacattcatt gcacacaaga tggatggtcg 1140

ccagcagtac catgcctcag aaaatgttat tttccttatt tggaaaatgg atataatcaa 1200

aatcatggaa gaaagtttgt acagggtaaa tctatagacg ttgcctgcca tcctggctac 1260

gctcttccaa aagcgcagac cacagttaca tgtatggaga atggctggtc tcctactccc 1320

agatgcatcc gtgtcaaaac atgttccaaa tcaagtatag atattgagaa tgggtttatt 1380

tctgaatctc agtatacata tgccttaaaa gaaaaagcga aatatcaatg caaactagga 1440

tatgtaacag cagatggtga aacatcagga tcaattacat gtgggaaaga tggatggtca 1500

gctcaaccca cgtgcattaa atcttgtgat atcccagtat ttatgaatgc cagaactaaa 1560

aatgacttca catggtttaa gctgaatgac acattggact atgaatgcca tgatggttat 1620

gaaagcaata ctggaagcac cactggttcc atagtgtgtg gttacaatgg ttggtctgat 1680

ttacccatat gttatgaaag agaatgcgaa cttcctaaaa tagatgtaca cttagttcct 1740

gatcgcaaga aagaccagta taaagttgga gaggtgttga aattctcctg caaaccagga 1800

tttacaatag ttggacctaa ttccgttcag tgctaccact ttggattgtc tcctgacctc 1860

ccaatatgta aagagcaagt acaatcatgt ggtccacctc ctgaactcct caatgggaat 1920

gttaaggaaa aaacgaaaga agaatatgga cacagtgaag tggtggaata ttattgcaat 1980

cctagatttc taatgaaggg acctaataaa attcaatgtg ttgatggaga gtggacaact 2040

ttaccagtgt gtattgtgga ggagagtacc tgtggagata tacctgaact tgaacatggc 2100

tgggcccagc tttcttcccc tccttattac tatggagatt cagtggaatt caattgctca 2160

gaatcattta caatgattgg acacagatca attacgtgta ttcatggagt atggacccaa 2220

cttccccagt gtgtggcaat agataaactt aagaagtgca aatcatcaaa tttaattata 2280

cttgaggaac atttaaaaaa caagaaggaa ttcgatcata attctaacat aaggtacaga 2340

tgtagaggaa aagaaggatg gatacacaca gtctgcataa atggaagatg ggatccagaa 2400

gtgaactgct caatggcaca aatacaatta tgcccacctc cacctcagat tcccaattct 2460

cacaatatga caaccacact gaattatcgg gatggagaaa aagtatctgt tctttgccaa 2520

gaaaattatc taattcagga aggagaagaa attacatgca aagatggaag atggcagtca 2580

ataccactct gtgttgaaaa aattccatgt tcacaaccac ctcagataga acacggaacc 2640

attaattcat ccaggtcttc acaagaaagt tatgcacatg ggactaaatt gagttatact 2700

tgtgagggtg gtttcaggat atctgaagaa aatgaaacaa catgctacat gggaaaatgg 2760

agttctccac ctcagtgtga aggccttcct tgtaaatctc cacctgagat ttctcatggt 2820

gttgtagctc acatgtcaga cagttatcag tatggagaag aagttacgta caaatgtttt 2880

gaaggttttg gaattgatgg gcctgcaatt gcaaaatgct taggagaaaa atggtctcac 2940

cctccatcat gcataaaaac agattgtctc agtttaccta gctttgaaaa tgccataccc 3000

atgggagaga agaaggatgt gtataaggcg ggtgagcaag tgacttacac ttgtgcaaca 3060

tattacaaaa tggatggagc cagtaatgta acatgcatta atagcagatg gacaggaagg 3120

ccaacatgca gagacacctc ctgtgtgaat ccgcccacag tacaaaatgc ttatatagtg 3180

tcgagacaga tgagtaaata tccatctggt gagagagtac gttatcaatg taggagccct 3240

tatgaaatgt ttggggatga agaagtgatg tgtttaaatg gaaactggac ggaaccacct 3300

caatgcaaag attctacagg aaaatgtggg ccccctccac ctattgacaa tggggacatt 3360

acttcattcc cgttgtcagt atatgctcca gcttcatcag ttgagtacca atgccagaac 3420

ttgtatcaac ttgagggtaa caagcgaata acatgtagaa atggacaatg gtcagaacca 3480

ccaaaatgct tacatccgtg tgtaatatcc cgagaaatta tggaaaatta taacatagca 3540

ttaaggtgga cagccaaaca gaagctttat tcgagaacag gtgaatcagt tgaatttgtg 3600

tgtaaacggg gatatcgtct ttcatcacgt tctcacacat tgcgaacaac atgttgggat 3660

gggaaactgg agtatccaac ttgtgcaaaa agatag 3696

<210> 8

<211> 1231

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 8

Met Arg Leu Leu Ala Lys Ile Ile Cys Leu Met Leu Trp Ala Ile Cys

1 5 10 15

Val Ala Glu Asp Cys Asn Glu Leu Pro Pro Arg Arg Asn Thr Glu Ile

20 25 30

Leu Thr Gly Ser Trp Ser Asp Gln Thr Tyr Pro Glu Gly Thr Gln Ala

35 40 45

Ile Tyr Lys Cys Arg Pro Gly Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Val Ile Met

50 55 60

Val Cys Arg Lys Gly Glu Trp Val Ala Leu Asn Pro Leu Arg Lys Cys

65 70 75 80

Gln Lys Arg Pro Cys Gly His Pro Gly Asp Thr Pro Phe Gly Thr Phe

85 90 95

Thr Leu Thr Gly Gly Asn Val Phe Glu Tyr Gly Val Lys Ala Val Tyr

100 105 110

Thr Cys Asn Glu Gly Tyr Gln Leu Leu Gly Glu Ile Asn Tyr Arg Glu

115 120 125

Cys Asp Thr Asp Gly Trp Thr Asn Asp Ile Pro Ile Cys Glu Val Val

130 135 140

Lys Cys Leu Pro Val Thr Ala Pro Glu Asn Gly Lys Ile Val Ser Ser

145 150 155 160

Ala Met Glu Pro Asp Arg Glu Tyr His Phe Gly Gln Ala Val Arg Phe

165 170 175

Val Cys Asn Ser Gly Tyr Lys Ile Glu Gly Asp Glu Glu Met His Cys

180 185 190

Ser Asp Asp Gly Phe Trp Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Val Glu Ile

195 200 205

Ser Cys Lys Ser Pro Asp Val Ile Asn Gly Ser Pro Ile Ser Gln Lys

210 215 220

Ile Ile Tyr Lys Glu Asn Glu Arg Phe Gln Tyr Lys Cys Asn Met Gly

225 230 235 240

Tyr Glu Tyr Ser Glu Arg Gly Asp Ala Val Cys Thr Glu Ser Gly Trp

245 250 255

Arg Pro Leu Pro Ser Cys Glu Glu Lys Ser Cys Asp Asn Pro Tyr Ile

260 265 270

Pro Asn Gly Asp Tyr Ser Pro Leu Arg Ile Lys His Arg Thr Gly Asp

275 280 285

Glu Ile Thr Tyr Gln Cys Arg Asn Gly Phe Tyr Pro Ala Thr Arg Gly

290 295 300

Asn Thr Ala Lys Cys Thr Ser Thr Gly Trp Ile Pro Ala Pro Arg Cys

305 310 315 320

Thr Leu Lys Pro Cys Asp Tyr Pro Asp Ile Lys His Gly Gly Leu Tyr

325 330 335

His Glu Asn Met Arg Arg Pro Tyr Phe Pro Val Ala Val Gly Lys Tyr

340 345 350

Tyr Ser Tyr Tyr Cys Asp Glu His Phe Glu Thr Pro Ser Gly Ser Tyr

355 360 365

Trp Asp His Ile His Cys Thr Gln Asp Gly Trp Ser Pro Ala Val Pro

370 375 380

Cys Leu Arg Lys Cys Tyr Phe Pro Tyr Leu Glu Asn Gly Tyr Asn Gln

385 390 395 400

Asn His Gly Arg Lys Phe Val Gln Gly Lys Ser Ile Asp Val Ala Cys

405 410 415

His Pro Gly Tyr Ala Leu Pro Lys Ala Gln Thr Thr Val Thr Cys Met

420 425 430

Glu Asn Gly Trp Ser Pro Thr Pro Arg Cys Ile Arg Val Lys Thr Cys

435 440 445

Ser Lys Ser Ser Ile Asp Ile Glu Asn Gly Phe Ile Ser Glu Ser Gln

450 455 460

Tyr Thr Tyr Ala Leu Lys Glu Lys Ala Lys Tyr Gln Cys Lys Leu Gly

465 470 475 480

Tyr Val Thr Ala Asp Gly Glu Thr Ser Gly Ser Ile Thr Cys Gly Lys

485 490 495

Asp Gly Trp Ser Ala Gln Pro Thr Cys Ile Lys Ser Cys Asp Ile Pro

500 505 510

Val Phe Met Asn Ala Arg Thr Lys Asn Asp Phe Thr Trp Phe Lys Leu

515 520 525

Asn Asp Thr Leu Asp Tyr Glu Cys His Asp Gly Tyr Glu Ser Asn Thr

530 535 540

Gly Ser Thr Thr Gly Ser Ile Val Cys Gly Tyr Asn Gly Trp Ser Asp

545 550 555 560

Leu Pro Ile Cys Tyr Glu Arg Glu Cys Glu Leu Pro Lys Ile Asp Val

565 570 575

His Leu Val Pro Asp Arg Lys Lys Asp Gln Tyr Lys Val Gly Glu Val

580 585 590

Leu Lys Phe Ser Cys Lys Pro Gly Phe Thr Ile Val Gly Pro Asn Ser

595 600 605

Val Gln Cys Tyr His Phe Gly Leu Ser Pro Asp Leu Pro Ile Cys Lys

610 615 620

Glu Gln Val Gln Ser Cys Gly Pro Pro Pro Glu Leu Leu Asn Gly Asn

625 630 635 640

Val Lys Glu Lys Thr Lys Glu Glu Tyr Gly His Ser Glu Val Val Glu

645 650 655

Tyr Tyr Cys Asn Pro Arg Phe Leu Met Lys Gly Pro Asn Lys Ile Gln

660 665 670

Cys Val Asp Gly Glu Trp Thr Thr Leu Pro Val Cys Ile Val Glu Glu

675 680 685

Ser Thr Cys Gly Asp Ile Pro Glu Leu Glu His Gly Trp Ala Gln Leu

690 695 700

Ser Ser Pro Pro Tyr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Glu Phe Asn Cys Ser

705 710 715 720

Glu Ser Phe Thr Met Ile Gly His Arg Ser Ile Thr Cys Ile His Gly

725 730 735

Val Trp Thr Gln Leu Pro Gln Cys Val Ala Ile Asp Lys Leu Lys Lys

740 745 750

Cys Lys Ser Ser Asn Leu Ile Ile Leu Glu Glu His Leu Lys Asn Lys

755 760 765

Lys Glu Phe Asp His Asn Ser Asn Ile Arg Tyr Arg Cys Arg Gly Lys

770 775 780

Glu Gly Trp Ile His Thr Val Cys Ile Asn Gly Arg Trp Asp Pro Glu

785 790 795 800

Val Asn Cys Ser Met Ala Gln Ile Gln Leu Cys Pro Pro Pro Pro Gln

805 810 815

Ile Pro Asn Ser His Asn Met Thr Thr Thr Leu Asn Tyr Arg Asp Gly

820 825 830

Glu Lys Val Ser Val Leu Cys Gln Glu Asn Tyr Leu Ile Gln Glu Gly

835 840 845

Glu Glu Ile Thr Cys Lys Asp Gly Arg Trp Gln Ser Ile Pro Leu Cys

850 855 860

Val Glu Lys Ile Pro Cys Ser Gln Pro Pro Gln Ile Glu His Gly Thr

865 870 875 880

Ile Asn Ser Ser Arg Ser Ser Gln Glu Ser Tyr Ala His Gly Thr Lys

885 890 895

Leu Ser Tyr Thr Cys Glu Gly Gly Phe Arg Ile Ser Glu Glu Asn Glu

900 905 910

Thr Thr Cys Tyr Met Gly Lys Trp Ser Ser Pro Pro Gln Cys Glu Gly

915 920 925

Leu Pro Cys Lys Ser Pro Pro Glu Ile Ser His Gly Val Val Ala His

930 935 940

Met Ser Asp Ser Tyr Gln Tyr Gly Glu Glu Val Thr Tyr Lys Cys Phe

945 950 955 960

Glu Gly Phe Gly Ile Asp Gly Pro Ala Ile Ala Lys Cys Leu Gly Glu

965 970 975

Lys Trp Ser His Pro Pro Ser Cys Ile Lys Thr Asp Cys Leu Ser Leu

980 985 990

Pro Ser Phe Glu Asn Ala Ile Pro Met Gly Glu Lys Lys Asp Val Tyr

995 1000 1005

Lys Ala Gly Glu Gln Val Thr Tyr Thr Cys Ala Thr Tyr Tyr Lys

1010 1015 1020

Met Asp Gly Ala Ser Asn Val Thr Cys Ile Asn Ser Arg Trp Thr

1025 1030 1035

Gly Arg Pro Thr Cys Arg Asp Thr Ser Cys Val Asn Pro Pro Thr

1040 1045 1050

Val Gln Asn Ala Tyr Ile Val Ser Arg Gln Met Ser Lys Tyr Pro

1055 1060 1065

Ser Gly Glu Arg Val Arg Tyr Gln Cys Arg Ser Pro Tyr Glu Met

1070 1075 1080

Phe Gly Asp Glu Glu Val Met Cys Leu Asn Gly Asn Trp Thr Glu

1085 1090 1095

Pro Pro Gln Cys Lys Asp Ser Thr Gly Lys Cys Gly Pro Pro Pro

1100 1105 1110

Pro Ile Asp Asn Gly Asp Ile Thr Ser Phe Pro Leu Ser Val Tyr

1115 1120 1125

Ala Pro Ala Ser Ser Val Glu Tyr Gln Cys Gln Asn Leu Tyr Gln

1130 1135 1140

Leu Glu Gly Asn Lys Arg Ile Thr Cys Arg Asn Gly Gln Trp Ser

1145 1150 1155

Glu Pro Pro Lys Cys Leu His Pro Cys Val Ile Ser Arg Glu Ile

1160 1165 1170

Met Glu Asn Tyr Asn Ile Ala Leu Arg Trp Thr Ala Lys Gln Lys

1175 1180 1185

Leu Tyr Ser Arg Thr Gly Glu Ser Val Glu Phe Val Cys Lys Arg

1190 1195 1200

Gly Tyr Arg Leu Ser Ser Arg Ser His Thr Leu Arg Thr Thr Cys

1205 1210 1215

Trp Asp Gly Lys Leu Glu Tyr Pro Thr Cys Ala Lys Arg

1220 1225 1230

<210> 9

<211> 357

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 9

ggccgtccca tcctggaagt gccagagagt gtaacaggac cttggaaagg ggatgtgaat 60

cttccctgca cctatgaccc cctgcaaggc tacacccaag tcttggtgaa gtggctggta 120

caacgtggct cagaccctgt caccatcttt ctacgtgact cttctggaga ccatatccag 180

caggcaaagt accagggccg cctgcatgtg agccacaagg ttccaggaga tgtatccctc 240

caattgagca ccctggagat ggatgaccgg agccactaca cgtgtgaagt cacctggcag 300

actcctgatg gcaaccaagt cgtgagagat aagattactg agctccgtgt ccagaaa 357

<210> 10

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 10

Gly Arg Pro Ile Leu Glu Val Pro Glu Ser Val Thr Gly Pro Trp Lys

1 5 10 15

Gly Asp Val Asn Leu Pro Cys Thr Tyr Asp Pro Leu Gln Gly Tyr Thr

20 25 30

Gln Val Leu Val Lys Trp Leu Val Gln Arg Gly Ser Asp Pro Val Thr

35 40 45

Ile Phe Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asp His Ile Gln Gln Ala Lys Tyr

50 55 60

Gln Gly Arg Leu His Val Ser His Lys Val Pro Gly Asp Val Ser Leu

65 70 75 80

Gln Leu Ser Thr Leu Glu Met Asp Asp Arg Ser His Tyr Thr Cys Glu

85 90 95

Val Thr Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn Gln Val Val Arg Asp Lys Ile

100 105 110

Thr Glu Leu Arg Val Gln Lys

115

<210> 11

<211> 915

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 11

gaagattgca atgaacttcc tccaagaaga aatacagaaa ttctgacagg ttcctggtct 60

gaccaaacat atccagaagg cacccaggct atctataaat gccgccctgg atatagatct 120

cttggaaatg taataatggt atgcaggaag ggagaatggg ttgctcttaa tccattaagg 180

aaatgtcaga aaaggccctg tggacatcct ggagatactc cttttggtac ttttaccctt 240

acaggaggaa atgtgtttga atatggtgta aaagctgtgt atacatgtaa tgaggggtat 300

caattgctag gtgagattaa ttaccgtgaa tgtgacacag atggatggac caatgatatt 360

cctatatgtg aagttgtgaa gtgtttacca gtgacagcac cagagaatgg aaaaattgtc 420

agtagtgcaa tggaaccaga tcgggaatac cattttggac aagcagtacg gtttgtatgt 480

aactcaggct acaagattga aggagatgaa gaaatgcatt gttcagacga tggtttttgg 540

agtaaagaga aaccaaagtg tgtggaaatt tcatgcaaat ccccagatgt tataaatgga 600

tctcctatat ctcagaagat tatttataag gagaatgaac gatttcaata taaatgtaac 660

atgggttatg aatacagtga aagaggagat gctgtatgca ctgaatctgg atggcgtccg 720

ttgccttcat gtgaagaaaa atcatgtgat aatccttata ttccaaatgg tgactactca 780

cctttaagga ttaaacacag aactggagat gaaatcacgt accagtgtag aaatggtttt 840

tatcctgcaa cccggggaaa tacagcaaaa tgcacaagta ctggctggat acctgctccg 900

agatgtacct tgaaa 915

<210> 12

<211> 305

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 12

Glu Asp Cys Asn Glu Leu Pro Pro Arg Arg Asn Thr Glu Ile Leu Thr

1 5 10 15

Gly Ser Trp Ser Asp Gln Thr Tyr Pro Glu Gly Thr Gln Ala Ile Tyr

20 25 30

Lys Cys Arg Pro Gly Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Val Ile Met Val Cys

35 40 45

Arg Lys Gly Glu Trp Val Ala Leu Asn Pro Leu Arg Lys Cys Gln Lys

50 55 60

Arg Pro Cys Gly His Pro Gly Asp Thr Pro Phe Gly Thr Phe Thr Leu

65 70 75 80

Thr Gly Gly Asn Val Phe Glu Tyr Gly Val Lys Ala Val Tyr Thr Cys

85 90 95

Asn Glu Gly Tyr Gln Leu Leu Gly Glu Ile Asn Tyr Arg Glu Cys Asp

100 105 110

Thr Asp Gly Trp Thr Asn Asp Ile Pro Ile Cys Glu Val Val Lys Cys

115 120 125

Leu Pro Val Thr Ala Pro Glu Asn Gly Lys Ile Val Ser Ser Ala Met

130 135 140

Glu Pro Asp Arg Glu Tyr His Phe Gly Gln Ala Val Arg Phe Val Cys

145 150 155 160

Asn Ser Gly Tyr Lys Ile Glu Gly Asp Glu Glu Met His Cys Ser Asp

165 170 175

Asp Gly Phe Trp Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Val Glu Ile Ser Cys

180 185 190

Lys Ser Pro Asp Val Ile Asn Gly Ser Pro Ile Ser Gln Lys Ile Ile

195 200 205

Tyr Lys Glu Asn Glu Arg Phe Gln Tyr Lys Cys Asn Met Gly Tyr Glu

210 215 220

Tyr Ser Glu Arg Gly Asp Ala Val Cys Thr Glu Ser Gly Trp Arg Pro

225 230 235 240

Leu Pro Ser Cys Glu Glu Lys Ser Cys Asp Asn Pro Tyr Ile Pro Asn

245 250 255

Gly Asp Tyr Ser Pro Leu Arg Ile Lys His Arg Thr Gly Asp Glu Ile

260 265 270

Thr Tyr Gln Cys Arg Asn Gly Phe Tyr Pro Ala Thr Arg Gly Asn Thr

275 280 285

Ala Lys Cys Thr Ser Thr Gly Trp Ile Pro Ala Pro Arg Cys Thr Leu

290 295 300

Lys

305

Claims

1.一种蛋白质，其特征在于，该蛋白质具有靶向抑制补体激活的功能，并且该蛋白质的氨基酸序列

（a）含有CRIg胞外功能区和补体抑制功能区；

或者

（b）由CRIg胞外功能区、补体抑制功能区以及两者间的连接物组成；

上述补体抑制功能区是factor H、C1-INH、C4BP、factor I、S-protein、Clusterin、CD35/CR1、CD46/MCP、CD55/DAF、CD59或者CRIg的功能片段或全长。

2.如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO2或者SEQ ID NO4所示。

3.一种核酸，其特征在于，该核酸序列编码权利要求1所述的蛋白质。

4.如权利要求3所述的核酸，其特征在于，该核酸的碱基序列如SEQ ID NO1或者SEQID NO3所示。

5.一种载体，其特征在于，含有权利要求3所述的核酸。

6.权利要求1所述的蛋白质的制备方法，其特征在于，利用基因工程技术，连接CRIg胞外区、补体抑制功能区的蛋白质多肽；

所述的CRIg胞外区蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO10所示；

所述的补体抑制功能区是factor H、C1-INH、C4BP、factor I、S-protein、Clusterin、CD35/CR1、CD46/MCP、CD55/DAF、CD59或者CRIg的功能片段或全长。

7.权利要求1所述的蛋白质在制备靶向抑制补体激活的药物中的用途。

8.权利要求1所述的蛋白质在制备保护阵发性夜间血红蛋白尿患者血细胞或其他疾病中遭受补体攻击的细胞免受补体攻击的药物中的用途。

9.一种药物，其特征在于，所述药物的活性成分为权利要求1所述的蛋白质。

10.如权利要求9所述的药物，其特征在于，该药物是针剂。