CN109078168A - 靶向补体抑制剂在制备改善脑死亡供肝药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了靶向补体抑制剂在制备改善脑死亡供肝药物中的应用。本发明利用补体受体2(Complement receptor 2,CR2)连接膜结合性调节因子Crry，通过CR2靶向性结合到补体活化和损伤局部，利用膜结合性调节因子特异性调节补体级联反应的不同阶段，通过建立小鼠脑死亡模型，比较CR2‑Cryy治疗组与对照组的肝功能改变，结果表明靶向补体抑制剂CR2‑Crry有效改善脑死亡后供体肝的损伤，并减轻肝脏炎症反应、氧化应激损伤，减少肝细胞凋亡。本发明还通过补体基因敲除小鼠进一步验证了该补体抑制剂在改善脑死亡后供体肝功能的作用。

Description

靶向补体抑制剂在制备改善脑死亡供肝药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及靶向补体抑制剂在制备改善脑死亡供肝药物中的应用。
背景技术
肝脏移植已成为治疗终末期肝病最有效的方法，然而器官供需比例紧张，供肝无法满足患者需要，目前供肝主要来自脑死亡供体。临床研究表明：与活体肝移植比较，脑死亡后供肝质量明显降低，移植后早期移植器官功能不全(early allograft dysfunction)甚至原发性无功能(primary no function,PNF)的发生率显著增高，这主要归因于脑死亡引起的损伤(Brain death-induced injury,BDI)。因此，脑死亡供体的合理使用是解决供体来源紧缺最有前景的方案之一。
BD可引起机体一系列严重复杂的病理生理改变，包括交感神经兴奋引起儿茶酚胺大量释放，产生强烈的血管收缩，造成血管内皮细胞损伤，诱发各种炎症介质的高表达、隐蔽抗原的暴露等形成供体的“前炎症状态”(pro-inflammatory state)以及血流动力学不稳定造成低灌注、缺血缺氧异常改变，组织细胞氧需/氧供失衡，从而出现不同程度的器官损伤。研究发现：补体(complement)还参与不同器官移植的免疫应答及损伤机制；例如心脏、肾脏移植存在补体的活化并参与移植损伤，靶向性抑制补体显著减轻BDD移植肾及移植心的损伤。然而基于BDD肝移植背景下损伤(BDI、IRI、级联损伤)与修复中补体相关机制研究鲜见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供靶向补体抑制剂在制备改善脑死亡供肝药物中的应用。
发明人前期已有研究发现小鼠肝脏缺血再灌注模型中，肝脏补体明显活化，而通过靶向补体抑制剂CR2-Crry处理可明显改善肝脏缺血再灌注损伤。
发明人利用补体受体2(Complement receptor 2,CR2)连接膜结合性调节因子(Crry)，通过CR2靶向性结合到补体活化和损伤局部，利用膜结合性调节因子特异性调节补体级联反应的不同阶段，通过建立小鼠脑死亡模型，比较CR2-Cryy治疗组与对照组的肝功能改变，结果表明靶向补体抑制剂CR2-Crry有效改善脑死亡后供体肝的损伤，并减轻肝脏炎症反应、氧化应激损伤，减少肝细胞凋亡。本发明还通过补体基因敲除小鼠进一步验证了该补体抑制剂在改善脑死亡后供体肝功能的作用。
因此，本发明的第一个目的是提供靶向补体抑制剂CR2-Crry在制备改善脑死亡供肝药物中的应用，所述的靶向补体抑制剂CR2-Crry，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选，所述的改善脑死亡供肝药物为减轻脑死亡后供体肝损伤的药物。
优选，所述的改善脑死亡供肝药物为减轻脑死亡后供体肝炎症反应的药物。
优选，所述的改善脑死亡供肝药物为减少脑死亡后供体肝氧化应激损伤和细胞凋亡的药物。
优选，所述的改善脑死亡供肝药物为减少脑死亡后供体肝肝细胞线粒体损伤的药物。
本发明的第二个目的是提供一种改善脑死亡供肝的药物，其含有有效量的靶向补体抑制剂CR2-Crry作为活性成分，所述的靶向补体抑制剂CR2-Crry，其氨基酸序列如SEQID NO.1所示。
本发明具有以下有益效果：
1.靶向补体抑制剂CR2-Crry具有靶向性强、高效、安全、不影响宿主全身免疫功能等优点。
2.该靶向补体抑制剂可改善脑死亡后供体肝肝功能。脑死亡前30min向供体注射CR2-Crry 0.25mg，脑死亡后4h、6h，取肝脏组织及血清，通过病理学及血清学检测到肝功能改变。
3.该靶向补体抑制剂可改善脑死亡后供体肝炎症反应。
4.该靶向补体抑制剂可改善氧化应激损伤及肝细胞凋亡。
5.该靶向补体抑制剂可减少脑死亡后供体肝肝细胞线粒体损伤。
附图说明
图1是脑死亡后小鼠动脉血压；脑死亡模型组血压均低于假手术组(Sham)，野生鼠脑死亡组(BD)血压波动与补体缺乏组(KO)及CR2-Crry处理组(BD+CR2-Crry)无显著差异。
图2是脑死亡供体的肝脏损伤情况及血清学检测肝、肾、心功能变化情况；A：脑死亡后4h和6h，各组小鼠肝组织HE染色；B：HE染色评分情况。；C-H：血清学检测肝、肾、心功能改变，检测指标依次分别为血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、血清肌酐(CRE)、血尿素氮(BUN)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌钙蛋白I水平；*，与Sham组比较，P均<0.05；**，与Sham组比较，P均<0.01；#，与BD组比，P均<0.05。
图3是脑死亡后肝组织补体C3沉积水平。
图4是脑死亡供肝的炎症因子表达水平，A-C：分别为通过Elisa检测血清MCP-1、IL-6、TNF-α结果；*，与假手术组比较，P<0.01；#,表示与野生鼠脑死亡组比较，P<0.01。
图5是脑死亡供肝的粘附分子表达水平，A-D：依次分别为RT-PCR检测组织中VCAM-1、ICAM-1、P-SELE、E-SELE RNA表达情况。
图6是脑死亡后小鼠肝组织凋亡情况，A图上半部分：脑死亡后4、6h各组小鼠肝组织凋亡情况；A图下半部分：透射电镜观察各组线粒体损伤情况；B：TUNEL检测统计结果；*，与假手术组比较，P<0.01；#，表示与野生鼠脑死亡组比较，P<0.01。
图7是检测线粒体凋亡途径相关指标表达水平，A：WB检测线粒体凋亡途径中CytC、bcl-2、bax、caspase3、caspase9蛋白的表达情况；B-D：RT-PCR检测肝组织中氧化应激指标SOD2，HIF1α，HSP70.2的表达情况；*，与假手术组比较，P<0.01；#，表示与野生鼠脑死亡组比较，P<0.01。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。以下实例中未具体注明的实验方法，均可按照常规方法进行，或按照所用产品生产厂商的使用说明；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径得到。
以下实施例中所用的野生型小鼠均为C57BL/6野生型小鼠。
靶向补体抑制剂CR2-Crry的制备：是将补体受体2(Complement receptor 2,CR2)连接膜结合性调节因子(Crry)而制备得到的，具体制备参见：Atkinson C,Song H,Lu B,etal.Targeted complement inhibition by C3d recognition ameliorates tissueinjury without apparent increase in susceptibility to infection.J ClinInvest.2005；115(9):2444-2453文中Methods中CR2-Crry fusion protein的制备。制备的用于实施例中的靶向补体抑制剂CR2-Crry的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，含585个氨基酸。
补体C3基因敲除小鼠(C3-/-小鼠、C3敲除小鼠)为B6；129S4-C3tm1Crr/J品系，购自The Jackson Laboratories(Bar Harbor,Maine,USA)。
实施例1
1.实验相关整体模型的建立
小鼠麻醉后通过颈动脉插管监测小鼠动脉压，将小鼠仰卧固定于手术架上，行气管切开接导管。然后将小鼠改俯卧位，在小鼠颅骨矢状线外侧约0.2cm处钻一个1mm的孔，一根4F号Fogarty导管由此置入颅内，尖端指向脑干。向导管气囊内以每分钟4μl的速度注入生理盐水，逐渐膨胀气囊，增加颅内压，直到出现自主呼吸停止(生理盐水总量为80μl±25μl)。脑死亡的诊断通过记录有无角膜反射及呼吸停止试验来证实，监测动脉压波动情况。小鼠术后采用小动物呼吸机机械通气维持BD状态4h或6h。术中维持室温37℃，确定脑死亡后4h或6h后打开腹腔，通过下腔静脉取静脉血及移除肝脏组织。其中一部分肝脏组织放入10％福尔马林至少固定24h后石蜡包埋用于组织学分析，另一部分放置-80℃冰箱保存。静脉血室温放置2h或4℃过夜后离心取血清。术中如出现以下情况提示模型失败：1.持续出现病理反射时间大于10min，2.动脉血压低于50mmHg持续20min以上。
利用C57BL/6野生型小鼠根据上述模型制备的为野生鼠脑死亡组(BD)。假手术组(Sham)为麻醉后行气管插管，无其他处理。
补体抑制剂CR2-Crry处理：利用C57BL/6野生型小鼠的脑死亡模型，在脑死亡前30min注射CR2-Crry 0.25mg，脑死亡后4h(BD(4h)+CR2-Crry组)、6h(BD(6h)+CR2-Crry组)，取新鲜肝脏组织，一部分置于-80℃用于蛋白及RNA提取，一部分肝脏组织用10％福尔马林固定，制备腊块，切片并HE染色及免疫组化，观察检测肝组织形态学及相关因子表达检测等。通过肝下下腔静脉取全血获得血清，用于肝功能检测及血清学指标检测。
利用补体C3基因敲除小鼠的脑死亡模型，在脑死亡前30min注射CR2-Crry 0.25mg(KO组，或补体缺乏组、C3敲除组)，同样取肝组织及血清检测相关指标，进一步验证CR2-Crry对脑死亡后肝功能保护作用。
建立渐进性脑死亡小鼠模型后，小鼠自主呼吸停止，角膜反射消失；如图1所示，与假手术组(Sham)比较，野生鼠脑死亡组(BD)脑死亡后血压明显下降(p<0.05)，且在脑死亡后20分钟，动脉血压呈现一过性下降，但均不低于50mmHg，后波动于60mmHg左右。野生鼠脑死亡组(BD)的动脉血压与补体抑制剂处理组(BD+CR2-Crry)及C3敲除组(KO)比较无显著差异(P>0.05)。
2.补体激活促进脑死亡供肝损伤的作用与炎症
分别采用C57BL/6、C3-/-小鼠建立脑死亡模型，设置脑死亡的不同时间点(4h，6h)，研究补体在小鼠脑死亡后供肝损伤和调控机制。
2.1补体抑制在脑死亡供体的肝脏及心、肾功能损伤中的作用
通过检测肝脏组织病理后发现：无论脑死亡后4h及6h，肝脏病理学改变提示各脑死亡模型组肝脏损伤程度明显高于假手术组，且经CR2-Crry处理或C3敲除的脑死亡组的肝损伤程度明显减轻(如图2A-B)。脑死亡后6h，小鼠肝损伤程度高于4h组，但二者无统计学差异。进一步通过血清学检测肝、肾、心功能变化情况(自动生化仪检测)：野生鼠脑死亡4h或6h组血清谷丙转氨酶(ALT)及谷草转氨酶(AST)水平均高于假手术组，而与CR2-Crry处理或C3敲除脑死亡组相比，野生鼠脑死亡组ALT、AST均显著升高(图2C-D)。检测心功能及肾功能后发现野生鼠脑死亡组血清肌酐(CRE)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌钙蛋白I亦明显高于假手术组及CR2-Crry处理或C3敲除组。由此推测脑死亡后肝组织内补体过度激活损伤肝功能，通过补体缺乏及抑制可有效减轻肝脏损伤(如图2E-H)。
2.2脑死亡后造成供肝补体系统的过度激活
用C3-/-小鼠和C57BL/6野生型小鼠模型以0.25mg剂量的CR2-Crry处理来研究补体在小鼠脑死亡后供肝损伤中的作用。脑死亡后分别在4h、6h时间点评估小鼠肝组织中补体C3沉积情况(免疫组化方法)：脑死亡后4h，野生鼠脑死亡组肝组织中的C3d(补体C3)沉积明显高于假手术组，与C3-/-小鼠和CR2-Crry处理组相比，野生小鼠脑死亡组C3d沉积也明显升高。脑死亡后6h，野生鼠肝组织C3d沉积较脑死亡后4h明显升高，然而C3-/-小鼠和CR2-Crry处理组未见补体沉积(如图3)。
2.3补体抑制减轻脑死亡供肝的炎症反应
2.3.1补体抑制减少脑死亡供肝的炎症因子表达
通过ELISA试剂盒检测血清中炎症因子MCP-1，IL-6，TNF-α。研究发现：无论脑死亡后4h或6h，野生鼠脑死亡组血清中MCP-1和IL-6较假手术组均显著升高，在CR2-Crry处理或C3敲除小鼠组血清中MCP-1，IL-6水平显著降低；而血清中TNF-α在脑死亡后4h或6h均未见升高(如图4A-C)。
2.3.2补体抑制减少脑死亡供肝的粘附分子表达
进一步提取肝组织中的RNA，通过RT-PCR检测(所用引物如表1所示)肝组织中粘附分子表达水平：野生鼠脑死亡组与假手术组相比，除了VCAM-1，选择的指标ICAM-1，P-selectin，E-selectin表达水平在脑死亡4h，6h时间点均显著升高，且CR2-Crry处理或C3敲除组均显著降低其表达(如图5A-D)。
表1各指标引物序列
Forward Reverse
ICAM-1 ACGTGCGTATGGTCCTCG <u>CAGCTGTAAATGGTA</u>
VCAM-1 CGTGGACATCTACTCTTTC CAGCCTGTAAACTGGGTA
P-selectin GAACCCTCACAGCCACCT CTCAGCAAATGCCCAAAT
E-selectin ACAGCTTCGTGTACCAATG GAGCAGTTCAGGCTTCCA
2.4补体抑制减少脑死亡供肝细胞的凋亡及其机制研究
通过TUNEL检测方法(罗氏TUNEL检测试剂盒)检测脑死亡后肝细胞凋亡情况：与假手术组比较，野生鼠脑死亡组脑死亡后4h及6h肝细胞凋亡程度显著升高，且脑死亡后6h肝细胞凋亡程度较脑死亡后4h严重。在CR2-Crry处理组及C3敲除组，脑死亡后4h或6h肝细胞凋亡情况较野生鼠脑死亡组显著改善。通过透射电镜观察发现线粒体损伤情况亦可得到同样趋势结果(如图6)。
2.5补体抑制减少脑死亡供肝凋亡的机制研究
由前期研究可知：由于BD可引起机体一系列严重复杂的病理生理改变，并导致血压的混乱波动，并诱发各种炎症介质的高表达、隐蔽抗原的暴露等形成供体的“前炎症状态”(pro-inflammatory state)以及血流动力学不稳定造成低灌注、缺血缺氧异常改变，组织细胞氧需/氧供失衡，而线粒体氧化代谢及能量转换的重要场所，由此推论：小鼠脑死亡是否通过线粒体凋亡途径影响肝细胞凋亡。进一步通过WB检测线粒体凋亡途径的相关蛋白发现bax、caspase3、caspase9、Cyt C在野生鼠脑死亡组较假手术组明显升高，而bcl-2较假手术组减少，而CR2-Crry处理组和C3敲除组的小鼠上述指标明显改善(如图7A)。另外，提取小鼠肝脏组织RNA，通过RT-PCR检测氧化应激相关指标发现：与假手术组比较，SOD2，HIF1α，HSP70.2在野生鼠脑死亡组明显升高，而CR2-Crry处理组和C3敲除组明显改善(如图7B-D)。
序列表
&lt;110&gt; 广西医科大学第一附属医院
&lt;120&gt; 靶向补体抑制剂在制备改善脑死亡供肝药物中的应用
&lt;160&gt; 1
&lt;170&gt; SIPOSequenceListing 1.0
&lt;210&gt; 1
&lt;211&gt; 585
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列(Artificial Sequence)
&lt;400&gt; 1
Ile Ser Cys Asp Pro Pro Pro Glu Val Lys Asn Ala Arg Lys Pro Tyr
1 5 10 15
Tyr Ser Leu Pro Ile Val Pro Gly Thr Val Leu Arg Tyr Thr Cys Ser
20 25 30
Pro Ser Tyr Arg Leu Ile Gly Glu Lys Ala Ile Phe Cys Ile Ser Glu
35 40 45
Asn Gln Val His Ala Thr Trp Asp Lys Ala Pro Pro Ile Cys Glu Ser
50 55 60
Val Asn Lys Thr Ile Ser Cys Ser Asp Pro Ile Val Pro Gly Gly Phe
65 70 75 80
Met Asn Lys Gly Ser Lys Ala Pro Phe Arg His Gly Asp Ser Val Thr
85 90 95
Phe Thr Cys Lys Ala Asn Phe Thr Met Lys Gly Ser Lys Thr Val Trp
100 105 110
Cys Gln Ala Asn Glu Met Trp Gly Pro Thr Ala Leu Pro Val Cys Glu
115 120 125
Ser Asp Phe Pro Leu Glu Cys Pro Ser Leu Pro Thr Ile His Asn Gly
130 135 140
His His Thr Gly Gln His Val Asp Gln Phe Val Ala Gly Leu Ser Val
145 150 155 160
Thr Tyr Ser Cys Glu Pro Gly Tyr Leu Leu Thr Gly Lys Lys Thr Ile
165 170 175
Lys Cys Leu Ser Ser Gly Asp Trp Asp Gly Val Ile Pro Thr Cys Lys
180 185 190
Glu Ala Gln Cys Glu His Pro Gly Lys Phe Pro Asn Gly Gln Val Lys
195 200 205
Glu Pro Leu Ser Leu Gln Val Gly Thr Thr Val Tyr Phe Ser Cys Asn
210 215 220
Glu Gly Tyr Gln Leu Gln Gly Gln Pro Ser Ser Gln Cys Val Ile Val
225 230 235 240
Glu Gln Lys Ala Ile Trp Thr Lys Lys Pro Val Cys Lys Glu Ile Leu
245 250 255
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Ala Pro Ser Gln
260 265 270
Leu Pro Ser Ala Lys Pro Ile Asn Leu Thr Asp Glu Ser Met Phe Pro
275 280 285
Ile Gly Thr Tyr Leu Leu Tyr Glu Cys Leu Pro Gly Tyr Ile Lys Arg
290 295 300
Gln Phe Ser Ile Thr Cys Lys Gln Asp Ser Thr Trp Thr Ser Ala Glu
305 310 315 320
Asp Lys Cys Ile Arg Lys Gln Cys Lys Thr Pro Ser Asp Pro Glu Asn
325 330 335
Gly Leu Val His Val His Thr Gly Ile Gln Phe Gly Ser Arg Ile Asn
340 345 350
Tyr Thr Cys Asn Gln Gly Tyr Arg Leu Ile Gly Ser Ser Ser Ala Val
355 360 365
Cys Val Ile Thr Asp Gln Ser Val Asp Trp Asp Thr Glu Ala Pro Ile
370 375 380
Cys Glu Trp Ile Pro Cys Glu Ile Pro Pro Gly Ile Pro Asn Gly Asp
385 390 395 400
Phe Phe Ser Ser Thr Arg Glu Asp Phe His Tyr Gly Met Val Val Thr
405 410 415
Tyr Arg Cys Asn Thr Asp Ala Arg Gly Lys Ala Leu Phe Asn Leu Val
420 425 430
Gly Glu Pro Ser Leu Tyr Cys Thr Ser Asn Asp Gly Glu Ile Gly Val
435 440 445
Trp Ser Gly Pro Pro Pro Gln Cys Ile Glu Leu Asn Lys Cys Thr Pro
450 455 460
Pro Pro Tyr Val Glu Asn Ala Val Met Leu Ser Glu Asn Arg Ser Leu
465 470 475 480
Phe Ser Leu Arg Asp Ile Val Glu Phe Arg Cys His Pro Gly Phe Ile
485 490 495
Met Lys Gly Ala Ser Ser Val His Cys Gln Ser Leu Asn Lys Trp Glu
500 505 510
Pro Glu Leu Pro Ser Cys Phe Lys Gly Val Ile Cys Arg Leu Pro Gln
515 520 525
Glu Met Ser Gly Phe Gln Lys Gly Leu Gly Met Lys Lys Glu Tyr Tyr
530 535 540
Tyr Gly Glu Asn Val Thr Leu Glu Cys Glu Asp Gly Tyr Thr Leu Glu
545 550 555 560
Gly Ser Ser Gln Ser Gln Cys Gln Ser Asp Gly Ser Trp Asn Pro Leu
565 570 575
Leu Ala Lys Cys Val Ser Arg Ser Ile
580 585

Claims (6)

1.靶向补体抑制剂CR2-Crry在制备改善脑死亡供肝药物中的应用，所述的靶向补体抑制剂CR2-Crry，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的改善脑死亡供肝药物为减轻脑死亡后供体肝损伤的药物。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的改善脑死亡供肝药物为减轻脑死亡后供体肝炎症反应的药物。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的改善脑死亡供肝药物为减少脑死亡后供体肝氧化应激损伤和细胞凋亡的药物。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的改善脑死亡供肝药物为减少脑死亡后供体肝肝细胞线粒体损伤的药物。
6.一种改善脑死亡供肝的药物，其特征在于，含有有效量的靶向补体抑制剂CR2-Crry作为活性成分，所述的靶向补体抑制剂CR2-Crry，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
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