CN115429879A - 靶向抑制gata3在促进肝脏再生及改善肝损伤中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了靶向抑制GATA3在促进肝脏再生及改善肝损伤中的应用。本发明首次揭示GATA3在肝脏再生过程中发挥负调控作用，其可以作为诊断或治疗的新型靶点。以其作为靶标，可开发促进肝脏再生、预防、缓解和/或治疗肝损伤的药物；以其作为分子标记，可对肝脏再生能力或肝损伤情况进行诊断、预后评估。同时，本发明人也筛选和优化了可靶向于GATA3且体内体外作用效果特别优异的靶向药物。

Description

靶向抑制GATA3在促进肝脏再生及改善肝损伤中的应用
技术领域
本发明属于生物技术药物应用领域；更具体地，本发明涉及靶向抑制GATA3(GATAbinding protein 3，GATA3)在促进肝脏再生及改善肝损伤中的应用。
背景技术
肝脏是机体脏器中功能最多且最复杂的实质脏器之一，主要功能包括调控糖类和脂质的平衡、参与外源性物质代谢与生物转化、胆汁的生成和排泄、维生素的储存、分泌性蛋白质的合成、凝血物质的生成与消除，并在特异性和非特异性免疫中具有重要作用。肝脏作为人体物质代谢的中心，在多种生理和病理过程中都发挥了重要的作用，很多疾病也会累及肝脏。
肝脏部分切除是目前治疗肝脏肿瘤最普遍、最有效的方法，而正常肝脏组织强大的再生能力是有效实施肝脏切除术的基础。但受限于肝脏肿瘤早期诊断技术的瓶颈，大部分肝脏肿瘤在首次诊断时已经发展至中晚期，由于肿瘤体积大，累及的肝段较多，切除后残余肝脏的体积无法满足人体代谢需求，会导致肝功能衰竭等危及生命的并发症。为了解决残余肝脏体积不足的问题，临床上开发了多种刺激残余肝脏快速再生的手术方法，比如门静脉结扎(Portal Vein Ligation，PVL)/门静脉栓塞(Portal Vein Embolization，PVE)，联合肝脏分隔和门静脉结扎的二步肝切除术(Associating Liver Partition and PortalVein Ligation for Staged Hepatectomy，ALPPS)。
然而，上述这类手术的效果尚存在争议，术后患者由于残余肝脏体积不足发生肝衰竭的风险依然很高。研究肝再生相关通路，探索调控肝脏再生的靶点并开发安全有效的药物，加速围手术期残余肝脏的再生，减少肝衰竭的发生率，对肝癌的手术治疗具有重要意义。
肝再生是一个由不同种类的细胞共同参与调控的复杂过程，肝细胞、免疫细胞、胆管细胞、星状细胞、肝窦内皮细胞(Liver Sinusoidal Endothelial Cells，LSEC)都参与了肝再生过程的调控。
因此，本领域还需要进一步研究和开发促进肝再生以及改善肝损伤的新型技术方案，以期为临床提供新的治疗途径。
发明内容
本发明的目的在于提供靶向抑制GATA3在促进肝脏再生及改善肝损伤中的应用。
在本发明的第一方面，提供GATA3的下调剂的应用，用于：制备促进肝脏再生的组合物；或制备预防、缓解和/或治疗肝损伤的组合物。
在一个优选例中，所述的组合物还用于：促进内皮细胞的增殖。
在另一优选例中，促进内皮细胞的成环能力。
在另一优选例中，促进残余肝脏或受损后肝脏内新生血管的产生。
在另一优选例中，加速肝切除术后肝体比和肝功能的恢复。
在另一优选例中，所述的内皮细胞包括(但不限于)：肝窦内皮细胞(LSEC)，血管内皮细胞(如静脉内皮细胞)以及淋巴管内皮细胞。
在另一优选例中，所述GATA3的下调剂包括选自(但不限于)：针对GATA3的化学小分子(化合物)拮抗剂或抑制剂；敲除或沉默GATA3的试剂；特异性与GATA3结合的结合分子如抗体；或干扰GATA3与效应分子相互作用的试剂。
在另一优选例中，所述针对GATA3的化学小分子拮抗剂或抑制剂包括：特异性抑制GATA3或其上游或下游信号通路(包括通路蛋白)的化学小分子；较佳地，所述针对GATA3的化学小分子拮抗剂或抑制剂包括(但不限于)：K-7174或Pyrrothiogatain。
在另一优选例中，所述敲除或沉默GATA3的试剂包括(但不限于)：特异性干扰GATA3的编码基因表达的干扰分子，针对GATA3的CRISPR基因编辑试剂，针对GATA3的同源重组试剂或定点突变试剂，所述同源重组试剂或定点突变试剂将GATA3进行功能丧失性突变；较佳地，所述干扰分子包括(但不限于)shRNA、siRNA、miRNA、反义核酸，或能形成所述shRNA、siRNA、miRNA、反义核酸的构建体；更佳地，所述敲除或沉默GATA3的试剂为干扰分子，靶向于SEQ ID NO:3所示核苷酸序列中第974-998位、第258-282位或其组合；较佳地靶向于SEQ ID NO:3所示核苷酸序列中第974-998位或其组合。
在另一优选例中，K-7174在所述组合物中的浓度为1～100uM或0.1～30％(w/v)。
在另一优选例中，Pyrrothiogatain在所述组合物中的浓度为3～300uM或0.2～50％(w/v)。
在另一优选例中，所述下调剂(如干扰分子或sgRNA等)通过表达构建物(表达载体)引入到靶向部位(病灶，如术后肝脏)；所述表达构建物包括：病毒载体，非病毒载体；较佳地所述病毒载体包括(但不限于)：腺病毒载体，腺相关病毒载体，慢病毒载体，逆转录病毒载体。
在另一优选例中，所述的K-7174在所述组合物中的浓度例如为2、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80或90uM。
在另一优选例中，所述的K-7174在所述组合物中的浓度例如为0.2％、0.5％、1％、2％、5％、8％、10％、15％、20％或25％(w/v)。
在另一优选例中，所述的Pyrrothiogatain在所述组合物中的浓度例如为5、10、15、20、30、50、80、100、150、200或250uM。
在另一优选例中，所述的Pyrrothiogatain在所述组合物中的浓度例如为0.3％、0.5％、0.8％、1％、2％、5％、10％、15％、20％、30％、40％或45％(w/v)。
在另一优选例中，所述的肝损伤包括肝脏手术后肝脏功能障碍，肝炎、肝纤维化、肝硬化、终末期肝病、肝癌、酒精肝、肝脏代谢疾病或肝功能衰竭导致的肝损伤。
在另一优选例中，所述的肝脏手术包括以正常肝脏再生能力为基础的、通过损毁病变部位肝组织，保留正常肝组织并使其代偿增生发挥正常肝功能的治疗方法；更佳地包括但不限于：传统肝大部切除术、门静脉结扎的二次肝切除术(Portal Vein Ligation，PVL)、联合肝脏分割和门静脉结扎的二次肝切除术(Associating Liver Partition andPortal Vein Ligation for Staged Hepatectomy，ALPPS)、射频消融术、微波消融术、冰冻消融术、肝动脉介入栓塞化疗、肝动脉介入栓塞放疗、立体定向放疗。
在本发明的另一方面，提供特异性识别或扩增GATA3的试剂的用途，用于制备对肝再生能力或肝损伤进行诊断或预后评估的诊断试剂或试剂盒；较佳地，所述的试剂包括(但不限于)：特异性结合GATA3蛋白的结合分子(如抗体或配体)；特异性扩增GATA3基因的引物；特异性识别GATA3基因的探针；或特异性识别GATA3基因的芯片。
在本发明的另一方面，提供一种用于促进肝脏再生或预防、缓解和/或治疗肝损伤的药物组合物或药盒，其中包括GATA3的下调剂，所述下调剂包括选自：特异性抑制GATA3或其上游或下游信号通路(包括通路蛋白)的化学小分子，或敲除或沉默GATA3的试剂；较佳地，所述针对GATA3的化学小分子拮抗剂或抑制剂包括(但不限于)：K-7174或Pyrrothiogatai；较佳地，所述敲除或沉默GATA3的试剂包括(但不限于)：特异性干扰GATA3的编码基因表达的干扰分子，针对GATA3的CRISPR基因编辑试剂，针对GATA3的同源重组试剂或定点突变试剂，所述同源重组试剂或定点突变试剂将GATA3进行功能丧失性突变；较佳地，所述干扰分子包括(但不限于)shRNA、siRNA、miRNA、反义核酸，或能形成所述shRNA、siRNA、miRNA、反义核酸的构建体；更佳地，所述敲除或沉默GATA3的试剂为干扰分子，靶向于SEQ ID NO:3所示核苷酸序列中第974-998位、第258-282位或其组合；较佳地靶向于SEQID NO:3所示核苷酸序列中第974-998位或其组合。
在另一优选例中，所述的组合物是药物组合物、生物活性制剂组合物、保健品组合物或食物组合物。
在另一优选例中，所述的组合物是将靶向GATA3基因的下调剂(包括生物活性制剂、GATA3相关抑制剂)中的一种或多种与药学上可接受的载体混合，获得刺激肝脏手术后肝脏再生以及预防、缓解和/或治疗肝切除术后肝脏功能障碍的组合物。
在本发明的另一方面，提供一种筛选促进肝脏再生或预防、缓解和/或治疗肝损伤的潜在物质的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)用候选物质处理一表达体系，该体系表达GATA3；和，
(2)检测所述体系中GATA3的表达或活性；若所述候选物质在统计学上下调(显著下调，如下调10％以上，20％以上，50％以上，80％以上等，或使之不表达或没有活性)GATA3的表达或活性，则该候选物质是促进肝脏再生或预防、缓解和/或治疗肝损伤的潜在物质。
在一个优选例中，步骤(1)所述体系为内皮细胞(培养物)体系；较佳地，所述的内皮细胞包括(但不限于)：肝窦内皮细胞(LSEC)，血管内皮细胞(如静脉内皮细胞)，淋巴管内皮细胞；步骤(2)还包括：检测所述体系中内皮细胞的增殖能力或成环能力；若其增殖能力或成环能力被促进(显著被促进，如提高10％以上，20％以上，50％以上，80％以上或更高)，则该候选物质是促进肝脏再生或预防、缓解和/或治疗肝损伤的潜在物质。
在另一优选方式中，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到所述表达体系中；和/或，步骤(2)包括：检测所述体系中GATA3的表达或活性、或检测内皮细胞的增殖能力或成环能力；并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达体系；若所述候选物质在统计学上下调GATA3的表达或活性、或使内皮细胞的增殖能力或成环能力在统计学上下降，则该候选物质是促进肝脏再生或预防、缓解和/或治疗肝损伤的潜在物质。
在另一优选方式中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对GATA3、其片段或变异体、其编码基因或其上下游分子或信号通路设计的调控分子或其构建体(如shRNA，siRNA，基因编辑实际，表达载体，重组的病毒或非病毒构建体等)，化学小分子(如特异性抑制剂或拮抗剂)，相互作用分子等。
在另一优选例中，所述的体系选自：细胞体系(如表达GATA3的细胞或细胞培养物)、亚细胞(培养物)体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。
在另一优选例中，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于促进肝脏再生以及预防、缓解和/或治疗肝损伤有用的物质。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、野生型和肝细胞过表达Gata3(Control和Gata3hep)小鼠ALPPS术围手术期的生存曲线(左图)；以及，Control和Gata3hep小鼠ALPPS术围手术期的肝体比恢复曲线(右图)。
图2、Control和Gata3hep小鼠在ALLPS I期术后2天和6天，肝组织的多重免疫荧光染色图。
图3、Gata3hep小鼠在回补K-7174或Pyrrothiogatain后，ALPPS术围手术期的生存曲线(左上)；Gata3hep小鼠在回补K-7174或Pyrrothiogatain后，ALPPS术围手术期的肝体比恢复曲线(右上)；Gata3hep小鼠在回补K-7174或Pyrrothiogatain后，肝功能检测血清ALT和AST图(下)。
图4、Gata3hep小鼠在回补K-7174或Pyrrothiogatain后，ALLPS I期术后2天和6天的肝组织多重免疫荧光染色图。
图5、根据肝切除患者肝组织GATA3转录水平将患者分为3组(左)；以及，肝切除患者肝组织GATA3转录水平与I期术后第3天ALT水平的相关性(右)。
图6、GATA3不同转录水平组添加K-7174或Pyrrothiogatain后，其条件培养基对HUVEC细胞CCK8增殖实验检测图。
图7、GATA3不同转录水平组添加K-7174或Pyrrothiogatain后，其条件培养基刺激HUVEC细胞成环的显微镜明场图(上图)；GATA3不同转录水平组添加K-7174或Pyrrothiogatain后，其条件培养基对HUVEC细胞成环能力的定量分析(下图)。
图8、靶向干扰GATA3不同序列的腺病毒感染肝细胞以后，其条件培养基可以提高HUVEC细胞增殖能力。
具体实施方式
本发明人通过深入的研究分析，首次揭示GATA3在肝脏再生过程中发挥负调控作用，其可以作为诊断或治疗的新型靶点。以其作为靶标，可开发促进肝脏再生、预防、缓解和/或治疗肝损伤的药物；以其作为分子标记，可对肝脏再生能力或肝损伤情况进行诊断、预后评估。同时，本发明人也筛选和优化了可靶向于GATA3且体内体外作用效果特别优异的靶向药物。
GATA3
GATA3，Gene ID:2625，是一种转录因子，包含两个锌指结构，表达于T细胞、内皮细胞、胎盘和肾上腺，是T细胞发育的重要调控因子。在一些类型的肿瘤中，该基因都证明与肿瘤的侵袭和转移等不良预后有关。也有研究表明，GATA3在肿瘤的血管生成中发挥重要作用，具体机制表现为：肿瘤细胞通过表达血管生成因子VEGF和炎性细胞因子TNF诱导GATA3介导的CX3CL1表达抑制，从而加速促血管新生单核细胞外渗。募集的促血管新生单核细胞通过释放MMP9来加速血管生成。该基因缺陷会引起甲状旁腺功能低下、感音神经性耳聋和肾脏发育不良等疾病。目前，已经有基于此基因建立的乳腺癌早期筛查和诊断试剂盒以及预测不孕症患者的妊娠结局的试剂盒(一种用于乳腺癌早期筛查和诊断的血清蛋白标志物、试剂盒及检测方法；中国发明201911014029，20191023；李玉叶等，一种用于预测不孕症患者的妊娠结局的生物标志物及其应用；中国发明202010744091，20200729)。除此以外，通过抑制GATA3蛋白介导的Th2细胞的分化，对Th2细胞因子相关变态反应病和小儿哮喘进行治疗和/或预防的药物也有相关报道(新井贤一等，治疗和/或预防Th2细胞因子相关变态反应病的诱骗物、GATA3突变蛋白、和包含它们的药物组合物；蔡欣等，一种检测儿童哮喘的标志物及引物.中国，发明，201310299330，20130717)。由此可见，本领域中对于GATA3的研究显示其具有多种功能，然而至今没有研究人员将其与肝脏再生以及促进肝损伤的恢复加以关联。本发明人在深入的体外以及体内研究后，确定了以GATA3作为肝脏再生的研究靶点。
本发明所述GATA3可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自哺乳动物。此外，所述的GATA3也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来生产重组GATA3，以应用于实验或临床。在应用时，可采用重组的GATA3。所述的GATA3包括全长的GATA3或其生物活性片段。优选地，所述的GATA3的氨基酸序列可以与SEQ ID NO:4(人)或SEQ ID NO:2(鼠)所示的序列基本上相同；其核苷酸序列可以与SEQ ID NO:3(人)或SEQ IDNO:1(鼠)所示的序列基本上相同。
经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的GATA3的氨基酸序列也包括在本发明中。GATA3或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。预期可用的GATA3的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，GATA3的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的GATA3的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长GATA3的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长GATA3的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。
围绕这一GATA3靶点，本发明人进行了深入的实验论证，所述实验论证包括细胞水平上以及动物水平上的论证，确定了GATA3基因和肝再生的关系。根据本发明的实施例，GATA3基因的过表达可以抑制ALPPS术后的肝再生，延迟ALPPS术后肝功能的恢复。靶向抑制GATA3表达，如使用GATA3抑制其表达的相关制剂，干扰GATA3基因的表达，抑制GATA3生物学功能的相关制剂等，可以刺激ALPPS术后的肝再生，加速ALPPS术后肝功能的恢复。
在本发明的更具体的实施例中，本发明人运用肝脏类器官共培养技术、内皮细胞体外增殖和成环功能检测、动物体内肝功能检测、肝组织免疫荧光、实时定量PCR等多种实验手段，确定了GATA3基因在肝再生中的作用，具体如下：1、肝细胞过表达GATA3可明显降低ALPPS术后动物的存活率；2、肝细胞过表达GATA3可明显降低ALPPS术后动物的肝体比恢复速率；3、肝细胞过表达GATA3可明显降低ALPPS术后肝再生后期肝窦内皮细胞的增殖；4、使用GATA3的抑制剂(K-7174或Pyrrothiogatain)可显著解除(显著逆转)肝细胞过表达GATA3对ALPPS术后动物肝再生的抑制状态，并加快肝细胞过表达GATA3动物ALPPS术后肝功能的恢复；5、将接受肝切除术的患者根据肝组织GATA3转录水平分为低中高组，检测术后3天的ALT水平后发现，GATA3转录水平较高的，I期术后3天时的ALT水平也相对较高；6、建立肝脏类器官与内皮细胞的共培养系统，发现GATA3高表达组类器官的条件培养基对内皮细胞的增殖和成环能力具有明显的抑制作用；7、GATA3的抑制剂(K-7174或Pyrrothiogatain)可显著解除(逆转)GATA3高表达组类器官条件培养基对内皮细胞增殖和成环能力的抑制作用。
由以上结果可知，与野生型动物相比，肝细胞过表达GATA3的动物在ALPPS手术后，肝脏的再生受到明显抑制。使用GATA3抑制剂后，可刺激肝窦内皮细胞细胞的增殖，加快肝体比恢复速率，促进肝功能的恢复，提高ALPPS术后动物的存活率。而且，行肝切除术的患者肝组织中GATA3转录水平与术后肝功能恢复密切相关，GATA3转录水平低的患者，术后肝功能恢复相对较快，可能与血管内皮细胞的功能改善有关。对GATA3高表达组肝脏类器官使用GATA3抑制剂后，可显著解除(逆转)该组类器官的条件培养基对人脐带内皮细胞系HUVEC细胞(作为内皮细胞的细胞模型)增殖和成环能力的抑制作用。因此靶向抑制GATA3具有促进肝再生，加快肝切除术后肝脏功能恢复的作用，为预防、缓解和/或治疗肝切除术后肝脏功能障碍提供了理论依据和临床基础。
针对GATA3基因的上述功能，GATA3的相关抑制剂、靶向干扰GATA3基因的生物活性制剂可作为药物，用于促进肝脏再生以及预防、缓解和/或治疗肝脏手术后的肝功能障碍。GATA3可作为药物靶点，用于筛选促进肝脏再生以及预防、缓解和/或治疗肝脏手术后肝脏功能障碍的药物；GATA3也可以作为基因治疗中的靶基因，用于设计和制备促进肝脏再生以及预防、缓解和/或治疗肝脏手术后肝脏功能障碍药物和/或生物学制剂。
GATA3下调剂及其应用
基于本发明人的上述新发现，本发明提供了一种GATA3或其编码基因的下调剂的用途，用于制备抑制促进肝脏再生以及预防、缓解和/或治疗肝损伤(如肝切除术后肝脏功能障碍)的组合物。
如本文所用，所述的GATA3或其编码基因的下调剂包括了抑制剂、拮抗剂、阻滞剂、阻断剂、降解剂等，这些术语可互换使用。
所述的GATA3或其编码基因的下调剂是指任何可降低GATA3的活性、降低GATA3或其编码基因的稳定性、下调GATA3的表达、减少GATA3有效作用时间、或抑制GATA3基因的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调GATA3有用的物质，从而可用于促进肝再生或预防、缓解或治疗肝损伤(如肝切除术后肝脏功能障碍)。例如，所述的下调剂包括特异性干扰GATA3基因表达的干扰RNA分子或反义核苷酸；特异性与GATA3基因编码的蛋白结合的抗体或配体；等等。
作为本发明的一种尤其优选的方式，所述的下调剂是干扰GATA3作为转录因子与DNA序列结合的分子，以K-7174和Pyrrothiogatain为代表。K-7174(CAS号：191089-60-8)是一种小分子化合物，可以特异地抑制GATA转录因子与VCAM-1等反映内皮细胞功能的相关基因的启动子区结合。Pyrrothiogatain则对GATA家族蛋白的DNA结合活性均表现出抑制作用。具体来说，其通过影响在GATA2至GATA5中均存在的一个高度同源的DNA结合结构域，影响GATA家族与DNA的结合。还有研究发现，Pyrrothiogatain通过影响GATA3DNA结合结构域来抑制GATA3与SOX4之间的相互作用。本发明人的研究结果发现，K-7174和Pyrrothiogatain在动物实验和人肝类器官系统中均表现出对GATA3的抑制作用，且在K-7174(在具体实施例中，体外实验浓度：15μM；体内实验浓度：30mg/kg)和Pyrrothiogatain(在具体实施例中，体外实验浓度：80μM；体内实验浓度：90mg/kg)浓度下，两者的抑制效果没有明显差距。在实施例中，这两种下调剂在不产生可见副作用的情况下，恰到好处地实现有效下调GATA3(不影响与其相关或潜在相关的其它体内机理机制)，有效促进肝再生。
Figure BDA0003095299840000081
在本发明中，所述的小分子化合物(K-7174或Pyrrothiogatain)可以是纯净形式存在的化合物，或纯度大于85％(较佳地大于90％，例如大于95％，98％，99％)的化合物。在得知其化学结构的情况下，所述的小分子化合物可通过化学合成的方式获得。本发明还包括化合物的前体，所述的“前体”指当用适当的方法服用后，该化合物的前体在病人体内进行代谢或化学反应而转变成具有活性的该化合物。
本发明还包括所述小分子化合物(K-7174或Pyrrothiogatain)的异构体、溶剂合物，或它们的药学上可接受的盐，只要它们也具有与K-7174或Pyrrothiogatain相同或基本相同的功能。所述的“药学上可接受的盐”是指化合物与无机酸、有机酸、碱金属或碱土金属等反应生成的盐。这些盐包括(但不限于)：(1)与如下无机酸形成的盐：如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸；(2)与如下有机酸形成的盐，如乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸、马来酸、或精氨酸。其它的盐包括与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以酯、氨基甲酸酯，或其它常规的“前体药物”的形式。化合物具有一个或多个不对称中心。所以，这些化合物可以作为外消旋的混合物、单独的对映异构体、单独的非对映异构体、非对映异构体混合物、顺式或反式异构体存在。
作为本发明的另一尤其优选的方式，所述的下调剂是GATA3特异性的干扰RNA分子(如siRNA、shRNA、miRNA等)，根据本发明中提供的GATA3序列信息，可以制备获得此类干扰RNA分子。对干扰RNA分子的制备方法没有特别的限制，包括但不限于：化学合成法，体外转录法等。所述的干扰RNA可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。本发明人的研究结果发现，针对GATA3基因的不同区段，尽管均可以获得具有一定干扰能力的分子，然而靶向某些特定的区段的干扰序列，其特异性好，靶向抑制效果尤其优异。因此，作为本发明的最为优选的方式，运用靶向于SEQ ID NO:3所示核苷酸序列中第974-998位的干扰分子作为下调剂。该优选的下调剂在不产生可见副作用的情况下，恰到好处地实现有效下调GATA3(不影响其产生的其它体内机理机制)，有效促进肝再生。
作为本发明的一种优选方式，所述的下调剂可以是针对GATA3的小分子化合物。本领域技术人员可以采用本领域的常规筛选方法，来进行这类小分子化合物的筛选。例如，本发明的实施例中，结合本发明所揭示的调控机制，提供了几种可选的筛选方法。
作为本发明的一种可选的方式，可采用CRISPR/Cas(如Cas9)系统进行靶向的基因编辑，从而在靶向疾病的区域敲除GATA3基因。常见的敲除GATA3基因的方法包括：将sgRNA或能形成所述sgRNA的核酸、Cas9 mRNA或能形成所述Cas9mRNA的核酸共转到靶向区域或靶向细胞中。在确定了靶位点之后，可以采用已知的方法来使得sgRNA及Cas9被引入到细胞内。所述的能形成所述sgRNA的核酸为核酸构建体或表达载体，或所述的能形成所述Cas9mRNA的核酸为核酸构建体或表达载体，将这些表达载体导入到细胞内，从而在细胞内形成有活性的sgRNA及Cas9 mRNA。
作为本发明的一种可选的方式，可采用同源重组的方法，特异性地靶向于GATA3，使之发生表达缺陷或缺失表达。也可应用Cre和loxp方法使细胞的基因组中相关基因选择性的敲除，表达降低或失活。
以上为一些代表性的或优选的下调GATA3的方式。在本领域技术人员了解了本发明的总体方案后，还可以采取本领域已知的其它方法来对GATA3进行调控，这些方法也包含在本发明中。
诊断及预后评估相关的应用
本发明中，揭示了对肝再生有着重要调控作用的靶标。基于本发明人的这一新发现，可以将GATA3作为诊断或预后肝再生能力或肝损伤回复情况的靶标：(i)进行肝损伤后的分型、鉴别诊断；(ii)评估相关人群(如经肝脏手术的人群)的治疗药物、药物疗效、预后，以及选择合适的治疗方法。比如，可分离出GATA3的基因表达异常的人群，从而可进行更有针对性的靶向治疗。
可以通过判断待评估样本中GATA3的表达情况或活性情况，来预测提供该待评估样本的受试者的预后情况，选择合适的药物实施治疗。通常，可以规定一个GATA3表达的阈值，当GATA3的表达情况高于所规定的阈值时，考虑采用抑制GATA3的方案进行治疗。所述的阈值对于本领域技术人员而言是易于确定的，例如可以通过将正常人细胞或组织中的GATA3的表达情况与受试者细胞或组织中的GATA3的表达情况进行比较后，获得GATA3表达异常的阈值。根据测定参数、测定仪器等的不同，所述的阈值的具体数值可以是不同的。
可采用各种本领域已知的技术来检测GATA3的基因的存在与否以及表达情况，这些技术均包含在本发明中。例如可用已有的技术如Southern印迹法、Western印迹法、DNA序列分析、PCR等，这些方法可结合使用。
本发明还提供了用于在分析物中检测GATA3或其编码基因的存在与否以及表达情况的试剂。优选的，当进行基因水平的检测时，可以采用特异性扩增GATA3的引物；或特异性识别GATA3的探针来确定GATA3基因的存在与否；当进行蛋白水平的检测时，可以采用特异性结合GATA3编码的蛋白的抗体或配体来确定GATA3的表达情况。
利用特异性结合GATA3的抗体来检测分析物中GATA3表达情况的方法是本领域人员熟知的技术。
针对GATA3基因的特异性探针的设计是本领域人员熟知的技术，例如，制备一种探针，其可与GATA3基因上特定位点发生特异性结合，而不与GATA3基因以外的其它基因特异性结合，且所述探针带有可检测信号。
本发明还提供了用于在分析物中检测GATA3基因的存在与否以及表达情况的试剂盒，该试剂盒包括：特异性扩增GATA3基因的引物；特异性识别GATA3基因的探针；或特异性结合GATA3基因编码的蛋白的抗体或配体。
此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。
此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或核酸序列分析软件等。
药物筛选
在得知了GATA3与肝再生的密切相关性后，可以基于该特征来筛选抑制GATA3或其编码基因的表达或活性的物质。可从所述的物质中找到对于促进肝再生或预防、缓解或治疗肝损伤真正有用的药物。
因此，本发明提供一种筛选促进肝再生或预防、缓解或治疗肝损伤的潜在物质(候选物质或候选药物)的方法，所述的方法包括：用候选物质处理表达GATA3的体系；和检测所述体系中GATA3的表达或活性；若所述候选物质可抑制GATA3的表达或活性，则表明该候选物质是促进肝再生或预防、缓解或治疗肝损伤的潜在物质。所述的表达GATA3的体系较佳的是细胞(或细胞培养物)体系，所述的细胞可以是内源性表达GATA3的细胞；或可以是重组表达GATA3的细胞。此外，也可通过观测GATA3与其上下游蛋白的相互作用情况，来评估所述潜在物质是否是有用的。
结合本发明人的研究结果，作为本发明的筛选方法的优选方式，还可进一步通过分析肝组织来源的内皮细胞的增殖能力或成环能力，来确定所述潜在物质(候选物质或候选药物)的有效性。这通常可以通过培养表达GATA3的肝细胞及其与内皮细胞的共培养筛选系统来进行分析。增殖能力或成环能力的可观测到的提高，预示这该潜在物质的有效性。
在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到GATA3的表达或活性的改变，还可设置对照组(Control)，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达GATA3的体系。所述的对照组包括但不限于：不加候选物质的空白对照、空质粒对照等。
作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于促进肝再生或预防、缓解或治疗肝损伤真正有用的物质。
另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的促进肝再生或预防、缓解或治疗肝损伤的潜在物质。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于抑制GATA3的表达和活性，进而促进肝再生或预防、缓解或治疗肝损伤有用的物质。
药物组合物
本发明还提供了一种药物组合物，它含有有效量(如0.000001-50wt％；较佳的0.00001-20wt％；更佳的0.0001-10wt％)的所述的GATA3或其编码基因的下调剂，以及药学上可接受的载体。
作为本发明的一种优选方式，提供了一种用于促进肝再生或预防、缓解或治疗肝损伤的组合物，所述的组合物含有有效量的GATA3或其编码基因的下调剂，以及药学上可接受的载体。
在本发明的优选方式中，所述的下调剂包括但不限于：敲除或沉默GATA3的试剂，特异性与GATA3结合的结合分子(如抗体或配体)，针对GATA3的化学小分子拮抗剂或抑制剂，等等。在更具体的方式中，所述的下调剂包括但不限于：特异性干扰GATA3的编码基因表达的干扰分子，针对GATA3的CRISPR基因编辑试剂，针对GATA3的同源重组试剂或定点突变试剂，所述同源重组试剂或定点突变试剂将GATA3进行功能丧失性突变。尤其优选地，所述组合物中包含有特异性中和GATA3的抗体；或干扰分子，其靶向于SEQ ID NO:3所示核苷酸序列中第974-998位或其组合。
本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由…组成”和“由…组成”包含在术语“含有”中。
如本文所用，所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂、稀释剂、溶剂、悬浮剂等，可以是液体或固体，其是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的物质。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。
本发明所述的药物组合物的剂型可以是多种可行的剂型，只要是能够使活性成分有效地到达哺乳动物体内的剂型都是可以的。作为本发明的优选方式，所述的药物组合物的剂型是溶液，其中GATA3抗体以溶胶的形式存在于适宜液体载体或稀释液中。
在得知了所述GATA3或其编码基因的下调剂的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的下调剂或其编码基因、或其药物组合物给药于哺乳动物或人。
优选的，可采用基因治疗的手段进行。比如，可直接将GATA3的下调剂通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带GATA3的下调剂的表达单位(比如表达载体或病毒等，或siRNA)递送到靶点上，并使之表达活性的GATA3下调剂，具体情况需视所述的下调剂的类型而定。优选地，所述下调剂通过表达构建物(表达载体)引入到靶向部位(病灶，如术后肝脏)；所述表达构建物包括：病毒载体，非病毒载体；较佳地所述病毒载体包括但不限于：腺病毒载体，腺相关病毒载体，慢病毒载体，逆转录病毒载体。
本发明所述的GATA3或其编码基因的下调剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的GATA3或其编码基因的下调剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。
本发明的具体实施例中，给出了一些针对动物如鼠的给药方案。从动物如鼠的给药剂量换算为适用于人类的给药剂量是本领域技术人员易于作出的，例如可根据Meeh-Rubner公式来进行计算：Meeh-Rubner公式：A＝k×(W2/3)/10,000。式中A为体表面积，以m2计算；W为体重，以g计算；K为常数，随动物种类而不同，一般而言，小鼠和大鼠9.1，豚鼠9.8，兔10.1，猫9.9，狗11.2，猴11.8，人10.6。应理解的是，根据药物以及临床情形的不同，根据有经验的药师的评估，给药剂量的换算是可以变化的。
在优选的实施方式中，所述的组合物中作为活性成分的病毒载体MOI值可以是1-100，更佳地5-50；进一步更佳地8-20。GATA3抗体或GATA3相关抑制剂剂量范围为0.1mg-1g/kg(更佳地1mg-0.5g/kg；进一步更佳地10mg-0.1g/kg)。应理解，根据实际临床所需，所述用量也可以是高于或低于这些范围的。
在优选的实施方式中，所述的药物组合物是口服制剂或注射制剂。
在优选的实施方式中，还包括在组合物中添加GATA3抗体或GATA3相关抑制剂以外的可以刺激肝再生的有效药物。
本发明还提供了含有所述的药物组合物或直接含有所述的GATA3或其编码基因的下调剂的药盒。此外，所述的药盒中还可包括说明药盒中药物的使用方法的说明书。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
序列信息
小鼠GATA3基因序列(SEQ ID NO:1；NM_008091.3)：
atggaggtgactgcggaccagccgcgctgggtgagccaccatcaccccgcggtcctcaacggtcagcacccagacacgcaccacccgggcctcggccattcgtacatggaagctcagtatccgctgacggaagaggtggacgtactttttaacatcgatggtcaaggcaaccacgtcccgtcctactacggaaactccgtcagggctacggtgcagaggtatcctccgacccaccacgggagccaggtatgccgcccgcctctgctgcacggatctctgccctggctggatggcggcaaagccctgagcagccaccacaccgcctcgccctggaacctcagccccttctccaagacgtccatccaccacggctctccggggcctctgtccgtttaccctccggcttcatcctcttctctggcggccggccactccagtcctcatctcttcaccttcccgcccaccccgccgaaagacgtctccccagacccgtcgctgtccaccccgggatccgccgggtcggccaggcaagatgagaaagagtgcctcaagtatcaggtgcagctgccagatagcatgaagctggagacgtctcactctcgaggcagcatgaccaccctgggtggggcctcatcctcagcccaccaccccattaccacctatccgccctatgtgcccgagtacagctctggactcttcccacccagcagcctgctgggaggatcccctaccgggttcggatgtaagtcgaggcccaaggcacgatccagcacagaaggcagggagtgtgtgaactgcggggcaacctctaccccactgtggcggcgagatggtaccgggcactacctttgcaatgcctgcggactctaccataaaatgaatgggcagaaccggccccttatcaagcccaagcgaaggctgtcggcagcaaggagagcagggacatcctgcgcgaactgtcagaccaccaccaccaccctctggaggaggaacgctaatggggacccggtctgcaatgcctgtgggctgtactacaagcttcataatattaacagacccctgactatgaagaaagaaggcatccagacccgaaaccggaagatgtctagcaaatcgaaaaagtgcaaaaaggtgcatgacgcgctggaggacttccccaagagcagctccttcaacccggccgctctctccagacacatgtcatccctgagccacatctctcccttcagccactccagccacatgctgaccacaccgacgcccatgcatccgccctccggcctctccttcggacctcaccacccttccagcatggtcaccgccatgggttag
小鼠GATA3氨基酸序列(SEQ ID NO:2；NM_008091.3)：
MEVTADQPRWVSHHHPAVLNGQHPDTHHPGLGHSYMEAQYPLTEEVDVLFNIDGQGNHVPSYYGNSVRATVQRYPPTHHGSQVCRPPLLHGSLPWLDGGKALSSHHTASPWNLSPFSKTSIHHGSPGPLSVYPPASSSSLAAGHSSPHLFTFPPTPPKDVSPDPSLSTPGSAGSARQDEKECLKYQVQLPDSMKLETSHSRGSMTTLGGASSSAHHPITTYPPYVPEYSSGLFPPSSLLGGSPTGFGCKSRPKARSSTEGRECVNCGATSTPLWRRDGTGHYLCNACGLYHKMNGQNRPLIKPKRRLSAARRAGTSCANCQTTTTTLWRRNANGDPVCNACGLYYKLHNINRPLTMKKEGIQTRNRKMSSKSKKCKKVHDALEDFPKSSSFNPAALSRHMSSLSHISPFSHSSHMLTTPTPMHPPSGLSFGPHHPSSMVTAMG
人GATA3(SEQ ID NO:3；NM_001002295.2；1332bp)：
atggaggtgacggcggaccagccgcgctgggtgagccaccaccaccccgccgtgctcaacgggcagcacccggacacgcaccacccgggcctcagccactcctacatggacgcggcgcagtacccgctgccggaggaggtggatgtgctttttaacatcgacggtcaaggcaaccacgtcccgccctactacggaaactcggtcagggccacggtgcagaggtaccctccgacccaccacgggagccaggtgtgccgcccgcctctgcttcatggatccctaccctggctggacggcggcaaagccctgggcagccaccacaccgcctccccctggaatctcagccccttctccaagacgtccatccaccacggctccccggggcccctctccgtctaccccccggcctcgtcctcctccttgtcggggggccacgccagcccgcacctcttcaccttcccgcccaccccgccgaaggacgtctccccggacccatcgctgtccaccccaggctcggccggctcggcccggcaggacgagaaagagtgcctcaagtaccaggtgcccctgcccgacagcatgaagctggagtcgtcccactcccgtggcagcatgaccgccctgggtggagcctcctcgtcgacccaccaccccatcaccacctacccgccctacgtgcccgagtacagctccggactcttcccccccagcagcctgctgggcggctcccccaccggcttcggatgcaagtccaggcccaaggcccggtccagcacaggcagggagtgtgtgaactgtggggcaacctcgaccccactgtggcggcgagatggcacgggacactacctgtgcaacgcctgcgggctctatcacaaaatgaacggacagaaccggcccctcattaagcccaagcgaaggctgtctgcagccaggagagcagggacgtcctgtgcgaactgtcagaccaccacaaccacact ctggaggaggaatgccaatggggaccctgtctgcaatgcctgtgggctctactacaagcttcacaatattaacagacccctgactatgaagaaggaaggcatccagaccagaaaccgaaaaatgtctagcaaatccaaaaagtgcaaaaaagtgcatgactcactggaggacttccccaagaacagctcgtttaacccggccgccctctccagacacatgtcctccctgagccacatctcgcccttcagccactccagccacatgctgaccacgcccacgccgatgcacccgccatccagcctgtcctttggaccacaccacccctccagcatggtcaccgccatgggttag
人GATA3氨基酸序列(SEQ ID NO:4；NM_001002295.2)：
MEVTADQPRWVSHHHPAVLNGQHPDTHHPGLSHSYMDAAQYPLPEEVDVLFNIDGQGNHVPPYYGNSVRATVQRYPPTHHGSQVCRPPLLHGSLPWLDGGKALGSHHTASPWNLSPFSKTSIHHGSPGPLSVYPPASSSSLSGGHASPHLFTFPPTPPKDVSPDPSLSTPGSAGSARQDEKECLKYQVPLPDSMKLESSHSRGSMTALGGASSSTHHPITTYPPYVPEYSSGLFPPSSLLGGSPTGFGCKSRPKARSSTGRECVNCGATSTPLWRRDGTGHYLCNACGLYHKMNGQNRPLIKPKRRLSAARRAGTSCANCQTTTTTLWRRNANGDPVCNACGLYYKLHNINRPLTMKKEGIQTRNRKMSSKSKKCKKVHDSLEDFPKNSSFNPAALSRHMSSLSHISPFSHSSHMLTTPTPMHPPSSLSFGPHHPSSMVTAMG
实施例1、肝细胞过表达Gata3对于ALPPS术后肝再生的作用
肝细胞过表达Gata3(Gata3hep)的小鼠的建立：通过Floxp-CRISPR-Cas9小鼠与ALB-Cre小鼠杂交得到能够在肝细胞特异性过表达Cas9蛋白的小鼠。通过尾静脉注射含有“AAV-CAG-FLEX-GATA3-3FLAG”元件的AAV8病毒，该元件中含有有效编码靶基因GATA3的cDNA序列(SEQ ID NO:1；NM_008091.3)(为提高Gata3表达的基因编码序列)输入小鼠细胞内，一段时间后实现Gata3的过表达；该病毒载体由和元生物提供，载体名称为AG28304，插入的酶切位点是KpnI和XhoI。
本实施例中，借助野生型(Control)和肝细胞过表达Gata3(Gata3hep)的小鼠，制备联合肝脏分割与门静脉结扎的分步肝切除术(ALPPS)的动物(小鼠)模型，观察肝脏恢复情况。主要操作步骤如下：
(1)Control和Gata3hep雄性小鼠(8周龄)各25只，均接受相同的ALPPS手术，一期手术后48小时行二期手术。
(2)从I期手术开始至术后第10天，记录两组小鼠生存情况。根据剩余存活小鼠数量，从I期手术开始，于术后1，2，3，4，6，9天分别处死3-4只小鼠，处死前称取肝重及体重，尾静脉取血300uL，离心后取血清检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨基转移酶(AST)；所取肝脏一半冷冻，储存于-80℃超低温冰箱备用；另一半用福尔马林液固定，石蜡包埋备用。
术后的测定结果如图1所示，与Control组相比，Gata3hep组小鼠ALPPS I期手术后生存率无明显差异，但II期手术(I期术后第二天)后生存率更低(左)；肝体比恢复速率较慢(右)。
实施例2、免疫荧光组织化学染色检测肝细胞过表达Gata3对于ALPPS术后肝再生的作用
如实施例1所述的方法进行ALPPS手术，制作小鼠ALPPS术模型，分别获取Control组和Gata3hep组I期术后2天和6天的肝组织。切片后对肝细胞的特异性标志物HNF4α、肝窦内皮细胞(LSEC)的特异性标志物LYVE1和增殖细胞特异性的核抗原Ki-67进行免疫荧光染色，并通过共聚焦显微镜进行观察计数。Ki-67是一种增殖细胞相关核抗原，其功能与有丝分裂密切相关，在细胞增殖中必不可少，其染色阳性说明细胞增殖活跃。
免疫荧光染色方法主要步骤如下：
(1)将肝组织进行石蜡包埋，获得石蜡切片，脱蜡至水；
(2)3％H2O2室温10min，水洗；
(3)抗原酸性修复；
(4)1％BSA封闭30min；
(5)滴加Ki-67抗体(1：100，Cell Signaling Technology)，4℃过夜；
(6)滴加辣根过氧化物酶标记的二抗(上海长岛生物)，37℃30min；
(7)滴加TSA荧光染色液(Perkin Elmer)，室温30min；
(8)洗片；
(9)按步骤5-8分别滴加抗体HNF4α(1：200，Abcam)和LYVE1(1：200，Abcam)；
(10)DAPI染色，甘油封片，Leica共聚焦显微镜观察。
如图2所示，I期术后2天(肝细胞增殖高峰期)，Control组和Gata3hep组增殖的肝细胞比例相似，但I期术后6天(LSEC增殖高峰期)，Gata3hep组LSEC增殖细胞比例远低于Control组。
该结果说明，肝细胞过表达Gata3主要通过抑制LSEC增殖降低肝再生后期恢复速率。
实施例3、靶向抑制Gata3对于ALPPS术后肝再生的影响
本实施例中，借助野生型(Control)和肝细胞过表达Gata3(Gata3hep)的小鼠，制备联合肝脏分割与门静脉结扎的分步肝切除术(ALPPS)的动物(小鼠)模型，观察肝脏恢复情况。主要操作步骤如下：
(1)Gata3hep雄性小鼠(8周龄)共50只，随机分为两组，均接受相同的ALPPS手术，一期手术后48小时行二期手术。
(2)两组一期手术的围手术期(术前12小时至术后48小时)每隔12小时补充一次Gata3的抑制剂，一组给予K-7174，另一组给予Pyrrothiogatain。K-7174浓度为30mg/kg，Pyrrothiogatain浓度为90mg/kg。
(3)同实施例1。
术后的测定结果如图3所示，与未注射抑制剂的Gata3hep组小鼠相比，K-7174组和Pyrrothiogatain组ALPPS I期手术后生存率无明显差异，但II期手术(I期术后第二天)后生存率明显增加(左上)；肝体比恢复速率加快(右上)；并且肝功能恢复速度加快(下)。K-7174组和Pyrrothiogatain组之间无明显差异。
实施例4、免疫荧光组织化学染色检测肝细胞过表达Gata3对于ALPPS术后肝再生的作用
如实施例3所述的方法进行ALPPS手术，制作小鼠ALPPS术模型，分别获取K-7174组和Pyrrothiogatain组I期术后2天和6天的肝组织。
其余操作同实施例2。
Gata3hep小鼠在给予K-7174或Pyrrothiogatain后，ALLPS I期术后2天和6天的肝组织多重免疫荧光染色图如图4所示。以K-7174或Pyrrothiogatain处理后，抑制了Gata3过表达，LSEC增殖细胞数量发生显著性增加。
该结果说明，抑制Gata3过表达动物的Gata3功能可以增加LSEC增殖细胞数量，逆转因过表达Gata3导致的肝再生恢复受阻现象。
实施例5、行肝切除患者肝组织GATA3转录水平与术后ALT水平的相关性
本实施例中，分析行大部肝切除术患者肝组织中GATA3转录水平与术后ALT水平。
主要操作步骤如下：
(1)在取得本院伦理委员会批准并与患者签署知情同意书后，取术中患者新鲜的癌旁组织，一部分用Trizol充分震荡裂解后，乙醇提取法抽提其中RNA；另一部分保存于4℃培养基中，在8小时内用于实施例7、8、9。
(2)通过M-MLV(Invitrogen，28025013)逆转录体系得到cDNA。
(3)通过qRT-PCR体系检测GATA3在肝组织中的转录水平。
(4)将GATA3转录水平与术后3天的血清ALT水平进行关联性分析。
结果如图5(左)所示，根据肝组织中GATA3转录水平的高低可将患者分为GATA3低中高三组(高：No.1～9；中：No.10～20；低：No.21～28)。结合I期术后第6天ALT水平分析后发现，GATA3转录水平高组术后ALT水平高于GATA3转录水平低组(图5；右)。
因此，行大部肝切除术患者肝组织中GATA3转录水平的高低与术后ALT水平有关，GATA3转录水平较高，其术后ALT水平也相对较高。
实施例6、靶向干扰人肝类器官中的GATA3，可以显著逆转GATA3高表达组条件培养基对HUVEC细胞增殖的抑制作用
本实施例中，首先观察不同GATA3表达水平的人肝类器官，其条件培养基对于HUVEC细胞的增殖的影响。然后利用GATA3的靶向抑制K-7174和Pyrrothiogata干扰人肝类器官中GATA3后，分析其对于HUVEC细胞的增殖的影响。
主要操作步骤如下：
(1)取实施例5中术中患者新鲜的癌旁组织，组织减剪碎成1-2mm左右，用1mg/ml胶原酶37℃消化1-1.5小时，至没有肉眼可见组织碎块时加入等体积完全培养基停止消化。
(2)70μm滤网过滤细胞混悬液后离心，50g×3min，离心两次，收集管底肝细胞。
(3)培养基与Matrigel基质胶混合重悬后，将肝细胞种植至24孔板中，种植密度为3-5×104每孔，每个患者的肝细胞种植15个孔。带基质胶凝固后每孔加入500uL培养基。
(4)1天后换液，将15个孔分为NS组，K-7174组和Pyrrothiogatain组各5个孔。其中K-7174浓度为15μM，Pyrrothiogatain浓度为80μM，NS组为添加等量生理盐水。2-3天换液一次，培养至每孔肝类器官数量≥50，收集换液得到的条件培养基。
(5)将此条件培养基与-完全培养基1:1混合后培养HUVEC细胞，并进行CCK8检测。
结果如图6所示，GATA3高转录水平组的肝细胞的条件培养基对HUVEC细胞的增殖具有明显的抑制作用。提示肝细胞中的GATA3可以通过调节血管内皮的功能影响肝切除术后肝功能的恢复。而其抑制剂K-7174和Pyrrothiogatain可以显著逆转GATA3高转录水平组条件培养基对HUVEC细胞增殖的抑制作用。
实施例7、靶向干扰人肝类器官中的GATA3，可以显著逆转GATA3高表达组条件培养基对HUVEC细胞成环的抑制作用
本实施例中，首先观察不同GATA3表达水平的人肝类器官，其条件培养基对于HUVEC细胞的增殖的影响。然后利用GATA3的靶向抑制K-7174和Pyrrothiogata干扰人肝类器官中GATA3后，分析其对于HUVEC细胞的增殖的影响。
主要操作步骤如下：
(1)-(4)同实施例6。
(5)HUVEC按5×103/孔密度接种于u-slide血管生成载玻片，接种前孔板需用10μLMatrigel铺板。
(6)将之前收集的条件培养基与完全培养基1:1混合后培养HUVEC细胞。
(7)用混合培养基培养HUVEC 24小时后，显微镜明场下观察成环情况。
结果如图7所示，GATA3高转录水平组的肝细胞的条件培养基对HUVEC细胞的成环具有明显的抑制作用。提示肝细胞中的GATA3可以通过调节血管内皮的功能影响肝切除术后肝功能的恢复。而其抑制剂K-7174和Pyrrothiogatain可以刺激受损后肝脏内新生血管的产生，显著逆转高转录水平组条件培养基对HUVEC细胞成环的抑制作用。
实施例8、靶向干扰行肝切除术患者肝细胞中GATA3对于HUVEC细胞增殖和成环的作用
本实施例中，利用腺病毒介导靶向干扰行肝切除术患者肝细胞中GATA3，分析对于HUVEC细胞的增殖的影响。
根据人来源的GATA3(SEQ ID NO:3)来确定干扰的靶序列；经过筛选分析，本发明人确定以下两个siGATA3：
siGATA3-1(序列1)：5′-ccacacucuggaggaggaaugccaa-3′(SEQ ID NO:5)，对应于SEQ ID NO:3第974-998位点；
siGATA3-2(序列2)：5′-cccgccucugcuucauggaucccua-3′(SEQ ID NO:6)，对应于SEQ ID NO:3第258-282位点。
腺病毒载体为获自上海和元生物有限公司。
将上述序列引入到腺病毒载体的EcoRⅠ和XbaⅠ位点中。
主要操作步骤如下：
(1)根据实施例5中患者GATA3转录水平，选取GATA3高表达组的新鲜癌旁组织，组织减剪碎成1-2mm左右，用1mg/ml胶原酶37℃消化1-1.5小时，至没有肉眼可见组织碎块时加入等体积完全培养基停止消化。
(2)70μm滤网过滤细胞混悬液后离心，50g×3min，离心两次，收集管底肝细胞。
(3)培养基重悬后将肝细胞种植至I型胶原包被的6孔板中，种植密度为1.2-1.5×106每孔，每个患者的肝细胞种植5个孔。
(4)6小时后换液，除去没有贴壁的细胞。
(5)用空载体与载有不同序列的腺病毒感染肝细胞(MOI＝8)，48小时后换液。
(6)换液后再培养48小时，收集肝细胞培养基，将此条件培养基与-完全培养基1:1混合后培养HUVEC细胞，并进行CCK8检测和成环实验。检测步骤同实施例6和7。
结果如图8所示，靶向干扰GATA3不同序列的腺病毒感染肝细胞以后，其条件培养基均可以提高HUVEC细胞增殖能力。序列1和序列2均有显著性效果；其中，所设计的序列1的效果最理想。
因此，利用腺病毒介导靶向干扰GATA3高转录水平组患者肝细胞中GATA3不同序列后，该原代肝细胞的条件培养基相比于空载体对照组可以显著促进HUVEC细胞的增殖。
实施例9、筛选方法
(1)基于GATA3表达或活性的筛选
筛选体系：过表达GATA3的人胎肝细胞系(L-02，又名HL7702)。
测试组：培养所述过表达GATA3的肝细胞系，给予候选物质；
对照组：培养所述过表达GATA3的肝细胞系，不给予候选物质。
分别检测测试组和对照组培养基中GATA3的表达或活性情况，并进行比较。如果测试组中GATA3的表达或活性在统计学上低于(如低30％或更低)对照组，就表明该候选物是有用于促进肝再生、缓解或治疗肝损伤的潜在物质。
(2)基于内皮细胞培养物进行筛选
筛选体系：过表达GATA3的人胎肝细胞系(L-02)以及人脐静脉内皮细胞系(HUVEC)。
测试组：使用过表达GATA3的L-02条件培养基刺激HUVEC细胞，给予候选物质；
对照组：使用过表达GATA3的L-02条件培养基刺激HUVEC细胞，不给予候选物质。
分别检测测试组和对照组中HUVEC细胞的增殖能力或成环能力，并进行比较。如果测试组中HUVEC细胞的增殖能力或成环能力显著高于(如高10％或更高)对照组，就表明该候选物是有用于促进肝再生、缓解或治疗肝损伤的潜在物质。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国人民解放军海军军医大学第三附属医院
<120> 靶向抑制GATA3在促进肝脏再生及改善肝损伤中的应用
<130> 214140
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1332
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 1
atggaggtga ctgcggacca gccgcgctgg gtgagccacc atcaccccgc ggtcctcaac 60
ggtcagcacc cagacacgca ccacccgggc ctcggccatt cgtacatgga agctcagtat 120
ccgctgacgg aagaggtgga cgtacttttt aacatcgatg gtcaaggcaa ccacgtcccg 180
tcctactacg gaaactccgt cagggctacg gtgcagaggt atcctccgac ccaccacggg 240
agccaggtat gccgcccgcc tctgctgcac ggatctctgc cctggctgga tggcggcaaa 300
gccctgagca gccaccacac cgcctcgccc tggaacctca gccccttctc caagacgtcc 360
atccaccacg gctctccggg gcctctgtcc gtttaccctc cggcttcatc ctcttctctg 420
gcggccggcc actccagtcc tcatctcttc accttcccgc ccaccccgcc gaaagacgtc 480
tccccagacc cgtcgctgtc caccccggga tccgccgggt cggccaggca agatgagaaa 540
gagtgcctca agtatcaggt gcagctgcca gatagcatga agctggagac gtctcactct 600
cgaggcagca tgaccaccct gggtggggcc tcatcctcag cccaccaccc cattaccacc 660
tatccgccct atgtgcccga gtacagctct ggactcttcc cacccagcag cctgctggga 720
ggatccccta ccgggttcgg atgtaagtcg aggcccaagg cacgatccag cacagaaggc 780
agggagtgtg tgaactgcgg ggcaacctct accccactgt ggcggcgaga tggtaccggg 840
cactaccttt gcaatgcctg cggactctac cataaaatga atgggcagaa ccggcccctt 900
atcaagccca agcgaaggct gtcggcagca aggagagcag ggacatcctg cgcgaactgt 960
cagaccacca ccaccaccct ctggaggagg aacgctaatg gggacccggt ctgcaatgcc 1020
tgtgggctgt actacaagct tcataatatt aacagacccc tgactatgaa gaaagaaggc 1080
atccagaccc gaaaccggaa gatgtctagc aaatcgaaaa agtgcaaaaa ggtgcatgac 1140
gcgctggagg acttccccaa gagcagctcc ttcaacccgg ccgctctctc cagacacatg 1200
tcatccctga gccacatctc tcccttcagc cactccagcc acatgctgac cacaccgacg 1260
cccatgcatc cgccctccgg cctctccttc ggacctcacc acccttccag catggtcacc 1320
gccatgggtt ag 1332
<210> 2
<211> 443
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 2
Met Glu Val Thr Ala Asp Gln Pro Arg Trp Val Ser His His His Pro
1 5 10 15
Ala Val Leu Asn Gly Gln His Pro Asp Thr His His Pro Gly Leu Gly
20 25 30
His Ser Tyr Met Glu Ala Gln Tyr Pro Leu Thr Glu Glu Val Asp Val
35 40 45
Leu Phe Asn Ile Asp Gly Gln Gly Asn His Val Pro Ser Tyr Tyr Gly
50 55 60
Asn Ser Val Arg Ala Thr Val Gln Arg Tyr Pro Pro Thr His His Gly
65 70 75 80
Ser Gln Val Cys Arg Pro Pro Leu Leu His Gly Ser Leu Pro Trp Leu
85 90 95
Asp Gly Gly Lys Ala Leu Ser Ser His His Thr Ala Ser Pro Trp Asn
100 105 110
Leu Ser Pro Phe Ser Lys Thr Ser Ile His His Gly Ser Pro Gly Pro
115 120 125
Leu Ser Val Tyr Pro Pro Ala Ser Ser Ser Ser Leu Ala Ala Gly His
130 135 140
Ser Ser Pro His Leu Phe Thr Phe Pro Pro Thr Pro Pro Lys Asp Val
145 150 155 160
Ser Pro Asp Pro Ser Leu Ser Thr Pro Gly Ser Ala Gly Ser Ala Arg
165 170 175
Gln Asp Glu Lys Glu Cys Leu Lys Tyr Gln Val Gln Leu Pro Asp Ser
180 185 190
Met Lys Leu Glu Thr Ser His Ser Arg Gly Ser Met Thr Thr Leu Gly
195 200 205
Gly Ala Ser Ser Ser Ala His His Pro Ile Thr Thr Tyr Pro Pro Tyr
210 215 220
Val Pro Glu Tyr Ser Ser Gly Leu Phe Pro Pro Ser Ser Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Ser Pro Thr Gly Phe Gly Cys Lys Ser Arg Pro Lys Ala Arg Ser
245 250 255
Ser Thr Glu Gly Arg Glu Cys Val Asn Cys Gly Ala Thr Ser Thr Pro
260 265 270
Leu Trp Arg Arg Asp Gly Thr Gly His Tyr Leu Cys Asn Ala Cys Gly
275 280 285
Leu Tyr His Lys Met Asn Gly Gln Asn Arg Pro Leu Ile Lys Pro Lys
290 295 300
Arg Arg Leu Ser Ala Ala Arg Arg Ala Gly Thr Ser Cys Ala Asn Cys
305 310 315 320
Gln Thr Thr Thr Thr Thr Leu Trp Arg Arg Asn Ala Asn Gly Asp Pro
325 330 335
Val Cys Asn Ala Cys Gly Leu Tyr Tyr Lys Leu His Asn Ile Asn Arg
340 345 350
Pro Leu Thr Met Lys Lys Glu Gly Ile Gln Thr Arg Asn Arg Lys Met
355 360 365
Ser Ser Lys Ser Lys Lys Cys Lys Lys Val His Asp Ala Leu Glu Asp
370 375 380
Phe Pro Lys Ser Ser Ser Phe Asn Pro Ala Ala Leu Ser Arg His Met
385 390 395 400
Ser Ser Leu Ser His Ile Ser Pro Phe Ser His Ser Ser His Met Leu
405 410 415
Thr Thr Pro Thr Pro Met His Pro Pro Ser Gly Leu Ser Phe Gly Pro
420 425 430
His His Pro Ser Ser Met Val Thr Ala Met Gly
435 440
<210> 3
<211> 3
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
<210> 4
<211> 443
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
Met Glu Val Thr Ala Asp Gln Pro Arg Trp Val Ser His His His Pro
1 5 10 15
Ala Val Leu Asn Gly Gln His Pro Asp Thr His His Pro Gly Leu Ser
20 25 30
His Ser Tyr Met Asp Ala Ala Gln Tyr Pro Leu Pro Glu Glu Val Asp
35 40 45
Val Leu Phe Asn Ile Asp Gly Gln Gly Asn His Val Pro Pro Tyr Tyr
50 55 60
Gly Asn Ser Val Arg Ala Thr Val Gln Arg Tyr Pro Pro Thr His His
65 70 75 80
Gly Ser Gln Val Cys Arg Pro Pro Leu Leu His Gly Ser Leu Pro Trp
85 90 95
Leu Asp Gly Gly Lys Ala Leu Gly Ser His His Thr Ala Ser Pro Trp
100 105 110
Asn Leu Ser Pro Phe Ser Lys Thr Ser Ile His His Gly Ser Pro Gly
115 120 125
Pro Leu Ser Val Tyr Pro Pro Ala Ser Ser Ser Ser Leu Ser Gly Gly
130 135 140
His Ala Ser Pro His Leu Phe Thr Phe Pro Pro Thr Pro Pro Lys Asp
145 150 155 160
Val Ser Pro Asp Pro Ser Leu Ser Thr Pro Gly Ser Ala Gly Ser Ala
165 170 175
Arg Gln Asp Glu Lys Glu Cys Leu Lys Tyr Gln Val Pro Leu Pro Asp
180 185 190
Ser Met Lys Leu Glu Ser Ser His Ser Arg Gly Ser Met Thr Ala Leu
195 200 205
Gly Gly Ala Ser Ser Ser Thr His His Pro Ile Thr Thr Tyr Pro Pro
210 215 220
Tyr Val Pro Glu Tyr Ser Ser Gly Leu Phe Pro Pro Ser Ser Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Ser Pro Thr Gly Phe Gly Cys Lys Ser Arg Pro Lys Ala Arg
245 250 255
Ser Ser Thr Gly Arg Glu Cys Val Asn Cys Gly Ala Thr Ser Thr Pro
260 265 270
Leu Trp Arg Arg Asp Gly Thr Gly His Tyr Leu Cys Asn Ala Cys Gly
275 280 285
Leu Tyr His Lys Met Asn Gly Gln Asn Arg Pro Leu Ile Lys Pro Lys
290 295 300
Arg Arg Leu Ser Ala Ala Arg Arg Ala Gly Thr Ser Cys Ala Asn Cys
305 310 315 320
Gln Thr Thr Thr Thr Thr Leu Trp Arg Arg Asn Ala Asn Gly Asp Pro
325 330 335
Val Cys Asn Ala Cys Gly Leu Tyr Tyr Lys Leu His Asn Ile Asn Arg
340 345 350
Pro Leu Thr Met Lys Lys Glu Gly Ile Gln Thr Arg Asn Arg Lys Met
355 360 365
Ser Ser Lys Ser Lys Lys Cys Lys Lys Val His Asp Ser Leu Glu Asp
370 375 380
Phe Pro Lys Asn Ser Ser Phe Asn Pro Ala Ala Leu Ser Arg His Met
385 390 395 400
Ser Ser Leu Ser His Ile Ser Pro Phe Ser His Ser Ser His Met Leu
405 410 415
Thr Thr Pro Thr Pro Met His Pro Pro Ser Ser Leu Ser Phe Gly Pro
420 425 430
His His Pro Ser Ser Met Val Thr Ala Met Gly
435 440
<210> 5
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<223> siGATA3-1
<400> 5
ccacacucug gaggaggaau gccaa 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<223> siGATA3-2
<400> 6
cccgccucug cuucauggau cccua 25

Claims (10)

1.GATA3的下调剂的应用，用于：
制备促进肝脏再生的组合物；或
制备预防、缓解和/或治疗肝损伤的组合物。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的组合物还用于：
促进内皮细胞的增殖；
促进内皮细胞的成环能力；
促进残余肝脏或受损后肝脏内新生血管的产生；和/或
加速肝切除术后肝体比和肝功能的恢复。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述GATA3的下调剂包括选自：针对GATA3的化学小分子拮抗剂或抑制剂；敲除或沉默GATA3的试剂；特异性与GATA3结合的结合分子如抗体；或干扰GATA3与效应分子相互作用的试剂。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述针对GATA3的化学小分子拮抗剂或抑制剂包括：特异性抑制GATA3或其上游或下游信号通路的化学小分子；较佳地，所述针对GATA3的化学小分子拮抗剂或抑制剂包括：K-7174或Pyrrothiogatain；
所述敲除或沉默GATA3的试剂包括：特异性干扰GATA3的编码基因表达的干扰分子，针对GATA3的CRISPR基因编辑试剂，针对GATA3的同源重组试剂或定点突变试剂，所述同源重组试剂或定点突变试剂将GATA3进行功能丧失性突变；较佳地，所述干扰分子包括shRNA、siRNA、miRNA、反义核酸，或能形成所述shRNA、siRNA、miRNA、反义核酸的构建体；更佳地，所述敲除或沉默GATA3的试剂为干扰分子，靶向于SEQ ID NO:3所示核苷酸序列中第974-998位、第258-282位或其组合；较佳地靶向于SEQ ID NO:3所示核苷酸序列中第974-998位或其组合。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，K-7174在所述组合物中的浓度为1～100uM或0.1～30％(w/v)；或
Pyrrothiogatain在所述组合物中的浓度为3～300uM或0.2～50％(w/v)；或
所述下调剂通过表达构建物引入到靶向部位；所述表达构建物包括：病毒载体，非病毒载体；较佳地所述病毒载体包括：腺病毒载体，腺相关病毒载体，慢病毒载体，逆转录病毒载体。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的肝损伤包括肝脏手术后肝脏功能障碍，肝炎、肝纤维化、肝硬化、终末期肝病、肝癌、酒精肝、肝脏代谢疾病或肝功能衰竭导致的肝损伤；
较佳地，所述的肝脏手术包括以正常肝脏再生能力为基础的、通过损毁病变部位肝组织，保留正常肝组织并使其代偿增生发挥正常肝功能的治疗方法；更佳地包括但不限于：传统肝大部切除术、门静脉结扎的二次肝切除术、联合肝脏分割和门静脉结扎的二次肝切除术、射频消融术、微波消融术、冰冻消融术、肝动脉介入栓塞化疗、肝动脉介入栓塞放疗、立体定向放疗。
7.特异性识别或扩增GATA3的试剂的用途，用于制备对肝再生能力或肝损伤进行诊断或预后评估的诊断试剂或试剂盒；较佳地，所述的试剂包括：特异性结合GATA3蛋白的结合分子；特异性扩增GATA3基因的引物；特异性识别GATA3基因的探针；或特异性识别GATA3基因的芯片。
8.一种用于促进肝脏再生或预防、缓解和/或治疗肝损伤的药物组合物或药盒，其特征在于，其中包括GATA3的下调剂，所述下调剂包括选自：特异性抑制GATA3或其上游或下游信号通路的化学小分子，或敲除或沉默GATA3的试剂；较佳地，所述针对GATA3的化学小分子拮抗剂或抑制剂包括：K-7174或Pyrrothiogatain；较佳地，所述敲除或沉默GATA3的试剂包括：特异性干扰GATA3的编码基因表达的干扰分子，针对GATA3的CRISPR基因编辑试剂，针对GATA3的同源重组试剂或定点突变试剂，所述同源重组试剂或定点突变试剂将GATA3进行功能丧失性突变；较佳地，所述干扰分子包括shRNA、siRNA、miRNA、反义核酸，或能形成所述shRNA、siRNA、miRNA、反义核酸的构建体；更佳地，所述敲除或沉默GATA3的试剂为干扰分子，靶向于SEQ ID NO:3所示核苷酸序列中第974-998位、第258-282位或其组合；较佳地靶向于SEQ ID NO:3所示核苷酸序列中第974-998位或其组合。
9.一种筛选促进肝脏再生或预防、缓解和/或治疗肝损伤的潜在物质的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)用候选物质处理一表达体系，该体系表达GATA3；和，
(2)检测所述体系中GATA3的表达或活性；若所述候选物质在统计学上下调GATA3的表达或活性，则该候选物质是促进肝脏再生或预防、缓解和/或治疗肝损伤的潜在物质。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述体系为内皮细胞体系；较佳地，所述的内皮细胞包括：肝窦内皮细胞，血管内皮细胞，淋巴管内皮细胞；
步骤(2)还包括：检测所述体系中内皮细胞的增殖能力或成环能力；若其增殖能力或成环能力被促进，则该候选物质是促进肝脏再生或预防、缓解和/或治疗肝损伤的潜在物质。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117018195A (zh) * 2023-08-04 2023-11-10 中国人民解放军海军军医大学 小分子化合物或组合在制备启动肝脏原位再生药物中的应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011196874A (ja) * 2010-03-19 2011-10-06 Kanazawa Univ 肝保護作用を有するタンパク質、肝障害予防・保護用化合物のスクリーニング方法
CN106755090A (zh) * 2016-11-25 2017-05-31 武汉大学 一种以凋亡信号调节激酶1n端二聚化为靶点筛选用于治疗脂肪性肝炎药物的方法
CN109078168A (zh) * 2018-07-26 2018-12-25 广西医科大学第附属医院 靶向补体抑制剂在制备改善脑死亡供肝药物中的应用
WO2021052286A1 (zh) * 2019-09-17 2021-03-25 中国科学院上海营养与健康研究所 新型外泌体释放相关靶点及其在监测和抑制肿瘤中的应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011196874A (ja) * 2010-03-19 2011-10-06 Kanazawa Univ 肝保護作用を有するタンパク質、肝障害予防・保護用化合物のスクリーニング方法
CN106755090A (zh) * 2016-11-25 2017-05-31 武汉大学 一种以凋亡信号调节激酶1n端二聚化为靶点筛选用于治疗脂肪性肝炎药物的方法
CN109078168A (zh) * 2018-07-26 2018-12-25 广西医科大学第附属医院 靶向补体抑制剂在制备改善脑死亡供肝药物中的应用
WO2021052286A1 (zh) * 2019-09-17 2021-03-25 中国科学院上海营养与健康研究所 新型外泌体释放相关靶点及其在监测和抑制肿瘤中的应用

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117018195A (zh) * 2023-08-04 2023-11-10 中国人民解放军海军军医大学 小分子化合物或组合在制备启动肝脏原位再生药物中的应用
CN117018195B (zh) * 2023-08-04 2024-05-21 中国人民解放军海军军医大学 小分子化合物或组合在制备启动肝脏原位再生药物中的应用

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