CN111448312A - 使用效应T细胞(Teff)抗原受体的抗原特异性调节性T细胞(Treg)的制作技术 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于制备对所期望的抗原特异的调节性T细胞的技术。该方法包括：针对存在于效应性T细胞供体中的抗原特异性的效应T细胞群中的T细胞受体(TCR)克隆进行鉴定的步骤；以及将包括在克隆中的TCRα基因的全部或部分核酸序列和TCRβ基因的全部或部分核酸序列引入调节性T细胞的步骤，所述步骤以该TCRα和该TCRβ成对表达的方式进行引入，通过上述方法生产抗原特异性的调节性T细胞。

Description

使用效应T细胞(Teff)抗原受体的抗原特异性调节性T细胞 (Treg)的制作技术
技术领域
本发明涉及T细胞生物技术工程。
背景技术
调节性T细胞(Treg)是体内主要负责免疫应答调节的细胞群。目前为止，为了治疗自身免疫性疾病或诱导同种移植后的免疫耐受，正尝试着开发体外扩增的Treg的移植疗法，但是未确认到充分的有效性。另外，由于Treg具有抗原非特异性的免疫抑制作用，所以存在过度抑制对感染、恶性肿瘤等的正常免疫应答的风险。
近年来，已经明确了存在对特定的自身抗原、同种抗原反应从而发挥免疫调节作用的抗原特异性Treg，据报道，抗原特异性Treg在自身免疫性疾病模型中与传统Treg相比发挥更高的有效性。然而，针对任意的所期望的抗原，目前为止尚未开发出对该抗原特异性的Treg的制作技术。
发明内容
用于解决课题的技术手段
在一个方面，本发明的特征在于使效应T细胞的T细胞受体(TCR)表达在T细胞(例如，调节性T细胞)中。在一个方案中，本发明包括将全部或部分的TCR基因引入调节性T细胞的步骤，该步骤以使得TCRα和TCRβ成对表达的方式进行引入。本发明还提供了一种在与所期望的抗原反应的效应T细胞中鉴定和/或分离具有高抗原结合能力的TCR的方法。进而，在一个方案中，本发明删除了调节性T细胞中的内源性TCR。在本发明的一个实施方案中，本发明的方法的一个特征是：容易地将具有高抗原结合能力的TCR从与所期望的抗原反应的效应T细胞(Teff)中分离出来，并且仅使从Teff分离的TCR表达在内源性TCR缺陷的调节性T细胞(Treg)中。
在本发明中，可以基于抗原特异性效应T细胞群中存在的T细胞受体(TCR)克隆的频率来鉴定具有高抗原结合能力的TCR。对于本发明中使用的TCR的鉴定，能使用测定TCR库(TCR repertoire)的方法，该方法包括无偏差扩增TCR核酸序列的步骤。在本发明中，可以使用鉴定和/或分离具有高抗原结合能力的TCRα和TCRβ对的方法。例如，能使用HLA四聚体等分离对所期望的抗原特异性反应的效应T细胞(TEFF)组，以获得含有其表达的TCRα链/TCRβ链的抗原识别区的基因序列。此外，能评估所获得的各个TCR克隆型与所期望的抗原的结合能力。
在本发明的一个方面，本发明的方法能包括去除调节性T细胞中的内源性TCR基因的步骤。例如，能使用基因组编辑技术切断从外周血中分离的Treg的TCR基因，以抑制内源性TCR的表达。
在本发明的一个方面，本发明的方法能包括将经鉴定的Teff的高功能性TCR基因引入到去除了内源性TCR基因的Treg中的步骤。由此，能制作出表达TCR(该TCR对所期望的抗原具有高特异性结合能力)的Treg。
在本发明中，还提供了使用本发明的方法制造的T细胞(例如，调节性T细胞)。该调节性T细胞在需要免疫抑制的各种情况下都很有用。例如，本发明的调节性T细胞能用于治疗或预防自身免疫性疾病、过敏性疾病、或移植时的移植物抗宿主病(GVHD)、排斥反应或移植物衰竭。本发明还提供了一种在本发明的方法中使用的物品(article)。
例如，本发明提供了以下项目。
(项目1)
一种产生抗原特异性的调节性T细胞的方法，包括：
针对在效应T细胞供体中的该抗原特异性效应T细胞群中所存在的T细胞受体(TCR)克隆进行鉴定的步骤；以及
将该克隆中所包含的TCRα基因的全部或部分核酸序列和TCRβ基因的全部或部分核酸序列引入调节性T细胞的步骤，该步骤以使得所述TCRα和所述TCRβ成对表达的方式进行引入。
(项目2)
根据前项所述的方法，其中，鉴定所述TCR克隆的步骤包括测定所述效应T细胞群的TCR库。
(项目3)
根据前述任一项所述的方法，其中，所述TCR克隆以与所述效应T细胞群中的各个克隆的存在频率的平均值相比大1个标准偏差以上的频率存在。
(项目4)
根据前述任一项所述的方法，其中，所述TCR克隆以与所述效应T细胞群中的各个克隆的存在频率的平均值相比大2个标准偏差以上的频率存在。
(项目5)
根据前述任一项所述的方法，其中，所述TCR克隆在所述效应T细胞群中以大约10％以上的频率存在。
(项目6)
根据前述任一项所述的方法，其中，所述TCRα基因的全部或部分核酸序列包括与Vα-Jα的CDR3区相对应的序列。
(项目7)
根据前述任一项所述的方法，其中，所述TCRβ的基因的全部或部分核酸序列包括与Vβ-D-Jβ的CDR3区相对应的序列。
(项目8)
根据前述任一项所述的方法，其中，所述TCRα的基因的全部或部分核酸序列包括Vα-Jα-Cα的cDNA序列。
(项目9)
根据前述任一项所述的方法，其中，所述TCRβ的基因的全部或部分核酸序列包括Vβ-D-Jβ-Cβ的cDNA序列。
(项目10)
根据前述任一项所述的方法，其中，所述TCR库的测定包括：
(1)提供核酸样品的步骤，该核酸样品包含从所述效应T细胞群无偏差扩增的T细胞受体(TCR)的核酸序列；
(2)确定该核酸样品中所含的该核酸序列的步骤；以及
(3)基于已确定的核酸序列计算各基因的出现频率或其组合、从而导出该效应T细胞群的TCR库的步骤。
(项目11)
根据前述任一项所述的方法，其中，所述TCR库的测定包括：
(1)提供核酸样品的步骤，该核酸样品包含从所述效应T细胞群无偏差扩增的TCR的核酸序列，该步骤(1)包括以下步骤：
步骤(1-1)：将来自靶细胞的RNA样品作为模板、合成互补DNA；
步骤(1-2)：使用该互补DNA作为模板、合成双链互补DNA；
步骤(1-3)：向该双链互补DNA中添加通用接头引物序列、合成添加有接头的双链互补DNA；
步骤(1-4)：使用该添加有接头的双链互补DNA、由该通用接头引物序列组成的通用接头引物、和第一TCR的C区特异性引物，进行第一PCR扩增反应，所述第一TCR的C区特异性引物被设计成：包括对该TCR的目标C区充分特异的、且与其他基因序列不同源的序列，并且在扩增时在下游在亚型之间含有不一致碱基；
步骤(1-5)：使用(1-4)的PCR扩增产物、该通用接头引物、和第二TCR的C区特异性引物进行第二PCR扩增反应，所述第二TCR的C区特异性引物被设计成：在与所述第一TCR的C区特异性引物的序列相比靠下游的序列中具有与该TCR的C区完全匹配的序列、但包含与其他基因序列不同源的序列，并且在扩增时在下游在亚型之间包括不一致碱基；以及
步骤(1-6)：使用(1-5)的PCR扩增产物、添加通用接头引物(在该通用接头引物的核酸序列中包含第一追加接头核酸序列)和带有接头的第三TCR的C区特异性引物(将第二追加接头核酸序列添加到第三TCR的C区特异性序列中)，进行第三PCR扩增反应；
所述第三TCR的C区特异性引物被设计成：在该第二TCR的C区特异性引物的序列下游的序列中具有与该TCR C区完全匹配的序列、但包含与其他基因序列不同源的序列，并且在扩增时在下游在亚型之间包括不一致碱基；
(2)确定该核酸样品中所包含的该核酸序列的步骤；以及
(3)基于已确定的该核酸序列计算各个基因的出现频率或其组合，从而导出该效应T细胞群的TCR库。
(项目12)
根据前述任一项所述的方法，其中，鉴定所述TCR克隆的步骤包括扩增源自同一细胞的TCRα基因和TCRβ基因、并鉴定所述效应T细胞群中的TCRα和TCRβ对。
(项目13)
根据前述任一项所述的方法，其中，进一步包括确认所述经鉴定的TCRα和TCRβ对是否与抗原有亲和性的步骤。
(项目14)
根据前述任一项所述的方法，其中，进一步包括克隆所述经鉴定的TCRα和TCRβ对中的TCRα的全部或部分核酸序列和TCRβ的全部或部分核酸序列的步骤。
(项目15)
根据前述任一项所述的方法，其中，所述引入的步骤包括将所述经克隆的TCRα的全部或部分核酸序列和TCRβ的全部或部分核酸序列引入到所述调节性T细胞中。
(项目16)
根据前述任一项所述的方法，其中，所述引入的步骤包括使用载体，该载体构成为使所述TCRα和所述TCRβ成对表达。
(项目17)
根据前述任一项所述的方法，其中，所述载体包含编码Cys的核酸序列使得表达的所述TCRα和TCRβ之间形成二硫键、或者所述TCRα和TCRβ的编码序列被密码子优化，或者构成为使亮氨酸拉链引入所述TCRα和所述TCRβ的胞内区，或者构成为使所述TCRα和所述TCRβ进行糖链修饰从而被表达。
(项目18)
根据前述任一项所述的方法，其中，包括使用编码Cα结构域(与Vα链连结)和Cβ结构域(与Vβ链连结)的载体，该载体构成为使所述TCRα和所述TCRβ成对表达。
(项目19)
根据前述任一项所述的方法，其中，所述调节性T细胞从所述效应T细胞供体获得。
(项目20)
根据前述任一项所述的方法，其中，进一步包括去除所述调节性T细胞的内源性TCR基因的步骤。
(项目21)
根据前述任一项所述的方法，其中，使用TCR特异性TALEN进行所述内源性TCR基因的去除。
(项目22)
根据前述任一项所述的方法，其中，所述TALEN以包含DNA结合结构域和功能结构域的多肽或编码该多肽的核酸的形式提供，
此处，该DNA结合结构域和该功能结构域通过由35～55个氨基酸组成的多肽连接，
DNA结合结构域从N末端侧连续地包括多个DNA结合模块，
对于任意的n，从N末端的第4n-3个DNA结合模块中的第x个氨基酸和第y个氨基酸的组合是相同的，
对于任意的n，从N末端的第4n-2个DNA结合模块中的第x个氨基酸和第y个氨基酸的组合是相同的，
对于任意的n，从N末端的第4n-1个DNA结合模块中的第x个氨基酸和第y个氨基酸的组合是相同的，以及
对于任意的n，从N末端的第4n个DNA结合模块中的第x个氨基酸和第y个氨基酸的组合是相同的，
从N末端的第4n-3个DNA结合模块中第x个氨基酸与第y个氨基酸的组合、从N末端的第4n-2个DNA结合模块中第x个氨基酸与第y个氨基酸的组合、从N末端的第4n-1个DNA结合模块中第x个氨基酸与第y个氨基酸的组合、以及从N末端的第4n个DNA结合模块中第x个氨基酸与第y个氨基酸的组合，彼此不同，
此处，n是1～10的自然数，x是1～40的自然数，y是1～40的自然数，并且x和y是不同的自然数。
(项目23)
根据上述任一项所述的方法，包括：
去除所述调节性T细胞中内源性TCRα或内源性TCRβ基因中的任一者的步骤；
将所述TCRα基因的全部或部分核酸序列和TCRβ基因的全部或部分核酸序列引入该调节性T细胞中的步骤；
去除该调节性T细胞中该内源性TCRα或内源性TCRβ基因中的另一者的步骤；以及
将所述TCRα基因的全部或部分核酸序列和所述TCRβ基因的全部或部分核酸序列重新引入该调节性T细胞中的步骤。
(项目24)
一种产生抗原特异性调节性T细胞的方法，包括：
在效应T细胞供体中的该抗原特异性效应T细胞群中，测定TCR库的步骤，该步骤包括无偏差扩增TCR基因；
鉴定该效应T细胞群中的TCRα和TCRβ对的步骤；
确认该经鉴定的TCRα和TCRβ对是否对抗原有亲和性的步骤；
克隆该经鉴定的TCRα和TCRβ对中的TCRα的全部或部分核酸序列和TCRβ的全部或部分核酸序列的步骤；
去除调节性T细胞的内源性TCR基因的步骤；以及
向该调节性T细胞中引入该经克隆的TCRα的全部或部分核酸序列和TCRβ的全部或部分核酸序列的步骤，该步骤以使得该TCRα和该TCRβ成对表达的方式进行引入。
(项目24A)
根据前项所述的方法，其具有前述任一项或多项所记载的特征。
(项目25)
一种通过前述任一项所述的方法制备的调节性T细胞。
(项目26)
一种调节性T细胞，其不含内源性TCR基因。
(项目27)
一种调节性T细胞，其包含在T细胞受体(TCR)克隆中所含的TCRα基因的全部或部分核酸序列和TCRβ基因的全部或部分核酸序列，所述T细胞受体克隆存在于效应T细胞供体的效应T细胞群中。
(项目28)
一种调节性T细胞，其不含内源性TCR基因，并包含在T细胞受体(TCR)克隆中所含的TCRα基因的全部或部分核酸序列和TCRβ基因的全部或部分核酸序列，所述T细胞受体克隆存在于效应T细胞供体的效应T细胞群中。。
(项目29)
一种组合物，包含用于治疗或预防自身免疫性疾病的上述任一项所述的调节性T细胞。
(项目30)
一种组合物，包含用于治疗或预防过敏性疾病的上述任一项所述的调节性T细胞。
(项目31)
一种组合物，包含用于治疗或预防移植时的移植物抗宿主病(GVHD)、排斥反应或移植物衰竭的上述任一项所述的调节性T细胞。
(项目32)
一种组合物，包含在前述任一项的方法中使用的、以使所述TCRα和所述TCRβ成对表达的方式构成的载体。
(项目33)
一种组合物，包含在前述任一项所述的方法中使用的、MHC四聚体。
(项目34)
一种组合物，包含在前述任一项所述的方法中使用的、含有DNA结合结构域和功能结构域的多肽或编码该多肽的核酸，该DNA结合结构域与TCR基因特异性结合。
(项目35)
通过前述任一项所述的方法获得的效应T细胞群的TCR库或其一部分、或编码其的核酸。
(第36项)
一种组合物，用于制备TCR修饰T细胞，包括通过前述任一项所述的方法获得的效应T细胞群的TCR库或其一部分、或编码其的核酸。
(项目37)
根据前述任一项所述的组合物，其中，所述TCR修饰T细胞包含TCR修饰的调节性T细胞。
(项目37A)
根据前项所述的组合物，其中，具有前述一项或多项所记载的特征。
本发明中，对于上述1个或多个特征，除了明确公开的组合之外，还能够进一步组合进行提供。对于本发明的其他实施方案和优点，只要根据需要阅读下述详细说明能够理解，则能够被本领域技术人员所知晓。
发明效果
通过本发明，能够制备具有抗原特异性且不产生非特异性免疫抑制的调节性T细胞，能提供可调节的免疫抑制。
附图说明
[图1]图1是示出了单个细胞的CMV NLV特异性TCRα和TCRβ库的图。图中示出了从两例HLA A2抗原阳性和CMV抗体阳性的健康供体(V001和V004)中获得的细胞的CMV NLV特异性TCRα和TCRβ对。分别从V001和V004中分析了118个T细胞和29个T细胞，并分别鉴定了3种(TCR ID；001-17、48和41)和6种(TCR ID；004-66、22、63、30、28和71)的CDR3α和CDR3β对。各CDR3序列对应于序列号81～98。
[图2]图2是示出了TCR库中各TCR对的存在频率与对抗原的亲和性之间之间的关系的散点图。纵轴是读段(read)的频率，横轴表示结合亲和性。
[图3]图3是示出了用TALEN去除了内源性TCR基因时的、与对照相比的CD3表达变化的直方图(右图)。图3的左侧显示了使用TALEN-TCR mRNA的实验方案以及使用GFP-A和SSC-A得到的FACS分析结果。CD3表达能用作TCR表达的标志物，与对照相比，CD3表达向阴性偏移，因此表明内源性TCR基因被成功去除。
[图4]图4是示出T7E1试验的电泳图，表示用TALEN成功切断了TCR基因。显示了在来源于人T细胞的Jurkat细胞株中TRA/TRB基因被切断(分别为左图和右图)。
[图5]图5是引入TCR中所使用的表达载体的一个示例的示意图。
[图6]图6是示出了通过去除内源性TCR并引入外源性抗原特异性TCR、能用抗原特异性TCR完全替代多克隆性Treg的TCR的示意图。
[图7]图7是示出了通过本发明的方法去除内源性TCR和引入外源性抗原特异性TCR的顺序的示意图。示出了各步骤中的细胞的CD3的表达状态。中间部分显示了通过CD3表达而成的分选前的细胞群的CD3表达的分布情况。下部显示了通过CD3表达进行分选后的细胞群的CD3表达的分布情况。
[图8]图8是多克隆调节性T细胞(Poly-Treg)与调节性T细胞(QYD-Treg)(引入了CD8+T细胞识别的CMV抗原(QYD516)特异性TCR)对抗原(QYD516)亲和性的比较图。左列表示GFP标签，右列表示QYD-四聚体标签。在各个细胞群的功能性亚群(CD4+)中与多克隆进行比较，可以理解引入了抗原特异性TCR的组获得对抗原的亲和性。
[图9]图9示出了使用本发明的技术制作巨细胞病毒特异性细胞毒性T细胞(人外周血T细胞)。示出了向细胞毒性T细胞中引入TCR的结果。上部显示TCRαβ表达量的分析结果，下部显示用NLV-四聚体分析CMV抗原结合能力的结果。左列示出了具有内源性TCR的T细胞的分析，右列示出了去除内源性TCR并引入了NLV特异性TCR的T细胞的分析。可以理解，能够在不受内源性TCR干扰的情况下进行TCR替换。
[图10]图10是示出了抗原特异性调节性T细胞(最右列)、多克隆调节性T细胞(左起第二列)、TCR基因敲除调节性T细胞(右起第二列)和对照(CD25阴性CD4阳性T细胞部分；最左列)的表面标志物表达的散点图。上段示出了对CD127和CD25的分析，从上数第二段示出了对CD25和FoxP3的分析，从上数第三段示出了对FoxP3和CTLA4的分析，以及从上数第四段示出了对FoxP3和HELIOS的分析。
[图11]图11是示出了抗原特异性调节性T细胞、多克隆调节性T细胞、TCR基因敲除调节性T细胞和对照(CD25阴性CD4阳性T细胞部分)的表面标志物表达的直方图。上段从左起示出了对CD25、CD127和FoxP3的分析，下段从左起示出了对CTLA4和HELIOS的分析。
[图12]图12是表示通过抗原刺激产生的抗原特异性效应T细胞的增殖的图。从左起依次显示第0天、第3天和第5天。可以理解，应答抗原刺激，QYD-516特异性效应T细胞已增殖。
[图13]图13示出了对抗原刺激应答的QYD-516特异性Treg的增殖。显示了QYD-516特异性Treg应答由抗原提呈细胞产生的抗原刺激从而增殖。虽然在多克隆调节性T细胞中没有观察到调节性T细胞的增殖，但在抗原特异性调节性T细胞群中观察到了增殖。
[图14]图14是表示由抗原刺激导致的抗原特异性效应T细胞的增殖被抗原特异性调节性T细胞抑制的图。其示出了在抑制QYD-Teff增殖中，QYD-Treg优于Poly-Treg。
[图15]图15是表示由抗原刺激导致的抗原特异性效应T细胞的增殖被抗原特异性调节性T细胞抑制的图。其示出了在抑制QYD-Teff增殖中，QYD-Treg优于Poly-Treg。
[图16]图16是示出实施例6中使用动物模型的实验概述的图。
[图17]图17是示出了几个改变TALEN的图。图中，Voytas TALEN的DNA结合模块的示例和PlatinumTALEN的DNA结合模块的示例中从上数第一个序列对应于序列号1，其余的从上开始依次对应于序列号99～102。
[图18]图18是示出了本发明优选实施方案的一例的图。通过本发明，例如能够实现使用高功能性TCR的抗原特异性Treg移植疗法。
[图19]图19A示出了Dolomite Bio公司制单细胞RNA-Seq系统。图19B示出了Oligo珠的概要。Oligo珠中的SMART序列对应于序列号45。图19C示出了显微镜下的Oligo珠。图19D示出了微芯片中的珠流和液滴。珠子流经中心线(黄色)并与两个细胞线(白色)混合后、注入油线(红色)从而形成液滴(左图)。在珠子通过的时刻被随机地封入液滴中。所回收的液滴(白色)与油层(透明)分离，能容易地回收。
[图20]图20是表示TAL-PITCh载体的设计的示意图。图中的序列分别对应于序列号120和121。
[图21]图21是表示TAL-PITCh载体的设计的示意图。图中的序列分别对应于序列号120和121。
[图22]图22是示出了使用TAL-PITCh载体制作内源性TCR缺陷型NY-ESO-1特异性T细胞的结果的图。
[图23]图23是示出了使用为切断小鼠TCR而制作的三种铂TALEN(TRA2-TALEN、TRB1-TALEN和TRB2-TALEN)的报告质粒通过试验方法(SSA试验)评价切断活性所得的结果的图。可以理解，锌指核酸酶对照(pSTL-ZFA36/ZFA36)的切断活性为1时，针对小鼠TRA2-TALEN、小鼠TRB1-TALEN和小鼠TRB2-TALEN的靶切断位点的活性分别是3.09倍、3.79倍和3.41倍。pSTL是ZFA36的阴性对照，TRA2、TRB1和TRB2分别是不存在TALEN时的仅报告子的阴性对照，TRA2-TALEN/ZFA36、TRB1-TALEN/ZFA36和TRB2-TALEN/ZFA36分别是报告子基因为ZFA36时的阴性对照。
具体实施方式
以下，给出本发明的最佳实施方式对本发明进行说明。在整个说明书中，除非另有特别说明，否则单数表达式应理解为也包括其复数形式的概念。因此，除非另有特别说明，单数冠词(例如英语中的“a”、“an”、“the”等)应被理解为也包括其复数形式的概念。此外，除非另有特别说明，否则本文使用的术语应理解为以本领域中通常使用的含义使用。因此，除非另有定义，否则本文使用的所有术语和科学技术术语与本发明所属领域的技术人员的一般理解具有相同的含义。如有矛盾，以本说明书(包括定义)为准。
(1、定义以及基础技术的说明)
下文适当地解释本在说明书中特别使用的术语的定义和/或基本的技术内容。
在本说明书中，“效应T细胞”是指通过T细胞受体识别由抗原呈递细胞(诸如巨噬细胞或树突细胞、B细胞等)呈递的抗原、进行分化和活化的T细胞。在本说明书中，效应T细胞也称为“Teff”等。
在本说明书中，“调节性T细胞(Regulatory T cell)”是Foxp3表达为阳性的、显示免疫抑制作用的CD4阳性T细胞。本说明书中，调节性T细胞也称为“Treg”。CD25强阳性和CD127表达弱阳性也能作为调节性T细胞的指标。Treg大致分为内源性T细胞(自然产生的调节性T细胞；nTreg)和由Naive CD4阳性T细胞分化而来的自我识别能力低的诱导性T细胞(Inducible Regulatory Tcell；iTreg)。
在本说明书中，“流式细胞术”是指用于测量悬浮在液体中的细胞、个体和其他生物颗粒的数量、各自的物理/化学/生物学的特性的技术。使用这种技术的设备被称为“流式细胞仪”
在本说明书中，“克隆型”是指源自编码T细胞受体或免疫球蛋白分子或其一部分的T细胞或B细胞的重组序列。通常体细胞的基因组序列在个体中是相同的，但是在各细胞中在T细胞或B细胞的受体的编码序列中进行重排，所以个体中的T细胞或B细胞中存在多种克隆型。
在本说明书中，“优势”克隆是指以比本领域技术人员能适当设定的某一阈值多的频率存在于克隆群中的克隆。
在本说明书中，“T细胞受体(TCR)”是指存在于T细胞中的受体。TCR是由两条TCR多肽链组成的异二聚体受体分子，存在通常T细胞表达的αβ型TCR以及具有特殊功能的γδ型TCR。α和β链TCR分子与多种CD3分子(CD3ζ链、CD3ε链、CD3γ链和CD3δ链)形成复合体，在抗原识别后传递细胞内信号，并启动各种免疫应答。在伴有病毒感染的细胞中增殖的病毒抗原、来自癌细胞的癌症抗原等内源性抗原能够作为抗原肽呈现在MHC I类分子上。另外，来自外源微生物的抗原通过内吞作用被抗原提呈细胞摄取并处理，然后提呈在MHC II类分子上。上述抗原被CD8+T细胞和CD4+T细胞各自表达的TCR识别。众所周知，CD28、ICOS或OX40分子等共刺激分子对于通过TCR分子进行的刺激很重要。对于本说明书的主要目标之一的αβ型TCR，α和β的各基因产物通过独特的组合来表达特异性。
利用免疫系统的生物防御机制在很大程度上依赖于主要由T细胞和B细胞负责的特异性免疫。原则上，T细胞和B细胞能特异性地识别、攻击病毒或细菌等外源病原体，而不与自体细胞或分子发生反应。因此，T细胞和B细胞具有如下机制：能通过在细胞表面表达的受体分子识别和区分自身抗原以及源自其他生物的各种抗原。在T细胞中，T细胞受体(TCR)作为抗原受体发挥作用。通过来自这些抗原受体的刺激来传递细胞内信号，促进炎性细胞因子、趋化因子等的产生，细胞增殖增加，并开始各种免疫应答。
TCR通过识别与抗原提呈细胞上表达的主要组织相容性复合体(Majorhistocompatibility complex，MHC)的肽结合槽(peptide binding cleft)相结合的肽(肽-MHC复合体，pMHC)，来区分自体和异源，并识别抗原肽(Cell 1994，76，287-299)。
TCR基因由基因组中不同区域编码的多数个V区(可变区，V)、J区(连接区，J)、D区(差异区，D)和C区(恒定区，C)组成。在T细胞分化过程中，这类基因片段以不同的组合进行基因重排。α链和γ链TCR表达由V-J-C组成的基因，β链和δ链TCR表达由V-D-J-C组成的基因。通过这些基因片段的重排而产生多样性，并且，通过在V和D或D和J基因片段之间引起一个以上碱基的插入或缺失，能够形成随机的氨基酸序列，从而制作出多样性更高的TCR基因序列。
对于TCR分子与pMHC复合体表面直接结合的区域(TCR足迹)，由V区内富含多样性的互补性决定区(complementarity determining regions，CDR)CDR1、CDR2和CDR3区组成。其中，CDR3区包括V区的一部分、由随机序列形成的V-D区(α链和γ链)或V-D-J区(β链和δ链)以及J区的一部分，该CDR3区形成最富含多样化的抗原识别位点。另一方面，其他区域被称为FR(骨架区域)，其作用是形成TCR分子的骨架结构。在胸腺中的T细胞分化成熟过程中，β链TCR首先进行基因重排，与pTα分子结合形成pre-TCR复合体分子。然后α链TCR重排，形成αβTCR分子，并且当没有形成功能性αβTCR时在另一个α链TCR基因等位基因中发生重排。已知在胸腺中进行正/负选择、从而选择具有合适亲和性的TCR，以获得抗原特异性(AnnualReview Immunology,1993,6,309-326)。
T细胞产生对特定抗原具有高度特异性的一种TCR。由于活体内存在多数抗原特异性T细胞，因此能形成多样的TCR库，能够作为针对各种病原体的防御机构有效地发挥作用。
在本说明书中，“高功能性TCR”是指在与某抗原具有结合能力的TCR中具有比其它TCR更高结合能力的TCR。对于TCR是否是高功能性TCR，例如可以如下判定：将表达该TCR的细胞与一定浓度(例如，10μg/ml)的抗原四聚体-PE复合物进行孵育，然后测量是否能以TCRαβ阳性细胞中的MFI(平均荧光强度)超过一定数值(例如，5000)这样的亲和性与其抗原结合。
(2、优选实施方案)
下文描述本发明的优选实施方案。可以理解，下文提供的实施方案是为了便于更好地理解本发明，本发明的范围不应受以下描述的限制。因此，不言而喻，本领域的技术人员能参考本说明书的记载来在本发明的范围内进行适当的修改。另外，还可以理解，本发明的以下实施方案可以单独使用或组合使用。
另外，下面描述的实施方案均示出全面或具体的示例。以下实施方案中的数值、形状、材料、组成要素、组成要素的排列位置和连接方式、步骤、步骤顺序等是一个示例，不限制权利要求的范围。另外，在以下实施方式的组成要素中，对于在表示最上位概念的独立权利要求中没有记载的组成要素，作为任意的组成要素进行说明。
(2.1抗原特异性调节性T细胞)
在一个方面，本发明提供了一种产生抗原特异性调节性T细胞的方法，包括如下步骤：在效应T细胞供体中的该抗原特异性的效应T细胞群中测定TCR库的步骤，该步骤包括无偏差扩增TCR基因；鉴定该效应T细胞群中的TCRα和TCRβ对的步骤；确认该经鉴定的TCRα和TCRβ对是否具有与抗原的亲和性的步骤；克隆该经鉴定的TCRα和TCRβ对中的TCRα的全部或部分核酸序列以及TCRβ的全部或部分核酸序列的步骤；去除调节性T细胞中的内源性TCR基因的步骤；以及，将该经克隆的TCRα的全部或部分核酸序列和TCRβ全部或部分核酸序列引入该调节性T细胞中的步骤，该步骤以使TCRα和TCRβ成对表达的方式进行进入。
图18描述了一个优选的实施方案。鉴定高功能性TCR，并将该高功能性TCR引入从供体获得的抗原非特异性的多克隆调节性T细胞中，此时，优选通过编辑等去除内源性TCR基因，更优选使用铂TALEN编辑内源性TCR基因。优选地，引入上述TCR使得上述TCR成对表达。将获得的抗原特异性单克隆或寡克隆调节性T细胞在体外扩增，并转移到受体内。认为通过本发明获得的抗原特异性调节性T细胞由于不具有未知的抗原反应性，所以是安全的，认为通过使用高功能性TCR，显示出高的抗原特异性免疫抑制能力。受体可以是与调节性T细胞的供体相同的个体，也可以是不同的个体。
本发明中，还提供了一种用于在本发明的方法中使用的任意物。例如，本发明能提供一种组合物，该组合物包含用于在本发明的方法中使用的、以使上述TCRα和上述TCRβ成对表达的方式构成的载体。另外，还提供包含在本发明的方法中使用的MHC四聚体的组合物。
进而，本发明还提供一种包含在本发明的方法中使用的、含有DNA结合结构域和功能结构域的多肽或编码该多肽的核酸的组合物，该DNA结合结构域与TCR基因特异性结合。
由本发明的方法鉴定的效应T细胞群的TCR库或其一部分、或编码其的核酸也在本发明的范围内。还提供了一种用于制备TCR修饰T细胞的组合物，包含效应T细胞群的TCR库或其一部分、或编码其的核酸。优选TCR修饰T细胞包括TCR修饰的调节性T细胞。
(2.2T细胞内源性TCR基因修饰)
本发明的一个方面是一种修饰T细胞中的内源性TCR基因的方法，该方法优选包括修饰T细胞使得内源性TCR不表达的步骤。
本发明的另一方面中，能包括将外源TCR引入T细胞(例如，通过引入核酸)的步骤。作为本发明中的成为对象的T细胞，没有限定，可以举出调节性T细胞、效应T细胞、辅助T细胞、自然杀伤T细胞(NKT细胞)、γδT细胞。调节性T细胞的TCR的修饰/引入是优选的，因为它引起免疫调节(包括抗原特异性的免疫耐受)。对于NKT细胞或γδT细胞，由于其本身具有抗原非特异性的杀伤活性，所以通过本发明的方法引入抗原特异性TCRαβ具有重要意义。例如，针对γδT细胞，如J Immunol.2009Jan 1；182(1):164-70.(PMID:19109147)中所示，通过将TCRαβ转导至γδT细胞，可以产生抗原特异性效应T细胞。将本发明鉴定的高功能性TCR引入γδT细胞是有效的。
T细胞或T细胞群可以通过常规方法从由受试者获得的样品等中分离。例如，可以从受试者的外周血、骨髓、肿瘤组织、造血组织、脾脏、正常组织或淋巴液等进行。从外周血中采集样品具有非侵入性且简单，因此是有利的。对于T细胞群的分离，除了使用流式细胞术进行的分选之外，还可以利用使用磁力的细胞分离。
本发明中，能利用要修饰的内源性TCR基因的第一T细胞、和具有要引入的TCR的第二T细胞。此处，第一T细胞和第二T细胞能从同一受试者或不同受试者(第一供体和第二供体)获得。此外，可以使用经修饰的第一T细胞用于治疗同一受试者，也可以用于治疗与所有供体均不同的受试者(受体)。在一个优选实施方案中，第一T细胞是调节性T细胞，第二T细胞是效应T细胞。
本发明的一些实施方案中，提供了经修饰的T细胞或包括其的组合物。一个实施方案提供了一种不含内源性TCR基因的调节性T细胞。该T细胞可以安全地赋予所期望的抗原特异性，不会产生TCR基因错配。
另一个实施方案提供一种调节性T细胞，包含在T细胞受体(TCR)克隆中所含的TCRα基因的全部或部分核酸序列和TCRβ基因的全部或部分核酸序列，该T细胞受体(TCR)克隆存在于效应T细胞供体的效应T细胞群中。在供体的T细胞群中所存在的T细胞受体(TCR)克隆被认为是高功能性的。认为具有这种TCR的调节性T细胞表现出抗原特异性免疫抑制。本发明还提供了一种调节性T细胞，其不含内源性TCR基因，而是含有在T细胞受体(TCR)克隆中所含的TCRα基因的全部或部分核酸序列和TCRβ基因的全部或部分核酸序列，该T细胞受体(TCR)克隆存在于效应T细胞供体的效应T细胞群中。
(2.3T细胞亚群的组成的分析)
本领域技术人员可以使用常规方法测定样品中或T细胞群中的所期望的T细胞亚群的组成。通常，对于规定样品或T细胞群中的目标细胞亚群的标志物、或者与所期望的特征相关的标志物(例如，CD3)呈阳性的细胞的数量，可以使用流式细胞术等来测定。另外，可用流式细胞术技术同时分取所期望的细胞亚群。作为流式细胞术的优点，例如可以举出：易于掌握引入了所期望的基因的细胞所占的比例、特异性和灵敏度高、再现性高、能够分析大量细胞、所需时间短，等。
流式细胞仪是一种从均匀细胞悬浮液中测定悬浮物(细胞)的光学性质的仪器。细胞搭乘液流通过激光束的焦点，在其通过时每秒500～4000个细胞，流式细胞仪能针对各个细胞同时测量前向散射光、侧向散射光、以及一种以上不同波长的荧光的光学特性，并快速准确地测定这些细胞的大小、内部结构、以及细胞膜/细胞质/细胞核内存在的各种抗原或核酸量等的生物学特性。
散射光是激光照射到细胞后向周围散射的光。前向散射光(Forward Scatter，FSC)是在相对于激光束轴的前方检测到的，散射光强度与细胞的表面积成比例。即，认为相对而言FSC值大时细胞也较大，而FSC值小时细胞也较小。侧向散射光(Side Scatter，SSC)是在与激光束轴线成90°(垂直)的位置检测到的，散射光强度与细胞的颗粒、细胞内结构的状态成比例。即，认为相对而言SSC值大时细胞的内部结构较复杂，而SSC值小时细胞的内部结构较简单。
对于流式细胞术的结果，代表性地可以用以FSC为X轴、以SSC为Y轴的点图来表示。在图中每个细胞由一个圆点(点)表示，通过FSC与SSC的相对值确定其位置。左下部分显示尺寸相对较小、内部结构简单的淋巴细胞，右上部分显示尺寸较大且内部具有颗粒的粒细胞，在淋巴细胞与粒细胞之间显示尺寸较大但内部结构简单的单核细胞，分别形成彼此相互分离的群。
荧光是指当标记细胞的荧光颜料被照射的激光束激发、在释放能量时产生的光。流式细胞仪(例如，产品名称：Becton&Dickinson FACSCalibur)通常照射488nm单波长激光束和635nm单波长激光束。虽然细胞本身也具有发射弱荧光的特性(自发荧光)，但是实际上欲要使用荧光特异性地检测细胞分子时需要预先以某种形式将荧光色素附着到细胞或其分子上。例如，FITC(异硫氰酸荧光素)吸收488nm的激发光，主要发射530nm的荧光(绿色)。如果预先用FITC标记抗体，则结合的抗体量会根据细胞表面所存在的抗原量而不同，其结果使得FITC的荧光强度不同，因此能够推定出细胞表面存在的抗原量。以FACSCalibur为示例，它搭载了四个荧光探测器(可以检测不同的荧光波长区域)，如果准备了发出不同波长光的多种荧光颜料，则可同时检测最多四种不同的抗原。作为被488nm单波长激光束激发的FITC以外的荧光色素，PE(藻红蛋白)主要发射585nm荧光，而PerCP(多甲藻素叶绿素蛋白(peridinin chlorophyll protein))和PE-Cy5(碳蓝蛋白-5(carbocyanin-5))主要发射670nm荧光。APC(别藻蓝蛋白)是一种由635nm单波长激光束激发的荧光色素，主要发射670nm荧光。这些荧光色素与各种抗体结合，用于细胞的双重或三重染色。在T淋巴细胞表面表达的CD3、CD4、CD8、CD25和TCR、在细胞内表达的Foxp3分子等可以用与其特异性反应的单克隆抗体来检测。
严格地说，流式细胞仪有两种类型，即，只解析细胞的仪器和能够分离(分选)经解析的细胞的仪器。后者被称为“FACS”。在本说明书中，“FACS”是荧光激活细胞分选器(fluorescence-activated cell sorter)的缩写，是指在使用激光束解析淋巴细胞等游离细胞的表面抗原、或者根据表面抗原的有无等对某特定细胞进行分选的方法中使用的设备。
流式细胞术的结果能以直方图、点图等显示。在本说明书中，“直方图”是指在使用流式细胞仪进行荧光测量时以各参数的光信号强度为X轴、以细胞计数为Y轴而获得的图。利用这种模式，总共可以计数1万个以上的细胞。
在本说明书中，“点图”是指在将两种荧光颜料的荧光强度作为X轴和Y轴而形成的图。在进行了双染色或三染色的情况下，可以使用将各自的荧光强度作为X或Y轴、各个细胞对应于二维图形上的每个点这样的显示方法进行解析。
例如，可以在收集外周血液或骨髓液后，用溶血法或比重离心法去除红细胞，然后与荧光标记抗体(针对目标抗原的抗体及其对照抗体)反应，并充分洗涤，然后用流式细胞术进行观察。将检测到的散射光或荧光转换成电信号，并由计算机进行解析。其结果，FSC的强度表示细胞大小，SSC的强度表示细胞内结构，由此能区分淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。之后，根据需要对目标细胞群进行门控，从而探讨这些细胞中的抗原表达方式。
在实施本发明的方法时，本领域技术人员可以适当地识别所示细胞的表面标志物以对细胞进行分离或计数。通过国际研讨会商定，CD抗原主要根据其识别的抗原的生化特征(特别是分子量)进行聚集(clusters)从而进行分类(clustering)。这被称为CD分类，由此识别特定白细胞分化抗原的多种单克隆抗体能够以CD后加编号、即CD编号的形式(例如CD1、CD2等)被统一命名。
由于CD3分子存在于细胞膜、与TCR形成复合物，所以可作为TCR表达的标志物进行使用。
研究发现高度表达CD25分子(为白细胞介素2受体α链)的CD4+T细胞具有抑制自身免疫性疾病的功能，CD4和CD25可被用作调节性T细胞的标志物。近年，发现了转录因子Foxp3是Treg分化的主控基因，能够被广泛用作鉴定CD4+CD25+Treg的分子标志物。另外，还发现了作为除Foxp3之外的Treg的细胞表面标志物可以使用CD127，在CD4+CD25强阳性、CD127阴性或弱阳性的T细胞级分中Treg含量较高。
(2.4TCR库的解析)
本发明的一个实施方案提供了一种方法，包括测定T细胞群的TCR库。在鉴定在供体中的抗原特异性效应T细胞群中所存在的TCR克隆时，发现通过测定各TCR克隆(α链或β链)在效应T细胞群中的存在频率，可以鉴定高功能性TCR克隆。
作为测定TCR库的方法的一个示例，有如下方法：使用特定的Vβ链特异性抗体，通过流式细胞术解析表达各个Vβ链的T细胞的比例，用于确定样品中的T细胞使用了多少个V链(FACS解析)。
此外，基于从人类基因组序列中获得的TCR基因的信息，构思了通过分子生物学方法进行的TCR库解析。存在如下方法：从细胞样品中提取RNA、合成互补DNA后，对TCR基因进行PCR扩增以进行量化。
通过使用本领域公知的工具(例如RNasy Plus通用迷你试剂盒(QIAGEN)等)，可以从细胞样品中提取核酸。使用RNasy Plus通用迷你试剂盒(QIAGEN)可以从溶解在TRIzolLS试剂中的细胞中提取纯化总RNA。
通过使用本领域已知的任何逆转录酶(例如Superscript IIITM(Invitrogen)等)，可以由提取的RNA合成互补DNA。
本领域技术人员能使用本领域已知的任何聚合酶适当地进行TCR基因的PCR扩增。然而，如果在TCR基因这样的变异较大的基因的扩增中能够进行“无偏差”扩增，则为精确测量带来有利的效果。
已经使用了如下方法：设计多个各个TCR V链特异性引物作为用于PCR扩增的引物，通过实时PCR法等分别定量的方法，或者同时扩增这些特异性引物的方法(多重PCR)。然而，即使使用内源性对照对每个V链进行定量，如果使用了许多引物，也不能进行准确的解析。此外，多重PCR的缺点是引物之间的扩增效率的不同导致PCR扩增过程中产生偏差。为了克服该多重PCR的缺点，鹤田等人报道了接头连接PCR法(Adaptor-ligation PCR)，即，在TCR基因的双链互补DNA的5’末端增加一个接头，然后通过通用接头引物和C区特异性引物扩增所有的γδTCR基因(Journal of Immunological Methods，1994，169，17-23)。进而，开发了也用于αβTCR基因的扩增、利用对各个V链特异性的Oligo探针进行定量的、反向斑点印迹法(Journal of Immunological Methods,1997,201,145-15.)和微板杂交试验法(HumanImmunology，1997，56，57-69)。
对于本发明的优选实施方案，如WO2015/075939(Repertoire Genesis Inc.，整个文献作为参考引用并入本说明书)中所记载的那样、通过由一种正向引物和一种反向引物组成的一组引物，在不改变存在频率的情况下扩增TCR基因(包括所有的同种型和亚型基因)，从而确定了TCR的多样性。以下的引物设计对于无偏差扩增是有利的。
重点放在TCR或BCR基因的基因结构上，通过在其5’末端添加接头序列，而不对高度多样化的V区设置引物，即可扩增包括所有的V区的基因。这类接头在碱基序列上是任何长度和序列，虽然大约20个碱基对是最佳的，但也能使用10个碱基至100个碱基的序列。添加到3’末端的接头用限制酶去除，通过与20碱基对的接头为相同序列的接头引物、以及对为共同序列的C区特异的反向引物进行扩增，由此扩增所有TCR基因。
由TCR或BCR基因信使RNA用逆转录酶合成互补链DNA，然后合成双链互补DNA。通过逆转录反应、双链合成反应合成包括不同长度V区的双链互补DNA，通过DNA连接酶反应将由20个碱基对和10个碱基对组成的接头添加到这类基因的5’末端部分。
通过在TCR的α链、β链、γ链、δ链的C区设置反向引物，能扩增这些基因。设置在C区中的反向引物与TCR的各Cβ、Cα、Cγ、Cδ的序列一致，并且在其他C区序列中设置具有不引发的程度的错配的引物。在考虑碱基序列、碱基组成、DNA熔化温度(Tm)、自互补序列有无的情况下，适当地制作C区的反向引物，从而能够进行与接头引物的扩增。可以在C区序列中的等位基因序列之间不同的碱基序列以外的区域设置引物，由此能够均匀扩增所有等位基因。为了提高扩增反应的特异性，进行多阶段的巢式PCR(nested PCR)。
相对于所有引物均不包含等位基因序列之间不同的序列的序列，引物候选序列的长度(碱基数)没有特别限制，碱基的数量为10～100，优选为15～50，并且更优选为20～30。
使用这种无偏差扩增对于鉴定低频(1/10000至1/100000或其以下)基因是有利且优选的。可以根据通过对以这种方式扩增的TCR基因进行测序而获得的读段数据，来确定TCR库。
现在，通过对来自人体样品的TCR基因进行PCR扩增、并利用下一代序列解析技术，可以实现大规模高效的TCR库解析，该大规模高效的TCR库解析能够从以往的得到小规模且V链使用频率等有限信息的TCR库解析中获得并解析克隆级别的更详细的基因信息。
只要能够确定核酸样品的序列，测序方法就不受限制，可以利用本领域中已知的任何方法，但优选使用下一代测序(NGS)。作为下一代测序，可以举出焦磷酸测序(pyrosequencing)、合成测序、连接测序、离子半导体测序等，但并不限定于此。
通过将所得的读段数据映射到包括V、D、J基因的参考序列，能够导出唯一读段数，从而确定TCR多样性。
在一实施方案中，针对每个V、D、J基因区准备所用的参考数据库。典型地，使用IMGT公布的每个区域、每个等位基因的核酸序列数据集，但不限于此，只要是对每个序列分配给唯一ID的数据集，即可使用。
将获得的读段数据(包括根据需要进行了修剪等适当处理的数据)用作输入序列集，与每个基因区域的参考数据库进行同源性检索，并记录与最接近的参考等位基因及其序列的比对。此处，同源性检索中，使用除了C之外错配容忍度高的算法。例如，当作为同源性检索程序使用通常的BLAST时，每个区域都进行了缩短窗口大小、减少错配惩罚、减少间隙惩罚这样的设定。在选择最接近的参考等位基因时，将同源性分数、比对长度、核长度(连续匹配碱基序列的长度)、匹配碱基数作为指标，根据确定它们的优先顺序进行应用。对于本发明中使用的V和J确定的输入序列，以参考V上的CDR3前端和参考J上的CDR3末端作为指导来提取CDR3序列。通过将其翻译成氨基酸序列，用于D区的分类。当制备D区的参考数据库时，将同源性检索结果和氨基酸序列翻译结果的组合作为分类结果。
由此，针对输入集中的每个序列分配V、D、J的各等位基因。随后在整个输入集中计算V、D、J的各出现频率或它们的组合的出现频率，由此导出TCR库。根据分类所需的精确度，以等位基因单位或基因名称单位计算出现频率。后者是通过将各等位基因翻译成基因名称来实现的。
在将V区、J区、C区分配至读段数据之后，对匹配的读段进行集中合计，按照唯一读段(没有相同序列的读段)，计算出在样品中检测到的读段数、以及在全部读段数中所占的比例(频率)。使用样品数、读段种类、读段数等数据，利用Estiments或R(vegan)等的统计解析软件，可以计算多样性指数或类似性指数。在优选实施方案中，使用TCR库解析软件(Repertoire Genesis Inc.)。
本发明的优选实施方案中，使用大规模高效TCR库解析来测定TCR多样性。在本说明书中，所谓“大规模高效库解析”，记载在WO2015/075939中(其全部公开内容根据需要作为参考并入本说明书)，在对象为TCR时被称为“大规模高效TCR库解析”。该方法包括：(1)提供核酸样品(包括无偏差扩增的T细胞受体(TCR)的核酸序列)的步骤；(2)确定该核酸样品中所包含的该核酸序列的步骤；以及(3)基于经确定的核酸序列计算各基因的出现频率或其组合、以得出该效应T细胞群的TCR库的步骤。
在另一个实施方案中，包含如下步骤：
(1)提供核酸样品(包括以无偏差方式扩增的TCR的核酸序列)的步骤，包括：
步骤(1-1)使用来自靶细胞的RNA样品为模板，合成互补DNA；
步骤(1-2)使用该互补DNA为模板，合成双链互补DNA；
步骤(1-3)向该双链互补DNA添加通用接头引物序列，合成添加接头的双链互补DNA；
步骤(1-4)使用该添加接头的双链互补DNA、由该通用接头引物序列组成的通用接头引物、和第一TCR的C区特异性引物，进行第一PCR扩增反应，
该第一TCR的C区特异性引物被设计为：包含对该TCR的目标C区足够特异的且与其他基因序列不同源的序列，并且在扩增时在下游在亚型之间包含不一致碱基；
步骤(1-5)使用(1-4)的PCR扩增子、该通用接头引物、和第二TCR的C区特异性引物，进行第二PCR扩增反应，该第二TCR的C区特异性引物被设计为：具有在所述第一TCR的C区特异性引物序列下游的序列中与该TCR的C区完全匹配的序列，但包含与其他基因序列不同源的序列，并且在扩增时在下游在亚型之间包含不一致碱基；以及
步骤(1-6)使用(1-5)的PCR扩增产物、添加的通用接头引物(其中在该通用接头引物的核酸序列中包含第一追加接头核酸序列)和带有接头的第三TCR的C区特异性引物(其中将第二追加接头核酸序列添加到第三TCR的C区特异性序列)进行第三PCR扩增反应；
该第三TCR的C区特异性引物被设计为：具有在该第二TCR的C区特异性引物的序列下游的序列中与该TCR的C区完全匹配的序列，但包含与其他基因序列不同源的序列，并且在扩增时在下游在亚型之间包含不一致碱基。
该方法的具体细节记载于WO 2015/075939中，本领域技术人员能通过适当参考该文献和本说明书的实施例等来进行分析。
(2.5TCR对鉴定)
在本发明的一实施方案中，作为T细胞群中存在的TCR克隆，鉴定一对TCRα链和TCRβ链。认为TCR以一对α链和β链的形式发挥抗原特异性，通过使用所鉴定的对，能进一步确实地通过引入TCR对从而赋予T细胞抗原特异性。因此，在鉴定TCR克隆的步骤中，能包括扩增源自同一细胞的TCRα基因和TCRβ基因，并对T细胞群中的TCRα和TCRβ对进行鉴定。在另一实施方案中，该方法还能进一步包括确认所鉴定的TCRα和TCRβ对是否与抗原有亲和性的步骤。进而在另一个实施方案中，能进一步包括克隆经鉴定的TCRα和TCRβ对中的TCRα的全部或部分核酸序列和TCRβ的全部或部分核酸序列。
例如，作为这种配对鉴定的技术，可以使用在Nature Medicine 19，1542～1546(2013)中记载的技术。由单个细胞扩增人TCR cDNA，克隆到表达载体中，并将其引入TCR阴性T细胞(如TG40细胞株)。通过用MHC四聚体染色该T细胞、或监测CD69的表达，来评估TCR抗原特异性。这样的整个过程可以在10天以内进行。
另外，通过多重PCR同时扩增α链和β链的技术(例如，如J Clin Invest.2011Jan；121(1):288-95.doi:10.1172/JCI44752.Epub 2010Dec 6.(PMID:21135507),PloS one[23May 2012,7(5):e37338](PMID:22649519)等中所记载)，理论上可以由单个细胞进行配对鉴定。
对于TCR配对技术，已经有一部分商业化，这些技术在TrendsBiotechnol.2017Mar；35(3):203-214.doi:10.1016/j.tibtech.2016.09.010.Epub2016Oct 26.(PMID:28341036)等的概评中也有记载。该文献的表2中记载了一般的单细胞测序技术，例如，记载了使用连续流动微流体的技术(Fluidigm,Kolodziejczyk,A.A.etal.(2015)The technology and biology of single-cell RNA sequencing.Mol.Cell58,610-620)、基于平板的技术(Cellular Research/BD Biosciences,65.Fan,H.C.et al.(2015)Expression profiling.Combinatorial labeling of single cells for geneexpression cytometry.Science 347,1258367)、使用基于液滴的微流体的技术(10XGenomics、76.Murphy,K.M.et al.(2016)Janeway’s Immunobiology.(9th),GarlandScience)等。此外，还可以使用在Sci Transl Med.2015Aug 19；7(301):301ra131.doi:10.1126/scitranslmed.aac5624.(PMID:26290413)中所记载的、不需要分离单个细胞的TCR高通量配对技术。本领域技术人员可以使用上述方法鉴定TCR对。
作为用于鉴定TCR对的代表性技术，可以举出对来自单个细胞的TCR进行分析，例如有：用流式细胞仪分选后的分析、使用液滴生成器的单细胞RNA-seq。例如，使用SMART方法的单细胞分析试剂盒作为SMARTER(注册商标)Human scTCR a/b分析试剂盒出售。可以通过逆转录(RT)反应、模板转换(TS)反应和PCR反应来扩增5’末端的序列未知的、或没有共同序列的RNA。也可以使用上述方法的改进方法。
在用流式细胞仪分选后的解析中，作为目标抗原肽已知或已被预期时，在约100～300个的单细胞解析中，可以通过FACS对具有TCR(使用四聚体与抗原肽反应)的T细胞进行分选，确定α链和β链，鉴定对抗原肽反应的TCR对。即使在抗原肽未知的情况下，当根据基于仅α链和仅β链的解析数据所确认的具有高保有率的α链和具有高保有率的β链的信息、考虑其组合时，该方法也能确定主要配对。
使用液滴生成装置的单细胞RNA-seq可以解析多达10000个单细胞，当上述抗原肽未知时无需采用使用流式细胞仪的方法进行这样的、两阶段的解析，可以一次解析多达10000个以上的单细胞。
上述方法能根据目的区分使用。虽然通过基于液滴的方法(能够解析多个细胞)进行配对鉴定，能够实现该步骤的目的，但是当抗原肽已知或是已预期的抗原肽时，通过制作四聚体来解析大约100～300个单细胞，也可以实现该步骤的目的。认为如果目标是找到高功能性TCR，解析最多几百个单细胞在费用效果方面非常优异，如果目标是综合解析低频存在的TCR(天然级分的TCR、共享的TCR等)，使用液滴进行解析虽然成本高但有利。
最近，单细胞RNA-Seq方法已被开发并用于各种研究(Hashimshony T et al:CellRep,2(3):666-673,2012,Hashimshony T et al:Genome Biol,17:77,2016)。流式细胞仪分选、微孔和微流体电路等各种分离设备被用于单细胞解析。使用液滴分离设备的方法能高效且简单地制作单细胞文库。
通过使用液滴产生设备的单细胞RNA-Seq，可以进行单细胞水平的TCR解析。液滴方法中，向大约100μm的油包水型液滴中快速封入细胞和将Oligo探针固相化的载体，由此能在大约30分钟内制作具有10000个细胞的单细胞文库。在2016年的细胞杂志中，Mocosko等人报道了一种使用Oligo珠的Drop-Seq方法(Macosko EZ et al:Cell,161(5):1202-1214,2015)，Klein等人报道了一种使用水凝胶的InDrop方法(Klein AM et al:Cell,161(5):1187-1201,2015)。这两种方法都将添加了细胞条形码(CBC)和分子识别序列(UMI)的聚(T)探针连接到载体上，并使用微芯片将细胞和Oligo载体封入液滴中。随后，进行cDNA合成、PCR和测序，以实现scRNA-Seq。
进而，对Drop-Seq方法进行改进，开发了一种高效地确定TCR对基因的基因捕获Drop-SeqTM方法。基因捕获Drop-SeqTM方法是一种通过将条形码标记的α和β链TCR寡聚体连接到微珠上并在液滴内选择性捕获TCR mRNA、从而高效确定TCR对基因的技术。对于使用基因特异性探针同时对细胞条形码序列和CDR3序列进行测序来确定配对基因的方法，不需要高规格测序器，能够有效地鉴定大量配对基因。该技术是一种有用的单细胞解析方法，也能应用于确定抗原基因的重链和轻链对、以及专注于特定基因表达的子集解析。本领域技术人员能使用上述技术、鉴定一对TCRα链和TCRβ链作为存在于T细胞群中的TCR克隆。
(2.6高功能性TCR)
研究发现，在所有功能T细胞亚群(Naive、SCM、CM、EM和EFF)的库中以及在抗原特异性T细胞库中，始终能检测到在不同个体之间高频共有的T细胞克隆型的TCR。如本说明书的实施例1所证明的，发现更优势的抗原特异性TCR具有更高的表位结合亲和性，并且来自更高度共有的克隆类型(图2)。此外，在实施例1中证实了这类抗原特异性TCR在被引入其他T细胞时也保持抗原亲和性。
已显示出，优势CMV NLV特异性克隆型的表位结合亲和性更高，并且优势克隆型共有且含有在不同个体中以较高频率存在的TCR克隆型(参见例如Scientific Reports 7,Article number:3663(2017)。出于所有目的，通过引用将整个文献并入本说明书)。显示出更优势的CMV PP65特异性克隆型具有更高的表位结合亲和性，并且来自更高度地共有的克隆类型。另外，由这一观察表明，在给定的个体中所存在的功能性TCR克隆型虽然数量较少，但这些克隆型即使在不同的个体间也高频度地共有。
在本发明的一实施方案中，提供了包括将存在于T细胞群中的TCR克隆(全部或部分核酸序列)引入T细胞的步骤。如上所述，主要存在于个体的抗原特异性T细胞群中的克隆具有高抗原亲和性，在将抗原特异性赋予要修饰的细胞时使用这样的克隆是有利的。然而，存在于抗原特异性T细胞群中的克隆由相对较少的克隆型组成，只要为其中包含的克隆，即使在该克隆不被认为是优势的情况下也可用于赋予抗原特异性。优选T细胞群是抗原特异性效应T细胞群。
引入的克隆可以是以比在抗原特异性T细胞群中的各克隆的存在频率的平均值高的频率存在的克隆。例如，引入的克隆的频率可以比抗原特异性T细胞群中的各克隆的存在频率的平均值大1个标准偏差以上、2个标准偏差以上或3个标准偏差以上。
引入的TCR克隆可以在T细胞群中以约1、约2、约5、约8、约10％、约12％、或约15％以上的频率存在。
(2.7内源性TCR基因的去除)
优选在引入TCR时去除内源性TCR。据Proc Natl Acad Sci U S A.2010Jun15；107(24):10972-7(PMID:20534461)报道，存在内源性TCR时，通过引入TCR可以形成混合二聚体，从而表现出新的抗原反应性。
当形成TCR混合二聚体(内源性TCR链和外源性TCR链的对)时，不仅已引入的TCR链和内源TCR链的表达降低、削弱特异性反应性，而且该混合二聚体可能具有潜在的有害的特异性。上述文献报道了虽然通过引入TCR而表现出新的反应性，并且大多数新的反应性是异种HLA反应性，但也发现了具有自身反应性的情况。另外，Mol Biol Rep.2010Dec；37(8):3951-6(PMID:20373027)中，作为用于定量检测由配对错误产生的TCR的技术，记载了FRET法。
内源性TCR的去除，可以通过内源性TCR基因的修饰来进行。内源性TCR的去除，例如可以通过敲减内源性TCR基因进行、也可以利用反义方法、RNAi等。内源性TCR还能通过敲除内源性TCR基因来去除。内源性TCR基因的修饰，例如，可以通过缺失全部或部分编码区、将变异引入调节区、引入无义或错义变异等来进行。
优选地，能使用基因组编辑技术来修饰内源性TCR基因。基因组编辑是一种利用位点特异性核酸酶修饰靶基因的技术。作为基因组编辑技术，可以举出ZFN、TALEN、CRISPR/CAS9等。每个都具有结合结构域(用于实现与期望序列的DNA序列特异性连接)和切断结构域(用于在期望的序列的位点切断DNA)。
ZFN是一种包含锌指结构域和DNA裂解结构域的人工限制酶。锌指结构域能被修饰以识别任意的DNA碱基序列，由此，锌指核酸酶能够靶向复杂基因组中的单个序列。
CRISPR(簇状的规律间隔性短回文重复序列(Clustered Regularly InterspacedShort Palindromic Repeats))/Cas9(Crispr相关蛋白9)系统由两个独立的分子(即，向导RNA和Cas9)组成，而ZFN和TALEN基本上是作为单一蛋白使用的。通过在向导RNA中包含与DNA靶位点互补的序列，能将向导RNA特异性地结合到靶位点。如此，以覆盖向导RNA和DNA的方式结合了Cas9蛋白，切断DNA。Cas9本身可以重复使用，根据靶位点只需产生向导RNA就足够了，因此，易于多路复用(multiplexing)。
TALEN(转录激活因子样效应物核酸酶)是将限制性酶FokI作为DNA切断结构域、与植物病原细菌黄单胞菌(Xanthomonas)分泌的TALE蛋白的DNA结合结构域融合而成的人工酶。TALE蛋白的DNA结合结构域具有大约34个氨基酸的重复结构。这种重复单元被称为模块。其中，氨基酸第12位和第13位是可变的，在与靶序列结合的部分被称为“重复可变双残基”(RVD)。TALEN使用与靶DNA的相对链(opposite strands)分别结合的分子，作为L-TALEN和R-TALEN的对。为了FokI显示切断活性，TALEN需要维持适当距离、形成二聚体。TALEN的错配耐受性和脱靶活性几乎没有报道，其特征是具有高特异性。如果在修饰T细胞时产生脱靶修饰，则可能触发意外的不良效应，因此在本发明中优选使用具有高特异性的TALEN。
除了传统的TALEN外，还制作了各种修饰TALEN。从高特异性和高修饰效率的方面考虑，优选通过这样的TALEN进行内源性TCR基因的修饰。在本说明书的实施例中证实了通过使用修饰TALEN可以完全消除T细胞的内源性TCR。
图17示出了修饰TALEN的一些示例。例如，在SuperTALEN中修饰模块的第4和第32个氨基酸，并且只组装使用特定的修饰重复(PCT/JP2014/071116,通过引用将其全部内容并入本说明书作为参考)。据报道，Zhang TALEN(EA型SuperTALEN)是将通过该SuperTALEN修改的两个氨基酸修为E和A而成的，除了图17所示的EA型之外通过QA型也使得活性增加。
铂TALEN通过形成在TALEN的DNA结合重复序列中含有的34个氨基酸中使第4个和第32个氨基酸发生变化的周期性排列，与Voytas TALEN相比活性更高(Sakuma et al.,SciRep,2013)。本发明的方法优选使用铂TALEN编辑内源性TCR基因。铂TALEN记载于日本特开2016-175922，作为参考，其全部内容通过引用并入本文。更具体地，能使用下述记载的基因组编辑技术来修饰内源性TCR基因。
本发明的一实施方案中，使用多肽或编码该多肽的核酸来修饰内源性TCR基因，该多肽或编码该多肽的核酸既可以通过功能结构域具有高功能性，又可以对DNA序列具有高识别特异性，能够以高概率安全地发挥所期望的功能，并且可以通过简单的操作来制造。
DNA结合结构域和功能结构域通过由35～55个氨基酸组成的多肽连接，并且，DNA结合结构域中含有的DNA结合模块中的两个特定位置的氨基酸对于四个DNA结合模块中的每一个都表现出不同重复形式的多肽，既可以通过功能结构域具有高功能性，又可以具有对DNA序列的高识别特异性。通过使用具有特定特征的载体集和具有特定特征的载体文库，能容易地制造用于表达该多肽的载体。
在本发明的一实施方案中，本发明能利用包括DNA结合结构域和功能结构域的多肽。可以使用下述多肽或者编码其的核酸，该多肽中，DNA结合结构域和功能结构域通过由35～55个氨基酸组成的多肽连接，DNA结合结构域从N末端侧连续地包括多个DNA结合模块，从N末端的第4n-3个DNA结合模块中的第x个氨基酸和第y个氨基酸的组合对于任意n都是相同的，从N末端的第4n-2个DNA结合模块中的第x个氨基酸和第y个氨基酸的组合对于任意n都是相同的，从N末端的第4n-1个DNA结合模块中的第x个氨基酸和第y个氨基酸的组合对于任意n都是相同的，从N末端的第4n个DNA结合模块中的第x个氨基酸和第y个氨基酸的组合对于任意n都是相同的，从N末端的第4n-3个DNA结合模块中的第x个氨基酸与第y个氨基酸的组合、从N末端的第4n-2个DNA结合模块中的第x个氨基酸与第y个氨基酸的组合、从N末端的第4n-1个DNA结合模块中的第x个氨基酸与第y个氨基酸的组合、以及从N末端的第4n个DNA结合模块中的第x个氨基酸与第y个氨基酸的组合，互不相同，此处，n是1～10的自然数，x是1～40的自然数，y是1～40的自然数，x和y是不同的自然数。功能性结构域可以是DNA切断结构域。包括编码多肽的多核苷酸。
另外，本发明可利用用于制作载体(其含编码上述多肽的多核苷酸)的载体文库，其中，载体文库由多个载体组成，所述载体从5’末端开始依次具有第一限制性酶切断位点、编码四个DNA结合模块的多核苷酸、和第二限制性酶切断位点，此处，第一限制性酶切位点和第二限制性酶切位点的组合是下述任意的组合，即，A型限制性酶切位点和B型限制性酶切位点的组合，A型限制性酶切位点和C型限制性酶切位点的组合，A型限制性酶切位点和D型限制性酶切位点的组合，A型限制性酶切位点和E型限制性酶切位点的组合，B型限制性酶切位点和C型限制性酶切位点的组合，C型限制性酶切位点和D型限制性酶切位点的组合，以及D型限制性酶切位点和E型限制性酶切位点的组合，其中，A型限制性内切酶切断位点～E型限制性内切酶切断位点通过用相同的限制性酶进行切断从而均得到彼此不同的切断末端，在四个DNA结合模块中，从5’末端开始的第1个DNA结合模块中的第x个氨基酸和第y个氨基酸的组合对于任何载体都是相同的，从5’末端开始的第2个DNA结合模块中的第x个氨基酸和第y个氨基酸的组合对于任何载体都是相同的，从5’末端开始的第3个DNA结合模块中的第x个氨基酸和第y个氨基酸的组合对于任何载体都是相同的，从5’末端开始的第4个DNA结合模块中的第x个氨基酸和第y个氨基酸的组合对于任何载体都是相同的，并且，从5’末端开始的第1个DNA结合模块中的第x个氨基酸和第y个氨基酸的组合、从5’末端开始的第2个DNA结合模块中的第x个氨基酸和第第y个氨基酸的组合、从5’末端开始的第3个DNA结合模块中的第x个氨基酸和第y个氨基酸的组合、以及从5’末端开始的第4个DNA结合模块中的第x个氨基酸和第y个氨基酸的组合，互不相同，其中，x是1～40的自然数，y是1～40的自然数，并且x和y是不同的自然数。
本发明进一步能够使用用于制造上述载体文库的载体集。此处，该载体集包括多个载体，这些载体从5’末端开始依次包括第一限制性酶切断位点、DNA结合模块和第二限制性酶切断位点，第一限制性酶切断位点和第二限制性酶切断位点通过用相同的限制性酶进行切断从而得到彼此不同的切断末端，DNA结合模块中的第x个氨基酸和第y个氨基酸的组合是四种不同组合的任一者，其中，x是1～40的自然数，y是1～40的自然数，x和y是不同的自然数。
上述多肽能够实现由功能结构域产生的高功能，同时能够实现对DNA序列的高识别特异性，因此，通过将包含编码上述多肽的多核苷酸的载体引入细胞，能安全且高概率地实现所期望的TCR基因的修改。另外，如果使用上述载体文库，则可以简便且快速地制备多肽表达用载体(其能够同时获得由功能结构域产生的高功能性和对DNA序列的高识别特异性)。
对于DNA结合结构域的来源，可以举出植物病原体黄单胞菌(Xanthomonas)的TALE(转录激活因子样效应物)、锌指等。
作为功能结构域，可以举出编码酶、转录调节因子、报告蛋白等的结构域。作为酶，可以举出重组酶、核酸酶、连接酶、激酶和磷酸酶等DNA修饰酶，内酰胺酶等其他酶。在本说明书中，将编码核酸酶的结构域称为DNA切断结构域。作为转录调节因子，可以举出激活因子、抑制因子等。作为报告蛋白，可以举出绿色荧光蛋白(GFP)、人源化Renilla reniformis绿色荧光蛋白(hrGFP)、增强型绿色荧光蛋白(eGFP)、增强型蓝色荧光蛋白(eBFP)、增强型青色荧光蛋白(eCFP)、增强型黄色荧光蛋白(eYFP)、红色荧光蛋白(RFP或DsRed)、mCherry等荧光蛋白；萤火虫荧光素酶、Renilla荧光素酶等生物发光蛋白；碱性磷酸酶、过氧化物酶、氯霉素乙酰转移酶、β-半乳糖苷酶等转化化学发光底物的酶。DNA切断结构域优选接近其他DNA切断结构域以形成多聚体，获得提高的核酸酶活性。作为这样的DNA切断结构域，可以举出那些来自FokI的切断结构域。
DNA结合结构域和功能结构域通过由35-55个、优选40-50个、更优选45-49个、最优选47个氨基酸组成的多肽连接。
DNA结合结构域从N-末端侧连续地包含多个DNA结合模块，一个DNA结合模块特异性地识别一个碱基对。从同时获得功能区的高功能性和对高DNA序列识别特异性的观点来看，DNA结合结构域中含有的DNA结合模块的数量优选为8～40个、更优选为12～25个，进一步更优选为15～20个。作为DNA结合模块，例如可以举出TAL效应物重复序列(TAL effectorrepeat)等。一个DNA结合模块的长度，例如可以举出20～45、30～38、32～36、或者34等。DNA结合结构域中含有的DNA结合模块的长度优选相对于所有DNA结合模块是相同的。作为DNA结合模块，例如可以举出TPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHG(序列号1)的序列。例如，如果该序列的第12个氨基酸和第13个氨基酸依次为H和D，则DNA结合结构域将识别C作为碱基，如果氨基酸依次为N和G，则该DNA结合结构域将识别T作为碱基，如果氨基酸依次为N和I，则DNA结合结构域将识别A作为碱基，如果氨基酸依次为N和N，则DNA结合结构域将识别G作为碱基。另外，作为DNA结合模块，例如可以举出与序列号1的氨基酸序列具有85％、90％、95％或97％同一性的、并且实质上保有识别1个碱基对的功能的多肽。
从N末端的第4n-3个DNA结合模块中的第x个氨基酸和第y个氨基酸的组合对于任意n是相同的。另外，从N-末端的第4n-2个DNA结合模块中的第x个氨基酸和第y个氨基酸的组合对于任意n是相同的。另外，从N-末端的第4n-1个DNA结合模块中的第x个氨基酸和第y个氨基酸的组合对于任意n是相同的。另外，从N-末端的第4n个DNA结合模块中的第x个氨基酸和第y个氨基酸的组合对于任意n是相同的。此处，n是1～10的自然数，优选为1～7的自然数，更优选为1～5的自然数。n优选是足以指示DNA结合结构域中含有的所有DNA结合模块的自然数。另外，x是1～40的自然数，优选是1～10的自然数，更优选是2～6的自然数，更优选是3～5的自然数，最优选是自然数4。y是1～40的自然数，优选是25～40的自然数，更优选是30～36的自然数，更优选是31～33的自然数，最优选是自然数32。x和y是不同的自然数。根据所使用的DNA结合模块的长度，x和y的值可以不同。x优选是表示与由34个氨基酸组成的DNA结合模块中的第二个氨基酸相当的位置的数值。y优选是表示与由34个氨基酸组成的DNA结合模块中的第32个氨基酸相当的位置的数值。
从N-末端的第4n-3个DNA结合模块中的第x个氨基酸与第y个氨基酸的组合、从N-末端的第4n-2个DNA结合模块中的第x个氨基酸与第y个氨基酸的组合、从N-末端的第4n-1个DNA结合模块中的第x个氨基酸与第y个氨基酸的组合、以及从N-末端的第4n个DNA结合模块中的第x个氨基酸与第y个氨基酸的组合，可以互不相同，此处，n是1～10的自然数，优选为1～7的自然数，更优选为1～5的自然数。优选n是足以指示DNA结合结构域中含有的所有DNA结合模块的自然数。另外，x是1～40的自然数，优选是1～10的自然数，更优选是2～6的自然数，更优选是3～5的自然数，最优选是自然数4。另外，y是1～40的自然数，优选是25～40的自然数，更优选是30～36的自然数，更优选是31～33的自然数，最优选是自然数32。x和y是不同的自然数。优选地，从N-末端的第4n-3个DNA结合模块中的第x个氨基酸与第y个氨基酸的组合、从N-末端的第4n-2个DNA结合模块中的第x个氨基酸与第y个氨基酸的组合、以及从N-末端的第4n个DNA结合模块中的第x个氨基酸与第y个氨基酸的组合，分别选自由按x和y的顺序为D和D的组合、E和A的组合、D和A的组合以及A和D的组合组成的组。
作为可使用的载体，可以举出质粒载体、粘粒载体、病毒载体、人工染色体载体等。作为人工染色体载体，额可以举出酵母人工染色体载体(YAC)、细菌人工染色体载体(BAC)、P1人工染色体载体(PAC)、小鼠人工染色体载体(MAC)、人类人工染色体载体(HAC)。另外，作为载体的成分，可以举出DNA、RNA等核酸、GNA、LNA、BNA、PNA和TNA等核酸类似物等。载体也可以用糖类等核酸以外的成分进行修饰。
上述多肽能通过将载体引入细胞等使其表达来制备。另外，通过将载体引入细胞等使其表达，可以在细胞中发挥与功能结构域相对应的所期望的功能，例如DNA重组、DNA切断等DNA修饰、转录调节等其他酶活性的表达、利用报告蛋白进行的DNA区域的标记化等。如果功能结构域是DNA切断结构域，则可以通过将多个(优选为两个)载体引入细胞等并使其表达，从而能够在引入了载体的细胞的基因组DNA上产生碱基序列特异的双链切断，能够在细胞的基因组中引入变异。作为引入载体的细胞的来源，可以举出果蝇、斑马鱼、小鼠等哺乳类等的动物、拟南芥等植物、ES细胞、iPS细胞等培养细胞等。
(2.8外源性TCR的引入)
本发明的一实施方案提供了一种方法，包括将TCR引入T细胞的步骤。T细胞优选为调节性T细胞。引入的步骤可以是引入TCRα基因的全部或部分核酸序列和TCRβ基因的全部或部分核酸序列的步骤。优选地，本说明书中记载的高功能性TCR被引入T细胞中。高功能性TCR能被鉴定为TCR对。优选以上述TCRα链和TCRβ链成对表达的方式进行引入。
对于以成对表达的方式进行引入，记载于Cancer Immunol Immunother.2016Jun；65(6):631-49(PMID:27138532)等中。另外，对于以成对表达的方式进行引入，除了通过Cys化(引入Cys残基)形成二硫键的方法之外，还有密码子优化·向胞内区引入亮氨酸拉链·TCR的糖链修饰等技术。
作为用于TCR引入载体的避免错配的现有技术，例如有：
1)Cys的引入(Blood.109:2331,2007.)；
2)亮氨酸拉链(Proc Natl Acad Sci.91:11408,1994.)；
3)使用2A序列的α/β链的均等表达(根据需要进行密码子优化)(J Mol Med 88:1113,2010)；
4)特定的N-糖基化位点的去除(J Exp Med.206:463,2009.)；
5)小鼠等的胞内结构域的使用(Cancer Res.66:8878,2006；J Immunol.184:6223,2010)；
6)单链TCR的使用(α-β-恒定)(Blood.115:5154,2010)；等。
可以使用能够实现这种表达的载体来引入TCR。例如，载体可以构成为：包含编码半胱氨酸(Cys)的核酸序列使得在表达的TCRα和TCRβ之间形成二硫键，或者将TCRα和TCRβ的编码序列进行密码子优化，或者将亮氨酸拉链引入TCRα和TCRβ的胞内区，或者载体也可以构成为将TCRα和TCRβ进行糖链修饰从而进行表达。
在本发明中，可以引入已鉴定的TCR克隆的全部核酸，或者只要能保持结合亲和性，也可以只引入部分核酸。在一实施方案中，能引入包含与Vα-Jα的CDR3区相对应的序列的、TCRα基因的部分核酸序列。另外，能引入包含与Vβ-D-Jβ的CDR3区相对应的序列的、TCRβ基因的部分核酸序列。能引入包含Vα-Jα-Cα的cDNA序列的、TCRα基因的部分核酸序列。能引入包含Vβ-D-Jβ-Cβ的cDNA序列的、TCRα基因的部分核酸序列。
在本发明的一实施方案中，也可以分两步骤进行内源性TCR基因的去除和TCR的引入，以完全替代内源性TCR。例如，提供了一种方法，包括：去除T细胞中内源性TCRα或内源性TCRβ中的任一者的步骤；将TCRα基因的全部或部分核酸序列和TCRβ基因的全部或部分核酸序列引入该T细胞中的步骤；去除该T细胞中的内源性TCRα或内源性TCRβ基因中的另一者的步骤；以及将TCRα基因的全部或部分核酸序列和TCRβ基因的全部或部分核酸序列重新引入该T细胞的步骤。
内源性TCR的完全替代中，也可以在不使用病毒载体的情况下将外源性TCR敲入并引入基因组。作为敲入技术，已知使用同源重组(HR)的技术。另外，也可以不采用同源重组(HR)，而是采用通过微同源介导的末端连接(MME J)进行的方法。MME J是真核生物具有的DNA修复机制之一，是在双链切断时所产生的两个切断末端之间、在互补序列(5～25个碱基对)之间结合进行修复的机制。利用MME J修复机制插入外源基因时，在供体载体上添加人工核酸酶的识别序列，使得该序列在双链切断时在染色体上靶位点和载体的切断末端互补结合。通过将该供体载体与人工核酸酶(TALEN以及CRISPR/Cas等)一起引入，可以将基因敲入靶点(分别称为TAL-PITCH法和CRIS-PITCH法)(Nature Communications volume 5,Article number:5560(2014))。当使用病毒载体引入外源性TCR时，即使实际上概率不是问题，但是由于理论上有致癌的风险，所以就避免这种风险而言，不使用病毒载体是有利的。
(3、应用)
本发明的调节性T细胞能用于处理、治疗或预防自身免疫性疾病、过敏性疾病或移植时的移植物抗宿主病(GVHD)、排斥反应或移植物衰竭，因为认为抗原特异性调节性T细胞在抑制对该抗原的免疫应答方面是有效的。
作为自身免疫性疾病，例如可以举出类风湿性关节炎(RA)、干燥综合征、系统性红斑狼疮(SLE)、抗磷脂综合征、多发性肌炎/皮肌炎、系统性硬化症、混合性结缔组织病、血管炎综合征、I型糖尿病、格雷夫斯病、桥本氏病、特发性艾迪森病、自身免疫性肝炎、古德帕斯综合征、肾小球肾炎、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、自身免疫性血小板减少性紫癜、自身免疫性中性粒细胞减少症、重症肌无力、天疱疮、白癜风、特发性无精子症等，但并不限定于此。作为过敏性疾病，可以举出花粉热、过敏性鼻炎、支气管哮喘、特应性皮炎等，但并不限定于此。此外，针对与对特定抗原的异常免疫应答发病、病情恶化相关的疾病，也可以利用本发明的抗原特异性调节性T细胞进行治疗或预防。
在本说明书中，当采用句子中的所列事项中的“至少一个以上”时，使用“或”。“或者”也为同样含义。当本说明书中明确记载为“在两个值的范围内”时，该范围还包括这两个值本身。
对于本说明书中所引用的科学文献、专利和专利申请等参考文献，以与分别具体记载时相同的程度作为参考并入本说明书。
以上，为了易于理解给出了优选实施方式对本发明进行了说明。以下，基于实施例对本发明进行说明，但以上记载和下面的实施例仅用于示例目的，而不是对本发明的限制。因此，本发明的范围不限于说明书具体记载的实施方案和实施例，而仅限于权利要求的范围。
[实施例]
下文记载实施例。以下实施例中使用的对象的处理，在需要时遵守国家规定的人类基因组基因/解析研究相关的伦理准则、与以人为对象的医学研究相关的伦理准则以及广岛大学规定的标准，即使没有明确规定，在涉及动物实验的情况下，也是基于动物保护精神和相关法律法规进行的。
(实施例1：高亲和性克隆的鉴定/克隆)
(概述)
本实施例的目的是证明免疫学优势的克隆是高亲和性克隆以及该克隆的鉴定/克隆的方法。
用抗原刺激T细胞群后，测定抗原特异性T细胞群中的TCR克隆的存在频率的分布，并克隆每个TCR克隆。测定各个TCR克隆与抗原的结合能力时，发现T细胞群中优势的克隆具有高抗原结合能力。Scientific Reports 7,Article number:3663(2017)中也记载了与此实施例相关的信息。出于本说明书的全部目的，将整个文档作为参考进行了援引。
(材料和方法)
[供体样品]
该实施例是根据“赫尔辛基宣言”的原则进行的。所有使用人体样品的实验都是按照广岛大学伦理委员会批准的方案进行的。外周血单核细胞(PBMC)取自5名提供书面同意的健康供体。对所有供体进行CMV血清学筛查，并采用高分辨率Luminex技术针对HLA-A、-B、-C、DRB1、-DQB1和-DPB1等位基因进行基因分型。使用标准Ficoll梯度分离方案分离PBMC，然后将其储存在液氮中。
[流式细胞术分析和细胞分选]
用下列荧光标记的单克隆抗体(mAb)确定细胞表面分子的表达：别藻蓝蛋白(APC)偶联或异硫氰酸荧光素(FITC)偶联抗CD8，别藻蓝蛋白-Hilite7(APC-H7)偶联抗CD3，藻红蛋白-花青素7(PE-Cy7)偶联抗CD45ROmAb，亮紫510(BV510)偶联抗CD62LmAb,亮紫421(BV421)偶联抗CD197mAb，APC偶联抗CD95和APC偶联抗TCRαβ。这些抗体购自BD Bioscience(San Jose,CA)。使CMV pp65特异性T细胞与藻红蛋白(PE)偶联HLA-A*02-肽四聚体反应，如“Kuzushima，K等，HLA A*2402限制性EB病毒特异性CD8+T细胞识别表位的四聚体辅助鉴定与表征(Tetramer-assisted identification and characterization of epitopesrecognized by HLA A*2402-restricted Epstein-Barr virus-specific CD8+ Tcells)，Blood 101,1460-1468(2003)”中所述。四聚体MHC-I上的CD8结合位点完整。本发明的发明人们选择HLA-A*02限制性CMV pp65肽(NLV肽)的NLVPMVATV(序列号2)序列作为模式抗原。在室温下进行MHC四聚体染色15min，然后在4℃下进行细胞表面染色30min。除系列稀释实验外，全部实验中所用的四聚体的浓度均为10μg/ml。使用阴性对照四聚体(HLA-A2-HIV(KLTPLCVTL(序列号3))四聚体-PE)检查非特异性四聚体染色。
流式细胞术分析和细胞分选使用FACSCanto II(BD Biosciences,San Jose,CA)和FACSAria(BD Biosciences,San Jose,CA)。使用FlowJo软件(Tree Star，Ashland，OR)分析所有的流式细胞术数据。用7-AAD去除死亡细胞和损伤细胞，然后用FSC-A/FSC-H和SSC-A/SSC-H去除二倍体细胞。CD3+CD8+T细胞进一步分为以下功能亚群：Naive，CD45RO-CD62L+CCR7+CD95-；SCM，CD45RO-CD62L+CCR7+CD95+；CM，CD45RO+CD62L+CCR7+CCR7+；EM，CD45RO+CD62L-CCR7-；EFF，CD45RO-CD62L-CCR7-。
[细胞培养]
PBMC和经分选的CD8+T细胞在含有10％AB血清、2mmol/l L-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素的X-VIVO 20(Lonza,Walkersville,MD)中培养。B淋巴母细胞系(B-LCL)在含有10％FBS、2mmol/l L-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素的RPMI1640(Sigma-Aldrich，StLouis，MO)中培养。所有细胞均在37℃、在含5％CO2的气氛中于加湿培养箱中培养。
在含5μg/ml PHA-L(Sigma-Aldrich,St Louis,MO)的CTL培养基中培养PBMC，由此获得植物血凝素(PHA)母细胞。第二天，加入IL-2(PeproTech，Rocky Hill，NJ)直至最终浓度为50U/ml。然后，将一半的培养基用含有IL-2(50U/ml)和IL-7(Peprotech,Rocky Hill,NJ)(20ng/ml)的新鲜培养基替换，每周两次。在开始培养14天后使用PHA母细胞(blast)。
对于用CRISPR-Cas9构建成缺陷TCR表达的Jurkat细胞，如下确立。简言之，在CRISPR/Cas9介导的内源性TCRα链的敲除后，通过流式分选，富集了CD3阴性细胞。用包含TCRα链的附加体载体(episome vector)转导经分选的细胞，然后，通过流式分选富集CD3阳性细胞(具有转导的α链和内源性β链的Jurkat细胞)。用CRISPR/Cas9敲除经分选的细胞的内源性TCRβ，然后，富集CD3阴性细胞(不含内源性TCRα和TCRβ的Jurkat细胞)。接着，采用流式细胞术单细胞分选法进行Jurkat细胞的单细胞克隆。最后，将TCRβ链引入经克隆的Jurkat细胞，然后筛选出内源性TCRα、内源性TCRβ以及转导TCRα均为阴性的Jurkat克隆。通过将TCRβ转导至克隆，确认克隆的TCRα阴性。通过将TCRα转导至克隆，确认克隆的TCRβ阴性。用pMX-CD8α表达载体转导该克隆，并用抗CD8mAb进行亮染色。
[CMV pp65特异性T细胞的体外刺激]
用CD8微珠从PBMC中分离CD8+T细胞。使用CD4+T细胞分离试剂盒(MiltenyiBiotec,Auburn,CA)从其余细胞中去除CD4+T细胞。将剩余的CD4/CD8双阴性细胞用作抗原提呈细胞(APC)。放射性照射(35Gy)后，将APC在室温下暴露于NLV肽2小时，并在含有IL-2和IL-7的CTL培养基中与同等数量的CD8+T细胞共培养。合成的NLV肽购自GenScript(Piscataway，NJ)。更换一半的培养基，每周两次。
[利用高通量NGS对TCR库进行半定量解析]
对于使用NGS和使用接头连接PCR的无偏差基因扩增方法进行的全面的TC库解析，简要而言如下文所述。从PBMC(5×106)或经分选的T细胞中提取总RNA，用包含Poly(T)18和NotI位点的BSL-18E引物转化为cDNA。然后，合成双链DNA(ds)，使用T4 DNA聚合酶(Invitrogen)进行末端钝化。将P10EA/P20EA接头连接到dsDNA的5’末端，然后用NotI切断。去除接头和引物后，用TRA恒定区特异性引物或TRB恒定区特异性引物、和P20EA进行PCR。用恒定区特异性P20EA引物采用相同的PCR条件进行第二次PCR。第二次PCR的产物用于使用Illumina MiSeq平台的高通量测序。在去除低质量分数的序列之后，使用由ReperireGenesis公司(Ibaraki,Japan)制作的生物信息学软件进行TCR库分析。以下各节将介绍各个过程的更详细信息。
[TCR基因的无偏差扩增]
根据制造商的说明书，使用RNasy Lipid Tissue Mini Kit(Qiagen,Hilden,Germany)从PBMC或经分选的T细胞中提取总RNA。用Agilent 2200TapeStation(AgilentTechnologies,Palo Alto,CA)测定RNA量和纯度。用SuperscriptⅢ逆转录酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)将1μg的总RNA转化为cDNA。用含Poly(T)18和NotI位点的BSL-18E引物合成cDNA。cDNA合成后，用大肠杆菌DNA聚合酶I(Invitrogen)、大肠杆菌DNA连接酶(Invitrogen)和RNase H(Invitrogen)合成双链(ds)cDNA。用T4 DNA聚合酶(Invitrogen)钝化dscDNA末端。将P10EA/P20EA接头连接到dscDNA的5’末端，然后用NotI切断。通过MinElute反应清除试剂盒(Qiagen)去除接头和引物后，用TCRα链恒定区特异性引物(CA1)或TCRβ链恒定区特异性引物(CB1)中的任一者和P20EA引物进行了PCR。PCR条件为95℃(30s)、55℃(30s)和72℃(1min)共20个循环。用CA2或CB2中的一者、和P20EA引物采用相同的PCR条件进行了第二次PCR。
下表中示出了所用引物。
[表1]
用于重排T细胞受体基因片段的下一代测序的引物
Figure BDA0002529358570000431
从顶部开始对应序列号4至13。V:A/C/G，N:A/C/G/T，接头A和B的序列分别用粗体和粗斜体表示。密钥序列(TCAG)由下划线表示。
用于鉴定样品来源的MID Tag序列如下所示：MID1
Figure BDA0002529358570000432
[使用Roche 454测序系统进行扩增子测序]
使用P20EA引物和融合Tag引物由第二次PCR的产物制备用于NGS的扩增子(表1)。融合Tag引物包括A接头序列(CCATCTCATCCCTGCGTGT CTCCGAC(序列号34))、4个碱基序列密钥(key)(TCAG)以及分子鉴定(MID)Tag序列(10个核苷酸)。根据制造商的说明书设计TCR恒定区特异性序列。PCR扩增之后，使用凝胶电泳评价扩增子。根据制造商的说明书使用Agencourt AMPure XP(Beckman Coulter，Brea，CA)去除不完整片段或引物。使用Quant-iTPicoGreen dsDNA分析试剂盒(Life Technologies,Carlsbad,CA)对经纯化的扩增子的量进行定量。将通过不同的融合Tag引物由10个样品获得各扩增子以等摩尔浓度进行混合。根据制造商的说明书，使用GS Junior Titanium emPCR Lib-L试剂盒(Roche 454LifeSciences，Branford，CT)通过使用扩增子混合物进行乳液PCR(emPCR)。
[TRV和TRJ段的分配]
根据MID Tag序列对所有序列读段进行分类。使用454测序系统提供的软件从序列读段的两末端去除人工添加的序列(Tag、接头和密钥)和低质量分数的序列。剩余序列用于TCRα序列的TRAV和TRAJ、以及TCRβ序列的TRBV和TRBJ的分配(assignment)。在可从ImMunoGeneTics Information System(IMGT)数据库(http://www.imgt.org))获得的参考序列(54的TRAV、61的TRAJ、65的TRBV和14的TRBJ基因(包括假基因和开放阅读框(ORF)参考序列))的数据集中确定具有最高百分比同一性的序列，由此进行序列的分配。使用由Repertoire Genesis公司(Osaka,Japan)独立开发的库解析软件(Repertoire Genesis，RG)自动执行数据处理、分配和数据聚集。RG首先使用BLASTN和IMGT数据集将TRV和TRJ等位基因分配以查询。在此步骤中计算了查询序列和参考序列之间的同一性。针对每个库分析，优化了提高灵敏度和准确性的参数(E值阈值、最小核函数、高分片段对(HSP)分数)wp。接下来，RG通过分析所翻译的读码框来评估查询的CDR3区域。然后，RG计算TRV-CDR3-TRJ模式的分布，生成图形(例如，TRV-TRJ使用直方图或CDR3长度分布图)。这些步骤是在输入查询后自动执行的。
[数据分析]
根据IMGT命名法，CDR3区的已翻译的核苷酸序列跨度从保存的Cys104到保存的Phe118或Gly119。唯一序列读段(USR)被定义为：相对于TRV、TRJ以及其他的序列读段的CDR3结构域的推导氨基酸序列，同一性为0％。RG软件自动地计算各样品中的相同UCR的拷贝数，然后按照拷贝数的顺序对它们进行排序。计算TRAV、TRAJ、TRBV和TRBJ基因的序列读段的百分比频率。
[单细胞分选和RT-PCR]
为了鉴定和表征由单个细胞表达的CMV NLV特异性TCRαβ对，本发明的发明人们使用如下改进的hTEC10系统(Kobayashi,E.et al.A new cloning and expression systemyields and validates TCRs from blood lymphocytes of patients with cancerwithin 10days.Nat.Med.19,1542-1546(2013).,Hamana,H.,Shitaoka,K.,Kishi,H.,Ozawa,T.&Muraguchi,A.A novel,rapid and efficient method of cloning functionalantigen specific T-cell receptors from single human and mouse T-cells.Biochem.Biophys.Res.Commun.474,709-714(2016))。96孔PCR板每孔分选CD8/NLV四聚体双阳性细胞。使用多重RT-PCR合成/扩增cDNA。根据从IMGT数据库(http://www.imgt.org/))获得的前导肽序列设计用于扩增编码TCRα链和TCRβ链的序列的基因特异性引物。PCR反应在下面的[TCRA和TCRB对的RT-PCR分析]中详细描述。使用IMGT/V-Quest toll(http://www.imgt.org/))进行TCR库分析。
[TCRA和TCRB对的RT-PCR分析]
在反应混合物中进行RT-PCR，该反应混合物包含0.1μl的40U/μl RNase抑制因子(NEB，Ipswich，MA)、0.1μl的200U/μl PrimeScript II RTase(TaKaRa,Otsu,Japan)、0.4μl的引物混合物、0.025μl的2.5U/μl PrimeStar HS DNA聚合酶(TaKaRa)、0.4μl的2.5mMdNTP和2.5μl的5×PrimeStar GC缓冲液(TaKaRa)。加入DEPC处理过的H2O，使最终体积为5μl。RT反应在45℃下进行40min，然后进行下述的PCR反应：在98℃下1分钟，然后在98℃下10秒、在55℃下5秒以及在72℃下1分钟，将其进行30个循环。将PCR反应物用水稀释10倍，用作之后的巢式PCR用的模板DNA。用不同的96孔PCR板进行巢式PCR用于扩增TCRA和TCRB。反应混合物包含：来自第一次PCR反应的2μl的DNA模板，0.4μl的10μM的各自特异性引物组(针对TCRα为A-AD和A-RV2引物，针对TCRβ为B-AD和B1-RV2引物、B2-RV2引物)，0.1μl的2.5U/μlPrimeSTAR HS DNA聚合酶，1.6μl的2.5mM dNTP，10μl的5×PrimeSTAR GC缓冲液，0.1μl的2.5U/μl和H2O(添加至最终体积为20μl)。PCR循环如下所示：在98℃下为1分钟，然后在98℃下为10秒，在55℃下为5秒，在72℃下为1分钟，将其进行35个循环。通过Sanger测序，分析TCRA和TCRB的PCR产物。
[已克隆的TCR的结合能力的确认]
1)用逆转录病毒载体(pMXs-IRES GFP)将上述已克隆的各TCRαβ对基因(CMVpp65NLVPMVATV：NLV特异性)分别引入TCRαβ缺陷的Jurkat细胞。
2)用细胞分选仪(AriaII)从已引入各TCR基因的Jurkat细胞中分离出GFP阳性细胞。
3)用被连续稀释成浓度为2、4、6、8、10μg/ml的NLV四聚体，对引入了各TCR的Jurkat细胞进行染色。
4)使用流式细胞术测定四聚体阳性细胞的荧光强度(MFI)，分析各TCR与四聚体的结合能力。
(结果)
图1和图2示出了结果。对于供体V001和V004，具有图1所示克隆型的T细胞克隆被鉴定为抗原特异性克隆型。研究发现，抗原特异性克隆群由非常少量的克隆组成。
进而，对于用上述方法测定的各TCR克隆的存在频率和与抗原的结合性的比较，如图2所示。由结果可知，存在频率与结合亲和性之间存在线性相关。可认为在抗原特异性T细胞群中优势的克隆是高亲和性克隆。
(实施例1-2)
使用不同的测序仪(Miseq,Illumina)，按照下述顺序进行了上述实施例1中的[利用高通量NGS对TCR库进行半定量解析]的步骤。
[实验方案的变更点的概述]
从RNA至双链DNA的合成，进行与实施例1相同的步骤。对于PCR，从第一次PCR到第二次PCR进行相同的步骤，之后进行MiSeq用的PCR(Tag PCR和索引PCR)。作为试剂的变更点，使用作为下一代测序的PCR酶而被推荐的KAPA HiFi HotStart ReadyMix。
3-2-9：样品操作7(第一次、第二次PCR)
*记载了用于解析人TCRαβ两个基因的流程。
<第一次PCR>
示出了一样品份的试剂量。
将10μL的2×KAPA HiFi Hot Start Ready Mix分别加入α或β管中。
将7.6μL的DW(DNA专用，瓶装)分别加入α或β管中。将0.2μL的10μM P20EA引物分别加入α或β管中。
将0.2μL的10μM CA1引物加入α管中，将0.2μL的10μM CB1引物加入β管中。
向加入了α或β溶液的管中，分别加入2μL的各dsDNA样品。
通过热循环仪，选择适用的设置(程序名称：KAPA20，条件为：95℃ 3分钟、20个循环(98℃ 20秒、65℃ 30秒、72℃ 1分钟)、72℃ 2分钟，最后维持12℃)。
<第二次PCR>
示出了一样品份的试剂量。
将10μL的2×KAPA HiFi Hot Start Ready Mix分别加入α或β管中。
将6μL的DW分别加入α或β管中。
将1μL的10μM P20EA引物分别加入α或β管中。
将1μL的10μM CA2引物加入α管中，将1μL的10μM CB2引物加入β管中。
向各个的α或βPCR用第二次PCR管中，分别加入2μL的α或β的第一次PCR产物。
通过热循环仪，选择适用的设置(程序名称：KAPA20，条件为：95℃ 3分钟、20个循环(98℃ 20秒、65℃ 30秒、72℃ 1分钟)、72℃ 2分钟，最后维持12℃)。
<DNA纯化1>
3-2-10：样品操作8(AMpure纯化1)
在此步骤中使用Beckman Coulter公司的Agencourt AMPure XP。
充分混合AMPure XP珠直至均匀，将8μL分配到管中。
在已分配AMPure XP珠的管中加入10μL的第二次PCR产物，将管放在MM-SeparatorM96(磁板)上收集磁珠。
去除上清液，用200μL的70％乙醇冲洗，置于MM-Separator M96、收集磁珠。
完全去除上清液，分配30μL的DW(DNA用，瓶装)并涡旋。置于MM-Separator M96，收集磁珠。
回收25μL上清液。
<Tag PCR>
3-2-11：样品操作9(Tag PCR)
将10μL的2×KAPA HiFi Hot Start Ready Mix分别加入α或β管中。
将4.2μL的DW(DNA专用，瓶装)分别加入α或β管中。将0.4μL的10μM P22EA-ST1-R引物分别加入α或β管中。
将0.4μL的10μM CA-ST1-R引物加入α管中，并将0.4μL的10μM CB-ST1-R引物加入β管中。
将5μL的各第二次PCR纯化完成的样品加入已加有α或β试剂混合物的管中。
用热循环仪选择适用的设置(程序名称：KAPA20，条件为：95℃ 3分钟、20个循环(98℃ 20秒、65℃ 30秒、72℃ 1分钟)、72℃ 2分钟，最后维持12℃)。
<DNA纯化2>
3-2-14：样品操作11(AMpure纯化2)*
*本节中的操作与方案“3-2-10：样品操作8(AMpure纯化1)”相同
<用于经一次测序解析多个样品的索引PCR的设计>
3-2-15：样品操作12(制作索引PCR所需的片)
3-2-15-1：要点
进行索引PCR，以向每个样品添加索引序列和P5/P7序列(与流通池结合的部分)。
预先确定样品和引物的排列顺序(矩阵)，使用Illumina Experiment Manager制作样品片。
索引引物使用Illumina的现有产品(Nextera XT Index Kit v2 Set A)。
<索引PCR>
3-2-16：样品操作13(索引PCR)
本方案中示出了一样品份的试剂量。
将10μL的2×KAPA HiFi Hot Start Ready Mix加入管中。
将4μL的DW(DNA用，瓶装)加入管中。
将14μL分配至PCR 8连管中。
各分配2μL N引物。
各分配2μL S引物。
向预定管中各分配2μLTag PCR纯化完成的样品。
用热循环仪选择适用的设置(程序名称：INDEX12，条件为：95℃ 3分钟、12个循环(95℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 30秒)、72℃ 5分钟，最后维持4℃)。
<电泳>
3-2-17：样品操作14(电泳和评估2)
*为TCR基因时约650bp
制备1.5％琼脂糖凝胶，用Atlas ClearSight染色。
将凝胶置于电泳槽中，将4μL的索引PCR产物与100bp的DNA梯形带和10x染料一起进行电泳(100V，30min)。使用紫外线透光仪、数码相机评估扩增结果。
*如果太弱，需要返回到方案“3-2-16：样品操作13(索引PCR)”，更改PCR条件(增加到15个循环)。
<浓度测定1>
3-3-3：样品操作1(用Qubit测定DNA浓度)
使用索引PCR产物将DW(DNA用，瓶装)稀释10倍。
将Qubit dsDNA HS检测试剂盒中所附的染料用所附的缓冲液稀释200倍。
将190μL的染料稀释液加入2根500μL的专用管(标准品用)中，加入198μL的染料稀释液用于样本。
向已加有190μL染料稀释液的500μL专用管(两管)中，分别加入10μL Qubit dsDNAHS分析试剂盒中所附的标准品#1和标准品#2。
向已加有198μL染料稀释液的500μL专用管(10管)中，加入2μL的索引PCR产物。
启动Qubit，选择测定模式“dsDNA”，然后选择“高灵敏度”。
移至测定屏幕，选择最下边的“读段标准(Read standards)”。
按顺序测定标准品#1和标准品#2。确认该值是“数十”、“数万”
将样品输入量设为2μL，进行测定。
*由于测量范围为0.1ngL～50ng/μL，所以如果超出该范围，则须在稀释后重新测定。
根据测量结果，自多个样本(通常，在MiSeq的测序中同时测定50～60个样本)以混合等量的DNA量的方式分配至另外的管中，使来，从而制成汇集样本(pool sample)。
<DNA纯化3>
3-2-18：样品操作15(AMpure纯化3)
*本节的操作与方案“3-2-10：样品操作8(AMpure纯化1)”中的操作相同，但根据汇集样本的液量进行调整。
<浓度测定2>
操作与3-3-3：样品操作1(用Qubit测定DNA浓度并稀释)相同。
由于在Miseq中用于测序的样品浓度为4nM(为650bp时为1.72ng)，所以在测定后稀释到指定浓度。
<使用Miseq的序列运行>
3-3：Miseq序列分析
3-3-4：样品操作2(phi-X和DNA文库的改性)
将5μL的0.2N-NaOH与5μL的配制成4nm的汇集样品(DNA)混合。
将5μL的0.2N-NaOH与5μL的配制成4nm的PhiX(序列稳定试剂；含有随机碱基)混合。
向各个混合物中分配Hyb-Buffer，进行混合、最终配制成最终浓度为10pM，DNA：PhiX＝4：1(PhiX为20％)。
3-3-5：样品操作3(Miseq运行)
使用Illumina公司的Miseq进行序列解析。使用MiSeq Reagent试剂盒v3(600个循环)MS-102-3003作为主要的序列试剂。操作方法为：在已解冻的试剂盒中，将经过最终调整的样本分配到指定的孔中，置于设备中。
下面记载引物序列等的信息。
[表2]
Figure BDA0002529358570000521
(从上部起依次与序列号：4、6、5、35～37、7、8、38、9、10、和39对应)
关于索引PCR引物的更多信息，参见https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentatio n/chemistry_documentation/experiment-design/illumina-adapter-sequences_1000000002694-01.pdf。
(实施例1-3)
实施例1中的[单细胞分选和RT-PCR]、[TCRA和TCRB对的RT-PCR分析]部分也可以按照以下步骤进行。本步骤是作为基因捕获Drop-SeqTM法(改进Drop-Seq法，高效地确定TCR对基因)而开发的。记载了一种TCR特异性Oligo珠的制造方法和利用基因捕获Drop-SeqTM法的单细胞TCR对基因确定法。本步骤的更详细内容记载于Yodosha,"实验医学·别册"单细胞解析方案(出版于2017年10月10日)，该文献作为参考其整体引用至本说明书。
[准备]
(设备)
□Dolomite Bio公司制单细胞RNA-Seq系统(图19A)
(三台P泵、三套流量计、细胞搅拌仪、数码显微镜、单细胞RNA-Seq芯片)
□MiSeq测序仪(Illumina公司)
□Qubit 3.0荧光计(Thermo Fisher Science公司)
单细胞分离设备(Dolomite Bio公司)包括：三台P泵、三套流量计、细胞搅拌仪、数码显微镜、单细胞RNA-Seq芯片。配备有监控器，以便可以实时确认液滴的形成，成为能够进行各种组装且扩张性高的模式。
(试剂)
1、珠Oligo的制作
□TE 10mM Tris-HCl，pH 8.0、1mM EDTA
□TE/TW 10mM Tris-HCl，pH 8.0、1mM EDTA、0.1％Tween20
□TE/SDS 10mM Tris-HCl，pH 8.0、1mM EDTA、0.5％SDS
□BST反应阻止液100mM KCl、10mM Tris-HCl(pH 8.0)、50mM EDTA，0.1％Tween20
□NaOH洗涤剂I150mM NaOH、0.5％Brij35P
□NaOH洗涤剂II 100mM NaOH、0.5％Brij35P
□中性缓冲液100mM NaCl、100mM Tris-HCl(pH 8.0)、10mM EDTA、0.1％Tween20
□Oligo固相化珠(定制合成，Chemgene公司)1(图19B)
□合成DNA
□Bst 3.0DNA聚合酶(NEB)
□核酸外切酶I(NEB)
1Oligo珠委托美国ChemGene公司合成。对于Mocosko等人的RNA-Seq用Oligo珠，在SMART序列(序列号45)之后包含12个碱基的混合和汇集碱基(细胞条形码序列，J)、8个碱基的随机序列(分子识别序列，N)和30个碱基的Poly(T)序列。在基因捕获中添加退火序列代替Poly(T)序列，TCRα链C区特异性探针和TCRβ链C区特异性探针这两个探针通过延伸反应结合到单个珠上。
探针Oligo通过延伸反应结合到珠上。通过合成具有退火序列的基因特异性探针(GSP)进行延伸反应，可以制作目标基因的Oligo珠。成对的两个基因具有相同的细胞条形码序列，可以由该序列确定成对基因。
2、细胞分离
□血清培养基RPMI1640(和光纯药)、10％FCS、青霉素/链霉素(和光纯药)、50μM2-巯基乙醇
□ACK裂解缓冲液0.15M NH4Cl、0.01M KHCO3、0.1mM Na2EDTA，pH 7.2至7.4
□70μm细胞筛(cell strainer)(Corning公司)
□MACS分离用磁性装置(Miltenyi Biotec公司)
□CD8a+T细胞生物素-抗体混合物(Miltenyi Biotec公司)
□抗生物素微珠(Miltenyi Biotec公司)
□MACS LS色谱柱(Miltenyi Biotec公司)
□MACS缓冲液PBS，2mM EDTA，0.5％BSA
3、单细胞分离
□100μm过滤器
□40μm过滤器
□细胞裂解液200mM Tris-HCl(pH 7.5)、6％ficoll PM400(GE Healthcare公司)、0.2％十二烷基肌氨酸钠(sarkosyl)(20％N-月桂酰肌氨酸钠盐，Sigma-Aldrich公司)、20mM EDTA、1.5M甜菜碱、0.2×SSC、5％DMSO
□1M DTT
□细胞用缓冲液PBS、0.01％BSA
□用于EvaGreen的液滴生成器油(Bio-Rad公司)
□全氟辛醇(PFO，Sigma-Aldrich公司)
□6×SSC
4、模板切换逆转录反应
□Superscript IV(Thermo Fisher Scientific公司)
□10mM dNTPs(Promega公司)
□RNasin(注册商标)Plus RNase抑制剂(Promega公司)
□KAPA HiFi HotStart ReadyMix(KAPA Biosystems公司)
□TSOOligo:GTCGCACGGTCCATCGCAGCAGTCACAGG(IG)、IG：LNA Oligo(序列号40)
□TSO PCR引物:GTCGCACGGTCCATCGCAGCAGTC(序列号41)
□SMART PCR引物:AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT(序列号42)
□TSO_Tag引物：GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGCGTCGCACGGTCCATGCAGTC(序列号43)
□SMART_Tag引物：TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT(序列号44)
□Nextera XT Index Kit v2 SetA(illumina公司)
□Agencourt AMPure XP(Beckman Coulter公司)
□EB缓冲液(5mM Tris-HCl,pH 8.5)
□Qubit dsDNA试验试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司)
(细胞)
T淋巴瘤细胞系(EL-4)
小鼠脾细胞(C57BL/6)
[方案]
1、Oligo珠的制作
(1)将从ChemGene公司获得的定制Oligo珠(10μmole级别)悬浮在30mL的TE/TW中，1000g离心1分钟并洗涤(重复2次)。对于珠的清洗和回收，可以通过悬浮在缓冲液中后、在1000g下离心1分钟而容易地回收。使用摆动旋转仪小心地去除缓冲液，以免吸入珠子。
(2)用血球计数仪计酸珠数(图19C)。悬浮在TE/TW溶液中使其达到500,000珠/mL，并进行冷藏保存。能在TE/TW中长时间冷藏保存。ChemGene公司制造的珠使用TOYOPEARLHW，珠直径约为30μm。
(3)将1ml珠悬浮液(500,000珠)分入Eppendorf管，以1000g离心1分钟。
(4)悬浮在500μL的1×等温缓冲液(NEB公司)中，1000g离心1min(为了用下述延伸反应用缓冲液进行预洗)。
(5)准备下述的Oligo延伸反应液，加入到(4)的珠中。
[表3]
Oligo延伸反应液(μl)
Figure BDA0002529358570000561
(6)85℃保温2分钟后，在60℃保温20分钟。
(7)加入2μL Bst 3.0聚合酶(800U/μL)，并在60℃下用热旋转器反应1小时30分钟。由于在酶反应过程中会有珠沉淀，所以为了保持反应的均匀性，优选使用热旋转器。
(8)加入1mL的Bet反应停止液，孵育30min，并1000g离心1min(重复2次)。
(9)为了进行核酸外切酶I处理，加入1mL的1×核酸外切酶缓冲液进行预洗，以1000g离心1min(降解单链DNA从而去除未反应的珠结合Oligo)。
(10)制备下述核酸外切酶I反应液，使珠悬浮其中。
[表4]
Figure BDA0002529358570000571
(11)加入2.5U/μL核酸外切酶I(20U/μL)使最终浓度为1U/μL，并在37℃下在热旋转器中使其反应45分钟。
(12)悬浮在1mL TE/SDS中，1000g离心1min(重复两次)。
(13)悬浮在1mL的NaOH洗涤剂中，1000g离心1分钟(通过碱洗法，改性与珠结合的双链DNA，制备单链DNA探针)。
(14)悬浮在1mL的NaOH洗涤剂II中，1000g离心1min(重复两次)。
(15)悬浮在1mL的TE/TW中，1000g离心1min(重复两次)。最后，悬浮在TE/TW中使其达到5×105珠/mL，并冷藏保存直至使用。
2、细胞的制备
<小鼠T细胞系>
(1)将培养在血清培养基中的小鼠T淋巴瘤细胞系800g离心5min，回收细胞。
(2)用10mL血清培养基进行洗涤。
(3)悬浮于10mL血清培养基中，用75μm细胞筛进行过滤。用血细胞计数仪计数细胞数。
<小鼠脾细胞>
(1)解剖小鼠(C57BL/6，6周龄)，取出脾脏。尽可能在分离单个细胞之前制备细胞，以减少细胞损伤。
(2)在包含10mL血清培养基的培养皿中，使用载玻片的磨砂部轻轻研磨碎脾脏。
(3)将血清培养基移到15mL离心管中，等待碎屑沉淀。
(4)将上清液移至另一离心管中，以800g离心5分钟。
(5)去除上清液后，加入2mL ACK裂解缓冲液，进行悬浮，在室温下放置2分钟，破坏红细胞。
(6)加入10mL血清培养基以停止溶血，以800g离心5min。
(7)悬浮于10mL血清培养基中，使其通过75μm细胞筛进行过滤。用血细胞计数仪计数细胞数。
<小鼠脾CD8阳性细胞>
(1)分取1×108细胞溶液，以800g离心5min。
(2)悬浮于10mL的冰冷MACS缓冲液中，以800g离心5min。
(3)加入400μL的CD8α+T细胞生物素-抗体混合物，冰上静置5min。
(4)加入300μL的MACS缓冲液，然后加入200μL的抗生物素微球，在冰上静置10分钟。
(5)在此期间，将LS色谱柱安装至磁分离器中，加入3mL的MACS缓冲液，再生色谱柱。
(6)将1mL细胞悬浮液装入LS色谱柱，收集所通过的级分(flow-through)。
(7)进一步加入3mL MACS缓冲液，回收所有的通过级分。
(8)加入6mL血清培养基，以800g离心5min。
(9)加入10mL血清培养基，以800g离心5min。
(10)加入4mL血清培养基，并计数细胞。
3、单细胞的分离
3-1、安装Dolomite Bio公司的单细胞分离器(由于微细纤维混入会导致线路堵塞，所以优选清洁实验台、使用无尘室用无尘擦拭物品等，以使得灰尘等不会掉落)。
(1)启动压缩机，启动PC和控制用专用软件(Mitos Flow Control Center)。
(2)确认每条线路的连接情况，并安装微芯片，使得在显微镜下通过监视器可以确认流路。
(3)将过滤无菌水和控制油放入P泵的瓶子中。预先过滤所有放置在线路中的试剂。因为包括表面活性剂的EvaGreen液滴油价格昂贵，所以运行时可以使用Novec 7700或FC40(3M公司)。
(4)将细胞线和珠线的流速设置为40μL/min、将油线设置为200μL/min，进行测试流程。液滴大小可以通过改变流速来调整。在此条件下，约为85μm，但在30μL/min(细胞)、30μL/min(珠)和166μL/min(油)条件下，可调节到约100μm。
(5)用显微镜确认无问题地形成液滴。
3-2、珠的准备
(6)分取1.5×105珠，1000g离心1min，将珠沉淀。
(7)加入500μL溶解缓冲液，预洗珠子，1000g离心1min。
(8)加入500μL溶解缓冲液，调至3×105珠/mL。
(9)用70um过滤器过滤，然后用1mL注射器吸入。
(10)为了在500μL样品回路中注射珠，切换阀门，在颠倒注射器的同时缓慢注射珠。在颠倒注射器时进行该过程，从而避免珠沉淀。
(11)设置珠子的流速为40μL/min，通过阀门关闭来维持。
3-3、细胞的准备
(12)分取悬浮在血清培养基中的1×106细胞溶液，800g离心5min。
(13)悬浮于10mL PBS/BSA中，800g离心5min。
(14)悬浮于PBS/BSA中使浓度为3×105细胞/mL，用70μm过滤器过滤，然后将瓶子放入P泵中。用冰冷却以防止细胞劣化。
(15)一边用搅拌棒搅拌，一边以40μL/min的流速运行。
3-4、油的准备
(16)取出装有控制油的瓶子，在P泵中放置液滴用EvaGreen液滴生成油。
(17)将流速设置为200μL/min，确认油在流动以及有液滴形成。
3-5、输出线的准备
(18)在管上设置输出线，以回收从微芯片出来的液滴。
(19)打开珠线，珠能够在微芯片内流动。查看监视器屏幕时，确认到珠流动并形成液滴(图19D)。在此条件下，以4000/秒形成液滴。在20个液滴中珠被封装入其中一个。
(20)回收液滴15至20分钟。在监视器屏幕上确认没有珠。可以确认所回收的液滴溶液上层液滴、下层油的2层。
4、液滴的破坏
(1)将液滴回收至管中，去除下层的油。用芯片的尖端吸取以去除油。尽快进行以下步骤。
(2)将上层(白色)的液滴全部分配到8连微管中。
(3)针对液滴进行退火，即75℃下2分钟，从65℃以每30秒降低1℃降至50℃。完成后，在冰上保存。
(4)将所有液滴移到50mL锥形管中，加入冷却的10mL的6×SSC溶液。
(5)加入500μL的全氟辛醇(PFO)，剧烈旋流。
(6)以1000g离心1分钟，小心地去除上清液。珠形成白色层。请注意，在6×SSC中珠可能会浮起。如果珠没有沉淀，则可以再次离心、或者用25μm过滤器回收。同时，也去除积聚在底部的油层(透明)。
(7)加入10mL的6×SSC，剧烈涡流后，再以1000g离心1min。小心地去除上清液，清洗珠(重复两次)。
(8)将白色珠移到Eppendorf管中，以1000g离心1分钟，去除上清液。
5、模板切换逆转录反应
(1)将100μL的5×RT缓冲液加入珠球中，1000g离心1min进行预洗。
(2)制备下述逆转录反应液，添加至珠中。
[表5]
逆转录反应液
Figure BDA0002529358570000611
1为了制作直接性文库，使用不同于珠序列的模板转换Oligo(TSO)。也可以使用珠所附带的SMART Oligo。
(3)加入2μL的SuperScript IV(200U/μL)，在热旋转器中在50℃下保温1小时30分钟。
(4)加入100μL的TE/SDS溶液，1000g离心1min，去除上清液。
(5)加入100μL的TE/TW溶液，1000g离心1min，去除上清液(重复两次)。
(6)加入100μL的1×核酸外切酶缓冲液，1000g离心1min进行预洗。
(7)将下述核酸外切酶反应液加入珠中。
[表6]
核酸外切酶反应液
Figure BDA0002529358570000612
(8)加入1μL核酸外切酶(20U/μL)，在37℃下在热旋转器中保温30分钟。
(9)加入100μL的TE/SDS溶液，1000g离心1min，去除上清液(重复两次)。
(10)加入100μL的TE/TW溶液，1000g离心1min，去除上清液(重复两次)。
6、PCR反应
(1)加入100μL的DW，1000g离心1min，去除上清液。
(2)制备下述预PCR反应液，添加至珠中。
[表7]
预PCR反应液
Figure BDA0002529358570000621
预PCR循环
98℃3分钟(98℃20秒，65℃20秒，72℃3分钟)18个循环，72℃5分钟
1当使用SMART序列作为TSO时，可以仅使用SMART PCR引物进行PCR。
(3)在15μL PCR产物中加入12μL的Ampure珠，室温静置5分钟。
(4)在磁板上室温静置2分钟，去除上清液。
(5)用200μL的70％乙醇洗涤(重复2次)。
(6)完全去除70％乙醇，然后晾干1分钟。
(7)加入15μL的EB缓冲液(5mM Tris-HCl，pH 8.5)进行涡旋，静置1分钟。
(8)在磁板上室温静置2分钟，将上清液回收至新管中。
(9)制备以下PCR溶液，加入2μL的经纯化的预PCR反应液，在下一循环进行PCR。
[表8]
PCR反应液
Figure BDA0002529358570000631
PCR循环
98℃3分钟(98℃20秒，65℃20秒，72℃3分钟)30个循环，72℃5分钟
(10)用2％琼脂糖凝胶电泳，确认PCR产物。
(11)通过与(3)～(8)相同的利用Ampure珠的纯化，回收PCR产物。
(12)制备INDEX Tag添加用PCR反应液，加入2μL的经纯化的PCR反应液，在下一循环进行PCR。
[表9]
Tag PCT反应液
Figure BDA0002529358570000632
Tag PCR循环
98℃3分钟(98℃20秒，65℃20秒，72℃3分钟)18个循环，72℃5分钟
(13)通过与(3)～(8)相同的利用Ampure珠的纯化，回收PCR产物。
(14)制备INDEX PCR用PCR反应液。加入2μL的经纯化的Tag PCR反应液，在下一循环进行PCR。
[表10]
INDEX PCR反应液
Figure BDA0002529358570000641
Tag PCR循环
95℃3分钟(95℃30秒，55℃20秒，72℃2分钟)14个循环，72℃5分钟
(15)用与(3)～(8)相同的利用Ampure珠的纯化，回收PCR产物。
(16)针对经纯化INDEX PCR产物，使用Qubit dsDNA检测试剂盒，用Qubit 3.0荧光光度计测定DNA含量。
(17)将PCR产物稀释以达到4pM，用MiSeq进行测序，目标是30万到100万个读数。
7、TCR库
对于基于序列数据的小鼠TCR参考序列对V、D、J区序列的分配和读段总计等的解析，可以通过由Repertoire Genesis公司开发的库解析用专用软件进行解析。作为可获得的TCR解析软件，已知MiXCR、IMGT提供的HighVQuest等，也能使用它们的软件。读段序列之间的条形码匹配能使用R的Biostrings或类似的包装(package)来执行。
[讨论]
对于利用实施例1-1中使用的流式细胞仪进行分选后的解析和实施例1-3中记载的基于液滴的方法，可以根据目的区别使用。认为如果目的是找到高功能性TCR，则最高数百个以内的单细胞解析在费用效果方面是非常优异的，如果目的是综合解析低频存在的TCR(Naive级分的TCR、共享的TCR等)，则使用液滴进行解析虽然成本高但有利。
(实施例2：内源性TCR基因的去除)
(概述)
本实施例证实了通过靶向TCR基因的基因组编辑能完全去除内源性TCR基因。
(材料和方法)
[由铂TALEN合成mRNA]
(1)针对TRA或TRB基因切断用的左(L)-TALEN和右(R)-TALEN的质粒，用SmaI在30℃下处理2小时。
(2)用蛋白酶K在50℃处理20min后，用QIAGEN PCR纯化试剂盒纯化。
(3)用mMESSAGE MACHINE T7 Kit(Life Technologies)、进而用Poly(A)TailingKit(Life Technologies)合成mRNA，通过LiCl沉淀法纯化(根据制造商的说明书)。
在该实施例中，使用一对TALEN-TCR-α2_L19和TALEN-TCR-α2_R19用于靶向TCRα基因。这些质粒的全长序列由序列号46和序列号47表示。另外，TALEN-TCR-α2_L19的TALEN编码序列用序列号52表示，该TALEN的氨基酸序列用序列号53表示。TALEN-TCR-α2_R19的TALEN编码序列用序列号54表示，该TALEN的氨基酸序列用序列号55表示。
在该实施例中，使用一对TALEN-TCR-β1_L19和TALEN-TCR-β1_R19、或者一对TALEN-TCR-β3_L19和TALEN-TCR-β3_R19，用于靶向TCRβ基因。这些质粒的全长序列按照记载顺序由序列号48、序列号49、序列号50和序列号51表示。另外，TALEN-TCR-β1_L19的TALEN编码序列用序列号56表示，该TALEN的氨基酸序列用序列号57表示。TALEN-TCR-β1_R19的TALEN编码序列用序列号58表示，该TALEN的氨基酸序列用序列号59表示。TALEN-TCR-β3_L19的TALEN编码序列用序列号60表示，该TALEN的氨基酸序列用序列号61表示。TALEN-TCR-β3_R19的TALEN编码序列用序列号62表示，该TALEN的氨基酸序列用序列号63表示。
[使用铂TALEN mRNA制备TCR缺陷型T细胞]
(1)在RPMI1640+10％FBS+2mmol/l L-谷氨酰胺+1％青霉素/链霉素中，将Jurkat细胞培养3天。
(2)按照下述步骤，当靶向TCRα基因时，将TALEN-TCRα2_L19(TCRα-L-TALEN)mRNA和TALEN-TCR-α2_R19(TCRα-R-TALEN)mRNA各10μg分别引入培养Jurkat细胞，当靶向TCRβ基因时，将一对TALEN-TCR-β1_L19(TCRβ1-L-TALEN)mRNA和TALEN-TCR-β1_R19(TCRβ1-R-TALEN)mRNA、或者一对TALEN-TCR-β-β3_L19(TCRβ3-L-TALEN)mRNA和TALEN-TCR-β3_R19(TCRβ3–R-TALEN)mRNA引入培养Jurkat细胞(SE Cell Line 4D-NucleofectorTM X Kit S)。
(2-1)将5×105至1×106Jurkat细胞通过离心(400G，10min，室温)制成细胞小球。
(2-2)将细胞小球悬浮在总共20μl的核转染溶液中，该核转染溶液是在每次反应中向16.4μl的核转染SE溶液中加入3.6μl的补充剂而制备的。
(2-3)将TCRα基因靶向用或TCRβ基因靶向用TALEN mRNA对，分别各添加10μg。
(2-4)用Amaxa 4D-Nucleofector(程序：CL-120)进行核转染。
(内源性TCR基因去除的确认)
确认了将TALEN mRNA引入Jurkat细胞后、出现了用FACS确认到的CD3阴性级分。对于分选CD3阴性级分而得的细胞，经FACS确认为TCR(内源性)也为阴性。用FACS解析软件(Flow Jo)对通过FACS获得的CD3表达强度进行解析。
至于出现的CD3/TCR阴性级分是否是通过引入TALEN获得的，通过T7核酸内切酶I(T7E1)试验确认了切断断片的存在。
[T7核酸内切酶I试验]
(1)使用提取的基因组DNA进行了PCR。在最终浓度为1x缓冲液、200μM dNTP、0.4μM引物、2.5～5ng DNA、Excellent Taq HS(APRO Science)的反应混合物中，PCR在94℃下进行10分钟后，在94℃下30秒、在55℃下30秒、在72℃下1分钟进行30循环，进而在72℃下反应5分钟。
(2)引物序列如下。
[化学式1]
Figure BDA0002529358570000671
(从上开始依次与序列号64～69对应)
(3)用凝胶提取试剂盒(QIAGEN)进行1％琼脂糖凝胶电泳提取DNA。
(4)将200～250ng所提取的DNA在95℃加热5min，然后恢复至室温，进行再退火。
(5)加入T7核酸内切酶I，在37℃处理30min。然后，用2％凝胶进行电泳从而进行确认。
(结果)
图3示出了结果。可以理解，各内源性TCR基因都通过靶向各个TCR基因的基因组编辑而被敲除。另外，图4显示了T7E1试验的结果。从图4可以了解到，TCR基因的敲除是通过基因组编辑进行的。
(实施例3：TCR的引入)
(概述)
该实施例证明了：通过使用半胱氨酸变异TCR引入载体，TCR基因可以在T细胞中表达，且不会发生错配。另外，证明了：与实施例2所证实的与内源性TCR基因的去除一起进行TCR基因的引入，可以制作出仅表达引入TCR的T细胞。
(材料和方法)
(1)用CD3/28珠刺激T细胞，用X-VIVO20+10％AB血清+2mmol/l L-谷氨酰胺+1％青霉素/链霉素培养3天。
(2)使用Amaxa 4D-Nucleofector，按照以下步骤将TCRα-L-TALEN mRNA和TCRα-R-TALEN mRNA引入培养T细胞(P3原代细胞4D-NucleofectorTM X Kit S)。
(2-1)5×105～1×106T细胞进行离心(400G，10min，室温)，由此制备细胞小球。
(2-2)将细胞小球悬浮在总共20μl的核转染溶液中，该核转染溶液是在每次反应中向16.4μl的核转染P3溶液中加入3.6μl的补充剂而制备的。
(2-3)分别添加TCRα-L-TALEN mRNA、TCRα-R-TALEN mRNA各10μg。
(2-4)进行核转染(程序：EO-115)。
(2-5)持续再培养。
(2-6)核转染3天后，基于通过流式细胞仪获得的CD3及TCRα或β的表达丧失，确认TCR基因切断效率。
(3)通过磁分选法或FACS(AriaII)回收CD3阴性级分。
(4)根据下面详述的步骤，用逆转录病毒载体将目标TCR基因引入由(3)获得的CD3阴性T细胞。
(5)次日经FACS确认到出现TCR阳性CD3阳性级分。
(6)通过磁分选法或FACS(AriaII)回收CD3阳性级分。
(7)采用与(2)相同的方法，将TCRβ3-L-TALEN mRNA和TCRβ3-R-TALEN mRNA引入(6)中获得的CD3阳性T细胞。
(8)通过磁分选法或FACS(AriaII)回收CD3阴性级分。
(9)再次按照相同的步骤，用逆转录病毒载体将目标TCR基因引入(8)中获得的CD3阴性T细胞。
(10)确认出现CD3阳性级分，通过磁分选法或FACS(AriaII)回收。
[将所期望的TCR引入TCR缺陷T细胞]
上述步骤中的TCR基因的引入按照以下步骤进行。
第1天：
(1)将Plat-GP接种于10cm培养皿中，至70％汇合。
(2)将10μg的载体和5μg的VSV-G加入1.4ml的OPTI-MEM I中，室温静置5min。
(3)将50μl的Lipofectamine 2000加入1.4ml的OPTI-MEM I中，室温静置5min。
(4)将上述(2)和(3)混合，室温静置20min。
(5)将(4)的混合物加入Plat-GP培养液中培养48小时。
第4天-1：
(1)从Plat-GP回收上清液，并离心(1500rpm×5min，4℃)。
(2)使上清液通过0.45μM过滤器，进一步进行离心(6000G×16小时，4℃)。
第4天-2：
将培养中的TCR缺陷T细胞以5×105/孔分配至24孔板中。
第5天：
(1)去除第4天-1(2)的离心管上清液，将小球悬浮于500μl的X-VIVO20中，制成病毒液。
(2)将病毒液加入前一天分配的TCR缺陷细胞的培养基中，进行离心(2000rpm×30min，32℃)，然后，继续培养24小时。次日，基于活细胞中的GFP阳性细胞(流式细胞术)的比例确认感染率。
[TCR基因克隆至pMXs-IRES-GFP载体]
(1)用BamHI和NotI切断pMXs-IRES-GFP载体。
(2)设计引物，使得在各结合部形成重叠序列，具体如下：
[化学式2]
Figure BDA0002529358570000691
(从上开始依次与序列号70～77对应)
(3)用(2)中的引物对各片段进行PCR扩增。
(4)将(1)和(3)中获得的片段进行纯化。
将(1)的片段(载体)纯化至25ng/μl。
将(2)的片段(Vα、Cα、Vβ、Cβ)分别纯化至10ng/μl。
(5)进行Gibson组装反应(NEB，Gibson Assembly Master Mix，根据制造商的说明书进行)。在5μl的Gibson Assembly Master Mix中，加入1μl的载体、0.75μl的Vα、0.75μl的Vβ、0.75μl的Cα和0.75μl的Cβ，在50℃下1小时。
(6)将(5)中的反应液稀释4倍，转化到感受态细胞(JM109)。
(7)用Miniprep纯化DNA，通过测序进行确认。
[引入载体]
对于引入载体，将pMXs-IRES-GFP逆转录病毒载体(Cell Biolabs，Inc.)用作骨架。图5示出了载体的示意图。将待引入的TCRβ链的V区、TCRβ链的恒定区(Cβ)、P2A序列、待引入的TCRα链的V区和TCRα链的恒定区(Cα)以此顺序组入pMXs-IRES-GFP逆转录病毒载体的引入序列部分进行使用。对于这类载体的制备，记载在Incorporation ofTransmembrane Hydrophobic Mutations in the TCR Enhance Its Surface Expressionand T Cell Functional Avidity Astar Haga-Friedman,Miryam Horovitz-Fried andCyrille J.Cohen J Immunol 2012；188:5538-5546；Prepublished online 27April 2012中。
参考Enhanced antitumor activity of T cells engineered to express T-cell receptors with a second disulfide bond.Cohen CJ,Li YF,El-Gamil M,RobbinsPF,Rosenberg SA,Morgan RA.Cancer Res.2007Apr 15；67(8):3898-903，将追加的Cys引入C区，以追加一个S-S键。进而，参考Incorporation of Transmembrane HydrophobicMutations in the TCR Enhance Its Surface Expression and T Cell FunctionalAvidity Astar Haga-Friedman,Miryam Horovitz-Fried and Cyrille J.Cohen JImmunol 2012；188:5538-5546；Prepublished online 27April2012，将疏水性氨基酸变异引入跨膜区域。
作为自切断性的链接，使用P2A序列(J.H.Kim,S.R.Lee,L.H.Li,H.J.Park,J.H.Park,K.Y.Lee,et al.,High cleavage efficiency of a 2A peptide derived fromporcine teschovirus-1in human cell lines,zebrafish and mice,PLoS One.6(2011)1-8.doi:10.1371/journal.pone.0018556)。
此外，所使用的TCRα链和TCRβ链的恒定区的氨基酸序列如下所示。
[化学式3]
Figure BDA0002529358570000711
[引入TCR基因]
使用hTEC10从健康个体外周血中存在的CMV pp65 QYD抗原特异性CD8+T细胞中获得QYD特异性TCRαβ基因，将其用作引入基因。
[Treg的抗原特异性]
针对已进行了引入的T细胞对QYD抗原的结合亲和性，进行测定，确认了TCR的引入。通过QYD四聚体染色确认了是否具有Treg(QYD-Treg)的抗原特异性。
(结果)
图5和图6示出了针对调节性T细胞进行了引入的结果。流式细胞术检测结果表明，只有被引入的TCR在修饰后的T细胞中表达。
与QYD的结合亲和性性的测定结果如图8所示。与多克隆Treg相比，引入了QYD特异性TCR的Treg对QYD的结合亲和性提高。
另外，图9示出了针对细胞毒性T细胞同样地进行TCR引入所得的结果。可以理解，能够不受内源性TCR的干扰替换TCR。
通过用TCR特异性TALEN敲低内源性TCR、以及用Cys-TCR进行基因引入，可建立高亲和性的CMV pp65 NLV特异性TCR表达T细胞。
(实施例4：所制作的抗原特异性调节性T细胞的特性)
(概述)
针对根据实施例3的方法制作的抗原特异性调节性T细胞的特性，如下进行评价。
[Treg固有性状的保留的确认]
将根据实施例3的方法制作的抗原特异性调节性T细胞、多克隆调节性T细胞、TCR敲除调节性T细胞和对照(CD25为阴性的CD4阳性T细胞级分)用以下抗体进行染色，采用FACS进行测定，并用FACS分析软件(Flow Jo)分析荧光强度，以调查替代了TCR的Treg与多克隆Treg(在TCR替代之前)的性质是否存在差异。
抗体：抗人CD25抗体、抗人CD127抗体、抗人FoxP3抗体、抗人CTLA-4抗体、抗人HELIOS抗体。
图10和图11示出了结果。由此可知，这些细胞的表面标志物表达没有显著差异，在本发明的TCR去除和TCR引入中调节性T细胞固有的特性得以保留。
[对抗原刺激的增殖]
针对实施例3中通过TCR替换获得的Tregs(QYD-Treg)是否识别QYD肽抗原并增殖，进行了确认。更具体地如下所述。
(1)通过离心，使QYD-Treg颗粒悬浮于1ml PBS。
(2)加入1μL的CellTrace Violet(Invitrogen,CellTrace Violet CellProliferation Kit,cat#C34557)，在37℃在暗处静置20min。
(3)用PBS清洗2次(300G，10min，室温)。
(4)以使经肽脉冲的抗原提呈细胞与用CellTrace Violet标记的QYD-Treg的细胞数为1：1的方式，混合在T细胞培养基(X-VIVO20+10％AB血清+2mmol/l L-谷氨酰胺+1％青霉素/链霉素)中，并在96孔板中培养5天。
(5)通过FACS确认了CellTrace Violet的荧光强度减弱、QYD-Treg分裂。
图12和图13示出了结果。可以理解，培养5天后，CellTrace Violet的荧光强度减弱，QYD-Treg应答由抗原提呈细胞产生的抗原刺激并进行了增殖。无QYD刺激组和多克隆调节性T细胞组中均未观察到增殖，通过本发明的方法，证实了所制备的调节性T细胞对抗原的特异性的高度。
[由抗原特异性调节性T细胞导致的抗原特异性效应T细胞抑制]
针对通过TCR替代获得的Treg(QYD-Treg)是否抑制QYD-Teff的抗原特异性增殖，进行了确认。更具体而言，如下所示。
A.抗原提呈细胞的分离(CD4阴性CD8阴性细胞的分离)
使用Miltenyi CD8微珠，人(130-045-201)，并使用Miltenyi CD4+T细胞分离试剂盒，人(130-096533)：
(1)用Ficoll-Paque Premium从50mL外周血中分离PBMCs，通过离心(400G，10min，室温)制作细胞小球。
(2)将小球悬浮在80μL的MACS缓冲液中，加入20μL的CD8微珠。
(3)在4℃下静置15min。
(4)用MACS缓冲液洗涤(300G，10min，室温)。
(5)加入MACS缓冲液至总共500μL，通过磁分离回收CD8-级分，通过离心(400G，10min，室温)制作细胞小球。
(6)将小球悬浮在40μL的MACS缓冲液中，加入10μL的T细胞生物素-抗体混合物。
(7)在4℃下静置5min。
(8)加入30μL的MACS缓冲液和20μL的CD4+T细胞微珠混合物。
(9)在4℃下静置10分钟。
(10)加入MACS缓冲液使总计为500μL，通过磁分离回收CD4-级分(形成CD4-8-T细胞)。
B.抗原提呈细胞的肽脉冲
(1)将A中回收的CD4-8-细胞悬浮在1ml X-XIVO 20中
(2)加入肽(此处QYDPVAALF：QYD(序列号80内源性))使其达到1μM。
(3)在室温下静置2个小时。
(4)进行35Gy的γ射线照射。
C.Treg抑制试验
(1)将基因引入了QYD-TCR的CD8+T细胞(QYD-Teff)通过离心沉淀，悬浮在1ml PBS中。
(2)加入1μL的CellTrace Violet(Invitrogen,CellTrace Violet CellProliferation Kit,cat#C34557)，在37℃在暗处静置20min。
(3)用PBS清洗2次(300G，10min，室温)。
(4)以使B的步骤中经肽脉冲的抗原提呈细胞与用CellTrace Violet标记的QYD-Teff的细胞数为2：1的方式，混合在T细胞培养基(X-VIVO 20+10％AB血清+2mmol/l L-谷氨酰胺+1％青霉素/链霉素)中，接种于96孔板中。
(5)在C.(4)的各孔中调整Treg(引入了所期望的TCR的Treg)的细胞数，以使得与CD8+T细胞的细胞数比为16：1、8：1、4：1、2：1，或1：1的方式进行添加。
(6)在第5天、第7天用FACS测定在各细胞比例的条件下的CellTrace Violet的荧光强度，确认到QYD-Teff的增殖抑制。
图14和图15示出了结果。与多克隆的调节性T细胞相比，抗原特异性调节性T细胞对效应T细胞生长的抑制作用明显更高。
(实施例5：抗原特异性调节性T细胞的体外免疫抑制)
(概述)
本实施例的目的是证明在体外根据本发明的方法制造的抗原特异性调节性T细胞可以用于自身免疫性疾病。
MART-1抗原(皮肤色素细胞的自身抗原)是成为寻常型白癜风(是皮肤科领域的难治性自身免疫性疾病)病因的靶抗原。另外，识别这种抗原的T细胞也存在于健康人的外周血液中。
(材料和方法)
(1)用hTEC10从健康个体样品中克隆MART-1特异性TCRαβ对基因。
(2)用铂TALEN编辑调节性T细胞的TCR基因组，消除内源性TCR的表达。
(3)使基因组编辑后的调节性T细胞增殖。
(4)将经克隆的TCRαβ对基因引入已增殖的调节性T细胞。
(5)通过与引入了TCR基因的调节性T细胞共培养，MART-1抗原特异性效应T细胞等对MART-1抗原的响应性变化，针对此进行评价。
(结果)
用hTEC10可从两名健康个体的样品中克隆出18种以上的MART-1特异性TCRαβ对基因。可以对这些MART-1特异性TCR与MART-1的结合性进行评估，在选择最高功能性的TCR的同时，制作引入了该TCR基因的MART-1抗原特异性Treg。对MART-1抗原(为自身免疫性疾病的模式抗原)的免疫应答被上述TCR替代Treg所抑制。
(实施例6：Teff→Treg对自身免疫性疾病小鼠模型的有效性分析)
(概述)
该实施例的目的在于证明在体内抗原特异性调节性T细胞对自身免疫性疾病的应用可能性，在动物模型中显示出由所制作的抗原特异性调节性T细胞所产生的免疫抑制。本实施例的概述如图16所示。
(材料和方法)
使用以下的小鼠和自身抗原，验证对下列疾病模型的应用可能性。
小鼠模型：NOD(非肥胖糖尿病)小鼠
自身抗原模型：GAD65
疾病模型：I型糖尿病
动物实验按如下方式进行。
(1)向7日龄NOD小鼠在出生后第7、9、11天经鼻给与源自GAD65的肽抗原p546(30μg)。
(2)用H-2Kd/p546四聚体通过流式细胞术从采用(1)的方法免疫的4周龄雌性小鼠中分离p546反应性效应CD8+T细胞(p546-Teff)。
(3)用下一代测序仪对p546-Teff的TRAV和TRBV进行综合鉴定，确认存在高频克隆型，然后通过单细胞克隆进行成对鉴定。
(4)利用逆转录病毒载体将通过上述(1)至(3)过程鉴定的p546抗原反应性TCR(p546-TCReff)引入缺乏内源性TCR表达的小鼠T细胞株，确定其功能层次。
(5)用珠柱法从4周龄的雄性NOD小鼠的脾脏/淋巴结/外周血中分离CD4+CD25+调节性T细胞，用铂TALEN敲除TCR。
(6)将(4)过程中获得的高功能p546-Teff-TCR候选基因引入已敲除了TCR的CD4+CD25+调节性T细胞(p546-Teff-TCR表达Treg)。
(7)在抗CD3/CD28抗体和IL-2存在下，将引入了Mock载体的Treg和引入了p546-TCReff的Treg进行扩增，输入I型糖尿病已发病的NOD小鼠，比较其能够获得胰腺β细胞损伤和糖耐量受损的改善。
(结果)
输入了已引入Mock载体的Treg的NOD小鼠中，胰腺β细胞损伤和糖耐量受损未见改善，而输入了引入有p546-TCReff的Treg的NOD小鼠中胰腺β细胞损伤和糖耐量受损明显改善。
(实施例6-2：小鼠TCR的切断)
(概述)
制作用于切断小鼠TCR的铂TALEN，通过使用报告质粒的试验法(SSA试验)来评价切断活性。
(材料和方法)
制作了三种类型的铂TALEN(TRA2-TALEN、TRB1-TALEN和TRB2-TALEN)，用于切断小鼠的TCR。
小鼠TRA2-TALEN、小鼠TRB1-TALEN和小鼠TRB2TALEN被设计为分别在小鼠的TRA基因Cα2区、TRB基因Cβ1区和TRB基因Cβ2区内包括一个切断位点。各自的靶序列是：
小鼠TRA2-TALEN：左侧TCTGCCTGTTCACCGACT(序列号113)和右侧AATGTGCCGAAAACCATGGA(序列号114)，
小鼠TRB1-TALEN：左侧TGACTCCACCCAAGGTCTCC(序列号115)和右侧AAAAGCAGAGATTGCAAACA(序列号116)，
小鼠TRB2-TALEN：左侧TGTGCTTGGCCAGGGGCTTC(序列号117)和右侧GGAGCTGAGCTGGTGGGTGA(序列号118)。
铂TALEN的制备过程基于(实施例2：内源性TCR的去除)中的[铂TALEN的制作]进行。
通过以下URL中描述的方法，使用人胚肾衍生细胞株HEK293T进行SSA试验(SakumaT，et al.Genes to Cells 2013)。http://www.mls.sci.hiroshima-u.ac.jp/smg/genome_editing/documents/6-module.pdf
(结果)
图23中示出了结果。由此可知，如果锌指核酸酶对照(pSTL-ZFA36/ZFA36)的切断活性为1，则小鼠TRA2-TALEN、小鼠TRB1-TALEN和小鼠TRB2-TALEN的靶切断位点上的活性分别是3.09倍、3.79倍和3.41倍。pSTL是ZFA36的阴性对照，TRA2，TRB1和TRB2分别是在TALEN不存在下的仅报告基因的阴性对照，TRA2-TALEN/ZFA36、TRB1TALEN/ZFA36和TRB2-TALEN/ZFA36分别是报道基因为ZFA36时的阴性对照。
(实施例7：产品化例)
提供含一种或多种以下组分的产品以用于本发明的方法。
用于编辑TCR基因的手段：以用于编辑TCR基因的组合物等的形式提供。使用靶向TCR基因的基因组编辑酶(TALEN，CRISPR/Cas9，ZFN)等。靶位点和功能结构域可以一起提供。或者也可以分别提供靶位点和功能结构域。以核酸的形式提供基因组编辑酶。或者以多肽形式提供基因组编辑酶。以mRNA形式提供基因组编辑酶。基因组编辑酶与引入用载体一起提供。
确认内源性TCR基因变异的手段：提供对内源性TCR基因特异的PCR用引物。可确认在基因组编辑之前可以进行特定的编辑，且靶部位不存在变异。
确认内源性TCR基因去除的手段：提供一种抗体，用于测定去除内源性TCR时的变化；并提供抗CD3抗体或抗TCR抗体；并提供经标记的抗体。
引入外源性TCR的手段：提供用于引入TCR的载体等。使用掺入了细胞毒性小的荧光色素的慢病毒类载体(诸如Venus)、或利用了转座子的Sleeping Beauty等非病毒类载体。
检测引入了基因的细胞的手段：提供一种抗体，用于在引入了内源性TCR时的变化测定；提供抗CD3抗体或抗TCR抗体；提供经标记的抗体。
(实施例8：通过TAL-PITCh方法进行的TCR替换)
(概述)
能通过TAL-PITCh方法制作本发明的修饰T细胞，不需使用病毒载体。
(材料和方法)
使用TAL-PITCh方法的内源性TCR缺陷NY-ESO-1特异性T细胞的制作内源性TCR缺陷型NY-ESO-1特异性T细胞是按照以下步骤制备的。
1、由铂TALEN合成mRNA：
(1)将TRA或TRB基因切断用的左(L)-TALEN和右(R)-TALEN的质粒，用SmaI在30℃下处理2小时。
(2)用蛋白酶K在50℃处理20min后，用QIAGEN PCR纯化试剂盒纯化。
(3)用mMESSAGE MACHINE T7 Kit(Life Technologies)、进而用Poly(A)TailingKit(Life Technologies)合成mRNA，通过LiCl沉淀法纯化(根据制造商的说明书)。
2、TAL-PITCh载体的设计
TAL-PITCh载体被设计成：用TRA基因切断用的左(L)-TALEN和右(R)-TALEN将引入基因的两端切断，通过微同源介导的末端结合(MMEJ)修复，将目标基因掺入TRA基因切断位点(图20，方块包围的部分表示微同源序列)。当目标基因被掺入TRA基因切断位点后，在两端都存在TALEN结合位点，且没有足够的空间给切断位点，因此不会发生DNA双链断裂(DSB)(图21)。对于TAL-PITCh载体，准备掺入EGFP的载体和掺入mKate2的载体，以通过流式细胞术确认TRA基因的两个等位基因都被切断(图20和21示出了掺入EGFP的载体)。临床应用时，构建了分别以CD20和CD34替代EGFP和mKate2作为选择标志物的载体。
3、用铂TALEN mRNA制备TRB基因切断T细胞
(1)用CD3/28珠刺激外周血T细胞，用X-VIVO20+10％AB血清+2mmol/l L-谷氨酰胺+1％青霉素/链霉素培养3天。
(2)用Amaxa 4D-Nucleofector将TCRβ-L-TALEN mRNA和TCRβ-R-TALEN mRNA引入培养T细胞(P3原代细胞4D-NucleofectorTM X Kit S)。
1)5×105至1×106T细胞通过离心(400G，10min，室温)制成细胞小球。
2)将细胞小球悬浮在总共20μl的核转染溶液中，该核转染溶液是在每次反应中向16.4μl的核转染P3溶液中加入3.6μl的补充剂而制备的。
3)添加TCRβ-L-TALEN mRNA和TCRβ-R-TALEN mRNA各10μg。
4)进行核转染(程序：EO-115)
5)继续再培养。
6)核转染3天后，基于通过流式细胞术的CD3和TCRαβ表达丧失，确认TCR基因的切断效率。
(3)通过磁分选法或FACS(AriaⅡ)回收CD3阴性级分。
4、采用TAL-PITCH法将NY-ESO-1特异性TCR(1G4)引入TRA基因切断位点
(1)用CD3/28珠刺激2中获得的TRB基因经切断T细胞，在X-VIVO20+10％AB血清+2mmol/l L-谷氨酰胺+1％青霉素/链霉素中培养3天。
(2)用Amaxa 4D-Nucleofector将TCRα-L-TALEN mRNA和TCRα-R-TALEN mRNA以及2种TAL-PITCh载体(1G4-EGFP和1G4-mKate2)引入培养T细胞(P3原代细胞4D-NucleofectorTMX Kit S)。
1)将5×105至1×106T细胞通过离心(400G，10min，室温)制成细胞小球。
2)将细胞小球悬浮在总共20μl的核转染溶液中，该核转染溶液是在每次反应时向16.4μl的核转染P3溶液中加入3.6μl的补充剂而制备的。
3)添加TCRα-L-TALEN mRNA、TCRα-R-TALEN mRNA、1G4-EGFP TAL-PITCh载体和1G4-mKate2 TAL-PITCh载体各10μg。
4)进行核转染(程序：EO-115)
5)继续再培养。
6)在核转染的3天后，基于通过流式细胞术的EGFP和mKate2表达，确认1G4-EGFP和1G4-mKate2的引入效率。
(3)通过FACS(Aria II)回收EGFP和mKate2都为阳性的级分。
(结果)
如图22所示，能够获得表达1G4TCR的细胞群。由此可知，通过TAL-PITCh法，不使用病毒载体，也可以制作内源性TCR缺陷NY-ESO-1特异性T细胞。通过引入所期望的外源性TCR代替NY-ESO-1特异性TCR，可以在不使用病毒载体的情况下制作表达具有所期望的抗原特异性的TCR的内源性TCR缺陷T细胞。
(实施例9：制作细胞的全基因组测序)
通过以下方法，在采用限制稀释法等克隆所制作的细胞之后，进行全基因组测序，评估细胞的特性。
[使用QIAamp DNA Mini Kit提取DNA](根据制造商说明书)
1、在1.5ml微管底部加入20μl的QIAGEN蛋白酶。
2、向该微管中加入悬浮在200μl PBS中的1×105个T细胞。
3、将200μl的缓冲液AL加到样品中。
4、56℃孵育10分钟。
5、将1.5ml微管离心沉降(Spin-down)几秒钟，收集附着在盖内侧的溶液。
6、向样品中加入200ml乙醇并涡旋15秒后，将1.5ml微管离心沉降几秒钟，收集附着在盖内侧的溶液。
7、将步骤6中的混合液应用于QIAamp Mini Spin柱。关闭盖子并在6000×g下离心1分钟。将QIAAmp Mini Spin柱移到新的2ml收集管中，丢弃含有滤液的收集管。
8、打开QIAamp Mini Spin柱，加入500μl缓冲液AW1。关闭盖子，在6000×g下离心1分钟。将QIAamp Mini Spin柱移到新的2ml收集管中，丢弃含有滤液的收集管。
9、打开QIAamp Mini Spin柱，加入500μl缓冲液AW2。关闭盖子，在20,000×g下离心3分钟
10、将QIAamp Mini Spin柱移到新的1.5ml微管中，丢弃含有滤液的收集管。打开QIAamp Mini Spin柱，加入200μl纯化水。室温(20℃)下孵育1分钟之后，在6000×g下离心1分钟，提取DNA。
[PCR-free文库的制作和全基因组测序]
1、用Bioruptor Pico(Diagenode,Belgium)将1μg高分子量的DNA片段化处理成平均约300bp，用Agilent Bioanalyzer(Agilent Technologies,USA)确认处理后的状态。
2、对片段化后的DNA进行末端修复、A-加尾、索引接头连接，并用AgentcourtAMPure XP珠(Beckman Coulter,USA)纯化。
3、用Agilent Bioanalyzer(Agilent Technologies,USA)和Bio-Rad实时PCR系统对，制备完成的DNA文库的大小和浓度进行质量确认。
4、根据制造商的说明书，使用HiSeq Xten(Illumina,USA)对DNA文库进行测序，根据Q30％以上且覆盖率30×得到的唯一读段序列，确定全基因组序列。
[注意]
如上所述，使用本发明的优选实施方案，针对本发明进行了例示。然而，可以理解本发明的范围应仅基于权利要求来解释。还应当理解，本说明书中引用的专利、专利申请和文献应当以与其内容自身具体记载的内容相同的方式作为本说明书的参考并入本说明书。本申请基于2017年10月10日向日本专利局提交的日本特愿2017-197013号要求优先权。其全部内容作为参考并入本说明书。
产业上的可利用性
本发明可用于认为免疫抑制是有效的疾病或病症的治疗或预防。
序列表自由文本
序列号1：TALE DNA结合模块的氨基酸序列的示例
序列号2：HLA-A*02限制性CMV pp65肽
序列号3：HLA-A2-HIV
序列号4：BSL-18E引物
序列号5：P20EA引物
序列号6：P10EA引物
序列号7：CA1引物
序列号8：CA2引物
序列号9：CB1引物
序列号10：CB2引物
序列号11：HuVaF引物
序列号12：HuVbF引物
序列号13：B-P20EA引物
序列号14：MID1
序列号15：MID2
序列号16：MID3
序列号17：MID4
序列号18：MID5
序列号19：MID6
序列号20：MID7
序列号21：MID8
序列号22：MID10
序列号23：MID11
序列号24：MID15
序列号25：MID16
序列号26：MID17
序列号27：MID18
序列号28：MID19
序列号29：MID20
序列号30：MID21
序列号31：MID22
序列号32：MID23
序列号33：MID24
序列号34：A接头序列
序列号35：P22EA-ST1-R引物
序列号36：Tag-1引物
序列号37：Tag-2引物
序列号38：CA-ST1-R
序列号39：CB-ST1-R
序列号40：TSO Oligo
序列号41：TSO PCR引物
序列号42：SMART PCR引物
序列号43：TSO_TAG引物
序列号44：SMART_TAG引物
序列号45：Oligo珠中的SMART序列
序列号46：TALEN-TCR-alpha2_L19质粒全长
序列号47：TALEN-TCR-alpha2_R19质粒全长
序列号48：TALEN-TCR-β1_L19质粒全长
序列号49：TALEN-TCR-β1_R19质粒全长
序列号50：TALEN-TCR-β3_L19质粒全长
序列号51：TALEN-TCR-β3_R19质粒全长
序列号52：TALEN-TCR-alpha2_L19 TALEN编码序列
序列号53：TALEN-TCR-alpha2_L19 TALEN氨基酸序列
序列号54：TALEN-TCR-alpha2_R19 TALEN编码序列
序列号55：TALEN-TCR-alpha2_R19 TALEN氨基酸序列
序列号56：TALEN-TCR-β1_L19 TALEN编码序列
序列号57：TALEN-TCR-β1_L19 TALEN氨基酸序列
序列号58：TALEN-TCR-β1_R19 TALEN编码序列
序列号59：TALEN-TCR-β1_R19 TALEN氨基酸序列
序列号60：TALEN-TCR-β3_L19 TALEN编码序列
序列号61：TALEN-TCR-β3_L19 TALEN氨基酸序列
序列号62：TALEN-TCR-β3_R19 TALEN编码序列
序列号63：TALEN-TCR-β3_R19 TALEN氨基酸序列
序列号64：TCR-alpha2-f引物
序列号65：TCR-alpha2-r引物
序列号66：TCR-β1-c1-f引物
序列号67：TCR-β1-c1-r引物
序列号68：TCR-β1-c2-f引物
序列号69：TCR-β1-c2-r引物
序列号70：Vα克隆用正向引物
序列号71：Vα克隆用反向引物
序列号72：Cα克隆用正向引物
序列号73：Cα克隆用反向引物
序列号74：Vβ克隆用正向引物
序列号75：Vβ克隆用反向引物
序列号76：Cβ克隆用正向引物
序列号77：Cβ克隆用反向引物
序列号78：引入用TCRα恒定区
序列号79：引入用TCRβ恒定区
序列号80：QYD肽
序列号81～98：人TRA或TRB的CDR3序列的示例
序列号99～101：铂TALEN的DNA结合模块的氨基酸序列的示例
序列号102：Zhang TALEN的DNA结合模块的氨基酸序列的示例
序列号103～112：图20和21中的碱基序列
序列号113：小鼠TRA2-TALEN左侧的靶序列
序列号114：小鼠TRA2-TALEN右侧的靶序列
序列号115：小鼠TRB1-TALEN左侧的靶序列
序列号116：小鼠TRB1-TALEN右侧的靶序列
序列号117：小鼠TRB2-TALEN左侧的靶序列
序列号118：小鼠TRB2-TALEN右侧的靶序列
序列表
<110> 国立大学法人广岛大学
组库创世纪株式会社
<120> 使用效应T细胞（Teff）抗原受体的抗原特异性调节性T细胞（Treg）的制作技术
<130> F518PCT168
<160> 118
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TALE DNA结合模块的氨基酸序列的示例
<400> 1
Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys
1 5 10 15
Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp
20 25 30
His Gly
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HLA-A*02-限制性CMV pp65肽
<400> 2
Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HLA-A2-HIV
<400> 3
Lys Leu Thr Pro Leu Cys Val Thr Leu
1 5
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BSL-18E引物
<220>
<221> misc_特征
<222> (35)..(35)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 4
aaagcggccg catgcttttt tttttttttt tttvn 35
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P20EA引物
<400> 5
taatacgact ccgaattccc 20
<210> 6
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P10EA引物
<400> 6
gggaattcgg 10
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CA1引物
<400> 7
tgttgaaggc gtttgcacat gca 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CA2引物
<400> 8
gtgcatagac ctcatgtcta gca 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CB1引物
<400> 9
gaactggact tgacagcgga act 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CB2引物
<400> 10
aggcagtatc tggagtcatt gag 23
<210> 11
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HuVbF引物
<220>
<221> misc_特征
<222> (31)..(40)
<223> MID标签序列
<400> 11
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag nnnnnnnnnn ataggcagac agacttgtca 60
ctg 63
<210> 12
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HuVbF引物
<220>
<221> misc_特征
<222> (31)..(40)
<223> MID标签序列
<400> 12
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag nnnnnnnnnn acaccagtgt ggccttttgg 60
gtg 63
<210> 13
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> B-P20EA引物
<400> 13
cctatcccct gtgtgccttg gcagtctaat acgactccga attccc 46
<210> 14
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MID1
<400> 14
acgagtgcgt 10
<210> 15
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MID2
<400> 15
acgctcgaca 10
<210> 16
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MID3
<400> 16
agacgcactc 10
<210> 17
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MID4
<400> 17
agcactgtag 10
<210> 18
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MID5
<400> 18
atcagacacg 10
<210> 19
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MID6
<400> 19
atatcgcgag 10
<210> 20
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MID7
<400> 20
cgtgtctcta 10
<210> 21
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MID8
<400> 21
ctcgcgtgtc 10
<210> 22
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MID10
<400> 22
tctctatgcg 10
<210> 23
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MID11
<400> 23
tgatacgtct 10
<210> 24
<400> 24
000
<210> 25
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MID16
<400> 25
tcacgtacta 10
<210> 26
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MID17
<400> 26
cgtctagtac 10
<210> 27
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MID18
<400> 27
tctacgtagc 10
<210> 28
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MID19
<400> 28
tgtactactc 10
<210> 29
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MID20
<400> 29
acgactacag 10
<210> 30
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MID21
<400> 30
cgtagactag 10
<210> 31
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MID22
<400> 31
tacgagtatg 10
<210> 32
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MID23
<400> 32
tactctcgtg 10
<210> 33
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MID24
<400> 33
tagagacgag 10
<210> 34
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 34
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgac 26
<210> 35
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P22EA-ST1-R引物
<400> 35
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagctaata cgactccgaa ttccc 55
<210> 36
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Tag-1引物
<400> 36
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag aca 33
<210> 37
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Tag-2引物
<400> 37
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cag 33
<210> 38
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CA-ST1-R
<400> 38
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga caggagggtc agggttctgg a 51
<210> 39
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CB-ST1-R
<400> 39
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga caggctcaaa cacagcgacc tc 52
<210> 40
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TSO Oligo
<400> 40
gtcgcacggt ccatcgcagc agtcacagg 29
<210> 41
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TSO PCR引物
<400> 41
gtcgcacggt ccatcgcagc agtc 24
<210> 42
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SMART PCR引物
<400> 42
aagcagtggt atcaacgcag agt 23
<210> 43
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TSO_TAG引物
<400> 43
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagcgtcgc acggtccatc gcagcagtc 59
<210> 44
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SMART_TAG引物
<400> 44
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagaagcagt ggtatcaacg cagagt 56
<210> 45
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Oligo珠中的SMART序列
<400> 45
aagcagtggt atcaacgcag agt 23
<210> 46
<211> 8363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TALEN-TCR-α2_L19质粒全长
<400> 46
agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca 60
ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcacaaca ctcaacccta tctcggtcta 120
ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat 180
ttaacaaaaa tttaacgcga attaattctg tggaatgtgt gtcagttagg gtgtggaaag 240
tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc 300
aggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat 360
tagtcagcaa ccatagtccc gcccctaact ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt 420
tccgcccatt ctccgcccca tggctgacta atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc 480
gcctctgcct ctgagctatt ccagaagtag tgaggaggct tttttggagg cctaggcttt 540
tgcaaaaagc tcccgggagc ttgtatatcc attttcggat ctgatcagca cgtgatgaaa 600
aagcctgaac tcaccgcgac gtctgtcgag aagtttctga tcgaaaagtt cgacagcgtt 660
tccgacctga tgcagctctc ggagggcgaa gaatctcgtg ctttcagctt cgatgtagga 720
gggcgtggat atgtcctgcg ggtaaatagc tgcgccgatg gtttctacaa agatcgttat 780
gtttatcggc actttgcatc ggccgcgctc ccgattccgg aagtgcttga cattggggaa 840
ttcagcgaga gcctgaccta ttgcatctcc cgccgtgcac agggtgtcac gttgcaagac 900
ctgcctgaaa ccgaactgcc cgctgttctg cagccggtcg cggaggccat ggatgcgatc 960
gctgcggccg atcttagcca gacgagcggg ttcggcccat tcggaccgca aggaatcggt 1020
caatacacta catggcgtga tttcatatgc gcgattgctg atccccatgt gtatcactgg 1080
caaactgtga tggacgacac cgtcagtgcg tccgtcgcgc aggctctcga tgagctgatg 1140
ctttgggccg aggactgccc cgaagtccgg cacctcgtgc acgcggattt cggctccaac 1200
aatgtcctga cggacaatgg ccgcataaca gcggtcattg actggagcga ggcgatgttc 1260
ggggattccc aatacgaggt cgccaacatc ttcttctgga ggccgtggtt ggcttgtatg 1320
gagcagcaga cgcgctactt cgagcggagg catccggagc ttgcaggatc gccgcggctc 1380
cgggcgtata tgctccgcat tggtcttgac caactctatc agagcttggt tgacggcaat 1440
ttcgatgatg cagcttgggc gcagggtcga tgcgacgcaa tcgtccgatc cggagccggg 1500
actgtcgggc gtacacaaat cgcccgcaga agcgcggccg tctggaccga tggctgtgta 1560
gaagtactcg ccgatagtgg aaaccgacgc cccagcactc gtccgagggc aaaggaatag 1620
cacgtgctac gagatttcga ttccaccgcc gccttctatg aaaggttggg cttcggaatc 1680
gttttccggg acgccggctg gatgatcctc cagcgcgggg atctcatgct ggagttcttc 1740
gcccacccca acttgtttat tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca 1800
aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc 1860
aatgtatctt atcatgtctg tataccgtcg acctctagct agagcttggc gtaatcatgg 1920
tcattaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc 1980
catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg 2040
ccccagcgct gcgatgatac cgcgagaacc acgctcaccg gctccggatt tatcagcaat 2100
aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat 2160
ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg 2220
caacgttgtt gccatcgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc 2280
attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa 2340
agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc 2400
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gaattattta accttataaa tgagaaaaaa gcaacgcact ttaaataaga tacgttgctt 4140
tttcgattga tgaacaccta taattaaact attcatctat tatttatgat tttttgtata 4200
tacaatattt ctagtttgtt aaagagaatt aagaaaataa atctcgaaaa taataaaggg 4260
aaaatcagtt tttgatatca aaattataca tgtcaacgat aatacaaaat ataatacaaa 4320
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<210> 47
<211> 8363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TALEN-TCR-α2_R19质粒全长
<400> 47
agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca 60
ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcacaaca ctcaacccta tctcggtcta 120
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<223> TALEN-TCR-β3_R19质粒全长
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gttttccggg acgccggctg gatgatcctc cagcgcgggg atctcatgct ggagttcttc 1740
gcccacccca acttgtttat tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca 1800
aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc 1860
aatgtatctt atcatgtctg tataccgtcg acctctagct agagcttggc gtaatcatgg 1920
tcattaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc 1980
catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg 2040
ccccagcgct gcgatgatac cgcgagaacc acgctcaccg gctccggatt tatcagcaat 2100
aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat 2160
ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg 2220
caacgttgtt gccatcgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc 2280
attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa 2340
agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc 2400
actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt 2460
ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag 2520
ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt 2580
gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag 2640
atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac 2700
cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc 2760
gacacggaaa tgttgaatac tcatattctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca 2820
gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg 2880
ggtcagtgtt acaaccaatt aaccaattct gaacattatc gcgagcccat ttatacctga 2940
atatggctca taacacccct tgctcatgac caaaatccct taacgtgagt tacgcgcgcg 3000
tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt 3060
tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt 3120
ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag 3180
ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg tagttagccc accacttcaa gaactctgta 3240
gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat 3300
aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg 3360
ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg 3420
agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac 3480
aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga 3540
aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt 3600
ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta 3660
cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat 3720
tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg 3780
accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaaggcg agagtaggga actgccaggc 3840
atcaaactaa gcagaaggcc cctgacggat ggcctttttg cgtttctaca aactctttct 3900
gtgttgtaaa acgacggcca gtcttaagct cgggccccct gggcggttct gataacgagt 3960
aatcgttaat ccgcaaataa cgtaaaaacc cgcttcggcg ggttttttta tggggggagt 4020
ttagggaaag agcatttgtc agaatattta agggcgcctg tcactttgct tgatatatga 4080
gaattattta accttataaa tgagaaaaaa gcaacgcact ttaaataaga tacgttgctt 4140
tttcgattga tgaacaccta taattaaact attcatctat tatttatgat tttttgtata 4200
tacaatattt ctagtttgtt aaagagaatt aagaaaataa atctcgaaaa taataaaggg 4260
aaaatcagtt tttgatatca aaattataca tgtcaacgat aatacaaaat ataatacaaa 4320
ctataagatg ttatcagtat ttattatcat ttagaataaa ttttgtgtcg cccttaattg 4380
tgagcggata acaattacga gcttcatgca cagtggcgtt gacattgatt attgactagt 4440
tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt 4500
acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg cccattgacg 4560
tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg 4620
gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt 4680
acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg 4740
accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg 4800
gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt 4860
ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac 4920
tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg 4980
tgggaggtct atataagcag agctctctgg ctaactagag aacccactgc ttactggctt 5040
atcgaaatta atacgactca ctatagggaa gcttcttgtt ctttttgcag aagctcagaa 5100
taaacgctca actttggcct cgaggccacc atggcttcct cccctccaaa gaaaaagaga 5160
aaggttgcgg ccgctgacta caaggatgac gacgataaaa gttggaagga cgcaagtggt 5220
tggtctagaa tgcatgcggc cccgcgacgg cgtgctgcgc aaccctccga cgcttcgccg 5280
gccgcgcagg tggatctacg cacgctcggc tacagtcagc agcagcaaga gaagatcaaa 5340
ccgaaggtgc gttcgacagt ggcgcagcac cacgaggcac tggtgggcca tgggtttaca 5400
cacgcgcaca tcgttgcgct cagccaacac ccggcagcgt tagggaccgt cgctgtcacg 5460
tatcagcaca taatcacggc gttgccagag gcgacacacg aagacatcgt tggcgtcggc 5520
aaacagtggt ccggcgcacg cgccctggag gccttgctca cggatgcggg ggagttgaga 5580
ggtccgccgt tacagttgga cacaggccaa cttgtgaaga ttgcaaaacg tggcggcgtg 5640
accgcaatgg aggcagtgca tgcatcgcgc aatgcgctca cgggagcacc cctcaacctg 5700
accccggacc aggtggttgc aatcgcgtca cacgatgggg gaaagcaggc cctagaaacc 5760
gttcagcgac tcctgcccgt cctgtgccag gaccacggcc tgaccccaga acaggttgtg 5820
gccatcgcca gcaacatagg tggcaagcag gccctcgaaa ccgtccagag actgttaccg 5880
gttctctgcc aggcccacgg cctgaccccg gaccaggtgg ttgcaatcgc gtcacacgat 5940
gggggaaagc aggccctaga aaccgttcag cgactcctgc ccgtcctgtg ccaggcccac 6000
ggcctgaccc cggcccaggt ggttgcaatc gcgtcacacg atgggggaaa gcaggcccta 6060
gaaaccgttc agcgactcct gcccgtcctg tgccaggacc acggcctgac cccggaccag 6120
gtggttgcaa tcgcgtcaca cgatggggga aagcaggccc tagaaaccgt tcagcgactc 6180
ctgcccgtcc tgtgccagga ccacggcctg accccagaac aggttgtggc catcgccagc 6240
aacataggtg gcaagcaggc cctcgaaacc gtccagagac tgttaccggt tctctgccag 6300
gcccacggcc tgaccccgga ccaggtggtt gcaatcgcgt cacacgatgg gggaaagcag 6360
gccctagaaa ccgttcagcg actcctgccc gtcctgtgcc aggcccacgg cctgaccccg 6420
gcccaggtgg ttgcaatcgc gtcacacgat gggggaaagc aggccctaga aaccgttcag 6480
cgactcctgc ccgtcctgtg ccaggaccac ggcctgaccc cagaccaggt tgtggccatc 6540
gccagcaaca taggtggcaa gcaggccctc gaaaccgtcc agagactgtt accggttctc 6600
tgccaggacc acggcctgac cccagaacaa gttgtcgcga ttgcaagcaa caacggaggc 6660
aaacaagcct tagaaacagt ccagagattg ttgccggtgc tgtgccaagc ccacggcctg 6720
accccggacc aggtggttgc aatcgcgtca cacgatgggg gaaagcaggc cctagaaacc 6780
gttcagcgac tcctgcccgt cctgtgccag gcccacggcc tgacccccgc ccaggttgtc 6840
gctattgcta gtaacggcgg aggcaaacag gcgctggaaa cagttcagcg cctcttgccg 6900
gtcttgtgtc aggaccacgg cctgaccccg gaccaggtgg ttgcaatcgc gtcacacgat 6960
gggggaaagc aggccctaga aaccgttcag cgactcctgc ccgtcctgtg ccaggaccac 7020
ggcctgaccc cagaacaggt tgtggccatc gccagcaaca taggtggcaa gcaggccctc 7080
gaaaccgtcc agagactgtt accggttctc tgccaggccc acggcctgac cccagaccaa 7140
gttgtcgcga ttgcaagcaa caacggaggc aaacaagcct tagaaacagt ccagagattg 7200
ttgcctgtgc tgtgccaagc ccacggcctg accccggccc aggtggttgc aatcgcgtca 7260
cacgatgggg gaaagcaggc cctagaaacc gttcagcgac tcctgcccgt cctgtgccag 7320
gaccacggcc tgacccccga ccaggttgtc gctattgcta gtaacggcgg aggcaaacag 7380
gcgctggaaa cagttcagcg cctcttgccg gtcttgtgtc aggaccacgg cctgaccccg 7440
gaacaggtgg ttgcaatcgc gtcacacgat gggggaaagc aggccctaga aaccgttcag 7500
cgactcctgc ccgtcctgtg ccaggcccac ggcctgacgc ctgagcaggt agtggctatt 7560
gcatcccacg acgggggcag acccgcactg gagtcaatcg tggcccagct ttcgaggccg 7620
gaccccgcgc tggccgcact cactaatgat catcttgtag cgctggcctg cctcggcgga 7680
cgtcctgcca tggatgcagt gaaaaaggga ttgccgcacg cgccggaatt gatcagatcc 7740
cagctagtga aatctgaatt ggaagagaag aaatctgaac ttagacataa attgaaatat 7800
gtgccacatg aatatattga attgattgaa atcgcaagaa attcaactca ggatagaatc 7860
cttgaaatga aggtgatgga gttctttatg aaggtttatg gttatcgtgg taaacatttg 7920
ggtggatcaa ggaaaccaga cggagcaatt tatactgtcg gatctcctat tgattacggt 7980
gtgatcgttg atactaaggc atattcagga ggttataatc ttccaattgg tcaagcagat 8040
gaaatgcaaa gatatgtcga agagaatcaa acaagaaaca agcatatcaa ccctaatgaa 8100
tggtggaaag tctatccatc ttcagtaaca gaatttaagt tcttgtttgt gagtggtcat 8160
ttcaaaggaa actacaaagc tcagcttaca agattgaatc atatcactaa ttgtaatgga 8220
gctgttctta gtgtagaaga gcttttgatt ggtggagaaa tgattaaagc tggtacattg 8280
acacttgagg aagtgagaag gaaatttaat aacggtgaga taaactttta aaaaatcagc 8340
ctcgactgtg ccttctagtt gcc 8363
<210> 52
<211> 3201
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TALEN-TCR-α2_L19 TALEN编码序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(3201)
<400> 52
atg gct tcc tcc cct cca aag aaa aag aga aag gtt gcg gcc gct gac 48
Met Ala Ser Ser Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ala Ala Ala Asp
1 5 10 15
tac aag gat gac gac gat aaa agt tgg aag gac gca agt ggt tgg tct 96
Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ser Trp Lys Asp Ala Ser Gly Trp Ser
20 25 30
aga atg cat gcg gcc ccg cga cgg cgt gct gcg caa ccc tcc gac gct 144
Arg Met His Ala Ala Pro Arg Arg Arg Ala Ala Gln Pro Ser Asp Ala
35 40 45
tcg ccg gcc gcg cag gtg gat cta cgc acg ctc ggc tac agt cag cag 192
Ser Pro Ala Ala Gln Val Asp Leu Arg Thr Leu Gly Tyr Ser Gln Gln
50 55 60
cag caa gag aag atc aaa ccg aag gtg cgt tcg aca gtg gcg cag cac 240
Gln Gln Glu Lys Ile Lys Pro Lys Val Arg Ser Thr Val Ala Gln His
65 70 75 80
cac gag gca ctg gtg ggc cat ggg ttt aca cac gcg cac atc gtt gcg 288
His Glu Ala Leu Val Gly His Gly Phe Thr His Ala His Ile Val Ala
85 90 95
ctc agc caa cac ccg gca gcg tta ggg acc gtc gct gtc acg tat cag 336
Leu Ser Gln His Pro Ala Ala Leu Gly Thr Val Ala Val Thr Tyr Gln
100 105 110
cac ata atc acg gcg ttg cca gag gcg aca cac gaa gac atc gtt ggc 384
His Ile Ile Thr Ala Leu Pro Glu Ala Thr His Glu Asp Ile Val Gly
115 120 125
gtc ggc aaa cag tgg tcc ggc gca cgc gcc ctg gag gcc ttg ctc acg 432
Val Gly Lys Gln Trp Ser Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ala Leu Leu Thr
130 135 140
gat gcg ggg gag ttg aga ggt ccg ccg tta cag ttg gac aca ggc caa 480
Asp Ala Gly Glu Leu Arg Gly Pro Pro Leu Gln Leu Asp Thr Gly Gln
145 150 155 160
ctt gtg aag att gca aaa cgt ggc ggc gtg acc gca atg gag gca gtg 528
Leu Val Lys Ile Ala Lys Arg Gly Gly Val Thr Ala Met Glu Ala Val
165 170 175
cat gca tcg cgc aat gcg ctc acg gga gca ccc ctc aac ctg acc cca 576
His Ala Ser Arg Asn Ala Leu Thr Gly Ala Pro Leu Asn Leu Thr Pro
180 185 190
gac caa gtt gtc gcg att gca agc aac aac gga ggc aaa caa gcc tta 624
Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu
195 200 205
gaa aca gtc cag aga ttg ttg ccg gtg ctg tgc caa gac cac ggc ctg 672
Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu
210 215 220
acc ccc gaa cag gtt gtc gct att gct agt aac ggc gga ggc aaa cag 720
Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln
225 230 235 240
gcg ctg gaa aca gtt cag cgc ctc ttg ccg gtc ttg tgt cag gcc cac 768
Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His
245 250 255
ggc ctg acc ccg gac cag gtg gtt gca atc gcg tca cac gat ggg gga 816
Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly
260 265 270
aag cag gcc cta gaa acc gtt cag cga ctc ctg ccc gtc ctg tgc cag 864
Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln
275 280 285
gcc cac ggc ctg acc ccc gcc cag gtt gtc gct att gct agt aac ggc 912
Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly
290 295 300
gga ggc aaa cag gcg ctg gaa aca gtt cag cgc ctc ttg ccg gtc ttg 960
Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu
305 310 315 320
tgt cag gac cac ggc ctg acc cca gac caa gtt gtc gcg att gca agc 1008
Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser
325 330 335
aac aac gga ggc aaa caa gcc tta gaa aca gtc cag aga ttg ttg ccg 1056
Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro
340 345 350
gtg ctg tgc caa gac cac ggc ctg acc ccg gaa cag gtg gtt gca atc 1104
Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile
355 360 365
gcg tca cac gat ggg gga aag cag gcc cta gaa acc gtt cag cga ctc 1152
Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu
370 375 380
ctg ccc gtc ctg tgc cag gcc cac ggc ctg acc ccg gac cag gtg gtt 1200
Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val
385 390 395 400
gca atc gcg tca cac gat ggg gga aag cag gcc cta gaa acc gtt cag 1248
Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln
405 410 415
cga ctc ctg ccc gtc ctg tgc cag gcc cac ggc ctg acc ccc gcc cag 1296
Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln
420 425 430
gtt gtc gct att gct agt aac ggc gga ggc aaa cag gcg ctg gaa aca 1344
Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr
435 440 445
gtt cag cgc ctc ttg ccg gtc ttg tgt cag gac cac ggc ctg acc cca 1392
Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro
450 455 460
gac cag gtt gtg gcc atc gcc agc aac ata ggt ggc aag cag gcc ctc 1440
Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu
465 470 475 480
gaa acc gtc cag aga ctg tta ccg gtt ctc tgc cag gac cac ggc ctg 1488
Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu
485 490 495
acc ccc gaa cag gtt gtc gct att gct agt aac ggc gga ggc aaa cag 1536
Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln
500 505 510
gcg ctg gaa aca gtt cag cgc ctc ttg ccg gtc ttg tgt cag gcc cac 1584
Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His
515 520 525
ggc ctg acc ccc gac cag gtt gtc gct att gct agt aac ggc gga ggc 1632
Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly
530 535 540
aaa cag gcg ctg gaa aca gtt cag cgc ctc ttg ccg gtc ttg tgt cag 1680
Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln
545 550 555 560
gcc cac ggc ctg acc ccg gcc cag gtg gtt gca atc gcg tca cac gat 1728
Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp
565 570 575
ggg gga aag cag gcc cta gaa acc gtt cag cga ctc ctg ccc gtc ctg 1776
Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu
580 585 590
tgc cag gac cac ggc ctg acc cca gac cag gtt gtg gcc atc gcc agc 1824
Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser
595 600 605
aac ata ggt ggc aag cag gcc ctc gaa acc gtc cag aga ctg tta ccg 1872
Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro
610 615 620
gtt ctc tgc cag gac cac ggc ctg acc ccg gaa cag gtg gtt gca atc 1920
Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile
625 630 635 640
gcg tca cac gat ggg gga aag cag gcc cta gaa acc gtt cag cga ctc 1968
Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu
645 650 655
ctg ccc gtc ctg tgc cag gcc cac ggc ctg acc ccg gac cag gtg gtt 2016
Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val
660 665 670
gca atc gcg tca cac gat ggg gga aag cag gcc cta gaa acc gtt cag 2064
Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln
675 680 685
cga ctc ctg ccc gtc ctg tgc cag gcc cac ggc ctg acc cca gcc caa 2112
Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln
690 695 700
gtt gtc gcg att gca agc aac aac gga ggc aaa caa gcc tta gaa aca 2160
Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr
705 710 715 720
gtc cag aga ttg ttg ccg gtg ctg tgc caa gac cac ggc ctg acc cca 2208
Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro
725 730 735
gac cag gtt gtg gcc atc gcc agc aac ata ggt ggc aag cag gcc ctc 2256
Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu
740 745 750
gaa acc gtc cag aga ctg tta ccg gtt ctc tgc cag gac cac ggc ctg 2304
Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu
755 760 765
acc ccc gaa cag gtt gtc gct att gct agt aac ggc gga ggc aaa cag 2352
Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln
770 775 780
gcg ctg gaa aca gtt cag cgc ctc ttg ccg gtc ttg tgt cag gcc cac 2400
Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His
785 790 795 800
ggc ctg acg cct gag cag gta gtg gct att gca tcc aac gga ggg ggc 2448
Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly
805 810 815
aga ccc gca ctg gag tca atc gtg gcc cag ctt tcg agg ccg gac ccc 2496
Arg Pro Ala Leu Glu Ser Ile Val Ala Gln Leu Ser Arg Pro Asp Pro
820 825 830
gcg ctg gcc gca ctc act aat gat cat ctt gta gcg ctg gcc tgc ctc 2544
Ala Leu Ala Ala Leu Thr Asn Asp His Leu Val Ala Leu Ala Cys Leu
835 840 845
ggc gga cgt cct gcc atg gat gca gtg aaa aag gga ttg ccg cac gcg 2592
Gly Gly Arg Pro Ala Met Asp Ala Val Lys Lys Gly Leu Pro His Ala
850 855 860
ccg gaa ttg atc aga tcc cag cta gtg aaa tct gaa ttg gaa gag aag 2640
Pro Glu Leu Ile Arg Ser Gln Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys
865 870 875 880
aaa tct gaa ctt aga cat aaa ttg aaa tat gtg cca cat gaa tat att 2688
Lys Ser Glu Leu Arg His Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile
885 890 895
gaa ttg att gaa atc gca aga aat tca act cag gat aga atc ctt gaa 2736
Glu Leu Ile Glu Ile Ala Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu
900 905 910
atg aag gtg atg gag ttc ttt atg aag gtt tat ggt tat cgt ggt aaa 2784
Met Lys Val Met Glu Phe Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys
915 920 925
cat ttg ggt gga tca agg aaa cca gac gga gca att tat act gtc gga 2832
His Leu Gly Gly Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly
930 935 940
tct cct att gat tac ggt gtg atc gtt gat act aag gca tat tca gga 2880
Ser Pro Ile Asp Tyr Gly Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly
945 950 955 960
ggt tat aat ctt cca att ggt caa gca gat gaa atg caa aga tat gtc 2928
Gly Tyr Asn Leu Pro Ile Gly Gln Ala Asp Glu Met Gln Arg Tyr Val
965 970 975
gaa gag aat caa aca aga aac aag cat atc aac cct aat gaa tgg tgg 2976
Glu Glu Asn Gln Thr Arg Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp
980 985 990
aaa gtc tat cca tct tca gta aca gaa ttt aag ttc ttg ttt gtg agt 3024
Lys Val Tyr Pro Ser Ser Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser
995 1000 1005
ggt cat ttc aaa gga aac tac aaa gct cag ctt aca aga ttg aat 3069
Gly His Phe Lys Gly Asn Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn
1010 1015 1020
cat atc act aat tgt aat gga gct gtt ctt agt gta gaa gag ctt 3114
His Ile Thr Asn Cys Asn Gly Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu
1025 1030 1035
ttg att ggt gga gaa atg att aaa gct ggt aca ttg aca ctt gag 3159
Leu Ile Gly Gly Glu Met Ile Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu
1040 1045 1050
gaa gtg aga agg aaa ttt aat aac ggt gag ata aac ttt taa 3201
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<220>
<223> 合成构建体
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65 70 75 80
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Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln
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Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln
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<212> DNA
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<223> TALEN-TCR-α2_R19 TALEN编码序列
<220>
<221> CDS
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tac aag gat gac gac gat aaa agt tgg aag gac gca agt ggt tgg tct 96
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805 810 815
aga ccc gca ctg gag tca atc gtg gcc cag ctt tcg agg ccg gac ccc 2496
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aaa tct gaa ctt aga cat aaa ttg aaa tat gtg cca cat gaa tat att 2688
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gaa ttg att gaa atc gca aga aat tca act cag gat aga atc ctt gaa 2736
Glu Leu Ile Glu Ile Ala Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu
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Met Lys Val Met Glu Phe Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys
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cat ttg ggt gga tca agg aaa cca gac gga gca att tat act gtc gga 2832
His Leu Gly Gly Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly
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tct cct att gat tac ggt gtg atc gtt gat act aag gca tat tca gga 2880
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ggt tat aat ctt cca att ggt caa gca gat gaa atg caa aga tat gtc 2928
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965 970 975
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aaa gtc tat cca tct tca gta aca gaa ttt aag ttc ttg ttt gtg agt 3024
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<211> 1066
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 55
Met Ala Ser Ser Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ala Ala Ala Asp
1 5 10 15
Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ser Trp Lys Asp Ala Ser Gly Trp Ser
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35 40 45
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65 70 75 80
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165 170 175
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly
530 535 540
Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln
545 550 555 560
Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn
565 570 575
Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu
580 585 590
Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser
595 600 605
Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro
610 615 620
Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile
625 630 635 640
Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu
645 650 655
Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val
660 665 670
Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln
675 680 685
Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln
690 695 700
Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr
705 710 715 720
Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro
725 730 735
Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu
740 745 750
Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu
755 760 765
Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln
770 775 780
Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His
785 790 795 800
Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly
805 810 815
Arg Pro Ala Leu Glu Ser Ile Val Ala Gln Leu Ser Arg Pro Asp Pro
820 825 830
Ala Leu Ala Ala Leu Thr Asn Asp His Leu Val Ala Leu Ala Cys Leu
835 840 845
Gly Gly Arg Pro Ala Met Asp Ala Val Lys Lys Gly Leu Pro His Ala
850 855 860
Pro Glu Leu Ile Arg Ser Gln Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys
865 870 875 880
Lys Ser Glu Leu Arg His Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile
885 890 895
Glu Leu Ile Glu Ile Ala Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu
900 905 910
Met Lys Val Met Glu Phe Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys
915 920 925
His Leu Gly Gly Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly
930 935 940
Ser Pro Ile Asp Tyr Gly Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly
945 950 955 960
Gly Tyr Asn Leu Pro Ile Gly Gln Ala Asp Glu Met Gln Arg Tyr Val
965 970 975
Glu Glu Asn Gln Thr Arg Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp
980 985 990
Lys Val Tyr Pro Ser Ser Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser
995 1000 1005
Gly His Phe Lys Gly Asn Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn
1010 1015 1020
His Ile Thr Asn Cys Asn Gly Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu
1025 1030 1035
Leu Ile Gly Gly Glu Met Ile Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu
1040 1045 1050
Glu Val Arg Arg Lys Phe Asn Asn Gly Glu Ile Asn Phe
1055 1060 1065
<210> 56
<211> 3201
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TALEN-TCR-β1_L19 TALEN编码序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(3201)
<400> 56
atg gct tcc tcc cct cca aag aaa aag aga aag gtt gcg gcc gct gac 48
Met Ala Ser Ser Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ala Ala Ala Asp
1 5 10 15
tac aag gat gac gac gat aaa agt tgg aag gac gca agt ggt tgg tct 96
Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ser Trp Lys Asp Ala Ser Gly Trp Ser
20 25 30
aga atg cat gcg gcc ccg cga cgg cgt gct gcg caa ccc tcc gac gct 144
Arg Met His Ala Ala Pro Arg Arg Arg Ala Ala Gln Pro Ser Asp Ala
35 40 45
tcg ccg gcc gcg cag gtg gat cta cgc acg ctc ggc tac agt cag cag 192
Ser Pro Ala Ala Gln Val Asp Leu Arg Thr Leu Gly Tyr Ser Gln Gln
50 55 60
cag caa gag aag atc aaa ccg aag gtg cgt tcg aca gtg gcg cag cac 240
Gln Gln Glu Lys Ile Lys Pro Lys Val Arg Ser Thr Val Ala Gln His
65 70 75 80
cac gag gca ctg gtg ggc cat ggg ttt aca cac gcg cac atc gtt gcg 288
His Glu Ala Leu Val Gly His Gly Phe Thr His Ala His Ile Val Ala
85 90 95
ctc agc caa cac ccg gca gcg tta ggg acc gtc gct gtc acg tat cag 336
Leu Ser Gln His Pro Ala Ala Leu Gly Thr Val Ala Val Thr Tyr Gln
100 105 110
cac ata atc acg gcg ttg cca gag gcg aca cac gaa gac atc gtt ggc 384
His Ile Ile Thr Ala Leu Pro Glu Ala Thr His Glu Asp Ile Val Gly
115 120 125
gtc ggc aaa cag tgg tcc ggc gca cgc gcc ctg gag gcc ttg ctc acg 432
Val Gly Lys Gln Trp Ser Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ala Leu Leu Thr
130 135 140
gat gcg ggg gag ttg aga ggt ccg ccg tta cag ttg gac aca ggc caa 480
Asp Ala Gly Glu Leu Arg Gly Pro Pro Leu Gln Leu Asp Thr Gly Gln
145 150 155 160
ctt gtg aag att gca aaa cgt ggc ggc gtg acc gca atg gag gca gtg 528
Leu Val Lys Ile Ala Lys Arg Gly Gly Val Thr Ala Met Glu Ala Val
165 170 175
cat gca tcg cgc aat gcg ctc acg gga gca ccc ctc aac ctg acc cca 576
His Ala Ser Arg Asn Ala Leu Thr Gly Ala Pro Leu Asn Leu Thr Pro
180 185 190
gac caa gtt gtc gcg att gca agc aac aac gga ggc aaa caa gcc tta 624
Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu
195 200 205
gaa aca gtc cag aga ttg ttg ccg gtg ctg tgc caa gac cac ggc ctg 672
Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu
210 215 220
acc ccc gaa cag gtt gtc gct att gct agt aac ggc gga ggc aaa cag 720
Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln
225 230 235 240
gcg ctg gaa aca gtt cag cgc ctc ttg ccg gtc ttg tgt cag gcc cac 768
Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His
245 250 255
ggc ctg acc ccc gac cag gtt gtc gct att gct agt aac ggc gga ggc 816
Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly
260 265 270
aaa cag gcg ctg gaa aca gtt cag cgc ctc ttg ccg gtc ttg tgt cag 864
Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln
275 280 285
gcc cac ggc ctg acc ccg gcc cag gtg gtt gca atc gcg tca cac gat 912
Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp
290 295 300
ggg gga aag cag gcc cta gaa acc gtt cag cga ctc ctg ccc gtc ctg 960
Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu
305 310 315 320
tgc cag gac cac ggc ctg acc ccg gac cag gtg gtt gca atc gcg tca 1008
Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser
325 330 335
cac gat ggg gga aag cag gcc cta gaa acc gtt cag cga ctc ctg ccc 1056
His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro
340 345 350
gtc ctg tgc cag gac cac ggc ctg acc ccg gaa cag gtg gtt gca atc 1104
Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile
355 360 365
gcg tca cac gat ggg gga aag cag gcc cta gaa acc gtt cag cga ctc 1152
Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu
370 375 380
ctg ccc gtc ctg tgc cag gcc cac ggc ctg acc cca gac cag gtt gtg 1200
Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val
385 390 395 400
gcc atc gcc agc aac ata ggt ggc aag cag gcc ctc gaa acc gtc cag 1248
Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln
405 410 415
aga ctg tta ccg gtt ctc tgc cag gcc cac ggc ctg acc ccg gcc cag 1296
Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln
420 425 430
gtg gtt gca atc gcg tca cac gat ggg gga aag cag gcc cta gaa acc 1344
Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr
435 440 445
gtt cag cga ctc ctg ccc gtc ctg tgc cag gac cac ggc ctg acc ccg 1392
Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro
450 455 460
gac cag gtg gtt gca atc gcg tca cac gat ggg gga aag cag gcc cta 1440
Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu
465 470 475 480
gaa acc gtt cag cga ctc ctg ccc gtc ctg tgc cag gac cac ggc ctg 1488
Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu
485 490 495
acc ccg gaa cag gtg gtt gca atc gcg tca cac gat ggg gga aag cag 1536
Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln
500 505 510
gcc cta gaa acc gtt cag cga ctc ctg ccc gtc ctg tgc cag gcc cac 1584
Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His
515 520 525
ggc ctg acc cca gac caa gtt gtc gcg att gca agc aac aac gga ggc 1632
Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly
530 535 540
aaa caa gcc tta gaa aca gtc cag aga ttg ttg cct gtg ctg tgc caa 1680
Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln
545 550 555 560
gcc cac ggc ctg acc cca gcc cag gtt gtg gcc atc gcc agc aac ata 1728
Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile
565 570 575
ggt ggc aag cag gcc ctc gaa acc gtc cag aga ctg tta ccg gtt ctc 1776
Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu
580 585 590
tgc cag gac cac ggc ctg acc cca gac caa gtt gtc gcg att gca agc 1824
Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser
595 600 605
aac aac gga ggc aaa caa gcc tta gaa aca gtc cag aga ttg ttg ccg 1872
Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro
610 615 620
gtg ctg tgc caa gac cac ggc ctg acc cca gaa caa gtt gtc gcg att 1920
Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile
625 630 635 640
gca agc aac aac gga ggc aaa caa gcc tta gaa aca gtc cag aga ttg 1968
Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu
645 650 655
ttg ccg gtg ctg tgc caa gcc cac ggc ctg acc ccc gac cag gtt gtc 2016
Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val
660 665 670
gct att gct agt aac ggc gga ggc aaa cag gcg ctg gaa aca gtt cag 2064
Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln
675 680 685
cgc ctc ttg ccg gtc ttg tgt cag gcc cac ggc ctg acc ccg gcc cag 2112
Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln
690 695 700
gtg gtt gca atc gcg tca cac gat ggg gga aag cag gcc cta gaa acc 2160
Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr
705 710 715 720
gtt cag cga ctc ctg ccc gtc ctg tgc cag gac cac ggc ctg acc cca 2208
Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro
725 730 735
gac caa gtt gtc gcg att gca agc aac aac gga ggc aaa caa gcc tta 2256
Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu
740 745 750
gaa aca gtc cag aga ttg ttg ccg gtg ctg tgc caa gac cac ggc ctg 2304
Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu
755 760 765
acc ccg gaa cag gtg gtt gca atc gcg tca cac gat ggg gga aag cag 2352
Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln
770 775 780
gcc cta gaa acc gtt cag cga ctc ctg ccc gtc ctg tgc cag gcc cac 2400
Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His
785 790 795 800
ggc ctg acg cct gag cag gta gtg gct att gca tcc aac gga ggg ggc 2448
Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly
805 810 815
aga ccc gca ctg gag tca atc gtg gcc cag ctt tcg agg ccg gac ccc 2496
Arg Pro Ala Leu Glu Ser Ile Val Ala Gln Leu Ser Arg Pro Asp Pro
820 825 830
gcg ctg gcc gca ctc act aat gat cat ctt gta gcg ctg gcc tgc ctc 2544
Ala Leu Ala Ala Leu Thr Asn Asp His Leu Val Ala Leu Ala Cys Leu
835 840 845
ggc gga cgt cct gcc atg gat gca gtg aaa aag gga ttg ccg cac gcg 2592
Gly Gly Arg Pro Ala Met Asp Ala Val Lys Lys Gly Leu Pro His Ala
850 855 860
ccg gaa ttg atc aga tcc cag cta gtg aaa tct gaa ttg gaa gag aag 2640
Pro Glu Leu Ile Arg Ser Gln Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys
865 870 875 880
aaa tct gaa ctt aga cat aaa ttg aaa tat gtg cca cat gaa tat att 2688
Lys Ser Glu Leu Arg His Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile
885 890 895
gaa ttg att gaa atc gca aga aat tca act cag gat aga atc ctt gaa 2736
Glu Leu Ile Glu Ile Ala Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu
900 905 910
atg aag gtg atg gag ttc ttt atg aag gtt tat ggt tat cgt ggt aaa 2784
Met Lys Val Met Glu Phe Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys
915 920 925
cat ttg ggt gga tca agg aaa cca gac gga gca att tat act gtc gga 2832
His Leu Gly Gly Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly
930 935 940
tct cct att gat tac ggt gtg atc gtt gat act aag gca tat tca gga 2880
Ser Pro Ile Asp Tyr Gly Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly
945 950 955 960
ggt tat aat ctt cca att ggt caa gca gat gaa atg caa aga tat gtc 2928
Gly Tyr Asn Leu Pro Ile Gly Gln Ala Asp Glu Met Gln Arg Tyr Val
965 970 975
gaa gag aat caa aca aga aac aag cat atc aac cct aat gaa tgg tgg 2976
Glu Glu Asn Gln Thr Arg Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp
980 985 990
aaa gtc tat cca tct tca gta aca gaa ttt aag ttc ttg ttt gtg agt 3024
Lys Val Tyr Pro Ser Ser Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser
995 1000 1005
ggt cat ttc aaa gga aac tac aaa gct cag ctt aca aga ttg aat 3069
Gly His Phe Lys Gly Asn Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn
1010 1015 1020
cat atc act aat tgt aat gga gct gtt ctt agt gta gaa gag ctt 3114
His Ile Thr Asn Cys Asn Gly Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu
1025 1030 1035
ttg att ggt gga gaa atg att aaa gct ggt aca ttg aca ctt gag 3159
Leu Ile Gly Gly Glu Met Ile Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu
1040 1045 1050
gaa gtg aga agg aaa ttt aat aac ggt gag ata aac ttt taa 3201
Glu Val Arg Arg Lys Phe Asn Asn Gly Glu Ile Asn Phe
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<210> 57
<211> 1066
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 57
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Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ser Trp Lys Asp Ala Ser Gly Trp Ser
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Arg Met His Ala Ala Pro Arg Arg Arg Ala Ala Gln Pro Ser Asp Ala
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Ser Pro Ala Ala Gln Val Asp Leu Arg Thr Leu Gly Tyr Ser Gln Gln
50 55 60
Gln Gln Glu Lys Ile Lys Pro Lys Val Arg Ser Thr Val Ala Gln His
65 70 75 80
His Glu Ala Leu Val Gly His Gly Phe Thr His Ala His Ile Val Ala
85 90 95
Leu Ser Gln His Pro Ala Ala Leu Gly Thr Val Ala Val Thr Tyr Gln
100 105 110
His Ile Ile Thr Ala Leu Pro Glu Ala Thr His Glu Asp Ile Val Gly
115 120 125
Val Gly Lys Gln Trp Ser Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ala Leu Leu Thr
130 135 140
Asp Ala Gly Glu Leu Arg Gly Pro Pro Leu Gln Leu Asp Thr Gly Gln
145 150 155 160
Leu Val Lys Ile Ala Lys Arg Gly Gly Val Thr Ala Met Glu Ala Val
165 170 175
His Ala Ser Arg Asn Ala Leu Thr Gly Ala Pro Leu Asn Leu Thr Pro
180 185 190
Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu
195 200 205
Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu
210 215 220
Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln
225 230 235 240
Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His
245 250 255
Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly
260 265 270
Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln
275 280 285
Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp
290 295 300
Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu
305 310 315 320
Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser
325 330 335
His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro
340 345 350
Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile
355 360 365
Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu
370 375 380
Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val
385 390 395 400
Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln
405 410 415
Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln
420 425 430
Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr
435 440 445
Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro
450 455 460
Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu
465 470 475 480
Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu
485 490 495
Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln
500 505 510
Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His
515 520 525
Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly
530 535 540
Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln
545 550 555 560
Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile
565 570 575
Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu
580 585 590
Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser
595 600 605
Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro
610 615 620
Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile
625 630 635 640
Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu
645 650 655
Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val
660 665 670
Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln
675 680 685
Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln
690 695 700
Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr
705 710 715 720
Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro
725 730 735
Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu
740 745 750
Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu
755 760 765
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770 775 780
Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His
785 790 795 800
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805 810 815
Arg Pro Ala Leu Glu Ser Ile Val Ala Gln Leu Ser Arg Pro Asp Pro
820 825 830
Ala Leu Ala Ala Leu Thr Asn Asp His Leu Val Ala Leu Ala Cys Leu
835 840 845
Gly Gly Arg Pro Ala Met Asp Ala Val Lys Lys Gly Leu Pro His Ala
850 855 860
Pro Glu Leu Ile Arg Ser Gln Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys
865 870 875 880
Lys Ser Glu Leu Arg His Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile
885 890 895
Glu Leu Ile Glu Ile Ala Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu
900 905 910
Met Lys Val Met Glu Phe Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys
915 920 925
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930 935 940
Ser Pro Ile Asp Tyr Gly Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly
945 950 955 960
Gly Tyr Asn Leu Pro Ile Gly Gln Ala Asp Glu Met Gln Arg Tyr Val
965 970 975
Glu Glu Asn Gln Thr Arg Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp
980 985 990
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995 1000 1005
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1010 1015 1020
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Leu Ile Gly Gly Glu Met Ile Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu
1040 1045 1050
Glu Val Arg Arg Lys Phe Asn Asn Gly Glu Ile Asn Phe
1055 1060 1065
<210> 58
<211> 3201
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TALEN-TCR-β1_R19 TALEN编码序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(3201)
<400> 58
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Met Ala Ser Ser Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ala Ala Ala Asp
1 5 10 15
tac aag gat gac gac gat aaa agt tgg aag gac gca agt ggt tgg tct 96
Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ser Trp Lys Asp Ala Ser Gly Trp Ser
20 25 30
aga atg cat gcg gcc ccg cga cgg cgt gct gcg caa ccc tcc gac gct 144
Arg Met His Ala Ala Pro Arg Arg Arg Ala Ala Gln Pro Ser Asp Ala
35 40 45
tcg ccg gcc gcg cag gtg gat cta cgc acg ctc ggc tac agt cag cag 192
Ser Pro Ala Ala Gln Val Asp Leu Arg Thr Leu Gly Tyr Ser Gln Gln
50 55 60
cag caa gag aag atc aaa ccg aag gtg cgt tcg aca gtg gcg cag cac 240
Gln Gln Glu Lys Ile Lys Pro Lys Val Arg Ser Thr Val Ala Gln His
65 70 75 80
cac gag gca ctg gtg ggc cat ggg ttt aca cac gcg cac atc gtt gcg 288
His Glu Ala Leu Val Gly His Gly Phe Thr His Ala His Ile Val Ala
85 90 95
ctc agc caa cac ccg gca gcg tta ggg acc gtc gct gtc acg tat cag 336
Leu Ser Gln His Pro Ala Ala Leu Gly Thr Val Ala Val Thr Tyr Gln
100 105 110
cac ata atc acg gcg ttg cca gag gcg aca cac gaa gac atc gtt ggc 384
His Ile Ile Thr Ala Leu Pro Glu Ala Thr His Glu Asp Ile Val Gly
115 120 125
gtc ggc aaa cag tgg tcc ggc gca cgc gcc ctg gag gcc ttg ctc acg 432
Val Gly Lys Gln Trp Ser Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ala Leu Leu Thr
130 135 140
gat gcg ggg gag ttg aga ggt ccg ccg tta cag ttg gac aca ggc caa 480
Asp Ala Gly Glu Leu Arg Gly Pro Pro Leu Gln Leu Asp Thr Gly Gln
145 150 155 160
ctt gtg aag att gca aaa cgt ggc ggc gtg acc gca atg gag gca gtg 528
Leu Val Lys Ile Ala Lys Arg Gly Gly Val Thr Ala Met Glu Ala Val
165 170 175
cat gca tcg cgc aat gcg ctc acg gga gca ccc ctc aac ctg acc cca 576
His Ala Ser Arg Asn Ala Leu Thr Gly Ala Pro Leu Asn Leu Thr Pro
180 185 190
gac caa gtt gtc gcg att gca agc aac aac gga ggc aaa caa gcc tta 624
Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu
195 200 205
gaa aca gtc cag aga ttg ttg ccg gtg ctg tgc caa gac cac ggc ctg 672
Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu
210 215 220
acc ccc gaa cag gtt gtc gct att gct agt aac ggc gga ggc aaa cag 720
Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln
225 230 235 240
gcg ctg gaa aca gtt cag cgc ctc ttg ccg gtc ttg tgt cag gcc cac 768
Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His
245 250 255
ggc ctg acc cca gac caa gtt gtc gcg att gca agc aac aac gga ggc 816
Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly
260 265 270
aaa caa gcc tta gaa aca gtc cag aga ttg ttg cct gtg ctg tgc caa 864
Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln
275 280 285
gcc cac ggc ctg acc cca gcc caa gtt gtc gcg att gca agc aac aac 912
Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn
290 295 300
gga ggc aaa caa gcc tta gaa aca gtc cag aga ttg ttg ccg gtg ctg 960
Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu
305 310 315 320
tgc caa gac cac ggc ctg acc cca gac caa gtt gtc gcg att gca agc 1008
Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser
325 330 335
aac aac gga ggc aaa caa gcc tta gaa aca gtc cag aga ttg ttg ccg 1056
Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro
340 345 350
gtg ctg tgc caa gac cac ggc ctg acc cca gaa cag gtt gtg gcc atc 1104
Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile
355 360 365
gcc agc aac ata ggt ggc aag cag gcc ctc gaa acc gtc cag aga ctg 1152
Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu
370 375 380
tta ccg gtt ctc tgc cag gcc cac ggc ctg acc cca gac caa gtt gtc 1200
Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val
385 390 395 400
gcg att gca agc aac aac gga ggc aaa caa gcc tta gaa aca gtc cag 1248
Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln
405 410 415
aga ttg ttg cct gtg ctg tgc caa gcc cac ggc ctg acc cca gcc cag 1296
Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln
420 425 430
gtt gtg gcc atc gcc agc aac ata ggt ggc aag cag gcc ctc gaa acc 1344
Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr
435 440 445
gtc cag aga ctg tta ccg gtt ctc tgc cag gac cac ggc ctg acc ccc 1392
Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro
450 455 460
gac cag gtt gtc gct att gct agt aac ggc gga ggc aaa cag gcg ctg 1440
Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu
465 470 475 480
gaa aca gtt cag cgc ctc ttg ccg gtc ttg tgt cag gac cac ggc ctg 1488
Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu
485 490 495
acc ccg gaa cag gtg gtt gca atc gcg tca cac gat ggg gga aag cag 1536
Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln
500 505 510
gcc cta gaa acc gtt cag cga ctc ctg ccc gtc ctg tgc cag gcc cac 1584
Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His
515 520 525
ggc ctg acc ccc gac cag gtt gtc gct att gct agt aac ggc gga ggc 1632
Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly
530 535 540
aaa cag gcg ctg gaa aca gtt cag cgc ctc ttg ccg gtc ttg tgt cag 1680
Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln
545 550 555 560
gcc cac ggc ctg acc ccg gcc cag gtg gtt gca atc gcg tca cac gat 1728
Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp
565 570 575
ggg gga aag cag gcc cta gaa acc gtt cag cga ctc ctg ccc gtc ctg 1776
Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu
580 585 590
tgc cag gac cac ggc ctg acc ccc gac cag gtt gtc gct att gct agt 1824
Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser
595 600 605
aac ggc gga ggc aaa cag gcg ctg gaa aca gtt cag cgc ctc ttg ccg 1872
Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro
610 615 620
gtc ttg tgt cag gac cac ggc ctg acc cca gaa caa gtt gtc gcg att 1920
Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile
625 630 635 640
gca agc aac aac gga ggc aaa caa gcc tta gaa aca gtc cag aga ttg 1968
Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu
645 650 655
ttg ccg gtg ctg tgc caa gcc cac ggc ctg acc ccg gac cag gtg gtt 2016
Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val
660 665 670
gca atc gcg tca cac gat ggg gga aag cag gcc cta gaa acc gtt cag 2064
Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln
675 680 685
cga ctc ctg ccc gtc ctg tgc cag gcc cac ggc ctg acc ccc gcc cag 2112
Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln
690 695 700
gtt gtc gct att gct agt aac ggc gga ggc aaa cag gcg ctg gaa aca 2160
Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr
705 710 715 720
gtt cag cgc ctc ttg ccg gtc ttg tgt cag gac cac ggc ctg acc ccc 2208
Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro
725 730 735
gac cag gtt gtc gct att gct agt aac ggc gga ggc aaa cag gcg ctg 2256
Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu
740 745 750
gaa aca gtt cag cgc ctc ttg ccg gtc ttg tgt cag gac cac ggc ctg 2304
Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu
755 760 765
acc ccg gaa cag gtg gtt gca atc gcg tca cac gat ggg gga aag cag 2352
Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln
770 775 780
gcc cta gaa acc gtt cag cga ctc ctg ccc gtc ctg tgc cag gcc cac 2400
Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His
785 790 795 800
ggc ctg acg cct gag cag gta gtg gct att gca tcc aac gga ggg ggc 2448
Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly
805 810 815
aga ccc gca ctg gag tca atc gtg gcc cag ctt tcg agg ccg gac ccc 2496
Arg Pro Ala Leu Glu Ser Ile Val Ala Gln Leu Ser Arg Pro Asp Pro
820 825 830
gcg ctg gcc gca ctc act aat gat cat ctt gta gcg ctg gcc tgc ctc 2544
Ala Leu Ala Ala Leu Thr Asn Asp His Leu Val Ala Leu Ala Cys Leu
835 840 845
ggc gga cgt cct gcc atg gat gca gtg aaa aag gga ttg ccg cac gcg 2592
Gly Gly Arg Pro Ala Met Asp Ala Val Lys Lys Gly Leu Pro His Ala
850 855 860
ccg gaa ttg atc aga tcc cag cta gtg aaa tct gaa ttg gaa gag aag 2640
Pro Glu Leu Ile Arg Ser Gln Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys
865 870 875 880
aaa tct gaa ctt aga cat aaa ttg aaa tat gtg cca cat gaa tat att 2688
Lys Ser Glu Leu Arg His Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile
885 890 895
gaa ttg att gaa atc gca aga aat tca act cag gat aga atc ctt gaa 2736
Glu Leu Ile Glu Ile Ala Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu
900 905 910
atg aag gtg atg gag ttc ttt atg aag gtt tat ggt tat cgt ggt aaa 2784
Met Lys Val Met Glu Phe Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys
915 920 925
cat ttg ggt gga tca agg aaa cca gac gga gca att tat act gtc gga 2832
His Leu Gly Gly Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly
930 935 940
tct cct att gat tac ggt gtg atc gtt gat act aag gca tat tca gga 2880
Ser Pro Ile Asp Tyr Gly Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly
945 950 955 960
ggt tat aat ctt cca att ggt caa gca gat gaa atg caa aga tat gtc 2928
Gly Tyr Asn Leu Pro Ile Gly Gln Ala Asp Glu Met Gln Arg Tyr Val
965 970 975
gaa gag aat caa aca aga aac aag cat atc aac cct aat gaa tgg tgg 2976
Glu Glu Asn Gln Thr Arg Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp
980 985 990
aaa gtc tat cca tct tca gta aca gaa ttt aag ttc ttg ttt gtg agt 3024
Lys Val Tyr Pro Ser Ser Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser
995 1000 1005
ggt cat ttc aaa gga aac tac aaa gct cag ctt aca aga ttg aat 3069
Gly His Phe Lys Gly Asn Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn
1010 1015 1020
cat atc act aat tgt aat gga gct gtt ctt agt gta gaa gag ctt 3114
His Ile Thr Asn Cys Asn Gly Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu
1025 1030 1035
ttg att ggt gga gaa atg att aaa gct ggt aca ttg aca ctt gag 3159
Leu Ile Gly Gly Glu Met Ile Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu
1040 1045 1050
gaa gtg aga agg aaa ttt aat aac ggt gag ata aac ttt taa 3201
Glu Val Arg Arg Lys Phe Asn Asn Gly Glu Ile Asn Phe
1055 1060 1065
<210> 59
<211> 1066
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 59
Met Ala Ser Ser Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ala Ala Ala Asp
1 5 10 15
Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ser Trp Lys Asp Ala Ser Gly Trp Ser
20 25 30
Arg Met His Ala Ala Pro Arg Arg Arg Ala Ala Gln Pro Ser Asp Ala
35 40 45
Ser Pro Ala Ala Gln Val Asp Leu Arg Thr Leu Gly Tyr Ser Gln Gln
50 55 60
Gln Gln Glu Lys Ile Lys Pro Lys Val Arg Ser Thr Val Ala Gln His
65 70 75 80
His Glu Ala Leu Val Gly His Gly Phe Thr His Ala His Ile Val Ala
85 90 95
Leu Ser Gln His Pro Ala Ala Leu Gly Thr Val Ala Val Thr Tyr Gln
100 105 110
His Ile Ile Thr Ala Leu Pro Glu Ala Thr His Glu Asp Ile Val Gly
115 120 125
Val Gly Lys Gln Trp Ser Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ala Leu Leu Thr
130 135 140
Asp Ala Gly Glu Leu Arg Gly Pro Pro Leu Gln Leu Asp Thr Gly Gln
145 150 155 160
Leu Val Lys Ile Ala Lys Arg Gly Gly Val Thr Ala Met Glu Ala Val
165 170 175
His Ala Ser Arg Asn Ala Leu Thr Gly Ala Pro Leu Asn Leu Thr Pro
180 185 190
Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu
195 200 205
Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu
210 215 220
Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln
225 230 235 240
Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His
245 250 255
Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly
260 265 270
Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln
275 280 285
Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn
290 295 300
Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu
305 310 315 320
Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser
325 330 335
Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro
340 345 350
Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile
355 360 365
Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu
370 375 380
Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val
385 390 395 400
Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln
405 410 415
Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln
420 425 430
Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr
435 440 445
Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro
450 455 460
Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu
465 470 475 480
Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu
485 490 495
Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln
500 505 510
Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His
515 520 525
Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly
530 535 540
Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln
545 550 555 560
Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp
565 570 575
Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu
580 585 590
Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser
595 600 605
Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro
610 615 620
Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile
625 630 635 640
Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu
645 650 655
Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val
660 665 670
Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln
675 680 685
Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln
690 695 700
Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr
705 710 715 720
Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro
725 730 735
Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu
740 745 750
Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu
755 760 765
Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln
770 775 780
Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His
785 790 795 800
Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly
805 810 815
Arg Pro Ala Leu Glu Ser Ile Val Ala Gln Leu Ser Arg Pro Asp Pro
820 825 830
Ala Leu Ala Ala Leu Thr Asn Asp His Leu Val Ala Leu Ala Cys Leu
835 840 845
Gly Gly Arg Pro Ala Met Asp Ala Val Lys Lys Gly Leu Pro His Ala
850 855 860
Pro Glu Leu Ile Arg Ser Gln Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys
865 870 875 880
Lys Ser Glu Leu Arg His Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile
885 890 895
Glu Leu Ile Glu Ile Ala Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu
900 905 910
Met Lys Val Met Glu Phe Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys
915 920 925
His Leu Gly Gly Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly
930 935 940
Ser Pro Ile Asp Tyr Gly Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly
945 950 955 960
Gly Tyr Asn Leu Pro Ile Gly Gln Ala Asp Glu Met Gln Arg Tyr Val
965 970 975
Glu Glu Asn Gln Thr Arg Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp
980 985 990
Lys Val Tyr Pro Ser Ser Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser
995 1000 1005
Gly His Phe Lys Gly Asn Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn
1010 1015 1020
His Ile Thr Asn Cys Asn Gly Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu
1025 1030 1035
Leu Ile Gly Gly Glu Met Ile Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu
1040 1045 1050
Glu Val Arg Arg Lys Phe Asn Asn Gly Glu Ile Asn Phe
1055 1060 1065
<210> 60
<211> 3201
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TALEN-TCR-β3_L19 TALEN编码序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(3201)
<400> 60
atg gct tcc tcc cct cca aag aaa aag aga aag gtt gcg gcc gct gac 48
Met Ala Ser Ser Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ala Ala Ala Asp
1 5 10 15
tac aag gat gac gac gat aaa agt tgg aag gac gca agt ggt tgg tct 96
Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ser Trp Lys Asp Ala Ser Gly Trp Ser
20 25 30
aga atg cat gcg gcc ccg cga cgg cgt gct gcg caa ccc tcc gac gct 144
Arg Met His Ala Ala Pro Arg Arg Arg Ala Ala Gln Pro Ser Asp Ala
35 40 45
tcg ccg gcc gcg cag gtg gat cta cgc acg ctc ggc tac agt cag cag 192
Ser Pro Ala Ala Gln Val Asp Leu Arg Thr Leu Gly Tyr Ser Gln Gln
50 55 60
cag caa gag aag atc aaa ccg aag gtg cgt tcg aca gtg gcg cag cac 240
Gln Gln Glu Lys Ile Lys Pro Lys Val Arg Ser Thr Val Ala Gln His
65 70 75 80
cac gag gca ctg gtg ggc cat ggg ttt aca cac gcg cac atc gtt gcg 288
His Glu Ala Leu Val Gly His Gly Phe Thr His Ala His Ile Val Ala
85 90 95
ctc agc caa cac ccg gca gcg tta ggg acc gtc gct gtc acg tat cag 336
Leu Ser Gln His Pro Ala Ala Leu Gly Thr Val Ala Val Thr Tyr Gln
100 105 110
cac ata atc acg gcg ttg cca gag gcg aca cac gaa gac atc gtt ggc 384
His Ile Ile Thr Ala Leu Pro Glu Ala Thr His Glu Asp Ile Val Gly
115 120 125
gtc ggc aaa cag tgg tcc ggc gca cgc gcc ctg gag gcc ttg ctc acg 432
Val Gly Lys Gln Trp Ser Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ala Leu Leu Thr
130 135 140
gat gcg ggg gag ttg aga ggt ccg ccg tta cag ttg gac aca ggc caa 480
Asp Ala Gly Glu Leu Arg Gly Pro Pro Leu Gln Leu Asp Thr Gly Gln
145 150 155 160
ctt gtg aag att gca aaa cgt ggc ggc gtg acc gca atg gag gca gtg 528
Leu Val Lys Ile Ala Lys Arg Gly Gly Val Thr Ala Met Glu Ala Val
165 170 175
cat gca tcg cgc aat gcg ctc acg gga gca ccc ctc aac ctg acc cca 576
His Ala Ser Arg Asn Ala Leu Thr Gly Ala Pro Leu Asn Leu Thr Pro
180 185 190
gac caa gtt gtc gcg att gca agc aac aac gga ggc aaa caa gcc tta 624
Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu
195 200 205
gaa aca gtc cag aga ttg ttg ccg gtg ctg tgc caa gac cac ggc ctg 672
Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu
210 215 220
acc ccc gaa cag gtt gtc gct att gct agt aac ggc gga ggc aaa cag 720
Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln
225 230 235 240
gcg ctg gaa aca gtt cag cgc ctc ttg ccg gtc ttg tgt cag gcc cac 768
Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His
245 250 255
ggc ctg acc cca gac caa gtt gtc gcg att gca agc aac aac gga ggc 816
Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly
260 265 270
aaa caa gcc tta gaa aca gtc cag aga ttg ttg cct gtg ctg tgc caa 864
Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln
275 280 285
gcc cac ggc ctg acc ccg gcc cag gtg gtt gca atc gcg tca cac gat 912
Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp
290 295 300
ggg gga aag cag gcc cta gaa acc gtt cag cga ctc ctg ccc gtc ctg 960
Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu
305 310 315 320
tgc cag gac cac ggc ctg acc ccg gac cag gtg gtt gca atc gcg tca 1008
Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser
325 330 335
cac gat ggg gga aag cag gcc cta gaa acc gtt cag cga ctc ctg ccc 1056
His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro
340 345 350
gtc ctg tgc cag gac cac ggc ctg acc ccc gaa cag gtt gtc gct att 1104
Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile
355 360 365
gct agt aac ggc gga ggc aaa cag gcg ctg gaa aca gtt cag cgc ctc 1152
Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu
370 375 380
ttg ccg gtc ttg tgt cag gcc cac ggc ctg acc cca gac caa gtt gtc 1200
Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val
385 390 395 400
gcg att gca agc aac aac gga ggc aaa caa gcc tta gaa aca gtc cag 1248
Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln
405 410 415
aga ttg ttg cct gtg ctg tgc caa gcc cac ggc ctg acc cca gcc caa 1296
Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln
420 425 430
gtt gtc gcg att gca agc aac aac gga ggc aaa caa gcc tta gaa aca 1344
Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr
435 440 445
gtc cag aga ttg ttg ccg gtg ctg tgc caa gac cac ggc ctg acc ccg 1392
Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro
450 455 460
gac cag gtg gtt gca atc gcg tca cac gat ggg gga aag cag gcc cta 1440
Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu
465 470 475 480
gaa acc gtt cag cga ctc ctg ccc gtc ctg tgc cag gac cac ggc ctg 1488
Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu
485 490 495
acc ccg gaa cag gtg gtt gca atc gcg tca cac gat ggg gga aag cag 1536
Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln
500 505 510
gcc cta gaa acc gtt cag cga ctc ctg ccc gtc ctg tgc cag gcc cac 1584
Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His
515 520 525
ggc ctg acc cca gac cag gtt gtg gcc atc gcc agc aac ata ggt ggc 1632
Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly
530 535 540
aag cag gcc ctc gaa acc gtc cag aga ctg tta ccg gtt ctc tgc cag 1680
Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln
545 550 555 560
gcc cac ggc ctg acc ccg gcc cag gtg gtt gca atc gcg tca cac gat 1728
Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp
565 570 575
ggg gga aag cag gcc cta gaa acc gtt cag cga ctc ctg ccc gtc ctg 1776
Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu
580 585 590
tgc cag gac cac ggc ctg acc cca gac cag gtt gtg gcc atc gcc agc 1824
Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser
595 600 605
aac ata ggt ggc aag cag gcc ctc gaa acc gtc cag aga ctg tta ccg 1872
Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro
610 615 620
gtt ctc tgc cag gac cac ggc ctg acc cca gaa caa gtt gtc gcg att 1920
Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile
625 630 635 640
gca agc aac aac gga ggc aaa caa gcc tta gaa aca gtc cag aga ttg 1968
Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu
645 650 655
ttg ccg gtg ctg tgc caa gcc cac ggc ctg acc cca gac caa gtt gtc 2016
Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val
660 665 670
gcg att gca agc aac aac gga ggc aaa caa gcc tta gaa aca gtc cag 2064
Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln
675 680 685
aga ttg ttg cct gtg ctg tgc caa gcc cac ggc ctg acc ccg gcc cag 2112
Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln
690 695 700
gtg gtt gca atc gcg tca cac gat ggg gga aag cag gcc cta gaa acc 2160
Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr
705 710 715 720
gtt cag cga ctc ctg ccc gtc ctg tgc cag gac cac ggc ctg acc ccc 2208
Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro
725 730 735
gac cag gtt gtc gct att gct agt aac ggc gga ggc aaa cag gcg ctg 2256
Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu
740 745 750
gaa aca gtt cag cgc ctc ttg ccg gtc ttg tgt cag gac cac ggc ctg 2304
Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu
755 760 765
acc ccc gaa cag gtt gtc gct att gct agt aac ggc gga ggc aaa cag 2352
Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln
770 775 780
gcg ctg gaa aca gtt cag cgc ctc ttg ccg gtc ttg tgt cag gcc cac 2400
Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His
785 790 795 800
ggc ctg acg cct gag cag gta gtg gct att gca tcc cac gac ggg ggc 2448
Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly
805 810 815
aga ccc gca ctg gag tca atc gtg gcc cag ctt tcg agg ccg gac ccc 2496
Arg Pro Ala Leu Glu Ser Ile Val Ala Gln Leu Ser Arg Pro Asp Pro
820 825 830
gcg ctg gcc gca ctc act aat gat cat ctt gta gcg ctg gcc tgc ctc 2544
Ala Leu Ala Ala Leu Thr Asn Asp His Leu Val Ala Leu Ala Cys Leu
835 840 845
ggc gga cgt cct gcc atg gat gca gtg aaa aag gga ttg ccg cac gcg 2592
Gly Gly Arg Pro Ala Met Asp Ala Val Lys Lys Gly Leu Pro His Ala
850 855 860
ccg gaa ttg atc aga tcc cag cta gtg aaa tct gaa ttg gaa gag aag 2640
Pro Glu Leu Ile Arg Ser Gln Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys
865 870 875 880
aaa tct gaa ctt aga cat aaa ttg aaa tat gtg cca cat gaa tat att 2688
Lys Ser Glu Leu Arg His Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile
885 890 895
gaa ttg att gaa atc gca aga aat tca act cag gat aga atc ctt gaa 2736
Glu Leu Ile Glu Ile Ala Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu
900 905 910
atg aag gtg atg gag ttc ttt atg aag gtt tat ggt tat cgt ggt aaa 2784
Met Lys Val Met Glu Phe Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys
915 920 925
cat ttg ggt gga tca agg aaa cca gac gga gca att tat act gtc gga 2832
His Leu Gly Gly Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly
930 935 940
tct cct att gat tac ggt gtg atc gtt gat act aag gca tat tca gga 2880
Ser Pro Ile Asp Tyr Gly Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly
945 950 955 960
ggt tat aat ctt cca att ggt caa gca gat gaa atg caa aga tat gtc 2928
Gly Tyr Asn Leu Pro Ile Gly Gln Ala Asp Glu Met Gln Arg Tyr Val
965 970 975
gaa gag aat caa aca aga aac aag cat atc aac cct aat gaa tgg tgg 2976
Glu Glu Asn Gln Thr Arg Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp
980 985 990
aaa gtc tat cca tct tca gta aca gaa ttt aag ttc ttg ttt gtg agt 3024
Lys Val Tyr Pro Ser Ser Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser
995 1000 1005
ggt cat ttc aaa gga aac tac aaa gct cag ctt aca aga ttg aat 3069
Gly His Phe Lys Gly Asn Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn
1010 1015 1020
cat atc act aat tgt aat gga gct gtt ctt agt gta gaa gag ctt 3114
His Ile Thr Asn Cys Asn Gly Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu
1025 1030 1035
ttg att ggt gga gaa atg att aaa gct ggt aca ttg aca ctt gag 3159
Leu Ile Gly Gly Glu Met Ile Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu
1040 1045 1050
gaa gtg aga agg aaa ttt aat aac ggt gag ata aac ttt taa 3201
Glu Val Arg Arg Lys Phe Asn Asn Gly Glu Ile Asn Phe
1055 1060 1065
<210> 61
<211> 1066
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 61
Met Ala Ser Ser Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ala Ala Ala Asp
1 5 10 15
Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ser Trp Lys Asp Ala Ser Gly Trp Ser
20 25 30
Arg Met His Ala Ala Pro Arg Arg Arg Ala Ala Gln Pro Ser Asp Ala
35 40 45
Ser Pro Ala Ala Gln Val Asp Leu Arg Thr Leu Gly Tyr Ser Gln Gln
50 55 60
Gln Gln Glu Lys Ile Lys Pro Lys Val Arg Ser Thr Val Ala Gln His
65 70 75 80
His Glu Ala Leu Val Gly His Gly Phe Thr His Ala His Ile Val Ala
85 90 95
Leu Ser Gln His Pro Ala Ala Leu Gly Thr Val Ala Val Thr Tyr Gln
100 105 110
His Ile Ile Thr Ala Leu Pro Glu Ala Thr His Glu Asp Ile Val Gly
115 120 125
Val Gly Lys Gln Trp Ser Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ala Leu Leu Thr
130 135 140
Asp Ala Gly Glu Leu Arg Gly Pro Pro Leu Gln Leu Asp Thr Gly Gln
145 150 155 160
Leu Val Lys Ile Ala Lys Arg Gly Gly Val Thr Ala Met Glu Ala Val
165 170 175
His Ala Ser Arg Asn Ala Leu Thr Gly Ala Pro Leu Asn Leu Thr Pro
180 185 190
Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu
195 200 205
Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu
210 215 220
Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln
225 230 235 240
Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His
245 250 255
Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly
260 265 270
Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln
275 280 285
Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp
290 295 300
Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu
305 310 315 320
Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser
325 330 335
His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro
340 345 350
Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile
355 360 365
Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu
370 375 380
Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val
385 390 395 400
Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln
405 410 415
Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln
420 425 430
Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr
435 440 445
Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro
450 455 460
Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu
465 470 475 480
Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu
485 490 495
Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln
500 505 510
Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His
515 520 525
Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly
530 535 540
Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln
545 550 555 560
Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp
565 570 575
Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu
580 585 590
Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser
595 600 605
Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro
610 615 620
Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile
625 630 635 640
Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu
645 650 655
Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val
660 665 670
Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln
675 680 685
Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln
690 695 700
Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr
705 710 715 720
Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro
725 730 735
Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu
740 745 750
Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu
755 760 765
Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln
770 775 780
Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His
785 790 795 800
Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly
805 810 815
Arg Pro Ala Leu Glu Ser Ile Val Ala Gln Leu Ser Arg Pro Asp Pro
820 825 830
Ala Leu Ala Ala Leu Thr Asn Asp His Leu Val Ala Leu Ala Cys Leu
835 840 845
Gly Gly Arg Pro Ala Met Asp Ala Val Lys Lys Gly Leu Pro His Ala
850 855 860
Pro Glu Leu Ile Arg Ser Gln Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys
865 870 875 880
Lys Ser Glu Leu Arg His Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile
885 890 895
Glu Leu Ile Glu Ile Ala Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu
900 905 910
Met Lys Val Met Glu Phe Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys
915 920 925
His Leu Gly Gly Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly
930 935 940
Ser Pro Ile Asp Tyr Gly Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly
945 950 955 960
Gly Tyr Asn Leu Pro Ile Gly Gln Ala Asp Glu Met Gln Arg Tyr Val
965 970 975
Glu Glu Asn Gln Thr Arg Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp
980 985 990
Lys Val Tyr Pro Ser Ser Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser
995 1000 1005
Gly His Phe Lys Gly Asn Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn
1010 1015 1020
His Ile Thr Asn Cys Asn Gly Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu
1025 1030 1035
Leu Ile Gly Gly Glu Met Ile Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu
1040 1045 1050
Glu Val Arg Arg Lys Phe Asn Asn Gly Glu Ile Asn Phe
1055 1060 1065
<210> 62
<211> 3201
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TALEN-TCR-β3_R19 TALEN编码序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(3201)
<400> 62
atg gct tcc tcc cct cca aag aaa aag aga aag gtt gcg gcc gct gac 48
Met Ala Ser Ser Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ala Ala Ala Asp
1 5 10 15
tac aag gat gac gac gat aaa agt tgg aag gac gca agt ggt tgg tct 96
Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ser Trp Lys Asp Ala Ser Gly Trp Ser
20 25 30
aga atg cat gcg gcc ccg cga cgg cgt gct gcg caa ccc tcc gac gct 144
Arg Met His Ala Ala Pro Arg Arg Arg Ala Ala Gln Pro Ser Asp Ala
35 40 45
tcg ccg gcc gcg cag gtg gat cta cgc acg ctc ggc tac agt cag cag 192
Ser Pro Ala Ala Gln Val Asp Leu Arg Thr Leu Gly Tyr Ser Gln Gln
50 55 60
cag caa gag aag atc aaa ccg aag gtg cgt tcg aca gtg gcg cag cac 240
Gln Gln Glu Lys Ile Lys Pro Lys Val Arg Ser Thr Val Ala Gln His
65 70 75 80
cac gag gca ctg gtg ggc cat ggg ttt aca cac gcg cac atc gtt gcg 288
His Glu Ala Leu Val Gly His Gly Phe Thr His Ala His Ile Val Ala
85 90 95
ctc agc caa cac ccg gca gcg tta ggg acc gtc gct gtc acg tat cag 336
Leu Ser Gln His Pro Ala Ala Leu Gly Thr Val Ala Val Thr Tyr Gln
100 105 110
cac ata atc acg gcg ttg cca gag gcg aca cac gaa gac atc gtt ggc 384
His Ile Ile Thr Ala Leu Pro Glu Ala Thr His Glu Asp Ile Val Gly
115 120 125
gtc ggc aaa cag tgg tcc ggc gca cgc gcc ctg gag gcc ttg ctc acg 432
Val Gly Lys Gln Trp Ser Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ala Leu Leu Thr
130 135 140
gat gcg ggg gag ttg aga ggt ccg ccg tta cag ttg gac aca ggc caa 480
Asp Ala Gly Glu Leu Arg Gly Pro Pro Leu Gln Leu Asp Thr Gly Gln
145 150 155 160
ctt gtg aag att gca aaa cgt ggc ggc gtg acc gca atg gag gca gtg 528
Leu Val Lys Ile Ala Lys Arg Gly Gly Val Thr Ala Met Glu Ala Val
165 170 175
cat gca tcg cgc aat gcg ctc acg gga gca ccc ctc aac ctg acc ccg 576
His Ala Ser Arg Asn Ala Leu Thr Gly Ala Pro Leu Asn Leu Thr Pro
180 185 190
gac cag gtg gtt gca atc gcg tca cac gat ggg gga aag cag gcc cta 624
Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu
195 200 205
gaa acc gtt cag cga ctc ctg ccc gtc ctg tgc cag gac cac ggc ctg 672
Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu
210 215 220
acc cca gaa cag gtt gtg gcc atc gcc agc aac ata ggt ggc aag cag 720
Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln
225 230 235 240
gcc ctc gaa acc gtc cag aga ctg tta ccg gtt ctc tgc cag gcc cac 768
Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His
245 250 255
ggc ctg acc ccg gac cag gtg gtt gca atc gcg tca cac gat ggg gga 816
Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly
260 265 270
aag cag gcc cta gaa acc gtt cag cga ctc ctg ccc gtc ctg tgc cag 864
Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln
275 280 285
gcc cac ggc ctg acc ccg gcc cag gtg gtt gca atc gcg tca cac gat 912
Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp
290 295 300
ggg gga aag cag gcc cta gaa acc gtt cag cga ctc ctg ccc gtc ctg 960
Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu
305 310 315 320
tgc cag gac cac ggc ctg acc ccg gac cag gtg gtt gca atc gcg tca 1008
Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser
325 330 335
cac gat ggg gga aag cag gcc cta gaa acc gtt cag cga ctc ctg ccc 1056
His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro
340 345 350
gtc ctg tgc cag gac cac ggc ctg acc cca gaa cag gtt gtg gcc atc 1104
Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile
355 360 365
gcc agc aac ata ggt ggc aag cag gcc ctc gaa acc gtc cag aga ctg 1152
Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu
370 375 380
tta ccg gtt ctc tgc cag gcc cac ggc ctg acc ccg gac cag gtg gtt 1200
Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val
385 390 395 400
gca atc gcg tca cac gat ggg gga aag cag gcc cta gaa acc gtt cag 1248
Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln
405 410 415
cga ctc ctg ccc gtc ctg tgc cag gcc cac ggc ctg acc ccg gcc cag 1296
Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln
420 425 430
gtg gtt gca atc gcg tca cac gat ggg gga aag cag gcc cta gaa acc 1344
Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr
435 440 445
gtt cag cga ctc ctg ccc gtc ctg tgc cag gac cac ggc ctg acc cca 1392
Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro
450 455 460
gac cag gtt gtg gcc atc gcc agc aac ata ggt ggc aag cag gcc ctc 1440
Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu
465 470 475 480
gaa acc gtc cag aga ctg tta ccg gtt ctc tgc cag gac cac ggc ctg 1488
Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu
485 490 495
acc cca gaa caa gtt gtc gcg att gca agc aac aac gga ggc aaa caa 1536
Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln
500 505 510
gcc tta gaa aca gtc cag aga ttg ttg ccg gtg ctg tgc caa gcc cac 1584
Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His
515 520 525
ggc ctg acc ccg gac cag gtg gtt gca atc gcg tca cac gat ggg gga 1632
Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly
530 535 540
aag cag gcc cta gaa acc gtt cag cga ctc ctg ccc gtc ctg tgc cag 1680
Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln
545 550 555 560
gcc cac ggc ctg acc ccc gcc cag gtt gtc gct att gct agt aac ggc 1728
Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly
565 570 575
gga ggc aaa cag gcg ctg gaa aca gtt cag cgc ctc ttg ccg gtc ttg 1776
Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu
580 585 590
tgt cag gac cac ggc ctg acc ccg gac cag gtg gtt gca atc gcg tca 1824
Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser
595 600 605
cac gat ggg gga aag cag gcc cta gaa acc gtt cag cga ctc ctg ccc 1872
His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro
610 615 620
gtc ctg tgc cag gac cac ggc ctg acc cca gaa cag gtt gtg gcc atc 1920
Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile
625 630 635 640
gcc agc aac ata ggt ggc aag cag gcc ctc gaa acc gtc cag aga ctg 1968
Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu
645 650 655
tta ccg gtt ctc tgc cag gcc cac ggc ctg acc cca gac caa gtt gtc 2016
Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val
660 665 670
gcg att gca agc aac aac gga ggc aaa caa gcc tta gaa aca gtc cag 2064
Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln
675 680 685
aga ttg ttg cct gtg ctg tgc caa gcc cac ggc ctg acc ccg gcc cag 2112
Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln
690 695 700
gtg gtt gca atc gcg tca cac gat ggg gga aag cag gcc cta gaa acc 2160
Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr
705 710 715 720
gtt cag cga ctc ctg ccc gtc ctg tgc cag gac cac ggc ctg acc ccc 2208
Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro
725 730 735
gac cag gtt gtc gct att gct agt aac ggc gga ggc aaa cag gcg ctg 2256
Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu
740 745 750
gaa aca gtt cag cgc ctc ttg ccg gtc ttg tgt cag gac cac ggc ctg 2304
Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu
755 760 765
acc ccg gaa cag gtg gtt gca atc gcg tca cac gat ggg gga aag cag 2352
Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln
770 775 780
gcc cta gaa acc gtt cag cga ctc ctg ccc gtc ctg tgc cag gcc cac 2400
Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His
785 790 795 800
ggc ctg acg cct gag cag gta gtg gct att gca tcc cac gac ggg ggc 2448
Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly
805 810 815
aga ccc gca ctg gag tca atc gtg gcc cag ctt tcg agg ccg gac ccc 2496
Arg Pro Ala Leu Glu Ser Ile Val Ala Gln Leu Ser Arg Pro Asp Pro
820 825 830
gcg ctg gcc gca ctc act aat gat cat ctt gta gcg ctg gcc tgc ctc 2544
Ala Leu Ala Ala Leu Thr Asn Asp His Leu Val Ala Leu Ala Cys Leu
835 840 845
ggc gga cgt cct gcc atg gat gca gtg aaa aag gga ttg ccg cac gcg 2592
Gly Gly Arg Pro Ala Met Asp Ala Val Lys Lys Gly Leu Pro His Ala
850 855 860
ccg gaa ttg atc aga tcc cag cta gtg aaa tct gaa ttg gaa gag aag 2640
Pro Glu Leu Ile Arg Ser Gln Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys
865 870 875 880
aaa tct gaa ctt aga cat aaa ttg aaa tat gtg cca cat gaa tat att 2688
Lys Ser Glu Leu Arg His Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile
885 890 895
gaa ttg att gaa atc gca aga aat tca act cag gat aga atc ctt gaa 2736
Glu Leu Ile Glu Ile Ala Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu
900 905 910
atg aag gtg atg gag ttc ttt atg aag gtt tat ggt tat cgt ggt aaa 2784
Met Lys Val Met Glu Phe Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys
915 920 925
cat ttg ggt gga tca agg aaa cca gac gga gca att tat act gtc gga 2832
His Leu Gly Gly Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly
930 935 940
tct cct att gat tac ggt gtg atc gtt gat act aag gca tat tca gga 2880
Ser Pro Ile Asp Tyr Gly Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly
945 950 955 960
ggt tat aat ctt cca att ggt caa gca gat gaa atg caa aga tat gtc 2928
Gly Tyr Asn Leu Pro Ile Gly Gln Ala Asp Glu Met Gln Arg Tyr Val
965 970 975
gaa gag aat caa aca aga aac aag cat atc aac cct aat gaa tgg tgg 2976
Glu Glu Asn Gln Thr Arg Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp
980 985 990
aaa gtc tat cca tct tca gta aca gaa ttt aag ttc ttg ttt gtg agt 3024
Lys Val Tyr Pro Ser Ser Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser
995 1000 1005
ggt cat ttc aaa gga aac tac aaa gct cag ctt aca aga ttg aat 3069
Gly His Phe Lys Gly Asn Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn
1010 1015 1020
cat atc act aat tgt aat gga gct gtt ctt agt gta gaa gag ctt 3114
His Ile Thr Asn Cys Asn Gly Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu
1025 1030 1035
ttg att ggt gga gaa atg att aaa gct ggt aca ttg aca ctt gag 3159
Leu Ile Gly Gly Glu Met Ile Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu
1040 1045 1050
gaa gtg aga agg aaa ttt aat aac ggt gag ata aac ttt taa 3201
Glu Val Arg Arg Lys Phe Asn Asn Gly Glu Ile Asn Phe
1055 1060 1065
<210> 63
<211> 1066
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 63
Met Ala Ser Ser Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ala Ala Ala Asp
1 5 10 15
Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ser Trp Lys Asp Ala Ser Gly Trp Ser
20 25 30
Arg Met His Ala Ala Pro Arg Arg Arg Ala Ala Gln Pro Ser Asp Ala
35 40 45
Ser Pro Ala Ala Gln Val Asp Leu Arg Thr Leu Gly Tyr Ser Gln Gln
50 55 60
Gln Gln Glu Lys Ile Lys Pro Lys Val Arg Ser Thr Val Ala Gln His
65 70 75 80
His Glu Ala Leu Val Gly His Gly Phe Thr His Ala His Ile Val Ala
85 90 95
Leu Ser Gln His Pro Ala Ala Leu Gly Thr Val Ala Val Thr Tyr Gln
100 105 110
His Ile Ile Thr Ala Leu Pro Glu Ala Thr His Glu Asp Ile Val Gly
115 120 125
Val Gly Lys Gln Trp Ser Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ala Leu Leu Thr
130 135 140
Asp Ala Gly Glu Leu Arg Gly Pro Pro Leu Gln Leu Asp Thr Gly Gln
145 150 155 160
Leu Val Lys Ile Ala Lys Arg Gly Gly Val Thr Ala Met Glu Ala Val
165 170 175
His Ala Ser Arg Asn Ala Leu Thr Gly Ala Pro Leu Asn Leu Thr Pro
180 185 190
Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu
195 200 205
Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu
210 215 220
Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln
225 230 235 240
Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His
245 250 255
Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly
260 265 270
Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln
275 280 285
Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp
290 295 300
Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu
305 310 315 320
Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser
325 330 335
His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro
340 345 350
Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile
355 360 365
Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu
370 375 380
Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val
385 390 395 400
Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln
405 410 415
Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln
420 425 430
Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr
435 440 445
Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro
450 455 460
Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu
465 470 475 480
Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu
485 490 495
Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln
500 505 510
Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His
515 520 525
Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly
530 535 540
Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln
545 550 555 560
Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly
565 570 575
Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu
580 585 590
Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser
595 600 605
His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro
610 615 620
Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile
625 630 635 640
Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu
645 650 655
Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val
660 665 670
Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln
675 680 685
Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln
690 695 700
Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr
705 710 715 720
Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro
725 730 735
Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu
740 745 750
Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu
755 760 765
Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln
770 775 780
Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His
785 790 795 800
Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly
805 810 815
Arg Pro Ala Leu Glu Ser Ile Val Ala Gln Leu Ser Arg Pro Asp Pro
820 825 830
Ala Leu Ala Ala Leu Thr Asn Asp His Leu Val Ala Leu Ala Cys Leu
835 840 845
Gly Gly Arg Pro Ala Met Asp Ala Val Lys Lys Gly Leu Pro His Ala
850 855 860
Pro Glu Leu Ile Arg Ser Gln Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys
865 870 875 880
Lys Ser Glu Leu Arg His Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile
885 890 895
Glu Leu Ile Glu Ile Ala Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu
900 905 910
Met Lys Val Met Glu Phe Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys
915 920 925
His Leu Gly Gly Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly
930 935 940
Ser Pro Ile Asp Tyr Gly Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly
945 950 955 960
Gly Tyr Asn Leu Pro Ile Gly Gln Ala Asp Glu Met Gln Arg Tyr Val
965 970 975
Glu Glu Asn Gln Thr Arg Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp
980 985 990
Lys Val Tyr Pro Ser Ser Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser
995 1000 1005
Gly His Phe Lys Gly Asn Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn
1010 1015 1020
His Ile Thr Asn Cys Asn Gly Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu
1025 1030 1035
Leu Ile Gly Gly Glu Met Ile Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu
1040 1045 1050
Glu Val Arg Arg Lys Phe Asn Asn Gly Glu Ile Asn Phe
1055 1060 1065
<210> 64
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR-α2-f引物
<400> 64
ctctgcatga ctcactagca ctctat 26
<210> 65
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR-α2-r引物
<400> 65
gactgactta gtgagctggg aaagat 26
<210> 66
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR-β1-c1-f引物
<400> 66
ctaatatgtg tcactacccc acgag 25
<210> 67
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR-β1-c1-r引物
<400> 67
gagagttaca caggccacat agaaag 26
<210> 68
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR-β1-c2-f引物
<400> 68
gaggagacat cacctggaat gttag 25
<210> 69
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR-β1-c2-r引物
<400> 69
gatatattag gctgtgctct ggctct 26
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Va克隆用正向引物
<400> 70
tggaggagaa ccctggacct 20
<210> 71
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Va克隆用反向引物
<400> 71
ggtgaatagg cagacagact t 21
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ca克隆用正向引物
<400> 72
gagactctaa atccagtgac 20
<210> 73
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ca克隆用反向引物
<400> 73
gggggcggaa tttacgtagc ggccgctcag ctgct 35
<210> 74
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Vb克隆用正向引物
<400> 74
tgccggatct agctagttaa ttaaggatcc gaattcctgc agg 43
<210> 75
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Vb克隆用反向引物
<400> 75
ttcacccacc agctcagctc 20
<210> 76
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cb克隆用正向引物
<400> 76
ttcacccacc agctcagctc 20
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cb克隆用反向引物
<400> 77
aggtccaggg ttctcctcca 20
<210> 78
<211> 141
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 引入用TCRα恒定区
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是任意天然氨基酸
<400> 78
Xaa Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys
1 5 10 15
Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr
20 25 30
Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr
35 40 45
Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala
50 55 60
Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser
65 70 75 80
Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp
85 90 95
Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe
100 105 110
Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala
115 120 125
Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
130 135 140
<210> 79
<211> 177
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 引入用TCRβ恒定区
<400> 79
Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro
1 5 10 15
Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
20 25 30
Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn
35 40 45
Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys
50 55 60
Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu
65 70 75 80
Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys
85 90 95
Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp
100 105 110
Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg
115 120 125
Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser
130 135 140
Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala
145 150 155 160
Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp
165 170 175
Phe
<210> 80
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> QYD肽
<400> 80
Gln Tyr Asp Pro Val Ala Ala Leu Phe
1 5
<210> 81
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<400> 81
Cys Ala Glu Thr Pro Thr Asn Asp Tyr Lys Leu Ser Phe
1 5 10
<210> 82
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 82
Ser Ser Gly Asn Gln Phe Tyr Phe
1 5
<210> 83
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 83
Cys Ala Asp Tyr Tyr Gly Gln Asn Phe Val Phe
1 5 10
<210> 84
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 84
Cys Ala Ser Ser Ser Glu Thr Glu Leu Leu Tyr Tyr Gly Tyr Thr Phe
1 5 10 15
<210> 85
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 85
Cys Ala Ser Ser Gln Gln Thr Gly Thr Ile Gly Gly Tyr Thr Phe
1 5 10 15
<210> 86
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<400> 86
Cys Ala Ser Ser Phe Gln Gly Phe Thr Glu Ala Phe Phe
1 5 10
<210> 87
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 87
Cys Ala Ser Pro Thr Gly Asn Gln Phe Tyr Phe
1 5 10
<210> 88
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<400> 88
Cys Ala Glu Ile Pro Ser Asn Asp Tyr Lys Leu Ser Phe
1 5 10
<210> 89
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 89
Cys Ala Ser Gly Ser Gln Gly Asn Leu Ile Phe
1 5 10
<210> 90
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 90
Cys Ala Gly Leu Thr Thr Asp Ser Trp Gly Lys Phe Gln Phe
1 5 10
<210> 91
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 91
Cys Ala Thr Tyr Leu Thr Gly Asn Gln Phe Tyr Phe
1 5 10
<210> 92
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 92
Cys Ala Val Cys Asn Phe Asn Lys Phe Tyr Phe
1 5 10
<210> 93
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 93
Cys Ala Ser Ser Phe Thr Leu Gly Thr Gly Gly Val Glu Gln Tyr Phe
1 5 10 15
<210> 94
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<400> 94
Cys Ser Ala Arg Gly Gln Asp Ile Tyr Glu Gln Tyr Phe
1 5 10
<210> 95
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 95
Cys Ala Ser Gly Leu Thr Gly Phe Met Asp Glu Gln Tyr Phe
1 5 10
<210> 96
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 96
Cys Ala Ser Ser Val Asp Val Ala Gly Gly Tyr Asn Glu Gln Phe Phe
1 5 10 15
<210> 97
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<400> 97
Cys Ala Ser Ser Gln Ala Leu Pro Tyr Glu Gln Tyr Phe
1 5 10
<210> 98
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 98
Cys Ala Ser Ser Ile Thr Leu Gly Thr Gly Gly Val Glu Gln Tyr Phe
1 5 10 15
<210> 99
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铂TALEN DNA结合模块的氨基酸序列的示例
<400> 99
Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys
1 5 10 15
Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala
20 25 30
His Gly
<210> 100
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铂TALEN DNA结合模块的氨基酸序列的示例
<400> 100
Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys
1 5 10 15
Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala
20 25 30
His Gly
<210> 101
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铂TALEN DNA结合模块的氨基酸序列的示例
<400> 101
Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys
1 5 10 15
Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp
20 25 30
His Gly
<210> 102
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Zhang TALEN DNA结合模块的氨基酸序列的示例
<400> 102
Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys
1 5 10 15
Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala
20 25 30
His Gly
<210> 103
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 图24和25中的核苷酸序列
<400> 103
gtctgtctgc ctattcaccg attttgattc tcaaacaaat gtgtcacaaa gtaaggattc 60
<210> 104
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 图24和25中的核苷酸序列
<400> 104
cagacagacg gataagtggc taaaactaag agtttgttta cacagtgttt cattcctaag 60
<210> 105
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 图24和25中的核苷酸序列
<400> 105
gtctgtctgc ctattcaccg attgaagatt ttgattcaat gtgtcacaaa gtaaggattc 60
<210> 106
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 图24和25中的核苷酸序列
<400> 106
cagacagacg gataagtggc taacttctaa aactaagtta cacagtgttt cattcctaag 60
<210> 107
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 图24和25中的核苷酸序列
<400> 107
gtctgtctgc ctattcaccg attcaaacaa atgtgttaat gtgtcacaaa gtaaggattc 60
<210> 108
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 图24和25中的核苷酸序列
<400> 108
cagacagacg gataagtggc taagtttgtt tacacaatta cacagtgttt cattcctaag 60
<210> 109
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 图24和25中的核苷酸序列
<400> 109
gtctgtctgc ctattcaccg attttgattc aatgtgtcac aaagtaagga ttc 53
<210> 110
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 图24和25中的核苷酸序列
<400> 110
cagacagacg gataagtggc taaaactaag ttacacagtg tttcattcct aag 53
<210> 111
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 图24和25中的核苷酸序列
<400> 111
gtctgtctgc ctattcaccg attcaaacaa atgtgtcaca aagtaaggat tc 52
<210> 112
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 图24和25中的核苷酸序列
<400> 112
cagacagacg gataagtggc taagtttgtt tacacagtgt ttcattccta ag 52
<210> 113
<211> 18
<212> DNA
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 113
tctgcctgtt caccgact 18
<210> 114
<211> 20
<212> DNA
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 114
aatgtgccga aaaccatgga 20
<210> 115
<211> 20
<212> DNA
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 115
tgactccacc caaggtctcc 20
<210> 116
<211> 20
<212> DNA
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 116
aaaagcagag attgcaaaca 20
<210> 117
<211> 20
<212> DNA
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 117
tgtgcttggc caggggcttc 20
<210> 118
<211> 20
<212> DNA
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 118
ggagctgagc tggtgggtga 20

Claims (37)

1.一种产生抗原特异性调节性T细胞的方法，包括：
针对在效应T细胞供体中的抗原特异性效应T细胞群中所存在的T细胞受体(TCR)克隆进行鉴定的步骤；以及
将所述克隆中所包含的TCRα基因的全部或部分核酸序列和TCRβ基因的全部或部分核酸序列引入调节性T细胞的步骤，该步骤以使得所述TCRα和所述TCRβ成对表达的方式进行引入。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，鉴定所述TCR克隆的步骤包括测定所述效应T细胞群的TCR库。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述TCR克隆以与所述效应T细胞群中的各克隆的存在频率的平均值相比大1个标准偏差以上的频率存在。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述TCR克隆以与所述效应T细胞群中的各克隆的存在频率的平均值相比大2个标准偏差以上的频率存在。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述TCR克隆在所述效应T细胞群中以大约10％以上的频率存在。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述TCRα的基因的全部或部分核酸序列包括与Vα-Jα的CDR3区相对应的序列。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述TCRβ的基因的全部或部分核酸序列包括与Vβ-D-Jβ的CDR3区相对应的序列。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述TCRα的基因的全部或部分核酸序列包括Vα-Jα-Cα的cDNA序列。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，所述TCRβ的基因的全部或部分核酸序列包括Vβ-D-Jβ-Cβ的cDNA序列。
10.根据权利要求2至9中任一项所述的方法，其中，所述TCR库的测定包括：
(1)提供核酸样品的步骤，所述核酸样品包含从所述效应T细胞群无偏差扩增的T细胞受体(TCR)的核酸序列；
(2)确定所述核酸样品中包含的所述核酸序列的步骤；以及
(3)基于已确定的所述核酸序列计算各基因的出现频率或其组合、从而导出所述效应T细胞群的TCR库的步骤。
11.根据权利要求2至10中任一项所述的方法，其中，所述TCR库的的测定包括：
(1)提供核酸样品的步骤，所述核酸样品包含从所述效应T细胞群无偏差扩增的TCR的核酸序列，所述步骤(1)包括以下步骤：
步骤(1-1)：将来自靶细胞的RNA样品作为模板，合成互补DNA；
步骤(1-2)：将所述互补DNA作为模板，合成双链互补DNA；
步骤(1-3)：向所述双链互补DNA添加通用接头引物序列，合成添加有接头的双链互补DNA；
步骤(1-4)：使用所述添加有接头的双链互补DNA、由所述通用接头引物序列组成的通用接头引物、和第一TCR的C区特异性引物，进行第一PCR扩增反应，所述第一TCR的C区特异性引物被设计成：包含对所述TCR的目标C区充分特异的、且与其他基因序列不同源的序列，并且在扩增时在下游在亚型之间包含不一致碱基；
步骤(1-5)：使用(1-4)的PCR扩增产物、所述通用接头引物、和第二TCR的C区特异性引物，进行第二PCR扩增反应，所述第二TCR的C区特异性引物被设计成：在所述第一TCR的C区特异性引物的序列下游的序列中具有与所述TCR的C区完全匹配的序列、但包含与其他基因序列不同源的序列，并且在扩增时在下游在亚型之间包含不一致碱基；以及
步骤(1-6)：使用(1-5)的PCR扩增产物、添加通用接头引物和带有接头的第三TCR的C区特异性引物进行第三PCR扩增反应，所述添加通用接头引物在所述通用接头引物的核酸序列中包含第一追加接头核酸序列，所述带有接头的第三TCR的C区特异性引物是将第二追加接头核酸序列添加到第三TCR的C区特异性序列中而成；
其中，所述第三TCR的C区特异性引物被设计成：具有在所述第二TCR的C区特异性引物的序列下游的序列中与所述TCR的C区完全匹配的序列，但包含与其他基因序列不同源序列的序列，并且在扩增时在下游在亚型之间包含不一致碱基；
(2)确定所述核酸样品中包含的所述核酸序列的步骤；以及
(3)基于已确定的所述核酸序列计算各基因的出现频率或其组合、从而导出所述效应T细胞群的TCR库。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，鉴定所述TCR克隆的步骤包括扩增源自同一细胞的TCRα基因和TCRβ基因、并鉴定所述效应T细胞群中的TCRα和TCRβ对。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，进一步包括确认所述经鉴定的TCRα和TCRβ对是否与抗原有亲和性的步骤。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中，进一步包括克隆所述经鉴定的TCRα和TCRβ对中的TCRα的全部或部分核酸序列和TCRβ的全部或部分核酸序列的步骤。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述引入的步骤包括将所述经克隆的TCRα的全部或部分核酸序列和TCRβ的全部或部分核酸序列引入所述调节性T细胞。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中，所述引入的步骤包括使用载体，所述载体构成为使所述TCRα和所述TCRβ成对表达。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述载体包含编码Cys的核酸序列使得表达的所述TCRα和所述TCRβ之间形成二硫键，或者所述TCRα和所述TCRβ的编码序列被密码子优化，或者构成为使亮氨酸拉链引入所述TCRα和所述TCRβ的胞内区，或者构成为使所述TCRα和所述TCRβ进行糖链修饰从而进行表达。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中，包括使用编码与Vα连结的Cα结构域和与Vβ链连结的Cβ结构域的载体，所述载体构成为使所述TCRα和所述TCRβ成对表达。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中，所述调节性T细胞从所述效应T细胞供体获得。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中，进一步包括去除所述调节性T细胞的内源性TCR基因的步骤。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述内源性TCR基因的去除使用TCR特异性TALEN进行。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述TALEN以包含DNA结合结构域和功能结构域的多肽或编码所述多肽的核酸的形式提供，
此处，所述DNA结合结构域和所述功能结构域通过由35～55个氨基酸组成的多肽连接，
DNA结合结构域从N末端侧连续地包含多个DNA结合模块，
对于任意的n，从N末端的第4n-3个DNA结合模块中的第x个氨基酸和第y个氨基酸的组合是相同的，
对于任意的n，从N末端的第4n-2个DNA结合模块中的第x个氨基酸和第y个氨基酸的组合是相同的，
对于任意的n，从N末端的第4n-1个DNA结合模块中的第x个氨基酸和第y个氨基酸的组合是相同的，
对于任意的n，从N末端的第4n个DNA结合模块中的第x个氨基酸和第y个氨基酸的组合是相同的，
从N末端的第4n-3个DNA结合模块中第x个氨基酸与第y个氨基酸的组合、从N末端的第4n-2个DNA结合模块中第x个氨基酸与第y个氨基酸的组合、从N末端的第4n-1个DNA结合模块中第x个氨基酸与第y个氨基酸的组合、以及从N末端的第4n个DNA结合模块中第x个氨基酸与第y个氨基酸的组合，互不相同，
此处，n是1～10的自然数，x是1～40的自然数，y是1～40的自然数，x和y是不同的自然数。
23.根据权利要求20至22中任一项所述的方法，包括：
去除所述调节性T细胞中内源性TCRα或内源性TCRβ基因中的任一者的步骤；
将所述TCRα基因的全部或部分核酸序列和所述TCRβ基因的全部或部分核酸序列引入所述调节性T细胞的步骤；
去除所述调节性T细胞中内源性TCRα或内源性TCRβ基因中的另一者的步骤；以及
将所述TCRα基因的全部或部分核酸序列和所述TCRβ基因的全部或部分核酸序列重新引入所述调节性T细胞的步骤。
24.一种产生抗原特异性的调节性T细胞的方法，包括：
测定效应T细胞供体中的对该抗原特异性的效应T细胞群中的TCR库的步骤，该步骤包括无偏差地扩增TCR基因；
鉴定所述效应T细胞群中的TCRα和TCRβ对的步骤；
确认所述经鉴定的TCRα和TCRβ对是否对抗原有亲和性的步骤；
针对所述经鉴定的TCRα和TCRβ对中的TCRα的全部或部分核酸序列和TCRβ的全部或部分核酸序列进行克隆的步骤；
去除调节性T细胞的内源性TCR基因的步骤；以及
向所述调节性T细胞中引入所述经克隆的TCRα的全部或部分核酸序列和TCRβ的全部或部分核酸序列的步骤，该步骤以使得所述TCRα和所述TCRβ成对表达的方式进行引入。
25.一种调节性T细胞，通过权利要求1至24中任一项所述的方法制备。
26.一种调节性T细胞，其不含内源性TCR基因。
27.一种调节性T细胞，其含有在T细胞受体(TCR)克隆中所包含的TCRα基因的全部或部分核酸序列以及TCRβ基因的全部或部分核酸序列，所述T细胞受体克隆存在于效应T细胞供体的效应T细胞群中。
28.一种调节性T细胞，其不含内源性TCR基因，含有在T细胞受体(TCR)克隆中所包含的TCRα基因的全部或部分核酸序列以及TCRβ基因的全部或部分核酸序列，所述T细胞受体克隆存在于效应T细胞供体的效应T细胞群中。
29.一种组合物，包含用于治疗或预防自身免疫性疾病的、权利要求25至28中任一项所述的调节性T细胞。
30.一种组合物，包含用于治疗或预防过敏性疾病的、权利要求25至28中任一项所述的调节性T细胞。
31.一种组合物，包含用于治疗或预防移植时的移植物抗宿主病(GVHD)、排斥反应或移植物衰竭的、权利要求25至28中任一项所述的调节性T细胞。
32.一种组合物，包含在权利要求24所述的方法中使用的、以使得所述TCRα和所述TCRβ成对表达的方式构成的载体。
33.一种组合物，包含在权利要求24所述的方法中使用的MHC四聚体。
34.一种组合物，包含在权利要求24所述的方法中使用的、含有DNA结合结构域和功能结构域的多肽或编码所述多肽的核酸，所述DNA结合结构域与TCR基因特异性结合。
35.通过权利要求10或11所述的方法获得的效应T细胞群的TCR库或其一部分、或编码其的核酸。
36.一种组合物，用于制备TCR修饰T细胞，所述组合物包含通过权利要求10或11所述的方法获得的效应T细胞群的TCR库或其一部分、或编码其的核酸。
37.根据权利要求36所述的组合物，其中，所述TCR修饰T细胞包括TCR修饰的调节性T细胞。
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