JP2012529270A - ハイブリッド／キメラ細胞を生成する方法およびその使用 - Google Patents

ハイブリッド／キメラ細胞を生成する方法およびその使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、ハイブリッド細胞およびハイブリッド細胞を生成するための方法に関する。特に、本発明は、少なくとも３つの細胞のハイブリダイゼーションから生成されたハイブリッド細胞に関し、ここで、少なくとも２つの細胞が異なる系統に由来するものである。本発明はさらに、診断、予防、治療および／または研究の様々な用途において有用なタンパク質の発現のためのハイブリット細胞の使用に関する。

Description

発明の詳細な説明
〔技術分野〕
本発明は、ハイブリッド細胞およびハイブリッド細胞を生成するための方法に関する。特に、本発明は、少なくとも３つの細胞のハイブリダイゼーションから生成されたハイブリッド細胞に関し、ここで、少なくとも２つの細胞が異なる系統（lineage）に由来するものである。本発明はさらに、診断、予防、治療および／または研究の様々な用途において有用なタンパク質の発現のためのハイブリット細胞の使用に関する。
〔背景技術〕
本明細書の全体を通じての先行技術のあらゆる議論は、当該従来技術が広く公知であるか、または当該分野においてよく知られている一般的な知識の一部を形成していることの自認として決して見做されるべきではない。
現在、診断、予防、治療および／または研究の様々な用途において商業的に関連するタンパク質を発現させるために、種々の異なる細胞型が用いられている。現在、そのようなタンパク質の製造は、定法として、バクテリア、酵母、真菌、昆虫および非ヒト哺乳類の細胞といった細胞において実施されている。
細胞はしばしば、多くの翻訳後修飾（グリコシル化、アシル化、リン酸化、メチル化、硫酸化、プレニル化および脂質化が挙げられるが、これに限定されない）によってタンパク質を修飾する。これらの修飾は種特異的であるため、商業的に関連するタンパク質の製造に現在、使用されている細胞は、ヒト細胞から発現されたタンパク質または人体において自然に生じるタンパク質にみられる翻訳後修飾と全く異なる翻訳後修飾を示す。例えば、商業的に関連するタンパク質を製造するために用いられる多くの非哺乳類の種類の細胞は、タンパク質をグリコシル化する能力を欠いているか、またはヒト細胞において発現するタンパク質によって示されるグリコシル化の様式と異なるグリコシル化の様式を示す。
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような非ヒトの哺乳類の発現系においてさえ、グリコシル化の様式における顕著な相違が、ヒト細胞の様式と比較して、実証されている。例えば、組換えタンパク質の発現に用いられるＣＨＯ細胞株は、ヒト細胞に存在している（α２，６）−結合の末端シアル酸の合成のための機能的な（α２，６）シアリルトランスフェラーゼ酵素を欠いている。さらに、ＣＨＯ細胞に発現している糖タンパク質に存在しているシアル酸モチーフは、ＣＨＯ細胞内在性シアリダーゼによって分解される傾向がある（Gramer et al. Biotechnology 13 (7):692-&, 1995）。
非ヒト発現系の全く異なる翻訳後修飾のレパートリの結果として、それらから発現されたタンパク質は、ヒト細胞に由来するタンパク質と全く異なる物理化学的特性および薬理学的特性（例えば、半減期、免疫原性、安定性および機能的な有効性）を示し得る。このことはこれらタンパク質の臨床的な有用性において実質的に影響を与え得る。
また、その種依存的な性質に加えて、翻訳後修飾は同種間において組織特異的であり得、細胞型特異的ですらあり得るという証拠が増えつつある。これは末端グリコシル化を示すタンパク質の、組織特異的および細胞型特異的な発現と特に関連している（Feizi Nature 314: 53-54, 1985; Rademacher et al Annu Rev Biochem 57: 785-838, 1988）。特に、末端シアル酸を糖タンパク質の糖鎖に付加する３つのシアリルトランスフェラーゼが、ラットの７つの組織において差別的な著しい発現を示すことが示されている（Paulson et al J. Biol. Chem. 264: 10931-10934, 1989）。これは、同じタンパク質の組織特異的なグリコシル化についての裏づけを与えている。さらに、骨髄由来のマウス繊維芽細胞およびマウス骨芽細胞によって発現された高度にリン酸化された糖タンパク質（マウスのオステオポンチン）の２つのアイソフォームに関する研究では、それらのリン酸化の程度における主要な相違が示され、生物学的活性における相違と相関していた。これらの結果は、異なる細胞型によって生産されたオステオポンチンの機能が全く異なっていることを示唆している（Christensen et al J Biol. Chem. 282(27): 19463-19472）。
完全にヒトの特性を示す生物製剤の製造に適した有効な細胞系は、理想的には、多数の基準（以下のａ）〜ｋ）が挙げられるが、これらに限定されない）を満たすべきである：
ａ）ヒトの組織からの派生：
ｂ）培養における高密度の成長；
ｃ）商業的に実行可能なタンパク質収量を示す；
ｄ）外来性遺伝子の安定な導入が可能である；
ｅ）遺伝子増幅法を適用できる；
ｆ）ヒト−ヒトハイブリドーマの場合のように、モノクローナル抗体の産生のための親細胞が使用可能である；
ｇ）長期間にわたる安定なタンパク質の発現を示す；
ｈ）無血清および無グルタミン培地において成長する能力；
ｉ）エンドペプチターゼ活性を欠いており、したがってタンパク質の分解が低下している；
ｊ）病原性の物質（ウイルスＤＮＡおよびマイコプラズマが挙げられる）がない；
ｋ）天然に生じるヒトのタンパク質、好ましくは組織および細胞特異的なタンパク質にみられる翻訳後修飾と機能的に類似または同一である翻訳後修飾を示すタンパク質を生産する。これら翻訳後修飾としては、糖タンパク質の炭化水素部分が挙げられ得るが、これに限定されない。
多数のヒト宿主細胞またはヘテロハイブリドーマが、ヒトのタンパク質の発現用に存在しているが、それらのうちで上記に挙げた基準を全て首尾よく満たすものはない。とりわけ、既存のヒト細胞発現系から臨床的に有用な収量においてタンパク質を発現させ、単離する試みは、わずかに成功しているに過ぎない。
真核細胞におけるタンパク質の発現は複数の段階において制御される。当該複数の段階としては（ａ）クロマチンにおける遺伝子に対する調節因子の作用；（ｂ）転写の開始の調節；および（ｃ）翻訳後修飾が挙げられる。これら異なる段階は、発生段階および／または組織に特異的であると考えられる。このように、所望のタンパク質をコードしている外来性遺伝子が細胞の中に組み込まれている場合に、所望のタンパク質の発現は最適な状態より少なくあり得る。安定な発現の欠如（Li et al., Proc Natl Acad Sci USA 95: 3650-3654, 1998; Miyaji et al., Cytotechnology, 3: 133-140, 1990; Miyaji et al., Cytotechnology 4: 173-180, 1990; Miyaji et al., Cytotechnology 4: 39-43, 1990; Satoh et al., Cytotechnology 13: 79-88, 1993）、低い発現量（Airoldi et al, Cancer Research 61:1285-1290, 2001; Hosoi et al. Cytotechnology 7: 25-32, 1991）、および非最適条件である翻訳後修飾（Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278:3466-3473, 2003）のような問題が生じ得る。これら因子の全てが当該タンパク質の潜在的な商業的有用性に影響し得る。
一例として、ナマルバ細胞の亜系（懸濁培養において成長し、無血清およびアルブミンなしの培地に順応したヒトＢリンパ芽球細胞）であるナマルバＫＪＭ−１は、バーキットリンパ腫細胞にとって内在性タンパク質であるα−インターフェロンの大規模な製造のために用いられた。しかし、バーキットリンパ腫細胞にとって外来性であるが、Ｂ細胞においては内在性であるＧ−ＣＳＦタンパク質がエレクトロポレーションによるトランスフェクションにとっての標的タンパク質として用いられた場合、多様なメトトレキサート（ＭＴＸ）耐性クローンと、Ｇ−ＣＳＦを最も多く生産するクローンとの間において異なるＧ−ＣＳＦの発現レベルは、無血清条件に順応させたとき、わずかに２．４μｇ／ｍｌ／日の固有の生産性を有していた。
さらに、細胞数が７×１０５／ｍｌを超える場合の高密度な培養において、固有の生産性は低下した（Hosoi et al. Cytotechnology 7: 25-32, 1991）。報告されたＧ−ＣＳＦの最大濃度は著しく向上し、４１μｇ／ｍｌに達したが、これを達成するために、非常に厳密なｐＨの調節をともなった、細胞培養条件の高価かつ煩瑣な操作を必要とした。最適な成長のために用いられた培地が最適な生産のために用いられた培地と異なっており、したがって所望される高密度と高生産率との間に顕著な不一致が生じ、工業的に実施できない系を結果として生じる。
真核生物における遺伝子発現は複数の段階において制御されているため、組織特異的な転写因子および発生に特異的な転写因子の存在が遺伝子の発現に対して大きな影響力を有している。当該複数の段階としては：（ａ）クロマチンにおける遺伝子に対する調節因子の有効性および接近可能性；（ｂ）接近可能なプロモータに対する、特定の転写開始の速度の調節；および（ｃ）その後の種々の段階における転写後の事象が挙げられる。さらに、特定の細胞型の遺伝子調節は、分子シグナルを遺伝子に伝達するタンパク質にとっての結合部位である種々のシス作用ＤＮＡ調節配列の共働を必要とする（Blackwood et al., Science 281: 60-63, 1998）。これらの配列は調節タンパク質と結合して、エンハンセオソームとして知られている複合体を形成する（Marika et al., Curr Opin Genet Dev 11(2): 205-208, 2001）。したがって、ヒトの系統特異的な宿主細胞に導入された場合に、標的遺伝子がその通常の細胞の環境から離れているほど、高生産レベルにおける所望のタンパク質の安定な発現性および生産性は低下する。リンパ芽球細胞株にとって系統特異的なタンパク質（例えば、βインターフェロン（Miyaji et al., Cytotechnology, 3: 133-140, 1990; Miyaji et al., Cytotechnology 4: 173-180, 1990）、ヒトのリンホトキシン（Miyaji et al., Cytotechnology 4: 39-43, 1990）またはプロウロキナーゼ（Satoh et al., Cytotechnology 13: 79-88, 1993））とはさらにかけ離れている外来性のタンパク質の遺伝子を用いて、ナマルバＫＪＭ−１細胞がトランスフェクションされている場合、トランスフェクションの割合および細胞の生産性はさらに低いことがわかった。
ヒトの系統特異的な細胞株における外来性遺伝子の効率的な発現は同様に、ヒト宿主細胞から利用可能な核因子の結合部位を含み得る適切なエンハンサ／プロモータの、ときにひどく単調である、慎重な選択を必要とする。そのようなエンハンサ／プロモータの発見は、そのようなプロモータの限られた適合をいまだにもたらし得る。例えば、種々のエンハンサ／プロモータ（例えば、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）の初期遺伝子プロモータ、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）の主要な前初期遺伝子プロモータ、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭｕＬＶ）のプロモータ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモータおよびニワトリβ−アクチンのプロモータ）が、ナマルバＫＪＭ−１細胞における外来性遺伝子のより効率的な発現に関して研究されたとき、Ｍｏ−ＭｕＬＶプロモータは従来のＳＶ４０の初期プロモータより約１０倍強力であり、高生産クローンは３０〜４０μｇ／１０６細胞／日の生産性に達することがわかった（Satoh et al., Cytotechnology 18:162-172, 1996）。しかし、Ｍｏ−ＭｕＬＶといったレトロウイルスベクターの使用に関する問題は、核のスプライシング機構によるイントロンの除去のために、逆方向の配列（イントロン）をともなう遺伝子をトランスフェクションに使用することが困難なことである（Li et al., Proc Ntl Acad Sci USA 95: 3650-3654, 1998）。
細胞の環境と核の環境とのミスマッチは、２つの遺伝子によってコードされているタンパク質（例えば抗体）の場合においてさらに増幅される。さらに、ナマルバＫＪＭ−１細胞がヒト−ヒトハイブリドーマの生成に使用されたが、抗体の収量ために、この細胞株は工業的な製造にとって不適当であった。
他の例として、ヒト胎児腎臓の細胞株２９３は、外来性の起源の遺伝子を用いて、高度な安定性をともなって非常に容易に形質転換されることが証明されている。しかし、２９３細胞はヒトアデノウイルスＡｄ５ＤＮＡを含んでいる（ＨＥＫ２９３細胞）ため、２９３の形質転換体に由来するタンパク質は限られた用途しか有しておらず、一般的に研究目的のみに適する。しかし、商業的な環境における２９３細胞の使用に関する最大の制限は、その接着性である。費用的に有効なビヒクルを用いた懸濁液における効率的なトランスフェクションに２９３細胞を適合させる多数の試みがなされてきた。当該ビヒクルは、例えば、ポリエチレンイミン（Durocher et al., Nucleic Acids Res 30(2):e9, 2002; Schlaeger et al., Cytotechnology 30:71-83, 1999）またはリン酸カルシウム（Girard et al, Cytotechnology 38:15-21, 2002; Jordan et al., Cytotechnology 26:39-47, 1998; Meissner et al., Biotechnol Bioeng 75(2):197-203, 2001）である。しかし、これらのビヒクルは、組換えタンパク質の一過性発現のみをもたらし、それは、新たに継代された培養物ごとにトランスフェクションを繰り返されなければならないことを意味している。ＥＢＶのｏｒｉＰがベクター骨格に存在する場合、懸濁培養およびより高いタンパク質発現を達成するためには、エプスタインバールウイルスのＥＢＮＡ１タンパク質を安定して発現するように、２９３細胞を遺伝的に改変しなければならない（２９３Ｅ）（Durocher et al., Nucleic Acids Res 30(2):e9, 2002; Parham et al., Cytotechnology 35:181-187, 2001; Schlaeger et al., Cytotechnology 30:71-83, 1999）。ＥＢＮＡ１を用いたトランスフェクションの後でさえ、無血清培地において培養したときの２９３Ｅ細胞（ＨＥＫ２９３ ＥＢＭＡ１）（大規模製造にとっての前提条件）は、細胞の凝集を防ぐために添加される多価陰イオン（ヘパリン、硫酸デキストラン）の存在にほとんどが起因している、非常に低いトランスフェクション率を示す。動物性の原料（例えば肉、ゼラチンおよびカゼイン）の酵素的な加水分解から得られたペプトンを培地に補うことによって、この問題を縮小させる試みがなされてきた（Pham et al., Biotechnol Bioeng 84(3):332-42, 2003）。Ｔｉｅ−２（アンジオポエチン成長因子に対する受容体チロシンキナーゼ）およびニューロピリン−１ＥＤ（神経性細胞誘導を仲介する受容体）の製造に、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ１細胞株を用いた場合、タンパク質の発現は、トランスフェクションしていない培養物において得られた発現と比べて、得られた細胞密度の低い培養物によって、制限されていた。また、生じたタンパク質の＞９５％の純度は、研究品質の製品にのみ適している。その上、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ１細胞はモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の製造に適していない。
治療用のｍＡｂの製造に関する現在の方法としては、ヒトＩｇ遺伝子を有している遺伝子導入マウス（異物性のマウス（ｘｅｎｏｍｉｃｅ））の免疫化、齧歯類ｍＡｂのヒト型化、またはヒトｍＡｂライブラリのスクリーニングによって得られたｍＡｂを組換えによって製造するための哺乳類細胞系（すなわちＣＨＯまたはＮＳ０トランスフェクトーマ）の使用が挙げられる（van Dijk et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 5:368-374, 2001）。それらの配列について、治療用のｍＡｂは、アレルギー反応を最小化するために、キメラ抗体（齧歯類の可変領域およびヒトの定常領域）、ヒト化抗体（齧歯類の相補性決定領域を除くヒトの配列）、および完全なヒト抗体（ヒトＡｂ）に近年発展してきたが、治療用のｍＡｂの重要な局面は、免疫エフェクター機能の誘導能である。当該免疫エフェクター機能は、例えば、抗体依存的な細胞傷害性であり、本来のグリコシル化パターンを変えている非ヒト宿主細胞においてｍＡｂが製造される場合に損なわれている（Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278:3466-3473, 2003）。これらの事実を考慮すると、理想的な計画の概要は、治療用の抗体がヒトの細胞によって製造されることである。この場合において、完全なヒトのｍＡｂは、それらのヒト本来の構造に起因して、ヒトのエフェクター機能を発揮し得、非常にわずかな免疫原性を有し得る。
ハイブリドーマまたはエプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）によって形質転換したヒトのＢ細胞に由来するリンパ芽球株が報告されている（Kirman et al., Hybrid. Hybridomics 21: 405-414, 2002; Boerner et al., J. Immunol. 147: 86-95, 1991; Zafiropoulos et al., J. Immunol. Methods 200: 181-190, 1997）。しかし、長期の安定性および製造処理に対する適合性（特にバッチ生産の全体における生産レベルおよびＩｇ分泌の安定性）に関するこれらのｍＡｂおよび株の特性について情報はわずかしかない。４日間にわたる稼動の間にヒトＧＭ−ＣＳＦに対するヒトｍＡｂを１．２ｇ／リットルの累積性の力価において生産する細胞株が報告されているが、これらの細胞株はヘテロミエロリンパ腫（heteromyelolymphoma）Ｋ６Ｈ６／Ｂ５細胞による、初代培養された（primary）ヒトＢ細胞の体細胞ハイブリダイゼーション（融合）から得られた（すなわちヒトＢ細胞のリンパ腫とマウス骨髄腫細胞とのハイブリダイゼーションから得られたマウス−ヒト細胞株（Li et al., Proc Natl Acad Sci USA 103(10):3557-3562, 2006）。
ＥＢＶ形質転換の場合における困難性は、安定した抗体の生産を維持しながら、完全に不死化されたＢ細胞株の樹立である。これは、低効率の不死化、細胞成長の静止、およびＩｇＭ産生細胞の優勢的な不死化に起因している。その上、ほとんどのＥＢＶによって形質転換したＢ細胞は短縮されたテロメアおよびわずかな寿命（たいていは１６０の集団倍化レベルより前）を有していることが、近年の報告によって示されている（Sugimoto et al., J Virol 73:9690-9691, 1999; Toda et al., J Chromatogr B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 787:197-206, 2003)）。この問題を克服するために、ＥＢＶによって形質転換したＢ細胞を適切なパートナー細胞株（発現系）とハイブリダイズ（または融合）させる試みがなされてきたが、これらパートナー細胞株は、異種の混成物の種々の組合せを事実上、意味している（Ainai et al., Hum Antibodies 15:139-154, 2006; Kalantarov et al., Hum Antibodies 11: 85-96, 2002; Karpas et. al., Proc Natl Acad Sci USA 98:1799-1804, 2001）。当該組合せは、例えば、ヒトＢ細胞を用いてマウス−ヒトへテロハイブリドーマから得られたトリオーマである。破傷風毒素（ＴＴ）に対する抗体を生産する、ＥＢＶによって形質転換した初代培養されたＢ細胞と、そのようなトリオーマが融合されたとき、マウスの１／４の構成要素を有しているテトローマが得られた。ＴＴに対するｍＡｂの安定した生産は、３回にわたる連続するテトローマのクローニングの後に可能であったが、そのような繰り返しの細胞クローニング工程は、煩瑣であり、時間がかかる。その上、テトローマによって生産されたｍＡｂの量は実験目的にとって十分であるが、そのレベルは、薬剤としてのｍＡｂの大規模生産にとって不十分であった。多クローン性活性化因子ＣｐＧ２００６の存在またはＣＤ１９もしくはＢＣＲのコライゲーション（co-ligation）における不死化が、治療用途にとって適切な量における特定のｍＡｂの効率的な生産のための完全な系を生じ得るか否かは未だに不確かである（Hartman et al., J Immunol 164: 944-953, 2000; Hur et al., Cell Prolif 38: 35-45, 2005; Traggiai et al., Nat Med 10: 871-875, 2004）。
生体物質（例えば、成長因子、抗体および可溶性タンパク質）の生産にヒト細胞を使用するために、多数の研究方法が試みられている。
本発明の目的は、先行技術の不都合のうち少なくとも１つを解消するか、もしくは改善すること、または有用な代替物を提供することである。
〔発明の概要〕
多融合細胞（multi-fusion cells）は不安定であり、融合に関わる細胞が多いほど、得られたハイブリッド細胞の不安定性が高まると、一般的に考えられている。驚くべきことに、本発明において、複数の細胞（例えば３つの細胞）の融合から得られたハイブリッド細胞は機能的な安定性を示す。特に、異なる系統に由来する細胞が体細胞融合されるか、または体細胞ハイブリダイズされて、実質的に安定なキメラ／ハイブリッド細胞を形成し得ることがわかっている。とりわけ、本発明は、トリハイブリッド（tri-hybrid）を生じる少なくとも３つの親細胞のハイブリダイゼーションから生成された系統交雑の（cross-lineage）キメラ／ハイブリッド細胞であって、少なくとも２つの親細胞が異なる系統に由来しており、骨髄腫細胞がハイブリダイゼーションに含まれていない系統交雑のキメラ／ハイブリッド細胞に関する。
また驚くべきことに、本発明の安定なキメラ／ハイブリッド細胞は、例えば所望の翻訳後修飾（例えばヒトのグリコシル化パターンが挙げられるが、これに限定されない）を示すタンパク質の生産における用途を有していることがわかっている。
また驚くべきことに、本発明の安定なキメラ／ハイブリッド細胞からの所望のタンパク質の発現レベルは、第２の所望のタンパク質が本発明のキメラ／ハイブリッド細胞から同時に発現される場合に、増強され得ることがわかっている。さらに、２つの標的タンパク質の発現レベルは、本発明のキメラ／ハイブリッド細胞からの第３の所望のタンパク質の同時の発現によって増強され得る。
したがって、本発明は、ハイブリッド細胞の汎用性および安定性について、これまでに知られている系を超えて顕著な利点をもたらす。一実施形態において、本発明のハイブリッド細胞は。２つの同一の細胞もしくは２つの同一の系統の細胞、および異なる系統の細胞の融合によって生成される。そのようなハイブリッドは、ハイブリダイゼーションに用いた多数を占める細胞型に方向付けられた表現型になる傾向を有している。これらのハイブリッド細胞は、特に、組織特異的な翻訳後修飾がタンパク質の機能性にとって重要であることが知られているタンパク質の発現に用いられ得る。例えば、Ｂ細胞から発現している場合に特定の機能的な翻訳後修飾を有していることが知られているサイトカインは、Ｂ細胞系統に由来する少なくとも２つの細胞を含んでいる（したがって機能的な翻訳後修飾を保証している）ハイブリッド細胞から、より効率的に発現され得る。
タンパク質の翻訳後修飾は組織特異的または細胞型特異的であり得る。このため、本発明のハイブリッド細胞はまた、（特異的なＣＤマーカーの存在によって証明されるように）特定の細胞型または表現型に関して濃縮されて、特定の細胞型または表現型と関連している所望の翻訳後修飾または所望の機能性を示すタンパク質の発現を可能にし得ることが、当業者にとって明らかであろう。
一実施形態において、本発明は、少なくとも１つの不死化された細胞の使用を包含しているハイブリッド細胞に関する。しかし、また、本発明は、インビトロの形質転換処理（例えばウイルス遺伝子の導入）によって続いて不死化され得る、不死化されていない細胞の融合に関することが当業者にとって明らかであろう。当該ウイルス遺伝子は、例えば、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０） Ｔ抗原、アデノウイルス Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ、ならびにヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ） Ｅ６およびＥ７である。代替的に、不死化されていない細胞は、テロメラーゼ逆転写酵素タンパク質（ＴＥＲＴ）の発現によって不死化され得る。また、不死化された細胞は、発癌遺伝子の発現が調節されている細胞に由来し得る。さらに、不死化された細胞は、無制限な成長能を誘導する任意の処置（ＵＶ照射、または不死化の機構が不明である自然発生的な形質転換が挙げられるが、これらに限定されない）に由来し得る。
本発明は、一実施形態において、個々の細胞３つの融合に関することが明らかであろう。代替的な実施形態において、本発明は、細胞の３つの集団の融合に関し、当該集団のそれぞれが同一の細胞型を複数含んでいる。細胞の集団の融合は大量の細胞培養において行われ得ることを当業者は理解し得る。次いで、所望のハイブリダイズされた細胞は、当該技術分野において公知の方法（例えば選択培地を介した方法）によって、同定および単離され得る。当該選択培地は、例えばヘポキサンチンアミノプテリンチミジン（ＨＡＴ）培地である。代替的に、融合細胞は、特異的な細胞マーカー（例えばＣＤマーカー）の同定を介して、同定および単離され得る。
特定の細胞型または表現型に関する細胞の濃縮だけでなく、マーカー（例えばＣＤマーカー）の発現に基づく細胞の単離は、当該技術分野において公知の方法（例えば蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）法）によって達成され得ることが明らかであろう。
また、本発明の細胞は、所望のタンパク質をコードしているＤＮＡを用いて、一過性または安定にトランスフェクトされ得ることが明らかであろう。一過性または安定にトランスフェクトされたこれらの細胞は、当該技術分野において公知の方法（例えば、トランスフェクションに用いるＤＮＡに選択レポーター遺伝子を含めること）によって同定され得る。そのようなレポーター遺伝子としては、化合物欠乏性の培地におけるトランスフェクトされた細胞の成長を可能にし得る遺伝子（例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈＦｒ）遺伝子）が挙げられ得る。また、レポーターとしては、トランスフェクトされた細胞の視覚的な同定をもたらす遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ遺伝子または緑色蛍光タンパク質（ｇｆｐ）遺伝子）が挙げられ得る。代替的に、レポーター遺伝子は特定の化合物（例えばＧ４１８）に対する耐性を付与し得る。そのようなレポーター遺伝子は当該技術分野において公知である。
好ましい一実施形態において、本発明のハイブリッド細胞は、モノクローナル抗体を発現するために用いられ得る。これまで、モノクローナル抗体の生産は、骨髄腫細胞、および免疫化された動物（例えばマウス）の脾臓に由来するＢ細胞の融合を介して実施されている。しかし、骨髄腫細胞の不安定性、特に遺伝子的な不安定性は、決して十分ではない所望の抗体の発現をもたらし得る。さらに、動物細胞がハイブリドーマの生成に用いられるため、生産された抗体は非ヒトの翻訳後修飾を示す。非ヒトの翻訳後修飾を有している抗体は、ヒトの治療薬として当該抗体が用いられるときに重大な問題を起こし得る。これらの問題としては、抗体のエフェクター機能および免疫原性の低下が挙げられ得、インビボにおける不十分な半減期をもたらし、したがってインビボにおける有効性を低下させる。また、骨髄腫細胞の非存在下において、ハイブリッドは首尾よく生成され得ないことを示唆する証拠がある。本発明のハイブリッド細胞は、驚くべきことに、骨髄腫細胞の非存在下において安定なハイブリッドが生成され得ることを示している。さらに、本発明のハイブリッド細胞から発現される抗体は、ハイブリドーマによって生産されたモノクローナル抗体の使用と関連する問題に対処する。これらの抗体は、ヒト型の翻訳後修飾を示し、機能的な安定性を示す細胞から発現される。
第１の局面によれば、本発明は、
未拘束（uncommitted）の前駆細胞に由来する細胞、または幹細胞であり、骨髄腫細胞ではない第１の細胞；
リンパ系の共通前駆細胞に由来する第２の細胞；ならびに
リンパ系の共通前駆細胞に由来する第３の細胞
のハイブリダイゼーションによって生成された、ハイブリッド細胞を提供する。
一実施形態において、上記第２の細胞はＢリンパ球系統に由来する細胞であり、上記第３の細胞はＢリンパ球系統に由来する細胞である。
他の実施形態において、上記第２の細胞はＴリンパ球系統に由来する細胞であり、上記第３の細胞はＴリンパ球系統に由来する細胞である。
他の実施形態において、上記第２の細胞はＢリンパ球系統に由来する細胞であり、上記第３の細胞はＴリンパ球系統に由来する細胞である。
好ましくは、上記第１の細胞は骨髄性の共通前駆細胞に由来する細胞である。したがって、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞または幹細胞、ならびに２つのＢリンパ球または２つのＴリンパ球のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供することが明らかである。また、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞または幹細胞、Ｂリンパ球、ならびにＴリンパ球のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。
好ましくは、骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞は、骨髄単球性の前駆細胞、単球、マクロファージ、好酸球、好中球、樹状細胞または好塩基球である。したがって、本発明は、骨髄性の前駆細胞、単球、マクロファージ、好酸球、好中球、樹状細胞または好塩基球、ならびに２つのＢリンパ球または２つのＴリンパ球のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供することが明らかである。また、本発明は、骨髄単球性の前駆細胞、単球、マクロファージ、好酸球、好中球、樹状細胞または好塩基球、Ｂリンパ球、ならびにＴリンパ球のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。
好ましくは、骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞は、以下のＣＤ抗原：ＣＤ１６、ＣＤ１５またはＣＤ１４のうち少なくとも１つを提示している。したがって、本発明は、以下のＣＤ抗原：ＣＤ１６、ＣＤ１５またはＣＤ１４のうち少なくとも１つを提示している骨髄性の共通前駆細胞、ならびに２つのＢリンパ球または２つのＴリンパ球のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供することが明らかである。また、本発明は、以下のＣＤ抗原：ＣＤ１６、ＣＤ１５またはＣＤ１４のうち少なくとも１つを提示している骨髄性の共通前駆細胞、Ｂリンパ球、ならびにＴリンパ球のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。
一実施形態において、骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞は単球である。したがって、本発明は、単球、ならびに２つのＢリンパ球または２つのＴリンパ球のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。また、本発明は、単球、Ｂリンパ球およびＴリンパ球のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。
他の実施形態において、骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞は初代培養された骨髄単球性の前駆細胞である。したがって、本発明は、初代培養された骨髄単球性の前駆細胞、ならびに２つのＢリンパ球または２つのＴリンパ球のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。また、本発明は、初代培養された骨髄単球性の前駆細胞、Ｂリンパ球およびＴリンパ球のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。
他の実施形態において、骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞は不死化された細胞である。したがって、本発明は、骨髄単球性の前駆細胞、単球、マクロファージ、好酸球、好中球、樹状細胞または好塩基球から選択される不死化された細胞、ならびに２つのＢリンパ球または２つのＴリンパ球のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供することが明らかである。また、本発明は、骨髄単球性の前駆細胞、単球、マクロファージ、好酸球、好中球、樹状細胞または好塩基球から選択される不死化された細胞、Ｂリンパ球およびＴリンパ球のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。
他の実施形態において、骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞は、脾臓、末梢血、臍帯血または骨髄に由来する。したがって、本発明は、脾臓、末梢血、臍帯血または骨髄に由来する骨髄性の共通前駆細胞、ならびに２つのＢリンパ球または２つのＴリンパ球のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供することが明らかである。また、本発明は、脾臓、末梢血、臍帯血または骨髄に由来する骨髄性の共通前駆細胞、Ｂリンパ球およびＴリンパ球のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。
他の実施形態において、Ｂリンパ球系統に由来する上記細胞は、プレＢ細胞、未成熟なＢ細胞、ナイーブＢ細胞、活性化Ｂ細胞またはエフェクターＢ細胞である。したがって、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞または幹細胞、ならびにプレＢ細胞、未成熟なＢ細胞、ナイーブＢ細胞、活性化Ｂ細胞またはエフェクターＢ細胞から選択される２つのＢリンパ球のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供することが明らかである。また、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞または幹細胞、プレＢ細胞、未成熟なＢ細胞、ナイーブＢ細胞、活性化Ｂ細胞またはエフェクターＢ細胞から選択されるＢリンパ球、ならびにＴリンパ球のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。
一実施形態において、上記エフェクターＢ細胞は、抗原を経験した（antigen-experienced）Ｂ細胞またはプラズマ細胞である。したがって、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞または幹細胞、ならびに抗原を経験したＢ細胞またはプラズマ細胞から選択される２つのＢリンパ球のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。また、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞または幹細胞、抗原を経験したＢ細胞またはプラズマ細胞、ならびにＴリンパ球のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。
一実施形態において、Ｂリンパ球系統に由来する上記細胞は、以下のＣＤ抗原：ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ７２またはＣＤ５のうち少なくとも１つを提示している。したがって、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞または幹細胞、ならびに以下のＣＤ抗原：ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ７２またはＣＤ５のうち少なくとも１つを提示している２つのＢリンパ球のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。また、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞または幹細胞、以下のＣＤ抗原：ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ７２またはＣＤ５のうち少なくとも１つを提示しているＢリンパ球、ならびにＴリンパ球のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。
一実施形態において、Ｔリンパ球系統に由来する上記細胞は、前Ｔ細胞、未成熟Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞、活性化Ｔ細胞またはエフェクターＴ細胞である。したがって、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞または幹細胞、Ｂリンパ球、ならびに前Ｔ細胞、未成熟Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞、活性化Ｔ細胞またはエフェクターＴ細胞から選択されるＴリンパ球のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。また、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞または幹細胞、ならびに前Ｔ細胞、未成熟Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞、活性化Ｔ細胞またはエフェクターＴ細胞から選択される２つのＴリンパ球のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。
一実施形態において、Ｔリンパ球系統に由来する上記細胞は、以下のＣＤ抗原：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５またはＣＤ８のうち少なくとも１つを提示している。したがって、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞または幹細胞、Ｂリンパ球、ならびに以下のＣＤ抗原：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５またはＣＤ８のうち少なくとも１つを提示しているＴリンパ球のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。また、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞または幹細胞、ならびに以下のＣＤ抗原：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５またはＣＤ８のうち少なくとも１つを提示しているＴ細胞から選択される２つのＴリンパ球のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。
一実施形態において、Ｂリンパ球系統に由来する上記細胞は不死化された細胞である。したがって、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞または幹細胞、ならびに少なくとも１つが不死化された細胞であり得る２つのＢリンパ球のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。また、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞または幹細胞、不死のＢリンパ球、ならびにＴリンパ球のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。
一実施形態において、Ｔリンパ球系統に由来する上記細胞は不死化された細胞である。したがって、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞または幹細胞、Ｂリンパ球、ならびに不死のＴリンパ球のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。
一実施形態において、Ｂリンパ球系統に由来する上記細胞はリンパ組織に由来する。したがって、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞または幹細胞、ならびにリンパ組織に由来する２つのＢリンパ球のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。また、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞または幹細胞、リンパ組織に由来するＢリンパ球、ならびにＴリンパ球のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。
一実施形態において、Ｔリンパ球系統に由来する上記細胞はリンパ組織に由来する。したがって、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞または幹細胞、Ｂリンパ球組織、ならびにリンパ組織に由来するＴリンパ球のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。
本発明のハイブリッド細胞に含まれているＢリンパ球またはＴリンパ球がリンパ系組織に由来している場合、当該リンパ組織は、好ましくは、末梢血、臍帯血、脾臓、骨髄、胸腺、扁桃腺、咽頭扁桃腺および所属リンパ節から選択される。
一実施形態において、本発明のハイブリッド細胞の生成において含まれている細胞のうち少なくとも１つはヒト細胞である。また、一実施形態において、本発明のハイブリッド細胞は少なくとも１つのマウス細胞を含み得ることが明らかであろう。
一実施形態において、骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞はＫ５６２細胞である。したがって、本発明は、Ｋ５６２細胞、および２つのＢリンパ球のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供することが明らかであろう。また、本発明は、Ｋ５６２細胞、不死のＢリンパ球、およびＴリンパ球のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。
一実施形態において、上記第２の細胞または第３の細胞は、ＷＩＬ２−ＮＳ細胞またはＭＯＬＴ４細胞である。したがって、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞または幹細胞、ＷＩＬ２−ＮＳ細胞、ならびにＴリンパ球のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供することが明らかであろう。また、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞または幹細胞、Ｂリンパ球、ならびにＭＯＬＴ４細胞のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。
一実施形態において、上記第１の細胞はＫ５６２細胞であり、上記第２の細胞はＷＩＬ２−ＮＳ細胞であり、上記第３の細胞はＭＯＬＴ４細胞である。
他の実施形態において、上記第１の細胞はＫ５６２細胞であり、上記第２の細胞は初代培養されたＢ細胞であり、上記第３の細胞は初代培養されたＴ細胞である。
他の実施形態において、上記第１の細胞は初代培養されたヒト単球であり、上記第２の細胞はＷＩＬ２−ＮＳ細胞であり、上記第３の細胞は初代培養されたＴ細胞である。
他の実施形態において、上記第１の細胞は初代培養されたヒト骨髄性の共通前駆細胞であり、上記第２の細胞はＷＩＬ２−ＮＳ細胞であり、上記第３の細胞は初代培養されたヒトＴ細胞である。
他の実施形態において、上記第１の細胞はＫ５６２細胞であり、上記第２の細胞はＷＩＬ２−ＮＳ細胞であり、上記第３の細胞は初代培養されたＴ細胞である。
他の実施形態において、上記第１の細胞は初代培養された単球であり、上記第２の細胞はＷＩＬ２−ＮＳ細胞であり、上記第３の細胞はＷＩＬ２−ＮＳ細胞である。
他の実施形態において、上記第１の細胞は初代培養されたマウス単球であり、上記第２の細胞はＳＰ２細胞であり、上記第３の細胞は初代培養されたマウスＴ細胞である。
他の実施形態において、上記第１の細胞は初代培養されたマウス単球であり、上記第２の細胞はＳＰ２細胞であり、上記第３の細胞はＳＰ２細胞である。
他の実施形態において、上記第１の細胞は初代培養されたヒトまたはマウス単球であり、上記第２の細胞はＷＩＬ２−ＮＳ細胞であり、上記第３の細胞はＳＰ２細胞である。
一実施形態において、本発明のハイブリッド細胞は所望のタンパク質の１つを発現している。他の実施形態において、本発明のハイブリッド細胞は所望のタンパク質の２つ以上を発現している。特定の実施形態において、本発明のハイブリッド細胞は所望のタンパク質の２つを発現している。他の実施形態において、本発明のハイブリッド細胞は所望のタンパク質の３つを発現している。一実施形態において、上記所望のタンパク質は内在性タンパク質であり、所望のタンパク質の２つ以上が発現されている場合、所望のタンパク質のうち少なくとも１つが内在性タンパク質である。他の実施形態において、上記タンパク質は組換えタンパク質であり、所望のタンパク質の２つ以上が発現されている場合、所望のタンパク質のうち少なくとも１つが組換えタンパク質である。好ましくは、上記タンパク質は、サイトカイン、例えばコロニー刺激因子またはインターロイキンである。一実施形態において、上記タンパク質はＧＭ−ＣＳＦである。他の実施形態において、上記タンパク質はインターロイキン２である。さらに他の実施形態において、上記タンパク質は受容体またはそのフラグメントである。一実施形態において、上記タンパク質は可溶性の受容体である。さらなる実施形態において、上記タンパク質は免疫グロブリンである。
一実施形態において、上記タンパク質はヒトＩＬ−４受容体α鎖である。他の実施形態において、上記タンパク質はＩｇＭである。さらに他の実施形態において、上記タンパク質はＩｇＧである。またさらなる実施形態において、上記タンパク質はＣＤ５４である。
一実施形態において、本発明のハイブリッド細胞が所望のタンパク質の２つ以上を発現している場合、好ましくは、所望タンパク質は、サイトカイン、コロニー刺激因子、インターロイキンまたは受容体もしくはそのフラグメントから選択される。特定の実施形態において、所望のタンパク質は、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＭ、詳細にはヒトの可溶性ＩｇＭ）；サイトカイン（例えばインターロイキン、詳細にはインターロイキン−２（ＩＬ−２）、より詳細にはヒトＩＬ−２）；および／または受容体（詳細にはインターロイキン受容体、より詳細にはヒトインターロイキン受容体、より詳細にはヒトインターロイキン−４受容体α（ＩＬ−４Ｒα））である。
本発明のハイブリッド細胞が、特定の所望のタンパク質を発現することに限定されないし、特定の数のタンパク質を発現することに限定されないことを当業者は理解するであろう。さらに、本発明のハイブリッド細胞からの所望のタンパク質の同時の発現が、所望のタンパク質の発現レベルの増強をもたらし得ることは、当業者にとって明らかであろう。
一実施形態において、本発明のハイブリッド細胞を生成するために用いられる上記ハイブリダイゼーションは電気的手段によってなされる。他の実施形態において、本発明のハイブリッド細胞を生成するために用いられる上記ハイブリダイゼーションは化学的手段によってなされる。
一実施形態において、本発明のハイブリッド細胞は、目的のタンパク質を発現している細胞とさらにハイブリダイズされる。
特定の実施形態において、本発明のハイブリッド細胞は、ＣＤ２５抗原を提示しているＢリンパ球とハイブリダイズされる。
特定の好ましい実施形態において、本発明のハイブリッド細胞は、ＣＤ２５抗原を提示しており、免疫グロブリンを発現している。さらなる実施形態において、本発明のハイブリッド細胞は、ＣＤ２５抗原を提示しているＢリンパ球とハイブリダイズされ、生じた細胞は免疫グロブリンを発現している。
一実施形態において、本発明のハイブリッド細胞を生成するために用いられる上記ハイブリダイゼーションは個々の細胞３つをハイブリダイズすることによって行われる。
他の実施形態において、本発明のハイブリッド細胞を生成するために用いられる上記ハイブリダイゼーションは３つの細胞の集団を用いて行われ、それぞれの当該集団は同一の細胞型または表現型を複数含んでいる。
一実施形態において、本発明の上記ハイブリッド細胞は、所望の翻訳後修飾または所望の機能性を示するタンパク質の発現を可能にするための、細胞型を決定する特定のマーカーに関して濃縮されている。
他の局面において、本発明はタンパク質を製造する方法を提供する。当該方法は、本発明に係るハイブリッド細胞においてタンパク質の発現させる工程を包含している。
他の局面おいて、本発明は、本発明に係るハイブリッド細胞において生産される場合のタンパク質を提供する。
他の局面において、本発明は、本発明に係るハイブリッド細胞を生成する方法を提供する。当該方法は、
未拘束の前駆細胞に由来する細胞、または幹細胞であり、骨髄腫細胞ではない第１の細胞；
リンパ系の共通前駆細胞に由来する第２の細胞；ならびに
リンパ系の共通前駆細胞に由来する第３の細胞
をハイブリダイズする工程を包含している。
本発明の方法の一実施形態において、上記第２の細胞はＢリンパ球系統に由来する細胞であり、上記第３の細胞はＢリンパ球系統に由来する細胞である。
本発明の方法の他の実施形態において、上記第２の細胞はＴリンパ球系統に由来する細胞であり、上記第３の細胞はＴリンパ球系統に由来している。
本発明の方法の他の実施形態において、上記第２の細胞はＢリンパ球系統に由来する細胞であり、上記第３の細胞はＴリンパ球系統に由来する細胞である。
好ましくは、上記第１の細胞は骨髄性の共通前駆細胞に由来する細胞である。したがって、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞または幹細胞、ならびに２つのＢリンパ球または２つのＴリンパ球のハイブリダイゼーションによってハイブリッド細胞を生成する方法を提供することが明らかである。また、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞または幹細胞、Ｂリンパ球ならびにＴリンパ球のハイブリダイゼーションによってハイブリッド細胞を生成する方法を提供する。
好ましくは、骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞は、骨髄単球性の前駆細胞、単球、マクロファージ、好酸球、好中球、樹状細胞または好塩基球である。したがって、本発明は、骨髄単球性の前駆細胞、単球、マクロファージ、好酸球、好中球、樹状細胞または好塩基球、ならびに２つのＢリンパ球または２つのＴリンパ球のハイブリダイゼーションによってハイブリッド細胞を生成する方法を提供することが明らかである。また、本発明は、骨髄単球性の前駆細胞、単球、マクロファージ、好酸球、好中球、樹状細胞または好塩基球、Ｂリンパ球ならびにＴリンパ球のハイブリダイゼーションによってハイブリッド細胞を生成する方法を提供する。
好ましくは、骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞は、以下のＣＤ抗原：ＣＤ１６、ＣＤ１５またはＣＤ１４のうち少なくとも１つを提示している。したがって、本発明は、以下のＣＤ抗原：ＣＤ１６、ＣＤ１５またはＣＤ１４のうち少なくとも１つを提示している骨髄性の共通前駆細胞、ならびに２つのＢリンパ球または２つのＴリンパ球のハイブリダイゼーションによってハイブリッド細胞を生成する方法を提供することが明らかである。また、本発明は、以下のＣＤ抗原：ＣＤ１６、ＣＤ１５またはＣＤ１４のうち少なくとも１つを提示している骨髄性の共通前駆細胞、Ｂリンパ球、ならびにＴリンパ球のハイブリダイゼーションによってハイブリッド細胞を生成する方法を提供する。
一実施形態において、骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞は単球である。したがって、本発明は、単球、ならびに２つのＢリンパ球または２つのＴリンパ球のハイブリダイゼーションによってハイブリッド細胞を生成する方法を提供する。また、本発明は、単球、Ｂリンパ球およびＴリンパ球のハイブリダイゼーションによってハイブリッド細胞を生成する方法を提供する。
他の実施形態において、骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞は初代培養された骨髄単球性の前駆細胞である。したがって、本発明は、初代培養された骨髄単球性の前駆細胞、ならびに２つのＢリンパ球または２つのＴリンパ球のハイブリダイゼーションによってハイブリッド細胞を生成する方法を提供する。また、本発明は、初代培養された骨髄単球性の前駆細胞、Ｂリンパ球およびＴリンパ球のハイブリダイゼーションによってハイブリッド細胞を生成する方法を提供する。
一実施形態において、骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞は不死化された細胞である。したがって、本発明は、骨髄単球性の前駆細胞、単球、マクロファージ、好酸球、好中球、樹状細胞または好塩基球から選択される不死化された細胞、ならびに２つのＢリンパ球または２つのＴリンパ球のハイブリダイゼーションによってハイブリッド細胞を生成する方法を提供することが明らかである。また、本発明は、骨髄単球性の前駆細胞、単球、マクロファージ、好酸球、好中球、樹状細胞または好塩基球から選択される不死化された細胞、Ｂリンパ球、ならびにＴリンパ球のハイブリダイゼーションによってハイブリッド細胞を生成する方法を提供する。
他の実施形態において、骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞は、脾臓、末梢血、臍帯血または骨髄に由来している。したがって、本発明は、脾臓、末梢血、臍帯血または骨髄に由来する骨髄性の共通前駆細胞、ならびに２つのＢリンパ球または２つのＴリンパ球のハイブリダイゼーションによってハイブリッド細胞を生成する方法を提供することが明らかである。また、本発明は、脾臓、末梢血、臍帯血または骨髄に由来する骨髄性の共通前駆細胞、Ｂリンパ球、ならびにＴリンパ球のハイブリダイゼーションによってハイブリッド細胞を生成する方法を提供する。
他の実施形態において、Ｂリンパ球系統に由来する上記細胞は、プレＢ細胞、未成熟なＢ細胞、ナイーブＢ細胞、活性化Ｂ細胞またはエフェクターＢ細胞である。したがって、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞または幹細胞、ならびにプレＢ細胞、未成熟Ｂな細胞、ナイーブＢ細胞、活性化Ｂ細胞またはエフェクターＢ細胞から選択される２つのＢリンパ球のハイブリダイゼーションによってハイブリッド細胞を生成する方法を提供することが明らかである。また、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞または幹細胞、プレＢ細胞、未成熟なＢ細胞、ナイーブＢ細胞、活性化Ｂ細胞またはエフェクターＢ細胞から選択されるＢリンパ球、ならびにＴリンパ球のハイブリダイゼーションによってハイブリッド細胞を生成する方法を提供する。
一実施形態において、上記エフェクターＢ細胞は、プラズマ細胞または抗原を経験したＢ細胞である。したがって、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞または幹細胞、ならびにプラズマ細胞または抗原を経験したＢ細胞から選択される２つのＢリンパ球のハイブリダイゼーションによってハイブリッド細胞を生成する方法を提供する。また、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞または幹細胞、プラズマ細胞または抗原を経験したＢ細胞、およびＴリンパ球のハイブリダイゼーションによってハイブリッド細胞を生成する方法を提供する。
一実施形態において、Ｂリンパ球系統に由来する上記細胞は、以下のＣＤ抗原：ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ７２またはＣＤ５のうち少なくとも１つを提示している。したがって、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞または幹細胞、および以下のＣＤ抗原：ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ７２またはＣＤ５のうち少なくとも１つを提示している２つのＢリンパ球のハイブリダイゼーションによってハイブリッド細胞を生成する方法を提供する。また、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞または幹細胞、以下のＣＤ抗原：ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ７２またはＣＤ５のうち少なくとも１つを提示しているＢリンパ球、およびＴリンパ球のハイブリダイゼーションによってハイブリッド細胞を生成する方法を提供する。
一実施形態において、Ｔリンパ球系統に由来する上記細胞は、前Ｔ細胞、未成熟Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞、活性化Ｔ細胞またはエフェクターＴ細胞である。したがって、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞または幹細胞、Ｂリンパ球、ならびに前Ｔ細胞、未成熟Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞、活性化Ｔ細胞またはエフェクターＴ細胞から選択されるＴリンパ球のハイブリダイゼーションによってハイブリッド細胞を生成する方法を提供する。また、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞または幹細胞、ならびに前Ｔ細胞、未成熟Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞、活性化Ｔ細胞またはエフェクターＴ細胞から選択される２つのＴリンパ球のハイブリダイゼーションによってハイブリッド細胞を生成する方法を提供する。
一実施形態において、Ｔリンパ球系統に由来する上記細胞は、以下のＣＤ抗原：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５またはＣＤ８のうち少なくとも１つを提示している。したがって、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞または幹細胞、Ｂリンパ球、ならびに以下のＣＤ抗原：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５またはＣＤ８のうち少なくとも１つを提示しているＴリンパ球のハイブリダイゼーションによってハイブリッド細胞を生成する方法を提供する。また、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞または幹細胞、ならびに以下のＣＤ抗原：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５またはＣＤ８のうち少なくとも１つを提示しているＴ細胞から選択される２つのＴリンパ球のハイブリダイゼーションによってハイブリッド細胞を生成する方法を提供する。
一実施形態において、Ｂリンパ球系統に由来する上記細胞は不死化された細胞である。したがって、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞または幹細胞、ならびに少なくとも１つが不死化された細胞であり得る２つのＢリンパ球のハイブリダイゼーションによってハイブリッド細胞を生成する方法を提供する。また、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞または幹細胞、不死のＢリンパ球、ならびにＴリンパ球のハイブリダイゼーションによってハイブリッド細胞を生成する方法を提供する。
一実施形態において、Ｔリンパ球系統に由来する上記細胞は不死化された細胞である。したがって、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞または幹細胞、Ｂリンパ球、ならびに不死のＴリンパ球のハイブリダイゼーションによってハイブリッド細胞を生成する方法を提供する。
一実施形態において、Ｂリンパ球系統に由来する上記細胞はリンパ組織に由来している。したがって、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞または幹細胞、ならびにリンパ組織に由来する２つのＢリンパ球のハイブリダイゼーションによってハイブリッド細胞を生成する方法を提供する。また、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞または幹細胞、リンパ組織に由来するＢリンパ球、ならびにＴリンパ球のハイブリダイゼーションによってハイブリッド細胞を生成する方法を提供する。
一実施形態において、Ｔリンパ球系統に由来する上記細胞はリンパ組織に由来するものである。したがって、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞または幹細胞、Ｂリンパ球組織、ならびにリンパ組織に由来するＴリンパ球のハイブリダイゼーションによってハイブリッド細胞を生成する方法を提供する。
本発明のハイブリッド細胞を生成する方法において含まれているＢリンパ球またはＴリンパ球がリンパ組織に由来する場合、当該リンパ組織は、好ましくは、末梢血、臍帯血、脾臓、骨髄、胸腺、扁桃腺、咽頭扁桃腺および所属リンパ節から選択される。
一実施形態において、本発明のハイブリッド細胞を生成する方法において含まれている細胞のうち少なくとも１つはヒト細胞である。また、一実施形態において、本発明のハイブリッド細胞を生成する方法は少なくとも１つのマウス細胞を含み得ることが明らかであろう。
一実施形態において、骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞はＫ５６２細胞である。したがって、本発明は、Ｋ５６２細胞、および２つのＢリンパ球のハイブリダイゼーションによってハイブリッド細胞を生成する方法を提供することが明らかであろう。また、本発明は、Ｋ５６２細胞、不死のＢリンパ球、およびＴリンパ球のハイブリダイゼーションによってハイブリッド細胞を生成する方法を提供する。
一実施形態において、上記第２の細胞または第３の細胞は、ＷＩＬ２−ＮＳ細胞またはＭＯＬＴ４細胞である。したがって、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞または幹細胞、ＷＩＬ２−ＮＳ細胞ならびにＴリンパ球のハイブリダイゼーションによってハイブリッド細胞を生成する方法を提供することが明らかであろう。また、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞または幹細胞、Ｂリンパ球、ならびにＭＯＬＴ４細胞のハイブリダイゼーションによってハイブリッド細胞を生成する方法を提供する。
一実施形態において、上記第１の細胞はＫ５６２細胞であり、上記第２の細胞はＷＩＬ２−ＮＳ細胞であり、上記第３の細胞はＭＯＬＴ４細胞である。
本発明の方法の他の実施形態において、上記第１の細胞はＫ５６２細胞であり、上記第２の細胞は初代培養されたＢ細胞であり、上記第３の細胞は初代培養されたＴ細胞である。
本発明の方法の他の実施形態において、上記第１の細胞は初代培養されたヒト単球であり、上記第２の細胞はＷＩＬ２−ＮＳ細胞であり、上記第３の細胞は初代培養されたＴ細胞である。
本発明の方法の他の実施形態において、上記第１の細胞は初代培養されたヒト骨髄性の共通前駆細胞であり、上記第２の細胞はＷＩＬ２−ＮＳ細胞であり、上記第３の細胞は初代培養されたヒトＴ細胞である。
本発明の方法の他の実施形態において、上記第１の細胞はＫ５６２細胞であり、上記第２の細胞はＷＩＬ２−ＮＳ細胞であり、上記第３の細胞は初代培養されたＴ細胞である。
本発明の方法の他の実施形態において、上記第１の細胞は初代培養された単球であり、上記第２の細胞はＷＩＬ２−ＮＳ細胞であり、上記第３の細胞はＷＩＬ２−ＮＳ細胞である。
本発明の方法の他の実施形態において、上記第１の細胞は初代培養されたマウス単球であり、上記第２の細胞はＳＰ２細胞であり、上記第３の細胞は初代培養されたマウスＴ細胞である。
本発明の方法の他の実施形態において、上記第１の細胞は初代培養されたマウス単球であり、上記第２の細胞はＳＰ２細胞であり、上記第３の細胞はＳＰ２細胞である。
本発明の方法の他の実施形態において、上記第１の細胞は初代培養されたヒトまたはマウス単球であり、上記第２の細胞はＷＩＬ２−ＮＳ細胞であり、上記第３の細胞はＳＰ２細胞である。
〔定義〕
本発明に照らして、「含んでいる（comprise）」および「含んでいる（comprising）」などは、それらの排他的な意味ではなく、「包含しているが、これに限定されない」というそれらの包括的な意味において解釈されるべきである。
（ハイブリッド細胞）
ハイブリッド細胞は、２以上のゲノムに由来する構成要素を含んでいる細胞（接合体およびそれらの派生物以外）である。それは、例えば２以上の生物学的な細胞（親細胞）の、体細胞ハイブリダイゼーション（または全細胞ハイブリダイゼーション）から構築される細胞である。親細胞は、同じ系統（または種）または異なる系統（または種）のいずれかから入手され得る。同じ系統および種から生成されたハイブリッド細胞は自己ハイブリッド（auto-hybrid）と呼ばれ、一方、異なる系統のハイブリッド細胞は異種ハイブリッドと呼ばれる。
（キメラ細胞）
キメラ細胞は、２以上の異なる種に由来するゲノムを有している、人工的に生成されたハイブリッド細胞である。
（系統交雑のハイブリッド細胞）
系統交雑のハイブリッド細胞は、異なる細胞系統に由来する２以上の細胞に由来するゲノムを有している人工的に生成されたハイブリッド細胞である。造血細胞は２つの主な系統：リンパ球系（Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞）ならびに骨髄系（単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球および好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）に分けられる。
（トリハイブリッド細胞（tri-hybrid cell））
トリハイブリッド細胞は、３つの細胞に由来するゲノムを有している、人工的に生成されたハイブリッド細胞である。
（安定な）
細胞に言及するときに、「安定な」という用語は、所定の成長パラメータもしくは生産パラメーターの一貫性を証明する細胞の能力、または増加する世代数に対して細胞株の生産特性の一貫性を意味する。安定な形質転換体に言及して用いられるとき、それは、比較的に一定のレベルにおいて導入遺伝子を、実質的に無期限に発現する細胞株を意味する。
（体細胞ハイブリダイゼーション）
本明細書に照らして、「体細胞ハイブリダイゼーション」という用語は、細胞の原形質膜が良好に接触するよう誘導され、接触点において親細胞の原形質膜の可逆的な破壊が同時に誘導され、新たに形成された単一細胞の外膜の内部にそれぞれの親細胞の本体または細胞小器官が組み込まれるような方法において、単一の生細胞が２以上の二倍体（非生殖細胞）の細胞（親細胞）から生成される過程を指す。新たに形成された単一の細胞はハイブリダイズされた細胞またはハイブリッド細胞と呼ばれる。
（幹細胞）
「幹細胞」という用語は、有糸分裂による分裂能および種々の異なる細胞型への分化能を有している特殊化していない細胞（unspecialised cell）を指す。幹細胞は、胚性幹細胞、臍帯に由来する「成熟な」幹細胞または成体に由来する幹細胞を包含し得る。幹細胞は、すべての細胞型に分化する無制限の能力を有している細胞、すなわち全能細胞を包含している。また、幹細胞は、特殊化した細胞（例えば、全能性、多能性、低能性（oligopotent）または単能性幹細胞）への分化能に制限されている細胞を包含し得る。
（不死化された細胞）
「不死化された細胞」という用語は、無制限に成長する能力を有している細胞を指す。不死化された細胞はインビボの悪性腫瘍または胚に由来し得ることが明確であろう。代替的に、不死化された細胞は、無制限に成長する能力を誘導する処理を細胞に施すことによって入手し得る。これら処理は、例えば、インビトロの形質転換処理（例えばウイルス遺伝子の導入）を包含し得る。当該ウイルス遺伝子は、例えば、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０） Ｔ抗原、アデノウイルス Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ、ならびにヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ） Ｅ６およびＥ７である。代替的に、不死化された細胞はテロメラーゼ逆転写酵素タンパク質（ＴＥＲＴ）の発現または他の方法を経た細胞に由来し得る。また、不死化された細胞は、発癌遺伝子の発現が改変されている細胞に由来し得る。不死化された細胞は無制限に成長する能力を誘導する任意の処理（ＵＶ照射、または不死化の機構が不明である任意の形質転換を包含しているが、これらに限定されない）に由来し得る。
（骨髄腫細胞）
「骨髄腫細胞」という用語は、プラズマ細胞の悪性腫瘍を指す。
（ハイブリドーマ）
「ハイブリドーマ」という用語は、免疫化された動物の脾臓に由来するＢ細胞と、骨髄腫細胞とのハイブリダイゼーションによって生成される細胞を指す。ハイブリドーマはモノクローナル抗体の産生能を有している不死化された細胞である。
（未拘束の前駆細胞）
「未拘束の前駆細胞」という用語は、任意の特定の系統に拘束されることなく、一部の種類の細胞にのみ分化し得るが、自己をもはや回復し得ない幹細胞の初期の子孫を指す。
（骨髄性の共通前駆細胞）
骨髄性の共通前駆細胞は、骨髄系統に制限された造血幹細胞の子孫であり、巨核球／赤血球または顆粒球／マクロファージ前駆細胞のいずれかになり得るが、リンパ球系細胞になり得ない。
（リンパ系の共通前駆細胞）
リンパ系の共通前駆細胞は、リンパ球系統に制限された造血幹細胞の子孫であり、Ｂ、Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞になり得るが、骨髄細胞になり得ない。
（Ｂリンパ球系統に由来する細胞）
Ｂリンパ球系統に由来する細胞は、Ｂ細胞の任意の型になるＢ系統の分化の後の、リンパ系の共通前駆細胞に由来する任意の細胞である。
（Ｔリンパ球系統に由来する細胞）
Ｔリンパ球系統由来の細胞は、Ｔ細胞の任意の型になるＴ系統の分化の後の、リンパ球共通前駆体に由来する任意の細胞である。
（顆粒球−マクロファージ前駆細胞）
顆粒球−マクロファージ前駆細胞は、骨髄性の共通前駆細胞に由来しており、顆粒球および単球の系統に分化するが、巨核球および赤血球の系統には分化しない前駆細胞である。
（巨核球−赤血球前駆細胞）
巨核球−赤血球前駆細胞は、骨髄性の共通前駆細胞に由来しており、巨核球および赤血球の系統に分化するが、顆粒球および単球の系統には分化しない前駆細胞である。
（プレＢ細胞）
プレＢ細胞は、膜結合型ＩｇＭの重鎖が代替軽鎖と共に発現している段階において発達中のＢ細胞である。
（未成熟なＢ細胞）
未成熟なＢ細胞は、抗体の位置の組換え段階においてＶＪがＬ鎖上に再構成され、ＶＤＪがＨ鎖上（ＩｇＭ受容体の発現がみられる）に再構成される骨髄において発達中のＢ細胞を指す。
（ナイーブＢ細胞）
ナイーブＢ細胞は、その表面の免疫グロブリンの無作為な遺伝子再構成を経て骨髄において分化し、成熟しているが、末梢において対応する抗原といまだに接触していない成熟Ｂ細胞である。
（活性化Ｂ細胞）
Ｔ依存性の様式または非依存性の様式におけるクローン性増殖、およびプラズマ細胞への最終分化の組合せを生じるＢＣＲを介した抗原認識を通じて、末梢において対応する抗原に接触した成熟Ｂ細胞型である。
（エフェクターＢ細胞）
エフェクターＢ細胞は、特定の抗原に特異的な抗体および免疫系の他の細胞を機能させるために過剰のサイトカインを分泌する短期生存型のＢ細胞の一種である、抗体分泌プラズマ細胞としばしば同義である。
（記憶Ｂ細胞）
記憶Ｂ細胞は、初期の免疫反応の間に接触した抗原に特異的である活性化Ｂ細胞から形成された長期生存型のＢ細胞であり、同じ抗原に対する２回目のばくろに続く迅速な応答が可能である。
（プラズマ細胞）
プラズマ細胞は、最終的な有糸分裂後の短期生存型の免疫系の細胞であり、ＣＤ４＋リンパ球（Ｔｈ細胞）による刺激によってＢ細胞から分化し、大量の抗体を分泌する。
（前Ｔ細胞）
前Ｔ細胞は、ＴＣＲのβ鎖が二重陰性（ＣＤ４−ＣＤ８−）のＴ細胞（ＣＤ３＋）において発現しており、ＶｂＤｂＪｂが揃いっている段階において発達中のＴ細胞である。
（未成熟Ｔ細胞）
未成熟Ｔ細胞は、骨髄から胸腺に移動しているが、そのＴＣＲの再構成もしくは自己の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子上に提示された自己ペプチドに対するＴＣＲ結合能についての選択が完了していないか、またはそれぞれＭＨＣクラスＩもしくはＩＩ分子に対する細胞のＴＣＲ特異性と正確に相互関係を示すＴキラー系統もしくはＴヘルパー系統への分化を経ていない発達中のＴ細胞である。系統分化は補助受容体分子であるＣＤ８またはＣＤ４の一方の発現を喪失することによって表現型として特徴付けられる。
（ナイーブＴ細胞）
骨髄において分化し、そのＴＣＲの再構成を伴う胸腺における中心的な選択のポジティブおよびネガティブな過程および補助受容体分子の１つの喪失を首尾よく経ているが、末梢において対応する抗原といまだに接触していない成熟Ｔ細胞。
（活性化Ｔ細胞）
活性化Ｔ細胞は、抗原提示細胞上における主要組織適合遺伝子複合体ペプチド（ペプチド：ＭＨＣの複合体）およびＢ７ファミリーメンバーのそれぞれによる、細胞表面上のＴＣＲおよびＣＤ２８の両方の結合を通して、抗原特異的なエフェクターＴ細胞になりつつあるＴ細胞である。
（エフェクターＴ細胞）
エフェクターＴ細胞は、細胞に適切なペプチド：ＭＨＣの複合体を有している当該細胞との接触によって即座に応答可能な短期生存型のＴリンパ球の一種である。
〔図面の簡単な説明〕
図１．同定および分取−精製したＣＤ７１＋Ｋ５６２細胞。
図２．ＣＤ１５およびＣＤ７１陽性のＫ５６２細胞のＦＡＣＳプロファイル；（ａ）ＣＤ７１に関して濃縮されている元のＫ５６２細胞集団の約１８％がＣＤ１５について陽性であった（Ｒ１領域）、（ｂ）培養物における２ヶ月後の、ＣＤ１５陽性のＫ５６２細胞の再分析。
図３．ＣＤ３４＋ＡＭＬ単核細胞上におけるＣＤ１５の発現。
図４．ＣＤ１６のＦＡＣＳプロファイルおよびＣＤ１４磁気ビーズ（ＭＡＣＳ）によって単離したＣＤ１４＋細胞の異なる集団のための分取ゲート。
図５．マウス抗ヒトＣＤ１９抗体およびマウス抗ヒトＣＤ５抗体を用いて染色した臍帯血単核細胞のＦＡＣＳプロファイル。
図６．マウス抗ヒトＣＤ３抗体およびマウス抗ヒトＣＤ５抗体を用いて染色した単核の臍帯血細胞のＦＡＣＳプロファイル。
図７．マウス抗ヒトＣＤ２０抗体およびマウス抗ヒトＣＤ７２抗体を用いて染色した骨髄単核細胞のＦＡＣＳプロファイル。
図８．ＣＤ３およびＣＤ５４についての扁桃単核細胞の典型的なＦＡＣＳプロファイル。
図９．ＩｇＭおよびＩｇＧ陽性の培養したリンパ球の同定；（Ａ）５日間の培養の後にＣＤ１９＋細胞の１８％がＩｇＭ陽性であり、１％が細胞表面上に検出可能なＩｇＧを有していた；（Ｂ）培養１０日後にＩｇＭ陽性リンパ球の割合は２％まで低下し、ＩｇＧ陽性細胞の割合は１５％まで増加した。
図１０．骨髄およびリンパ球起源の発癌遺伝子を有しているＫＭＷトリハイブリッド細胞上におけるＣＤの発現のＦＡＣＳプロファイル。
図１１．初代培養された混合の脾臓リンパ球、分取したＣＤ４およびＣＤ１９の集団、ならびに得られたＫＢＴトリハイブリッド細胞株上におけるＣＤ４およびＣＤ１９の発現；（ａ）初代培養された脾臓リンパ球上におけるＣＤ４およびＣＤ１９の発現；（ｂ）分取したＣＤ１９＋細胞の純度プロファイル（９８．１％）；（ｃ）分取したＣＤ４＋細胞の純度プロファイル（９６．８％）；（ｄ）トリハイブリッド細胞上におけるＣＤ１９およびＣＤ４の共発現。９９％を超えるトリハイブリッド細胞集団がＢ細胞およびＴ細胞の両方についてのマーカーを共発現している。
図１２．不死の骨髄細胞および抗原を経験した初代培養された２つのリンパ球に由来するＫＢＴトリハイブリッド上におけるＣＤ１９、ＣＤ３およびＣＤ５の発現；（ａ）ＫＢＴトリハイブリッド細胞の表面上におけるＣＤ１９およびＣＤ５の発現、（ｂ）ＫＢＴトリハイブリッド上におけるＣＤ３およびＣＤ５の発現。
図１３．不死の骨髄細胞、ならびに骨髄および胸腺に由来する初代培養された２つのリンパ細胞に由来するＫＢＴトリハイブリッド上におけるＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ７２およびＣＤ２０の表面発現；（ａ）ＣＤ４およびＣＤ８の発現、（ｂ）ＣＤ４およびＣＤ７２の発現、（ｃ）ＣＤ２０およびＣＤ８の発現。
図１４．リンパ球起源の発癌遺伝子、ならびに初代培養された細胞に由来するＣＤ４およびＣＤ１４を有しているＷＴＭトリハイブリッド株上におけるＣＤの発現のＦＡＣＳプロファイル；（ａ）高レベルのＣＤ４の発現を有しているＣＤ１９細胞（ＣＤ１９ＣＤ４Ｈ）の集団および低レベルのＣＤ４の発現を有しているＣＤ１９細胞（ＣＤ１９ＣＤ４Ｌ）の集団を示すトリハイブリッド細胞上におけるＣＤ１９およびＣＤ４の共発現；（ｂ）ＣＤ１４の高発現または低発現に基づく細胞集団（ＣＤ４ＨＣＤ１４Ｌ、ＣＤ４ＨＣＤ１４Ｈ、ＣＤ４ＬＣＤ１４Ｈ）の不均質性をさらに示す同じＣＤ１９陽性トリハイブリッド集団上におけるＣＤ４およびＣＤ１４の共発現。
図１５．リンパ球起源のＷＩＬ２−ＮＳの発癌遺伝子、抗原を経験したＴ細胞に由来するＣＤ５、および初代培養された単球細胞に由来するＣＤ１４を有しているＷＴＭトリハイブリッド細胞上におけるＣＤの発現の典型的なＦＡＣＳプロファイル。
図１６．リンパ球起源のＷＩＬ２ＮＳの発癌遺伝子、細胞傷害性Ｔ細胞に由来するＣＤ８、および初代培養された単球細胞に由来するＣＤ１４を有しているＷＴＭトリハイブリッド細胞上におけるＣＤの発現のＦＡＣＳプロファイル。
図１７．二重のＣＤ陽性なＴ細胞に由来するＷＴＭトリハイブリッド細胞上におけるＣＤ４およびＣＤ８の共発現のＦＡＣＳプロファイル。
図１８．骨髄単球性の前駆細胞に由来するＷＴＭトリハイブリッド細胞の表面上におけるＣＤの発現；（Ａ）ＣＤ１９、ＣＤ４およびＣＤ１５による三色の染色、ならびに（Ｂ）骨髄単球性の前駆体に由来するＣＤ３４およびＣＤ１５、ならびにエフェクターＴ細胞に由来するＣＤ４による三色の染色（tri-colour staining）。
図１９．ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞に由来するＫＷＴトリハイブリッド細胞の系統特異的なマーカーの発現。
図２０．二重陽性ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞に由来するＫＷＴトリハイブリッド細胞の系統特異的なマーカーの発現。
図２１．ＣＤ５＋抗原を経験したＴ細胞に由来するＫＷＴトリハイブリッド細胞の系統特異的なマーカーの発現。
図２２．それぞれリンパ球の発癌遺伝子を含んでいる２つの細胞、および初代培養された１つの単球細胞に由来するＷＷＭトリハイブリッド細胞の典型的なＣＤ発現プロファイル；（ａ）ＣＤ１４を発現していないＣＤ１９陽性細胞（Ｒ２領域）と全く異なる集団を示すトリハイブリッド細胞上におけるＣＤ１９およびＣＤ１４の共発現（Ｒ１領域）；（ｂ）Ｒ１におおいて分取した細胞に由来するトリハイブリッド細胞、および２ヶ月間の培養において増殖させたトリハイブリッド細胞上におけるＣＤ１４の発現；（ｃ）Ｒ２領域の分取した集団に由来するトリハイブリッド細胞上の２ヶ月後における表面のＣＤ１４の欠如。
図２３．ＷＷＭトリハイブリッド細胞の異なる亜集団から得たＣＤ１４についての代表的なＲＴ−ＰＣＲ。
図２４．Ｋ５６２細胞の単一クローンの核型分類。この結果は、Ｋ５６２細胞株が６９本の染色体数を有している三倍体であることを示した。以下の染色体異常を検出した：１本のＸ染色体の欠損；バンドｑ３３およびｑ３５を含んでいる第２染色体の長腕の偏動原体逆位：第３染色体の欠損、ｑ１１．２からの断片を置換している由来不明の過剰な染色体部分を有している過剰な第５染色体の派生物；第６染色体の短腕のバンドｐ２１．２およびｐ２３の間における断片の重複；バンドｐ１３およびｐ２２を含んでいる第７染色体の短腕の偏動原体逆位を伴う過剰な第７染色体；１本の第９染色体の欠損；第９染色体の短腕のバンドｐ１３からの末端部欠失；２つの第９染色体由来の断片を含んでいる、転座に起因する第９染色体の派生物；第３染色体および第１０染色体由来の断片を含んでいる、転座に起因する第１０染色体の派生物；第１３染色体の欠損；１本の第１３染色体の短腕上の由来不明の過剰な染色体部分；第１４染色体の欠損；２つの第１７染色体上のｐ１３からの断片と置換している由来不明の過剰な部分；第１染色体および第１８染色体由来の断片を含んでいる、転座に起因する第１８染色体の派生物；第２０染色体の欠損；第１染色体および第２１染色体の断片を含んでいる、転座に起因する第２１染色体の派生物；１本の第２２染色体の欠損；５本の過剰な異なる標識染色体。
図２５．ＷＩＬ２ＮＳ細胞株の５つのクローンのうちの１つの核型分類。このクローン（クローン１）において、以下の異常を検出した；第１染色体および第８染色体由来の断片を含んでいる、転座に起因する第８派生染色体；第１３染色体の過剰なホモログ；第５染色体および第１４染色体の断片を含んでいる、転座に起因する第１４染色体の派生物；第１７染色体におけるｑ２２〜ｑ２３由来の断片の重複。
図２６．ＫＢＴ−１（ＣＤ１９＋）＆（ＣＤ４＋）トリハイブリッド株の核型分類であり、近三倍体である単一細胞クローンを示す。染色体の総数はランダムな欠損に起因して６５〜６６本と異なっていたが、分類群における典型的染色体数（a modal number of chromosomes）が６６であった。以下の染色体異常を検出した：Ｘ染色体の短腕およびおそらく２本の他の由来不明の染色体を含んでいる複合型転座から形成された派生Ｘ染色体；バンドｑ３３およびｑ３５を含んでいる第２染色体の長腕における偏動原体逆位；第３染色体の欠損；３ｐ染色体の欠失；第４染色体および他の由来不明の染色体の断片を含んでいる、第４染色体の派生物；ｑ１１．２からの断片を置換している由来不明の過剰な染色体部分を有している過剰な第５染色体の派生物；第６染色体の短腕のバンドｐ２１．２およびｐ２３の間における断片の重複；第７染色体の長腕およびマーカー３の長腕を含んでいる過剰な第７染色体の派生物；１本の第１３染色体の欠損；１本の第１３染色体の短腕上の由来不明の過剰な染色体部分；１本の第１４染色体の欠損；１本の第１５染色体の欠損；２つの第１７染色体上のｐ１３からの断片を置換している由来不明の過剰部分；第１染色体および第１８染色体由来の断片を含んでいる、転座に起因する第１８染色体の派生物；１本の第２０染色体の欠損；第１染色体および第２１染色体由来の断片を含んでいる、転座に起因する第２１染色体の派生物；第２２染色体の欠損；４本の過剰な異なる標識染色体。
図２７．ＫＢＴ（Ｋ５６２、ＣＤ２０＋ＣＤ７２＋およびＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞）系統交雑のトリハイブリッド（すなわちＫＢＴ−２系統交雑の）の核型分類であり、近三倍体である４つのクローンを示しており、（Ａ）クローン１は、６７本の染色体数を有し、以下の染色体異常を有している：Ｘ染色体の短腕およびおそらく２本の他の由来不明の染色体を含んでいる複合型転座から形成されたＸ染色体の派生物；１本のＸ染色体の欠損；第１染色体および第４染色体の可能性が最も高いもの由来の断片を含んでいる、第１染色体の派生物；バンドｑ３３およびｑ３５を含んでいる第２染色体の長腕における偏動原体逆位；１本の第３染色体の欠損；小さい第４染色体の派生物であろう欠失した第４染色体の可能性が最も高いもの；ｑ１１．２からの断片を置換している由来不明の過剰な染色体部分を有している過剰な第５染色体の派生物；第６染色体の短腕のバンドｐ２１．２およびｐ２３の間における断片の重複；第７染色体の長腕およびマーカー３の長腕を含んでいる過剰な第７染色体の派生物；１本の第９染色体の欠損；第９染色体の短腕におけるバンドｐ１３からの末端部欠失；２本の第９染色体由来の断片を含んでいる、転座に起因する第９染色体の派生物；第３染色体および第１０染色体由来の断片を含んでいる、転座に起因する第１０染色体の派生物；１本の第１３染色体の欠損；１本の第１３染色体の短腕上の由来不明の過剰な染色体部分；１本の第１４染色体の欠損；２本の第１７染色体上のｐ１３からの断片と置換された由来不明の過剰部分；第１染色体および第１８染色体由来の断片を含んでいる、転座に起因する第１８染色体の派生物；１本の第２０染色体の欠損；第１染色体および第２１染色体の断片を含んでいる、転座に起因する第２１染色体の派生物；１本の第２２染色体の欠損；４本の過剰な異なる標識染色体、（Ｂ）クローン２はランダムな欠損に起因して６５から６７本の染色体を含んでおり（分類群における典型的染色体数は６７）、クローン１の第４染色体の欠損が第４染色体および他の由来不明の染色体の断片を含んでいる明確な第４染色体の派生物に代替されていることを除いて、クローン１と類似している染色体特性を有している、（Ｃ）クローン３は基本的にクローン１と同様であるが、第１染色体の派生物が欠損し、第１染色体および第４染色体の断片に由来する異なる第４染色体の派生物が存在する。クローン３は６７の分類群における典型的染色体数を伴って、ランダムな欠損に起因して６７から６８本の染色体を含んでいる、（Ｄ）クローン４は基本的にクローン１と同様であるが、第１染色体の欠損、ならびに第１染色体および第４染色体の断片を含んでいる、転座に起因する異なる第１染色体の派生物が存在する。２つのみの正常な第５染色体およびサテライトされた５ｑとみられる第５染色体の派生物が存在する。
図２８．ＫＷＴ−１トリハイブリッド株（不死の骨髄細胞およびＢリンパ球ならびに初代培養された成熟ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞に由来するＫＷＴトリハイブリッド）の核型分類であり、分類群における１２９から１４０の典型的染色体数および以下の染色体異常を有している近六倍体である単一クローンを示す：２本のＸ染色体の欠損；１本の第１染色体の欠損；１本の第２染色体の欠損；バンドｑ３３およびｑ３５を含んでいる第２染色体の長腕における偏動原体逆位；２本の第３染色体の欠損；１本の第４染色体の欠損；ｑ３５からの断片を置換している由来不明の過剰な染色体部分を有している第４染色体の派生物；１本の過剰な第５染色体のホモログ；ｑ１１．２からの断片を置換している由来不明の過剰な染色体部分を有している２つの過剰な第５染色体の派生物；１本の過剰な第６染色体のホモログ；第６染色体の短腕のバンドｐ２１．２およびｐ２３の間における断片の重複を有している過剰な第６染色体；１本の過剰な第７染色体のホモログ；バンドｐ１３およびｐ２２を含んでいる第７染色体の短腕における偏動原体逆位を有している２つの第７染色体；第１染色体および第８染色体由来の断片を含んでいる、転座に起因する第８染色体の派生物；２本の第９染色体の欠損；第９染色体の短腕におけるバンドｐ１３からの末端部欠失；２本の第９染色体由来の断片を含んでいる、転座に起因する２本の第９染色体の派生物；第３染色体および第１０染色体由来の断片を含んでいる、転座に起因する第１０染色体の派生物；１本の第１２染色体の欠損；１本の第１３染色体の短腕上の由来不明の過剰な染色体部分を有している１本の第１３染色体；２本の第１４染色体の欠損；第５染色体および第１４染色体由来の断片を含んでいる、転座に起因する第１４染色体の派生物；１本の第１５染色体の欠損；１本の第１７染色体の欠損；２本の第１７染色体上のｐ１３からの断片と置換している由来不明の過剰部分を有している２本の第１７染色体；ｑ２２〜ｑ２３由来の断片における重複を有している２本の第１７染色体；２本の第１８染色体の欠損；過剰な第２０染色体；第１染色体および第２１染色体の断片を含んでいる、転座に起因する第２１染色体の派生物；１本の第２２染色体の欠損；２コピーの標識第２染色体を有している７本の過剰な標識染色体。
図２９．ＫＷＴ−２（不死の骨髄細胞およびＢリンパ球ならびに初代培養された記憶ＣＤ３＋ＣＤ５＋Ｔ細胞に由来するＫＷＴトリハイブリッド株）の核型分類であり、分類群における１３５から１４２の典型的染色体数および以下の染色体異常を有している近六倍体である単一クローンを示す：２本のＸ染色体の欠損；１本の第１染色体の欠損；１本の第２染色体の欠損；バンドｑ３３およびｑ３５を含んでいる第２染色体の長腕における偏動原体逆位；２本の第３染色体の欠損；１本の第４染色体の欠損；ｑ３５からの断片を置換している由来不明の過剰な染色体部分を有している第４染色体の派生物；１本の過剰な第５染色体のホモログ；ｑ１１．２からの断片を置換している由来不明の過剰な染色体部分を有している２つの過剰な第５染色体の派生物；１本の過剰な第６染色体の相同物；第６染色体の短腕のバンドｐ２１．２およびｐ２３の間における断片の重複を有している過剰な第６染色体；バンドｐ１３およびｐ２２を含んでいる第７染色体の短腕における偏動原体逆位を有している２つの第７染色体；第１染色体および第８染色体の断片を含んでいる、転座に起因する第８染色体の派生物；２本の第９染色体の欠損；第９染色体の短腕におけるバンドｐ１３からの末端部欠失；２本の第９染色体由来の断片を含んでいる、転座に起因する２本の第９染色体の派生物；第３染色体および第１０染色体由来の断片を含んでいる、転座に起因する第１０染色体の派生物；１本の第１２染色体の欠損；１本の第１３染色体の短腕上の由来不明の過剰な染色体部分を有している１本の第１３染色体；２本の第１４染色体の欠損；第５染色体および第１４染色体由来の断片を含んでいる、転座に起因する第１４染色体の派生物；１本の第１５染色体の欠損；１本の第１７染色体の欠損；２本の第１７染色体上のｐ１３からの断片と置換された由来不明の過剰部分を有している２本の第１７染色体；ｑ２２〜ｑ２３由来の断片における重複を有している２本の第１７染色体；２本の第１８染色体の欠損；過剰な第２０染色体；第１染色体および第２１染色体の断片を含んでいる、転座に起因する第２１染色体の派生物；１本の第２２染色体の欠損；標識第２番染色体の２つのコピーを有している８本の過剰な標識染色体。
図３０．ＫＷＴ−３トリハイブリッド株（不死の骨髄細胞およびＢリンパ球ならびに初代培養された二重陽性ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞に由来するＫＷＴトリハイブリッド）の核型分類であり、分類群における１２４から１３９の典型的染色体数を有している高五倍体である３つのクローンを示す。（Ａ）クローン１は以下の染色体異常を有している：３本のＸ染色体および１本のＹ染色体；過剰な第１染色体；２本の過剰な第２染色体；バンドｑ３３およびｑ３５を含んでいる第２染色体の長腕における偏動原体逆位；１本の第３染色体の欠損；第５染色体および由来不明の染色体を含んでいる転座に起因する第５染色体の過剰な派生物；過剰な第６染色体；第６染色体の短腕のバンドｐ２１．２およびｐ２３の間における断片の重複；バンドｐ１３およびｐ２２を含んでいる第７染色体の短腕の過剰な偏動原体逆位；第１染色体および第８染色体の断片を含んでいる、転座に起因する第８染色体の派生物；第９染色体の短腕におけるバンドｐ１３からの末端部欠失；２本の第９染色体由来の断片を含んでいる、転座に起因する第９染色体の派生物；２本の過剰な第１０染色体；第３染色体および第１０染色体由来の断片を含んでいる、転座に起因する２本の第１０染色体の派生物；２本の過剰な第１３染色体；１本の第１３染色体の短腕上の由来不明の過剰な染色体部分；１本の第１４染色体の欠損；第５染色体および第１４染色体由来の断片を含んでいる、転座に起因する第１４染色体の派生物；３本の第１７染色体上のｐ１３からの断片と置換された由来不明の過剰部分；ｑ２２〜ｑ２３由来の断片における第１７染色体の重複の２本の染色体；過剰な第１８染色体；第１染色体および第１８染色体の断片を含んでいる、転座に起因する第１８染色体の派生物；過剰な第１９染色体；１本の第２０染色体の欠損；第１染色体および第２１染色体の断片を含んでいる、転座に起因する第２１染色体の派生物；標識第４染色体および標識第５染色体のそれぞれの２つのコピーを有している５本の過剰な標識染色体。（Ｂ）クローン２は１本の第９染色体を欠損していることを除いて、クローン１と類似の染色体異常を有している。（Ｃ）クローン３は第２染色体の長腕における偏動原体逆位がバンドｑ３３およびｑ３５を含んでいる長腕における偏動原体逆位によって生じた第２染色体の派生物を含んでいる同腕染色体の形成に起因する第２染色体の同腕派生物に代替されていることを除いて、クローン２と同様の染色体異常を含んでいる。
図３１．ＷＷＭトリハイブリッド（Ａ）およびそのＣＤ１４に関して濃縮されている亜系統（Ｂ）の核型分類であり、元のＷＷＭトリハイブリッドにおける５５％からそのＣＤ１４に関して濃縮されている亜系統における９５％までその存在が増加している単一優性クローン（a single dominant clone）を示する。それぞれ分類群における４７の典型的染色体数および以下の染色体異常を有している：第１染色体および第８染色体に由来する断片を含んでいる、転座に起因する第８染色体の派生物；過剰な第１３染色体の相同物；転座に起因する第１４染色体が第５染色体および第１４染色体に由来する断片を含んでいる場合の派生物；ｑ２２〜ｑ２３由来の断片の第１７染色体における重複；第３染色体および第２１染色体由来の断片を含んでいる、転座に起因する第２１染色体の派生物。元のＷＷＭトリハイブリッドとそのＣＤ１４に関して濃縮されている亜系統との間における唯一の違いは、これらの異常が元のＷＷＴトリハイブリッドにおいては５５％の細胞だけに存在し、ＣＤ１４に関して濃縮されている亜系統の９５％の細胞に存在していることである。ＷＷＭトリハイブリッドにおける残りの細胞は、近三倍体（ランダムな染色体欠損を伴う）から近四倍体（ランダムな染色体欠損を伴う）までに分布している。
図３２．ＰｒｏＧＭ培養物に由来する上清のウェスタンブロット。レーン１および２はそれぞれ非活性化および活性化の４日目のヒトＴリンパ球の培養物の上清がロードされている。レーン４および５はそれぞれツニコマイシンの非存在下または存在下において成長させたＰｒｏＧＭの培養物の上清を含んでいる。ＧＭ−ＣＳＦを発現していない細胞の上清をレーン３において用いた。参考として、大腸菌から得られた組換えｈＧＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ）をレーン６に用いた。
図３３．ＰｒｏＧＭハイブリッド株によって産生されたヒトＧＭ−ＣＳＦのゲル電気泳動。ツニカマイシンと共に培養した（レーン３および４）およびツニカマイシンなしで培養した（レーン１および２）サンプルから得たＰｒｏＧＭハイブリッド株の細胞上清を、ラット抗ヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体（レーン１および３）およびラット抗マウスＧＭ−ＣＳＦ抗体（レーン２および４）を用いて免疫沈降させた。タンパク質を銀染色によって可視化した。
図３４．ＰｒｏＣＤ５４細胞株、およびそのＣＤ５４に関して濃縮されている亜系統であるＰｒｏＣＤ５４ＥＸの表面上におけるＣＤ４およびＣＤ５４の発現；（ａ）ＰｒｏＣＤ５４細胞の１００％がＣＤ４の発現を保持していた。細胞集団の約７２％が同様にＣＤ５４について陽性であり、低レベルから高レベルの発現に分布していた。中間レベルから高レベルのＣＤ５４の発現を有しているＣＤ４＋ＣＤ５４＋表現型の特性を有している細胞集団の４２％をゲートして分取した、また（ｂ）元のＰｒｏＣＤ５４の分取したＣＤ４＋ＣＤ５４＋亜系統の表面上におけるＣＤ４およびＣＤ５４の発現の分析は、９８％の細胞が６ヶ月を超える培養の後も依然として両方のマーカーについて陽性であることを示す。
図３５．ＰｒｏＣＤ５４およびＰｒｏＣＤ５４ＥＸ細胞によって分泌された可溶性のヒトＣＤ５４のウェスタンブロット。ＫＷＴトリハイブリッドパートナー細胞株の細胞を対照として用いた。ＰｒｏＣＤ５４およびＰｒｏＣＤ５４ＥＸ細胞の両方が約８２ｋＤａの可溶型のＣＤ５４を放出している。
図３６．ＰｒｏＣＤ５４およびＰｒｏＣＤ５４ＥＸ細胞におけるＩＣＡＭ−１遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。
図３７．ｈＩＬ４−Ｒα鎖を一過性にトランスフェクトしたＫＢＴトリハイブリッド細胞株（トランスフェクションから２４、４８および７２時間後における）に由来する細胞抽出物のウェスタンブロット分析。１００ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ４によって刺激されたヒトＰＢＭＬおよびトランスフェクトしていないＫＢＴ細胞をそれぞれｈＩＬ４−Ｒα鎖についての陽性対照および陰性対照として用いた。
図３８．ｈＩＬ−２をトランスフェクトしたＫＢＴトリハイブリッド細胞におけるｈＩＬ−２のｍＲＮＡの検出についてのＰＣＲ産生量。発現のレベルはＣＤ８＋ヒトＴリンパ球およびジャーカット細胞から得られたものと類似している。トランスフェクトしていないＫＢＴ細胞およびＫ５６２細胞を陰性対照として用いた。
図３９．（ａ）元のＫＢＴトリハイブリッド細胞および（ｂ）ＫＢＴ ＴＲ−ＩＬ２細胞における細胞内ｈＩＬ−２についてのＦＡＣＳ分析。ＫＢＴ細胞の約４１％がＣＤ６９活性化分子について陽性であった。ＫＢＴ ＴＲ−ＩＬ２細胞の９２％が細胞内ｈＩＬ−２について陽性に染色された（Ｒ１＋Ｒ２）。ｈＩＬ−２陰性細胞はＣＤ６９陽性集団の一部である。一方、ＣＤ６９陰性細胞は細胞内ｈＩＬ２について全て陽性であった。
図４０．ＲＰ−ＨＰＬＣに続く、ｈＧＭ−ＣＳＦに対するアフィニティー吸収の後の得られた溶出プロファイル。
図４１．ＲＰ−ＨＰＬＣに続く、ｈＧＭ−ＣＳＦに対するアフィニティー免疫吸収の後に回収された画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（下図）およびウェスタンブロット（上図）。ウェスタンブロットは、Ｐｒｏ−ＧＭ−ＳＦによって分泌されたｈＧＭ−ＣＳＦの分子量プロファイルにおける画分間の変化を明らかにした。２４から２８分において溶出された画分は、ＲＰ−ＨＰＬＣ溶出プロファイルにおける第１のピークと一致し、２９から３１分の間に回収された画分は第２のピークに相当する。一方、第３のピークは３４から３６分の間に回収された画分に滴下した。
図４２．ＰＨＡ活性化ヒトリンパ球の培養の培養物由来のＣＤ４＋細胞の分離：（Ａ）抗ヒトＣＤ４−ＦＩＴＣを用いて標識した細胞をゲートして（Ｒ１）、残りの細胞集団から分取した。分取した細胞をさらに純度について分析した；（Ｂ）分取した集団における細胞の１００％がＣＤ４陽性であった。
図４３．Ｐｒｏ−ＧＭｓｆに由来する脱グリコシル化ｈＧＭ−ＣＳＦのゲル電気泳動。精製したｈＧＭ−ＣＳＦを、ＰＨＧａｓｅ Ｆ消化に対して異なる期間にわたってさらした。レーン１−０分間にわたって、レーン２−１０分間にわたって、レーン３−２０分間にわたって、レーン４−４０分間のインキュベーション。レーン５−大腸菌から得られた組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ。タンパク質を銀染色によって可視化した。分子量マーカーを示す。
図４４．マウス骨髄腫Ｓｐ２細胞株のＴｆＲ＋細胞の同定および分取。
図４５．抗マウスＣＤ４および抗マウスＣＤ８を用いて染色した（ａ）末梢血および（ｂ）脾臓に由来するマウス単核細胞のＦＡＣＳプロファイル。ゲートした領域Ｒ１およびＲ３は単独陽性のエフェクターヘルパー（ＣＤ４＋ＣＤ８−）および細胞傷害性（ＣＤ８＋ＣＤ４−）Ｔ細胞に相当する。一方、Ｒ２は二重陽性（ＣＤ４＋ＣＤ８＋）のＴ細胞を含んでいる。
図４６．磁気ビーズを用いた負の選択によって末梢血から単離したマウス単球の純度プロファイル。単離した細胞の１００％がＣＤ１１ｂについて陽性であったが、同時に、これら細胞が９８％を超えて、Ｂ２２０、ＣＤ９０、ＣＤ４９ｂおよびＮＫ１．１について陰性であった。ＣＤ１１ｂ＋細胞の約３８％が低いレベルにおいてそれらの表面上にＬｙ５Ｇを発現していた。
図４７．リンパ球の不死の１つの細胞Ｓｐ２、初代培養されたマウスＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ１１ｂ＋単球に由来するＳＴｍＭｍトリハイブリッド上におけるＣＤ１３８、ＣＤ４およびＣＤ１１ｂの発現のＦＡＣＳプロファイル。Ｂリンパ球系統の核型をトリハイブリッド細胞の１００％におけるＣＤ１３８の発現によって確かめた、（ａ）および（ｂ）細胞集団の少なくとも８２％が３つのＣＤマーカーの全てを発現しており、わずか５％の細胞がＣＤ４またはＣＤ１１ｂのいずれかを共発現することなくＣＤ１３８陽性であった。
図４８．マウスリンパ球の不死の１つの細胞Ｓｐ２、初代培養されたマウス細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞およびマウスＣＤ１１ｂ＋単球に由来するＳＴｍＭｍトリハイブリッド上におけるＣＤ１３８、ＣＤ８およびＣＤ１１ｂの発現の典型的なＦＡＣＳプロファイル。マウスＣＤ１３８の発現がトリハイブリッド細胞（ａ）および（ｂ）の９７〜１００％において確認されたが、Ｔ細胞および単球マーカーの共発現はそれぞれトリハイブリッド細胞集団の５６％および５７％において検出された。トリハイブリッド集団全体の約４０％が３つのマーカーの全てを共発現しており、（ｃ）１４％のみがそれらの表面上にＣＤ８およびＣＤ１１ｂの何れも発現していなかった。
図４９．マウスリンパ球の不死の１つの細胞Ｓｐ２、初代培養された１つのマウス二重陽性ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、および初代培養された１つのマウスＣＤ１１ｂ＋単球に由来するＳＴｍＭｍトリハイブリッド上におけるＣＤ１３８、ＣＤ８およびＣＤ１１ｂの発現の典型的なＦＡＣＳプロファイル。トリハイブリッド細胞集団の９８〜１００％がＣＤ１３８について陽性であり、集団の９３％が同様にＣＤ８について陽性であった（ｂ）。細胞集団全体の約５７〜６０％がＣＤ１３８、ＣＤ８およびＣＤ１１ｂについて同時に陽性であった。
図５０．マウスリンパ球の不死の１つの細胞Ｓｐ２、初代培養された１つのマウス二重陽性ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、および初代培養された１つの単球に由来するＳＴｍＭｍトリハイブリッドの表面上におけるＣＤ４およびＣＤ８の発現の典型的なプロファイル。細胞の９５％がＣＤ８について陽性であったが、トリハイブリッド集団の５０％のみがＣＤ４およびＣＤ８を共発現していた。特に、実質的にＣＤ４＋集団全体がＣＤ８についても陽性であった。
図５１．ＳＳＭｍトリハイブリッドの表面上におけるＣＤ１３８およびＣＤ１１ｂの発現の典型的なプロファイルであり、トリハイブリッド集団の９３％がＣＤ１３８について陽性の染色を示し、７０％の細胞がＣＤ１１ｂを共発現している。
図５２．ＳＷＭｍ（ａ）およびＳＷＭｈ（ｂ）トリハイブリッドの表面上のヒトＣＤ７１およびマウスＴｆＲの発現の典型的なプロファイル。単球の起源がマウスまたはヒトであるかに関わらず、トリハイブリッドの１００％がヒトおよびマウスの両方のトランスフェリン受容体について陽性であった。
図５３．ＳＷＭｍ（ａ）およびＳＷＭｈ（ｂ）トリハイブリッド上のマウスＣＤ１３８の発現およびマウスＣＤ１１ｂまたはヒトＣＤ１４の典型的なプロファイル。マウスＣＤ１３８の発現は単球のマウスまたはヒト起源に依存的なようである。ＳＷＭｍトリハイブリッドの８４％がマウスＣＤ１３８について陽性であったが、ＳＷＭｈの２９％のみがそれらの表面上にマウスＣＤ１３８を有していた。
図５４．ＳＷＭｈキメラトリハイブリッドの表面上のヒトＣＤ１９およびヒトＣＤ１４の発現のＦＡＣＳプロファイルは、９６％の細胞がヒトＣＤ１９を発現しており、６６％がヒトＣＤ１４を共発現していることを示す。
図５５．単一細胞の操作／供給系。
図５６．ガラスのマイクロピペット。
図５７．微小電極。
図５８．平行な２つの微小電極。
図５９．組織培養プレートのウェルにおける２つの微小電極。
図６０．２つの微小電極の中間に３つの細胞を含んでいるウェルの上面図。
図６１．図６０のウェルの側面図。
図６２．１つのＫＢＴ細胞および１つのｓＩｇＭ＋ＣＤ２５＋Ｂ細胞のハイブリダイゼーションによって生成したハイブリッド細胞の表面上におけるＣＤ２５およびｓＩｇＭの発現（第２のタンパク質ｈＩＬ−２の安定的トランスフェクションの前（Ａ）および後（Ｂ））。
〔発明の詳細な記載〕
本発明の好ましい実施形態を、添付の図面を参照して、以下の非限定的な実施例によってさらに記載する。
＜実施例１＞
１．細胞の選択、細胞の操作および単一細胞のクローニング
以下の実施例は、系統交雑のトリハイブリッドの生成および所望のタンパク質の発現に用いる哺乳類細胞株および初代培養された細胞の、選択および単離（または分取）を包含している細胞の調製について記載している。特定の特性を有している細胞の単一集団を得るための特定の選択法の選択、または特定の表現型の細胞を単離するための特定の（複数の）マーカーの使用は、まったく限定的ではなく、むしろ暗示的である。他の細胞マーカーまたは分取の手順は、同様の結果を出すために用いられ得る。
１．１．発癌遺伝子の供給源としての細胞の、哺乳類細胞株からの選択
ＮａＨＣＯ３（JRH Biosciences）、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Sigma）、４ｍＭのＬ−グルタミン（Sigma）によって改変し、１０％のウシ胎児血清ＦＣＳ（JRH Biosciences）を補ったＲＰＭＩ１６４０（Roswell Park Memorial Institute培地）を用いて、加湿した５％のＣＯ２雰囲気の３７℃のＣＯ２インキュベーターにおいて、標準的な（通常の）条件下において、すべての不死の細胞株（下記を参照）を懸濁培養において成長させた。特に記載がない限り、本明細書に記載の組織培養培地（ＴＣ培地）は、本発明に関するすべての不死の細胞株、初代培養された癌細胞、初代培養された細胞培養および樹立したトリハイブリッド細胞株を培養するための標準培地である。一般的に、用いたすべての不死の細胞株、初代培養された癌細胞および初代培養された細胞を抗生物質のない環境において培養した。しかし、危険性の高いバクテリアおよび／または真菌による汚染の疑いがある場合、２％のアンピシリン（５０００ユニット）／ストレプトマイシン（５ｍｇ）溶液（Sigma）を標準培地に加えた。
ヒト細胞株
本発明において用いられ得るヒト細胞株は、以下のとおりである：
ａ）骨髄性の共通前駆細胞系統、Ｋ５６２（ヒト慢性骨髄性白血病に由来する細胞株）、
ｂ）Ｔリンパ球系統、ＭＯＬＴ４（ヒトＴリンパ球芽球）、および
ｃ）Ｂリンパ球系統、ＷＩＬ２ＮＳ（ヒトＢリンパ球芽球）。
非ヒト細胞株
本発明において用いられ得る非ヒト細胞株は、マウス骨髄腫細胞株−Ｓｐ２（Ｂリンパ球プラズマ細胞）である。
１．１．１．単一細胞の供給系（single-cell delivering system）
細胞の単離または分取、細胞の操作および単一細胞のクローニングは、本発明を通して重要な工程である。ここには、我々は目的の単一細胞の操作および／またはクローニングのために確立した単一細胞の供給系について説明する。単一細胞の供給系（図５５）は、ガラスのマイクロピペット、１ｍｌのシリンジおよび１次元簡易操作装置（one-dimensional coarse manipulator）から主に構成される。図５６は、目的の単一細胞を拾い上げるために用いられるガラスのＬ字型マイクロピペットを示す。このピペットを、ヘマトクリットキャピラリーチューブ（７５ミリメートル（ｍｍ）の長さ、それぞれ１．５ｍｍおよび１．１０ｍｍの外径および内径）から作製した。熱を用いることによって、チューブの一端を、約２５０〜３００マイクロメートル（μｍ）の内径および約３０μｍの先端の壁厚を有している先端（１）が得られるように引っ張った。マイクロピペットの他端には手を加えなかった（２）。細胞供給系（図５５）において、シリンジ（４）を簡易操作装置上に載せ、同様に簡易操作装置を磁気スタンド（１６）に載せている。この系は、シリンジのピストン（６）がシリンジに対して前方または後方に非常にゆっくりと動かされ得るように機能する。目的の単一細胞を操作するために、柔軟性のある医療用品質のチューブ（３）を用いて、図に示されるようにシリンジをマイクロピペット（２）の手を加えていない端に接続しなければならない。この単一細胞の供給系は、任意の細胞操作の前に、７０％のアルコールを用いて数回にわたって洗浄することによって殺菌し、最終的に、必要なあらゆる適切な組織培養培地または溶液によって気泡を含ずに満たされる必要がある。
１．１．２．単一細胞のクローニング
各細胞株由来の細胞のクローンを単一細胞のクローニングによって樹立した。本発明において用いられる任意の生物学的な細胞（例えば、Ｋ５６２細胞株の細胞）の単一細胞のクローニングまたは操作の方法を以下に記載する。
５μｌのＫ５６２細胞の細胞懸濁液を、対数期においてその培養物から採取し、１５０μｌのＴＣ培地が入っている組織培養９６ウェルプレート（ＴＣプレート, Becton and DickinsonまたはBD）のウェルの中に入れた。このウェルを「細胞保存ウェル」と称した。このプレートを倒立顕微鏡（Axiovert 40C, Carl Zeiss）のＸＹ顕微鏡ステージの上に置いた。単一細胞の操作／クローニング工程の前に、気泡を含んでいないＴＣ培地によってマイクロピペット（図５６）を完全に満たした。単一細胞の供給系（図５５）のマイクロピペット、チューブおよびシリンジを、１次元簡易操作装置（Narishege）の上に載せた。マイクロピペットの先端（１）を、顕微鏡の視野の中心に位置するように配置した。Ｋ５６２の単一細胞の操作およびクローニングのために、マイクロピペットを細胞保存ウェルの中へ挿入した。シリンジのピストンを吸い込む方向へ非常にゆっくりと動かすことによって、Ｋ５６２の単一細胞をマイクロピペットの中に入れた。マイクロピペットを細胞保存ウェルから引き出した。顕微鏡のステージを細胞保存ウェルから隣接したウェル（「クローニングウェル」と称する）へ横方向に動かし、その後マイクロピペットをこのクローニングウェルに挿入することによって、マイクロピペット中の単一細胞をマイクロピペットから静かに放出した。シリンジのピストンを放出する方向へ非常にゆっくりと動かすことによって、これを行った。細胞保存ウェルから単一細胞を採取し、この単一細胞をクローニングウェルに入れる工程を、ＴＣプレートあたり６０個の単一細胞クローンを得るまで複数回にわたって繰り返した。３７℃、５％ＣＯ２において管理した加湿したインキュベーター（Thermoline Scientific）において、このクローニングプレートを１０日間にわたってインキュベートした。インキュベーションの期間中、定期的に各クローニングウェル中の培地を新鮮なＴＣ培地と交換した。各クローニングウェルからの各クローンの細胞増殖を２４時間毎に記録した。インキュベーションの期間の終了時において、Ｋ５６２細胞のクローン数を決めた。増殖速度が最大であるクローンまたは細胞表面上に発現している目的のマーカー（例えば、Ｋ５６２細胞上におけるＣＤ７１トランスフェリン受容体）のレベルが最大であるクローンを、トリハイブリッドの生成またはさらなる実験のために選択した。
１．１．３．ＣＤ７１＋細胞の分取
一例として、以下の方法は、蛍光標示式細胞分取器（fluorescence-activated cell sorter (FACS)）を用いた、Ｋ５６２細胞株からのＣＤ７１陽性細胞の細胞選択および分取について説明する。
２％のウシ血清アルブミンＢＳＡ（Sigma）を含んでいる１００μｌのリン酸緩衝溶液（Dulbeco PBS）に懸濁させた１×１０５個のＫ５６２細胞を、２０μｌの抗ＣＤ７１（BD Pharmingen）に結合させたフィコエリスリン（ＰＥ）またはＰＥを結合させた同位体対照抗体ＩｇＧ２ａ，κ（BD Pharmingen）のいずれかとともに、３０分間にわたって、室温の暗所においてインキュベートした。インキュベーション混合物を１ｍｌのＰＢＳを用いて希釈し、染色した細胞を３００ｇにおいて１０分間にわたって遠心することによって回収した。１ｍｌのＰＢＳを用いてさらに洗浄した後、染色した細胞を１ｍｌのＰＢＳに懸濁して、直ちにＦＡＣＳ（BD FACSCalibur）を用いて分析した。図１はＫ５６２細胞株のＣＤ７１＋細胞のプロファイルを示す。ＣＤ７１＋陽性細胞を絞り込み（gate）、分取した（図１ａ）。元のＫ５６２集団の約６５％がＣＤ７１について陽性であった。さらなる実験のために、分取した細胞を３００ｇにおいて１０分間にわたって遠心分離し、１ｍｌのＰＢＳに懸濁させた。図１ｂにおいて示されるような純度分析のために、１００ｍｌの懸濁したＣＤ７１＋の分取した細胞を回収した。９９％の純度のＣＤ７１＋の分取した細胞を得た。細胞分取の後、このＫ５６２細胞株のＣＤ７１＋細胞をさらなる実験に用いたか、または標準的な培養条件下の培養に置き、ＣＤ７１に関して濃縮されているＫ５６２細胞として特徴付けた。ＣＤ７１に関して濃縮されているＷＩＬ２ＮＳおよびＣＤ７１に関して濃縮されているＭＯＬＴ４の培養を確立するために、同様の方法論を用いた。
１．１．３．１．Ｋ５６２培養物からの、骨髄単球系統のＣＤ７１＋細胞の分取
細胞ハイブリダイゼーション実験のための細胞の骨髄単球の表現型を確認するために、ＦＡＣＳ分析に続く分取およびを用いてＣＤ７１＋Ｋ５６２細胞をさらにＣＤ１５＋細胞に関して濃縮し、続いて分取した。
この目的のために、項目１．１．３において記載した工程から得たＣＤ７１に関して濃縮されているＫ５６２細胞を、ＰＥ抗ヒトＣＤ７１およびＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ１５（BD Pharmingen）を用いて標識した。２％のＢＳＡを含んでいる１００μｌのＰＢＳに懸濁させた１×１０５個の洗浄したＣＤ７１に関して濃縮されているＫ５６２細胞を、２０μｌの（１）抗ヒトＣＤ７１−ＰＥおよび抗ヒトＣＤ１５−ＦＩＴＣ抗体、（２）陰性の同位体対照抗体、または（３）ＦＩＴＣおよびＰＥを用いて標識した陰性の同位体対照抗体のいずれかとともに、３０分間にわたって室温の暗所においてインキュベートした。インキュベーション混合物を１ｍｌのＰＢＳを用いて希釈し、染色した細胞を３００ｇにおいて１０分間にわたって遠心することによって回収した。１ｍｌのＰＢＳを用いてさらに洗浄した後、染色した細胞を１ｍｌのＰＢＳに懸濁して、直ちにFACSCalibur（BD）を用いて分析した。
典型的なＦＡＣＳプロファイルを図２ａに示す。培養において５ヶ月後、ＣＤ７１に関して濃縮されているＫ５６２細胞の９９％がＣＤ７１について陽性のままであり、その約１８％が表面のＣＤ１５を発現していた。ＣＤ７１およびＣＤ１５の両方について陽性な細胞を絞り込み（図２ａ）、分取した。さらなる実験のために、分取した細胞を３００ｇにおいて１０分間にわたって遠心分離し、１ｍｌのＰＢＳに懸濁させた。純度分析のために、１００ｍｌの懸濁したＣＤ７１＋ＣＤ１５＋の分取した細胞を回収した。２ヶ月間の培養の後、分取した細胞をＣＤ７１およびＣＤ１５の共発現について再分析した（図２ｂ）。この結果は、その精製した細胞の約９８％がＣＤ７１およびＣＤ１５の両方を保持していたことを示している。表面上にＣＤ７１およびＣＤ１５の両方を以前に発現していた細胞の一部が、それらのＣＤ１５の発現を消失していたことがわかり（図２ｂ）、Ｋ５６２細胞における骨髄単球系統への分化が安定的ではなく、可逆的であることを暗示している。
１．１．４．マウスＳｐ２細胞株からの、トランスフェリン受容体陽性細胞の選択
マウス骨髄腫細胞株Ｓｐ２をトリハイブリッドの生成において用いたとき、その集団を、ヒトＣＤ７１のアナログであるマウストランスフェリン受容体（ＴｆＲ）を発現している細胞に関して濃縮した。
ＰＥを結合させたマウス抗ヒトＣＤ７１の代わりにＦＩＴＣを結合させたラット抗マウスＴｆＲ抗体（Abcam）を用いたことを除いて、基本的には、ヒト細胞株のＣＤ７１＋細胞に関する濃縮について記載している項目１．１．３と同様の手順にしたがった。同位体対照をそれに応じて適合させた。
図４４はＳｐ２細胞株のＴｆＲ＋細胞のプロファイルを示す。ＴｆＲ＋陽性細胞を絞り込み、分取した（図４４ａ）。元のＳｐ２集団の約４５％がＴｆＲについて陽性であった。さらなる実験のために、分取した細胞を３００ｇにおいて１０分間にわたって遠心分離し、１ｍｌのＰＢＳに懸濁させた。図４４ｂにおいて示されるような純度分析のために、１００ｍｌの懸濁したＴｆＲ＋の分取した細胞を回収した。９９．５％の純度のＴｆＲ＋の分取した細胞を得た。細胞分取の後、Ｓｐ２細胞株のＴｆＲ＋細胞をさらなる実験に用いたか、または標準的な培養条件下の培養に置き、ＴｆＲに関して濃縮されているＳｐ２細胞として特徴付けた。
１．２．初代培養された癌細胞からの、発癌遺伝子の供給源としての細胞の選択
一例として、下記の方法は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の患者から得られた骨髄のサンプルからの、骨髄系統の形質転換細胞の選択について説明する。対応する血液悪性腫瘍の骨髄のサンプルから他の系統の細胞を選択するために、同様の方法を適用し得る。
説明および同意の後、ＡＭＬの患者から骨髄を吸引物を得た。実験の実施前にＡＭＬであると明らかに診断されている患者からサンプルを抽出した。項目１．３．１に記載のように同じ密度勾配遠心分離手法を用いてＡＭＬの単核細胞を単離し、ＦＡＣＳを用いてサンプルからＣＤ３４＋細胞を分取するか、または単離した。
上記において得られた単核細胞を染色するか、または標識するために、マウス抗ヒトＣＤ３４−ＰＥ抗原（BD Pharmingen）またはＰＥ同位体対照抗体（BD Pharmingen）の１０μｌを、染色培地（ＰＢＳ＋５％のＢＳＡ）における１×１０６の単核細胞の所定の分取物の１００μｌに加えた。所定の分取物について、染色混合物を３０分間にわたって氷上においてインキュベートした。１０ｍｌの氷冷した染色培地を細胞のペレットに加え、３５０ｇおよび４℃において７分間にわたって遠心分離した。上清を吸出し、それから同じ体積の氷冷した染色培地を加えたチューブを軽く叩くことによって細胞のペレットを再懸濁させた。染色した細胞を遠心分離し、もう一度、氷冷した染色培地において洗浄した。標識した細胞を染色培地に懸濁させ、ＦＡＣＳにかけた。ＣＤ３４＋細胞の集団について適切に分取するゲートを設定した後に、細胞の画分を回収した。
集積培養のために、４０×１０３の濃縮されたＣＤ３４＋細胞を、合成細胞外マトリクスを用いてあらかじめ被覆された１２ウェルのプレートに播いた。５７ｍＭのβ−メルカプトエタノール（Sigma）、１ｍＭのヒドロコルチゾン、２０ｎｇ／ｍｌのヒトのインターロイキン−３（ＩＬ−３）および２０ｎｇ／ｍｌのヒトの顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を補った完全ＴＣ培地において細胞を広げた。培養の４８時間後に、細胞をＦＡＣＳを用いてＣＤ１５発現についてさらに選択した。
細胞の蛍光染色のために、マウス抗ヒトＣＤ１５−ＦＩＴＣ（BD Pharmingen）およびマウス抗ヒトＣＤ３４−ＰＥ（BD Pharmingen）を使用し、また、この項目の前半に記載した類似の細胞染色方法を採用した。ＦＡＣＳを用いて染色したサンプルを分析した。ＣＤ３４およびＣＤ１５陽性の細胞集団（ＣＤ３４＋ＣＤ１５＋）およびＣＤ３４陽性およびＣＤ１５陰性の細胞集団（ＣＤ３４＋ＣＤ１５−）について適切に分取するゲートを設定した後に、画分を回収した。
培養して４８時間後のＣＤ３４＋ＡＭＬ細胞上におけるＣＤ１５の発現プロファイルを図３に示す。ＡＭＬ単核細胞の約５４％はそれらのＣＤ３４の発現を保持しているがＣＤ１５について陽性であるとわかり、一方で、残りの細胞集団は骨髄単球系統へと分化することなくそのＣＤ３４の発現を保持していた。ＣＤ３４＋ＣＤ１５＋細胞をトリハイブリッドの生成のための実験において用いた。
１．３．初代培養された細胞
初代培養された細胞は任意のリンパ組織（例えば、末梢血、臍帯血、脾臓、骨髄、胸腺、扁桃腺、および所属リンパ）に由来し得る。第１の段階において、単核細胞を単離するためにすべてのリンパ組織を処理した。
１．３．１．骨髄、末梢血または臍帯血からのヒト単核細胞の単離
説明および同意の後に、末梢血のサンプルを健康な個人から収集した。各血液サンプルはヘパリン処理されたチューブ（Vacutainer, BD）に回収し、プールし、ＲＰＭＩ１６４０を用いて希釈した。
骨髄生検を受け、血液異常のない正常な骨髄を有している患者から、ヒト骨髄の吸引物を得た。このサンプルをＲＰＭＩ１６４０を用いて１：３の割合に希釈した。
ヒト臍帯血のサンプルを、説明および同意の後、正常な満期経膣出産児から得た。乳児の出産および臍帯の結さつの後、胎盤の娩出の前に、各臍帯血をヘパリン処理した６０ｍｌのシリンジを用いて収集した。各サンプルをＲＰＭＩ１６４０を用いて希釈した。
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄単核細胞（ＢＭＭＣ）および臍帯血単核細胞（ＵＣＢＭＣ）をFicoll-Paque（Amersham Pharmacia）による密度遠心分離によって調製した。要約すると、２０ｍｌのシリンジに取り付けたカニューレチューブを用いて、１０ｍｌのFicoll-Paqueを２０ｍｌの細胞懸濁液の下に層化した。サンプルの細胞を４℃、１７００ｒｐｍ（７００ｇ）において、４０分間にわたって遠心分離した。境界面にある細胞を回収し、５０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０、２０００ｒｐｍ（１０００ｇ）における１０分間にわたる遠心によって洗浄した。上清を捨て、ペレット化した細胞を４０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０に再懸濁させ、１３００ｒｐｍ（４００ｇ）において１０分間にわたって遠心分離した。赤血球および血小板を、それぞれ０．８３％（ｗｔ／ｖｏｌ）のＮＨ４Ｃｌを用いた溶解およびＰＢＳを用いて１：２の割合に希釈したFicoll-Paqueによる２回目の遠心によって除去した。
単離した単核細胞を、培養、またはＦＡＣＳまたは磁気ビーズ分離方法を介した細胞の特異的な画分への分析および分取に用いた。
１．３．２．固形のリンパ組織からのヒト単核細胞の単離
以下の方法は、脾臓、胸腺、扁桃腺または所属リンパ節から単核細胞を単離するために、本発明に使用された手法を説明する。
脾臓のサンプルを、国際的な倫理指針にしたがって、臓器移植ドナーから得た。脾臓細胞を単離するまでの間、約２×２×３ｃｍの脾臓のブロックのそれぞれを、４℃のＲＰＭＩ１６４０に保存した。シリンジのピストンを用いて無菌のふるいのメッシュに各ブロックを通して、小さい断片に切断した。それから、２０Ｕ／ｍｌのタイプＶＩＩコラーゲナーゼ（Sigma）および２０Ｕ／ｍｌのＤＮａｓｅ（Sigma）を用いて、室温の完全培地において３０分間にわたって消化することによって、細胞を酵素的に分離した。１０ｍＭになるようＥＤＴＡを加えて、室温において５分間にわたって攪拌することによって、この細胞集団をさらに分離した。それから、酵素消化を停止させるために完全培地を用いて脾臓細胞を２回にわたって洗浄し、ＲＰＭＩ１６４０に再懸濁させた。これらの条件は非酵素的な分離工程と比べて表面分子の発現に影響を与えなかった（McIlroy et al 1995）。赤血球の除去を除いて、項目１．３．１に記載のように、密度勾配遠心分離によってこれらの脾臓細胞の懸濁液から脾臓の単核細胞を単離した。この脾臓の単核細胞をＲＰＭＩ１６４０に再懸濁させ、細胞濃度を１ｍｌあたり１×１０６に調節した。細胞の生存率は、トリパンブルー排除によって決定したところ、９８％を超えていた。
胸腺を、親の説明および同意の後、心臓外科手術を受けた子供達から得た。胸腺組織を破砕し、ＲＰＭＩ１６４０を満たしたシリンジを用いて、組織から胸腺細胞を取り出すことによって、胸腺細胞を胸腺から単離した。胸腺細胞を上記のように密度勾配遠心分離によって精製した。
扁桃腺を、説明および同意の後、炎症性疾患に対する扁桃切除術を受けた患者から得た。組織サンプルを完全培地および２５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンに入れて、氷上において保存し、３時間以内にわたって処理した。上皮層を除去した後、扁桃組織を小片に切断し、切断したホールピペットを用いて組織ブロックを静かに吸引した。次いで、脾臓の単核細胞の単離について上述と同じ工程を用いて、扁桃細胞を単離した。
１．３．３．種々の組織に由来する単核細胞からの系統特異的な初代培養された細胞の単離
Ｂリンパ球系統、Ｔリンパ球系統および骨髄系統のヒト細胞を、ＦＡＣＳ分析および細胞分取または磁気細胞分取を用いて標準的な手順によって単離した。系統特異的な初代培養された細胞を種々の組織から単離するための細胞染色および分取の非限定的な例を以下に示す。
１．３．３．１．ヒトの脾臓および末梢血からの、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞および骨髄単球細胞の単離
組織サンプルをまず、項目１．３．１に記載のように単核細胞集団を抽出するために処理した。次いで、蛍光細胞染色、続いて細胞分取を、単核細胞集団の単離から４時間以内に行った。この細胞を、染色するまで標準的な培養条件（項目１．１参照）下に完全培地に懸濁させた。
１．３．３．１．１．種々の組織に由来する初代培養された成熟Ｂ細胞、エフェクターＴ細胞および骨髄単球細胞の細胞染色および分取
以下は、初代培養された細胞からのＢ細胞およびＴ細胞の染色および分取の例である。通常、Ｂ細胞およびヘルパーＴ細胞の選択はそれぞれＣＤ１９およびＣＤ４の表面発現に基づいており、一方で、骨髄単球細胞はＣＤ１４および／またはＣＤ１６の表面発現に基づいていた。
要約すると、それぞれ１０μｌのマウス抗ヒトＣＤ１９−ＦＩＴＣ抗体（BD Pharmingen）およびマウス抗ヒトＣＤ４−ＰＥ抗体（BD Pharmingen）または適切な同位体対照を、染色用培地（ＰＢＳ＋５％ＢＳＡ）における単核細胞の１００μｌの分取物（１×１０５の細胞を含んでいる）に加えた。分取物の単核細胞集団のために、染色混合物を氷上で３０分間にわたってインキュベートした。１０ｍｌの氷冷した染色用培地を染色混合物に加え、３５０ｇ、４℃において７分間にわたって遠心分離した。上清を吸引し、次いで同じ容積の氷冷した染色用培地を加えたチューブを軽くたたくことによって細胞ペレットを再懸濁させ。染色した細胞を遠心分離し、氷冷した染色用培地において再び洗浄した。この工程を他の分取物に対して繰り返した。ＦＡＣＳを用いて染色した細胞を分析した。少なくとも２００００の絞り込んだ結果を各サンプルに関して分析した。ＣＤ１９陽性Ｂ細胞集団（ＣＤ１９＋ＣＤ４−）またはＣＤ４陽性Ｔ細胞集団（ＣＤ４＋ＣＤ１９−）にとって適切な分取ゲートを設定し、画分を回収した。各画分のうち１ｍｌを純度分析のために回収し、各画分の残りをさらなる実験のために完全培地に懸濁させた。
１．３．３．１．２．分取した細胞集団の回復および分析
適切なアダプターを備えているマイクロ遠心チューブに少数の細胞（≦５×１０５個）を直接分取した。分取の前に、補完したＲＰＭＩ１６４０の少量（０．１から０．２ｍｌ）を回復チューブに加えて、分取したサンプルと混合させ、分取した細胞の生存性を向上させた。許容される回復した細胞の数が供給された分取の後、２０μｌの分取した細胞の各サンプルをその純度の変化を再分析するために染色用培地を用いて１：１０に希釈した。許容可能な純度は≧９５％であった。分取したサンプルの１ｍｌにつき、２０から４０μｌのＦＣＳをさらに加え、続いて３５０ｇ、４℃において７分間にわたって遠心分離した。次いで、細胞を標準的な組織培養培地に再懸濁させた。十分な細胞が利用可能であれば、収量を決定するためにその数を数えた。
抗ヒトＣＤ１９−ＦＩＴＣおよび抗ヒトＣＤ４−ＰＥによって標識した脾臓のサンプルのＦＡＣＳプロファイルを図１１ａに示し、分取したＣＤ１９＋Ｂ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の純度分析のプロファイルを図１１ｂおよび図１１ｃに示す（ＫＢＴハイブリッドの性質決定を参照）。画分における細胞の純度は、ＣＤ１９＋細胞については９８％を超え、ＣＤ４＋細胞については９６％を超えた。
末梢血由来のＣＤ１９＋およびＣＤ４＋細胞についての分取および純度のプロファイルは基本的に脾臓のサンプル由来のものと同様であるが、わずかな数の各細胞集団を得たのみであった。
ヒトの単球および骨髄単球細胞の分離のために、単核細胞集団をまず、ヒトＣＤ１４磁気ビーズ、ＭＡＣＳ（Miltenyi Biotec GmbH）を用いて、製造者の手順にしたがって、ＣＤ１４陰性細胞を枯渇させた。マウス抗ヒトＣＤ１６−ＰＥ（BD Pharmingen）およびマウス抗ヒトＣＤ１４−ＰｅｒＣＰ（BD Pharmingen）抗体を用いて、陽性として選択されたＣＤ１４細胞をさらに染色するか、または標識した。細胞染色および分取、ならびに分取した細胞の回復の方法は上述されている（項目１．３．３．１．１および項目１．３．３．１．２参照）。
ＦＡＣＳを用いて染色した細胞を分析した。少なくとも２００００の絞り込んだ結果を分析した。ＭＡＣＳビーズを用いてＣＤ１４について陽性として選択された全細胞の約８６％がＣＤ１４について陽性であった。ＣＤ１４＋集団をＣＤ１６の発現に基づいて３つのグループ（ＣＤ１４＋細胞の大多数に相当しているＣＤ１４ＨＣＤ１６−；少数のＣＤ１４ＨＣＤ１６ＬおよびＣＤ１４ＨＣＤ１６Ｈ細胞）にさらに分けた。画分における細胞の純度は、ＣＤ１４ＨＣＤ１６−については９８％を超え、ＣＤ１４ＨＣＤ１６Ｌについては９６％を超え、ＣＤ１４ＨＣＤ１６Ｈについては９２％を超えた。適切な分取ゲートを設定した後、以下の細胞集団を回収した：ＣＤ１４ＨＣＤ１６−、ＣＤ１４ＨＣＤ１６ＬおよびＣＤ１４ＨＣＤ１６Ｈ細胞の画分。図４はマウス抗ヒトＣＤ１６−ＰＥおよびマウス抗ヒトＣＤ１４−ＰｅｒＣＰを用いて標識したＣＤ１４に関して濃縮されているサンプルのＦＡＣＳプロファイルを示す。
脾臓組織からのＣＤ１４＋細胞の細胞分取および精製の方法は、少数の各細胞集団を得たことを除いて、基本的に末梢血のサンプルからのものに関する方法と同様である。
１．３．３．２．ヒトの臍帯血からの、ＣＤ５陽性（抗原を経験した）Ｂ細胞およびＣＤ５陰性（ナイーブ）Ｂ細胞の単離
項目１．３．１に記載のように、単核細胞を臍帯血のサンプルから調製した。蛍光細胞染色、続く細胞分取を単核細胞集団の単離から４時間以内に行った。この特定の例において、上述の方法（項目１．３．３．１．１）にしたがって、ヒトの臍帯血からのＣＤ５陰性（ナイーブ）Ｂ細胞およびＣＤ５陽性（抗原を経験した）Ｂ細胞の分取を、マウス抗ヒトＣＤ５−ＦＩＴＣ抗体（BD Pharmingen）、マウス抗ヒトＣＤ１９−ＰＥ抗体（BD Pharmingen）または適切な同位体対照を用いて行った。
ＦＡＣＳを用いて染色した細胞を分析した。少なくとも２００００のゲートした結果を各サンプルについて分析した。ＣＤ５陰性Ｂ細胞集団（ＣＤ１９＋ＣＤ５−）またはＣＤ５陽性Ｂ細胞集団（ＣＤ１９＋ＣＤ５＋）にとって適切な分取ゲートを設定し、多数の画分を回収した。図５はマウス抗ヒトＣＤ１９およびマウス抗ヒトＣＤ５を用いて染色したサンプルの典型的なプロファイルを示す。
サンプル中のＢ細胞の割合は４から１９．２％に及び、ＣＤ５＋Ｂ細胞は移動した全リンパ球の０．８から７．２％に及んだ。
１．３．３．３．ヒトの臍帯血からの、ＣＤ５陽性（抗原を経験した）Ｔ細胞およびＣＤ５陰性（ナイーブ）Ｔ細胞の単離
項目１．３．１の記載と同様の方法を用いて、単核細胞を臍帯血のサンプルから調製した。蛍光細胞染色、続いて細胞分取を単核細胞集団の単離から４時間以内に行った。この特定の実施例において、上述した細胞の方法（項目１．３．３．１．１）にしたがって、ヒトの臍帯血からのＣＤ５陽性（抗原を経験した）Ｔ細胞およびＣＤ５陰性（ナイーブ）Ｔ細胞の分取を、マウス抗ヒトＣＤ５−ＦＩＴＣ抗体（BD Pharmingen）、マウス抗ヒトＣＤ３−ＰＥ抗体（BD Pharmingen）または適切な同位体対照を用いて行った。ＦＡＣＳを用いて染色した細胞を分析した。少なくとも２００００の絞り込んだ結果を分析した。ＣＤ５陰性Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ５−）またはＣＤ５陽性Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ５＋）のいずれか一方を含んでいる画分を回収するために、分取ゲートを設定した。図６はマウス抗ヒトＣＤ３抗体およびマウス抗ヒトＣＤ５抗体を用いて染色したサンプルの典型的なプロファイルを示す。
分取した集団の回復および分析
分取した集団を回復および分析するために用いた実質的に同様の方法については、項目１．３．３．１．２に記載している。
サンプルにおけるＴ細胞の割合は１．７から１３．５％に及び、ＣＤ５＋Ｔ細胞は移動した全リンパ球の０．４から１．３％に及んだ。
１．３．３．４．ＣＤ２０およびＣＤ７２の発現に基づく、ヒト骨髄単核性集団からの、初期Ｂ細胞、活性化Ｂ細胞および休止Ｂ細胞の単離
上述の方法（項目１．３．１）を用いて、単核細胞を骨髄から抽出した。蛍光細胞染色に続く細胞分取を単核細胞集団の単離から４時間以内に行った。活性化Ｂ細胞の染色および分取は、上記の項目１．３．３．１．１に記載されている。すなわち、１０μｌのマウス抗ヒトＣＤ７２−ＦＩＴＣ抗体（BD Pharmingen）および２０μｌのマウス抗ヒトＣＤ２０−ＰＥ抗体（BD Pharmingen）または適切な同位体対照（ＰＥマウスＩｇＧ２ｂ，κ抗体）を用いた。ＦＡＣＳを用いて染色した細胞を分析した。プレＢ細胞、休止Ｂ細胞、活性化Ｂ細胞、濾胞樹状細胞からなるＣＤ２０陽性集団（ＣＤ２０＋ＣＤ７２−）、または初期Ｂ細胞（ＣＤ２０−ＣＤ７２＋）もしくは活性化Ｂ細胞（ＣＤ２０＋ＣＤ７２＋）からなるＣＤ７２陽性細胞のいずれか一方を含んでいる画分を回収するために、分取ゲートを設定した。図７はマウス抗ヒトＣＤ２０およびマウス抗ヒトＣＤ７２抗体を用いて染色したサンプルの典型的なプロファイルを示す。
分取した集団の回復および分析
項目１．３．３．１．２の記載と実質的に同様の方法を、分取した細胞を回復および分析するために用いた。
代表的に、骨髄単核細胞集団の約１０〜１５％がＣＤ２０およびＣＤ７２の両方について陽性であり；細胞の９〜１２％がＣＤ２０について陽性であるが、ＣＤ７２について陰性であり；約８％がＣＤ７２のみについて陽性であった。
１．３．３．５．磁気ビーズ分取による胸腺細胞亜集団の単離
ＭＡＣＳ ＣＤ４ Ｍｕｌｔｉｓｏｒｔキット（Miltenyi Biotec GmbH）を用いて、ＣＤ４−ＣＤ８−二重陰性の胸腺細胞、ＣＤ４＋ＣＤ８＋二重陽性の胸腺細胞、ならびにＣＤ４＋およびＣＤ８＋単独陽性の胸腺細胞の集団を、製造者の手順にしたがって分取した。要約すると、項目１．３．２の記載と同様の方法を用いて回収した胸腺細胞をＣＤ４ Ｍｕｌｔｉｓｏｒｔ ＣＤ４マイクロビーズと共に３０分間にわたってインキュベートした。５ｍＭのＥＤＴＡおよび０．５％のＢＳＡを含んでいるＰＢＳを用いて洗浄した後、標識した細胞を磁気カラムによって分離した。陽性として選択された胸腺細胞（磁気カラム上に保持された）はＣＤ４＋単独陽性およびＣＤ４＋ＣＤ８＋二重陽性の細胞集団を含んでいた。一方、ＣＤ４が減少した細胞集団（カラムから逃れた）はＣＤ８＋単独陽性およびＣＤ４−ＣＤ８−二重陰性の細胞を含んでいた。ＣＤ４陽性として選択された細胞集団からマイクロビーズを除去するために、ＭＡＣＳ Ｍｕｌｔｉｓｏｒｔ分離試薬と共に細胞をインキュベートした。２０分後に消化を止め、細胞をＣＤ８マイクロビーズによって３０分間にわたって標識した。ＣＤ４＋ＣＤ８＋二重陽性の胸腺細胞を正の選択によって得た。一方、ＣＤ４＋単独陽性細胞は細胞集団が枯渇したことがわかった。ＣＤ４の枯渇した細胞集団をＣＤ８マイクロビーズと共に３０分間にわたってインキュベートした。標識した細胞を磁気カラムにかけた後、ＣＤ８＋単独陽性の細胞を、ＣＤ４−ＣＤ８−二重陰性の胸腺細胞から分離できた。４つの異なる胸腺細胞亜集団の純度をフローサイトメトリー解析によって評価した。許容される純度は９５％より高いものである。
１．３．３．６．ヒト扁桃腺からのＣＤ５４＋Ｔ細胞の単離
項目１．３．２に記載の方法を用いて、単核細胞をヒト扁桃腺から抽出した。蛍光細胞染色に続く細胞分取を単核細胞集団の単離から４時間以内に行った。ＣＤ５４＋Ｔ細胞（細胞間接着分子−１またはＩＣＡＭ−１）を単核扁桃細胞集団から抽出し、マウス抗ヒトＣＤ３−ＰＥ抗体（BD Pharmingen）およびマウス抗ヒトＣＤ５４−ＦＩＴＣ抗体（BD Pharmingen）または適切な同位体対照の使用は項目１．３．３．１．１に記載のような細胞染色／分取方法を用いて選択した。ＦＡＣＳを用いて染色した細胞を分析した。ＣＤ３＋Ｔ細胞（すなわちＣＤ３＋ＣＤ５４−細胞）または活性化ＣＤ５４＋Ｔ細胞（すなわちＣＤ３＋ＣＤ５４＋細胞）のいずれか一方を含んでいる画分を回収するために、分取ゲートを設定した。図８はマウス抗ヒトＣＤ３案乳亜およびマウス抗ヒトＣＤ５４抗体を用いて染色したサンプルのＦＡＣＳプロファイルを示す。ＣＤ３＋細胞を系統交雑のトリハイブリッドの生成のために用い、一方でＣＤ５４＋活性化Ｔ細胞を発現実験のために用いた。
その結果は、Ｔ細胞が扁桃腺から単離した単核細胞の大部分（８２％）を構成しているが、９％のみがＣＤ５４＋Ｔ細胞であることを示した。
１．３．４．マウス単核細胞の単離
８〜１２週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを特定の病原体のない動物施設において飼育した。組織抽出の前に、マウスをＣＯ２にさらすことによって安楽死させた。末梢血を腋窩または大腿動脈の穿刺によって得、ヘパリン処理されたチューブの中に回収した。単核細胞集団の単離は、ヒト末梢血単核細胞の単離に関する項目１．３．１の記載と同様の手順を用いて行った。マウス脾臓を機械的に破砕し、項目１．３．２に記載のようなヒト脾臓の単核細胞の単離のための手順を用いて単離した。
１．３．５．マウス単核細胞からの、初代培養された系統特異的な細胞の単離
Ｔリンパ球系統および骨髄系統のマウス細胞をＦＡＣＳ分析および細胞分取または磁気細胞分取を用いて、標準的な工程によって単離した。初代培養された系統特異的なマウス細胞の単離のための細胞染色および分取の非限定的な例を以下に示す。
１．３．５．１．マウスの脾臓および末梢血からの、エフェクターＴ細胞の単離
異なるエフェクターＴ細胞の選択はＣＤ４およびＣＤ８の表面発現に基づいた。
それぞれ１０μｌのマウス抗マウスＣＤ４−ＰＥ抗体（BD Pharmingen）およびラット抗マウスＣＤ８−ＦＩＴＣ抗体（BD Pharmingen）または適切な同位体対照を、染色用培地（ＰＢＳ＋５％ＢＳＡ）における脾臓または末梢血の単核細胞の１００μｌの分取物（１×１０５の細胞を含んでいる）に加えた。所定の分量の単核細胞集団のために、染色混合物を氷上において３０分間にわたってインキュベートした。１０ｍｌの氷冷した染色用培地をこの染色混合物に加え、３５０ｇ、４℃において７分間にわたって遠心分離した。上清を吸引し、次いで同じ容積の氷冷した染色用培地を加えたチューブを軽くたたくことによって細胞ペレットを再懸濁した。染色した細胞を遠心分離し、氷冷した染色用培地において再度洗浄した。この工程を他の分取物に対して繰り返した。ＦＡＣＳを用いて染色した細胞を分析した。少なくとも２００００の絞り込んだ結果を各サンプルに関して分析した。染色したマウスの末梢血および脾臓の単核細胞の典型的なＦＡＣＳプロファイルを、それぞれ図４５（ａ）および図４５（ｂ）に示す。いずれのリンパ組織も単独陽性のＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞および二重陽性のＴ細胞を含んでいたが、細胞表現型において異なっていた。例えば、末梢血において最も多い集団はＣＤ８＋ＣＤ４−細胞傷害性Ｔ細胞（４３％）を含んでいたが、一方、脾臓単核細胞は主にＣＤ４＋ＣＤ８−ヘルパーＴ細胞または制御性Ｔ細胞（４２％）に相当した。ＣＤ４陽性集団（領域Ｒ１）、ＣＤ８陽性集団（領域Ｒ３）または二重陽性の細胞集団（領域Ｒ２）にとって適切な分取ゲートを設定した後、画分を回収した。各画分のうち１ｍｌを純度分析のために回収し、各画分の残りをさらなる実験のために完全培地に懸濁させた。各画分についての純度は９８％より高かった。
１．３．５．２．マウス末梢血からの、単球の単離
磁気ビーズ（Miltenyi Biotec）による負の選択を用いることによって、マウス単球を末梢血単核集団から単離した。単核細胞を磁気細胞分取緩衝液（ＰＢＳ、０．１％ｗｔ／ｖｏｌのＢＳＡ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ）に懸濁し、製造業者の手順にしたがって、Ｔ細胞（ＣＤ９０）、Ｂ細胞（Ｂ２２０）およびＮＫ細胞（ＣＤ４９ｂ）に対する抗体を含んでいる抗体MicroBeadsの混合物と共にインキュベートした。次いで、この細胞をＬＤ−ネガティブセレクションカラムに通した。陰性の（単球）画分を回収した。純度を決定するために、この細胞をＣＤ１１ｂに対する抗体と結合させたＰＥならびにＣＤ９０、Ｂ２２０、ＣＤ４９ｂ、ＮＫ１．１およびＬｙ６Ｇ（BD Pharmingen）に対する抗体と結合させたＦＩＴＣを用いて染色した。単球をＣＤ１１ｂ＋ＣＤ９０−Ｂ２２０−ＣＤ４９ｂ−ＮＫ１．１−Ｌｙ６Ｇ−／（ｌｏｗ）であるとみなし、純度のプロファイルをＦＡＣＳによって確認した。マウス単球集団の純度のプロファイルを図４６に示す。１００％の細胞がＣＤ１１ｂについて陽性である一方、９８％を超える細胞がＢ２２０、ＣＤ９０、ＣＤ４９ｂおよびＮＫ１．１について陰性であった。ＣＤ１１ｂ陽性細胞の約３８％が、Ｌｙ６Ｇを低いレベルにおいて発現していた。
＜実施例２＞
２．所望のタンパク質を分泌している初代培養された細胞の生成
所望のタンパク質を分泌する初代培養されたヒト細胞の生成のために用いた方法を以下に示す。細胞ハイブリダイゼーション実験のために、または分析実験における対照としてか、もしくはトリハイブリッド発現系において発現しているタンパク質の分析のための参照として、これらの細胞を用いた。
２．１．ヒトＧＭ−ＣＳＦを分泌しているリンパ球の生成
臍帯血のリンパ球をまず項目１．３．１に記載のように密度勾配遠心によって分離し、次いで培養液においてフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）によって活性化させ、続いてＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍｌ）について細胞発現させた。ヒトＧＭ−ＣＳＦの産生をＥＬＩＳＡによって分析した。この産生に基づく濃度は１５から４０ｎｇ／ｍｌ／１０６細胞に分布した。
３０００００のＰＨＡ活性化ヒト単球の全てを、製造者の手順にしたがった濃度においてＦＩＴＣ（Sigma）を結合させたマウス抗ヒトＣＤ４抗体と共に、４℃の暗所において３０分間にわたってインキュベートした。活性化ヒトＴ細胞をＦＡＣＳ（FACS VantageSE, BD）を用いて分析し、選択した。図４２（ａ）は、ＰＨＡ活性化リンパ球培養物におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の典型的なプロファイルを示し、図４２（ｂ）はＣＤ４＋の分取した細胞について１００％の純度を示す。
２．２．ＩｇＭおよびＩｇＧを分泌しているヒト単球の生成
マウス抗ヒトＣＤ１５４抗体（BD Pharmingen）によって被覆した丸底９６ウェルプレート（Corning）のウェルに、精製したＢ細胞（項目１．３．３．１参照）を３．７５×１０５／ｍｌにおいて播いた。１０％の熱不活性化尿素−低ＩｇＧ ＦＢＳ（Gibco/BRL）ならびに１００Ｕ／ｍｌのインターロイキン４（ＩＬ−４）（R&D systems）および５０ｎｇ／ｍｌのインターロイキン１０（ＩＬ１０）を補った（培養３日目の後に加えた）完全ＲＰＭＩ２６４０培地において、この細胞を培養した。培養物を２から３日毎に培養培地の半分を交換することによって新しく補給した。細胞生存率および細胞数を、血球計算板を用いて、トリパンブルー排除によって３回にわたって評価した。５日目および１０日目において、培養したリンパ球を、回収し、ＰＢＳにおいて２回にわたって洗浄して、マウス抗ヒトＣＤ１９−ＰＥ抗体、マウス抗ヒトＩｇＭ−ＦＩＴＣ抗体またはマウス抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣ抗体（全てBD Pharmingen製）を用いたＦＡＣＳによって分析した。すべての染色を、１×１０６の細胞あたり１μｇの各抗体を用いて４℃において行った。すべての分析において、９５％を超える細胞が同位体適合の陰性対照の染色にしたがったマーカーの組について二重陰性であった。死細胞および残骸を含んでいる領域を分析から排除した。すべての分析を５０００から１００００の生細胞を絞り込むことによって行った。
培養したリンパ球におけるＩｇＭおよびＩｇＧ陽性細胞の典型的なプロファイルを図９に示す。５日間の培養の後、ＣＤ１９＋細胞の１８％がＩｇＭ陽性であり、わずか１％が表面上に検出可能なＩｇＧを有していた。一方、１０日後には、ＩｇＧ陽性細胞の割合は１５％まで増加したが、ＩｇＭ陽性単球の割合はわずか２％まで減少した。適切なゲートを設定した後、ＩｇＭ陽性およびＩｇＧ陽性な画分をＩｇ発現実験のために分取した。
培養物におけるＩｇＭおよびＩｇＧの濃度を９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートおよびプラスチックに吸着させたヒトμ鎖およびγ鎖に対するヤギの親和性精製した抗体を用いた標準的なＥＬＩＳＡによって決定した。結合した抗体をＨＲＰを結合させたヒツジ抗ヒトＩｇ抗体によって明確にした。すべての抗体はSigma製であった。ＡＢＴＳを基質として用い、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。表１は、５日後および１０日後にＢリンパ球の培養物において検出されたＩｇＭおよびＩｇＧのレベルを要約したものである。
Figure 2012529270
ＩｇＭの生産は５日間の培養の後に低下した一方で、ＩｇＧの生産は増加した。
＜実施例３＞
３．体細胞ハイブリダイゼーション
体細胞ハイブリダイゼーションの種々の方法が当該技術において周知である。これらとしては、例えば、センダイウイルスのような融合性（fusagenic）ウイルスを用いる生物学的方法（Kohler and Milstein, 1975）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる化学的方法（Wojciezsyn, et al, 1983）、および電界を用いる電気的方法（Neil, and Zimmermann, 1993）が挙げられるが、これらに限られない。各方法は目的の細胞の原形質膜が可逆的に透過可能となり、ハイブリダイズすることを誘導し得るか、または引き起こし得る。
上述した細胞ハイブリダイゼーション法とは関係なく、細胞ハイブリダイゼーションを達成するために、２つの不可欠な段階が原則として必要とされる。第一に、ハイブリダイズさせたい細胞の原形質膜を、良好に細胞膜と接触させる必要がある。第二に、接触点における原形質膜の可逆的な破壊が同時に誘導される必要がある。
電気的な細胞ハイブリダイゼーション法に関して、目的の細胞を、適切なフィールド周波数を有している交流電界（ＡＣ電界）を用いて良好に細胞膜と接触させ、次いでＡＣ電界と同時に短い電気パルスにさらしたときにハイブリダイズを誘導し得る。
さらに詳しく述べると、電気的な細胞ハイブリダイゼーションは次の物理現象；誘電泳動（ＤＥＰ）および原形質細胞膜の電気的な破壊を伴う。
誘電泳動（Pohl,1978）は、生物学な細胞のような誘電体粒子が適切な溶液に懸濁され、適切な周波数の不均一なＡＣ電界にさらされる場合に、その誘電体粒子の運動を説明する現象である。細胞の運動は、（ｉ）例えば１００ｍＭのソルビトールに懸濁されているＳｐ２細胞に対する０．５〜２．０メガヘルツ（ＭＨｚ）のフィールド周波数における、誘電体粒子の転移または移動（Mahaworasilpa, 1992）、および（ｉｉ）例えば１００ｍＭのソルビトールに懸濁されているＳｐ２細胞に対する２〜１０キロヘルツ（ｋＨｚ）のフィールド周波数における、誘電体粒子の回転（Mahaworasilpa, 1992）として説明され得ることがよく報告される。不均一電界は１対の電極（例えば、多数の配置において設計され得る電気的な円筒形の金属線）を横切る電界を印加することによって発生させ得る。最も広く用いられている配置は平行な電極配置（図５８）である。不均一電界の存在において、ＤＥＰは誘電体粒子（すなわち生物細胞）を互いに引きつけさせ、同時に最も強い電界の領域に向かって移動させ得る。その結果、一続きの細胞（a chain or string of cells）を形成し、次は良好な細胞膜の接触を誘引する。細胞が適度に低い電気伝導度の溶液に懸濁されている場合に、細胞の引き合いは強く促進される。
適切なハイブリダイゼーション溶液に懸濁されている細胞が適切なパルス振幅およびパルス幅を伴っている電気パルスにさらされる場合に、細胞膜の電気的な破壊が誘導され得る（Zimmermann, 1982）。様々なパルス幅、例えば１から２００マイクロ秒（μ秒）の方形波パルスが、ハイブリダイズされる細胞のタイプに依存して広く用いられる。
３．１．電気的な細胞ハイブリダイゼーション系
本発明のいくつかの実施形態において、電気的な細胞技術をトリハイブリッドのようなハイブリダイズされた細胞の生成に用い得る。
３．１．１．細胞操作系
細胞ハイブリダイゼーションの前に目的の個々の細胞を増殖させるため、上述した単一細胞の増殖／供給系（項目１．１．１）を本発明を通じて用いた。
３．１．２．微小電極
本発明において、２つのＬ字型の微小電極を用いた。図５７は被覆されていない直径１２８μｍのニッケル合金から作製した微小電極（７）を示す。微小電極の柄を、外径１．５ｍｍのヘマトクリットキャピラリーチューブ（８）によって覆った。微小電極のＬ字型部（９および１０）を、電極の水平な部分および垂直な部分の両方の表面の一致する領域が、培地または適切な溶液にさらされるように配置した（Mahaworasilpa, 1992）。細胞ハイブリダイゼーションの工程の前に、２つの微小電極を２つの微細マイクロマニピュレーター（fine micromanipulators）（各微小電極について１つずつ）の上に載せた。これらの微小電極を各電極の平行な電極配置が得られるような方法において設計した（図５８）。各微細マイクロマニピュレーターを水圧によって駆動させし、０．５μｍの精度の動きがＸ、ＹまたはＺ方向において行えるようにした。
３．１．３．細胞チャンバーおよび配置
図５９は標準的な９６ウェルＴＣプレートのウェルにおける２つの平行な電極を示す。このウェルは本発明のいくつかの実施形態において、細胞ハイブリダイゼーションのチャンバーの役割を果たす。細胞ハイブリダイゼーションを行うため、微小電極を標準的な９６ウェル組織培養プレートのウェル（１２）に入っている適切な培地（１１）に沈めた。図６０および図６１はそれぞれ、平行な電極配置の上面図および側面図を示す。ここでは、例えば、ハイブリダイズされるべくあらかじめ選択された３つの細胞をそれらが適切なＡＣ電界の存在において一続きの細胞に整列するまたは形成することを誘導し得るようにおいて、平行な電極の間に置く。
＜実施例４＞
４．電気的な細胞ハイブリダイゼーション法による系統交雑のトリハイブリッドの生成の実施例
以下の項目は、異なる系統もしくは細胞型であるか、または同じ系統／もしくは細胞型であるが異なる表現型である、いずれかに由来する細胞のハイブリダイゼーションによって得たトリハイブリッド細胞株の生成の例を提供する。安定な各トリハイブリッドが親細胞の表現型の特性を同時に有していることを確認するために分析を行った。この確認は系統特異的な細胞表面マーカー、系統特異的なマーカーの細胞内発現、系統特異的なマーカーのＲＮＡ転写産物の存在、核型分類、および／または系統特異的なタンパク質の分泌の分析に基づいた。以下の例は系統交雑のトリハイブリッドの最も典型的な表現型の特性について説明する。しかし、これらの例は、選択した特定のマーカーに限定されない。
４．１．骨髄系統、Ｔリンパ球系統およびＢリンパ球系統に由来する３つの不死の細胞からの系統交雑のトリハイブリッドの生成−ＫＭＷ
この種の系統交雑のトリハイブリッドを１つの骨髄Ｋ５６２細胞、１つのＴリンパ球ＭＯＬＴ４細胞および１つのＢリンパ球ＷＩＬ２ＮＳ細胞をハイブリダイズすることによって生成した。このようにして得られた系統交雑のトリハイブリッドをＫＭＷ株と名付けた（続いてその識別番号を付与した）。ＫＭＷの系統交雑のトリハイブリッドの生成の工程に関する以下の段階、溶液（ハイブリダイゼーション、培養および回復培地）および本発明に用いるパラメーターを以下に記載する。
４．１．１．ＫＭＷ系統交雑のトリハイブリッドの生成のための細胞の調製
Ｋ５６２、ＷＩＬ２ＮＳ、およびＭＯＬＴ４細胞株を我々の標準培地（項目１．１参照）において培養した。定法にしたがって、各細胞株を３日毎に継代した。細胞ハイブリダイゼーションの前に、最も速い増殖速度を有している細胞型の安定な各クローンを、項目１．１．２に記載の手順を用いて樹立した。いくつかの実験において、項目１．１．３に記載のように樹立したＣＤ７１＋に関して濃縮されている細胞集団を用いた。また、いくつかの事例において、ＣＤ７１＋に関して濃縮されているＫ５６２集団のＣＤ１５＋細胞（項目１．１．３．１）を用いた。
４．１．２．ＫＭＷ系統交雑のトリハイブリッドの生成のための細胞ハイブリダイゼーションの手順
ＴＣ９６ウェルプレートの少数のウェルを細胞ハイブリダイゼーションウェルとして用いた。各ウェルを約１５０μｌのハイブリダイゼーション培地によって満たした。この培地は、２４０ｍＭのソルビトール（Sigma）、２．０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４（Sigma）、０．４ｍＭのＣａＣｌ２（Sigma）、０．２ｍＭのＭｇ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２（Sigma）および０．２ｍＭのＣａ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２（Sigma）を含んでおり、０．２％のウシ血清アルブミン、ＢＳＡ（Sigma）によって補われていた。電気的な細胞ハイブリダイゼーションの前に、あらかじめ選択した細胞型の各クローンの細胞を一度ハイブリダイゼーション培地において数分間にわたって洗浄し、新鮮なハイブリダイゼーション培地を含んでいるウェルに移した。このウェルはプレハイブリダイゼーションウェルとして設計した。細胞ハイブリダイゼーションの工程の前に、選択した各クローンの単一の洗浄した細胞を項目１．１．１にしたがって、３つの細胞（選択した各クローンから１つずつ）のみを１対の同一の平行な電極（ウェルの底に沈めた（図６１において示されるように））の間に置くように操作した。電極の距離は４００マイクロメートル（すなわち４００μｍ）において設定した。
電気的な細胞ハイブリダイゼーションを実施するために、まず、０．８ＭＨｚの周波数および１メートルあたり約５０〜６０キロボルト（例えば５０〜６０ｋＶ／ｍ）の場の強度を有している交流（ＡＣ）電界を、誘電泳動，ＤＥＰによって３つの細胞の互いにおける引き合いを誘導するまで、数秒間にわたって電極の間に印加し、一続きの細胞を形成させた。この工程は良好な細胞膜接触をこれら細胞に起こさせた。細胞をＫ５６２細胞が細胞の列の中央にあるような方法において配置した（図６０または６１参照）。次いで、３秒間隔の２回にわたる電気的方形波パルスをＡＣ電界と同時に印加した。約１７０ｋＶ／ｍの強度および７５マイクロ秒（例えば７５μ秒）のパルス幅を伴う各パルスを用いた。２回目の方形波パルスの終了後、ＡＣ電界をさらに５秒間にわたって連続的に維持し、単一の系統交雑のトリハイブリダイズされた細胞への細胞ハイブリダイゼーションが得られた。本発明のいくつかの実施形態に関して、３つの細胞のハイブリダイゼーションは同時に起こり得ないことが観察された。すなわち、まず３つのうち２つの細胞のハイブリダイゼーションがしばしば起こり、続いて３つ目の細胞のハイブリダイゼーションが起こる。いくつかの事例において、３つの細胞の完全なハイブリダイゼーションを得るために、さらなる方形波パルスを必要とした。新しく生成した系統交雑のトリハイブリッド細胞を次いで、ハイブリダイゼーションウェルから回復ウェルに移した。１つの回復ウェルはハイブリダイゼーションウェルの列と異なる列に位置していた。各回復ウェルは１５０μｌの標準ＴＣ培地（項目１．１参照）を含んでいた。新しく樹立した各系統交雑のトリハイブリッド細胞を、回復ウェルあたり１つの系統交雑のトリハイブリッド細胞において、３７℃、５％のＣＯ２容量に制御された加湿インキュベーターにおいて数日間にわたってインキュベートした。大多数の系統交雑のトリハイブリッドは細胞ハイブリダイゼーションの実施後３６時間以内に分裂することがわかった。インキュベーション期間の終了時において、各回復ウェル中の培地を新鮮な標準培地と適切に交換した。このことは各系統交雑のトリハイブリッドのクローンの細胞増殖を刺激した。２または３日後、分裂している細胞または生き残っている細胞を各回復ウェルから同定し、標準的な２４ウェルＴＣプレートのウェルに播き、１組の系統交雑のトリハイブリッドクローンの基とした。各系統交雑のトリハイブリッドのクローンを、１０ミリリットル（ｍｌ）の我々の標準培養培地（項目１．１参照）を入れた２５ｃｍ２ＴＣフラスコに移してさらなる分析のために適切に標識する前に、２４ウェルプレートにおいてさらに１週間にわたって培養した。一群の安定な系統交雑のトリハイブリッド細胞を生成するために、電気的な細胞ハイブリダイゼーションの全工程および系統交雑のトリハイブリッドの回復の工程を複数回にわたって繰り返した。
４．１．３．ＫＭＷ系統交雑のトリハイブリッドの状態の確認
ＣＤマーカーの発現
樹立したＫＭＷ系統交雑のトリハイブリッド細胞株の確認の例を以下に示す。
ＫＭＷ系統交雑のトリハイブリッド細胞株を通常の培養条件下において６ヶ月間にわたって樹立した後、系統交雑のトリハイブリッド細胞集団を系統特異的なＣＤマーカーの発現について分析した。
次のＣＤマーカー：ＷＩＬ２ＮＳ由来のＣＤ１９、Ｋ５６２由来のＣＤ１５およびＭＯＬＴ４由来のＣＤ４の共発現を確認するために、三色のＦＡＣＳ分析（tri-colour FACS analysis）を用いた。
要約すると、５％のＢＳＡを含んでいるＰＢＳにおいて１×１０６／ｍｌの濃度であるＫＭＷ系統交雑のトリハイブリッド細胞のうち１００μｌを、１００μｌのＰＢＳに懸濁させ、０．５ｍｇ／１００ｍｌのマウス抗ヒトＣＤ１５−ＰｅｒＣＰ抗体、０．２５ｍｇ／１００ｍｌのマウス抗ヒトＣＤ４−ＰＥ抗体および１．０ｍｇ／１００ｍｌのマウス抗ヒトＣＤ１９−ＦＩＴＣ抗体、または適切な同位体対照と共に、４℃において３０分間にわたってインキュベートした。すべてのマウス抗ヒト抗体はBD Pharmingenから入手した。ＰＢＳを用いた十分な洗浄の後、標識した細胞をFACSCaliburフローサイトメーターおよびCellQuest Proソフトウェアを用いて分析した。
図１０はＫＭＷ系統交雑のトリハイブリッド細胞株のＦＡＣＳプロファイルを示す。ＫＭＷ系統交雑のトリハイブリッド細胞は系統特異的な特性が不死化表現型に由来するが、骨髄が支配的である、混合表現型（mixed phenotypes）の異種の細胞集団を含んでいることを、このＦＡＣＳプロファイルは示唆している。しかし、６２％のＫＭＷ細胞が骨髄およびＴリンパ球の表現型を共有し、２８％のＫＭＷ細胞がＴおよびＢリンパ球の表現型を発現している。
４．２．１つの不死の骨髄細胞および初代培養された２つのリンパ球からの系統交雑のトリハイブリッドの生成−ＫＢＴ
系統交雑のトリハイブリッドを、１つの骨髄Ｋ５６２細胞、初代培養された１つのヒトＢ細胞および初代培養された１つのヒトＴ細胞の体細胞ハイブリダイゼーションによって生成した。この系統交雑のトリハイブリッドをＫＢＴと名付け、その後ろに識別番号を付与した。
４．２．１．ＫＢＴ系統交雑のトリハイブリッドの生成のための細胞の調製
ＫＢＴ系統交雑のトリハイブリッドの生成前のＫ５６２細胞の調製については、上述の通りである（項目４．１．１）。（ｉ）脾臓、末梢血または臍帯血に由来する成熟Ｂ細胞（ＣＤ１９＋）；骨髄に由来する初期Ｂ細胞（ＣＤ２０−ＣＤ７２＋）；骨髄に由来する活性化Ｂ細胞（ＣＤ２０＋ＣＤ７２＋）；臍帯血に由来する、抗原を経験したＢ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ５＋）、および（ｉｉ）脾臓、末梢血、臍帯血および胸腺に由来するヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋）、脾臓、末梢血、臍帯血および胸腺に由来する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋）；臍帯血に由来する、抗原を経験したＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ５＋）；臍帯血に由来するＣＤ３＋Ｔ細胞；胸腺に由来する二重陰性Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ８−）、胸腺に由来する二重陽性のＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８＋）を含んでいるＫＢＴ系統交雑のトリハイブリッドの生成に用いた初代培養された細胞を実験において用いた。初代培養された種々のリンパ球の、種々のリンパ組織からの単離は、項目１．３に上述されている。
４．２．２．ＫＢＴ系統交雑のトリハイブリッドの生成のための細胞ハイブリダイゼーションの手順
ＫＢＴ系統交雑のトリハイブリッドの生成のための細胞ハイブリダイゼーションの手順は、培地ならびにＡＣ電界およびパルスを変更したことを除いて、ＫＭＷ系統交雑のトリハイブリッドの生成のために用いたもの（項目４．１．２）と同様である。これらの実験において用いたハイブリダイゼーション培地は、２３０ｍＭのソルビトール、１．８ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｍＭのＣａＣｌ２、０．２ｍＭのＭｇ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２および０．３ｍＭのＣａ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２を含んでおり、０．３％のＢＳＡによって補われていた。０．５ＭＨｚおよび６５〜７５ｋＶ／ｍのＡＣ電界を、それぞれ１００μ秒のパルス幅および１７５〜１８５ｋＶ／ｍの強度を伴う３秒間隔における３回にわたる連続した方形波パルスと同時に印加した。３回目の方形波パルスの終了後、ＡＣ電界をさらに５秒間にわたって連続的に出力し、細胞のハイブリダイゼーションが系統交雑のトリハイブリッドを生成するという結果になった。この新しく作り出した系統交雑のトリハイブリッド細胞の安定な株の回復および樹立のための手順は、４．１．２に記載されている。
４．２．３．ＫＢＴ系統交雑のトリハイブリッドの状態の確認
細胞表面上におけるＣＤマーカーの発現
１つの不死の骨髄（Ｋ５６２）細胞、初代培養された１つの成熟Ｂ細胞、および初代培養された１つのエフェクターＴヘルパー細胞から樹立したＫＢＴ系統交雑のトリハイブリッド細胞株
系統交雑のトリハイブリッド細胞株を、例えば、通常の培養条件下において数ヶ月間にわたって樹立した後、この細胞株を系統特異的なＣＤマーカーの発現について分析した。ハイブリダイゼーション前の細胞の調製（項目１．３．１．１）についての記載と同様の手順を用いて、ＫＢＴ細胞株の細胞をマウス抗ヒトＣＤ１９およびＣＤ４抗体を用いて標識した。図１１（ｄ）は、１つの不死の骨髄単球細胞および初代培養された２つの細胞から樹立したＫＢＴ系統交雑のトリハイブリッド細胞株のＦＡＣＳプロファイル（ＣＤ１９およびＣＤ４標識）を示す。代表的に、このような安定な系統交雑のトリハイブリッドにおける９５％より多い細胞が、親である初代培養された細胞と同様の密度を伴って、ＢおよびＴ細胞の両方に関するＣＤマーカーを発現していた。
１つの不死の骨髄細胞（Ｋ５６２）および抗原を経験した、初代培養された２つのリンパ球（ＢおよびＴ細胞）から樹立したＫＢＴ系統交雑のトリハイブリッド細胞株
他の実施形態において、１つのＫ５６２細胞、抗原を経験した１つのＢ細胞および抗原を経験した１つのＴ細胞に由来するＫＢＴ細胞株を樹立した。この細胞をＦＡＣＳを用いてＣＤ１９、ＣＤ３およびＣＤ５の共発現について分析した。
要約すると、細胞ハイブリダイゼーション前の細胞の調製（項目１．３．１．１）と同様の手順を用いて、この細胞をマウス抗ヒトＣＤ５−ＦＩＴＣ抗体およびマウス抗ヒトＣＤ１９−ＰＥ抗体またはマウス抗ヒトＣＤ４−ＰＥ抗体を用いて標識した。図１２はこのようなＫＢＴ系統交雑のトリハイブリッド細胞株の細胞のＦＡＣＳプロファイルを示す。この結果は、ＫＢＴ細胞集団の５〜１０％がＣＤ５分子の細胞表面発現を維持する一方で、ＣＤ３または／およびＣＤ１９について陽性であることによって、その抗原ばくろの記憶を保持していたことを示す。また、ＣＤ５陰性細胞集団の少なくとも８３％がＢ系統（ＣＤ１９）およびＴ系統（ＣＤ３）マーカーの両方を共発現していた。
１つの不死の骨髄細胞（Ｋ５６２）、１つの活性化Ｂ細胞および初代培養された１つの二重陰性の未拘束のエフェクターＴ細胞から樹立したＫＢＴ系統交雑のトリハイブリッド細胞株
他の実施形態において、１つのＫ５６２、胸腺から単離した１つのＴ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ８＋について二重陽性）および骨髄から単離した１つの活性化Ｂ細胞（ＣＤ２０＋およびＣＤ７２＋）（項目１．３．３．４に記載されている）の細胞ハイブリダイゼーションに由来するＫＢＴ細胞株を樹立した。この細胞を細胞表面上におけるＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２０およびＣＤ７２の共発現について分析した。
要約すると、初代培養されたリンパ球の単離（項目１．３．３．１．１）についての記載と同様の手順を用いて、ＫＢＴ系統交雑のトリハイブリッド細胞を、（１）マウス抗ヒトＣＤ４−ＰＥおよびマウス抗ヒトＣＤ７２−ＦＩＴＣ抗体の組合せ、（２）マウス抗ヒトＣＤ２０−ＰＥおよびマウス抗ヒトＣＤ８−ＦＩＴＣ抗体の組合せ、または（３）マウス抗ヒトＣＤ４−ＰＥおよびマウス抗ヒトＣＤ８−ＦＩＴＣ抗体の組み合わせのいずれかを用いて標識した。図１３はこのような系統交雑のトリハイブリッド細胞のＦＡＣＳプロファイルを示す。
この結果（図１３参照）は、ＫＢＴ系統交雑のトリハイブリッド細胞の９９％がその表面上に二重陽性のＴ細胞由来のＣＤ４またはＣＤ８のいずれかを発現しており、６６〜７１％の細胞がＣＤ４について陽性であり、８８〜８９％の細胞がＣＤ８について陽性であった。これらの細胞の６０％において、ＣＤ４およびＣＤ８の発現は同時に起こっていた。二重陽性の胸腺細胞に由来するＣＤ４について陽性であるが、６１％の細胞が同様に骨髄の活性化Ｂ細胞に由来するＣＤ７２について陽性であった。しかし、系統交雑のトリハイブリッド集団の９４％がそれらの表面上にＣＤ７２を発現していた。一方、ＣＤ８陽性の系統交雑のトリハイブリッド細胞の３１％がＣＤ２０を共発現していた。ＣＤ２０陽性細胞の総数は３９％であった。
４．３．１つの不死のリンパ球、初代培養された１つのリンパ球、および初代培養された１つの骨髄単球細胞からの系統交雑のトリハイブリッドの生成−ＷＴＭ
この記載は、１つの不死のヒトＢリンパ球（ＷＩＬ２ＮＳ）、初代培養された１つのヒトＴ細胞、および初代培養された１つのヒト単球からの系統交雑のトリハイブリッド細胞の生成の例である。この系統交雑のトリハイブリッド株をＷＴＭと名付け、その後ろに識別番号を付与した。
４．３．１．ＷＴＭ系統交雑のトリハイブリッドの生成のための細胞の調製
ＷＴＭ系統交雑のトリハイブリッドの生成において用いられるＷＩＬ２ＮＳ細胞の調製については、上述の項目４．１．１に記載されている。脾臓および末梢血に由来するＣＤ１４＋ＣＤ１６−またはＣＤ１４＋ＣＤ１６Ｌ単球；脾臓、末梢血、臍帯血および胸腺に由来するヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋）；脾臓、末梢血、臍帯血および胸腺に由来する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋）；臍帯血に由来する、抗原を経験したＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ５＋）およびＣＤ３＋Ｔ；胸腺に由来する二重陰性のＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ８−）および二重陽性のＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８＋）を包含している、初代培養された細胞をこれらの実験において用いた。初代培養された種々のリンパ球の、種々のリンパ組織からの単離については上述の通りである（項目１．３．３）。いくつかの実施形態において、骨髄に由来するＣＤ３４＋ＣＤ１５＋骨髄単球性の前駆細胞をＣＤ１４陽性単球の代わりに用いた。
４．３．２．ＷＴＭ系統交雑のトリハイブリッドの生成のための細胞ハイブリダイゼーションの手順
ＷＴＭ系統交雑のトリハイブリッドの生成のための細胞ハイブリダイゼーションの手順は、培地を変更したことを除いて、ＫＭＷ系統交雑のトリハイブリッドの生成のために用いたもの（項目４．１．２参照）と同様であった。これらの実験において用いたハイブリダイゼーションの培地は、２３５ｍＭのソルビトール、１．８ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｍＭのＣａＣｌ２、０．３ｍＭのＭｇ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２および０．２５ｍＭのＣａ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２（Sigma）を含んでおり、０．３％のＢＳＡによって補われていた。項目４．２．２の記載とまったく同じ電気的な手順をＷＴＭの生成のために用いた。この新しく作り出した系統交雑のトリハイブリッド細胞の安定な株の回復および樹立のための手順については、項目４．１．２に記載されている。
４．３．３．ＷＴＭ系統交雑のトリハイブリッドの状態の確認
ＣＤマーカーの発現
１つの不死のリンパ球（ＷＩＬ２ＮＳ）、初代培養された１つのＴ細胞および初代培養された１つの単球から樹立したＷＴＭ系統交雑のトリハイブリッド細胞株
１つのＷＩＬ２ＮＳ細胞、初代培養された１つのＴ細胞、および１つの単球の細胞ハイブリダイゼーションに由来するＷＴＭ細胞株を樹立した。系統交雑のトリハイブリッド細胞株を通常の条件（項目１．１参照）下において６ヶ月間にわたって培養した後、系統交雑のトリハイブリッド細胞集団を系統特異的なＣＤマーカーの発現について分析した。初代培養されたこれらのＴ細胞をハイブリダイゼーションのために用いたときの、ＷＩＬ２ＮＳから生じたＣＤ１９、初代培養された単球に由来するＣＤ１４、および初代培養されたＴ細胞に由来するＣＤ４の共発現について確認するために、三色のＦＡＣＳ分析を用いた。
要約すると、５％のＢＳＡを含んでいるＰＢＳにおける１×１０６／ｍｌの濃度であるＷＴＭ系統交雑のトリハイブリッド細胞のうち１００μｌを、１００μｌのＰＢＳに懸濁し、標識したモノクローナル抗体（０．５ｍｇ／１００ｍｌのＣＤ１４−ＰｅｒＣＰ、０．２５ｍｇ／１００ｍｌのＣＤ４−ＰＥ、および１．０ｍｇ／１００ｍｌのＣＤ１９−ＦＩＴＣ、全てBD Pharmingenから入手した）または適切な同位体対照と共に、４℃において３０分間にわたってインキュベートした。ＰＢＳを用いた十分な洗浄の後、標識した細胞をFACSCaliburフローサイトメーターおよびCellQuest Proソフトウェアを用いて分析した。
ＷＴＭ系統交雑のトリハイブリッド細胞のＦＡＣＳプロファイルを図１４に示す。不死の細胞に由来するマーカーであるＣＤ１９の発現のレベルは系統交雑のトリハイブリッド細胞集団の間で一貫しているようであったが、初代培養された細胞に由来するマーカーの発現は異なるようであった。この特定の例において、ＣＤ１４およびＣＤ４の発現の強さに基づいて細胞集団を３つのサブグループに分け得る：（ｉ）ＣＤ４ＨＣＤ１４Ｌ；（ｉｉ）ＣＤ４ＨＣＤ１４Ｈ；（ｉｉｉ）ＣＤ４ＬＣＤ１４Ｈ。その後、これらの各集団をＦＡＣＳ、ＭＡＣＳまたは単一細胞クローニングなどの標準的な方法によって単離し、培養物の均質性を維持しながら表現型の特性を互いに異なるものにする、別々の系統交雑のトリハイブリッドの培養物に展開し得る。
１つの不死のリンパ球（ＷＩＬ２ＮＳ）、抗原を経験した、初代培養された１つのＴ細胞および初代培養された１つの単球から樹立したＷＴＭ系統交雑のトリハイブリッド細胞株
ＷＴＭ系統交雑のトリハイブリッド細胞株を生成するためにＣＤ５＋抗原を経験したＴ細胞を用いたときに、三色のＦＡＣＳ分析を用いることによって、ＣＤ１９およびＣＤ１４と同時にＣＤ５の発現を確認した。手順は、マウス抗ヒトＣＤ１９−ＰＥ抗体およびマウス抗ヒトＣＤ５−ＦＩＴＣ抗体を、マウス抗ヒトＣＤ１９−ＦＩＴＣ抗体およびマウス抗ヒトＣＤ４−ＰＥ抗体の代わりに用いたことを除いて、基本的に上記の通りである。系統交雑のトリハイブリッド細胞上におけるこれらのＣＤの発現のＦＡＣＳプロファイルを図１５に示す。不死の細胞に由来し、Ｂ細胞の表現型の要因となるＣＤ１９の発現のレベルは細胞集団の約９１〜９９％において一貫しているようであるが、抗原を経験したＴ細胞に由来するＣＤ５、および初代培養された単球に由来するＣＤ１４の発現はＷＭＴハイブリッド細胞の間で異なっていることが、この分析によって示された。ＣＤ１９陽性細胞のわずか６３％が同様にＣＤ５について陽性であり、ＣＤ１９陽性細胞の７９％がＣＤ１４について陽性であった。特に、ＣＤ１４の発現のレベルはこのようなＷＭＴ系統交雑のトリハイブリッド細胞の間で低いレベルから高いレベルまで異なっていた。一方、細胞集団はＣＤ５＋およびＣＤ５−系統交雑のトリハイブリッド細胞に明確に分かれた。
１つの不死のリンパ球（ＷＩＬ２ＮＳ）、初代培養された１つの細胞傷害性Ｔ細胞、および初代培養された１つの単球から樹立したＷＴＭ系統交雑のトリハイブリッド細胞株
ＷＴＭ系統交雑のトリハイブリッド株を生成するために細胞傷害性ＣＤ８陽性Ｔ細胞を用いたとき、ＣＤ１９、ＣＤ８およびＣＤ１４の共発現を確認するために、この項目において記載したものと同様の三色の標識の手順を用いて、ＦＡＣＳ分析を行った。図１６は、このＷＴＭ系統交雑のトリハイブリッド細胞株の細胞上におけるＣＤ１９、ＣＤ８およびＣＤ１４の発現のＦＡＣＳプロファイルを示す。ＣＤ１９の発現およびそのレベルはこれらＷＭＴ系統交雑のトリハイブリッド細胞の間で一定に維持されている一方で、これら細胞のわずか４６％が初代培養された細胞傷害性Ｔ細胞に由来するＣＤ８を低レベルにおいて共発現しており、４１％が初代培養された単球に由来するＣＤ１４を共発現していた。特に、これらＷＭＴ細胞の間におけるＣＤ１４の発現のレベルは低レベルから高レベルまで異なっていた。
１つの不死のリンパ球（ＷＩＬ２ＮＳ）、初代培養された１つの二重陽性Ｔ細胞および初代培養された１つの単球に由来するＷＴＭ系統交雑のトリハイブリッド細胞株
ＷＴＭ系統交雑のトリハイブリッド細胞株の生成のために胸腺に由来するＣＤ二重陽性のＴ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ８＋）を用いたとき、ＣＤ１９、ＣＤ８およびＣＤ１４の発現を分析に加えて、ＣＤ４およびＣＤ８の共発現の分析を用いた。図１７は、系統交雑のトリハイブリッド細胞株の細胞上におけるＣＤ４およびＣＤ８の共発現についてのＦＡＣＳプロファイルを示す。二重陽性のＴ細胞を用いたこの例において、ＷＴＭ系統交雑のトリハイブリッド細胞の９６％がＣＤ４およびＣＤ８の両方について陽性であった。ＣＤ４＋ＣＤ８＋陽性のＴ細胞に由来するＷＴＭ系統交雑のトリハイブリッド細胞上におけるＣＤ１９およびＣＤ１４の発現プロファイルは、細胞傷害性ＣＤ８陽性エフェクターＴ細胞に由来するＷＴＭ系統交雑のトリハイブリッド細胞と基本的に類似していた。
１つの不死のリンパ球（ＷＩＬ２ＮＳ）、初代培養された１つのＴ細胞、および初代培養された１つの骨髄単球性の前駆細胞から樹立したＷＭＴ系統交雑のトリハイブリッド細胞株
ＷＴＭ系統交雑のトリハイブリッド細胞株を生成するために骨髄に由来するＣＤ３４＋ＣＤ１５＋骨髄単球細胞を用いたとき、ＣＤ１９（Ｂ系統）、ＣＤ３（Ｔ系統）、ＣＤ１５（骨髄系統）およびＣＤ３４（前駆細胞）について表面マーカーを分析した。要約すると、マウス抗ヒトＣＤ１９−ＰＥ抗体、マウス抗ヒトＣＤ４−ＦＩＴＣ抗体（BD Pharmingen）およびマウス抗ヒトＣＤ１５−ＰｅｒＣＰ抗体の組合せ、またはマウス抗ヒトＣＤ３４−ＰＥ抗体、マウス抗ヒトＣＤ４−ＦＩＴＣ抗体およびマウス抗ヒトＣＤ１５−ＰｅｒＣＰ抗体の組合せによって、このＷＴＭ系統交雑のトリハイブリッド細胞株の細胞を標識した。上述の手順（項目１．３．３．１．１）にしたがって、細胞染色を行った。ＣＤ３４＋ＣＤ１５＋骨髄単球性の前駆細胞に由来するＷＴＭ系統交雑のトリハイブリッド細胞の典型的な発現プロファイルを図１８に示す。この分析は、ＷＴＭ系統交雑のトリハイブリッド細胞の約８１％がＢ系統および骨髄単球の表現型（ＣＤ１９＋ＣＤ１５＋）を共有しており、ＣＤ１９＋の６１％がＴ系統のマーカーであるＣＤ４についても陽性であることを示した。ＣＤ４＋系統交雑のトリハイブリッド細胞の３４％がそれらの表面上にＣＤ３４も保持しており、ＣＤ３４＋トリハイブリッド細胞の６８％がＣＤ１５を発現していた。面白いことに、ＣＤ３４およびＣＤ１５はどちらも同じ起源（骨髄単球性の前駆細胞）に由来するにも関わらず、ＣＤ３４＋系統交雑のトリハイブリッド細胞の２８％がＣＤ１５の発現を維持していなかった。
４．４．１つの不死の骨髄細胞、１つの不死のリンパ球、および初代培養された１つのリンパ球Ｔ細胞からの系統交雑のトリハイブリッドの生成−ＫＷＴ
この種の系統交雑のトリハイブリッドの生成を、１つの不死の骨髄細胞（Ｋ５６２）、１つの不死のＢリンパ球（ＷＩＬ２ＮＳ）および初代培養された１つのヒトＴ細胞によって生成した。この種の系統交雑のトリハイブリッドをＫＷＴと名付け、その後ろに識別番号を付与した。
４．４．１．ＫＷＴ系統交雑のトリハイブリッドの生成のための細胞の調製
これら細胞ハイブリダイゼーション実験のためのＫ５６２およびＷＩＬ２ＮＳ細胞の調製については、項目４．１．１に記載されている。細胞ハイブリダイゼーションの前に、最も速い増殖速度を示している細胞型の安定な各クローンを、項目１．１．１に記載されている工程を用いて樹立した。いくつかの実施形態において、項目１．１．３に記載のようなＣＤ７１＋に関して濃縮されている細胞集団を用いた。さらなる実施形態において、項目１．１．３．１に記載のように選択したＣＤ７１＋に関して濃縮されているＫ５６２集団のＣＤ１５＋細胞を用いた。脾臓、末梢血、臍帯血および胸腺に由来するヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋）；脾臓、末梢血、臍帯血および胸腺に由来する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋）；臍帯血に由来する抗原を経験したＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ５＋）およびＣＤ３＋Ｔ細胞；胸腺に由来する二重陰性のＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ８−）および二重陽性のＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８＋）を包含しているＫＷＴ系統交雑のトリハイブリッドの生成のために用いた初代培養された細胞をこれらの実験に用いた（項目１．３参照）。
４．４．２．ＫＷＴ系統交雑のトリハイブリッドの生成のための細胞ハイブリダイゼーションの手順
ＫＷＴ系統交雑のトリハイブリッドの生成のための細胞ハイブリダイゼーションの手順は、ＫＭＷ系統交雑のトリハイブリッドの生成のために用いたもの（項目４．１．２参照）と類似であった。
４．４．３．ＫＷＴ系統交雑のトリハイブリッドの状態の確認
ＣＤマーカーの発現
１つの不死の骨髄細胞（Ｋ５６２）、１つの不死のリンパ球系（ＷＩＬ２ＮＳ）および初代培養された１つのＴ細胞から樹立したＫＷＴ系統交雑のトリハイブリッド細胞株
１つのＫ５６２細胞、１つのＷＩＬ２ＮＳ細胞、および初代培養された１つのＴ細胞の細胞ハイブリダイゼーションに由来するＫＷＴ細胞株を樹立した。系統交雑のトリハイブリッド細胞株が通常の培養条件下において６ヶ月間にわたって安定であった後、系統交雑のトリハイブリッド細胞集団を系統特異的なＣＤマーカーの発現について分析した。Ｋ５６２に由来するＣＤ１５、ＷＩＬ２ＮＳに由来するＣＤ１９、および初代培養されたエフェクターＴヘルパー細胞に由来するＣＤ４の共発現について確認するために、三色のＦＡＣＳ分析を用いた。ＫＷＴ系統交雑のトリハイブリッド細胞の細胞染色のための手順は、基本的にＫＷＴ系統交雑のトリハイブリッドについての記載（項目４．１．３）と同様であった。ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞に由来するＫＷＴ系統交雑のトリハイブリッド細胞のＦＡＣＳプロファイルを図１９に示す。ＫＷＴ系統交雑のトリハイブリッド細胞の大多数は、骨髄単球、ＢおよびＴリンパ球系統の混合表現型の特性を明らかに示した。ＫＷＴ系統交雑のトリハイブリッド細胞の１００％が細胞表面上に、初代培養されたエフェクターＴ細胞に由来する、Ｔリンパ球系統のマーカーであるＣＤ４を発現した一方で、これら細胞の５４％が同時にＷＩＬ２ＮＳ株の不死の細胞に由来するＢ系統マーカーＣＤ１９について陽性であり、これらＣＤ４＋ＣＤ１９＋細胞の２４％が不死の骨髄単球性の前駆細胞株Ｋ５６２に由来するＣＤ１５について陽性であった。
１つの不死の骨髄細胞（Ｋ５６２）、１つの不死のリンパ球（ＷＩＬ２ＮＳ）および１つの二重陽性のＴ細胞から樹立したＫＷＴ系統交雑のトリハイブリッド細胞株
ＫＷＴ系統交雑のトリハイブリッド株を生成するために二重陽性のＴ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞）を用いたとき、初代培養された胸腺細胞に由来するＣＤ４およびＣＤ８の両方の発現プロファイルを同様に分析した。ＣＤプロファイリングのための手順は、マウス抗ヒトＣＤ１９−ＦＩＴＣ抗体の代わりにマウス抗ヒトＣＤ８−ＦＩＴＣ抗体を用いたことを除いて、基本的にＣＤ４＋Ｔ細胞に由来するＫＷＴ系統交雑のトリハイブリッドに関して上述したものと同様であった。二重陽性（ＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞）のＴ細胞に由来する系統交雑のトリハイブリッド細胞の典型的なＣＤ発現プロファイルを図２０に示す。この結果は、ＫＷＴ系統交雑のトリハイブリッド細胞の９９％がＣＤ４＋について陽性であり、６９％がＣＤ８について陽性であり、ＣＤ４＋細胞の２６％がＣＤ１５骨髄単球細胞マーカーについて陽性であり、ＣＤ８＋細胞の２３％がＣＤ１５について陽性であることを示し、これはＣＤ４＋ＣＤ８＋ＣＤ１５＋細胞が全細胞集団の約２３％に相当することを意味した（細胞のほぼ１００％がＣＤ４＋であるため、二重陽性ＣＤ８＋ＣＤ１５＋集団はＣＤ４に対しても陽性であり得る）。ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞に由来するＫＷＴトリハイブリッドの場合と同様に、ＣＤ１９＋細胞は全細胞集団の５２％に相当し、そのうちの２２％がＣＤ１５を共発現していた。したがって、２２〜２３％に相当する全ＣＤ１５＋細胞集団はＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ１９を共発現していた。
１つの不死の骨髄細胞（Ｋ５６２）、不死のリンパ球（ＷＩＬ２ＮＳ）および抗原を経験したＣＤ５陽性のＴ細胞から樹立したＫＷＴ系統交雑のトリハイブリッド細胞株
ＫＷＴ系統交雑のトリハイブリッド株を生成するために抗原を経験したＣＤ５陽性のＴ細胞を用いた際、ＣＤ５の発現を分析した。マウス抗ヒトＣＤ１９抗体およびマウス抗ヒトＣＤ５抗体の間において結合させた蛍光体を入れ替えたことを除いて、ＷＴＭ系統交雑のトリハイブリッドの分析のために用いたもの（項目４．６）と同様の手順を用いて、マウス抗ヒトＣＤ１９−ＦＩＴＣおよびマウス抗ヒトＣＤ５−ＰＥ抗体を用いて、ＫＷＴハイブリッド細胞を標識した。図２１に示される結果は、ＫＷＴ系統交雑のトリハイブリッド細胞の９０％が抗原を経験したＴ細胞に由来するＣＤ５について陽性であり、ＣＤ５細胞の４９％がＷＩＬ２ＮＳ細胞（Ｂ細胞）に由来するＣＤ１９に対しても陽性であることを示した。系統交雑のトリハイブリッド細胞の間のＣＤ１９＋細胞の全割合は約５６％であった。
４．５．２つの不死のリンパ球（ＷＩＬ２ＮＳ）および初代培養された１つの単球からの系統交雑のトリハイブリッドの生成−ＷＷＭ
この種の系統交雑のトリハイブリッドの生成を２つの不死のリンパ球（ＷＩＬ２ＮＳ）および初代培養された１つのヒト単球の体細胞ハイブリダイゼーションによって行った。この系統交雑のトリハイブリッドをＷＷＭと名付け、その後ろに識別番号を付与した。
４．５．１．ＷＷＭ系統交雑のトリハイブリッドの生成のための細胞の調製
ＷＩＬ２ＮＳ細胞株を項目４．１．１の記載と同様の手順において培養した。
いくつかの実施形態において、項目１．１．３に記載のように樹立したＣＤ７１＋に関して濃縮されている細胞集団を用いた。ヒト単球を脾臓、末梢血または臍帯血に由来する混合リンパ球から単離した。単球の単離はＣＤ１４マーカーの発現およびいくつかの実施例においては低いレベルのＣＤ１６の発現に基づいており、項目１．３．３．１．１に記載のようなＦＡＣＳまたは磁気ビーズのいずれかに基づいた。異なるリンパ組織由来の単球を用いたとき、ハイブリダイゼーションのパラメーターまたは得られた系統交雑のトリハイブリッドにおいて違いはないようであった。
４．５．２．ＷＷＭ系統交雑のトリハイブリッドの生成のための細胞ハイブリダイゼーションの手順
ＷＷＭ系統交雑のトリハイブリッドの生成のための細胞ハイブリダイゼーションの手順は、ＫＢＴ系統交雑のトリハイブリッドの生成のために用いたもの（項目４．２．２参照）と同様であった。
４．５．３．ＷＷＭ系統交雑のトリハイブリッドの状態の確認
ＣＤマーカーの発現
ＷＷＴ系統交雑のトリハイブリッド細胞株が通常の培養条件（項目１．１参照）下において６ヶ月間にわたって安定であった後、系統交雑のトリハイブリッド細胞集団を系統特異的なＣＤマーカーの発現について分析した。
マウス抗ヒトＣＤ１９−ＦＩＴＣ抗体およびマウス抗ヒトＣＤ１４−ＰＥ抗体による二重染色または標識を、得られた系統交雑のトリハイブリッドの系統交雑のマーカーの発現をプロファイルするために使用した。図２２ａはこのような系統交雑のトリハイブリッド細胞の典型的なＣＤプロファイルを示す。発癌遺伝子関連マーカーのＣＤ１９の発現が系統交雑のトリハイブリッドにおいて一貫しているようであった。いくらかの割合の細胞（２３．５％）はそれらの表面上にＣＤ１４を発現していたが、残りの７２．７％はＣＤ１４の表面発現について陰性であった。
４．６．非ヒト哺乳類細胞を用いた系統交雑のトリハイブリッドの生成
以下の例は、ヒト以外の哺乳類細胞（特にマウス細胞）を用いて系統交雑のトリハイブリッドを生成し得ることを示す。他の哺乳類細胞からの系統交雑のトリハイブリッドの生成において同様の原理を適用し得ることがわかった。
４．６．１．１つの不死のマウスリンパ球、初代培養された１つのマウスリンパ球、および初代培養された１つのマウス単球からの系統交雑のトリハイブリッドの生成
ここでは、１つの不死のマウスＢリンパ球（Ｓｐ２)、初代培養された１つのマウスＴ細胞、および初代培養された１つのマウス単球からの系統交雑のトリハイブリッド細胞の生成について説明する。この系統交雑のトリハイブリッド株をＳＴｍＭｍと名付け、その後ろに識別番号を付与した。
４．６．１．１．ＳＴｍＭｍ系統交雑のトリハイブリッドの生成のための細胞の調製
ＳＴｍＭｍ系統交雑のトリハイブリッドの生成において用いたＳｐ２細胞の調製については、項目１．１．４に記載されている。末梢血に由来するＣＤ１１ｂ＋ＣＤ９０−Ｂ２２０−ＣＤ４９ｂ−ＮＫ１．１−Ｌｙ６Ｇ−／ｌｏｗ単球；脾臓または末梢血に由来するマウスヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋）；脾臓または末梢血に由来するマウス細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋）；脾臓または末梢血に由来する二重陽性のＴ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ８＋）を包含している、初代培養されたマウス細胞をこれらの実験に用いた。初代培養された種々のマウスリンパ球の、脾臓または末梢血からの単離については上述の通りである（項目１．３．５）。
４．６．１．２．ＳＴｍＭｍ系統交雑のトリハイブリッドの生成のための細胞ハイブリダイゼーションの手順
ＳＴｍＭｍ系統交雑のトリハイブリッドの生成のための細胞ハイブリダイゼーションの手順は、培地ならびにＡＣ電界およびパルスを変更したことを除いて、ＷＴＭ系統交雑のトリハイブリッドの生成のために用いたもの（項目４．３．２参照）と同様であった。これらの実験において用いたハイブリダイゼーション培地は、２６５ｍＭのソルビトール、１．５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、０．４ｍＭのＣａＣｌ２および０．３ｍＭのＭｇ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２（Sigma）を含んでおり、０．２％のＢＳＡによって補われていた。０．５ＭＨｚおよび６５〜７５ｋＶ／ｍのＡＣ電界を、それぞれ７０μ秒のパルス幅および２５０〜２８０ｋＶ／ｍの強度を伴う３秒間隔における３回にわたる連続した方形波パルスと同時に印加した。この新しく作り出した系統交雑のトリハイブリッド細胞の安定な株の回復および樹立のための手順については、項目４．１．２に記載されている。
４．６．１．３．ＳＴｍＭｍ系統交雑のトリハイブリッドの状態の確認
１つのＳｐ２細胞、初代培養された１つのマウスＴ細胞および１つのマウス単球に由来するＳＴｍＭｍ細胞株を樹立した。系統交雑のトリハイブリッド細胞株を通常の培養条件（項目１．１参照）下において６ヶ月間にわたって培養した後、系統交雑のトリハイブリッド細胞集団を系統特異的なＣＤマーカーの発現について分析した。初代培養されたこれらのＴ細胞をハイブリダイゼーションのために用いたときの、Ｓｐ２細胞に由来するＣＤ１３８、初代培養されたマウス単球に由来するＣＤ１１ｂ、および初代培養されたマウスＴ細胞に由来するＣＤ４の共発現について確認するために、三色のＦＡＣＳ分析を用いた。
要約すると、５％のＢＳＡを含んでいるＰＢＳにおける１×１０６／ｍｌの濃度であるＳＴｍＭｍ系統交雑のトリハイブリッド細胞のうち１００μｌを、１００μｌのＰＢＳのに懸濁し、マウスＣＤ１３８−ＰＥ、ＣＤ１１ｂ−ＦＩＴＣおよびＣＤ４−ＰｅｒＣＰ（BD Pharmingen）に対する標識したラットのモノクローナル抗体、または適切な同位体対照と共に、４℃において３０分間にわたってインキュベートした。ＰＢＳを用いた十分な洗浄の後、標識した細胞をFACSCaliburフローサイトメーターおよびCellQuest Proソフトウェアを用いて分析した。
ＳＴｍＭｍ系統交雑のトリハイブリッド細胞のＦＡＣＳプロファイルを図４７に示す。Ｂ系統の不死の細胞に由来するマーカーであるＣＤ１３８の発現のレベルは系統交雑のトリハイブリッド細胞集団の間で一貫しているようであったが、初代培養された細胞に由来するマーカーの発現は異なるようであった。この特定の例において、ＣＤ４またはＣＤ１１ｂのいずれかがＣＤ１３８と共発現してい比較的に少ない割合の細胞が存在していた（図４７ａおよびｂ参照）。ＳＴｍＭｍ細胞をＣＤ４およびＣＤ１１ｂの共発現について分析した際（図４７ｃ参照）、細胞の約８２％がＣＤ４およびＣＤ１１ｂを共発現していた。事実上、細胞集団の８２％が３つすべてのＣＤマーカーを発現していており、細胞のわずか５％がＣＤ４またはＣＤ１１ｂのいずれかと共発現することなくＣＤ１３８陽性であった。その後、これらの各集団をＦＡＣＳ、ＭＡＣＳまたは単一細胞クローニングなどの標準的な方法によって続いて単離し、培養物の均質性を維持しながら表現型の特性を互いに異なるものにする、別々の系統交雑のトリハイブリッドの培養物に展開し得る。
ＳＴｍＭｍ系統交雑のトリハイブリッドの生成において細胞傷害性ＣＤ８陽性リンパ球を用いたとき、得られたトリハイブリッド細胞上におけるＣＤの共発現に関して、抗ＣＤ４−ＰｅｒＣｐ抗体の代わりにラット抗マウスＣＤ８−ＰｅｒＣｐ抗体を用いた。図４８からみられるように、このトリハイブリッド細胞の９７から１００％がＣＤ１３８（図４８ａおよびｂ）について陽性である一方、これら細胞の５６％または５７％がＣＤ８（図４８ｂ）またはＣＤ１１ｂ（図４８ａ）を共発現していた。トリハイブリッド集団の少なくとも４０％が３つのマーカーＣＤ１３８、ＣＤ８およびＣＤ１１ｂの全てを発現していた（図４８ｃ）。
二重陽性のＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の場合において、第１の分析を細胞傷害性Ｔ細胞に関するものと同様の方法において行った。図４９は、得られたトリハイブリッド上におけるＣＤ１３８、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ８の発現のＦＡＣＳプロファイルを示す。トリハイブリッド細胞の９８〜１００％がＣＤ１３８について陽性であり、全集団の５７〜６０％が３つの系統マーカーの全てについて陽性であった（図４９ｃ）。ＣＤ１３８およびＣＤ８の共発現を９３％の細胞において検出した（図４９ｂ）。第２の段階において、トリハイブリッド細胞をＣＤ８およびＣＤ４の共発現について確認した。この細胞をラット抗マウスＣＤ８−ＰＥ抗体およびラット抗マウスＣＤ４−ＦＩＴＣ抗原（BD Pharmingen）を用いて標識した。図５０は、ＣＤ８およびＣＤ４の発現のＦＡＣＳプロファイルを示す。トリハイブリッド細胞の９５％が表面上にＣＤ８を発現していたが、細胞の５０％のみが同時にＣＤ４を共発現していた。特に、ＣＤ４陽性集団の全体がＣＤ８に対しても実際に陽性であった。
４．６．２．２つの不死のマウスリンパ球および初代培養された１つのマウス単球からの系統交雑のトリハイブリッドの生成
この例は、２つの不死のマウスＢリンパ球（Ｓｐ２）および初代培養された１つのマウス単球からの系統交雑のトリハイブリッド細胞株の生成を詳細について説明する。この系統交雑のトリハイブリッド株をＳＳＭｍと名付け、その後ろに識別番号を付与した。
４．６．２．１．ＳＳＭｍ系統交雑のトリハイブリッドの生成のための細胞の調製
ＳＳＭｍ系統交雑のトリハイブリッドの生成において用いたＳｐ２細胞の調製については、項目１．１．４に記載されている。末梢血に由来するマウスＣＤ１１ｂ＋ＣＤ９０−Ｂ２２０−ＣＤ４９ｂ−ＮＫ１．１−Ｌｙ６Ｇ−／ｌｏｗ単球をこれら実験に用いた。初代培養されたマウス単球の、末梢血からの単離については上述の通りである（項目１．３．５）。
４．６．２．２．ＳＳＭｍ系統交雑のトリハイブリッドの生成のための細胞ハイブリダイゼーションの手順
ＳＳＭｍ系統交雑のトリハイブリッドの生成のための細胞ハイブリダイゼーションの手順は、ＳＴｍＭｍ系統交雑のトリハイブリッドの生成のために用いたもの（項目４．６．１．２参照）と同様であった。
４．６．２．３．ＳＳＭｍ系統交雑のトリハイブリッドの状態の確認
ＳＳＭｍ系統交雑のトリハイブリッド細胞株が通常の培養条件（項目１．１参照）下において６ヶ月間にわたって安定であった後、系統交雑のトリハイブリッド細胞集団を系統特異的なＣＤマーカーの発現について分析した。
得られた系統交雑のトリハイブリッドの系統特異的なマーカーの発現をプロファイルするために、ラット抗マウスＣＤ１３８−ＰＥ抗体およびラット抗マウスＣＤ１１ｂ−ＦＩＴＣ抗体（BD Pharmingen）による二重染色または標識を適用した。図５１はこのような系統交雑のトリハイブリッド細胞の典型的なＣＤプロファイルを示す。発現遺伝子関連マーカーのＣＤ１３８の発現は系統交雑のトリハイブリッド細胞において一貫しているようであり、わずか７％の細胞がＣＤ１３８について陰性であった。高い割合の細胞（７０％）がそれらの表面上にＣＤ１１ｂも発現していた一方、ＣＤ１３８陽性細胞の残りの２３％がＣＤ１１ｂの表面発現について陰性であった。
４．７．ヒトおよび非ヒト哺乳類細胞を用いた系統交雑のキメラトリハイブリッド（cross-lineage chimeric tri-hybrid）の生成
この例は、ヒトおよび非ヒト哺乳類細胞（特にマウス）を用いた系統交雑のキメラトリハイブリッドの生成について詳細に説明する。他の哺乳類細胞からの系統交雑のトリハイブリッドの生成において同様の原理を適用し得ることがわかった。
４．７．１．１つの不死のマウスリンパ球、１つの不死のヒトリンパ球、ならびに初代培養された１つのマウス単球または初代培養されたヒト単球からの系統交雑のキメラトリハイブリッドの生成
１つの不死のマウスＢリンパ球（Ｓｐ２）、１つの不死のヒトＢリンパ球（ＷＩＬ２ＮＳ）、ならびに初代培養された１つのマウス単球または初代培養されたヒト単球からの系統交雑のキメラトリハイブリッド細胞株の生成。系統交雑のトリハイブリッド株をＳＷＭｍ（マウス単球を用いた）およびＳＷＭｈ（ヒト単球を用いた）と名付けた。各例において、トリハイブリッドの略称に続いて、識別番号を付与した。
４．７．１．１．ＳＷＭｍおよびＳＷＭｈ系統交雑のキメラトリハイブリッドの生成のための細胞の調製
ＳＷＭｍおよびＳＷＭｈ系統交雑のキメラトリハイブリッドの生成において用いたＳｐ２およびＷＩＬ２ＮＳ細胞の調製については、項目１．１．４および項目１．１．３のそれぞれに記載されている。ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ９０−Ｂ２２０−ＣＤ４９ｂ−ＮＫ１．１−Ｌｙ６Ｇ−／ｌｏｗの、初代培養された末梢血に由来するマウス単球をこれらの実験に用いた。初代培養されたマウス単球の、末梢血からの単離については上述されている（項目１．３．５）。ヒト単球を脾臓、末梢血または臍帯血に由来する混合リンパ球から単離した。単球の単離はＣＤ１４マーカーの発現およびいくつかの実施例においては低いレベルのＣＤ１６の発現に基づいており、項目１．３．３．１．１に記載のようなＦＡＣＳまたは磁気ビーズのいずれかに基づいた。異なるリンパ組織からの単球を用いたとき、ハイブリダイゼーションのパラメーターまたは得られた系統交雑のトリハイブリッドにおいて違いはないようであった。
４．７．１．２．ＳＷＭｍおよびＳＷＭｈ系統交雑のキメラトリハイブリッドの生成のための細胞ハイブリダイゼーションの手順
ＳＷＭｍおよびＳＷＭｈ系統交雑のトリハイブリッドの生成のための細胞ハイブリダイゼーションの手順は、ＳＴｍＭｍ系統交雑のトリハイブリッドの生成のために用いたものと同様であった（項目４．６．１．２．参照）。
４．７．１．３．ＳＷＭｍおよびＳＷＭｈ系統交雑のキメラトリハイブリッドの状態の確認
ＳＷＭｍおよびＳＷＭｈ系統交雑のキメラトリハイブリッド細胞株が通常の培養条件（項目１．１参照）下において６ヶ月間にわたって安定であった後、系統交雑のキメラトリハイブリッド細胞集団を系統特異的なＣＤマーカーの発現について分析した。
ヒトＣＤ７１およびマウスＴｆＲの発現についての二重染色を、得られたトリハイブリッドのキメラ化を証明するために行った。図５２は、このような分析の典型的なＦＡＣＳプロファイルを示し、１００％の細胞がヒトおよびマウス両方のトランスフェリン受容体について陽性であったことを示す。これは、マウスおよびヒト両方の細胞分裂の制御におけるトリハイブリッドな依存を示す。
得られた系統交雑のキメラトリハイブリッドの系統マーカーの発現をプロファイルするために、初代培養された単球のマウスまたはヒト起源にしたがって、（１）ラット抗マウスＣＤ１３８−ＰＥ抗体およびラット抗マウスＣＤ１１ｂ−ＦＩＴＣ抗体（BD Pharmingen）、（１）またはラット抗マウスＣＤ１３８−ＰＥ抗体およびマウス抗ヒトＣＤ１４−ＦＩＴＣ抗体（BD Pharmingen）による二重染色または標識を適用した。図５３は、このような、系統交雑のキメラトリハイブリッド細胞の典型的なＣＤプロファイルを示す。マウスＳｐ２細胞に由来する発癌遺伝子関連マーカーのＣＤ１３８の発現は、単球のマウスまたはヒト起源に依存しているようであった。マウスＣＤ１３８陽性細胞の割合は、ＳＷＭｍトリハイブリッドにおける８４％からＳＷＭｈトリハイブリッドにおける２９％まで低下した。しかし、ＳＷＭｈキメラトリハイブリッド細胞の９６％がＷＩＬ２ＮＳに由来するヒトＣＤ１９について陽性であった（図５４参照）。一方、ＳＷＭｍキメラトリハイブリッドにおける何れの細胞もヒトＣＤ１９を発現していなかった。
＜実施例５＞
５．ＣＤマーカーの分布に基づいた、特異的な異系統の表現型を有している細胞についての、系統交雑のトリハイブリッドの濃縮
以下の項目は、異なる表現型特性に基づいて系統交雑のトリハイブリッド細胞株の亜系統を樹立する一例をもたらす。この試みは、系統特異的な細胞表面マーカー、系統特異的なマーカーの細胞内発現、系統特異的なマーカーのＲＮＡ転写産物の存在、核型分類、および／または系統特異的なタンパク質の分泌の分析に基づいた。所望の特性を有している系統交雑のトリハイブリッド細胞を、ＦＡＣＳによって全体の集団から単離した。以下の例は、ＣＤ１４の発現に基づいている２つのトリハイブリッド集団を有しているＷＷＭ系統交雑のトリハイブリッドに基づいている。しかし、この例は、選択した特定の系統交雑のトリハイブリッドまたはマーカーには決して限定されない。
ＷＷＭ系統交雑のトリハイブリッド細胞をＣＤ１４陽性およびＣＤ１４陰性の画分に分取し、各画分を増殖させ、３ヶ月間にわたって別々に培養に維持した。図２２ｂは系統交雑のトリハイブリッド細胞の９５％よりも多くがＣＤ１４の発現を保持していたことを示す一方、図２２ｃにおける細胞集団はＣＤ１４について陰性であり続けた。このことは、同じ系統交雑のトリハイブリッド株に由来する、異なる均質性の細胞集団を単離および樹立することが可能であることを証明する。
ＲＴ−ＰＣＲによる系統交雑のトリハイブリッドの確認
生成した亜系統の系統交雑のトリハイブリッドの性質を確認するため、元の系統交雑のトリハイブリッド細胞、ＣＤ１９＋ＣＤ１４＋に関して濃縮されている継代培養物およびＣＤ１４陰性の継代培養物を、ＣＤ１４についてＲＴ−ＰＣＲ分析にかけた。ヒトＣＤ１４＋単球を陽性対照として用いた。上述のようにＦＡＣＳを用いて、対照細胞を末梢血から単離した（項目１．３．３）。
要約すると、RNeasyキット（RNeasy Mini kit, Qiagen）を用いて、培養した細胞から総ＲＮＡを調製した。ｃＤＮＡの合成をcDNA-Kit（Amersham Pharmacia）を用いて、製造者の手順にしたがって行い、ＰＣＲを基本的にSewingらの記載の通りに行った。ＰＣＲ反応混合物をアガロースゲル（２％）電気泳動によって分析し、エチジウムブロマイド染色によって可視化した。オリゴヌクレオチドプライマー対は、４５０ｂｐのＰＣＲ産物を増幅するための配列、５’−プライマー
5’ - CACACTCGCCTGCCTTTTCC - 3’（配列番号１）および
３’−プライマー 5’ GATTCCCGTCCAGTGTCAGG - 3’（配列番号２）を有していた。
図２３において示されるように、ＲＴ−ＰＣＲは、細胞を含んでいる元のＷＷＭ培養物の両方および元のＷＷＭ培養物のＣＤ１４＋に関して濃縮されている継代培養物おいてＣＤ１４のｍＲＮＡ転写産物の存在を明らかにした。ＣＤ１４のｍＲＮＡを表面のＣＤ１４が消失しているＷＷＭ継代培養物においても、ヒトＣＤ１４＋単球のものと同等のレベルにおいて検出した。
＜実施例６＞
６．核型分類
系統交雑のトリハイブリッドの、ハイブリッドの起源を確認するためだけでなく、細胞発生特性を確立するために、系統交雑のトリハイブリッドの核型分類を行った。
６．１．元の細胞株の核型分類
一例として、元の細胞株の任意の染色体の不安定性を記録するために、Ｋ５６２の細胞およびＷＩＬ２ＮＳ細胞株を、初期および後期の継代について核型分類した。所定の細胞株（例えばＫ５６２株）について、新たに解凍した株の核型は、通常の培養条件下において数ヶ月間にわたって維持した細胞株と同一であることがわかった。
図２４および２５は、それぞれＫ５６２およびＷＩＬ２ＮＳ細胞の典型的な核型を表している。両方の場合に、全部で２０のＧバンドを形成した分裂中期の細胞を４００ｂｐｈｓにおいて調べた。
核型分類の結果は、Ｋ５６２細胞株が、三倍体の特性を有している（すなわち種々の染色体異常を伴う分類群における６９の典型的染色体数を有している）単一クローンを含んでいることを示した。それに対して、ＷＩＬ２ＮＳ細胞株はＫ５６２細胞と比較した場合に明らかに異なる染色体異常を伴う分類群における４７から４８の典型的染色体数を有している５つの二倍体クローン含んでいた。ＷＩＬ２ＮＳ細胞株におけるクローンの説明
は以下のとおりである：
クローン１が１０％を占める
クローン２が５５％を占める
クローン３が１０％を占める
クローン４が２０％を占める
クローン５が５％を占める。
Figure 2012529270
６．２．タンパク質の発現のために用いる系統交雑のトリハイブリッドの核型分類
系統の異なる３つの不死の細胞および初代培養された細胞の種々の組合せに由来しており、さらに所望のタンパク質の発現のために用いる系統交雑のトリハイブリッドを核型分類した。また、これらの核型を元の不死の細胞株（系統交雑のトリハイブリッドの生成に用いた）のものと比較した。
６．２．１．ＫＢＴ系統交雑のトリハイブリッド株の核型分類
Ｋ５６２不死の骨髄細胞株および初代培養されたＢリンパ球およびＴリンパ球に由来する２つのＫＢＴ系統交雑のトリハイブリッド株を核型分類した。活性化Ｂ細胞（ＣＤ２０＋ＣＤ７２＋）および二重陽性のＴ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ８＋）に由来し、ＣＤ発現特性に基づいた種々の型の細胞を有しているＫＢＴ系統交雑のトリハイブリッド（項目４．２．３）も比較のために核型分類した。図２６は、Ｋ５６２＋Ｂ（ＣＤ１９＋）＋Ｔ（ＣＤ４＋）ハイブリダイゼーションに由来するＫＢＴ系統交雑のトリハイブリッド株（ＫＢＴ−１株と称する）の典型的な核型を示す。ＫＢＴ−１の単一細胞クローンが、分類群における６６の典型的染色体数を有している近三倍体であることを示した。
Ｋ５６２細胞、Ｂ（ＣＤ２０＋ＣＤ７２＋）細胞およびＴ（ＣＤ４＋ＣＤ８＋）細胞の細胞ハイブリダイゼーションに由来するＫＢＴ系統交雑のトリハイブリッド株（ＫＢＴ−２株と称する）を核型分類したところ、ＫＢＴ−２株（前の項目において種々のＣＤ発現が示されていた株）の核型分類が近三倍体である４つのクローンからなることがわかった。クローン１、クローン２、クローン３およびクローン４は、それぞれ細胞集団の４５％、３０％、１５％および１０％に相当した。クローン４は分類群における６６の典型的染色体数を有していた。一方、他のクローンはそれぞれ分類群における６７の典型的染色体数を有していた。図２７はＫＢＴ−２株のクローンのうち１つの核型分類を示す。
ＫＢＴ−１およびＫＢＴ−２株の核型分類を表３に要約している。この表の最初の列は染色体の番号を表した。del(3)(p14)、der(4)t(4;?)(q25;?)、+der(7)t(7;mar3)(q10;q10)およびder(X)t(X;?;?)(q13;?;?)のようないくつかの染色体変化が、初代培養されたリンパ球の亜型と無関係にすべての系統交雑のトリハイブリッドによって共有されているが、Ｋ５６２細胞とは共有されていない。
Figure 2012529270
６．２．２．ＫＷＴ系統交雑のトリハイブリッド株の核型分類
不死の骨髄細胞株Ｋ５６２、不死のＢリンパ球株ＷＩＬ２ＮＳ、および初代培養されたＴリンパ球に由来する３つのＫＷＴ系統交雑のトリハイブリッド株を核型分類した。二重陽性のＴ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ８＋）に由来し、ＣＤ発現特性（項目４．２．３）に基づいた種々のタイプの細胞を有しているＫＷＴ系統交雑のトリハイブリッド（ＫＷＴ−３と称する）も比較のために核型分類した。
図２８、２９および３０はそれぞれＫＷＴ−１、ＫＷＴ−２およびＫＷＴ−３系統交雑のトリハイブリッド株の典型的な核型を示す。それぞれの場合において、全部で２０個のＧバンドを形成した分裂中期の細胞を４００ｂｐｈｓにおいて分析した。ＫＷＴ−１は近六倍体（６ｎ＝１３８染色体）である単一クローンを含んでいた。分類群の典型的染色体数は核型の不均質性を伴って１２９から１４０に分布した。すなわち、すべての分析した細胞がいくつかの染色体異常を共有していた。ＫＷＴ−２は同様に近六倍体である単一クローンを含んでいた。分類群の典型的染色体数は核型の不均質性を伴って１３５から１４５本に分布した。ＫＷＴ−３は高七倍体（ｎ＞１１５）である３つのクローンを含んでいた。クローン１、クローン２および３は、それぞれ細胞集団の５５％、２０％および２５％に相当した。ＫＷＴ系統交雑のトリハイブリッドの核型は、Ｋ５６２およびＷＩＬ２ＮＳ細胞株の両方の遺伝的特徴がすべてのＫＷＴ系統交雑のトリハイブリッドにおいて、それらの生成において用いた初代培養されたＴ細胞の型と無関係に保持されることを裏付けた。表４は、これらＫＷＴ系統交雑のトリハイブリッド（すなわち、ＫＷＴ−１、ＫＷＴ−２およびＫＷＴ−３株）の核型の比較分析を要約するものである。
Figure 2012529270
６．２．３．ＷＷＭ系統交雑のトリハイブリッド株の核型分類
２つの不死のＢリンパ球（２つのＷＩＬ２ＮＳ株）および初代培養された単球（ＣＤ１４＋）に由来するＷＷＭ系統交雑のトリハイブリッド株も核型分類した。ＣＤ１４＋細胞に関して濃縮されているこの系統交雑のトリハイブリッドの亜系統を同様に核型分類した。図３１Ａおよび３１Ｂは、それぞれ元のＷＷＭ系統交雑のトリハイブリッドおよびそのＣＤ１４＋に関して濃縮されている亜系統の核型を示す。それぞれの場合において、全部で２０の細胞に由来するＧバンドを形成した分裂中期の染色体を、４００ｂｐｈｓにおいて分析した。元のＷＷＭ系統交雑のトリハイブリッドは４７本の染色体（１１の細胞（５５％）においてみられた）を有している単一優性クローン（a single dominant clone）を含んでいた。しかし、分析した残りの９の細胞は近三倍体（ランダムな染色体欠損を伴う）から近四倍体（ランダムな染色体欠損を伴う）に分布する。これら細胞の何れの間でも一貫性はなかった。一方、ＣＤ１４＋に関して濃縮されているＷＷＭ系統交雑のトリハイブリッドの核型は、１９の細胞において検出された単一クローンの異常を示した。たった１個の四倍体細胞が検出された。
Figure 2012529270
＜実施例７＞
７．ＰＣＲによるＥＢＶゲノムの検出
ＰＣＲ分析のためにおよび所定の系統交雑のトリハイブリッド細胞株のために、ゲノムＤＮＡを５×１０６の系統交雑のトリハイブリッドから抽出した。製造者の手順にしたがってQIAamp DNA Micro kit（Qiagen）を用いて、ＭＯＬＴ−４細胞を陰性対照として使用し、一方でＣＯ８８ＢＶ５９−１を陽性対照として使用した。定性ＰＣＲ分析において、ＥＢＶゲノムのＢａｍＨＩ Ｗ領域を特異的プライマーを用いて増幅した。上流および下流のプライマー配列は、それぞれ、5’-CAAGAACCCAGACGAGTCCGTAGAA-3’（配列番号３）および5’-AAGAAGCATGTATACTAAGCCTCCC-3’（配列番号４）である（Kimura, et al., 1999）。１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ、２００μＭのｄＮＴＰ、０．６μＭの各プライマーおよび０．５ＵのＴａｑポリメラーゼ（Lomb Life Science）を含んでいる反応混合物に、１０ｎｇの抽出したＤＮＡを加えた。GeneAmp PCR system 9600（Perkin Elmer）を用いて、９５℃における２分間の最初の変性に続いて、９５℃における１５秒間および６０℃における１分間を２８サイクル行った。増幅させたサンプルを２％アガロースゲルにおいて分離した。
上記分析による結果は、本発明において樹立したすべての系統交雑のトリハイブリッドがＥＢＶゲノムについて陰性であることを示した。
＜実施例８＞
８．マイコプラズマ試験
本発明において用いた任意の細胞株および生成した系統交雑のトリハイブリッド株に対するマイコプラズマ試験を、製造者の手順にしたがってマイコプラズマＰＣＲ検出キット（Lomb Scientific）を用いて行った。この試験による結果は、すべての細胞株および系統交雑のトリハイブリッドがマイコプラズマを有していないことを示した。
＜実施例９＞
９．系統交雑のトリハイブリッドの発現系におけるタンパク質の発現およびそれらのキャラクタリゼーション
本発明のおいて具体化したトリハイブリッドの異系統細胞系は、種々の生体物質の調製に用いられ得る。当該生体分子としては、生体分子（例えば、タンパク質、ペプチド、炭化水素、脂質およびそれらのキメラ分子）が挙げられるが、これらに限定されない。特に、生体分子としては、サイトカイン、成長因子ホルモン、受容体またはそれらのフラグメントもしくはキメラ分子が挙げられ得る。トリハイブリッドの異系統細胞から発現したタンパク質のような所望の生体分子が、分泌、膜結合またはその両方を受け得ることを、当業者は理解し得る。さらに、種々のタンパク質のサブユニットが系統交雑のトリハイブリッド細胞において共発現（例えば免疫グロブリンの発現および特にモノクローナル抗体の生産）され得ることを、当業者は理解し得る。また、トリハイブリッドの異系統細胞が種々の機能的タンパク質またはペプチドフラグメントを発現させるために用いられ得ることを、当業者はさらに理解し得る。免疫グロブリンの場合に、当該機能的タンパク質またはペプチドフラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント（単鎖Ｆｖフラグメントが挙げられる）断片である。
所望のタンパク質を発現しているパートナー細胞とのトリハイブリッド細胞の体細胞ハイブリダイゼーションによって、所望のタンパク質の発現がトリハイブリッド細胞系においてなされ得る（項目９．１）。代替的に、所望のタンパク質の発現を促進するために従来の遺伝子導入の手順に、トリハイブリッド細胞を供し得る（項目９．２．１および項目９．２．２）。さらなる実施形態において、体細胞ハイブリダイゼーションもしくは従来の遺伝子トランスフェクションのいずれか一方またはその両方を用いることによって、トリハイブリッド細胞は複数の標的タンパク質を同時に発現し得る（項目９．３）。
以下の例は、系統交雑のトリハイブリッド細胞における、複数の異なる種類のタンパク質の発現について説明する。また、これらの例は、特定の分化した細胞型に特有のタンパク質が同じ系統交雑のトリハイブリッド細胞において発現され得ることを証明する（たとえば、免疫グロブリンおよびＣＤ５４）。
９．１．トリハイブリッド異系統細胞の、所望のタンパク質を発現している細胞とのハイブリダイゼーション
９．１．１．ヒトＧＭ−ＣＳＦの発現
ＣＤ１４陽性細胞を濃縮したＷＷＭ系統交雑のトリハイブリッド株（項目５に記載されている）を、この特定の例においてパートナー細胞として用いた。項目１．３．３．１．１に記載のように単離した活性化ヒトＣＤ４陽性リンパ球を、ヒトＧＭ−ＣＳＦの起源として用いた。電気的な細胞ハイブリダイゼーションの手順は、基本的に項目４．３．２に記載されているＷＷＭ系統交雑のトリハイブリッドの生成のために用いたものと同様であった。得られたＷＷＭとＣＤ４＋培養Ｔ細胞とのハイブリッドが安定になった後、細胞株として維持し、ＰｒｏＧＭと名付けた。
ヒトＧＭ−ＣＳＦの発現の結果
ＰｒｏＧＭの上清をサンドイッチ型のＥＬＩＳＡによってヒトＧＭ−ＣＳＦについて試験した。９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Corning）を、５０μｌの精製したウサギポリクローナル抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体（１０μｇ／ｍｌ）により、４℃において一晩にわたって被覆した。抗体溶液を除去した後、プレート上の残っているタンパク質の結合部位を５％のＢＳＡを含んでいる１００μｌのＰＢＳ（５％ＢＳＡ−ＰＢＳ）によってブロックした。次いで、ＰｒｏＧＭハイブリッド細胞株由来の５０μｌの培養上清をウェルに加え、３７℃において２時間にわたってインキュベートした。０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含んでいるＰＢＳ（Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ）を用いて３回にわたって洗浄した後、５０μｌのウサギ抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体（１０μｇ／ｍｌ）と共に室温において１時間にわたってインキュベートした。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳによって３回にわたって洗浄した後、ペルオキシダーゼを結合させた、２００倍希釈の抗ウサギ免疫グロブリンと共に室温において２時間にわたってインキュベートした。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳによって３回にわたってリンスした後、ＡＢＴＳおよび０．０１％の過酸化水素と共にインキュベートすることによって最後の反応を可視化した。４１５ｎｍにおける吸収を測定した。組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを基準として用いた。すべての分析を、所定のサンプルに関して２回にわたって行った。その結果は、ＰｒｏＧＭが最適化されていない培養条件下においてヒトＧＭ−ＣＳＦを０．７から１．１μｇ／ｍｌ／１０６細胞の範囲において産生することを示した。
ウェスタンブロットおよび免疫沈降による、ＰｒｏＧＭハイブリッドに由来するｈＧＭ−ＣＳＦの性質決定は、ＰｒｏＧＭハイブリッドがヒトリンパ球によって天然に分泌される糖鎖型と一致する糖タンパク質型を示している完全なヒトＧＭ−ＣＳＦを産生することを裏付けた。ＰｒｏＧＭハイブリッドから回収した上清を分析前に１００倍希釈した。ウェスタンブロット分析用の免疫ブロットＮＣ膜（Millipore）および０．１μｇ／ｍｌの濃度におけるビオチン化されたラット抗ヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体（R&D systems）を、ウェスタンブロット検出のために用いた。図３２において、ＰｒｏＧＭハイブリッドによって分泌されたｈＧＭ−ＣＳＦのウェスタンブロット（レーン４）は、ＰＨＡ活性化ヒトリンパ球の培養物によって分泌されたＧＭ−ＣＳＦ（レーン２）と同様の、型の不均質性を示した。ＰｒｏＧＭおよびリンパ球の培養物の両方において発現したＧＭ−ＣＳＦの分子量分布は、１８ｋＤａから３５ｋＤａに及んでいた。ツニカマイシン（アスパラギン残基への炭化水素鎖の付加を示す）の存在において、より分子量の大きい分子（すなわち３５ｋＤａ）は検出されず、認められる不均質性が異なるグリコシル化の程度に起因していることを示した（レーン５）。ＰＨＡ活性化リンパ球またはＰｒｏＧＭハイブリッドの発現系のいずれか一方によって産生されたＧＭ−ＣＳＦ型の分子量は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するＧＭ−ＣＳＦ（レーン６）より大きかった。
１０μｇ／ｍｌのツニカマイシンを補ってか、または補わずに培養したＰｒｏＧＭハイブリッドの上清を回収し、それぞれ大腸菌に由来するヒトまたはマウスＧＭ−ＣＳＦに対するラット抗ヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体またはウサギ抗マウスＧＭ−ＣＳＦ抗体と共に４０℃において一晩にわたってインキュベートした。Protein A-Sepharose（Invitrogen）を加え、さらに室温において３時間にわたってインキュベートした。回収した樹脂を０．１５ＭのＮａＣｌ、０．５％のＮＰ−４０、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０によって完全に洗浄した。結合しているタンパク質をＬａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液によって可溶化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。図３３において示されるように、ＰｒｏＧＭハイブリッドによって分泌されたＧＭ−ＣＳＦの分子量は、天然に存在している型と類似している１８ｋＤａから３５ｋＤａに分布する。この不均質性は、２つのＮ−グリコシル化部位およびいくつかのＯ−グリコシル化部位における異なるグリコシル化に起因している。ツニカマイシンの存在下において、より大きい分子量のバンドは検出されず、より小さい分子量（１８〜２２ｋＤａ）のタンパク質が蓄積した。このデータは、ＰｒｏＧＭハイブリッドに由来するｈＧＭ−ＣＳＦがヒト糖タンパク質として分泌されることを裏付けている。
９．１．２．ヒト免疫グロブリンの発現
ＦＡＣＳによって決定したとおりの表現型マーカー（さらなる詳細については項目４．４．３参照）有し、項目６．２．２に記載のように核型分類した、抗原を経験したＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ５＋）に由来するＫＷＴ系統交雑のトリハイブリッド株（ＫＷＴ−２と称する）を、電気的な細胞ハイブリダイゼーションを介したヒト免疫グロブリンの発現のために用いた。特に、ＫＷＴ−２系統交雑のトリハイブリッドをこの特定の例においてパートナー細胞株として用いた。項目１．３．３に記載のように単離した、初代培養されたＣＤ４０活性化ＩｇＭ陽性またはＩｇＧ陽性Ｂ細胞を、ヒトＩｇの起源として用いた。電気的な細胞ハイブリダイゼーションの手順は項目４．４．２に記載されているＫＷＴ系統交雑のトリハイブリッド株の生成のために用いたものと基本的に同様であった。得られたハイブリッドが安定になった後、それらを維持し、ＰｒｏＩＭまたはＰｒｏＩＧ細胞株と名付けた（項目１．１参照）。
ヒト免疫グロブリンの発現の結果
ＰｒｏＩＭまたはＰｒｏＩＧ由来の上清を、ＩｇＭまたはＩｇＧの存在について、上述したＥＬＩＳＡ（項目１．３．３参照）によって分析した。細胞を丸底９６ウェルプレートにおいて、１ウェルあたり１×１０５に播き、標準的な条件下において２４時間にわたって培養した。血球計算板およびトリパンブルー排除を用いて、細胞のカウントおよび生存率を行った。その結果を表６Ａおよび６Ｂに要約している。各値は３回にわたる独立した計測の平均値±標準偏差（ＳＤ）として示されている。
Figure 2012529270
ＩｇＧサブクラスおよび軽鎖の亜型を、ビオチン化されたマウス抗ヒトＩｇＧ１（クローンＨＰ６０６９）、ＩｇＧ２（クローンＨＰ６００２）、ＩｇＧ３（クローンＨＰ６０４７）、ＩｇＧ４（クローンＨＰ６０２５）（ICN Biomedicals）およびビオチン化されたヤギ抗ヒトκおよびλ鎖（Biosource）を用いて検出した。結合しているビオチン化抗体を、ＡＬＰを結合させたストレプトアビジンによって検出した。
その結果は、ＰｒｏＩＭおよびＰｒｏＩＧ細胞によってそれぞれ産生されたＩｇＭおよびＩｇＧの両方がκ軽鎖を有し、ＩｇＧがＩｇＧ２クラスに属することを示した。
９．１．３．ヒトＣＤ５４の発現
ヒトＣＤ５４の発現についての方法論
ＦＡＣＳによって決定したとおりの表現型マーカー（さらなる詳細については項目４．４．３参照）を有し、項目６．２．２に記載のように核型分類した、成熟ＴヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋）に由来するＫＷＴ系統交雑のトリハイブリッド（ＫＷＴ−１と称する）を、電気的な細胞ハイブリダイゼーションを介したヒトＣＤ５４の発現のためにさらに用いた。特に、ＫＷＴ系統交雑のトリハイブリッドをこの特定の例においてパートナー細胞株として用いた。項目１．３．３に記載のように単離した、初代培養されたヒトＣＤ５４陽性のＴ細胞を、ヒトＣＤ５４分子の起源として用いた。ハイブリダイゼーションの手順はＫＷＴ系統交雑のトリハイブリッド株の生成のために用いたもの（項目４．４．２参照）と基本的に同様であった。得られたハイブリッドが安定になった後、それらを標準的な培養条件（項目１．１参照）下において細胞株として維持し、ＰｒｏＣＤ５４と名付けた。
ｈＣＤ５４の発現の結果
ＰｒｏＣＤ５４細胞の表面上におけるＣＤ５４の発現を、ＦＡＣＳ分析を用いることによって確認した。元のＫＷＴ系統交雑のトリハイブリッド細胞の１００％が、それらの表面上にＣＤ４を発現していた（図１９参照）。そのため、ＰｒｏＣＤ５４細胞の表面上におけるＣＤ４の発現を、得られた細胞株の安定性のための基準として用いた。要約すると、１００μｌの分量あたり１×１０５の細胞をマウス抗ヒトＣＤ５４−ＦＩＴＣおよびマウス抗ヒトＣＤ４−ＰＥ抗体を用いて標識し、続いて項目１．３．３．１（ＣＤ５４＋Ｔ細胞の単離）における記載と同様の手順を行った。ＰｒｏＣＤ５４細胞の表面上におけるＣＤ４およびＣＤ５４の発現の典型的なプロファイルを図３４ａに示す。元のＰｒｏＣＤ５４細胞の約７２％が、ＣＤ５４について陽性であった。一方、ＣＤ４の発現のレベルはＫＷＴ系統交雑のトリハイブリッド細胞のものよりもやや低いようであったが、１００％の細胞がそのＣＤ４の発現を維持していた。適切なゲートを設定した後、中間から高いレベルのＣＤ５４の発現を有しているＣＤ４＋ＣＤ５４＋細胞集団（全細胞集団の約４２％）を絞り込み、分取した（図３４ａ）。分取した細胞を標準培養培地に再懸濁し、数ヶ月間にわたって培養において維持した。得られた亜系統をＰｒｏＣＤ５４ＥＸと名付けた。次いで、本項目において上述した同様の手順を用いて、この亜系統をそのＣＤ４およびＣＤ５４の発現について分析した。ＰｒｏＣＤ５４ＥＸの表面上におけるＣＤ４およびＣＤ５４の発現の典型的なプロファイルを図３４ｂに示す。図からわかるように、標準的な条件下における６ヶ月間の培養後、細胞の少なくとも９８％がＣＤ４およびＣＤ５４の両方の発現を維持していた。さらに、ＣＤ５４の発現は中間のレベルにおいて均質になった。
製造者の手順にしたがってヒトＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）ＥＬＩＳＡ（R&D systems）を用いることによって、ＰｒｏＣＤ５４およびＰｒｏＣＤ５４ＥＸを同様に、組織培養上清における可溶性のＣＤ５４の存在について分析した。培養７日目において少なくとも３回、上清を回収した。ＫＷＴ系統交雑のトリハイブリッドのパートナー細胞株の上清を陰性対照として用いた。すべての測定を同じサンプルを用いて２回にわたって行った。要約すると、ヒト可溶性ＩＣＡＭ−１に直接的に対するマウスモノクローナル抗体によってマイクロタイタープレートを被覆した。対照、サンプルまたは適切に希釈した基準と共にインキュベートした後、ヒト可溶性ＩＣＡＭ−１に対するセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を結合させたポリクローナル抗体を加えた。基質および反応停止溶液の添加後、４５０ｎｍに設定したマイクロプレートリーダーを用いて、各ウェルの吸光度を３０分以内に決定した。その結果を表７に要約する。
Figure 2012529270
ＰｒｏＣＤ５４およびＰｒｏＣＤ５４ＥＸから放出された可溶性ＣＤ５４の分子量をゲル電気泳動およびウェスタンブロット分析によって決定した。要約すると、上清におけるタンパク質の濃度をタンパク質分析（R&D systems）によって決定し、１．８ｍｇ／ｍｌに合わせた。電気泳動をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって行った。合計３０ｍｌのサンプルを、非還元サンプル緩衝液としてゲルにロードした。電気泳動後、タンパク質をフッ化ポリビニリデン膜（Bio-Rad）に転写した。ブロットした膜をＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ緩衝液（ＴＢＳＴ）中の脱脂粉乳（５％）によってブロックし、マウス抗ヒトＩＣＡＭ−１抗体（ＴＢＳＴにおいて１：１００希釈）と共に２時間にわたって振とうした。サンプルをＴＢＳＴによって洗浄した後、二次試薬であるＨＲＰを結合させたヤギ抗マウスＩｇＧ（１：１００００希釈）を加えた。ＴＢＳＴによる洗浄を繰り返した後、膜を水を用いてリンスした。すべてのインキュベーションを室温において行った。図３５は、ＣＤ５４がＰｒｏＣＤ５４およびＰｒｏＣＤ５４ＥＸの両方の上清において約８２ｋＤａ（ヒト血清において検出された可溶性のＣＤ５４のものと一致する）の単一分子種として存在していることを示す。
ＰｒｏＣＤ５４およびＰｒｏＣＤ５４ＥＸ細胞の両方におけるヒトＣＤ５４のｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲによって確認した。項目５に上述したように、市販のキットを用いて総ＲＮＡを抽出し、遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ検出を行った。ヒトＩＣＡＭ−１プライマー対［センス鎖、5’-CCGGAAGGTGTATGAACTG-3’；（配列番号５） アンチセンス鎖、5’-TCCATGGTGATCTCTCCTC-3’（配列番号６）］を、実験用および対照のＲＮＡサンプルから逆転写されたｃＤＮＡを探すために用いた。シクロフィリンについてのプライマー対を内部対照として各アッセイに含めた［センス鎖、5’- TGTTCTTCGACATTGCCGTCGAC-3’；（配列番号７） アンチセンス鎖、5’- GCATTTGCCATGGACAAGATGCCAGGA-3’（配列番号８）］。ＰＣＲ反応産物を３％アガロースゲルにおいてエチジウムブロマイドを含んでいるＴｒｉｓ−酢酸緩衝液において電気泳動して、ＵＶに誘導された蛍光バンドを撮影し、デジタル化した。図３６は、ＰｒｏＣＤ５４およびＰｒｏＣＤ５４ＥＸにおけるヒトＩＣＡＭ−１のｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。ＫＷＴ系統交雑のトリハイブリッド細胞は細胞表面上にＣＤ５４を発現していないが、ＩＣＡＭ−１遺伝子の非常に低量の転写を示す。
９．２．所望のタンパク質をコードしている遺伝子によるトリハイブリッドの系統交雑の細胞株のトランスフェクション
多数の従来技術（ベクターを介した遺伝子移入が挙げられる）によって、特定の遺伝子を培養した細胞へ導入し得る。本発明の一実施形態において、トリハイブリッドの系統交雑の細胞に、所望のタンパク質をコードしている遺伝子を一過性にトランスフェクトした。これにより、ＤＮＡの取込みから数時間以内に、遺伝子産物（ＲＮＡまたはタンパク質のいずれか一方）が得られる。本発明の代替の実施形態において、トリハイブリッドの系統交雑の細胞に、所望のタンパク質をコードしている遺伝子を安定にトランスフェクトした。これは宿主細胞のクロマチンに融合されているプラスミドベクターＤＮＡを含んでいる。
９．２．１．一過性トランスフェクション
成熟Ｂ細胞（ＣＤ１９＋）および成熟Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４＋）に由来するＫＢＴ系統交雑のトリハイブリッド（系統交雑のトリハイブリッド細胞の１００％が、ＦＡＣＳ（項目４．２．３参照）によって決定されたようにＢおよびＴ細胞の表現型マーカーの両方を共有しており、項目６．２．１に記載のように核型分類された）を、遺伝子トランスフェクション実験のために用いた。系統交雑のトリハイブリッド株の細胞における、所望のタンパク質の一過性トランスフェクションの一実施例として、ＫＢＴ系統交雑のトリハイブリッドの細胞にヒトＩＬ−４受容体α鎖（ｈＩＬ４−Ｒα）をトランスフェクトした。
方法
骨髄サンプルからのＰＢＭＬ細胞の調製については、項目１．３．１に記載されている。１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−４（R&D systems）と共に標準的な培養条件下において２４時間にわたってインキュベートした合計１×１０６のＰＢＭＬ細胞からｈＩＬ４−ＲαのｃＤＮＡをクローンとして増幅させた。総ＲＮＡを抽出し（RNeasy Mini Kit，Qiagen）、First Strand cDNA精製キット（Amersham Pharmacia）を用いてｃＤＮＡを合成した。ｈＩＬ４−ＲαのｃＤＮＡを増幅するためにＰＣＲを用いた。センス鎖のプライマー5’-AGGGGCGCGCAGATAATTAAA-3’（配列番号９）
およびアンチセンス鎖のプライマー5’-AGTGGGGCCAATCACCTTCATA-3’（配列番号１０）を用いて増幅を行った。２つのＢａｍＨＩ制限部位をｈＩＬ４−Ｒαフラグメントに付加するためにネステッドＰＣＲを用いた［センス鎖のプライマー 5’-GGATCCGCGCAGATAATTAAAGA-3’、（配列番号１１） アンチセンス鎖のプライマー 5’-GGATCCAAATCACCTTCATACCAT-3’（配列番号１２］。増幅されたｃＤＮＡを希釈し、９４℃において１分間の最初の変性を行い、続いて９４℃において２０秒、５９℃において４５秒、７２℃において３分を３１サイクル行った。ＩＬ４ＲのｃＤＮＡフラグメントをクローニングベクターｐＧＥＭ−Ｔ（Promega）にライゲーションし、ＪＭ１０９コンピテント細胞（Promega）にトランスフェクトした。Plasmid Mini Kit（Qiagen）を用いることによって、プラスミドＤＮＡを調製した。
エレクトロポレーションのために、３５０μｌの完全ＴＣ培地（項目１．１参照）に懸濁した７×１０６のＫＢＴ細胞を、３０μｇのｃＤＮＡプラスミドと混合した。Eurogentec Easyject Pulserからの単パルス（２５ｋＶ／ｍ、１０５０μＦ、３４〜３７ｍ秒のパルス幅）によって、トランスフェクションを行った。その後、６ウェル組織培養プレートにおいて、１００ｎｇ／ｍｌの組換えｈＩＬ４を補った完全ＴＣ培地において細胞をインキュベートした。
トランスフェクション後２４、４８および７２時間後に、凍結融解の処理によって細胞抽出物を調製した。トランスフェクトしていないＫＢＴおよびＰＢＭＬ細胞を、それぞれ陰性対照および陽性対照として用いた。細胞抽出物の総タンパク質量をBio-Radタンパク質アッセイ（Bio-Rad Laboratories）を用いて決定した。等しい量の細胞抽出物（約２ｍｇ）を、Sapharose 4B fast flow（Sigma）において不溶化された２０ｍｇのタンパク質Ａを用いて、３μｇの抗ｈＩＬ４−Ｒα鎖（BD Pharmingen 551894）と共に免疫沈降させた。免疫沈降物を希釈緩衝液において２回にわたって洗浄した（ＴＳＡ溶液中の０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００およびウシヘモグロビン、ＴＳＡ溶液において１回、およびＬａｅｍｍｌｉ緩衝液によって可溶化させた０．０５ＭのＴＲＩＳ−Ｃｌ（ｐＨ６．８）溶液において１回、沸騰させ、ＴＲＩＳ−グリシン４％〜１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離させた。ＴＳＡ溶液は０．０１ＭのＴＲＩＳ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、０．１４ＭのＮａＣｌおよび０．０２５％のアジ化ナトリウムを含んでいた）。いくつかの実験において、細胞抽出物のタンパク質含有物の７５μｇを、あらかじめの免疫沈降をせずにＳＤＳ−ＰＡＧＥによって直接分離した。
２５ｍＭのＴＲＩＳ、１９２ｍＭのグリシン、０．１％のＳＤＳ、１００μＭのバナジン酸ナトリウムおよび２０％のメタノールを含んでいるＴＲＩＳ−グリシン緩衝液において、２５Ｖにおいて２時間にわたって、タンパク質をポリアクリルアミドゲルからHybond-ECLニトロセルロース膜（Amersham）上に転写することによって、ウェスタンブロット分析を行った。ブロッキング緩衝液（２．５％の脱脂粉乳、１０ｍＭのＴＲＩＳ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌおよび０．１％のＴｗｅｅｎ２０）を用いてブロットを１時間にわたって処理し、次いで、ブロッキング緩衝液において２μｇ／ｍｌのマウス抗ｈＩＬ４−Ｒα抗体と共に１時間にわたってインキュベートした。セイヨウワサビペルオキシダーゼを結合させたヒツジ抗マウス免疫グロブリンと共にブロットを１時間にわたってインキュベートし、続いてヨウ素化された基質と共に１分間にわたってインキュベートし、次いで促進された化学発光を検出することによって、結合している抗体を検出した。
結果
図３７は、ｈＩＬ４−Ｒα鎖を一過性にトランスフェクトしたＫＢＴ系統交雑のトリハイブリッド細胞株（トランスフェクション後２４、４８および７２時間）からの細胞抽出物のウェスタンブロット分析を示す。トランスフェクションから２４時間後の、ｈＩＬ４−Ｒα鎖をトランスフェクトしたＫＢＴ細胞においてｈＩＬ４−Ｒα鎖を検出し、ｈＩＬ４−Ｒα鎖の発現レベルはトランスフェクションから４８および７２時間後において次第に増加していた。トランスフェクトしていないＫＢＴ細胞をｈＩＬ４−Ｒα鎖に対する陰性対照として用いた。ｈＩＬ４−ＲαのｃＤＮＡの調整のため用いたヒトＰＢＭＬ細胞からの細胞抽出物を、ｈＩＬ４−Ｒα鎖に対する陽性対照として用いた。
９．２．２．安定的トランスフェクション
系統交雑のトリハイブリッド株の細胞における、所望のタンパク質の安定なトランスフェクションの一として、ＫＢＴ細胞株の細胞にヒトインターロイキン２（ｈＩＬ−２）遺伝子をトランスフェクトした。
方法
ＲＳＶの長い末端繰り返し配列の制御下にラットプレプロインスリンＩＩ遺伝子を含んでいるｈＩＬ−２発現ベクターｐＢＣ１２／ＲＳＶ／ＩＬ２（ＩＳ）を、トランスフェクションのために用いた。全長のインスリンのリーダー領域および翻訳開始コドンをコードしているインスリン配列が組み込まれている。このキメラのｈＩＬ−２のｍＲＮＡは、天然型のｈＩＬ−２のリーダーおよび開始コドンを含んでいるｈＩＬ−２のｍＲＮＡよりも、非常に大量のｈＩＬ２タンパク質を産生する（Cullen, 1988）。
ジヒドロ葉酸還元酵素の遺伝子配列（ｄｈＦｒ）を、ＳＶ４０／ｄｈＦｒ遺伝子フラグメントとのライゲーションによって、ｐＢＣ１２／ＲＳＶ／ＩＬ２ベクターに挿入して（Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1:854, 1981）、ＳＶ４０ウイルス初期領域プロモータの制御下に全長のマウスｄｈＦｒ遺伝子を含んでいるｐＢＣ１２／ＲＳＶ／ＩＬ２／ｄｈＦｒプラスミドを得た。このプラスミドにおいて、ｈＩＬ−２およびｄｈＦｒ遺伝子は同じ向きに配置されている。
トランスフェクションの前に、０．１ｍＭのポリサイクリック芳香族炭化水素ラセミ体３ａ，４ｂ−ジヒドロキシ−１ａ，２ａ−エポキシ−１，２，３，４−テトラヒドロベンゼゾ［ｃ］フェナントレン（Ｂ［ｃ］ＰＨＤＥ）を用いた９０分間にわたる突然変異生成に、培養したＫＢＴ細胞を供した（Carothers et al., Proc. Natl. Acad. Sci 87:5464-68, 1990）。ｄｈＦｒ−クローンの選択は、ヒポキサンチンおよびチミジンに対する依存性に基づいており、６日間にわたる発現期間をおいた（Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 77(7): 4216-20, 1980）。得られたｄｈＦｒ欠損ＫＴＢ細胞（ＫＢＴｄｈＦｒ−）を、１０−４Ｍのヘポキサンチンおよび１０−５Ｍのチミジンを補った標準培地に維持した。
トランスフェクションにおいて、培養したＫＢＴｄｈＦｒ−細胞を、ＰＢＳを用いて３回にわたって洗浄し、０．８ｍｌのＰＢＳに再懸濁させた。６０μｇのｐＢＣ１２／ＲＳＶ／ＩＬ２／ｄｈＦｒベクターを細胞上清に加え、この上清をプラスチック製のエレクトロポレーションキュベットに移し、氷上において１０分間にわたってインキュベートした。Gene-pulserエレクトロポレーション装置（Bio-Rad）による標準的なエレクトロポレーションの手順を用いて７５ｋＶ／ｍ、２５μＦにおいて、エレクトロポレーションを行った。パルスを与えた後、キュベットを氷上において１０分間にわたってインキュベートした。次いで、細胞をフラスコの中へ移し、ヘポキサンチンおよびチミジンを含んでいない標準培地において培養した。生き残った細胞を単一細胞クローニング技術（項目１．１．２参照）を用いてクローン化させ、樹立した株をｈＩＬ−２に分泌について評価した。
結果
トランスフェクトしたＫＢＴ（ＫＢＴ ＴＲ−ＩＬ２）細胞におけるｈＩＬ−２のｍＲＮＡの発現を、ｈＩＬ−２に特異的なプライマーを用いたＰＣＲによって確認した。磁気ビーズ分取によってＰＢＭＬから得たヒトＣＤ８＋Ｔ細胞（項目１．３．３．５に記載されている）、およびジャーカット細胞株、クローンＥ６−１を、陽性対照として用いた。Ｋ５６２細胞、およびトランスフェクトしていないＫＢＴハイブリッド細胞を、陰性対照として用いた。製造者の手順にしたがってRNeasy Miniキット（Qiagen）における種々の処理をした後、トランスフェクトしたＫＢＴ細胞から総ＲＮＡを抽出した。次のプライマーは、公知の配列に基づいて用いたｈＩＬ−２プライマーである（Wang et al, 1989）：
5’プライマー＝ 5’-GAATGGAATTAATAATTACAAGAATCCC-3’（配列番号１３）
3’プライマー＝ 5’-TGTTTCAGATCCCTTTAGTTCCAG-3’（配列番号１４）
増幅を３５サイクルにわたって行った。ＰＣＲサイクルは、９４℃において４０秒、ｈＩＬ２に対する５５℃のアニーリング温度、続く７２℃における４０秒間の伸長からなっていた。ＰＣＲ産物を２％のアガロースゲルにおいてエチジウムブロマイドによって可視化した。その結果を図３８に示す。発現のレベルは、ＣＤ８＋ヒトＴリンパ球およびジャーカット細胞から得られたものと類似している。トランスフェクトしていないＫＢＴ細胞およびＫ５６２細胞を陰性対照として用いた。
BD FastImmune（登録商標） CD4 intracellular IL-2 Detection Kit（BD Pharmingen）を製造者の手順にしたがって用いて、細胞内ＩＬ−２を検出した。BD FACSCaliburを用いて、ＦＡＣＳ分析を行った。まず、前方散乱および側方散乱だけでなく前方散乱および蛍光閾値に基づいて、ＣＤ４＋細胞を絞り込んだ。続いて、ＣＤ６９（活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞）および細胞内ＩＬ−２の発現に基づいて絞り込んだ集団を分析した。ＫＢＴ ＴＲ−ＩＬ２細胞におけるＩＬ−２発現のＦＡＣＳプロファイルを図３９に示す。トランスフェクトしていないＫＢＴ細胞を対照として用いた。ＫＢＴ細胞の約４１％がＣＤ６９活性化分子について陽性であった。ＫＢＴ ＴＲ−ＩＬ２細胞の９２％が、細胞内ｈＩＬ−２について陽性に染色されていた（Ｒ１＋Ｒ２）。ｈＩＬ−２陰性細胞はＣＤ６９陽性集団の一部であったが、ＣＤ６９陰性細胞は細胞内ｈＩＬ２に対して全て陽性であった。
トランスフェクションから３０日後および９０日後におけるｈＩＬ−２の分泌をＥＬＩＳＡによって確認した。要約すると、ｈＩＬ−２をトランスフェクトした１×１０６のＫＢＴ細胞を、２４ウェル組織培養プレートにおいて、３７℃において２４時間にわたってインキュベートした。上清を回収し、ｈＩＬ−２の活性をｈＩＬ−２ ＥＬＩＳＡキット（R&D systems）によって測定した。上清を希釈して、ｈＩＬ−２ ＥＬＩＳＡキットの検出範囲に合わせた。組換えｈＩＬ−２（R&D systems）を陽性対照として用いた。ＥＬＩＳＡ分析は、ｈＩＬ−２の分泌速度が６６０ｎｇ／１０６／２４時間から３３００ｎｇ／１０６／２４時間に分布していることを示した。
ｈＩＬ２を安定的にトランスフェクトされｈＩＬ２を分泌している得られたＫＢＴ細胞株をＰｒｏＬ２と名付けた。
９．３．ハイブリダイゼーションおよびトランスフェクションを組み合わせた標的タンパク質の同時発現
トリハイブリッド系を用いる同時のタンパク質発現の一例として、ｈＩｇＭを発現させるためにトリハイブリッド細胞をヒトｓＩｇＭ＋ＣＤ２５＋Ｂリンパ球とハイブリダイズし、続いてｈＩＬ−２を用いて安定にトランスフェクトした。ｈＩｇＭおよびｈＩＬ−２の両方を安定に発現しているハイブリッド細胞系に、さらにｈＩＬ−４Ｒαを一過性にトランスフェクトした。この実施例において、ｈＩｇＭは第１のタンパク質に相当し、ｈＩＬ−２は同時に発現される第２のタンパク質に相当し、ｈＩＬ−４Ｒαは同時に発現される第３のタンパク質に相当した。代替的に、トリハイブリッド細胞に対してｈＩＬ−２を安定にトランスフェクトし、続いてヒトｓｈＩｇＭ＋ＣＤ２５＋Ｂ細胞との体細胞ハイブリダイゼーションを行った。ｈＩＬ−２およびｈＩｇＭの両方がハイブリッド細胞系から発現されることを確認した後、このハイブリッド細胞系に、さらにｈＩＬ−４Ｒαを一過性にトランスフェクトした。この実施例において、ｈＩＬ−２は第１のタンパク質に相当し、ｈＩｇＭは同時に発現される第２のタンパク質に相当し、ｈＩＬ−４Ｒαは同時に発現される第３のタンパク質に相当した。
９．３．１．細胞の調製
成熟Ｂ細胞（ＣＤ１９＋）および成熟ＴヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋）に由来するＫＢＴ系統交雑のトリハイブリッド（系統交雑のトリハイブリッド細胞の１００％が、ＦＡＣＳによって決定したようにＢ細胞およびＴ細胞の両方の表現型マーカーを共有しており（項目４．２．３参照）、項目６．２．１に記載のように核型分類された）を、これらの実験に用いた。いくつかの実施例において、項目９．２．２に記載されている突然変異生成の工程に由来し、１０−４Ｍのヘポキサンチンおよび１０−５Ｍのチミジンを補った標準培地に維持したｄｈＦｒ欠損ＫＢＴ細胞（ＫＢＴｄｈＦｒ−）を実験に用いた。また、ｈＩＬ−２をトランスフェクトした細胞株ＫＢＴ ＴＲ−ＩＬ２（項目９．２．２参照）もいくつかの例に用いた。
項目１．３．３に記載のようにＰＢＭＣから単離し、項目２．２に記載のようにＣＤ４０の経路によって活性化された、初代培養されたＣＤ４０活性化ｓＩｇＭ陽性Ｂ細胞を、ハイブリダイゼーションのためのヒトｓＩｇＭ Ｂ細胞の起源として用いた。また、これら特定の実験のために、ｓＩｇＭ＋Ｂ細胞の単離は、培養の５日後におけるＣＤ２５（ヒトＩＬ−２受容体）の同時の、ＦＡＣＳを用いた表面発現に基づいていた。項目１．３．３．５に記載のようにMACS CD4 Multisortキットを用いて、ＣＤ８＋Ｔ細胞を胸腺から単離した。
９．３．２．第１のタンパク質の産生または第２のタンパク質の共発現のための体細胞ハイブリダイゼーション
ＫＢＴ細胞またはＫＢＴｄｈＦｒ−細胞もしくは株ＫＢＴ ＴＲ−ＩＬ２細胞とｓｈＩｇＭ＋ＣＤ２５＋Ｂ細胞（記憶Ｂ細胞の一部）との間の電気的な細胞ハイブリダイゼーションの手順は、基本的に、項目４．４．２に記載されているＫＢＴ系統交雑のトリハイブリッド株の生成のために用いたものと同様であった。得られたハイブリッドが安定になった後、それらを項目１．１に記載のように維持した。得られたハイブリッドによるｓｈＩｇＭおよびＣＤ２５の共発現をＦＡＣＳ分析によって確認し（図６２参照）、ｈＩｇＭの産生をＥＬＩＳＡによって分析した。また、ＫＢＴ ＴＲ−ＩＬ２細胞をｓｈＩｇＭ＋ＣＤ２５＋Ｂ細胞とのハイブリダイゼーションに用いた場合において、ｈＩＬ−２の産生をｈＩｇＭと同時に分析した。
９．３．３．第２のタンパク質の安定なトランスフェクション
ｈＩＬ−２を用いた系の安定なトランスフェクションの前に体細胞ハイブリダイゼーションを行うときに、ｈＩｇＭ産生系に、項目９．２．２に記載の方法論を用いてｈＩＬ−２をトランスフェクトした。ｈＩｇＭおよびｈＩＬ−２の両方の同時産生をＥＬＩＳＡによって確認した。
９．３．４．第３のタンパク質の一過性トランスフェクション
ｈＩｇＭおよびｈＩＬ−２の両方を分泌している安定なハイブリッド系をさらに、項目９．２．１の記載と同様の方法を用いて、ｈＩＬ−４Ｒα遺伝子を用いたエレクトロポレーションによって、一過性にトランスフェクトした。ｈＩｇＭ、ｈＩＬ−２およびｈＩＬ−４Ｒαの共発現をＥＬＩＳＡによって確認した。
結果
同じハイブリッド細胞系の細胞によって同時に発現および共発現されている３つのタンパク質の産生レベルを、表７ａおよび表７ｂに要約している。分析のために、細胞を２４ウェルプレートにおいて、１つのタンパク質の発現のために０．５×１０５／ｍｌの密度まで成長させ、２つのタンパク質の発現のために１．２×１０５／ｍｌの密度まで成長させ、３つのタンパク質の発現のために３．２×１０５／ｍｌの密度まで成長させた。この系は３つのタンパク質を同時に産生可能なだけでなく、第１のタンパク質の産生レベルを第２のタンパク質の共発現にしたがって増加させ、第３のタンパク質の発現によってさらに増加させた。同様の方法において、第２のタンパク質の産生は第３のタンパク質の発現によって増加した。
Figure 2012529270
＜実施例１０＞
１０．ＰｒｏＧＭハイブリッドの生成のための無血清培養条件への順応
市販の製品としてのＰｒｏＧＭハイブリッド細胞の頑強性を証明するために、１．２Ｌの使用可能量（working volume）を有しているスピナーフラスコに培養量を拡大し、無血清の環境に培養的に順応させた。
方法論
ＦＣＳ含有量を７．５、５．０、２．５、１．０、０．５および０％まで徐々に減らすことによって、ｈＧＭ−ＣＳＦを最も多く産生しているＰｒｏＧＭハイブリッドのクローンを、無血清の環境において成長するように順応させた。最も頑強な細胞成長および上記ｈＧＭ−ＣＳＦの産生を示している継代培養物のみを、連続して低くなる血清の環境に移した。選択した各継代培養物を、保存用の５％のＤＭＳＯを含んでいる我々の標準培地において冷凍した。２つの無血清培養培地を順応の目的のために用いた。市販の無血清および無タンパク質の限定培地Hybri-Max（Sigma）またはExcel（JHR）をいくつか改変して用いた。細胞の生存率を７日目にトリパンブルー排除によって評価した。ｈＧＭ−ＣＳＦの濃度を同日にＥＬＩＳＡによって決定した。
結果
無血清培養条件への順応の結果を表８に示す。
Figure 2012529270
ＰｒｏＧＭハイブリッドのすべての継代培養物において、ｈＧＭ−ＣＳＦの産生は、血清およびタンパク質含有量の減少と共に増加した。無血清培養における低い細胞密度にもかかわらず、無血清培地中のｈＧＭ−ＣＳＦの量は、標準的な培養条件下において得られたものよりも約４倍多かった。細胞濃度に対して標準化すると、ｈＧＭ−ＣＳＦの産生速度は１５倍まで増加した。
＜実施例１１＞
１１．１．スピナーフラスコにおける産生
方法論
１．２Ｌの使用可能量を有しているスピナーフラスコを、５０ｒｐｍにおいて攪拌した。無血清の環境における成長について順応したＰｒｏＧＭハイブリッド細胞（ＰｒｏＧＭｓｆ）を１×１０５／ｍｌの濃度において播いた。５％のＣＯ２を含んでいる加湿した雰囲気、３７℃において、培養物をインキュベートした。達成した最大の細胞密度は５×１０５／ｍｌであった。トリパンブルー排除法を用いて生細胞を判定した。毎日の培地交換を、９日目まで行った。細胞上清（６００ｍｌ）を１０００ｒｐｍにおいて１０分間にわたって遠心分離し、培地を除去して新鮮な培地と交換し、細胞をスピナーフラスコに戻した。分泌されたｈＧＭ−ＣＳＦの濃度をＥＬＩＳＡによって決定した。１：５００に希釈した１００μｌのラット抗ヒトＧＭ−ＣＳＦ（R&D）を用いて、各ウェルを被覆した。０．０５％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ２０を含んでいるＰＢＴ（ＰＢＳ−Ｔ）を用いて洗浄した後、１００μｌのＰＢＳ−５％ｖ／ｖのＢＳＡにおける標準のｒｈＧＭ−ＣＳＦ（Invitrogen）（０．１９５〜２００ｎｇ／ｍｌの範囲に及ぶ）またはそれぞれ１００倍希釈した１００μｌのサンプルを、ウェルに加えた（２回分ずつ）。すべてのインキュベーションを３７℃において１時間行った。その後、ＰＢＳ−Ｔを用いてプレートを洗浄し、ＰＢＳ−ＢＳＡ−Ｔにおいて１：１０００に希釈した１００μｌのウサギ抗ヒトＧＭ−ＣＳＦ（R&D）抗体を加え、インキュベーションおよび洗浄をした後、同じ緩衝液において１：１０００に希釈した１００μｌのヤギ抗ウサギ免疫グロブリン−ＨＲＰ結合体を加えた。もう一度、プレートをインキュベートおよび洗浄し、１００μｌの基質を加えた。４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
結果
１ｍｌあたり５×１０５という比較的に低い細胞密度は、ＰｒｏＧＭｓｆの細胞成長に対する最適下限の培養条件を示している。より高い密度（１０６細胞／ｍｌの次数の）を得るためには、グルコース含有量および他の補完物を含んでいる培養条件のさらなる最適化を必要とし得る。また、乳酸塩およびアンモニウムの含有量の綿密なモニタリング（close monitoring）が妥当とされている。最適下限の成長にもかかわらず、培養上清中のｈＧＭ−ＣＳＦの濃度は、１ｍｌあたり２．８から４．２μｇの間に分布した。細胞密度および時間について標準化した場合、ＰｒｏＧＭｓｆは、０．６から０．９μｇのｈＧＭ−ＣＳＦ／ｍｌ／１０６／２４時間の産生速度を示した。比較として、ＣＨＯ細胞における０．３μｇのタンパク質／ｍｌ／１０６／２４時間の産生は高いとみなされている。
１１．２．ＰｒｏＧＭハイブリッド細胞株によって産生されたヒトＧＭ−ＣＳＦの精製
方法論
ＰｒｏＧＭｓｆ培養物由来の上清を４０℃においてＰＭ−１０膜（Amicon）を用いて約１０倍に濃縮した。大腸菌由来のヒトＧＭ−ＣＳＦに対するラット抗ヒトＧＭ−ＣＳＦをＡｆｆｉ−Ｇｅｌ １０（Bio-Rad）に対して製造者の手順にしたがって結合させ、ＰＢＳ（１３７ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、８ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１．５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４）を用いて平衡化させることによって調製した免疫アフィニティーカラムに、サンプル濃縮物をロードした。０．１ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ２．８を用いて、結合させタンパク質を溶出させた。次いで、アフィニティーカラムから溶出したタンパク質を、ＲＰ ３００ ＨＰＬＣカラムにロードし、０．１ｍｌ／分の流速において、６０分間にわたって、０〜６０％のアセト硝酸塩勾配を用いて溶出させた。得られた溶出プロファイルを図４０に示す。ＲＰ−ＨＰＬＣから回収された部分をＥＬＩＳＡ、銀染色およびウェスタンブロット分析のために集めた。
結果
表９は、典型的な二段階精製からのｈＧＭ−ＣＳＦの回収を示す。アフィニティーカラムからの最初の回収率はわずか５９％であり、わずか２％のｈＧＭ−ＣＳＦがＲＰＨＰＬＣ後に失われた。アフィニティー精製後の低い回収率の原因となっている複数の可能性が存在する。ｈＧＭ−ＣＳＦの１３％が貫流および洗浄の段階において失われたため、アフィニティーカラムの結合容量がＰｒｏＧＭｓｆの上清中のｈＧＭ−ＣＳＦの量より小さくなり得る。低い回収率は、ＰｒｏＧＭｓｆハイブリッドによって産生されたｈＧＭ−ＣＳＦのグリコシル化型と比較して、大腸菌由来のｈＧＭ−ＣＳＦに対するラット抗体の親和性が低いことにも起因し得る。最終的な収率についての考え得る他の改良は、より最適化された溶出条件の開発であり得る。図４１において（項目１２参照）、ＲＰ−ＨＰＬＣ後に回収した画分のウェスタンブロットは、ｈＧＭ−ＣＳｆが画分２４〜３６（２４〜３６分において溶出している）において溶出したことを明らかにした。高い分子量型（２８〜３２ｋＤａ）は画分２４から２７において溶出し、一方で、より低い分子量の分子（１８〜２２ｋＤａ）は画分３４から３６において溶出した。これらのクロマトグラフィーの条件は、ｈＧＭ−ＣＳＦの異なる分子量型を（特に高い分子量および中間の分子量の画分において）完全には分離しなかった。
銀染色によって得られたプロファイルおよびウェスタンブロットプロファイルは基本的に同一であり、ｈＧＭ−ＣＳＦ関連タンパク質のみがアフィニティーカラムに結合することを示唆していた。天然のｈＧＭ−ＣＳＦにおいて様々な分子量の分子種がみられた。
Figure 2012529270
＜実施例１２＞
１２．グリコシダーゼによる消化
方法論
ＰｒｏＧＭｓｆハイブリッドに由来する精製したヒトＧＭ−ＣＳＦを、１％のＳＤＳ、１ＭのＰ−メルカプトエタノール、１００ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０において、１００℃において３分間にわたって熱変性させ、０．８ＵのシークエンスグレードのＰＮＧアーゼＦ（Sigma）を加え、３７℃においてさらなる長時間にわたってインキュベートした。
結果
図４３にみられるように、Ｎ−消化後、ＰｒｏＧＭｓｆハイブリッドに由来するｈＧＭ−ＣＳＦ型は時間に依存して、大腸菌に由来するｈＧＭ−ＣＳＦに近い位置に移動した。しかし、消化後の何れのバンドも大腸菌によって産生された非グリコシル化型と一致しなかった。これらの結果は、ＰｒｏＧＭｓｆハイブリッドに由来するｈＧＭ−ＣＳＦがＮ−グリコシル化部位およびＯ−グリコシル化部位の両方においてグリコシル化されること、ならびに分子量の分布が不均質なグリコシル化によって引き起こされることを示唆する。ｈＧＭ−ＣＳＦのすべての分子におけるＯ−グリコシル化のこの発見は、保護されていないＯ−グリコシル化部位の免疫原性の観点から重要である；Ｏ−グリコシル化を欠いている組換えヒトＧＭ−ＣＳＦは、臨床試験において抗体を発達させることが報告されている。
このデータは、ＰｒｏＧＭｓｆハイブリッド細胞がＮ−グリコシル化部位に依存して３つのクラスのｈＧＭ−ＣＳＦを分泌することを示唆する：両方の部位がグリコシル化されている分子（２５〜３５ｋＤａ、２Ｎ型）；一方の部位がグリコシル化されている分子（２０〜２５ｋＤａ、１Ｎ型）；および何れの部位もグリコシル化されていない分子（１８〜２０ｋＤａ、０Ｎ型）。
特定の例を参照して本発明について説明しているが、本明細書に記載の本発明の広範な原理および精神にしたがって、本発明は多くの他の形態として具体化され得ることが、当業者によって適切に理解されるであろう。
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同定および分取−精製したＣＤ７１＋Ｋ５６２細胞を示す図である。 ＣＤ１５およびＣＤ７１陽性Ｋ５６２細胞のＦＡＣＳプロファイルを示す図である。 ＣＤ３４＋ＡＭＬ単核細胞上におけるＣＤ１５の発現を示す図である。 ＣＤ１６のＦＡＣＳプロファイルおよびＣＤ１４磁気ビーズ（ＭＡＣＳ）によって単離したＣＤ１４＋細胞の異なる集団に対する分取ゲートを示す図である。 マウス抗ヒトＣＤ１９およびマウス抗ヒトＣＤ５抗体を用いて染色した臍帯血単核細胞のＦＡＣＳプロファイルを示す図である。 マウス抗ヒトＣＤ３およびマウス抗ヒトＣＤ５抗体を用いて染色した単核の臍帯血細胞のＦＡＣＳプロファイルを示す図である。 マウス抗ヒトＣＤ２０およびマウス抗ヒトＣＤ７２抗体を用いて染色した骨髄単核細胞のＦＡＣＳプロファイルを示す図である。 ＣＤ３およびＣＤ５４に対する扁桃単核細胞の典型的なＦＡＣＳプロファイルを示す図である。 ＩｇＭおよびＩｇＧ陽性な培養したリンパ球の同定を示す図である。 骨髄およびリンパ球起源の発癌遺伝子を有しているＫＭＷトリハイブリッド細胞上におけるＣＤの発現のＦＡＣＳプロファイルを示す図である。 初代培養された混合の脾臓リンパ球、分取したＣＤ４およびＣＤ１９の集団、ならびに得られたＫＢＴトリハイブリッド細胞株上におけるＣＤ４およびＣＤ１９の発現を示す図である。 不死の骨髄細胞、および抗原を経験した、初代培養された２つのリンパ球に由来するＫＢＴトリハイブリッド上におけるＣＤ１９、ＣＤ３およびＣＤ５の発現を示す図である。 骨髄および胸腺に由来する不死の骨髄細胞および初代培養された２つのリンパ球に由来するＫＢＴトリハイブリッド上におけるＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ７２およびＣＤ２０の表面発現を示す図である。 リンパ球供給源の発癌遺伝子ならびに初代培養された細胞由来のＣＤ４およびＣＤ１４を有しているＷＴＭトリハイブリッド株上におけるＣＤの発現のＦＡＣＳプロファイルを示す図である。 リンパ球供給源ＷＩＬ２−ＮＳの発癌遺伝子、抗原を経験したＴ細胞に由来するＣＤ５および初代培養された単球細胞に由来するＣＤ１４を有しているＷＴＭトリハイブリッド細胞上におけるＣＤの発現の典型的なＦＡＣＳプロファイルを示す図である。 リンパ球供給源ＷＩＬ２ＮＳの発癌遺伝子、細胞傷害性Ｔ細胞に由来するＣＤ８および初代培養された単球細胞に由来するＣＤ１４を有しているＷＴＭトリハイブリッド細胞上におけるＣＤの発現のＦＡＣＳプロファイルを示す図である。 ダブルＣＤポジティブなＴ細胞に由来するＷＴＭトリハイブリッド細胞上におけるＣＤ４およびＣＤ８の共発現のＦＡＣＳプロファイルを示す図である。 骨髄単球性の前駆細胞に由来するＷＴＭトリハイブリッド細胞の表面上におけるＣＤの発現を示す図である。 ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞に由来するＫＷＴトリハイブリッド細胞の系統特異的なマーカーの発現 二重陽性ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞に由来するＫＷＴトリハイブリッド細胞の系統特異的なマーカーの発現を示す図である。 ＣＤ５＋の抗原を経験したＴ細胞に由来するＫＷＴトリハイブリッド細胞の系統特異的なマーカーの発現を示す図である。 それぞれリンパ球の発癌遺伝子を含んでいる２つの細胞および初代培養された１つの単球細胞に由来するＷＷＭトリハイブリッド細胞の典型的なＣＤ発現プロファイルを示す図である。 ＷＷＭトリハイブリッド細胞の異なる亜集団から得たＣＤ１４についてのリプレセンティブＲＴ−ＰＣＲ（representative RT-PCR）を示す図である。 Ｋ５６２細胞の単一クローンの核型分類を示す図である。 ＷＩＬ２ＮＳ細胞株の５つのクローンのうちの１つの核型分類を示す図である。 ＫＢＴ−１（ＣＤ１９＋）および（ＣＤ４＋）トリハイブリッド株の核型分類を示す図である。 ＫＢＴ（Ｋ５６２、ＣＤ２０＋ＣＤ７２＋およびＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞）系統交雑のトリハイブリッド（すなわちＫＢＴ−２系統交雑の）のクローン１の核型分類を示す図である。 ＫＢＴ（Ｋ５６２、ＣＤ２０＋ＣＤ７２＋およびＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞）系統交雑のトリハイブリッド（すなわちＫＢＴ−２系統交雑の）のクローン２の核型分類を示す図である。 ＫＢＴ（Ｋ５６２、ＣＤ２０＋ＣＤ７２＋およびＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞）系統交雑のトリハイブリッド（すなわちＫＢＴ−２系統交雑の）のクローン３の核型分類を示す図である。 ＫＢＴ（Ｋ５６２、ＣＤ２０＋ＣＤ７２＋およびＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞）系統交雑のトリハイブリッド（すなわちＫＢＴ−２系統交雑の）のクローン４の核型分類を示す図である。 ＫＷＴ−１トリハイブリッド株（不死の骨髄細胞およびＢリンパ球ならびに初代培養された成熟ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞に由来するＫＷＴトリハイブリッド）の核型分類を示す図である。 ＫＷＴ−２（不死の骨髄細胞およびＢリンパ球ならびに初代培養された記憶ＣＤ３＋ＣＤ５＋Ｔ細胞に由来するＫＷＴトリハイブリッド株）の核型分類を示す図である。 ＫＷＴ−３トリハイブリッド株（不死の骨髄細胞およびＢリンパ球ならびに初代培養された二重陽性ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞に由来するＫＷＴトリハイブリッド）のクローン１の核型分類を示す図である。 ＫＷＴ−３トリハイブリッド株（不死の骨髄細胞およびＢリンパ球ならびに初代培養された二重陽性ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞に由来するＫＷＴトリハイブリッド）のクローン２の核型分類を示す図である。 ＫＷＴ−３トリハイブリッド株（不死の骨髄細胞およびＢリンパ球ならびに初代培養された二重陽性ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞に由来するＫＷＴトリハイブリッド）のクローン３の核型分類を示す図である。 ＷＷＭトリハイブリッドの核型分類を示す図である。 ＷＷＭトリハイブリッドのＣＤ１４に富んでいる亜系統の核型分類を示す図である。 ＰｒｏＧＭ培養物由来の上清のウェスタンブロットを示す図である。 ＰｒｏＧＭハイブリッド株によって産生されたヒトＧＭ−ＣＳＦのゲル電気泳動を示す図である。 ＰｒｏＣＤ５４細胞株およびそのＣＤ５４に富んでいる亜系統であるＰｒｏＣＤ５４ＥＸの表面上におけるＣＤ４およびＣＤ５４の発現を示す図である。 ＰｒｏＣＤ５４およびＰｒｏＣＤ５４ＥＸ細胞によって分泌された可溶性のヒトＣＤ５４のウェスタンブロットを示す図である。 ＰｒｏＣＤ５４およびＰｒｏＣＤ５４ＥＸ細胞におけるＩＣＡＭ−１遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す図である。 ｈＩＬ４−Ｒα鎖を一過性にトランスフェクトしたＫＢＴトリハイブリッド細胞株（トランスフェクションから２４、４８および７２時間後における）由来の細胞抽出物のウェスタンブロット分析を示す図である。 ｈＩＬ−２をトランスフェクトしたＫＢＴトリハイブリッド細胞におけるｈＩＬ−２のｍＲＮＡの検出についてのＰＣＲ量を示す図である。 （ａ）元のＫＢＴトリハイブリッド細胞および（ｂ）ＫＢＴ ＴＲ−ＩＬ２細胞における細胞内ｈＩＬ−２についてのＦＡＣＳ分析を示す図である。 ＲＰ−ＨＰＬＣ続いてｈＧＭ−ＣＳＦに対するアフィニティー吸収の後の得られた溶出プロファイルを示す図である。 ＲＰ−ＨＰＬＣ続いてｈＧＭ−ＣＳＦに対するアフィニティー免疫吸収の後に回収された画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（下図）およびウェスタンブロット（上図）を示す図である。 ＰＨＡ活性化ヒトリンパ球の培養の培養物由来のＣＤ４＋細胞の分離を示す図である。 Ｐｒｏ−ＧＭｓｆに由来する脱グリコシル化ｈＧＭ−ＣＳＦのゲル電気泳動を示す図である。 マウス骨髄腫Ｓｐ２細胞株のＴｆＲ＋細胞の同定および分取を示す図である。 抗マウスＣＤ４およびＣＤ８を用いて染色した（ａ）末梢血および（ｂ）脾臓由来のマウス単核細胞のＦＡＣＳプロファイルを示す図である。 磁気ビーズを用いた負の選択によって末梢血から単離したマウス単球の純度プロファイルを示す図である。 １つのリンパ球の不死の細胞Ｓｐ２、初代培養されたマウスＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ１１ｂ＋単球に由来するＳＴｍＭｍトリハイブリッド上におけるＣＤ１３８、ＣＤ４およびＣＤ１１ｂの発現のＦＡＣＳプロファイルを示す図である。 １つのマウスリンパ球の不死の細胞Ｓｐ２、初代培養されたウス細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞およびマウスＣＤ１１ｂ＋単球に由来するＳＴｍＭｍトリハイブリッド上におけるＣＤ１３８、ＣＤ８およびＣＤ１１ｂの発現の典型的なＦＡＣＳプロファイルを示す図である。 １つのマウスリンパ球の不死の細胞Ｓｐ２、初代培養された１つのマウス二重陽性ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞および初代培養された１つのマウスＣＤ１１ｂ＋単球に由来するＳＴｍＭｍトリハイブリッド上におけるＣＤ１３８、ＣＤ８およびＣＤ１１ｂの発現の典型的なＦＡＣＳプロファイルを示す図である。 １つのマウスリンパ球の不死の細胞Ｓｐ２、初代培養された１つのマウス二重陽性ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞および初代培養された１つの単球に由来するＳＴｍＭｍトリハイブリッドの表面上におけるＣＤ４およびＣＤ８の発現の典型的なプロファイルを示す図である。 ＳＳＭｍトリハイブリッドの表面上におけるＣＤ１３８およびＣＤ１１ｂの発現の典型的なプロファイルを示す図である。 ＳＷＭｍ（ａ）およびＳＷＭｈ（ｂ）トリハイブリッドの表面上のヒトＣＤ７１およびマウスＴｆＲの発現の典型的なプロファイルを示す図である。 ＳＷＭｍ（ａ）およびＳＷＭｈ（ｂ）トリハイブリッド上のマウスＣＤ１３８の発現およびマウスＣＤ１１ｂまたはヒトＣＤ１４の典型的なプロファイルを示す図である。 ＳＷＭｈキメラトリハイブリッドの表面上のヒトＣＤ１９およびヒトＣＤ１４の発現のＦＡＣＳプロファイルを示す図である。 単一細胞の操作／供給系を示す図である。 ガラス製マイクロピペットを示す図である。 微小電極を示す図である。 ２つの平行な微小電極を示す図である。 組織培養プレートのウェルにおける２つの微小電極を示す図である。 ２つの微小電極の中間に３つの細胞を含んでいるウェルの上面図を示す図である。 図６０のウェルの側面図を示す図である。 １つのＫＢＴ細胞および１つのｓｈＩｇＭ＋ＣＤ２５＋Ｂ細胞のハイブリダイゼーションによって生成したハイブリッド細胞の表面上におけるＣＤ２５およびｓＩｇＭの発現（第２のタンパク質ｈＩＬ−２の安定的トランスフェクションの前（Ａ）および後（Ｂ））を示す図である。

Claims (65)

  1. 未拘束の前駆細胞に由来する細胞、または幹細胞であり、骨髄腫細胞ではない第１の細胞；
    リンパ系の共通前駆細胞に由来する第２の細胞；ならびに
    リンパ系の共通前駆細胞に由来する第３の細胞
    のハイブリダイゼーションによって生成された、ハイブリッド細胞。
  2. 上記第２の細胞がＢリンパ球系統に由来する細胞であり、上記第３の細胞がＢリンパ球系統に由来する細胞である、請求項１に記載のハイブリッド細胞。
  3. 上記第２の細胞がＴリンパ球系統に由来する細胞であり、上記第３の細胞がＴリンパ球系統に由来する細胞である、請求項１に記載のハイブリッド細胞。
  4. 上記第２の細胞がＢリンパ球系統に由来する細胞であり、上記第３の細胞がＴリンパ球系統に由来する細胞である、請求項１に記載のハイブリッド細胞。
  5. 上記第１の細胞が骨髄性の共通前駆細胞に由来する細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のハイブリッド細胞。
  6. 骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞が、骨髄単球性の前駆細胞、単球、マクロファージ、好酸球、好中球、樹状細胞または好塩基球である、請求項５に記載のハイブリッド細胞。
  7. 骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞が、以下のＣＤ抗原：ＣＤ１６、ＣＤ１５またはＣＤ１４のうち少なくとも１つを提示している、請求項５に記載のハイブリッド細胞。
  8. 骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞が単球である、請求項５に記載のハイブリッド細胞。
  9. 骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞が初代培養された骨髄単球性の前駆細胞である、請求項５に記載のハイブリッド細胞。
  10. 骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞が不死化された細胞である、請求項５に記載のハイブリッド細胞。
  11. 骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞が、脾臓、末梢血、臍帯血または骨髄に由来するものである、請求項５に記載のハイブリッド細胞。
  12. Ｂリンパ球系統に由来する上記細胞が、プレＢ細胞、未成熟なＢ細胞、ナイーブＢ細胞、活性化Ｂ細胞またはエフェクターＢ細胞である、請求項２または４に記載のハイブリッド細胞。
  13. 上記エフェクターＢ細胞が、抗原を経験したＢ細胞またはプラズマ細胞である、請求項１２に記載のハイブリッド細胞。
  14. Ｂリンパ球系統に由来する上記細胞が、以下のＣＤ抗原：ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ７２またはＣＤ５のうち少なくとも１つを提示している、請求項２または４に記載のハイブリッド細胞。
  15. Ｔリンパ球系統に由来する上記細胞が、前Ｔ細胞、未成熟Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞、活性化Ｔ細胞またはエフェクターＴ細胞である、請求項３または４に記載のハイブリッド細胞。
  16. Ｔリンパ球系統に由来する上記細胞が、以下のＣＤ抗原：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５またはＣＤ８のうち少なくとも１つを提示している、請求項３または４に記載のハイブリッド細胞。
  17. Ｂリンパ球系統に由来する上記細胞が不死化された細胞である、請求項２または４に記載のハイブリッド細胞。
  18. Ｔリンパ球系統に由来する上記細胞が不死化された細胞である、請求項３または４に記載のハイブリッド細胞。
  19. Ｂリンパ球系統に由来する上記細胞がリンパ組織に由来するものである、請求項２または４に記載のハイブリッド細胞。
  20. Ｔリンパ球系統に由来する上記細胞がリンパ組織に由来するものである、請求項３または４に記載のハイブリッド細胞。
  21. 上記リンパ組織が、末梢血、臍帯血、脾臓、骨髄、胸腺、扁桃腺、咽頭扁桃腺および所属リンパ節から選択される、請求項１９または２０に記載のハイブリッド細胞。
  22. 上記細胞の少なくとも１つがヒト細胞である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のハイブリッド細胞。
  23. 上記細胞の少なくとも１つがマウス細胞である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のハイブリッド細胞。
  24. 骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞がＫ５６２細胞である、請求項５に記載のハイブリッド細胞。
  25. 上記第２の細胞または上記第３の細胞が、ＷＩＬ２−ＮＳ細胞またはＭＯＬＴ４細胞である、請求項１に記載のハイブリッド細胞。
  26. Ｂリンパ球系統に由来する上記細胞が、ＷＩＬ２−ＮＳ細胞である、請求項２または４に記載のハイブリッド細胞。
  27. 上記Ｔリンパ球系統に由来する上記細胞が、ＭＯＬＴ４細胞である、請求項３または４に記載のハイブリッド細胞。
  28. 上記第１の細胞がＫ５６２細胞であり、上記第２の細胞がＷＩＬ２−ＮＳ細胞であり、上記第３の細胞がＭＯＬＴ４細胞である、請求項１または４に記載のハイブリッド細胞。
  29. 上記第１の細胞がＫ５６２細胞であり、上記第２の細胞が初代培養されたＢ細胞であり、上記第３の細胞が初代培養されたＴ細胞である、請求項１または４に記載のハイブリッド細胞。
  30. 上記第１の細胞が初代培養されたヒト単球であり、上記第２の細胞がＷＩＬ２−ＮＳ細胞であり、上記第３の細胞が初代培養されたＴ細胞である、請求項１または４に記載のハイブリッド細胞。
  31. 上記第１の細胞が初代培養されたヒト骨髄性の共通前駆細胞であり、上記第２の細胞がＷＩＬ２−ＮＳ細胞であり、上記第３の細胞が初代培養されたヒトＴ細胞である、請求項１または４に記載のハイブリッド細胞。
  32. 上記第１の細胞がＫ５６２細胞であり、上記第２の細胞がＷＩＬ２−ＮＳ細胞であり、上記第３の細胞が初代培養されたＴ細胞である、請求項１または４に記載のハイブリッド細胞。
  33. 上記第１の細胞が初代培養された単球であり、上記第２の細胞がＷＩＬ２−ＮＳ細胞であり、上記第３の細胞がＷＩＬ２−ＮＳ細胞である、請求項１または２に記載のハイブリッド細胞。
  34. 上記第１の細胞が初代培養されたマウス単球であり、上記第２の細胞がＳＰ２細胞であり、上記第３の細胞が初代培養されたマウスＴ細胞である、請求項１または４に記載のハイブリッド細胞。
  35. 上記第１の細胞が初代培養されたマウス単球であり、上記第２の細胞がＳＰ２細胞であり、上記第３の細胞がＳＰ２細胞である、請求項１または２に記載のハイブリッド細胞。
  36. 上記第１の細胞が初代培養されたヒトまたはマウス単球であり、上記第２の細胞がＷＩＬ２−ＮＳ細胞であり、上記第３の細胞がＳＰ２細胞である、請求項１または２に記載のハイブリッド細胞。
  37. 所望のタンパク質の１つを発現している、請求項１〜３６のいずれか１項に記載のハイブリッド細胞。
  38. 所望のタンパク質の２つ以上を発現している、請求項１〜３６のいずれか１項に記載のハイブリッド細胞。
  39. 所望のタンパク質の２つを発現している、請求項３８に記載のハイブリッド細胞。
  40. 所望のタンパク質の３つを発現している、請求項３８に記載のハイブリッド細胞。
  41. 上記タンパク質が内在性タンパク質である、請求項３７に記載のハイブリッド細胞。
  42. 上記タンパク質のうち少なくとも１つが内在性タンパク質である、請求項３８〜４０のいずれか１項に記載のハイブリッド細胞。
  43. 上記タンパク質が組換えタンパク質である、請求項３７に記載のハイブリッド細胞。
  44. 上記タンパク質のうち少なくとも１つが組換えタンパク質である、請求項３８〜４０のいずれか１項に記載のハイブリッド細胞。
  45. 上記タンパク質がサイトカインである、請求項３６〜４４のいずれか１項に記載のハイブリッド細胞。
  46. 上記タンパク質がコロニー刺激因子である、請求項３７〜４４のいずれか１項に記載のハイブリッド細胞。
  47. 上記タンパク質がインターロイキンである、請求項３７〜４４のいずれか１項に記載のハイブリッド細胞。
  48. 上記タンパク質がＧＭ−ＣＳＦである、請求項３７〜４４のいずれか１項または４６に記載のハイブリッド細胞。
  49. 上記タンパク質がインターロイキン２である、請求項３７〜４４のいずれか１項または４７に記載のハイブリッド細胞。
  50. 上記タンパク質が受容体またはそのフラグメントである、請求項３７〜４４のいずれか１項に記載のハイブリッド細胞。
  51. 上記タンパク質が可溶性の受容体である、請求項３７〜４４のいずれか１項または５０に記載のハイブリッド細胞。
  52. 上記タンパク質がヒトＩＬ−４受容体α鎖である、請求項３６〜４４のいずれか１項または５０に記載のハイブリッド細胞。
  53. 上記タンパク質が免疫グロブリンである、請求項３６〜４４のいずれか１項または５０に記載のハイブリッド細胞。
  54. 上記免疫グロブリンがＩｇＭである、請求項５３に記載のハイブリッド細胞。
  55. 上記免疫グロブリンがＩｇＧである、請求項５３に記載のハイブリッド細胞。
  56. 上記タンパク質がＣＤ５４である、請求項３７〜４４のいずれか１項または５１に記載のハイブリッド細胞。
  57. 上記ハイブリダイゼーションが電気的手段によってなされる、請求項１〜５６のいずれか１項に記載のハイブリッド細胞。
  58. 上記ハイブリダイゼーションが化学的手段によってなされる、請求項１〜５６のいずれか１項に記載のハイブリッド細胞。
  59. 所定のタンパク質を発現している細胞とさらにハイブリダイズされた、請求項１〜５８のいずれか１項に記載のハイブリッド細胞。
  60. 上記ハイブリダイゼーションが個々の細胞３つをハイブリダイズすることによって行われる、請求項１〜５８のいずれか１項に記載のハイブリッド細胞。
  61. 上記ハイブリダイゼーションが３つの細胞集団を用いて行われ、当該集団のそれぞれが同一の細胞型を複数含んでいる、請求項１〜５８のいずれか１項に記載のハイブリッド細胞。
  62. 所望の翻訳後修飾または所望の機能性を示すタンパク質の発現を可能にするために、特定の細胞型を特徴付けるマーカーに関して濃縮されている、請求項１〜６１のいずれか１項に記載のハイブリッド細胞。
  63. 請求項１〜６２のいずれか１項に記載のハイブリッド細胞を生成する方法であって、
    未拘束の前駆細胞に由来する細胞または幹細胞であり、骨髄腫細胞ではない第１の細胞；
    リンパ系の共通前駆細胞に由来する第２の細胞；ならびに
    リンパ系の共通前駆細胞に由来する第３の細胞
    をハイブリダイズする工程を包含している、方法。
  64. 請求項１〜６２のいずれか１項に記載のハイブリッド細胞においてタンパク質を発現させる工程を包含している、タンパク質を製造する方法。
  65. 請求項１〜６２のいずれか１項に記載のハイブリッド細胞において生産された、タンパク質。
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