CN107012126A - 制备杂交细胞/嵌合细胞的方法及其应用 - Google Patents

制备杂交细胞/嵌合细胞的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及制备杂交细胞/嵌合细胞的方法及其应用。具体地，本发明涉及从至少3个细胞的杂交产生的杂交细胞，其中至少2个细胞源自不同的谱系。本发明另外涉及杂交细胞用于表达蛋白的应用，所述蛋白可用于多种诊断用途、预防用途、治疗用途和/或研究用途。

Description

制备杂交细胞/嵌合细胞的方法及其应用
本申请为分案申请，原申请的申请日为2010年6月10日，申请号为201080035457.6(PCT/AU2010/000715)，发明名称为“制备杂交细胞/嵌合细胞的方法及其应用”。
技术领域
本发明涉及杂交细胞和用于生产杂交细胞的方法。具体地，本发明涉及从至少3个细胞的杂交产生的杂交细胞，其中至少2个细胞源自不同的谱系。本发明另外涉及杂交细胞用于表达蛋白的应用，所述蛋白可用于多种诊断用途、预防用途、治疗用途和/或研究用途。
背景技术
在本说明书自始至终对现有技术的任何讨论，绝不能视作承认：这样的现有技术是广泛已知的，或形成本领域的普通一般常识的一部分。
多种不同的细胞类型目前被用于表达蛋白，所述蛋白在商业上与多种诊断用途、预防用途、治疗用途和/或研究用途有关。目前，这样的蛋白的生产常规地在细胞中进行，所述细胞例如细菌、酵母、真菌、昆虫和非人哺乳动物细胞。
细胞经常以多种翻译后修饰来修饰蛋白，所述翻译后修饰包括、但不限于：糖基化、酰化、磷酸化、甲基化、硫酸化、异戊二烯化和脂质化(lipidation)。这些修饰是物种特异性的，且因而，目前用于生产商业上有关的蛋白的细胞表现出这样的翻译后修饰：所述修饰不同于在从人细胞表达的蛋白或在人体中天然存在的蛋白上观察到的翻译后修饰。例如，许多用于生产商业上有关的蛋白的非哺乳动物细胞类型要么缺少糖基化蛋白的能力，要么表现出这样的糖基化模式：所述模式不同于在人细胞中表达的蛋白所表现出的糖基化模式。
甚至在非人哺乳动物表达系统诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中，确证了与人细胞相比糖基化模式的显著差异。例如，用于重组蛋白表达的CHO细胞系缺乏功能性的(α2,6)唾液酸转移酶，该酶用于合成在人细胞中存在的(α2,6)-连接的末端唾液酸。此外，在CHO-细胞表达的糖蛋白上存在的唾液酸基序易于被CHO细胞内源性的唾液酸酶降解(Gramer等人Biotechnology 13(7):692-&,1995)。
作为非人表达系统的不同翻译后修饰谱(repertoires)的结果，由它们表达的蛋白可能表现出不同于人细胞-衍生的蛋白的生理化学特征和药理学特征，诸如半衰期、免疫原性、稳定性和功能性的功效。这可以在很大程度上影响这些蛋白的临床效用。
还有日益增多的证据表明，除了它的物种-依赖性的性质以外，在相同的物种内，翻译后修饰也可以是组织特异性的，甚至是细胞类型特异性的。这具体地与表现出终末糖基化的蛋白的组织特异性的表达和细胞类型特异性的表达有关(Feizi Nature 314:53-54,1985；Rademacher等人Annu Rev Biochem 57:785-838,1988)。具体地，已经表明，3种唾液酸转移酶(它们将末端唾液酸附着至糖蛋白糖链上)表现出在大鼠的7种组织中显著不同的表达(Paulson等人J.Biol.Chem.264:10931-10934,1989)。这为相同蛋白的组织特异性的糖基化提供了支持。此外，使用由来自骨髓的小鼠成纤维细胞和小鼠成骨细胞表达的高度磷酸化的糖蛋白(小鼠骨桥蛋白)的两种同工型的研究，表现出它们的磷酸化程度的主要差异，这与生物活性的差异有关。这些结果提示，由不同的细胞类型生产的骨桥蛋白的功能是不同的(Christensen等人J Biol.Chem.282(27):19463-19472)。
适用于生产表现出全人特征的生物制品的有效的细胞系统理想地应当满足许多标准，包括、但不限于：
a)源自人组织；
b)在培养中高密度生长；
c)表现出商业上可行的蛋白得率；
d)允许稳定的外来基因导入；
e)允许基因扩增方法；
f)允许使用亲本细胞进行单克隆抗体生产，如在人-人杂交瘤中；
g)表现出稳定的长期蛋白表达；
h)在无血清的和无谷氨酰胺的培养基中生长的能力；
i)缺乏内肽酶活性，从而减少蛋白降解，
j)不含有致病剂，包括病毒DNA和支原体；
k)生产表现出翻译后修饰的蛋白，所述翻译后修饰在功能上与在天然存在的人蛋白上发生的翻译后修饰类似或相同，优选地是组织和细胞特异性的。这些翻译后修饰可以包括、但不限于：糖蛋白上的碳水化合物部分。
尽管存在许多用于表达人蛋白的人宿主细胞或异源杂交瘤(heterohybridomas)，但它们都没有成功地满足所有上述标准。最值得注意的是，从现有的人细胞表达系统以临床上有用的得率表达和分离蛋白的尝试，已经导致有限的成功。
真核细胞中的蛋白表达在多个阶段受到控制，所述阶段包括：(a)调节因子对染色质中的基因的影响；(b)转录起始的调节；和(c)翻译后修饰。认为这些不同的阶段是发育阶段特异性的和/或组织特异性的。因而，当将编码所需蛋白的外源基因掺入细胞中时，所需蛋白的表达可能小于最佳量。可能产生问题，诸如缺乏稳定的表达(Li等人,Proc NatlAcad Sci USA 95:3650-3654,1998；Miyaji等人,Cytotechnology,3:133-140,1990；Miyaji等人,Cytotechnology 4:173-180,1990；Miyaji等人,Cytotechnology 4:39-43,1990；Satoh等人,Cytotechnology 13:79-88,1993)、低表达得率(Airoldi等人,CancerResearch 61:1285-1290,2001；Hosoi等人Cytotechnology 7:25-32,1991)和非最佳的翻译后修饰(Shinkawa等人,J.Biol.Chem.278:3466-3473,2003)。所有这些因素都可能影响蛋白的潜在商业效用。
作为一个实例，Namalwa细胞(在悬浮培养物中生长并适应没有血清和清蛋白的培养基的人B类淋巴母细胞)的一个亚系Namalwa KJM-1，被用于大规模生产α-干扰素，后者是伯基特氏淋巴瘤细胞的内源蛋白。但是，当将G-CSF蛋白(它对于伯基特氏淋巴瘤细胞而言是外来的，但是对于B细胞而言是内源的(Airoldi等人,Cancer Research 61:1285-1290,2001))用作经由电穿孔的转染的靶向蛋白时，G-CSF表达水平在多个氨甲蝶呤(MTX)抗性的克隆中存在不同，且最高的G-CSF生产克隆具有仅2.4μg/ml/天的比生产率(当适应无血清的条件时)。
此外，当细胞数目超过7x105细胞/ml时，高密度培养抑制比生产率(Hosoi等人Cytotechnology 7:25-32,1991)。即使报道的最大G-CSF浓度显著提高并达到41μg/ml，但为了实现它，需要广泛地并费力地操纵细胞培养条件，其中非常严紧地控制pH。也表明用于最佳生长的培养基不同于用于最佳生产的培养基，因而产生希望的高密度和高生产率之间的明显冲突，并导致工业上不可行的系统。
因为真核生物中的基因表达在多个步骤中受到控制，所述步骤包括：(a)染色质中的基因的调节因子的可用性和可接近性；(b)对特定转录起始速率的可及启动子的调节；和(c)随后在不同的步骤处的转录后事件，组织特异性的和发育特异性的转录因子的存在对基因的表达具有很大影响。此外，特定细胞类型的基因调节需要几种顺式作用的DNA调节序列的协同作用，所述调节序列是将分子信号传递给基因的蛋白的结合位点(Blackwood等人,Science 281:60-63,1998)。这些序列结合调节蛋白，以形成称作增强体(enhanceosome)的复合物(Marika等人,Curr Opin Genet Dev 11(2):205-208,2001)。因而，当导入人谱系特异性的宿主细胞中时被靶向的基因离它的通常细胞环境越远，所需蛋白在高生产水平的稳定表达和生产越低。当用外来蛋白的基因转染Namalwa KJM-1细胞时，所述外来蛋白进一步远离谱系特异性的蛋白(对于类淋巴母细胞系而言)，诸如β干扰素(Miyaji等人,Cytotechnology,3:133-140,1990；Miyaji等人,Cytotechnology 4:173-180,1990)或人淋巴毒素(Miyaji等人,Cytotechnology 4:39-43,1990)或尿激酶原(Satoh等人,Cytotechnology 13:79-88,1993)，发现转染率和细胞生产率甚至更低。
外来基因在人谱系特异性的细胞系中的有效表达也需要小心的、且有时使人厌烦的合适的增强子/启动子选择，所述增强子/启动子将含有人宿主细胞可利用的核因子的结合位点。发现这样的增强子/启动子仍然可能导致这样的启动子的有限的适合性。例如，当研究几种增强子/启动子(诸如猿猴病毒40(SV40)早期基因启动子、人巨细胞病毒(hCMV)主要立即早期基因启动子、莫洛尼鼠白血病病毒(Mo-MuLV)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子和鸡β-肌动蛋白启动子)在Namalwa KJM-1细胞中对外来基因的更有效表达时，发现Mo-MuLV启动子是传统的SV40早期启动子的约10倍强，且高生产克隆达到30-40μg/106细胞/天的生产率(Satoh等人,Cytotechnology 18:162-172,1996)。但是，使用逆转录病毒载体诸如Mo-MuLV的问题是，难以用于具有倒转序列(inverting sequences)(内含子)的基因的转染，这是由于核剪接机制对它们的去除(Li等人,Proc Ntl Acad Sci USA 95:3650-3654,1998)。
在由2个基因编码的蛋白(诸如抗体)的情况下，甚至进一步增加细胞和核环境之间的不匹配。此外，尽管Namalwa KJM-1细胞被用于制备人-人杂交瘤，但抗体得率使得该细胞系不适合工业生产。
作为另一个实例，已经证实人胚肾细胞系293可以被外来来源的基因非常容易地转染，具有高度的稳定性。但是，源自293转染子的蛋白具有有限的用途，且通常仅适用于研究目的，这是因为293细胞包括人腺病毒Ad5DNA(HEK 293细胞)。但是，在商业场合使用293细胞的最大限制是它的贴壁性质。已经进行了许多尝试来使293细胞适合悬浮液中的有效转染，其中使用节省成本的载体诸如聚乙烯亚胺(Durocher等人,Nucleic Acids Res 30(2):e9,2002；Schlaeger等人,Cytotechnology 30:71-83,1999)或磷酸钙(Girard等人,Cytotechnology38:15-21,2002；Jordan等人,Cytotechnology 26:39-47,1998；Meissner等人,Biotechnol Bioeng 75(2):197-203,2001)。但是，这些载体仅导致重组蛋白的瞬时表达，这意味着，对于接种的培养物的每个新批次，必须重复转染。在EBV的oriP存在于载体主链上时，为了实现悬浮生长和更高的蛋白表达，必须遗传地修饰293细胞，以稳定地表达EB病毒EBNA1蛋白(293E)(Durocher等人,Nucleic Acids Res 30(2):e9,2002；Parham等人,Cytotechnology 35:181-187,2001；Schlaeger等人,Cytotechnology 30:71-83,1999)。甚至在用EBNA1转染以后，当在无血清培养基(HEK293EBNA1)中培养(大规模生产的先决条件)时，293E细胞表现出非常差的转染率，这最可能是由于为了防止细胞集合而加入的聚阴离子(肝素,硫酸葡聚糖)的存在。已经尝试如下减轻该问题：给培养基补加蛋白胨，所述蛋白胨从动物来源(诸如肉、明胶和酪蛋白)的酶促水解得到(Pham等人,BiotechnolBioeng 84(3):332-42,2003)。当将HEK293EBNA1细胞系用于生产Tie-2(血管形成素(angiopoietin)生长因子的受体酪氨酸激酶)和神经毡蛋白-1ED(介导神经元细胞导向的受体)时，蛋白表达受到得到的低细胞密度培养物(与在未转染的培养物中得到的那些相比)的限制。同样，得到的蛋白的>95％的纯度仅适用于研究级产物。另外，HEK293EBNA1细胞不适用于生产单克隆抗体(mAb)。
目前的生产治疗用mAb的策略包括：使用哺乳动物细胞系统(即CHO或NS0转染瘤)来重组地生产由下述获得的mAbs：免疫接种携带人Ig基因的转基因小鼠(xenomice)，人源化啮齿类动物mAbs，或通过筛选人mAb文库(van Dijk等人,Curr.Opin.Chem.Biol.5:368-374,2001)。尽管在它们的序列方面，治疗用mAb最近已经发展成嵌合抗体(啮齿类动物可变区和人恒定区)、人源化的抗体(除了啮齿类动物互补决定区以外，都是人序列)和全人抗体(人Ab)以使变应性应答最小化，但治疗用mAb的重要方面是它的引起免疫效应子功能(诸如抗体依赖性细胞毒作用)的能力，如果mAb是由改变它的天然糖基化模式的非人宿主细胞生产的，则该能力受损(Shinkawa等人,J.Biol.Chem.278:3466-3473,2003)。考虑到这些事实，理想的方案是，由人细胞生产治疗用抗体。在该情况下，全人mAb将能够发挥人效应子功能，并因为它们的天然的人结构而具有非常有限的免疫原性。
已经报道了杂交瘤或EB病毒(EBV)-转化的源自人B细胞的类淋巴母细胞系的制备(Kirman等人,Hybrid.Hybridomics 21:405-414,2002；Boerner等人,J.Immunol.147:86-95,1991；Zafiropoulos等人,J.Immunol.Methods 200:181-190,1997)。但是，关于这些mAb和系在它们的长期稳定性和生产过程的适合性(尤其是整批生产过程中的生产水平和Ig分泌的稳定性)方面的表征，存在有限的信息。尽管已经报道了在4天运行期间以1.2g/升的累积效价生产抗人GM-CSF的人mAb的细胞系，但这些细胞系源自原代人B细胞与异源髓淋巴瘤(heteromyelolymphoma)K6H6/B5细胞(即从人B细胞淋巴瘤和小鼠骨髓瘤细胞的杂交得到的小鼠-人细胞系)的体细胞杂交(融合)(Li等人,Proc Natl Acad Sci USA 103(10):3557-3562,2006)。
在EBV-转化的情况下，困难是，确立完全无限增殖化的人B细胞系，同时维持稳定的抗体生产。这是由于无限增殖化的低功效、细胞生长的停滞、和生产IgM的细胞的优势无限增殖化。另外，最近的报道已经表明，大多数EBV-转化的B细胞具有缩短的端粒和有限的寿命，主要是在160群体倍增水平之前(Sugimoto等人,J Virol73:9690-9691,1999；Toda等人,J Chromatogr B Analyt.Technol.Biomed.Life Sci.787:197-206,2003)。为了克服该问题，已经尝试使EBV-转化的B细胞与合适的配偶体细胞系(表达系统)杂交(或融合)，但是实际上，这些配偶体细胞系代表异源杂合体(heterohybrid)的各种组合，诸如源自小鼠-人异源杂交瘤与人B细胞的三源杂交瘤(trioma)(Ainai等人,Hum Antibodies 15:139-154,2006；Kalantarov等人,Hum Antibodies 11:85-96,2002；Karpas等人,Proc Natl AcadSci USA98:1799-1804,2001)。当将这样的三源杂交瘤与生产针对破伤风毒素(TT)的抗体的原代EBV-转化的B细胞融合时，导致产生具有1/4的小鼠组分的四源杂交瘤(tetroma)。尽管在连续克隆四源杂交瘤3次以后仍然可能稳定地生产针对TT的mAb，但这样的重复的细胞克隆步骤是费力的且费时的。另外，尽管由四源杂交瘤生产的mAb的量对于实验目的而言是足够的，但该水平对于作为药物的mAb的大规模生产而言是不足的。仍然有疑问的是，在有多克隆激活剂CpG 2006或者CD19或BCR的共同连接(co-ligation)存在下，无限增殖化是否可能产生完整的系统，用于以适当的体积有效地生产用于治疗用途的特定mAb(Hartman等人,J Immunol 164:944-953,2000；Hur等人,Cell Prolif38:35-45,2005；Traggiai等人,Nat Med 10:871-875,2004)。
已经尝试了许多方法来使用人细胞生产生物学物质，诸如生长因子、抗体和可溶性的蛋白。
本发明的一个目的是，克服或改善现有技术的至少一个缺点，或提供有用的替代方案。
发明内容
普遍认为，多融合细胞是不稳定的，且参与融合的细胞越多，得到的杂交细胞的不稳定性越大。令人惊奇地，在本发明中，由许多细胞(例如3个细胞)的融合产生的杂交细胞表现出功能稳定性。具体地，已经发现，源自不同谱系的细胞可以体细胞地(somatically)融合或杂交，以形成基本上稳定的嵌合细胞/杂交细胞。更具体地，本发明涉及如下制备的跨谱系(cross-lineage)嵌合细胞/杂交细胞：杂交至少3个亲本细胞，产生三杂交体(tri-hybrid)，其中至少2个亲本细胞源自不同的谱系，且其中在杂交中没有包括骨髓瘤细胞。
还已经令人惊讶地发现，本发明的稳定的嵌合细胞/杂交细胞具有多种用途，例如，用于生产表现出希望的翻译后修饰(例如，但不限于，人糖基化模式)的蛋白。
还已经令人惊讶地发现，当从本发明的嵌合细胞/杂交细胞同时地表达第二种所需蛋白时，可以增强来自本发明的稳定的嵌合细胞/杂交细胞的所需蛋白的表达水平。此外，从本发明的嵌合细胞/杂交细胞同时地表达第三种所需蛋白，可以增强2种靶蛋白的表达水平。
因此，本发明提供了在杂交细胞的多方适应性和稳定性方面明显胜过以前已知的系统的优点。在一个实施方案中，通过融合2个相同的细胞或相同谱系的2个细胞以及不同谱系的1个细胞，生产本发明的杂交细胞。这样的杂合体倾向于出现指向在杂交中使用的大多数细胞类型的表型。这些杂交细胞可以特别地用于表达蛋白，其中已知组织-特异性的翻译后修饰对于蛋白功能而言是重要的。例如，从包括至少2个源自B细胞谱系的细胞的杂交细胞，可以更有效地表达已知在从B细胞表达时具有特定功能性的翻译后修饰的细胞因子，从而确保功能性的翻译后修饰。
由于蛋白的翻译后修饰可能是组织特异性的或细胞类型特异性的，所以技术人员显而易见，本发明的杂交细胞也可以富含特定细胞类型或表型(如特定CD标记物的存在所证实的)，以允许表达这样的蛋白：所述蛋白表现出希望的翻译后修饰或与特定细胞类型或表型有关的希望的功能性。
在一个实施方案中，本发明涉及杂交细胞，其包括使用至少一个无限增殖化的细胞。但是，本领域技术人员显而易见，本发明也涉及非无限增殖化的细胞的融合，所述细胞随后可以通过体外转化方法无限增殖化，所述方法例如：导入病毒基因，例如EB病毒(EBV)、猿猴病毒40(SV40)T抗原、腺病毒E1A和E1B和人乳头瘤病毒(HPV)E6和E7。或者，通过表达端粒末端转移酶逆转录酶蛋白(TERT)，可以使非无限增殖化的细胞无限增殖化。无限增殖化的细胞也可以源自其中癌基因表达已经被修饰的细胞。无限增殖化的细胞另外可以源自诱导无限生长的能力的任何动作，包括、但不限于紫外线暴露或自发转化(其中无限增殖的机理不明)。
显而易见，在一个实施方案中，本发明涉及3个个别细胞的融合。在替代实施方案中，本发明涉及3个细胞群体的融合，其中每个群体包括多个相同的细胞类型。本领域技术人员将理解，细胞群体的融合可以在大量细胞培养物中进行。然后可以通过本领域众所周知的方法，例如通过选择性培养基，诸如次黄嘌呤氨基蝶呤胸苷(HAT)培养基，鉴别和分离希望的杂交的细胞。或者，通过鉴别特定的细胞标记物，诸如CD标记物，可以鉴别和分离融合的细胞。
显而易见，通过本领域众所周知的方法，诸如荧光激活细胞分选术(FACS)方法，可以实现基于它们的标记物(诸如CD标记物)的表达以及细胞对特定细胞类型或表型的富集来分离细胞。
还显而易见，可以用编码所需蛋白的DNA稳定地或瞬时地转染本发明的细胞。通过本领域众所周知的方法，诸如通过在用于转染的DNA中包含选择报道基因，可以鉴别出这些稳定地或瞬时地转染的细胞。这样的报道基因可以包括这样的基因：所述基因能够使转染的细胞在化合物-缺陷型培养基中生长，例如二氢叶酸还原酶(dhFr)基因。报道基因还可包括赋予转染的细胞的目视鉴定的基因，例如，萤光素酶基因或绿色荧光蛋白(gfp)基因。或者，报道基因可以赋予对特定化合物(例如G418)的抗性。这样的报道基因是本领域众所周知的。
在一个优选的实施方案中，本发明的杂交细胞可以用于表达单克隆抗体。传统上，已经通过融合骨髓瘤细胞和源自免疫接种的动物(诸如小鼠)的脾的B细胞，进行单克隆抗体生产。但是，骨髓瘤细胞不稳定性且尤其是基因组不稳定性可能导致所需抗体的差强人意的表达。另外，因为动物细胞被用于生产杂交瘤，所以生产的抗体表现出非人翻译后修饰。当将抗体用作人治疗剂时，具有非人翻译后修饰的抗体可能产生显著的问题。这些问题可能包括：抗体的降低的效应子功能以及免疫原性，从而导致令人不满意的体内半衰期和因此导致的降低的体内功效。也有证据提示，在没有骨髓瘤细胞存在下，不能成功地生产杂合体。本发明的杂交细胞令人惊讶地表明，在没有骨髓瘤细胞存在下，可以生产稳定的杂合体。此外，由本发明的杂交细胞表达的抗体解决了与使用由杂交瘤生产的单克隆抗体有关的问题。这些抗体表现出人源化的翻译后修饰，并由表现出功能稳定性的细胞表达。
根据第一个方面，本发明提供了通过杂交下述细胞而制备的杂交细胞：
第一个细胞，其中所述第一个细胞是干细胞或源自未定型的祖细胞的细胞；
源自淋巴共同祖细胞的第二个细胞；和
源自淋巴共同祖细胞的第三个细胞，
且其中所述第一个细胞不是骨髓瘤细胞。
在一个实施方案中，所述第二个细胞是源自B淋巴谱系的细胞，且所述第三个细胞是源自B淋巴谱系的细胞。
在另一个实施方案中，所述第二个细胞是源自T淋巴谱系的细胞，且所述第三个细胞源自T淋巴谱系。
在另一个实施方案中，所述第二个细胞是源自B淋巴谱系的细胞，且所述第三个细胞是源自T淋巴谱系的细胞。
优选地，所述第一个细胞是源自髓共同祖细胞的细胞。这样，显而易见，本发明提供了通过杂交1个髓共同祖细胞或1个干细胞和2个B淋巴样细胞或2个T淋巴样细胞而制备的杂交细胞。本发明也提供了通过杂交1个髓共同祖细胞或1个干细胞、1个B淋巴样细胞和1个T淋巴样细胞而制备的杂交细胞。
优选地，所述源自髓共同祖细胞的细胞是骨髓单核祖细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞或嗜碱性粒细胞。因此，显而易见，本发明提供了通过杂交1个骨髓单核祖细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞或嗜碱性粒细胞和2个B淋巴样细胞或2个T淋巴样细胞而制备的杂交细胞。本发明也提供了通过杂交1个骨髓单核祖细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞或嗜碱性粒细胞、1个B淋巴样细胞和1个T淋巴样细胞而制备的杂交细胞。
优选地，所述源自髓共同祖细胞的细胞显示至少一种下述CD抗原：CD16、CD15或CD14。因此，显而易见，本发明提供了通过杂交1个显示至少一种下述CD抗原的髓共同祖细胞和2个B淋巴样细胞或2个T淋巴样细胞而制备的杂交细胞：CD16、CD15或CD14。本发明也提供了通过杂交1个显示至少一种下述CD抗原的髓共同祖细胞、1个B淋巴样细胞和1个T淋巴样细胞而制备的杂交细胞：CD16、CD15或CD14。
在一个实施方案中，所述源自髓共同祖细胞的细胞是单核细胞。因此，本发明提供了通过杂交1个单核细胞和2个B淋巴样细胞或2个T淋巴样细胞而制备的杂交细胞。本发明也提供了通过杂交1个单核细胞、1个B淋巴样细胞和1个T淋巴样细胞而制备的杂交细胞。
在另一个实施方案中，所述源自髓共同祖细胞的细胞是原代骨髓单核祖细胞。因此，本发明提供了通过杂交1个原代骨髓单核祖细胞和2个B淋巴样细胞或2个T淋巴样细胞而制备的杂交细胞。本发明也提供了通过杂交1个原代骨髓单核祖细胞、1个B淋巴样细胞和1个T淋巴样细胞而制备的杂交细胞。
在一个实施方案中，所述源自髓共同祖细胞的细胞是无限增殖化的细胞。因此，显而易见，本发明提供了通过杂交1个选自下述的无限增殖化的细胞和2个B淋巴样细胞或2个T淋巴样细胞而制备的杂交细胞：骨髓单核祖细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞或嗜碱性粒细胞。本发明也提供了通过杂交1个选自下述的无限增殖化的细胞、1个B淋巴样细胞和1个T淋巴样细胞而制备的杂交细胞：骨髓单核祖细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞或嗜碱性粒细胞。
在另一个实施方案中，所述源自髓共同祖细胞的细胞源自脾、外周血、脐带血或骨髓。因此，显而易见，本发明提供了通过杂交1个源自脾、外周血、脐带血或骨髓的髓共同祖细胞和2个B淋巴样细胞或2个T淋巴样细胞而制备的杂交细胞。本发明也提供了通过杂交1个源自脾、外周血、脐带血或骨髓的髓共同祖细胞、1个B淋巴样细胞和1个T淋巴样细胞而制备的杂交细胞。
在另一个实施方案中，所述源自B淋巴谱系的细胞是前B细胞、幼B细胞、幼稚B细胞、活化的B细胞或效应B细胞。因此，显而易见，本发明提供了通过杂交1个髓共同祖细胞或1个干细胞和2个选自下述的B淋巴样细胞而制备的杂交细胞：前B细胞、幼B细胞、幼稚B细胞、活化的B细胞或效应B细胞。本发明也提供了通过杂交1个髓共同祖细胞或干细胞、1个选自下述的B淋巴样细胞和1个T淋巴样细胞而制备的杂交细胞：前B细胞、幼B细胞、幼稚B细胞、活化的B细胞或效应B细胞。
在一个实施方案中，所述效应B细胞是抗原处理过的(antigen-experienced)B-细胞或浆细胞。因此，本发明提供了通过杂交1个髓共同祖细胞或干细胞和2个选自下述的B淋巴样细胞而制备的杂交细胞：抗原处理过的B-细胞或浆细胞。本发明也提供了通过杂交1个髓共同祖细胞或干细胞、1个抗原处理过的B-细胞或浆细胞和1个T淋巴样细胞而制备的杂交细胞。
在一个实施方案中，所述源自B淋巴谱系的细胞显示至少一种下述CD抗原：CD19、CD20、CD72或CD5。因此，本发明提供了通过杂交1个髓共同祖细胞或干细胞和2个显示至少一种下述CD抗原的B淋巴样细胞而制备的杂交细胞：CD19、CD20、CD72或CD5。本发明也提供了通过杂交1个髓共同祖细胞或干细胞、1个显示至少一种下述CD抗原的B淋巴样细胞和1个T淋巴样细胞而制备的杂交细胞：CD19、CD20、CD72或CD5。
在一个实施方案中，所述源自T淋巴谱系的细胞是前T细胞、幼T细胞、幼稚T细胞、活化的T细胞或效应T细胞。因此，本发明提供了通过杂交1个髓共同祖细胞或干细胞、1个B淋巴样细胞和1个选自下述的T淋巴样细胞而制备的杂交细胞：前T细胞、幼T细胞、幼稚T细胞、活化的T细胞或效应T细胞。本发明也提供了通过杂交1个髓共同祖细胞或干细胞和2个选自下述的T淋巴样细胞而制备的杂交细胞：前T细胞、幼T细胞、幼稚T细胞、活化的T细胞或效应T细胞。
在一个实施方案中，所述源自T淋巴谱系的细胞显示至少一种下述CD抗原：CD3、CD4、CD5或CD8。因此，本发明提供了通过杂交1个髓共同祖细胞或干细胞、1个B淋巴样细胞和1个显示至少一种下述CD抗原的T淋巴样细胞而制备的杂交细胞：CD3、CD4、CD5或CD8。本发明也提供了通过杂交1个髓共同祖细胞或干细胞和2个T淋巴样细胞而制备的杂交细胞，所述T淋巴样细胞选自显示至少一种下述CD抗原的T细胞：CD3、CD4、CD5或CD8。
在一个实施方案中，所述源自B淋巴谱系的细胞是无限增殖化的细胞。因此，本发明提供了通过杂交1个髓共同祖细胞或干细胞和2个B淋巴样细胞而制备的杂交细胞，所述B淋巴样细胞中的至少一个可以是无限增殖的细胞。本发明也提供了通过杂交1个髓共同祖细胞或干细胞、1个无限增殖的B淋巴样细胞和1个T淋巴样细胞而制备的杂交细胞。
在一个实施方案中，所述源自T淋巴谱系的细胞是无限增殖化的细胞。因此，本发明提供了通过杂交1个髓共同祖细胞或干细胞、1个B淋巴样细胞和1个无限增殖的T淋巴样细胞而制备的杂交细胞。
在一个实施方案中，所述源自B淋巴谱系的细胞源自淋巴组织。因此，本发明提供了通过杂交1个髓共同祖细胞或干细胞和2个源自淋巴组织的B淋巴样细胞而制备的杂交细胞。本发明也提供了通过杂交1个髓共同祖细胞或干细胞、1个源自淋巴组织的B淋巴样细胞和1个T淋巴样细胞而制备的杂交细胞。
在一个实施方案中，所述源自T淋巴谱系的细胞源自淋巴组织。因此，本发明提供了通过杂交1个髓共同祖细胞或干细胞、1个B淋巴样细胞组织和1个源自淋巴组织的T淋巴样细胞而制备的杂交细胞。
在本发明的杂交细胞中所包括的B或T淋巴样细胞源自淋巴组织的情况下，所述淋巴组织优选地选自：外周血、脐带血、脾、骨髓、胸腺、扁桃体、腺样体(adenoids)和局部淋巴结。
在一个实施方案中，在本发明的杂交细胞的制备中包含的细胞中的至少一个是人细胞。还显而易见，在一个实施方案中，本发明的杂交细胞可以包含至少一个小鼠细胞。
在一个实施方案中，所述源自髓共同祖细胞的细胞是K562细胞。因此，显而易见，本发明提供了通过杂交1个K562细胞和2个B淋巴样细胞而制备的杂交细胞。本发明也提供了通过杂交1个K562细胞、1个无限增殖的B淋巴样细胞和1个T淋巴样细胞而制备的杂交细胞。
在一个实施方案中，所述第二个细胞或所述第三个细胞是WIL2-NS细胞或MOLT4细胞。因此，显而易见，本发明提供了通过杂交1个髓共同祖细胞或干细胞、1个WIL2-NS细胞和1个T淋巴样细胞而制备的杂交细胞。本发明也提供了通过杂交1个髓共同祖细胞或干细胞、1个B淋巴样细胞和1个MOLT4细胞而制备的杂交细胞。
在一个实施方案中，所述第一个细胞是K562细胞，所述第二个细胞是WIL2-NS细胞，且所述第三个细胞是MOLT4细胞。
在另一个实施方案中，所述第一个细胞是K562细胞，所述第二个细胞是原代B细胞，且所述第三个细胞是原代T细胞。
在另一个实施方案中，所述第一个细胞是原代人单核细胞，所述第二个细胞是WIL2-NS细胞，且所述第三个细胞是原代T细胞。
在另一个实施方案中，所述第一个细胞是原代人骨髓单核祖细胞，所述第二个细胞是WIL2-NS细胞，且所述第三个细胞是原代人T细胞。
在另一个实施方案中，所述第一个细胞是K562细胞，所述第二个细胞是WIL2-NS细胞，且所述第三个细胞是原代T细胞。
在另一个实施方案中，所述第一个细胞是原代单核细胞，所述第二个细胞是WIL2-NS细胞，且所述第三个细胞是WIL2-NS细胞。
在另一个实施方案中，所述第一个细胞是原代小鼠单核细胞，所述第二个细胞是SP2细胞，且所述第三个细胞是原代小鼠T细胞。
在另一个实施方案中，所述第一个细胞是原代小鼠单核细胞，所述第二个细胞是SP2细胞，且所述第三个细胞是SP2细胞。
在另一个实施方案中，所述第一个细胞是原代人或小鼠单核细胞，所述第二个细胞是WIL2-NS细胞，且所述第三个细胞是SP2细胞。
在一个实施方案中，本发明的杂交细胞表达所需蛋白。在另一个实施方案中，本发明的杂交细胞表达超过一种所需蛋白。在某些实施方案中，本发明的杂交细胞表达2种所需蛋白。在其它实施方案中，本发明的杂交细胞表达3种所需蛋白。在一个实施方案中，所述所需蛋白是内源蛋白，且在表达超过一种所需蛋白的情况下，至少一种所需蛋白是内源蛋白。在另一个实施方案中，所述蛋白是重组蛋白，且在表达超过一种所需蛋白的情况下，至少一种所需蛋白是重组蛋白。优选地，所述蛋白是细胞因子，例如集落刺激因子或白介素。在一个实施方案中，所述蛋白是GM-CSF。在另一个实施方案中，所述蛋白是白介素2。在另一个实施方案中，所述蛋白是受体或其片段。在一个实施方案中，所述蛋白是可溶的受体。在另一个实施方案中，所述蛋白是免疫球蛋白。
在一个实施方案中，所述蛋白是人IL-4受体α链。在另一个实施方案中，所述蛋白是IgM。在另一个实施方案中，所述蛋白是IgG。在另一个实施方案中，所述蛋白是CD54。
在一个实施方案中，在本发明的杂交细胞表达超过一种所需蛋白的情况下，优选地所需蛋白选自：细胞因子、集落刺激因子、白介素或受体或其片段。在具体实施方案中，所需蛋白是：免疫球蛋白，诸如IgM、且具体是可溶的人IgM；细胞因子，例如白介素、且具体是白介素-2(IL-2)、且更具体地是人IL-2；和/或受体，具体是白介素受体、且更具体地是人白介素受体、且甚至更具体地是人白介素-4受体α(IL-4Ra)。
技术人员将理解，本发明的杂交细胞不限于表达特定所需蛋白，它们也不限于表达特定数目的蛋白。此外，技术人员显而易见，从本发明的杂交细胞同时表达所需蛋白，可以导致所需蛋白表达水平的增强。
在一个实施方案中，所述用于制备本发明的杂交细胞的杂交是通过电方法来实现的。在另一个实施方案中，所述制备本发明的杂交细胞的杂交是通过化学方法来实现的。
在一个实施方案中，本发明的杂交细胞另外与表达目标蛋白的细胞杂交。
在具体实施方案中，本发明的杂交细胞与显示CD25抗原的B淋巴细胞杂交。
在特别优选的实施方案中，本发明的杂交细胞显示CD25抗原，并表达免疫球蛋白。在另一个实施方案中，本发明的杂交细胞与显示CD25抗原的B淋巴细胞杂交，且得到的细胞表达免疫球蛋白。
在一个实施方案中，通过杂交3个个别细胞，进行所述用于制备本发明的杂交细胞的杂交。
在另一个实施方案中，使用3个细胞群体，进行所述用于制备本发明的杂交细胞的杂交，其中每个所述群体包括多个相同的细胞类型或表型。
在一个实施方案中，本发明的所述杂交细胞富含界定特定细胞类型的标记物，以允许表达表现出希望的翻译后修饰或希望的功能性的蛋白。
在另一个方面，本发明提供了一种生产蛋白的方法，所述方法包括下述步骤：在根据本发明的杂交细胞中表达蛋白。
在另一个方面，本发明提供了在根据本发明的杂交细胞中生产的蛋白。
在另一个方面，本发明提供了一种生产根据本发明的杂交细胞的方法，其中所述方法包括下述步骤：杂交：
第一个细胞，其中所述第一个细胞是干细胞或源自未定型的祖细胞的细胞；
源自淋巴共同祖细胞的第二个细胞；和
源自淋巴共同祖细胞的第三个细胞，
且其中所述第一个细胞不是骨髓瘤细胞。
在本发明的方法的一个实施方案中，所述第二个细胞是源自B淋巴谱系的细胞，且所述第三个细胞是源自B淋巴谱系的细胞。
在本发明的方法的另一个实施方案中，所述第二个细胞是源自T淋巴谱系的细胞，且所述第三个细胞源自T淋巴谱系。
在本发明的方法的另一个实施方案中，所述第二个细胞是源自B淋巴谱系的细胞，且所述第三个细胞是源自T淋巴谱系的细胞。
优选地，所述第一个细胞是源自髓共同祖细胞的细胞。因此，显而易见，本发明提供了通过杂交1个髓共同祖细胞或1个干细胞和2个B淋巴样细胞或2个T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法。本发明也提供了通过杂交1个髓共同祖细胞或1个干细胞、1个B淋巴样细胞和1个T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法。
优选地，所述源自髓共同祖细胞的细胞是骨髓单核祖细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞或嗜碱性粒细胞。因此，显而易见，本发明提供了通过杂交1个骨髓单核祖细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞或嗜碱性粒细胞和2个B淋巴样细胞或2个T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法。本发明也提供了通过杂交1个骨髓单核祖细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞或嗜碱性粒细胞、1个B淋巴样细胞和1个T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法。
优选地，所述源自髓共同祖细胞的细胞显示至少一种下述CD抗原：CD16、CD15或CD14。因此，显而易见，本发明提供了通过杂交1个显示至少一种下述CD抗原的髓共同祖细胞和2个B淋巴样细胞或2个T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法：CD16、CD15或CD14。本发明也提供了通过杂交1个显示至少一种下述CD抗原的髓共同祖细胞、1个B淋巴样细胞和1个T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法：CD16、CD15或CD14。
在一个实施方案中，所述源自髓共同祖细胞的细胞是单核细胞。因此，本发明提供了通过杂交1个单核细胞和2个B淋巴样细胞或2个T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法。本发明也提供了通过杂交1个单核细胞、1个B淋巴样细胞和1个T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法。
在另一个实施方案中，所述源自髓共同祖细胞的细胞是原代骨髓单核祖细胞。因此，本发明提供了通过杂交1个原代骨髓单核祖细胞和2个B淋巴样细胞或2个T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法。本发明也提供了通过杂交1个原代骨髓单核祖细胞、1个B淋巴样细胞和1个T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法。
在一个实施方案中，所述源自髓共同祖细胞的细胞是无限增殖化的细胞。因此，显而易见，本发明提供了通过杂交1个选自下述的无限增殖化的细胞和2个B淋巴样细胞或2个T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法：骨髓单核祖细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞或嗜碱性粒细胞。本发明也提供了通过杂交1个选自下述的无限增殖化的细胞、1个B淋巴样细胞和1个T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法：骨髓单核祖细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞或嗜碱性粒细胞。
在另一个实施方案中，所述源自髓共同祖细胞的细胞源自脾、外周血、脐带血或骨髓。因此，显而易见，本发明提供了通过杂交1个源自脾、外周血、脐带血或骨髓的髓共同祖细胞和2个B淋巴样细胞或2个T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法。本发明也提供了通过杂交1个源自脾、外周血、脐带血或骨髓的髓共同祖细胞、1个B淋巴样细胞和1个T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法。
在另一个实施方案中，所述源自B淋巴谱系的细胞是前B细胞、幼B细胞、幼稚B细胞、活化的B细胞或效应B细胞。因此，显而易见，本发明提供了通过杂交1个髓共同祖细胞或1个干细胞和2个选自下述的B淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法：前B细胞、幼B细胞、幼稚B细胞、活化的B细胞或效应B细胞。本发明也提供了通过杂交1个髓共同祖细胞或干细胞、1个选自下述的B淋巴样细胞和1个T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法：前B细胞、幼B细胞、幼稚B细胞、活化的B细胞或效应B细胞。
在一个实施方案中，所述效应B细胞是抗原处理过的B-细胞或浆细胞。因此，本发明提供了通过杂交1个髓共同祖细胞或干细胞和2个选自下述的B淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法：抗原处理过的B-细胞或浆细胞。本发明也提供了通过杂交1个髓共同祖细胞或干细胞、1个抗原处理过的B-细胞或浆细胞和1个T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法。
在一个实施方案中，所述源自B淋巴谱系的细胞显示至少一种下述CD抗原：CD19、CD20、CD72或CD5。因此，本发明提供了通过杂交1个髓共同祖细胞或干细胞和2个显示至少一种下述CD抗原的B淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法：CD19、CD20、CD72或CD5。本发明也提供了通过杂交1个髓共同祖细胞或干细胞、1个显示至少一种下述CD抗原的B淋巴样细胞和1个T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法：CD19、CD20、CD72或CD5。
在一个实施方案中，所述源自T淋巴谱系的细胞是前T细胞、幼T细胞、幼稚T细胞、活化的T细胞或效应T细胞。因此，本发明提供了通过杂交1个髓共同祖细胞或干细胞、1个B淋巴样细胞和1个选自下述的T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法：前T细胞、幼T细胞、幼稚T细胞、活化的T细胞或效应T细胞。本发明也提供了通过杂交1个髓共同祖细胞或干细胞和2个选自下述的T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法：前T细胞、幼T细胞、幼稚T细胞、活化的T细胞或效应T细胞。
在一个实施方案中，所述源自T淋巴谱系的细胞显示至少一种下述CD抗原：CD3、CD4、CD5或CD8。因此，本发明提供了通过杂交1个髓共同祖细胞或干细胞、1个B淋巴样细胞和1个显示至少一种下述CD抗原的T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法：CD3、CD4、CD5或CD8。本发明也提供了通过杂交1个髓共同祖细胞或干细胞和2个T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法，所述T淋巴样细胞选自显示至少一种下述CD抗原的T细胞：CD3、CD4、CD5或CD8。
在一个实施方案中，所述源自B淋巴谱系的细胞是无限增殖化的细胞。因此，本发明提供了通过杂交1个髓共同祖细胞或干细胞和2个B淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法，所述B淋巴样细胞中的至少一个可以是无限增殖的细胞。本发明也提供了通过杂交1个髓共同祖细胞或干细胞、1个无限增殖的B淋巴样细胞和1个T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法。
在一个实施方案中，所述源自T淋巴谱系的细胞是无限增殖化的细胞。因此，本发明提供了通过杂交1个髓共同祖细胞或干细胞、1个B淋巴样细胞和1个无限增殖的T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法。
在一个实施方案中，所述源自B淋巴谱系的细胞源自淋巴组织。因此，本发明提供了通过杂交1个髓共同祖细胞或干细胞和2个源自淋巴组织的B淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法。本发明也提供了通过杂交1个髓共同祖细胞或干细胞、1个源自淋巴组织的B淋巴样细胞和1个T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法。
在一个实施方案中，所述源自T淋巴谱系的细胞源自淋巴组织。因此，本发明提供了通过杂交1个髓共同祖细胞或干细胞、1个B淋巴样细胞组织和1个源自淋巴组织的T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法。
在生产本发明的杂交细胞的方法中所包括的B或T淋巴样细胞源自淋巴组织的情况下，所述淋巴组织优选地选自：外周血、脐带血、脾、骨髓、胸腺、扁桃体、腺样体和局部淋巴结。
在一个实施方案中，在生产本发明的杂交细胞的方法中包含的细胞中的至少一个是人细胞。还显而易见，在一个实施方案中，生产本发明的杂交细胞的方法可以包含至少一个小鼠细胞。
在一个实施方案中，所述源自髓共同祖细胞的细胞是K562细胞。因此，显而易见，本发明提供了通过杂交1个K562细胞和2个B淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法。本发明也提供了通过杂交1个K562细胞、1个无限增殖的B淋巴样细胞和1个T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法。
在一个实施方案中，所述第二个细胞或所述第三个细胞是WIL2-NS细胞或MOLT4细胞。因此，显而易见，本发明提供了通过杂交1个髓共同祖细胞或干细胞、1个WIL2-NS细胞和1个T淋巴样细胞来生产杂交细胞的方法。本发明也提供了通过杂交1个髓共同祖细胞或干细胞、1个B淋巴样细胞和1个MOLT4细胞来生产杂交细胞的方法。
在一个实施方案中，所述第一个细胞是K562细胞，所述第二个细胞是WIL2-NS细胞，且所述第三个细胞是MOLT4细胞。
在本发明的方法的另一个实施方案中，所述第一个细胞是K562细胞，所述第二个细胞是原代B细胞，且所述第三个细胞是原代T细胞。
在本发明的方法的另一个实施方案中，所述第一个细胞是原代人单核细胞，所述第二个细胞是WIL2-NS细胞，且所述第三个细胞是原代T细胞。
在本发明的方法的另一个实施方案中，所述第一个细胞是原代人骨髓单核祖细胞，所述第二个细胞是WIL2-NS细胞，且所述第三个细胞是原代人T细胞。
在本发明的方法的另一个实施方案中，所述第一个细胞是K562细胞，所述第二个细胞是WIL2-NS细胞，且所述第三个细胞是原代T细胞。
在本发明的方法的另一个实施方案中，所述第一个细胞是原代单核细胞，所述第二个细胞是WIL2-NS细胞，且所述第三个细胞是WIL2-NS细胞。
在本发明的方法的另一个实施方案中，所述第一个细胞是原代小鼠单核细胞，所述第二个细胞是SP2细胞，且所述第三个细胞是原代小鼠T细胞。
在本发明的方法的另一个实施方案中，所述第一个细胞是原代小鼠单核细胞，所述第二个细胞是SP2细胞，且所述第三个细胞是SP2细胞。
在本发明的方法的另一个实施方案中，所述第一个细胞是原代人或小鼠单核细胞，所述第二个细胞是WIL2-NS细胞，且所述第三个细胞是SP2细胞。
定义
在本发明的上下文中，词语“包含”、“包括”等应当解释为它们的包括含义(而不是它们的排除含义)，也就是“包括、但不限于”的含义。
杂交细胞
杂交细胞是包含来自超过一个基因组的组分的细胞(除了合子和它们的衍生物以外)。它是从例如2个或更多个生物细胞(亲本细胞)的体细胞杂交(或全细胞杂交)构建出的细胞。所述亲本细胞可以从相同的谱系(或物种)或不同的谱系(或物种)得到。从相同的谱系和物种产生的杂交细胞被称作同源杂合体(auto-hybrid)，从不同的谱系产生的杂交细胞被称作异源杂合体(hetero-hybrid)。
嵌合细胞
嵌合细胞是使用源自2个或更多个不同物种的基因组人工生产的杂交细胞。
跨谱系杂交细胞
跨谱系杂交细胞是使用源自2个或更多个细胞的基因组人工生产的杂交细胞，所述细胞源自不同的细胞谱系。造血细胞被分成2个主要谱系：淋巴样(T细胞、B细胞和NK细胞)和髓样(单核细胞和巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突细胞)。
三杂交细胞
三杂交细胞是使用源自3个细胞的基因组人工生产的杂交细胞。
稳定的
当提及细胞时，术语“稳定的”表示细胞的表现出下述一致性的能力：给定生长或生产率参数的一致性，或细胞系的产物特征随着世代数的渐增的一致性。当关于稳定的转染子使用时，它表示在相对恒定的水平基本上无限地表达转基因的细胞系。
体细胞杂交
在本申请的上下文中，术语“体细胞杂交”表示以下述方式从2个或更多个二倍体(非配子)细胞(亲本细胞)产生一个单独的活细胞的过程：诱导所述细胞的质膜处于良好接触，同时诱导亲本细胞的质膜在接触点处可逆地分解，并使每个亲本细胞的实体或细胞器组合在新形成的单个细胞的包膜内。新形成的单个细胞被称作杂交的细胞或杂交细胞。
干细胞
术语“干细胞”表示非特化的细胞，其具有通过有丝分裂进行分裂和发育成多种不同细胞类型的能力。干细胞可以包括胚胎干细胞、源自脐带的“成体”干细胞或源自成体的干细胞。干细胞包括具有分化成所有细胞类型的非限制能力的细胞，即全能细胞。干细胞还可以包括它们的分化成特化细胞的能力受限制的细胞，例如多潜能干细胞(pluripotentstem cell)、多能干细胞(multipotent stem cell)、寡能干细胞(oligopotent stemcell)或单能干细胞(unipotent stem cell)。
无限增殖化的细胞
术语“无限增殖化的细胞”表示具有无限生长的能力的细胞。显而易见，无限增殖化的细胞可以源自体内恶性肿瘤或胚胎。或者，通过对细胞进行诱导无限生长能力的操作，可以衍生出无限增殖化的细胞。这些操作可以包括，例如，体外转化过程，例如导入病毒基因诸如EB病毒(EBV)、猿猴病毒40(SV40)T抗原、腺病毒E1A和E1B和人乳头瘤病毒(HPV)E6和E7。或者，通过表达端粒末端转移酶逆转录酶蛋白(TERT)或其它方法，可以从细胞衍生出无限增殖化的细胞。也可以从已经修饰了癌基因表达的细胞衍生出无限增殖化的细胞。无限增殖化的细胞可以源自诱导无限生长能力的任意操作，包括、但不限于：紫外线暴露或自发转化(其中无限增殖的机理不明)
骨髓瘤细胞
术语“骨髓瘤细胞”表示浆细胞的恶性肿瘤。
杂交瘤
术语“杂交瘤”表示通过杂交骨髓瘤细胞和源自免疫接种的动物的脾的B-细胞而生成的细胞。杂交瘤是具有生产单克隆抗体的能力的无限增殖化的细胞。
未定型的祖细胞
术语“未定型的祖细胞”表示干细胞的早期后代，其仅可以分化成有限种类的细胞，而不定向于任何特定谱系，但是它不再可以更新自身。
髓共同祖细胞
髓共同祖细胞是这样的造血干细胞的后代：所述造血干细胞限于髓谱系，且能够产生巨核细胞/红细胞或粒细胞/巨噬细胞祖细胞，但不产生淋巴样细胞。
淋巴共同祖细胞
淋巴共同祖细胞是这样的造血干细胞的后代：所述造血干细胞限于淋巴谱系，且产生B细胞、T细胞和天然杀伤细胞，但不产生髓样细胞。
B淋巴谱系-衍生的细胞
B淋巴谱系-衍生的细胞是源自淋巴共同祖细胞(在它的B谱系定型为变成任意类型的B细胞以后)的任何细胞。
T淋巴谱系-衍生的细胞
T淋巴谱系-衍生的细胞是源自淋巴共同祖细胞(在它的T谱系定型为变成任意类型的T细胞以后)的任何细胞。
粒细胞-巨噬细胞祖细胞
粒细胞-巨噬细胞祖细胞是这样的祖细胞：其源自髓共同祖细胞，且定型为粒细胞和单核细胞谱系，但是没有定型为巨核细胞谱系和红细胞谱系。
巨核细胞-红细胞祖细胞
巨核细胞-红细胞祖细胞是这样的祖细胞：其源自髓共同祖细胞，且定型为巨核细胞谱系和红细胞谱系，但是没有定型为粒细胞和单核细胞谱系。
前B细胞
前B细胞是这样的发育中的B细胞：其处于膜结合的IgM的重链与替代轻链一起表达时的阶段。
幼B细胞
幼B细胞表示骨髓内的发育中的B细胞，其中在抗体的重组阶段，基因座VJ重排在L链上，且VDJ重排在H链上，表现出IgM受体表达。
幼稚B细胞
幼稚B细胞是这样的成熟的B细胞：其通过它的表面免疫球蛋白的随机基因重排，已经在骨髓中分化和成熟，但是尚未遇到周围的关连抗原。
活化的B细胞
一类成熟的B细胞，其已经通过抗原识别(经由BCR)遇到在周围的它的关连抗原，从而导致克隆增殖和以T-依赖性的或非依赖性的方式终末分化成浆细胞的组合。
效应B细胞
效应B细胞经常与分泌抗体的浆细胞同义，后者是一类短寿B细胞，其分泌对特定抗原特异性的抗体以及过多的细胞因子，以吸引免疫系统的其它细胞。
记忆B细胞
记忆B细胞是从活化的B细胞形成的长寿B细胞，其对在初次免疫应答过程中遇到的抗原是特异性的，且能够在第二次暴露于相同抗原以后快速应答。
浆细胞
浆细胞是免疫系统的终末的有丝分裂后的、短寿细胞，其在CD4+淋巴细胞(Th细胞)刺激时从B细胞分化，并分泌大量抗体。
前T细胞
前T细胞是这样的发育中的T细胞：其处于VbDbJb是完整的且TCRβ链在双阴性的(CD4-CD8-)T细胞(CD3+)中表达时的阶段。
幼T细胞
幼T细胞是这样的发育中的T细胞：其已经从骨髓迁移至胸腺，但是尚未完成它的TCR的重排，或针对它的TCR对在自身主要组织相容性复合体(MHC)分子背景下呈递的自身肽的结合能力的选择，或定型为T杀伤谱系或T辅助谱系，它们与细胞分别对MHC I类或II类分子的TCR特异性精确地关联。通过共同受体分子CD8或CD4之一的表达的丧失，在表型上标记谱系定型。
幼稚T细胞
一种成熟的T细胞，其已经在骨髓中分化，并成功地经历了胸腺中的中心选择的正过程和负过程(重排它的TCR，并丧失共同受体分子之一)，但是尚未遇到在周围的关连抗原。
活化的T细胞
活化的T细胞是这样的T细胞：其通过在抗原呈递细胞上的主要组织相容性复合体肽(肽:MHC复合物)和B7家族成员分别对细胞表面上的TCR和CD28的衔接，开始变成抗原-特异性的效应T细胞。
效应T细胞
效应T细胞是一类短寿T淋巴细胞，其在接触携带对于所述细胞而言适当的肽:MHC复合物的细胞时，能够立即做出应答。
附图说明
图1.鉴别和分选-纯化的CD71+K562细胞。
图2.CD15和CD71阳性的K562细胞的FACS概况；(a)原始的CD71-富集的K562细胞群体中大约18％是CD15阳性的(R1区域)，和(b)在培养2个月以后CD15阳性的K562细胞的重新分析。
图3.CD15在CD34+AML单核的细胞上的表达。
图4.CD16的FACS概况和通过CD14磁珠(MACS)分离的不同CD14+细胞群体的分选门。
图5.用小鼠抗-人CD19和小鼠抗-人CD5抗体染色的脐带血单核的细胞的FACS概况。
图6.用小鼠抗-人CD3和小鼠抗-人CD5抗体染色的单核的脐带血细胞的FACS概况。
图7.用小鼠抗-人CD20和小鼠抗-人CD72抗体染色的骨髓单核的细胞的FACS概况。
图8.扁桃体单核的细胞的CD3和CD54的典型FACS概况。
图9.IgM和IgG阳性的培养的淋巴细胞的鉴别；(A)在培养5天以后，18％的CD19+细胞是IgM阳性的，且1％在细胞表面上具有可检测的IgG；(B)在培养10天以后，IgM阳性的淋巴细胞的百分比降低至2％，且IgG阳性的细胞的百分比增加至15％。
图10.在具有髓样和淋巴样来源的癌基因的KMW三杂交细胞上的CD表达的FACS概况。
图11.CD4和CD19在原代混合的脾淋巴细胞、分选的CD4和CD19群体以及得到的KBT三杂交细胞系上的表达；(a)CD4和CD19在原代脾淋巴细胞上的表达；(b)分选的CD19+细胞的纯度概况(98.1％)；(c)分选的CD4+细胞的纯度概况(96.8％)；(d)CD19和CD4在三杂交细胞上的共表达。三杂交细胞群体中超过99％共表达B和T细胞的标记物。
图12.CD19、CD3和CD5在KBT三杂交体上的表达，所述KBT三杂交体源自1个无限增殖的髓样细胞和2个原代抗原处理过的淋巴样细胞；(a)CD19和CD5在KBT三杂交细胞表面上的表达；(b)CD3和CD5在KBT三杂交体上的表达。
图13.CD4、CD8、CD72和CD20在KBT三杂交细胞表面上的表达，所述KBT三杂交细胞源自1个无限增殖的髓样细胞和2个原代淋巴样细胞，所述淋巴样细胞源自骨髓和胸腺；(a)CD4和CD8的表达，(b)CD4和CD72的表达，(c)CD20和CD8的表达。
图14.在WTM三杂交体系上的CD表达的FACS概况，所述WTM三杂交体系具有淋巴样来源的癌基因和来自原代细胞的CD4和CD14；(a)CD19和CD4在三杂交细胞上的共表达，表现出一群具有高CD4表达水平的CD19细胞(CD19CD4H)和另一群具有低CD4表达水平的CD19细胞(CD19CD4L)；(b)CD4和CD14在相同的CD19阳性的三杂交体群体上的共表达，表现出基于高或低CD14表达的进一步的细胞群体异质性(CD4HCD14L；CD4HCD14H；CD4LCD14H)。
图15.在WTM三杂交细胞上的CD表达的典型FACS概况，所述WTM三杂交细胞具有淋巴样来源WIL2-NS的癌基因、源自抗原处理过的T细胞的CD5和源自原代单核细胞的CD14。
图16.在WTM三杂交细胞上的CD表达的FACS概况，所述WTM三杂交细胞具有淋巴样来源WIL2-NS的癌基因、源自细胞毒性T细胞的CD8和源自原代单核细胞的CD14。
图17.在WTM三杂交体上的CD4和CD8共表达的FACS概况，所述WTM三杂交体源自双CD阳性的T细胞。
图18.源自骨髓单核祖细胞的WTM三杂交细胞的表面上的CD表达；(A)使用CD19、CD4和CD15的三色染色，和(B)使用源自骨髓单核祖细胞的CD34和CD15和源自效应T细胞的CD4的三色染色。
图19.源自CD4+效应T细胞的KWT三杂交细胞的谱系特异性的标记物的表达。
图20.源自双阳性的CD4+CD8+T细胞的KWT三杂交细胞的谱系特异性的标记物的表达。
图21.源自CD5+抗原处理过的T细胞的KWT三杂交细胞的谱系特异性的标记物的表达。
图22.WWM三杂交细胞的典型CD表达概况，所述WWM三杂交细胞源自2个各自含有淋巴样癌基因的细胞和1个原代单核细胞；(a)CD19和CD14在三杂交细胞上的共表达(R1区域)，显示了不表达CD14的CD19阳性细胞的独特群体(R2区域)；(b)三杂交细胞上的CD14表达，所述三杂交细胞源自R1区域中的分选的细胞，并在培养中增殖2个月；(c)三杂交细胞上缺乏表面CD14，所述三杂交细胞源自2个月以后的R2区域中的分选的群体。
图23.从WWM三杂交细胞的不同亚群得到的CD14的代表性的RT-PCR。
图24.K562细胞的单个克隆的核型分析。结果表明，K562细胞系是三倍体，具有69个染色体模式数。检测到下述染色体异常：缺少1个X染色体；染色体2的长臂的臂内倒位，其涉及带q33和q35；缺少染色体3、额外的衍生染色体5，所述衍生染色体5用未知起源的额外染色体材料替代来自q11.2的区段；染色体6的短臂在带p21.2和p23之间的区段的重复；额外的染色体7，其具有染色体7的短臂的臂内倒位，其涉及带p13和p22；缺少1个染色体9；染色体9的短臂从带p13的末端缺失；由易位产生的衍生染色体9，所述易位涉及来自2个染色体9的区段；由易位产生的染色体10的衍生物，所述易位涉及来自染色体3和10的区段；缺少染色体13；在一个染色体13的短臂上的未知起源的额外染色体材料；缺少染色体14；未知起源的额外材料，其替代在2个染色体17上来自p13的区段；由易位产生的衍生染色体18，所述易位涉及来自染色体1和18的区段；缺少1个染色体20；由易位产生的衍生染色体21，所述易位涉及染色体1和21的区段；缺少1个染色体22；5个额外的不同的标记物染色体。
图25.WIL2NS细胞系的5个克隆之一的核型分析。在该克隆(克隆1)中，检测到下述异常：由易位产生的衍生染色体8，所述易位涉及来自染色体1和8的区段；染色体13的额外同源物；由易位产生的染色体14的衍生物，所述易位涉及来自染色体5和14的区段；染色体17的来自q22-q23的区段的重复。
图26.KBT-1(CD19+)&(CD4+)三杂交体系的核型分析，显示了接近三倍体的单个细胞克隆。由于随机丧失，染色体计数在65-66之间变化，但是具有66的染色体模式数。检测到下述的染色体异常：由复杂易位形成的衍生物X，所述复杂易位涉及X染色体的短臂，并可能涉及2个其它的未鉴别的染色体；缺少1个X染色体；染色体2的长臂中的臂内倒位，其涉及带q33和q35；缺少染色体3；缺失染色体3p；衍生染色体4，其涉及染色体4和另一个未鉴别的染色体的区段；额外的衍生染色体5，其用未知起源的额外染色体材料替代来自q11.2的区段；染色体6的短臂在带p21.2和p23之间的区段的重复；额外的衍生染色体7，其涉及染色体7的长臂和标记物3的长臂；缺少1个染色体13；在一个染色体13的短臂上的未知起源的额外染色体材料；缺少1个染色体14；缺少1个染色体15；未知起源的额外材料替代2个染色体17上来自p13的区段；由易位产生的衍生染色体18，所述易位涉及来自染色体1和18的区段；缺少1个染色体20；由易位产生的衍生染色体21，所述易位涉及染色体1和21的区段；缺少染色体22；4个额外的不同的标记物染色体。
图27.KBT(K562&CD20+CD72+&CD4+CD8+细胞)跨谱系三杂交体(或KBT-2跨谱系)的核型，显示了4个接近三倍体的克隆，(A)克隆1具有67的染色体模式数和下述的染色体异常：由复杂易位形成的衍生物X，所述复杂易位涉及X染色体的短臂，并可能涉及2个其它的未鉴别的染色体；缺少1个X染色体；衍生染色体1，其包含来自染色体1的区段和最可能来自染色体4的区段；染色体2的长臂中的臂内倒位，其涉及带q33和q35；缺少1个染色体3；最可能地，缺失的染色体4可能是小衍生染色体4；额外的衍生染色体5，其用未知起源的额外染色体材料替代来自q11.2的区段；染色体6的短臂在带p21.2和p23之间的区段的重复；额外的衍生染色体7，其涉及染色体7的长臂和标记物3的长臂；缺少1个染色体9；染色体9的短臂从带p13的末端缺失；由易位产生的衍生染色体9，所述易位涉及来自2个染色体9的区段；由易位产生的衍生染色体10，所述易位涉及来自染色体3和10的区段；缺少1个染色体13；在一个染色体13的短臂上的未知起源的额外染色体材料；缺少1个染色体14；未知起源的额外材料替代2个染色体17上来自p13的区段；由易位产生的衍生染色体18，所述易位涉及来自染色体1和18的区段；缺少1个染色体20；由易位产生的衍生染色体21，所述易位涉及染色体1和21的区段；缺少1个染色体22；4个额外的不同的标记物染色体，(B)由于随机丧失，克隆2含有65-67个染色体(染色体模式数是67)，且具有与克隆1类似的染色体特征，例外是，克隆1的缺失的染色体4被确定的衍生染色体4置换，后者涉及染色体4和另一个未鉴别的染色体的区段，(C)克隆3与克隆1基本上相同，但是缺少衍生染色体1，且存在源自染色体1和4的区段的不同衍生染色体4。由于随机丧失，它含有67-68个染色体，模式数为67，(D)克隆4与克隆1基本上相同，但是缺少衍生染色体1，且存在由易位产生的不同衍生染色体1，所述易位涉及染色体1和4的区段。仅存在2个正常染色体5’s和一个衍生染色体5，后者似乎是随体化的(satellited)5q。
图28.KWT-1三杂交体系(源自无限增殖的髓样细胞和B淋巴样细胞和原代成熟的CD4+T辅助细胞的KWT三杂交体)的核型分析，显示了接近六倍体的单个克隆，其具有129-140染色体的模式数和下述的染色体异常：缺少2个X染色体；缺少1个染色体1；缺少1个染色体2；染色体2的长臂中的臂内倒位，其涉及带q33和q35；缺少2个染色体3；缺少1个染色体4；衍生染色体4，其用未知起源的额外染色体材料替代来自q35的区段；一个额外的染色体5同源物；染色体5的2个额外的衍生物，其用未知起源的额外染色体材料替代来自q11.2的区段；一个额外的染色体6同源物；额外的染色体6，其具有染色体6的短臂在带p21.2和p23之间的区段的重复；一个额外的染色体7同源物；2个染色体7，它们具有染色体7的短臂的臂内倒位，其涉及带p13和p22；由易位产生的衍生染色体8，所述易位涉及来自染色体1和8的区段；缺少2个染色体9；染色体9的短臂从带p13的末端缺失；2个由易位产生的衍生染色体9，所述易位涉及来自2个染色体9的区段；由易位产生的染色体10的衍生物，所述易位涉及来自染色体3和10的区段；缺少1个染色体12；一个染色体13，其具有在一个染色体13的短臂上的未知起源的额外染色体材料；缺少2个染色体14；由易位产生的染色体14的衍生物，所述易位涉及来自染色体5和14的区段；缺少1个染色体15；缺少1个染色体17；2个染色体17，其用未知起源的额外材料替代来自2个染色体17上的p13的区段；2个染色体17，其具有来自q22-q23的区段的重复；缺少2个染色体18；额外的染色体20；由易位产生的衍生染色体21，所述易位涉及染色体1和21的区段；缺少1个染色体22；7个额外的标记物染色体，它们具有标记物染色体2的2个拷贝。
图29.KWT-2(源自无限增殖的髓样细胞和B淋巴样细胞和原代记忆CD3+CD5+T细胞的KWT三杂交体系)的核型分析，显示了接近六倍体的单个克隆，其具有135-142染色体的模式数和下述的染色体异常：缺少2个X染色体；缺少1个染色体1；缺少1个染色体2；染色体2的长臂中的臂内倒位，其涉及带q33和q35；缺少2个染色体3；缺少1个染色体4；衍生染色体4，其用未知起源的额外染色体材料替代来自q35的区段；一个额外的染色体5的同源物；染色体5的2个额外的衍生物，其用未知起源的额外染色体材料替代来自q11.2的区段；一个额外的染色体6的同源物；额外的染色体6，其具有染色体6的短臂在带p21.2和p23之间的区段的重复；2个染色体7，它们具有染色体7的短臂的臂内倒位，其涉及带p13和p22；由易位产生的衍生染色体8，所述易位涉及来自染色体1和8的区段；缺少2个染色体9；染色体9的短臂从带p13的末端缺失；2个由易位产生的衍生染色体9，所述易位涉及来自2个染色体9的区段；由易位产生的染色体10的衍生物，所述易位涉及来自染色体3和10的区段；缺少1个染色体12；一个染色体13，其具有在一个染色体13的短臂上的未知起源的额外染色体材料；缺少2个染色体14；由易位产生的染色体14的衍生物，所述易位涉及来自染色体5和14的区段；缺少1个染色体15；缺少1个染色体17；2个染色体17，它们用未知起源的额外材料替代在2个染色体17上的来自p13的区段；2个染色体17，其具有来自q22-q23的区段的重复；缺少2个染色体18；额外的染色体20；由易位产生的衍生染色体21，所述易位涉及染色体1和21的区段；缺少1个染色体22；8个额外的标记物染色体，它们具有标记物染色体2的2个拷贝。
图30.KWT-3三杂交体系(源自无限增殖的髓样细胞和B淋巴样细胞和原代双阳性的CD4+CD8+T细胞的KWT三杂交体)的核型分析，显示了3个克隆，它们是染色体模式数为124-139的超五倍体(hyperpentaploid)。(A)克隆1具有下述的染色体异常：3个X染色体和单个Y染色体；额外的染色体1；2个额外的染色体2；染色体2的长臂中的臂内倒位，其涉及带q33和q35；缺少1个染色体3；额外的由易位产生的染色体5衍生物，所述易位涉及染色体5和未知起源的染色体；额外的染色体6；染色体6的短臂在带p21.2和p23之间的区段的重复；染色体7的短臂的额外的臂内倒位，其涉及带p13和p22；由易位产生的衍生染色体8，所述易位涉及来自染色体1和8的区段；染色体9的短臂从带p13的末端缺失；由易位产生的衍生染色体9，所述易位涉及来自2个染色体9的区段；2个额外的染色体10；2个由易位产生的染色体10的衍生物，所述易位涉及来自染色体3和10的区段；2个额外的染色体13；在一个染色体13的短臂上的额外的未知起源的染色体材料；缺少1个染色体14；由易位产生的染色体14的衍生物，所述易位涉及来自染色体5和14的区段；额外的未知起源的材料，其替换来自3个染色体17上的p13的区段；来自q22-q23的区段中的染色体17的2个染色体重复；额外的染色体18；由易位产生的衍生染色体18，所述易位涉及来自染色体1和18的区段；额外的染色体19；缺少1个染色体20；由易位产生的衍生染色体21，所述易位涉及染色体1和21的区段；5个额外的标记物染色体，它们具有每个标记物染色体4和5的2个拷贝。(B)克隆2具有与克隆1类似的染色体异常，但是它丧失一个染色体9。(C)克隆3含有与克隆2相同的染色体异常，但是染色体2的长臂中的臂内倒位被替换为等臂衍生(isoderivative)染色体2，后者因涉及衍生染色体2的等臂染色体的形成而产生，所述衍生染色体2由长臂中的臂内倒位产生，其涉及带q33和q35。
图31.WWM三杂交体(A)和它的CD14富集的亚系(B)的核型分析，显示了单个优势克隆，这将它的存在从在原始的WWM三杂交体中的55％增加至在它的CD14富集的亚系中的95％。每个具有47染色体的模式数和下述的染色体异常:由易位产生的染色体8衍生物，所述易位涉及来自染色体1和8的区段；额外的染色体13同源物；由易位产生的染色体14衍生物，所述易位涉及来自染色体5和14的区段；染色体17的来自q22-23的区段的重复；由易位产生的衍生染色体21，所述易位涉及来自染色体3和21的区段。原始的WWM三杂交体和它的CD14+富集的亚系之间的唯一差别在于，这些异常存在于仅55％的原始WWM细胞中和95％的CD14富集的亚系细胞中。WWM三杂交体中的剩余细胞是从接近三倍体(具有随机的染色体丧失)至接近四倍体(具有随机的染色体丧失)。
图32.来自ProGM培养物的上清液的蛋白印迹。给泳道1和2分别装载未活化的和活化的4天人T淋巴细胞培养物的上清液。泳道4和5分别含有在没有或有衣霉素存在下培养的ProGM培养物的上清液。在泳道3中使用非表达-GM-CSF的细胞的上清液。作为参照，在泳道6中使用源自大肠杆菌(E.coli)的重组hGM-CSF(10ng)。
图33.由ProGM杂交体系生产的人GM-CSF的凝胶电泳。从在有(泳道3和4)和没有(泳道1和2)衣霉素存在下培养的样品得到ProGM杂交体系的细胞上清液，对其进行使用大鼠抗-人GM-CSF抗体(泳道1和3)和大鼠抗-小鼠GM-CSF抗体(泳道2和4)的免疫沉淀。通过银染色，使蛋白显影。
图34.CD4和CD54在ProCD54细胞系和它的CD54富集的亚系ProCD54EX的表面上的表达；(a)100％的ProCD54细胞保持CD4的表达。细胞群体中的大约72％也是CD54阳性的，表达水平从低至高。门控和分选出42％的具有CD4+CD54+表型特征的细胞群体，所述细胞群体的CD54表达水平从中等至高；(b)CD4和CD54在原始ProCD54的分选的CD4+CD54+亚系的表面上的表达分析表明，在培养超过6个月以后，98％的细胞仍然是两种标记物阳性的。
图35.由ProCD54和ProCD54EX细胞分泌的可溶的人CD54的蛋白印迹。使用KWT三杂交体配偶体细胞系的细胞作为对照。ProCD54和ProCD54EX细胞脱落大约82kDa的可溶形式的CD54。
图36.ProCD54和ProCd54EX细胞中ICAM-1基因表达的RT-PCR分析。
图37.在转染后24、48和72小时，来自用hIL4-Rα链瞬时转染的KBT三杂交细胞系的细胞提取物的蛋白印迹分析。用100ng/ml hIL4刺激的人PBML和未转染的KBT细胞分别用作hIL4-Rα链的阳性对照和阴性对照。
图38.用于检测被hIL-2转染的KBT三杂交细胞中的hIL-2mRNA的PCR输出。表达水平类似于来自CD8+人T淋巴细胞和Jurkat细胞的那些。未转染的KBT细胞和K562细胞用作阴性对照。
图39.(a)原始的KBT三杂交细胞和(b)KBT TR-IL2细胞中的细胞内hIL-2的FACS分析。大约41％的KBT细胞是CD69活化分子阳性的。92％的KBT TR-IL2细胞是细胞内hIL-2(R1+R2)染色阳性的。hIL-2阴性的细胞是CD69阳性群体的一部分，而CD69阴性的细胞都是细胞内hIL2阳性的。
图40.在hGM-CSF亲和吸收以后，进行RP-HPLC得到的洗脱图。
图41.在hGM-CSF亲和免疫吸收以后，进行RP-HPLC所收集的级分的SDS-PAGE(下图)和蛋白印迹(上图)。蛋白印迹揭示级分之间由Pro-GM-SF分泌的hGM-CSF的分子量概况的变化。在24-28分钟洗脱的级分对应着RP-HPLC洗脱图上的第一个峰，在29-31分钟之间收集的级分代表第二个峰，而第三个峰落进在34-36分钟之间收集的级分。
图42.从PHA活化的人淋巴细胞培养物分离CD4+细胞：(A)从剩余的细胞群体门控(R1)和分选用抗人CD4-FITC标记的细胞。进一步分析分选的细胞的纯度；(B)分选的群体中100％的细胞是CD4阳性的。
图43.源自Pro-GMsf的去糖基化的hGM-CSF的凝胶电泳。
将纯化的hGM-CSF暴露于PHGase F消化不同的时间段。温育时间是：泳道1-0min，泳道2-10min，泳道3-20min，泳道4-40min。泳道5–源自大肠杆菌的重组人GM-CSF。通过银染色，使蛋白显影。指示了分子量标记物。
图44.小鼠骨髓瘤Sp2细胞系的TfR+细胞的鉴别和分选。
图45.来自用抗-小鼠CD4和CD8染色的(a)外周血和(b)脾的小鼠单核的细胞的FACS概况。门控的区域R1和R3代表单个阳性的效应辅助(CD4+CD8-)T细胞和细胞毒性(CD8+CD4-)T细胞，而R2含有双阳性的(CD4+CD8+)T细胞。
图46.通过磁珠负选择从外周血分离出的小鼠单核细胞的纯度概况。100％的分离的细胞是CD11b阳性的，且同时，这些细胞中超过98％是B220、CD90、CD49b和NK1.1阴性的。大约38％的CD11b+细胞在它们的表面上表达低水平的Ly5G。
图47.CD138、CD4和Cd11b在STmMm三杂交体上的表达的FACS概况，所述STmMm三杂交体源自1个Sp2的淋巴样无限增殖细胞、原代小鼠CD4+T细胞和CD11b+单核细胞。通过CD138在100％的三杂交细胞上的表达(a)和(b)，证实B淋巴谱系的表型。细胞群体中至少82％表达所有3个CD标记物，仅5％的细胞是CD138阳性的，而不共表达CD4或CD11b。
图48.CD138、CD8和CD11b在STmMm三杂交体上的表达的典型FACS概况，所述STmMm三杂交体源自1个Sp2的小鼠淋巴样无限增殖细胞、原代小鼠细胞毒性CD8+T细胞和小鼠CD11b+单核细胞。尽管在97-100％的三杂交细胞上证实了小鼠CD138的表达(a)和(b)，分别在三杂交细胞群体中的56％和57％上检测到T细胞和单核细胞标记物的共表达。整个三杂交体群体中的大约40％共表达所有3个标记物(c)，且仅14％在它们的表面上既不表达CD8也不表达CD11b。
图49.CD138、CD8和CD11b在STmMm三杂交体上的表达的典型FACS概况，所述STmMm三杂交体源自1个Sp2的小鼠淋巴样无限增殖细胞、1个原代小鼠双阳性的CD4+CD8+T细胞和1个原代小鼠CD11b+单核细胞。三杂交细胞群体中的98-100％是CD138阳性的，群体中的93％也是CD8阳性的(b)。整个细胞群体中的大约57-60％同时是CD138、CD8和CD11b阳性的。
图50.CD4和CD8在STmMm三杂交体表面上的表达的典型概况，所述STmMm三杂交体源自1个Sp2的小鼠淋巴样无限增殖细胞、1个原代小鼠双阳性的CD4+CD8+T细胞和1个原代单核细胞。尽管95％的细胞是CD8阳性的，但三杂交体群体中的仅50％共表达CD4和CD8。值得注意的是，实际上整个CD4+群体也是CD8阳性的。
图51.CD138和CD11b在SSMm三杂交体表面上的表达的典型概况，其中三杂交体群体中的93％显示出CD138阳性染色，70％的细胞共表达CD11b。
图52.人CD71和小鼠TfR在SWMm(a)和SWMh(b)三杂交体表面上的表达的典型概况。不论单核细胞的小鼠或人来源，100％的三杂交体是人和小鼠运铁蛋白受体阳性的。
图53.小鼠CD138以及小鼠CD11b或人CD14在SWMm(a)和SWMh(b)三杂交体上的表达的典型概况。小鼠CD138的表达似乎依赖于单核细胞的小鼠或人来源。尽管84％的SWMm三杂交体是小鼠CD138阳性的，但仅29％的SWMh在它们的表面上具有小鼠CD138。
图54.人CD19和人CD14在SWMh嵌合的三杂交体的表面上的表达的FACS概况，显示了96％的细胞表达人CD19，66％共表达人CD14。
图55.一个单细胞操作/递送系统。
图56.一个玻璃微量移液管。
图57.一个微电极。
图58. 2个平行的微电极。
图59.在组织培养板的孔中的2个微电极。
图60.含有处于2微电极中间的3个细胞的孔的顶视图。
图61.图60的孔的侧视图。
图62.在用第二种蛋白hIL-2稳定转染之前(A)和之后(B)，CD25和sIgM在杂交细胞表面上的表达，所述杂交细胞通过杂交1个KBT细胞和1个shIgM+CD25+B细胞而产生。
具体实施方式
参考附图，下面的非限制性实施例进一步描述了本发明的优选的实施方案。
实施例1
1.细胞选择、细胞操作和单细胞克隆
下面的实施例描述了细胞制备，包括用于产生跨谱系三杂交体和用于表达所需蛋白的哺乳动物细胞系和原代细胞的选择和分离(或分选)。特定选择技术的挑选，无论如何不是限制性的，而是指示性的，所述选择技术用于得到具有特定特征的细胞的纯群体，或使用特定标记物(或多个标记物)来分离具有特定表型的细胞。其它细胞标记物或分选程序可以用于产生类似的结果。
1.1.从哺乳动物细胞系选择细胞作为癌基因来源
在标准的(正常的)条件下，在CO2培养箱中，在37℃，在湿润的5％CO2气氛中，使用改良的RPMI1640(Roswell Park Memorial Institute培养基)，悬浮培养所有无限增殖的细胞系(参见下面)，所述培养基含有NaHCO3(JRH Biosciences)、20mM Hepes(Sigma)、4mML-谷氨酰胺(Sigma)，并补加了10％胎牛血清FCS(JRH Biosciences)。除非另外说明，这里描述的组织培养基(TC培养基)是用于培养本发明的所有无限增殖细胞系、原代癌细胞、原代细胞培养物和确立的三杂交细胞系的标准培养基。一般而言，在不含抗生素的环境中培养使用的所有细胞系、原代癌细胞和原代细胞。但是，当怀疑存在细菌和/或真菌污染的高风险时，在标准培养基中包含2％青霉素(5000单位)/链霉素(5mg)溶液(Sigma)。
人细胞系
可以用于本发明中的人细胞系如下：
a)髓共同祖细胞谱系,K562(源自人慢性髓细胞性白血病的细胞系)，
b)T淋巴谱系,MOLT4(人T淋巴母细胞)，和
c)B淋巴谱系,WIL2NS(人B淋巴母细胞)。
非人细胞系
可以用于本发明中的非人细胞系是小鼠骨髓瘤细胞系-Sp2(B淋巴细胞浆细胞)。
1.1.1.单细胞递送系统
细胞分离或分选、细胞操作和单细胞克隆是本发明自始至终的基本过程。在这里，我们描述了为了操作和/或克隆单个目标细胞而确立的单细胞递送系统。所述细胞递送系统(图55)主要由玻璃微量移液管、1ml注射器和一维粗操作器(coarse manipulator)组成。图56显示了用于获得单个目标细胞的L-形玻璃微量移液管。移液管由血细胞比容毛细管制成，其长度为75毫米(mm)，外径和内径分别为1.5mm和1.10mm。通过加热，拉伸管的一个末端，从而得到这样的尖端(1)：其具有大约250-300微米(μm)的内径，尖端壁厚为大约30μm。微量移液管的另一个末端保持未改变(2)。在所述的细胞递送系统(图55)中，注射器(4)安装在粗操作器上，后者又安装在磁性架(16)上。该系统以这样的方式工作：注射器的柱塞(6)可以被迫相对于注射器非常缓慢地向前或向后移动。为了操作单个目标细胞，必须使用柔性的医学级管(3)，将注射器连接至微量移液管的未改变的末端(2)，如图所示。必须通过用70％乙醇冲洗几次，将单细胞递送系统灭菌，最后没有气泡地充入适当的组织培养基或溶液(根据无论什么需要)，然后进行任何细胞操作。
1.1.2.单细胞克隆
通过单细胞克隆，确立来自每个细胞系的细胞的克隆。下面描述了在本发明中使用的克隆或操作任意生物学细胞的单个细胞(例如，K562细胞系的细胞)的技术。
将5μl K562细胞的细胞悬浮液从它的对数期培养物取出，并放入组织培养96-孔板(TC板,Becton and Dickinson或BD)的孔中，所述孔含有150μl TC培养基。该孔被命名为“细胞储存孔”。将板放在倒置显微镜(Axiovert 40C,Carl Zeiss)的XY显微镜载物台上。在单细胞操作/克隆过程前，给微量移液管(图56)没有气泡地完全充满TC培养基。将单细胞递送系统的微量移液管、管和注射器(图55)安装在一维粗操作器(Narishege)上。以使尖端位于显微镜的光学视野中心的方式，排列微量移液管尖端(1)。为了操作和克隆单个K562细胞，将微量移液管插入细胞储存孔中。通过在抽吸方向非常缓慢地移动注射器的柱塞，将单个K562细胞放置在微量移液管中。从细胞储存孔收回微量移液管。通过使显微镜载物台从细胞储存孔侧向移动至邻近的孔(命名为“克隆孔”)，并随后将微量移液管插入该克隆孔中，然后将微量移液管中的单个细胞轻轻从微量移液管释放出来。这通过在释放方向非常缓慢地移动注射器的柱塞来实现。将从细胞储存孔取出单个细胞并将所述单个细胞放入克隆孔中的过程重复多次，直到每个TC板得到60个单细胞克隆。在运行于37℃、5％CO2的湿润培养箱(Thermoline Scientific)中温育克隆板10天的时段。在温育时间段过程中，定期地用新鲜的TC培养基补充每个克隆孔中的培养基。每24小时，记录来自每个克隆孔的每个克隆的细胞增殖。在温育时间段结束时，确立K562细胞的许多克隆。选择具有最高增殖速率或最高目标标记物(其在细胞表面上表达，例如，在K562细胞上的CD71运铁蛋白受体)水平的克隆，用于三杂交体生产或其它实验。
1.1.3.CD71+细胞的分选
作为一个实例，下面的方法描述了使用荧光激活细胞分选仪(FACS)从K562细胞系中进行CD71阳性细胞的细胞选择和分选。
与20μl藻红蛋白(PE)缀合的抗-CD71(BD Pharmingen)或PE缀合的同种型对照抗体IgG2a,κ(BD Pharmingen)一起，将悬浮于100μl磷酸盐缓冲溶液(Dulbeco PBS)中的1x105K562细胞在暗处在室温温育30分钟，所述磷酸盐缓冲溶液含有2％牛血清清蛋白BSA(Sigma)。用1ml PBS稀释温育混合物，且通过在300g离心10分钟，收集染色的细胞。在用1mlPBS洗涤另外一次以后，将染色的细胞悬浮于1ml PBS中，并立即使用FACS(BDFACSCalibur)进行分析。图1显示了K562细胞系的CD71+细胞的概况。门控并分选CD71+阳性的细胞(图1a)。原始的K562群体中大约65％是CD71阳性的。将分选的细胞在300g离心10分钟，并悬浮于1ml PBS中，用于进一步的实验。收集100ml悬浮的CD71+-分选的细胞用于纯度分析，如图1b所示。得到CD71+分选的细胞的99％纯度。在细胞分选以后，将K562细胞系的CD71+细胞用于进一步的实验，或置于在标准培养条件下的培养物中，并标记为CD71-富集的K562细胞。使用相同的方法，确立CD71-富集的WIL2NS和CD71-富集的MOLT4培养物。
1.1.3.1.从K562培养物分选骨髓单核细胞谱系的CD71+细胞
为了确保用于细胞杂交实验的细胞的骨髓单核细胞表型，使用FACS分析和随后的分选，进一步富集CD71+K562细胞中的CD15+细胞。
为此目的，用PE抗-人CD71和FITC抗-人CD15(BD Pharmingen)标记从在第1.1.3部分中所述的方法得到的CD71-富集的K562细胞。与20μl抗-人CD71-PE和抗-人CD15-FITC抗体或阴性同种型对照抗体或FITC和PE标记的阴性同种型对照抗体一起，将悬浮于100μl含有2％BSA的PBS中的1x105洗过的CD71-富集的K562细胞在暗处在室温温育30分钟。用1mlPBS稀释温育混合物，且通过在300g离心10分钟，收集染色的细胞。在用1ml PBS洗涤另外一次以后，将染色的细胞悬浮于1ml PBS中，且立即使用FACSCalibur(BD)进行分析。
典型的FACS概况示于图2a。在培养5个月以后，99％的CD71-富集的K562细胞保持CD71阳性，其中大约18％表达表面CD15。门控CD71和CD15阳性的细胞(图2a)，并分选。通过在300g离心10分钟，收集分选的细胞，并悬浮于1ml PBS中，用于进一步实验。收集100μl悬浮的CD71+CD15+分选的细胞，用于纯度分析。在2个月培养以后，关于CD71和CD15的共表达，重新分析分选的细胞(图2b)。结果表明，大约98％的纯化的细胞保持CD 71和CD15。已经发现，一些在早期在表面上表达CD71和CD15的细胞已经丧失它们的CD15表达(图2b)，从而提示，K562细胞中向骨髓单核细胞谱系的定型是不稳定的和可逆的。
1.1.4.从小鼠Sp2细胞系选择运铁蛋白受体阳性的细胞
当在三杂交体的产生中使用小鼠骨髓瘤细胞系Sp2时，该群体富集表达小鼠运铁蛋白受体(TfR)(人CD71的类似物)的细胞。
遵循与第1.1.3部分(其描述了人细胞系中CD71+细胞的富集)基本上相同的规程，但是使用FITC-缀合的大鼠抗-小鼠TfR抗体(Abcam)替代PE-缀合的小鼠抗-人CD71。相应地调节同种型对照。
图44显示了Sp2细胞系的TfR+细胞的概况。门控并分选TfR+阳性的细胞(图44a)。原始的Sp2群体中大约45％是TfR阳性的。将分选的细胞在300g离心10分钟，并悬浮于1ml PBS中，用于进一步实验。收集100ml悬浮的TfR+-分选的细胞用于纯度分析，如图44b所示。得到TfR+分选的细胞的99.5％纯度。在细胞分选以后，将Sp2细胞系的TfR+细胞用于进一步的实验，或置于在标准培养条件下的培养物中，并标记为TfR-富集的Sp2细胞。
1.2.从原代癌细胞选择细胞作为癌基因来源
作为一个实例，下面的方法描述了从急性髓细胞性白血病(AML)患者得到的骨髓样品的髓性谱系选择转化的细胞。相同的方法也适用于从对应的血液恶性肿瘤的骨髓样品选择其它谱系的细胞。
在知情同意以后，从AML患者得到骨髓抽吸物。从患者提取样品，所述患者在进行实验以前已经确诊AML。使用与第1.3.1部分所述相同的密度梯度离心程序，分离出AML单核的细胞，并使用FACS，从样品分选或分离CD34+细胞。
为了染色或标记上面得到的单核的细胞，将10μl小鼠抗-人CD34-PE抗体(BDPharmingen)或PE同种型对照抗体(BD Pharmingen)添加到1x106单核的细胞在染色培养基(PBS+5％BSA)中的100μl给定的等分试样中。对于给定的等分试样，在冰上温育染色混合物30分钟。将10ml冰冷的染色培养基添加到细胞沉淀中，并在350g和4℃离心7min。抽吸上清液，然后通过轻打管，重新悬浮细胞沉淀，向其中添加同等体积的冰冷的染色培养基。将染色的细胞离心，且在冰冷的染色培养基中再洗涤一次。将标记的细胞悬浮于染色培养基中，并应用FACS。在设定CD34+细胞群体的适当分选门以后，收集细胞级分。
对于富集培养物，将40x103细胞的CD34+-富集的细胞铺平板于用合成的胞外基质预包被的12孔板中。在补加了57mMβ-巯基乙醇(Sigma)、1mM氢化可的松和20ng/ml人IL-3和人G-CSF的完全TC培养基中，增殖细胞。培养48小时以后，使用FACS，针对CD15表达来进一步选择细胞。
对于荧光-细胞染色，使用小鼠抗-人CD15-FITC(BD Pharmingen)和小鼠抗-人CD34-PE(BD Pharmingen)，且也采用在在该部分前面的内容中描述的类似的细胞染色方法。使用FACS，分析染色的样品。在为CD34和CD15阳性的细胞群体(CD34+CD15+)或为CD34阳性和CD15阴性的细胞群体(CD34+CD15-)设定适当的分选门以后，收集级分。
培养48小时以后CD15在CD34+AML细胞上的表达的概况显示于图3中。大约54％的AML单核的细胞被测试为CD15阳性的，同时维持它们的CD34表达，而细胞群体的剩余部分保持它的CD34表达，没有定型为骨髓单核细胞谱系。在该实验中使用CD34+CD15+细胞，用于确立三杂交体。
1.3.原代细胞
原代细胞可以源自任意淋巴组织，诸如外周血、脐带血、脾、骨髓、胸腺、扁桃体和局部淋巴结。作为第一步，处理所有淋巴组织，以分离单核的细胞。
1.3.1.从骨髓、外周血或脐带血分离人单核的细胞
在知情同意以后，从健康个体收集外周血样品。将每个血液样品收集在肝素化(heparinised)的管(Vacutainer,BD)中，合并，并在RPMI1640中稀释。
从经历骨髓活组织检查且具有正常骨髓、没有任何血液异常的患者，得到人骨髓抽吸物。以1:3的比例，用RPMI1640稀释样品。
在知情同意以后，从正常的足月产道分娩，得到人脐带血样品。在分娩婴儿和结扎脐带以后，在娩出胎盘之前，用肝素化的60ml注射器，收集每份脐带血。在RPMI1640中稀释每份样品。
通过在Ficoll-Paque(Amersham Pharmacia)上的密度离心，制备外周血单核细胞(PBMC)、骨髓单核的细胞(BMMC)和脐带血单核的细胞(UCBMC)。简而言之，使用附着至20ml注射器的套管，在20ml细胞悬浮液下，分层10ml Ficoll-Paque。在1,700rpm(700g)在4℃离心样品细胞40分钟。收集在界面中的细胞，且通过在2,000rpm(1,000g)离心10分钟，在50mlRPMI1640中洗涤。抛弃上清液，将沉淀的细胞重新悬浮于40ml RPMI1640中，并在1,300rpm(400g)离心10分钟。如下分别取出红血细胞和血小板：用0.83％(wt/vol)NH4Cl裂解，并在用PBS以1:2比率稀释的Ficoll-Paque上进行第二次离心。
分离的单核的细胞用于培养或分析，并通过FACS或磁珠分离系统，分选成细胞特异性的级分。
1.3.2.从实体淋巴组织分离人单核的细胞
下面的方法描述了在本发明中使用的从脾、胸腺、扁桃体或局部淋巴结分离单核的细胞的程序。也给出了用于细胞染色和分选的方法。
遵循国家伦理方针，从器官移植供体得到脾样品。在分离脾细胞之前，将各自大约2x 2x 3cm的脾块于4℃保存在RPMI 1640中。使用注射器的柱塞，穿过无菌筛目，将每个块切成小块。然后通过用在完全培养基中的20U/ml VII型胶原酶(Sigma)和20U/ml DNA酶(Sigma)在室温消化30分钟，酶促地解离细胞。通过添加EDTA达到10mM，并在室温搅拌5分钟，进一步解离细胞团块。然后用完全培养基洗涤脾细胞2次，以停止酶促消化，并重新悬浮于RPMI 1640中。与非酶促解离程序(McIlroy等人1995)相比，这些条件不影响表面分子表达。通过在第1.3.1部分中描述的密度梯度离心(但是红血细胞的取出除外)，从这些脾细胞悬浮液分离脾单核的细胞。将脾单核的细胞重新悬浮于RPMI1640中，且将细胞浓度调节至1x106细胞/ml。通过锥虫蓝排除，测得细胞生存力超过98％。
在他们的父母知情同意以后，从经历心脏外科手术的儿童获得胸腺。如下从胸腺分离出胸腺细胞：破裂胸腺组织，并使用填充了RPMI1640培养基的注射器，冲洗胸腺细胞脱离组织。通过上述的密度梯度-离心，纯化胸腺细胞。
在知情同意以后，从因为炎性病症而经历扁桃体切除术的患者得到扁桃体。将组织样品保存在冰上的完全培养基和250μg/ml庆大霉素中，并在3小时内处理。在去除上皮层以后，将扁桃体组织切成块，并通过截断转移移液管，轻轻抽吸组织块。然后使用与前面在脾单核细胞的分离中所述相同的程序，分离扁桃体细胞。
1.3.3.从源自各种组织的单核的细胞分离谱系特异性的原代细胞
使用FACS分析和细胞分选或磁性细胞分选，通过标准程序，分离B淋巴谱系、T淋巴谱系和髓谱系的人细胞。下面给出了用于从各种组织分离谱系特异性的原代细胞的细胞染色和分选的非限制性实例。
1.3.3.1.从人脾和外周血分离B细胞、辅助T细胞和骨髓单核细胞
如第1.3.1部分所述，初步处理组织样品，以提取单核的细胞群体。然后在分离单核的细胞群体的4小时内，进行荧光-细胞染色，继之以细胞分选。在标准培养条件下(参见第1.1部分)，将细胞悬浮于完全培养基中，直到染色。
1.3.3.1.1.源自各种组织的原代成熟B细胞、效应T细胞和骨髓单核细胞的细胞染色和分选
下面是来自原代细胞的B和T细胞的染色和分选的实例。通常，B细胞和辅助T细胞的选择分别基于CD19和CD4的表面表达，而骨髓单核细胞的选择是基于CD14和/或CD16的表面表达。
简而言之，将各10μl的小鼠抗-人CD19-FITC抗体(BD Pharmingen)和小鼠抗-人CD4-PE抗体(BD Pharmingen)或适当的同种型对照添加到单核的细胞在染色培养基(PBS+5％BSA)中的100μl等分试样中，每份等分试样含有1x105细胞。对于单核的细胞群体的给定的等分试样，在冰上温育染色混合物30分钟。将10ml冰冷的染色培养基添加到染色混合物中，且在350g和4℃离心7分钟。抽吸上清液，且然后通过轻打管，重新悬浮细胞沉淀，向其中添加同等体积的冰冷的染色培养基。将染色的细胞离心，且在冰冷的染色培养基中再洗涤一次。对于其它等分试样，重复该过程。使用FACS，分析染色的细胞。对于每个样品，分析至少20,000个门控的事件。在为CD19阳性的B细胞群体(CD19+CD4-)或为CD4阳性的T细胞群体(CD4+CD19-)设定适当的分选门以后，收集级分。收集1ml每个级分用于纯度分析，并将每个级分的剩余部分重新悬浮于完全培养基中，用于进一步实验。
1.3.3.1.2.分选的细胞群体的回收和分析
使用适当的衔接头，将少数细胞(≤5×105细胞)直接地分选进微量离心管中。在分选之前，向回收管中添加小体积(0.1-0.2ml)的补料RPMI1640，以与分选的样品混合，并提高分选的细胞的生存力。在分选以后，只要回收的细胞的数目允许，用染色培养基以1:10稀释20μl每个分选的细胞样品用于重新分析，以验证它的纯度。可接受的纯度是≥95％。添加另外20-40μl FCS/ml的分选的样品，且随后在350g、4℃离心7min。然后将细胞重新悬浮于标准的组织培养基中。如果可得到足够的细胞，则对它们计数，以测定得率。
用抗-人CD19-FITC和抗-人CD4-PE标记的脾样品的FACS概况示于图11a，而分选的CD19+B细胞和CD4+T细胞的纯度分析的概况示于图11b和11c(参见KBT杂交体表征)。级分中的细胞纯度超过98％(对于CD19+细胞而言)和96％(对于CD4+细胞而言)。
来自外周血的CD19+和CD4+细胞的分选和纯度概况与来自脾样品的那些基本上类似，仅得到更少数目的每种细胞群体。
对于人单核细胞和骨髓单核细胞的分离，首先根据生产商的说明书，使用人CD14磁珠MACS(Miltenyi Biotec GmbH)，排除单核的细胞群体中的CD14阴性的细胞。用小鼠抗-人CD16-PE(BD Pharmingen)和小鼠抗-人CD14-PerCP(BD Pharmingen)抗体，进一步染色或标记阳性地选择的CD14细胞。上面已经描述了细胞染色和分选以及回收分选的细胞的方法(参见第1.3.3.1.1部分和第1.3.3.1.2部分)。
使用FACS，分析染色的样品。分析至少20,000个门控的事件。使用MACS珠关于CD14阳性选择的总细胞中的大约86％是CD14阳性的。基于CD16的表达，将CD14+群体进一步分成3个组：代表大部分CD14+细胞的CD14HCD16-；CD14HCD16L和CD14HCD16H细胞的少数群体。级分中的细胞纯度超过98％(对于CD14HCD16-而言)、96％(对于CD14HCD16L而言)和92％(对于CD14HCD16H而言)。在设定适当的分选门以后，收集下述细胞群体：CD14HCD16-、CD14HCD16L和CD14HCD16H细胞级分。图4显示了用小鼠抗-人CD16-PE和小鼠抗-人CD14-PerCP标记的CD14富集的样品的FACS概况。
来自脾组织的CD14+细胞的细胞分选和纯化的方法与来自外周血样品的那些基本上相同，但是得到更少数目的每个细胞群体。
1.3.3.2.从人脐带血分离CD5阳性的(抗原处理过的)B细胞和CD5阴性的(幼稚)B细胞
如在第1.3.1部分中所述，从脐带血样品制备单核的细胞。在单核的细胞群体分离的4小时内，进行荧光-细胞染色，继之以细胞分选。在该具体实施例中，根据前面(第1.3.3.1.1部分)所述的方法，使用小鼠抗-人CD5-FITC抗体(BD Pharmingen)、小鼠抗-人CD19-PE抗体(BD Pharmingen)或适当的同种型对照，从人脐带血分选CD5阴性的(幼稚)B细胞和CD5阳性的(抗原处理过的)B细胞。
使用FACS，分析染色的样品。对于每个样品，分析至少20,000门控的事件。在为CD5阴性的B细胞群体(CD19+CD5-)或为CD5阳性的B细胞群体(CD19+CD5+)群体设定适当的分选门以后，收集许多级分。图5显示了用小鼠抗-人CD19和小鼠抗-人CD5染色的样品的典型概况。
样品中B细胞的百分比范围是4-19.2％，且CD5+B细胞占总循环的淋巴细胞的0.8-7.2％。
1.3.3.3.从人脐带血分离CD5阳性的(抗原处理过的)T细胞和CD5阴性的(幼稚)T细胞
使用与在第1.3.1部分中所述类似的方法，从脐带血样品提取单核的细胞。在单核的细胞群体分离的4小时内，进行荧光-细胞染色，继之以细胞分选。在该具体实施例中，根据前面(第1.3.3.1.1部分)所述的细胞方法，使用小鼠抗-人CD5-FITC抗体(BDPharmingen)、小鼠抗-人CD3-PE抗体(BD Pharmingen)或适当的同种型对照，从人脐带血分选CD5阳性的(抗原处理过的)T细胞和CD5阴性的(幼稚)T细胞。使用FACS，分析染色的细胞。分析至少20,000门控的事件。设定分选门，以收集含有CD5阴性的T细胞(CD3+CD5-)或CD5阳性的T细胞(CD3+CD5+)的级分。图6显示了用小鼠抗-人CD3和小鼠抗-人CD5抗体染色的样品的典型概况。
回收和分析分选的群体
实际上，用于回收和分析分选的群体的相同方法已经描述在第1.3.3.1.2部分中。
样品中T细胞的百分比范围是1.7-13.5％，且CD5+T细胞占总循环的淋巴细胞的0.4-1.3％。
1.3.3.4.基于CD 20和CD 72表达从人骨髓单核的群体分离早期B细胞、活化的和静息B细胞
使用前面(第1.3.1部分)所述的方法，从骨髓提取单核的细胞。在单核的细胞群体分离的4小时内，进行荧光-细胞染色，继之以细胞分选。活化的B细胞的染色和分选以前描述在第1.3.3.1.1部分。具体地，使用10μl小鼠抗-人CD72-FITC抗体(BD Pharmingen)和20μl小鼠抗-人CD20-PE抗体(BD Pharmingen)或适当的同种型对照(PE小鼠IgG2b,κ抗体)。使用FACS，分析染色的细胞。设定分选门，以收集含有下述群体的级分：包含前B细胞、静息和活化的B细胞、滤泡树突细胞的CD20阳性群体(CD20+CD72-)，或包含早期B细胞(CD20-CD72+)或活化的B细胞(CD20+CD72+)的CD72阳性的细胞群体。图7显示了用小鼠抗-人CD20和小鼠抗-人CD72抗体染色的样品的典型概况。
回收和分析分选的群体
实际上，将在第1.3.3.1.2部分中描述的相同方法用于回收和分析分选的群体。
通常，骨髓单核的细胞群体中的大约10-15％是CD20和CD72阳性的；9-12％的细胞是CD20阳性的，但是CD72阴性的；且仅大约8％是CD72阳性的。
1.3.3.5.通过磁珠分选分离出胸腺细胞亚群
使用MACS CD4Multisort试剂盒(Miltenyi Biotec GmbH)，根据生产商的说明书，分选CD4-CD8-双阴性的胸腺细胞、CD4+CD8+双阳性的胸腺细胞和CD4+和CD8+单阳性的胸腺细胞群体。简而言之，与CD4Multisort CD4微珠一起，温育使用与在第1.3.2部分中所述类似的方法收集的胸腺细胞30分钟。用在PBS中的5mM EDTA和0.5％BSA洗涤以后，在磁性柱上分离标记的细胞。阳性选择的胸腺细胞(其保持在磁性柱上)含有CD4+单阳性的和CD4+CD8+双阳性的细胞群体，而CD4排除的细胞群体(其通过柱洗脱)含有CD8+单阳性的和CD4-CD8-双阴性的细胞。为了从CD4阳性地选择的细胞群体去除微珠，将细胞与MACS Multisort释放试剂温育。20分钟以后，停止消化，且用CD8微珠标记细胞30分钟。通过阳性选择，得到CD4+CD8+双阳性的胸腺细胞，而CD4+单阳性的细胞存在于排除的细胞群体中。将CD4排除的细胞群体与CD8微珠温育30分钟。在将标记的细胞应用于磁性柱以后，CD8+单阳性的细胞可以与CD4-CD8-双阴性的胸腺细胞分离开。通过流式细胞术分析，评价4个不同的胸腺细胞亚群的纯度。可接受的纯度是超过95％。
1.3.3.6.从人扁桃体分离CD54+T细胞。
使用在第1.3.2部分中所述的方法，从人扁桃体提取单核的细胞。在单核的细胞群体分离的4小时内，进行荧光-细胞染色，继之以细胞分选。使用小鼠抗-人CD3-PE抗体(BDPharmingen)和小鼠抗-人CD54-FITC抗体(BD Pharmingen)或适当的同种型对照，从单核的扁桃体细胞群体提取CD54+T细胞(细胞间粘附分子-1或ICAM-1)，使用在第1.3.3.1.1部分中所述的细胞染色/分选方法进行选择。使用FACS，分析染色的细胞。设定分选门，以收集含有CD3+T细胞(即CD3+CD54-细胞)或活化的CD54+T细胞(即CD3+CD54+细胞)的级分。图8显示了用小鼠抗-人CD3和小鼠抗-人CD54抗体染色的样品的FACS概况。使用CD3+细胞产生跨谱系三杂交体，而CD54+活化的T细胞用于表达实验。
结果表明，尽管T细胞占从扁桃体分离的单核的细胞的大多数(82％)，但仅9％是CD54+T细胞。
1.3.4小鼠单核的细胞的分离
将8-12周龄的BALB/c小鼠维持在无特定病原动物设施中。在组织提取之前，通过CO2暴露，对小鼠实施安死术。通过腋动脉或股动脉穿刺，得到外周血，并收集在肝素包被的管中。使用与在第1.3.1部分中关于人外周血单核的细胞的分离所述相同的规程，分离单核的细胞群体。机械地破裂小鼠脾，并使用在第1.3.2部分中所述的人脾单核的细胞的分离的程序，分离单核的细胞。
1.3.5.从小鼠单核的细胞分离谱系特异性的原代细胞
使用FACS分析和细胞分选或磁性细胞分选，通过标准程序，分离T淋巴谱系和髓谱系的小鼠细胞。下面给出了用于分离谱系特异性的原代小鼠细胞的细胞染色和分选的非限制性实例。
1.3.5.1.从小鼠脾和外周血分离效应T细胞
不同的效应T细胞的选择基于CD4和CD8的表面表达。
将10μl每种小鼠抗-小鼠CD4-PE抗体(BD Pharmingen)和大鼠抗-小鼠CD8-FITC抗体(BD Pharmingen)或适当的同种型对照添加到脾或外周血单核细胞在染色培养基(PBS+5％BSA)中的100μl等分试样中，每份等分试样含有1x105细胞。对于单核的细胞群体的给定的等分试样，在冰上温育染色混合物30分钟。将10ml冰冷的染色培养基添加到染色混合物中，且在350g和4℃离心7分钟。抽吸上清液，且然后通过轻打管，重新悬浮细胞沉淀，向其中添加同等体积的冰冷的染色培养基。将染色的细胞离心，且在冰冷的染色培养基中再洗涤一次。对于其它等分试样，重复该过程。使用FACS，分析染色的细胞。对于每个样品，分析至少20,000个门控的事件。染色的小鼠外周血和脾单核的细胞的典型FACS概况分别显示于图45(a)和45(b)中。淋巴组织含有单阳性的CD4或CD8T细胞和双阳性的T细胞，但是细胞表现存在差异。例如，外周血中的最大群体含有CD8+CD4-细胞毒性T细胞(43％)，而单核的脾细胞主要表现为CD4+CD8-辅助或调节T细胞(42％)。在为CD4阳性群体(区域R1)、为CD8阳性群体(区域R3)或为双阳性的细胞群体(区域R2)设定适当的分选门以后，收集级分。收集1ml每个级分用于纯度分析，并将每个级分的剩余部分重新悬浮于完全培养基中，用于进一步实验。每个级分的纯度大于98％。
1.3.5.2.从小鼠外周血分离单核细胞
通过使用磁珠(Miltenyi Biotec)的负选择，从外周血单核群体分离小鼠单核细胞。将单核的细胞悬浮于磁性细胞分选缓冲液(PBS,01％wt/vol BSA,和0.5mM EDTA)中，并根据生产商的规程，与包括针对T细胞(CD90)、B细胞(B220)和NK细胞(CD49b)的抗体的抗体微珠(MicroBeads)混合物一起温育。然后将细胞通过LD-负选择柱运行。收集阴性的(单核细胞)级分。为了测定纯度，用PE缀合的针对CD11b的抗体和FITC缀合的针对CD90、B220、CD49b、NK1.1和Ly6G的抗体(BD Pharmingen)，对细胞染色。将单核细胞鉴别为CD11b+CD90-B220-CD49b-NK1.1-Ly6G-/(低)，并通过FACS验证纯度概况。小鼠单核细胞群体的纯度概况示于图46。100％的细胞是CD11b阳性的，而它们中超过98％是B220、CD90、CD49b和NK1.1阴性的。大约38％的CD11b阳性的细胞在低水平表达Ly6G。
实施例2
2.分泌所需蛋白的原代细胞的产生
在下面的部分中，给出了用于产生分泌所需蛋白的原代人细胞的方法。这些细胞被用于细胞杂交实验，或用作分析实验的对照，或用作在三杂交体表达系统中表达的蛋白的分析参照。
2.1.分泌人GM-CSF的淋巴细胞的产生
首先，通过如在第1.3.1部分中所述的梯度密度离心，分离脐带血淋巴细胞，然后在含有植物凝集素(PHA)的培养物中活化，继之以在IL-2(1000U/ml)中进行细胞增殖。通过ELISA，分析人GM-CSF的生产。生产的浓度范围是15-40ng/ml/106细胞。
将共300,000PHA-活化的人淋巴细胞与根据生产商的说明书的浓度的与FITC缀合的小鼠抗-人CD4抗体(Sigma)在暗处在4℃温育30min。使用FACS(FACS VantageSE,BD)，分析和选择活化的人T细胞。图42(a)显示了PHA-活化的淋巴细胞培养物中CD4+T细胞的典型概况，而图42(b)显示了CD4+分选的细胞的100％纯度。
2.2.分泌IgM和IgG的人淋巴细胞的产生
将纯化的B细胞(参见第1.3.3.1部分)以3.75x105细胞/ml接种在用小鼠抗-人CD154抗体(BD Pharmingen)包被的96圆底孔板(Corning)的孔中。在完全RPMI1640培养基中培养细胞，所述完全RPMI1640培养基补加了10％热灭活的超低IgG FBS(Gibco/BRL)和100U/ml白介素4(IL-4)(R&D systems)，并在培养3天后添加50ng/ml白介素10(IL10)。通过每2-3天更换一半培养基，补充培养物。使用血细胞计数器，通过锥虫蓝排除，一式三份地评价细胞生存力和计数。在第5天和第10天，收获培养的淋巴细胞，在PBS中洗涤2次，并使用小鼠抗-人CD19-PE、小鼠抗-人IgM-FITC或小鼠抗-人IgG-FITC抗体(都来自BD Pharmingen)，通过FACS进行分析。使用1μg每种抗体/1x106细胞，在4℃进行所有染色。在所有分析中，超过95％的细胞是双阴性的(使用根据同种型-匹配的阴性对照染色的标记物集合)。从分析中排除含有死细胞和碎片的区域。通过门控5000-10000活细胞，进行所有分析。
培养的淋巴细胞中IgM和IgG阳性的细胞的典型概况示于图9。在培养5天以后，18％的CD19+细胞是IgM阳性的，且仅1％在表面上具有可检测的IgG，而在10天以后，IgM阳性的淋巴细胞的百分比降低至仅2％，同时IgG阳性的细胞的百分比增加至15％。在设定适当的门以后，分选IgM阳性的和IgG阳性的级分，用于Ig表达实验。
通过标准的ELISA，使用96ELISA孔板和塑料吸附的山羊-亲和纯化的针对人μ和γ链的抗体，测定培养物中的IgM和IgG浓度。用HRP-缀合的绵羊抗-人Ig抗体揭示结合的抗体。所有抗体来自Sigma。将ABTS用作底物，并在405nm测量光密度。表1总结了在5和10天以后在B淋巴细胞培养物中检测到的IgM和IgG水平。
表1
培养时间段 IgM,ng/106细胞 IgG,ng/106细胞
5天 2480±182 850±92
10天 1215±260 1914±101
在培养5天以后，IgM的生产下降，而IgG生产增加。
实施例3
3.体细胞杂交
几种体细胞杂交方法是本领域众所周知的。它们包括、但不限于：例如，使用融合病毒诸如仙台病毒的生物学方法(Kohler和Milstein,1975)，使用聚乙二醇(PEG)的化学方法(Wojciezsyn,等人,1983)，及使用电场的电方法(Neil,和Zimmermann,1993)。每种方法可以诱导或造成目标细胞的质膜可逆地可透过和杂交。
无论采用上述的哪种细胞杂交方法，原则上，为了实现细胞杂交，需要2个基本步骤。首先，必须使要杂交的细胞的质膜发生良好的细胞膜接触。其次，必须同时地诱导质膜在接触点处可逆的破裂。
关于电细胞杂交方法，通过使用具有适当电场频率的交流电电场(AC场)，可以使目标细胞发生良好的细胞膜接触，然后当用AC场使它们同时地暴露于短电脉冲时，诱导杂交。
为了进一步详细地说明，电细胞杂交涉及下述的物理现象：介电电泳(DEP)和浆细胞膜的电破裂。
介电电泳(Pohl,1978)是这样的现象：其描述了介电颗粒(诸如生物细胞)当悬浮于适当的溶液中并施加适当频率的不均匀的AC电场时的运动。已经确定地记载，细胞的运动可以描述为：(i)介电颗粒的平移或迁移，例如，对于悬浮于100mM山梨糖醇中的Sp2细胞，在0.5-2.0兆赫(MHz)之间的电场效率(Mahaworasilpa,1992)，和(ii)介电颗粒的旋转(Mahaworasilpa,1992)，例如对于悬浮于100mM山梨糖醇中的Sp2细胞，在2-10千赫(kHz)之间的电场频率。通过在一对电极(例如，圆柱状电线，其可以排列成许多构型)之间施加电场，可以产生不均匀的场。最广泛使用的构型是平行的电极构型(图58)。在有不均匀的场存在下，DEP可以造成介电颗粒(即生物细胞)彼此吸引，并同时向最强场的区域迁移。结果，它形成细胞的链或串，并又诱导良好的细胞膜接触。显而易见，当将细胞悬浮于适当的低导电性溶液中时，强烈地促进细胞的相互吸引。
当将悬浮于合适的杂交溶液中的细胞暴露于具有适当脉冲振幅和宽度的电脉冲时，可以诱导细胞膜的电破裂(Zimmermann,1982)。广泛地使用一定范围的脉冲宽度，例如，1-200微秒(μsec)的矩形脉冲，这取决于要杂交的细胞的类型。
3.1.电细胞杂交系统
在本发明的某些实施方案中，电细胞技术可以用于产生杂交的细胞，诸如三杂交体。
3.1.1.细胞操作系统
为了在细胞杂交之前操作个别目标细胞，在本发明自始至终使用在前面(第1.1.1部分)描述的单细胞操作/递送系统。
3.1.2.微电极
在本发明中，使用2个L-形微电极。图57显示了直径为128μm的、由未包被的镍合金制成的微电极(7)。微电极的轴被外径为1.5mm的血细胞比容毛细管(8)覆盖。微电极的L-形部分(9和10)构造成允许电极的水平段和垂直段的表面的相容区域暴露于培养基或适当的溶液中(Mahaworasilpa,1992)。在细胞杂交过程之前，将2个微电极安装在2个精致的显微操作器上，每个显微操作器安装一个微电极。以得到每个电极的平行电极构型的方式，排列这些微电极(图58)。每个精致的显微操作器由液压驱动，并允许在X、Y或Z方向做出精细至0.5μm的运动。
3.1.3.细胞室和构型
图59显示了在标准的96-孔TC板的孔中的2个平行的电极，在本发明的某些实施方案中，所述孔用作细胞杂交室。为了进行细胞杂交，将微电极浸没在适当的培养基(11)中，所述培养基包含在标准的96-孔组织培养板的孔(12)内。图60和图61分别显示了平行的电极构型的顶视图和侧视图，其中，将例如3个预选择的要杂交的细胞放在平行的电极之间，其方式使得它们在有适当AC电场存在下可以被诱导列成一行或形成细胞链。
实施例4
4.通过电细胞杂交方法生产跨谱系三杂交体的实施例
下面的部分提供了产生三杂交细胞系的实施例，所述三杂交细胞系通过杂交来自不同的谱系或细胞类型的细胞、或来自相同的谱系/或细胞类型但是具有不同表型的细胞而得到。对每个稳定的三杂交体进行分析，以证实它同时具有亲本细胞的表型特征。所述证实基于谱系特异性的细胞表面标记物的分析、谱系特异性的标记物的细胞内表达、谱系特异性的标记物的RNA转录物的存在、核型分析和/或谱系特异性的蛋白的分泌。下面的实施例例证了跨谱系三杂交体的最典型的表型特征。但是，这些实施例绝不限于选择的特定标记物。
4.1.从源自髓谱系、T淋巴谱系和B淋巴谱系的3个无限增殖细胞生产跨谱系三杂交体——KMW。
通过杂交1个髓样K562细胞、1个T淋巴样MOLT4细胞和1个B淋巴样WIL2NS细胞，产生这类跨谱系三杂交体。这样得到的跨谱系三杂交体被标记为KMW系(继之以它的系列号)。下面描述了在本发明中使用的KMW跨谱系三杂交体生产的过程的下述步骤、溶液(杂交培养基、培养培养基和恢复培养基)和参数。
4.1.1.用于KMW跨谱系三杂交体生产的细胞制备
在我们的标准培养基(参见第1.1部分)中，培养K562、WIL2NS和MOLT4细胞系。作为惯例，每3天传代每个细胞系。在细胞杂交之前，使用在第1.1.2部分中描述的程序，确立每个细胞类型的稳定克隆，其具有最高增殖速率。在有些实验中，使用如在第1.1.3部分中所述确立的CD71+-富集的细胞群体。同样，在一些场合，使用CD71+-富集的K562群体的CD15+细胞(第1.1.3.1部分)。
4.1.2.用于KMW跨谱系三杂交体生产的细胞杂交规程
将TC 96-孔板的几个孔用作细胞杂交孔。给每个孔装填大约150μl杂交培养基，其由240mM山梨糖醇(Sigma)、2.0mM KH2PO4(Sigma)、0.4mM CaCl2(Sigma)、0.2mM Mg(C2H3O2)2(Sigma)和0.2mM Ca(C2H3O2)2(Sigma)组成，并补加了0.2％牛血清清蛋白BSA(Sigma)。在电细胞杂交之前，在杂交培养基中洗涤每个细胞类型的预选择的克隆的细胞一次，进行几分钟，并转移至含有新鲜的杂交培养基的孔中。该孔被命名为预杂交孔。在细胞杂交过程之前，根据第1.1.1部分，操作每个选择的克隆的单个且洗过的细胞，从而使得仅3个细胞(一个细胞来自一个选择的克隆)位于一对相同的平行的电极之间，所述电极浸没至孔底(如图61所示)。电极的间距设定为400微米(即400μm)。
为了实现电细胞杂交，首先，在电极之间施加交流电(AC)场几秒，所述交流电场具有0.8MHz的频率和大约50-60千伏/米(例如50-60kV/m)的场强，直到3个细胞被介电电泳DEP诱导成彼此吸引，并形成细胞串。该过程造成细胞产生良好的细胞膜接触。以使K562细胞处于细胞排列的中间的方式，排列细胞(参见图60或61)。然后，用AC场同时施加2个矩形电脉冲，在脉冲之间时间间隔3秒。使用具有大约170kV/m的强度和75微秒(例如75μsec)的脉冲宽度的每个脉冲。在第二个矩形脉冲结束以后，使AC场保持连续另外5秒，从而导致细胞杂交成单个跨谱系三杂交的细胞。对于本发明的某些实施方案，观察到，3个细胞的杂交可能不同时地发生，即经常先发生3个细胞中的2个的杂交，然后与第三个细胞杂交。在有些情况下，需要额外的矩形脉冲来达到完全的3细胞杂交。然后将新产生的跨谱系三杂交细胞从杂交孔转移至恢复孔，后者位于与杂交孔不同的行中。每个恢复孔含有150μl标准的TC培养基(参见第1.1部分)。在湿润的培养箱(运行在37℃和5％CO2含量)中，温育每个新确立的跨谱系三杂交细胞7天，每个恢复孔一个跨谱系三杂交细胞。发现大多数跨谱系三杂交体在细胞杂交事件以后的36小时内分裂。在温育时间段结束时，用新鲜的标准培养基适当地补充每个恢复孔中的培养基。这刺激每个跨谱系三杂交体克隆的细胞增殖。2或3天以后，从每个恢复孔鉴别出分裂的细胞或存活的细胞，并铺平板进标准的24-孔TC板的孔中，产生一组跨谱系三杂交体克隆。在24-孔板中培养每个跨谱系三杂交体克隆另外一周，然后转移进25cm2TC瓶，该瓶含有10毫升(ml)我们的标准的培养基(参见第1.1部分)，并适当地标记，用于进一步分析。为了产生一批稳定的跨谱系三杂交细胞，重复电细胞杂交和跨谱系三杂交体恢复过程的整个过程许多次。
4.1.3.KMW跨谱系三杂交体状态的确认
CD标记物的表达
下面给出了确立的KMW跨谱系三杂交细胞系的确认实施例。
在已经在正常培养条件下确立KMW跨谱系三杂交细胞系6个月以后，分析跨谱系三杂交细胞群体的谱系特异性的CD标记物的表达。
使用三色FACS分析来验证下述CD标记物的共表达：源于WIL2NS的CD19、源于K562的CD15和源于MOLT4的CD4。
简而言之，以1x106细胞/ml的浓度，将100μl在含有5％BSA的PBS中的KMW跨谱系三杂交细胞悬浮于100μl PBS中，并在4℃与0.5mg/100ml小鼠抗-人CD15-PerCP、0.25mg/100ml小鼠抗-人CD4-PE和1.0mg/100ml小鼠抗-人CD19-FITC抗体或适当的同种型对照一起温育30min。从BD Pharmingen得到所有小鼠抗-人抗体。在用PBS充分洗涤以后，使用FACSCalibur流式细胞仪和CellQuest Pro软件，分析标记的细胞。
图10显示了KMW跨谱系三杂交细胞系的FACS概况，其间接表明，KMW跨谱系三杂交细胞(其中谱系特异性的特征来自无限增殖的表型)含有混合表型的异质细胞群体，其中髓样表型是优势的。但是，62％的KMW细胞具有髓样表型和T淋巴样表型，且28％的KMW细胞表达T淋巴样表型和B淋巴样表型。
4.2.从1个无限增殖的髓样细胞和2个原代淋巴样细胞生产跨谱系三杂交体——KBT
通过1个髓样K562细胞、1个原代人B细胞和1个原代人T细胞的体细胞杂交，产生跨谱系三杂交体。所述跨谱系三杂交体被称作KBT继之以系列号。
4.2.1.用于KBT跨谱系三杂交体生产的细胞制备
在前面(第4.1.1部分)已经描述了在产生KBT跨谱系三杂交体之前制备K562细胞。在KBT跨谱系三杂交体的产生中使用的原代细胞包括：(i)源自脾、外周血或脐带血的成熟的B细胞(CD19+)；源自骨髓的早期B细胞(CD20-CD72+)；源自骨髓的活化的B细胞(CD20+CD72+)；抗原处理过的源自脐带血的B细胞(CD19+CD5+)，和(ii)源自脾、外周血、脐带血和胸腺的辅助T细胞(CD4+)，源自脾、外周血、脐带血和胸腺的细胞毒性T细胞(CD8+)；抗原处理过的源自脐带血的T细胞(CD3+CD5+)；源自脐带血的CD3+T细胞；源自胸腺的双阴性的T细胞(CD3+CD4-CD8-)，源自胸腺的双阳性的T细胞(CD3+CD4+CD8+)，将它们用于实验中。在前面在第1.3部分中已经描述了来自各种淋巴组织的各种原代淋巴样细胞的分离。
4.2.2.用于KBT跨谱系三杂交体生产的细胞杂交规程
用于KBT跨谱系三杂交体生产的细胞杂交规程类似于用于KMW跨谱系三杂交体生产的规程(第4.1.2部分)，但是培养基和AC电场和脉冲不同。在这些实验中使用的杂交培养基由230mM山梨糖醇、1.8mM KH2PO4、0.5mM CaCl2、0.2mM Mg(C2H3O2)2和0.3mM Ca(C2H3O2)2组成，补加了0.3％BSA。同时施加0.5MHz和65-75kV/m的AC场，其具有3秒时间间隔的3个矩形脉冲串，每个矩形脉冲具有100μsec的脉冲宽度和175-185kV/m的强度。在第三个矩形脉冲结束以后，将AC场连续接通另外5秒，从而导致细胞的杂交，以生产跨谱系三杂交细胞。在第4.1.2部分中描述了该新形成的跨谱系三杂交细胞的稳定系的回收和确立的规程。
4.2.3.KBT跨谱系三杂交体状态的确认
CD标记物在细胞表面上的表达
从1个无限增殖的髓样(K562)细胞、1个原代成熟的B细胞和1个原代效应T辅助细胞确立的KBT跨谱系三杂交细胞系
在例如已经在正常培养条件下确立跨谱系三杂交细胞系几个月以后，分析该细胞系的谱系特异性的CD标记物的表达。使用与杂交之前在细胞制备中所述相同的规程(第1.3.1.1部分)，用小鼠抗-人CD19和CD4抗体标记KBT细胞系的细胞。图11(d)显示了从1个无限增殖的骨髓单核细胞和2个原代细胞确立的KBT跨谱系三杂交细胞系的FACS概况(CD19和CD4标记)。一般，这样的稳定的跨谱系三杂交体中超过95％的细胞表达B和T细胞的CD标记物，具有与亲本、原代细胞类似的密度。
从1个无限增殖的髓样细胞(K562)和2个原代抗原处理过的淋巴样细胞(B和T细胞)确立的KBT跨谱系三杂交细胞系
在另一个实施方案中，确立了源自1个K562细胞、1个抗原处理过的B细胞和1个抗原处理过的T细胞的细胞杂交的KBT细胞系。使用FACS，分析细胞的CD19、CD3和CD5的共表达。
简而言之，使用与细胞杂交之前在细胞制备中相同的规程(第1.3.1.1部分)，用小鼠抗-人CD5-FITC和小鼠抗-人CD19-PE或小鼠抗-人CD4-PE抗体标记细胞。图12显示了这样的KBT跨谱系三杂交细胞系的细胞的FACS概况。结果表明，5-10％的KBT细胞群体通过维持CD5分子的细胞表面表达，同时是CD3和/或CD19阳性的，来保持它的抗原暴露记忆。同样，CD5阴性的细胞群体中的至少83％共表达B谱系(CD19)和T谱系(CD3)标记物。
从1个无限增殖的髓样细胞(K562)、1个活化的B细胞和1个原代双阳性的未定型的效应T细胞确立的KBT跨谱系三杂交细胞系
在另一个实施方案中，确立了源自1个K562、1个分离自胸腺的T细胞(CD4+和CD8+双阳性的)和1个分离自骨髓的活化的B细胞(CD20+和CD72+)(在第1.3.34部分中解释)的细胞杂交的KBT细胞系。关于CD4、CD8、CD20和CD72在细胞表面上的共表达，分析细胞。
简而言之，使用与关于原代淋巴细胞的分离所述的相同规程(第1.3.3.1.1部分)，用小鼠抗-人CD4-PE和小鼠抗-人CD72-FITC抗体、或小鼠抗-人CD20-PE和小鼠抗-人CD8-FITC抗体、或小鼠抗-人CD4-PE和小鼠抗-人CD8-FITC抗体的抗体组合，标记KBT跨谱系三杂交细胞。图13显示了这样的跨谱系三杂交细胞的FACS概况。
结果(参见图13)表明，99％的KBT跨谱系三杂交细胞在它的表面上表达双阳性的T细胞衍生的CD4或CD8中的任一种，其中66-71％的细胞是CD4阳性的，且88-89％的细胞是CD8阳性的。在这些细胞的60％中，CD4和CD8的表达是并行的。在是源自双阳性的胸腺细胞的CD4阳性的同时，61％的细胞也是源自骨髓的活化B细胞的CD72阳性的。但是，跨谱系三杂交体群体中的94％在它们的表面上表达CD72。另一方面，31％的CD8阳性的跨谱系三杂交细胞共表达CD20。CD20阳性的细胞的总数是39％。
4.3.从1个无限增殖的淋巴样细胞、1个原代淋巴样细胞和1个原代骨髓单核细胞生产跨谱系三杂交体——WTM
这是从1个无限增殖的人B淋巴样细胞(WIL2NS)、1个原代人T细胞和1个原代人单核细胞产生跨谱系三杂交细胞系的实施例。跨谱系三杂交体系被标记为WTM继之以系列号。
4.3.1.用于WTM跨谱系三杂交体生产的细胞制备
在前面在第4.1.1部分中描述了在WTM跨谱系三杂交体的产生中使用的WIL2NS细胞的制备。原代细胞包括：源自脾和外周血的CD14+CD16-或CD14+CD16L单核细胞；源自脾、外周血、脐带血和胸腺的辅助T细胞(CD4+)；源自脾、外周血、脐带血和胸腺的细胞毒性T细胞(CD8+)；源自脐带血的抗原处理过的T细胞(CD3+CD5+)和CD3+T；源自胸腺的双阴性的T细胞(CD3+CD4-CD8-)和双阳性的T细胞(CD3+CD4+CD8+)，它们用于这些实验中。在前面(第1.3.3部分)已经描述了从各种淋巴组织分离各种原代淋巴样细胞。在某些实施方案中，使用源自骨髓的CD34+CD15+骨髓单核祖细胞替代CD14阳性的单核细胞。
4.3.2.用于WTM跨谱系三杂交体生产的细胞杂交规程
用于WTM跨谱系三杂交体生产的细胞杂交规程类似于用于KMW跨谱系三杂交体生产的规程(参见第4.1.2部分)，但是培养基不同。在这些实验中使用的杂交培养基由235mM山梨糖醇、1.8mM KH2PO4、0.5mM CaCl2、0.3mM Mg(C2H3O2)2和0.25mM Ca(C2H3O2)2(Sigma)组成，并补加了0.3％BSA。使用完全如第4.2.2部分所述的电规程，生产WTM。在第4.1.2部分中描述了该新形成的跨谱系三杂交细胞的稳定系的回收和确立的规程。
4.3.3.WTM跨谱系三杂交体状态的确认
CD标记物的表达
从1个无限增殖的淋巴样细胞(WIL2NS)、1个原代T细胞和1个原代单核细胞确立的WTM跨谱系三杂交细胞系
确立了源自1个WIL2NS细胞、1个原代T细胞和1个单核细胞的细胞杂交的WTM细胞系。在已经在正常条件(参见第1.1部分)下培养跨谱系三杂交细胞系6个月以后，分析该跨谱系三杂交细胞群体的谱系特异性的CD标记物的表达。使用三色FACS分析，以验证源于WIL2NS的CD19、源于原代单核细胞的CD14和源于原代T细胞的CD4的共表达(当这些原代T细胞被用于杂交时)。
简而言之，以1x106细胞/ml的浓度，将100ml在含有5％BSA的PBS中的WTM跨谱系三杂交细胞悬浮于100μl PBS中，并与标记的单克隆抗体(0.5mg/100ml CD14-PerCP、0.25mg/100ml CD4-PE和1.0mg/100ml CD19-FITC，都来自BD Pharmingen)或适当的同种型对照在4℃温育30min。在用PBS彻底洗涤以后，使用FACSCalibur流式细胞仪和CellQuest Pro软件，分析标记的细胞。
WTM跨谱系三杂交细胞的FACS概况示于图14。尽管源自无限增殖细胞的CD19标记物在跨谱系三杂交细胞群体中的表达水平似乎是一致的，但源于原代细胞的标记物的表达似乎是变化的。在该具体实施例中，基于CD14和CD4表达强度，可以将细胞群体分成3个亚群：(i)CD4HCD14L；(ii)CD4HCD14H；(iii)CD4LCD14H。随后，通过标准技术诸如FACS、MACS或单细胞克隆等，可以分离这些群体中的每一个，并增殖成单独的跨谱系三杂交体培养物，它们形成彼此不同的表型特征，同时维持在培养物中的同质性。
从1个无限增殖的淋巴样细胞(WIL2NS)、1个原代抗原处理过的T细胞和1个原代单核细胞确立的WTM跨谱系三杂交细胞系
当使用CD5+抗原处理过的T细胞来产生WTM跨谱系三杂交细胞系时，通过使用三色FACS分析，验证CD5与CD19和CD14并行的表达。该规程与上面所述的规程基本上相同，但是采用小鼠抗-人CD19-PE和小鼠抗-人CD5-FITC抗体替代小鼠抗-人CD19-FITC和小鼠抗-人CD4-PE抗体。这些CD在跨谱系三杂交细胞上的表达的FACS概况示于图15。分析表明，尽管源自无限增殖细胞且负责B细胞表型的CD19表达水平在细胞群体的约91-99％中似乎是一致的，但源自抗原处理过的T细胞的CD5和源自原代单核细胞的CD14的表达，在WMT杂交细胞中存在差异。仅63％的CD19阳性细胞也是CD5阳性的，且79％的CD19阳性细胞是CD14阳性的。值得注意的是，在这样的WMT跨谱系三杂交细胞中，CD14表达水平从低到高变化。另一方面，所述细胞群体明显地分成CD5+和CD5-跨谱系三杂交细胞。
从1个无限增殖的淋巴样细胞(WIL2NS)、1个原代细胞毒性T细胞和1个原代单核细胞确立的WTM跨谱系三杂交细胞系
当使用细胞毒性的CD8阳性的T细胞来产生WTM跨谱系三杂交体系时，使用与在本部分前面所述相同的三色标记规程，进行FACS分析来验证CD19、CD8和CD14的共表达。图16显示了CD19、CD8和CD14在该WTM跨谱系三杂交细胞系的细胞上的表达的FACS概况。CD19的表达和它的水平在这些WMT跨谱系三杂交细胞中保持恒定，而这些细胞中仅46％在低水平共表达源自原代细胞毒性T细胞的CD8，且41％共表达源自原代单核细胞的CD14。值得注意的是，这些WMT细胞中的CD14表达水平从低到高变化。
从1个无限增殖的淋巴样细胞(WIL2NS)、1个原代双阳性的T细胞和1个原代单核细胞确立的WTM跨谱系三杂交细胞系
当使用源自胸腺的双CD阳性的T细胞(CD4+CD8+)来产生WTM跨谱系三杂交细胞系时，除了分析CD19、CD8和CD14表达以外，还分析CD4和CD8共表达。图17显示了CD4和CD8在跨谱系三杂交细胞系的细胞上的共表达的FACS概况。在该使用双阳性的T细胞的情况下，96％的WTM跨谱系三杂交细胞是CD4和CD8阳性的。CD19和CD14在源自CD4+CD8+阳性的T细胞的WTM跨谱系三杂交细胞上的表达概况，与源自细胞毒性的CD8阳性的效应T细胞的那些WTM跨谱系三杂交细胞基本上类似。
从1个无限增殖的淋巴样细胞(WIL2NS)、1个原代T细胞和1个原代骨髓单核祖细胞确立的WTM跨谱系三杂交细胞系
当使用源自骨髓的CD34+CD15+骨髓单核细胞来产生WTM跨谱系三杂交细胞系时，分析了CD19(B谱系)、CD3(T谱系)、CD15(髓谱系)和CD34(祖细胞)的表面标记物。简而言之，用小鼠抗-人CD19-PE、小鼠抗-人CD4-FITC(BD Pharmingen)和小鼠抗-人CD15-PerCP抗体的组合，或用小鼠抗-人CD34-PE、小鼠抗-人CD4-FITC和小鼠抗-人CD15-PerCP抗体的组合，标记该WMT跨谱系三杂交细胞系的细胞。根据前面(第1.3.3.1.1部分)所述的规程，进行细胞染色。源于CD34+CD15+骨髓单核祖细胞的WTM跨谱系三杂交细胞的典型表达概况示于图18。分析表明，大约81％的WTM跨谱系三杂交细胞共享B谱系和骨髓单核细胞表型(CD19+CD15+)，且61％的CD19+也是CD4T谱系标记物阳性的。34％的CD4+跨谱系三杂交细胞也在它们的表面上保持CD34，且68％的CD34+三杂交细胞表达CD15。令人感兴趣地，28％的CD34+跨谱系三杂交细胞不保留CD15的表达，即使CD34和CD15来自相同来源(骨髓单核祖细胞)。
4.4.从1个无限增殖的髓样细胞、1个无限增殖的淋巴样细胞和1个原代淋巴样T细胞生产跨谱系三杂合体——KWT
通过1个无限增殖的髓样细胞(K562)、1个无限增殖的B淋巴样细胞(WIL2NS)和1个原代人T细胞的细胞杂交，产生这类跨谱系三杂交体生产。这类跨谱系三杂交体被称作KWT继之以系列号。
4.4.1.用于KWT跨谱系三杂交体生产的细胞制备
在第4.1.1部分中已经描述了用于这些细胞杂交实验的K562和WIL2NS细胞的制备。在细胞杂交之前，使用在第1.1.1部分中所述的规程序，确立表现出最高增殖速率的每个细胞类型的稳定克隆。在某些实施方案中，使用如在第1.1.3部分中描述的CD71+-富集的细胞群体。在其它实施方案中，使用如在第1.1.3.1部分中所述选择的CD71+-富集的K562群体的CD15+细胞。用于产生KWT跨谱系三杂交体的原代细胞包括：源自脾、外周血、脐带血和胸腺的辅助T细胞(CD4+)；源自脾、外周血、脐带血和胸腺的细胞毒性T细胞(CD8+)；抗原处理过的源自脐带血的T细胞(CD3+CD5+)和CD3+T细胞；源自胸腺的双阴性的T细胞(CD3+CD4-CD8-)和双阳性的T细胞(CD3+CD4+CD8+)，它们用于这些实验中(参见第1.3部分)。
4.4.2.用于KWT跨谱系三杂交体生产的细胞杂交规程
用于KWT跨谱系三杂交体生产的细胞杂交规程类似于KMW跨谱系三杂交体生产的规程(参见第4.1.2部分)。
4.4.3.KWT跨谱系三杂交体状态的确认
CD标记物的表达
从1个无限增殖的髓样细胞(K562)、1个无限增殖的淋巴样细胞(WIL2NS)和1个原代T细胞确立的KWT跨谱系三杂交细胞系
确立了源自1个K562细胞、1个WIL2NS细胞和1个原代T细胞的细胞杂交的KWT细胞系。在已经在正常培养条件下稳定跨谱系三杂交细胞系6个月以后，分析跨谱系三杂交细胞群体的谱系特异性的CD标记物的表达。使用三色FACS分析，以鉴别源于K562的CD15、源于WIL2NS的CD19和源于原代效应T辅助细胞的CD4的共表达。用于KWT跨谱系三杂交细胞的细胞染色的规程与关于KMW跨谱系三杂交体所述的规程(部分4.1.3)基本上相同。源自CD4+效应T细胞的KWT跨谱系三杂交细胞的FACS概况示于图19。大部分KWT跨谱系三杂交细胞表现出骨髓单核谱系、B淋巴谱系和T淋巴谱系的混合表型特征。100％的KWT跨谱系三杂交细胞在细胞表面上表达CD4(即T淋巴谱系的标记物)，其源自原代效应T细胞，而这些细胞中的54％同时是B谱系标记物CD19(其源自无限增殖的细胞WIL2NS系)阳性的，且这些CD4+CD19+细胞中的24％是CD15(其源自无限增殖的骨髓单核祖细胞系K562)阳性的。
从1个无限增殖的髓样细胞(K562)、无限增殖的淋巴样细胞(WIL2NS)和1个双阳性的T细胞确立的KWT跨谱系三杂交细胞系
当使用双阳性的T细胞(CD4+CD8+细胞)来产生KWT跨谱系三杂交体系时，也分析了源自原代胸腺细胞的CD4和CD8的表达概况。用于CD概况分析的规程与上面关于源自CD4+T细胞的KWT跨谱系三杂交体所述的规程基本上相同，但是使用小鼠抗-人CD8-FITC抗体替代小鼠抗-人CD19-FITC抗体。源自双阳性的(CD4+CD8+)T细胞的跨谱系三杂交细胞的典型CD表达概况示于图20。结果表明，99％的KWT跨谱系三杂交细胞是CD4+阳性的，且69％是CD8阳性的，26％的CD4+细胞是CD15骨髓单核细胞标记物阳性的，且23％的CD8+细胞是CD15阳性的，这意味着，CD4+CD8+CD15+细胞占总细胞群体的大约23％(因为几乎100％的细胞是CD4+，双阳性的CD8+CD15+群体也是CD4阳性的)。象在源自CD4+效应T细胞的KWT三杂交体中一样，CD19+细胞占总细胞群体的52％，它们中的22％共表达CD15。因而，整个CD15+细胞群体共表达CD4、CD8和CD19，意味着22-23％。
从1个无限增殖的髓样细胞(K562)、无限增殖的淋巴样细胞(WIL2NS)和CD5阳性的抗原处理过的T细胞确立的KWT跨谱系三杂交细胞系
当使用CD5阳性的抗原处理过的T细胞来产生KWT跨谱系三杂交体系时，分析了CD5的表达。除了在小鼠抗-人CD19和小鼠抗-人CD5抗体之间的荧光缀合物的颠倒(reversion)以外，使用与分析WTM跨谱系三杂交体所用相同的规程(部分4.6)，用小鼠抗-人CD19-FITC和小鼠抗-人CD5-PE抗体标记KWT杂交细胞。在图21中所示的结果表明，90％的KWT跨谱系三杂交细胞是CD5(源自抗原处理过的T细胞)阳性的，且49％的CD5细胞也是CD19(源于WIL2NS细胞(B细胞))阳性的。CD19+细胞在跨谱系三杂交细胞中的总百分比是约56％。
4.5.从2个无限增殖的淋巴样细胞(WIL2NS)和1个原代单核细胞生产跨谱系三杂交体——WWM
通过2个无限增殖的淋巴样细胞(WIL2NS)和1个原代人单核细胞的体细胞杂交，产生这类跨谱系三杂交体生产。跨谱系三杂交体被标记为WWM继之以系列号。
4.5.1.用于WWM跨谱系三杂交体生产的细胞制备
以与在第4.1.1部分中所述相同的程序，培养WIL2NS细胞系。
在某些实施方案中，使用如在第1.1.3部分中所述确立的CD71+-富集的细胞群体。从源自脾、外周血或脐带血的混合淋巴细胞，分离出人单核细胞。单核细胞的分离基于CD14标记物的表达，和在有些情况下，基于CD16的低表达水平(FACS或磁珠)，如前面在第1.3.3.1.1部分中所述。当使用来自不同淋巴组织的单核细胞时，杂交参数或得到的跨谱系三杂交体似乎没有差异。
4.5.2.用于WWM跨谱系三杂交体生产的细胞杂交规程
用于WWM跨谱系三杂交体生产的细胞杂交规程与用于KBT跨谱系三杂交体生产的规程(参见第4.2.2部分)类似。
4.5.3.WWM跨谱系三杂交体状态的确认
CD标记物的表达
在已经在正常培养条件(参见第1.1部分)下稳定WWT跨谱系三杂交细胞系6个月以后，分析跨谱系三杂交细胞群体的谱系特异性的CD标记物的表达。
施加小鼠抗-人CD19-FITC和小鼠抗-人CD14-PE抗体的双重染色或标记，以描绘得到的跨谱系三杂交体的跨谱系标记物表达。图22a显示了这样的跨谱系三杂交细胞的典型CD概况。癌基因-关联的标记物CD19的表达似乎在跨谱系三杂交细胞中是恒定的。尽管一些部分的细胞(23.5％)在它们的表面上确实表达CD14，但剩余的72.7％是CD14表面表达阴性的。
4.6.使用非人哺乳动物细胞的跨谱系三杂交体生产
下面的实施例表明，使用除了人细胞以外的哺乳动物细胞(具体地，小鼠细胞)，可以产生跨谱系三杂交体。应当理解，相同的原理可以用于从其它哺乳动物细胞产生跨谱系三杂交体。
4.6.1.从1个无限增殖的小鼠淋巴样细胞、1个原代小鼠淋巴样细胞和1个原代小鼠单核细胞生产跨谱系三杂交体
本部分描述了从1个无限增殖的小鼠B淋巴样细胞(Sp2)、1个原代小鼠T细胞和1个原代小鼠单核细胞产生跨谱系三杂交细胞系。该跨谱系三杂交体系被标记为STmMm继之以系列号。
4.6.1.1.用于STmMm跨谱系三杂交体生产的细胞制备
在前面在第1.1.4部分中描述了用于产生STmMm跨谱系三杂交体的Sp2细胞的制备。在这些实验中使用原代小鼠细胞，包括：源自外周血的CD11b+CD90-B220-CD49b-NK1.1-Ly6G-/低单核细胞；源自脾或外周血的小鼠辅助T细胞(CD4+)；源自脾或外周血的小鼠细胞毒性T细胞(CD8+)；和源自脾或外周血的双阳性的T细胞(CD4+CD8+)。在前面(第1.3.5部分)已经描述了从脾和外周血分离各种原代小鼠淋巴样细胞。
4.6.1.2.用于STmMm跨谱系三杂交体生产的细胞杂交规程
用于STmMm跨谱系三杂交体生产的细胞杂交规程类似于用于WTM跨谱系三杂交体生产的规程(参见部分4.3.2)，但是培养基和AC电场和脉冲不同。也就是说，在这些实验中使用的杂交培养基由265mM山梨糖醇、1.5mM KH2PO4、0.4mM CaCl2和0.3mM Mg(C2H3O2)2(Sigma)组成，补加了0.2％BSA。同时施加0.5MHz和65-75kV/m的AC场，其具有3秒间隔的3个矩形脉冲串，每个矩形脉冲具有70μsec的脉冲宽度和250-280kV/m的强度。在第4.1.2部分中描述了该新形成的跨谱系三杂交细胞的稳定系的回收和确立的规程。
4.6.1.3.STmMm跨谱系三杂交体状态的确认
确立了源自1个Sp2细胞、1个原代小鼠T细胞和1个小鼠单核细胞的细胞杂交的STmMm细胞系。在已经在正常条件(参见第1.1部分)下培养跨谱系三杂交细胞系6个月以后，分析跨谱系三杂交细胞群体的谱系特异性的CD标记物的表达。使用三色FACS分析，以验证源于Sp2细胞的CD138、源于原代小鼠单核细胞的CD11b和源于原代小鼠T细胞的CD4的共表达(当这些原代T细胞用于杂交时)。
简而言之，以1x106细胞/ml的浓度，将100μl在含有5％BSA的PBS中的STmMm跨谱系三杂交细胞悬浮于100μl PBS中，并与标记的针对小鼠CD138-PE、CD11b-FITC和CD4-PerCP的大鼠单克隆抗体(BD Pharmingen)或适当同种型对照一起在4℃温育30min。在用PBS彻底洗涤以后，使用FACSCalibur流式细胞仪和CellQuest Pro软件，分析标记的细胞。
STmMm跨谱系三杂交细胞的FACS概况示于图47。尽管CD138(即源自B谱系无限增殖细胞的标记物)的表达水平在跨谱系三杂交细胞群体中似乎是一致的，源于原代细胞的标记物的表达似乎是不同的。在该具体实施例中，存在相对较小百分比的不共表达CD4或CD11b之一与CD138的细胞(参见图47a和b)。当分析STmMm细胞的CD4和CD11b的共表达时(参见图47c)，大约82％的细胞共表达。实际上，细胞群体中的82％表达所有3个CD标记物，仅5％的细胞是CD138阳性的，不共表达CD4或CD11b之一。随后通过标准技术诸如FACS、MACS或单细胞克隆等，可以分离这些不同群体中的每一个，并增殖成单独的跨谱系三杂交体培养物，它们形成彼此不同的表型特征，同时维持在培养物中的同质性。
当使用细胞毒性的CD8阳性的淋巴细胞来产生STmMm三杂交体时，使用大鼠抗-小鼠CD8-PerCp抗体替代抗-CD4-PerCp，用于在得到的三杂交细胞上共表达CD。如从图48可见，97-100％的三杂交细胞是CD138阳性的(图48a和b)，同时这些细胞中的56％或57％共表达CD8(图48b)或CD11b(图48a)。三杂交体群体中的至少40％表达所有3种标记物CD138、CD8和CD11b(图48c)。
在双阳性的CD4+CD8+T细胞的情况下，以与细胞毒性T细胞相同的方式进行第一次分析。图49显示了得到的三杂交体上的CD138、CD11b和CD8表达的FACS概况。98-100％的三杂交细胞是CD138阳性的，整个群体中的57-60％是所有3个谱系标记物阳性的(图49c)。在93％的细胞上，检测到CD138和CD8的共表达(图49b)。在第二步中，检查三杂交细胞的CD8和CD4的共表达。用大鼠抗-小鼠CD8-PE和大鼠抗-小鼠CD4-FITC抗体(BD Pharmingen)标记细胞。图50显示了CD8和CD4表达的FACS概况。尽管95％的三杂交细胞在表面上表达CD8，但仅50％的细胞同时共表达CD4。值得注意的是，实际上整个CD4阳性群体也是CD8阳性的。
4.6.2.从2个无限增殖的小鼠淋巴样细胞和1个原代小鼠单核细胞生产跨谱系三杂交体
本实施例详述了从2个无限增殖的小鼠B淋巴样细胞(Sp2)和1个原代小鼠单核细胞产生跨谱系三杂交细胞系。跨谱系三杂交体系被标记为SSMm继之以系列号。
4.6.2.1.用于SSMm跨谱系三杂交体生产的细胞制备
在前面在第1.1.4部分中描述了用于产生SSMm跨谱系三杂交体的Sp2细胞的制备。在这些实验中使用源自外周血的原代小鼠CD11b+CD90-B220-CD49b-NK1.1-Ly6G-/低单核细胞。在前面(第1.3.5部分)已经描述了从外周血分离原代小鼠单核细胞。
4.6.2.2.用于SSMm跨谱系三杂交体生产的细胞杂交规程
用于SSMm跨谱系三杂交体生产的细胞杂交规程与用于STmMm跨谱系三杂交体生产的规程相同(参见第4.6.1.2部分)。
4.6.2.3.SSMm跨谱系三杂交体状态的确认
在已经在正常培养条件(参见第1.1部分)下稳定SSMm跨谱系三杂交细胞系6个月以后，分析跨谱系三杂交细胞群体的谱系特异性的CD标记物的表达。
施加大鼠抗-小鼠CD138-PE和大鼠抗-小鼠CD11b-FITC抗体(BD Pharmingen)的双重染色或标记，以描绘得到的跨谱系三杂交体的跨谱系标记物表达。图51显示了这样的跨谱系三杂交细胞的典型CD概况。癌基因-关联的标记物CD138的表达似乎在跨谱系三杂交细胞中是恒定的，仅7％的细胞是CD138阴性的。大部分细胞(70％)确实也在它们的表面上表达CD11b，尽管剩余的23％的CD138阳性的细胞是CD11b表面表达阴性的。
4.7.使用人和非人哺乳动物细胞生产跨谱系嵌合三杂交体
本实施例详述了使用人和非人哺乳动物细胞(具体地，小鼠)产生跨谱系嵌合三杂交体。应当理解，相同的原理可以用于从其它哺乳动物细胞产生跨谱系三杂交体。
4.7.1.从1个无限增殖的小鼠淋巴样细胞、1个无限增殖的人淋巴样细胞和1个原代小鼠或人单核细胞生产跨谱系嵌合三杂交体
从1个无限增殖的小鼠B淋巴样细胞(Sp2)、1个无限增殖的人B淋巴样细胞(WIL2NS)和1个原代小鼠或人单核细胞产生跨谱系嵌合的三杂交细胞系。跨谱系三杂合体系被标记为SWMm(在使用小鼠单核细胞的情况下)和SWMh(在使用人单核细胞的情况下)。在每个情况下，三杂交体的缩写名称后面跟着系列号。
4.7.1.1.用于SWMm和SWMh跨谱系嵌合三杂交体生产的细胞制备
在前面在第1.1.4部分和第1.1.3部分中，分别描述了用于产生SWMm和SWMh跨谱系嵌合三杂交体的Sp2和WIL2NS细胞的制备。在这些实验中，使用源自外周血的原代小鼠CD11b+CD90-B220-CD49b-NK1.1-Ly6G-/低单核细胞。在前面(第1.3.5部分)已经描述了从外周血分离原代小鼠单核细胞。从源自脾、外周血或脐带血的混合淋巴细胞，分离出人单核细胞。单核细胞的分离基于CD14标记物的表达，和在有些情况下，基于CD16的低表达水平(FACS或磁珠)，如前面在第1.3.3.1.1部分中所述。当使用来自不同淋巴组织的单核细胞时，杂交参数或得到的跨谱系三杂交体似乎没有差异。
4.7.1.2.用于SWMm和SWMh跨谱系嵌合三杂交体生产的细胞杂交规程
用于SWMm和SWMh跨谱系三杂交体生产的细胞杂交规程与用于STmMm跨谱系三杂交体生产的规程相同(参见第4.6.1.2部分)。
4.7.1.3.SWMm和SWMh跨谱系嵌合三杂交体状态的确认
在已经在正常培养条件(参见第1.1部分)下稳定SWMm和SWMh跨谱系嵌合的三杂交细胞系6个月以后，分析跨谱系嵌合的三杂交细胞群体的谱系特异性的CD标记物的表达。
针对人CD71和小鼠TfR的表达进行双染色，以确立得到的三杂交体的嵌合状态。图52显示了这样的分析的典型FACS概况，100％的细胞是人和小鼠运铁蛋白受体阳性的。这指示三杂交体对小鼠和人细胞分裂控制的依赖性。
依赖于原代单核细胞的小鼠或人来源，施加大鼠抗-小鼠CD138-PE和大鼠抗-小鼠CD11b-FITC抗体(BD Pharmingen)或大鼠抗-小鼠CD138-PE和小鼠抗-人CD14-FITC抗体(BDPharmingen)的双重染色或标记，以描绘得到的跨谱系嵌合三杂交体的跨谱系标记物表达。图53显示了这样的跨谱系嵌合三杂交细胞的典型CD概况。癌基因-关联的标记物CD138(源自小鼠Sp2细胞系)的表达似乎依赖于单核细胞的小鼠或人来源。小鼠CD138阳性的细胞的百分比从在SWMm三杂交体中的84％下降至在SWMh三杂交体中的29％。但是，96％的SWMh嵌合的三杂交细胞是人CD19(源自WIL2NS)阳性的(参见图54)，而在SWMm嵌合的三杂交体中的细胞都不表达人CD19。
实施例5
5.基于CD标记物的分布来富集具有特定跨谱系表型的细胞的跨谱系三杂交体
下面的部分提供了基于不同的表型特征来确立跨谱系三杂交细胞系的亚系的实施例。所述方法基于谱系特异性的细胞表面标记物的分析、谱系特异性的标记物的细胞内表达、谱系特异性的标记物的RNA转录物的存在、核型分析和/或谱系特异性的蛋白的分泌。通过FACS，从一般群体分离出具有希望的特征的跨谱系三杂交细胞。下面的实施例基于WWM跨谱系三杂交体，其具有2个基于CD14表达(阳性的和阴性的)的三杂交体群体。但是，该实施例绝不限于选择的特定跨谱系三杂交体或标记物。
将WWM跨谱系三杂交细胞分选成CD14阳性的和CD14阴性的级分，增殖每个级分，并单独地维持培养3个月。图22b表明，超过95％的跨谱系三杂交细胞保持CD14表达，而图22c中的细胞群体继续是CD14阴性的。这表明，可能分离和确立源自相同跨谱系三杂交体系的不同的同质细胞群体。
通过RT-PCR确认跨谱系三杂交体
为了验证产生的亚系的跨谱系三杂交体性质，对原始的跨谱系三杂交细胞，CD19+CD14+富集的传代培养物和CD14阴性的传代培养物进行关于CD14的RT-PCR测定。使用人CD14+单核细胞作为阳性对照。使用在前面(第1.3.3部分)描述的FACS，从外周血分离对照细胞。
简而言之，使用RNeasy试剂盒(RNeasy Mini kit,Qiagen)，从培养的细胞制备总RNA。根据生产商的规程，使用cDNA-Kit(Amersham Pharmacia)，进行cDNA合成，且基本上如Sewing等人所述，进行PCR。通过琼脂糖凝胶(2％)电泳，分析PCR反应混合物，并通过溴化乙锭染色来显影。寡核苷酸引物对具有序列
5’-引物5’-CACACTCGCCTGCCTTTTCC-3’(SEQ ID NO:1)和
3’-引物5’GATTCCCGTCCAGTGTCAGG-3’(SEQ ID NO:2)
用于扩增450bp的PCR产物。
如图23所示，RT-PCR揭示CD14mRNA转录物在含有细胞的原始WWM培养物中和在原始WWM培养物的CD14+富集的传代培养物中的存在。在缺少表面CD14的WWM传代培养物中也检测到CD 14mRNA，其水平与人CD14+单核细胞的水平相当。
实施例6
6.核型分析
进行跨谱系三杂交体的核型分析，以确立跨谱系三杂交体的细胞发生特征，并证实它们的杂交体起源。
6.1.原始细胞系的核型分析
作为一个实例，对K562和WIL2NS细胞系的细胞的早期传代和晚期传代进行核型分析，以记录原始细胞系的任何染色体不稳定性。经发现，对于给定的细胞系，例如K562系，新鲜解冻的系的核型与在正常培养条件下维持几个月的细胞系的核型相同。
图24和25分别描绘了K562和WIL2NS细胞的典型核型。在两种情况下，在400bphs检查到共20个具有G带的中期细胞。
核型分析结果表明，K562细胞系含有具有三倍体特征的单个克隆，即具有69染色体的模式数，具有各种染色体异常。相比而言，WIL2NS细胞系含有5个二倍体克隆，具有47-48的染色体数目，与K562细胞相比具有明显不同的染色体异常。WIL2NS细胞系中的克隆的表现如下：
克隆1占10％
克隆2占55％
克隆3占10％
克隆4占20％
克隆5占5％
表2(下面)总结了K562和WIL2NS细胞系的复杂核型。2个细胞系之间没有共享的异常。用蓝色突出显示在WIL2NS细胞系的所有克隆中存在的染色体异常。
6.2.用于蛋白表达的跨谱系三杂交体的核型分析
对跨谱系三杂交体进行了核型分析，所述跨谱系三杂交体源自3个不同谱系的无限增殖细胞和原代细胞的各种组合，并进一步用于表达所需蛋白。还将这些核型与用于产生跨谱系三杂交体的原始无限增殖细胞系的核型进行了对比。
6.2.1.KBT跨谱系三杂交体系的核型分析
对源自K562无限增殖的髓样细胞系和原代B和T淋巴细胞的2个KBT跨谱系三杂交体系进行了核型分析。为了对比，还对KBT跨谱系三杂交体进行了核型分析，所述KBT跨谱系三杂交体源自活化的B细胞(CD20+CD72+)和双阳性的T细胞(CD4+CD8+)，具有各种类型细胞(基于它们的CD表达特征)(第4.2.3部分)。图26显示了源自K562+B(CD19+)+T(CD4+)杂交的KBT跨谱系三杂交体系(称作KBT-1系)的典型核型。其表明，KBT-1的单个细胞克隆是近三倍体，具有66染色体的模式数。
当对源自K562细胞、B(CD20+CD72+)细胞和T(CD4+CD8+)细胞的细胞杂交的KBT跨谱系三杂交体系(称作KBT-2系)进行核型分析时，发现，KBT-2系(该系已经在以前的部分中表现出CD表达的变化)的核型分析由4个克隆组成，所述克隆是近三倍体。克隆1、克隆2、克隆3和克隆4分别占细胞群体的45％、30％、15％和10％。克隆4具有66的染色体模式数，而其它克隆各自具有67的染色体模式数。图27显示了KBT-2系的克隆之一的核型分析。
KBT-1和KBT-2系的核型分析总结在表3中。该表的第一列指示染色体数目。一些染色体变化诸如del(3)(p14)、der(4)t(4；？)(q25；？)、+der(7)t(7；mar3)(q10；q10)和der(X)t(X；？；？)(q13；？；？)被所有跨谱系三杂交体共享(无论原代淋巴样细胞的亚型如何)，但是不被K562细胞共享。
表3.源自不同原代淋巴样细胞亚型和作为癌基因来源的K562髓样细胞系的KBT-1和KBT-2的对比分析的总结。用蓝色突出显示了被KBT-1和KBT-2跨谱系三杂交体系共享的K562系的染色体异常。用红色突出显示了在KBT跨谱系三杂交体系的克隆中共享、但是不被原始的K562细胞系共享的染色体异常。用绿色突出显示了在有些KBT跨谱系三杂交体中存在并源自K562系的染色体异常。
6.2.2.KWT跨谱系三杂交体系的核型分析
对3个KWT跨谱系三杂交体系进行了核型分析，所述KWT跨谱系三杂交体系源自K562无限增殖的髓样细胞系、WIL2NS无限增殖的B淋巴样细胞系和原代T淋巴细胞。为了对比，也对KWT跨谱系三杂交体进行了核型分析，所述KWT跨谱系三杂合体源自双阳性的T细胞(CD4+CD8+)(称作KWT-3)，具有各种类型细胞(基于它们的CD表达特征)(第4.2.3部分)。
图28、29和30分别显示了KWT-1、KWT-2和KWT-3跨谱系三杂交体系的典型核型。在每个情况下，在400bphs分析了共20个具有G带的中期细胞。KWT-1含有单个克隆，它是近六倍体(6n＝138染色体)。染色体模式数的范围是129-140个具有核型异质性的染色体，即所有分析的细胞共享一些染色体异常。KWT-2含有单个克隆，它也是近六倍体。染色体模式数的范围是135-145个具有核型异质性的染色体。KWT-3含有3个克隆，它们是超五倍体(n>115)。克隆1、克隆2和3分别占细胞群体的55％、20％和25％。KWT跨谱系三杂交体的核型证实，在所有KWT跨谱系三杂交体中保持了K562和WIL2-NS细胞系的遗传特征，无论在它们的产生中使用哪种原代T细胞类型。表4总结了这些KWT跨谱系三杂交体(即KWT-1、KWT-2和KWT-3系)的核型的对比分析。
表4.源自不同类型的原代T细胞的KWT跨谱系三杂交体的对比分析。用红色突出显示了KWT跨谱系三杂交体与K562细胞系共享的染色体变化。用蓝色突出显示了在KWT跨谱系三杂交体和WIL2NS细胞系之间共享的染色体变化。用绿色突出显示了在跨谱系三杂交体的不同亚型之间共享、但是不被K562细胞系也不被WIL2NS细胞系共享的变化。
6.2.3.WWM跨谱系三杂交体系的核型分析
对源自2个无限增殖的B淋巴样细胞(2WIL2NS系)和原代单核细胞(CD14+)的WWM跨谱系三杂交体系进行了核型分析。对该跨谱系三杂交体的富含CD14+细胞的亚系也进行了核型分析。图31A和31B分别显示了原始的WWM跨谱系三杂交体和它的CD14+-富集的亚系的核型。在每个情况下，在400bphs分析了来自共20个细胞的具有G带的中期染色体。原始的WWM跨谱系三杂合体含有单个优势克隆，它具有47染色体模式数，存在于11个细胞中(55％)。但是，分析的剩余的9个细胞是从近三倍体(具有随机的染色体丧失)至近四倍体(具有随机的染色体丧失)。在这些细胞的任意一个中没有一致性。另一方面，CD14+-富集的WWM跨谱系三杂交体的核型指示在19个细胞中检测到的单个克隆异常。仅1个四倍体细胞被检测到。
表5总结了WWM跨谱系三杂交体系的核型分析的对比分析。用蓝色突出显示了与WIL2-NS细胞共享的染色体特征。
实施例7
7.通过PCR检测EBV基因组
对于PCR测定和对于给定的跨谱系三杂交细胞系，从跨谱系三杂交体的5x106细胞提取基因组DNA。根据生产商的说明书，使用QIAamp DNA Micro试剂盒(Qiagen)，使用MOLT-4细胞作为阴性对照，而使用CO 88BV59-1作为阳性对照。在定性PCR测定中，用特异性引物，扩增EBV基因组的BamHI W区域。上游和下游引物序列分别是：5’-CAAGAACCCAGACGAGTCCGTAGAA-3’(SEQ ID NO:3)和5’-AAGAAGCATGTATACTAAGCCTCCC-3’,(SEQ ID NO:4)(Kimura,等人,1999)。将10ng提取的DNA添加到反应混合物中，所述反应混合物含有10mM Tris-HCl(pH 8.3)、1.5mM MgCl2、50mM KCl、200μM dNTP、0.6μM每种引物和0.5U的Taq聚合酶(Lomb Life Science)。在95℃初始变性2min以后，使用GeneAmp PCR系统9600(Perkin Elmer)，进行28个95℃15秒和60℃1min的循环。在2％琼脂糖凝胶上分离扩增的样品。
来自上述测定的结果表明，在本发明中确立的所有跨谱系三杂交体都被发现是EBV基因组阴性的。
实施例8
8.支原体测试
根据生产商的说明书，使用支原体PCR检测试剂盒(Lomb Scientific)，对使用的任意细胞系和在本发明中产生的跨谱系三杂交体系进行支原体测试。测试结果表明，所有细胞系和跨谱系三杂交体都被发现不含支原体。
实施例9
9.蛋白在跨谱系三杂交体表达系统中的表达和它们的表征
在本发明中体现的三杂交体跨谱系细胞系统可以用于制备多种生物制品，包括、但不限于生物学分子诸如蛋白、肽、碳水化合物、脂质和它们的嵌合分子。具体地，所述生物学分子可以包括细胞因子、生长因子、激素、受体或它们的嵌合分子或片段。技术人员将理解，所需的生物学分子诸如由三杂交体跨谱系细胞表达的蛋白可以是分泌型、膜结合型或二者。技术人员将另外理解，各种蛋白亚基可以在跨谱系三杂交细胞中共表达，例如免疫球蛋白表达和更具体地单克隆抗体生产。技术人员将另外理解，三杂交体跨谱系细胞也可以用于表达多种功能蛋白或肽片段，例如在免疫球蛋白的情况下，用于表达诸如Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段(包括单链Fv片段)的片段。
通过三杂交细胞与表达所需蛋白的配偶体细胞的体细胞杂交(第9.1部分)，可以在三杂交细胞系统中实现所需蛋白的表达。或者，可以对三杂交细胞进行常规的基因转染规程，以促进所需蛋白的表达(第9.2.1部分和第9.2.2部分)。在另一个实施方案中，通过使用体细胞杂交或常规基因转染或二者，可以使三杂交细胞并行地表达多种靶蛋白(第9.3部分)。
下面的实施例例证了许多不同种类的蛋白在跨谱系三杂交细胞中的表达。所述实施例也证实，可以在相同的跨谱系三杂交细胞中表达对特定分化的细胞类型特异性的蛋白(例如免疫球蛋白和CD54)。
9.1.三杂交体跨谱系细胞与表达所需蛋白的细胞的杂交
9.1.1.人GM-CSF的表达
在该具体实施例中，使用富含CD14阳性细胞的WWM跨谱系三杂交体系(在第5部分中描述)作为配偶体细胞系。使用在第1.3.3.1.1部分中所述分离的活化的人CD4阳性的淋巴细胞作为人GM-CSF的来源。电细胞杂交程序与在第4.3.2部分中所述用于产生WWM跨谱系三杂交体的程序基本上相同。在得到的WWM和CD4+培养的T细胞的杂交体变得稳定以后，将它维持为细胞系，并标记为ProGM。
人GM-CSF表达的结果
通过夹心型ELISA，测试ProGM上清液中的人GM-CSF。以10μg/ml，用50μl纯化的兔多克隆抗-GM-CSF抗体在4℃包被96孔ELISA板(Corning)过夜。去除抗体溶液以后，用100μl含有5％BSA的PBS(5％BSA-PBS)，封闭在板上的残余蛋白结合位点。然后，将50μl来自ProGM杂交细胞系的培养物上清液添加到孔中，并在37℃温育2小时。用含有0.05％吐温20的PBS(吐温-PBS)洗涤3次以后，将它们与50μl兔抗-GM-CSF抗体(10μg/ml)在室温温育1小时。用吐温-PBS洗涤3次以后，将它们与200倍稀释的过氧化物酶-缀合的抗-兔免疫球蛋白在室温温育2小时。用吐温-PBS漂洗3次以后，通过与ABTS和0.01％过氧化氢温育，使最终的反应物显影。测量在415nm的吸光度。使用重组人GM-CSF作为标准。对于给定的样品，一式两份地进行所有分析。结果表明，在非最优化的培养条件下，ProGM生产在0.7-1.1μg/ml/106细胞范围内的人GM-CSF。
通过蛋白印迹和免疫沉淀对源自ProGM杂交体的hGM-CSF的表征证实，ProGM杂交体生产的全人GM-CSF表现出与由人淋巴细胞天然地分泌的糖形相同的糖蛋白形式。在分析之前，将从ProGM杂交体收集的上清液稀释100倍。用于蛋白印迹分析的免疫印迹NC膜(Millipore)和浓度为0.1μg/ml的生物素化的大鼠抗-人GM-CSF抗体(R&D systems)，被用于蛋白印迹检测。在图32中，由ProGM杂交体分泌的hGM-CSF的蛋白印迹(泳道4)表现出与由PHA活化的人淋巴细胞培养物分泌的GM-CSF的形式(泳道2)相同的异质性。在ProGM和淋巴细胞培养物中表达的GM-CSF的分子量分布范围是18kDa-35kDa。在有衣霉素(其抑制碳水化合物链向天冬酰胺残基上的添加)存在下，没有检测到更高分子量的分子(即35kDa)，从而表明观察到的异质性是由于不同程度的糖基化(泳道5)。由PHA活化的淋巴细胞或在ProGM杂交体表达系统中生产的GM-CSF形式的分子量高于源自大肠杆菌的GM-CSF(泳道6)。
收集补加或不补加10μg/ml衣霉素所培养的ProGM杂交体的上清液，并与分别针对大肠杆菌-衍生的人或小鼠GM-CSF产生的大鼠抗-人GM-CSF抗体或兔抗-小鼠GM-CSF抗体一起在40℃温育过夜。添加A蛋白-琼脂糖凝胶(Invitrogen)，并在室温另外温育3小时。用0.15M NaCl、0.5％NP-40、10mM Tris-HCl、pH 8.0，彻底洗涤回收的树脂。用Laemmli样品缓冲液溶解结合的蛋白，并进行SDS-PAGE。如图33所示，由ProGM杂交体分泌的GM-CSF的分子量范围是18kDa-35kDa，这类似于天然存在的形式。该异质性是由于在2个N-糖基化和几个O-糖基化位点处的不同糖基化。在有衣霉素存在下，没有检测到更高分子量的带，然而积累了更低分子量18-22kDa的蛋白。该数据证实，源自ProGM杂交体的hGM-CSF被作为人糖蛋白分泌。
9.1.2.人免疫球蛋白的表达
将通过FACS测得具有表型标记物(关于更多的细节，参见第4.4.3部分)并如在第6.2.2部分中所述进行了核型分析的源自抗原处理过的T细胞(CD3+CD5+)的KWT跨谱系三杂交体系(称作KWT-2)，用于经由电细胞杂交来表达人免疫球蛋白。具体地，在该具体实施例中，使用KWT-2跨谱系三杂交体作为配偶体细胞系。将如在第1.3.3部分中所述分离的原代CD40活化的IgM阳性的或IgG阳性的B细胞，用作人Ig的来源。电细胞杂交程序与在第4.4.2部分中所述用于产生KWT跨谱系三杂交体系的程序基本上相同。在得到的杂交体变得稳定以后，维持它们，并标记为ProIM或ProIG细胞系(参见第1.1部分)。
人免疫球蛋白表达的结果
通过前面所述的ELISA(参见第1.3.3部分)，分析来自ProIM和ProIG的上清液中IgM或IgG的存在。以1x105细胞/孔，将细胞接种进圆底96孔板中，并在标准条件下培养24小时。使用血细胞计数器和锥虫蓝排除，进行细胞计数和生存力测定。结果总结在表6A和6B中。给出的每个值是3个独立测量的平均值±SD。
表6A.ProIM细胞的细胞生长和IgM生产
表6B.ProIG细胞的细胞生长和IgG生产
使用生物素化的小鼠抗-人IgG1(克隆HP6069)、IgG2(克隆HP6002)、IgG3(克隆HP6047)、IgG4(克隆HP6025)(ICN Biomedicals)和生物素化的山羊抗-人κ和λ链(Biosource)，检测IgG亚类和轻链亚型。使用ALP-缀合的链霉抗生物素蛋白，检测结合的生物素化的抗体。
结果表明，分别由ProIM和ProIG细胞生产的IgM和IgG具有κ轻链，且IgG属于IgG2类。
9.1.3.人CD54的表达
人CD54表达的方法
将通过FACS测得具有表型标记物(关于更多的细节，参见第4.4.3部分)并如在第6.2.2部分中所述进行了核型分析的源自成熟的T辅助细胞(CD4+)的KWT跨谱系三杂交体(称作KWT-1)，进一步用于经由电细胞杂交来表达人CD54。具体地，在该具体实施例中，使用KWT跨谱系三杂交体作为配偶体细胞系。将如在第1.3.3部分中所述分离的原代人CD54阳性的T细胞用作人CD54分子的来源。杂交程序与用于产生KWT跨谱系三杂交体系的程序(参见第4.4.2部分)基本上相同。在得到的杂交体变得稳定以后，在标准的培养条件下将它维持为细胞系(参见第1.1部分)，并标记为ProCD54。
hCD54表达的结果
使用FACS分析，验证CD54在ProCD54细胞表面上的表达。由于100％的原始的KWT跨谱系三杂交细胞在它们的表面上表达CD4(参见图19)，所以使用在ProCD54细胞表面上的CD4表达作为得到的细胞系的稳定性的参照。简而言之，按照如在第1.3.3.1部分(CD54+T细胞的分离)中所述的相同规程，用小鼠抗-人CD54-FITC和小鼠抗-人CD4-PE抗体，标记1x105细胞/100μl等分试样。ProCD54细胞表面上的CD4和CD54表达的典型概况显示于图34a中。大约72％的原始的ProCD54细胞是CD54阳性的，同时100％的细胞保持它的CD4表达，即使CD4表达水平似乎稍微低于KWT跨谱系三杂交细胞的水平。在设定适当的门以后，门控并分选具有中等至高水平的CD54表达的CD4+CD54+细胞群体(总细胞群体的大约42％)(图34a)。将分选的细胞重新悬浮于标准培养基中，并维持培养几个月。得到的亚系被标记为ProCD54EX。然后采用与本部分前面所述相同的规程，分析该亚系的CD4和CD54表达。ProCD54EX表面上的CD4和CD54表达的典型概况显示于图34b中。从该图可以看出，在标准条件下培养6个月以后，至少98％的细胞维持CD4和CD54的表达。更进一步，CD54的表达在中间水平变得同质。
还根据生产商的说明书，使用人CD54(ICAM-1)ELISA(R&D systems)，分析了ProCD54和ProCD54EX的可溶的CD54在组织培养物上清液中的存在。在培养第7天时，收集上清液至少3次。使用KWT跨谱系三杂交体配偶体细胞系的上清液作为阴性对照。一式两份地对相同的样品进行所有测量。简而言之，用针对人可溶的ICAM-1的鼠单克隆抗体包被微量滴定板。在与对照、样品或适当稀释的标准一起温育以后，添加辣根过氧化物酶(HRP)缀合的针对人可溶的ICAM-1的多克隆抗体。添加底物和终止液以后，使用设置在450nm的微量培养板读数器，在30分钟内测定每个孔的光密度。结果总结在表7中。
表7.在KWT跨谱系三杂交体配偶体细胞系、ProCD54和ProCD54EX细胞系中的可溶的CD54(ICAM-1)的浓度范围
细胞系 最低浓度,ng/ml 最高浓度,ng/ml
KWT 0 0
ProCD54 420 1320
ProCD54EX 910 2870
通过凝胶电泳和蛋白印迹分析，测定从ProCD54和ProCD54EX脱落的可溶CD54的分子量。简而言之，通过蛋白测定(R&D systems)，测量上清液中的蛋白浓度，并调节至1.8mg/ml。通过SDS-PAGE，进行电泳。将共30ml样品装载上在非还原样品缓冲液中的凝胶。电泳以后，将蛋白转移至聚偏氟乙烯膜(Bio-Rad)。用在TBS-吐温缓冲液(TBST)中的脱脂奶粉(5％)封闭印迹的膜，并与小鼠抗-人ICAM-1抗体(在TBST中1:100稀释)一起搅拌2小时。在用TBST洗涤样品以后，添加第二种试剂，即与HRP连接的山羊抗-小鼠IgG(1:10,000稀度)。用TBST重复洗涤以后，用水漂洗膜。在室温进行所有温育。图35表明，在ProCD54和ProCD54EX的上清液中存在的sCD54是大约82kDa的单一种类，这与在人血清中检测到的可溶CD54的分子量相对应。
通过RT-PCR，验证ProCD54和ProCD54EX细胞中人CD54的mRNA的表达。使用商业试剂盒，提取总RNA，并如前面在第5部分中所述，进行基因表达的RT-PCR检测。使用人ICAM-1引物组[有义,5’-CCGGAAGGTGTATGAACTG-3’；(SEQ ID NO:5)反义,5’-TCCATGGTGATCTCTCCTC-3’(SEQ ID NO:6)]，探测从实验和对照RNA样品反转录的cDNA。在每个测定中包括亲环蛋白的引物对作为内部对照[有义,5’-TGTTCTTCGACATTGCCGTCGAC-3’；(SEQ ID NO:7)反义5’-GCATTTGCCATGGACAAGATGCCAGGA-3’(SEQ ID NO:8)]。在含有溴化乙锭的Tris-乙酸盐缓冲液中，在3％琼脂糖凝胶中电泳PCR反应产物，对紫外线诱导的荧光带照相，并数字化。图36显示了ProCD54和ProCD54EX中人ICAM-1的mRNA的RT-PCR分析。KWT跨谱系三杂交细胞(其在细胞表面上不表达CD54)也显示出非常低的ICAM-1基因转录。
9.2.用编码所需蛋白的基因转染三杂交体跨谱系细胞系
通过许多常规技术，包括载体-介导的基因转移，可以将特定基因导入培养的细胞中。在本发明的一个实施方案中，用编码所需蛋白的基因瞬时转染三杂交体跨谱系细胞。这允许在DNA摄入的数小时内得到基因产物(RNA或蛋白)。在本发明的替代实施方案中，用编码所需蛋白的基因稳定地转染三杂交体跨谱系细胞。这包括质粒载体DNA整合进宿主细胞染色质中。
9.2.1.瞬时转染
将通过FACS测得100％的跨谱系三杂交细胞共享B和T细胞表型标记物(参见第4.2.3部分)并如在第6.2.1部分中所述进行了核型分析的源自成熟的B细胞(CD19+)和成熟的T辅助细胞(CD4+)的KBT跨谱系三杂交体，用于基因转染实验。作为用所需蛋白瞬时转染跨谱系三杂交体系的细胞的一个实例，用人IL-4受体α链(hIL4-Rα)转染KBT跨谱系三杂交体的细胞。
方法
在第1.3.1部分中已经描述了从骨髓样品制备PBML细胞。从在标准培养条件下与100ng/ml重组人IL-4(R&D systems)温育24小时的共1x106PBML细胞，克隆出hIL4-RαcDNA。提取总RNA(RNeasy Mini Kit,Qiagen)，并使用第一链cDNA纯化试剂盒(AmershamPharmacia)合成cDNA。使用PCR来扩增hIL4-RαcDNA。使用有义引物5'-AGGGGCGCGCAGATAATTAAA-3'(SEQ ID NO:9)和反义引物5'-AGTGGGGCCAATCACCTTCATA-3'(SEQ ID NO:10)，进行扩增。使用嵌套式PCR来添加2个BamHI限制位点给hIL4-Rα片段[有义引物5'-GGATCCGCGCAGATAATTAAAGA-3',(SEQ ID NO:11)反义引物5'-GGATCCAAATCACCTTCATACCAT-3'(SEQ ID NO:12]。稀释扩增的cDNA，并进行在94℃1min的初始变性，继之以31个在94℃20秒、在59℃45秒、在72℃3分钟的循环。将IL4R cDNA片段连接进克隆载体pGEM-T(Promega)中，并转染进JM109感受态细胞(Promega)中。使用PlasmidMini Kit(Qiagen)，制备质粒DNA。
对于电穿孔，将悬浮于350μl完全TC培养基中的7x106KBT细胞(参见第1.1部分)与30μg cDNA质粒相混合。通过来自Eurogentec Easyject Pulser的单个脉冲(25kV/m,1050μF,34-37msec脉冲宽度)，进行转染。随后，在6孔组织培养板中在补加了100ng/ml重组hIL4的完全TC培养基中温育细胞。
在转染后24、48和72小时，通过冷冻-融化程序，制备细胞提取物。使用未转染的KBT和PBML细胞分别作为阴性对照和阳性对照。使用Bio-Rad蛋白测定(Bio-RadLaboratories)，测定细胞提取物的总蛋白含量。使用20mg固定化在Sapharose 4B fastflow(Sigma)上的A蛋白，用3μg抗-hIL4-Rα链(BD Pharmingen 551894)免疫沉淀等量的细胞提取物(大约2mg)。在稀释缓冲液中洗涤免疫沉淀物2次(在TSA溶液中的0.1％Triton X-100和牛血红蛋白，1次在TSA溶液中，另一次在0.05M TRIS-Cl(pH 6.8)溶液中，用Laemmli缓冲液溶解，煮沸，并用TRIS-甘氨酸4％-12％SDS-PAGE分离。所述TSA溶液含有0.01MTRIS-Cl(pH 8.0)、0.14M NaCl和0.025％叠氮化钠)。在有些实验中，没有先前的免疫沉淀，通过SDS-PAGE，直接地分离细胞提取物的75μg蛋白内容物。
如下进行蛋白印迹分析：将蛋白从聚丙烯酰胺凝胶转移到处于25V的Hybond-ECL硝酸纤维素膜(Amersham)上2小时，处于含有25mM TRIS、192mM甘氨酸、0.1％SDS、100μM钒酸钠和20％甲醇的TRIS-甘氨酸缓冲液中。用封闭缓冲液(2.5％脱脂奶粉、10mM TRIS-Cl[pH 7.5]、100mM NaCl和0.1％吐温20)处理印迹1小时，然后与在封闭缓冲液中的2μg/ml小鼠抗-hIL4-Rα抗体温育另外1小时。如下检测抗体结合：同与辣根过氧化物酶缀合的绵羊抗-小鼠免疫球蛋白一起温育印迹1小时，随后与碘化的底物温育1分钟，然后进行增强的化学发光检测。
结果
图37显示了在转染以后24、48和72小时，来自用hIL4-Rα链瞬时转染的KBT跨谱系三杂交细胞系的细胞提取物的蛋白印迹分析。在转染后24小时，在用hIL4-Rα链转染的KBT细胞中检测到hIL4-Rα链，且在转染后48和72小时，hIL4-Rα链的表达水平逐渐增加。未转染的KBT细胞用作hIL4-Rα链的阴性对照。来自人PBML细胞(其用于制备hIL4-RαcDNA)的细胞提取物用作hIL4-Rα链的阳性对照。
9.2.2.稳定转染
作为用所需蛋白稳定转染跨谱系三杂交细胞系的细胞的一个实施例，用人白介素2(hIL-2)基因转染了KBT细胞系的细胞。
方法
将含有大鼠前胰岛素原II基因(其在RSV长末端重复序列控制下)的hIL-2表达载体pBC12/RSV/IL2(IS)用于转染。已经掺入了整个胰岛素前导区和编码翻译起始密码子的胰岛素序列。该嵌合的hIL-2mRNA生产比含有天然的hIL-2前导序列和起始密码子的hIL-2mRNA(Cullen,1988)明显更多的hIL2蛋白。
经由与SV40/dhFr基因片段的连接(Subramani等人,Mol.Cell.Biol.1:854,1981)，将二氢叶酸还原酶基因序列(dhFr)插入pBC12/RSV/IL2载体中，从而产生pBC12/RSV/IL-2/dhFr质粒，其含有在SV40病毒早期区启动子控制下的整个鼠dhFr基因，且其中hIL-2和dhFr基因位于相同的朝向。
在转染之前，使用0.1mM多环芳族烃外消旋的3a,4b-二羟基-la,2a-环氧-1,2,3,4-四氢苯并[c]菲(B[c]PHDE)，对培养的KBT细胞诱变90分钟(Carothers等人,Proc.Natl.Acad.Sci 87:5464-68,1990)。dhFr-克隆的选择基于对次黄嘌呤和胸苷的依赖性，并遵循6-天表达时间段(Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.77(7):4216-20,1980)。在补加了10-4M次黄嘌呤和10-5M胸苷的标准培养基中，维持得到的dhFr缺陷的KTB细胞(KBTdhFr-)。
在转染中，用PBS洗涤培养的KBTdhFr-细胞3次，并重新悬浮于0.8ml PBS中。将60μg pBC12/RSV/IL2/dhFr载体添加到细胞悬浮液中，将悬浮液转移进塑料电穿孔杯中，并在冰上温育10min。使用标准的电穿孔规程，使用基因-脉冲发生器(pulser)电穿孔单位(Bio-Rad)，在75kV/m和25μF，进行电穿孔。在脉冲处理以后，在冰上温育杯10min。然后将细胞转移进瓶中，并在没有次黄嘌呤和胸苷的标准培养基中培养。使用单细胞克隆技术(参见第1.1.2部分)，克隆存活的细胞，并评价确立的系的hIL-2分泌。
结果
使用hIL-2特异性的引物，通过PCR，验证转染的KBT(KBT TR-IL2)细胞中hIL-2mRNA的表达。经由磁珠分选(如在第1.3.3.5部分中所述)，从PBML得到的人CD8+T细胞，以及Jurkat细胞系，克隆E6-1用作阳性对照。使用K562细胞和未转染的KBT杂交细胞作为阴性对照。按照生产商的说明书，在RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)中的各种处理以后，从转染的KBT细胞提取总RNA。下面的引物是基于公开的序列(Wang等人,1989)使用的hIL-2引物：
5’引物＝5’-GAATGGAATTAATAATTACAAGAATCCC-3’(SEQ ID NO:13)
3’引物＝5’-TGTTTCAGATCCCTTTAGTTCCAG-3’(SEQ ID NO:14)
扩增进行35个循环。PCR循环由下述组成：在94℃40秒，hIL2的退火温度是55℃，继之以在72℃延伸40秒。在含有溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶中使PCR产物显影。结果给出在图38中。表达水平与从CD8+人T淋巴细胞和Jurkat细胞得到的那些类似。使用未转染的KBT细胞和K562细胞作为阴性对照。
根据生产商的说明书，使用BD FastImmuneTMCD4细胞内IL-2检测试剂盒(BDPharmingen)，检测细胞内IL-2。使用BD FACSCalibur，进行FACS分析。最初，基于前向散射和荧光阈值以及前向散射和侧向散射，门控CD4+细胞。随后基于CD69(活化的CD4+T细胞)和细胞内IL-2表达，分析门控的群体。KBT TR-IL2细胞中IL-2表达的FACS概况示于图39。使用未转染的KBT细胞作为对照。大约41％的KBT细胞是CD69活化分子阳性的。92％的KBT TR-IL2细胞是细胞内hIL-2染色阳性的(R1+R2)。hIL-2阴性的细胞是CD69阳性群体的一部分，而CD69阴性的细胞都是细胞内hIL2阳性的。
通过ELISA，验证在转染后30天和90天时hIL-2的分泌。简而言之，在24-孔组织培养板中在37℃温育1x106hIL-2转染的KBT细胞24小时。收集上清液，且通过hIL-2ELISA试剂盒(R&D systems)，测量hIL-2活性。稀释上清液，以拟合hIL-2ELISA试剂盒的检测范围。重组的hIL-2(R&D systems)用作阳性对照。ELISA分析表明，hIL-2分泌率范围是660ng/106细胞/24小时至3300ng/106细胞/24小时。
得到的KBT细胞系(其被hIL2稳定转染，且分泌hIL2)被标记为ProL2。
9.3.组合杂交和转染的靶蛋白并行表达
作为使用三杂交体系统的并行蛋白表达的一个实施例，使三杂交细胞与人sIgM+CD25+B淋巴细胞杂交，以表达hIgM，随后用hIL-2稳定转染。对稳定地表达hIgM和hIL-2的杂交细胞系统进一步进行hIL-4Rα的瞬时转染。在该实施例中，hIgM代表第一种蛋白，hIL-2代表第二种并行地表达的蛋白，且hIL-4Rα代表第三种并行地表达的蛋白。或者，用hIL-2稳定地转染三杂交细胞，随后与人shIgM+CD25+B细胞进行体细胞杂交。在确认hIL-2和hIgM都从杂交细胞系统表达以后，对杂交细胞系统进一步进行hIL-4Rα的瞬时转染。在该实施例中，hIL-2代表第一种蛋白，hIgM代表第二种并行地表达的蛋白，且hIL-4Rα代表第三种并行地表达的蛋白。
9.3.1细胞制备
在这些实验中使用源自成熟的B细胞(CD19+)和成熟的T辅助细胞(CD4+)的KBT跨谱系三杂交体，通过FACS测得100％的跨谱系三杂交细胞共享B和T细胞表型标记物(参见第4.2.3部分)，并如在第6.2.1部分中所述进行了核型分析。在有些情况下，在实验中使用dhFr缺陷的KBT细胞(KBTdhFr-)，它们源自在第9.2.2部分中所述的诱变过程，并维持在补加了10-4M次黄嘌呤和10-5M胸苷的标准培养基中。同样，在有些情况下，还使用hIL-2转染的细胞系KBT TR-IL2(参见第9.2.2部分)。
将原代CD40活化的sIgM阳性的B细胞(其如在第1.3.3部分中所述从PBMC分离，并经由在第2.2部分中所述的CD40途径活化)用作用于杂交的人sIgM B细胞的来源。对于这些具体的实验，sIgM+B细胞的分离也基于CD25(人IL-2受体)的并行表面表达，其中在培养5天后使用FACS。如在第1.3.3.5部分中所述，使用MACS CD4Multisort试剂盒，从胸腺分离出CD8+T细胞。
9.3.2用于生产第一种蛋白或共生产第二种蛋白的体细胞杂交
KBT细胞或KBTdhFr-细胞或系KBT TR-IL2细胞和shIgM+CD25+B细胞(记忆B细胞的亚群)之间的电细胞杂交程序与在第4.4.2部分中所述的用于产生KBT跨谱系三杂交体系的程序基本上相同。在在得到的杂交体变得稳定以后，如在第1.1部分中所述，维持它们。通过FACS分析，验证得到的杂交体对shIgM和CD25的共表达(参见图62)，并通过ELISA，分析hIgM的生产。在将KBT TR-IL2细胞用于与shIgM+CD25+B细胞杂交的情况下，还分析与hIgM并行的hIL-2生产。
9.3.3用第二种蛋白的稳定转染
当在系统用hIL-2稳定转染之前进行体细胞杂交时，使用在第9.2.2部分中所述的方法学，对hIgM生产系统进行hIL-2转染。通过ELISA，验证hIgM和hIL-2的并行生产。
9.3.4用第三种蛋白的瞬时转染
使用与在第9.2.1部分中所述相同的方法，经由用hIL-4Ra基因的电穿孔，进一步瞬时转染分泌hIgM和hIL-2的稳定的杂交体系统。通过ELISA，证实hIgM、hIL-2和hIL-4Rα的共生产。
结果
在表7a和表7b中，总结了由相同杂交细胞系统的细胞并行地表达和共表达的3种蛋白的生产水平。为了分析，在24孔板中培养细胞至下述密度：0.5x105细胞/ml(对于表达1种蛋白)、1.2x105细胞/ml(对于表达2种蛋白)和3.2x105细胞/ml(对于表达3种蛋白)。该系统不仅能够并行地生产3种蛋白，而且在第二种蛋白共表达以后，第一种蛋白的生产水平增加，且第三种蛋白的表达使它进一步增加。以相同的方式，第三种蛋白的表达增加第二种蛋白的生产。
表7a.当体细胞杂交是第一种表达方法时由相同的杂交细胞系统并行地表达的蛋白的典型生产水平
表7b.当稳定转染是第一种表达方法时由相同的杂交细胞系统并行地表达的蛋白的典型生产水平
实施例10
10.对用于ProGM杂交体生产的无血清培养条件的适应
为了证实ProGM杂交细胞用于商业生产的稳健性，将培养体积按比例放大至工作容积为1.2L的旋转瓶，并培养适应无血清环境。
方法
通过使FCS含量逐渐降低至7.5％、5.0％、2.5％、1.0％、0.5％和0％，使ProGM杂交体的最高hGM-CSF生产克隆适应在无血清环境中生长。仅将表现出最稳健的细胞生长和上述hGM-CSF的生产的传代培养物转移至连续更低的血清环境。将每个选择的传代培养物在我们的含有5％DMSO的标准培养基中冷冻保藏。2种无血清培养基用于适应目的。可商业得到的确定成分的无血清和蛋白的培养基Hybri-Max(Sigma)或Excel(JHR)经过一些改进后使用。在第7天，通过锥虫蓝排除，评估细胞生存力。在同一天，通过ELISA，测定hGM-CSF的浓度。
结果
对无血清培养条件的适应结果给出在表8中。
表8.ProGM在无血清条件中对hGM-CSF的生产
在ProGM杂交体的所有传代培养物中，hGM-CSF的生产随着血清和蛋白含量的降低而增加。尽管在无血清培养物中的细胞密度低，但在无血清培养基中的hGM-CSF的量是在标准培养条件下得到的量的大约4倍。当标准化成细胞浓度时，hGM-CSF的生产率增加了15倍。
实施例11
11.1.在旋转瓶中的生产
方法
在50r.p.m搅动具有1.2L工作容积的旋转瓶。以1x105细胞/ml的浓度，接种适应了在无血清环境中生长的ProGM杂交细胞(ProGMsf)。在含有5％CO2的湿润气氛中，在37℃温育培养物。实现的最大细胞密度是5x105细胞/ml。使用锥虫蓝排除方法，测定活细胞。每天更换培养基，持续最多9天。在1000r.p.m.离心细胞悬浮液(600ml)10min，取出培养基，更换为新鲜的培养基，并使细胞返回旋转瓶。通过ELISA，测定分泌的hGM-CSF的浓度。用1:500稀释的100μl大鼠抗-人GM-CSF(R&D)包被每个孔。在用含有0.05％v/v吐温20的PBS(PBS-T)洗涤以后，一式两份地向孔中添加100μl在PBS-5％v/v BSA中的在0.195-200ng/ml范围内的标准rhGM-CSF(Invitrogen)或100μl各自稀释100倍的样品。在37℃进行所有温育1h。然后，用PBS-T洗涤板，并添加100μl在PBS-BSA-T中1:1,000稀释的兔抗人GM-CSF(R&D)抗体，且在温育和洗涤以后，添加100μl在相同缓冲液中1:1,000稀释的山羊抗-兔免疫球蛋白-HRP缀合物。再次温育和洗涤板，且添加100μl底物。在450nm测量光密度。
结果
相对较低的细胞密度(5x105细胞/ml)指示ProGMsf的细胞生长的亚最适培养条件。为了达到更高的密度(在106细胞/ml的数量级)，可能需要进一步最优化培养条件，包括葡萄糖含量和其它补充物。也需要密切监控乳酸盐和铵含量。尽管亚最适生长，但培养物上清液中的hGM-CSF浓度在2.8-4.2μg/ml范围内。当标准化成细胞密度和时间时，ProGMsf表现出0.6-0.9μg hGM-CSF/ml/106细胞/24小时的生产率。为了对比，认为CHO细胞中0.3μg蛋白/ml/106细胞/24小时的生产是高的。
11.2.由ProGM杂交细胞系生产的人GM-CSF的纯化
方法
使用PM-10膜(Amicon)，将来自ProGMsf培养物的上清液在40℃浓缩大约10倍。根据生产商的规程，将样品浓缩物装载上免疫亲和柱，该柱通过将针对大肠杆菌-衍生的人GM-CSF的大鼠抗-人GM-CSF偶联到Affi-Gel 10(Bio-Rad)上而制备，用PBS(137mM NaCl、3mM KCl、8mM Na2HPO4、1.5mM KH2PO4)平衡该柱，并用0.1mM柠檬酸钠pH 2.8洗脱结合的蛋白。然后将从亲和柱洗脱的蛋白装载上RP300HPLC柱，并用乙腈(acetonitrite)梯度0-60％在60分钟内洗脱，流速为0.1ml/min。得到的洗脱图示于图40。收集从RP-HPLC回收的等分试样，用于ELISA、银染色和蛋白印迹分析。
结果
表9显示了hGM-CSF从典型的两步纯化的回收。从亲和柱的初步回收仅是59％，且在RPHPLC以后丧失了仅2％的hGM-CSF。在亲和纯化以后的低回收有许多可能的原因。亲和柱的结合容量可能低于ProGMsf的上清液中的hGM-CSF的量，因为13％的hGM-CSF在流通和洗涤步骤中丧失。低回收也可能是由于针对大肠杆菌-衍生的hGM-CSF产生的大鼠抗体比由ProGMsf杂交体生产的hGM-CSF的糖基化形式更低的亲和力。最终得率的其它潜在提高则是更好的最优化的洗脱条件的开发。在图41(参见第12部分)中，在RP-HPLC以后收集的级分的蛋白印迹表明，hGM-CSF洗脱在级分24-36中(在第24-36分钟洗脱)。高分子量形式(28-32kDa)洗脱在级分24-27中，而更低分子量的分子(18-22kDa)洗脱在级分34-36中。这些层析条件没有完全分离hGM-CSF的不同分子量形式，尤其是在高和中分子量级分中。
用银染色得到的概况和蛋白印迹概况是基本上相同的，从而表明仅hGM-CSF有关的蛋白结合在亲和柱上。观察到天然hGM-CSF的几种分子量种类。
表9.源自ProGMsf的hGM-CSF的两步纯化
RP-HPLC免疫测定阳性的级分
实施例12
12.糖苷酶消化
方法
在1％SDS、1M P-巯基乙醇、100mM磷酸钠、pH 7.0中，在100℃热变性纯化的源自ProGMsf杂交体的人GM-CSF 3min，添加0.8U的测序级PNGase F(Sigma)，并在37℃温育递增的时间段。
结果
从图43可见，在N-消化以后，源自ProGMsf杂交体的hGM-CSF形式以时间依赖性的方式迁移至靠近源自大肠杆菌的hGM-CSF的位置。但是，在消化以后的带都不对应由大肠杆菌生产的未糖基化形式。这些结果提示，源自ProGMsf杂交体的hGM-CSF在N-和O-糖基化位点处被糖基化，且分子量分布由异质糖基化造成。从未保护的O-糖基化位点的免疫原性的观点看，O-糖基化在所有hGM-CSF分子中的这种发现是重要的；已经报道，缺乏O-糖基化的重组人GM-CSF在临床试验中产生抗体。
数据提示，ProGMsf杂交细胞分泌3类hGM-CSF(根据N-糖基化位点)：在2个位点处被糖基化的分子(25-35kDa,2N-型)；在任一个位点处被糖基化的分子(20-25kDa,1N-型)；和在任一个位点处都没有被糖基化的分子(18-20kDa,0N-型)。
尽管已经参考具体实施例描述了本发明，但本领域技术人员将认识到，本发明可以以许多其它形式来体现，与本文所述的本发明的广阔的原理和精神一致。
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<170> PatentIn version 3.5
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cacactcgcc tgccttttcc 20
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<210> 4
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<210> 11
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<213> 智人（Homo sapiens）
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<210> 12
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<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
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<210> 13
<211> 28
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<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 13
gaatggaatt aataattaca agaatccc 28
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 14
tgtttcagat ccctttagtt ccag 24

Claims (65)

1.通过杂交下述细胞而产生的杂交细胞：
第一个细胞，其中所述第一个细胞是干细胞或源自未定型的祖细胞的细胞；
源自淋巴共同祖细胞的第二个细胞；和
源自淋巴共同祖细胞的第三个细胞，
且其中所述第一个细胞不是骨髓瘤细胞。
2.根据权利要求1所述的杂交细胞，其中所述第二个细胞是源自B淋巴谱系的细胞，且所述第三个细胞是源自B淋巴谱系的细胞。
3.根据权利要求1所述的杂交细胞，其中所述第二个细胞是源自T淋巴谱系的细胞，且所述第三个细胞是源自T淋巴谱系的细胞。
4.根据权利要求1所述的杂交细胞，其中所述第二个细胞是源自B淋巴谱系的细胞，且所述第三个细胞是源自T淋巴谱系的细胞。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的杂交细胞，其中所述第一个细胞是源自髓共同祖细胞的细胞。
6.根据权利要求5所述的杂交细胞，其中所述源自髓共同祖细胞的细胞是骨髓单核祖细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞或嗜碱性粒细胞。
7.根据权利要求5所述的杂交细胞系，其中所述源自髓共同祖细胞的细胞显示至少一种下述CD抗原：CD16、CD15或CD14。
8.根据权利要求5所述的杂交细胞，其中所述源自髓共同祖细胞的细胞是单核细胞。
9.根据权利要求5所述的杂交细胞，其中所述源自髓共同祖细胞的细胞是原代骨髓单核祖细胞。
10.根据权利要求5所述的杂交细胞，其中所述源自髓共同祖细胞的细胞是无限增殖化的细胞。
11.根据权利要求5所述的杂交细胞，其中所述源自髓共同祖细胞的细胞源自脾、外周血、脐带血或骨髓。
12.根据权利要求2或权利要求4所述的杂交细胞，其中所述源自B淋巴谱系的细胞是前B细胞、幼B细胞、幼稚B细胞、活化的B细胞或效应B细胞。
13.根据权利要求12所述的杂交细胞，其中所述效应B细胞是抗原处理过的B-细胞或浆细胞。
14.根据权利要求2或权利要求4所述的杂交细胞，其中所述源自B淋巴谱系的细胞显示至少一种下述CD抗原：CD19、CD20、CD72或CD5。
15.根据权利要求3或权利要求4所述的杂交细胞，其中所述源自T淋巴谱系的细胞是前T细胞、幼T细胞、幼稚T细胞、活化的T细胞或效应T细胞。
16.根据权利要求3或权利要求4所述的杂交细胞，其中所述源自T淋巴谱系的细胞显示至少一种下述CD抗原：CD3、CD4、CD5或CD8。
17.根据权利要求2或权利要求4所述的杂交细胞，其中所述源自B淋巴谱系的细胞是无限增殖化的细胞。
18.根据权利要求3或权利要求4所述的杂交细胞，其中所述源自T淋巴谱系的细胞是无限增殖化的细胞。
19.根据权利要求2或权利要求4所述的杂交细胞，其中所述源自B淋巴谱系的细胞源自淋巴组织。
20.根据权利要求3或权利要求4所述的杂交细胞，其中所述源自T淋巴谱系的细胞源自淋巴组织。
21.根据权利要求19或权利要求20所述的杂交细胞，其中所述淋巴组织选自：外周血、脐带血、脾、骨髓、胸腺、扁桃体、腺样体和局部淋巴结。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的杂交细胞，其中至少一个细胞是人细胞。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的杂交细胞，其中至少一个细胞是小鼠细胞。
24.根据权利要求5所述的杂交细胞，其中所述源自髓共同祖细胞的细胞是K562细胞。
25.根据权利要求1所述的杂交细胞，其中所述第二个细胞或所述第三个细胞是WIL2-NS细胞或MOLT4细胞。
26.根据权利要求2或权利要求4所述的杂交细胞，其中所述源自B淋巴谱系的细胞是WIL2-NS细胞。
27.根据权利要求3或权利要求4所述的杂交细胞，其中源自所述T淋巴谱系的细胞是MOLT4细胞。
28.根据权利要求1或权利要求4所述的杂交细胞，其中所述第一个细胞是K562细胞，所述第二个细胞是WIL2-NS细胞，且所述第三个细胞是MOLT4细胞。
29.根据权利要求1或权利要求4所述的杂交细胞，其中所述第一个细胞是K562细胞，所述第二个细胞是原代B细胞，且所述第三个细胞是原代T细胞。
30.根据权利要求1或权利要求4所述的杂交细胞，其中所述第一个细胞是原代人单核细胞，所述第二个细胞是WIL2-NS细胞，且所述第三个细胞是原代T细胞。
31.根据权利要求1或权利要求4所述的杂交细胞，其中所述第一个细胞是原代人骨髓单核祖细胞，所述第二个细胞是WIL2-NS细胞，且所述第三个细胞是原代人T细胞。
32.根据权利要求1或权利要求4所述的杂交细胞，其中所述第一个细胞是K562细胞，所述第二个细胞是WIL2-NS细胞，且所述第三个细胞是原代T细胞。
33.根据权利要求1或权利要求2所述的杂交细胞，其中所述第一个细胞是原代单核细胞，所述第二个细胞是WIL2-NS细胞，且所述第三个细胞是WIL2-NS细胞。
34.根据权利要求1或权利要求4所述的杂交细胞，其中所述第一个细胞是原代小鼠单核细胞，所述第二个细胞是SP2细胞，且所述第三个细胞是原代小鼠T细胞。
35.根据权利要求1或权利要求2所述的杂交细胞，其中所述第一个细胞是原代小鼠单核细胞，所述第二个细胞是SP2细胞，且所述第三个细胞是SP2细胞。
36.根据权利要求1或权利要求2所述的杂交细胞，其中所述第一个细胞是原代人或小鼠单核细胞，所述第二个细胞是WIL2-NS细胞，且所述第三个细胞是SP2细胞。
37.根据权利要求1-36中任一项所述的杂交细胞，其中所述杂交细胞表达所需蛋白。
38.根据权利要求1-36中任一项所述的杂交细胞，其中所述杂交细胞表达超过一种所需蛋白。
39.根据权利要求38所述的杂交细胞，其中所述杂交细胞表达2种所需蛋白。
40.根据权利要求38所述的杂交细胞，其中所述杂交细胞表达3种所需蛋白。
41.根据权利要求37所述的杂交细胞，其中所述蛋白是内源蛋白。
42.根据权利要求38-40中任一项所述的杂交细胞，其中所述蛋白中的至少一种是内源蛋白。
43.根据权利要求37所述的杂交细胞，其中所述蛋白是重组蛋白。
44.根据权利要求38-40中任一项所述的杂交细胞，其中所述蛋白中的至少一种是重组蛋白。
45.根据权利要求36-44中任一项所述的杂交细胞，其中所述蛋白是细胞因子。
46.根据权利要求37-44中任一项所述的杂交细胞，其中所述蛋白是集落刺激因子。
47.根据权利要求37-44中任一项所述的杂交细胞，其中所述蛋白是白介素。
48.根据权利要求37-44或46中任一项所述的杂交细胞，其中所述蛋白是GM-CSF。
49.根据权利要求37-44或47中任一项所述的杂交细胞，其中所述蛋白是白介素2。
50.根据权利要求37-44中任一项所述的杂交细胞，其中所述蛋白是受体或其片段。
51.根据权利要求37-44或50中任一项所述的杂交细胞，其中所述蛋白是可溶的受体。
52.根据权利要求36-44或50中任一项所述的杂交细胞，其中所述蛋白是人IL-4受体α链。
53.根据权利要求36-44或50中任一项所述的杂交细胞，其中所述蛋白是免疫球蛋白。
54.根据权利要求53所述的杂交细胞，其中所述免疫球蛋白是IgM。
55.根据权利要求53所述的杂交细胞，其中所述免疫球蛋白是IgG。
56.根据权利要求37-44或51中任一项所述的杂交细胞，其中所述蛋白是CD54。
57.根据权利要求1-56中任一项所述的杂交细胞，其中所述杂交通过电方法来实现。
58.根据权利要求1-56中任一项所述的杂交细胞，其中所述杂交通过化学方法来实现。
59.根据权利要求1-58中任一项所述的杂交细胞，其进一步与表达目标蛋白的细胞杂交。
60.如权利要求1-58中任一项所述的杂交细胞，其中所述杂交通过杂交3个个别细胞来实现。
61.如权利要求1-58中任一项所述的杂交细胞，其中所述杂交使用3个细胞群体来实现，其中每个所述群体包括多个相同的细胞类型。
62.根据权利要求1-61中任一项所述的杂交细胞，其中所述杂交细胞富含界定特定细胞类型的标记物，以允许表达表现出希望的翻译后修饰或希望的功能性的蛋白。
63.一种生产根据权利要求1-62中任一项所述的杂交细胞的方法，其中所述方法包括下述步骤：杂交：
第一个细胞，其中所述第一个细胞是干细胞或源自未定型的祖细胞的细胞；
源自淋巴共同祖细胞的第二个细胞；和
源自淋巴共同祖细胞的第三个细胞，
且其中所述第一个细胞不是骨髓瘤细胞。
64.一种生产蛋白的方法，所述方法包括下述步骤：在根据权利要求1-62中任一项所述的杂交细胞中表达蛋白。
65.在根据权利要求1-62中任一项所述的杂交细胞中生产的蛋白。
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