ES2714704T3

ES2714704T3 - Métodos de generación de células híbridas/quiméricas y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2714704T3
Application number: ES10785597T
Authority: ES
Inventors: Galina Kaseko; Tohsak L Mahaworasilpa
Original assignee: BTS Research International Pty Ltd
Current assignee: BTS Research International Pty Ltd
Priority date: 2009-06-10
Filing date: 2010-06-10
Publication date: 2019-05-29
Anticipated expiration: 2030-06-10
Also published as: EP2440653A1; CN107012126A; CA2764446C; TR201903287T4; WO2010141989A1; SG176302A1; PL2440653T3; CN102612556A; JP2012529270A; RU2536978C2; AU2010258093B2; EP2440653B1; US8778677B2; CN107012125A; KR101681480B1; IL216842A; JP5870026B2; CA2764446A1; DK2440653T3; PL2440653T4

Abstract

Una célula híbrida generada mediante la hibridación de: una primera célula, en la que dicha primera célula es una célula derivada de una célula progenitora mieloide común, en la que una célula progenitora mieloide común es una progenie de una célula madre hematopoyética restringida al linaje mieloide y capaz de dar origen a cualquiera de los progenitores de megacariocitos/eritrocitos o de granulocitos/macrófagos, pero no a células linfoides; una segunda célula derivada de una célula progenitora linfoide común; y una tercera célula derivada de una célula progenitora linfoide común, en la que una célula progenitora linfoide común es una progenie de una célula madre hematopoyética restringida al linaje linfoide y capaz de dar origen a linfocitos B, T y citolíticos naturales, pero no a células mieloides, en la que dicha segunda célula y dicha tercera célula no son una célula de mieloma, y en la que dicha segunda célula es preferentemente una célula derivada del linaje linfoide B y dicha tercera célula es preferentemente una célula derivada del linaje linfoide B o en la que dicha segunda célula es preferentemente una célula derivada del linaje linfoide T y dicha tercera célula es preferentemente una célula derivada del linaje linfoide T.

Description

DESCRIPCION

Metodos de generacion de celulas Idbridas/quimericas y usos de los mismos

Campo tecnico

[0001] La presente invencion se refiere a celulas hnbridas y a metodos para producir celulas hnbridas. En particular, la invencion se refiere a celulas hnbridas generadas a partir de la hibridacion de al menos tres celulas donde al menos dos celulas derivan de diferentes linajes. La invencion se refiere adicionalmente al uso de celulas tnbridas para la expresion de protemas utiles en una gama de aplicaciones de diagnostico, profilacticas, terapeuticas y/o de investigacion.

Antecedentes

[0002] Cualquier analisis de la tecnica anterior a lo largo de la memoria descriptiva no debe considerarse de ninguna manera como una admision de que dicha tecnica anterior es ampliamente conocida o de que forma parte del conocimiento general comun en el campo.

[0003] Actualmente se usa una diversidad de diferentes tipos celulares para expresar protemas que son comercialmente relevantes en una gama de aplicaciones de diagnostico, profilacticas, terapeuticas y/o de investigacion. Actualmente, la produccion de dichas protemas se realiza habitualmente en celulas tales como celulas de bacterias, levaduras, hongos, insectos y mairnferos no humanos.

[0004] Las celulas modifican con frecuencia protemas con una multitud de modificaciones postraduccionales que incluyen, pero no se limitan a, glucosilacion, acilacion, fosforilacion, metilacion, sulfatacion, prenilacion y lipidacion. Estas modificaciones son espedficas de especie y, como tales, las celulas utilizadas actualmente en la produccion de protemas comercialmente relevantes presentan modificaciones postraduccionales que son distintas de las modificaciones postraduccionales observadas en protemas expresadas a partir de celulas humanas o que se producen de forma natural en el cuerpo humano. Por ejemplo, muchos tipos celulares no de mai^eras utilizados para producir protemas comercialmente relevantes carecen de la capacidad para glucosilar protemas o presentan patrones de glucosilacion que son diferentes de los patrones de glucosilacion que presentan las protemas expresadas en celulas humanas.

[0005] Incluso en sistemas de expresion de mai^eras no humanos, tales como las celulas de ovario de hamster chino (CHO), se documentan diferencias significativas en los patrones de glucosilacion en comparacion con los de las celulas humanas. Por ejemplo, las estirpes celulares de CHO utilizadas para la expresion de protemas recombinantes carecen de una enzima sialiltransferasa funcional (a 2, 6) para la smtesis de acidos sialicos terminales unidos en (a 2, 6) que estan presentes en las celulas humanas. Ademas, los motivos de acido sialico que estan presentes en las glucoprotemas expresadas en celulas CHO son propensos a la degradacion por una sialidasa endogena de celulas CHO (Gramer et al. Biotechnology 13 (7): 692-&, 1995).

[0006] Como resultado de los distintos repertorios de modificacion postraduccional de los sistemas de expresion no humanos, las protemas expresadas a partir de ellos pueden presentar caractensticas fisicoqmmicas y farmacologicas tales como la vida media, la inmunogenicidad, la estabilidad y la eficacia funcional que son distintas de las protemas derivadas de celulas humanas. Esto puede afectar sustancialmente a la utilidad clmica de estas protemas.

[0007] Tambien existen pruebas crecientes de que, ademas de su naturaleza dependiente de la especie, las modificaciones postraduccionales tambien pueden ser espedficas de tejido e incluso espedficas de tipo celular dentro de la misma especie. Esto es particularmente relevante para la expresion espedfica de tejido y espedfica de tipo celular de protemas que presentan glucosilacion terminal (Feizi Nature 314: 53-54, 1985; Rademacher et al Annu Rev Biochem 57: 785-838, 1988). Espedficamente, se ha demostrado que tres sialiltransferasas, que unen acidos sialicos terminales a cadenas de azucar de glucoprotemas, presentan una expresion diferencial sorprendente en siete tejidos de la rata (Paulson et al J. Biol. Chem. 264: 10931-10934, 1989). Esto proporciona soporte para la glucosilacion espedfica de tejido de la misma protema. Ademas, los estudios con dos isoformas de una glucoprotema altamente fosforilada (osteopontina de raton) expresada por fibroblastos de raton y osteoblastos de raton de medula osea presentaron diferencias importantes en su grado de fosforilacion, que se correlacionaban con diferencias en la actividad biologica. Estos resultados indican que la funcion de la osteopontina producida por diferentes tipos celulares es distinta (Christensen et al J Biol. Chem. 282 (27): 19463-19472).

[0008] Idealmente, los sistemas celulares adecuados para la produccion de productos biologicos que presenten caractensticas completamente humanas debenan satisfacer una serie de criterios, incluyendo, pero no limitados a, los siguientes:

a) derivacion de tejido humano;

b) crecimiento de alta densidad en cultivo;

c) presentan rendimientos de protemas comercialmente viables;

d) permiten la introduccion de genes extranos estables;

e) permiten metodos de amplificacion de genes;

f) permiten el uso de una celula parental para la produccion de anticuerpos monoclonales como en los hibridomas humano-humano;

g) presentan expresion de protemas estable a largo plazo;

h) la capacidad de crecer en un medio sin suero y sin glutamina;

i) carecen de actividad endopeptidasa, lo que reduce la degradacion de protemas,

j) estan libres de agentes patogenos, incluyendo ADN vmco y micoplasma;

k) producen protemas que presentan modificaciones postraduccionales que son funcionalmente similares o iguales a las modificaciones postraduccionales que se producen en protemas humanas de origen natural, preferentemente espedficas de tejidos y celulas. Estas modificaciones postraduccionales pueden incluir, pero no se limitan a, restos de hidratos de carbono en glucoprotemas.

[0009] Si bien existe una serie de celulas hospedadoras humanas o heterohibridomas para la expresion de protemas humanas, ninguna de ellas cumple satisfactoriamente todos los criterios enumerados anteriormente. En particular, los intentos de expresar y aislar protemas de sistemas de expresion de celulas humanas existentes con rendimientos clmicamente utiles han dado como resultado un exito limitado.

[0010] La expresion de protemas en celulas eucariotas se controla en multiples etapas, que incluyen: (a) la influencia de factores reguladores sobre los genes en la cromatina; (b) la regulacion del inicio de la transcripcion; y (c) la modificacion postraduccional. Se piensa que estas etapas diferentes son espedficas de la etapa de desarrollo y/o espedficas de tejido. Por tanto, cuando un gen exogeno que codifica una protema deseada se incorpora en una celula, la expresion de la protema deseada puede ser inferior a optima. Pueden producirse como resultado problemas tales como la falta de expresion estable (Li et al., Proc Natl Acad Sci USA 95: 3650-3654, 1998; Miyaji et al., Cytotechnology, 3: 133-140, 1990; Miyaji et al., Cytotechnology 4: 173-180, 1990; Miyaji et al., Cytotechnology 4: 39-43, 1990; Satoh et al., Cytotechnology 13: 79-88, 1993), bajos rendimientos de expresion (Airoldi et al, Cancer Research 61: 1285-1290, 2001; Hosoi et al. Cytotechnology 7: 25-32, 1991) y modificaciones postraduccionales no optimas (Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278: 3466-3473, 2003). Todos estos factores pueden influir en la utilidad comercial potencial de la protema.

[0011] Como ejemplo, se uso una subestirpe de celulas Namalwa (celulas linfoblastoides B humanas cultivadas en cultivos en suspension y adaptadas a un medio sin suero y sin albumina), Namalwa KJM-1, para la produccion a gran escala de interferon alfa, que es una protema endogena para las celulas de linfoma de Burkitt. Sin embargo, cuando se uso protema G-CSF extrana para las celulas de linfoma de Burkitt pero endogena para las celulas B (Airoldi et al, Cancer Research 61: 1285-1290, 2001) como protema dirigida para la transfeccion a traves de electroporacion, los niveles de expresion de G-CSF variaron entre multiples clones resistentes a metotrexato (MTX) y el clon que mas produda G-CSF tuvo una productividad espedfica de solamente 2,4 |jg/ml/dfa cuando se adapto a las condiciones sin suero.

[0012] Adicionalmente, la productividad espedfica se redujo en un cultivo de alta densidad cuando el numero de celulas estaba por encima de 7x105 celulas/ml (Hosoi et al. Cytotechnology 7: 25-32, 1991). A pesar de que la concentracion maxima notificada de G-CSF mejoro notablemente y alcanzo 41 jg/ml, con el fin de conseguir esto, se requirio una manipulacion exhaustiva y laboriosa de las condiciones de cultivo celular con un control muy estricto del pH. Tambien mostro que el medio utilizado para el crecimiento optimo era diferente del utilizado para la produccion optima, creando de este modo un conflicto significativo entre la densidad alta y la velocidad de produccion alta deseadas y dando como resultado un sistema industrialmente no viable.

[0013] Debido a que la expresion genica en eucariotas se controla en multiples etapas, que incluyen: (a) disponibilidad y accesibilidad de los factores reguladores a los genes en la cromatina; (b) modulacion en promotores accesibles de la velocidad de inicio espedfico de la transcripcion; y (c) posteriormente eventos postranscripcionales en diversas etapas, la presencia de factores de transcripcion espedficos del tejido y espedficos del desarrollo tiene una gran influencia sobre la expresion de los genes. Adicionalmente, la regulacion genica de un tipo celular espedfico requiere la cooperacion de varias secuencias reguladoras del ADN que actuan en cis, que son sitios de union para protemas que transmiten senales moleculares a los genes (Blackwood et al., Science 281: 60-63, 1998). Estas secuencias se unen a protemas reguladoras para formar complejos conocidos como enhanceosomas (Marika et al., Curr Opin Genet Dev 11 (2): 205-208, 2001). Por tanto, cuanto mas lejos este el gen dirigido de su entorno celular habitual cuando se introduce en las celulas hospedadoras espedficas del linaje humano, se reducen la expresion y la produccion estables de la protema deseada a altos niveles de produccion. Cuando se transfectaron celulas Namalwa KJM-1 con genes de protemas extranas mas lejos de ser protemas espedficas de linaje para estirpes celulares linfoblastoides tales como interferon beta (Miyaji et al., Cytotechnology, 3: 133-140, 1990; Miyaji et al., Cytotechnology 4: 173-180, 1990) o linfotoxina humana (Miyaji et al., Cytotechnology 4: 39-43, 1990) o prourocinasa (Satoh et al., Cytotechnology 13: 79-88, 1993), se descubrio que la velocidad de transfeccion y la productividad celular eran aun menores.

[0014] La expresion eficiente de genes extranos en estirpes celulares espedficas del linaje humano tambien requiere una seleccion cuidadosa y, a veces, tediosa de un potenciador/promotor adecuado que contenga sitios de union para factores nucleares disponibles de celulas hospedadoras humanas. Encontrar un potenciador/promotor de este tipo aun podna dar como resultado una idoneidad limitada de un promotor de este tipo. Por ejemplo, cuando se investigaron varios potenciadores/promotores, tales como el promotor del gen temprano del virus de simio 40 (VS40), el promotor del gen inmediato-temprano principal del citomegalovirus humano (hCMV), el promotor del virus de la leucemia murina Moloney (Mo-MuLV), el promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV) y el promotor de la pactina de pollo, para determinar una expresion mas eficiente de un gen extrano en las celulas Namalwa KJM-1, se descubrio que el promotor del Mo-MuLV era aproximadamente 10 veces mas fuerte que el promotor temprano VS40 tradicional y los mayores clones productores alcanzaron una productividad de 30-40 pg/106celulasMa (Satoh et al., Cytotechnology 18: 162-172, 1996). Sin embargo, el problema con el uso de vectores retrovmcos tales como el Mo-MuLV es que son diffciles de usar para la transfeccion de genes con secuencias de inversion (intrones) debido a su retirada por la maquinaria de corte y empalme nuclear (Li et al., Proc Ntl Acad Sci USA 95: 3650-3654, 1998).

[0015] La falta de coincidencia entre el entorno celular y el nuclear aumenta aun mas en el caso de las protemas codificadas por dos genes tales como los anticuerpos. Adicionalmente, aunque las celulas Namalwa KJM-1 se usaron para la generacion de hibridomas humano-humano, los rendimientos de anticuerpos hicieron que esta estirpe celular no fuera adecuada para la produccion industrial.

[0016] Como otro ejemplo, se ha demostrado que la estirpe celular de rinon embrionario humano 293 se transfecta muy facilmente con genes de origen extrano con un alto grado de estabilidad. Sin embargo, las protemas derivadas de 293 transfectantes tienen un uso limitado y por lo general son adecuadas para fines de investigacion solamente porque las celulas 293 incluyen el adenovirus humano Ad5 ADN (celulas HEK 293). Sin embargo, la mayor limitacion en el uso de las celulas 293 en un entorno comercial es su naturaleza adherente. Se ha realizado una serie de intentos para adaptar 293 celulas para una transfeccion eficiente en suspension usando vehmulos rentables tales como la polietilenimina (Durocher et al., Nucleic Acids Res 30 (2): e9, 2002; Schlaeger et al., Cytotechnology 30: 71 83, 1999) o fosfato de calcio (Girard et al, Cytotechnology 38: 15-21, 2002; Jordan et al., Cytotechnology 26: 39-47, 1998; Meissner et al., Biotechnol Bioeng 75 (2): 197-203, 2001). Sin embargo, estos vehmulos solamente dan como resultado una expresion transitoria de protemas recombinantes, lo que significa que la transfeccion debe repetirse para cada nuevo lote de cultivo sembrado. Con el fin de conseguir un crecimiento de la suspension y una mayor expresion de protemas cuando el oriP del VEB esta presente en la cadena principal del vector, las celulas 293 tuvieron que ser modificadas geneticamente para expresar de forma estable la protema EBNA1 del virus de Epstein Barr (293E) (Durocher et al., Nucleic Acids Res 30 (2): e9, 2002; Parham et al., Cytotechnology 35: 181-187, 2001; Schlaeger et al., Cytotechnology 30: 71-83, 1999). Incluso despues de la transfeccion con EBNA1, las celulas 293E cuando se cultivan en medio sin suero (HEK293 EBNA1), (requisito previo para la produccion a gran escala) presentan una velocidad de transfeccion muy escasa muy probablemente debido a la presencia de polianiones (heparina, sulfato de dextrano) que se anaden para evitar la agregacion celular. Se han hecho intentos para mitigar este problema complementando el medio con peptonas obtenidas de la hidrolisis enzimatica de fuentes animales tales como carne, gelatina y casema (Pham et al., Biotechnol Bioeng 84 (3): 332-42, 2003). Cuando se uso la estirpe celular HEK293 EBNA1 para la produccion de Tie-2 (receptor tirosina cinasa para factores de crecimiento de angiopoyetina) y neuropilina-1 ED (receptor que media la gma de celulas neuronales), la expresion de la protema se vio limitada por los cultivos de baja densidad celular obtenidos en comparacion con los obtenidos en cultivos no transfectados. Ademas, la pureza del >95 % de la protema resultante es adecuada solamente para productos de calidad de investigacion. Ademas, las celulas HEK293 EBNA1 no son adecuadas para la produccion de anticuerpos monoclonales (mAb).

[0017] Las estrategias actuales para la produccion de mAb terapeuticos incluyen el uso de sistemas de celulas de mairnferos (es decir, transfectomas CHO o NS0) para producir de forma recombinante mAb derivados de la inmunizacion de ratones transgenicos que llevan genes de Ig humana (xenoratones), la humanizacion de mAb de roedores o a traves de la seleccion de bibliotecas de mAb humanos (van Dijk et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 5: 368 374, 2001). Si bien en terminos de su secuencia, los mAb terapeuticos han evolucionado recientemente a anticuerpos quimericos (regiones variables de roedores y constantes humanas), humanizados (secuencia humana excepto por regiones determinantes de la complementariedad de roedores) y completamente humanos (Ab humanos) para minimizar la respuesta alergica, el aspecto importante de un mAb terapeutico es su capacidad para desencadenar funciones efectoras inmunitarias, tales como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos que se ve comprometida si el mAb se produce en celulas hospedadoras no humanas que alteran su patron de glucosilacion nativo (Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278: 3466-3473, 2003). En vista de estos hechos, un escenario ideal es uno donde las celulas humanas producen anticuerpos terapeuticos. En este caso, los mAb completamente humanos podnan ejercer funciones efectoras humanas y tener una inmunogenicidad muy limitada debido a su estructura humana nativa.

[0018] Se ha notificado la generacion de hibridomas o estirpes linfoblastoides transformadas con el virus de Epstein-Barr (VEB) derivados de celulas B humanas (Kirman et al., Hybrid. Hybridomics 21: 405-414, 2002; Boerner et al., J. Immunol. 147: 86-95, 1991; Zafiropoulos et al., J. Immunol. Methods 200: 181-190, 1997). Sin embargo, hay información limitada acerca de la caracterizacion de estos mAb y las estirpes con respecto a su estabilidad a largo plazo y su idoneidad para procesos de fabricacion, especialmente los niveles de produccion y la estabilidad de la secrecion de Ig durante la fabricacion de todo el lote. Si bien se han notificado estirpes celulares que producen mAb humanos contra GM-CSF humanos a un tftulo acumulativo de 1,2 g/litro durante un penodo de 4 d^as, estas estirpes celulares derivaron de la hibridacion de celulas somaticas (fusion) de celulas B humanas primarias con celulas K6H6/B5 de heteromielolinfoma (es decir, una estirpe celular de raton-humano obtenida de una hibridacion de un linfoma de celulas B humanas y una celula de mieloma de raton (Li et al, Proc Natl Acad Sci USA 103 (10): 3557 3562, 2006).

[0019] En el caso de la transformacion con VEB, la dificultad ha sido el establecimiento de una estirpe de celulas B humanas completamente inmortalizadas mientras se mantiene la produccion estable de anticuerpos. Esto se debe a la baja eficacia de la inmortalizacion, la detencion del crecimiento celular y la inmortalizacion dominante de celulas productoras de IgM. Adicionalmente, informes recientes han demostrado que la mayona de las celulas B transformadas con VEB tienen telomeros mas cortos y una esperanza de vida limitada, principalmente antes de 160 niveles de duplicacion de la poblacion (Sugimoto et al., J Virol 73: 9690-9691, 1999; Toda et al., J Chromatogr B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 787: 197-206, 2003). Con el fin de superar este problema, se han hecho intentos de hibridar (o fusionar) celulas B transformadas con VEB con una estirpe celular companera adecuada (sistema de expresion) pero, en efecto, estas estirpes celulares companeras representan diversas combinaciones de heterohnbridos, tales como un trioma derivado de un heterohibridoma de raton humano con una celula B humana (Ainai et al., Hum Antibodies 15: 139-154, 2006; Kalantarov et al., Hum Antibodies 11: 85-96, 2002; Karpas et al., Proc Natl Acad Sci USA 98: 1799-1804, 2001). Cuando un trioma de este tipo se fusiono con celulas B transformadas con VEB primarias que produdan un anticuerpo contra la toxina tetanica (TT), dio como resultado un tetroma que tema una cuarta parte del componente del raton. Aunque la produccion estable de mAb contra TT fue posible despues de la clonacion consecutiva tres veces de los tetromas, dichas etapas repetidas de clonacion de celulas son laboriosos y requieren mucho tiempo. Ademas, aunque las cantidades de mAb producidos por tetromas fueron suficientes con fines experimentales, los niveles fueron insuficientes para la produccion a gran escala de mAb como agentes farmaceuticos. Todavfa es cuestionable si la inmortalizacion en presencia del activador policlonal CpG 2006 o la co-ligadura de CD19 o BCR podnan dar como resultado un sistema completo para una produccion eficiente de mAb espedficos en volumenes apropiados para su uso terapeutico (Hartman et al., J Immunol 164: 944 953, 2000; Hur et al., Cell Prolif 38: 35-45, 2005; Traggiai et al., Nat Med 10: 871-875, 2004).

[0020] Hering et al., BIOMEDICA BIOCHIMICA ACTA 47: 211-216, 1988 se relaciona con la fusion de la estirpe celular linfoblastoide B, Raji (linfoma de Burkitt) y la estirpe celular mieloide-eritroide K562 (subestirpe AB5). Se usaron hnbridos de estas celulas para la produccion de triomas cuando se fusionaron con celulas de bazo estimuladas humanas. El documento EP 0292965 A2 (CETUS CORPORATION, 1988) se refiere a una celula de trioma que comprende una celula de mieloma humano (U266), una celula B linfoblastoide transformada con VEB y una estirpe celular linfoblastoide que secreta IgG.

[0021] Se ha intentado una serie de enfoques para usar celulas humanas para la produccion de sustancias biologicas tales como factores de crecimiento, anticuerpos y protemas solubles.

[0022] Un objeto de la presente invencion es superar o mejorar al menos una de las desventajas de la tecnica anterior o proporcionar una alternativa util.

Sumario de la invencion

[0023] De acuerdo con la invencion, se proporciona una celula hnbrida como se define en la reivindicacion independiente 1 y un metodo de produccion de una protema como se define en la reivindicacion independiente 15. En las reivindicaciones dependientes se proporcionan ejemplos de caractensticas preferidas u opcionales.

[0024] En general, se considera que las celulas de fusion multiple son inestables y que cuantas mas celulas estan implicadas en una fusion, mayor es la inestabilidad de la celula tnbrida resultante. Sorprendentemente, en la presente invencion las celulas hnbridas que son resultado de la fusion de una serie de celulas, por ejemplo, tres celulas, presentan estabilidad funcional. En particular, se ha descubierto que las celulas derivadas de diferentes linajes pueden fusionarse o hibridarse somaticamente para formar celulas quimericas/hnbridas sustancialmente estables. Mas en particular, la presente invencion se refiere a celulas quimericas/hnbridas de linaje cruzado generadas a partir de la hibridacion de al menos tres celulas parentales que dan como resultado un tri-hnbrido donde al menos dos celulas parentales derivan de diferentes linajes y en el que no se incluye una celula de mieloma en la hibridacion.

[0025] Tambien se ha descubierto sorprendentemente que las celulas quimericas/hnbridas estables de la invencion tienen aplicaciones, por ejemplo, en la produccion de protemas que presentan modificaciones postraduccionales deseadas tales como, pero no limitadas a, patrones de glucosilacion humanos.

[0026] Tambien se ha descubierto sorprendentemente que los niveles de expresion de una protema deseada en las celulas quimericas/hnbridas estables de la invencion pueden potenciarse cuando una segunda protema deseada se expresa simultaneamente en las celulas quimericas/tnbridas de la invencion. Ademas, los niveles de expresion de dos protemas diana pueden potenciarse mediante la expresion simultanea de una tercera protema deseada en las celulas tnbridas/quimericas de la invencion.

[0027] En consecuencia, la presente invencion proporciona ventajas significativas sobre sistemas conocidos anteriormente en terminos de versatilidad y estabilidad de las celulas tnbridas. Las celulas tnbridas de la invencion se producen mediante la fusion de dos celulas identicas o dos celulas del mismo linaje y una celula de un linaje diferente. Un hnbrido de este tipo esta predispuesto a un fenotipo dirigido hacia el tipo de celula mayoritario utilizado en la hibridacion. Estas celulas tnbridas pueden usarse espedficamente para expresar protemas en las que se sabe que las modificaciones postraduccionales espedficas de tejido son importantes para la funcionalidad de la protema. Por ejemplo, una citocina que se sabe que tiene una modificacion postraduccional funcional espedfica cuando se expresa en una celula B puede expresarse mas eficientemente en una celula tnbrida que incluya al menos dos celulas derivadas de un linaje de celulas B, lo que garantiza una modificacion postraduccional funcional.

[0028] Como la modificacion postraduccional de protemas puede ser espedfica de tejido o espedfica de tipo celular, sera evidente para el experto en la materia que las celulas tnbridas de la invencion tambien pueden enriquecerse para un tipo de celula o un fenotipo particulares (como lo demuestra la presencia de marcadores CD espedficos) para permitir la expresion de una protema que presenta una modificacion postraduccional deseada o una funcionalidad deseada asociada a un tipo celular o un fenotipo particulares.

[0029] En una realizacion, la presente invencion se refiere a celulas tnbridas que incluyen el uso de al menos una celula inmortalizada. Sin embargo, sera evidente para el experto en la materia que la presente invencion tambien se relaciona con la fusion de celulas no inmortalizadas que posteriormente pueden inmortalizarse mediante un proceso de transformacion in vitro, tal como la introduccion de genes vmcos, por ejemplo, el virus de Epstein-Barr (VEB), antigeno T del virus de simio 40 (VS40), E1A y E1B de adenovirus y E6 y E7 del virus del papiloma humano (VPH). Como alternativa, las celulas no inmortalizadas pueden inmortalizarse a traves de la expresion de la protema transcriptasa inversa de la telomerasa (TERT). Las celulas inmortalizadas tambien pueden derivar de celulas en las que se ha modificado la expresion del oncogen. Las celulas inmortalizadas pueden derivar adicionalmente de cualquier accion que induzca una capacidad de crecimiento indefinido incluyendo, pero no limitada a, la exposicion a rayos UV o la transformacion espontanea en la que no se conoce el mecanismo de la inmortalidad.

[0030] Sera evidente que la presente invencion se refiere en una realizacion a la fusion de tres celulas individuales. En una realización alternativa, la presente invencion se refiere a la fusion de tres poblaciones de celulas en las que cada poblacion incluye una pluralidad de tipos celulares identicos. El experto en la materia entendena que la fusion de poblaciones de celulas podna realizarse en cultivos celulares en masa. Las celulas hibridadas deseadas pueden identificarse y aislarse despues, mediante metodos bien conocidos en la tecnica, por ejemplo, a traves de medios selectivos, tales como medio de hipoxantina aminopterina timidina (HAT). Como alternativa, pueden identificarse y aislarse celulas fusionadas mediante la identificacion de marcadores celulares espedficos, tales como los marcadores CD.

[0031] Sera evidente que el aislamiento de las celulas en funcion de su expresion de marcadores tales como los marcadores CD, asf como el enriquecimiento de una celula para un tipo celular o un fenotipo particulares, puede lograrse mediante metodos bien conocidos en la tecnica, tales como metodos de clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS).

[0032] Tambien sera evidente que las celulas de la presente invencion pueden transfectarse de forma estable o transitoria con ADN que codifica una protema deseada. Estas celulas estables o transfectadas transitoriamente pueden identificarse mediante metodos bien conocidos en la tecnica, tales como mediante la inclusion de un gen indicador de seleccion en el ADN utilizado en la transfeccion. Dichos genes indicadores pueden incluir genes que permitinan que las celulas transfectadas crezcan en un medio deficiente en compuestos, por ejemplo, el gen de la dihidrofolato reductasa (dhFr). Los indicadores tambien podnan incluir genes que confieran identificacion visual de celulas transfectadas, por ejemplo, el gen de la luciferasa o un gen de protema fluorescente verde (gfp). Como alternativa, el gen indicador podna conferir resistencia a un compuesto particular, por ejemplo, G418. Dichos genes indicadores son bien conocidos en la tecnica.

[0033] En una realización preferida, las celulas tnbridas de la invencion pueden usarse para expresar anticuerpos monoclonales. Tradicionalmente, la produccion de anticuerpos monoclonales se ha realizado a traves de la fusion de una celula de mieloma y una celula B derivada del bazo de un animal inmunizado tal como un raton. Sin embargo, la inestabilidad de las celulas de mieloma y, en particular, la inestabilidad genomica, pueden dar como resultado una expresion menos que satisfactoria del anticuerpo deseado. Adicionalmente, debido a que las celulas animales se usan en la produccion de hibridomas, los anticuerpos producidos presentan modificaciones postraduccionales no humanas. Los anticuerpos con modificaciones postraduccionales no humanas pueden dar como resultado problemas significativos cuando los anticuerpos se usan como agentes terapeuticos humanos. Estos problemas pueden incluir una funcion efectora reducida del anticuerpo, asf como una inmunogenicidad que da como resultado una semivida insatisfactoria in vivo y, por tanto, una eficacia reducida in vivo. Tambien existe evidencia que sugiere que los hnbridos no pueden producirse satisfactoriamente en ausencia de una celula de mieloma. Las celulas hnbridas de la invencion han demostrado sorprendentemente que pueden producirse hnbridos estables en ausencia de una celula de mieloma. Ademas, los anticuerpos expresados a partir de las celulas hnbridas de la invencion abordan los problemas asociados al uso de anticuerpos monoclonales producidos mediante hibridomas. Estos anticuerpos presentan modificaciones postraduccionales humanizadas y se expresan a partir de celulas que presentan estabilidad funcional.

[0034] De acuerdo con un primer aspecto, la presente divulgacion proporciona una celula hnbrida generada mediante la hibridacion de:

una primera celula, en la que dicha primera celula es una celula madre o una celula derivada de una celula progenitora no comprometida;

una segunda celula derivada de una celula progenitora linfoide comun; y

una tercera celula derivada de una celula progenitora linfoide comun,

y en la que dicha primera celula no es una celula de mieloma.

[0035] En una realizacion, dicha segunda celula es una celula derivada del linaje linfoide B y dicha tercera celula es una celula derivada del linaje linfoide B.

[0036] En otra realizacion, dicha segunda celula es una celula derivada del linaje linfoide T y dicha tercera celula deriva del linaje linfoide T.

[0037] En otra realizacion, dicha segunda celula es una celula derivada del linaje linfoide B y dicha tercera celula es una celula derivada del linaje linfoide T.

[0038] De acuerdo con la invencion, dicha primera celula es una celula derivada de una celula progenitora mieloide comun. Propiamente dicho, es evidente que la invencion proporciona una celula tnbrida generada mediante la hibridacion de una celula progenitora mieloide comun o una celula madre y dos celulas linfoides B o dos linfocitos linfoides T. La divulgacion tambien proporciona una celula hnbrida generada mediante la hibridacion de una celula progenitora mieloide comun o celula madre, una celula linfoide B y un linfocito linfoide T.

[0039] Preferentemente, dicha celula derivada de una celula progenitora mieloide comun, es una celula progenitora mielomonocftica, un monocito, un macrofago, un eosinofilo, un neutrofilo, una celula dendntica o un basofilo. Propiamente dicho, es evidente que la invencion proporciona una celula hnbrida generada mediante la hibridacion de un progenitor mielomonocftico, monocito, macrofago, eosinofilo, neutrofilo, celula dendntica o basofilo y dos celulas linfoides B o dos linfocitos linfoides T. La invencion tambien proporciona una celula hnbrida generada mediante la hibridacion de un progenitor mielomonocftico, monocito, macrofago, eosinofilo, neutrofilo, celula dendntica o basofilo, una celula linfoide B y un linfocito linfoide T.

[0040] Preferentemente, dicha celula derivada de una celula progenitora mieloide comun muestra al menos uno de los siguientes antfgenos CD CD16, CD15 o CD14. Propiamente dicho, es evidente que la invencion proporciona una celula hnbrida generada mediante la hibridacion de una celula progenitora mieloide comun que presenta al menos uno de los siguientes antfgenos CD CD16, CD15 o CD14 y dos celulas linfoides B o dos linfocitos linfoides T. La invencion tambien proporciona una celula hnbrida generada mediante la hibridacion de una celula hnbrida generada mediante la hibridacion de una celula progenitora mieloide comun que presenta al menos uno de los siguientes antfgenos CD CD16, CD15 o CD14, una celula linfoide B y un linfocito linfoide T.

[0041] En una realizacion, dicha celula derivada de una celula progenitora mieloide comun es un monocito. Propiamente dicho, la invencion proporciona una celula hnbrida generada mediante la hibridacion de un monocito y dos celulas linfoides B o dos linfocitos linfoides T. La invencion tambien proporciona una celula hnbrida generada mediante la hibridacion de un monocito, una celula linfoide B y un linfocito linfoide T.

[0042] En otra realizacion, dicha celula derivada de una celula progenitora mieloide comun es un progenitor mielomonocftico primario. Propiamente dicho, la invencion proporciona una celula hnbrida generada mediante la hibridacion de un progenitor mielomonocftico primario y dos celulas linfoides B o dos linfocitos linfoides T. La invencion tambien proporciona una celula hnbrida generada mediante la hibridacion de un progenitor mielomonocftico primario, una celula linfoide B y un linfocito linfoide T.

[0043] En una realizacion, dicha celula derivada de una celula progenitora mieloide comun es una celula inmortalizada. Propiamente dicho, es evidente que la invencion proporciona una celula hnbrida generada mediante la hibridacion de una celula inmortalizada seleccionada entre un progenitor mielomonocftico, monocito, macrofago, eosinofilo, neutrofilo, celula dendntica o basofilo y dos celulas linfoides B o dos linfocitos linfoides T. La invencion tambien proporciona una celula hnbrida generada mediante la hibridacion de una celula inmortalizada seleccionada entre un progenitor mielomonocftico, monocito, macrofago, eosinofilo, neutrofilo, celula dendntica o basofilo, una celula linfoide B y un linfocito linfoide T.

[0044] En otra realizacion, dicha celula derivada de una celula progenitora mieloide comun deriva del bazo, la sangre periferica, el cordon umbilical o la medula osea. Propiamente dicho, es evidente que la invencion proporciona una celula tubrida generada mediante la hibridacion de una celula progenitora mieloide comun derivada de bazo, sangre periferica, sangre de cordon umbilical o medula osea y dos celulas linfoides B o dos linfocitos linfoides T. La invencion tambien proporciona una celula tubrida generada mediante la hibridacion de una celula progenitora mieloide comun derivada de bazo, sangre periferica, sangre de cordon umbilical o medula osea, una celula linfoide B y un linfocito linfoide T.

[0045] En otra realizacion, dicha celula derivada del linaje linfoide B es una celula pre-B, una celula B inmadura, una celula B ingenua, una celula B activada o una celula B efectora. Propiamente dicho, es evidente que la invencion proporciona una celula tubrida generada mediante la hibridacion de una celula progenitora mieloide comun o una celula madre y dos celulas linfoides B seleccionadas entre una celula pre-B, una celula B inmadura, una celula B indiferenciada, una celula B activada o una celula B efectora. La invencion tambien proporciona una celula tubrida generada mediante la hibridacion de una celula progenitora mieloide comun o celula madre, una celula linfoide B seleccionada entre una celula pre-B, una celula B inmadura, una celula B indiferenciada, una celula B activada o una celula B efectora y un linfocito linfoide T.

[0046] En una realizacion, dicha celula B efectora es una celula B con experiencia antigenica o una celula plasmatica. Propiamente dicho, la invencion proporciona una celula tubrida generada mediante la hibridacion de una celula progenitora mieloide comun o celula madre y dos celulas linfoides B seleccionadas entre una celula B con experiencia antigenica o una celula plasmatica. La invencion tambien proporciona una celula hfbrida generada mediante la hibridacion de una celula progenitora mieloide comun o celula madre, una celula B con experiencia antigenica o una celula plasmatica y un linfocito linfoide T.

[0047] En una realizacion, dicha celula derivada del linaje linfoide B muestra al menos uno de los siguientes antfgenos CD CD19, CD20, CD72 o CD5. Propiamente dicho, la invencion proporciona una celula tubrida generada mediante la hibridacion de una celula progenitora mieloide comun o celula madre y dos celulas linfoides B que muestran al menos uno de los siguientes antfgenos CD CD19, CD20, CD72 o CD5. La invencion tambien proporciona una celula tubrida generada mediante la hibridacion de una celula progenitora mieloide comun o celula madre, una celula linfoide B que presenta al menos uno de los siguientes antfgenos CD CD19, CD20, CD72 o CD5 y un linfocito linfoide T.

[0048] En una realizacion, dicha celula derivada del linaje linfoide T es un linfocito pre-T, un linfocito T inmaduro, un linfocito T indiferenciado, un linfocito T activado o un linfocito T efector. Propiamente dicho, la invencion proporciona una celula tubrida generada mediante la hibridacion de una celula progenitora mieloide comun o celula madre, una celula linfoide B y un linfocito linfoide T seleccionado entre un linfocito pre-T, un linfocito T inmaduro, un linfocito T indiferenciado, un linfocito T activado o un linfocito T efector. La invencion tambien proporciona una celula tubrida generada mediante la hibridacion de una celula progenitora mieloide comun o celula madre y dos linfocitos linfoides T seleccionados entre un linfocito pre-T, un linfocito T inmaduro, un linfocito T indiferenciado, un linfocito T activado o un linfocito T efector.

[0049] En una realizacion, dicha celula derivada del linaje linfoide T muestra al menos uno de los siguientes antfgenos CD CD3, CD4, CD5 o CD8. Propiamente dicho, la invencion proporciona una celula tubrida generada mediante la hibridacion de una celula progenitora mieloide comun o celula madre, una celula linfoide B y un linfocito linfoide T que presenta al menos uno de los siguientes antfgenos CD CD3, CD4, CD5 o CD8. La invencion tambien proporciona una celula tubrida generada mediante la hibridacion de una celula progenitora mieloide comun o celula madre y dos linfocitos linfoides T seleccionados entre linfocitos T que muestran al menos uno de los siguientes antfgenos CD CD3, CD4, CD5 o CD8.

[0050] En una realizacion, dicha celula derivada del linaje linfoide B es una celula inmortalizada. Propiamente dicho, la invencion proporciona una celula tubrida generada mediante la hibridacion de una celula progenitora mieloide comun o celula madre y dos celulas linfoides B, al menos una de las cuales puede ser una celula inmortal. La invencion tambien proporciona una celula tubrida generada mediante la hibridacion de una celula progenitora mieloide comun o celula madre, una celula linfoide B inmortal y un linfocito linfoide T.

[0051] En una realizacion, dicha celula derivada del linaje linfoide T es una celula inmortalizada. Propiamente dicho, la invencion proporciona una celula tubrida generada mediante la hibridacion de una celula progenitora mieloide comun o celula madre, una celula linfoide B y un linfocito linfoide T inmortal.

[0052] En una realizacion, dicha celula derivada del linaje linfoide B deriva de tejido linfoide. Propiamente dicho, la invencion proporciona una celula tubrida generada mediante la hibridacion de una celula progenitora mieloide comun o celula madre y dos celulas linfoides B derivadas de tejido linfoide. La invencion tambien proporciona una celula tubrida generada mediante la hibridacion de una celula progenitora mieloide comun o celula madre, celula linfoide B derivada de tejido linfoide y un linfocito linfoide T.

[0053] En una realizacion, dicha celula derivada del linaje linfoide T deriva de tejido linfoide. Propiamente dicho, la invencion proporciona una celula tubrida generada mediante la hibridacion de una celula progenitora mieloide comun o celula madre, tejido de celulas linfoides B y un linfocito linfoide T derivado de tejido linfoide.

[0054] Cuando las celulas linfoides B o T incluidas en las celulas tubridas de la invencion derivan de tejido linfoide, dicho tejido linfoide se selecciona preferentemente entre sangre periferica, cordon umbilical, bazo, medula osea, timo, airngdalas, adenoides y ganglios linfaticos locales.

[0055] En una realizacion, al menos una de las celulas incluidas en la generacion de la celula tubrida de la invencion es una celula humana. Tambien sera evidente que, en una realizacion, la celula tubrida de la invencion puede incluir al menos una celula de raton.

[0056] En una realizacion, dicha celula derivada de una celula progenitora mieloide comun es una celula K562. Propiamente dicho, sera evidente que la invencion proporciona una celula tubrida generada mediante la hibridacion de una celula K562 y dos celulas linfoides B. La invencion tambien proporciona una celula tubrida generada mediante la hibridacion de una celula K562, una celula linfoide B inmortal y un linfocito linfoide T.

[0057] En una realizacion, dicha segunda celula o dicha tercera celula es una celula WIL2-NS o una celula MOLT4. Propiamente dicho, sera evidente que la invencion proporciona una celula tubrida generada mediante la hibridacion de una celula progenitora mieloide comun o celula madre, una celula WIL2-NS y un linfocito linfoide T. La invencion tambien proporciona una celula hfbrida generada mediante la hibridacion de una celula progenitora mieloide comun o celula madre, una celula linfoide B y una celula MOLT4.

[0058] En una realizacion, dicha primera celula es una celula K562, dicha segunda celula es una celula WIL2-NS y dicha tercera celula es una celula MOLT4.

[0059] En otra realizacion, dicha primera celula es una celula K562, dicha segunda celula es una celula B primaria y dicha tercera celula es un linfocito T primario.

[0060] En otra realizacion, dicha primera celula es un monocito humano primario, dicha segunda celula es una celula WIL2-NS y dicha tercera celula es un linfocito T primario.

[0061] En otra realizacion, dicha primera celula es un progenitor mielomonodtico humano primario, dicha segunda celula es una celula WIL2-NS y dicha tercera celula es un linfocito T humano primario.

[0062] En otra realizacion, dicha primera celula es una celula K562, dicha segunda celula es una celula WIL2-NS y dicha tercera celula es un linfocito T primario.

[0063] En otra realizacion, dicha primera celula es un monocito primario, dicha segunda celula es una celula WIL2-NS y dicha tercera celula es una celula WIL2-NS.

[0064] En otra realizacion, dicha primera celula es un monocito de raton primario, dicha segunda celula es una celula SP2 y dicha tercera celula es un linfocito T de raton primario.

[0065] En otra realizacion, dicha primera celula es un monocito de raton primario, dicha segunda celula es una celula SP2 y dicha tercera celula es una celula SP2.

[0066] En otra realizacion, dicha primera celula es un monocito humano o de raton primario, dicha segunda celula es una celula WIL2-NS y dicha tercera celula es una celula SP2.

[0067] En una realizacion, la celula hfbrida de la invencion expresa una protema deseada. En otra realizacion, la celula hfbrida de la invencion expresa mas de una protema deseada. En determinadas realizaciones, la celula hfbrida de la invencion expresa dos protemas deseadas. En otras realizaciones, la celula hfbrida de la invencion expresa tres protemas deseadas. En una realizacion, dicha protema deseada es una protema endogena y cuando se expresa mas de una protema deseada, al menos una de las protemas deseadas es una protema endogena. En otra realizacion, dicha protema es una protema recombinante y cuando se expresa mas de una protema deseada, al menos una de las protemas deseadas es una protema recombinante. Preferentemente dicha protema es una citocina, por ejemplo, un factor estimulante de colonias o una interleucina. En una realizacion, dicha protema es GM-CSF. En otra realizacion, dicha protema es interleucina 2. En otra realizacion mas, dicha protema es un receptor o fragmento de la misma. En una realizacion, dicha protema es un receptor soluble. En una realizacion adicional, dicha protema es una inmunoglobulina.

[0068] En una realizacion, dicha protema es una cadena alfa del receptor de IL-4 humano. En otra realizacion, dicha protema es IgM. En otra realización mas, dicha protema es IgG. En una realizacion adicional mas, dicha protema es CD54.

[0069] En una realización en la que la celula tnbrida de la invencion expresa mas de una protema deseada, preferentemente las protemas deseadas se seleccionan entre una citocina, un factor estimulante de colonias, una interleucina o un receptor o fragmento de la misma. En una realización particular, las protemas deseadas son una inmunoglobulina tal como IgM y en particular IgM soluble humana; una citocina, por ejemplo, una interleucina y en particular interleucina-2 (IL-2) y mas en particular IL2 humana; y/o un receptor, en particular un receptor de interleucina y mas en particular un receptor de interleucina humana e incluso mas en particular el receptor alfa de interleucina-4 humana (IL-4Ra).

[0070] El experto en la materia entendera que las celulas tnbridas de la invencion no se limitan a expresar protemas particulares deseadas ni se limitan a expresar un determinado numero de protemas. Ademas, sera evidente para el experto en la materia que la expresion simultanea de protemas deseadas de las celulas tnbridas de la invencion puede dar como resultado la potenciacion de los niveles de expresion de protemas deseados.

[0071] En una realizacion, dicha hibridacion utilizada para generar la celula tnbrida de la invencion se consigue por medios electricos. En otra realizacion, dicha hibridacion para generar la celula tnbrida de la invencion se consigue por medios qmmicos.

[0072] En una realizacion, la celula tnbrida de la invencion se hibrida adicionalmente con una celula que expresa una protema de interes.

[0073] En una realización particular, la celula hibrida de la invencion se hibrida con un linfocito B que presenta antigeno CD25.

[0074] En una realización particularmente preferida, la celula tnbrida de la invencion muestra el antigeno CD25 y expresa una inmunoglobulina. En una realización adicional, la celula tnbrida de la invencion se hibrida con un linfocito B que presenta antigeno CD25 y la celula resultante expresa una inmunoglobulina.

[0075] En una realizacion, dicha hibridacion utilizada para generar la celula tnbrida de la invencion se realiza mediante la hibridacion de tres celulas individuales.

[0076] En otra realizacion, dicha hibridacion utilizada para generar la celula hibrida de la invencion se realiza usando tres poblaciones de celulas en las que cada una de dichas poblaciones incluye una pluralidad de tipos celulares o fenotipos identicos.

[0077] En una realizacion, dicha celula hibrida de la invencion se enriquece para un marcador particular que define el tipo celular para permitir la expresion de una protema que presenta una modificacion postraduccional deseada o una funcionalidad deseada.

[0078] En otro aspecto, la invencion proporciona un metodo de produccion de una protema, comprendiendo dicho metodo la etapa de expresar una protema en una celula hibrida de acuerdo con la invencion.

[0079] En otro aspecto, la invencion proporciona una protema cuando se produce en una celula hibrida de acuerdo con la invencion.

[0080] En otro aspecto, la divulgacion proporciona un metodo de produccion de una celula hibrida de acuerdo con la divulgacion en la que dicho metodo incluye la etapa de hibridar:

una segunda celula derivada de una celula progenitora linfoide comun; y

una tercera celula derivada de una celula progenitora linfoide comun,

y en la que dicha primera celula no es una celula de mieloma.

[0081] En un ejemplo del metodo de la divulgacion, dicha segunda celula es una celula derivada del linaje linfoide B y dicha tercera celula es una celula derivada del linaje linfoide B.

[0082] En otro ejemplo del metodo de la divulgacion, dicha segunda celula es una celula derivada del linaje linfoide T y dicha tercera celula deriva del linaje linfoide T.

[0083] En otro ejemplo del metodo de la divulgacion, dicha segunda celula es una celula derivada del linaje linfoide B y dicha tercera celula es una celula derivada del linaje linfoide T.

[0084] Preferentemente, dicha primera celula es una celula derivada de una celula progenitora mieloide comun. Propiamente dicho, es evidente que la divulgacion proporciona un metodo de produccion de una celula tubrida mediante la hibridacion de una celula progenitora mieloide comun o una celula madre y dos celulas linfoides B o dos linfocitos linfoides T. La divulgacion tambien proporciona un metodo de produccion de una celula tubrida mediante la hibridacion de una celula progenitora mieloide comun o celula madre, una celula linfoide B y un linfocito linfoide T.

[0085] Preferentemente, dicha celula derivada de una celula progenitora mieloide comun, es una celula progenitora mielomonocftica, monocito, macrofago, eosinofilo, neutrofilo, celula dendntica o basofilo. Propiamente dicho, es evidente que la divulgacion proporciona un metodo de produccion de una celula tubrida mediante la hibridacion de un progenitor mielomonocftico, monocito, macrofago, eosinofilo, neutrofilo, celula dendntica o basofilo y dos celulas linfoides B o dos linfocitos linfoides T. La divulgacion tambien proporciona un metodo de produccion de una celula tubrida mediante la hibridacion de un progenitor mielomonocftico, monocito, macrofago, eosinofilo, neutrofilo, celula dendntica o basofilo, una celula linfoide B y un linfocito linfoide T.

[0086] Preferentemente, dicha celula derivada de una celula progenitora mieloide comun presenta al menos uno de los siguientes antfgenos CD CD16, CD15 o CD14. Propiamente dicho, es evidente que la divulgacion proporciona un metodo de produccion de una celula tubrida mediante la hibridacion de una celula progenitora mieloide comun que presenta al menos uno de los siguientes antfgenos CD CD16, CD15 o CD14 y dos celulas linfoides B o dos linfocitos linfoides T. La divulgacion tambien proporciona un metodo de produccion de una celula tubrida mediante la hibridacion de una celula progenitora mieloide comun que presenta al menos uno de los siguientes antfgenos CD CD16, CD15 o CD14, una celula linfoide B y un linfocito linfoide T.

[0087] En un ejemplo, dicha celula derivada de una celula progenitora mieloide comun es un monocito. Propiamente dicho, la divulgacion proporciona un metodo de produccion de una celula hfbrida mediante la hibridacion de un monocito y dos celulas linfoides B o dos linfocitos linfoides T. La divulgacion tambien proporciona un metodo de produccion de una celula hfbrida mediante la hibridacion de un monocito, una celula linfoide B y un linfocito linfoide T.

[0088] En otro ejemplo, dicha celula derivada de una celula progenitora mieloide comun es un progenitor mielomonocftico primario. Propiamente dicho, la divulgacion proporciona un metodo de produccion de una celula hfbrida mediante la hibridacion de un progenitor mielomonocftico primario y dos celulas linfoides B o dos linfocitos linfoides T. La divulgacion tambien proporciona un metodo de produccion de una celula hfbrida mediante la hibridacion de un progenitor mielomonocftico primario, una celula linfoide B y un linfocito linfoide T.

[0089] En un ejemplo, dicha celula derivada de una celula progenitora mieloide comun es una celula inmortalizada. Propiamente dicho, es evidente que la divulgacion proporciona un metodo de produccion de una celula hfbrida mediante la hibridacion de una celula inmortalizada seleccionada entre un progenitor mielomonocftico, monocito, macrofago, eosinofilo, neutrofilo, celula dendntica o basofilo y dos celulas linfoides B o dos linfocitos linfoides T. La divulgacion tambien proporciona un metodo de produccion de una celula tubrida mediante la hibridacion de una celula inmortalizada seleccionada entre un progenitor mielomonocftico, monocito, macrofago, eosinofilo, neutrofilo, celula dendntica o basofilo, una celula linfoide B y un linfocito linfoide T.

[0090] En otro ejemplo, dicha celula derivada de una celula progenitora mieloide comun deriva del bazo, la sangre periferica, el cordon umbilical o la medula osea. Propiamente dicho, es evidente que la divulgacion proporciona un metodo de produccion de una celula hubrida mediante la hibridacion de una celula progenitora mieloide comun derivada de bazo, sangre periferica, sangre de cordon umbilical o medula osea y dos celulas linfoides B o dos linfocitos linfoides T. La divulgacion tambien proporciona un metodo de produccion de una celula tubrida mediante la hibridacion de una celula progenitora mieloide comun derivada de bazo, sangre periferica, sangre de cordon umbilical o medula osea, una celula linfoide B y un linfocito linfoide T.

[0091] En otro ejemplo, dicha celula derivada del linaje linfoide B es una celula pre-B, una celula B inmadura, una celula B indiferenciada, una celula B activada o una celula B efectora. Propiamente dicho, es evidente que la divulgacion proporciona un metodo de produccion de una celula hfbrida mediante la hibridacion de una celula progenitora mieloide comun o una celula madre y dos celulas linfoides B seleccionadas entre una celula pre-B, una celula B inmadura, una celula B indiferenciada, una celula B activada o una celula B efectora. La divulgacion tambien proporciona un metodo de produccion de una celula hfbrida mediante la hibridacion de una celula progenitora mieloide comun o celula madre, una celula linfoide B seleccionada entre una celula pre-B, una celula B inmadura, una celula B indiferenciada, una celula B activada o una celula B efectora y un linfocito linfoide T.

[0092] En un ejemplo, dicha celula B efectora es una celula B con experiencia antigenica o una celula plasmatica. Propiamente dicho, la divulgacion proporciona un metodo de produccion de una celula hfbrida mediante la hibridacion de una celula progenitora mieloide comun o celula madre y dos celulas linfoides B seleccionadas entre una celula B con experiencia antigenica o una celula plasmatica. La divulgacion tambien proporciona un metodo de produccion de una celula tubrida mediante la hibridacion de una celula progenitora mieloide comun o celula madre, una celula B con experiencia antigenica o una celula plasmatica y un linfocito linfoide T.

[0093] En un ejemplo, dicha celula derivada del linaje linfoide B presenta al menos uno de los siguientes antigenos CD CD19, CD20, CD72 o CD5. Propiamente dicho, la divulgacion proporciona un metodo de produccion de una celula tubrida mediante la hibridacion de una celula progenitora mieloide comun o celula madre y dos celulas linfoides B que presentan al menos uno de los siguientes antigenos CD CD19, CD20, CD72 o CD5. La divulgacion tambien proporciona un metodo de produccion de una celula tubrida mediante la hibridacion de una celula progenitora mieloide comun o celula madre, una celula linfoide B que presenta al menos uno de los siguientes antigenos CD CD19, CD20, CD72 o CD5 y un linfocito linfoide T.

[0094] En un ejemplo, dicha celula derivada del linaje linfoide T es un linfocito pre-T, un linfocito T inmaduro, un linfocito T indiferenciado, un linfocito T activado o un linfocito T efector. Propiamente dicho, la divulgacion proporciona un metodo de produccion de una celula tubrida mediante la hibridacion de una celula progenitora mieloide comun o celula madre, una celula linfoide B y un linfocito linfoide T seleccionado entre un linfocito pre-T, un linfocito T inmaduro, un linfocito T indiferenciado, un linfocito T activado o un linfocito T efector. La divulgacion tambien proporciona un metodo de produccion de una celula tubrida mediante la hibridacion de una celula progenitora mieloide comun o celula madre y dos linfocitos linfoides T seleccionados entre un linfocito pre-T, un linfocito T inmaduro, un linfocito T indiferenciado, un linfocito T activado o un linfocito T efector.

[0095] En un ejemplo, dicha celula derivada del linaje linfoide T presenta al menos uno de los siguientes antfgenos CD CD3, CD4, CD5 o CD8. Propiamente dicho, la divulgacion proporciona un metodo de produccion de una celula tubrida mediante la hibridacion de una celula progenitora mieloide comun o celula madre, una celula linfoide B y un linfocito linfoide T que presenta al menos uno de los siguientes antfgenos CD CD3, CD4, CD5 o CD8. La divulgacion tambien proporciona un metodo de produccion de una celula tubrida mediante la hibridacion de una celula progenitora mieloide comun o celula madre y dos linfocitos linfoides T seleccionadas entre linfocitos T que presentan al menos uno de los siguientes antfgenos CD CD3, CD4, CD5 o CD8.

[0096] En un ejemplo, dicha celula derivada del linaje linfoide B es una celula inmortalizada. Propiamente dicho, la divulgacion proporciona un metodo de produccion de una celula tubrida mediante la hibridacion de una celula progenitora mieloide comun o celula madre y dos celulas linfoides B, al menos una de las cuales puede ser una celula inmortal. La divulgacion tambien proporciona un metodo de produccion de una celula tubrida mediante la hibridacion de una celula progenitora mieloide comun o celula madre, una celula linfoide B inmortal y un linfocito linfoide T.

[0097] En un ejemplo, dicha celula derivada del linaje linfoide T es una celula inmortalizada. Propiamente dicho, la divulgacion proporciona un metodo de produccion de una celula hubrida mediante la hibridacion de una celula progenitora mieloide comun o celula madre, una celula linfoide B y un linfocito linfoide T inmortal.

[0098] En un ejemplo, dicha celula derivada del linaje linfoide B deriva de tejido linfoide. Propiamente dicho, la divulgacion proporciona un metodo de produccion de una celula hfbrida mediante la hibridacion de una celula progenitora mieloide comun o celula madre y dos celulas linfoides B derivadas de tejido linfoide. La divulgacion tambien proporciona un metodo de produccion de una celula hfbrida mediante la hibridacion de una celula progenitora mieloide comun o celula madre, una celula linfoide B derivada de tejido linfoide y un linfocito linfoide T. En un ejemplo, dicha celula derivada del linaje linfoide T deriva de tejido linfoide. Propiamente dicho, la divulgacion proporciona un metodo de produccion de una celula hfbrida mediante la hibridacion de una celula progenitora mieloide comun o celula madre, tejido de celulas linfoides B y un linfocito linfoide T derivado de tejido linfoide.

[0099] Cuando las celulas linfoides B o T incluidas en el metodo de produccion de una celula hfbrida de la divulgacion derivan de tejido linfoide, dicho tejido linfoide se selecciona preferentemente entre sangre periferica, cordon umbilical, bazo, medula osea, timo, amfgdalas, adenoides y ganglios linfaticos locales.

[0100] En un ejemplo, al menos una de las celulas incluidas en el metodo de produccion de una celula tubrida de la divulgacion es una celula humana. Tambien sera evidente que, en una realizacion, el metodo de produccion de una celula hfbrida de la divulgacion puede incluir al menos una celula de raton.

[0101] En un ejemplo, dicha celula derivada de una celula progenitora mieloide comun es una celula K562. Propiamente dicho, sera evidente que la divulgacion proporciona un metodo de produccion de una celula hfbrida mediante la hibridacion de una celula K562 y dos celulas linfoides B. La divulgacion tambien proporciona un metodo de produccion de una celula hfbrida mediante la hibridacion de una celula K562, una celula linfoide B inmortal y un linfocito linfoide T.

[0102] En un ejemplo, dicha segunda celula o dicha tercera celula es una celula WIL2-NS o una celula MOLT4. Propiamente dicho, sera evidente que la divulgacion proporciona un metodo de produccion de una celula hfbrida mediante la hibridacion de una celula progenitora mieloide comun o celula madre, una celula WIL2-NS y un linfocito linfoide T. La divulgacion tambien proporciona un metodo de produccion de una celula hfbrida mediante la hibridacion de una celula progenitora mieloide comun o celula madre, una celula linfoide B y una celula MOLT4.

[0103] En un ejemplo, dicha primera celula es una celula K562, dicha segunda celula es una celula WIL2-NS y dicha tercera celula es una celula MOLT4.

[0104] En otro ejemplo del metodo de la divulgacion, dicha primera celula es una celula K562, dicha segunda celula es una celula B primaria y dicha tercera celula es un linfocito T primario.

[0105] En otro ejemplo del metodo de la divulgacion, dicha primera celula es un monocito humano primario, dicha segunda celula es una celula WIL2-NS y dicha tercera celula es un linfocito T primario.

[0106] En otro ejemplo del metodo de la divulgacion, dicha primera celula es un progenitor mielomonodtico humano primario, dicha segunda celula es una celula WIL2-NS y dicha tercera celula es un linfocito T humano primario.

[0107] En otro ejemplo del metodo de la divulgacion, dicha primera celula es una celula K562, dicha segunda celula es una celula WIL2-NS y dicha tercera celula es un linfocito T primario.

[0108] En otro ejemplo del metodo de la divulgacion, dicha primera celula es un monocito primario, dicha segunda celula es una celula WIL2-NS y dicha tercera celula es una celula WIL2-NS.

[0109] En otro ejemplo del metodo de la divulgacion, dicha primera celula es un monocito de raton primario, dicha segunda celula es una celula SP2 y dicha tercera celula es un linfocito T de raton primario. En otro ejemplo del metodo de la divulgacion, dicha primera celula es un monocito de raton primario, dicha segunda celula es una celula SP2 y dicha tercera celula es una celula SP2.

[0110] En otro ejemplo del metodo de la divulgacion, dicha primera celula es un monocito humano o de raton primario, dicha segunda celula es una celula WIL2-NS y dicha tercera celula es una celula SP2.

Definiciones

[0111] En el contexto de la presente invencion, las expresiones "comprende", "que comprende" y similares han de interpretarse en su sentido inclusivo, en oposicion a su sentido exclusivo, es decir, en el sentido de "incluyendo, pero no limitado a".

Celula h^brida

[0112] Una celula hnbrida es una celula que comprende componentes de mas de un genoma (distintos de los cigotos y derivados de los mismos). Es una celula que se construye a partir de una hibridacion de celulas somaticas (o una hibridacion de celulas completas) de, por ejemplo, dos o mas celulas biologicas (celulas parentales). Las celulas parentales pueden obtenerse de un mismo linaje (o especie) o de un linaje (o especie) diferente. La celula hnbrida creada a partir del mismo linaje y especie se denomina auto-hnbrido, mientras que la de diferentes linajes se denomina hetero-hnbrido.

Celula quimerica

[0113] Una celula quimerica es una celula hnbrida producida de forma artificial con un genoma que se origina a partir de dos o mas especies diferentes.

Celula h^brida de linaje cruzado

[0114] Una celula hnbrida de linaje cruzado es una celula hnbrida producida de forma artificial con un genoma que se origina a partir de dos o mas celulas derivadas de diferentes linajes celulares. Las celulas hematopoyeticas se dividen en dos linajes principales: linfoide (linfocitos T, celulas B y linfocitos NK) y mieloide (monocitos y macrofagos, neutrofilos, basofilos y eosinofilos, eritrocitos, megacariocitos/plaquetas, celulas dendnticas).

Celula tri-h^brida

[0115] Una celula tri-hnbrida es una celula hnbrida producida de forma artificial con un genoma que se origina a partir de tres celulas.

Estable

[0116] Cuando se refiere a una celula, el termino "estable" denota la capacidad de una celula para demostrar la uniformidad de un determinado parametro de crecimiento o productividad, o la uniformidad de las caractensticas del producto de la estirpe celular con un numero de generacion creciente. Cuando se usa en referencia a un transfectante estable, denota una estirpe celular que expresa un transgen a un nivel relativamente constante sustancialmente indefinido.

Hibridacion de celulas somaticas

[0117] En el contexto de la presente solicitud, la expresion "hibridacion de celulas somaticas" se refiere a un proceso en el que se crea una unica celula viable a partir de dos o mas celulas diploides (no gametos) (celulas parentales) de manera que se induzca que las membranas plasmaticas de las celulas esten en contacto estrecho, se induzca una ruptura reversible de las membranas plasmaticas de las celulas parentales en el punto de contacto simultaneamente y se combinen las entidades u organulos de cada celula parental dentro de la envoltura de la celula unica recien formada. La celula unica recien formada se denomina celula hibridada o celula hubrida.

Celula madre

[0118] La expresion "celula madre" se refiere a una celula no especializada con capacidad para dividirse por mitosis y para desarrollarse en una gama de diferentes tipos celulares. Las celulas madre pueden incluir celulas madre embrionarias, celulas madre "adultas" derivadas de cordon umbilical o celulas madre derivadas de adultos. Las celulas madre incluyen celulas no humanas que tienen una capacidad ilimitada para diferenciarse en todos los tipos celulares, es decir, celulas totipotentes no humanas. Las celulas madre tambien pueden incluir celulas que estan limitadas en su capacidad para diferenciarse en celulas especializadas, por ejemplo, celulas madre pluripotentes, multipotentes, oligopotentes o unipotentes.

Celula inmortalizada

[0119] La expresion "celula inmortalizada" se refiere a una celula que tiene una capacidad de crecimiento indefinido. Sera evidente que una celula inmortalizada puede derivar de una malignidad in vivo o un embrion no humano. Como alternativa, una celula inmortalizada puede derivarse realizando una accion en una celula que induzca una capacidad de crecimiento indefinido. Estas acciones pueden incluir, por ejemplo, procesos de transformacion in vitro, por ejemplo, la introduccion de genes vmcos tales como el virus de Epstein-Barr (VEB), el antfgeno T del virus de simio 40 (VS40), E1A y E1B de adenovirus y E6 y E7 del virus del papiloma humano (VPH). Como alternativa, una celula inmortalizada puede derivar de una celula a traves de la expresion de la protema transcriptasa inversa de la telomerasa (TERT) u otros medios. Las celulas inmortalizadas tambien pueden derivar de celulas en las que se ha modificado la expresion del oncogen. Las celulas inmortalizadas pueden derivar de cualquier accion que induzca una capacidad de crecimiento indefinido incluyendo, pero no limitada a, la exposicion a rayos UV o la transformacion espontanea en la que no se conoce el mecanismo de inmortalidad.

Celula de mieloma

[0120] La expresion "celula de mieloma" se refiere a una malignidad de una celula plasmatica.

Hibridoma

[0121] El termino "hibridoma" se refiere a una celula que se produce mediante la hibridacion de una celula de mieloma y una celula B derivada del bazo de un animal inmunizado. Los hibridomas son celulas inmortalizadas con capacidad para producir anticuerpos monoclonales.

Celula progenitora no comprometida

[0122] La expresion "celula progenitora no comprometida" se refiere a un descendiente temprano de una celula madre que solo puede diferenciarse en tipos limitados de celulas sin estar comprometido con ningun linaje espedfico, pero que ya no puede renovarse.

Celulas progenitoras mieloides comunes

[0123] Una celula progenitora mieloide comun es una progenie de una celula madre hematopoyetica restringida al linaje mieloide y capaz de dar origen a progenitores ya sea de megacariocitos/eritrocitos o de granulocitos/macrofagos, pero no a celulas linfoides.

Progenitor linfoide comun

[0124] Un progenitor linfoide comun es una progenie de las celulas madre hematopoyeticas restringida al linaje linfoide y que da origen a celulas B, linfocitos T y linfocitos citolfticos naturales, pero no a celulas mieloides.

Celula derivada del linaje linfoide B

[0125] Una celula derivada del linaje linfoide B es cualquier celula que se origina a partir de un progenitor linfoide comun despues de su compromiso de linaje B para convertirse en cualquier tipo de celulas B.

Celula derivada del linaje linfoide T

[0126] Una celula derivada del linaje linfoide T es cualquier celula que se origina a partir de un progenitor linfoide comun despues de su compromiso de linaje T para convertirse en cualquier tipo de linfocitos T.

Celula progenitora de granulocitos-macrofagos

[0127] Una celula progenitora de granulocitos-macrofagos es una celula progenitora que se origina a partir de una celula progenitora mieloide comun y que esta comprometida con los linajes de granulocitos y monocitos, pero no con los linajes megacariodtico y eritroide.

Celula progenitora de megacariocitos-eritroide

[0128] Una celula progenitora de megacariocitos-eritroide es una celula progenitora que se origina a partir de una celula progenitora mieloide comun y que esta comprometida con los linajes megacariocftico y eritroide, pero no con los linajes de granulocitos y monocitos.

Celula pre-B

[0129] Una celula pre-B es una celula B en desarrollo en la etapa en la que la cadena pesada de IgM unida a membrana se expresa con una cadena ligera sustituta.

Celula B inmadura

[0130] Una celula B inmadura se refiere a una celula B en desarrollo en la medula osea en la que en la etapa de recombinacion de anticuerpos los loci VJ se reorganizan en cadenas L y los VDJ se reorganizan en cadenas H, se presenta la expresion del receptor IgM.

Celula B indiferenciada

[0131] Una celula B indiferenciada es una celula B madura que se ha diferenciado y madurado en la medula osea a traves de un reordenamiento genico aleatorio de su inmunoglobulina de superficie, pero que aun no ha encontrado anftgeno afm en la periferia.

Celula B activada

[0132] Un tipo de celula B madura que ha encontrado su antfgeno afm en la periferia a traves del reconocimiento de antfgenos a traves de BCR, dando como resultado una combinacion de proliferacion clonal y diferenciacion terminal en celulas plasmaticas de forma dependiente o independiente de T.

Celula B efectora

[0133] Una celula efectora B es con frecuencia sinonimo de una celula plasmatica que secreta anticuerpos, un tipo de celula B de corta duracion que secreta anticuerpos espedficos para un anftgeno particular, asf como una gran cantidad de citocinas para implicar otras celulas del sistema inmunitario.

Celula B de memoria

[0134] Una celula B de memoria es una celula B de larga vida formada a partir de una celula B activada que es espedfica del anftgeno encontrado durante la respuesta inmunitaria primaria y es capaz de proporcionar una respuesta rapida despues de una segunda exposicion al mismo anftgeno.

Celula plasmatica

[0135] Una celula plasmatica es una celula postmitotica terminal, de corta vida, del sistema inmunitario, que se diferencia a partir de una celula B tras la estimulacion por linfocitos CD4+ (linfocitos Th) y segrega una gran cantidad de anticuerpos.

Linfocito pre-T

[0136] Un linfocito pre-T es un linfocito T en desarrollo en la etapa en la que VbDbJb esta completa y la cadena beta de TCR se expresa en un linfocito T (CD3+) doble negativo (CD4"CD8").

Linfocito T inmaduro

[0137] Un linfocito T inmaduro es un linfocito T en desarrollo que ha migrado de la medula osea al timo pero que no ha completado la reorganizacion de su TCR o la seleccion de su capacidad de union de TCR a los autopeptidos presentados en el contexto de moleculas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) o ha experimentado el compromiso con los linajes T citolftico o T auxiliar que se correlacionan precisamente con la especificidad de TCR de una celula hacia las moleculas del CMH de clase I o II, respectivamente. El compromiso de linaje esta marcado fenotfpicamente por la perdida de expresion de una de las moleculas correceptoras, CD8 o CD4.

Linfocito T indiferenciado

[0138] Un linfocito T maduro que se ha diferenciado en la medula osea y que ha experimentado satisfactoriamente los procesos positivos y negativos de la seleccion central en el timo con una nueva concordancia de su TCR y la perdida de una de las moleculas correceptoras, pero aun no ha encontrado un antigeno afm en la periferia.

Linfocito T activado

[0139] Un linfocito T activado es un linfocito T que, a traves de la implicacion tanto de TCR como de CD28 en la superficie celular por el peptido del complejo mayor de histocompatibilidad (complejo peptido:CMH) y miembros de la familia B7 en las celulas presentadoras de antigeno, respectivamente, se establece convirtiendose en un linfocito T efector espedfico de antigeno.

Linfocito T efector

[0140] Un linfocito T efector es un tipo de linfocito T de vida corta que puede responder inmediatamente tras el contacto con celulas que llevan el complejo peptido:CMH apropiado para la celula.

Breve descripción de las figuras

[0141]

Figura 1. Identificacion y celulas K562 CD71 purificadas por clasificacion.

Figura 2. Perfiles de FACS de celulas K562 positivas para CD15 y CD71; (a) aproximadamente el 18 % de la poblacion original de celulas K562 enriquecidas con CD71 fue positiva para CD15 (region R1) y (b) reanalisis de celulas K562 positivas para CD15 despues de dos meses en cultivo.

Figura 3. Expresion de CD15 en celulas mononucleares de LMA CD34+.

Figura 4. Un perfil de FACS de CD16 y ventanas de clasificacion para diferentes poblaciones de celulas CD14+ aisladas por perlas magneticas de CD14 (MACS).

Figura 5. Un perfil de FACS de celulas mononucleares de sangre de cordon umbilical tenidas con anticuerpos anti-CD19 humano de raton y anticuerpos anti-CD5 humano de raton.

Figura 6. Un perfil de FACS de celulas de sangre de cordon umbilical mononucleares tenidas con anticuerpos anti-CD3 humano de raton y anti-CD5 humano de raton.

Figura 7. Un perfil de FACS de celulas mononucleares de medula osea tenidas con anticuerpos anti-CD20 humano de raton y anti-CD72 humano de raton.

Figura 8. Un perfil tfpico de FACS de celulas mononucleares amigdalinas para CD3 y CD54.

Figura 9. Identificacion de linfocitos cultivados positivos para IgM e IgG; (A) despues de 5 dfas de cultivo, el 18 % de las celulas CD19+ fueron positivas para IgM y el 1 % tema IgG detectable sobre la superficie celular y; (B) despues de 10 dfas en cultivo, el porcentaje de linfocitos positivos para IgM se redujo al 2 % y el porcentaje de celulas positivas para IgG aumento al 15 %.

Figura 10. Perfiles de FACS de expresiones de CD sobre celulas tri-hnbridas KMW con oncogen de fuentes mieloides y linfoides.

Figura 11. Expresion de CD4 y CD19 sobre linfocitos primarios de bazo mixtos, poblaciones de CD4 y CD19 clasificados y una estirpe celular tri-hnbrida KBT resultante; (a) expresion de CD4 y CD19 sobre linfocitos primarios de bazo (b) perfil de pureza de celulas CD19+ clasificadas (98,1 %); (c) perfil de pureza de celulas CD4+ clasificadas (96,8 %); (d) coexpresion de CD19 y CD4 sobre las celulas trihnbridas. Mas del 99 % de la poblacion de celulas tri-hnbridas coexpresa marcadores tanto para celulas B como para linfocitos T

Figura 12. Expresiones de CD19, CD3 y CD5 sobre celulas tri-hnbridas KBT derivadas de celulas mieloides inmortales y 2 celulas linfoides experimentadas con experiencia con antfgeno primario; (a) expresion de CD19 y CD5 sobre la superficie de celulas tri-hnbridas KBT, (b) expresion de CD3 y CD5 en el tri hnbrido de KBT.

Figura 13. Expresiones en superficie de CD4, CD8, CD72 y CD20 sobre celulas tri-hnbridas KBT derivadas de celulas mieloides inmortales y 2 celulas linfoides primarias derivadas de medula osea y timo; (a) expresion de CD4 y CD8, (b) expresion de CD4 y c D72, (c) expresion de CD20 y CD8.

Figura 14. Perfiles de FACS de expresiones de CD sobre una estirpe tri-hnbrida WTM con oncogen de fuente linfoide y CD4 y CD14 de celulas primarias; (a) coexpresion de CD19 y CD4 sobre las celulas trihnbridas que muestra una poblacion de celulas CD19 con alto nivel de expresion de CD4 (CD19 CD4H) y otra con bajo nivel de expresion de CD4 (CD19 CD4L) y; (b) coexpresion de CD4 y CD14 sobre la misma poblacion de tri-hnbridos positiva para CD19 que muestra una mayor heterogenia de la poblacion celular basada en la expresion alta o baja de CD14 (CD4HCD14L; CD4HCD14H; CD4LCD14H).

Figura 15. Perfiles de FACS tfpicos de expresiones de CD sobre las celulas tri-hnbridas WTM con oncogen WIL2-NS de fuente linfoide, CD5 derivado de linfocitos T con experiencia antigenica y CD14 derivado de celulas monodticas primarias.

Figura 16. Perfiles de FACS de expresiones de CD en celulas tri-hnbridas WTM con oncogen de WIL2NS de fuente linfoide, CD8 derivado de linfocitos T citotoxicos y CD14 derivado de celulas monodticas primarias.

Figura 17. Un perfil de FACS de coexpresion de CD4 y CD8 en los tri-hnbridos de WTM derivados de linfocitos T doble positivos para CD.

Figura 18. Expresiones de CD sobre la superficie de celulas tri-fnbridas WTM que se originan a partir de celulas progenitoras mielomonodticas; tincion tricolor con CD19, CD4 y CD15 y (B) tincion tricolor con CD34 y CD15 derivados de progenitor mielomonodtico y CD4 derivados de linfocitos T efectores. Figura 19. La expresion de marcadores espedficos de linaje de celulas tri-hnbridas KWT derivadas de linfocitos T efectores CD4+.

Figura 20. Expresiones de marcadores espedficos de linaje de celulas tri-hnbridas KWT derivadas de linfocitos T CD4+ CD8+ doble positivos.

Figura 21. Una expresion de marcadores espedficos de linaje de celulas tri-hnbridas KWT derivadas de linfocitos T con experiencia con antfgeno CD5+.

Figura 22. Perfil de expresion de CD tfpico de celulas tri-hnbridas WWM que se originan a partir de dos celulas, conteniendo cada una oncogen linfoide y una celula monodtica primaria; (a) coexpresion de CD19 y CD14 sobre las celulas tri-hnbridas (region R1) que muestran una poblacion distinta de celulas positivas para CD19 que no expresan CD14 (region R2); (b) expresion de CD14 sobre celulas trihnbridas derivadas de las celulas clasificadas en la region R1 y expandidas en el cultivo durante 2 meses y; (c) falta de CD14 de superficie sobre las celulas tri-hnbridas derivadas de la poblacion clasificada de la region R22 meses despues.

Figura 23. RT-PCR representativa para CD14 obtenido de diferentes subpoblaciones de celulas tri-hnbridas WWM.

Figura 24. Un cariotipado de un unico clon de celulas K562. Los resultados indicaron que la estirpe celular K562 era triploide, que tema un numero modal de 69 cromosomas. Se detectaron las siguientes anomalfas cromosomicas: falta un cromosoma X; inversion paracentrica del brazo largo del cromosoma 2, que implica las bandas q33 y q35; falta el cromosoma 3, un cromosoma 5 derivado adicional con material cromosomico adicional de origen desconocido que reemplaza el segmento de q11.2; una duplicacion de un segmento del brazo corto del cromosoma 6 entre las bandas p21.2 y p23; un cromosoma 7 adicional con una inversion paracentrica del brazo corto del cromosoma 7 que implica las bandas p13 y p22; falta un cromosoma 9; una supresion terminal del brazo corto del cromosoma 9 de la banda p13; un cromosoma 9 derivado resultante de una translocacion que implica segmentos de dos cromosomas 9; un derivado del cromosoma 10 resultante de una translocacion que implica segmentos de los cromosomas 3 y 10; falta el cromosoma 13; material cromosomico adicional de origen desconocido en el brazo corto de un cromosoma 13; falta el cromosoma 14; material adicional de origen desconocido que reemplaza el segmento de p13 en dos cromosomas 17; un cromosoma 18 derivado resultante de una translocacion que implica segmentos de los cromosomas 1 y 18; falta un cromosoma 20; un cromosoma 21 derivado resultante de la translocacion que implica segmentos de los cromosomas 1 y 21; falta un cromosoma 22; cinco cromosomas marcadores diferentes adicionales.

Figura 25. Un cariotipado de uno de los cinco clones de la estirpe celular WIL2NS. En este clon (CLON 1), se detectaron las siguientes anomalfas; un cromosoma 8 derivado resultante de una translocacion que implica segmentos de los cromosomas 1 y 8; un homologo extra del cromosoma 13; un derivado del cromosoma 14 resultante de la translocacion que implica segmentos de los cromosomas 5 y 14; una duplicacion del cromosoma 17 del segmento de q22-q23.

Figura 26. Un cariotipado de la estirpe tri-hnbrida KBT-1 (CD19+) y (CD4+), que muestra un clon de una unica celula casi triploide. El recuento de cromosomas vario de 65 a 66 debido a la perdida aleatoria, pero tuvo un numero modal de cromosomas de 66. Se detectaron las siguientes anomalfas cromosomicas: un X derivado formado a partir de una translocacion compleja que implica el brazo corto del cromosoma X y posiblemente otros 2 cromosomas no identificados; falta un cromosoma X; inversion paracentrica en el brazo largo del cromosoma 2 que implica las bandas q33 y q35; falta el cromosoma 3; supresion del cromosoma 3p; un cromosoma 4 derivado que implica segmentos del cromosoma 4 y otro cromosoma no identificado; un cromosoma 5 derivado adicional con material cromosomico adicional de origen desconocido que reemplaza el segmento de q11.2; una duplicacion de un segmento del brazo corto del cromosoma 6 entre las bandas p21.2 y p23; un cromosoma 7 derivado adicional que implica el brazo largo del cromosoma 7 y el brazo largo del marcador 3; falta un cromosoma 13; material cromosomico adicional de origen desconocido en el brazo corto de un cromosoma 13; falta un cromosoma 14; falta un cromosoma 15; material adicional de origen desconocido reemplaza el segmento de p13 en dos cromosomas 17; un cromosoma 18 derivado resultante de una translocacion que implica segmentos de los cromosomas 1 y 18; falta un cromosoma 20; un cromosoma 21 derivado resultante de una translocacion que implica segmentos de los cromosomas 1 y 21; falta el cromosoma 22; cuatro cromosomas marcadores diferentes adicionales.

Cariotipo de tri-hforido de linaje cruzado de KBT (celulas K562 y CD20+CD72+ y CD4+CD8+) (o linaje cruzado de KBT-2), que muestra cuatro clones casi triploides, (A) el CLON 1 tiene un numero modal de cromosomas de 67 y las siguientes anomalfas cromosomicas: un derivado X formado a partir de una translocacion compleja que implica el brazo corto del cromosoma X y posiblemente otros dos cromosomas no identificados; falta un cromosoma X; un cromosoma 1 derivado que implica segmentos del cromosoma 1 y, muy probablemente, del cromosoma 4; Inversion paracentrica en el brazo largo del cromosoma 2, que implica las bandas q33 y q35; falta un cromosoma 3; lo mas probable es que un cromosoma 4 suprimido sea un cromosoma 4 derivado pequeno; un cromosoma 5 derivado adicional con material cromosomico adicional de origen desconocido que reemplaza el segmento de q11.2; una duplicacion de un segmento del brazo corto del cromosoma 6 entre las bandas p21.2 y p23; un cromosoma 7 derivado adicional que implica el brazo largo del cromosoma 7 y el brazo largo del marcador 3; falta un cromosoma 9; una supresion terminal del brazo corto del cromosoma 9 de la banda p13; un cromosoma 9 derivado resultante de una translocacion que implica segmentos de dos cromosomas 9; un cromosoma 10 derivado resultante de una translocacion que implica segmentos de los cromosomas 3 y 10; falta un cromosoma 13; material cromosomico adicional de origen desconocido en el brazo corto de un cromosoma 13; falta un cromosoma 14; el material adicional de origen desconocido reemplaza el segmento de p13 en dos cromosomas 17; un cromosoma 18 derivado resultante de una translocacion que implica segmentos de los cromosomas 1 y 18; falta un cromosoma 20; un cromosoma 21 derivado resultante de una translocacion que implica segmentos de los cromosomas 1 y 21; falta un cromosoma 22; cuatro cromosomas marcadores diferentes adicionales (B) el CLON 2 contiene 65 a 67 cromosomas debido a la perdida aleatoria (el numero modal de cromosomas es 67) y tiene caractensticas cromosomicas similares al CLON 1, con la excepcion de que el cromosoma 4 suprimido del CLON 1 esta sustituido por un cromosoma 4 derivado definido que implica segmentos del cromosoma 4 y otro cromosoma no identificado, (C) el CLON 3 es esencialmente igual al CLON 1 pero falta el cromosoma 1 derivado y hay un cromosoma 4 derivado diferente derivado de segmentos de los cromosomas 1 y 4. Contiene de 67 a 68 cromosomas debidos a la perdida aleatoria con un numero modal de 67, (D) el CLON 4 es esencialmente igual al CLON 1 pero falta un cromosoma 1 y un cromosoma 1 derivado diferente resultante de una translocacion que implica segmentos de los cromosomas 1 y 4. Hay solo dos cromosomas 5 normales y un cromosoma 5 derivado que parece ser un 5q satelital.

Un cariotipado de la estirpe tri-tubrida KWT-1 (celulas mieloides y linfoides B inmortales y linfocitos T CD4+ maduros primarios derivadas del tri-tubrido de KWT), que muestra un unico clon que es casi hexaploide con un numero modal de 129 a 140 cromosomas y las siguientes anomalfas cromosomicas: faltan dos cromosomas X; falta un cromosoma 1; falta un cromosoma 2; inversion paracentrica en el brazo largo del cromosoma 2, que implica las bandas q33 y q35; faltan dos cromosomas 3; falta un cromosoma 4; un cromosoma 4 derivado con material cromosomico adicional de origen desconocido que reemplaza el segmento de q35; un homologo extra del cromosoma 5; dos derivados adicionales del cromosoma 5 con material cromosomico adicional de origen desconocido que reemplaza el segmento de q11.2; un homologo extra del cromosoma 6; un cromosoma 6 adicional con una duplicacion de un segmento del brazo corto del cromosoma 6 entre las bandas p21.2 y p23; un homologo extra del cromosoma 7; dos cromosomas 7 con una inversion paracentrica del brazo corto del cromosoma 7 que implica las bandas p13 y p22; un cromosoma 8 derivado resultante de una translocacion que implica segmentos de los cromosomas 1 y 8; faltan dos cromosomas 9; una supresion terminal del brazo corto del cromosoma 9 de la banda p13; dos cromosomas 9 derivados resultantes de una translocacion que implica segmentos de dos cromosomas 9; un derivado del cromosoma 10 resultante de una translocacion que implica segmentos de los cromosomas 3 y 10; falta un cromosoma 12; un cromosoma 13 con material cromosomico adicional de origen desconocido en el brazo corto de un cromosoma 13; faltan dos cromosomas 14; un derivado del cromosoma 14 resultante de una translocacion que implica segmentos de los cromosomas 5 y 14; falta un cromosoma 15; falta un cromosoma 17; dos cromosomas 17 con material adicional de origen desconocido que reemplazan el segmento de p13 en dos cromosomas 17; dos cromosomas 17 con una duplicacion en el segmento de q22-q23; faltan dos cromosomas 18; un cromosoma 20 adicional; un cromosoma 21 derivado resultante de una translocacion que implica segmentos de los cromosomas 1 y 21; falta un cromosoma 22; siete cromosomas marcadores adicionales con dos copias del cromosoma 2 marcador.

Un cariotipado de KWT-2 (celulas mieloides y linfoides B inmortales y linfocitos T CD3+CD5+ de memoria primarios derivadas de la estirpe tri-hnbrida KWT), que muestra un unico clon que es casi hexaploide con un numero modal de 135 a 142 cromosomas y las siguientes anomalfas cromosomicas: faltan dos cromosomas X; falta un cromosoma 1; falta un cromosoma 2; inversion paracentrica en el brazo largo del cromosoma 2, que implica las bandas q33 y q35; faltan dos cromosomas 3; falta un cromosoma 4; un cromosoma 4 derivado con material cromosomico adicional de origen desconocido que reemplaza el segmento de q35; un homologo adicional del cromosoma 5; dos derivados adicionales del cromosoma 5 con material cromosomico adicional de origen desconocido que reemplaza el segmento de q11.2; un homologo adicional del cromosoma 6; un cromosoma 6 adicional con una duplicacion de un segmento del brazo corto del cromosoma 6 entre las bandas p21.2 y p23; dos cromosomas 7 con una inversion paracentrica del brazo corto del cromosoma que implica las bandas p13 y p22; un cromosoma 8 derivado resultante de una translocacion que implica segmentos de los cromosomas 1 y 8; faltan dos cromosomas 9; una supresion terminal del brazo corto del cromosoma 9 de la banda p13; dos cromosomas 9 derivados resultantes de una translocacion que implica segmentos de dos cromosomas 9; un derivado del cromosoma 10 resultante de una translocacion que implica segmentos de los cromosomas 3 y 10; falta un cromosoma 12; un cromosoma 13 con material cromosomico adicional de origen desconocido en el brazo corto de un cromosoma 13; faltan dos cromosomas 14; un derivado del cromosoma 14 resultante de una translocacion que implica segmentos de los cromosomas 5 y 14; falta un cromosoma 15; falta un cromosoma 17; dos cromosomas 17 con material adicional de origen desconocido que reemplazan el segmento de p13 en dos cromosomas 17; dos cromosomas 17 con una duplicacion en el segmento de q22-q23; faltan dos cromosomas 18; un cromosoma 20 adicional; un cromosoma 21 derivado resultante de una translocacion que implica segmentos de los cromosomas 1 y 21; falta un cromosoma 22; ocho cromosomas marcadores adicionales con dos copias del cromosoma 2 marcador.

Cariotipado de la estirpe tri-hnbrida KWT-3 (celulas mieloides y linfoides B inmortales y linfocitos T CD4+CD8+ doble positivo primarios derivadas del tri-hnbrido de KWT), que muestra tres clones que son hiperpentaploides con un numero modal de cromosomas de 124 a 139. (A) El CLON 1 tiene las siguientes anomalfas cromosomicas: tres cromosomas X y un unico cromosoma Y; un cromosoma 1 adicional; dos cromosomas 2 adicionales; inversion paracentrica en el brazo largo del cromosoma 2, que implica las bandas q33 y q35; falta un cromosoma 3; un derivado adicional del cromosoma 5 resultante de una translocacion que implica el cromosoma 5 y un cromosoma de origen desconocido; un cromosoma 6 adicional; una duplicacion de un segmento del brazo corto del cromosoma 6 entre las bandas p21.2 y p23; una inversion paracentrica adicional del brazo corto del cromosoma 7 que implica las bandas p13 y p22; un cromosoma 8 derivado resultante de una translocacion que implica segmentos de los cromosomas 1 y 8; una supresion terminal del brazo corto del cromosoma 9 de la banda p13; un cromosoma 9 derivado resultante de una translocacion que implica segmentos de dos cromosomas 9; dos cromosomas 10 adicionales; dos derivadas del cromosoma 10 resultantes de una translocacion que implica segmentos de los cromosomas 3 y 10; dos cromosomas 13 adicionales; un material cromosomico adicional de origen desconocido en el brazo corto de un cromosoma 13; falta un cromosoma 14; un derivado del cromosoma 14 resultante de una translocacion que implica segmentos de los cromosomas y 14; un material adicional de origen desconocido que reemplaza el segmento de p13 en tres cromosomas 17; dos cromosomas una duplicacion del cromosoma 17 en el segmento de q22-q23; un cromosoma 18 adicional; un cromosoma 18 derivado resultante de una translocacion que implica segmentos de los cromosomas 1 y 18; un cromosoma 19 adicional; falta un cromosoma 20; un cromosoma 21 derivado resultante de una translocacion que implica segmentos de los cromosomas 1 y 21; cinco cromosomas marcadores adicionales con dos copias de cada cromosoma marcador 4 y 5. (B) El CLON 2 tiene anomalfas cromosomicas similares a las del CLON 1 excepto porque perdio un cromosoma 9. (C) El CLON 3 contiene las mismas anomalfas cromosomicas que el CLON 2 excepto porque la inversion paracentrica en el brazo largo del cromosoma se reemplaza con un cromosoma 2 isoderivado resultante de la formacion de un isocromosoma que implica un cromosoma 2 derivado que se genero mediante una inversion paracentrica en el brazo largo, que implica las bandas q33 y q35. Cariotipados de tri-hnbridos de WWM (A) y su subestirpe enriquecida con CD14 (B) que muestran un unico clon dominante que aumenta su presencia del 55 % en el tri-tnbrido de WWM original al 95 % en su subestirpe enriquecida con CD14. Cada uno tiene un numero modal de 47 cromosomas y las siguientes anomalfas cromosomicas: un derivado del cromosoma 8 resultante de una translocacion que implica segmentos de los cromosomas 1 y 8; un homologo adicional del cromosoma 13; un derivado del cromosoma 14 resultante de una translocacion que implica segmentos de los cromosomas 5 y 14; una duplicacion del cromosoma 17 del segmento de q22-23; un cromosoma 21 derivado resultante de una translocacion que implica segmentos de los cromosomas 3 y 21. La unica diferencia entre el tri-hnbrido de WWM original y su subestirpe CD14+ enriquecida es que estas anomalfas estan presentes en solo el 55 % de las celulas en el WWM original y en el 95 % de las celulas de la subestirpe enriquecida con CD14. El resto de las celulas del tri-hnbrido de WWM vanan desde casi triploides (con perdida aleatoria de cromosomas) hasta casi tetraploides (con perdida aleatoria de cromosomas).

Figura 32. Transferencia Western de sobrenadantes de cultivos de ProGM. Los carriles 1 y 2 se cargaron con sobrenadantes de cultivos de linfocitos T humanos de 4 dfas no activados y activados, respectivamente. Los carriles 4 y 5 conteman sobrenadantes de cultivos de ProGM cultivados en ausencia o en presencia de tunicomicina, respectivamente. El sobrenadante de celulas que no expresaban GM-CSF se uso en el Carril 3. Como referencia, se uso hGM-CSF recombinante (10 ng) derivado de E. coli en el carril 6.

Figura 33. Electroforesis en gel de GM-CSF humano producido por la estirpe fnbrida de ProGM. Los sobrenadantes celulares de la estirpe fnbrida de ProGM obtenidos de las muestras que se cultivaron con (carriles 3 y 4) y sin (carriles 1 y 2) tunicamicina se sometieron a inmunoprecipitacion con anticuerpo anti-GM-CSF humano de rata (carriles 1 y 3) y anticuerpo anti-GM-CSF de raton de rata (carriles 2 y 4). Las protemas se visualizaron mediante tincion con plata.

Figura 34. Expresion de CD4 y CD54 sobre la superficie de la estirpe de celulas ProCD54 y su subestirpe enriquecida con CD54, ProCD54EX; (a) el 100 % de las celulas ProCD54 conservaron la expresion de CD4. Aproximadamente el 72 % de la poblacion celular tambien fue positiva para CD54 con niveles variables de expresion de bajos a altos. El 42 % de la poblacion celular con caractensticas de fenotipo CD4+CD54+ con niveles medios a altos de expresion de CD54 se seleccionaron y clasificaron, y (b) el analisis de la expresion de CD4 y CD54 de la superficie de la subestirpe CD4+CD54+ clasificada del ProCD54 original muestra que el 98 % de las celulas siguen siendo positivas para ambos marcadores despues de mas de 6 meses de cultivo.

Figura 35. Transferencia Western de CD54 humano soluble secretado por celulas ProCD54 y ProCD54EX. Se usaron las celulas de la estirpe celular companera del tri-hnbrido de KWT como control. Tanto las celulas ProCD54 como las ProCD54EX arrojaron una forma soluble de CD54 de aproximadamente 82 kDa.

Figura 36. Un analisis por RT-PCR de la expresion del gen de ICAM-1 en celulas ProCD54 y ProCd54EX.

Figura 37. Analisis por transferencia Western de extractos celulares de una estirpe celular de tri-hnbrido de KBT transfectada transitoriamente con cadena hIL4-Ra, 24, 48 y 72 horas despues de la transfeccion. Se uso PBML humano estimulado con hIL4 100 ng/ml y celulas KBT no transfectadas como control positivo y negativo para la cadena de hIL4-Ra, respectivamente.

Figura 38. Una salida de PCR para la deteccion de ARNm de hIL-2 en las celulas de tri-hnbrido de KBT transfectadas con hIL-2. Los niveles de expresion son similares a los obtenidos a partir de linfocitos T humanos CD8+ y celulas Jurkat. Se usaron celulas KBT no transfectadas y celulas K562 como controles negativos.

Figura 39. El analisis por FACS para determinar hIL-2 intracelular en (a) celulas tri-hnbridas de KBT originales y (b) celulas KBT TR-IL2. Aproximadamente el 41 % de las celulas KBT fueron positivas para la molecula de activacion de CD69. El 92 % de las celulas KBT TR-IL2 se tineron de forma positiva para hIL-2 intracelular (R1+R2). Las celulas negativas para hIL-2 eran parte de la poblacion positiva para CD69, mientras que las celulas negativas para CD69 eran todas positivas para hIL2 intracelular. Figura 40. Perfil de elucion resultante despues de RP-HPLC tras absorcion de afinidad para hGM-CSF.

Figura 41. SDS-PAGE (panel inferior) y transferencia Western (panel superior) de fracciones recogidas despues de RP-HPLC tras inmunoabsorcion de afinidad para hGM-CSF. La transferencia Western revelo cambios en el perfil de peso molecular de hGM-CSF secretado por Pro-GM-SF entre fracciones. Las fracciones eluidas a los 24 a 28 minutos correspondieron a un primer pico en el perfil de elucion de RP-HPLC, las fracciones recogidas entre 29 y 31 minutos representaron el segundo pico, mientras que el tercer pico cayo en las fracciones recogidas entre 34 y 36 minutos.

Figura 42. Separacion de celulas CD4+ del cultivo de linfocitos humanos activados por PHA: (A) las celulas marcadas con CD4-FITC antihumano se seleccionaron (R1) y se clasificaron del resto de la poblacion celular. Las celulas clasificadas se analizaron adicionalmente para determinar su pureza; (B) el 100 % de las celulas en la poblacion clasificada fueron positivas para CD4.

Figura 43. Electroforesis en gel de hGM-CSF desglucosilado derivado de Pro-GMsf. El hGM-CSF purificado se expuso a la digestion con PHGasa F durante un penodo de tiempo diferente. Carril 1 - 0 min, carril 2 -10 min, carril 3 - 20 min, carril 4 - 40 min de incubacion. Carril 5 - GM-CSF humano recombinante derivado de E. coli. Las protemas se visualizaron mediante tincion con plata. Se indican los marcadores de peso molecular.

Figura 44. Identificacion y clasificacion de celulas TfR+ de la estirpe celular Sp2 de mieloma de raton.

Figura 45. Perfiles de FACS de celulas mononucleares de raton de (a) sangre periferica y (b) bazo tenido con anti-CD4 y CD8 de raton. Las regiones seleccionadas R1 y R3 representan un unico linfocito T auxiliar efector positivo (CD4+CD8-) y linfocitos T citotoxicos (CD8+CD4-), mientras que R2 contiene linfocitos T doble positivo (CD4+CD8+).

Figura 46. Perfiles de pureza de monocitos de raton aislados de sangre periferica mediante seleccion negativa con perlas magneticas. El 100% de las celulas aisladas fueron positivas para CD11b y al mismo tiempo mas del 98% de estas celulas fueron negativas para B220, CD90, CD49b y NK1.1. Aproximadamente, el 38 % de las celulas CD11b+ expresaron Ly5G en su superficie en niveles bajos. Figura 47. Perfiles de FACS de expresion de CD138, CD4 y Cd11b en tri-hnbrido de STmMm derivado de una celula inmortal linfoide de Sp2, linfocito T CD4+ de raton primario y monocito CD11b+. El fenotipo del linaje linfoide B se confirmo mediante la expresion de CD138 en el 100 % de las celulas tri-hnbridas, (a) y (b) al menos el 82 % de la poblacion celular expreso los tres marcadores CD, siendo solo el 5 % de las celulas positivas para CD138 sin coexpresar ya sea CD4 o CD11b.

Figura 48. Perfiles de FACS tipicos de expresion de cDl38, CD8 y CD11b en tri-hnbrido de STmMm derivado de una celula inmortal linfoide de raton de Sp2, linfocito T CD8+ citotoxico de raton primario y monocito de CD11b+ de raton. Mientras que la expresion de CD138 de raton se confirmo en el 97-100% de las celulas tri-hnbridas (a) y (b), la coexpresion de marcadores de linfocitos T y monocitos se detecto en el 56 % y 57 % de poblacion de celulas tri-hnbridas, respectivamente. Aproximadamente el 40 % de la poblacion del tri-hnbrido completo coexpreso los tres marcadores (c) y solamente el 14 % no expreso ni CD8 ni CD11b en su superficie.

Figura 49. Perfiles de FACS tfpicos de expresion de CD138, CD8 y CD11b en tri-hnbridos de STmMm derivados de una celula inmortal linfoide de raton de Sp2, un linfocito T CD4+CD8+ doble positivo de raton primario y un monocito CD11b+ de raton primario. El 98-100 % de la poblacion de celulas tri-hnbridas fue positiva para CD138 siendo el 93% de la poblacion tambien positiva para CD8 (b). Aproximadamente el 57-60 % de la poblacion celular total fue simultaneamente positiva para CD138, CD8 y CD11b.

Figura 50. Un perfil tfpico de expresion de CD4 y CD8 sobre la superficie de tri-hnbridos de STmMm derivados de una celula inmortal linfoide de raton de Sp2, un linfocito T CD4 CD8+ doble positivo de raton primario y un monocito primario. Mientras que el 95 % de las celulas fueron positivas para CD8, solo el 50 % de la poblacion de tri-hnbridos coexpreso CD4 y CD8. En particular, practicamente toda la poblacion de CD4+ tambien fue positiva para CD8.

Figura 51. Un perfil tfpico de expresion de CD138 y CD11b en la superficie de tri-hnbridos de SSMm donde el 93% de la poblacion de tri-hnbrido muestra una tincion positiva para CD138 con el 70% de celulas que coexpresan CD11b.

Figura 52. Perfiles tfpicos de expresion de CD71 humano y TfR de raton sobre la superficie de tri-hnbridos de SWMm (a) y SWMh (b). Independientemente de la fuente de raton o humana del monocito, el 100 % de los tri-hnbridos fueron positivos para el receptor de transferrina tanto humano como de raton.

Figura 53. Perfiles tfpicos de expresion de CD138 de raton en tri-hnbridos de SWMm (a) y SWMh (b) y ya sea CD11b de raton o ^cD14 humano. La expresion de CD138 de raton parece depender de la fuente de raton o humana del monocito. Mientras que el 84 % de los tri-hnbridos de SWMm fueron positivos para CD138 de raton, solo el 29 % de SWMh lo tema sobre su superficie.

Figura 54. Un perfil de FACS de expresion de CD19 humano y de CD14 humano sobre la superficie de trihnbridos quimericos de SWMh muestra que el 96% de las celulas expresan CD19 humano coexpresando el 66 % de CD14 humano.

Figura 55. Un sistema de manipulacion/entrega de una celula individual.

Figura 56. Una micropipeta de vidrio.

Figura 57. Un microelectrodo.

Figura 58. Dos microelectrodos paralelos.

Figura 59. Dos microelectrodos en un pocillo de una placa de cultivo tisular.

Figura 60. Una vista superior de un pocillo que contiene 3 celulas entre 2 microelectrodos.

Figura 61. Una vista lateral del pocillo de la figura 60.

Figura 62. Expresion de CD25 y sIgM sobre la superficie de celulas hnbridas creadas mediante hibridacion de una celula KBT y una celula B shIgM+CD25+ antes (A) y despues (B) de la transfeccion estable con la segunda protema hIL-2.

Descripcion de la invencion

[0142] Una realización preferida de la invencion se describe adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitantes con referencia a las figuras adjuntas.

Ejemplo 1

1. Seleccion de celulas, manipulacion de celulas y clonacion de una celula individual

[0143] Los siguientes ejemplos describen preparaciones celulares que incluyen la seleccion y el aislamiento (o clasificacion) de estirpes celulares de mairnferos y celulas primarias utilizadas para la creacion de tri-hnbridos de linaje cruzado, y para la expresion de protemas deseadas. La eleccion de una tecnica de seleccion particular para obtener una poblacion pura de celulas con caractensticas espedficas o el uso de un marcador (o marcadores) particular para el aislamiento de las celulas de un fenotipo particular no es de ninguna manera restrictiva sino mas bien indicativa. Pueden usarse otros marcadores celulares o procedimientos de clasificacion para entregar resultados similares.

1.1. Seleccion de celulas como fuente de oncogenes de estirpes celulares de mamifero

[0144] Todas las estirpes celulares inmortales (vease a continuacion) se cultivaron en cultivo en suspension en condiciones convencionales (normales) en una incubadora a 37 °C en atmosfera de CO2 al 5 % humidificada usando RPMI1640 modificado (medio del Roswell Park Memorial Institute) con NaHCO3 (JRH Biosciences), Hepes 20 mM (Sigma), L-glutamina 4 mM (Sigma) y complementado con suero de ternera fetal al 10 %, FCS, (JRH Biosciences). A menos que se indique lo contrario, el medio de cultivo tisular (medio TC) que se describe en el presente documento es el medio convencional para cultivar todas las estirpes celulares inmortales, celulas cancerosas primarias, cultivos celulares primarios y estirpes celulares tri-hforidas establecidas para la presente invencion. En general, todas las estirpes celulares, celulas cancerosas primarias y celulas primarias utilizadas se cultivaron en un entorno sin antibioticos. Sin embargo, cuando existia la sospecha de un alto riesgo de contaminacion bacteriana y/o fungica, se incluyo una solucion de penicilina al 2 % (5000 unidades)/estreptomicina (5 mg) (Sigma) en el medio convencional. Estirpes celulares humanas

[0145] Las estirpes celulares humanas que pueden usarse en la presente invencion son las siguientes: -a) Linaje progenitor mieloide comun, K562 (una estirpe celular derivada de una leucemia mielogena cronica humana),

b) Linaje linfoide T, MOLT4 (linfoblasto T humano), y

c) Linaje linfoide B, WIL2NS (linfoblasto B humano).

Estirpe o estirpes celulares no humanas

[0146] Una estirpe celular no humana que puede usarse en la presente invencion es una estirpe de celulas de mieloma de raton-Sp2 (celulas plasmaticas de linfocitos B).

1.1.1. Sistema de entrega de una celula individual

[0147] El aislamiento o clasificacion de celulas, la manipulacion de celulas y la clonacion de una celula individual son procesos esenciales a lo largo de la presente invencion. En el presente documento los inventores describen un sistema de entrega de una celula individual que se establecio para manipular y/o clonar una celula individual de interes. El sistema de entrega de celulas (Figura 55) consiste principalmente en una micropipeta de vidrio, una jeringa de 1 ml y un manipulador grueso unidimensional. La Figura 56 muestra una micropipeta de vidrio en forma de L utilizada para recoger una celula individual de interes. La pipeta estaba hecha de un tubo capilar de hematocrito, de 75 milfmetros (mm) de longitud, con un diametro externo e interno de 1,5 mm y 1,10 mm, respectivamente. Mediante el uso de calor, se tiro de un extremo del tubo de manera que se obtuvo la punta (1) con un diametro interno de aproximadamente 250-300 micrometros (pm) y la pared de la punta de aproximadamente 30 pm de espesor. El otro extremo de la micropipeta permanecio sin modificar (2). En el sistema de entrega de celulas (Figura 55), una jeringa se monta en un manipulador grueso, que a su vez se monta en un soporte magnetico (16). El sistema funciona de manera que el embolo (6) de la jeringa pueda forzarse a moverse muy lentamente, ya sea hacia adelante o hacia atras con respecto a la jeringa. Con el fin de manipular una celula individual de interes, la jeringa debe conectarse al extremo sin modificar de la micropipeta (2) como se muestra en la figura usando un tubo flexible de calidad medica (3). El sistema de entrega de una celula individual debe esterilizarse mediante el lavado abundante varias veces con alcohol al 70 % y, finalmente, rellenarse sin burbujas de aire con un medio o una solucion de cultivo tisular adecuados, sea necesario, an setegsún de cualquier manipulacion de celulas.

1.1.2. Clonacion de una celula individual

[0148] Se establecieron clones de celulas de cada estirpe celular mediante clonacion de una celula individual. A continuacion, se describe una tecnica de clonacion o manipulacion de una celula individual de cualesquier celulas biologicas, por ejemplo, celulas de la estirpe celular K562, utilizada en la presente invencion.

[0149] Se extrajeron 5 pl de suspension celular de celulas K562 de su cultivo en la fase logantmica y se depositaron en un pocillo de una placa de 96 pocillos de cultivo tisular (placa TC, Becton y Dickinson o BD), que contema 150 pl de medio TC. El pocillo se denomino "pocillo de almacenamiento de celulas". La placa se coloco en una platina de microscopio XY de un microscopio invertido (Axiovert 40C, Carl Zeiss). Antes del proceso de manipulacion/clonacion de una celula individual, una micropipeta (Figura 56) se lleno completamente con medio TC sin burbujas de aire. La micropipeta, el tubo y la jeringa del sistema de entrega de una celula individual (Figura 55) se montaron en un manipulador grueso unidimensional (Narishege). La punta de la micropipeta (1) se dispuso de manera que la punta estuviera ubicada en el centro de la vista optica del microscopio. Para manipular y clonar una celula individual de K562, la micropipeta se inserto en el pocillo de almacenamiento de celulas. Moviendo el embolo de la jeringa muy lentamente en la direccion de succion, se deposito una celula individual de K562 en la micropipeta. La micropipeta se retiro del pocillo de almacenamiento de celulas. Moviendo lateralmente la platina del microscopio desde el pocillo de almacenamiento de celulas a un pocillo adyacente, denominado "pocillo de clonacion", e insertando posteriormente la micropipeta en este pocillo de clonacion, la celula individual en la micropipeta despues se libero suavemente de la micropipeta. Esto se consiguio moviendo el embolo de la jeringa muy lentamente en una direccion de liberacion. El proceso de extraccion de una celula individual del pocillo de almacenamiento de celulas y la deposicion de la celula individual en el pocillo de clonacion se repitio varias veces hasta que se obtuvieron 60 clones de una celula individual por placa de TC. La placa de clonacion se incubo en un incubador humidificado (Thermoline Scientific), que funcionaba a 37 °C con CO2 al 5 % durante un penodo de 10 dfas. El medio en cada pocillo de clonacion se repuso con medio TC recien preparado regularmente durante el penodo de incubacion. Se registro la proliferacion celular de cada clon de cada pocillo de clonacion cada 24 horas. Al final del penodo de incubacion, se establecio una serie de clones de celulas K562. Se selecciono un clon con la velocidad de proliferacion mas alta o el nivel mas alto de un marcador de interes que se expresaba sobre la superficie celular, por ejemplo, el receptor de transferrina CD71 sobre celulas K562, para la produccion de tri-fnbridos o experimentos adicionales.

1.1.3. Clasificacion de celulas CD71+

[0150] Como ejemplo, el metodo a continuacion describe una seleccion de celulas y la clasificacion de celulas positivas para c D71 a partir de la estirpe celular K562 usando un clasificador de celulas activadas por fluorescencia (FACS).

[0151] Se incubaron 1x105 celulas K562 suspendidas en 100 pl de una solucion de tampon de fosfato (Dulbeco PBS) que contema albumina de suero bovino al 2 %, BSA, (Sigma) en la oscuridad con 20 pl de anti-CD71 conjugado con ficoeritrina (PE) (BD Pharmingen) o anticuerpos de control isotfpicos conjugados con PE IgG2a,K (BD Pharmingen) durante 30 minutos a temperatura ambiente. La mezcla de incubacion se diluyo con 1 ml de PBS y las celulas tenidas se recogieron mediante centrifugacion a 300 g durante 10 minutos. Despues de un lavado adicional con 1 ml de PBS, las celulas tenidas se suspendieron en 1 ml de PBS y se analizaron inmediatamente usando un FACS (BD FACSCalibur). La Figura 1 muestra perfiles de celulas CD71 de la estirpe celular K562. Las celulas positivas para CD71 se seleccionaron y clasificaron (Figura 1a). Aproximadamente, el 65% de la poblacion de K562 original fue positiva para CD71. Las celulas clasificadas se centrifugaron a 300 g durante 10 minutos y se suspendieron en 1 ml de PBS para experimentos adicionales. Se recogieron 100 ml de celulas clasificadas CD71 suspendidas para el analisis de pureza, como se muestra en la Figura 1b. Se obtuvo una pureza del 99 % de las celulas clasificadas CD71+. Despues de la clasificacion de celulas, las celulas CD71+ de la estirpe celular K562 se usaron para experimentos adicionales o se colocaron en el cultivo en condiciones de cultivo convencionales y se marcaron como celulas K562 enriquecidas en CD71. La misma metodologfa se uso para establecer cultivos de WIL2NS enriquecidos con CD71 y de MOLT4 enriquecido con CD71.

1.1.3.1. Clasificacion de celulas CD71+ de linaje mielomonocitico de cultivo de K562

[0152] Para garantizar el fenotipo mielomonodtico de las celulas para experimentos de hibridacion celular, las celulas K562 CD71+ se enriquecieron adicionalmente para celulas CD15+ usando analisis por FACS seguido de clasificacion.

[0153] Para este proposito, se marcaron celulas K562 enriquecidas con CD71 obtenidas a partir del proceso descrito en la Seccion 1.1.3 con CD71 antihumano PE y CD15 antihumano FITC (BD Pharmingen). Se incubaron 1x105 celulas K562 enriquecidas con CD71 lavadas suspendidas en 100 pl de PBS que contema BSA al 2 % en la oscuridad con 20 pl de anticuerpos anti-CD71 humano-PE y anti-CD15 humano-FITC o anticuerpos de control isotfpico negativos o anticuerpos de control isotfpicos negativos marcados con PE y FITC durante 30 minutos a temperatura ambiente. La mezcla de incubacion se diluyo con 1 ml de PBS y las celulas tenidas se recogieron mediante centrifugacion a 300 g durante 10 minutos. Despues de un lavado adicional con 1 ml de PBS, las celulas tenidas se suspendieron en 1 ml de PBS y se analizaron inmediatamente usando un FACSCalibur (BD).

[0154] Se muestra un perfil tfpico de FACS en la Figura 2a. Despues de 5 meses en el cultivo, el 99 % de las celulas K562 enriquecidas con CD71 permanecieron positivas para CD71, aproximadamente el 18% expresaba CD15 de superficie. Las celulas positivas tanto para CD71 como para CD15 se seleccionaron (Figura 2a) y se clasificaron. Las celulas clasificadas se recogieron mediante centrifugacion a 300 g durante 10 minutos y se suspendieron en 1 ml de PBS para experimentos adicionales. Se recogieron 100 pl de celulas clasificadas CD71+CD15+ suspendidas para un analisis de pureza. Despues de dos meses de cultivo, las celulas clasificadas se volvieron a analizar para determinar la coexpresion de CD71 y CD15 (Figura 2 b). Los resultados indican que aproximadamente el 98 % de las celulas purificadas retuvieron tanto CD 71 como CD15. Se descubrio que algunas de las celulas que expresaban anteriormente tanto CD71 como CD15 sobre la superficie habfan perdido su expresion de CD15 (Figura 2b), lo que sugiere que el compromiso con el linaje mielomonodtico en celulas K562 no es estable y reversible.

1.1.4. Seleccion de celulas positivas para el receptor de transferrina entre la estirpe celular Sp2 de raton [0155] Cuando se uso estirpe celular de mieloma de raton Sp2 en la creacion de tri-dbridos, la poblacion se enriquecio para celulas que expresaban receptor de transferrina de raton (TfR), analoga de CD71 humano.

[0156] Esencialmente, se siguio el mismo protocolo que en la Seccion 1.1.3, que describe el enriquecimiento de estirpes celulares humanas para celulas CD71+, excepto porque se usaron anticuerpos de rata anti-TfR de raton conjugados con FITC (Abcam) en lugar de anticuerpo de raton anti-CD71 humano conjugado con PE. Los controles de isotipo se ajustaron en consecuencia.

[0157] La Figura 44 muestra el perfil de las celulas TfR+ de la estirpe celular Sp2. Las celulas positivas para TfR+ se seleccionaron y se clasificaron (Figura 44a). Aproximadamente, el 45 % de la poblacion original de Sp2 fue positiva para TfR. Las celulas clasificadas se centrifugaron a 300 g durante 10 minutos y se suspendieron en 1 ml de PBS para experimentos adicionales. Se recogieron 100 ml de celulas seleccionadas TfR+ suspendidas para un analisis de pureza como se muestra en la Figura 44b. Se obtuvo una pureza del 99,5 % de celulas clasificadas TfR+. Despues de la clasificacion de celulas, las celulas TfR+ de la estirpe celular Sp2 se usaron para experimentos adicionales o se colocaron en el cultivo en condiciones de cultivo convencionales y se marcaron como celulas Sp2 enriquecidas con TfR.

1.2. Seleccion de celulas como fuente de oncogenes entre celulas cancerosas primarias

[0158] Como ejemplo, el metodo a continuacion describe la seleccion de celulas transformadas del linaje mielogeno a partir de muestras de medula osea obtenidas de pacientes con leucemia mielogena aguda (LMA). El mismo metodo tambien podna aplicarse para seleccionar celulas de otros linajes a partir de muestras de medula osea de malignidades de sangre correspondientes.

[0159] Se obtuvieron aspirados de medula osea de pacientes con LMA despues del consentimiento informado. Las muestras se extrajeron de los pacientes cuyo diagnostico de LMA se establecio antes de realizar los experimentos. Se aislaron celulas mononucleares de LMA usando el mismo procedimiento de centrifugacion en gradiente de densidades que se describe en la Seccion 1.3.1 y las celulas CD34+ de las muestras se clasificaron o aislaron usando un FACS.

[0160] Para tenir o marcar las celulas mononucleares obtenidas anteriormente, se anadieron 10 pl de un anticuerpo anti-CD34 humano-PE de raton (BD Pharmingen) o un anticuerpo de control de isotipo PE (BD Pharmingen) a 100 pl de una alfcuota dada de 1x106 celulas mononucleares en un medio de tincion (^pB^s+ BSA al 5 %). Para una alfcuota dada, la mezcla de tincion se incubo durante 30 minutos en hielo. Se anadieron 10 ml de medio de tincion enfriado con hielo al sedimento de celulas y se centrifugaron durante 7 minutos a 350 g y 4 °C. Los sobrenadantes se aspiraron y despues el sedimento de celulas se resuspendieron moviendo el tubo en el que se anadio un volumen comparable de medio de tincion enfriado con hielo. Las celulas tenidas se centrifugaron y se lavaron una vez mas en medio de tincion enfriado con hielo. Las celulas marcadas se suspendieron en medio de tincion y se aplicaron a FACS. Despues de configurar las ventanas de clasificacion apropiadas para la poblacion de celulas CD34+, se recogieron las fracciones de celulas.

[0161] Para cultivos de enriquecimiento, se sembraron en placas 40x103 celulas de las celulas enriquecidas con CD34+ en placas de 12 pocillos recubiertas previamente con matriz extracelular sintetica. Las celulas se expandieron en medio T^ccompleto complementado con 57 mM de p-mercaptoetanol (Sigma), hidrocortisona 1 mM y 20 ng/ml de IL-3 humana y G-CSF humano. Despues de 48 horas en el cultivo, las celulas se seleccionaron adicionalmente para la expresion de CD15 usando FACS.

[0162] Para la tincion de celulas con fluorescencia, se usaron un antfgeno anti-CD15 humano-FITC de raton (BD Pharmingen) y un anti-CD34 humano-PE de raton (BD Pharmingen) y tambien se empleo un metodo de tincion de celulas similar descrito anteriormente en esta Seccion. Las muestras tenidas se analizaron usando un FACS. Despues de configurar las ventanas de clasificacion apropiadas para la poblacion de celulas positivas para CD34 y CD15 (CD34+CD15+) o para la poblacion de celulas positivas para CD34 y CD15 (CD34+CD15'), se recogieron las fracciones.

[0163] El perfil de expresion de CD15 sobre las celulas de LMA CD34+ despues de 48 horas en cultivo se muestra en la Figura 3. Aproximadamente, el 54 % de las celulas mononucleares de LMA dieron positivo para CD15 mientras manteman su expresion de CD34, mientras que el resto de la poblacion celular mantuvo su expresion de CD34 sin comprometerse con el linaje mielomonocftico. Las celulas CD34+CD15+ se usaron en experimentos para crear trifnbridos.

1.3. Celulas primarias

[0164] Las celulas primarias pueden derivar de cualquier tejido linfoide, tal como la sangre periferica, la sangre de cordon umbilical, el bazo, la medula osea, el timo, las airngdalas y los ganglios linfaticos locales. Como primera etapa, todos los tejidos linfoides se procesaron para aislar celulas mononucleares.

1.3.1. Aislamiento de celulas mononucleares humanas a partir de medula osea, sangre periferica o sangre de cordon umbilical

[0165] Se recogieron muestras de sangre periferica de individuos sanos despues del consentimiento informado. Cada muestra de sangre se recogio en tubos heparinizados (Vacutainer, BD), se agruparon y se diluyeron en RPMI1640.

[0166] Los aspirados de medula osea humana se obtuvieron de pacientes que se sometieron a biopsias de medula osea y teman medula osea normal sin anomalfas en la sangre. Las muestras se diluyeron a una relacion de 1:3 con RPMI1640.

[0167] Se obtuvieron muestras de sangre de cordon umbilical humano de partos vaginales normales a termino, despues del consentimiento informado. Cada sangre del cordon se recogio con una jeringa heparinizada de 60 ml despues del parto y la ligadura del cordon antes de la expulsion de la placenta. Cada muestra se diluyo en RPMI1640.

[0168] Se prepararon celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC), celulas mononucleares de medula osea (BMMC) y celulas mononucleares de sangre de cordon umbilical (UCBMC) mediante centrifugacion por densidad sobre Ficoll-Paque (Amersham Pharmacia). En resumen, se colocaron en capas 10 ml de Ficoll-Paque bajo 20 ml de suspension celular usando un tubo de canula unido a una jeringa de 20 ml. Las celulas de la muestra se centrifugaron a 1.700 rpm (700 g) durante 40 minutos a 4 °C. Las celulas en la interfaz se recogieron y se lavaron en 50 ml de RPMI1640 mediante centrifugacion a 2.000 rpm (1.000 g) durante 10 minutos. El sobrenadante se descarto y las celulas sedimentadas se resuspendieron en 40 ml de RPMI1640 y se centrifugaron a 1.300 rpm (400 g) durante 10 minutos. Los eritrocitos y las plaquetas se retiraron mediante lisis con NH4Cl al 0,83 % (peso/vol) y una segunda centrifugacion sobre Ficoll-Paque diluido a una relacion de 1:2 con PBS, respectivamente.

[0169] Las celulas mononucleares aisladas se usaron para el cultivo o el analisis y la clasificacion en fracciones espedficas de celula a traves de un FACS o un sistema de separacion de perlas magneticas.

1.3.2. Aislamiento de celulas mononucleares humanas a partir de tejidos linfoides solidos

[0170] El metodo a continuacion describe el procedimiento utilizado en la presente invencion para aislar celulas mononucleares de bazo, timo, amfgdala o ganglios linfaticos locales. Tambien se proporciona un metodo para la tincion y clasificacion de celulas.

[0171] Se obtuvieron muestras de bazo de donantes de trasplante de organos siguiendo las directrices eticas nacionales. Se mantuvieron bloques de bazo, aproximadamente de 2 x 2 x 3 cm cada uno, a 4 °C en RPMI 1640 hasta el aislamiento de los esplenocitos. Cada bloque se corto en trozos pequenos a traves de la malla de un tamiz esteril usando el embolo de una jeringa. Despues, las celulas se disociaron enzimaticamente mediante digestion con 20 U/ml de colagenasa de tipo VlI (Sigma) y 20 U/ml de DNasa (Sigma) en medio completo durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los agregados celulares se disociaron adicionalmente mediante adicion de EDTA para alcanzar 10 mM y agitacion durante 5 minutos a temperatura ambiente. Despues, los esplenocitos se lavaron con medio completo dos veces para detectar la digestion enzimatica y se resuspendieron en RPMI 1640. Estas condiciones no afectaron a la expresion de moleculas de superficie en comparacion con procedimientos de disociacion no enzimaticos (Mcllroy et al., 1995). Se aislaron celulas mononucleares del bazo de estas suspensiones de esplenocitos mediante centrifugacion en gradiente de densidades como se describe en la Seccion 1.3.1, excepto por la retirada de eritrocitos. Las celulas mononucleares de bazo se resuspendieron en RPMI1640 y la concentracion de celulas se ajusto a 1x106 celulas por ml. La viabilidad celular fue superior al 98 % segun se determino mediante exclusion con azul de tripano.

[0172] Se obtuvieron timos de ninos sometidos a cirugfa cardfaca despues del consentimiento informado de sus padres. Los timocitos se aislaron de los timos mediante la ruptura del tejido del timo y la retirada por lavado abundante de los timocitos fuera del tejido con una jeringa llena de medio RPMI1640. Los timocitos se purificaron mediante centrifugacion en gradiente de densidades como se ha descrito anteriormente.

[0173] Se obtuvieron amfgdalas de pacientes sometidos a amigdalectoirna por trastornos inflamatorios, despues del consentimiento informado. Las muestras de tejido se almacenaron en hielo en medio completo y gentamicina 250 |jg/ml y se procesaron en 3 horas. El tejido amigdalino se corto en trozos despues de retirar la capa epitelial y los bloques de tejido se aspiraron suavemente a traves de una pipeta de transferencia cortada. Despues, las celulas amigdalinas se aislaron usando el mismo procedimiento descrito anteriormente en el aislamiento de celulas mononucleares esplenicas.

1.3.3. Aislamiento de celulas primarias especificas de linaje a partir de celulas mononucleares derivadas de diversos tejidos

[0174] Se aislaron celulas humanas de linaje linfoide B, linaje linfoide T y linaje mieloide mediante procedimientos convencionales usando analisis por FACS y clasificacion de celulas o clasificacion magnetica de celulas. A continuacion, se proporcionan ejemplos no limitantes de tincion y clasificacion de celulas para el aislamiento de celulas primarias espedficas de linaje a partir de diversos tejidos.

1.3.3.1. Aislamiento de celulas B, linfocitos T auxiliares y celulas mielomonocfticas a partir de bazos y sangre periferica humanos

[0175] Las muestras de tejido se procesaron inicialmente para extraer una poblacion de celulas mononucleares como se describe en la Seccion 1.3.1. Despues, se realizo una tincion de celulas por fluorescencia seguida de clasificacion de celulas a las 4 horas del aislamiento de la poblacion de celulas mononucleares. Las celulas se suspendieron en medio completo en condiciones de cultivo convencionales (vease la Seccion 1.1) hasta la tincion.

1.3.3.1.1. Tincion celular y clasificacion de celulas B maduras primarias, linfocitos T efectores y celulas mielomonocfticas derivadas de diversos tejidos

[0176] A continuacion, se muestran ejemplos de tincion y clasificacion de celulas B y linfocitos T a partir de celulas primarias. Por lo general, las selecciones de celulas B y linfocitos T auxiliares se basaron en las expresiones de superficie de CD19 y CD4, respectivamente, mientras que las selecciones de celulas mielomonodticas se basaron en la expresion de superficie de CD14 y/o CD16.

[0177] En resumen, se anadieron 10 pl de cada uno de entre anticuerpo anti-CD19 humano-FITC de raton (BD Pharmingen) y anticuerpo anti-CD4 humano-PE de raton (BD Pharmingen) o control de isotipo apropiado, a una alfcuota de 10o pl de celulas mononucleares en medio de tincion (PBS BSA al 5 %), que contema 1x105 celulas por alfcuota. Para una alfcuota dada de poblacion de celulas mononucleares, la mezcla de tincion se incubo durante 30 minutos en hielo. Se anadieron 10 ml de medio de tincion enfriado con hielo a la mezcla de tincion y se centrifugaron durante 7 minutos a 350 g y 4 °C. Se aspiro el sobrenadante y despues se resuspendio el sedimento de celulas moviendo el tubo en el que se anadio un volumen comparable de medio de tincion enfriado con hielo. Las celulas tenidas se centrifugaron y se lavaron una vez mas en medio de tincion enfriado con hielo. El proceso se repitio para otras alfcuotas. Las celulas tenidas se analizaron usando un FACS. Se analizaron al menos 20.000 eventos seleccionados para cada muestra. Despues de configurar las ventanas de clasificacion apropiadas para la poblacion de celulas B positivas para CD19 (CD19+CD4-) o para la poblacion de linfocitos T positivos para CD4 (CD4+CD19-), se recogieron las fracciones. Se recogio 1 ml de cada fraccion para un analisis de pureza y el resto de cada fraccion se resuspendio en medio completo para experimentos adicionales.

1.3.3.1.2. Recuperacion y analisis de poblaciones de celulas clasificadas

[0178] Un pequeno numero de celulas (< 5 x 105 celulas) se clasifico directamente en tubos de microcentnfuga con adaptadores apropiados. Antes de la clasificacion, se anadio un pequeno volumen (de 0,1 a 0,2 ml) de RPMI1640 complementado a los tubos de recuperació cnon el fin de mezclarse con la muestra clasificada y mejorar la viabilidad de las celulas clasificadas. Despues de la clasificacion, dado el numero permitido de celulas recuperadas, se diluyeron 20 pl de cada muestra de celulas clasificadas a 1:10 con medio de tincion para un nuevo analisis para verificar su pureza. Una pureza aceptable fue del > 95 %. Se anadieron de 20 a 40 pl adicionales de FCS por ml de muestra clasificada y se siguio centrifugando durante 7 minutos a 350 g, 4 °C. Despues, las celulas se resuspendieron en el medio de cultivo tisular convencional. Si hada suficientes celulas disponibles, se contaron para determinar el rendimiento.

[0179] En la Figura 11a se muestra un perfil de FACS de muestras de bazo marcadas con anticuerpo anti-CD19 humano-FITC y anticuerpo anti-CD4 humano-PE, mientras que en las Figuras 11b y 11c se muestran los perfiles de analisis de pureza de celulas B CD19+ y linfocitos T CD4+ clasificados (ver la caracterizacion hnbrida de KBT). La pureza celular en las fracciones supero el 98 % para las celulas CD19+ y el 96 % para las celulas CD4+.

[0180] Los perfiles de clasificacion y pureza para las celulas CD19+ y CD4+ de sangre periferica fueron esencialmente similares a los de las muestras de bazo, solo que se obtuvo un numero menor de cada poblacion celular.

[0181] Para el aislamiento de monocitos humanos y celulas mielomonodticas humanas, la poblacion de celulas mononucleares se agoto en primer lugar de las celulas negativas para CD14 usando perlas magneticas de CD14 humano, MACS (Miltenyi Biotec GmbH), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las celulas CD14 seleccionadas positivamente se tineron o marcaron adicionalmente con anticuerpos anti-CD16 humano-PE de raton (BD Pharmingen) y anti-CD14 humano-PerCP de raton (BD Pharmingen). Los metodos de tincion y clasificacion de celulas y la recuperación de celulas clasificadas se han descrito anteriormente (vease la Seccion 1.3.3.1.1 y 1.3.3.1.2).

[0182] Las muestras tenidas se analizaron usando un FACS. Se analizaron al menos 20.000 eventos seleccionados. Aproximadamente el 86 % del total de celulas seleccionadas positivamente para CD14 usando perlas de MACS fueron positivas para CD14. La poblacion de CD14+ se separo adicionalmente en tres grupos basandose en la expresion de CD16: CD14HCD16- que representa la mayor parte de las celulas CD14+; poblacion minoritaria de celulas CD14hCD16l y CD14HCD16H La pureza de las celulas en las fracciones supero el 98 % para CD14HCD16-, el 96% para CD14hCd 16l y el 92% para CD14HCD16H Despues de configurar las ventanas de clasificacion apropiadas, se recogieron las siguientes poblaciones de celulas: fracciones de celulas CD14HCD16-, CD14HCD16L y CD14^hCD16^hLa Figura 4 muestra un perfil de FACS de muestras enriquecidas con CD14 marcadas con anticuerpo anti-CD16 humano-PE de raton y anticuerpo anti-CD14 humano-PerCP de raton.

[0183] Los metodos de clasificacion y purificacion celulares de celulas CD14+ de tejidos del bazo fueron esencialmente los mismos que para los de muestras de sangre periferica, excepto porque se otuvo un numero menor de cada poblacion celular.

1.3.3.2. Aislamiento de celulas B positivas para CD5 (con experiencia antigenica) y celulas B negativas para CD5 (indiferenciadas) a partir de sangre de cordon umbilical humana

[0184] Se prepararon celulas mononucleares a partir de muestras de sangre de cordon umbilical como se describe en la Seccion 1.3.1. Se realizo una tincion de celulas por fluorescencia seguida de clasificacion de celulas a las 4 horas del aislamiento de la poblacion de celulas mononucleares. En este ejemplo particular, la clasificacion de celulas B negativas para CD5 (indiferenciada) y celulas B positivas para CD5 (con experiencia antigenica) de sangre de cordon umbilical humana se realizo usando un anticuerpo anti-CD5 humano-FITC (BD Pharmingen), un anticuerpo anti-CD19 humano-PE de raton (BD Pharmingen) o control de isotipo apropiado de acuerdo con el metodo descrito anteriormente (Seccion 1.3.3.1.1).

[0185] Las muestras tenidas se analizaron usando un FACS. Se analizaron al menos 20.000 eventos seleccionados para cada muestra. Despues de configurar las ventanas de clasificacion apropiadas para la poblacion de celulas B negativas para CD5 (CD19+CD5-) o para la poblacion de celulas B positivas para CD5 (CD19+CD5+), se recogio una serie de fracciones. La Figura 5 muestra un perfil tfpico de las muestras tenidas con anticuerpo anti-CD19 humano de raton y anticuerpo anti-CD5 humano de raton.

[0186] El porcentaje de celulas B en la muestra vario entre el 4 y el 19,2 % y las celulas B CD5+ variaron entre el 0,8 y el 7,2 % de los linfocitos circulantes totales.

1.3.3.3. Aislamiento de linfocitos T positivos para CD5 (con experiencia antigenica) y linfocitos T negativos para CD5 (indiferenciados) a partir de sangre de cordon umbilical humana

[0187] Se extrajeron celulas mononucleares de muestras de sangre de cordon umbilical usando un metodo similar al descrito en la Seccion 1.3.1. La tincion de celulas por fluorescencia seguida de la clasificacion de celulas se realizo a las 4 horas del aislamiento de la poblacion de celulas mononucleares. En este ejemplo particular la clasificacion de linfocitos T positivos para CD5 (con experiencia antigenica) y linfocitos T negativos para CD5 (indiferenciados) de sangre de cordon umbilical humana, se realizo usando un anticuerpo anti-CD5 humano-FITC de raton (BD Pharmingen), un anticuerpo anti-CD3 humano-PE de raton (BD Pharmingen) o control de isotipo apropiado de acuerdo con el metodo descrito anteriormente (Seccion 1.3.3.1.1). Las celulas tenidas se analizaron usando un FACS. Se analizaron al menos 20.000 eventos seleccionados. Las ventanas de clasificacion se configuraron para recoger fracciones que conteman linfocitos T negativos para CD5 (CD3+CD5-) o linfocitos T positivos para CD5 (CD3+CD5+). La Figura 6 muestra un perfil tfpico de las muestras tenidas con anticuerpos anti-CD3 humano de raton y anticuerpos anti-CD5 humano de raton.

Recuperacion y analisis de poblaciones clasificadas

[0188] Efectivamente, el mismo metodo utilizado para recuperar y analizar las poblaciones clasificadas se ha descrito en la Seccion 1.3.3.1.2.

[0189] El porcentaje de linfocitos T en las muestras vario del 1,7 al 13,5 % y los linfocitos T CD5+ variaron del 0,4 al 1,3 % del total de linfocitos circulantes.

1.3.3.4. Aislamiento de celulas B tempranas, celulas B activadas y en reposo basado en expresiones de CD 20 y CD 72 a partir de la poblacion mononuclear de medula osea humana

[0190] Se extrajeron celulas mononucleares de medula osea usando el metodo descrito anteriormente (Seccion 1.3.1). La tincion de celulas por fluorescencia seguida de la clasificacion de celulas se realizo a las 4 horas del aislamiento de la poblacion de celulas mononucleares. La tincion y la clasificacion de las celulas B activadas se ha descrito anteriormente en la Seccion 1.3.3.1.1. Espedficamente, se usaron 10 |jl de un anticuerpo anti-CD72 humano-FITC de raton (BD Pharmingen) y 20 j l de un anticuerpo anti-CD20 humano-PE de raton (BD Pharmingen) o un control de isotipo apropiado (anticuerpos IgG2b,K de raton PE). Las celulas tenidas se analizaron usando un FACS. Las ventanas de clasificacion se configuraron para recoger fracciones que conteman una poblacion positiva para CD20 que comprendfa celulas pre-B, celulas B en reposo y activadas, celulas dendnticas foliculares (CD20+CD72-) o una poblacion de celulas positivas para CD72 que comprendfa celulas B tempranas (CD20'CD72+) o celulas B activadas (CD20+CD72+). La Figura 7 representa un perfil tfpico de las muestras tenidas con anticuerpos anti-CD20 humano de raton y anti-CD72 humano de raton.

Recuperacion y analisis de poblaciones clasificadas

[0191] Efectivamente, se aplico el mismo metodo que se ha descrito en la Seccion 1.3.3.1.2 para recuperar y analizar celulas clasificadas.

[0192] Normalmente, aproximadamente el 10-15 % de la poblacion de celulas mononucleares de medula osea fue positiva tanto para CD20 como para CD72; el 9-12 % de las celulas fueron positivas para CD20, pero negativas para CD72; y aproximadamente el 8 % fueron positivas solamente para CD72.

1.3.3.5. Aislamiento de subpoblaciones de timocitos mediante clasificacion con perlas magneticas [0193] Usando el kit MACS CD4 Multisort (Miltenyi Biotec GmbH), se clasificaron timocitos doble negativo CD4-CD8', timocitos doble positivo CD4+CD8+ y poblaciones celulares de timocitos positivo simple CD4+ y CD8+ de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, se incubaron timocitos recogidos usando un metodo similar al descrito en la Seccion 1.3.2 con microperlas de CD4 Multisort CD4 durante 30 minutos. Despues de lavar con EDTA 5 mM y BSA al 0,5 % en PBS, las celulas marcadas se separaron en columnas magneticas. Los timocitos seleccionados positivamente, que se retuvieron en la columna magnetica, conteman poblaciones celulares positivo simple CD4+ y doble positivo CD4+CD8+, mientras que la poblacion celular con CD4 agotado, que se eluyo a traves de la columna, contema celulas positivo simple CD8+ y doble negativo CD4'CD8. Para retirar las microperlas de las poblaciones celulares seleccionadas positivamente para CD4, las celulas se incubaron con reactivo de liberacion MACS Multisort. Despues de 20 minutos, la digestion se detuvo y las celulas se marcaron durante 30 minutos con microperlas de CD8. Los timocitos doble positivo CD4+CD8+ se obtuvieron mediante seleccion positiva, mientras que se encontraron celulas positivas simple CD4+ en la poblacion celular agotada. La poblacion celular agotada en CD4 se incubo durante 30 minutos con microperlas de CD8. Despues de aplicar celulas marcadas en una columna magnetica, las celulas positivo simple CD8+ podnan separarse de los timocitos doble negativo CD4'CD8\ Las purezas de las cuatro subpoblaciones de timocitos diferentes se evaluaron mediante analisis por citometna de flujo. La pureza aceptada fue superior al 95 %.

1.3.3.6. Aislamiento de linfocitos T CD54+ a partir de amigdalas humanas

[0194] Se extrajeron celulas mononucleares de airngdalas humanas usando el metodo descrito en la Seccion 1.3.2. La tincion de celulas por fluorescencia seguida de la clasificacion de celulas se realizo a las 4 horas del aislamiento de la poblacion de celulas mononucleares. Se extrajeron linfocitos T CD54+ (molecula de adhesion intercelular-1 o IcAM-1) de la poblacion de celulas amigdalinas mononucleares, usando un anticuerpo anti-CD3 humano-PE de raton (BD Pharmingen) y un anticuerpo anti-CD54 humano-FITC de raton (BD Pharmingen) o se eligio un control de isotipo adecuado usando el metodo de tincion/clasificacion de celulas que se describe en la Seccion 1.33.1.1. Las celulas tenidas se analizaron usando un FACS. Las ventanas de clasificacion se configuraron para recoger fracciones que conteman linfocitos T CD3+ (es decir, celulas CD54+CD54) o linfocitos T CD54+ activados (es decir, celulas CD3+CD54+). La figura 8 muestra un perfil de FACS de las muestras tenidas con anticuerpos anti-CD3 humano de raton y anti-CD54 humano de raton. Las celulas CD3+ se usaron para la creacion de un tri-ldbrido de linaje cruzado, mientras que se usaron linfocitos T activados CD54+ para experimentos de expresion.

[0195] Los resultados mostraron que mientras que los linfocitos T constitrnan la mayor parte (82 %) de las celulas mononucleares aisladas de amfgdalas, solo el 9 % eran linfocitos T CD54+.

1.3.4. Aislamiento de celulas mononucleares de raton

[0196] Se mantuvieron ratones BALB/c de 8-12 semanas de edad en las instalaciones para animales sin patogenos espedficas. Antes de la extraccion de tejido los ratones se sacrificaron mediante exposicion CO2. Se obtuvo sangre periferica mediante puncion de la arteria axilar o femoral y se recogio en tubos recubiertos con heparina. El aislamiento de la poblacion de celulas mononucleares se realizo usando el mismo protocolo que se ha descrito en la Seccion 1.3.1 para el aislamiento de celulas mononucleares de sangre periferica humana. Se rompieron mecanicamente bazos de raton y se aislaron celulas mononucleares usando un procedimiento para el aislamiento de celulas mononucleares esplenicas humanas como se ha descrito en la Seccion 1.3.2.

1.3.5. Aislamiento de celulas primarias especificas de linaje a partir de celulas mononucleares de raton [0197] Se aislaron celulas de raton de linaje linfoide T y de linaje mieloide mediante procedimientos convencionales usando analisis por FACS y clasificacion de celulas o clasificacion magnetica de celulas. Se proporcionan a continuacion ejemplos no limitantes de tincion celular y clasificacion para el aislamiento de celulas de raton primarias especificas de linaje.

1.3.5.1. Aislamiento de linfocitos T efectores a partir de bazos de raton y sangre periferica

[0198] Las selecciones de diferentes linfocitos T efectores se basaron en las expresiones superficiales de CD4 y CD8.

[0199] Se anadieron 10 pl de cada uno de entre anticuerpo anti-CD4 de raton-PE de raton (BD Pharmingen) y anticuerpo anti-CD8 de raton-FITC de rata (BD Pharmingen) o control de isotipo apropiado a una alfcuota de 100 pl de celulas mononucleares de bazo o sangre periferica en medio de tincion (PBS BSA al 5 %), que conteman 1xl05 celulas por alfcuota. Para una alfcuota dada de poblacion de celulas mononucleares, la mezcla de tincion se incubo durante 30 minutos en hielo. Se anadieron 10 ml de medio de tincion enfriado con hielo a la mezcla de tincion y se centrifugaron durante 7 minutos a 350 g y 4 °C. Se aspiro el sobrenadante y despues se resuspendio el sedimento de celulas moviendo el tubo en el que se anadio un volumen comparable de medio de tincion enfriado con hielo. Las celulas tenidas se centrifugaron y se lavaron una vez mas en medio de tincion enfriado con hielo. El proceso se repitio para otras alfcuotas. Las celulas tenidas se analizaron usando un FACS. Se analizaron al menos 20.000 eventos seleccionados para cada muestra. Los perfiles de FACS tfpicos de tincion de sangre periferica de raton y celulas mononucleares de bazo se muestran en la Figura 45 (a) y 45 (b), respectivamente. Ambos tejidos linfoides conteman linfocitos T CD4 o CD8 positivo simple y linfocitos T doble positivo, pero variaron en la representacion celular. Por ejemplo, la mayor poblacion en sangre periferica contema linfocitos T citotoxicos CD8+CD4" (43 %), mientras que las celulas mononucleares de bazo estaban representadas principalmente por linfocitos T auxiliares o reguladores CD4+CD8- (42 %). Despues de configurar las ventanas de clasificacion apropiadas para la poblacion positiva para CD4 (region R1), para la poblacion positiva para CD8 (region R3) o la poblacion de celulas doble positivo (region R2), se recogieron las fracciones. Se recogio 1 ml de cada fraccion para el analisis de pureza y el resto de cada fraccion se resuspendio en medio completo para experimentos adicionales. Las purezas para cada fraccion fueron superiores al 98 %.

1.3.5.2. Aislamiento de monocitos a partir de sangre periferica de raton

[0200] Se aislaron monocitos de raton a partir de una poblacion mononuclear de sangre periferica mediante el uso de seleccion negativa con perlas magneticas (Miltenyi Biotec). Las celulas mononucleares se suspendieron en tampon de clasificacion magnetica de celulas (PBS, BSA al 01 % peso/volumen y EDTA 0,5 mM) y se incubaron con una mezcla de MicroBeads de anticuerpo incluyendo anticuerpos contra linfocitos T (CD90), celulas B (B220) y linfocitos NK (CD49b) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Despues, las celulas se hicieron pasar a traves de una columna de seleccion negativa-LD. Se recogio la fraccion negativa (monocitos). Para determinar la pureza, las celulas se tineron con anticuerpos conjugados con PE para CD11b y anticuerpos conjugados con FITC para CD90, B220, CD49b, NK1.1 y Ly6G (BD Pharmingen). Los monocitos se identificaron como CD11b+CD90'B220'CD49b' NK1.1'Ly6G'/(bajo) y el perfil de pureza se confirmo mediante FACS. El perfil de pureza de la poblacion de monocitos de raton se muestra en la Figura 46. El 100% de las celulas fueron positivas para CD11b, mientras que mas del 98 % de las mismas fueron negativas para B220, CD90, CD49b y NK1.1. Aproximadamente el 38 % de las celulas positivas para CD11b expresaron Ly6G a niveles bajos.

Ejemplo 2

2. Generacion de celulas primarias que secretan proteinas deseadas

[0201] Los metodos utilizados para generar celulas humanas primarias que secretan proteinas deseadas se proporcionan en las siguientes Secciones. Estas celulas se usaron para experimentos de hibridacion celular o como controles en experimentos analfticos o como referencia para el analisis de proteinas expresadas en un sistema de expresion tri-hforido.

2.1. Generacion de linfocitos que segregan GM-CSF humano

[0202] Se separaron linfocitos de sangre de cordon umbilical en primer lugar mediante centrifugacion en gradiente de densidades como se ha descrito en la Seccion 1.3.1 y despues se activaron en cultivo con fitohemaglutinina (PHA) seguida de expansion celular en IL-2 (1000 U/ml). La produccion de GM-CSF humano se analizo mediante ELISA. Las concentraciones de la produccion variaron entre 15 y 40 ng/ml/106 celulas.

[0203] Se incubaron en la oscuridad un total de 300.000 linfocitos humanos activados por PHA con anticuerpo anti-CD4 humano de raton conjugado con FITC (Sigma) a concentraciones de acuerdo con las instrucciones del fabricante durante 30 minutos a 4 °C. Los linfocitos T humanos activados se analizaron y se seleccionaron usando un FACS (FACS VantageSE, BD). La Figura 42 (a) muestra un perfil tfpico de linfocitos T CD4+ en cultivos de linfocitos activados por PHA, donde la Figura 42 (b) muestra una pureza del 100 % para celulas clasificadas CD4+.

2.2. Generacion de linfocitos humanos que secretan IgM e IgG

[0204] . Se sembraron celulas B purificadas (vease la Seccion 1.3.3.1) a 3,75 x 105 celulas/ml en placas de 96 pocillos de fondo redondo (Corning) recubiertas con anticuerpo anti-CD154 humano de raton (BD Pharmingen). Las celulas se cultivaron en medio RPMI1640 completo complementado con FBS de IgG ultra baja inactivado por calor al 10% (Gibco/BRL) e interleucina 4 (IL-4) 100 U/ml (R&D systems) e interleucina 10 (lLl0) 50 ng/ml anadidas despues del d^ a 3 en el cultivo. Los cultivos se rellenaron reemplazando la mitad del medio de cultivo cada 2 a 3 dfas. La viabilidad celular y los recuentos se evaluaron por triplicado mediante exclusion con azul de tripano usando un hemocitometro. El dfa 5 y el dfa 10, los linfocitos cultivados se recogieron, se lavaron dos veces en PBS y se analizaron mediante FACS usando anticuerpos anti-CD19 humano-PE de raton, anti-IgM humano-FITC de raton o anti-IgG humano-FITC de raton (todos de BD Pharmingen). Todas las tinciones se consiguieron con 1 |jg de cada anticuerpo por 1x106 celulas a 4 °C. En todos los analisis, mas del 95 % de las celulas fueron doble negativo con marcadores configurados de acuerdo con la tincion de control negativo emparejado con isotipo. Las regiones que conteman celulas muertas y desechos se excluyeron del analisis. Todos los analisis se realizaron mediante seleccion de 5000 a 10000 celulas vivas.

[0205] Se muestran perfiles tfpicos de celulas positivas para IgM e IgG en los linfocitos cultivados en la Figura 9. Despues de 5 dfas en el cultivo, el 18 % de las celulas CD19+ fueron positivas para IgM y solo el 1 % tema IgG detectable sobre la superficie, mientras que despues de 10 dfas el porcentaje de linfocitos positivos para IgM se redujo a solo el 2%, mientras que el porcentaje de celulas positivas para IgG aumento al 15%. Despues de configurar las ventanas apropiadas, se clasificaron fracciones positivas para IgM y positivas para IgG para experimentos de expresion de Ig.

[0206] Se determinaron concentraciones de IgM e IgG en el cultivo mediante un ELISA convencional usando placas de ELISA de 96 pocillos y anticuerpos purificados por afinidad con cabra y absorbidos en plastico frente a las cadenas j y Y humanas. Los anticuerpos unidos se revelaron con anticuerpos anti-Ig humana de oveja conjugados con HRP. Todos los anticuerpos fueron de Sigma. Se uso ABTS como sustrato y las densidades opticas se midieron a 405 nm. La Tabla 1 resume los niveles de IgM e IgG detectados en el cultivo de linfocitos B despues de 5 y 10 dfas.

Tabla 1

[0207] La produccion de IgM disminuyo despues de 5 dfas en el cultivo mientras que la produccion de IgG aumento.

Ejemplo 3

3. Hibridacion de celulas somaticas

[0208] Se conocen bien en la tecnica varios metodos de hibridacion de celulas somaticas. Estos incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, un metodo biologico que usa virus fusagenicos tales como el virus Sendai (Kohler y Milstein, 1975), un medio qmmico que usa polietilenglicol (PEG) (Wojciezsyn, et al, 1983) y un metodo electrico que usa campos electricos (Neil y Zimmermann, 1993). Cada metodo puede inducir o provocar que las membranas plasmaticas de las celulas de interes sean permeables reversiblemente y se hibriden.

[0209] Independientemente de los metodos de hibridacion celular mencionados anteriormente, se requieren dos etapas esenciales, en principio, para conseguir la hibridacion celular. En primer lugar, las membranas plasmaticas de las celulas que se han de hibridar deben ponerse en contacto estrecho con la membrana celular. En segundo lugar, debe inducirse simultaneamente una ruptura reversible de las membranas plasmaticas en el punto de contacto.

[0210] Para el metodo de hibridacion de celulas electricas, las celulas de interes pueden ponerse en contacto estrecho con la membrana celular usando un campo electrico de corriente alterna (campo de cA) con una frecuencia de campo apropiada y despues pueden inducirse a hibridarse cuando se exponen a un pulso electrico corto simultaneamente con el campo de CA.

[0211] Para la elaboracion adicional, la hibridacion de celulas electricas implica los siguientes fenomenos ffsicos; dielectroforesis (DEP) y una ruptura electrica de las membranas celulares plasmaticas.

[0212] La dielectroforesis (Pohl, 1978) es un fenomeno que describe el movimiento de partfculas dielectricas tales como celulas biologicas cuando se suspenden en una solucion apropiada y se someten a un campo electrico de CA no uniforme de una frecuencia apropiada. Esta bien documentado que el movimiento de las celulas puede describirse como una (i) traduccion o migracion de partfculas dielectricas, por ejemplo, a frecuencias de campo de entre 0,5 - 2,0 megahercios (MHz) para celulas Sp2 suspendidas en sorbitol l0o mM (Mahaworasilpa, 1992) y (ii) rotacion de partfculas dielectricas (Mahaworasilpa, 1992), por ejemplo, a frecuencias de campo de entre 2 - 10 kilohercios (kHz) para celulas Sp2 suspendidas en sorbitol 100 mM. Puede generarse un campo no uniforme mediante la aplicacion de un campo electrico a traves de un par de electrodos, por ejemplo, cables electricos, cilmdricos, que pueden disponerse en una serie de configuraciones. La configuracion mas utilizada es una configuracion de electrodo paralelo (Figura 58). En presencia de un campo no uniforme, la DEP puede provocar que las partfculas dielectricas (es decir, las celulas biologicas) se atraigan entre sf y migren simultaneamente hacia las regiones del campo mas intenso. Como resultado, forma una cadena o cuerda de celulas y, a su vez, induce un contacto estrecho de la membrana celular. Es evidente que la atraccion mutua de las celulas se promueve fuertemente cuando las celulas se suspenden en soluciones de conductividad electrica moderadamente baja.

[0213] La ruptura electrica de las membranas celulares puede inducirse cuando las celulas suspendidas en una solucion de hibridacion adecuada se exponen a un pulso electrico con una amplitud y un ancho de pulso apropiados (Zimmermann, 1982). Se usa ampliamente un intervalo de anchos de pulso, por ejemplo, pulsos cuadrados de 1 a 200 microsegundos (ps), dependiendo de los tipos celulares que se hibridan.

3.1. Sistema de hibridacion de celulas electricas

[0214] En determinadas realizaciones de la presente invencion, puede usarse una tecnica de celulas electricas para crear celulas hibridadas, tales como los tri-hfbridos.

3.1.1. Sistema de manipulacion de celulas

[0215] Con el fin de manipular celulas individuales de interes antes de la hibridacion celular, se uso el sistema de manipulacion/entrega de una celula individual descrito anteriormente (Seccion 1.1.1) en toda la presente invencion.

3.1.2. Microelectrodos

[0216] En la presente invencion se usaron dos microelectrodos en forma de L. La Figura 57 muestra un microelectrodo que estaba hecho de una aleacion de mquel sin recubrir, de 128 pm de diametro (7). El eje del microelectrodo se cubrio con un tubo capilar de hematocrito, con un diametro externo de 1,5 mm (8). La seccion en forma de L del microelectrodo (9 y 10) se configuro para permitir que un area uniforma de la superficie de las secciones tanto horizontal como vertical del electrodo se exponga a un medio o una solucion apropiada (Mahaworasilpa, 1992). Antes del proceso de hibridacion celular, se montaron dos microelectrodos en dos micromanipuladores finos, uno por cada microelectrodo. Estos microelectrodos se dispusieron de manera que se obtuvo una configuracion de electrodos en paralelo de cada electrodo (Figura 58). Cada micromanipulador fino se acciono hidraulicamente y permitio que se hiciera un movimiento tan fino como de 0,5 pm en la direccion X, Y o Z.

3.1.3. Camara y configuracion de celulas

[0217] La Figura 59 muestra dos electrodos paralelos en un pocillo de una placa TC convencional de 96 pocillos, el pocillo sirve como una camara de hibridacion celular en determinadas realizaciones de la presente invencion. Para realizar la hibridacion celular, los microelectrodos se sumergieron en un medio apropiado (11) contenido en el pocillo (12) de una placa de cultivo tisular de 96 pocillos convencional. La Figura 60 y la Figura 61 muestran una vista superior y una vista lateral de la configuracion de electrodos en paralelo respectivamente, donde, por ejemplo, tres celulas preseleccionadas que se han de hibridar se colocan entre los electrodos paralelos de manera que puedan inducirse para que se alineen o formen una cadena de celulas en presencia de un campo electrico de CA apropiado.

Ejemplo 4

4. Ejemplos de producciones de tri-hibridos de linaje cruzado mediante un metodo electrico de hibridacion de celulas

[0218] Las siguientes Secciones proporcionan ejemplos de la creacion de estirpes celulares tri-hforidas obtenidas mediante la hibridacion de celulas de diferentes linajes o tipos celulares o de los mismos linajes o tipos celulares, pero de diferentes fenotipos. Cada tri-hforido estable se sometio a un analisis para confirmar que posefa simultaneamente caractensticas fenotfpicas de las celulas parentales. La confirmacion se baso en el analisis de marcadores de superficie celular espedficos de linaje, la expresion intracelular de marcadores espedficos de linaje, la presencia de transcritos de ARN de marcadores espedficos de linaje, el cariotipado y la secrecion de protemas espedficas de linaje. Los ejemplos a continuacion ilustran las caractensticas fenotfpicas mas tipicas de los trihnbridos de linaje cruzado. Sin embargo, estos ejemplos no se limitan de ninguna manera a un marcador particular elegido.

4.1. Produccion de tri-hibridos de linaje cruzado a partir de tres celulas inmortales derivadas de linajes mieloide, linfoide T y B - KMW.

[0219] Este tipo de tri-hnbrido de linaje cruzado se creo mediante la hibridacion de una celula K562 mieloide, una celula MOLT4 linfoide T y una celula WIL2NS linfoide B. El tri-tnbrido de linaje cruzado obtenido de este modo se marco como una estirpe KMW (seguida de su numero de serie). A continuacion, se describen las siguientes etapas para el proceso de produccion de tri-hnbridos de linaje cruzado KMW, las soluciones (medios de hibridacion, cultivo y recuperació)n y los parametros utilizados en la presente invencion.

4.1.1. Preparacion de celulas para la produccion de tri-hibridos de linaje cruzado KMW

[0220] Se cultivaron las estirpes celulares K562, WIL2NS y MOLT4 en el medio convencional de los inventores (vease la Seccion 1.1). Habitualmente, se hizo un pase de cada estirpe celular cada 3 dfas. Antes de la hibridacion celular, el clon estable de cada tipo de celula que tema la velocidad de proliferacion mas alta se establecio usando el procedimiento descrito en la Seccion 1.1.2. En algunos experimentos, se usaron poblaciones de celulas enriquecidas con CD71 establecidas como se ha descrito en la Seccion 1.1.3. Ademas, en algunas ocasiones, se usaron las celulas CD15+ de la poblacion K562 enriquecida con CD71 (Seccion 1.1.3.1).

4.1.2. Protocolo de hibridacion celular para la produccion de tri-hibridos de linaje cruzado KMW

[0221] Se usaron algunos pocillos de una placa TC de 96 pocillos como pocillos de hibridacion celular. Cada pocillo se lleno con aproximadamente 150 pl de medio de hibridacion, que consistfa en sorbitol 240 mM (Sigma), KH2PO4 2,0 mM (Sigma), CaCl2 0,4 mM (Sigma), Mg(C2H3O2)2 0,2 mM (Sigma) y Ca(C2H3O2)2 0,2 mM (Sigma), complementado con albumina de suero bovino al 0,2 %, BSA (Sigma). Antes de la hibridacion celular electrica, las celulas del clon preseleccionado de cada tipo celular se lavaron una vez en un medio de hibridacion durante unos minutos y se transfirieron a un pocillo que contema el medio de hibridacion recien preparado. El pocillo se denomino un pocillo de prehibridacion. Antes del proceso de hibridacion celular, se manipulo una celula individual y lavada de cada clon seleccionado de acuerdo con la Seccion 1.1.1, de manera que solo se colocaron tres celulas, una de cada clon seleccionado, entre un par de electrodos paralelos identicos, que se sumergio en el fondo del pocillo (como se muestra en la Figura 61). La separacion de los electrodos se configuro a 400 micrometres (es decir, 400 pm).

Para conseguir la hibridacion de celulas electricas, en primer lugar, se aplico un campo de corriente alterna (CA) con una frecuencia de 0,8 MHz y una intensidad de campo de aproximadamente 50 - 60 kilovoltios por metro (por ejemplo, 50-60 kV/m) entre los electrodos durante unos segundos hasta que se indujeron las tres celulas para que se atrajeran entre sf por dielectroforesis, DEP y formar una cadena de celulas. Este proceso provoco que las celulas hicieran contacto estrecho con la membrana celular. Las celulas se dispusieron de manera que las celulas K562 estuvieran en el centro de la alineacion de las celulas (vease la Figura 60 o 61). Despues, se aplicaron dos pulsos cuadrados electricos, con un intervalo de 3 segundos entre los pulsos, simultaneamente con el campo de CA. Se uso cada pulso con una intensidad de aproximadamente 170 kV/m y un ancho de pulso de 75 microsegundos (por ejemplo, 75 ps). Despues de completar el segundo pulso cuadrado, el campo de CA se mantuvo continuamente durante otros 5 segundos, lo que dio como resultado la hibridacion celular en una unica celula tri-hibridada de linaje cruzado. Para determinadas realizaciones de la presente invencion, se observo que la hibridacion de las tres celulas podna no tener lugar simultaneamente, es decir, se produda en primer lugar la hibridacion de dos de las tres celulas, seguida de la hibridacion de la tercera celula. En algunos casos se requirio un pulso cuadrado adicional para obtener una hibridacion completa de las tres celulas. La nueva celula tri-hnbrida de linaje cruzado se transfirio despues del pocillo de hibridacion a un pocillo de recuperació,n que se ubico en una fila diferente de la de los pocillos de hibridacion. Cada pocillo de recuperació cnontema 150 pl de medio TC convencional (vease la Seccion 1.1). Cada nueva celula tri-hnbrida de linaje cruzado se incubo, una celula tri-hnbrida de linaje cruzado por pocillo de recuperació,n en una incubadora humidificada, que funcionaba a 37 °C y un contenido de CO2 del 5 %, durante siete dfas. Se descubrio que la mayona de los tri-hnbridos de linaje cruzado se dividfan en las 36 horas posteriores al evento de hibridacion celular. Al final del penodo de incubacion, el medio en cada pocillo de recuperació sne relleno adecuadamente con medio convencional nuevo. Esto estimulo la proliferacion celular de cada clon tri-hnbrido de linaje cruzado. Dos o tres dfas despues, se identificaron las celulas que se dividieron o sobrevivieron de cada pocillo de recuperació yn se sembraron en placas en los pocillos de una placa TC convencional de 24 pocillos, dando origen a un conjunto de clones tri-hnbridos de linaje cruzado. Cada clon de tri-hnbrido de linaje cruzado se cultivo en la placa de 24 pocillos durante otra semana antes de transferirlo a un matraz de TC de 25 cm2, que contema 10 mililitros (ml) del medio de cultivo convencional de los inventores (vease la Seccion 1.1) y se etiqueto adecuadamente para el analisis adicional. El proceso completo de hibridacion celular electrica y el proceso de recuperació dnel tri-hnbrido de linaje cruzado se repitio durante un numero de veces para crear un lote de celulas trihnbridas de linaje cruzado estable.

4.3.1. Confirmacion del estado de tri-hibridos de linaje cruzado KMW

Expresiones de marcadores CD

[0222] A continuacion, se proporciona un ejemplo de la verificacion de una estirpe celular tri-hforida de linaje cruzado KMW establecida.

[0223] Despues de configurar una estirpe celular tri-hforida de linaje cruzado KMW en condiciones de cultivo normales durante 6 meses, se analizo la expresion de marcadores CD espedficos del linaje en la poblacion de celulas tri-hforidas de linaje cruzado.

[0224] Se uso un analisis por FACS tricolor para verificar las coexpresiones de los siguientes marcadores CD: Cd 19 originado partir de WIL2NS, CD15 originado a partir de K562 y CD4 originado a partir de MOLT4.

[0225] En resumen, se suspendieron 100 pl de celulas tri-hforidas de linaje cruzado KMW a una concentracion de 1x106 celulas/ml en PBS que contema BSA al 5 % en 100 pl de PBS y se incubaron durante 30 min a 4 °C con anticuerpo anti-CD15 humano-PerCP de raton 0,5mg/100ml, anticuerpo anti-CD4 humano-PE de raton 0,25mg/100ml y anticuerpo anti-CD19 humano-FITC de raton 1,0 mg/100 ml o un control de isotipo adecuado. Todos los anticuerpos antihumanos de raton se adquirieron de BD Pharmingen. Despues de un lavado exhaustivo con PBS, las celulas marcadas se analizaron usando el citometro de flujo FACSCalibur y el software CellQuest Pro.

[0226] La Figura 10 muestra el perfil de FACS de la estirpe celular tri-hforida de linaje cruzado KMW, lo que sugiere que las celulas tri-hforidas de linaje cruzado KMW, en las que las caractensticas espedficas del linaje provienen de fenotipos inmortales, contienen poblaciones celulares heterogeneas de fenotipos mixtos, siendo predominante la mieloide. Sin embargo, el 62 % de las celulas KMW compartfan fenotipos mieloides y linfoides y el 28 % de las celulas KMW expresan fenotipos linfoides T y B.

4.2. Produccion de tri-hibridos de linaje cruzado a partir de una celula mieloide inmortal y dos celulas linfoides primarias - KBT

[0227] El tri-hforido de linaje cruzado se creo mediante hibridacion de celulas somaticas de una celula K562 mieloide, una celula B humana primaria y un linfocito T humano primario. El tri-hforido de linaje cruzado se denomino KBT seguido de un numero de serie.

4.2.1. Preparacion de celulas para la produccion de tri-hibridos de linaje cruzado de KBT

[0228] La preparacion de celulas K562 antes de la creacion del tri-hfbrido de KBT de linaje cruzado se ha descrito anteriormente (Seccion 4,1.1). Las celulas primarias utilizadas en la creacion de los tri-hibridos de linaje cruzado KBT incluyeron (i) celulas B maduras (CD19+) derivadas de bazo, sangre periferica o sangre de cordon umbilical; celulas B tempranas (CD20'CD72+) derivadas de medula osea; celulas B activadas (CD20+CD72+) derivadas de medula osea; celulas B con experiencia antigenica (CD19+CD5+) derivadas de sangre de cordon umbilical y (ii) linfocitos T auxiliares (CD4+) derivados de bazo, sangre periferica, sangre de cordon umbilical y timo, linfocitos T citotoxicos (CD8+) derivadas de bazo, sangre periferica, sangre de cordon umbilical y timo; linfocitos T con experiencia antigenica (CD3+CD5+) derivados de sangre de cordon umbilical; linfocitos T CD3+ de sangre de cordon umbilical; en los experimentos se usaron linfocitos T doble negativo (CD3+CD4'CD8‘) derivados de timo, linfocitos T doble positivo (CD3+CD4+CD8+) derivados de timo. El aislamiento de diversas celulas linfoides primarias de diversos tejidos linfoides se ha descrito anteriormente en la Seccion 1.3.

4.2.2. Protocolo de hibridacion celular para la produccion de tri-hibrido de linaje cruzado de KBT

[0229] El protocolo de hibridacion celular para la produccion de tri-hforido de linaje cruzado de KBT es similar al utilizado para la produccion de tri-hforido de linaje cruzado de KMW (Seccion 4.1.2), excepto porque el medio y los campos electricos de CA y los pulsos variaron. El medio de hibridacion utilizado en estos experimentos consistfa en sorbitol 230 mM, KH2PO41,8 mM, CaCl20,5 mM, Mg(C2H3O2)20,2 mM y Ca(C2H3O2)20,3 mM, complementado con BSA al 0,3 %. Se aplico un campo de CA de 0,5 MHz y 65-75 kV/m simultaneamente con un tren de tres pulsos cuadrados en un intervalo de 3 segundos, cada uno con un ancho de pulso de 100 ps y una fuerza de 175 185 kV/m. El campo de CA se encendio de forma continua durante otros 5 segundos despues de completar el tercer pulso cuadrado, lo que dio como resultado la hibridacion de las celulas para producir una celula tri-hforida de linaje cruzado. Los protocolos para la recuperació yn el establecimiento de una estirpe estable de esta celula tri-hforida de linaje cruzado formada recientemente se describieron en la Seccion 4.1.2.

4.2.3. Confirmacion del estado de tri-hibridos de linaje cruzado de KBT

Expresiones de marcadores CD sobre la superficie celular

Una estirpe celular de tri-hforido de linaje cruzado de KBT establecida a partir de una celula mieloide inmortal (K562), una celula B madura primaria y un linfocito T auxiliar efector primario

[0230] Despues que se ha^a establecido una estirpe celular tri-hnbrida de linaje cruzado, por ejemplo, en condiciones normales de cultivo durante unos pocos meses, la estirpe celular se analizo para determinar la expresion de marcadores CD espedficos de linaje. Las celulas de la estirpe celular KBT se marcaron con anticuerpos anti-CD19 y CD4 humanos usando los mismos protocolos que se describen en la preparacion celular antes de la hibridacion (Seccion 1.3.1.1). La Figura 11 (d) muestra los perfiles de FACS (marcadores CD19 y CD4) de una estirpe celular tri-hnbrida de linaje cruzado de KBT establecida a partir de una celula mielomonocftica inmortal y 2 celulas primarias. Normalmente, mas del 95 % de las celulas en un tri-hnbrido de linaje cruzado estable de este tipo expresaron marcadores CD tanto para las celulas B como para los linfocitos T con una densidad similar a la de las celulas primarias parentales.

Una estirpe celular tri-hibrida de linaje cruzado de KBT establecida a partir de una celula mieloide inmortal (K562) y 2 celulas linfoides con experiencia antigenica primarias (linfocitos B y T)

[0231] En otra realizacion, se establecio una estirpe celular KBT derivada de la hibridacion celular de una celula K562, una celula B con experiencia antigenica y un linfocito T con experiencia antigenica. Las celulas se analizaron para la coexpresion de CD19, CD3 y CD5 usando un FACS.

[0232] En resumen, las celulas se marcaron con anticuerpos anti-CD5 humano-FITC de raton y anti-CD19 humano-PE de raton o anti-CD4 humano-PE de raton usando los mismos protocolos que en la preparacion celular antes de la hibridacion celular (Seccion 1.3.1.1). La Figura 12 muestra los perfiles de FACS de las celulas de dicha estirpe celular tri-hnbrida de linaje cruzado de KBT. Los resultados muestran que el 5-10 % de la poblacion de celulas KBT conservo su memoria de exposicion al antfgeno manteniendo la expresion de la molecula CD5 en la superficie celular, mientras que era positiva para CD3 y/o CD19. Ademas, al menos el 83% de la poblacion de celulas CD5 negativas coexpresaron los marcadores tanto del linaje B (CD19) como del linaje T (CD3).

Una estirpe celular tri-hibrida de linaje cruzado de KBT establecida a partir de una celula mieloide inmortal (K562), una celula B activada y un linfocito T efector no comprometido doble positivo primario

[0233] En otra realizacion, se establecio una estirpe celular KBT derivada de la hibridacion celular de una K562, un linfocito T (doble positivo para CD4+ y CD8+) aislado de timo y una celula B activada (CD20+ y CD72+) (explicada en la seccion 1.3.34) aislada de medula osea. Las celulas se analizaron para determinar las coexpresiones de CD4, CD8, CD20 y Cd72 sobre la superficie celular.

[0234] En resumen, las celulas tri-hnbridas de linaje cruzado de KBT se marcaron con una combinacion de anticuerpos anti-CD4 humano-PE de raton y anticuerpos anti-CD72 humano-FITC de raton o anticuerpos anti-CD20 humano-PE de raton y anticuerpos anti-CD8 humando-FITC de raton o anticuerpos anti-CD4 humano-PE de raton y anti-CD8 humano-FlTC de raton usando el mismo protocolo descrito para el aislamiento de linfocitos primarios (Seccion 1.3.3.1.1). La Figura 13 muestra los perfiles de FACS de dichas celulas tri-hnbridas de linaje cruzado.

[0235] Los resultados (vease la Figura 13) mostraron que el 99 % de las celulas tri-hnbridas de linaje cruzado de KBT expresaban CD4 o CD8 derivados de linfocitos T doble positivo sobre su superficie donde el 66-71 % de las celulas fueron positivas para CD4 y un 88-89 % de las celulas fueron positivas para CD8. En el 60 % de estas celulas, la expresion de CD4 y CD8 fue simultanea. Aunque fueron positivas para CD4 derivado de timocitos doble positivo, el 61 % de las celulas tambien fueron positivas para CD72 derivado de celulas B activadas de medula osea. Sin embargo, el 94 % de la poblacion de tri-hibridos de linaje cruzado expreso CD72 en su superficie. Por otro lado, el 31 % de las celulas tri-hnbridas de linaje cruzado positivas para CD8 coexpresaron CD20. El numero total de celulas CD20 positivas fue del 39 %.

4.3. Produccion de tri-hibridos de linaje cruzado a partir de un linfoide inmortal, una celula linfoide primaria y una celula mielomonocftica primaria -WTM

[0236] Este es un ejemplo de creacion de una estirpe celular tri-hnbrida de linaje cruzado a partir de una celula linfoide B humana inmortal (WIL2NS), un linfocito T humano primario y un monocito humano primario. La estirpe trifnbrida de linaje cruzado se marco como WTM seguido de un numero de serie.

4.3.2. Preparacion de celulas para la produccion de tri-hibridos de linaje cruzado de WTM

[0237] La preparacion de celulas WIL2NS utilizadas en la creacion de tri-hibridos de linaje cruzado de WTM se ha descrito anteriormente en la Seccion 4.1.1. Las celulas primarias incluyen monocitos CD14+CD16 o CD14+CD16L derivados de bazo y sangre periferica; se usaron en estos experimented linfocitos T auxiliares (CD4+) derivados de bazo, sangre periferica, sangre de cordon umbilical y timo; linfocitos T citotoxicos (CD8+) derivados de bazo, sangre periferica, sangre de cordon umbilical y timo; linfocitos T con experiencia antigenica (CD3+CD5+) y T CD3+ derivados de sangre de cordon umbilical; linfocitos T doble negativo (CD3+CD4-CD8-) y linfocitos T doble positivo (CD3+CD4+CD8+) derivados de timo. El aislamiento de diversas celulas linfoides primarias de diversos tejidos linfoides se ha descrito anteriormente (Seccion 1.3.3). En determinadas realizaciones, se usaron celulas progenitoras mielomonocfticas CD34+CD15+ derivadas de medula osea en lugar de monocitos positivos para CD14.

4.3.2. Protocolo de hibridacion celular para la produccion de tri-hibridos de linaje cruzado de WTM [0238] El protocolo de hibridacion celular para la produccion de tri-hteridos de linaje cruzado de WTM fue similar al utilizado para la produccion de tri-hteridos de linaje cruzado de KMW (vease la Seccion 4.1.2), excepto porque el medio vario. El medio de hibridacion utilizado en estos experimentos consistio en sorbitol 235 mM, KH2PO41,8 mM, CaCl2 0,5 mM, Mg(C2H3O2)2 0,3 mM y Ca(C2H3O2)2 0,25 mM (Sigma), complementado con BSA al 0,3%. El protocolo electrico exacto que se ha descrito en la Seccion 4.2.2 se uso para la produccion de WTM. Los protocolos para la recuperació yn el establecimiento de una estirpe estable de esta celula tri-hterida de linaje cruzado recien formada se describieron en la Seccion 4.1.2.

4.3.2. Confirmacion del estado de tri-hibridos de linaje cruzado de WTM

Expresiones de marcadores CD

Una estirpe celular de tri-hibridos de linaje cruzado de WTM establecida a partir de una celula linfoide inmortal (WIL2NS), un linfocito T primario y un monocito primario

[0239] Se establecio una estirpe celular WTM derivada de la hibridacion celular de una celula WIL2NS, un linfocito T primario y un monocito. Despues de que la estirpe celular tri-hterida de linaje cruzado se hubiera cultivado en condiciones normales (vease la Seccion 1.1) durante 6 meses, la poblacion de celulas tri-hteridas de linaje cruzado se analizo para determinar la expresion de marcadores CD espedficos de linaje. El analisis por FACS tricolor se uso para verificar la coexpresion de CD19 originado a partir de WIL2NS, CD14 originado a partir de monocitos primarios y CD4 originado a partir de linfocitos T primarios cuando estos linfocitos T primarios se usaron para la hibridacion.

[0240] En resumen, se incubaron 100 ml de las celulas tri-hteridas de linaje cruzado de WTM a una concentracion de 1x106 celulas/ml en PBS que contema BSA al 5 % suspendidas en 100 pl de PBS durante 30 min a 4 °C con anticuerpos monoclonales marcados (CD14-PerCP 0,5mg/100ml, CD4-PE 0,25mg/100ml y CD19-FITC1,0 mg/100 ml, todos adquiridos de BD Pharmingen) o el control de isotipo adecuado. Despues de un lavado exhaustivo con PBS, las celulas marcadas se analizaron usando el citometro de flujo FACSCalibur y el software CellQuest Pro.

[0241] En la Figura 14 se muestran perfiles de FACS de celulas tri-hteridas de linaje cruzado de WTM. Aunque los niveles de la expresion CD19, marcador derivado de celulas inmortales, paredan ser uniformes entre la poblacion de celulas tri-hteridas de linaje cruzado, las expresiones de marcadores que se originaban a partir de celulas primarias parecieron variar. En este ejemplo particular, las poblaciones de celulas pueden dividirse en los tres subgrupos basandose en la intensidad de las expresiones de CD14 y CD4: (i) CD4HCD14L; (ii) CD4HCD14H; (iii) CD4LCD14H Cada una de estas poblaciones puede aislarse posteriormente mediante tecnicas convencionales tales como FACS, MACS o clonacion de una celula individual, etc. y pueden expandirse en cultivos tri-hteridos de linaje cruzado separados procesando caractensticas fenotfpicas diferentes entre sf, mientras se mantiene la homogeneidad en cultivo.

Una estirpe celular tri-hibrida de linaje cruzado de WTM establecida a partir de una celula linfoide inmortal (WIL2NS), un linfocito T con experiencia antigenica primario y un monocito primario.

[0242] Cuando se usaron linfocitos T con experiencia con antfgeno CD5+ para generar una estirpe celular trihterida de linaje cruzado de WTM, la expresion de CD5 simultaneamente con CD19 y CD14 se verifico mediante el uso de un analisis por FACS tricolor. El protocolo fue esencialmente el mismo que se ha descrito anteriormente, excepto porque se emplearon anticuerpos anti-CD19 humano-PE de raton y anti-CD5 humano-FITC de raton en lugar de anticuerpos anti-CD19 humano-FITC de raton y anticuerpos anti-CD4 humano-PE de raton. Se muestran perfiles de FACS de estas expresiones de CD en las celulas tri-hteridas de linaje cruzado en la Figura 15. El analisis demostro que, aunque el nivel de expresion de CD19 derivado de celulas inmortales y responsable del fenotipo de celulas B parece ser uniforme, de aproximadamente el 91-99% de la poblacion celular, la expresion de CD5 derivado de linfocitos T con experiencia antigenica y CD14 derivado de monocitos primarios vario entre las celulas hteridas de WMT. Solo el 63 % de las celulas positivas para CD19 tambien fueron positivas para CD5 y el 79 % de las celulas positivas para CD19 fueron positivas para CD14. Notablemente, el nivel de expresion de CD14 vario entre dichas celulas tri-hteridas de linaje cruzado de WMT de bajo a alto. Por otro lado, la poblacion celular se dividio claramente en las celulas tri-hnbridas de linaje cruzado de CD5+ y CD5.

Una estirpe celular tri-hibrida de linaje cruzado de WTM establecida a partir de una celula linfoide inmortal (WIL2NS), un linfocito T citotoxico primario y un monocito primario.

[0243] Cuando se usaron linfocitos T positivos para CD8 citotoxicos para crear una estirpe tri-hnbrida de linaje cruzado de WTM, el analisis por FACS se realizo para verificar la coexpresion de CD19, CD8 y CD14 usando el mismo protocolo de etiquetado tricolor como se ha descrito anteriormente en la presente Seccion. La Figura 16 muestra los perfiles de FACS de las expresiones de CD19, CD8 y CD14 sobre las celulas de la presente estirpe celular tri-hnbrida de linaje cruzado de WTM. La expresion de CD19 y su nivel se mantuvieron constantes entre estas celulas tri-hnbridas de linaje cruzado de WMT, mientras que solo el 46 % de estas celulas coexpresaron CD8 derivado de linfocitos T citotoxicos primarios a niveles bajos y el 41 % coexpresaron CD14 derivado de monocitos primarios. Notablemente, el nivel de expresion de CD14 entre estas celulas de WMT vario de bajo a alto.

Una estirpe celular tri-hibrida de linaje cruzado de WTM de una celula linfoide inmortal (WIL2NS), un linfocito T doble positivo primario y un monocito primario

[0244] Cuando se usaron linfocitos T positivos para CD dobles (CD4+CD8+) derivados de timos para la creacion de una estirpe celular tri-hnbrida de linaje cruzado de WTM, se utilizo el analisis de la coexpresion de CD4 y CD8 ademas del analisis de las expresiones de CD19, CD8 y CD14. La Figura 17 muestra un perfil de FACS para la coexpresion de CD4 y CD8 sobre las celulas de la estirpe celular tri-hnbrida de linaje cruzado. En este caso donde se usaron linfocitos T doble positivo, el 96 % de las celulas tri-hnbridas de linaje cruzado de WTM fueron positivas tanto para CD4 como para CD8. El perfil de expresion de CD19 y CD14 en las celulas tri-hnbridas de linaje cruzado de WTM derivadas de linfocitos T positivos para CD4+CD8+ fue esencialmente similar al de las celulas tri-hnbridas de linaje cruzado de WTM derivadas de linfocitos T efectores positivos para CD8 citotoxico.

Una estirpe celular tri-hibrida de linaje cruzado de WTM establecida a partir de una celula linfoide inmortal (WIL2NS), un linfocito T primario y una celula progenitora mielomonocitica primaria

[0245] Cuando se usaron celulas mielomonodticas CD34+CD15+ derivadas de medula osea para generar una estirpe celular tri-hnbrida de linaje cruzado WTM, se analizaron los marcadores de superficie para CD19 (linaje B), CD3 (linaje T), CD15 (linaje mieloide) y CD34 (celulas progenitoras). En resumen, las celulas de la presente estirpe celular tri-hnbrida de linaje cruzado w Mt se marcaron con una combinacion de anticuerpos anti-CD19 humano-PE de raton, anti-CD4 humano-FITC de raton (BD Pharmingen) y anti-CD15 humano-PerCP de raton o con una combinacion de anticuerpos anti-CD34 humano-PE de raton, anti-CD4 humano-FITC de raton y anti-CD15 humano-PerCP de raton. La tincion celular se realizo de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente (Seccion 1.3.3.1.1. ). Los perfiles de expresion tfpicos de celulas tri-hnbridas de linaje cruzado de WTM que se originan a partir de celulas progenitoras mielomonocfticas CD34+CD15+ se muestran en la Figura 18. El analisis mostro que aproximadamente el 81 % de las celulas tri-hnbridas de linaje cruzado de WTM compartieron el linaje B y fenotipos mielomonodticos (CD19+CD15+) y el 61 % de CD19+ tambien fue positivo para c D4, el marcador de linaje T. El 34 % de las celulas tri-hnbridas de linaje cruzado CD4+ conservaron tambien CD34 sobre su superficie y el 68 % de las CD34+ celulas tri-hnbridas expresaron CD15. Curiosamente, el 28 % de las celulas tri-hnbridas de linaje cruzado CD34+ no conservo la expresion de CD15 incluso a pesar de que tanto CD34 como CD15 proceden de la misma fuente (celula progenitora mielomonodtica).

4.4. Produccion de tri-hibridos de linaje cruzado a partir de una celula mieloide inmortal, una celula linfoide inmortal y un linfocito T linfoide primario. - KWT

[0246] Este tipo de produccion de tri-hnbridos de linaje cruzado se creo mediante la hibridacion celular de una celula mieloide inmortal (K562), una celula linfoide B inmortal (WIL2NS) y un linfocito T humano primario. El trihnbrido de linaje cruzado de este tipo se denomino KWT seguido de un numero de serie.

4.4.1. Preparacion de celulas para la produccion de tri-hibridos de linaje cruzado de KWT

[0247] Las preparaciones de celulas K562 y WIL2NS para estos experimentos de hibridacion de celulas se han descrito en las Secciones 4.1.1. Antes de la hibridacion celular, se establecio un clon estable de cada tipo de celula, que presentaba la velocidad de proliferacion mas alta, usando el procedimiento descrito en la Seccion 1.1.1. En determinadas realizaciones, se usaron poblaciones de celulas enriquecidas con CD71+ como se ha descrito en la Seccion 1.1.3. En realizaciones adicionales, se usaron celulas CD15+ de la poblacion de K562 enriquecida en CD71 seleccionada como se ha descrito en la Seccion 1.1.3.1. Las celulas primarias utilizadas para la creacion de trifnbridos de linaje cruzado de KWT incluyeron linfocitos T auxiliares (CD4+) derivados de bazo, sangre periferica, sangre de cordon umbilical y timo; linfocitos T citotoxicos (CD8+) derivados de bazo, sangre periferica, sangre de cordon umbilical y timo; linfocitos T con experiencia antigenica (CD3+CD5+) y linfocitos T CD3+ derivados de sangre de cordon umbilical; se usaron linfocitos T doble negativo (CD3+CD4'CD8') y linfocitos T doble positivo (CD3+CD4+CD8+) derivados de timo en estos experimentos (vease la Seccion 1.3).

4.4.2. Protocolo de hibridacion celular para la produccion de tri-hibrido de linaje cruzado de KWT

[0248] El protocolo de hibridacion celular para la produccion de tri-hnbridos de linaje cruzado de KWT fue similar al utilizado para la produccion de tri-hnbridos de linaje cruzado de KMW (vease la Seccion 4.1.2).

4.4.3. Confirmacion del estado de tri-hibridos de linaje cruzado de KWT

Expresion de marcadores CD

Una estirpe celular de tri-hibridos de linaje cruzado de KWT establecida a partir de una celula mieloide inmortal (K562), una celula linfoide inmortal (WIL2NS) y un linfocito T primario

[0249] Se establecio una estirpe celular derivada de KWT a partir de la hibridacion celular de una celula K562, una celula WIL2NS y un linfocito T primario. Despues de que la estirpe celular de tri-hnbrido de linaje cruzado se hubiera mantenido estable en condiciones de cultivo normales durante 6 meses, se analizo la expresion de marcadores CD especfticos de linaje en la poblacion de celulas tri-hnbridas de linaje cruzado. Se uso un analisis por FACS tricolor para identificar la coexpresion de CD15 que se origina a partir de K562, CD19 que se origina a partir de WIL2NS y CD4 que se origina a partir de linfocitos T auxiliares efectores primarios. El protocolo para la tincion celular de celulas tri-hnbridas de linaje cruzado de KWT fue esencialmente el mismo que el descrito para los tri-hnbridos de linaje cruzado de KMW (Seccion 4.1.3). Los perfiles de FACS de celulas tri-hnbridas de linaje cruzado de KWT derivadas de linfocitos T efectores CD4+ se muestran en la Figura 19. La mayona de las celulas tri-hnbridas de linaje cruzado de KWT mostraron caractensticas fenoftpicas mixtas de linajes linfoides mielomiocfticos, B y T. El 100 % de las celulas tri-hnbridas de linaje cruzado de KWT expresaron CD4 en la superficie celular, un marcador del linaje linfoide T, que deriva del linfocito T efector primario, mientras que el 54 % de estas celulas fueron simultaneamente positivas para el marcador CD19 del linaje B derivado de celulas inmortales de la estirpe WIL2NS y el 24 % de estas celulas CD4+CD19+ fueron positivas para CD15 derivado de la estirpe de celulas progenitoras mielomonocfticas inmortales K562.

Una estirpe celular de tri-hibrida de linaje cruzado de KWT establecida a partir de una celula mieloide inmortal (K562), celula linfoide inmortal (WIL2NS) y un linfocito T doble positivo

[0250] Cuando se usaron linfocitos T doble positivo (celulas CD4+CD8+) para generar una estirpe tri-hnbrida de linaje cruzado de KWT, tambien se analizo el perfil de expresion de CD4 y CD8 derivados de timocitos primarios. El protocolo para el realizar el perfil de CD fue esencialmente el mismo que se ha descrito anteriormente para los trihnbridos de linaje cruzado de KWT derivados de linfocitos T CD4+, excepto porque se uso anticuerpo anti-CD8 humano-FITC de raton en lugar de anticuerpo anti-CD19 humano-FITC de raton. Los perfiles de expresion de CD ftpicos de las celulas tri-hnbridas de linaje cruzado derivadas de los linfocitos T doble positivo (CD4+CD8+) se muestran en la Figura 20. Los resultados mostraron que el 99 % de las celulas tri-hnbridas de linaje cruzado de KWT fueron positivas para CD4+ y el 69 % fueron positivas para CD8, con un 26 % de las celulas CD4+ que son positivas para el marcador de celulas mielomonocfticas CD15 y el 23 % de las celulas CD8+ que son positivas para CD15, lo que significa que las celulas CD4+CD8+CD15+ representaron aproximadamente el 23 % de la poblacion celular total (debido a que casi el 100% de las celulas son CD4+, la poblacion de CD8+CD15+ doble positivo tambien sena positiva para CD4). Al igual que en los tri-hnbridos de KWT derivados de linfocitos T efectores CD4+, las celulas CD19+ representaron el 52 % de la poblacion celular total, expresando el 22 % de las mismas CD15. Por tanto, toda la poblacion de celulas CD15+ coexpreso CD4, CD8 y CD19, lo que significa un 22-23 %.

Una estirpe celular tri-hibrida de linaje cruzado de KWT establecida a partir de una celula mieloide inmortal (K562), una celula linfoide inmortal (WIL2NS) y un linfocito T con experiencia con antigeno CD5 positivo [0251] Cuando se usaron linfocitos T con experiencia con anftgeno CD5 positivo para generar una estirpe trihnbrida de linaje cruzado de KWT, se analizo la expresion de CD5. Las celulas hnbridas de KWT se marcaron con anticuerpos anti-CD19 humano-FITC de raton y anti-CD5 humano-PE de raton usando el mismo protocolo que se uso para el analisis de tri-hnbridos de linaje cruzado de WTM excepto por la reversion de conjugados fluorescentes entre anticuerpos anti-CD19 humano de raton y anti-CD5 humano de raton (Seccion 4.6). Los resultados que se muestran en la Figura 21 demostraron que el 90 % de las celulas tri-hnbridas de linaje cruzado de KWT fueron positivas para CD5 que se origina a partir de linfocitos T con experiencia antigenica y el 49 % de las celulas CD5 tambien fueron positivas para CD19 que se origina a partir de celulas WIL2NS (celulas B). El porcentaje total de celulas CD19+ entre las celulas tri-hnbridas de linaje cruzado fue de aproximadamente el 56 %.

4.5. Produccion de tri-hibridos de linaje cruzado a partir de dos celulas linfoides inmortales (WIL2NS) y un monocito primario - WWM

[0252] Este tipo de produccion de hnbridos de linaje cruzado se creo mediante la hibridacion de celulas somaticas de dos celulas linfoides inmortales (WIL2NS) y un monocito humano primario. El tri-hnbrido de linaje cruzado se marco como WWM seguido de un numero de serie.

4.5.1. Preparacion celular para la produccion de tri-hibridos de linaje cruzado de WWM

[0253] La estirpe celular WIL2NS se cultivo en el mismo procedimiento que se ha descrito en la Seccion 4.1.1.

[0254] En determinadas realizaciones, se usaron poblaciones de celulas enriquecidas con CD71 establecidas como se ha descrito en la Seccion 1.1.3. Se aislaron monocitos humanos a partir de linfocitos mixtos procedentes de bazo, sangre periferica o sangre de cordon umbilical. El aislamiento de monocitos se baso en la expresion de marcador CD14 y, en algunos casos, niveles bajos de expresion de CD16, ya sea FACS o perlas magneticas, como se ha descrito anteriormente en la Seccion 1.3.3.1.1. Parece que no existen diferencias en los parametros de hibridacion o en los tri-hforidos de linaje cruzado resultantes cuando se usaron monocitos de diferentes tejidos linfoides.

4.5.2. Protocolo de hibridacion celular para la produccion de tri-hibridos de linaje cruzado de WWM [0255] El protocolo de hibridacion celular para la produccion de tri-hnbridos de linaje cruzado de WWM fue similar al utilizado para la produccion de tri-hnbridos de linaje cruzado de KBT (vease la Seccion 4.2.2).

4.5.3. Confirmacion del estado de tri-hibridos de linaje cruzado de WWM

Expresion de marcadores CD

[0256] Despues de que una estirpe celular tri-hnbrida de linaje cruzado de WWT haya sido estable en condiciones de cultivo normales (vease la Seccion 1.1) durante 6 meses, se analizo la poblacion de celulas tri-hnbridas de linaje cruzado para la expresion de marcadores CD espedficos del linaje.

[0257] La tincion o el marcaje doble con anticuerpos anti-CD19 humano-FITC de raton y anti-CD14 humano-PE de raton se aplico para perfilar la expresion del marcador de linaje cruzado del tri-hnbrido de linaje cruzado resultante. La Figura 22a muestra un perfil de CD tfpico de dichas celulas tri-hnbridas de linaje cruzado. La expresion del marcador CD19 ligado a oncogen pareda ser constante en las celulas tri-hnbridas de linaje cruzado. Mientras que determinada proporcion de las celulas (23,5 %) expreso CD14 sobre su superficie, el 72,7 % restante fue negativo para la expresion en superficie de CD14.

4.6. Produccion de tri-hibridos de linaje cruzado usando celulas de mamiferos no humanos

[0258] El siguiente ejemplo indica que pueden crearse tri-hibridos de linajes cruzado usando celulas de mairnferos distintas de celulas humanas, espedficamente celulas de raton. Se entiende que puede aplicarse el mismo principio para generar tri-hibridos de linaje cruzado a partir de otras celulas de mamfferos.

4.6.1. Produccion de tri-hibridos de linaje cruzado a partir de una celula linfoide de raton inmortal, una celula linfoide de raton primaria y un monocito de raton primario.

[0259] Esta seccion describe la creacion de una estirpe celular tri-hnbrida de linaje cruzado a partir de una celula linfoide B de raton inmortal (Sp2), un linfocito T de raton primario y un monocito de raton primario. La estirpe trihnbrida de linaje cruzado se marco como STmMm seguido de un numero de serie.

4.6.1.1. Preparacion de celulas para la produccion de tri-hibridos de linaje cruzado de STmMm

[0260] La preparacion de celulas Sp2 utilizada en la creacion de tri-hibridos de linaje cruzado de STmMm se ha descrito anteriormente en la Seccion 1.1.4. Las celulas primarias de raton que incluyen monocitos CD11b+CD90' B220'CD49b'NK1.1'Ly6G'/baj° derivados de sangre periferica; linfocitos T auxiliares de raton (CD4+) derivados de bazo o sangre periferica; linfocitos T citotoxicos de raton (CD8+) derivadas de bazo o sangre periferica; y linfocitos T doble positivo (CD4+CD8+) derivados de bazo o sangre periferica se usaron en estos experimentos. El aislamiento de diversas celulas linfoides primarias de raton de bazo y sangre periferica se ha descrito anteriormente (Seccion 1.3.5).

4.6.1.2. Protocolo de hibridacion celular para la produccion de tri-hibridos de linaje cruzado de STmMm [0261] El protocolo de hibridacion celular para la produccion de tri-hibridos de linaje cruzado de STmMm fue similar al utilizado para la produccion de tri-hibridos de linaje cruzado de WTM (vease la Seccion 4.3.2), excepto porque el medio y los campos y pulsos electricos de CA variaron. Es decir, el medio de hibridacion utilizado en estos experimentos consistio en sorbitol 265 mM, KH2PO4 1,5 mM, CaCl2 0,4 mM y Mg(C2H3O2)2 0,3 mM (Sigma), complementado con BSA al 0,2 %. Se aplico un campo de CA de 0,5 MHz y 65-75 kV/m simultaneamente con un tren de tres pulsos cuadrados en un intervalo de 3 segundos, cada uno con un ancho de pulso de 70 ms y una potencia de 250-280 kV/m. Los protocolos para la recuperació yn el establecimiento de una estirpe estable de esta celula tri-hnbrida de linaje cruzado recien formada se describieron en la Seccion 4.1.2.

4.6.I.3. Confirmacion del estado de tri-hibridos de linaje cruzado de STmMm

[0262] Se establecio una estirpe celular STmMm derivada de la hibridacion celular de una celula Sp2, un linfocito T de raton primario y un monocito de raton. Despues de que la estirpe celular tri-hnbrida de linaje cruzado se hubiera cultivado en condiciones normales (vease la Seccion 1.1) durante 6 meses, se analizo la poblacion de celulas trihnbridas de linaje cruzado para determinar la expresion de marcadores CD espedficos de linaje. El analisis por FACS tricolor se utilizo para verificar la coexpresion de CD138 que se origina a partir de celulas Sp2, CD11b que se origina a partir de monocitos de raton primarios y CD4 que se origina a partir de linfocitos T primarios de raton cuando estos linfocitos T primarios se usaron para la hibridacion.

[0263] En resumen, se suspendieron 100 pl de las celulas tri-hnbridas de linaje cruzado de STmMm a una concentracion de 1x106 celulas/ml en PBS que contema BSA al 5% en 100 pl de PBS y se incubaron durante 30 min a 4 °C con anticuerpos monoclonales de rata marcados contra CD138-PE, CD11b-FITC y CD4-PerCP de raton (BD Pharmingen) o el control de isotipo adecuado. Despues de un lavado exhaustivo con PBS, las celulas marcadas se analizaron usando un citometro de flujo FACSCalibur y un software CellQuest Pro.

[0264] En la Figura 47 se muestran perfiles de FACS de celulas tri-hnbridas de linaje cruzado de STmMm. Aunque los niveles de la expresion de CD138, el marcador que deriva de celulas inmortales de linaje B parece ser uniforme entre la poblacion de celulas tri-hnbridas de linaje cruzado, las expresiones de los marcadores que se originan a partir de celulas primarias paredan variar. En este ejemplo particular, hubo un porcentaje relativamente pequeno de celulas que no coexpresaron CD4 ni CD11b con CD138 (vease la Figura 47a y b). Cuando se analizaron celulas STmMm para determinar la coexpresion de CD4 y CD11b (vease la Figura 47c), aproximadamente el 82 % de las celulas lo hicieron. Efectivamente, el 82 % de la poblacion celular expreso los tres marcadores CD, siendo solo el 5 % de las celulas positivas para CD138 sin coexpresar CD4 ni CD11b. Cada una de estas diversas poblaciones puede aislarse posteriormente mediante tecnicas convencionales tales como FACS, MACS o clonacion de una celula individual, etc. y puede expandirse en cultivos tri-hnbridos de linaje cruzado separados que procesan caractensticas fenotfpicas diferentes entre sf manteniendo al mismo tiempo la homogeneidad en el cultivo.

[0265] Cuando se usaron linfocitos positivos para CD8 citotoxicos en la creacion de tri-hnbridos de STmMm, se usaron anticuerpos anti-CD8 de raton-PerCp de rata en lugar de anti-CD4-PerCp para la coexpresion de CD en celulas tri-hnbridas resultantes. Como se observa en la Figura 48, del 97 al 100 % de las celulas tri-hnbridas fueron positivas para CD138 (Figura 48a y b), mientras que el 56 % o el 57 % de estas celulas coexpresaron CD8 (Figura 48b) o CD11b (Figura 48a). Al menos el 40% de la poblacion de tri-hnbridos expreso los tres marcadores CD138, CD8 y CD11b (Figura 48c).

[0266] En el caso de linfocitos T CD4+CD8+ doble positivo, el primer analisis se realizo de la misma manera que para los linfocitos T citotoxicos. La Figura 49 muestra el perfil de FACS de expresion de CD138, CD11b y CD8 en el tri-hnbrido resultante. El 98-100 % de las celulas tri-hnbridas fueron positivas para CD138, siendo el 57-60 % de la poblacion total positiva para los tres marcadores de linaje (Figura 49c). La coexpresion de CD138 y CD8 se detecto en el 93 % de las celulas (Figura 49b). En la segunda etapa, las celulas tri-hnbridas se comprobaron para la coexpresion de CD8 y CD4. Las celulas se marcaron con anticuerpos anti-CD8 de raton-PE de rata y anti-CD4 de raton-FITC de rata (Bd Pharmingen). La Figura 50 muestra el perfil de FACS de la expresion de CD8 y CD4. Mientras que el 95 % de las celulas tri-hnbridas expresaron CD8 sobre la superficie, solo el 50 % de las celulas expresaron conjuntamente CD4 al mismo tiempo. En particular, practicamente toda la poblacion positiva para CD4 tambien fue positiva para CD8.

4.6.2. Produccion de tri-hibridos de linaje cruzado a partir de dos celulas linfoides de raton inmortales y un monocito primario de raton

[0267] Este ejemplo detalla la creacion de una estirpe celular de tri-hnbridos de linaje cruzado a partir de dos celulas linfoides B de raton inmortales (Sp2) y un monocito primario de raton. La estirpe tri-hnbrida de linaje cruzado se marco como SSMm seguido de un numero de serie.

4.6.2.I. Preparacion de celulas para la produccion de tri-hibridos de linaje cruzado de SSMm

[0268] La preparacion de celulas Sp2 utilizadas en la creacion de tri-hnbridos de linaje cruzado de SSMm se ha descrito anteriormente en la Seccion 1.1.4. Los monocitos CD11b+CD90'B220'CD49b'NK1.1'Ly6G'/baj° de raton primarios derivados de sangre periferica se usaron en estos experimentos. El aislamiento de los monocitos primarios de raton a partir de sangre periferica se ha descrito anteriormente (Seccion 1.3.5).

4.6.2.2. Protocolo de hibridacion celular para la produccion de tri-hibridos de linaje cruzado de SSMm [0269] El protocolo de hibridacion celular para la produccion de tri-hnbridos de linaje cruzado de SSMm fue el mismo que el utilizado para la produccion de tri-hnbridos de linaje cruzado de STmMm (vease la Seccion 4.6.1.2).

4.6.2.3. Confirmacion del estado del tri-hforido de linaje cruzado de SSMm

[0270] Despues de que una estirpe celular de tri-hnbrido de linaje cruzado de SSMm se hubiera mantenido estable en condiciones normales de cultivo (vease la Seccion 1.1) durante 6 meses, la poblacion de celulas tri-hnbridas de linaje cruzado se analizo para la expresion de marcadores CD espedficos de linaje.

[0271] Se aplico doble tincion o marcaje con anticuerpos anti-CD138 de raton-PE de rata y anti-CD11b de raton-FITC de rata (BD Pharmingen) para perfilar la expresion del marcador de linaje cruzado del tri-hnbrido de linaje cruzado resultante. La Figura 51 muestra un perfil de CD tfpico de dichas celulas tri-hnbridas de linaje cruzado. La expresion del marcador CD138 unido a oncogen parece ser constante en las celulas tri-hnbridas de linaje cruzado siendo solamente el 7 % de las celulas negativas para CD138. Una proporcion grande de las celulas (70 %) tambien expreso CD11b sobre su superficie, mientras que el 23 % restante de celulas positivas para CD138 fueron negativas para la expresion en superficie de CD11b.

4.7. Produccion de tri-hibridos quimericos de linaje cruzado usando celulas de maimferos humanos y no humanos

[0272] Este ejemplo detalla la creacion de tri-hnbridos quimericos de linaje cruzado que usan celulas de mairnferos humanos y no humanos, espedficamente ratones. Se entiende que puede aplicarse el mismo principio para generar tri-hibridos de linaje cruzado a partir de otras celulas de mamfferos.

4.7.1. Produccion de tri-hibridos quimericos de linaje cruzado a partir de una celula linfoide de raton inmortal, una celula linfoide humana inmortal y un monocito primario ya sea humano o de raton

[0273] Creacion de una estirpe celular de tri-hibridos quimericos de linaje cruzado a partir de una celula linfoide B de raton inmortal (Sp2), una celula linfoide B humana inmortal (WIL2NS) y un monocito primario ya sea de raton o humano. La estirpe tri-hnbrida de linaje cruzado se marco como SWMm donde se uso monocito de raton y SWMh donde se uso monocito humano. En cada caso, al nombre abreviado del tri-hnbrido le siguio un numero de serie.

4.7.1.1. Preparacion de celulas para la produccion de tri-hibridos quimericos de linaje cruzado de SWMm y SWMh

[0274] La preparacion de celulas Sp2 y WIL2NS utilizadas en la creacion de tri-hibridos quimericos de linaje cruzado de SWMm y SWMh se ha descrito anteriormente en la Seccion 1.1.4 y la Seccion 1.1.3. respectivamente. Los monocitos CD11b+CD90'B220'CD49b'NK1.1'Ly6G'/baj° de raton primarios derivados de sangre periferica se usaron en estos experimentos. El aislamiento de monocitos primarios de raton a partir de sangre periferica se ha descrito anteriormente (Seccion 1.3.5). Se aislaron monocitos humanos a partir de linfocitos mixtos procedentes de bazo, sangre periferica o sangre de cordon umbilical. El aislamiento de monocitos se baso en la expresion del marcador CD14 y, en algunos casos, niveles bajos de expresion de CD16, ya sea FACS o perlas magneticas, como se ha descrito anteriormente en la Seccion 1.3.3.1.1. Parece que no hubo diferencias en los parametros de hibridacion o en los tri-hnbridos de linaje cruzado resultantes cuando se usaron monocitos de diferentes tejidos linfoides.

4.7.1.2. Protocolo de hibridacion celular para producciones de tri-hibridos quimericos de linaje cruzado de SWMm y SWMh

[0275] El protocolo de hibridacion celular para la produccion de tri-hibridos de linaje cruzado de SWMm y SWMh fue el mismo que el utilizado para la produccion de tri-hibridos de linaje cruzado de STMMm (vease la Seccion 4.6.

1.2).

4.7.1.3. Confirmacion del estado de tri-hibridos quimericos de linaje cruzado de SWMm y SWMh

[0276] Despues de que las estirpes celulares de tri-hibridos quimericos de linaje cruzado de SWMm y SWMh hubieran permanecido estables en condiciones normales de cultivo (vease la Seccion 1.1) durante 6 meses, las poblaciones celulares de tri-hnbridos quimericos de linaje cruzado se analizaron para determinar la expresion de marcadores CD espedficos de linaje.

[0277] Se realizo una doble tincion para la expresion de CD71 humano y TfR de raton para establecer el quimerismo de los tri-hnbridos resultantes. La Figura 52 muestra perfiles de FACS tfpicos de dicho analisis siendo el 100 % de las celulas positivas para los receptores de transferrina tanto humanos como de raton. Esto indica la dependencia de los tri-tnbridos de los controles de division celular del raton y del ser humano.

[0278] Dependiendo de la fuente de raton o humana de monocitos primarios, se aplicaron doble tincion o marcaje con anticuerpos anti-CD138 de raton-PE de rata y anticuerpos anti-CD11b de raton-FlTC de rata (BD Pharmingen) o anticuerpos anti-CD138 de raton-PE de rata y anticuerpos anti-CD14 humano-FITC de raton (BD Pharmingen), para perfilar la expresion del marcador de linaje cruzado de los tri-tnbridos quimericos de linaje cruzado resultantes. La Figura 53 muestra perfiles de CD tfpicos de dichas celulas tri-hnbridas quimericas de linaje cruzado. La expresion de marcador CD138 unido a oncogen derivado de la estirpe celular Sp2 de raton pareda depender de la fuente de monocitos humana o de raton. El porcentaje de celulas positivas para CD138 de raton disminuyo del 84 % en trihnbridos de SWMm al 29 % en los tri-hnbridos de SWMh. Sin embargo, el 96 % de las celulas tri-hnbridas quimericas de SWMh fueron positivas para CD19 humano derivado de WIL2NS (vease la Figura 54), mientras que ninguna de las celulas en el CD19 humano expresado en tri-hnbridos quimericos de SWMm.

Ejemplo 5

5. Enriquecimiento de tri-hforidos de linaje cruzado para celulas con fenotipos de linaje cruzado espedficos basados en la distribucion de marcadores CD

[0279] La siguiente Seccion proporciona un ejemplo del establecimiento de subestirpes de estirpes celulares triidbridas de linaje cruzado basadas en diferentes caractensticas fenotfpicas. El enfoque se baso en el analisis de marcadores de superficie celular espedficos de linaje, la expresion intracelular de marcadores espedficos de linaje, la presencia de transcritos de ARN de marcadores espedficos de linaje, el cariotipado y la secrecion de protemas espedficas de linaje. Se aislaron celulas tri-hnbridas de linaje cruzado con las caractensticas deseadas a partir de la poblacion general mediante FACS. El siguiente ejemplo se basa en un tri-hnbrido de linaje cruzado de WWM que tema dos poblaciones tri-hnbridas basadas en la expresion de CD14: positiva y negativa. Sin embargo, el ejemplo no se limita de ninguna manera a un tn-hnbrido de linaje cruzado o un marcador particular elegido.

[0280] Las celulas tri-hnbridas de linaje cruzado de WWM se clasificaron en fracciones positivas para CD14 y negativas para CD14 y cada una de las fracciones se expandio y se mantuvo en el cultivo por separado durante 3 meses. La Figura 22b muestra que mas del 95 % de las celulas tri-hnbridas de linaje cruzado conservaron la expresion de CD14, mientras que la poblacion de celulas de la Figura 22c continuo siendo negativa para CD14. Esto demuestra que es posible aislar y establecer diferentes poblaciones de celulas homogeneas derivadas de la misma estirpe tri-hnbrida de linaje cruzado.

Confirmacion del tri-hnbrido de linaje cruzado a traves de RT-PCR

[0281] Con el fin de verificar la naturaleza del tri-hnbrida de linaje cruzado de las sub-estirpes creadas, las celulas tri-hnbridas originales de linaje cruzado, el subcultivo enriquecido con CD19+CD14+ y el subcultivo negativo para CD14 se sometieron a ensayos de RT-PCR para CD14. Se usaron monocitos CD14+ humanos como control positivo. Las celulas de control se aislaron de la sangre periferica usando FACS como se ha descrito anteriormente (Seccion 1.3.3).

[0282] En resumen, se preparo ARN total a partir de celulas cultivadas usando el kit RNeasy (RNeasy Mini kit, Qiagen). La smtesis de ADNc se realizo con el kit de ADNc (Amersham Pharmacia) de acuerdo con el protocolo del fabricante y la PCR se realizo esencialmente como se describe en Sewing et al. La mezcla de reaccion de PCR se analizo mediante electroforesis en gel de agarosa (2 %) y se visualizo mediante tincion con bromuro de etidio. Los pares de cebadores oligonucleotfdicos teman las secuencias 5'-cebador 5'-CACACTCGCCTGCCTTTTCC-3' (SEQ ID NO: 1) y 3'-cebador 5' GATTCCCGTCCAGTGTCAGG-3' (SEQ ID NO: 2) para amplificar un producto de PCR de 450 pb.

[0283] Como se muestra en la Figura 23, la RT-PCR revelo la presencia de transcritos de ARNm CD14 tanto en el cultivo original de WWM que contema celulas como en el subcultivo enriquecido con CD14+ del cultivo original de WWM. Tambien se detecto ARNm de CD14 en el subcultivo de WWM que careda de CD14 de superficie a un nivel comparable al de los monocitos CD14+ humanos.

Ejemplo 6

6. Cariotipado

[0284] Se realizo un cariotipado de tri-hnbridos de linaje cruzado para establecer las caractensticas citogenicas de los tri-hnbridos de linaje cruzado, asf como para confirmar sus ongenes hnbridos.

6.1. Cariotipado de estirpes celulares originales

[0285] Como ejemplo, las celulas de las estirpes celulares K562 y WIL2NS se cariotiparon para pases tempranos y posteriores para registrar cualquier inestabilidad cromosomica de las estirpes celulares originales. Se descubrio que, para una estirpe celular dada, por ejemplo, la estirpe K562, el cariotipo de una estirpe recien descongelada era identico al de una estirpe celular que se mantuvo en condiciones de cultivo normales durante algunos meses.

[0286] Las Figuras 24 y 25 representan un cariotipo tipico de celulas K562 y WIL2NS, respectivamente. En ambos casos, se examino un total de 20 celulas en metafase con bandas G a 400 bph.

[0287] Los resultados del cariotipo demostraron que la estirpe celular K562 contema un unico clon con una caractenstica triploide, es decir, que tema un numero modal de 69 cromosomas con diversas anomalfas cromosomicas. Por el contrario, la estirpe celular WIL2NS contema cinco clones diploides con un numero de cromosomas de 47 a 48 con anomalfas cromosomicas claramente diferentes en comparacion con las celulas K562. La representacion de clones en la estirpe celular WIL2NS es la siguiente:

El CLON 1 constituye el 10 %

El CLON 2 constituye el 55 %

El CLON 3 constituye el 10 %

El CLON 4 constituye el 20 %

El CLON 5 constituye el 5 %

La Tabla 2 (a continuation) resume los cariotipos complejos de estirpes celulares K562 y WIL2NS. No hay anomallas compartidas entre dos estirpes celulares. Las anomallas cromosomicas presentes en todos los clones de las estirpes celulares WIL2NS se resaltan en azul

6.2. Cariotipado de tri-hibridos de linaje cruzado utilizados para la expresion de protemas

[0288] Los tri-hibridos de linaje cruzado derivados de diversas combinaciones de celulas inmortales y primarias de tres linajes diferentes y utilizados adicionalmente para la expresion de protelnas deseadas se cariotiparon. Estos cariotipos tambien se compararon con los de las estirpes celulares inmortales originales, que se usaron en la creation de los tri-hibridos de linaje cruzado.

6.2.1. Cariotipado de estirpes tri-hibridas de linaje cruzado de KBT

[0289] Se cariotiparon dos estirpes tri-hibridas de linaje cruzado de KBT derivadas de la estirpe celular mieloide inmortal K562 y los linfocitos primarios B y T. El tri-hlbrido de linaje cruzado de KBT derivado de celulas B activadas (CD20+CD72+) y linfocitos T doble positivo (CD4+CD8+) con diversos tipos celulares en funcion de sus caracterlsticas de expresion de CD (Section 4.2.3) tambien se cariotipo para la comparacion. Las Figuras 26 muestran un cariotipo tlpico de estirpes tri-hibridas de linaje cruzado de k Bt derivadas de la hibridacion K562 B(CD19+) T(CD4+), denominada estirpe KBT-1. Mostro que un clon de una celula individual de KBT-1 era casi triploide, con un numero modal de 66 cromosomas.

[0290] Cuando una estirpe tri-hforida de linaje cruzado de KBT derivada de la hibridacion celular de celulas K562, celulas B (CD20+CD72+) y linfocitos T (CD4+CD8+), denominada estirpe KBT-2, se cariotipo, se descubrio que el cariotipado de la estirpe KBT-2 (la estirpe que habfa mostrado una variacion de expresiones de CD en la Seccion anterior) consistfa en cuatro clones que eran casi triploides. El Clon 1, el clon 2, el clon 3 y el clon 4 representaron el 45 %, el 30%, el 15% y el 10% de la poblacion celular, respectivamente. El clon 4 tema un numero modal de cromosomas de 66, mientras que los otros clones teman un numero modal de cromosomas de 67 cada uno. La Figura 27 muestra un cariotipado de uno de los clones de la estirpe KBT-2.

[0291] Los cariotipados de las estirpes KBT-1 y KBT-2 se resumen en la Tabla 3. La primera columna de la Tabla indico el numero de cromosomas. Algunos de los cambios cromosomicos, tales como del(3)(p14), der(4)t(4;?)(q25;?), der(7)t(7;mar3)(q10;q10)and der(X)t(X;?;?)(q13;?;?) son compartidos por todos los tri-hforidos de linaje cruzado independientemente del subtipo de celulas linfoides primarias, pero no se comparten con las celulas K562.

Tabla 3. Un sumario de un analisis comparativo de KBT-1 y KBT-2 derivadas de diferentes subtipos celulares linfoides primarios y de la estirpe celular mieloide K562 como fuente de oncogen. Las anomalfas cromosomicas de la estirpe K562 compartida con estirpes tri-hibridas de linaje cruzado de KBT-1 y KBT-2 se resaltan en azul. Las anomalfas cromosomicas compartidas entre los clones de las estirpes tri-tnbridas de linaje cruzado de KBT, pero no de la estirpe celular K562 original, se resaltan en rojo. Las anomalfas cromosomicas presentes en algunos de los trihibridos de linaje cruzado de KBT y derivadas de la estirpe K562 se resaltan en verde.

6.2.2. Cariotipado de estirpes tri-hibridas de linaje cruzado de KWT

[0292] Se cariotiparon estirpes tri-hibridas de linaje cruzado de KWT derivadas de la estirpe celular mieloide inmortal K562, la estirpe de celulas linfoides B inmortales WIL2NS y un linfocito T primario. Tambien se cariotipo un tri-tnbrido de linaje cruzado de KWT derivado de linfocitos T doble positivo (CD4+CD8+) (denominado KWT-3) con diversos tipos de celulas basandose en sus caractensticas de expresion de CD (Seccion 4.4.3) para su comparacion.

[0293] Las Figuras 28, 29 y 30 muestran cariotipos tipicos de estirpes tri-hforidas de linaje cruzado de KWT-1, KWT-2 y KWT-3, respectivamente. En cada caso, se analizaron un total de 20 celulas en metafase con bandas G a 400 bph. KWT-1 contema un unico clon que era casi hexaploide (6n = 138 cromosomas). El numero modal de cromosomas vario de 129 a 140 cromosomas con heterogeneidad cariotipica, es decir, todas las celulas analizadas compartieron algunas de las anomalfas cromosomicas. KWT-2 contema un unico clon que tambien era casi hexaploide. El numero modal de cromosomas vario de 135 a 145 cromosomas con heterogeneidad cariotipica. KWT-3 contema tres clones que eran hiperpentaploides (n > 115). El Clon 1 y los Clones 2 y 3 representan el 55 %, el 20 % y el 25 % de la poblacion celular, respectivamente. Los cariotipos de tri-hforidos de linaje cruzado de KWT confirmaron que las caractensticas geneticas de ambas estirpes celulares K562 y WIL2-NS se conservan en todos los tri-hfbridos de linaje cruzado de KWT, independientemente del tipo de linfocito T primario utilizado en su creacion. La Tabla 4 resume un analisis comparativo de cariotipos de estos tri-hforidos de linaje cruzado de KWT (es decir, estirpes KWT-1, KWT-2 y KWT-3).

Tabla 4. Un analisis comparativo de los tri-hibridos de linaje cruzado de KWT derivados de diferentes tipos de linfocitos T primarios. Los cambios cromosomicos en tri-hibridos de linaje cruzado de KWT compartidos con la estirpe celular K562 se resaltan en rojo. Los cambios cromosomicos compartidos entre los tri-hibridos de linaje cruzado de KWT y la estirpe celular WIL2NS se resaltan en azul. Los cambios que se comparten entre diferentes subtipos de los tri-hibridos de linaje cruzado, pero no con la estirpe celular K562 ni con la estirpe celular WIL2NS se resaltan en verde.

6.2.3. Cariotipado de estirpes tri-hforidas de linaje cruzado de WWM

[0294] Se cariotiparon una estirpe tri-hforida de linaje cruzado de WWM derivada de dos celulas linfoides B inmortales (2 estirpes WIL2NS) y monocitos primarios (CD14+). La subestirpe de este tri-hibrido de linaje cruzado enriquecida para celulas CD14+ tambien se cariotipo. Las Figuras 31A y 31B muestran cariotipos del tri-hibrido de linaje cruzado de WWM original y su subestirpe enriquecida con CD14+, respectivamente. En cada caso, se analizaron cromosomas en metafase con bandas G de un total de 20 celulas a 400 bph. El tri-hfbrido de linaje cruzado de WWM original contema un unico clon dominante que tema un numero modal de 47 cromosomas se encontro en 11 celulas (55%). Sin embargo, las 9 celulas restantes analizadas vanan desde casi triploides (con perdida aleatoria de cromosomas) hasta casi tetraploides (con perdida aleatoria de cromosomas). No hubo uniformidad entre ninguna de estas celulas. Por otro lado, el cariotipo del tn-hforido de linaje cruzado de WWM enriquecido con CD14+ indico una unica anomalfa clonal detectada en 19 celulas. Solo se detecto una celula tetraploide.

La Tabla 5 resume el analisis comparativo de los cariotipados de las estirpes tri-dbridas de linaje cruzado de WWM.

Las caracteristicas cromosomicas compartidas con las celulas WIL2-NS se resaltan en azul.

Ejemplo7

7. Deteccion del genoma del VEB por PCR

[0295] Para ensayos de PCR y para una estirpe celular de tri-dbridos de linaje cruzado dada, el ADN genomico se extrajo de 5x106 celulas del tri-dbrido de linaje cruzado. Se usaron celulas MOLT-4 como control negativo, mientras que se uso CO 88BV59-1 como control positivo usando un kit QIAamp DNA Micro kit (Qiagen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En el ensayo de PCR cualitativa, la region BamHI W del genoma del VEB se amplifico con cebadores espedficos. Las secuencias de cebadores corriente abajo y corriente arriba fueron 5’-CAAGAACCCAGACGAGTCCGTAGAA-3' (SEQ ID NO: 3) y 5-AAGAAGCATGTATACTAAGCCTCCC-31, (SEQ ID NO: 4) respectivamente (Kimura, et al., 1999). Se anadieron 10 ng del ADN extraido a la mezcla de reaccion que conteda Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), MgCl21,5 mM, KCl 50mM, dNTP 200 pM, 0,6 pM de cada cebador y 0,5 U de polimerasa Taq (Lomb Life Science). Despues de la desnaturalizacion inicial durante 2 minutos a 95 °C, se realizaron 28 ciclos de 15 segundos a 95 °C y 1 minuto a 60 °C usando el sistema GeneAmp PCR system 9600 (Perkin Elmer). Las muestras amplificadas se separaron en un gel de agarosa al 2 %.

[0296] Los resultados de los ensayos anteriores indicaron que se descubrio que todos los tri-dbridos de linaje cruzado establecidos en la presente invencion son negativos para el genoma del VEB.

Ejemplo 8

8. Ensayo de Mycoplasma

[0297] Se realizaron ensayos de Mycoplasma en cualquiera de las estirpes celulares utilizadas y en las estirpes de tri-dbridos de linaje cruzado creadas en la presente invencion usando un kit de deteccion por PCR de micoplasma (Lomb Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los resultados del ensayo indicaron que se descubrio que todas las estirpes celulares y los tri-dbridos de linaje cruzado caredan de micoplasma.

Ejemplo 9

9. Expresion de protemas en un sistema de expresion de tri-hibridos de linaje cruzado y su caracterizacion [0298] El sistema de celulas de linaje cruzado de tri-hnbridos incorporado en la presente invencion puede usarse para la preparacion de una gama de productos biologicos, incluyendo, pero no limitada a, moleculas biologicas tales como proteinas, peptidos, hidratos de carbono, lfpidos y moleculas quimericas de los mismos. Espedficamente, las moleculas biologicas pueden incluir citocinas, hormonas de factores de crecimiento, receptores o moleculas quimericas o fragmentos de los mismos. El experto en la materia comprendera que una molecula biologica deseada, tal como una protema expresada a partir de la celula de linaje cruzado de tri-hnbrido puede secretarse, unirse a membrana o ambas cosas. El experto en la materia comprendera adicionalmente que diversas subunidades de proteinas puedan coexpresarse en celulas tri-hnbridas de linaje cruzado, por ejemplo, expresion de inmunoglobulina y mas espedficamente produccion de anticuerpos monoclonales. El experto en la materia comprendera adicionalmente que la celula de linaje cruzado tri-hnbrida tambien puede usarse para expresar una gama de proteinas o fragmentos de peptidos funcionales, por ejemplo, en el caso de inmunoglobulinas, fragmentos tales como fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, incluyendo los fragmentos Fv monocatenarios.

[0299] La expresion de la protema deseada puede conseguirse en el sistema de celulas tri-tnbridas mediante hibridacion de celulas somaticas de la celula tri-dbrida con una celula companera que expresa la protema deseada (Seccion 9.1). Como alternativa, las celulas tri-hnbridas pueden someterse a protocolos de transfeccion genica convencionales para facilitar la expresion de una protema deseada (Seccion 9.2.1 y 9.2.2). En una realizacion adicional, las celulas tri-hnbridas pueden expresar multiples protemas diana simultaneamente mediante el uso de hibridacion de celulas somaticas o transfeccion de genes convencional o ambas cosas (Seccion 9.3).

[0300] Los siguientes ejemplos ilustran la expresion de una serie de tipos diferentes de protemas, en celulas trihnbridas de linaje cruzado. Los ejemplos tambien demuestran que las protemas, espedficas de un tipo celular diferenciado particular, pueden expresarse en las mismas celulas tri-hnbridas de linaje cruzado (por ejemplo, inmunoglobulina y CD54).

9.1. Hibridacion de la celula de linaje cruzado tri-dbrida con una celula que expresa una protema deseada 9.1.1. Expresion de GM-CSF humano

[0301] La estirpe tri-hnbrida de linaje cruzado de WWM enriquecida para celulas positivas para CD14 (descrita en la Seccion 5) se uso como estirpe celular companera en este ejemplo particular. Se usaron linfocitos positivos para CD4 humanos activados aislados como se ha descrito en la Seccion 1.3.3.1.1. como fuente de GM-CSF humano. El procedimiento de hibridacion de celulas electricas fue esencialmente el mismo que el utilizado para la creacion de trihnbridos de linaje cruzado de WWM como se ha descrito en la Seccion 4.3.2. Despues de que el hnbrido resultante de linfocitos T cultivados WWM y CD4+ se volviera estable, se mantuvo como una estirpe celular y se marco como ProGM.

Resultados de la expresion de GM-CSF humano

[0302] Se sometieron a ensayo sobrenadantes de ProGM para determinar el GM-CSF humano mediante ELISA de tipo sandwich. Se recubrio una placa ELISA de 96 pocillos (Corning) con 50 pl de anticuerpo policlonal de conejo purificado anti-GM-CSF a 10 pg/ml a 4 °C durante la noche. Despues de la retirada de la solucion de anticuerpo, los sitios de union de protemas residuales en las placas se bloquearon con 100 pl de PBS que contema BSA al 5 % (BSA al 5 %-PBS). Despues se anadieron 50 pl de un sobrenadante de cultivo de la estirpe celular hnbrida ProGM a los pocillos y se incubaron durante 2 horas a 37 °C. Despues de lavar con PBS que contema un 0,05 % de Tween 20 (Tween-PBS) tres veces, se incubaron con 50 pl de anticuerpo de conejo anti-GM-CSF a 10 pg/ml a temperatura ambiente durante 1 hora. Despues de lavar 3 veces con Tween-PBS, se incubaron con una inmunoglobulina anticonejo conjugada con peroxidasa diluida 200 veces durante 2 horas a temperatura ambiente. Despues de aclarar tres veces con Tween-PBS, la reaccion final se visualizo mediante incubacion con ABTS y peróxido de hidrógeno al 0,01 %. Se midio la absorbancia a 415 nm. Se uso GM-CSF humano recombinante como patron. Todos los analisis se realizaron por duplicado para una muestra dada. Los resultados mostraron que ProGM produjo GM-CSF humano en el intervalo de 0,7 a 1,1 pg/ml/106 celulas en condiciones de cultivo no optimizadas.

[0303] La caracterizacion de hGM-CSF derivado de ProGM hnbrido mediante transferencia Western e inmunoprecipitacion confirmo que el hnbrido ProGM produjo GM-CSF completamente humano que presentaba formas de glucoprotemas identicas a las glucoformas secretadas de forma natural por los linfocitos humanos. Los sobrenadantes recogidos de ProGM hnbrido se diluyeron 100 veces antes del analisis. Se usaron membranas de inmunotransferencia NC para analisis por transferencia Western (Millipore) y anticuerpo biotinilado anti-GM-CSF humano de rata (R&D systems) a una concentracion de 0,1 pg/ml para la deteccion por transferencia Western. En la Figura 32, la transferencia Western de hGM-CSF secretado por el hnbrido ProGM (carril 4) mostro la misma heterogeneidad de sus formas que el GM-CSF secretado por el cultivo de linfocitos humanos activados por PHA (carril 2). La distribucion de pesos moleculares de GM-CSF expresada tanto en ProGM como en cultivos de linfocitos vario entre 18 kDa y 35 kDa. En presencia de tunicamicina, que inhibe la adicion de cadenas de hidratos de carbono a los restos de asparagina, las moleculas de mayor peso molecular (es decir, 35 kDa) no se detectaron, lo que indica que la heterogeneidad observada se debe a un grado diferente de glucosilacion (carril 5). Los pesos moleculares de las formas de GM-CSF producidas por los linfocitos activados por PHA o en el sistema de expresion hforido ProGM fueron mayores que el del GM-CSF derivado de E. coli (carril 6).

[0304] Los sobrenadantes del hforido ProGM cultivado con o sin complementacion con 10 pg/ml de tunicamicina se recogieron y se incubaron durante la noche a 40 °C con anticuerpo anti-GM-CSF humano de rata o anticuerpo anti-GM-CSF de raton de conejo contra GM-CSF humano o de raton derivado de E. coli, respectivamente. Se anadio protema A-Sepharose (Invitrogen) y se incubo adicionalmente durante 3 horas a temperatura ambiente. La resina recuperada se lavo minuciosamente con NaCl 0,15M, NP-40 al 0,5 %, Tris-HCl 10 mM, pH 8,0. Las protemas unidas se solubilizaron con tampon de muestra Laemmli y se sometieron a SDS-PAGE. Como se muestra en la Figura 33, el peso molecular del GM-CSF secretado por el hforido ProGM vana de 18 kDa a 35 kDa, que es similar a las formas de origen natural. Esta heterogeneidad se debe a la diferente glucosilacion en dos sitios de N-glucosilacion y varios sitios de O-glucosilacion. En presencia de tunicamicina, las bandas de mayor peso molecular no se detectaron mientras que las protemas de menor peso molecular de 18-22 kDa se acumularon. Estos datos confirman que el hGM-CSF derivado de ProGM hforido se secreta como glucoprotema humana.

9.1.2. Expresion de inmunoglobulinas humanas

[0305] La estirpe tri-hforida de linaje cruzado de KWT derivada de linfocitos T con experiencia antigenica (CD3+CD5+) (denominada KWT-2) con marcadores fenotfpicos se determino por FA sCegSún (vease la Seccion 4.4.3 para mas detalles) y cariotipada como se ha descrito en la Seccion 6.2.2, se uso para la expresion de inmunoglobulina humana a traves de hibridacion celular electrica. Espedficamente, el tri-hfbrido de linaje cruzado de KWT se uso como estirpe celular companera en este ejemplo particular. Se usaron CD40 primarios activados con celulas B positivas para IgM o positivas para IgG aisladas como se ha descrito en la Seccion 1.3.3 como fuente de Ig humana. El procedimiento de hibridacion electrica de celulas fue esencialmente el mismo que el que se uso para la creacion de estirpes tri-hforidas de linaje cruzado de KWT como se ha descrito en la Seccion 4.4.2. Una vez que los hfbridos resultantes se estabilizaron, se mantuvieron y se marcaron como estirpes celulares ProlM o ProlG (vease la Seccion 1.1).

Resultados de la expresion de inmunoglobulinas humanas

[0306] Los sobrenadantes de ProlM y ProlG se analizaron para determinar la presencia de IgM o IgG mediante un ELISA descrito anteriormente (vease la Seccion 1.3.3). Las celulas se sembraron en placas de 96 pocillos de fondo redondo a 1x105 celulas por pocillo y se cultivaron en condiciones convencionales durante 24 horas. El recuento de celulas y la viabilidad se realizaron usando un hemocitometro y la exclusion con azul tripano. Los resultados se resumen en las Tablas 6A y 6B. Cada valor se proporciona como media ± DT de tres mediciones independientes.

T l A. r imi n l l r r i n I M l l Pr lM

T l B. r imi n l l r r i n I l l Pr l

[0307] Se detectaron subclases de IgG y subtipos de cadenas ligeras usando la anti-IgG 1 (clon HP6069), IgG2 (clon HP6002), IgG3 humana de raton biotinilada (clon HP6047), IgG4 humana de raton biotinilada (clon ^hP6025) (ICN Biomedicals) y el anticuerpo anti-cadena kappa y lambda humana de cabra biotinilada (Biosource). El anticuerpo biotinilado unido se detecto con estreptavidina conjugada con ALP.

[0308] Los resultados mostraron que tanto la IgM como la IgG producidas por las celulas ProIM y ProIG, respectivamente, teman una cadena ^kligera y la IgG de clase IgG2.

9.1.3. Expresion de CD54 humano

Metodologia para la expresion de CD54 humano

[0309] El tri-fnbrido de linaje cruzado de KWT derivado de un linfocito T auxiliar maduro (CD4+) (denominado KWT-1) con marcadores fenotfpicos se d seetgeúrmnino por FACS (vease la Seccion 4.4.3 para mas detalles) y cariotipado como se ha descrito en la Seccion 6.2.2 se uso adicionalmente para la expresion de CD54 humano a traves de la hibridacion celular electrica. Espedficamente, el tri-fnbrido de linaje cruzado de KWT se uso como una estirpe celular companera en este ejemplo particular. Se usaron linfocitos T positivos para CD54 humano primarios aislados como se ha descrito en la Seccion 1.3.3 como fuente de la molecula de CD54 humano. El procedimiento de hibridacion fue esencialmente el mismo que el utilizado para la creacion de estirpes tri-hnbridas de linaje cruzado de KWT (vease la Seccion 4.4.2). Una vez que el hnbrido resultante se volvio estable, se mantuvo como una estirpe celular en condiciones de cultivo convencionales (vease la Seccion 1.1) y se marco como ProCD54.

Resultados de la expresion de hCD54

[0310] La expresion de CD54 sobre la superficie de celulas ProCD54 se verifico mediante un analisis por FACS. Como el 100 % de las celulas tri-hnbridas de linaje cruzado de KWT originales expresaban CD4 sobre su superficie (vease la Figura 19), la expresion de CD4 sobre la superficie de la celula ProCD54 se uso como referencia para la estabilidad de la estirpe celular resultante. En resumen, se marcaron 1x105 celulas por almuotas de 100 pl con anticuerpos anti-CD54 humano-FITC de raton y anti-CD4 humano-PE de raton siguiendo el mismo protocolo que se ha descrito en la Seccion 1.3.3.1 (aislamiento de linfocitos T CD54+). El perfil tfpico de la expresion de CD4 y CD54 sobre la superficie de las celulas ProCD54 se muestra en la Figura 34a. Aproximadamente el 72 % de las celulas ProCD54 originales fueron positivas para CD54, mientras que el 100 % de las celulas conservaron su expresion de CD4, incluso aunque los niveles de la expresion de CD4 paredan ser algo mas bajos que los de las celulas trihnbridas de linaje cruzado de KWT. Despues de configurar las ventanas apropiadas, la poblacion de celulas CD4+CD54+ con niveles medios a altos de expresion de CD54 (aproximadamente el 42 % de la poblacion celular total) se selecciono y se clasifico (Figura 34a). Las celulas clasificadas se resuspendieron en medio de cultivo convencional y se mantuvieron en el cultivo durante unos pocos meses. La sub-estirpe resultante se etiqueto como ProCD54EX. Despues se analizo la subestirpe para determinar su expresion de CD4 y CD54 empleando el mismo protocolo que se ha descrito anteriormente en la presente seccion. El perfil tfpico de expresion de CD4 y CD54 sobre la superficie de ProCD54EX se muestra en la Figura 34b. Como puede observarse a partir de la figura, al menos el 98 % de las celulas mantuvieron la expresion de CD4 y CD54 despues de 6 meses de cultivo en condiciones convencionales. Aun mas, la expresion de CD54 se volvio homogenea a niveles medios.

[0311] El ProCD54 y el ProCD54EX tambien se analizaron para determinar la presencia de un CD54 soluble en los sobrenadantes de cultivo tisular mediante el uso de ELISA de CD54 (ICAM-1) humano (sistemas de R&D) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los sobrenadantes se recogieron el dfa 7 en cultivo al menos 3 veces. Se usaron los sobrenadantes de la estirpe celular companera tri-hnbrida de linaje cruzado de KWT como control negativo. Todas las mediciones se realizaron con la misma muestra por duplicado. En resumen, las placas de microtitulacion se recubrieron con un anticuerpo monoclonal murino dirigido contra la ICAM-1 soluble humana. Despues de la incubacion con control, las muestras o los patrones en una dilucion apropiada, se anadio un anticuerpo policlonal conjugado con peroxidasa de rabano picante (HRP) contra ICAM-1 soluble humana. Despues de la adicion del sustrato y la solucion de parada, la densidad optica de cada pocillo se determino en 30 minutos, usando un lector de microplacas configurado a 450 nm. Los resultados se resumen en la Tabla 7.

Tabla 7. Un intervalo de concentraciones de CD54 soluble (ICAM-1) en la estirpe celular companera trihibrida lin r z KWT ir l l r Pr D 4 Pr D 4EX

[0312] El peso molecular del desprendimiento de CD54 soluble de ProCD54 y ProCD54EX se determino mediante electroforesis en gel y analisis de transferencia Western. En resumen, la concentracion de protema en los sobrenadantes se determino mediante un ensayo de protemas (R&D systems) y se ajusto a 1,8mg/ml. La electroforesis se realizo mediante SDS-PAGE. Se cargo un total de 30 ml de la muestra en el gel en un tampon de muestra no reductor. Despues de la electroforesis, las protemas se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (Bio-Rad). La membrana secante se bloqueo con leche en polvo sin grasa (5 %) en tampon TBS-Tween (TBST) y se agito durante 2 horas con un anticuerpo anti-ICAM-1 humana de raton (dilucion 1:100 en TBST). Despues de lavar las muestras con TBST, se anadio el reactivo secundario, anticuerpo anti-IgG de raton de cabra unido a HRP (dilucion 1:10.000). Despues de un lavado repetido con TBST, la membrana se aclaro con agua. Todas las incubaciones se realizaron a temperatura ambiente. La Figura 35 muestra que CD54 esta presente en los sobrenadantes de ProCD54 y de ProCD54EX como una unica especie de aproximadamente 82 kDa, lo que corresponde al CD54 soluble detectado en suero humano.

[0313] La expresion de ARNm para CD54 humano en celulas tanto ProCD54 como ProCD54EX se verifico mediante RT-PCR. El ARN total se extrajo con un kit comercial y la deteccion por RT-PCR de la expresion genica se realizo como se ha descrito anteriormente en la Seccion 5. Un conjunto de cebadores de ICAM-1 humana [sentido, 5'-CCGGAAGGTGTATGAACTG-3'; (SEQ ID NO: 5) antisentido, 5'-TCCATGGTGATCTCTCCTC-3' (SEQ ID NO: 6)] se uso para sondar el ADNc transcrito inversamente de muestras de ARN experimentales y de control. Se incluyo un par de cebadores para ciclofilina en cada ensayo como control interno [sentido, 5'-TGTTCTTCGACATTGCCGTCGAC-3'; (SEQ ID NO: 7) antisentido 5'-GCATTTGCCATGGACAAGATGCCAGGA-3' (SEQ ID NO: 8)]. Los productos de la reaccion de PCR se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 3 % en un tampon de trisacetato que contema bromuro de etidio y se fotografiaron y digitalizaron las bandas fluorescentes inducidas por UV. La Figura 36 muestra un analisis por RT-PCR de ARNm para ICAM-1 humana en ProCD54 y ProCD54EX. Las celulas tri-hforidas de linaje cruzado de KWT, que no expresan CD54 en la superficie celular tambien muestran una transcripcion muy baja del gen ICAM-1.

9.2. Transfeccion de la estirpe celular de linaje cruzado tri-hibrida con un gen que codifica una proteina deseada

[0314] Se pueden introducir genes espedficos en celulas cultivadas mediante una serie de tecnicas convencionales, incluyendo la transferencia de genes mediada por vectores. En una realizacion de la presente invencion, las celulas de linaje cruzado tri-hforidas se transfectaron transitoriamente con un gen que codificaba una proteina deseada. Esto permite obtener productos geneticos, ya sea ARN o proteina, a las pocas horas de la absorcion del ADN. En una realización alternativa de la presente invencion, la celula de linaje cruzado tri-hfbrida se transfecto de forma estable con un gen que codificaba una proteina deseada. Esto implica que el ADN plasirndico del vector se integre en la cromatina de la celula hospedadora.

9.2.1. Transfeccion transitoria

[0315] El tri-hforido de linaje cruzado de KBT derivado de celulas B maduras (CD19+) y de linfocitos T auxiliares maduros (CD4+) compartiendo el 100% de las celulas tri-hforidas de linaje cruzado marcadores fenotfpicos de celulas B s ye Tgún se determino por FACS (vease la Seccion 4.2.3) y cariotipado como se ha descrito en la Seccion 6.2.1 se uso para experimentos de transfeccion de genes. Como ejemplo de transfeccion transitoria de celulas de una estirpe de tri-hfbridos de linaje cruzado con una proteina deseada, las celulas de un tri-hfbrido de linaje cruzado de KBT se transfectaron con cadena alfa de receptor de IL-4 humano (hIL4-Ra).

Metodo

[0316] La preparacion de celulas PBML a partir de una muestra de medula osea se ha descrito en la Seccion 1.3.1. Se clono ADNc de hIL4-Ra clonado a partir de un total de 1x106 celulas PBML incubadas con 100 ng/ml de IL-4 humana recombinante (R&D systems) durante 24 horas en condiciones de cultivo convencionales. Se extrajo el ARN total (RNeasy Mini Kit, Qiagen) y se sintetizo el ADNc usando el kit de purificacion de ADNc First Strand (Amersham Pharmacia). Se uso PCR para amplificar el ADNc de hIL4-Ra. La amplificacion se realizo con el cebador sentido 5'-AGGGGCGCGCAGATAATTAAA-3' (SEQ ID NO: 9) y el cebador antisentido 5'-AGTGGGCCAATCACCTTCATA-3' (SEQ ID NO: 10). Se uso una PCR anidada para anadir dos sitios de restriccion BamHI al fragmento hIL4-Ra [cebador sentido 5'-GGATCCGCGCAGATAATTAAAGA-3', (SEQ ID NO: 11) cebador antisentido 5'-GGATCCAAATCACCTTCATACCAT-3' (SEQ ID NO: 12]. El ADNc amplificado se diluyo y se sometio a una desnaturalizacion inicial de 1 min a 94 °C, seguido de 31 ciclos de 20 segundos a 94 °C, 45 segundos a 59 °C, 3 minutos a 72 °C. El fragmento de ADNc de IL4R se ligo en el vector de clonacion pGEM-T (Promega) y se transfecto en celulas competentes JM109 (Promega). Se preparo ADN plasirndico usando un kit Plasmid Mini Kit (Qiagen).

[0317] Para la electroporacion, se mezclaron 7x106 de las celulas KBT suspendidas en 350 pl de medio TC completo (vease la Seccion 1.1) con 30 pg de plasmido de ADNc. La transfeccion se realizo mediante un unico pulso (25 kv/m, 1050 pF, ancho de pulso 34-37 ms) de un pulsador Eurjectch Easyject. Posteriormente, se incubaron las celulas en placas de cultivo tisular de seis pocillos en medio TC completo complementado con 100 ng/ml de hIL4 recombinante.

[0318] Se prepararon extractos celulares mediante un procedimiento de congelacion y descongelacion 24, 48 y 72 horas despues de la transfeccion. Las celulas KBT y PBML no transfectadas se usaron como control negativo y control positivo, respectivamente. El contenido de proteina total de los extractos celulares se determino usando el ensayo de proteina Bio-Rad (Laboratorios Bio-Rad). Se inmunoprecipitaron cantidades iguales de extractos celulares (aproximadamente 2 mg) con 3 pg de cadena anti-hIL4-Ra (BD Pharmingen 551894) usando 20 mg de proteina A insolubilizada en flujo rapido de Sefarosa 4B (Sigma). Los inmunoprecipitados se lavaron dos veces en tampon de dilucion (Triton X-100 al 0,1 % y hemoglobina bovina en solucion de TSA, una vez en solucion de TSA y otra en solucion de TRIS-Cl 0,05 M (pH 6,8) solubilizada con tampon Laemmli, se hirvieron y se redisolvieron mediante SDS-PAGE de TRIS-glicina del 4 % al 12 %. La solucion de TSA contema TRIS-Cl 0,01 M (pH 8,0), NaCl 0,14 M y azida sodica al 0,025%). En algunos experimented, 75 pg de contenido de protema de los extractos celulares se redisolvieron directamente mediante SDS-PAGE sin inmunoprecipitacion previa.

[0319] Se realizaron analisis de transferencia Western transfiriendo las protemas de geles de poliacrilamida a membranas de nitrocelulosa Hybond-ECL (Amersham) a 25 V durante 2 horas en el tampon TRIS-glicina que contema TRIS 25 mM, glicina 192 mM, SDS al 0,1%, vanadato de sodio 100 pM y metanol al 20%. Las transferencias se trataron durante 1 hora con tampon de bloqueo (leche en polvo desnatada al 2,5%, TRIS-Cl 10 mM [pH 7,5], NaCl 100 mM y Tween 20 al 0,1 %) y despues se incubaron con 2 pg/ml de anticuerpo hIL4-Ra de raton en tampon de bloqueo durante otra hora. La union del anticuerpo se detecto incubando las transferencias durante 1 hora con anti-inmunoglobulina de raton de oveja conjugada con peroxidasa de rabano picante, seguida de una incubacion de 1 minuto con sustrato yodado y despues deteccion por quimioluminiscencia potenciada.

Resultados

[0320] La Figura 37 muestra un analisis por transferencia Western de extractos celulares de una estirpe celular trihterida de linaje cruzado de KBT transfectada transitoriamente con cadena hIL4-Ra, 24, 48 y 72 horas despues de la transfeccion. La cadena hIL4-Ra se detecto en celulas KBT transfectadas con cadena hIL4-Ra 24 horas despues de la transfeccion y los niveles de expresion de la cadena hIL4-Ra aumentaron progresivamente 48 y 72 horas despues de la transfeccion. Las celulas KBT no transfectadas sirvieron como control negativo para la cadena hIL4-Ra. Los extractos celulares de celulas PBML humanas utilizadas para la preparacion de ADNc de hIL4-Ra sirvieron como control positivo para la cadena hIL4-Ra.

9.2.2. Transfeccion estable

[0321] Como ejemplo de transfeccion estable de celulas de una estirpe celular tri-hterida de linaje cruzado con una protema deseada, las celulas de una estirpe celular KBT se transfectaron con el gen de la interleucina 2 (hIL-2) humana.

Metodo

[0322] Se uso el vector de expresion hIL-2 pBC12/RSV/IL2 (IS) que contema un gen de preproinsulina II de rata bajo el control de secuencias de repeticion terminales largas de RSV para la transfeccion. Se han incorporado la region lfder de la insulina completa y las secuencias de insulina que codifican un codon de inicio de la traduccion. Este ARNm de hIL-2 quimerico produce significativamente mas protema hIL2 que el ARNm de hIL-2 que contiene el lfder natural de hIL-2 y el codon de iniciacion (Cullen, 1988).

[0323] Las secuencias del gen de la dihidrofolato reductasa (dhFr) se insertaron en el vector pBC12/RSV/IL2 mediante ligadura con el fragmento del gen VS40/dhFr (Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1: 854, 1981) dando como resultado el plasmido pBC12/RSV/IL-2/dhFr que contema un gen dhFr murino completo bajo el control del promotor de la region temprana del virus VS40 y en el que los genes hIL-2 y dhFr se posicionaron en la misma orientacion.

[0324] Antes de la transfeccion, las celulas KBT cultivadas se sometieron a mutagenesis con 0,1 mM del hidrocarburo aromático polictelico racemico 3a,4b-dihidroxi-1a,2a-epoxi-1,2,3,4-tetrahidrobenzo[c]fenantreno (B[c]PHDE) durante 90 minutos (Carothers et al., Proc. Natl. Acad. Sci 87: 5464-68, 1990). La seleccion de los clones de dhFr se baso en la dependencia de la hipoxantina y la timidina y siguio un pertedo de expresion de 6 dfas (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 77 (7): 4216-20, 1980). Las celulas KTB deficientes en dhFr (KBTdhFr-) resultantes se mantuvieron en medio convencional complementado con hipoxantina 10-4 M y timidina 10-5 M.

[0325] En la transfeccion, las celulas KBTdhFr- cultivadas se lavaron con PBS tres veces y se resuspendieron en 0,8 ml de PBS. Se anadieron 60 pg de vector pBC12/RSV/IL2/dhFr a la suspension celular y la suspension se transfirio a una cubeta de electroporacion de plastico y se incubo en hielo durante 10 min. La electroporacion se realizo a 75 kV/m y 25 pF usando un protocolo de electroporacion convencional con una unidad de electroporacion de pulsos geneticos (Bio-Rad). Despues de pulsar, la cubeta se incubo en hielo durante 10 min. Las celulas se transfirieron despues a los matraces y se cultivaron en medio convencional sin hipoxantina y timidina. Las celulas supervivientes se clonaron usando una tecnica de clonacion de una celula individual (vease la Seccion 1.1.2) y las estirpes establecidas se evaluaron para determinar la secrecion de hIL-2.

Resultados

[0326] La expresion del ARNm de hIL-2 en celulas KBT transfectadas (KBT TR-IL2) se verifico mediante PCR con cebadores espedficos de hIL-2. Los linfocitos T CD8+ humanas obtenidos de PBML a traves de la clasificacion de perlas magneticas (como se ha descrito en la Seccion 1.3.3.5) y la estirpe celular Jurkat, Clon E6-1 se usaron como control positivo. Se usaron celulas K562 y celulas tubridas KBT no transfectadas como controles negativos. El ARN total se extrajo de las celulas KBT transfectadas despues de varios tratamientos en el kit RNeasy Mini (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los siguientes cebadores fueron los cebadores hIL-2 utilizados basandose en las secuencias publicadas (Wang et al, 1989):

cebador 5' = 5'-GAATGGAATTAATAATTACAAGAATCCC-3' (SEQ ID NO: 13)

cebador 3' = 5'-TGTTTCAGATCCCTTTAGTTCCAG-3' (SEQ ID NO: 14)

La amplificacion se realizo durante 35 ciclos. Los ciclos de PCR consistieron en 40 segundos a 94 °C, la temperatura de hibridacion para hIL2 fue de 55 °C, seguida de una extension durante 40 segundos a 72 °C. Los productos de la PCR se visualizaron en geles de agarosa al 2 % con bromuro de etidio. Los resultados se proporcionan en la Figura 38. Los niveles de expresion son similares a los obtenidos a partir de linfocitos T humanos CD8+ y celulas Jurkat. Se usaron celulas KBT no transfectadas y celulas K562 como controles negativos.

[0327] La IL-2 intracelular se detecto usando el kit de deteccion de IL-2 intracelular BD Fastlmmune™ CD4 (BD Pharmingen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los analisis por FACS se realizaron usando un BD FACSCalibur. Inicialmente, las celulas CD4+ se clasificaron se lagú dnispersion directa y el umbral de fluorescencia, asf como la dispersion frontal y lateral. Le siguio el analisis de la poblacion seleccionada basada en CD69 (linfocitos T CD4+ activados) y la expresion de IL-2 intracelular. En la Figura 39 se muestra un perfil de FACS de la expresion de IL-2 en las celulas KBT TR-IL2. Se usaron celulas KBT no transfectadas como control. Aproximadamente el 41 % de las celulas KBT fueron positivas para la molecula de activacion de CD69. El 92 % de las celulas KBT TR-IL2 se tineron de forma positiva para hIL-2 intracelular (R1+ R2). Las celulas negativas para hIL-2 eran parte de la poblacion positiva para CD69, mientras que las celulas negativas para CD69 eran todas positivas para hIL2 intracelular.

[0328] Las secreciones de hIL-2 treinta dfas y noventa dfas despues de la transfeccion se verificaron mediante ELISA. En resumen, se incubaron 1x106 celulas KBT transfectadas con 6hIL en una placa de cultivo tisular de 24 pocillos a 37 °C durante 24 horas. Se recogio el sobrenadante y se midio la actividad de hIL-2 con el kit ELISA de hIL-2 (R&D systems). Los sobrenadantes se diluyeron para ajustarse al intervalo de deteccion del kit ELISA de hIL-2. Se uso hIL-2 recombinante (R&D systems) como control positivo. El analisis de ELISA mostro velocidades de secrecion de hIL-2 que variaban de 660 ng/106 celulas/24 horas a 3300 ng/106 celulas/24 horas.

[0329] La estirpe de celulas KBT resultante, transfectada de forma estable con hIL2 y que secretaba hIL2, se etiqueto como ProL2.

9.3. Expresion simultanea de protemas diana combinando hibridacion y transfeccion

[0330] Como ejemplo de expresion de protema simultanea usando el sistema tri-tubrido, las celulas tri-tubridas se hibridaron con linfocitos sIgM+ CD25+ B humanos para expresar hIgM, seguido de una transfeccion estable con hIL-2. El sistema de celulas tubridas que expresaba de forma estable tanto hIgM como hIL-2 se sometio adicionalmente a transfeccion transitoria con hIL-4Ra. En este ejemplo, hIgM represento la primera protema, hIL-2 represento la segunda protema expresada simultaneamente y hIL-4Ra represento la tercera protema expresada simultaneamente. Como alternativa, las celulas tri-hubridas se transfectaron de forma estable con hIL-2, seguido de hibridacion de celulas somaticas con celulas B shigM+ CD25+ humanas. Tras la confirmacion de que tanto hIL-2 como hIgM se expresaban a partir del sistema celular hubrido, el sistema celular hubrido se sometio a una transfeccion transitoria con hIL-4Ra. En este ejemplo, hIL-2 represento la primera protema, hIgM represento la segunda protema expresada simultaneamente y hIL-4Ra represento la tercera protema expresada simultaneamente.

9.3.1. Preparacion de celulas

[0331] Se uso en estos experimentos el tri-hubrido de linaje cruzado de KBT derivado de celulas B maduras (CD19+) y de linfocitos T auxiliares maduros (CD4+) con el 100% de celulas tri-hubridas de linaje cruzado que compartfan marcadores fenotfpicos de celulas B y T según se determino por FACS (vease la Seccion 4.2.3) y cariotipado como se ha descrito en la Seccion 6.2.1. En algunos casos, en los experimentos se usaron celulas KBT deficientes en dhFr (KBTdhFr-) derivaron del proceso de mutagenesis descrito en la seccion 9.2.2 y se mantuvieron en medio convencional complementado con hipoxantina 10-4M y timidina 10-5M. Ademas, en algunos casos tambien se uso la estirpe celular transfectada con hIL-2 KBT TR-IL2 (vease la Seccion 9.2.2). Se usaron celulas B positivas primarias sIgM activadas por CD40 aisladas de PBMC como se ha descrito en la Seccion 1.3.3 y activadas a traves de la via CD40, como se ha descrito en la Seccion 2.2, como fuente de celulas sIgM B humanas para la hibridacion. Para estos experimentos particulares, el aislamiento de celulas B sIgM+ tambien se baso en la expresion de superficie simultanea de CD25

[0332] (receptor de IL-2 humano) usando FACS despues de 5 dfas en el cultivo. Se aislaron linfocitos T CD8+ de los timos usando el kit MACS CD4 Multisort como se ha descrito en la Seccion 1.3.3.5.

9.3.2. Hibridacion de celulas somaticas para la produccion de una primera protema o coproduccion de una segunda proteina

[0333] El procedimiento de hibridacion celular electrica entre una celula KBT o una celula KBTdhFr- o estirpe celular KBT TR-IL2 y celulas B shIgM+ CD25+ (subconjunto de celulas B de memoria) fue esencialmente el mismo que el utilizado para la creacion de estirpes de tri-hforido de linaje cruzado de KBT como se ha descrito en la Seccion 4.4.2. Una vez que los hforidos resultantes se estabilizaron, se mantuvieron como se ha descrito en la Seccion 1.1. La coexpresion de shIgM y CD25 por el hforido resultante se verifico a traves del analisis por FACS (vease la Figura 62) y la produccion de hIgM se analizo mediante ELISA. En los casos en que se usaron celulas KBT TR-IL2 para la hibridacion con celulas B shIgM+ CD25+, la produccion de hIL-2 tambien se analizo al mismo tiempo que hIgM.

9.3.3. Transfeccion estable con la segunda proteina

[0334] Cuando se realizo la hibridacion de celulas somaticas antes de la transfeccion estable del sistema con hIL-2, el sistema productor de hIgM se sometio a transfeccion con hIL-2 usando la metodologfa descrita en la seccion 9.2.2. La produccion simultanea de hIgM y hIL-2 se verifico mediante ELISA.

9.3.4. Transfeccion transitoria con la tercera proteina

[0335] Un sistema hfbrido estable que secretaba tanto hIgM como hIL-2 se transfecto de manera transitoria a traves de la electroporacion con el gen hIL-4Ra, usando el mismo metodo descrito en la Seccion 9.2.1. La coproduccion de hIgM, hIL-2 y hIL-4Ra se confirmo mediante ELISA.

Resultados

[0336] Los niveles de produccion de tres protemas expresadas simultaneamente y coproducidas por las celulas del mismo sistema celular hfbrido se resumen en la Tabla 7a y la Tabla 7b. Para el analisis, las celulas se cultivaron en placas de 24 pocillos hasta la densidad de 0,5x10 celulas/ml para la expresion de una proteina, 1,2x10 celulas/ml para la expresion de dos protemas y 3,2x105celulas/ml para la expresion de tres protemas. El sistema no solo fue capaz de producir tres protemas simultaneamente, sino que tambien aumento el nivel de produccion de la primera proteina despues de la coexpresion de la proteina secundaria y aumento adicionalmente por la expresion de la tercera proteina. De la misma manera, la produccion de la segunda proteina aumento por la expresion de la tercera proteina.

Tabla 7a. Niveles tipicos de produccion de protemas expresadas simultaneamente por el mismo sistema de l l hi ri i n l rim r m x r i n l hi ri i n m i

Tabla 7b. Nivel de produccion tipico de protemas expresadas simultaneamente por el mismo sistema de l l hi ri i n l rim r m x r i n l r n f i n l

Ejemplo 10

10. Adaptacion a condiciones de cultivo sin suero para la produccion del hibrido ProGM

[0337] Con el fin de demostrar la robustez del hforido ProGM para la produccion comercial, el volumen de cultivo se amplio a matraces giratorios con un volumen de trabajo de 1,2 l y se adapto el cultivo a un ambiente sin suero. Metodologia

[0338] Los clones de mayor produccion de hGM-CSF de hfbridos de ProGM se adaptaron para crecer en un ambiente sin suero mediante la reduccion gradual del contenido de FCS al 7,5, 5,0, 2,5, 1,0, 0,5 y 0%. Solo los subcultivos que mostraron el crecimiento celular mas robusto y la produccion de hGM-CSF anterior se transfirieron a los entornos sericos inferiores consecutivos. Cada subcultivo seleccionado se congelo en el medio convencional de los presentes inventores con DMSO al 5 % para almacenamiento. Se usaron dos medios de cultivo sin suero con fines de adaptacion. Se usaron medios libres desin protemas y suero definidos disponibles en el mercado Hybri-Max (Sigma) o Excel (JHR) con algunas modificaciones. La viabilidad celular se evaluo mediante exclusion con azul de tripano el d^ a 7. La concentracion de hGM-CSF se determino mediante ELISA el mismo d^ a.

Resultados

[0339] Los resultados de la adaptacion a las condiciones de cultivo sin suero se proporcionan en la Tabla 8.

T l . Pr i n h M- F r Pr M n n i i n in r

[0340] En todos los subcultivos de ProGM hforido, la produccion de hGM-CSF aumento con la reduccion del contenido en suero y protemas. A pesar de la baja densidad celular en cultivos sin suero, la cantidad de hGM-CSF en el medio sin suero fue aproximadamente 4 veces superior a la obtenida en condiciones de cultivo convencionales. Cuando se normalizo a la concentracion celular, la velocidad de produccion de hGM-CSF aumento 15 veces.

Ejemplo 11

11.1. Produccion en matraces giratorios

Metodologia

[0341] Se agitaron matraces giratorios con un volumen de trabajo de 1,2 l a 50 rpm. Las celulas hforidas ProGM adaptadas al crecimiento en un entorno sin suero (ProGMsf) se inocularon a una concentracion de 1x105 celulas/ml. El cultivo se incubo a 37 °C en una atmosfera humidificada que contema CO2 al 5%. La densidad celular maxima alcanzada fue de 5x105 celulas/ml. Las celulas viables se determinaron usando el metodo de exclusion con azul de tripano. Se realizaron cambios diarios de medio durante hasta 9 dfas. La suspension celular (600 ml) se centrifugo a 1000 rpm durante 10 minutos, el medio se retiro y se reemplazo por medio recien preparado y las celulas se devolvieron al matraz de centrifugacion. La concentracion de hGM-CSF secretada se determino mediante ELISA. Cada pocillo se recubrio con 100 pl de anti-GM-CSF humano de rata (R&D) diluido 1:500. Despues de lavar con PBS que contema Tween 20 al 0,05 % v/v (PBS-T), se anadieron 100 pl de rhGM-CSF convencional (Invitrogen) en PBS-5 % v/v BSA, en el intervalo de 0,195-200 ng/ml o muestras de 100 pl cada una diluida 100 veces a los pocillos por duplicado. Todas las incubaciones se realizaron a 37 °C durante 1 h. Posteriormente, las placas se lavaron con PBS-T y se anadieron 100 pl de anticuerpo anti-GM-CSF humano de conejo (R&D) diluido 1:1.000 en PBS-BSA-T y, despues de la incubacion y el lavado, se anadieron 100 pl de anti-inmunoglobulinas de conejo de cabra conjugadas con HRRP diluidos 1:1.000 en el mismo tampon. Una vez mas, las placas se incubaron y se lavaron y se anadieron 100 pl de sustrato. Las densidades opticas se midieron a 450 nm.

Resultados

[0342] La densidad celular relativamente baja de 5 x 105 celulas por ml indica condiciones de cultivo suboptimas para el crecimiento celular de ProGMsf. Puede requerirse una optimizacion adicional de las condiciones de cultivo que incluyan un contenido de glucosa y otros complementos para obtener densidades mas altas (en el orden de 106 celulas/ml). Tambien se justifica una estrecha vigilancia del contenido de lactato y amonio. A pesar del crecimiento suboptimo, la concentracion de hGM-CSF en los sobrenadantes de cultivo oscilo entre 2,8 y 4,2 pg por ml. Cuando se normalizo con la densidad de celulas y el tiempo, ProGMsf presento velocidades de produccion de entre 0,6 a 0,9 pg de hGM-CSF por ml por cada 106 celulas durante 24 horas. Para comparacion, una produccion de 0,3 pg de protema por ml por 106 celulas durante 24 horas en celulas CHO se considera alta.

11.2. Purificacion de GM-CSF humano producido por la estirpe celular hibrida ProGM

Metodologia

[0343] El sobrenadante del cultivo de ProGMsf se concentro aproximadamente 10 veces a 40 °C con una membrana PM-10 (Amicon). El concentrado de muestra se cargo en una columna de inmunoafinidad, preparada mediante el acoplamiento de GMCSF antihumano de rata contra GM-CSF humano derivado de E. coli a Affi-Gel 10 (Bio-Rad) de acuerdo con el protocolo del fabricante, equilibrado con PBS (NaCl 137 mM, KCl 3 mM, Na2HPO4 8 mM, KH2PO41,5 mM) y las protemas unidas se eluyeron con citrato de sodio 1 mM, pH 2,8. Las protemas eluidas de la columna de afinidad se cargaron despues en la columna de HPLC RP 300 y se eluyeron con un gradiente de acetonitrito del 0-60 % durante 60 minutes a un caudal de 0,1 ml/min. El perfil de elucion resultante se muestra en la Figura 40. Se recogieron alteuotas recuperadas de RP-HPLC para ELISA, tincion con plata y analisis por transferencia Western.

Resultados

[0344] La Tabla 9 muestra la recuperación de hGM-CSF a partir de la purificacion tfpica en dos etapas. La recuperació innicial de la columna de afinidad fue solo del 59 % y solo el 2 % de hGM-CSF se perdio despues de la RPHPLC. Hay varias posibilidades que explican la baja recuperació dnespues de la purificacion por afinidad. La capacidad de union de la columna de afinidad podna ser inferior a la cantidad de hGM-CSF en los sobrenadantes de ProGMsf, ya que el 13% de hGM-CSF se perdio en las etapas de paso de flujo y lavado. La baja recuperación tambien podna deberse a una menor afinidad de los anticuerpos de rata producidos contra hGM-CSF derivado de E. coli en comparacion con las formas glucosiladas de hGM-CSF producidas por el hterido ProGMsf. La otra mejora potencial en los rendimientos finales sena el desarrollo de unas condiciones de elucion mejor optimizadas. En la Figura 41 (vease la Seccion 12), la transferencia Western de las fracciones recogidas despues de RP-HPLC demostro que hGM-CSF eluyo en las fracciones 24-36 (eluyendo a los 24-36 minutos). Las formas de alto peso molecular (28-32 kDa) eluyeron en las fracciones 24 a 27, mientras que las moleculas de menor peso molecular (18 22 kDa) eluyeron en las fracciones 34 a 36. Estas condiciones cromatograficas no resolvieron completamente las diferentes formas de peso molecular del hGM-CSF, especialmente en las fracciones de peso molecular medio y alto.

[0345] El perfil obtenido con la tincion con plata y los perfiles de transferencia Western fueron esencialmente identicos, lo que sugiere que solo las protemas relacionadas con hGM-CSF se unen a la columna de afinidad. Se observaron varias especies de peso molecular de hGM-CSF nativo.

________________ Tabla 9. Purificacion en dos etapas del hGM-CSF derivado de ProGMsf________________

Muestra Volumen ^C

_EL ^o

_I ⁿ

_S ^c

_A ^{entracion de hGM-CSF por}Total de hGM-CSF en la

_muestraRendimiento ml |jg/ml jg % Sobrenadante de ProGMsf 60 3,825 229,5 100

Flujo de paso de la columna de

_afinidad60 0,467 28,02 12

Etapa de lavado 10 0,112 1,12 0,5

Eluato 3 44,78 134,34 59 Fracciones positivas para el inmunoensayo por RP-HPLC

24 0,1 144,5 14,45 6,3

25 0,1 159,7 15,97 7,0

26 0,1 102,8 10,28 4,5

27 0,1 123,1 12,31 5,4

28 0,1 163,6 16,36 7,0

29 0,1 146,8 14,68 6,0

30 0,1 71,72 7,172 3,0

31 0,1 144 1,324 0,6

32 0,1 9,38 0,938 0,4

33 0,1 10,72 1,072 0,5

34 0,1 184,6 18,46 8,0

35 0,1 161,3.3 16,16 7,0

36 0,1 19,71 1,971 0,9

Total 131,1557

Rendimiento total 57

Ejemplo 12

12. Digestion por glucosidasa

Metodologia

[0346] Se desnaturalizo termicamente GM-CSF purificado humano derivado del hterido ProGMsf durante 3 minutos a 100 °C en SDS al 1 %, P-mercaptoetanol 1 M, fosfato de sodio 100 mM, pH 7,0, se anadieron 0,8 U de PNGasa F de calidad de secuenciacion (Sigma) se incubaron en pertedos crecientes a 37 °C.

Resultados

[0347] Como se observa en la Figura 43 despues de la digestion con N, las formas de hGM-CSF derivadas del tnbrido ProGMsf migraron de manera dependiente del tiempo a la posicion cercana al hGM-CSF derivado de E. coli. Sin embargo, ninguna de las bandas despues de la digestion correspondio a la forma no glucosilada producida por E. coli. Estos resultados sugieren que el hGM-CSF derivado del tnbrido ProGMsf esta glucosilado en ambos sitios de glucosilacion N y O y que la distribucion de peso molecular esta provocada por la glucosilacion heterogenea. Este hallazgo de O-glucosilacion en todas las moleculas de hGM-CSF es importante desde el punto de vista de la inmunogenicidad de los sitios de O-glucosilacion no protegidos; se ha notificado que el GM-CSF humano recombinante que carece de O-glucosilacion desarrollo anticuerpos en ensayos clmicos.

[0348] Los datos sugieren que las celulas hnbridas ProGMsf secretan tres clases de hGM-CSF de acuerdo con los sitios de N-glucosilacion: moleculas con ambos sitios glucosilados (25-35 kDa, tipo 2N); moleculas con cualquier sitio glucosilado (20-25 kDa, tipo 1N); y moleculas sin ningun sitio glucosilado (18-20 kDa, tipo ON).

Referencias

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Una celula tubrida generada mediante la hibridacion de:

una primera celula, en la que dicha primera celula es una celula derivada de una celula progenitora mieloide comun, en la que una celula progenitora mieloide comun es una progenie de una celula madre hematopoyetica restringida al linaje mieloide y capaz de dar origen a cualquiera de los progenitores de megacariocitos/eritrocitos o de granulocitos/macrofagos, pero no a celulas linfoides;

una segunda celula derivada de una celula progenitora linfoide comun; y

una tercera celula derivada de una celula progenitora linfoide comun, en la que una celula progenitora linfoide comun es una progenie de una celula madre hematopoyetica restringida al linaje linfoide y capaz de dar origen a linfocitos B, T y citolfticos naturales, pero no a celulas mieloides,

en la que dicha segunda celula y dicha tercera celula no son una celula de mieloma,

y en la que dicha segunda celula es preferentemente una celula derivada del linaje linfoide B y

dicha tercera celula es preferentemente una celula derivada del linaje linfoide B o en la que dicha segunda celula es preferentemente una celula derivada del linaje linfoide T y dicha tercera celula es preferentemente una celula derivada del linaje linfoide T.

2. Una celula tubrida de acuerdo con la reivindica 1c eiónn la que dicha segunda celula es una celula derivada del linaje linfoide B y en la que dicha celula derivada del linaje linfoide B es preferentemente una celula pre-B, una celula B inmadura, una celula B indiferenciada, una celula B activada o una celula efectora B en la que dicha celula efectora es preferentemente una celula B con experiencia antigenica o una celula plasmatica y dicha tercera celula es una celula derivada del linaje linfoide T en la que dicha celula derivada del linaje linfoide T es preferentemente un linfocito pre-T , un linfocito T inmaduro, un linfocito T indiferenciado, un linfocito T activado o un linfocito T efector.

3. Una celula tubrida de acuerdo con la reivindica 1ci eónn la que dicha celula derivada de una celula progenitora mieloide comun se selecciona entre el grupo que consiste en un progenitor mielomonodtico, monocito, macrofago, eosinofilo, neutrofilo, celula dendntica o basofilo y en la que dicha celula derivada de una celula progenitora mieloide comun es preferentemente una celula inmortalizada, en la que dicha celula inmortalizada deriva de una malignidad o de la realización de una accion en una celula que induce la capacidad de crecimiento indefinido, y/o deriva de bazo, sangre periferica, sangre de cordon umbilical o medula osea.

4. La celula hfbrida de acuerdo con la reivindic 2ac einón la que dicha celula derivada del linaje linfoide B o del linaje linfoide T es una celula inmortalizada, en la que dicha celula inmortalizada deriva de una malignidad o de la realización de una accion en una celula que induce la capacidad de crecimiento indefinido, o en la que dicha celula derivada del linaje linfoide B o del linaje T linfoide deriva de tejido linfoide, tal como sangre periferica, sangre de cordon umbilical, bazo, medula osea, timo, airngdalas, adenoides y ganglios linfaticos locales.

5. La celula hfbrida de acuerdo con la reivindic 1ac enió lna que al menos una de las celulas es una celula humana o una celula de raton.

6. La celula hfbrida de acuerdo con la reivindicac 3ió enn la que dicha celula derivada de una celula progenitora mieloide comun es una celula K562.

7. La celula hforida de acuerdo con la reivindica 1c eiónn la que dicha segunda celula o dicha tercera celula es una celula WIL2-NS o una celula MOLT4.

8. La celula hfbrida de acuerdo con la reivindicac 2ió enn la que dicha celula derivada del linaje linfoide B es una celula WIL2-NS.

9. La celula hfbrida de acuerdo con la reivindica 2ci eónn la que dicha celula derivada de dicho linaje linfoide T es una celula MOLT4.

10. La celula hfbrida de acuerdo con la reivindicac 1ió enn la que dicha primera celula es una celula K562, dicha segunda celula es una celula WIL2-NS y dicha tercera celula es una celula MOLT4, o en la que dicha primera celula es una celula K562, dicha segunda celula es una celula B primaria y dicha tercera celula es un linfocito T primario, o en la que dicha primera celula es un monocito humano primario, dicha segunda celula es una celula WIL2-NS y dicha tercera celula es un linfocito T primario, o en la que dicha primera celula es un progenitor mielomonodtico humano primario, dicha segunda celula es una celula WIL2-NS y dicha tercera celula es un linfocito T humano primario, o en la que dicha primera celula es una celula K562, dicha segunda celula es una celula WIL2-NS y dicha tercera celula es un linfocito T primario, o en la que dicha primera celula es un monocito primario, dicha segunda celula es una celula WIL2-NS y dicha tercera celula es una celula WIL2-NS.

11. La celula hfbrida de acuerdo con la reivindica 1c einón la que dicha celula hfbrida expresa una protema deseada, mas de una protema deseada, dos protemas deseadas o tres protemas deseadas en la que una o mas de las protemas es una protema endogena o una protema recombinante y en la que dicha protema es preferentemente una citocina, un factor estimulante de colonias, una interleucina, GM-CSF, interleucina 2, un receptor o fragmento de la misma, un receptor soluble, una cadena alfa del receptor de IL-4 humano, CD54 o una inmunoglobulina incluyendo IgM o IgG.

12. La celula hforida de acuerdo con la 1 en la que d riechivain hdibircidaacciióonn se consigue por medios electricos o por medios qmmicos.

13. La celula hforida de acuerdo con la 1 en la que r deicivhain cdeiclualaci hófonrida se hibrida adicionalmente con una celula que expresa una protema de interes o en la que dicha celula hibrida se enriquece para un marcador que define un tipo celular particular para permitir la expresion de una protema que presente una modificacion postraduccional o funcionalidad deseada.

14. La celula hibrida de acuerdo con la 1 en la que d riechivain hdibicridaaccióionn se realiza mediante la hibridacion de tres celulas individuales o en la que dicha hibridacion se realiza usando tres poblaciones de celulas en las que cada una de dichas poblaciones incluye una pluralidad de tipos celulares identicos.

15. Un metodo de produccion de una protema, comprendiendo dicho metodo la etapa de expresar una protema en una celula hfbrida de la 1. reivindicación