KR20120058497A - 하이브리드/키메라 세포의 제조 방법 및 이의 용도 - Google Patents

하이브리드/키메라 세포의 제조 방법 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하이브리드 세포 및 하이브리드 세포의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은, 2 이상이 세포가 서로 다른 계통으로부터 유래되는, 3 이상의 세포의 하이브리드화를 통해 제조되는 하이브리드 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 진단, 예방, 치료 및/또는 연구적 용도 범위에서 유용한 단백질의 발현을 위한 하이브리드 세포의 용도에 관한 것이다.

Description

하이브리드/키메라 세포의 제조 방법 및 이의 용도 {METHODS OF GENERATING HYBRID/CHIMERIC CELLS, AND USES THEREOF}
본 발명은 하이브리드 세포 및 하이브리드 세포의 제조 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 2 이상의 세포가 서로 다른 계통(lineage)으로부터 유래된, 3 이상의 세포들의 하이브리드화에 의해 제조되는 하이브리드 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 진단, 예방, 치료 및/또는 연구 응용 분야에서 유용한 단백질을 발현시키기 위한 하이브리드 세포의 용도에 관한 것이다.
본 명세서의 전반에 걸친 선행 기술에 관한 일체의 논의는 그러한 선행 기술이 당해 분야에서 통상적 일반 지식의 일부를 이루거나 널리 공지된 것임을 인정하는 것으로 간주되어서는 안된다.
현재 다양한 상이한 세포 타입들이 진단, 예방, 치료 및/또는 연구 응용 분야에서 상업적으로 관련있는 단백질을 발현시키는데 이용되고 있다. 현재, 이러한 단백질의 생산은 박테리아, 효모, 진균, 곤충 및 인간을 제외한 포유류 세포 등의 세포들에서 일상적으로 수행되고 있다.
세포는, 비제한적인 예로서, 당화, 아실화, 인산화, 메틸화, 황화, 페닐화 및 지질화를 포함하여, 여러번의 번역 후 변형(post-translational modification)을 통해, 단백질을 변형시킨다. 이러한 변형은 종 특이적이므로, 상업적인 관련 단백질의 생산에 있어 현재 사용되고 있는 세포들은, 인간 세포에서 발현되는 단백질에서 관찰되거나 또는 인체에서 자연적으로 이루어지는, 번역 후 변형과는 다른, 번역 후 변형을 나타내게 된다. 예를 들어, 상업적인 관련 단백질의 생산에 사용되는 다수의 비-포유류 세포 타입들은, 단백질 당화력이 결여되어 있거나, 또는 인간 세포에서 발현되는 단백질에서 보여지는 당화 패턴과는 다른 당화 패턴을 나타낸다.
중국 햄스터 난소(CHO) 세포와 같은 비-인간계 포유류 발현 시스템이라고 하더라도, 인간 세포의 경우와 비교하여, 당화 패턴에는 상당한 차이가 보고되어 있다. 예컨대, 재조합 단백질 발현에 사용되는 CHO 세포주에는, 인간 세포에 존재하는, (α 2, 6)-연결된 말단 시알산을 합성하기 위한 기능성 (α 2, 6) 시알릴트랜스퍼라제 효소가, 결여되어 있다. 또한, CHO-세포에서 발현되는 당단백질 상에 존재하는 시알산 모티프는 CHO 세포의 내인성 시알리다제에 의해 쉽게 분해된다 (Gramer et al. Biotechnology 13 (7):692-&, 1995).
비-인간계 발현 시스템들의 번역 후 변형 레퍼토리가 서로 달라서, 이로부터 발현되는 단백질은 인간 세포 유래의 단백질과는 상이한 반감기, 면역원성, 안정성 및 약동학적 특징들을 나타낼 수 있다. 이러한 점들이 실질적으로 이러한 단백질의 임상적인 이용에 영향을 미칠 수 있다.
또한, 번역 후 변형은, 이의 종 의존적인 특성 외에도, 동일한 종들에서도 조직 특이적이며, 심지어 세포 타입 특이적일 수 있다는 증거들이 증가하고 있다. 이는 말단 당화를 나타내는 단백질의 조직-특이적인 발현성 및 세포 타입-특이적인 발현성과 특히 관련있다 (Feizi Nature 314: 53-54, 1985; Rademacher et al Annu Rev Biochem 57: 785-838, 1988). 구체적으로, 당단백질 당쇄에 말단 시알산을 부착시키는 3종의 시알릴트랜스퍼라제가, 랫의 7종의 조직들에서 매우 차별적으로 발현됨이 확인되었다 (Paulson et al J. Biol. Chem. 264: 10931-10934, 1989). 이러한 사실은 동일한 단백질의 조직 특이적인 당화를 뒷받침해준다. 아울러, 마우스 섬유모세포와 마우스의 골수 유래 골모세포에서 발현되는 고도로 인산화된 당단백질(마우스 오스테오폰틴)의 2가지 이소형은 인산화 수준에서 큰 차이를 보이는데, 이는 생물학적 활성 차이와 관련있다. 이러한 결과들은, 다른 세포 타입에서 발현되는 오스테오폰틴이 그 기능에 차이가 있음을 의미한다 (Christensen et al J Biol. Chem. 282(27): 19463-19472).
인간 특징들을 모두 보여주는 생물제의 생산에 적합한 효율적인 세포 시스템은, 이상적으로는, 여러 기준들을 만족시켜야 하는데, 이러한 기준으로는 하기 사항들이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다:
a) 인간 조직으로부터의 파생물;
b) 배양시 고밀도 배양;
c) 상업적으로 실용적인 단백질 수율 확보;
d) 안정적인 외래 유전자 도입 가능;
e) 유전자 증폭법 적용 가능;
f) 인간-인간 하이브리도마와 같이 단일클론 항체 생산용으로의 모 세포의 이용 가능성;
g) 장기간의 안정적인 단백질 발현성;
h) 무혈청 및 글루타민 무첨가 배지에서의 증식력;
i) 엔도-펩티다제 활성의 결여로 인한 단백질 분해 감소;
j) 바이러스 DNA 및 마이코플라스마 등의 병원성 물질의 결여;
k) 천연 인간 단백질에서 이루어지는, 바람직하게는 조직 및 세포 특이적인, 번역 후 변형과 기능적으로 유사하거나 또는 동일한 번역 후 변형을 보이는, 단백질의 생산. 이러한 번역 후 변형은 당단백질 상의 탄수화물 모이어티일 수 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
인간 단백질을 발현시키기 위한, 다수의 인간 숙주 세포 또는 이종의 하이드리도마들이 존재하고 있지만, 이러한 것들 모두 전술한 기준들을 모두 성공적으로 만족시키지 못한다. 특히, 임상적으로 유용한 수율로 기존의 인간 세포 발현 시스템에서 단백질을 발현 및 분리하고자 하는 시도들은 성공이 제한적이었다.
진핵 세포에서의 단백질 발현은, (a) 염색질 유전자에 대한 조절 인자의 영향, (b) 전사 개시 조절, 및 (c) 번역 후 변형 등의, 다단계로 조절된다. 이러한 여러 단계들은 발생 단계 특이적이거나 및/또는 조직 특이적인 것으로 생각된다. 따라서, 원하는 단백질을 코딩하는 외인성 유전자를 세포에 병합시켰을 때, 원하는 단백질의 발현 수준은 최적 수준 미만일 수 있다. 안정적인 발현의 결여 (Li et al., Proc Natl Acad Sci USA 95: 3650-3654, 1998; Miyaji et al., Cytotechnology, 3: 133-140, 1990; Miyaji et al., Cytotechnology 4: 173-180, 1990; Miyaji et al., Cytotechnology 4: 39-43, 1990; Satoh et al., Cytotechnology 13: 79-88, 1993), 낮은 발현 수율 (Airoldi et al, Cancer Research 61:1285-1290, 2001; Hosoi et al. Cytotechnology 7: 25-32, 1991) 및 비-최적의 번역 후 변형 (Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278:3466-3473, 2003) 등의 문제들이 발생할 수 있다. 이러한 인자들은 모두 단백질의 잠재적인 상업적 유용성에 영향을 미칠 수 있다.
예를 들어, Namalwa 세포(현탁 배양으로 배양하고 혈청 및 알부민-무첨가 배지에서 적응시킨, 인간 B 림프모구성 세포)의 서브세포주인 Namalwa KJM-1은, 버킷의 림프종 세포의 내인성 단백질인 알파-인터페론을 대량 생산하는데, 사용되었다. 그러나, 버킷의 림프종 세포에 외인성이지만 B 세포에 내인성인 G-CSF 단백질(Airoldi et al, Cancer Research 61:1285-1290, 2001)을 전기충격을 통한 형질감염의 타겟 단백질로서 사용하였을 경우, G-CSF 발현 수준은 다중 메토트렉세이트(MTX) 내성 클론들의 경우에 다양하고 G-CSF-최고 생산자 클론들은 무혈청 조건에서 적응시켰을 때에는, 비생산성(specific productivity)이 2.4 ㎍/ml/day에 불과하였다.
나아가, 비생산성은 세포수를 7 x 105세포/ml (Hosoi et al. Cytotechnology 7: 25-32, 1991) 이상의 고밀도로 배양한 경우에 감소되었다. 보고되는 최대 G-CSF 농도가 크게 증가하여, 41 ㎍/ml에 도달하였지만, 이를 달성하기 위해서는, pH를 매우 엄격하게 조절하는, 세포 배양 조건에 대한 상당한 노동력을 요하는 조작 과정이 요구되었다. 또한, 최적 증식용 사용 배지는 최적 생산용 사용 배지와 다르므로, 원하는 고밀도와 고생산율 간에 현격한 모순이 생겨, 산업적으로 실행불가한 시스템이다.
진핵 생물에서의 유전자 발현은, (a) 조절 인자의 염색질 유전자에 대한 유용성 및 접근 용이성, (b) 특이적인 전사 개시 속도를 달성할 수 있는 프로모터의 조절, 및 (c) 이후, 다양한 단계들에서의 번역 후 현상들을 비롯하여 다단계로 조절되기 때문에, 조직 특이적인 전사 인자 및 발생 특이적인 전사 인자들의 존재는 유전자의 발현에 크게 영향을 미친다. 아울러, 특이적인 세포 타입의 유전자 조절에는 몇가지의 cis로 작용하는 DNA 조절 서열들의 협동이 요구되는데, 이 서열이 유전자에 분자 신호를 전달하는 단백질이 결합하는 부위이다 (Blackwood et al., Science 281: 60-63, 1998). 이 서열에 조절 단백질이 결합되면, 인핸스오좀(enhanceosome)이라고 하는 복합체가 형성된다 (Marika et al., Curr Opin Genet Dev 11(2): 205-208, 2001). 그래서, 추가적인 타겟화된 유전자는, 인간 계통 특이적인 숙주 세포로의 도입시, 이의 일반적인 세포 환경에서 이탈되게 되어, 원하는 단백질의 안정적인 발현과 고수준의 생산은 줄어들게 된다. Namalwa KJM-1 세포에, 베타 인터페론 (Miyaji et al., Cytotechnology, 3: 133-140, 1990; Miyaji et al., Cytotechnology 4: 173-180, 1990) 또는 인간 림포톡신 (Miyaji et al., Cytotechnology 4: 39-43, 1990) 또는 프로-우로키나제 (Satoh et al., Cytotechnology 13: 79-88, 1993) 등의, 림포모구 세포주에 대한 계통 특이적인 단백질이 아닌, 외래 단백질의 유전자를 형질감염시켰을 때, 형질감염율과 세포 생산성은 훨씬 더 감소되는 것으로 확인되었다.
또한, 인간 계통 특이적인 세포주에서 외래 유전자를 효과적으로 발현시키기 위해서는 세심한 주의가 요구되며, 때로는 인간 숙주 세포에서 이용가능한 핵 인자에 대한 결합부를 포함하고 있는 적합한 인핸서/프로모터를 선별하는 지루한 과정이 필요하다. 이러한 인핸서/프로모터의 발굴에도 불구하고 여전히 이러한 프로모터의 적합성은 제한될 가능성도 있다. 예컨대, 유인원 바이러스 40(SV40) 초기 유전자 프로모터, 인간 사이토메갈로바이러스(hCMV) 주요 전-초기 유전자 프로모터, 말로니 뮤라인 백혈병 바이러스 (Mo-MuLV) 프로모터, 라우스 육종 바이러스 (RSV) 프로모터 및 닭 베타-액틴 프로모터와 같은 몇가지 인핸서/프로모터들을, Namalwa KJM-1 세포에서 외래 유전자의 보다 효율적인 발현에 대해 조사하였을 때, Mo-MuLV 프로모터가 기존의 SV40 초기 프로모터 보다 약 10배 강력하고, 고생산자 클론의 생산성이 30-40 ㎍/106세포/일에 이르는 것으로 확인되었다 (Satoh et al., Cytotechnology 18:162-172, 1996). 그러나, Mo-MuLV와 같은 레트로바이러스 벡터를 이용할 경우의 문제는, 역위된 서열(인트론)을 가진 유전자가 핵 스플라이싱 기구에 의해 제거되기 때문에, 상기 유전자의 형질감염에는 사용하기 어렵다는 것이다 (Li et al., Proc Ntl Acad Sci USA 95: 3650-3654, 1998).
세포 환경과 핵 환경 간의 미스매치는, 항체와 같이 2가지 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 경우에는, 보다 더 커진다. 또한, 인간-인간 하이브리도마의 제조에 Namalwa KJM-1 세포가 사용되고 있지만, 항체의 수율로 인해 이 세포주는 산업적인 생산에는 부적절하다.
다른 예로서, 인간 배아성 신장 세포주 293이 외래 기원의 유전자로 매우 용이하게 형질감염되고 안정성도 높은 것으로 입증되었다. 그러나, 293 형질감염체로부터 유래된 단백질들은 이용성이 한정적이며, 293 세포에 인간 아데노바이러스 Ad5 DNA (HEK 293 세포)가 포함되어 있기 때문에, 통상적으로 연구 목적으로만 적합하다. 그러나, 산업적인 환경에서 293 세포의 사용에 가장 큰 제한 요소는 이의 부착 특성이다. 폴리에틸렌이민 (Durocher et al., Nucleic Acids Res 30(2):e9, 2002; Schlaeger et al., Cytotechnology 30:71-83, 1999) 또는 칼슘 포스페이트 (Girard et al, Cytotechnology 38:15-21, 2002; Jordan et al., Cytotechnology 26:39-47, 1998; Meissner et al., Biotechnol Bioeng 75(2):197-203, 2001) 등의 비용 효율이 높은 비히클을 이용하여, 현탁 상태에서 293 세포의 효과적인 형질 감염을 이루고자 하는, 다수의 시도들이 행해지고 있다. 그러나, 이러한 비히클들을 이용한 경우 재조합 단백질의 일시적인 발현만 달성되는데, 이는 접종된 배양물의 각각의 새로운 배치에 대해 형질감염이 반복되어야 함을 의미한다. EBV의 oriP가 벡터 백본에 존재하는 경우에는, 현탁 증식 및 고도의 단백질 발현을 달성하기 위해, 엡스타인 바 바이러스 EBNA1 단백질을 안정적으로 발현시키도록, 293 세포의 유전자 변형을 야기하여야 하였다(293E) (Durocher et al., Nucleic Acids Res 30(2):e9, 2002; Parham et al., Cytotechnology 35:181-187, 2001; Schlaeger et al., Cytotechnology 30:71-83, 1999). EBNA1으로 형질감염시킨 후, (대규모 생산에 필수적인) 무혈청 배지에서 배양한 293E 세포(HEK293 EBNA1)는, 세포 응집을 방지하기 위해 첨가되는 폴리양이온(헤파린, 덱스트란 설페이트)의 존재로 인해, 아마 형질감염율이 매우 불량할 가능성이 크다. 이에, 육류, 젤라틴 및 카세인 등의 동물 소스의 효소적 가수분해를 통해 수득되는 펩톤을 배지에 보충함으로써, 이러한 문제를 완화시키고자 하는 시도들이 행해지고 있다 (Pham et al., Biotechnol Bioeng 84(3):332-42, 2003). HEK293 EBNA1 세포주를 Tie-2 (안지오포이에틴 성장 인자에 대한 수용체 타이로신 키나제) 및 뉴로필린-1 ED (신경 세포 안내를 매개하는 수용체)의 생산에 사용하였을 때, 단백질 발현은 형질감염되지 않은 배양물에서 수득되는 결과에 비해, 저밀도 세포 배양물로 인해 한계가 있었다. 또한, 제조되는 단백질의 순도 >95%는 연구 등급의 제품으로만 적합할 뿐이다. 또한, HEK293 EBNA1 세포는 단일클론 항체(mAb)의 생산에 적합하지 않았다.
치료학적 mAb 생산을 위한 현행 전략들은, 인간 Ig 유전자를 포함하는 형질전환 마우스(제노마우스)의 면역화로부터 유래되거나, 설치류 mAb의 인간화로부터 유래되거나, 또는 인간 mAb 라이브러리의 스크리닝을 통해 유래되는, mAb를 재조합기법으로 생산하기 위한, 포유류 세포 시스템(즉, CHO 또는 NSO 트랜스펙토마스)의 사용을 포함한다 (van Dijk et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 5:368-374, 2001). 이의 서열 측면에서, 치료학적 mAb는, 알레르기 반응을 최소화하기 위해, 현재 키메라(설치류 가변부 및 인간 불변부) 항체, 인간화된 항체(설치류 상보성-결정부를 제외한 인간 서열) 및 완전한 인간 항체(인간 Ab)로 만들어지고 있지만, 치료학적 mAb의 중요한 측면은, 항체-의존적인 세포성 세포독성과 같은 면역 작동자 기능을 도출하는 능력인데, 이는, mAb가 이의 천연적인 당화 패턴을 변형시키는 비-인간 숙주 세포에서 생산되는 경우에는 저하된다 (Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278:3466-3473, 2003). 이러한 사실에 비추어, 이상적인 시나리오는 치료학적 항체를 인간 세포에서 생산하는 것이다. 이럴 경우, 완전한 인간 mAb는 인간 작동자 기능을 도출할 수 있으며, 이의 천연적인 인간 구조로 인해 매우 한정된 면역원성을 가지게 될 것이다.
엡스타인 바 바이러스(EBV)-형질감염된 인간 B 세포 유래의 림프모구 세포주의 제조가 보고되었다 (Kirman et al., Hybrid. Hybridomics 21: 405-414, 2002; Boerner et al., J. Immunol. 147: 86-95, 1991; Zafiropoulos et al., J. Immunol. Methods 200: 181-190, 1997). 그러나, 이의 장기간의 안정성과 제조 프로세스의 적합성, 특히 전체 배치를 제조하는 동안의 Ig 분비물의 생산 수준 및 안정성과 관련하여, 이들 mAb와 세포주의 특정화에 대한 정보는 제한적이다. 4일 동안 누적 역가 1.2 g/L로 인간 GM-CSF에 대한 인간 mAb를 생산하는 세포주가 보고되었는데, 이들 세포주들은 이종골수성 림프종 K6H6/B5 세포(즉, 인간 B 세포 림프종과 마우스 골수종 세포를 하이브리드화하여 수득한 마우스-인간 세포주)를 일차 인간 B 세포와 체세포성 세포 하이브리드화(융합)를 통해 만들어질 것이다(Li et al., Proc Natl Acad Sci USA 103(10):3557-3562, 2006).
EBV-형질감염의 경우, 안정적인 항체 생산을 유지하면서 완전히 불멸화된 인간 B 세포주를 확립하기 어렵다. 그 이유는, 낮은 불멸화 효율, 세포 증식의 정지 및 IgM 생산 세포의 우성적인 불멸화 때문이다. 또한, 최근 보고에서는, 대부분의 EBV-형질전환된 B 세포가 짧아진 텔로미어를 가지고 있고, 대부분 배가 수준이 160 세대 미만으로 수명이 한정되는 것으로, 확인되었다 (Sugimoto et al., J Virol 73:9690-9691, 1999; Toda et al., J Chromatogr B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 787:197-206, 2003). 이러한 문제를 극복하기 위해, EBV-형질전환된 B 세포를 적합한 파트너 세포주(발현 시스템)와 하이브리드화(또는 융합)시키고자 하는 시도들이 행해졌지만, 실제 이들 파트너 세포주들은 인간 B 세포와 마우스-인간 헤테로하이브리도마로부터 유래된 트리오마(trioma)에서와 같이, 다양한 헤테로하이브리드 조합을 보여주었다 (Ainai et al., Hum Antibodies 15:139-154, 2006; Kalantarov et al., Hum Antibodies 11: 85-96, 2002; Karpas et. al., Proc Natl Acad Sci USA 98:1799-1804, 2001). 트리오마를 파상풍 독소(TT)에 대한 항체를 생산하는 일차 EBV-형질전환된 B 세포와 융합시켰을 때, 마우스 유래 구성 요소를 1/4로 포함하는 테트로마가 만들어진다. TT에 대한 mAb의 안정적인 생산은 테트로마의 3차례 연속적인 클로닝 이후에 가능하였지만, 이러한 반복된 세포 클로닝 단계는 노동력과 시간을 요구하는 과정이다. 또한, 테트로마에 의해 만들어지는 mAb의 양은 실험 목적으로는 충분하였지만, 그 수준은 약학제로서 mAb를 대량 생산하기에는 불충분하였다. 다클론 활성자 CpG 2006의 존재시의 불멸화 또는 CD19 또는 BCR의 공동-라이게이션(co-ligation)이, 치료 용도에 적합한 규모로 특이적인 mAb를 효율적으로 생산하는데 완벽한 시스템이 될지는, 여전히 의문이다 (Hartman et al., J Immunol 164: 944-953, 2000; Hur et al., Cell Prolif 38: 35-45, 2005; Traggiai et al., Nat Med 10: 871-875, 2004).
성장 인자, 항체 및 가용성 단백질 등의 생물학적 물질의 생산에 인간 세포를 이용하고자 하는 몇가지 방법들이 시도되고 있다.
Ainai et al., Hum Antibodies 15:139-154, 2006 Airoldi et al, Cancer Research 61:1285-1290, 2001 Blackwood et al, Science 281: 60-63, 1998 Boerner et al, J. Immunol. 147: 86-95, 1991; Carothers et al, Proc. Natl. Acad. Sci 87:5464-68, 1990 Christensen et al J Biol. Chem. 282(27): 19463-19472 Cullen, B. R., 1988. DNA, 7: 645-650 Durocher et al, Nucleic Acids Res 30(2):e9, 2002; Durocher et al, Nucleic Acids Res 30(2):e9, 2002; Feizi Nature 314: 53-54, 1985; Girard et al, Cytotechnology 38:15-21, 2002; Gramer et al, Biotechnology 13 (7):692, 1995 Hartman et al, J Immunol 164: 944-953, 2000; Hosoi et al, Cytotechnology 7: 25-32, 1991 Hosoi et al, Cytotechnology 7: 25-32, 1991 Hosoi et al, Cytotechnology 7: 25-32, 1991 Hur et al, Cell Prolif 38: 35-45, 2005; Jordan et al, Cytotechnology 26:39-47, 1998; Jordan et al, Cytotechnology 26:39-47, 1998; Kalantarov et al, Hum Antibodies 11: 85-96, 2002; Karpas et al, Proc Natl Acad Sci USA 98:1799-1804, 2001 Kimura H. et al, 1999. J Clin Microbiol 37: 132-136 Kirman et al, Hybrid. Hybridomics 21: 405-414, 2002; Kohler, G and Milstein, C. Nature, 256, 495-497 1975 Li et al, Proc Natl Acad Sci USA 103(10):3557-3562, 2006 Li et al, Proc Ntl Acad Sci USA 95: 3650-3654, 1998; Mahaworasilpa, T. L. (1992). Cell Electro-Dynamics: The mechanics of living cells in intense alternating electric fields. PhD Thesis, University of New South Wales, Sydney, Australia Marika et al, Curr Opin Genet Dev 11(2): 205-208, 2001 McIlroy D, Autran B, Cheynier R, et al. J Virol.; 69:4737-4745 1995 Meissner et al, Biotechnol Bioeng 75(2):197-203, 2001 Miyaji et al., Cytotechnology 4: 173-180, 1990; Miyaji et al., Cytotechnology 4: 39-43, 1990; Miyaji et al, Cytotechnology, 3: 133-140, 1990; Neil, G. A. and Zimmermann, U Electro, Meth. Enzymol 220, 174 1993 Parham et al, Cytotechnology, 35:181-187, 2001 Paulson et al, J. Biol. Chem. 264: 10931-10934, 1989 Pham et al, Biotechnol Bioeng 84(3):332-42, 2003 Pohl, H. Dielectrophoresis, Cambridge University Press, London 1978 Rademacher et al, Annu Rev Biochem 57: 785-838, 1988 Satoh et al, Cytotechnology 18:162-172, 1996 Satoh et al, Cytotechnology 13: 79-88, 1993 Satoh et al, Cytotechnology 13: 79-88, 1993 Schlaeger et al, Cytotechnology 30:71-83, 1999 Shinkawa et al, J. Biol. Chem. 278:3466-3473, 2003 Sugimoto et al, J Virol 73:9690-9691, 1999; Toda et al, J Chromatogr B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 787:197-206, 2003. Traggiai et al, Nat Med 10: 871-875, 2004 Urlaub et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 77(7): 4216-20, 1980 van Dijk et al, Curr. Opin. Chem. Biol. 5:368-374, 2001 Wang, A. M., Doyle. M. V., and Mark. D. F. Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 86: 9717-9721, 1989 Wojciezsyn, J. W. et al, J. Cell. Biol., 96, 151-159, 1983 Zafiropoulos et al, J. Immunol. Methods 200: 181-190, 1997 Zimmermann, U. (1982). Biochim. Biophys. Acta. 694, 227-277
본 발명의 목적은 종래 분야의 한가지 이상의 문제점을 해결 또는 완화시키거나, 또는 유용한 대안책을 제공하는 것이다.
이에, 본 발명의 목적은, 종래 기술의 한가지 이상의 문제점들을 극복 또는 개선하거나, 또는 유용한 대안책을 제공하는 것이다.
일반적으로, 다중-융합 세포들은 불안정하며, 융합에 참여하는 세포의 수가 많을수록 제조되는 하이브리드 세포의 불안정성은 더 커지는 것으로 여겨진다. 놀랍게도, 본 발명에서, 다수의 세포, 예컨대 3종의 세포의 융합으로 제조되는 하이브리드 세포는 기능적인 안정성을 나타낸다. 특히, 서로 다른 계통으로부터 유래된 세포들이 체세포 융합되거나 하이브리드화되어, 실질적으로 안정적인 키메라/하이브리드 세포를 형성할 수 있는 것으로 확인되었다. 보다 구체적으로, 본 발명은, 2종 이상의 모 세포들이 서로 다른 계통으로부터 유래되고, 하이브리드화에 골수종 세포가 포함되지 않는, 트리-하이브리드를 만드는, 3종 이상의 모 세포의 하이브리드화로부터 제조되는 교차-계통(cross-lineage)의 키메라/하이브리드 세포에 관한 것이다.
또한, 놀랍게도, 본 발명의 안정적인 키메라/하이브리드 세포들이, 예컨대, 비제한적인 예로서, 인간 당화 패턴 등의 바람직한 번역 후 변형을 보이는 단백질의 생산에 유용함이 확인되었다.
또한, 놀랍게도, 본 발명의 안정적인 키메라/하이브리드 세포에서의 원하는 단백질의 발현 수준이, 제2 바람직한 단백질을 본 발명의 키메라/하이브리드 세포에서 동시에 발현시킬 때, 강화될 수 있다는 것을 확인하였다. 아울러, 2가지의 타겟 단백질의 발현 수준은, 본 발명의 키메라/하이브리드 세포에서 제3의 바람직한 단백질의 동시 발현에 의해, 강화될 수 있다.
이에, 본 발명은 하이브리드 세포의 다변성 및 안정성 측면에서 기술에 공지된 시스템 대비 현저한 이점들을 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명의 하이브리드 세포는 상동 세포 2주 또는 동일한 계통의 세포 2주와 다른 계통의 세포 1주의 융합에 의해 만들어진다. 이러한 하이브리드는 하이브리드화에 사용되는 주류 세포 타입으로 유도되는 표현형을 나타내는 경향을 보인다. 이들 하이브리드 세포는, 조직 특이적인 번역 후 변형이 단백질의 기능성에 중요한 것으로 알려져 있는 단백질의 발현에 특이적으로 사용할 수 있다. 예를 들어, B 세포에서 발현시 특이적인 기능적인 번역 후 변형을 거치는 것으로 알려진 사이토카인은, B 세포 계통으로부터 유래된 2주 이상의 세포를 포함하는 하이브리드 세포에서 보다 효율적으로 발현되고, 기능적인 번역 후 변형을 확보할 수 있다.
단백질의 번역 후 변형이 조직 특이적이거나 세포 타입 특이적일 수 있기 때문에, 또한, 본 발명의 하이브리드 세포는, 특정 세포 타입이나 표현형으로 농화시켜(특이적인 CD 마커의 존재에 의해 확인함), 특정 세포 타입 또는 표현형과 조합된 바람직한 번역 후 변형 또는 바람직한 기능성을 나타내는 단백질의 발현을 가능하게 할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 불멸화된 세포의 사용을 포함하는 하이브리드 세포에 관한 것이다. 그러나, 당해 기술 분야의 당업자는, 본 발명이, 또한, 바이러스 유전자, 예컨데 엡스타인 바 바이러스(EBV), 유인원 바이러스 40(SV40) T 항원, 아데노바이러스 E1A 및 E1B, 및 인간 파필로마바이러스(HPV) E6 및 E7의 도입과 같이, 시험관내 형질전환 프로세스에 의해 이후에 불멸화될 수 있는, 비-불멸화된 세포의 융합에 관한 것이라는 것도 자명하게 이해할 것이다. 다른 예로, 비-불멸화된 세포는 텔로머라제 역전사효소 단백질(TERT)의 발현을 통해 불멸화될 수 있다. 또한, 불멸화된 세포는 온코진의 발현이 변형된 세포로부터 유래될 수 있다. 불멸화된 세포는, 또한, 비제한적인 예로서, UV 노출 또는 불멸 기전이 미확인된 자연적인 형질전환 등의, 무한 증식 능력을 유도하는 모든 작용으로부터 파생될 수 있다.
본 발명은, 일 구현예에서, 개별 세포 3주의 융합에 관한 것임이 자명할 것이다. 다른 구현예에서, 본 발명은, 각 세포 집단이 동일한 세포 타입들을 복수개로 포함하는, 3가지의 세포 집단의 융합에 관한 것이다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 세포 개체군의 융합을 벌크한 세포 배양물에서 수행할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 바람직한 하이브리드화된 세포는 그 후 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 방법들, 예컨대 하이폭산틴 아미노프테린 티미딘(HAT) 배지 등의 선택 배지를 통해, 동정 및 분리될 수 있다. 다른 예로, 융합된 세포는 CD 마커와 같은, 특이적인 세포 마커의 동정을 통해, 동정 및 분리될 수 있다.
CD 마커 등의 마커의 발현을 토대로 한 세포의 분리와, 특정 세포 타입 또는 표현형인 세포의 동정은, 형광-활성화된 세포 분류(FACS) 방법과 같이, 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 방법에 의해 달성될 수 있음은 자명할 것이다.
또한, 본 발명의 세포는 바람직한 단백질을 코딩하는 DNA로 안정적으로 또는 일시적으로 형질감염될 수 있음이 자명할 것이다. 이러한 안정적이거나 일시적으로 형질감염된 세포는 형질감염에 사용되는 DNA에 선별 리포터 유전자를 포함시키는 등과 같이, 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 방법으로 동정할 수 있다. 이러한 리포터 유전자들은 화합물-결핍 배지에서 형질감염된 세포가 증식할 수 있는 유전자, 예컨대 디하이드로폴레이트 리덕타제 (dhFr) 유전자를 포함할 수 있다. 또한, 리포터는 형질감염된 세포의 가시적인 동정을 부여하는 유전자, 예컨대 루시퍼라제 유전자 또는 그린 플루오레센트 단백질(GFP) 유전자를 포함할 수 있다. 다른 예로, 리포터 유전자는 특정 화합물, 예컨대 G418에 대한 내성을 부여할 수 있다. 이러한 리포터 유전자들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다.
바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 하이브리드 세포는 단일클론 항체의 발현에 이용할 수 있다. 전통적으로, 단일클론 항체 생산은 마우스와 같은 면역화된 동물의 비장으로부터 유래된 B 세포와 골수종 세포의 융합을 통해 수행되고 있다. 그러나, 골수종 세포의 불안정성, 특히 게놈 불안정성으로 인해 바람직한 항체를 만족할 만한 발현 수준 보다 낮게 생산될 수 있다. 부가적으로, 하이브리도마의 제조에 동물 세포가 사용되기 때문에, 만들어지는 항체들은 비-인간 유래의 번역 후 변형을 나타낸다. 비-인간 유래의 번역 후 변형을 보이는 항체들은, 이 항체를 인간 치료제로서 사용하는 경우, 현저한 문제들을 일으킬 수 있다. 이러한 문제들은 항체의 작동자 기능 감소 뿐만 아니라 면역원성의 감소와 그로인한 불충분한 생체내 반감기 및 그에 따른 생체내 효능 감소를 포함할 수 있다. 또한, 골수종 세포를 사용하지 않은 경우에는 하이브리드가 성공적으로 만들어질 수 없음을 시사하는 증거도 있다. 본 발명의 하이브리드 세포는, 놀랍게도, 안정적인 하이브리드를 골수종 세포의 부재시에도 만들 수 있다는 것을 보여주었다. 아울러, 본 발명의 하이드리드 세포로부터 발현되는 항체들은 하이브리도마에 의해 생산되는 단일클론 항체의 사용과 관련된 문제들을 해소시킨다. 이러한 항체는 인간화된 번역 후 변형을 따르며, 기능적인 안정성을 보이는 세포로부터 발현된다.
제1 측면에서, 본 발명은,
줄기 세포 또는 미구속된 기원 세포(uncommitted progenitor cell)로부터 유래된 세포인, 제1 세포;
공통 림프성 기원 세포(common lymphoid progenitor cell) 유래의 제2 세포; 및
공통 림프성 기원 세포 유래의 제3 세포의 하이브리드화에 의해 제조되며, 상기 제1 세포는 골수종 세포가 아닌, 하이브리드 세포를 제공한다.
제1 구현예에서, 상기 제2 세포는 B 림프 계통 유래의 세포이고, 상기 제3 세포는 B 림프 계통 유래의 세포이다.
다른 구현예에서, 상기 제2 세포는 T 림프 계통 유래의 세포이고, 상기 제3 세포는 T 림프 계통으로부터 유래된다.
다른 구현예에서, 상기 제2 세포는 B 림프 계통으로부터 유래된 세포이고, 상기 제3 세포는 T 림프 계통 유래의 세포이다.
바람직하게는, 상기 제1 세포는 공통 골수계 기원 세포로부터 유래된 세포이다. 이처럼, 본 발명은, 1주의, 공통 골수계 기원 세포 또는 줄기 세포, 및 2주의 B 림프계 세포 또는 2주의 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의해 제조되는 하이브리드를 제공한다. 또한, 본 발명은 공통 골수계 기원 세포 또는 줄기 세포, B 림프계 세포 및 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의해 제조되는 하이브리드 세포를 제공한다.
바람직하게는, 상기 공통 골수계 기원 세포 유래의 세포는 골수단핵구 기원 세포, 단핵구, 대식세포, 호산구, 호중구, 수지상 세포 또는 호염기성 세포이다. 이와 같이, 본 발명은, 1주의, 골수단핵구 기원 세포, 단핵구, 대식세포, 호산구, 호중구, 수지상 세포 또는 호염기성 세포, 및 B 림프계 세포 2주 또는 T 림프계 세포 2주의 하이브리드화에 의해 제조되는 하이브리드 세포를 제공한다. 또한, 본 발명은, 골수단핵구 기원 세포, 단핵구, 대식세포, 호산구, 호중구, 수지상 세포 또는 호염기성 세포, B 림프계 세포 및 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의해 제조되는 하이브리드 세포를 제공한다.
바람직하게는, 상기 공통 골수계 기원 세포 유래의 세포는 다음과 같은 CD 항원들, CD16, CD15 또는 CD14 중 한가지 이상을 제시(display)한다. 이처럼, 본 발명은 하기 CD 항원들, CD16, CD15 또는 CD14 중 한가지 이상을 제시하는 공통 골수계 기원 세포 1주와, 2주의 B 림프계 세포 또는 2주의 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의해 제조되는 하이브리드 세포를 제공하는 것이 자명하다. 또한, 본 발명은 CD 항원들, CD16, CD15 또는 CD14 중 한가지 이상을 제시하는 공통 골수계 기원 세포, B 림프계 세포 및 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의해 제조되는 하이브리드 세포를 제공한다.
일 구현예에서, 상기 공통 골수계 기원 세포 유래의 세포는 단핵구이다. 이처럼, 본 발명은, 단핵구 1주와, B 림프계 세포 2주 또는 T 림프계 세포 2주의 하이브리드화에 의해 제조되는 하이브리드 세포를 제공한다. 또한, 본 발명은 단핵구, B 림프계 세포 및 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의해 제조되는 하이브리드 세포를 제공한다.
다른 구현예에서, 상기 공통 골수계 기원 세포 유래의 세포는 일차 골수단핵구 기원 세포이다. 이처럼, 본 발명은 일차 골수단핵구 기원 세포 1주와, B 림프계 세포 2주 또는 T 림프계 세포 2주의 하이브리드화에 의해 제조되는 하이브리드 세포를 제공한다. 본 발명은 일차 골수단핵구 기원 세포, B 림프계 세포 및 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의해 제조되는 하이브리드 세포를 제공한다.
일 구현예에서, 상기 공통 골수계 기원 세포 유래의 세포는 불멸화된 세포이다. 이처럼, 본 발명은 골수단핵구 기원 세포, 단핵구, 대식세포, 호산구, 호중구, 수지상 세포 또는 호염기성 세포로부터 선택되는 불멸화된 세포 1주와, B 림프계 세포 2주 또는 T 림프계 세포 2주의 하이브리드화에 의해 제조되는 하이브리드 세포를 제공함이 분명하다. 본 발명은 또한 골수단핵구 기원 세포, 단핵구, 대식세포, 호산구, 호중구, 수지상 세포 또는 호염기성 세포로부터 선택되는 불멸화된 세포, B 림프계 세포 및 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의해 제조되는 하이브리드 세포를 제공한다.
다른 구현예에서, 상기 공통 골수계 기원 세포 유래의 세포는 비장, 말초 혈액, 제대혈 또는 골수로부터 유래된다. 이처럼, 자명하게, 본 발명은 비장, 말초 혈액, 제대혈 또는 골수로부터 유래되는 공통 골수계 기원 세포 1주와, B 림프계 세포 2주 또는 T 림프계 세포 2주의 하이브리드화에 의해 제조되는 하이브리드 세포를 제공한다. 또한, 본 발명은 비장, 말초 혈액, 제대혈 또는 골수로부터 유래된 공통 골수계 기원 세포, B 림프계 세포 및 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의해 제조되는 하이브리드 세포를 제공한다.
다른 구현예에서, 상기 B 림프 계통으로부터 유래되는 세포는 프리-B 세포, 미성숙 B 세포, 나이브(naive) B 세포, 활성화된 B 세포 또는 작동자 B 세포이다. 이처럼, 자명하게, 본 발명은 공통 골수계 기원 세포 또는 줄기세포 1주와, 프리-B 세포, 미성숙 B 세포, 나이브 B 세포, 활성화된 B 세포 또는 작동자 B 세포로부터 선택되는 림프계 세포 2주의 하이브리드화에 의해 제조되는 하이브리드 세포를 제공한다. 또한, 본 발명은, 공통 골수계 기원 세포 또는 줄기세포; 프리-B 세포, 미성숙 B 세포, 나이브 B 세포, 활성화된 B 세포 또는 작동자 B 세포로부터 선택되는 B 림프계 세포; 및 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의해 제조되는 하이브리드 세포를 제공한다.
일 구현예에서, 상기 작동자 B 세포는 항원-경험한 B 세포 또는 형질 세포(plasma cell)이다. 이처럼, 본 발명은 공통 골수계 기원 세포 또는 줄기 세포 1주와, 항원-경험한 B-세포 또는 형질 세포로부터 선택되는 B 림프계 세포 2주의 하이브리드화에 의해 제조되는 하이브리드 세포를 제공한다. 또한, 본 발명은, 공통 골수계 기원 세포 또는 줄기 세포; 항원-경험한 B-세포 또는 형질 세포; 및 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의해 제조되는 하이브리드 세포를 제공한다.
일 구현예에서, 상기 B 림프 계통으로부터 유래되는 세포는 하기 CD 항원들 중 하나, 예컨대 CD19, CD20, CD72 또는 CD5를 제시한다. 이처럼, 본 발명은 공통 골수계 기원 세포 또는 줄기 세포 1주와, 하기 CD 항원들 중 하나, 예컨대 CD19, CD20, CD72 또는 CD5를 제시하는 B 림프계 세포 2주의 하이브리드화에 의해 제조되는 하이브리드 세포를 제공한다. 또한, 본 발명은 공통 골수계 기원 세포 또는 줄기 세포; 하기 CD 항원들 중 하나, 예컨대 CD19, CD20, CD72 또는 CD5를 제시하는 B 림프계 세포; 및 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의해 제조되는 하이브리드 세포를 제공한다.
일 구현예에서, 상기 T 림프 계통으로부터 유래된 상기 세포는 프리-T 세포, 미성숙 T 세포, 나이브 T 세포, 활성화된 T 세포 또는 작동자 T 세포이다. 이처럼, 본 발명은 공통 골수계 기원 세포 또는 줄기 세포; B 림프계 세포; 및 프리-T 세포, 미성숙 T 세포, 나이브 T 세포, 활성화된 T 세포 또는 작동자 T 세포로부터 선택되는 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의해 제조되는 하이브리드 세포를 제공한다. 또한, 본 발명은, 공통 골수계 기원 세포 또는 줄기 세포 1주와, 프리-T 세포, 미성숙 T 세포, 나이브 T 세포, 활성화된 T 세포 또는 작동자 T 세포로부터 선택되는 T 림프계 세포 2주의 하이브리드화에 의해 제조되는 하이브리드 세포를 제공한다.
일 구현예에서, 상기 T 림프 계통으로부터 유래된 세포는 하기 CD 항원들 CD3, CD4, CD5 또는 CD8 중 한가지 이상을 제기한다. 이처럼, 본 발명은 공통 골수계 기원 세포 또는 줄기 세포; B 림프계 세포; 및 하기 CD 항원들 CD3, CD4, CD5 또는 CD8 중 한가지 이상을 제시하는 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의해 제조되는 하이브리드 세포를 제공한다. 또한, 본 발명은 공통 골수계 기원 세포 또는 줄기 세포 1주와, 하기 CD 항원들 CD3, CD4, CD5 또는 CD8 중 한가지 이상을 제시하는 T 세포로부터 선택되는 T 림프계 세포 2주의 하이브리드화에 의해 제조되는 하이브리드 세포를 제공한다.
일 구현예에서, 상기 B 림프 계통으로부터 유래되는 상기 세포는 불멸화된 세포이다. 이처럼, 본 발명은 공통 골수계 기원 세포 또는 줄기 세포 1주와, 1주 이상이 불멸 세포일 수 있는 B 림프계 세포 2주의 하이브리드화에 의해 제조되는 하이브리드 세포를 제공한다. 또한, 본 발명은 공통 골수계 기원 세포 또는 줄기 세포; 불멸성 B 림프계 세포; 및 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의해 제조되는 하이브리드 세포를 제공한다.
일 구현예에서, 상기 T 림프 계통으로부터 유래된 세포는 불멸화된 세포이다. 이처럼, 본 발명은 공통 골수계 기원 세포 또는 줄기 세포; B 림프계 세포; 및 불멸 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의해 제조되는 하이브리드 세포를 제공한다.
일 구현예에서, 상기 B 림프 계통으로부터 유래되는 세포는 림프계 조직으로부터 유래된다. 이처럼, 본 발명은 공통 골수계 기원 세포 또는 줄기 세포 1주와, 림프계 조직으로부터 유래된 B 림프계 세포 2주의 하이브리드화에 의해 제조되는 하이브리드 세포를 제공한다. 또한, 본 발명은 공통 골수계 기원 세포 또는 줄기 세포, 림프계 조직으로부터 유래된 B 림프계 세포 및 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의해 제조되는 하이브리드 세포를 제공한다.
일 구현예에서, 상기 T 림프 계통으로부터 유래된 상기 세포는 림프계 조직으로부터 유래된다. 이처럼, 본 발명은 공통 골수계 기원 세포 또는 줄기 세포, B　림프계 세포 조직 및 림프계 조직 유래의 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의해 제조되는 하이브리드 세포를 제공한다.
본 발명의 하이브리드 세포에 포함되는 B 또는 T 림프계 세포들이 림프계 조직으로부터 유래되는 경우, 상기 림프계 조직은 바람직하게는 말초 혈액, 제대혈, 비장, 골수, 흉선, 편도선, 아데노이드(adenoid) 및 국소 림프절(regional lymph node)로부터 선택된다.
일 구현예에서, 본 발명의 하이브리드 세포의 제조에 사용되는 세포들 중 1주 이상의 인간 세포이다. 또한, 일 구현에에서, 본 발명의 하이브리드 세포는 1주 이상의 마우스 세포를 포함할 수 있음이 자명하다.
일 구현예에서, 상기 공통 골수계 기원 세포 유래의 세포는 K562 세포이다. 이처럼, 본 발명은 K562 세포 1주와 B 림프계 세포 2주의 하이브리드화에 의해 제조되는 하이브리드 세포를 제공함이 자명할 것이다. 또한, 본 발명은 K562 세포, 불멸성 B 림프계 세포 및 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의해 제조되는 하이브리드 세포를 제공한다.
일 구현예에서, 상기 제2 세포 또는 상기 제3 세포는 WIL2-NS 세포 또는 MOLT4 세포이다. 이처럼, 본 발명은 공통 골수계 기원 세포 또는 줄기 세포, WIL2-NS 세포 및 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의해 제조되는 하이브리드 세포를 제공함이 자명할 것이다. 또한, 본 발명은 공통 골수계 기원 세포 또는 줄기 세포, B 림프계 세포 및 MOLT4 세포의 하이브리드화에 의해 제조되는 하이브리드 세포를 제공한다.
일 구현예에서, 상기 제1 세포는 K562 세포이고, 제2 세포는 WIL2-NS 세포이고, 제3 세포는 MOLT4 세포이다.
다른 구현예에서, 상기 제1 세포는 K562 세포이고, 상기 제2 세포는 일차 B 세포이고, 상기 제3 세포는 일차 T 세포이다.
다른 구현예에서, 상기 제1 세포는 일차 인간 단핵구이고, 상기 제2 세포는 WIL2-NS 세포이고, 상기 제3 세포는 일차 T 세포이다.
다른 구현예에서, 상기 제1 세포는 일차 인간 골수단핵구 기원 세포이고, 상기 제2 세포는 WIL2-NS 세포이고, 상기 제3 세포는 일차 인간 T 세포이다.
다른 구현예에서, 상기 제1 세포는 K562 세포이고, 상기 제2 세포는 WIL2-NS 세포이고, 상기 제3 세포는 일차 T 세포이다.
다른 구현예에서, 상기 제1 세포는 일차 단핵구이고, 상기 제2 세포는 WIL2-NS 세포이고, 상기 제3 세포는 WIL2-NS 세포이다.
다른 구현예에서, 상기 제1 세포는 일차 마우스 단핵구이고, 상기 제2 세포는 SP2 세포이고, 상기 제3 세포는 일차 마우스 T 세포이다.
다른 구현예에서, 상기 제1 세포는 일차 마우스 단핵구이고, 상기 제2 세포는 SP2 세포이고, 상기 제3 세포는 SP2 세포이다.
다른 구현예에서, 상기 제1 세포는 일차 인간 또는 마우스 단핵구이고, 상기 제2 세포는 WIL2-NS 세포이고, 상기 제3 세포는 SP2 세포이다.
일 구현예에서, 본 발명의 하이브리드 세포는 바람직한 단백질을 발현한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 하이브리드 세포는 2종 이상의 바람직한 단백질을 발현한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 하이브리드 세포는 2종의 바람직한 단백질을 발현한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 하이브리드 세포는 3종의 바람직한 세포를 발현한다. 일 구현예에서, 상기 바람직한 단백질은 내인성 단백질이고, 2종 이상의 바람직한 단백질이 발현되는 경우, 바람직한 단백질들 중 하나 이상이 내인성 단백질이다. 다른 구현예에서, 상기 단백질은 재조합 단백질이고, 2종 이상의 바람직한 단백질이 발현되는 경우, 바람직한 단백질들 중 하나 이상이 재조합 단백질이다. 바람직하게는, 상기 단백질은 사이토카인, 예컨대 콜로니 자극 인자 또는 인터루킨이다. 일 구현예에서, 상기 단백질은 GM-CSF이다. 다른 구현예에서, 상기 단백질은 인터루킨 2이다. 또다른 구현예에서, 상기 단백질은 수용체 또는 이의 단편이다. 일 구현예에서, 상기 단백질은 가용성 수용체이다. 다른 구현예에서, 상기 단백질은 면역글로불린이다.
일 구현예에서, 상기 단백질은 인간 IL-4 수용체 알파 체인이다. 다른 구현예에서 상기 단백질은 IgM이다. 또다른 구현예에서, 상기 단백질은 IgG이다. 또 다른 구현예에서, 상기 단백질은 CD54이다.
일 구현예에서, 본 발명의 하이브리드 세포가 2종 이상의 바람직한 단백질을 발현하는 경우, 바람직하게는 바람직한 단백질은 사이토카인, 콜로니 자극 인자, 인터루킨, 수용체 또는 이의 단편으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 바람직한 단백질은 IgM 등의 면역글로불린, 특히 인간 가용성 IgM; 사이토카인, 예컨대 인터루킨, 특히 인터루킨-2 (IL-2), 보다 구체적으로, 인간 IL-2; 및/또는 수용체, 특히 인터루킨 수용체, 보다 구체적으로, 인간 인터루킨 수용체, 보다 더 구체적으로 인간 인터루킨-4 수용체 알파(IL-4Ra)이다.
당업자라면, 본 발명의 하이브리드 세포가 특정 바람직한 단백질의 발현으로 한정되지 않거나, 또는 특정 수의 단백질의 발현으로 한정되지 않음을 이해할 것이다. 아울러, 당업자라면, 본 발명의 하이브리드 세포로부터의 바람직한 단백질의 자발적인 발현이 바람직한 단백질의 발현 수준을 강화시킬 수 있음을, 명확하게 이해할 것이다.
일 구현예에서, 본 발명의 하이브리드 세포의 제조에 사용되는 상기 하이브리드화는 전기적 수단에 의해 달성된다. 다른 구현예에서, 본 발명의 하이브리드 세포를 제조하기 위한 상기 하이브리드화는 화학적 수단에 의해 달성된다.
일 구현예에서, 본 발명의 하이브리드 세포는 대상 단백질을 발현하는 세포와 추가적으로 하이브리드화된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 하이브리드 세포는 CD25 항원을 제시하는 B 림프구와 하이브리드화된다.
일 특정한 바람직한 구현예에서, 본 발명의 하이브리드 세포는 CD25 항원을 제시하며, 면역글로불린을 발현한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 하이브리드 세포는 CD25 항원을 제시하는 B 림프구와 하이브리드화되며, 제조되는 세포는 면역글로불린을 발현한다.
일 구현예에서, 본 발명의 하이브리드 세포의 제조에 사용되는 상기 하이브리드화는 개별 세포 3주를 하이브리드화함으로써 수행된다.
다른 구현예에서, 본 발명의 하이브리드 세포의 제조에 사용되는 상기 하이브리드화는, 상기 각각 세포 집단이 동일한 세포 타입 또는 표현형을 포함하는, 3가지의 세포 집단을 이용하여 수행된다.
일 구현예에서, 본 발명의 상기 하이브리드 세포는 바람직한 번역 후 변형 또는 바람직한 기능성을 나타내는 단백질의 발현을 허용하기 위한 개개 세포 타입을 규정하는 마커에 대해 농화(enrich)된다.
다른 측면에서, 본 발명은, 본 발명에 따른 하이브리드 세포에서 단백질을 발현하는 단계를 포함하는, 단백질 생산 방법을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 하이브리드 세포에서 생산되는 단백질을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은,
줄기 세포 또는 미구속된 기원 세포(uncommitted progenitor cell)로부터 유래된 세포인, 제1 세포;
공통 림프성 기원 세포(common lymphoid progenitor cell) 유래의 제2 세포; 및
공통 림프성 기원 세포 유래의 제3 세포를 하이브리드화하는 단계를 포함하며, 상기 제1 세포는 골수종 세포가 아닌, 본 발명에 따른 하이브리드 세포의 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 따른 일 구현예에서, 상기 제2 세포는 B 림프 계통 유래의 세포이고, 상기 제3 세포는 B 림프 계통 유래의 세포이다.
본 발명의 방법에 대한 다른 구현예에서, 상기 제2 세포는 T 림프 계통 유래의 세포이고, 상기 제3 세포는 T 림프 계통으로부터 유래된다.
본 발명의 방법에 대한 다른 구현예에서, 상기 제2 세포는 B 림프 계통 유래의 세포이고, 상기 제3 세포는 T 림프 계통 유래의 세포이다.
바람직하게는, 상기 제1 세포는 공통 골수계 기원 세포로부터 유래된 세포이다. 이처럼, 자명하게, 본 발명은 공통 골수계 기원 세포 또는 줄기 세포 1주와, B 림프계 세포 2주 또는 T 림프계 세포 2주의 하이브리드화에 의해 하이브리드 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 공통 골수계 기원 세포 또는 줄기 세포, B 림프계 세포 및 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의해 하이브리드 세포를 생산하는 방법을 제공한다.
바람직하게는, 공통 골수계 기원 세포로부터 유래된 상기 세포는, 골수단핵구 기원 세포, 단핵구, 대식세포, 호산구, 호중구, 수지상 세포 또는 호염기성 세포이다. 이처럼, 자명하게, 본 발명은 골수단핵구 기원 세포, 단핵구, 대식세포, 호산구, 호중구, 수지상 세포 또는 호염기성 세포 1주와, B 림프계 세포 2주 또는 T 림프계 세포 2주의 하이브리드화에 의한 하이브리드 세포의 생산 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 골수단핵구 기원 세포, 단핵구, 대식세포, 호산구, 호중구, 수지상 세포 또는 호염기성 세포, B 림프계 세포 및 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의한, 하이브리드 세포의 생산 방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 공통 골수계 기원 세포로부터 유래된 세포는 하기 CD 항원들, CD16, CD15 또는 CD14 중 하나 이상을 제시한다. 이처럼, 자명하게도, 본 발명은, 하기 CD 항원들, CD16, CD15 또는 CD14 중 하나 이상을 제시하는 공통 골수계 기원 세포 1주와, B 림프계 세포 2주 또는 T 림프계 세포 2주의 하이브리드화에 의한 하이브리드 세포의 생산 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은, 하기 CD 항원들, CD16, CD15 또는 CD14 중 하나 이상의 제시하는 공통 골수 기원 세포, B 림프계 세포 및 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의한, 하이브리드 세포의 생산 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 공통 골수계 기원 세포 유래의 상기 세포는 단핵구이다. 이처럼, 본 발명은 단핵구 1주와, B 림프계 세포 2주 또는 T 림프계 세포 2주의 하이브리드화에 의한 하이브리드 세포의 생산 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 단핵구, B 림프계 세포 및 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의한 하이브리드 세포의 생산 방법을 제공한다.
다른 구현예에서, 공통 골수계 기원 세포 유래의 상기 세포는 일차 골수단핵구 기원 세포이다. 이처럼, 본 발명은 일차 골수단핵구 기원 세포 1주와, B 림프계 세포 2주 또는 T 림프계 세포 2주의 하이브리드화에 의한 하이브리드 세포의 생산 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 일차 골수단핵구 기원 세포, B 림프계 세포 및 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의한 하이브리드 세포의 생산 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 공통 골수계 기원 세포 유래의 상기 세포는 불멸화된 세포이다. 이처럼, 자명하게, 본 발명은 골수단핵구 기원 세포, 단핵구, 대식세포, 호산구, 호중구, 수지상 세포 또는 호염기성 세포로부터 선택되는 불멸화된 세포 1주와, B 림프계 세포 2주 또는 T 림프계 세포 2주의 하이브리드화에 의한 하이브리드 세포의 생산 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 골수단핵구 기원 세포, 단핵구, 대식세포, 호산구, 호중구, 수지상 세포 또는 호염기성 세포로부터 선택되는 불멸화된 세포, B 림프계 세포 및 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의한 하이브리드 세포의 생산 방법을 제공한다.
다른 구현예에서, 공통 골수계 기원 세포 유래의 상기 세포는 비장, 말초 혈액, 제대혈 또는 골수로부터 유래된다. 이처럼, 자명하게, 본 발명은, 비장, 말초 혈액, 제대혈 또는 골수 유래의 공통 골수계 기원 세포 1주와, B 림프계 세포 2주 또는 T 림프계 세포 2주의 하이브리드화에 의한 하이브리드 세포의 생산 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 비장, 말초 혈액, 제대혈 또는 골수로부터 유래된 골통 골수계 기원 세포, B 림프계 세포 및 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의한 하이브리드 세포의 생산 방법을 제공한다.
다른 구현예에서, B 림프 계통으로부터 유래되는 상기 세포는 프리-B 세포, 미성숙 B 세포, 나이브 B 세포, 활성화된 B 세포 또는 작동자 B 세포이다. 이처럼, 자명하게, 본 발명은 공통 골수계 기원 세포 또는 줄기 세포 1주와, 프리-B 세포, 미성숙 B 세포, 나이브 B 세포, 활성화된 B 세포 또는 작동자 B 세포로부터 선택되는 B 림프계 세포 2주의 하이브리드화에 의한 하이브리드 세포의 생산 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 공통 골수계 기원 세포 또는 줄기 세포; 프리-B 세포, 미성숙 B 세포, 나이브 B 세포, 활성화된 B 세포 또는 작동자 B 세포; 및 T 림프계 세포로부터 선택되는 B 림프계 세포의 하이브리드화에 의한 하이브리드 세포의 생산 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 상기 작동자 B 세포는 항원-경험한 B 세포 또는 형질 세포이다. 이처럼, 본 발명은 공통 골수계 기원 세포 또는 줄기 세포 1주와, 항원-경험한 B-세포 또는 형질 세포로부터 선택되는 B 림프계 세포 2주의 하이브리드화에 의한 하이브리드 세포의 생산 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 공통 골수계 기원 세포 또는 줄기 세포; 항원-경험한 B-세포 또는 형질 세포; 및 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의한 하이브리드 세포의 생산 방법을 제공한다.
일 구현예에서, B 림프 계통으로부터 유래되는 상기 세포는 하기 CD 항원들 중 하나, 예컨대 CD19, CD20, CD72 또는 CD5를 제시한다. 이처럼, 본 발명은 공통 골수계 기원 세포 또는 줄기 세포 1주와, 하기 CD 항원들 중 하나, 예컨대 CD19, CD20, CD72 또는 CD5를 제시하는 B 림프계 세포 2주의 하이브리드화에 의한 하이브리드 세포의 생산 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 공통 골수계 기원 세포 또는 줄기 세포; 하기 CD 항원들 중 하나, 예컨대 CD19, CD20, CD72 또는 CD5를 제시하는 B 림프계 세포; 및 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의한 하이브리드 세포의 생산 방법을 제공한다.
일 구현예에서, T 림프 계통으로부터 유래된 상기 세포는 프리-T 세포, 미성숙 T 세포, 나이브 T 세포, 활성화된 T 세포 또는 작동자 T 세포이다. 이처럼, 본 발명은 공통 골수계 기원 세포 또는 줄기 세포; B 림프계 세포; 및 프리-T 세포, 미성숙 T 세포, 나이브 T 세포, 활성화된 T 세포 또는 작동자 T 세포로부터 선택되는 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의한 하이브리드 세포의 생산 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 공통 골수계 기원 세포 또는 줄기 세포 1주와, 프리-T 세포, 미성숙 T 세포, 나이브 T 세포, 활성화된 T 세포 또는 작동자 T 세포로부터 선택되는 T 림프계 세포 2주의 하이브리드화에 의한 하이브리드 세포의 생산 방법을 제공한다.
일 구현예에서, T 림프 계통으로부터 유래된 상기 세포는 하기 CD 항원들 CD3, CD4, CD5 또는 CD8 중 한가지 이상을 제시한다. 이처럼, 본 발명은 공통 골수계 기원 세포 또는 줄기 세포, B 림프계 세포, 및 하기 CD 항원들 CD3, CD4, CD5 또는 CD8 중 한가지 이상을 제시하는 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의한 하이브리드 세포의 생산 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 공통 골수계 기원 세포 또는 줄기 세포 1주와, 하기 CD 항원들 CD3, CD4, CD5 또는 CD8 중 한가지 이상을 제시하는 T 세포들로부터 선택되는 T 림프계 세포 2주의 하이브리드화에 의한 하이브리드 세포의 생산 방법을 제공한다.
일 구현예에서, B 림프 계통으로부터 유래되는 상기 세포는 불멸화된 세포이다. 이처럼, 본 발명은 공통 골수계 기원 세포 또는 줄기 세포 1주와, 1주 이상이 불멸화된 세포일 수 있는 B 림프계 세포 2주의 하이브리드화에 의한 하이브리드 세포의 생산 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 공통 골수계 기원 세포 또는 줄기 세포, 불멸성 B 림프계 세포 및 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의한 하이브리드 세포의 생산 방법을 제공한다.
일 구현예에서, T 림프 계통으로부터 유래된 상기 세포는 불멸화된 세포이다. 이처럼, 본 발명은 공통 골수계 기원 세포 또는 줄기 세포, B 림프계 세포, 및 불멸성 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의한 하이브리드 세포의 생산 방법을 제공한다.
일 구현예에서, B 림프 계통으로부터 유래되는 상기 세포는 림프계 조직으로부터 유래된다. 이처럼, 본 발명은 공통 골수계 기원 세포 또는 줄기 세포 1주와, 림프계 조직으로부터 유래된 B 림프계 세포 2주의 하이브리드화에 의한 하이브리드 세포의 생산 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 공통 골수계 기원 세포 또는 줄기 세포, 림프계 조직으로부터 유래된 B 림프계 세포 및 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의한 하이브리드 세포의 생산 방법을 제공한다.
일 구현예에서, T 림프 계통으로부터 유래된 상기 세포는 림프계 조직으로부터 유래된다. 이처럼, 본 발명은 공통 골수계 기원 세포 또는 줄기 세포, B　림프계 세포 조직 및 림프계 조직으로부터 유래된 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의한 하이브리드 세포의 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 하이브리드 세포 생산 방법에 포함되는 B 또는 T 림프계 세포가 림프계 조직으로부터 유래되는 경우, 상기 림프계 조직은 바람직하게는 말초 혈액, 제대혈, 비장, 골수, 흉선, 편도선, 아데노이드 및 국소 림프절로부터 선택된다.
일 구현예에서, 본 발명의 하이브리드 세포의 생산 방법에 사용되는 세포 1주 이상은 인간 세포이다. 또한, 일 구현예에서, 본 발명의 하이브리드 세포의 생산 방법은 1주 이상의 마우스 세포를 사용함이, 자명할 것이다.
일 구현예에서, 공통 골수계 기원 세포 유래의 상기 세포는 K562 세포이다. 이처럼, 본 발명은 K562 세포 1주와 B 림프계 세포 2주의 하이브리드화에 의한 하이브리드 세포의 생산 방법을 제공함이 자명할 것이다. 또한, 본 발명은 K562 세포, 불멸성 B 림프계 세포 및 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의한 하이브리드 세포의 생산 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 상기 제2 세포 또는 상기 제3 세포는 WIL2-NS 세포 또는 MOLT4 세포이다. 이처럼, 본 발명은 공통 골수계 기원 세포 또는 줄기 세포, WIL2-NS 세포 및 T 림프계 세포의 하이브리드화에 의한 하이브리드 세포의 생산 방법을 제공함이 자명할 것이다. 또한, 본 발명은 공통 골수계 기원 세포 또는 줄기 세포, B 림프계 세포 및 MOLT4 세포의 하이브리드화에 의한 하이브리드 세포의 생산 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 상기 제1 세포는 K562 세포이고, 상기 제2 세포는 WIL2-NS 세포이고, 상기 제3 세포는 MOLT4 세포이다.
본 발명의 방법에 대한 다른 구현예에서, 상기 제1 세포는 K562 세포이고, 상기 제2 세포는 일차 B 세포이고, 상기 제3 세포는 일차 T 세포이다.
본 발명의 방법에 대한 다른 구현예에서, 상기 제1 세포는 일차 인간 단핵구이고, 상기 제2 세포는 WIL2-NS 세포이고, 상기 제3 세포는 일차 T 세포이다.
본 발명의 방법에 대한 다른 구현예에서, 상기 제1 세포는 일차 인간 골수단핵구 기원 세포이고, 상기 제2 세포는 WIL2-NS 세포이고, 상기 제3 세포는 일차 인간 T 세포이다.
본 발명의 방법에 대한 다른 구현예에서, 상기 제1 세포는 K562 세포이고, 상기 제2 세포는 WIL2-NS 세포이고, 상기 제3 세포는 일차 T 세포이다.
본 발명의 방법에 대한 다른 구현예에서, 상기 제1 세포는 일차 단핵구이고, 상기 제2 세포는 WIL2-NS 세포이고, 상기 제3 세포는 WIL2-NS 세포이다.
본 발명의 방법에 대한 다른 구현예에서, 상기 제1 세포는 일차 마우스 단핵구이고, 상기 제2 세포는 SP2 세포이고, 상기 제3 세포는 일차 마우스 T 세포이다.
본 발명의 방법에 대한 다른 구현예에서, 상기 제1 세포는 일차 마우스 단핵구이고, 상기 제2 세포는 SP2 세포이고, 상기 제3 세포는 SP2 세포이다.
본 발명의 방법에 대한 다른 구현예에서, 상기 제1 세포는 일차 인간 또는 마우스 단핵구이고, 상기 제2 세포는 WIL2-NS 세포이고, 상기 제3 세포는 SP2 세포이다.
정의
본 발명에서, 용어 "포함한다", "포함하는" 등은 배타적인 의미와는 반대되는 포괄적인 의미로 해석되며, 즉 "포함하나, 제한되지 않는" 의미이다.
하이브리드 세포
하이브리드 세포는 2 이상의 게놈 (접합체(zygote) 및 이의 유도체 이외)으로부터 유래된 구성 성분을 포함하는 세포이다. 이는 예컨대 2종 이상의 생물 세포(모 세포)의 체세포 하이브리드화(또는 전 세포 하이브리드화)로 구축된 세포이다. 모 세포는 동일 계통(또는 종) 또는 상이한 계통(또는 종) 중 어느 하나로부터 수득할 수 있다. 동일 계통 및 종으로부터 제조된 하이브리드 세포는 동종(auto)-하이브리드로 불리지만, 상이한 계통들의 하이브리드 세포는 이종-하이브리드라고 한다.
키메라 세포
키메라 세포는 2종 이상의 종으로부터 기원하는 게놈을 가진 인공적으로 제조된 하이브리드 세포이다.
교차-계통 하이브리드 세포
교차-계통 하이브리드 세포는 상이한 세포 계통들로부터 유래된 2 이상의 세포에서 기원하는 게놈을 가진 인공적으로 제조된 하이브리드 세포이다. 조혈 세포는 2종의 주요 계통으로 분류된다: 림프계(T 세포, B 세포 및 NK 세포) 및 골수계(단핵구 및 대식세포, 호중구, 호염기구 및 호산구, 에리트로사이트, 거핵구/혈소판, 수지상 세포).
트리-하이브리드 세포
트리-하이브리드 세포는 3가지 세포로부터 기원하는 게놈을 가진 인공적으로 제조된 하이브리드 세포이다.
안정적인
세포를 언급할 때, 용어 "안정적인"은 주어진 성장 또는 생산성 파라미터의 일관성 또는 세대 수 증가에 따른 세포주의 생산 특징의 일관성을 보여주는 세포의 능력을 의미한다. 안정적인 형질감염 언급시에 사용되는 경우, 이 용어는 실질적으로 무기한 비교적 일정한 수준으로 트랜스-유전자를 발현하는 세포를 지칭한다.
체세포 하이브리드화
본원에서, 용어 "체세포 하이브리드화"는, 세포의 원형질막이 충분히 접촉되어, 접촉 지점에서 모 세포의 원형질막이 동시에 가역적으로 파괴되고, 각 모 세포의 세포 기관 또는 전체가 새롭게 형성된 단일 세포의 외막 안에서 조합되도록 유도하는 방식으로 하나의 단일 생존 세포가 2 이상의 이배체(비-배우자) 세포(모 세포)로부터 제조되는 과정을 지칭한다. 새롭게 형성된 단일 세포는 하이브리드화된 세포 또는 하이브리드 세포라고 불리운다.
줄기 세포
용어 "줄기 세포"는, 유사분열에 의해 분열되어 다양한 여러가지 세포 타입으로 발생되는 능력을 가진, 비특정화된 세포를 지칭한다. 줄기 세포는 배아 줄기 세포, 제대혈 유래의 "성체" 줄기 세포 또는 성체 유래 줄기 세포를 포함할 수 있다. 줄기 세포는 모든 세포 타입으로 분화되는 무제한적인 능력을 가진 세포, 즉 전능 세포(totipotent cell)를 포함한다. 또한, 줄기 세포는 특수화된 세포로 분화하는 능력에 제한이 있는 세포, 예컨대 만능(pluripotent), 다능(multipotent), 올리고포텐트(oligopotent) 또는 유니포텐트(unipotent) 줄기 세포를 포함할 수 있다.
불멸화된 세포
용어 "불멸화된 세포"는 무한정 증식하는 능력을 가지고 있는 세포를 지칭한다. 불멸화된 세포는 생체내 악성 종양 또는 배아로부터 유래될 수 있다. 다른 예로, 불멸화된 세포는 무한정 증식하는 능력을 유도하는 작용을 세포에서 수행함으로써 유도할 수 있다. 이러한 작용들로는, 예컨대 시험관내 형질전환 프로세스, 예컨대 엡스타인 바 바이러스(EBV), 유인원 바이러스 40(SV40) T 항원, 아데노바이러스 E1A 및 E1B, 및 인간 파필로마바이러스(HPV) E6 및 E7과 같은 바이러스 유전자의 도입을 포함할 수 있다. 다른 예로, 불멸화된 세포는 텔러머라제 역전사효소 단백질(TERT)의 발현을 통해 또는 그외 수단을 통해 세포로부터 유도될 수 있다. 또한, 불멸화된 세포는 온고진 발현이 변형된 세포로부터 유도될 수도 있다. 불멸화된 세포는 비제한적인 예로서 UV 노출 또는 불멸성 기전이 미확인된 자발적인 형질전환 등의 무한 증식력을 유도하는 모든 작용으로 유도될 수 있다.
골수종 세포
용어 "골수종 세포"는 악성 형질 세포를 지칭한다.
하이브리도마
용어 "하이브리도마"는 골수종 세포와 면역화된 동물의 비장에서 수득한 B 세포의 하이브리드화에 의해 제조되는 세포를 지칭한다. 하이브리도마는 단일클론 항체 생산력을 가진 불멸화된 세포이다.
미구속된 기원 세포
용어 "미구속된 기원 세포"는 어떠한 특정한 계통으로 구속되어 있지 않지만 한정된 세포 타입들로만 분화될 수 있고 더이상 자신을 갱신(renew)시킬 수 없는, 줄기 세포의 첫 후손을 지칭한다.
공통 골수계 기원 세포
공통 골수계 기원 세포는 골수 계통으로 제한되며, 림프계 세포가 아닌 거핵구/적혈구 또는 과립구/대식세포 기원 세포 중 하나가 될 수 있는 조혈 줄기 세포의 후대이다.
공통 림프계 기원 세포
공통 림프계 기원 세포는 림프 계통으로 한정되며, 골수계 세포가 아닌 B, T 및 천연 살상 세포가 되는, 조혈 줄기 세포의 후대이다.
B 림프 계통-유래 세포
B 림프 계통-유래 세포는 공통 림프계 기원 세포에서 기원한 것으로 추후 임의 타입의 B 세포가 되는 것으로 구속된(committed) 임의의 세포이다.
T 림프 계통-유래 세포
T 림프 계통-유래 세포는 공통 림프계 기원 세포로부터 기원한 것으로 추후 임의 타입의 T 세포가 되는 것으로 구속된 임의의 세포이다.
과립구-대식세포 기원 세포
과립구-대식세포 기원 세포는 공통 골수계 기원 세포로부터 기원하며, 거핵구 및 적혈구가 아닌 과립구 및 단핵구 계통으로 구속된 기원 세포이다.
거핵구-적혈구 기원 세포
거핵구-적혈구 기원 세포는 공통 골수계 기원 세포로부터 기원하며, 과립구 및 단핵구 계통이 아닌 거핵구 및 적혈구 계통으로 구속된 기원 세포이다.
프리-B 세포
프리-B-세포는 막에 결합된 IgM의 중쇄가 서로게이트(surrogate) 경쇄와 함께 발현되는 단계에 있는 분화 중인 B 세포이다.
미성숙 B 세포
미성숙 B 세포는 항체의 재조합 단계에서 L 체인에서 위치 VJ의 재정렬과 H 체인에서 VDJ의 재정렬이 이루어지고, IgM 수용체 발현이 나타나는, 골수에서 분화 중인 B 세포를 지칭한다.
나이브 B 세포
나이브 B 세포는 분화되고 골수에서의 표면 면역글로불린의 랜덤 유전자 재정렬을 통해 성숙화되었지만, 아직 말초에서 동종 항원을 만나지 않은 성숙 B 세포이다.
활성화된 B 세포
말초에서 BCR을 통한 항원 인지를 통해 이의 동종 항원을 만나, 클론 증식과 T-의존성 또는 비의존성 방식으로 형질 세포로의 최종 분화가 이루어진, 성숙 타입의 B 세포.
작동자 B 세포
작동자 B 세포는, 특정 항원에 특이적인 항체 뿐만 아니라 면역계의 다른 세포를 끌어들이는 다수의 사이토카인을 분비하는 수명이 짧은 B 세포 타입으로, 항체 분비성 형질 세포와 동의어이다.
기억 B-세포
기억 B 세포는 1차 면역 반응시에 만난 항원에 특이적이며, 동일한 항원에 2차 노출되었을 때 신속하게 반응할 수 있는, 활성화된 B 세포로부터 형성된 수명이 긴 B 세포이다.
형질 세포
형질 세포는, CD4+ 림프구 (Th 세포)에 의해 자극받아 B 세포로부터 분화되어 다량의 항체를 분비하는, 마지막 유사 분열이 완료된 수명이 짧은 면역계 세포이다
프리-T 세포
프리-T 세포는 VbDbJb가 완전히 갖추어지고 TCR 베타 체인이 2중 음성(CD4-CD8-) T 세포 (CD3+)에서 발현되는 단계에 있는, 분화 중인 T 세포이다.
미성숙 T 세포
미성숙 T 세포는, 골수에서 흉선으로 이동하였지만 이의 TCR의 재-정렬이나 또는 자가-주 조직적합 복합체(MHC) 분자에 제시되는 자기-펩타이드에 대한 이의 TCR의 결합력에 대한 선별이 완료되지 않았거나, 또는 MHC 클래스 I 또는 II 분자 각각에 대한 세포의 TCR 특이성과 정확하게 연관되는 T 킬러 또는 T 헬퍼 계통으로 구속되어진, 분화 중인 T 세포이다. 계통 구속(lineage commitment)은 공동-수용체 분자, CD8 또는 CD4 중 하나의 발현 감소에 의해 표현형으로 표시된다.
나이브 T 세포
골수에서 분화된 다음 흉선에서 주된 양성 및 음성 선별 과정, 이의 TCR 재-정렬 및 공동-수용체 분자 중 하나를 소실하는 과정을 성공적으로 거쳤지만, 아직 말초에서 동종 항원을 만나지 않은, 성숙형 T 세포.
활성화된 T 세포
활성화된 T 세포는, TCR이, 주 조직적합성 복합체 펩타이드(펩타이드:MHC 복합체)에 의한 세포 표면 상의 CD28 및 항원 제시 세포 상의 B7 패밀리 멤버 각각과의 결속을 통해, 항원-특이적인 작동자 T 세포가 되게 작동되는, T 세포이다.
작동자 T 세포
작동자 T 세포는 세포에 대해 적합한 펩타이드:MHC 복합체를 가지고 있는 세포와 접촉한 즉시 반응할 수 있는 수명이 짧은 T 림프구 타입이다.
도 1. 동정 및 분류-정제된 CD71+ K562 세포.
도 2. CD15 및 CD71 양성인 K562 세포의 FACS 프로파일들; (a) 오리지날 CD71-농화된 K562 세포 집단에서 약 18%는 CD15(R1 영역) 양성이며, (b) 이후 2달 배양한 후 CD15 양성 K562 세포의 재-분석 결과.
도 3. CD34+ AML 단핵 세포 상에서의 CD15의 발현.
도 4. CD14 자기 비드(MACS)에 의해 분리한 여러가지 CD14+ 세포 집단에 대한 CD16 FACS 프로파일 및 분류 게이트(sorting gate).
도 5. 마우스 항-인간 CD19 및 마우스 항-인간 CD5 항체로 착색된 제대혈 단핵 세포의 FACS 프로파일.
도 6. 마우스 항-인간 CD3 및 마우스 항-인간 CD5 항체로 착색된 단랙 제대혈 세포의 FACS 프로파일.
도 7. 마우스 항-인간 CD20 및 마우스 항-인간 CD72 항체로 착색된 골수 단핵 세포의 FACS 프로파일.
도 8. 편도선 단핵 세포의 전형적인 CD3 및 CD54의 FACS 프로파일.
도 9. IgM 및 IgG 양성인 배양 림프구의 동정; (A) 5일 배양 후, CD19+ 세포의 18%는 IgM 양성이었고, 1%는 세포 표면 상에 검출가능 수준으로 IgG를 나타냄; (B) 배양 10일 후, IgM 양성 림프구의 퍼센트는 2%로 감소되었고, IgG 양성 세포의 퍼센트는 15%로 증가되었음.
도 10. 골수 및 림프계 소스의 온코진을 가진 KMW 트리-하이드리드 세포 상에서의 CD 발현에 대한 FACS 프로파일.
도 11. 일차 혼성 비장 림프구, 분류된 CD4 및 CD19의 집단, 및 제조되는 KBT 트리-하이브리드 세포주 상에서의 CD4 및 CD19의 발현; (a) 1차 비장 림프구 상에서의 CD4 및 CD19의 발현; (b) 분류된 CD19+ 세포의 순도 프로파일(98.1%); (c) 분류된 CD4+ 세포의 순도 프로파일(96.8%); (d) 트리-하이브리드 세포 상에서의 CD19 및 CD4의 공동-발현. 트리-하이브리드 세포 집단의 99% 이상이 B 세포와 T 세포의 모든 마커들을 공동-발현한다.
도 12. 불멸성 골수계 세포 1주와 일차 항원-경험한 림프계 세포 2주로 제조된 KBT 트리-하이브리드 상에서의 CD19, CD3 및 CD5의 발현; (a) KBT 트리-하이브리드 세포 표면 상에서의 CD19 및 CD5의 발현, (b) KBT 트리-하이브리드 상에서의 CD3 및 CD5의 발현.
도 13. 골수 및 흉선으로부터 유래된, 불멸성 골수계 세포 1주와 림프계 세포 2주로 제조된 KBT 트리-하이브리드 세포 상에서의 CD4, CD8, CD72 및 CD20의 표면 발현; (a) CD4 및 CD8의 발현, (b) CD4 및 CD72의 발현, (c) CD20 및 CD8의 발현.
도 14. 림프계 소스의 온코진과 일차 세포 유래의 CD4 및 CD14를 가진 WTM 트리-하이브리드 세포주 상에서의 CD 발현에 대한 FACS 프로파일; (a) 트리-하이브리드 세포 상에서의 CD19 및 CD4의 공동-발현시, CD4 발현율이 높은 CD19 세포 집단 (CD19 CD4H)과 CD4 발현율이 낮은 CD19 세포 집단 (CD19 CD4L)이 나타남; (b) CD19 양성인 동일 트리-하이브리드 집단 상에서의 CD4 및 CD14의 공동-발현시, CD14의 고발현 또는 저발현을 기준으로 세포 집단의 추가적인 이종성(heterogeneity) (CD4HCD14L; CD4HCD14H; CD4LCD14H)이 나타남.
도 15. 림프계 소스 WIL2-NS의 온코진, 항원-경험한 T 세포 유래의 CD5 및 일차 단핵 세포 유래의 CD14를 가지고 있는, WTM 트리-하이브리드 세포 상에서의 전형적인 CD 발현의 FACS 프로파일.
도 16. 림프계 소스 WIL2NS의 온코진, 세포독성 T 세포 유래의 CD8 및 일차 단핵 세포 유래의 CD14을 가지고 있는, WTM 트리-하이브리드 세포 상에서의 CD 발현에 대한 FACS 프로파일.
도 17. 이중 CD 양성의 T 세포로부터 유래된 WTM 트리-하이브리드 상에서의 CD4 및 CD8 공동-발현에 대한 FACS 프로파일.
도 18. 골수단핵구성 기원 세포로부터 기원하는 WTM 트리-하이브리드 세포의 표면 상에서의 CD 발현; (a) CD19, CD4 및 CD15의 3색 염색, 및 (b) 골수단핵구성 기원 세포 유래의 CD34와 CD15 및 작동자 T 세포 유래의 CD4를 이용한 3색 염색.
도 19. CD4+ 작동자 T 세포로부터 유래된 KWT 트리-하이브리드 세포의 계통 특이적인 마커들의 발현.
도 20. 2중 양성인 CD4+CD8+ T 세포로부터 유래된 KWT 트리-하이브리드 세포의 계통 특이적인 마커들의 발현.
도 21. CD5+ 항원-경험한 T 세포로부터 유래된 KWT 트리-하이브리드 세포에서의 계통 특이적인 마커들의 발현.
도 22. 각각 림프계 온코진을 포함하고 있는 세포 2주와 일차 단핵구 세포 1주로 제조된 WWM 트리-하이브리드 세포의 전형적인 CD 발현 프로파일; (a) CD14를 발현하지 않는(R2 영역) 구분되는 CD19 양성 세포 집단을 보여주는, 트리-하이브리드 세포 상에서의 CD19 및 CD14의 공동-발현 (R1 영역); (b) R1 영역에서 분류된 세포로부터 유래되며 2달간 배양하여 증폭시킨 트리-하이브리드 세포 상에서의 CD14 발현; 및 (c) 2달 후 R2 영역의 분류된 집단으로부터 유래된 트리-하이브리드 세포 상에서의 표면 CD14의 결핍.
도 23. WWM 트리-하이브리드 세포의 여러가지 서브집단들로부터 수득되는 CD14에 대한 예시적인 RT-PCR.
도 24. K562 세포의 단일 클론의 핵형 분석. 그 결과, K562 세포주는 3배체로, 염색체 수(modal number)는 69개이다. 다음과 같은 염색체 이상이 검출되었다: X 염색체 하나 결여; q33 및 q35 밴드가 참여하는 2번 염색체 장완(long arm)의 측동원체 역위(paracentric inversion); 3번 염색체 결여; q11.2 유래 세그먼트를 치환하는 오리진 미확인의 추가적인 염색체 물질을 가진 부가적인 5번 파생 염색체; 밴드 p21.2와 p23 사이에서 6번 염색체의 단완의 세그먼트의 배가; 밴드 p13 및 p22가 참여한 7번 염색체의 단완의 측동원체 역위가 나타난 부가적인 7번 염색체; 9번 염색체의 결여; 밴드 p13에서 9번 염색체의 단완의 말단 결손; 2개의 9번 염색체 유래의 세그먼트가 참여한 전위로 생성된 9번 파생 염색체; 3번 및 10번 염색체 유래의 세그먼트가 참여한 전위가 있는 10번 파생 염색체; 13번 염색체의 결여; 13번 염색체 한개의 단완 상에서의 오리진 미확인의 추가적인 염색체 물질; 2개의 17번 염색체 상의 p13 유래 세그먼트로 치환된 오리진 미확인의 추가적인 물질; 1번 및 18번 염색체 유래의 세그먼트가 참여한 전위가 있는 18번 파생 염색체; 20번 염색체 한개의 결여; 1번 및 21번 염색체의 세그먼트가 참여한 전위가 있는 21번 파생 염색체; 22번 염색체의 결여; 5개의 추가적인 상이한 마커 염색체들.
도 25. WIL2NS 세포주 클론 5개 중 하나의 핵형 분석. 이 클론 (CLONE 1)에서, 다음과 같은 이상이 검출되었다: 1번 및 8번 염색체 유래의 세그먼트가 참여한 전위가 있는 8번 파생 염색체; 13번 염색체의 여분의 상동체(extra homologue); 5번 및 14번 염색체 유래의 세그먼트가 참여한 전위가 있는 14번 파생 염색체; q22-q23 유래 세그먼트의 17번 염색체의 배가(duplication).
도 26. 거의 3배체인 단일 세포 클론이 나타난, KBT-1 (CD19+)&(CD4+) 트리-하이브리드 세포주의 핵형 분석. 랜덤 소실로 인해 염색체 수는 65-66으로 다양하였지만 염색체 수는 66개였다. 다음과 같은 이상이 검출되었다: X 염색체의 단완과 아마도 2개의 다른 불특정 염색체가 참여한 복잡한 전위가 형성된 X 파생물; X 염색체 한개 결여; 밴드 q33 및 q35가 참여한 2번 염색체의 장완에서의 측동원체 역위; 3번 염색체의 결여; 3p 염색체의 결손; 4번 염색체와 다른 불특정 염색체의 세그먼트가 참여한 4번 파생 염색체; q11.2 유래 세그먼트를 치환하는 미확인 오리진의 부가적인 염색체 물질이 있는 부가적인 5번 파생 염색체; 밴드 p21.2와 p23 사이에서 6번 염색체 단완 세그먼트의 배가; 7번 염색체의 장완과 마커 3의 장완이 참여한, 부가적인 7번 파생 염색체; 13번 염색체의 결여; 13번 염색체 하나의 단완 상에 미확인 오리진의 부가적인 염색체 물질; 14번 염색체 하나 결여; 15번 염색체 하나 결여; 17번 염색체 2개 상의 p13 유래 세그먼트를 치환하는 미확인 오리진의 부가적인 물질; 1번 및 18번 염색체 유래 세그먼트가 참여하는 전위가 있는 18번 파생 염색체; 20번 염색체 하나 결여; 1번 및 21번 염색체의 세그먼트가 관여하는 전위가 있는 21번 파생 염색체; 22번 염색체의 결여; 4개의 추가적인 상이한 마커 염색체.
도 27. 거의 3배체인 클론 4개가 나타난, KBT (K562&CD20+CD72+&CD4+CD8+ 세포) 교차-계통 트리-하이브리드(또는 KBT-2 교차-계통)의 핵형 분석, (A) CLONE 1의 염색체 수는 67개고, 다음과 같은 이상이 있었다: X 염색체의 단완과 아마 2개의 다른 불특정 염색체가 참여한 복잡한 전위가 형성된 X 파생물; X 염색체 하나 결여; 1번 염색체 유래 세그먼트와 아마 4번 염색체일 가능성이 높은 세그먼트가 참여한 1번 파생 염색체; 밴드 q33 및 q35가 참여하는, 2번 염색체의 장완에서의, 측동원체 역위; 3번 염색체 하나 결여; 4번 염색체의 작은 파생물일 수 있는 가장 가능성있는 결손된 4번 염색체; q11.2 유래 세그먼트를 치환하는 오리진 미확인의 추가적인 염색체 물질이 있는 부가적인 5번 파생 염색체; 밴드 p21.2 및 p23 사이에 6번 염색체의 단완 세그먼트의 배가; 7번 염색체의 장완과 마커 3의 장완이 참여하는 부가적인 7번 파생 염색체; 9번 염색체 하나 결여; 밴드 p13에서 9번 염색체의 단완의 말단 결손; 9번 염색체 2로부터 유래된 세그먼트가 참여한 전위가 있는 9번 파생 염색체; 3번 및 10번 염색체 유래 세그먼트가 참여한 전위가 있는 10번 파생 염색체; 13번 염색체 한개의 결여; 13번 염색체 한개의 단완 상의 오리진 미확인의 부가적인 염색체 물질; 14번 염색체 한개의 결여; 17번 염색체 2개 상에서 p13 유래 세그먼트를 치환하는 오리진 미확인의 부가적인 물질; 1번 및 18번 염색체 유래 세그먼트가 참여한 전위가 있는 18번 파생 염색체; 20번 염색체 한개의 결여; 21 1번 및 21번 염색체의 세그먼트가 참여한 전위가 있는 21번 파생 염색체; 22번 염색체 한개의 결여; 4개의 부가적인 상이한 마커 염색체들, (B) CLONE 2는 랜덤 소실(염색체 수는 67개임)로 인해 염색체를 65-67개를 포함하고 있으며, CLONE 1의 4번 염색체 결손이 4번 염색체 및 다른 불특정 염색체의 세그먼트가 참여하는 한정된 4번 파생 염색체로 치환된 것을 제외하고는, CLONE 1과 비슷한 염색체 특징들을 가짐, (C) CLONE 3는 기본적으로 CLONE 1과 동일하지만, 1번 파생 염색체가 결여되어 있으며, 1번 및 4번 염색체의 세그먼트로부터 유래된 상이한 4번 파생 염색체가 있다. 이것은 랜덤 소실이 있어 염색체 67-68개를 포함하고 있으며, 형태학적 갯수는 67개이다. (D) CLONE 4는 기본적으로 CLONE 1과 동일하나, 1번 염색체의 결여와 1번 및 4번 염색체의 세그먼트가 참여하는 전위가 있는 상이한 1번 파생 유도체가 있다. 정상적인 5번 염색체 2개와 새틀라이티드(satellited) 5q인 것으로 보이는 5번 파생 염색체가 존재한다.
도 28. 염색체 수가 129 - 140개이고 다음과 같은 이상이 있는, 거의 6배체에 가까운 단일 클론이 나타난, KWT-1 트리-하이브리드주 (불멸성 골수계 세포, B 림프계 세포 및 일차 성숙형 CD4+ T 헬퍼 세포로 제조된 KWT 트리-하이브리드)의 핵형 분석: 2개의 X 염색체의 결여; 1번 염색체 한개의 결여; 2번 염색체 한개의 결여; 밴드 q33 및 q35가 참여하는, 2번 염색체의 장완에서의 측동원체 역위 2; 3번 염색체 2개의 결여; 4번 염색체 한개의 결여; q35 유래 세그먼트를 치환하는, 오리진 미확인의 부가적인 염색체 물질을 가진, 4번 파생 염색체; 5번 염색체의 하나의 여분의 상동체; q11.2 유래 세그먼트를 치환하는 오리진 미확인의 부가적인 염색체 물질이 있는, 5번 염색체의 2개의 여분의 파생물; 6번 염색체의 하나의 여분의 상동체; 밴드 p21.2과 p23 사이에 6번 염색체의 단완의 세그먼트의 배가가 있는 부가적인 6번 염색체; 7번 염색체의 하나의 여분의 상동체; 밴드 p13 및 p22가 참여하는 7번 염색체의 단완의 측동원체 역위가 있는 7번 염색체 2개; 1번 및 8번염색체 유래 세그먼트가 참여한 전위가 있는 8번 파생 염색체; 9번 염색체 2개 결여; 밴드 p13으로부터 9번 염색체의 단완의 말단 결손; 9번 염색체 2개로부터 유래된 세그먼트가 참여한 전위가 있는 9번 파생 염색체 2개; 3번 및 10번 염색체 유래 세그먼트가 참여한 전위가 있는 10번 파생 염색체; 12번 염색체 한개의 결여; 13번 염색체 한개의 단완 상에 오리진 미확인의 부가적인 염색체 물질이 있는 1개의 13번 염색체; 14번 염색체 2개 결여; 5번 및 14번 염색체 유래 세그먼트가 참여한 전위가 있는 14번 파생 염색체; 15번 염색체 한개의 결여; 17번 염색체 한개의 결여; 2개의 17번 염색체 상에서 p13 유래 세그먼트를 치환하는 오리진 미확인의 부가적인 물질이 있는 2개의 17번 염색체; q22-q23 유래 세그먼트에 배가가 있는 2개의 17번 염색체; 18번 염색체 2개 결여; 여분의 20번 염색체; 1번 및 21번 염색체의 세그먼트가 참여한 전위가 있는21번 파생 염색체; 22번 염색체 한개의 결여; 2번 마커 염색체 2 카피가 있는 7개의 부가적인 마커 염색체.
도 29. 염색체 수가 135-142이고 다음과 같은 염색체 이상이 있는, 거의 6배체에 가까운 단일 클론이 나타난, KWT-2 (불멸성 골수계 세포, B 림프계 세포 및 일차 기억 CD3+CD5+ T 세포로부터 제조된 KWT 트리-하이브리드주)의 핵형 분석: 2개의 X 염색체의 결여; 1번 염색체 한개의 결여; 2번 염색체 한개의 결여; 밴드 q33 및 q35가 참여한 2번 염색체의 장완에서의 측동원체 역위; 3번 염색체 2개의 결여; 4번 염색체 한개의 결여; q35 유래 세그먼트를 치환하는 오리진 미확인의 부가적인 염색체 물질이 있는 4번 파생 염색체; 5번 염색체의 하나의 여분의 상동체; q11.2 유래 세그먼트를 치환하는 오리진 미확인의 부가적인 염색체 물질이 있는 2개의 여분의 5번 파생 염색체; 6번 염색체의 하나의 여분의 상동체; 밴드 p21.2 및 p23 사이에 6번 염색체의 단완의 세그먼트가 배가된 부가적인 6번 염색체; 밴드 p13 및 p22가 참여한 7번 염색체의 단완의 측동원체 역위가 있는 2개의 7번 염색체; 1번 및 8번 염색체 유래 세그먼트가 참여한 전위가 있는 8번 파생 염색체; 9번 염색체 2개 결여; 밴드 p13에서 9번 염색체의 단완의 발단 결손; 2개의 9번 염색체 유래 세그먼트가 참여한 전위가 있는 2개의 9번 파생 염색체; 3번 및 10번 염색체 유래 세그먼트가 참여한 전위가 있는 10번 파생 염색체; 12번 염색체 한개의 결여; 1개의 13번 염색체의 단완상에 오리진 미확인의 부가적인 염색체 물질이 있는 한개의 13번 염색체; 14번 염색체 2개 결여; 5번 및 14번 염색체 유래 세그먼트가 참여한 전위가 있는 14번 파생 염색체; 15번 염색체 한개의 결여; 17번 염색체 한개의 결여; 2개의 17번 염색체 상에서 p13 유래 단편을 치환하는 오리진 미확인의 부가적인 물질이 있는 2개의 17번 염색체; q22-q23 유래 세그먼트에 배가가 있는 2개의 17번 염색체; 2개의 18번 염색체의 결여; 여분의 20번 염색체; 1번 및 21번 및 번 염색체의 세그먼트가 참여한 전위가 있는 21번 파생 염색체; 22번 염색체 한개의 결여; 마커 2번 염색체가 2카피가 있는 8개의 부가적인 마커 염색체들.
도 30. 염색체 수가 124-139인 하이퍼펜타플로이드(hyperpentaploid)인 클론 3개가 나타난, (불멸성 골수계 세포, B 림프계 세포 및 일차 2중양성 CD4+CD8+ T 세포로 제조된 KWT 트리-하이브리드)의 핵형 분석. (A) CLONE 1에는 다음과 같은 염색체 이상이 있다: X 염색체 3개와 Y 염색체 1개; 부가적인 1번 염색체; 2개의 부가적인 2번 염색체; 밴드 q33 및 q35가 참여한 2번 염색체의 장완에서의 측동원체 역위; 1개의 3번 염색체의 결여; 5번 염색체와 오리진 미확인 염색체가 참여한 전위가 있는 부가적인 5번 파생 염색체; 부가적인 6번 염색체; 밴드 p21.2 및 p23 사이에 6번 염색체의 단완 세그먼트의 배가; 밴드 p13 및 p22가 참여한 7번 염색체의 단완의 부가적인 측동원체 역위; 1번 및 8번 염색체 유래 세그먼트가 참여한 전위가 있는 8번 파생 염색체; 밴드 p13으로부터 9번 염색체의 단완의 말단 결손; 2개의 9반 얌섹ㅊ[ 유래 세그먼트가 참여한 전위가 있는 9번 파생 염색체; 2개의 부가적인 10번 염색체; 3번 및 10번 염색체 유래 세그먼트가 참여한 전위가 있는 2개의 10번 파생 염색체; 한개의 13번 염색체의 단완 상의 오리진 미확인의 부가적인 염색체 물질; 14번 염색체 한개의 결여; 5번 및 14번 염색체 유래 세그먼트가 참여한 전위가 있는 14번 파생 염색체; 3개의 17번 염색체 상에서 p13 유래 세그먼트를 치환하는 오리진 미확인의 부가적인 물질; q22-q23 유래 세그먼트에서의 17번 염색체의 배가가 있는 2개의 염색체; 부가적인 18번 염색체; 1번 및 18번 염색체 유래 세그먼트가 참여한 전위가 있는 18번 파생 염색체; 부가적인 19번 염색체; 20번 염색체 한개의 결여; 1번 및 21번 염색체의 세그먼트가 참여한 전위가 있는 21번 파생 염색체; 각 마커 4번 및 5번 염색체 2카피가 있는 5개의 부가적인 마커 염색체들. (B) CLONE 2는 9번 염색체 1개가 없는 것을 제외하고는 CLONE1과 비슷한 염색체 이상을 가지고 있다. (C) CLONE 3는, 2번 염색체의 장완에서의 측동원체 역위가 2번 동위파생(isoderivative) 염색체로 치환되어, 밴드 q33 및 q35가 참여하는 장완에서의 측동원체 역위에 의해 형성된 2번 파생 염색체가 포함된 동위염색체(isochromosome)가 형성되는 것을 제외하고는, CLONE 2와 동일한 염색체 이상을 포함한다.
도 31. WWM 트리-하이브리드 (A)의 핵형 분석, 및 (B) 오리지날 WWM 트리-하이브리드에서의 55%에서 CD14 농화된 서브라인에서의 95%로 존재가 증가하는, 단일 우성 클론이 나타난, 이의 CD14 농화된 서브라인. 각각은 염색체 수는 47개이고, 다음과 같은 염색체 이상을 가진다: 1번 및 8번 염색체 유래 세그먼트가 참여한 전위가 있는 8번 파생 염색체; 여분의 13번 염색체의 상동체; 5번 및 14번 염색체 유래 세그먼트가 참여한 전위가 있는 14번 파생 염색체; q22-23 유래 세그먼트의 17번 염색체의 배가; 3번 및 21번 염색체 유래 세그먼트가 참여한 전위가 있는 21번 파생 염색체. 오리지날 WWM 트리-하이브리드 및 이의 CD14+ 농화된 서브라인 간의 유일한 차이는, 이러한 이상이 오리지날 WWM의 경우에서는 세포의 55%에 불과하고, CD14 농화된 서브라인의 경우에서는 세포의 95%라는 것이다. WWM 트리-하이브리드에서 나머지 세포들은 거의 3배체(랜덤 염색체 소실 있음) 내지 거의 4배체(랜덤 염색체 소실 있음)이다.
도 32. ProGM 배양물의 상층액의 서든 블롯. 1번 및 2번 레인에는 각각 불활성화된 상층액과 4일간 인간 T 림프구 배양물에서 활성화된 상층액을 주입하였다. 4번 및 5번 레인에는 투니코마이신 무첨가 또는 첨가 조건에서 배양한 ProGM의 상층액을 각각 넣었다. 3번 레인에는 비-GM-CSF 발현 세포의 상층액을 사용하였다. 비교로서, 6번 레인에 E. coli 유래 재조합 hGM-CSF (10ng)를 사용하였다.
도 33. ProGM 하이브리드주에서 생산된 인간 GM-CSF의 겔 전기영동. 투니카마이신 첨가(3번 및 4번 레인) 및 무첨가(1번 및 2번 레인) 조건에서 배양한 샘플에서 수득한 ProGM 하이브리드주의 세포 상층액을, 랫-항-인간 GM-CSF 항체(1번 및 3번 레인) 및 랫 항-마우스 GM-CSF(2번 및 4번 레인)를 이용한 면역침강을 수행하였다. 단백질은 은 염색으로 가시화하였다.
도 34. ProCD54 세포주 및 이의 CD54 농화된 서브라인, ProCD54EX의 표면에서의 CD4 및 CD54의 발현; (a) ProCD54 세포들은 100%가 CD4의 발현을 유지하였다. 세포 집단의 약 72%가 낮은 내지 높은 발현 수준 범위로 CD54에 양성이었다. CD54를 중간 내지 높은 수준으로 발현하는 특징적인 CD4+CD54+ 표현형을 보이는 세포 집단의 42%를 게이팅(gate)하여 분류하였다. (b) 오리지날 ProCD54의 분류된 CD4+CD54+ 서브라인의 표면에서의 CD4 및 CD54의 발현 분석에서, 세포의 98%는 6개월 이상 배양한 후에도 2개의 마커에 여전히 양성을 나타낸다.
도 35. ProCD54 및 ProCD54EX 세포에 의해 분비되는 가용성 인간 CD54의 웨스턴 블롯. KWT 트리-하이브리드 파트너 세포주의 세포들을 대조군으로 사용하였다. ProCD54 및 ProCD54EX 세포들은 모두 약 82 kDa의 CD54의 가용성 형태를 방출한다.
도 36. ProCD54 및 ProCd54EX 세포에서의 ICAM-1 유전자 발현에 대한 RT-PCR 분석.
도 37. 형질감염한지 24, 48 및 72시간 후, hIL4-Ra 체인으로 일시적으로 형질감염된 KBT 트리-하이브리드 세포주의 세포 추출물에 대한 웨스턴 블롯 분석. 100 ng/ml hIL4로 자극시킨 인간 PBML과 비-형질감염시킨 KBT 세포를 각각 hIL4-Ra 체인에 대한 양성 대조군 및 음성 대조군으로 사용하였다.
도 38. hIL-2로 형질감염된 KBT 트리-하이브리드 세포에서 hIL-2 mRNA를 검출하기 위한 PCR 결과. 발현 수준은 CD8+ 인간 T 림프구 및 Jurkat 세포로부터 수득되는 수준과 비슷하다. 비-형질감염된 KBT 세포와 K562 세포를 음성 대조군으로 사용하였다.
도 39. (a) 오리지닐 KBT 트리-하이브리드 세포 및 (b) KBT TR-IL2 세포에서의 세포내 hIL-2에 대한 FACS 분석. KBT 세포의 약 41%가 CD69 활성 분자에 대해 양성이었다. KBT TR-IL2 세포의 92%는 세포내 hIL-2 (R1+R2)에 대해 양성으로 염색되었다. hIL-2 음성인 세포는 CD69 양성 집단의 일부였지만, CD69 음성 세포는 세포내 hIL2에 모두 양성이었다.
도 40. hGM-CSF에 대한 친화성 흡착 후 RP-HPLC하여 수득한 용출 프로파일.
도 41. hGM-CSF 친화성 면역흡착 후 RP-HPLC하여 수득한 분획들의 SDS-PAGE (하단 패널) 및 웨스턴 블롯(상단). 웨스턴 블롯에서 분획들 간에 Pro-GM-SF에 의해 분비되는 hGM-CSF의 분자량 프로파일 상의 변화가 확인되었다. 24 - 28분에 용출된 분획들이 RP-HPLC 용출 프로파일에서 첫번째 피크에 해당되며, 29-31분에 채취한 분획들은 2번째 피크이고, 3번째 피크는 34-36분에 채취한 분획으로 취해진다.
도 42. PHA 활성화된 인간 림프구 배양물로부터의 CD4+ 세포의 분리: (A) 항 인간 CD4-FITC로 표지된 세포를 게이팅(gating)하고(R1), 세포 집단의 나머지와 분류하였다. 분류된 세포를 순도에 대해 추가 분석하였다; (B) 분류된 집단에서 세포 100%가 CD4 양성이었다.
도 43. Pro-GMsf로부터 유래된 탈당화된(deglycosylated) hGM-CSF의 겔 전기영동. 정제된 hGM-CSF를 여러가지 시간 간격으로 PHGase F 절단에 노출시켰다. 1번 레인 - 0분 인큐베이션, 2번 레인 - 10분 인큐베이션, 3번 레인 - 20분 인큐베이션, 4번 레인 - 40분 인큐베이션. 5번 레인 - E.coli 유래 재조합 인간 GM-CSF. 단백질은 은 염색으로 가시화하였다. 분자량 마커를 나타내었다.
도 44. 마우스 골수종 Sp2 세포주의 TfR+ 세포 동정과 분류.
도 45. (a) 말초 혈액 및 (b) 항-마우스 CD4 및 CD8로 염색된 비장 유래의 마우스 단핵구 세포의 FACS 프로파일. 게이팅된 영역 R1 및 R3는 단일 양성의 작동자 헬퍼(CD4+CD8-) 및 세포독성 (CD8+CD4-) T 세포이지만, R2는 2중양성의 (CD4+CD8+) T 세포를 포함한다.
도 46. 자기 비드로 네거티브 선별을 통해 말초 혈액으로부터 분리된 마우스 단핵구의 순도 프로파일. 분리된 세포들은 100%가 CD11b에 대해 양성이었고, 이들 세포의 98% 이상이 동시에 B220, CD90, CD49b 및 NK1.1에 대해 음성이었다. 대략적으로, 38%의 CD11b+ 세포가 그 표면에 낮은 수준으로 Ly5G를 발현하였다.
도 47. 하나의 Sp2 불멸 세포, 일차 마우스 CD4+ T 세포 및 CD11b+ 단핵구로부터 유래된 STmMm 트리-하이브리드 상에서의 CD138, CD4 및 Cd11b 발현에 대한 FACS 프로파일. 트리-하이브리드 세포의 100%에서, CD138의 발현에 의해 B 림프 계통의 표현형이 검증되었으며(a), (b) 세포 집단의 82% 이상이 3종의 CD 마커 모두를 발현하였고, 세포의 5%만 CD4 또는 CD11b 중 한가지를 동시에 발현하지 않으면서 CD138 양성이었다.
도 48. 하나의 림프계 불멸 세포 Sp2, 일차 마우스 세포독성 CD8+ T 세포 및 마우스 CD11b+ 단핵구로부터 제조된 STmMm 트리-하이브리드 상에서의 CD138, CD8 및 CD11b 발현에 대한 전형적인 FACS 프로파일. 마우스 CD138의 발현은 트리하이브리드 세포의 97-100%에서 확인되었지만(a), (b) 트리-하이브리드 세포 집단의 56% 및 57%에서는 각각 T 세포 및 단핵구 마커의 공동-발현이 검출되었다. 전체 트리-하이브리드 집단의 약 50%가 3종의 마커들을 모두 공동-발현하였지만(c), 14%는 표면에 CD8 또는 CD11b도 발현하지 않았다.
도 49. 마우스 림프계 불멸 세포 Sp2 1주, 일차 마우스 이중 양성 CD4+CD8+ T 세포 1주 및 일차 마우스 CD11b+ 단핵구 1주로 제조된 STmMm 트리-하이브리드 상에서의 CD138, CD8 및 CD11b 발현에 대한 전형적인 FACS 프로파일. 트리-하이브리드 세포 집단의 98-100%가 CD138에 양성이었고, 이들 집단의 93%는 또한 CD8 양성이었다 (b). 전체 세포 집단의 57-60%는 동시에 CD138, CD8 및 CD11b에 양성이었다.
도 50. 마우스 림프계 불멸 세포 Sp2 1주, 일차 마우스 이중 양성 CD4+CD8+ T 세포 1주 및 일차 단핵구 1주로 제조된 STmMm 트리-하이브리드 상에서의 CD4 및 CD8 발현에 대한 전형적인 FACS 프로파일. 세포의 95%는 CD8에 양성이었고, 트리-하이브리드 개제의 50%만 CD4 및 CD8을 공동-발현하였다. 특히, 구체적으로 전체 CD4+ 집단 역시 CD8에 양성이었다.
도 51. 트리-하이브리드 집단의 95%가 CD138에 양성 염색을 보이고, 세포의 70%가 CD11b를 공동-발현하는, SSMm 트리-하이브리드의 표면 상에서의 전형적인 CD138 및 CD11b의 발현 프로파일.
도 52. SWMm (a) 및 SWMh (b) 트리-하이브리드의 표면 상에서의 전형적인 인간 CD71 및 마우스 TfR의 발현 프로파일. 단핵구의 마우스 또는 인간 소스와는 상관없이, 트리-하이브리드는 100%가 인간 및 마우스 트랜스페린 수용체 둘다에 양성이었다.
도 53. SWMm (a) 및 SWMh (b) 트리-하이브리드 상의 마우스 CD138 및 마우스 CD11b 또는 인간 CD14 중 어느 하나의 전형적인 발현 프로파일. SWMm 트리-하이브리드의 84%가 마우스 CD138에 양성이었고, SWMh의 단지 29%만 그 표면에 이를 제시하였다.
도 54. SWMh 키메라 트리-하이브리드의 표면 상에서의 인간 CD19 및 인간 CD14 발현에 대한 FACS 프로파일로서, 세포의 96%가 인간 CD19를 발현하며, 66%가 인간 CD14를 공동-발현한다.
도 55. 단일-세포 조작/전달 시스템.
도 56. 유리 마이크로파이펫.
도 57. 마이크로-전극.
도 58. 2개의 병렬 마이크로-전극.
도 59. 조직 배양 플레이트의 웰내 2개의 마이크로-전극.
도 60. 2개의 마이크로전극 사이에 세포 3개가 있는 웰의 상면도.
도 61. 도 60의 웰의 측면도.
도 62. 제2 단백질 hIL-2로의 안정적인 형질감염 전(A) 및 후(B)에, KBT 세포 하나와 shIgM+CD25+ B 세포 하나의 하이브리드화에 의해 만들어진 하이브리드 세포의 표면 상에서의 CD25와 sIgM의 발현.
본 발명의 바람직한 구현예는 첨부된 도면을 참조하여 하기 비제한적인 실시예를 들어 추가로 설명된다.
실시예 1
1. 세포 선별, 세포 조작 및 단일-세포 클로닝
아래 실시예들은, 교차-계통 트리-하이브리드의 제조와 원하는 단백질의 발현에 사용되는, 포유류 세포주 및 일차 세포의 선별 및 분리(또는 분류) 등의 세포 준비에 대해 설명한다. 특이적인 특징을 가진 세포의 순수 집단을 수득하기 위한 각 선별 기법의 선택 또는 개개 표현형의 세포 분리용 개개 마커(또는 마커들)의 사용은 어떠한 방식으로의 제한되지 않으며, 이를 설명하기 위한 것이다. 비슷한 결과를 달성하기 위한 다른 세포 마커 또는 분류 공정을 사용할 수도 있다.
1.1. 포유류 세포주 유래의 온코진 소스로서의 세포의 선별
모든 불멸성 세포주(아래 참조)를 CO2 배양기에서, 37℃, 가습된 5% CO2 대기 하에, NaHCO3 (JRH Biosciences), 20 mM Hepes (Sigma), 4 mM L-글루타민 (Sigma)이 부가되고, 10% 소 태아 혈청, FCS, (JRH Biosciences)이 보충된, 변형된 RPMI1640 (Roswell Park Memorial Institute medium) 배지를 이용하여, 표준(정상) 조건 하에, 현탁 배양으로 배양하였다. 다르게 언급되지 않은 한, 본원에 언급되는 조직 배양 배지(TC 배지)는 불멸성 세포주, 원발성 암세포, 일차 세포 배양물 및 본 발명의 확립된 트리-하이브리드 세포주들 모두를 배양하기 위한 표준 배지이다. 일반적으로, 사용되는 모든 세포주, 원발성 암세포 및 일차 세포들을 항생제-무첨가 환경에서 배양하였다. 그러나, 박테리아 및/또는 진균의 오염 위험성이 높은 것으로 의심될 때에는, 2% 페니실린 (5000 units)/스트렙토마이신 (5 mg) 용액 (Sigma)을 표준 배지에 포함시켰다.
인간 세포주
본 발명에 사용될 수 있는 인간 세포주들은 다음과 같다:
a) 공통 골수계 기원 세포 계통, K562 (인간 만성 골수성 백혈병으로부터 유래된 세포주),
b) T 림프 계통, MOLT4 (인간 T 림프모구), 및
c) B 림프 계통, WIL2NS (인간 B 림프모구).
비-인간 세포주(들)
본 발명에 사용될 수 있는 비-인간 세포주는 마우스 골수종 세포주-Sp2 (B 림프구 형질 세포)이다.
1.1.1. 단일-세포 전달 시스템
세포 분리 또는 분류, 세포 조작 및 단일-세포 클로닝은 본 발명 전체에서 기본적인 공정들이다. 여기에서는, 대상 단일 세포의 조작 및/또는 클로닝을 위해 확립된 단일-세포 전달 시스템을 설명한다. 세포 전달 시스템(도 55)은 주로 유리 마이크로파이펫, 1 ml의 시린지 및 1차원의 조악한 조작기로 구성된다. 도 56은 대상 단일 세포를 골라내기 위해 사용되는 L 형의 유리 마이크로파이펫을 보여준다. 파이펫은 헤마토크리트 모세관(haematocrit capillary tube)으로 구성되며, 길이가 75 밀리미터(mm)이고, 외경과 내경은 각각 1.5 mm 및 1.10 mm이다. 열을 가하여 관의 한쪽 끝(1)을 잡아 당겨, 팁의 내경이 약 250-330 마이크로미터(㎛)이고, 팁의 벽 두께가 약 30 ㎛가 되게 하였다. 마이크로파이펫의 다른 쪽 말단(2)은 변형시키지 않았다. 세포 전달 시스템(도 55)에서, 시린지(4)를 조악한 조작기 위에 놓은 다음, 이를 자기 스텐드(16) 위에 올려놓는다. 이 시스템은, 시린지의 플런저(6)가 시린지에 대해 정방향으로 또는 역방향으로 매우 천천히 움직이도록 힘을 가하는 방식으로 작동한다. 대상 단일 세포를 조작하기 위해서는, 도에 나타낸 비와 같이, 유연한 의료 등급의 튜브(3)를 이용하여, 시린지에 마이크로파이펫의 비변형 말단을(2) 연결시켜야 한다. 단일 세포 전달 시스템은 70% 알코올을 이용한 여러번 수세하여 멸균시키고, 마지막에는 필요에 따라 임의의 세포 조작하기 전에, 적절한 조직 배양 배지나 용액으로 기포없이 충진한다.
1.1.2. 단일 세포 클로닝
각 세포주 유래의 세포 클론들은 단일 세포 클로닝에 의해 확립하였다. 본 발명에서 사용되는, 임의의 생물학적 세포, 예컨대 K562 세포주의 세포의 단일 세포를 클로닝하거나 조작하는 기법들을 아래에서 설명한다.
대수기의 배양물로부터 K562 세포의 세포 현탁물 5 ㎕를 취하여, 조직 배양용 96웰 플레이트(TC 플레이트, Becton and Dickinson 또는 BD)의 웰에 넣고, 이 웰에는 TC 배지 150 ㎕이 들어 있다. 이 웰을 "세포-보관 웰"로 지칭하였다. 이 플레이트를 도립 현미경(Axiovert 40C, Carl Zeiss)의 XY 현미경 스테이지에 놓았다. 단일 세포 조작/클로닝 프로세스 수행하기 전에, 마이크로파이펫(도 56)에는 기포없이 TC 배지로 완전히 채워넣었다. 단일-세포 전달 시스템(도 55)의 마이크로파이펫, 관 및 시린지를 1차원의 조악한 조작기(Narishege) 상에 장착하였다. 마이크로파이펫 팁(1)은, 팁이 현미경의 광학 뷰의 중심에 위치되도록 배치하였다. K562의 단일 세포를 조작하고 클로닝하기 위해, 마이크로파이펫을 세포-보관 웰에 삽입하였다. 시린지의 플런저를 흡입 방향으로 매우 천천히 움직여, K562 단일 세포를 마이크로파이펫에 넣었다. 이 마이크로파이펫을 세포-보관 웰에서 꺼냈다. 현미경 스테이지를 세포-보관 웰에서 "클로닝 웰"로 지칭된 인접 웰로 측방향으로 이동시키고, 마이크로파이펫을 이 클로닝 웰에 넣어, 마이크로파이펫내의 단일 세포를 조심스럽게 마이크로파이펫에서 방출시켰다. 이는, 시린지의 플런저를 방출시키는 방향으로 매우 천천히 음직임으로써 달성하였다. 세포-보관 웰로부터의 단일 세포의 채취 과정과 이 단일 세포를 클로닝 웰에 넣는 과정은, TC 플레이트 당 단일 세포 클론 60개가 달성될 때까지 수회 반족하였다. 클로닝 플레이트를 가습된 인큐베이터(Thermoline Scientific)에서 37℃, 5% CO2로 맞추어 10일간 인큐베이션하였다. 각 클로닝 웰내 배지는 배양 기간 동안에 정기적으로 신선한 TC 배지로 보충하였다. 각 클로닝 웰에서의 각 클론의 세포 증식을 24시간 마다 기록하였다. 인큐베이션 종료 후, K562 세포 클론의 수를 확정하였다. 세포 표면 상에서 발현되는 대상 마커, 예컨대 K562 세포 상의 CD71 트랜스페린 수용체의 수준이 높거나 또는 증식율이 가장 높은 클론들을, 트리-하이브리드 제조 또는 이후의 실험을 위해 선별하였다.
1.1.3. CD71 + 세포의 분류
예컨대, 아래 방법들은 형광-활성화된 세포 분류기(FACS)를 이용하여 K562 세포주로부터 CD71 양성 세포의 세포 선별 및 분류를 설명한다.
2% 소 혈청 알부민 BSA(Sigma)가 함유된 포스페이트 완충 용액(Dulbeco PBS) 100 ㎕에 현탁한 K562 세포 1x105개를, 암조건에서, 피코에리트린(PE) 접합된 항-CD71(BD Pharmingen) 또는 PE 접합된 이소형의 대조 항체 IgG2a,k (BD Pharmingen) 중 하나를 20 ㎕로 사용하여 함께 실온에서 30분간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 혼합물을 PBS 1ml로 희석하고, 10분간 300g에서 원심분리하여 착색된 세포를 수집하였다. PBS 1 ml로 추가로 헹군 다음, 착색된 세포를 PBA 1 ml에 현탁하고, FACS (BD FACSCalibur)를 이용하여 즉시 분석하였다. 도 1은 K562 세포주의 CD71+ 세포 프로파일을 나타낸 것이다. CD71+ 양성 세포들을 게이팅하고, 분류하였다 (도 1a). 대략적으로, 오리지날 K562 집단의 65%는 CD71 양성이었다. 분류된 세포를 10분간 300 g에서 원심분리하고, 이를 추가적인 실험을 위해 PBS 1 ml에 현탁하였다. 현탁한 CD71+-분류 세포 100 ml을 도 1b에 나타낸 바와 같이 순도 분석용으로 수집하였다. 99% 순도의 CD71+-분류 세포가 수득되었다. 세포 분류 후, K562 세포주의 CD71+ 세포들은 추가적인 실험에 사용하거나 또는 표준 배양 조건 하의 배양하여, CD71-농화된 K562 세포로서 표시하였다. 동일한 방법을 사용하여, CD71-농화된 WIL2NS 및 CD71-농화된 MOLT4 배양물을 확립하였다.
1.1.3.1. K562 배양물로부터의 골수단핵구 계통의 CD71 + 세포의 분류
세포 하이브리드화 실험을 위한 세포의 골수단핵구 표현형을 보증하기 위해, CD71+ K562 세포들을 FACS 분석과 이후의 분류에 의해 CD15+ 세포들로 농화시켰다.
이를 위해, 섹션 1.1.3에 기술된 방법으로 수득되는 CD71-농화된 K562 세포를, PE 항-인간 CD71 및 FITC 항-인간 CD15 (BD Pharmingen)로 표지하였다. 2% BSA가 포함된 PBS 100 ㎕에 현탁시킨, 헹군 CD71-농화된 K562 세포 1x105를, 암 조건에서, 항-인간 CD71-PE 및 항-인간 CD15-FITC 항체 중 어느 하나의 20 ㎕와 함께, 또는 이소형의 음성 대조군 항체, 또는 FITC 및 pE 표지된 이소형의 음성 대조군 항체와, 실온에서 30분간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 혼합물을 PBS 1 ml로 희석하고, 착색된 세포를 10분간 300 g로 원심분리하여 수집하였다. PBS 1 ml로 추가로 헹군 다음, 착색된 세포를 PBS 1 ml에 현탁하여 FACSCalibur (BD)를 이용하여 즉식 분석하였다.
전형적인 FACS 프로파일을 도 2a에 나타낸다. 5개월 배양한 후, CD71-농화된 K562 세포의 99%가 CD71 양성을 유지하였고, 약 18%는 표면 CD15를 발현하였다. CD71 및 CD15 둘다에 양성인 세포를 게이팅(2a)하여, 분류하였다. 분류된 세포를 10분간 300 g로 원심 분리하여 수집하고, 이를 이후의 실험을 위해 PBS 1 ml에 현탁하였다. 순도 분석을 위해 CD71+CD15+ 분류 세포 현탁물 100 ㎕를 채집하였다. 2달 배양한 후, 분류된 세포에서 CD71 및 CD15의 공동-발현에 대해 재분석하였다 (도 2b). 그 결과, 정제된 세포의 약 98%에서 CD71과 CD15 둘다가 유지되어 있는 것으로 나타났다. 표면에 CD17 및 CD15 둘다를 보다 초기에 발현하는 세포들 중 일부에서 CD15 발현이 없어졌는데(도 2b), 이는 K562 세포의 골수단핵구 계통으로의 구속(commitment)이 안정적이지 않으며 가역적일 수 있음을 시사한다.
1.1.4. 마우스 Sp2 세포주로부터의 트랜스페린 수용체 양성 세포의 선별
마우스 골수종 세포주 Sp2를 트리-하이브리드의 제조에 사용하였을 때, 집단에서 인간 CD71의 유사체인 마우스 트랜스페린 수용체(TfR)를 발현하는 세포가 농화되었다.
기본적으로, FITC-접합된 랫 항-마우스 TfR 항체(Abcam)를 TE-접합된 마우스 항-인간 CD71 대신 사용한 것을 제외하고는, 인간 세포주에서 CD71+ 세포를 농화하는, 섹션 1.1.3과 동일한 프로토콜을 수행하였다. 이소형 대조군도 그에 따라 조정하였다.
도 44는 Sp2 세포주의 TfR+ 세포 프로파일을 보여준다. TfR+ 양성 세포를 게이팅하여 분류하였다 (도 44a). 대략적으로, 오리지날 Sp2 집단의 45%가 TfR에 양성이었다. 분류된 세포를 10분간 300 g로 원심분리하고, 이후 실험을 위해 PBS 1 ml에 현탁하였다. 도 44b에 나타낸 바와 같이, 순도 분석을 위해 현탁된 TfR+-분류된 세포 100 ml을 취하였다. TfR+ 분류된 세포가 순도 99.5%로 확인되었다. 세포 분류 후, Sp2 세포주의 TfR+ 세포를 이후의 실험에 사용하거나 또는 표준 배양 조건 하에서의 배양에 사용하고, TfR-농화된 Sp2 세포로 표시하였다.
1.2. 원발성 암세포로부터 온코진의 소스로서의 세포의 선별
예로서, 아래 방법은 급성 골수성 백혈병(AML)에 걸린 환자로부터 수득한 골수 샘플들에서 골수 계통의 형질전환된 세포의 선별에 대해 기술한다. 또한, 동일한 방법은, 대응되는 혈액 악성 종양의 골수 샘플로부터 다른 계통의 세포를 선별하는데에도 적용할 수 있다.
AML 환자의 골수 채집물을 사전 동의를 구한 후 수득하였다. 실험을 수행하기 전에 AML로 진단 확증된 환자들에서 샘플을 추출하였다. AML 단핵 세포를 섹션 1.3.1에 기술된 동일한 밀도 구배 원심분리 공정을 이용하여 분리하였고, 샘플에서 CD34+ 세포를 FACS를 이용하여 분류하거나 동정하였다.
상기에서 수득한 단핵 세포를 염색하거나 표지하기 위해, 마우스 항-인간 CD34-PE 항체 (BD Pharmingen) 또는 PE 이소형 대조군 항체 (BD Pharmingen) 10 ㎕를, 염색 배지(PBS+5%BSA) 중의, 단핵 세포 1x106개에 해당되는 해당 분액 100 ㎕에 첨가하였다. 해당 분액의 경우, 염색 혼합물을 얼음 위에서 30분간 인큐베이션하였다. 빙랭한 염색 배지 10 ml을 세포 펠렛에 첨가하여, 4℃에서 7분간 350 g로 원심분리하였다. 상층액을 뽑아낸 다음, 상응하는 부피의 빙랭한 염색 배지를 첨가한 튜브를 손가락으로 튕겨, 세포 펠렛을 재현탁하였다. 염색된 세포를 원심분리한 다음 빙랭한 염색 배지 중에서 한번 헹구었다. 표시된 세포를 염색 배지에 현탁하여 FACS에 적용하였다. CD34+ 세포 집단에 대한 적합한 분류 게이트를 세팅한 다음, 세포 분획을 수집하였다.
농화 배양을 위해, CD34+-농화된 세포 40x103개를 세포외 합성 기질로 사전 코팅된 12웰 플레이트에 접종하였다. 세포는, 57 mM 베타-머캅토에탄올(Sigma), 1 mM 하이드로코르티손 및 20 ng/ml 인간 IL-3 및 인간 G-CSF가 보충된 TC 완전 배지에서 증식시켰다. 48시간 배양 후, FACS를 이용하여 세포를 CD15 발현에 대해 추가로 선별하였다.
형광-세포 염색시, 마우스 항-인간 CD15-FITC (BD Pharmingen) 및 마우스 항-인간 CD34-PE (BD Pharmingen)를 사용하였고, 또한, 본 섹션에서 앞에서 기술한 유사한 세포 염색 방법을 적용하였다. 염색된 샘플을 FACS로 분석하였다. CD34 및 CD15 양성 세포 집단 (CD34+CD15+) 또는 CD34 양성 및 CD15 음성 세포 집단 (CD34+CD15-)에 대한 적절한 분류 게이트를 세팅한 후, 분획을 수집하였다.
48시간 배양한 후, CD34+ AML 세포 상에서의 CD15 발현 프로파일을 도 3에 나타낸다. 대략적으로, AML 단핵 세포의 54%는 CD15 양성이면서 이의 CD34 발현을 유지하고 있는 것으로 확인되었지만, 세포 집단의 나머지는 골수단핵 계통으로의 구속됨이 없이 CD34 발현을 유지하고 있었다. CD34+CD15+ 세포를 트리-하이브리드 제조용 실험에 사용하였다.
1.3. 일차 세포
일차 세포는 말초 혈액, 제대혈, 비장, 골수, 흉선, 편도선 및 국부 림프절 등의 임의의 림프계 조직으로부터 유래될 수 있다. 1차 단계로서, 모든 림프계 조직들을 가공하여 단핵 세포를 분리하였다.
1.3.1. 골수, 말초 혈액 또는 제대혈로부터 인간 단핵 세포의 분리
사전 동의를 구한 후, 건강한 개체로부터 말초 혈액 샘플을 수집하였다. 각 혈액 샘플을 헤파린 처리한 시험관 (Vacutainer, BD)에 채혈하고, 모아, RPMI1640에 희석하였다.
인간 골수 채집물은 골수 생검을 받았고, 어떠한 혈액 이상도 나타내지 않는 정상 골수를 가진 환자로부터 수득하였다. 샘플은 RPMI1640에 1:3의 비율로 희석하였다.
인간 제대혈 샘플은 사전 동의를 구한 후 정상적인 만삭 출산으로 수득하였다. 각 제대혈은, 태아 출산하고 태반 축출 전 탯줄을 결찰한 후에, 헤파린 처리한 60 ml 시린지를 사용하여 채취하였다. 각 샘플은 RPMI1640에 희석하였다.
말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 골수 단핵 세포(BMMC) 및 제대혈 단핵 세포(UCBMC)는, Ficoll-Paque (Amersham Pharmacia) 상에서의 밀도 원심 분리에 의해 준비하였다. 간략하게는, Ficoll-Paque 10 ml을 20 ml 시린지가 부착된 캐뉼러 관을 이용하여 세포 현탁물 20 ml 아래에 적층하였다. 샘플 세포를 4℃에서 40분간 1,700 rpm (700 g)으로 원심분리하였다. 계면에 있는 세포를 취하고, 10분간 2,000 rpm (1,000 g)으로 원심분리하여 RPMI1640 50 ml로 헹구었다. 상층액은 버리고, 펠렛화된 세포를 RPMI1640 40 ml에 재현탁한 다음 10분간 1,300 rpm (400 g)에서 원심분리하였다. 0.83% (wt/vol) NH4Cl로 세포 용혈시키고, PBS로 1:2 비율로 희석된 Ficoll-Paque 상에서 2차 원심분리하여, 적혈구 세포와 혈소판을 제거하였다.
분리된 단핵 세포는 배양 또는 분석 및 FACS 또는 자기 비드 분리 시스템을 통한 세포 특이적인 분획으로의 분류에 사용하였다.
1.3.2. 고형 림프계 조직으로부터 인간 단핵 세포의 분리
아래 방법은 비장, 흉선, 편도선 또는 국소 림프절로부터 단핵 세포를 분리하기 위해 본 발명에서 사용한 공정들을 기술한다. 또한, 세포 염색 및 분류 방법을 제공한다.
국가 윤리 가이드라인에 따라 장기 이식 공여체로부터 비장 샘플을 수득하였다. 약 2 x 2 x 3 cm 크기의 비장 블록을, 비장세포가 분리될 때까지 RPMI 1640내 4℃에 두었다. 각 블록을 시린지의 플런저를 이용하여 멸균 체의 메쉬를 통해 작은 조각으로 잘랐다. 그런 후, 세포를, 완전 배지 중에서, 20 U/ml VII형 콜라게나제 (Sigma) 및 20 U/ml DNase (Sigma)를 이용하여, 실온에서 30분간 절단시켜, 효소적으로 해리시켰다. 세포 응집물에 EDTA를 10 mM이 되도록 실온에서 5분간 첨가하여, 더욱 해리시킨다. 그런 후, 비장세포를 완전 배지로 2번 헹구어 효소 절단물을 헹구고, RPMI 1640에 재현탁하였다. 이러한 조건들은 비-효소적 해리 공정과 비교하여 표면 분자 발현에 영향을 미치지 않는다 (McIlroy et al 1995). 적혈구 제거를 제외하고는, 섹션 1.3.1에 기술된 바와 같이, 밀도 구배 원심분리에 의해 이들 비장세포 현탁물로부터 비장 단핵 세포를 분리하였다. 비장 단핵 세포를 RPMI1640에 재현탁하고, 세포 농도를 ml 당 1x106 세포수로 조정하였다. 세포 생존성은 트립판 블루 배제법으로 결정하였을 때 98% 이상이었다.
흉선은 부모의 사전 동의를 받은 후 심장 수술을 받는 어린이로부터 수득하였다. 흉선 조직을 파괴시키고, RPMI1640 배지가 충전된 시린지를 이용하여 조직의 흉선 세포를 플러싱함으로써, 흉선으로부터 흉선 세포를 분리하였다. 이 흉선 세포는 전술한 바와 같이 밀도 구배-원심분리에 의해 정제하였다.
편도선은 사전 동의를 구한 후 염증 장애로 인한 편도선 절제술을 받는 환자로부터 수득하였다. 조직 샘플을 완전 배지 및 250 ㎍/ml 젠타마이신 중에서 얼음 위에 보관하였고, 3일간 처리하였다. 상피 층을 제거한 후 편도선 조직을 조간으로 자르며, 조직 블록을 컷-오프 이동 파이펫을 통해 조심스럽게 흡입시켰다. 그런 후, 비장 단핵 세포의 분리에서 이전에 기술한 동일한 과정을 이용하여 편도선 세포를 분리하였다.
1.3.3. 다양한 조직으로부터 유래된 단핵 세포로부터 계통 특이적인 일차 세포의 분리
FACS 분석 및 세포 분류 또는 자기 세포 분류를 이용한 동일한 절차에 의해, B 림프 계통, T 림프 계통 및 골수 계통의 인간 세포를, 분리하였다. 다양한 조직으로부터 계통 특이적인 일차 세포를 분리하기 위한 비제한적인 예로서의 세포 염색 및 분류 방법을 아래에 제공한다.
1.3.3.1. 인간 비장 및 말초 혈액으로부터 B 세포, 헬퍼 T 세포 및 골수단핵 세포의 분리
조직 샘플을 먼저 처리하여 섹션 1.3.1에 기술된 바와 같인 단핵 세포 집단을 추출하였다. 그런 후, 형광-세포 염색과 이후의 세포 분류를 단핵 세포 집단을 분리한 후 4시간 이내에 수행하였다. 세포는, 염색할 때까지 표준 배양 조건(섹션 1.1 참조) 하에서 완전 배지에 현탁하였다.
1.3.3.1.1. 다양한 조직으로부터 유래된 일차 성숙 B 세포, 작동자 세포 및 골수단핵 세포의 세포 염색 및 분류
하기 내용은 일차 세포로부터 B 및 T 세포의 염색 및 분류에 대한 예이다. 통상적으로, B 세포 및 헬퍼 T 세포의 선별은 각각 CD19 및 CD4의 표면 발현을 토대로 하지만, 골수단핵 세포는 CD14 및/또는 CD16의 표면 발현을 토대로 한다.
간략하게, 마우스 항-인간 CD19-FITC 항체 (BD Pharmingen) 및 마우스 항-인간 CD4-PE 항체 (BD Pharmingen) 각각 10 ㎕ 또는 적절한 이소형 대조군을, 분액 당 세포 1x105개가 포함된 염색 매질(PBS+5%BSA) 중의 단핵 세포 분액 100 ㎕에 첨가하였다. 단핵 세포 집단의 각 분액에서, 염색 혼합물을 얼음 위에서 30분간 인큐베이션하였다. 빙랭한 염색 매질 10 ml을 염색 혼합물에 첨가하고, 7분간 4℃에서 350 g로 원심분리하였다. 상층액을 흡입 제거한 다음, 빙랭한 상응하는 부피의 염색 매질을 튜브에 넣고 손가락으로 튕겨 세포 펠렛을 재현탁하였다. 염색된 세포를 원심분리하고, 빙랭한 염색 매질 중에서 1회 이상 헹구었다. 이 과정은 다른 분액에서도 반복하였다. 염색된 세포는 FACS를 이용하여 분석하였다. 20,000 회 이상의 게이팅 현상을 각 샘플에서 분석하였다. CD19 양성의 B 세포 집단 (CD19+CD4-) 또는 CD4 양성의 T 세포 집단 (CD4+CD19-)에 대한 적절한 분류 케이트를 세팅한 후, 분획을 수집하였다. 각 분획 1 ml를 순도 분석을 위해 취하고, 각 분획의 나머지는 추가적인 실험을 위해 완전 배지에 재현탁하였다.
1.3.3.1.2. 분류된 세포 집단의 회수 및 분석
적은 수의 세포 (≤ 5 x 105개의 세포)를 적절한 어댑터를 이용하여 장착한 마이크로원심분리관으로 직접 분류하였다. 분류 후, 보충된 RPMI1640의 소량(0.1 - 0.2 ml)을 분류된 샘플과 혼합하여 분류된 세포의 생존성을 향상시키기 위해 회수 튜브에 넣었다. 분류 후, 다수의 세포 회수가 가능하였으며, 각 분류된 세포 샘플 20 ㎕를 순도를 검증하기 위한 재-분석을 위해 염색 매질에 1:10으로 희석하였다. 허용가능한 순도는 ≥95%이었다. 분류된 샘플 1 ml 당 FCS 20 - 40 ㎕를 첨가한 다음, 7분간 4℃에서 350 g로 원심분리하였다. 그런 후, 세포를 표준 조직 배양 배지에 재현탁하였다. 충분한 세포를 이용가능한 경우, 이를 계수하여 수율을 측정하였다.
도 11a에 항-인간 CD19-FITC 및 항-인간 CD4-PE로 표지된 비장 샘플의 FACS 프로파일을 나타내며, 도 11b 및 11c에는 분류된 CD19+ B 세포 및 CD4+ T 세포의 순도 분석 프로파일을 나타낸다(KBT 하이브리드 특정화 참조). 분획의 세포 순도는 CD19+ 세포는 98% 이상이었고, CD4+ 세포는 96%이었다.
말초 혈액으로부터의 CD19+ 및 CD4+ 세포의 분류 및 순도 프로파일은, 비장 샘플과 기본적으로 비슷하였고, 소수의 각 세포 집단이 수득되었다.
인간 단핵구 및 골수단핵 세포의 분리를 위해, 제조사의 지침서에 따라 인간 CD14 자기 비드 MACS (Miltenyi Biotec GmbH)를 이용하여, 단핵 세포 집단에서 CD14 음성 세포를 먼저 고갈시켰다. 선별된 CD14 양성 세포를 마우스 항-인간 CD16-PE (BD Pharmingen) 및 마우스 항-인간 CD14-PerCP (BD Pharmingen) 항체로 염색하거나 표지하였다. 세포 염색 & 분류 방법 및 분류된 세포의 회수 방법은 위에 기술되어 있다(섹션 1.3.3.1.1 및 1.3.3.1.2 참조).
염색된 샘플을 FACS를 이용하여 분석하였다. 20,000 회 이상의 게이트를 분석하였다. MACS 비드를 이용하여 CD14 양성으로 선별된 총 세포의 약 86%가 CD14에 양성이었다. CD14+ 집단을 CD16의 발현을 토대로 3가지 그룹으로 추가로 분리하였다: CD14HCD16-는 대다수의 CD14+ 세포에서 나타남; 소수는 CD14HCD16L 및 CD14HCD16H 세포임. 분획의 세포 순도는, CD14HCD16-가 98% 이상이고, CD14HCD16L가 96% 이상이고, CD14HCD16H가 92% 이상이다. 적절한 분류 게이트 설정 후, 아래 세포 집단들을 수집하였다: CD14HCD16-, CD14HCD16L 및 CD14HCD16H 세포 분획. 도 4는 마우스 항-인간 CD16-PE 및 마우스 항-인간 CD14-PerCP로 표시된 CD14 농화된 샘플의 FACS 프로파일이다.
비장 조직으로부터의 CD14+ 세포의 세포 분류법과 정제 방법은, 소수의 각 세포 집단이 수득되는 것을 제외하고는, 말초 혈액 샘플과 기본적으로 동일하였다.
1.3.3.2. 인간 제대혈로부터 CD5 양성(항원-경험한) B 세포 및 CD5 음성(나이브) B 세포의 분리
단핵 세포를 섹션 1.3.1에 기술된 바와 같이 제대혈 샘플로부터 준비하였다. 형광-세포 분리 후 세포 분류는 단핵 세포 집단을 분리한 후 4시간 이내에 수행하였다. 이러한 본 실시예에서, 인간 제대혈에서의 CD5 음성 (나이브) B 세포 및 CD5 양성 (항원-경험한) B 세포의 분류는 마우스 항-인간 CD5-FITC 항체 (BD Pharmingen), 마우스 항-인간 CD19-PE 항체 (BD Pharmingen) 또는 적절한 이소형의 대조군을 전술한 방법 (섹션 1.3.3.1.1)에 따라 수행하였다.
FACS를 이용하여 염색된 샘플을 분석하였다. 20,000회 이상의 게이트를 각 샘플에서 분석하였다. CD5 음성 B 세포 집단 (CD19+CD5-) 또는 CD5 양성 B 세포 집단 (CD19+CD5+) 집단에 대한 적절한 분류 게이트를 설정한 후, 다수의 분획들을 수집하였다. 도 5는 마우스 항-인간 CD19 및 마우스 항-인간 CD5로 염색된 샘플의 전형적인 프로파일을 나타낸다.
샘플내 B 세포의 퍼센트는 4 - 19.2%이고, CD5+ B 세포는 총 순환 림프구의 0.8 - 7.2%였다.
1.3.3.3. 인간 제대혈로부터 CD5 양성 (항원-경험한) T 세포 및 CD5 음성 (나이브) T 세포의 분리
섹션 1.3.1에 기술된 바와 동일한 방법을 이용하여, 제대혈 샘플로부터 단핵 세포를 추출하였다. 형광-세포 분류 및 이후의 세포 분류는, 단핵 세포 집단을 분리한 후 4시간 이내에 수행하였다. 본 실시예에서, 인간 제대혈로부터 CD5 양성 (항원-경험한) T 세포 및 CD5 음성 (나이브) T 세포의 분류는 마우스 항-인간 CD5-FITC 항체 (BD Pharmingen), 마우스 항-인간 CD3-PE 항체 (BD Pharmingen) 또는 적합한 이소형 대조군을 앞(섹션 1.3.3.1.1)에서 언급한 세포의 방법에 따라 이용하여 수행하였다. 염색된 세포를 FACS로 분석하였다. 20,000회 이상의 게이트를 분석하였다. CD5 음성 T 세포 (CD3+CD5-) 또는 CD5 양성 T 세포 (CD3+CD5+) 중 하나를 포함하고 있는 분획를 수집하도록 분류 세이트를 설정하였다. 도 6은 마우스 항-인간 CD3 및 마우스 항-인간 CD5 항체로 염색된 샘플의 전형적인 프로파일을 나타낸다.
분류된 집단의 회수와 분석
분류된 집단을 회수하고 분석하는데 사용되는 동일한 방법은, 사실상 섹션 1.3.3.1.2에 기술되어 있다.
샘플에서의 T 세포 퍼센트는 1.7 - 13.5%이고, CD5+ T 세포는 총 순화된 림프구의 0.4 - 1.3% 범위였다.
1.3.3.4. 인간 골수단핵 집단으로부터 CD20 및 CD72 발현을 토대로 한, 초기 B 세포, 활성화된 B 세포 및 휴지기 B 세포의 동정
단핵 세포를 이전의 방법(섹션 1.3.1)으로 골수에서 추출하였다. 형광-세포 분류 및 이후의 세포 분류는, 단핵 세포 집단을 분리한 후 4시간 이내에 수행하였다. 활성화된 B 세포의 염색 및 분류는 앞의 섹션 1.3.3.1.1에 기술되어 있다. 구체적으로, 10 ㎕의 마우스 항-인간 CD72-FITC 항체 (BD Pharmingen) 및 20 ㎕의 마우스 항-인간 CD20-PE 항체 (BD Pharmingen) 또는 적절한 이소형 대조군 (PE 마우스 IgG2b,κ 항체)을 사용하였다. 염색된 세포를 FACS로 분석하였다. 분류 게이트를 프리-B 세포, 휴지기 및 활성화된 B 세포를 포함하는 CD20 양성 집단, 여포성 수지상 세포(CD20+CD72-) 또는 초기 B 세포 (CD20-CD72+) 또는 활성화된 B 세포 (CD20+CD72+)를 포함하는 CD72 양성 세포 집단이 함유된 분획들이 수집되도록 설정하였다. 도 7은, 마우스 항-인간 CD20 및 마우스 항-인간 CD72 항체로 염색된 샘플의 전형적인 프로파일을 보여준다.
분류된 집단의 회수 및 분석
사실상, 분류된 집단을 회수하고 분석하는데 섹션 1.3.3.1.2에 기술된 동일한 방법을 적용하였다.
전형적으로, 골수 단핵 세포 집단의 약 10-15%가 CD20과 CD72에 양성이었고, 세포의 9-12%는 CD20에는 양성이나 CD72에는 음성이었고, 약 8%는 CD72에만 양성이었다.
1.3.3.5. 자기 비드 분류에 의한 흉선 세포 서브집단의 분리
MACS CD4 멀티분류 키트 (Miltenyi Biotec GmbH)를 이용하여, CD4-CD8- 22중 음성 흉선 세포, CD4+CD8+ 2중 양성 흉선 세포, 및 CD4+ 및 CD8+ 단일 양성 흉선 세포 집단을 제조사의 지침서에 따라 분류하였다. 간략하게는, 섹션 1.3.2에 기술된 유사 방법으로 이용하여 수집한 흉선 세포를 30분간 CD4 멀티분류 CD4 마이크로비드와 함께 인큐베이션하였다. 이를 PBS 중의 5 mM EDTA 및 0.5% BSA로 헹군 다음, 표시된 세포를 자기 컬럼에서 분리하였다. 양성으로 선별된, 자기 컬럼 상에서 유지된 흉선 세포에는, CD4+ 단일 양성 및 CD4+CD8+ 2중 양성 세포 집단이 함유되어 있지만, 컬럼을 통해 용출되는 CD4 고갈된(depleted) 세포 집단에는 CD8+ 단일 양성 및 CD4-CD8- 2중 음성의 세포들이 함유되어 있었다. CD4에 양성인 것으로 선별된 세포 집단에서 마이크로비드를 제거하기 위해, 세포를 MACS 멀티분류 방출 시약과 함께 인큐베이션하였다. 20분 후, 해리를 중지시키고, 세포를 CD8 마이크로비드로 30분간 표지하였다. 양성 선별에 의해 CD4+CD8+ 2중 양성인 흉성 세포가 수득되었지만, CD4+ 단일 양성 세포는 고갈시킨 세포 집단에서 발견되었다. CD4 고갈된 세포 집단을 CD8 마이크로비드와 함께 30분간 인큐베이션하였다. 자기 컬럼 상에 표지된 세포를 적용한 후, CD8+ 단일 양성 세포들을 CD4-CD8- 2중 음성의 흉선 세포에서 분리할 수 있었다. 4종의 여러가지 흉선 서브집단의 순도는, 유세포 측정 분석으로 평가하였다. 허용가능한 순도는 95% 이상이었다.
1.3.3.6. 인간 편도선에서의 CD54 + T 세포의 분리
섹션 1.3.2에 기술된 방법을 이용하여 인간 편도선에서 단핵 세포를 추출하였다. 단핵 세포 집단을 분리한 후 4시간 이내에, 형광-세포 염색 및 이후의 세포 분류를 수행하였다. CD54+ T 세포 (세포내 접착 분자-1 또는 ICAM-1)를, 마우스 항-인간 CD3-PE 항체 (BD Pharmingen) 및 마우스 항-인간 CD54-FITC 항체 (BD Pharmingen) 또는 적절한 이소형 대조군을 이용하여 추출하였고, 섹션 1.3.3.1.1에 기술된 바와 같은 세포 염색/분류 방법을 이용하여 선별하였다. 염색된 세포를 FACS를 이용하여 분석하였다. 분류 게이트는, CD3+ T 세포 (즉, CD3+CD54- 세포) 또는 활성화된 CD54+ T 세포 (즉, CD3+CD54+ 세포) 중 어느 하나를 함유하는 분획을 수집하도록, 설정하였다. 도 8은 마우스 항-인간 CD3 및 마우스 항-인간 CD54 항체를 이용하여 염색한 샘플의 FACS 프로파일을 보여준다. CD3+ 세포를 교차 계통의 트리-하이브리드의 제조에 사용하였고, CD54+ 활성화된 T 세포는 발현 실험에 사용하였다.
그 결과, T 세포는 편도선에서 분리된 단핵 세포 대부분(82%)을 구성하고 있으며, 9%가 CD54+ T 세포인 것으로 확인되었다.
1.3.4 마우스 단핵 세포의 분리
8-12 주령의 BALB/c 마우스를 특수 무균 동물 시설에서 유지시켰다. 조직을 추출하기 전에, 이산화탄소에 노출시켜 마우스를 안락사시켰다. 말초 혈액을 겨드랑이 동맥이나 대퇴부 동맥의 천공에 의해 수득하고, 헤파린 코팅된 관에 수집하였다. 단핵 세포 집단의 분리는 인간 말초 혈액 단핵 세포의 분리에 대한 섹션 1.3.1에 기술된 동일한 프로토콜을 이용하여 수행하였다. 마우스 비장을 기계적으로 파괴시키고, 섹션 1.3.2에 기술된 인간 비장 단핵 세포 분리용 공정을 이용하여 단핵 세포를 분리하였다.
1.3.5. 마우스 단핵 세포로부터 계통 특이적인 일차 세포의 분리
T 림프 계통 및 골수 계통의 마우스 세포들을 FACS 분석과 세포 분류 및 자기 세포 분류를 이용하여 표준 공정으로 분리하였다. 계통 특이적인 일차 마우스 세포의 분리를 위한 비제한적인 세포 염색 및 분류 방법의 예를 아래에 제공한다.
1.3.5.1. 마우스 비장 및 말초 혈액으로부터 작동자 T 세포의 분리
여러가지 작동자 T 세포의 선별은 CD4 및 CD8의 표면 발현을 토대로 하였다.
각 마우스 항-마우스 CD4-PE 항체 (BD Pharmingen) 및 랫 항-마우스 CD8-FITC 항체 (BD Pharmingen) 10 ㎕ 또는 적절한 이소형 대조군을, 분액 당 세포 1x105가 포함된, 염색 매질(PBS+5%BSA) 중의 비장 또는 말초 혈액 단핵 세포의 분액 100 ㎕에 첨가하였다. 단핵 세포 집단의 해당 분액에 대해, 염색 혼합물을 얼음 위에 30분간 인큐베이션하였다. 10 ml의 빙랭한 염색 매질을 염색 혼합물에 첨가하고, 7분간 4℃에서 350 g로 원심분리하였다. 상층액을 뽑아내고, 세포 펠렛을 빙랭한 상응하는 체적의 염색 매질이 첨가된 튜브에서 손가락으로 튕겨 재현탁하였다. 염색된 세포를 원심분리하고, 빙랭한 염색 매질에서 1회 헹구었다. 다른 분액들에 대해 이 과정을 반복하였다. 염색된 세포를 FACS로 분석하였다. 20,000회 이상의 게이팅을 각 샘플에 대해 분석하였다. 염색 마우스 말초 혈액 및 비장 단핵 세포의 전형적인 FACS 프로파일을 각각 도 45(a) 및 45(b)에 나타낸다. 림프계 조직 둘다에는 단일 양성 CD4 또는 CD8 T 세포 및 2중 양성 T 세포가 함유되어 있었지만, 세포 존재율은 다양하였다. 예컨대, 말초 혈액에서의 가장 큰 집단에는 CD8+CD4- 세포독성 T 세포 (43%)가 함유되어 있었지만, 단핵 비장 세포는 주로 CD4+CD8- 헬퍼 또는 조절성 T 세포 (42%)인 것으로 나타났다. CD4 양성 집단(R1 영역), CD8 양성 집단(R3 영역) 또는 2중 양성 세포 집단(R2 영역)에 대한 적절한 분류 게이트를 설정한 후, 분획들을 수집하였다. 각 분획 1 ml을 순도 분석용으로 취하였고, 각 분획의 나머지는 이후 실험을 위해 완전 배지에 재현탁하였다. 각 분획의 순도는 98% 이상이었다.
1.3.5.2. 마우스 말초 혈액으로 단핵구의 분리
마우스 단핵구는 자기 비드(Miltenyi Biotec)를 이용한 네거티브 선별에 의해 말초 혈액 단백질 집단으로부터 분리하였다. 단핵 세포를 자기 세포 분류 완충액(PBS, 01%wt/vol BSA, 및 0.5mM EDTA)에 현탁하고, T 세포 (CD90), B 세포 (B220), 및 NK 세포 (CD49b)에 대한 항체 등의, 항체 마이크로비드 혼합물과 함께, 제조사의 프로토콜에 따라 인큐베이션하였다. 그런 후, 세포를 LD-네거티브 선별 컬럼을 통과시켰다. 네거티브(단핵구) 분획을 수집하였다. 순도를 측정하기 위해, 세포를 PE-CD116 항체 접합물과 FITC와 접합된 CD90, B220, CD49b, NK1.1 및 Ly6G (BD Pharmingen)로 염색하였다. 단핵구는 CD11b+CD90-B220-CD49b-NK1.1-Ly6G-/(low)으로 동정되었으며, 순도 프로파일을 FACS로 검증하였다. 마우스 단핵구 집단의 순도 프로파일은 도 46에 나타낸다. 세포들 100%가 CD11b에 양성이었고, 이것들 중 98% 이상이 B220, CD90, CD49b 및 NK1.1에 대해 음성이었다. CD11b 양성 세포의 약 38%는 Ly6G를 낮은 수준으로 발현하였다.
실시예 2
2. 바람직한 단백질을 분비하는 일차 세포의 제조
바람직한 단백질을 분비하는 일차 인간 세포의 제조에 사용되는 방법들은 하기 섹션들에 제공한다. 이들 세포는 세포 하이브리드화 실험에 사용하거나 또는 분석 실험에 대조군으로서 사용하거나, 또는 트리-하이브리드 발현 시스템에서 발현되는 단백질의 분석의 비교군으로 사용하였다.
2.1. 인간 GM-CSF를 분비하는 림프구의 제조
제대혈 림프구는, 먼저, 섹션 1.3.1에 기술된 바와 같이 밀도 구배 원심분리에 의해 분리한 다음, 피토헴어글루티닌(PHA)과의 배양으로 활성화한 후, IL-2(1000 U/ml) 중에서 세포 증식시켰다. 인간 GM-CSF의 생산은 ELISA로 분석하였다. 생산 농도는 15 - 40 ng/ml/106 (세포) 범위였다.
총 300,000 PHA-활성화된 인간 림프구를 암조건에서 FITC(Sigma)가 접합된 마우스 항-인간 CD4 항체와 함께 여러 농도에서 제조사의 지침에 따라 4℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 활성화된 인간 T 세포를 분석하고, FACS (FACS VantageSE, BD)를 이용하여 선별하였다. 도 42 (a)는 PHA-활성화된 림프구 배양물에서의 전형적인 CD4+ T 세포 프로파일이며, 도 42 (b)는 CD4+ 분류된 세포의 100% 순도를 보여준다.
2.2. IgM 및 IgG를 분비하는 인간 림프구의 제조
정제된 B 세포 (섹션 1.3.3.1 참조)를 마우스 항-인간 CD154 항체 (BD Pharmingen)로 코팅된 둥근 바닥의 96웰 플레이트의 웰에 3.75 x 105 세포/ml로 접종하였다. 세포는 10% 열 불활성화시킨 울트라-로우 IgG FBS (Gibco/BRL) 및 100U/ml 인터루킨 4 (IL-4) (R&D systems)가 보충된 RPMI1640 완전 배지에서 배양하고, 배양 3일 후 50 ng/ml 인터루킨 10 (IL10)을 첨가하였다. 2일 내지 3일 마다 배양 배지의 절반을 교체하여, 배양물을 보충해주었다. 세포 생존성과 수를 혈구 측정기를 이용하여 트립판 블루 배제법에 의해 3번 평가하였다. 5일과 10일에, 배양된 림프구를 회수하여, PBS에서 2번 헹군 다음, 마우스 항-인간 CD19-PE, 마우스 항-인간 IgM-FITC 또는 마우스 항-인간 IgG-FITC 항체 (모두 BD Pharmingen 사 제품임)를 이용하여 FACS에 의해 분석하였다. 모든 염색은 4℃에서 세포 1x106개 당 각 항체 1 ㎍을 사용하여 달성하였다. 모든 분석에서, 세포의 95% 이상이 이소타입-매칭된 음성 대조군 염색에 따른 마커 세트 이용시 2중 음성이었다. 죽은 세포와 세포 찌꺼기가 함유된 영역은 분석에서 배제하였다. 모든 분석들은 5000 내지 10000개의 살아있는 세포를 게이팅함으로써 수행하였다.
배양한 림프구내 IgM 및 IgG 양성 세포의 전형적인 프로파일들은 도 9에 나타낸다. 배양 5일 후, CD19+ 세포의 18%가 IgM 양성이었고, 1%만 표면에서 검출가능한 IgG를 가지고 있었는데 반해, 10일 후에는 IgG 양성 림프구의 퍼센트는 2%로 감소되면서 IgM 양성 림프구의 퍼센트는 15%로 증가하였다. 적절한 게이트로 분류한 후, IgM 양성 분획과 IgG 양성 분획들을 Ig 발현 실험으로 위해 분류하였다.
배양물의 IgM 및 IgG 농도를, 96웰 ELISA 웰 플레이트와 인간 μ 및 γ 체인에 대한 플라스틱-흡착된 염소-친화성 정제한 항체를 이용한 표준 ELISA에 의해 측정하였다. 결합된 항체는 HRP-접합된 염소 항-인간 Ig 항체를 이용하여 확인하였다. 항체들은 모두 시그마사로부터 구입하였다. ABTS를 기질로 사용하였고, 405 nm에서 광학 밀도를 측정하였다. 표 1에는 5일 및 10일 후 B 림프구 배양물에서 검출된 IgM 및 IgG 수준을 요약 개시한다.
배양 기간 IgM, ng/10 6 (세포) IgG, ng/10 6 (세포)
5일 2480 ± 182 850 ± 92
10일 1215 ± 260 1914 ± 101
5일 배양 후 IgM의 생산은 감소된 반면, IgG 생산은 증가하였다.
실시예 3
3. 체세포 하이브리드화
몇가지 체세포 하이브리드화 방법들이 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 이러한 방법으로는 예컨대 센다이 바이러스(Kohler and Milstein, 1975)와 같은 용해성 바이러스(fusagenic virus)를 이용하는 생물학적 방법, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)를 이용하는 화학적 수단(Wojciezsyn, et al, 1983) 및 전기장을 이용하는 전기적 방법(Neil, and Zimmermann, 1993)이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 각 방법은 대상 세포의 원형질막을 가역적으로 투과가능하게 하여 하이브리드화되게 유도 또는 유발할 수 있다.
전술한 세포 하이브리드화 방법들과는 무관하게, 세포 하이브리드화를 달성하기 위해서는 원칙적으로 2가지의 기본적인 단계들이 필요하다. 첫번째로, 하이브리드화할 세포의 원형질막이 양호하게 세포막 접촉되어야 한다. 두번째로, 접촉 지점에서의 원형질막의 가역적인 파괴가 동시에 유도되어야 한다.
전기적인 세포 하이브리드화 방법으로, 적절한 필드 주파수의 교류-전류 전기장(AC 필드)을 이용함으로써, 대상 세포가 양호한 세포막 접촉이 이루어질 수 있도록 할 수 있으며, 그런 후 AC 필드에서 동시에 짧은 전기 펄스에 노출시켜 하이브리드화를 유도할 수 있다.
추가적으로 정밀하게 하기 위해, 전기 세포 하이브리드화에 다음과 같은 물리적 현상들이 수반된다: 유전영동(DEP) 및 원형질 세포막의 전기적 파괴.
유전영동(Pohl, 1978)은, 적정 용액에 현탁하여 적정 주파수의 불균일한 AC 전기장에 노출시켰을 때 생물 세포와 같은 유전 입자(dielectric particle)의 이동을 설명하는 현상이다. 세포의 이동은, (i) 예컨대, 100 mM 소르비톨(Mahaworasilpa, 1992)에 현탁한 Sp2 세포의 경우, 0.5 - 2.0 메가헤르츠 (MHz) 주파수 필드에서의 유전 입자의 전위 또는 이동, 및 (ii) 예컨대, 100 mM 소르비톨에 현탁한 Sp2 세포의 경우, 2 - 10 킬로헤르츠 (kHz) 주파수 필드에서의 유전 입자의 회전 (Mahaworasilpa, 1992)으로서, 잘 기록되어 있다. 불균일한 필드는, 한쌍의 전극 간에 전기장을, 예컨대, 여러가지 배치로 배열할 수 있는 실린더형의 전기선을 이용하여 발생시킬 수 있다. 가장 많이 사용되는 배치는 병렬 전극 배치(도 58)이다. 불균일한 필드 존재시에는, DEP는 유전 입자(즉, 생물 세포)가 서로를 잡아당기도록 유도하고, 동시에 가장 강력한 필드 영역 쪽으로 이동하게 유도할 수 있다. 그 결과, 세포 체인 또는 스트링이 형성되고, 양호한 세포막 접촉을 유도하게 된다. 세포의 상호 유인은 세포가 전기 전도성이 꽤 낮은 용액에 현탁되었을 때 강하게 촉진되는 것으로 확인되었다.
세포막의 전기적 파괴는, 적합한 하이브리드화 용액에 현탁된 세포를 적정 펄스 진폭과 간격의 전기 펄스에 노출되었을 때, 유도할 수 있다 (Zimmermann, 1982). 펄스 간격 범위, 예컨대, 하이브리드화할 세포 타입에 따라, 스퀘어 펄스 1 - 200 마이크로세컨드 (μsec)가 많이 사용된다.
3.1. 전기 세포 하이브리드화 시스템
본 발명의 특정 구현예에서, 전기적 세포 기법을 이용하여 트리-하이브리드와 같은 하이브리드화된 세포를 만들 수 있다.
3.1.1. 세포 조작 시스템
세포 하이브리드화 이전에 대상 개개 세포를 조작하기 위해, 앞서(섹션 1.1.1) 언급한 단일 세포 조작/전달 시스템을 본 발명 전역에서 사용하였다.
3.1.2. 미소전극
본 발명에서, 2개의 L형 미소전극을 사용하였다. 도 57에 무코팅 니켈 합금으로 제조된 직경 128 ㎛의 미소전극(7)을 보여준다. 미소전극의 대(shaft)는 헤마토크리트 모세관으로 피복되어 있으며, 외경은 1.5 mm 이다(8). 미소전극(9 및 10)의 L형 섹션은 전극의 수평부 및 수직부 양쪽의 표면의 일정한 구역이 매질 또는 적정 용액에 노출될 수 있도록 배열될 수 있다 (Mahaworasilpa, 1992). 세포 하이브리드화 과정 전에, 2개의 미소전극을 2개의 섬세한 미세조작기 위에 각 미소전극에 대해 하나씩 둔다. 이 미소전극을, 각 전극의 병렬 전극 구조가 되는 방식으로 배치하였다(도 58). 각각의 섬세한 미세조작기는 유압으로 운용되며, X, Y 또는 Z 방향으로 0.5 ㎛ 수준으로 미세하게 이동할 수 있다.
3.1.3. 세포 챔버 및 배치
도 59는 표준 96웰 TC 플레이트의 웰내의 2개의 병렬 전극을 나타낸 것으로, 웰은 본 발명의 특정 구현예에서 세포 하이브리드화 챔버로서 제공된다. 세포 하이브리드화를 수행하기 위해, 미소전극을 표준적인 96웰 조직 배양 플레이트의 웰(12)에 든 적정 매질(11)에 침지한다. 도 60 및 도 61은 각각 병렬 전극 배치의 상면도 및 측면도로서, 예컨대, 하이브리드화시킬 것으로 사전-선택한 3개의 세포를, 적절한 AC 전기장의 존재 하에 세포가 일렬로 배치되거나 또는 세포 체인이 될 수 있는 방식으로, 병렬 전극 사이에 배치한다.
실시예 4
4. 전기적 세포 하이브리드화 방법에 의한 교차-계통 트리-하이브리드 제조예
하기 섹션은, 계통이나 세포 타입이 다르거나 또는 계통 또는 세포 타입은 동일하지만 표현형은 다른 세포를 하이브리드화함으로써 수득되는 트리-하이브리드 세포주를 제조하는 예를 제공한다. 각 안정적인 트리-하이브리드는 모 세포의 표현형 특징들을 동시에 가지고 있는지를 검증하기 위한 분석을 수행하였다. 이러한 검증은 계통 특이적인 세포 표면 마커, 계통 특이적인 마커의 세포내 발현, 계통 특이적인 마커의 RNA 전사체의 존재, 핵형 분석(karyotyping), 및/또는 계통 특이적인 단백질의 분비에 대한 분석을 토대로 하였다. 아래 실시예들에서 교차-계통의 트리-하이브리드의 가장 전형적인 표현형 특징들을 설명한다. 그러나, 이들 실시예들은 선택한 개개 마커로 한정되는 것은 아니다.
4.1. 골수계, T 림프계 및 B 림프계 계통으로부터 유래된 3종의 불멸 세포로부터의 교차-계통의 트리-하이브리드의 제조 - KMW.
골수계 K562 세포 1주, T 림프계 MOLT4 세포 1주 B 림프계 WIL2NS 세포 1주를 하이브리드화하여, 이러한 교차-계통 타입의 트리-하이브리드를 제작하였다. 이렇게 수득한 교차-계통의 트리-하이브리드를 KMW 주(시리얼 번호를 붙임)로 표시하였다. 본 발명에 사용되는 KMW 교차-계통의 트리-하이브리드 제조 공정에 대한 이후의 단계들, 용액(하이브리드화, 배양 및 회수 배지) 및 파라미터를 아래에서 설명한다.
4.1.1. KMW 교차-계통의 트리-하이브리드 제조를 위한 세포 준비
K562, WIL2NS 및 MOLT4 세포주들을 표준 배지(섹션 1.1 참조)에서 배양하였다. 일상적으로, 각 세포주는 3일마다 계대 증식하였다. 세포 하이브리드화하기 전에, 증식율이 가장 높은 각 세포 타입의 안정적인 클론을 섹션 1.1.2에 기술된 방법을 이용하여 확립하였다. 일부 실험들에서, 섹션 1.1.3에 기술된 바와 같이 확립된 CD71+-농화된 세포 집단을 사용하였다. 또한, 일부 경우에는, CD71+-농화된 K562 집단의 CD15+ 세포(섹션 1.1.3.1)를 사용하였다.
4.1.2. KMW 교차-계통의 트리-하이브리드 제조를 위한 세포 하이브리드화 프로토콜
TC 96웰 플레이트의 웰 몇개를 세포 하이브리드화 웰로 사용하였다. 각 웰에, 240 mM 소르비톨 (Sigma), 2.0 mM KH2PO4 (Sigma), 0.4 mM CaCl2 (Sigma), 0.2 mM Mg(C2H3O2)2 (Sigma) 및 0.2 mM Ca(C2H3O2)2 (Sigma)로 구성되며 0.2 % 소 혈청 알부민, BSA (Sigma)이 첨가된 하이브리드화 매질 약 150 ㎕를 주입하였다. 세포의 전기적 하이브리드화를 하기 전에, 각 세포 타입의 사전-선별된 클론의 세포를 수분간 하이브리드화 매질로 한번 헹구고, 신선한 하이브리드화 매질이 든 웰로 옮겼다. 이 웰을 프리-하이브리드화 웰로 지칭하였다. 세포 하이브리드화 공정 전에, 각 선별된 클론의 하나의 헹군 세포를 섹션 1.1.1에 따라 조작하여, 각 선별된 클론에서 하나씩 3개의 세포만 한쌍의 상동한 병렬 전극 사이에 놓이게 하였고, 상기 전극들은 웰의 바닥에 잠기게 하였다(도 61에 나타냄). 전극의 간격은 400 마이크로미터(즉, 400 ㎛)로 설정하였다.
전기적 세포 하이브리드화를 달성하기 위해, 먼저, 주파수 0.8 MHz, 필드의 세기 약 50-60 킬로볼트/미터 (예, 50-60 kV/m)의 교류 전류(AC) 필드를, 3개의 세포들이 유전영동에 의해 서로 유인하게 유도될 수 있을 때까지, 수초간 전극 사이에 인가하였다. 이러한 과정은 세포가 양호한 세포막 접촉이 이루어지도록 한다. 세포는, K562 세포가 세포 일렬선의 가운데 있도록 정렬되었다(도 60 또는 61 참조). 그런 후, 2개의 전기적 스퀘어 펄스를, 펄스 간격 3초로, AC 필드와 동시에 가하였다. 강도가 약 170 kV/m 이고, 펄스 폭이 75마이크로세컨드(예, 75 μsec)인 각 펄스를 사용하였다. 세컨드 스퀘어 펄스 완료 후, AC 필드를 다시 5초간 지속적으로 유지시켜, 세포 하이브리드화로 단일 교차-계통의 트리-하이브리드화된 세포를 만들었다. 본 발명의 특정 구현예에서, 이들 3개의 세포의 하이브리드화는 동시에 발생하지 않을 것으로, 즉, 세포 3개 중 2개가 하이브리드화된 다음 3번째 세포가 하이브리드화되는 비율이 높은 것으로 관찰되었다. 일부 경우에, 완전한 3세포 하이브리드화를 달성하는데 추가적인 스퀘어 펄스가 필요하였다. 새롭게 만들어진 교차-계통의 트리-하이브리드 세포를 하이브리드화 웰에서 하이브리드화 웰과는 다른 열에 위치되어 있는 회수 웰로 이동시켰다. 각 회수 웰에는 150 ㎕ 표준 TC 매질 (섹션 1.1 참조)을 넣었다. 새롭게 확립된 각각의 교차-계통의 트리-하이브리드 세포를, 각 회수 웰 당 교차-계통의 트리-하이브리드 세포 하나씩 넣어, 37℃ 및 5% CO2 조건으로 가동되는 가습화된 인큐베이터에서 7일간 인큐베이션하였다. 교차-계통의 트리-하이브리드 대부분은 세포 하이브리드화가 이루어진 후 36시간 이내에 분열되는 것으로 확인되었다. 인큐베이션 기간이 종료된 후, 각 회수 웰내 배지를 신선한 표준 배지로 적절하게 보충하였다. 이는 각 교차-계통의 트리-하이브리드 클론의 세포 증식을 자극하였다. 2일 또는 3일 후, 분열 또는 생존 세포는 각 회수 웰에서 식별하여, 표준 24웰 TC 플레이트의 웰에 넣어, 교차-계통의 트리-하이브리드 클론들 세트로 키웠다. 각 교차-계통의 트리-하이브리드 클론을 다시 일주일간 24웰 플레이트에서 배양한 다음, 이를 본 발명자의 표준 배양 배지 (섹션 1.1 참조) 10 밀리리터(ml)가 든 25 cm2 TC 플라스크로 옮기고, 추가적인 분석을 위해 적절하게 표지하였다. 전기적 세포 하이브리드화의 전과정과 교차-계통의 트리-하이브리드 회수 공정은, 안정적인 교차-계통의 트리-하이브리드 세포의 배치를 제조하기 위해, 다수회 반복하였다.
4.1.3. KMW 교차-계통의 트리-하이브리드 상태의 검증
CD 마커의 발현
KMW 교차-계통의 트리-하이브리드 세포의 검증예를 아래에 제공한다.
KMW 교차-계통의 트리-하이브리드 세포주가 6개월간 정상 배양 조건 하에서 확립된 후, 교차-계통의 트리-하이브리드 세포 집단을 계통 특이적인 CD 마커의 발현에 대해 분석하였다.
3색 FACS 분석을 이용하여, 다음과 같은 CD 마커의 공동-발현을 검증하였다: WIL2NS 기원의 CD19, K562 기원의 CD15 및 MOLT4 기원의 CD4,
간략하게, 5% BSA가 함유된 PBS 중의 1x106 세포/ml 농도의 KMW 교차-계통의 트리-하이브리드 세포 100 ㎕를, 100 ㎕의 PBS에 현탁하고, 0.5 mg/100 ml 마우스 항-인간 CD15-PerCP, 0.25 mg/100 ml 마우스 항-인간 CD4-PE 및 1.0 mg/100 ml 마우스 항-인간 CD19-FITC 항체 또는 적절한 이소형 대조군와 함께, 4℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 모든 마우스 항-인간 항체는 BD Pharmingen로부터 구입하였다. PBS로 잘 헹군 후, 표지된 세포를 FACSCalibur 유세포 측정기와 CellQuest Pro 소프트웨어로 분석하였다.
도 10은, 계통 특이적인 특징들이 불멸성 표현형으로부터 유래된, KMW 교차-계통의 트리-하이브리드 세포가, 혼성 표현형을 가지며 골수계가 현저한, 이종의 세포 집단을 함유하고 있는 것으로 시사되는, KMW 교차-계통의 트리-하이브리드 세포주의 FACS 프로파일을 보여준다. KMW 세포의 62%는 골수계와 T 림프계 표현형을 공유하고 있고, KMW 세포의 28%는 T 및 B 림프계 표현형을 발현한다.
4.2. 불멸성 골수계 세포 1주와 일차 림프계 세포 2주로부터 유래된 교차-계통의 트리-하이브리드의 제조 - KBT
교차-계통의 트리-하이브리드를, 골수계 K562 세포 1주, 일차 인간 B 세포 1주 및 일차 인간 T 세포 1주의 체세포 하이브리드화에 의해 제조하였다. 교차-계통의 트리-하이브리드는 KBT에 시리얼 번호를 붙였다.
4.2.1. KBT 교차-계통의 트리-하이브리드 제조를 위한 세포 준비
KBT 교차-계통의 트리-하이브리드를 제조하기 이전의 K562 세포의 준비는 앞서 기술하였다(Section 4.1.1). KBT 교차-계통의 트리-하이브리드의 제조에 사용되는 일차 세포들로는, (i) 비장, 말초 혈액 또는 제대혈 유래의 성숙형 B 세포 (CD19+); 골수 유래의 초기 B 세포 (CD20-CD72+); 골수 유래의 활성화된 B 세포 (CD20+CD72+); 제대혈 유래의 경험한 B 세포 (CD19+CD5+) 및 (ii) 비장, 말초 혈액, 제대혈 및 흉선 유래의 헬퍼 T 세포 (CD4+), 비장, 말초 혈액, 제대혈 및 흉선 유래의 세포독성 T 세포 (CD8+); 제대혈 유래의 항원-경험한 T 세포 (CD3+CD5+); 제대혈 유래의 CD3+ T 세포; 흉선 유래의 2중 음성의 T 세포 (CD3+CD4-CD8-), 흉선 유래의 2중 양성 T 세포 (CD3+CD4+CD8+)가 있으며, 이를 실험에 사용하였다. 다양한 림프계 조직으로부터 다양한 일차 림프계 세포를 분리하는 것은 섹션 1.3에서 앞서 기술하였다.
4.2.2. KBT 교차-계통의 트리-하이브리드 제조용 세포 하이브리드화 프로토콜
KBT 교차-계통의 트리-하이브리드 제조용 세포 하이브리드화 프로토콜은 KMW 교차-계통의 트리-하이브리드 제조 (섹션 4.1.2)에 사용되는 방법과 비슷하나, 단, 매질, AC 전기장 및 펄스는 달리하였다. 본 실험들에 사용되는 하이브리드화 매질은 230 mM 소르비톨, 1.8 mM KH2PO4, 0.5 mM CaCl2, 0.2 mM Mg(C2H3O2)2 및 0.3 mM Ca(C2H3O2)2로 구성되며 0.3 % BSA가 첨가된 것이다. 0.5 MHz 및 65-75 kV/m의 AC 필드를, 3초 간격의 3회 스퀘어 펄스와 동시에 적용하였고, 이때 각 펄스 폭은 100 μsec이고, 강도는 175-185 kV/m이다. AC 필드는 3번째 스퀘어 펄스를 종료한 후 다시 5초간 지속되게 전원을 켜서, 세포가 하이브리드화되어 교차-계통의 트리-하이브리드 세포가 생성되게 하였다. 이런 새롭게 생성된 교차-계통의 트리-하이브리드 세포의 안정적인 세포주의 회수 및 확립 프로토콜은 섹션 4.1.2에 기술하였다.
4.2.3. KBT 교차-계통의 트리-하이브리드 상태의 검증
세포 표면에서의 CD 마커의 발현
불멸성 골수계 세포 (K562) 1주, 일차 성숙형 B 세포 1주 및 일차 작동자 T 헬퍼 세포 1주로 확립된 KBT 교차-계통의 트리-하이브리드 세포주
교차-계통의 트리-하이브리드 세포주를, 예컨대, 수개월간 정상 배양 조건에서 확립시킨 후, 이 세포주에서 계통 특이적인 CD 마커의 발현에 대해 분석하였다. KBT 세포주의 세포들을, 하이브리드화 이전의 세포 준비에 대해 기술된 바(섹션 1.3.1.1)와 동일한 프로토콜을 이용하여 마우스 항-인간 CD19 및 CD4 항체들로 표지하였다. 도 11(d)는 불멸성 골수단핵 세포 1주와 일차 세포 2주로 확립된 KBT 교차-계통의 트리-하이브리드 세포의 FACS 프로파일 (CD19 및 CD4 표지)을 보여준다. 전형적으로, 안정적인 교차-계통의 트리-하이브리드에서 세포의 95% 이상이 B 및 T 세포 둘다에 대한 CD 마커를 발현하였으며, 그 강도는 모 세포인 일차 세포와 비슷하였다.
불멸성 골수계 세포주 (K562) 1주 및 일차 항원-경험한 림프계 세포 (B 및 T 세포) 2주로부터 확립한, KBT 교차-계통의 트리-하이브리드 세포주
다른 구현예에서, K562 세포 1주, 항원-경험한 B 세포 1주 및 항원-경험한 T 세포 1주의 세포 하이브리드화로 만든 KBT 세포주를 확립하였다. 이 세포를 FACS를 이용하여 CD19, CD3 및 CD5의 공동-발현에 대해 분석하였다.
간략하게, 세포를 세포 하이브리드화 이전의 세포 준비(섹션 1.3.1.1)에서와 동일한 프로토콜을 이용하여 마우스 항-인간 CD5-FITC 및 마우스 항-인간 CD19-PE 또는 마우스 항-인간 CD4-PE 항체들로 표지하였다. 도 12에, 이러한 KBT 교차-계통의 트리-하이브리드 세포주의 세포의 FACS 프로파일을 나타낸다. 그 결과, KBT 세포 집단의 5-10%는 CD 분자의 세포 표면 발현을 유지하여 항원 노출 기억을 유지하고 있었으며, CD3 및/또는 CD19에 양성이었다. CD5 음성 세포 집단의 83% 이상이, B 계통 (CD19) 및 T 계통 (CD3) 마커 양자를 공동-발현하였다.
불멸성 골수계 세포 (K562) 1주, 활성화된 B 세포 1주 및 일차 2중 양성의 미구속된 작동자 T 세포 1주로부터 확립된 KBT 교차-계통의 트리-하이브리드 세포주
다른 구현예에서, K562 1주, 흉선에서 분리한 T 세포(CD4+ 및 CD8+에 2중 양성) 1주 및 골수로부터 분리된 활성화된 B 세포 (CD20+ 및 CD72+) (섹션 1.3.34) 1주의 세포 하이브리드화에 의해 파생된 KBT 세포주를 확립하였다. 이 세포를 세포 표면에서의 CD4, CD8, CD20 및 CD72의 공동-발현에 대해 분석하였다.
간략하게, KBT 교차-계통의 트리-하이브리드 세포를, 마우스 항-인간 CD4-PE 및 마우스 항-인간 CD72-FITC 항체들 또는 마우스 항-인간 CD20-PE 및 마우스 항-인간 CD8-FITC 항체들 또는 마우스 항-인간 CD4-PE 및 마우스 항-인간 CD8-FITC 항체들의 항체 조합으로, 일차 림프구의 분리용으로 기술된 바(섹션 1.3.3.1.1)와 동일한 프로토콜을 이용하여, 표지하였다. 도 13은 이러한 교차-계통의 트리-하이브리드 세포의 FACS 프로파일을 보여준다.
그 결과(도 13 참조), KBT 교차-계통의 트리-하이브리드 세포의 99%가, 그 표면에 2중 양성의 T 세포 유래의 CD4 또는 CD8를 발현하고 있었고, 그 중 66-71%는 CD4에 양성이고, 88-89%는 CD8에 양성이었다. 이들 세포들 중 60%는 CD4와 CD8을 동시에 발현하였다. 세포의 61%가 2중 양성 흉선 세포로부터 유래된 CD4에 양성이면서, 또한, 골수의 활성화된 B 세포 유래의 CD72에도 양성이었다. 그러나, 교차-계통의 트리-하이브리드 집단에서 94%만 표면에 CD72를 발현하였다. 한편, CD8 양성인 교차-계통의 트리-하이브리드 세포들 중 31%가 CD20도 공동-발현하였다. CD20에 양성인 세포의 총 비율은 39%였다.
4.3. 불멸성 림프계 1주, 일차 림프계 세포 1주 및 일차 골수단핵구 세포 1주로부터의 교차-계통의 트리-하이브리드의 제조 -WTM
본 실시예는, 불멸성 인간 B 림프계 세포 (WIL2NS) 1주, 일차 인간 T 세포 1주 및 일차 인간 단핵구 1주로부터 교차-계통의 트리-하이브리드 세포주를 제조하는 일 예이다. 교차-계통의 트리-하이브리드주는 WTM 다음에 시리얼 번호를 붙인다.
4.3.1. WTM 교차-계통의 트리-하이브리드 집단을 위한 세포 준비
WTM 교차-계통의 트리-하이브리드의 제조에 사용되는 WIL2NS 세포의 준비에 대해서는 섹션 4.1.1에 기술되어 있다. 일차 세포로는, 비장 및 말초 혈액 유래의 CD14+CD16- 또는 CD14+CD16L 단핵구; 비장, 말초 혈액, 제대혈 및 흉선 유래의 헬퍼 T 세포(CD4+); 비장, 말초 혈액, 제대혈 및 흉선 유래의 세포독성 T 세포 (CD8+); 제대혈 유래의 항원 경험한 T 세포 (CD3+CD5+) 및 CD3+ T 세포; 흉선유래의 2중 음성의 T 세포 (CD3+CD4-CD8-) 및 2중 양성의 T 세포 (CD3+CD4+CD8+)를 이러한 실험에 사용하였다. 다양한 림프계 조직으로부터 다양한 일차 림프계 세포를 분리하는 것은 앞서(섹션 1.3.3) 기술하였다. 특정 구현예에서, 골수 유래의 CD34+CD15+ 골수단핵구성 기원체 세포를 CD14 양성 단핵구 대신 사용하였다.
4.3.2. WTM 교차-계통의 트리-하이브리드 제조용 세포 하이브리드화 프로토콜
WTM 교차-계통의 트리-하이브리드 제조용 세포 하이브리드화 프로토콜은 KMW 교차-계통의 트리-하이브리드 제조 (섹션 4.1.2)에 사용되는 방법과 비슷하나, 단, 매질은 달리하였다. 본 실험들에 사용되는 하이브리드화 매질은 230 mM 소르비톨, 1.8 mM KH2PO4, 0.5 mM CaCl2, 0.3 mM Mg(C2H3O2)2 및 0.25 mM Ca(C2H3O2)2 (Sigma)로 구성되며 0.3 % BSA가 첨가된 것이다. 섹션 4.2.2에 기술된 바에 따른 정확한 전기적 프로토콜을 WTM의 제조에 이용하였다. 이런 새롭게 생성된 교차-계통의 트리-하이브리드 세포의 안정적인 세포주의 회수 및 확립 프로토콜은 섹션 4.1.2에 기술되어 있다.
4.3.3. WTM 교차-계통의 트리-하이브리드 상태의 검증
CD 마커의 발현
불멸성 림프계 세포 (WIL2NS) 1주, 일차 T 세포 1주 및 일차 단핵구 1주로 확립된 WTM 교차-계통의 트리-하이브리드 세포주
WIL2NS 세포 1주, 일차 T 세포 1주 및 단핵구 1주의 세포 하이브리드화에 의해 제조되는 WTM 세포주를 확립하였다. 교차-계통의 트리-하이브리드 세포주를, 6개월간 정상 배양 조건(참조 섹션 1.1)에서 배양한 후, 교차-계통의 트리-하이브리드 세포 집단에서 계통 특이적인 CD 마커의 발현에 대해 분석하였다. 3색 FACS 분석을 이용하여, 일차 T 세포를 하이브리드화에 사용하였을 때의, WIL2NS 기원의 CD19, 일차 단핵구 기원의 CD14 및 일차 T 세포 기원의 CD4의 공동-발현을, 검증하였다.
간략하게, 5% BSA가 함유된 PBS 중의 1x106 cells/ml 농도의 WTM 교차-계통의 트리-하이브리드 세포 100 ㎕를, 100 ㎕의 PBS에 현탁하고, 표지된 단일클론 항체(0.5mg/100ml CD14-PerCP, 0.25mg/100 ml CD4-PE, 및 1.0 mg/100 ml CD19-FITC, 모두 BD Pharmingen사 제품임) 또는 적절한 이소형 대조군과 함께, 4℃에서 30분간 인큐베이션하였다. PBS로 잘 헹군 후, 표지된 세포를 FACSCalibur 유세포 측정기와 CellQuest Pro 소프트웨어로 분석하였다.
WTM 교차-계통의 트리-하이브리드 세포의 FACS 프로파일은 도 14에 나타낸다. 불멸성 세포 유래인 마커 CD19의 발현 수준은 교차-계통의 트리-하이브리드 세포 집단들에서 일정하지만, 일차 세포에서 기원한 마커의 발현은 상이한 것으로 보였다. 이러한 특정 경우에, 세포 집단을 CD14 및 CD4 발현의 강도를 토대로 3개의 서브그룹으로 나눌 수 있다: (i) CD4HCD14L; (ii) CD4HCD14H; (iii) CD4LCD14H. 이들 집단 각각은 이후 FACS, MACS 또는 단일 세포 클로닝 등의 표준 기법으로 분리할 수 있으며, 배양 동종성을 유지시키면서 서로 상이한 표현형 특징을 발생시키는 구분되는 교차-계통의 트리-하이브리드 배양물로 증폭시킬 수 있다.
불멸성 림프계 세포 (WIL2NS) 1주, 일차 항원-경험한 T 세포 1주 및 일차 단핵구 1주로부터 확립된 WTM 교차-계통의 트리-하이브리드 세포주
CD5+ 항원-경험한 T 세포를 이용하여 WTM 교차-계통의 트리-하이브리드 세포주를 제작하였을 때, CD5의 CD19 및 CD14와의 동시 발현을 3색 FACS 분석을 이용하여 검증하였다. 프로토콜은 기본적으로 전술한 방법과 동일하였지만, 단, 마우스 항-인간 CD19-FITC 및 마우스 항-인간 CD4-PE 항체 대신 마우스 항-인간 CD19-PE 및 마우스 항-인간 CD5-FITC 항체를 사용하였다. 교차-계통의 트리-하이브리드 세포에서의 이들 CD 발현에 대한 FACS 프로파일을 도 15에 나타낸다. 분석 결과, 불멸성 세포로부터 유래되며 B 세포 표현형을 담당하는 CD19의 발현율은 세포 집단의 약 91-99%로 일관되게 나타나며, 항원-경험한 T 세포 유래의 CD5의 발현과 일차 단핵구 유래의 CD14의 발현은 WMT 하이브리드 세포들 간에 다양하였다. 또한, CD19 양성 세포 중 63%가 CD5에 양성이었고, CD19 양성 세포 중 79%가 CD14에 양성이었다. 특히, CD14의 발현율은 이들 WMT 교차-계통의 트리-하이브리드 세포들 간에도 낮은 수준에서 높은 수준까지 다양하였다. 한편, 이 세포 집단은 CD5+ 및 CD5- 교차-계통의 트리-하이브리드 세포로 명확하게 분류되었다.
불멸성 림프계 세포 (WIL2NS) 1주, 일차 세포독성 T 세포 1주 및 일차 단핵구 1주로부터 확립된 WTM 교차-계통의 트리-하이브리드 세포주
세포독성 CD8 양성 T 세포를 이용하여 WTM 교차-계통의 트리-하이브리드주를 만들고, 본 섹션의 앞에서 기술한 동일한 3색 표지 프로토콜을 이용한 FACS 분석을 수행하여 CD19, CD8 및 CD14의 공동-발현을 검증하였다. 도 16은 WTM 교차-계통의 트리-하이브리드 세포주의 세포들에 대한 CD19, CD8 및 CD14 발현의 FACS 프로파일을 나타낸다. WMT 교차-계통의 트리-하이브리드 세포주들에서 CD19의 발현과 그 수준이 일정하게 유지되었지만, 이들 세포 중 46%만 일차 세포독성 T 세포 유래의 CD8을 낮은 수준으로 공동-발현하였으며, 일차 단핵구 유래의 CD14는 41%만 공동-발현하였다. 특히, WMT 세포들에서의 CD14 발현 수준은 낮은 수준 내지는 높은 수준으로 다양하였다.
불멸성 림프계 세포 (WIL2NS) 1주, 일차 2중 양성 T 세포 1주 및 일차 단핵구 1주로부터의 WTM 교차-계통의 트리-하이브리드 세포주
흉선 유래의 2중 CD 양성 T 세포 (CD4+CD8+)를 WTM 교차-계통의 트리-하이브리드 세포주의 제조에 사용한 경우, CD4 및 CD8의 공동-발현 분석을, CD19, CD8 및 CD14 발현 분석과 더불어 실시하였다. 도 17은 교차-계통의 트리-하이브리드 세포주의 세포에서의 CD4 및 CD8의 공동-발현에 대한 FACS 프로파일을 나타낸다. 2중 양성의 T 세포를 사용한 경우, WTM 교차-계통의 트리-하이브리드 세포들 중 96%가 CD4 및 CD8 모두에 양성이었다. CD4+CD8+ 양성 T 세포 유래의 WTM 교차-계통의 트리-하이브리드 세포에서의 CD19 및 CD14의 발현 프로파일은, 기본적으로, 세포독성 CD8 양성 작동자 T 세포 유래의 WTM 교차-계통의 트리-하이브리드 세포와 비슷하였다.
불멸성 림프계 세포 (WIL2NS) 1주, 일차 T 세포 1주 및 일차 골수단핵구성 기원체 세포 1주로부터 확립된 WTM 교차-계통의 트리-하이브리드 세포주
골수 유래의 CD34+CD15+ 골수단핵구성 세포를 이용하여 WTM 교차-계통의 트리-하이브리드 세포주를 만든 다음, CD19 (B 계통), CD3 (T 계통), CD15 (골수 계통) 및 CD34 (기원체 세포) 표면 마커들을 분석하였다. 간략하게, 이들 WMT 교차-계통의 트리-하이브리드 세포주의 세포를, 마우스 항-인간 CD19-PE, 마우스 항-인간 CD4-FITC (BD Pharmingen) 및 마우스 항-인간 CD15-PerCP 항체의 조합, 또는 마우스 항-인간 CD34-PE, 마우스 항-인간 CD4-FITC 및 마우스 항-인간 CD15-PerCP 항체의 조합으로 표지하였다. 세포 염색은 전술한(섹션 1.3.3.1.1) 프로토콜에 따라 수행하였다. CD34+CD15+ 골수단핵구성 기원체 세포로부터 기원하는 WTM 교차-계통의 트리-하이브리드 세포의 전형적인 발현 프로파일들은 도 18에 나타낸다. 분석에서, WTM 교차-계통의 트리-하이브리드 세포들 중 약 81%가 B 계통 표현형과 골수단핵구 표현형(CD19+CD15+)을 공유하고 있었으며, 또한, CD19+의 61%가 T 계통 마커인 CD4에 양성이었다. CD4+ 교차-계통의 트리-하이브리드 세포 중 34%가 그 표면에 CD34를 보유하고 있었으며, CD34+ 트리-하이브리드 세포 중 68%가 CD15를 발현하였다. 흥미롭게도, CD34+ 교차-계통의 트리-하이브리드 세포 중 28%는 CD34와 CD15가 둘다 동일 소스(골수단핵거 기원체 세포)로부터 유래된 경우라도 CD15의 발현을 유지하지 않았다.
4.4. 불멸성 골수계 세포 세포 1주, 불멸성 림프계 세포 1주 및 일차 림프계 T 세포 1부로부터의 교차-계통의 트리-하이브리드의 제조 - KWT
이 타입의 교차-계통의 트리-하이브리드는, 불멸성 골수계 세포 세포 (K562) 1주, 불멸성 B 림프계 세포 (WIL2NS) 1주 및 일차 인간 T 세포 1주의 세포 하이브리드화에 의해 제조하였다. 이러한 유형의 교차-계통의 트리-하이브리드는 KWT 다음에 시리얼 번호를 붙인다.
4.4.1. KWT 교차-계통의 트리-하이브리드 제조를 위한 세포의 준비
이러한 세포 하이브리드화 실험을 위한 K562 및 WIL2NS 세포의 준비 방법은 섹션 4.1.1에 기술되어 있다. 세포 하이브리드화를 수행하기 전에, 증식율이 가장 높은, 각 세포 타입의 안정적인 클론을 섹션 1.1.1에 기술된 공정을 이용하여 확립하였다. 특정 구현예에서, 섹션 1.1.3에 기술된 CD71+-농화된 세포 집단을 사용하였다. 추가적인 구현예에서, 섹션 1.1.3.1에 기술된 바와 같이 선별된 CD71+-농화된 K562 집단의 CD15+ 세포를 사용하였다. KWT 교차-계통의 트리-하이브리드의 제조에 사용되는 일차 세포는, 비장, 말초 혈액, 제대혈 및 흉선 유래의 헬퍼 T 세포 (CD4+); 비장, 말초 혈액, 제대혈 및 흉선 유래의 세포독성 T 세포 (CD8+); 제대혈 유래의, 항원 경험한 T 세포 (CD3+CD5+) 및 CD3+ T 세포; 흉선 유래의, 2중 음성의 T 세포 (CD3+CD4-CD8-) and 2중 양성 T 세포 (CD3+CD4+CD8+)가 있으며, 이들을 본 실험에 사용하였다(섹션 1.3 참조).
4.4.2. KWT 교차-계통의 트리-하이브리드 제조용 세포 하이브리드화 프로토콜
KWT 교차-계통의 트리-하이브리드 제조용 세포 하이브리드화 프로토콜은, KMW 교차-계통의 트리-하이브리드 제조용 프로토콜과 비슷하였다(섹션 4.1.2 참조).
4.4.3. KWT 교차-계통의 트리-하이브리드 상태 검증
CD 마커의 발현
불멸성 골수계 세포 (K562) 1주, 불멸성 림프계 세포 (WIL2NS) 1주 및 일차 T 세포 1주로부터 확립된 KWT 교차-계통의 트리-하이브리드 세포주
K562 세포 1주, WIL2NS 세포 1주 및 일차 T 세포 1주의 세포 하이브리드화로 파생된 KWT 세포주를 확립하였다. 교차-계통의 트리-하이브리드 세포주를 6개월 동안 정상 배양 조건 하에서 안정화시킨 후, 교차-계통의 트리-하이브리드 세포 집단을 계통 특이적인 CD 마커 발현에 대해 분석하였다. 3색 FACS 분석을 사용하여, K562 기원의 CD15, WIL2NS 기원의 CD19 및 일차 작동자 T 헬퍼 세포 기원의 CD4의 공동-발현을 동정하였다. KWT 교차-계통의 트리-하이브리드 세포의 세포 염색 프로토콜은, KMW 교차-계통의 트리-하이브리드 (섹션 4.1.3)에 대한 프로토콜과 기본적으로 동일하였다. CD4+ 작동자 T 세포 유래의 KWT 교차-계통의 트리-하이브리드 세포의 FACS 프로파일을 도 19에 나타낸다. KWT 교차-계통의 트리-하이브리드 세포 대부분은 골수단핵구, B 및 T 림프계 계통의 혼성 표현형 특징들을 보여주었다. KWT 교차-계통의 트리-하이브리드 세포들은 100%가 일차 작동자 T 세포로부터 유래된 T 림프 계통의 마커인 CD4를 세포 표면 상에 발현하였지만, 이들 세포들 중 54%는 동시에 WIL2NS 세포주의 불멸성 세포로부터 유래된 B 계통 마커인 CD19에 대해서도 양성이었고, 이들 CD4+CD19+ 세포들 중 24%는 불멸성 골수단핵구성 기원체 세포주 K562로부터 유래된 CD15에 대해 양성이었다.
불멸성 골수계 세포 (K562) 1주, 불멸성 림프계 세포 (WIL2NS) 1주 및 2중 양성 T 세포 1주로부터 확립된KWT 교차-계통의 트리-하이브리드 세포주
2중 양성 T 세포 (CD4+CD8+ 세포)를 이용하여 KWT 교차-계통의 트리-하이브리드주를 제조한 경우, 일차 흉선 세포로부터 유래된 CD4와 CD8 양자에 대한 발현 프로파일도 분석하였다. CD 프로파일링 프로토콜은 기본적으로 CD4+ T 세포 유래의 KWT 교차-계통의 트리-하이브리드에 대한 전술한 방법과 동일하였지만, 단, 마우스 항-인간 CD19-FITC 항체 대신 마우스 항-인간 CD8-FITC 항체를 사용하였다. 2중 양성 (CD4+CD8+) T 세포로부터 유래된 교차-계통의 트리-하이브리드 세포의 전형적인 CD 발현 프로파일을 도 20에 나타내었다. 그 결과, KWT 교차-계통의 트리-하이브리드 세포들 중 99%가 CD4에 양성이었고, 69%가 CD8에 양성이었으며, CD4+ 세포의 26%가 CD15 골수단핵 세포 마커에 양성이었고, CD8+ 세포의 23%가 CD15에 양성이었는데, 이는, CD4+CD8+CD15+ 세포가 총 세포 집단의 약 23%임(그 이유는, 세포의 거의 100%가 CD4+이고, 2중 양성 CD8+CD15+ 집단 역시 CD4에 양성이기 때문임)을 의미한다. CD4+ 작동자 T 세포 유래의 KWR 트리-하이브리드에서와 같이, CD19+ 세포는 총 세포 집단의 52%를 차지하였으며, 이들 중 22%는 CD15를 공동-발현하였다. 따라서, 전체 CD15+ 세포 집단은 CD4, CD8 및 CD19를 공동-발현하며, 22-23%를 차지한다.
불멸성 골수계 세포 (K562) 1주, 불멸성 림프계 세포 (WIL2NS) 1주 및 CD5 양성의 항원-경험한 T 세포 1주로부터 확립된 KWT 교차-계통의 트리-하이브리드 세포주
CD5 양성 항원-경험한 T 세포를 사용하여 KWT 교차-계통의 트리-하이브리드주를 확립하는 경우, CD5의 발현을 분석하였다. KWT 하이브리드 세포를 마우스 항-인간 CD19-FITC 및 마우스 항-인간 CD5-PE 항체로, TM 교차-계통의 트리-하이브리드의 분석에 사용된 동일한 프로토콜을 이용하여 표지하였고, 단, 마우스 항-인간 CD19와 마우스 항-인간 CD5 항체 사이에 형광 접합체는 역방향으로 사용하였다(섹션 4.6). 그 결과는 도 21에 나타내는데, KWT 교차-계통의 트리-하이브리드 세포들 중 90%가 항원-경험한 T 세포로부터 기원한 CD5에 양성이었고, CD5 세포들 중 49%가 또한 WIL2NS 세포 (B 세포) 기원의 CD19에도 양성이었다. 교차-계통의 트리-하이브리드 세포들에서, CD19+인 세포의 총 비율은 56%였다.
4.5.불멸성 림프계 세포 (WIL2NS) 2주와 일차 단핵구 1주로부터의 교차-계통의 트리-하이브리드의 제조 - WWM
이러한 타입의 교차-계통의 트리-하이브리드는, 불멸성 림프계 세포 (WIL2NS) 2주와 일차 인간 단핵구 1주를 체세포 하이브리드화하여 제조하였다. 교차-계통의 트리-하이브리드는 WWM에 시리얼 번호를 붙여 표시하였다.
4.5.1. WWM 교차-계통의 트리-하이브리드 제조를 위한 세포 준비
WIL2NS 세포주는 섹션 4.1.1에 기술된 동일한 공정으로 배양하였다.
특정 구현예에서, 섹션 1.1.3에서와 같이 확립한 D71+-농화된 세포 집단을 사용하였다. 인간 단핵구는 비장, 말초 혈액 또는 제대혈로부터 기원한 혼성 림프구로부터 분리하였다. 단핵구의 분리는 CD14 마커의 발현을 토대로 실시하였고, 일부 경우에는, 섹션 1.3.3.1.1에서 전술한 FACS 또는 자기 비드를 이용하여 CD16의 저발현율을 토대로 실시하였다. 여러가지 림프계 조직으로부터 유래된 단핵구를 사용하였을 때, 하이브리드화 파라미터 또는 제조되는 교차-계통의 트리-하이브리드 간에는 차이가 없는 것으로 나타났다.
4.5.2. WWM 교차-계통의 트리-하이브리드 제조용 세포 하이브리드화 프로토콜
WWM 교차-계통의 트리-하이브리드 제조용 세포 하이브리드화 프로토콜은 KBT 교차-계통의 트리-하이브리드 제조용 프로토콜과 유사하였다(섹션 4.2.2 참조).
4.5.3. WWM 교차-계통의 트리-하이브리드 상태 검증
CD 마커의 발현
WWT 교차-계통의 트리-하이브리드 세포주가 6개월간 정상 배양 조건(섹션 1.1 참조)에서 안정화된 후, 교차-계통의 트리-하이브리드 세포 집단을 계통 특이적인 CD 마커의 발현에 대해 분석하였다.
이중 염색 또는 마우스 항-인간 CD19-FITC 및 마우스 항-인간 CD14-PE 항체를 이용한 표지를 적용하여, 제조되는 교차-계통의 트리-하이드리드의 교차-계통 마커 발현을 프로파일링하였다. 도 22a는 이러한 교차-계통의 트리-하이브리드 세포의 전형적인 CD 프로파일을 보여준다. 교차-계통의 트리-하이브리드 세포들에서, 온코진-관련된 마커 CD19의 발현은 일관된 것으로 나타났다. 일부 세포들(23.5%)에서는 표면에 CD14의 발현이 확인되었고, 나머지 72.7%에서는 CD14의 표면 발현이 없었다.
4.6. 비-인간 포유류 세포를 이용한 교차-계통의 트리-하이브리드
아래 실시예는, 교차-계통의 트리-하이브리드를 인간 세포 이외의 포유류 세포, 구체적으로 마우스 세포를 이용하여 제조할 수 있음을 보여준다. 동일한 원리는 다른 포유류 세포로부터 교차-계통의 트리-하이브리드를 제조하는데에도 적용할 수 있는 것으로 이해된다.
4.6.1. 불멸성 마우스 림프계 세포 1주, 일차 마우스 림프계 세포 1주 및 일차 마우스 단핵구 1주로부터의 교차-계통의 트리-하이브리드의 제조
본 섹션에서는, 불멸성 마우스 B 림프계 세포 (Sp2), 일차 마우스 T 세포 1주 및 일차 마우스 단핵구 1주로부터 교차-계통의 트리-하이브리드 세포주를 제조하는 방법을 설명한다. 교차-계통의 트리-하이브리드주는 STmMm에 시리얼 번호를 붙여 표시한다.
4.6.1.1. STmMm 교차-계통의 트리-하이브리드 제조를 위한 세포 준비
STmMm 교차-계통의 트리-하이브리드의 제조에 사용되는 Sp2 세포의 준비 과정은 섹션 1.1.4에 기술되어 있다. 말초 혈액으로부터 유래된 CD11b+CD90-B220-CD49b-NK1.1-Ly6G-/low 단핵구; 비장 또는 말초 혈액로부터 유래된 마우스 헬퍼 T 세포 (CD4+); 비장 또는 말초 혈액으로부터 유래된 마우스 세포독성 T 세포 (CD8+); 및 비장 또는 말초 혈액으로부터 유래된 2중 양성 T 세포 (CD4+CD8+) 등의 일차 마우스 세포를 본 실험에 사용하였다. 비장 및 말초 혈액으로부터 다양한 일차 마우스 림프계 세포를 분리하는 과정은 앞 (섹션 1.3.5)에 기술되어 있다.
4.6.1.2. STmMm 교차-계통의 트리-하이브리드 제조용 세포 하이브리드화 프로토콜
STmMm 교차-계통의 트리-하이브리드 제조용 세포 하이브리드화 프로토콜은 WTM 교차-계통의 트리-하이브리드 제조 (섹션 4.3.2 참조)에 사용되는 프로토콜과 유사하였나, 단, 매질, AC 전기장 및 펄스를 달리하였다. 본 실험에 사용된 하이브리드화 매질은, 265 mM 소르비톨, 1.5 mM KH2PO4, 0.4 mM CaCl2, 및 0.3 mM Mg(C2H3O2)2 (Sigma)로 구성되며, 0.2 % BSA에 첨가된 것이다. AC 필드 0.5 MHz 및 65-75 kV/m을, 3초 간격의 3회 스퀘어 펄스를 동시에 가하였으며, 각 펄수의 폭은 70 μsec이고 강도는 250-280 kV/m이었다. 새롭게 형성된 교차-계통의 트리-하이브리드 세포의 안정적인 세포주의 회수 및 확립을 위한 프로토콜은 섹셕 4.1.2에 기술되어 있다.
4.6.1.3. STmMm 교차-계통의 트리-하이브리드 상태의 검증
Sp2 세포 1주, 일차 마우스 T 세포 1주 및 마우스 단핵구 1주의 세포 하이브리드화로 파생된 STmMm 세포주를 확립하였다. 교차-계통의 트리-하이브리드 세포주를 6개월간 정상 조건(섹션 1.1 참조) 하에 배양한 후, 교차-계통의 트리-하이브리드 세포 집단에서 계통 특이적인 CD 마커에 대해 분석하였다. 일차 T 세포를 하이브리드화에 사용하였을 때, 3색 FACS 분석을 이용하여, Sp2 세포 기원의 CD138, 일차 마우스 단핵구 기원의 CD11b 및 일차 마우스 T 세포 기원의 CD4의 공동-발현을 검증하였다.
간략하게, 5% BSA가 함유된 PBS 중의 1x106 cells/ml 농도의 STmMm 교차-계통의 트리-하이브리드 세포 100 ㎕를, 100 ㎕의 PBS에 현탁하고, 마우스 CD138-PE, CD11b-FITC 및 CD4-PerCP에 대한 표지된 랫 단일클론 항체(BD Pharmingen) 또는 적절한 이소형 대조군과 함께, 4℃에서 30분간 인큐베이션하였다. PBS로 잘 헹군 후, 표지된 세포를 FACSCalibur 유세포 측정기와 CellQuest Pro 소프트웨어로 분석하였다.
STmMm 교차-계통의 트리-하이브리드 세포의 FACS 프로파일은 도 47에 나타낸다. 교차-계통의 트리-하이브리드 세포 집단들에서 B 계통의 불멸성 세포 유래 마커인 CD138 발현 수준은 일정한 것으로 보이지만, 일차 세포 기원의 마커들의 발현은 다양한 것으로 보였다. 이러한 특정 예에서, CD138과 함께 CD4 또는 CD11b 중 하나를 공동-발현하지 않는 세포의 비율은 상대적으로 낮았다(도 47a 및 b 참조). STmMm 세포에서 CD4 및 CD11b의 공동-발현을 분석하였을 때(도 47c), 세포의 약 82%가 공동 발현한다는 것이 확인되었다. 효율적으로, 세포 집단의 82%가 3종의 CD 마커 모두를 발현하였으며, CD138은 양성이나 CD4 또는 CD11b 중 어느 하나를 공동-발현하지 않는 세포는 5%에 불과하였다. 이들 다양한 집단들 각각을 FACS, MACS 또는 단일 세포 클로닝 등의 표준 기법에 의해 분리하여, 배양 동종성을 유지시키면서 서로 상이한 표현형 특징을 발생시키는 구분되는 교차-계통의 트리-하이브리드 배양물로 증폭시킬 수 있다.
STmMm 트리-하이브리드의 제조에 세포독성의 CD8 양성 림프구를 사용하는 경우, 제조되는 트리-하이브리드 세포에서의 CD 공동-발현 분석을 위해, 항-CD4-PerCp 대신, 랫 항-마우스 CD8-PerCp 항체를 사용하였다. 도 48에서 볼 수 있는 바와 같이, 트리-하이브리드 세포 중 97 - 100%가 CD138에 양성(도 48a 및 b)이었고, 이들 세포 중 56% 또는 57%가 CD8 (도 48b) 또는 CD11b (도 48a)을 공동-발현하였다. 트리-하이브리드 집단 중 40% 이상이 CD138, CD8 및 CD11b의 3종의 마커 모두를 발현하였다 (도 48c).
2중 양성 CD4+CD8+ T 세포의 경우, 1차 분석은 세포독성 T 세포와 동일한 수단으로 수행하였다. 도 49는, 제조되는 트리-하이브리드 상에서의 CD138, CD11b 및 CD8 발현의 FACS 프로파일을 보여준다. 트리-하이브리드 세포의 98-100%가 CD138에 양성이었고, 전체 집단의 57-60%는 3종의 마커 모두에 대해 양성이었다 (도 49c). CD138 및 CD8의 공동-발현은 세포의 93%에서 검출되었다 (도 49b). 2번째 단계로, 트리-하이브리드 세포에서 CD8 및 CD4의 공동-발현을 체크하였다. 세포를 랫 항-마우스 CD8-PE 및 랫 항-마우스 CD4-FITC 항체 (BD Pharmingen)로 표지하였다. 도 50은, CD8 및 CD4 발현에 대한 FACS 프로파일을 보여준다. 트리-하이브리드 세포의 95%는 표면에 CD8을 발현하였지만, 세포의 50%에서는 동시에 CD4를 공동-발현하였다. 특히, 실질적으로 전체 CD4 양성 집단들은 CD8에 대해서도 양성이었다.
4.6.2. 불멸성 마우스 림프계 세포 2주와 일차 마우스 단핵구 1주로부터의 교차-계통의 트리-하이브리드의 제조
본 실시예는 불멸성 마우스 B 림프계 세포 (Sp2) 2주와 일차 마우스 단핵구 1주로부터의 교차-계통의 트리-하이브리드 세포주의 제조에 대해 상세하게 기술한다. 교차-계통의 트리-하이브리드주는 SSMm에 시리얼 번호를 붙여 표시하였다.
4.6.2.1. SSMm 교차-계통의 트리-하이브리드 제조를 위한 세포 준비
SSMm 교차-계통의 트리-하이브리드의 제조에 사용되는 Sp2 세포의 준비에 대해서는 섹션 1.1.4에서 앞서 기술하였다. 말초 혈액으로부터 유래된 일차 마우스 CD11b+CD90-B220-CD49b-NK1.1-Ly6G-/low 단핵구를 본 실험에 사용하였다. 말초 혈액으로부터의 일차 마우스 단핵구의 분리에 대해서는 앞에서 기술하였다 (섹션 1.3.5).
4.6.2.2. SSMm 교차-계통의 트리-하이브리드 제조용 세포 하이브리드화 프로토콜
SSMm 교차-계통의 트리-하이브리드 제조용 세포 하이브리드화 프로토콜은 STmMm 교차-계통의 트리-하이브리드 제조용 프로토콜(섹션 4.6.1.2)과 동일하였다.
4.6.2.3. SSMm 교차-계통의 트리-하이브리드 상태의 검증
SSMm 교차-계통의 트리-하이브리드 세포주를 6개월간 정상 배양 조건(섹션 1.1 참조) 하에서 안정화시킨 후, 교차-계통의 트리-하이브리드 세포 집단에서 계통 특이적인 CD 마커의 발현을 분석하였다.
2중 염색 또는 랫 항-마우스 CD138-PE 및 랫 항-마우스 CD11b-FITC 항체 (BD Pharmingen)를 이용한 표지를 수행하여, 제조되는 교차-계통의 트리-하이브리드의 교차-계통 마커 발현에 대한 프로파일을 작성하였다. 도 51은 이러한 교차-계통의 트리-하이브리드 세포의 전형적인 CD 프로파일을 보여준다. 교차-계통의 트리-하이브리드 세포에서의 온코진-관련 마커 CD138의 발현은 일정한 것으로 나타났으며, 세포의 7%에서만 CD138에 음성이었다. 세포의 큰 비율(70%)에서 그 표면에 CD11b 발현이 나타났고, CD138 양성 세포의 나머지 23%는 CD11b 표면 발현에 음성이었다.
4.7. 인간 및 비-인간 포유류 세포를 이용한, 교차-계통 키메라 트리-하이브리드 제조
본 실시예는, 인간 및 비-인간 포유류 세포, 특히 마우스를 이용한, 교차-계통의 키메라 트리-하이브리드의 제조 과정을 상세하게 기술한다. 동일한 원리는 포유류 세포 이외의 세포로부터 교차-계통의 트리-하이브리드를 제조하는데에도 적용할 수 있다.
4.7.1. 불멸성 마우스 림프계 세포 1주, 불멸성 인간 림프계 세포 1주 및 일차 마우스 또는 인간 단핵구 1주로부터의 교차-계통의 키메라 트리-하이브리드의 제조
불멸성 마우스 B 림프계 세포 (Sp2) 1주, 불멸성 인간 B 림프계 세포 (WIL2NS) 1주 및 일차 마우스 또는 인간의 단핵구 1주로부터 교차-계통의 키메라 트리-하이브리드 세포를 제조하였다. 교차-계통의 트리-하이브리드주는, 마우스 단핵구가 사용된 경우에는 SWMm으로, 인간 단핵구가 사용된 경우에는 SWMh로 표시하였다. 각 경우에, 트리-하이브리드의 약칭에 시리얼 번호를 붙였다.
4.7.1.1. SWMm 및 SWMh 교차-계통의 키메라 트리-하이브리드 집단을 위한 세포 준비
SWMm 및 SWMh 교차-계통의 키메라 트리-하이브리드의 제조에 사용되는 Sp2 및 WIL2NS 세포의 준비는, 각각 섹션 1.1.4 및 섹션 1.1.3에 기술하였다. 말초 혈액 유래의 일차 마우스 CD11b+CD90-B220-CD49b-NK1.1-Ly6G-/low 단핵구를 본 실험에 사용하였다. 말초 혈액 유래의 일차 마우스 단핵구의 분리에 대해서는 앞에서 기술하였다(섹션 1.3.5). 비장, 말초 혈액 또는 제대혈로부터 기원한 혼성 림프구로부터 인간 단핵구를 분리하였다. 단핵구의 분리는 CD14 마커의 발현과, 일부의 경우에는, 섹션 1.3.3.1.1에서 앞서 기술한 바와 같이 FACS 또는 자기 비드 중 어느 하나를 이용한 CD16의 저발현을 토대로 수행하였다. 여러가지 림프계 조직 유래의 단핵구를 사용하였을 때, 하이브리드화 파라미터 또는 제조되는 교차-계통의 트리-하이브리드에 차이가 없는 것으로 나타났다.
4.7.1.2. SWMm 및 SWMh 교차-계통의 키메라 트리-하이브리드 제조용 세포 하이브리드화 프로토콜
SWMm 및 SWMh 교차-계통의 트리-하이브리드 제조용 세포 하이브리드화 프로토콜은, STmMm 교차-계통의 트리-하이브리드 제조용 프로토콜(섹션 4.6.1.2 참조)과 동일하였다.
4.7.1.3. SWMm 및 SWMh 교차-계통의 키메라 트리-하이브리드 상태의 검증
SWMm 및 SWMh 교차-계통의 키메라 트리-하이브리드 세포주들을 6개월간 정상 배양 조건(섹션 1.1 참조)에서 안정화시킨 후, 교차-계통의 키메라 트리-하이브리드 세포 집단들에서 계통 특이적인 CD 마커의 발현을 분석하였다.
인간 CD71 및 마우스 TfR의 발현에 대한 2중 염색을 수행하여, 제조되는 트리-하이브리드의 키메라 현상을 확립하였다. 도 52는 세포 100%가 인간 및 마우스 트랜스페린 수용체 둘다에 대해 양성으로 나타난 이러한 분석의 전형적인 FACS 프로파일을 보여준다. 이는, 마우스 및 인간 세포 분열 대조군들에 대한 트리-하이브리드 의존성(tri-hybrid reliance)을 보여준다.
인차 단핵구의 마우스 또는 인간 소스에 따라, 2중 염색 또는 랫 항-마우스 CD138-PE 및 랫 항-마우스 CD11b-FITC 항체 (BD Pharmingen) 또는 랫 항-마우스 CD138-PE 및 마우스 항-인간 CD14-FITC 항체 (BD Pharmingen)를 이용한 표지를 적용하여, 제조되는 교차-계통의 키메라 트리-하이브리드의 교차-계통 마커 발현을 프로파일링하였다. 도 53은 이러한 교차-계통의 키메라 트리-하이브리드 세포의 전형적인 CD 프로파일을 보여준다. 마우스 Sp2 세포주 유래의 온코진-관련된 마커 CD138의 발현은 마우스 또는 인간 소스의 단핵구에 의존되는 것으로 보였다. 마우스 CD138 양성 세포 퍼센트는, SWMm 트리-하이브리드에서 84%에서, SWMh 트리-하이브리드에서 29%로 하락되었다. 그러나, SWMh 키메라 트리-하이브리드 세포의 96%는 WIL2NS 유래의 인간 CD19에 양성(도 54)이었으나, SWMm 키메라 트리-하이브리드에서 인간 CD19를 발현하는 세포는 없었다.
실시예 5
5. 교차-계통의 트리하이브리드에서 CD 마커 분포를 토대로 한 특이적인 교차-계통 표현형을 가진 세포의 농화
아래 섹션은 여러가지 표현형 특징들을 기초로 교차-계통의 트리-하이브리드 세포주의 서브라인을 확립하는 일 예를 제공한다. 접근 방법은 계통 특이적인 세포 표면 마커의 분석, 계통 특이적인 마커의 세포내 발현, 계통 특이적인 마커의 RNA 전사체의 존재, 핵형 분석, 및/또는 계통 특이적인 단백질의 분비를 토대로 하였다. 원하는 특징을 가진 교차-계통의 트리-하이브리드 세포를 FACS에 의해 일반 집단(general population)에서 분리하였다. 아래 실시예는, CD14의 발현: 양성 및 음성을 토대로 2가지의 트리-하이브리드 집단이 포함된, WWM 교차-계통의 트리-하이브리드를 기초로 한다. 그러나, 이 실시예는 특정 교차-계통의 트리-하이브리드나 선택 마커에 한정되지 않는다.
WWM 교차-계통의 트리-하이브리드 세포를 CD14 양성 분획과 CD14 음성 분획으로 분류하고, 각 분획을 3개월 동안 각각 배양하여 증식시키고 유지시켰다. 도 22b는 CD14 발현을 유지하는 교차-계통의 트리-하이브리드 세포가 95% 보다 높다는 것을 보여주는데, 도 22c에서 세포 집단은 계속적으로 CD14에 음성이었다. 이는, 동일한 교차-계통의 트리-하이브리주로부터 유래된 여러가지 동종의 세포 집단들을 분리 및 확립할 수 있음을 입증한다.
RT-PCR을 통한 교차-계통의 트리-하이브리드의 검증
제조된 서브라인들의 교차-계통의 트리-하이브리드 성질을 검증하기 위해, 오리지날 교차-계통의 트리-하이브리드 세포, CD19+CD14+ 농화된 서브배양물 및 CD14 음성 서브배양물을 CD14에 대해 RT-PCR을 수행하였다. 양성 대조군으로 인간 CD14+ 단핵구를 사용하였다. 대조군 세포를 전술한 바(섹션 1.3.3)와 같이 FACS를 이용하여 말초 혈액으로부터 분리하였다.
간략하게, RNeasy 키트 (RNeasy Mini kit, Qiagen)를 이용하여 배양한 세포로부터 총 RNA를 분리하였다. cDNA 합성은 cDNA-키트 (Amersham Pharmacia)를 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였고, PCR을 기본적으로 Sewing 등이 언급한 바와 같이 수행하였다. PCR 반응 혼합물을 (2%) 아가로스 겔 전기영동으로 분석하고, 에티듐 브로마이드 염색으로 가시화하였다. 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍은, 450bp의 PCR 산물 증폭을 위한, 5'-프라이머 5'-CACACTCGCCTGCCTTTTCC-3' (서열번호: 1) 및 3'-프라이머　5'-　GATTCCCGTCCAGTGTCAGG-3' (서열번호: 2)의 서열을 가진다.
도 23에 나타낸 바와 같이, RT-PCR에서, 오리지날 WWM 배양물 함유 세포 및 오리지날 WWM 배양물의 CD14+ 농화된 서브배양물에서의, CD14 mRNA 전사체가 존재하는 것으로 나타났다. 또한, CD14 mRNA는 CD14가 표면에 없는 WWM 서브배양물에서도 인간 CD14+ 단핵구와 비슷한 수준으로 검출되었다.
실시예 6
6. 핵형 분석
교차-계통의 트리-하이브리드의 세포형성(cytogenic) 특징들을 확립하고 이의 하이브리드 오리진을 검증하기 위해, 교차-계통의 트리-하이브리드의 염색체 핵형 분석을 수행하였다.
6.1. 오리지날 세포주의 핵형 분석
예로, K562 및 WIL2NS 세포주의 세포들을 초기 계대와 후기 계대에서 핵형을 분석하여, 오리지날 세포주의 모든 염색체 불안정성을 기록하였다. 해당 세포주, 예컨대 K562 세포주의 경우, 막 해동시킨 세포주의 핵형이, 수개월간 정상 배양 조건에서 유지시킨 세포주의 핵형과 동일하다는 것을 확인하였다.
도 24 및 25는 각각 K562 및 WIL2NS 세포의 전형적인 핵형을 도시한 것이다. 양자에서, 총 20개의 G-밴드형의 중기 세포를 400bphs에서 조사하였다.
핵형 분석 결과, K562 세포주에 3배체 특징을 가진, 즉, 다양한 염색체 이상이 있는 염색체 수가 69개인 단일 클론이 포함된 것으로 나타났다. 반면, WIL2NS 세포주에는, K562 세포와 비교하여, 확연히 구분되는 염색체 이상이 있는 47 - 49개의 염색체를 가진 5종 2배체 클론들이 포함되어 있었다.
CLONE 1 10%를 차지함
CLONE 2 55%를 차지함
CLONE 3 10%를 차지함
CLONE 4 20%를 차지함
CLONE 5 5%를 차지함
표 2(하기)는 K562 및 WIL2NS 세포주의 복잡합 핵형 분석 결과를 종합하여 나타낸다. 상기 2종의 세포주 간의 공유되는 이상은 없다. WIL2NS 세포주의 모든 클론들에 존재하는 염색체 이상들은 청색으로 강조 표시한다.
Figure pct00001
6.2. 단백질 발현에 사용되는 교차-계통의 트리-하이브리드의 핵형 분석
3가지 다른 계통의 불멸성 세포와 일차 세포의 다양한 조합으로 유래되며, 추가로 원하는 단백질의 발현을 위해 사용된 교차-계통의 트리-하이브리드의 핵형을 분석하였다. 또한, 이러한 핵형을, 교차-계통의 트리-하이브리드의 제조에 사용된 오리지날 불멸성 세포주의 핵형과 비교하였다.
6.2.1. KBT 교차-계통의 트리-하이브리드주의 핵형 분석
K562 불멸성 골수계 세포주와 일차 B 및 T 림프구로부터 유래된 KBT 교차-계통의 트리-하이브리드주 2주의 핵형을 분석하였다. 활성화된 B 세포 (CD20+CD72+)와 2중 양성 T 세포 (CD4+CD8+)로부터 유래되며 이의 CD 발현 특징들을 토대로 다양한 세포 타입을 나타내는, KBT 교차-계통의 트리-하이브리드(섹션 4.2.3)도, 비교를 위해 핵형을 분석하였다. 도 26에 K562 + B(CD19+) + T(CD4+) 하이브리드화로 유래된 KBT 교차-계통의 트리-하이브리드주, KBT-1으로 칭해지는 세포주의 전형적인 핵형 분석 결과를 나타낸다. KBT-1의 단일 세포 클론은 거의 3배체이며, 염색체의 수(modal number)는 66개인 것으로 나타났다.
K562 세포, B (CD20+CD72+) 세포 및 T (CD4+CD8+) 세포로부터 유래되며, KBT-2 주로 표시되는, KBT 교차-계통의 트리-하이브리드주의 핵형을 분석한 결과, KBT-2 주의 핵형(이전 섹션에서 CD 발현에 편차가 확인된 세포주)은 거의 3배체인 클론 4가지로 구성된 것으로 확인되었다. Clone 1. Clone 2, Clone 3 및 Clone 4는 세포 집단의 45%, 30%, 15% 및 10%를 차지하였다. Clone 4의 염색체 수는 66개이고, 다른 클론들의 염색체 수는 각각 67개였다. 도 27에 KBT-2 세포주의 클론들 중 하나의 클론의 핵형 분석 결과를 나타낸다.
표 3에 KBT-1 및 KBT-2 세포주의 핵형 분석 결과를 요약 기술한다. 표에서 제1열은 염색체 번호이다. del(3)(p14), der(4)t(4;?)(q25;?), +der(7)t(7;mar3)(q10;q10)and der(X)t(X;?;?)(q13;?;?) 와 같은 염색체의 일부 변화들은, 일차 림프계 세포의 서브타입과는 무관하게 모든 교차-계통의 트리-하이브리드에 공유되어 있었지만, K562 세포에서는 공유되지 않았다.
표 3. 다른 일차 림프계 세포 서브타입과 온코진 소스로서 K562 골수계 세포주로부터 유래된 KBT-1 및 KBT-2의 비교 분석 결과의 종합. KBT-1 및 KBT-2 교차-계통의 트리-하이브리드주에서 공유되는 K562 세포주의 염색체의 이상은 청색으로 강조 표시하였다. KBT 교차-계통의 트리-하이브리드주의 클론들에서 공유되어 있지만 오리지날 K562 세포주에는 공유되어 있지 않은, 염색체 이상은 적색으로 강조 표시하였다. KBT 교차-계통의 트리-하이브리드 중 일부에 존재하며 K562 세포주로부터 유래된, 염색체 이상은 녹색으로 강조 표시하였다.
Figure pct00002
6.2.2. KWT 교차-계통의 트리-하이브리드주의 핵형 분석
K562 불멸성 골수계 세포주, WIL2NS 불멸성 B 림프계 세포주 및 일차 T 림프구로부터 유래된 KWT 교차-계통의 트리-하이브리드주 3종의 핵형을 분석하였다. 2중 양성 T 세포 (CD4+CD8+) (KWT-3)로부터 유래되며 이의 CD 발현 특징들을 기초로 다양한 세포 타입을 나타내는(섹션 4.4.3), KWT 교차-계통의 트리-하이브리드도 비교를 위해 핵형 분석하였다.
도 28, 29 및 30은 각각 KWT-1, KWT-2 및 KWT-3 교차-계통의 트리-하이브리드주의 전형적인 핵형을 도시한다. 각 경우에, 총 20개의 G-밴드형의 중기 세포를 400bphs에서 조사하였다. KWT-1에는 거의 6배체(6n = 138개의 염색체)인 단일 클론이 포함되어 있었다. 염색체의 수는, 핵형이 상이한, 즉 분석한 세포들이 모두 일부 염색체 이상을 공유하고 있는, 129 내지 140개이다. KWT-2에는 또한 거의 6배체인 단일 클론이 포함되어 있었다. 염색체의 수는 135-145개이고, 핵형이 이종적이었다. KWT-3에는 5배체 이상(n>115)인 클론 3개가 포함되어 있었다. Clone 1, Clone 2 및 Clone 3는 각각 세포 집단의 55%, 20% 및 25%를 차지한다. KWT 교차-계통의 트리-하이브리드의 핵형 분석에서, K562 세포주와 WIL2-NS 세포주의 유전자 특징들이 이의 제조에 사용된 일차 R 세포 타입과 무관하게, 모든 KWT 교차-계통의 트리-하이브리드주들에 유지되는 것으로 확인되었다. 표 4에 이들 KWT 교차-계통의 트리-하이브리드 (즉, KWT-1, KWT-2 및 KWT-3 세포주)의 비교 분석 결과를 요약 개시한다.
표 4. 여러가지 일차 T 세포 타입으로부터 유래된 KWT 교차-계통의 트리-하이브리드의 비교 분석. K562 세포주와 공유하고 있는 KWT 교차-계통의 트리-하이브리드주의 염색체 변화는 적색으로 강조 표시한다. KWT 교차-계통의 트리-하이브리드주와 WIL2NS 세포주 간에 공유된 염색체 변화는 청색으로 강조 표시한다. K562 세포주도 WIL2NS 세포주와도 공유되지 않지만, 교차-계통의 트리-하이브리드의 여러가지 서브타입들간에 공유된 염색체 차이는 녹색으로 강조 표시한다.
Figure pct00003
6.2.3. WWM 교차-계통의 트리-하이브리드주의 핵형 분석
불멸성 B 림프계 세포 (2 WIL2NS 세포주) 2주와 일차 단핵구 (CD14+)로부터 유래된 WWM 교차-계통의 트리-하이브리드주의 핵형을 분석하였다. 상기 교차-계통의 트리-하이브리드를 CD14+ 세포로 농화시킨 서브라인도 핵형을 분석하였다. 도 31A과 31B는 오리지날 WWM 교차-계통의 트리-하이브리드와 이의 CD14+-농화된 서브라인 각각의 핵형을 도시한다. 각 경우에, 총 20개 세포로부터 G-밴드형의 중기 염색체를 400bphs에서 분석하였다. 오리지날 WWM 교차-계통의 트리-하이브리드에는, 세포 11주(55%)에서 확인된, 염색체의 수가 47개인, 단일 우성 클론이 포함되어 있었다. 그러나, 나머지 세포 9주는 거의 3배체(랜덤 염색체 소실이 있음) 내지 거의 4배체(랜덤 염색체 소실이 있음)인 것으로 분석되었다. 이들 세포들 간에는 일관성이 없었다. 한편, CD14+-농화된 WWM 교차-계통의 트리-하이브리드의 핵형 분석에서, 세포 19주에서 검출된 단일 클론 이상이 확인되었다. 4배체 세포는 오직 하나만 검출되었다.
표 5는 WWM 교차-계통의 트리-하이브리드주의 핵형 분석 결과를 비교하여 요약 개시한 것이다. WIL2-NS 세포와 공유한 염색체 특징은 청색으로 강조 표시한다.
Figure pct00004
실시예 7
7. PCR에 의한 EBV 게놈 검출
해당 교차-계통의 트리-하이브리드 세포주에 대한 PCR 분석을 위해, 교차-계통의 트리-하이브리드 세포 5x106주로부터 게놈 DNA를 추출하였다. MOLT-4 세포를 음성 대조군으로 사용하고, CO 88BV59-1을 양성 대조군으로 하여 QIAamp DNA Micro kit (Qiagen)를 제조사의 지침에 따라 사용하였다. 정성 PCR 분석에서, EBV 게놈의 BamHI W 영역을 특이적인 프로이머로 증폭시켰다. 상류 및 하류 프라이머의 서열은 각각 5'-CAAGAACCCAGACGAGTCCGTAGAA-3' (서열번호: 3) 및 5'-AAGAAGCATGTATACTAAGCCTCCC-3' (서열번호: 4) 이다(Kimura, et al., 1999). 추출한 DNA 10 ng을, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 1.5 mM MgCl2, 50mM KCl, 200 μM dNTP, 0.6 μM 의 각 프라이머 및 0.5 U Taq 중합효소 (Lomb Life Science)를 포함하는 반응 혼합물에 첨가하였다. 95℃에서 2분간 초기 변성을 수행한 후, 95℃에서 15초 및 60℃에서 1분으로 구성된 28회 사이클을 GeneAmp PCR system 9600 (Perkin Elmer)을 이용하여 수행하였다. 증폭된 샘플은 2% 아가로스 겔에서 분리하였다.
상기 분석 결과를 통해, 본 발명에서 확립된 교차-계통의 트리-하이브리드들 모두 EBV 게놈에 음성인 것으로 확인되었다.
실시예 8
8. 마이코플라스마 검사
사용된 모든 세포주들과 본 발명에서 제작한 교차-계통의 트리-하이브리드주를 대상으로 한 마이코플라스마 검사를, 마이코플라스마 PCR 검출 키트 (Lomb Scientific)를 제조사의 지침에 따라 사용하여 수행하였다. 테스트 결과, 모든 세포주들과 교차-계통의 트리-하이브리드에 마이코플라스마가 없다는 것이 확인되었다.
실시예 9
9. 교차-계통의 트리-하이브리드 발현 시스템에서의 단백질 발현 및 이의 특정화
본 발명에서 구현된 트리-하이브리드 교차-계통 세포 시스템을, 비제한적인 예로서, 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 지질 및 이들의 키메라 분자와 같은 생물 분자 등의 다양한 생물제의 제조에 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 생물 분자들로는 사이토카인, 성장 인자 호르몬, 수용체 또는 이들의 키메라 분자나 단편이 포함될 수 있다. 당업자는, 트리-하이브리드 교차-계통의 세포로부터 발현되는 단백질과 같은 원하는 생물 분자를 분비시키거나, 막 결합시키거나 또는 양자를 할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 당업자는, 또한, 다양한 단백질 서브유닛들을 교차-계통의 트리-하이브리드 세포에서 공동-발현시킬 수 있으며, 예컨대 면역글로불린 발현시킬 수 있으며, 보다 구체적으로는 단일클론 항체를 생산할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 당업자는, 아울러, 트리-하이브리드 교차-계통 세포를 이용하여 다양한 기능성 단백질이나 펩타이드 단편들을, 예컨대 면역글로불린, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, 예컨대 단쇄 Fv 단편과 같은 단편들을 발현할 수 있다는 것을 알 것이다.
원하는 단백질의 발현은, 원하는 단백질을 발현하는 파트너 세포와의 트리-하이브리드 세포의 체세포 하이브리드화를 통해 트리-하이브리드 세포에서 달성할 수 있다(섹션 9.1). 다른 예로, 트리-하이브리드 세포는 원하는 단백질의 발현을 용이하게 하기 위한 통상적인 유전자 형질감염 프로토콜에 따라 수행될 수 있다(섹션 9.2.1 및 9.2.2). 다른 구현예에서, 트리-하이브리드 세포는 체세포 하이브리드화 또는 통상적인 유전자 형질감염 또는 양자를 이용하여 동시에 다수의 타겟 단백질들을 발현할 수도 있다(섹션 9.3).
아래 실시예들은 교차-계통의 트리-하이브리드 세포에서의 다양한 유형의 다수 단백질들의 발현을 예시한다. 또한, 실시예들은 특정 분화된 세포 타입에 특이적인 단백질을 동일한 교차-계통의 트리-하이브리드 세포 (예, 면역글로불린 및 CD54)에서 발현시킬 수 있음을 보여준다.
9.1. 원하는 단백질을 발현하는 세포와 트리-하이브리드 교차-계통의 세포의 하이브리드화
9.1.1. 인간 GM-CSF의 발현
CD14 양성 세포로 농화시킨 WWM 교차-계통의 트리-하이브리드주(섹션 5)를 본 실시예에서 파트너 세포주로 사용하였다. 섹션 1.3.3.1.1에 기술된 바와 같이 분리한 활성화된 인간 CD4 양성 림프구를 인간 GM-CSF의 소스로서 사용하였다. 세포의 전기적 하이브리드화 공정은 기본적으로 섹션 4.3.2에 기술된 바와 같이 WWM 교차-계통의 트리-하이브리드의 제조에 사용되는 공정과 동일하였다. 제조되는 WWM과 CD4+ 배양한 T 세포의 하이브리드가 안정화가 된 후, 이를 세포주로서 유지시키고, ProGM으로 칭하였다.
인간 GM-CSF의 발현 결과
ProGM 상층액을 대상으로 샌드위치 타입의 ELISA에 의해 인간 GM-CSF를 조사하였다. 96웰 ELISA 플레이트(Corning)를 50 ㎕의 정제된 토끼 다클론 항-GM-CSF 항체(10 ㎍/ml)로 4℃에서 코팅하였다. 항체 용액을 제거한 후, 플레이트 상의 잔류하는 단백질 결합부들을 5% BSA가 포함된 PBS (5% BSA-PBS) 100 ㎕로 블록킹하였다. 그런 후, ProGM 하이브리드 세포주의 배양 상층액 50 ㎕를 웰에 넣어, 37℃에서 2시간 인큐베이션하였다. 0.5% Tween 20이 첨가된 PBS (Tween-PBS)로 웰을 3번 헹군 후, 이를 50 ㎕의 토끼 항-GM-CSF 항체(10 ㎍/ml)와 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. Tween-PBS로 3번 헹군 후, 200배 희석한 퍼옥시다제-접합된 항-토끼 면역글로불린과 함께 실온에서 2시간 인큐베이션하였다. Tween-PBS로 3번 헹군 후, ABTS와 0.01% 과산화수소와 함께 인큐베이션하여, 최종 반응물을 가시화하였다. 이를 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 재조합 인간 GM-CSF를 표준물로서 사용하였다. 모든 분석들은 해당 샘플에 대해 2세트로 수행하였다. 그 결과, ProGM에서는 인간 GM-CSF를 비-최적 배양 조건에서 0.7 내지 1.1 ㎍/ml/106(세포)의 농도로 생산하는 것으로 확인되었다.
ProGM 하이브리드로부터 유래된 hGM-CSF의 웨스턴 블록 및 면역-침강에 의한 특정화를 통해, ProGM 하이브리드가 인간 림프구에 의해 자연적으로 분비되는 당형태와 동일한 당단백질 형태를 보이는 충분한 인간 GM-CSF를 생산한다는 것이 검증되었다. ProGM 하이브리드로부터 수집되는 상층물을 분석하기 전에 100배로 희석하였다. 웨스턴 블롯 분석용 면역블롯 NC(Millipore)와 0.1 ㎍/ml 농도의 바이오틴화된 랫 항-인간 GM-CSF 항체(R&D systems)를 웨스턴 블롯 검출에 사용하였다. 도 32에서, ProGM 하이브리드에 의해 분비되는 hGM-CSF의 웨스턴 블롯 (4번 레인)은 PHA 활성화된 인간 림프구 배양물에서 분비되는 GM-CSF(2번 레인)의 형태와 동일한 이종성(heterogeneity)을 나타내었다. ProGM 및 림프구 배양물 양자에서 발현된 GM-CSF의 분자량 분포는 18kDa - 35kDa 범위였다. 아스파라긴 잔기에 탄수화물 체인의 부가를 저해하는 투니카마이신(tunicamycin)이 존재하는 경우, 보다 고분자량의 분자(즉, 35 kDa)는 검출되지 않았는데, 이는 관찰된 이종성이 다양한 당화 수준이 그 이유임을 의미한다(5번 레인). PHA 활성화된 림프구 또는 ProGM 하이브리드 발현 시스템에서 생산된 GM-CSF 형태들의 GM-CSF의 분자량은 E. coli 유래의 GM-CSF(6번 레인) 보다 더 큰 것으로 나타났다.
10 ㎍/ml의 투니카마이신을 첨가하거나 첨가하지 않으면서 배양한 ProGM 하이브리드의 상층물을 수집하여, E.coli-유래 인간 또는 마우스 GM-CSF 각각에 대해 만든 랫 항-인간 GM-CSF 항체 또는 토끼 항-마우스 GM-CSF 항체와 함께 40℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 단백질 A-세파로스 (Invitrogen)를 첨가하고, 실온에서 3시간 다시 인큐베이션하였다. 수지를 회수하여 0.15 M NaCl, 0.5% NP-40, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0로 잘 헹구었다. 결합된 단백질들은 Laemmli 샘플 완충액으로 용해시키고, SDS-PAGE를 실시하였다. 도 33에 나타낸 바와 같이, ProGM 하이브리드에 의해 분비되는 GM-CSF의 분자량은 18kDa - 35kDa으로, 이는 자연적으로 생성되는 형태들과 유사하였다. 이러한 이종성은 2개의 N-당화와 수개의 0-당화 부위들에서의 다양한 당화로 인한 것이다. 투니카마이신의 존재시, 보다 큰 분자량의 밴드는 검출되지 않았지만, 분자량이 낮은 단백질 18-22kDa이 축적되었다. 이러한 데이타는, ProGM 하이브리드로부터 유래된 hGM-CSF는 인간 당단백질로서 분비됨을 입증한다.
9.1.2. 인간 면역글로불린의 발현
항원-경험한 T 세포 (CD3+CD5+) (약칭 KWT-2)로부터 유래되며, 섹션 6.2.2에 기술된 핵형과 FACS(보다 상세하게는 섹션 4.4.3 참조)에서 결정된 표현형 마커를 보여주는, KWT 교차-계통의 트리-하이브리드주를, 전기적 세포 하이브리드화를 통한 인간 면역글로불린의 발현에 사용하였다. 구체적으로, KWT-2 교차-계통의 트리-하이브리드를 본 특정 실시예에서 파트너 세포주로서 사용하였다. 섹션 1.3.3에 기술된 바와 같이 분리한 일차 CD40의 활성화된 IgM 양성 또는 IgG 양성의 B 세포를 인간 Ig의 소스로서 사용하였다. 전기적 세포 하이브리드화 공정은 기본적으로 섹션 4.4.2에 기술된 KWT 교차-계통의 트리-하이브리드주의 제조에 사용되는 공정과 동일하였다. 제조되는 하이브리드가 안정화된 후, 이를 유지시키고, ProIM 또는 ProIG 세포주(섹션 1.1 참조)로 표시하였다.
인간 면역글로불린 발현 결과
ProIM 및 ProIG의 상층액에서, IgM 또는 IgG의 존재를 전술한(섹션 1.3.3 참조) ELISA에 의해 분석하였다. 세포를 둥근 바닥의 96웰 플레이트에 웰 당 1x105주로 접종하여, 표준 조건에서 24시간 배양하였다. 세포수와 생존성을 혈구계수기와 트립판 블루 배제법을 이용하여 수행하였다. 결과는 표 6 및 7에 요약 개시한다. 각 수치는 3번의 독립적인 측정 결과들의 평균 ± SD로 나타낸다.
ProIM 세포의 세포 증식과 IgM 생산
실험 생존 세포의 밀도
(세포/ml) 		IgM 생산
(ng/ml) 		IgM 생산성
(ng/10 4 세포/24시간)
1 1.2x105 310 ± 12.3 26.7
2 1.4x105 512 ± 20.1 36.6
3 1.1x105 298 ± 10.5 27.1
4 1.2x105 387 ± 15.1 32.3
5 1.5x105 701 ± 23.4 46.7
ProIG 세포의 세포 증식과 IgG 생산
실험 생존 세포의 밀도
(세포/ml) 		IgG 생산
(ng/ml) 		IgG 생산성
(ng/10 4 세포/24시간)
1 8.0x104 84 ± 5.9 10.5
2 8.1x104 85 ± 3.7 10.5
3 8.0x104 76 ± 4.3 9.5
4 8.2x104 89 ± 6.1 10.9
5 8.2x104 82 ± 4.3 10.0
IgG 서브클래스 및 경쇄 서브타입들을 바이오틴화된 마우스 항-인간 IgG1 (clone HP6069), IgG2 (clone HP6002), IgG3 (clone HP6047), IgG4 (clone HP6025) (ICN Biomedicals) 및 바이오틴화된 염소 항-인간 카파 및 람다 체인(Biosource)을 이용하여 검출하였다. 결합된 바이오틴화된 항체를 ALP-접합된 스트렙타미딘으로 검출하였다.
그 결과, ProIM 및 ProIG 세포로부터 각각 생산되는 IgM과 IgG는 κ 경쇄를 가지고 있었으며, IgG는 IgG2 클래스였다.
9.1.3. 인간 CD54의 발현
인간 CD54 발현의 방법
성숙형 T 헬퍼 세포 (CD4+) (약칭 KWT-1)로부터 유래되며, FACS (보다 상세하게는 섹션 4.4.3 참조)에 의해 결정된 표현형 마커와 섹션 6.2.2에 기술된 핵형을 나타내는, KWT 교차-계통의 트리-하이브리드를, 전기적 세포 하이브리드화를 통한 인간 CD54의 발현에 추가로 사용하였다. 구체적으로, 본 특정 실시예에서는 KWT 교차-계통의 트리-하이브리드를 파트너 세포주로 사용하였다. 섹션 1.3.3에 기술된 바와 같이 분리된 일차 인간 CD54 양성 T 세포를 인간 CD54 분자의 소스로서 사용하였다. 하이브리드화 공정은 기본적으로 KWT 교차-계통의 트리-하이브리드주의 제조에 사용된 공정 (섹션 4.4.2)과 동일하였다. 제조된 하이브리드가 안정이 된 후, 이를 표준 배양 조건(섹션 1.1 참조)에서 세포주로서 유지시켰고, ProCD54로 표시하였다.
hCD54 발현 결과
ProCD54 세포의 표면 상의 CD54의 발현을 FACS 분석을 이용하여 검증하였다. 오리지날 original KWT 교차-계통의 트리-하이브리드 세포는 100%가 그 표면에 CD4를 발현하였기 때문에(도 19 참조), ProCD54 세포 표면 상의 CD4의 발현을 제조되는 세포주의 안정성에 대한 기준으로서 사용하였다. 간략하게, 분액 100 ㎕ 당 1x105 개의 세포를 섹션 1.3.3.1 (CD54+ T 세포의 분리)에 기술된 동일한 프로토콜에 따라 마우스 항-인간 CD54-FITC 및 마우스 항-인간 CD4-PE 항체로 표지하였다. ProCD54 세포의 표면에서의 CD4 및 CD54의 전형적인 발현 프로파일들을 도 34a에 나타낸다. 오리지날 ProCD54 세포의 약 72%가 CD54에 양성이었고, 세포의 100%는 CD4 발현 수준이 KWT 교차-계통의 트리-하이브리드 세포에서의 수준 보다 다소 낮은 것으로 나타났지만, CD4 발현은 유지하였다. 적합한 게이트를 설정한 후, CD54 발현 수준이 중간 내지 높은 CD4+CD54+ 세포 집단(총 세포 집단의 약 42%)을 게이팅하여 분류하였다(도 34a). 분류된 세포를 표준 배양 배지에 재현탁하여 수개월간 배양 상태로 유지시켰다. 제조되는 서브라인은 ProCD54EX로 표시하였다. 그 후, 전술한 섹셕에서 기술된 동일한 프로토콜을 사용하여 서브라인에서 CD4 및 CD54의 발현을 분석하였다. ProCD54EX의 표면에서의 전형적인 CD4 및 CD54 발현 프로파일을 도 34b에 나타낸다. 도에서 볼 수 있는 바와 같이, 표준 배양 조건에서 6개월 배양한 후에도, 세포의 98% 이상이 CD4와 CD54 둘다의 발현을 유지하였다. 또한, CD54의 발현은 중간 수준으로 균일해졌다.
또한, ProCD54 및 ProCD54EX에서, 제조사의 지침에 따라 인간 CD54 (ICAM-1) ELISA (R&D systems)를 이용함으로써, 조직 배양 상층액내 가용성 CD554의 존재에 대해 분석하였다. 상층액을 배양시 7일에 3회 이상 채집하였다. KWT 교차-계통의 트리-하이브리드 파트너 세포주의 상층액을 음성 대조군으로 사용하였다. 모든 평가는 동일 샘플 2세트로 수행하였다. 간략하게, 마이크로타이터 플레이트를 인간 가용성 ICAM-1에 대한 뮤라인 단일클론 항체로 코팅하였다. 대조군, 샘플 또는 적정하게 희석한 표준물과 함께 인큐베이션한 후, 인간 가용성 ICAM-1에 대한 HRP(horseradish peroxidase) 접합된 다클론 항체를 첨가하였다. 기질과 정지 용액을 첨가한 후, 각 웰의 광학 밀도를 30분 이내에 450 nm로 설정된 마이크로플레이트 리더로 측정하였다. 이 결과는 표 8에 요약 개시한다.
KWT 교차-계통의 트리-하이브리드 파트너 세포주, ProCD54 및 ProCD54EX 세포주에서의 가용성 CD54 (ICAM-1)의 농도 범위
세포주 최저 농도, ng/ml 최고 농도, ng/ml
KWT 0 0
ProCD54 420 1320
ProCD54EX 910 2870
ProCD54 및 ProCD54EX로부터 방출(shedding)되는 가용성 CD54의 분자량을 겔 전기영동 및 웨스턴 블롯 분석으로 측정하였다. 간략하게, 상층액내 단백질 농도는 단백질 분석(R&D systems)으로 측정하고, 1.8 mg/ml로 조정하였다. 전기영동은 SDS-PAGE로 수행하였다. 샘플의 총 30 ml을 비변성 샘플 완충액 중에서 겔에 주입하였다. 전기영동 후, 단백질을 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막(Bio-Rad)으로 이동시켰다. 블롯팅한 막을 TBS-Tween 완충액(TBST) 중의 탈지 건조 밀크(5%)로 블롯킹하고, 마우스 항-인간 ICAM-1 항체(TBST에 1:100으로 희석)와 함께 2시간 교반하였다. 샘플을 TBST로 헹군 후, 2차 시약, 염소 항-마우스 IgG 연결된 HRP(1:10,000 희석)을 첨가하였다. TBST로 반복 헹군 후, 막을 물로 헹구었다. 모든 인큐베이션은 실온에서 수행하였다. 도 35는 sCD54가 ProCD54 및 ProCD54EX 양자의 상층액에 인간 혈청에서 검출되는 가용성 CD54에 해당되는 약 82 kDa의 단일종으로서 존재함을 보여준다.
ProCD54 및 ProCD54EX 세포 양자에서의 인간 CD54의 mRNA의 발현을 RT-PCR로 검증하였다. 상업적인 키트를 이용하여 총 RNA를 추출하고, 유전자 발현의 RT-PCR을 섹션 5에서 전술된 바와 같이 수행하였다. 인간 ICAM-1 프라이머 세트 [센스, 5'-CCGGAAGGTGTATGAACTG-3'; (서열번호: 5) 안티-센스, 5'-TCCATGGTGATCTCTCCTC-3' (서열번호: 6)]를 사용하여, 실험 및 대조군 RNA 샘플로부터 역전사되는 cDNA를 탐침하였다. 사이클로필린에 대한 프라이머 쌍을 각 분석에 내부 대조군으로서 포함시켰다 [센스, 5'- TGTTCTTCGACATTGCCGTCGAC-3'; (서열번호: 7) 안티-센스 5'- GCATTTGCCATGGACAAGATGCCAGGA-3' (서열번호: 8)]. PCR 반응 산물을 3% 아가로스 겔에서 에티듐 브로마이드가 첨가된 Tris-아세테이트 완충액 중에서 전기영동하고, UV-유도된 형광 밴드를 촬영하여 디지털 가공하였다. 도 36은 ProCD54 및 ProCD54EX에서의 인간 ICAM-1 mRNA에 대한 RT-PCR 분석 결과를 보여준다. 세포 표면에 CD554를 발현하지 않는 KWT 교차-계통의 트리-하이브리드 세포는 또한 ICAM-1 유전자를 매우 낮은 수준으로 전사하는 것으로 나타났다.
9.2. 트리-하이브리드 교차-계통 세포주에 원하는 단백질을 코딩하는 유전자의 형질감염
벡터-매개 유전자 전이 등의 통상적인 다수의 기법에 의해 특정 유전자를 배양된 세포에 도입할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 트리-하이브리드 교차-계통 세포에, 원하는 단백질을 발현하는 유전자를 일시적으로 현질감염시켰다. 이로써 DNA 감염 후 수시간 이내에 유전자 산물, RNA 또는 단백질을 수득할 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에서, 트리-하이브리드 교차-계통 세포를 원하는 단백질을 코딩하는 유전자로 안정적으로 형질감염시켰다. 여기에는 숙주 세포 염색질에 병합되는 플라스미드 벡터 DNA가 수반된다.
9.2.1. 일시적인 형질감염
성숙 B 세포 (CD19+) 및 성숙 T 헬퍼 세포 (CD4+)로부터 유래되며, FACS (섹션 4.2.3)에 따라 결정된 표현형 마커와 섹션 6.2.1에 기술된 핵형을 가진, KBT 교차-계통의 트리-하이브리드를 유전자 형질감염의 실험에 사용하였다. 교차-계통의 트리-하이브리드주의 세포에 원하는 단백질의 일시적인 형질감염의 예로서, KBT 교차-계통의 트리-하이브리드 세포에 인간 IL-4 수용체 알파 체인(hIL4-Rα)을 형질감염시켰다.
방법
골수 샘플에서 PBML 세포의 준비는 섹션 1.3.1에 기술되어 있다. hIL4-Rα cDNA를 100 ng/ml의 재조합 인간 IL-4 (R&D systems)와 함께 표준 배양 조건에서 24시간 동안 인큐베이션한 총 1x106 PBML 세포에서 클로닝하였다. 총 RNA를 추출(RNeasy Mini Kit, Qiagen)하고, 1차 가닥 cDNA 정제 키트(Amersham Pharmacia)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. PCR로 hIL4-Rα cDNA를 증폭하였다. 증폭은 센스 프라이머 5'-AGGGGCGCGCAGATAATTAAA-3' (서열번호: 9)와 안티-센스 프라이머 5'-AGTGGGGCCAATCACCTTCATA-3' (서열번호: 10)로 수행하였다. 네스티드(nested) PCR을 수행하여, hIL4-Rα 단편에 2개의 BamHI 제한효소 부위를 부가하였다 [센스 프라이머 5'-GGATCCGCGCAGATAATTAAAGA-3', (서열번호: 11), 안티-센스 프라이머 5'-GGATCCAAATCACCTTCATACCAT-3' (서열번호: 12]. 증폭된 cDNA를 희석하여, 94℃에서 1분간 최초 변성시킨 다음, 94℃에서의 20초 -> 59℃에서의 45초 -> 72℃에서의 3분으로 이루어진 사이클을 31회 수행하였다. IL4R cDNA 단편을 클로닝 벡터 pGEM-T (Promega)에 연결하여, JM109 컴피턴트 세포(Promega)에 형질감염시켰다. 플라스미드 미니 키트 (Qiagen)를 이용하여 플라스미드 DNA를 제조하였다.
전기영동을 위해, 완전 TC 배지 350 ㎕에 현탁한 7x106의 KBT 세포(섹션 1.1 참조)를 30 ㎍의 cDNA 플라스미드와 혼합하였다. Eurogentec Easyject Pulser를 이용한 1회 펄스(25 kV/m, 1050 μF, 34-37 msec 펄스 폭)에 의해 형질감염을 수행하였다. 그 후, 세포를 재조합 hIL4 100 ng/ml이 첨가된 완전 TC 배지 중에서 6웰 조직 배양 플레이트에서 인큐베이션하였다.
형질감염 수행 후 24, 48 및 72시간 후에, 동결-해동 과정을 통해 세포 추출물을 준비하였다. 비-형질감염된 KBT 및 pBML 세포를 각각 음성 대조군과 양성 대조군으로 사용하였다. 세포 추출물의 총 단백질 함량은 Bio-Rad 단백질 분석 (Bio-Rad Laboratories)을 이용하여 측정하였다. 동량의 세포 추출물(약 2 mg)을, 세파로스 4B fast flow (Sigma) 상에 불용화된 단백질 A 20 mg을 이용하여, 3 ㎍의 항-hIL4-Rα 체인 (BD Pharmingen 551894)과 함께 면역침강시켰다. 면역침강물을 희석 완충액(TSA 용액 중의 0.1% Triton X-100 및 소 헤모글로빈, TSA 용액으로 1번, 그리고 Laemmli 완충액으로 가용화한 0.05 M TRIS-Cl (pH 6.8) 용액으로 1번)으로 2번 헹구고, 끓인 후, TRIS-글리신 4% 내지 12% SDS-PAGE로 분리시켰다. TSA 용액에는 0.01 M TRIS-Cl (pH 8.0), 0.14 M NaCl 및 0.025% 소듐 아지드가 포함되어 있다. 일부 실험에서는, 세포 추출물의 단백질 함량 75 ㎍을 사전 면역침강 없이 SDS-PAGE로 바로 분리시켰다.
웨스턴 블롯 분석은 단백질을 폴리아크릴아미드 겔에서 Hybond-ECL 니트로셀룰로스 막(Amersham)위로 2시간 동안 25 V로 25 mM TRIS, 192 mM 글리신, 0.1% SDS, 100 μM 소듐 바나데이트 및 20% 메탄올을 포함하는 TRIS-글리신 중에서 이동시켜, 수행하였다. 이 블롯을 1시간 동안 블롯킹 완충액(2.5% 탈지 건조 밀크, 10 mM TRIS-Cl [pH 7.5], 100 mM NaCl 및 0.1% Tween 20)으로 처리한 다음, 블롯킹 완충액 중의 2 ㎍/ml 마우스 항-hIL4-Rα 항체과 함께 다시 한시간 인큐베이션하였다. 항체 결합은 호세라디시 퍼옥시다제가 접합된 양 항-마우스 면역글로불린과 블롯을 1시간 인큐베이션한 다음, 요오드화된 기질과 다시 1분 인큐베이션한 후, 강화된 화학발광 검출에 의해 검출하였다.
결과
도 37은 형질감염후 24, 48 및 72시간에 hIL4-Rα 체인으로 일시적으로 형질감염된 KBT 교차-계통의 트리-하이브리드 세포주의 세포 추출물에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과를 보여준다. hIL4-Rα 체인은 형질감염 후 hIL4-Rα 체인으로 형질감염된 KBT 세포에서 검출되었고, hIL4-Rα 체인의 발현율은 형질감염 후 48 및 72시간에 점점 증가하였다. 형질감염되지 않은 KBT 세포를 hIL4-Rα 체인에 대한 음성 대조군으로 사용하였다. hIL4-Rα cDNA의 제조에 사용된 인간 PBML 세포로부터 추출한 세포 추출물은 hIL4-Rα 체인에 대한 양성 대조군으로 사용하였다.
9.2.2. 안정적인 형질감염
교차-계통의 트리-하이브리드 세포주의 세포에 원하는 단백질의 안정적인 형질감염의 예로서, KBT 세포주의 세포에 인간 인터루킨 2 (hIL-2) 유전자를 형질감염시켰다.
방법
RSV의 긴 말단 반복 서열의 통제 하에 랫 프리프로인슐린 II 유전자가 포함된 hIL-2 발현 벡터 pBC12/RSV/IL2 (IS)를 형질감염용으로 사용하였다. 전체 인슐린 리더 영역과 번역 개시 코돈을 포함하는 인슐린 서열을 병합시켰다. 이 키메라 hIL-2 mRNA는 천연 hIL-2 리더 및 개시 코돈을 포함하는 hIL-2 mRNA가 그런한 것 보다 hIL2 단백질을 보다 현저하게 발현한다(Cullen, 1988).
디하이드로폴레이트 리덕타제 유전자 서열 (dhFr)을 SV40/dhFr 유전자 단편과의 연결을 통해 pBC12/RSV/IL2 벡터에 삽입하여 (Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1:854, 1981), SV40 초기 영역 프로모터의 통제 하에 뮤라인 dhFr 전체 유전자를 함유하고 있으며 hIL-2와 dhFr이 동일한 오리엔테이션으로 위치되어 있는, pBC12/RSV/IL-2/dhFr 플라스미드를 만들었다.
형질감염하기 전에, 배양된 KBT 세포에 0.1 mM 폴리사이클릭 방향족 하이드로카본 라세믹 3a,4b-디하이드록시-1a,2a-에폭시-1,2,3,4-테트라하이드로벤조[c]펜안트렌(B[c]PHDE)을 90분간 처리하여 돌연변이 유발한다 (Carothers et al., Proc. Natl. Acad. Sci 87:5464-68, 1990). dhFr-클론의 선별은 하이폭산틴 및 티미딘에 대한 의존성을 토대로 하며, 6일간의 발현으로 수행하였다 (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 77(7): 4216-20, 1980). 제조되는 dhFr 결여된 KTB 세포(KBTdhFr-)는 10-4M 하이폭산틴 및 10-5M 티미딘이 첨가된 표준 배지에서 유지시켰다.
형질감염에서, 배양된 KBTdhFr- 세포를 PBS로 3번 헹구고, PBS 0.8 ml에 재현탁하였다. 60 ㎍의 pBC12/RSV/IL2/dhFr 벡터를 세포 현탁물에 첨가하고, 현탁물을 플라스틱 전기영동 큐벳에 넣어 얼음 위에서 10분간 인큐베이션하였다. 전기영동은 Gene-pulser 전기영동 유닛 (Bio-Rad)을 이용하여 표준 전기영동 프로토콜로 75 kV/m 및 25 μF에서 수행하였다. 펄스를 가한 후, 규벳을 얼음 위에서 10분간 인큐베이션하였다. 그런 후, 세포를 플라스크로 옮겨 하이폭산틴과 티미딘이 첨가되지 않은 표준 배지에서 배양하였다. 생존 세포는 단일 세포 클로닝 기법(섹션 1.1.2)으로 클로닝하여, 확립된 세포주를 hIL-2 분비에 대해 평가하였다.
결과
형질감염된 KBT (KBT TR-IL2) 세포에서의 hIL-2 mRNA 발현을 hIL-2 특이 프라이머를 이용한 PCR로 검증하였다. 자기 비드 분류(섹션 1.3.3.5)를 통해 PBML로부터 수득한 인간 CD8+ T 세포와 JurkaT 세포주, Clone E6-1을 양성 대조군으로 사용하였다. K562 세포 및 비-형질감염된 KBT 하이브리드 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. RNeasy 미니 키트 (Qiagen)에서 제조사의 지침에 따라 다양한 처리로 형질감염된 KBT 세포로부터 총 RNA를 추출하였다. 아래 프라이머들을 공지된 서열을 기초로 사용한 hIL-2 프라이머이다 (Wang et al, 1989):
5' 프라이머 = 5'-GAATGGAATTAATAATTACAAGAATCCC-3' (서열번호: 13)
3' 프라이머 = 5'-TGTTTCAGATCCCTTTAGTTCCAG-3' (서열번호: 14)
증폭은 35회 사이클로 수행하였다. PCR 사이클은, 94℃에서 40초, hIL 어닐링 온도 55℃, 72℃에서 40초간의 연장으로 구성된다. PCR 산물은 2% 아가로스 겔에서 에티듐 브로마이드를 사용하여 가시화하였다. 그 결과는 도 38에 나타낸다. 발현율은 CD8+ 인간 T 림프구와 JurkaT 세포에서 수득되는 수준과 비슷하였다. 비-형질감염된 KBT 세포와 K562 세포를 음성 대조군으로서 사용하였다.
세포내 IL-2는 BD FastImmune CD4 세포내 IL-2 검출 키트(BD Pharmingen)를 제조사의 지침에 따라 사용하여 검출하였다. FACS 분석은 BD FACSCalibur을 이용하여 수행하였다. 먼저, CD4+ 세포를 정방향 스캐터 및 형광 역치 뿐만 아니라 정방향 및 측면 스캐터에 기반으로하여 게이팅하였다. 그 후, CD69 (활성화된 CD4+ T 세포) 및 세포내 IL-2 발현을 토대로 게이팅된 집단을 분석하였다. KBT TR-IL2 세포에서의 IL-2의 발현에 대한 FACS 프로파일을 도 39에 나타낸다. 비-형질감염된 KBT 세포를 대조군으로서 사용하였다. KBT 세포의 약 41%가 CD69 활성화 분자에 대해 양성이었다. KBT TR-IL2 세포의 92%는 세포내 hIL-2 (R1+R2)에 대해 양성으로 염색되었다. hIL-2 음성 세포는 CD69 양성 집단의 일부였지만, CD69 음성 집단은 모두 세포내 hIL2에 양성이엇다.
형질감염 후 30일 및 90일째에 hIL-2의 분비를 ELISA로 검증하였다. 간략하게, 1x106의 hIL-2 형질감염된 KBT 세포를 24웰 조직 배양 플레이트에서 37℃에서 24시간 인큐베이션하였다. 상층액을 모우고, hIL-2 활성을 hIL-2 ELISA 키트(R&D systems)를 이용하여 측정하였다. 상층액을 hIL-2 ELISA 키트의 검출 범위에 맞게 희석하였다. 재조합 hIL-2 (R&D systems)를 양성 대조군으로 사용하였다. ELISA 분석에서 hIL-2 분비율은 660 ng/106세포/24시간 - 3300 ng/106 세포/24시간이었다.
hIL2로 안정적으로 형질감염되고 hIL2를 분비하는 제조된 KBT 세포주를 ProL2로 표시하였다.
9.3. 하이브리드화 및 형질감염을 조합한, 타겟 단백질의 동시 발현(Concurrent expression)
트리-하이브리드 시스템을 이용한 단백질의 동시 발현의 예로서, hIgM을 발현시키기 위해, 트리-하이브리드 세포를 인간 sIgM+CD25+ B 림프구와 하이브리드화한 다음, hIL-2를 안정적으로 형질감염시켰다. hIgM과 hIL-2 둘다를 안정적으로 발현하는 하이브리드 세포 시스템에, hIL-4Rα를 일시적으로 형질감염시켰다. 이러한 예에서, hIgM은 제1 단백질로 표시하며, hIL-2는 동시 발현되는 제2 단백질로 표시하며, hIL-4Rα는 동시 발현되는 제3 단백질로 표시하였다. 다른 예에서, 트리-하이브리드 세포에 hIL-2를 안정적으로 형질감염시킨 다음, 인간 shIgM+CD25+ B 세포와 체세포 하이브리드화를 수행하였다. hIL-2 및 hIgM 양자가 하이브리드 세포 시스템에서 발현되는지를 확인한 다음, 하이브리드 세포 시스템에 hIL-4Rα를 일시적으로 형질감염시켰다. 이러한 예에서, hIL-2를 제1 단백질로 표시하며, hIgM을 동시 발현되는 제2 단백질로 표시하며, hIL-4Rα를 동시 발현되는 제3 단백질로 표시하였다.
9.3.1 세포 준비
성숙 B 세포 (CD19+) 및 성숙 T 헬퍼 세포 (CD4+)로부터 유래된 KBT 교차-계통의 트리-하이브리드로서, 교차-계통의 트리-하이브리드 세포들 100%가 FACS(섹션 4.2.3)에서 결정된 바에 따라 B 및 T 세포 표현형 마커 둘다를 공유하고 있으며 섹션 6.2.1에 기술될 핵형을 가진 KBT 교차-계통의 트리-하이브리드를 본 실험에 사용하였다. 일부 예에서, 섹션 9.2.2에 기술된 돌연변이 유발 프로세스로부터 유래된 dhFr 결핍 KBT 세포 (KBTdhFr-)를 10-4M 하이폭산틴 및 10-5M 티미딘이 첨가된 표준 배지에서 유지시켰으며, 이를 본 실험에 사용하였다. 또한, hIL-2 형질감염 세포주 KBT TR-IL2 (섹션 9.2.2 참조)도 일부 경우에 사용하였다.
섹션 1.3.3에 기술된 바와 같이 PBMC로부터 분리되며, 섹션 2.2에 기술된 바와 같이 CD40 경로를 통해 활성화되는, 일차 CD40 활성화된 sIgM 양성 B 세포를, 하이브리드화를 위한 인간 sIgM B 세포의 소스로서 사용하였다. 이러한 각각의 실험들에서, sIgM+ B 세포의 분리는 또한 배양 5일 후 FACS를 이용하여 CD25 (인간 IL-2 수용체)의 동시 표면 발현을 토대로 수행하였다. CD8+T 세포는 섹션 1.3.3.5에 기술된 바와 같이 MACS CD4 다분류 키트를 이용하여 흉선으로부터 분리하였다.
9.3.2 제1 단백질의 생산 또는 제2 단백질의 공동-생산을 위한 체세포 하이브리드화
KBT 세포, 또는 KBTdhFr- 세포 또는 KBT TR-IL2 세포주 및 shIgM+CD25+ B 세포(기억 B 세포의 서브세트) 간의 전기적 세포 하이브리드화는, 기본적으로, 섹션 4.4.2에 기술된 KBT 교차-계통의 트리-하이브리드주의 제조 방법과 동일하였다. 제조되는 하이브리드가 안정화된 후, 이를 섹션 1.1에 기술된 바와 같이 유지시켰다. 제조되는 하이브리드에서의 shIgM과 CD25의 공동-발현을 FACS 분석을 통해 검증하였고(도 62 참조), hIgM의 생산을 ELISA로 분석하였다. KBT TR-IL2 세포를 hIgM+CD25+ B 세포와의 하이브리드화에 사용한 경우, hIL-2의 생산도 hIgM과 동시에 분석하였다.
9.3.3 제2 단백질에 의한 안정적인 형질감염
hIL-2로 안정적인 형질감염을 진행하기 전에 체세포 하이브리드화를 수행한 경우, hIgM 생산 시스템에 섹션 9.2.2에 기술된 방법을 이용하여 hIL-2를 형질감염시켰다. hIgM과 hIL-2 양자의 동시 생산을 ELISA로 검증하였다.
9.3.4 제3 단백질에 의한 일시적인 형질감염
hIgM과 hIL-2 양자를 분비하는 안정적인 하이브리드 시스템에, 추가로, 섹션 9.2.1에 기술된 동일한 방식으로 hIL-4Ra 유전자를 전기충격을 통해 일시적으로 형질감염시켰다. hIgM, hIL-2 및 hIL-4Rα의 공동-생산을 ELISA로 검증하였다.
결과
동일한 하이브리드 세포 시스템의 세포들에서 동시에 발현되고 공동-발현되는 3가지 단백질의 생산율을 표 9 및 10에 나타내었다. 분석을 위해, 세포를 24웰 플레이트에 한가지 단백질의 발현을 위해서는 0.5x105cells/ml의 밀도로, 2가지 단백질의 발현을 위해서는 1.2x105cells/ml의 밀도로, 그리고 3가지 단백질의 발현을 위해서는 3.2x105cells/ml의 밀도로 접종하였다. 이 시스템은 3가지 단백질을 동시에 생산할 뿐만 아니라 제2 단백질의 공동-발현 후 제1 단백질의 생산율이 증가하였고, 제3 단백질의 발현에 의해 더욱 증대되었다. 동일한 방식으로, 제2 단백질의 생산은 제3 단백질의 발현에 의해 증대되었다.
제1 발현 방법인, 체세포 하이브리드화된 동일 하이브리드 세포 시스템에서 동시 발현된 단백질의 전형적인 생산율
생산율 1가지 단백질의 발현 2가지 단백질의 발현 3가지 단백질의 발현
hIgM, ng/ml/24시간 3,382 ± 284 12,547 ± 593 33,891 ± 835
hIL-2, ng/ml/24시간 18,524 ± 660 74,012 ± 1,034
hIL-4Ra, ng/ml/24시간 13,892 ± 791
제1 발현 방법인, 안정적으로 형질감염된 동일 하이브리드 세포 시스템에서 동시 발현된 단백질의 전형적인 생산율
생산율 1가지 단백질의 발현 2가지 단백질의 발현 3가지 단백질의 발현
hIL2, ng/ml/24시간 3,228 ± 284 19,875 ± 843 81,124 ± 1,435
hIgM, ng/ml/24시간 5,321 ± 476 18,067 ± 613
hIL-4Ra, ng/ml/24시간 12,766 ± 897
실시예 10
10. ProGM 하이브리드 생산을 위한 무혈청 배양 조건에 적응
ProGM 하이브리드 세포의 상업적 생산에 있어서의 건실함을 입증하기 위해, 배양 부피를 워킹 부피 1.2 L로 스피너 플라스크로 규모를 증가시키고, 무혈청 조건에 적응시키며 배양하였다.
방법
ProGM 하이브리드의 hGM-CSF 생산율이 가장 높은 클론들을, FCS 함량을 7.5, 5.0, 2.5, 1.0, 0.5 및 0 %로 서서히 줄이면서 무혈청 환경에서 증식하도록 적응시켰다. 가장 양호한 세포 증식 및 hGM-CSF 생산을 나타내는 서브-배양물들만 연속적인 더 낮은 혈청 조건으로 이동시켰다. 각각의 선별된 서브배양물은 저장을 위해 5% DMSO가 첨가된 표준 배지에서 동결시켰다. 적응 목적으로 2종의 무혈청 배양 배지를 사용하였다. 상업적으로 구입가능한 혈청 한정 및 단백질 무첨가 배지 Hybri-Max (Sigma) 또는 Excel (JHR)을 일부 변형시켜 사용하였다. 세포 생존성은 7일째에 트립판 블루 배제로 평가하였다. hGM-CSF의 농도는 동일일에 ELISA로 측정하였다.
결과
무혈청 배양 조건에 적응시킨 결과는 표 11로 제공한다.
무혈청 조건에서의 ProGM에 의한 hGM-CSF 생산
혈청 함량 (%)
10.0 7.5 5.0 2.5 1.0 0.5 0
최대 세포 밀도(x106 세포/ml) 1.8 1.0 1.0 0.8 0.6 0.5 0.5
hGM-CSF의 농도 (㎍/ml) 0.911 1.431 1.412 2.345 3.971 4.231 3.825
생산성(㎍/ml/106 세포) 0.5 1.431 1.412 2.93 6.62 8.46 7.65
ProGM 하이브리드의 모든 서브배양물들에서, hGM-CSF의 생산은 혈청 및 단백질의 함량 감소에 따라 증가되었다. 무혈청 배양물에서의 낮은 세포 밀도에도 불구하고, 무혈청 배지내 hGM-CSF의 양은 표준 배양 조건에서 수득되는 결과 보다 약 4배 높았다. 세포 농도를 표준화하였을 때, hGM-CSF의 생산율은 15배 증가하였다.
실시예 11
11.1. 스피너 플라스크에서의 생산
방법
워킹 부피 1.2L의 스피너 플라스크를 50 rpm으로 교반하였다. 무혈청 환경(ProGMsf)에서 증식되게 적응시킨 ProGM 하이브리드 세포를 1x105 세포/ml의 농도로 접종하였다. 배양물을 5% CO2의 가습 대기에서 37℃에서 인큐베이션하였다. 도달되는 최고 세포 밀도는 5x105 세포/ml엿다. 생존 세포는 트립판 블루 배제법을 이용하여 측정하였다. 최대 9일간 매일 배지를 교체하였다. 세포 현탁물 (600 ml)을 10분간 1000 rpm으로 원심분리하고, 배지를 제거하여 신선한 배지로 교체한 다음, 세포를 스피너 플라스크에 다시 넣었다. 분비되는 hGM-CSF의 농도를 ELISA로 측정하였다. 각 웰을 1:500으로 희석된 랫 항-인간 GM-CSF (R&D) 100 ㎕로 코팅하였다. 이를, 0.05% v/v 트윈 20이 포함된 PBS(PBS-T)로 헹군 후, PBS-5% v/v BSA 중의 0.195-200 ng/ml 범위의 표준 rhGM-CSF (Invitrogen) 100 ㎕, 또는 100배로 희석한 각 샘플 100 ㎕를 2세트로 웰에 첨가하였다. 모든 인큐베이션은 37℃에서 1시간 수행하였다. 그 후, 플레이트를 PBS-T로 헹구고, PBS-BSA-T에 1:1,000로 희석한 토끼 항 인간 GM-CSF (R&D) 항체 100 ㎕을 첨가한 다음, 인큐베이션하고 세정한 후, 동일 완충액에 1:1,000에 희석한 염소 항-토끼 면역글로불린-HRP 접합체 100 ㎕를 첨가하였다. 한번 더 플레이트를 인큐베이션하고 헹군 다음, 기질 100 ㎕을 첨가하였다. 이의 광학 밀도를 450 nm에서 판독하였다.
결과
상대적인 낮은 세포 밀도 ml 당 5 x105 세포는, ProGMsf의 세포 증식을 위한 준최적의 배양 조건이다. 또한, 보다 높은 밀도(106 세포/ml)를 달성하기 위해, 글루코드 함량 및 그외 보충물질 등의 배양 조건의 최적화가 필요할 수 있다. 또한, 락테이트 및 암모늄 함량에 대한 면밀한 모니터링도 보장된다. 준최적 증식에도 불구하고, 배양 상층액내 hGM-CSF의 농도는 2.8 - 4.2 ㎍/ml 범위였다. 세포 밀도와 시간으로 표준화하였을 때, ProGMsf에 의한 hGM-CSF의 생산율은 0.6 - 0.9 ㎍/ml/106 세포/24시간이었다. 비교로, CHO 세포에서의 단백질 생산성 0.3 ㎍/ml/106 세포/24시간은 높은 것으로 간주된다.
11.2. ProGM 하이브리드 세포주에 의해 생산된 인간 GM-CSF의 정제
방법
ProGMsf 배양물의 상층액을 40℃에서 PM-10 막(Amicon)을 이용하여 약 10배로 농축하였다. 샘플 농축물을, E. coli -유래 인간 GM-CSF에 대한 랫 항-인간 GM-CSF를 제조사의 프로토콜에 따라 Affi-Gel 10 (Bio-Rad)에 커플링시키고, PBS (137 mM NaCl, 3 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.5 mM KH2PO4)로 평형화한, 면역친화성 컬럼에 주입하고, 결합된 단백질은 0.1 mM 소듐-사이트레이트 pH 2.8로 용출시켰다. 친화성 컬럼으로부터 용출되는 단백질을 다시 RP 300 HPLC 컬럼에 주입하고, 60분간의 아세토니트릴 농도 구배 0-60%로 유속 0.1 ml/분으로 용출시켰다. 수득되는 용출 프로파일을 도 40에 나타낸다. RP-HPLC로 수득한 분액들을 ELISA, 음 염색 및 웨스턴 블롯 분석을 위해 수집하였다.
결과
표 9는 전형적인 2단계 정제를 통한 hGM-CSF의 회수 결과를 나타낸다. 친화성 컬럼에서의 초기 회수율은 59%에 불과하였고, RP-HPLC 이후에는 hGM-CSF의 2%만 소실되었다. 친화성 정제 후 낮은 회수율의 원인은 여러가지가 있다. 친화성 컬럼의 결합 용량은 hGM-CSF의 13%가 플로우 쓰루(flow through) 및 수세 단계들에서 유실되기 때문에, ProGMsf의 상층액내 hGM-CSF 양 보다 낮을 것임에 틀림없다. 또한, 낮은 회수율은, ProGMsf 하이브리드에서 생산된 hGM-CSF의 당화된 형태와 비해, E. coli-유래 hGM-CSF에 대한 랫 항체의 친화성이 더 낮기 때문일 수 있다. 최종 수율을 향상시킬 수 있는 다른 가능성은 보다 최적화된 용출 조건의 개발일 수 있다. 도 41(섹션 12 참조)에서, RP-HPLC 수행 후 수집된 분획에 대한 웨스턴 블롯에서, hGM-CSF는 분획 24-36 (24-36분에 용출됨)에서 용출된 것으로 확인되었다. 고분자량 형태 (28-32kDa)는 분획 24 - 27에서 용출된 반면, 저분자량의 분자 (18-22kDa)는 분획 34 - 36에서 용출되었다. 이러한 크로마토그래피 조건들은 여러가지 분자량 형태의 hGM-CSF, 특히 고분자량 분획과 중분자량 분획을 완전히 분리시키지 못하였다.
은 염색으로 수득한 프로파일과 웨스턴 블롯 프로파일은 기본적으로 동일하였을 때, 이는 hGM-CSF만 친화성 컬럼에 결합된 단백질임을 의미한다. 천연 hGM-CSF의 몇가지 분자량 종들도 관찰되었다.
표 12. ProGMsf 유래의 hGM-CSF의 2단계 정제
Figure pct00005
실시예 12
12 . 글리코시다제에 의한 분해
방법
ProGMsf 하이브리드 유래의 정제된 인간 GM-CSF를 1% SDS, 1M P-머캅토에탄올, 100 mM 소듐 포스페이트, pH 7.0 중에서 100℃로 3분간 열-변성시키고, 0.8U의 서열분석 등급의 PNGase F (Sigma)를 첨가한 다음, 37℃에서 배양 기간을 연장시키면서 인큐베이션하였다.
결과
도 43에서 볼 수 있는 바와 같이, N-절단 후, ProGMsf 하이브리드로부터 유래된 hGM-CSF 형태들은 E. coli 유래의 hGM-CSF에 가까운 위치로 시간 의존적인 방식으로 이동되었다. 그러나, 절단 후의 밴드들은 E. coli에 의해 생산된 비당화된 형태와 일치되지 않았다. 이러한 결과는, ProGMsf 하이브리드 유래의 hGM-CSF가 N- 및 O-당화 부위에서 당화되며, 분자량 분포는 이종적인 당화가 원인임을 시사한다. 모든 hGM-CSF 분자에서의 이러한 O-당화는 비보호된 O-당화 부위의 면역원성 측면에서 중요하다. O-당화가 결여된 재조합 인간 GM-CSF가 임상 실험에서 항체를 만들어낸다는 것으로 보고되었다.
데이타는, ProGMsf 하이브리드 세포가 N-당화 부위에 따라 3가지의 hGM-CSF 클래스들을 분비함을 시사해준다: 양쪽 부위가 당화된 분자(25-35kDa, 2N-타입); 한쪽 부위만 당화된 분자(20-25kDa, 1N-타입); 및 어느 쪽도 당화되지 않은 분자 (18-20kDa, 0N-타입).
본 발명은 구체적인 실시예들을 참조하여 설명되지만, 당해 기술 분야의 당업자라면 본 발명을 본원에 기술된 본 발명의 광의적인 기본 원칙과 사상을 유지하면서 다양한 다른 형태로 구현할 수 있음이 자명할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Stephen Sanig Research Institute <120> Methods of generating hybrid cells <130> 50356WOP00 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 cacactcgcc tgccttttcc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gattcccgtc cagtgtcagg 20 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 caagaaccca gacgagtccg tagaa 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 aagaagcatg tatactaagc ctccc 25 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 ccggaaggtg tatgaactg 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 tccatggtga tctctcctc 19 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 tgttcttcga cattgccgtc gac 23 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 gcatttgcca tggacaagat gccagga 27 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 aggggcgcgc agataattaa a 21 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 agtggggcca atcaccttca ta 22 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 ggatccgcgc agataattaa aga 23 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 ggatccaaat caccttcata ccat 24 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 gaatggaatt aataattaca agaatccc 28 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 tgtttcagat ccctttagtt ccag 24

Claims (65)

  1. 줄기 세포 또는 미구속된 기원 세포(uncommitted progenitor cell)로부터 유래된 제1 세포;
    공통 림프성 기원 세포 유래의 제2 세포; 및
    공통 림프성 기원 세포 유래의 제3 세포의 하이브리드화(hybridisation)에 의해 제조되며,
    상기 제1 세포는 골수종 세포가 아닌, 하이브리드(hybrid) 세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제2 세포가 B 림프 계통(B lymphoid lineage) 유래의 세포이고, 상기 제3 세포가 B 림프 계통 유래의 세포인 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제2 세포가 T 림프 계통 유래의 세포이고, 상기 제3 세포가 T 림프 계통 유래의 세포인 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제2 세포가 B 림프 계통 유래의 세포이고, 상기 제3 세포가 T 림프 계통 유래의 세포인 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한항에 있어서, 상기 제1 세포가 공통 골수계 기원 세포(common myeloid progenitor cell) 유래의 세포인 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  6. 제5항에 있어서, 상기 공통 골수계 기원 세포로부터 유래된 세포가 골수단핵구 기원 세포, 단핵구, 대식세포, 호산구, 호중구, 수지상 세포 또는 호염기성 세포인 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  7. 제5항에 있어서, 상기 공통 골수계 기원 세포로부터 유래된 세포가 CD 항원들, CD16, CD15 또는 CD14 중 하나 이상을 제시(display)하는 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  8. 제5항에 있어서, 상기 공통 골수계 기원 세포 유래의 세포가 단핵구인 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  9. 제5항에 있어서, 상기 공통 골수계 기원 세포 유래의 세포가 일차 골수단핵구 기원 세포인 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  10. 제5항에 있어서, 상기 공통 골수계 기원 세포 유래의 세포가 불멸화된 세포인 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  11. 제5항에 있어서, 상기 공통 골수계 기원 세포 유래의 세포가 비장, 말초 혈액, 제대혈 또는 골수로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  12. 제2항 또는 제4항에 있어서, 상기 B 림프 계통으로부터 유래되는 세포가 프리-B 세포(pre-B cell), 미성숙 B 세포, 나이브(naive) B 세포, 활성화된 B 세포 또는 작동자 B 세포인 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  13. 제12항에 있어서, 상기 작동자 B 세포가 항원-경험한 B 세포 또는 형질 세포(plasma cell)인 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  14. 제2항 또는 제4항에 있어서, 상기 B 림프 계통으로부터 유래되는 세포가 CD 항원들, CD19, CD20, CD72 또는 CD5 중 하나를 제시하는 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  15. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 T 림프 계통으로부터 유래된 세포가 프리-T 세포, 비성숙 T 세포, 나이브 T 세포, 활성화된 T 세포 또는 작동자 T 세포인 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  16. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 T 림프 계통으로부터 유래된 세포가 CD 항원들 CD3, CD4, CD5 또는 CD8 중 한가지 이상을 제시하는 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  17. 제2항 또는 제4항에 있어서, 상기 B 림프 계통으로부터 유래되는 세포가 불멸화된 세포인 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  18. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 T 림프 계통으로부터 유래된 세포가 불멸화된 세포인 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  19. 제2항 또는 제4항에 있어서, 상기 B 림프 계통으로부터 유래되는 세포가 림프계 조직(lymphoid tissue)인 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  20. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 T 림프 계통으로부터 유래된 세포가 림프계 세포인 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 림프계 조직이 말초 혈액, 제대혈, 비장, 골수, 흉선, 편도선, 아데노이드(adenoid) 및 국소 림프절로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포들 중 하나 이상이 인간 세포인 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포들 중 하나 이상이 마우스 세포인 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  24. 제5항에 있어서, 상기 공통 골수계 기원 세포 유래의 세포가 K562 세포인 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  25. 제1항에 있어서, 상기 제2 세포 또는 상기 제3 세포가 WIL2-NS 세포 또는 MOLT4 세포인 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  26. 제2항 또는 제4항에 있어서, 상기 B 림프 계통으로부터 유래되는 세포가 WIL2-NS 세포인 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  27. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 T 림프 계통 유래의 세포가 MOLT4 세포인 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  28. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 제1 세포가 K562 세포이고, 상기 제2 세포가 WIL2-NS 세포이고, 상기 제3 세포가 MOLT4인 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  29. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 제1 세포가 K562 세포이고, 상기 제2 세포가 일차 B 세포이고, 상기 제3 세포가 일차 T 세포인 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  30. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 제1 세포가 일차 인간 단핵구이고, 상기 제2 세포가 WIL2-NS 세포이고, 상기 제3 세포가 일차 T 세포인 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  31. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 제1 세포가 일차 인간 골수단핵구 기원 세포이고, 상기 제2 세포가 WIL2-NS 세포이고, 상기 제3 세포가 일차 인간 T 세포인 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  32. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 제1 세포가 K562 세포이고, 상기 제2 세포가 WIL2-NS 세포이고, 상기 제3 세포가 일차 T 세포인 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  33. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제1 세포가 일차 단핵구이고, 상기 제2 세포가 WIL2-NS 세포이고, 상기 제3 세포가 WIL2-NS 세포인 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  34. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 제1 세포가 일차 마우스 단핵구이고, 상기 제2 세포가 SP2 세포이고, 상기 제3 세포가 일차 마우스 T 세포인 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  35. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제1 세포가 일차 마우스 단핵구이고, 상기 제2 세포가 SP2 세포이고, 상기 제3 세포가 SP2 세포인 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  36. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제1 세포가 일차 인간 또는 마우스 단핵구이고, 상기 제2 세포가 WIL2-NS 세포이고, 상기 제3 세포가 SP2 세포인 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한항에 있어서, 상기 하이브리드화 세포가 원하는 단백질을 발현하는 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  38. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이브리드 세포가 원하는 단백질을 2종 이상 발현하는 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  39. 제38항에 있어서, 상기 하이브리드 세포가 원하는 단백질 2종을 발현하는 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  40. 제38항에 있어서, 상기 하이브리드 세포가 원하는 단백질 3종을 발현하는 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  41. 제37항에 있어서, 상기 단백질이 내인성 단백질인 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  42. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 중 1종 이상이 내인성 단백질인 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  43. 제37항에 있어서, 상기 단백질이 재조합 단백질인 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  44. 제38항 내지 제40항 중 어느 한항에 있어서, 상기 단백질 중 1종 이상이 재조합 단백질인 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  45. 제36항 내지 제44항 중 어느 한항에 있어서, 상기 단백질이 사이토카인인 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  46. 제37항 내지 제44항 중 어느 한항에 있어서, 상기 단백질이 콜로니-자극 인자인 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  47. 제37항 내지 제44항 중 어느 한항에 있어서, 상기 단백질이 인터루킨인 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  48. 제37항 내지 제44항 또는 제46항 중 어느 한항에 있어서, 상기 단백질이 GM-CSF인 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  49. 제37항 내지 제44항 또는 제 47항 중 어느 한항에 있어서, 상기 단백질이 인터루킨 2인 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  50. 제37항 내지 제44항 중 어느 한항에 있어서, 상기 단백질이 수용체 또는 수용체의 단편인 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  51. 제37항 내지 제44항 또는 제50항 중 어느 한항에 있어서, 상기 단백질이 가용성 수용체(soluble receptor)인 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  52. 제37항 내지 제44항 또는 제50항 중 어느 한항에 있어서, 상기 단백질이 인간 IL-4 수용체 알파 체인인 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  53. 제37항 내지 제44항 또는 제50항 중 어느 한항에 있어서, 상기 단백질이 면역글로불린인 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  54. 제53항에 있어서, 상기 면역글로불린이 IgM인 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  55. 제53항에 있어서, 상기 면역글로불린이 IgG인 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  56. 제37항 내지 제44항 또는 제51항 중 어느 한항에 있어서, 상기 단백질이 CD54인 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한항에 있어서, 상기 하이브리드화는 전기적 수단에 의해 달성되는 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  58. 제1항 내지 제56항 중 어느 한항에 있어서, 상기 하이브리드화는 화학적 수단에 의해 달성되는 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한항에 있어서, 대상 단백질을 발현하는 세포와 추가로 하이브리드화되는 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  60. 제1항 내지 제58항 중 어느 한항에 있어서, 상기 하이브리드화는 3종의 개별 세포들의 하이브리드화에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  61. 제1항 내지 제58항 중 어느 한항에 있어서, 상기 하이브리드화는 각 세포 집단이 복수개의 동일 세포 타입을 포함하는, 3가지의 세포 집단을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  62. 제1항 내지 제61항 중 어느 한항에 있어서, 상기 하이브리드 세포는 원하는 번역 후 변형 또는 원하는 기능성을 나타내는 단백질의 발현을 허용하기 위해, 특정 세포 타입을 규정하는 마커들로 농화(enrich)되는 것을 특징으로 하는 하이브리드 세포.
  63. 제1항 내지 제62항 중 어느 한항에 따른 하이브리드 세포의 제조 방법으로서,
    줄기 세포 또는 미구속된 기원 세포로부터 유래된 제1 세포;
    공통 림프성 기원 세포 유래의 제2 세포; 및
    공통 림프성 기원 세포 유래의 제3 세포의 하이브리드화 단계를 포함하며,
    상기 제1 세포는 골수종 세포가 아닌 것을 특징으로 하는, 하이브리드 세포의 제조 방법.
  64. 제1항 내지 제62항 중 어느 한항에 따른 하이브리드 세포에서 단백질을 발현시키는 단계를 포함하는, 단백질의 생산 방법.
  65. 제1항 내지 제62항 중 어느 한항에 따른 하이브리드 세포에서 생산되는 단백질.
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