KR102648479B1

KR102648479B1 - 단백질 기반 의약들 (protein-based pharmaceuticals) 의 고 수준 생산을 위한 세포주들 (cell lines)

Info

Publication number: KR102648479B1
Application number: KR1020227000886A
Authority: KR
Inventors: 로렌스 포먼
Original assignee: 초 플러스 인크.
Priority date: 2019-06-10
Filing date: 2019-06-10
Publication date: 2024-03-15
Also published as: JP2024091682A; CN114096659A; AU2019450349B2; JP2022543522A; EP3980524A4; AU2019450349A1; WO2020251537A1; IL288877B1; IL288877B2; EP3980524A1; IL288877A; KR20220024478A; CA3143154A1; BR112021024923A2

Abstract

본 개시는 상업적 생산 비용을 상당히 감소시키는 단백질-기반 의약제들의 제조를 위한 개선된 세포주들을 제공한다. 세포주들은 출발 혼합물 내의 다른 세포들과 비교하여, 소포체, 골지체 및/또는 기타 원하는 표현형 특징들의 수준과 같은 비특이적 기준으로 단백질 생산을 지원하는 하나 이상의 특성들에 대해 혼합된 군집으로부터 세포들을 선별함으로써 획득된다. 특히 효과적인 생산자 세포주들은 세포 하이브리드들을 만들어 기능 선별을 위한 세포들을 준비함으로써 획득할 수 있다. 관심 치료 단백질을 인코딩하는 유전자는 융합 및 선별의 1회 이상의 사이클 전에, 또는 후에 세포들 내로 형질주입될 수 있다. 발현되는 단백질 제품에 따라 배양액 1 리터당 8 g 이상의 단백질을 생산하는 세포주들이 획득될 수 있다.

Description

단백질 기반 의약들 (PROTEIN-BASED PHARMACEUTICALS) 의 고 수준 생산을 위한 세포주들 (CELL LINES)

본 출원은 일반적으로 단백질 기반 의약 화합물들의 생산에 관한 것이다. 이것은 또한 세포들의 변형 및 선별, 그리고 개선된 생물학적 및 약리학적 특성들을 갖고 단백질 생산을 위한 세포주들을 획득하기 위해 관심 유전자로 이러한 세포들의 형질주입 (transfection) 에 관한 것이다.

생물학적 제제들은 의약 시장에서 지속적으로 증가하는 비율을 구성한다. 이들은 다른 약제들보다 특이성이 높아 부작용이 보다 적으면서 더 표적화된 효능을 초래한다. 이에 따라 보다 높은 생산성과 더 낮은 비용으로 개선된 산업 생산 수단에 대한 수요가 급증하고 있다.

일부 치료 단백질들은 연간 환자당 10g 이상의 단백질을 요구할 수 있는 치료 용량 및 투여 일정을 갖는다. 현재의 단백질 생산 수준은 일반적으로 배양액 1 리터당 4 g 이하이며 더 전형적으로 리터당 2 g 미만이다. 특정 단백질 제품을 시장에 공급하려면 연간 400,000 ㎏을 생산해야 할 수 있다. 이것은 약 40개의 올림픽® 크기 수영장 양에 해당하는―1 억 리터의 배양 배지가 처리되어야 함을 의미하고―이에 따라 10 억 달러의 전용 제조 시설들이 여러 개 필요하다.

포유류 단백질 생산의 최근 발전은 A.D. Bandaranayake 및 S.C. Almo, FEBS Lett 2014, 588 (2) : 253-260; 및 T. Lai 외, Pharmaceuticals 2013, 6:579-603에 거론된다. 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포들의 세포 공학 및 배양은 T. Omasa 외, Current Pharmaceutical. Biotechnology, 2010:11, 233-240; C.A. 윌켄스 및 Z.P. Gerdzen, PLOS ONE, 2015년 3월 13일; 및 J.Y. Kim 외, Appl. Microbiol. Biotechnol. 2012, 93:917-930에 검토된다. CRISPR/Cas 9와 같은 시스템들을 이용한 복합 게놈 공학은 L. Cong 외, Science 2013, 339 (6121) :819-823; Y. Huang 외, J. Immunol. Methods 2007, 322:28-39; J.S. Lee 외, Science Reports, 2015년 2월 25일; 및 P. Mali 외, Nat. 방법 2013, 10 (10) :957-963에 의해 검토된다.

미국 특허 제5,607,845호 (Spira 외, Pharmacia & Upjohn) 는 융합 프로토콜을 이용하여 생산 세포주의 증가된 생산을 획득하는 방법을 제안했다. 미국 특허 제6,420,140호 (Hori 외, Abgenix Inc.) 는 세포 융합 방법에 의한 다량체 단백질의 생산을 제안하였다. CRISPR/Cas9 및 CRISPy를 이용한 CHO 세포들의 게놈 편집은 C. Ronda 외, Biotechnol. Bioeng. 2014, 111:1604-1616에 의해 검토된다.

지금까지 설명된 기술 중 어느 것도 다음 섹션에서 설명되는 바와 같은 본 발명의 기술의 특징들 및 이점들을 갖지 않는다.

미국에 한하여, 본 출원은 2015년 9월 3일에 출원된 미국 가출원 제62/213,880호의 우선권 이점을 주장하는, 2016년 9월 1일에 출원된 미국 출원 제15/254,852호 (계류중, 미공개) 의 일부 계속 출원이다. 앞서 언급한 우선권 출원들은 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 여기에 인용된다.

이전에 이용 가능한 기술을 사용하여 치료 단백질들 (예를 들어, 항체들) 의 생산은 많은 양의 배양 배지와 복잡한 기반 시설을 필요로 하는 고가였다. 본 개시는 세포당 기준으로 실질적으로 증가된 단백질 생산 수율을 제공하여 상업적 생산 비용을 감소시키고 잠재적으로 제품 품질을 개선시킨다.

본 개시에 기술된 모형 세포주들은 높은 수준의 단백질 생산에 적합하다. 원칙적으로, 본 발명은 포유류 세포들, 곤충 세포들, 및 효모 세포들을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 기원 진핵 세포주 (originating eukaryotic cell line) 에서 구현될 수 있다. 세포들은 출발 혼합물 (starting mixture) 의 다른 세포들과 비교하여, 특정 단백질에 대해 반드시 특이적이지 않은 기준으로 단백질 생산을 지원하는 하나 이상의 특성들: 예를 들어, 세포 내 소포체의 밀도, 골지체의 밀도 및/또는 기타 원하는 표현형 특징들의 수준에 대해 스크리닝된다. 선별된 세포들은 이식 유전자로부터 단백질 또는 기타 유전자 생성물을 생산하는 능력이 증가되었다. 선별된 세포는 내인성 유전자들 (endogenous genes) 이 추가 조절 제약을 받기 때문에 내인성 유전자로부터 증가된 생산을 보일 수도 있고 보이지 않을 수도 있다. 치료 단백질을 인코딩하는 유전자는 전형적으로 하나 이상의 사이클들 전에, 후에 또는 동안에 세포들 내로 형질주입된다. 선별한 단백질에 따라 배양액 1 리터당 8 g 이상의 단백질을 생산하는 세포주를 획득할 수 있다.

본 발명의 일 양태는 단백질 기반 의약들 (protein-based pharmaceuticals) 의 고 수준 생산에 적합한 세포주를 획득하는 방법이다. 기원 세포 군집 (originating cell population) 은 전형적으로 단백질 생산 능력 측면에서 이종적이며(heterogeneous), 그리고/또는 그 안에 포함된 세포들 중 적어도 일부가 전체로서 세포 군집보다 세포당 증가된 양의 단백질을 생산하는 능력을 갖는 방식으로 처리될 수 있다. 예를 들어, 세포들의 혼합물은 혼합물이 하나 이상의 세포 하이브리드들 (cell hybrids) 을 형성하도록 처리되며, 세포 하이브리드들 각각은 혼합물로부터 2 개 이상의 세포들의 게놈의 전부 또는 일부를 포함한다. 세포들은 출발 혼합물 내의 다른 세포들과 비교하여 단백질의 증가된 생산 및/또는 분비를 지원하는 보다 고 밀도의 하나 이상의 아세포 소기관들 (subcellular organelles) 에 대해 강화된 생산자 세포 군집을 획득하기 위해 군집으로부터 선별된다. 기원 혼합물 (originating mixture) 은 본질적으로 (essentially) 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포들로 예시되는 단일 세포주의 세포들 또는 둘 이상의 상이한 세포주들의 조합으로 구성될 수 있다.

본 개시가 "생산자 세포주"를 언급할 때, 의미하는 것은 상업적 사용 또는 판매와 같은 유전자 생성물의 생산에 적합한 세포주이다. 본 개시에 제시된 기술은 세포들이 높은 수준 (세포당, 또는 배양 부피당) 의 및/또는 특정 관심 특징들을 갖는 유전자 생성물을 생산할 수 있게 하는 특별한 특성들을 갖는 생산자 세포주를 획득하는 방법을 설명한다. 이 기술에 따라 선별된 세포주는 이식 유전자가 선별 전에 또는 후에 도입될 수 있기 때문에 특정 생성물의 생산을 위한 재조합 이식 유전자를 함유하거나 함유하지 않을 수 있다. 이식 유전자가 존재하는지 여부에 관계없이, 본 발명에 따라 생성된 세포주는 일단 이식 유전자가 세포에 도입되면 높은 수준의 생성물 생산자가 될 수 있게 하는 특별한 특성들을 갖는다. 이러한 특별한 특성들에는 소포체 또는 골지체와 같은 단백질 생산에 관여하는 세포내 소기관들의 상대적 강화 (relative enrichment for intracellular organelles) 를 포함될 수 있다. 이식 유전자로부터 높은 수준의 생산을 위한 세포들의 능력은 반드시 세포들이 내인성 유전자들로부터 높은 수준의 생산을 위한 능력을 마찬가지로 갖는다는 것을 의미하지는 않는다: 실제로, 이식 유전자에 의해 인코딩된 표적 유전자 생성물을 생성하기 위한 증가된 생산 능력이 선택적인 경우, 표적의 순도는 (총 세포 생산과 비교하여) 증가하여 정제를 용이하게 할 수 있다.

적절한 고 생산자 세포들을 선별하는 방법은 다음 절차들 중 임의의 조합에서 하나 이상을 포함할 수도 있다:

● 혼합물 내의 다른 세포들과 비교하여 상대적으로 고 밀도의 세포당 소세포를 갖는 개별 세포들 또는 하이브리드들을 선별하는 단계;

● 혼합물 내의 다른 세포들과 비교하여 상대적으로 고 밀도의 골지체를 갖는 개별 세포들 또는 하이브리드들을 선별하는 단계;

● 소포체 및/또는 골지체를 염색하는 바이탈 염료로 세포들을 인큐베이션하는 단계 (incubating), 및 세포 각각과 관련된 바이탈 염료의 양에 따라 세포들을 분류하는 단계;

● 혼합물 내 세포들에서 융합 단백질을 발현시키는 단계로서, 여기서 융합 단백질은 소포체 및/또는 골지체에 의해 처리되는 펩타이드와 융합된 광학 신호 (예, GFP 또는 루시퍼라제) 를 생성하는 펩타이드를 포함하며, 이에 따라 세포들은 혼합물 내 다른 세포들보다 높은 수준으로 광학 신호를 발현하여 선별될 수 있는, 발현 단계.

고 생산자 세포들을 획득하는 방법은 다음 절차들 중 하나 이상을 더 포함할 수 있다:

● 특정 배양 조건에서 더 빨리 자라거나 더 잘 자라는 세포를 선별하는 단계;

● 세포 표면 리간드(입자에 선택 가능하게 라벨링되거나 결합되는 항체)에 특이적인 항체와 세포들을 바인딩하는 단계; 및 항체로 라벨링된 세포들을 선별하여 리간드를 발현하는 세포들에 대해 강화된 아군집(subpopulation)을 획득하는 단계;

● 혼합물 내 다른 세포들과 비교하여 상대적으로 고 수준의 마커 단백질을 생산하는 세포들을 선별하는 단계로서, 여기서 마커 단백질은 세포로부터 분비되고 그리고/또는 분비된 알칼리성 포스파타제 또는 분비된 루시퍼라제와 같은, 세포 표면 상에 발현되는 선별 단계;

● 혼합물 내 다른 세포들과 비교하여 마커 단백질에서 선호하는 글리코실화 패턴 또는 밀도를 생성하는 세포들을 선별하는 단계; 및

● 생산자 세포 군집의 배양하는 단계; 및 동일한 특징에 대해 그 안의 세포들을 재분류함으로써, 증가된 밀도의 아세포 소기관들이 안정적으로 유전될 수 있는 세포들에 대해 더욱 강화된 아군집을 획득하는 단계.

특정 표적 단백질에 대한 생산자 세포주는 본 개시에 따라, 예를 들어 표적 단백질을 인코딩하는 이식 유전자로 높은 수준의 단백질 생산을 위해 이미 선별된 세포주로부터 세포들을 형질주입시킴으로써 획득될 수 있다. 선택 가능하게, 높은 수준의 생산을 위한 추가 선별은 형질주입 후에 계속될 수 있다. 대안적으로, 관심 단백질을 인코딩하는 이식 유전자는 출발 세포 군집으로 형질주입될 수 있고, 이어서 혼합물 내의 다른 세포들과 비교하여 관심 유전자로부터 발현된 높은 수준의 단백질 생성물을 생성하는 세포들이 선별된다. 어느 경우든, 이식 유전자는 무작위 삽입에 의해 또는 게놈 내의 다른 위치들과 비교하여 높은 수준의 전사를 허용하거나 지원하는 것으로 미리 선별된 위치에서 세포들의 게놈에 삽입될 수 있다. 표적 단백질에 대한 생산자 세포주는 이어서 형질주입되고 선별된 세포들로부터 확립될 수 있다.

예를 들어, 관심 유전자는 항체 중쇄, 항체 경쇄, 또는 단쇄 (single-chain) 항체를 인코딩할 수 있다. 생산자 세포주는 원하는 특이성을 갖는 항체를 생성하는 항체 중쇄 및 항체 경쇄 모두를 발현할 수 있다. 생산자 세포주는 치료 효소, 호르몬, 성장 인자 또는 자연 발생 혈액 성분인 단백질을 발현할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 표적 단백질을 발현하도록 유전적으로 변형되기 전에 또는 후에 높은 수준의 단백질 생산을 위해 선별된 본 개시에 제공된 방법들에 따라 생산된 세포주이다. 이러한 세포주는 본 명세서에 나중에 기술되는 바와 같이 정량화된, 다음: 2 개 이상의 부모 세포주들의 게놈의 일부 또는 전부, 상기 부모 세포주들 중 어느 하나에 비해 보다 높은 농도의 소포체 및/또는 골지체, 및 재조합적으로 삽입된 유전자들 중 하나 또는 조합으로부터 특정 수주의 단백질을 생성하는 능력으로부터 선별된 특징들을 가질 수 있다. 생산자 세포주는 클론일 수도 있고 아닐 수도 있다.

발명가에게 현재 상업적인 관심이 있는 본 발명의 양태들은 첨부된 청구범위들에 의해 나타내어진다. 본 발명의 다른 양태들은 다음 설명으로부터 명백할 것이다.

도 1은 CHO 세포 오토형 하이브리드들 (CHO cell autotypic hybrids) 과 비교하여, 천연 CHO 세포들에서 소포체 (endoplasmic reticulum; ER) 염색에 대한 세포 빈도 프로파일을 나타낸다.
도 2는 CHO 세포 오토형 하이브리드들과 비교하여, 천연 CHO 세포들로 형질주입된 알칼리성 포스파타제의 상대적인 발현 수준을 나타낸다. 융합 세포들에서의 발현은 4 배 이상의 개선 (p＜0.05) 을 나타낸다.

본 개시는 상업적 생산 비용을 상당히 감소시키는 단백질-기반 약제들 (protein-based pharmaceutical agents) 의 제조를 위한 개선된 세포주들 (cell lines) 을 제공한다. 세포주들은 출발 혼합물 내의 다른 세포들과 비교하여, 소포체 (endoplasmic reticulum), 골지체 (Golgi apparatus) 및/또는 기타 원하는 표현형 특징들 (phenotypic features) 의 수준과 같은 비특이적 기준으로 단백질 생산을 지원하는 하나 이상의 특징들에 대해 혼합된 군집 (mixed population) 으로부터 세포들을 선별함에 의해 획득된다. 특히 효과적인 생산자 세포주들은 세포 하이브리드들을 만들어 기능 선별을 위한 세포들을 제조함으로써 획득할 수 있다. 관심 치료 단백질을 인코딩하는 유전자는 융합 및 선별의 1회 이상의 사이클 전에 또는 후에 세포들 내로 형질주입될 (transfected) 수 있다.

문맥

새로운 생물 의약품들 (biopharmaceutical products) 이 연간 약 100개의 비율 (rate) 로 출시되고 있으며, 바이오시밀러들 (biosimilars) 의 생산 경쟁은 계속 증가하고 있다. 이들 제품들의 생산에 필요한 배양량과 및 배양 비용을 줄일 수 있는 기술이 분명히 필요하다.

본 개시는 현재 표준 (잠재적으로 리터당 8g 이상) 을 능가하는 생산성으로 단백질 생물학적 제제의 생성물을 가능하게 하는 기술을 제공한다. 본 명세서에 설명된 고 효율 생산자 세포주들은 여러 방식들로 산업적 이용 가능성을 위해 사용될 수 있다. 바이오시밀러들과 관련하여, 브랜드 네임 제품들을 가진 회사들은 그들의 제품 비용 구조를 낮춤으로써 마케팅 이점을 유지할 수 있다. 유사하게, 바이오시밀러들을 생산하는 회사들은 비용면에서 브랜드 네임 제품들과 경쟁할 것이다. 세포주들은 기존 공장들의 용량을 증가시킴으로써: 더 적거나 더 작은 시설들에서 더 많은 단백질의 생산을 허용; 및 신제품들을 위한 비용과 임상 시간 (time-to-clinic) 을 감소시킴으로써 상당한 제품 유연성을 제공한다.

높은 수준의 표적 단백질을 생성하는 생산자 세포주들은 세포당 기준으로 (on per-cell basis) 더 많거나 더 빠른 단백질 생산을 위해 더 잘 갖추어진 개별 세포들에 대한 혼합 세포 군집을 스크리닝 (screening) 및 분류함 (sorting) 으로써 얻어진다.

세포 하이브리드들 제조

개별 고 생산자 세포들은 다음 섹션에 기술된 바와 같이 이와 관련하여 이종적인 (heterogeneous) 임의의 세포 군집으로부터 선별될 수 있다. 많은 단일 세포주들 (예를 들어, CHO 세포들) 은 표준 배양으로부터 직접적으로 고 생산자 세포들에 뷴류 및 선별될 수 있는 증식하는 세포 군집의 유전자 함량 및 세포내 조직체 (intracellular apparatus) 의 측면에서 처음에 충분히 다양하다.

선택 가능하게, 최종 제품 수율을 향상시키거나 분류 과정을 향상시키기 위해, 사용자는 세포 군집 내에서 단백질 생산 수준의 이질성을 향상시키거나 일반적으로 세포 군집에 대한 단백질 생산의 수준을 전체로서, 또는 그의 아군집 (subpopulation) 으로서 증가시킬 기술들 중 하나 또는 조합을 취함으로써 분류를 위해 세포들를 준비할 수 있다. 적합한 기술들은 예를 들어 단백질 생산 또는 처리에 관련된 세포내 기계류 (intracellular machinery) 에 기여하는 유전자들을 증가시키거나 셔플링하기 위해 (shuffle) 세포들의 게놈을 변경하는 기술들이다. 이러한 방식으로 게놈을 변경하거나 셔플링하면 단백질 생산 수준 및 성장률을 포함한 다양한 서로 다른 특성들 중 하나 이상을 갖는 많은 유전적 변이체들이 생성될 수 있다.

본 발명의 제작자는 단백질 생산에 적합한 세포들이 다른 세포들과 융합함으로써 보다 높은 수준의 생산을 달성할 수 있다는 것을 발견하였다. 본 발명의 실시를 제한하지 않고, 2 개의 세포들을 함께 융합하는 것은 단백질 생산에 참여하는 세포들의 성분들, 유전학, 또는 유전적 제어 측면에서 부분적으로 부가적이라는 가설이 세워졌다. 개선된 특성들이 형질을 유지하면 (breed true) 유리하다. 따라서, 세포들이 융합된 후, 이들은 전형적으로 관심 표현형 특성들에 대해 여러 회의 배양 및 선별을 받게 된다. 결과한 세포들은 이수성일 (aneuploid) 수 있거나, 그렇지 않으면 단백질 생산에 관련된 세포 성분들을 인코딩하는 부모 세포들 (parental cells) 의 게놈들 전부 또는 일부를 보유할 수 있다.

융합에 적합한 모형 세포들은 CHO 세포들, 마우스 골수종 NS0 세포들, 마우스 골수종 SP2/0 세포들, 인간 배아 신장 (Human Embryonic Kidney; HEK) 293 세포들 및 베이비 햄스터 신장 (Baby Hamster Kidney-21) 세포들과 같은 산업 단백질 생산에 이미 사용된 세포주들이다. 또한, 기타 중국 햄스터 세포 유형들 (예를 들어, 분비된 단백질을 만드는 유방 및 간 세포들), 인간 세포주들, 원하는 글리코실화 특성들을 가질 수 있는 곤충 및 연체 동물 세포들과 같은 무척추 동물 세포들도 적합한다. 본 개시의 맥락에서, "세포주"는 조직 배양에서 지속적으로, 광범위하게, 또는 무기한으로 증식될 수 있는 세포들의 군집이다. 출발 세포주는 전형적으로 세포가 생산할 이식 유전자로부터의 단백질의 양과 관련된 하나 이상의 표현형 특징들의 측면에서 이종적이다. 배양될 때, 본 개시에 따라 획득된 생산자 세포주는 이종적이거나, 실질적으로 동종이거나(homogeneous), 클론성인 차대 (progeny) 를 생산할 수 있다.

세포 융합은 융합될 세포들의 세포 혼합물 (하나의 세포주로부터 복수의 세포들, 또는 하나 이상의 세포주, 또는 적어도 하나의 세포주와 적어도 하나의 1차 세포 군집의 혼합물) 을 획득함으로써 수행된다. 다음으로, 세포 혼합물은, 예를 들어, 하이브리드들의 형성을 촉진하는 배양 조건들에서 배양함으로써, 전기융합을 수행함으로써, 센다이 바이러스와 같은 융합 생성 바이러스와 결합함으로써, 세포를 접촉하게 배치함으로써 (예를 들어, 완만한 원심분리에 의해), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 과 같은 융합 생성제로 처리하거나, 이들의 임의의 효과적인 조합을 사용하여, 적절한 융합 프로토콜에 적용된다.

본 개시의 목적들을 위해, 2 개 이상의 세포들을 함께 융합시켜 만들어진 세포들은 오토형 하이브리드들 (autotypic hybrids) (동일한 세포주로부터의 세포들이 함께 융합됨), 아이소형 하이브리드들 (isotypic hybrids) (동일한 유전자형을 갖는 세포들), 알로형 하이브리드들 (allotypic hybrids) (상이한 유전자형들을 갖는 동일한 종들의 상이한 개체들로부터의 세포들), 및 지노형 하이브리드들 (xenotypic hybrids) (상이한 종들로부터의 세포들) 로 일컬어질 수 있다. 오토형 하이브리드들은 전형적으로 단일 세포주로부터 본질적으로 (즉, 적어도 99％의) 세포들로 구성된 세포들의 군집을 사용하여 형성된다. 다른 타입들의 하이브리드들은 전형적으로 잠재적으로 상보적인 특성들을 갖는 둘 이상의 세포주들로부터의 세포 군집들을 사용하여 형성된다. 본 개시는 또한 1차 공급원들로부터 단리되거나 획득된 하나 이상의 세포 군집들 그 자체들과의 융합 또는 확립되거나 (established) 클로닝된 세포주들과의 융합을 포함한다.

세포들은 임의의 적합한 기술을 사용하여 하이브리드들로 융합될 수 있다. 예를 들어, 세포들은 융합 생성제의 존재 및/또는 하이브리드들의 형성을 촉진하는 배양 조건들 하에 배양될 수 있거나, 또는 선택 가능하게, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 과 같은 융합 생성제와 조합하여 완만한 원심분리에 의해 강제로 접촉될 수 있다. 전형적으로, 융합된 세포는 2 개의 세포들을 함께 융합함으로써 얻어지지만, 3개 이상의 세포들의 융합이 가능하다. 2 개의 상이한 세포 군집들의 융합은 혼합 세포 생성물들 (부모 세포주들에 따라, 아이소형의, 알로형의, 또는 지노형의 하이브리드들) 및 오토형 하이브리드들을 초래할 것이다. 오토형 또는 아이소형 하이브리드들은 원하는 경우 혼합물 내의 세포주들 중 하나에서 발현되지만 다른 것에서는 아닌 리간드에 대해 특이적인 형광 라벨링된 또는 표면 결합된 항체를 사용하여 알로형 또는 지노형 하이브리드들로부터 분리될 수 있다.

달리 명시적으로 나타내지 않는 한, 이러한 모든 조합은 본 발명의 범위에 속한다. 효과를 더욱 향상시키기 위해 하이브리드들의 군집 내에서 세포 융합을 반복 및/또는 궁극적인 세포주에 부가적인 유익한 특성들을 부여하기 위해 다른 세포주들과 교차 하이브리드화하는 것이 유익할 수 있다. 따라서, 융합 및 선별 단계들은 2 회, 3 회 또는 4 회 또는 이상 반복적으로 수행될 수 있다.

고 생산자 세포주들의 선별

본 개시의 귀중한 통찰은 출발 혼합물 내의 다른 하이브리드들 또는 부모 세포들과 비교하여, 증가된 단백질 생성을 지원하는 보다 높은 수준의 아세포 기계류 (subcellular machinery) 또는 생화학을 위해 혼합된 세포 군집으로부터 세포들을 선별함으로써 단백질 생산이 증가될 수 있다는 발상이다. 특정 단백질의 생산에 반드시 특이적이지 않은 표현형 특징들 중 적어도 하나가 선별된다. 특징은 단순히 관심 단백질이나 대리 (surrogate) 의 발현 수준이 아니다. 오히려, 광범위의 상이한 단백질들의 생산을 지원하는 특징이다. 이러한 특징들은 아세포 소기관들, 특히 세포로부터의 단백질 분비와 관련된 아세포 소기관들의 상대 밀도, 및 다양한 서로 다른 단백질들을 완성하거나 분비하는데 도움이 되는 효소들의 상대적 수준 또는 농도를 포함한다.

단백질 생성에 관여하는 아세포 소기관들은 소포체 (ER) 및 골지체를 포함한다. 이들 중 하나 또는 둘 모두가 측정될 수 있으며 바이탈 염료를 사용하여 세포를 손상시키지 않고 분류하거나 또는 선별하기 위한 기준으로서 사용할 수 있으며, 결합된 염료의 양을 기준으로 세포가 선별될 수 있다.

이러한 염료들은, 예를 들어, Molecular Probes 사로부터 상업적으로 입수할 수 있다. ER에 대한 바이탈 염료들의 예는,

● ER-Tracker™ 블루-화이트 DPX (E12353)

● ER Tracker™ 그린 (글리벤클라미드 BODIPY® FL) (E34251)

● ER-Tracker™ 레드 (글리벤클라미드 BODIPY® TR) (34250)

● DiOC_{6 (}D273)

● DiOC_{5 (}D272)

를 포함한다.

골지체에 대한 바이탈 염료들은,

● NBD C6-6-세라마이드 (N1154)

● NBD C6-스핑고미엘린

● BODIPY® FL C5-세라마이드 (D3521)

● BODIPY® TR 세라마이드 (D7540)

를 포함한다.

대안적으로 또는 추가로, 사용자는 ER 또는 골지체를 표적으로 하는 형광 단백질을 도입하는 발현 기반 라벨링 시스템들 (expression-based labeling systems) 을 시험할 수 있다. 이들은 라벨링될 세포 소기관을 표적으로 하거나 이에 의해 처리되는 단백질 서열과 융합된, 광학적 라벨을 발현하는 부분을 포함하는 융합 단백질들이다. 예들은 다음을 포함한다:

인비트로젠 (invitrogen) :

● CellLight™ ER-GFP (C10590)

● CellLight™ ER-GFP (C10591)

● CellLight™ 골지 (Golgi)-GFP (C10592)

● CellLight™ 골지-GFP (C10593)

에브로젠 (Evrogen) :

● pmKate2-ER (FP324)

● pFusionRed-ER (FP420)

● pTagRFP-골지 (FP367)

● pFusionRed-골지 (FP419)

클론텍 (Clontech) :

● pDsRed2-ER 벡터 (632409)

● pDsRed-단량체-골지 벡터 (632480)

● pAcGFP1-골지 벡터 (632464)

이들 염료들 중 하나로 염색한 후, (예를 들어, 유동 세포 분석 및 분류에 의해), 예를 들어, ER, 골지 또는 광학적으로 라벨링된 유전자 생성물에 대한 염색 측면에서, 평균적으로 적어도 1.2 배, 1.5 배, 2 배 또는 2 배보다 높은 염색 수준을 갖는 세포들이 선별될 수 있다.

선별할 다른 특징들은 표현형 특징들, 면역학적 특징들 및 단백질 생산 수준들을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 면역학적 특징들은 세포에 의한 원하는 리간드의 발현 (예를 들어, 세포에 의해 분비되거나 표면에서 발현됨) 을 포함할 수 있다. 부모 주 (parental line) 보다 적어도 1.5 배, 2 배, 3 배, 또는 5 배 보다 높은 이러한 마커들 (markers) 의 평균 발현 수준을 갖는 세포들은, 예를 들어, 직접 또는 간접 항체 라벨링에 이어 FACS에 의해, 또는 항체 코팅된 마이크로비드들 (antibody-coated microbeads) 에 대한 결합 또는 이들로부터의 해제에 의해 선별될 수 있다. 관심 면역학적 마커들은 글리코실화 효소들과 같은 분비된 단백질 생산에 참여하는 리간드들을 포함한다. 본 개시에 따라 세포들을 스크리닝하기 위해 사용될 수 있는 다른 분류 방법들은 PCR-활성화된 세포 분류, 형광 인 시츄 혼성화 유동 세포분석 (fluorescence in situ hybridization flow cytometry; FISH PC), 또는 FISH에 이은 레이저 포획을 포함할 수 있다.

동시에 또는 별도의 단계로서, 개별 세포들은 또한, 특정 배양 조건 하에서 더 잘 성장하거나 또는 상대적으로 낮은 수준의 하나 이상의 원치 않는 오염 물질들을 발현하는 세포들과 같이, 제조 목적들을 위한 바람직한 특징들을 위해 혼합 세포 군집으로부터 선별될 수 있다:

생물학적 제제들의 제조에 사용하기에 충분히 안정적인 세포주를 생성하기 위해, 선별된 세포들은 여러 세포 분열들을 통해 배양물에서 성장한 다음, 원하는 특징 각각에 대해 총 2 회, 3 회, 또는 3 회보다 많이, 원하는 특징이 안정적인지 확인하기 위해 재시험될 수 있다.

관심 유전자로 세포들의 형질주입

관심 단백질 (표적 단백질) 을 발현하는 세포주를 생성하기 위해, 생산자 세포들 또는 그들의 전구체들은 숙주 세포주에서 발현을 유발하는 유비쿼터스 또는 포유류 프로모터의 제어 하에 단백질을 인코딩하는 유전자로 형질주입될 수 있다. 표적 단백질의 생산 수준은 단백질 발현 카세트를 삽입하기 위한 일시적 형질주입 방법을 사용하여 처리 과정에서 결정할 수 있다. 대안적으로 또는 후속적으로, 관심 유전자 또는 마커 유전자를 세포주의 게놈 내로 통합하는 영구 형질주입 (permanent transfection) 이 수행될 수 있다. 형질주입은 리포솜 기반 시약들 (예를 들어, Lipofectamine™ 2000 또는 FuGENE™ 6), 인산칼슘, 전기천공 또는 아데노바이러스, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 기반 벡터 감염을 사용하여 수행할 수 있다.

형질주입 후, 예를 들어, 효소결합 면역흡착 측정법 (enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA) 에 의해, (전형적으로 클로닝 또는 제한 희석 배양 후) 표적 단백질의 생성 또는 분비에 대해 세포들을 시험한다. 원하는 단백질의 생산이 증가된 세포들 또는 클론들이 선별된다. 목적은 부모 세포주보다 1.5 배, 2 배, 4 배, 8 배, 12 배, 16 배 또는 20 배 높은 단백질 생산; 및/또는 전형적인 제조 조건들에서 배양액 1 리터당 6 g, 8 g, 10 g, 12 g, 15 g 또는 20 g 수준의 생산 증가이다. 관심 단백질은 또한 시알릴화의 품질 또는 글리코실화의 다른 측면들과 같은 기타 원하는 특성들에 대해 시험될 수 있다.

원칙적으로, 형질주입은 다른 특징들에 대한 융합 및 선별의 1회 이상의 사이클 전, 사이클 동안에 또는 사이클 후에 수행될 수 있다. 예를 들어, 관심 유전자로 형질주입하기 전에 융합 및 선별을 수행할 수 있어, 사용자가 선별한 단백질의 고 수준 생산에 적합한 부모 세포주를 확립할 수 있다. 대안적으로, 형질주입은 원래의 부모 세포주 (originating parental cell line) 내로 수행될 수 있으며, 후속 융합 및 분류 단계들 동안 생산 수준들을 추적하거나 이러한 분류를 위한 또 다른 기초를 제공하는데 사용할 수 있다. 대안적으로, 형질주입은 중간 단계로서 수행될 수 있으며, 여기서 세포들은 이미 ER 또는 골지와 같은 일부 다른 특징에 대한 융합 및 선별의 하나 이상의 사이클을 거치고, 생성된 하이브리드는 관심 단백질을 발현하도록 형질주입되고, 그리고 나서 관심 단백질의 발현 및/또는 본 개시에서 앞서 언급된 기타 특징들에 대한 융합 및 선별의 추가 사이클들을 거친다.

관심 단백질은, 예를 들어, 항체 중쇄, 항체 경쇄, 단쇄 항체, 치료 효소, 호르몬, 성장 인자, 또는 일반적으로 혈액 성분인 단백질 제조를 위해 의도된 생물학적 제제일 수 있다.

또 다른 옵션은 궁극적으로 제조될 단백질에 대한 대리 (proxy) 로서 마커 단백질을 사용하여 세포주를 개발하는 것이다 (예를 들어, 분비된 알칼리성 포스파타제 또는 분비된 루시퍼라제). 다시금, 형질주입은 선택 가능하게 하나 이상의 사이클에서 선별 기준으로서 마커의 발현 수준을 사용하여, 융합 및 선별의 복수의 사이클들 전에, 복수의 사이클들 동안에 또는 복수의 사이클들 후에 수행될 수 있다. 이는 마커 단백질의 발현에 최적화된 부모 세포주를 생성하며, 세포주의 유익한 특성들은 상업적 관심의 생물학적 제품을 생산하기 위한 추가 유전적 변경 이후에도 유지될 것으로 예상된다.

궁극적으로, 원하는 수준의 마커 단백질 발현을 갖는 세포주가 개발되면 마커는 관심 단백질로 대체된다. 형질주입은 위에 나열된 기술들을 사용하여 게놈에 무작위로 다시 수행할 수 있으며 마커 단백질의 발현은 축소된다. 대안적으로, 마커 단백질에 대한 유전자는 표적 통합 기술 (targeted integration technique) 을 사용하여 관심 단백질을 인코딩하는 유전자로 치환될 수 있다. 이러한 기술들은 예를 들어 CRISPR/Cas9, 아연-핑거 재조합효소 (zinc-finger recombinas; ZFR) 또는 전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제 (transcription activator-like effector nuclease; TALEN) 를 포함한다. 이러한 방식으로, 관심 유전자는 게놈 내의 다른 위치들과 비교하여 높은 수준의 전사 (transcription) 를 허용하거나 지원하는 것으로서 미리 선별된 위치의 생산자 세포주 또는 혼합물로부터 세포들의 게놈으로 삽입된다.

표적 통합 기술들의 사용에 대한 더 많은 정보를 위해, 독자는 L. Cong 외, Science 2013, 339 (6121) :819-823; Y. Huang 외, J. Immunol. Methods 2007, 322:28-39; J.S. Lee 외, Science Reports, 2015년 2월 25일; 및 P. Mali 외, Nat. Methods 2013, 10 (10) :957-963; 및 C. Ronda 외, Biotechnol. Bioeng. 2014, 111:1604-1616을 참조할 수 있다.

부가적인 특징들의 통합

본 개시에서 제공되는 시스템 및 기술들은 제조 목적을 위해 세포 성장 또는 단백질 생산을 향상시키기 위한 하나 이상의 대안적인 전략들과 조합될 수 있다. 이러한 기술들은 벡터 및 발현 플랫폼 엔지니어링, 오믹스 (omics) 기반 접근 방식들, 유전자 전달 및 통합의 발전, 염색질 개방 요소를 사용한 단백질 생산의 향상, 클론 스크리닝 전략의 개선 등을 포함한다.

이러한 기술들은 예를 들어 A.D. Bandaranayake 및 S.C. Almo, FEBS Lett 2014, 588 (2) : 253-260; T. Lai 외, Pharmaceuticals 2013, 6:579-603; T. Omasa 외, Current Pharmaceutical. Biotechnology, 2010:11, 233-240; C.A. 윌켄스 및 Z.P. Gerdzen, PLOS ONE, 2015년 3월 13일; J.Y. Kim 외, Appl. Microbiol. Biotechnol. 2012, 93:917-930; 및 C. Ronda 외, Biotechnol. Bioeng. 2014, 111:1604-1616에 거론된다.

통합에 적합한 이러한 특징 중 하나는 급속한 확산이다. 혼합 세포 군집들은 소포체 및/또는 골지의 함량 기준으로, 세포당 기준으로 높은 수준의 단백질 생산을 위해 준비된 세포들의 선별으로부터 동시에 또는 별도의 단계로 생산자 세포주의 개발 동안 언제든지 스크리닝할 수 있다. 생존이 불가능하거나 느리게 성장하는 세포들은 더 빠른 성장을 위해 선별 동안 군집으로부터 제거되거나 희석된다.

예시로서, 세포들은 적절한 배양 배지 및 적절한 조건하에서 배양된다. 세포들의 전형적인 종자 농도는 2 × 10⁵ 세포/mL이다. 세포들을 2일 동안 배양한 다음 세포들을 2 × 10⁵세포/mL의 농도로 희석하여 계대 배양한다 (sub-cultivate). 느리게 성장하는 세포가 희석되도록 원하는 대로 반복한다. 혼합 배양에서 빠르게 성장하는 세포의 비율이 증가함에 따라 계대 배양 단계들 사이의 시간이 감소될 수 있고 그리고/또는 각 단계에서 세포 희석 정도가 증가할 수 있다.

생산자 세포들의 특성들

높은 수준의 단백질 생산을 위해 선별된 세포주 또는 혼합 세포 군집은 여러 상이한 매개변수들 중 임의의 하나 이상에 의해 부모 세포주 또는 기원 세포주와 비교하여 특성화될 수 있다. 예를 들어, 선별된 세포들은 (1) (동일하거나 동일하지 않을 수 있는) 2 개 이상의 부모 세포주들의 게놈의 일부 또는 전부를 포함하는, 출발 세포들보다 더 이수성인 (aneuploid) 게놈 (동일하거나 동일하지 않을 수 있음), (2) 부모 세포주들 중 임의의 하나 또는 모두에 비해 보다 높은 (예를 들어, 2 배 내지 5 배 또는 4 배 내지 8 배, 또는 2 배, 4 배 또는 8 배 초과) 농도의 소포체 및/또는 골지체, (3) 부모 세포주보다 실질적으로 보다 높은 (예를 들어, 2 배 내지 5 배 또는 4 배 내지 8 배, 또는 2 배, 4 배 또는 8 배 초과) 세포당 또는 배양액 1 리터당 표적 단백질의 수준을 생성하는 능력, (4) 세포당 특정 양의 표적 단백질을 생산하는 능력 (예를 들어, 50, 65, 75, 100, 150, 200, 300 이상, 또는 500 pg/세포/일, 또는 50 내지 200 또는 75 내지 300 pg/세포/일) ; 또는 (5) 배양액 부피당 특정 양의 표적 단백질을 생성하는 능력 (예를 들어, 배양액 1 리터당 적어도 5 g, 8 g, 12 g, 20g, 또는 30 g, 또는 8 g 내지 20 g 또는 10 g 내지 50g의 단백질) 을 가질 수 있다.

이러한 비교들의 목적을 위해, 생산자 세포주는 동일한 시스템의 일부로서 보유하거나 참조 공급원으로부터 획득된 원래 세포주의 표준화된 군집과 비교될 수 있다. 예를 들어, CHO 유래 생산자 세포들은 American Type Culture Collection (ATCC®) 의 CRL-12023 세포와 비교될 수도 있다. 본 개시는 출발 세포주, 및 예를 들어 상기 열거된 바이탈 염료들 중 하나 이상을 사용하여, 결정된 바와 같이, 상대적으로 고 밀도의 세포당 소포체 및/또는 골지체를 갖는, 출발 세포주로부터 유래된 생산자 세포주 둘 다를 포함하는 단백질 기반 의약들 (protein-based pharmaceuticals) 의 고 수준 생산을 위한 시스템들을 포함한다.

이 기술의 이점들

실시 및 적용 방식에 따라, 본 개시에 기재된 본 발명의 측면들은 임의의 조합으로 하기 이점들 중 임의의 것을 제공할 수 있다:

● 시장 규모가 커짐에 따라 새로운 GMP 생산 시설들을 확장하거나 건설할 필요성을 줄이고;

● 상대적으로 작거나 적은 수의 생물 반응기로 킬로그램 양의 단백질 완제품의 GMP 생산을 제공하고;

● 입증된 생물학적 제제의 생산 비용을 줄이고;

● 원하는 생물학적 제제 군의 (family of desired biological agents) 고 수준 발현에 적합한 생산 세포주를 생성하고;

● 발현될 유전자의 통합 후에 필요한 클로닝 또는 선별 단계들을 줄이고;

● 제품 품질을 향상하고 (예를 들어, 글리코실화) ; 그리고

● 고 품질의 소량 연구 자료를 제공하여 임상 시험 시간을 감소시킨다.

실시예들

실시예 1

본 발명의 기술은 CHO 세포들의 K1 라인 (ATCC® CCL-61) 을 사용하여 실행될 수 있다. 다음 프로토콜에 따라 아이소형 하이브리드들을 만들기 위해 배양에서 성장한 CHO 세포들의 군집이 융합된다.

1. 10⁷세포들 원심분리함

2. 상층액 (supernatant) 폐기함

3. 튜브 바닥을 가볍게 두드려 펠렛을 부숨

4. 파이펫 팁으로 세포를 혼합하면서 1 분 동안 100μL의 50 ％ PEG를 추가함

5. 추가 1분 동안 세포를 계속 교반함

6. 혼합하면서 1 분에 걸쳐 100μL의 성장 배지를 첨가함

7. 혼합하면서 3분에 걸쳐 300μL의 성장물을 첨가함

8. mL의 성장 배지 (growth medium) 를 천천히 첨가함

9. 37 ℃에서 5 분간 인큐베이션함 (incubate)

10. 원심분리함

11. 펠릿을 20mL의 성장 배지에 재현탁하고 125 mL 배양 플라스크로 옮김

12. 정상적으로 배양

대안적으로, ECM2001 펄스 발생기 (BTX) 를 이용하는 전기융합 절차가 사용된다. 10⁷개 세포들이 원심분리되고 1 mL의 Cytofusion™ 배지 C에 재현탁된 다음, 융합 챔버로 옮겨진다. 셀들은 10초 동안 150 V/㎝의 교류 펄스로 정렬된다. 세포 융합은 25μsec 동안 1200 V/㎝의 단일 구형파 직류 펄스에 의해 트리거된다 (triggered). 세포들을 5분 동안 방치하고 원심분리한 다음, 성장 배지에 재현탁하고 정상적으로 배양한다.

대안적으로, 바이러스 유도 융합 프로토콜이 사용될 수 있다. 센다이 바이러스를 이용하는, 예를 들어 GenomONE™ HVJ-E 키트 (Cosmo Bio USA) 를 이용하는, 다양한 프로토콜들이 존재한다: 세포들을 원심분리하고 2 × 10⁵ 세포/25 μL의 얼음처럼 차가운 세포 융합 완충액에 재현탁한다. 2.5 μL의 얼음처럼 차가운 HVJ-E (센다이 바이러스 막들) 현탁액이 세포들에 첨가되고 두드림 (tapping) 에 의해 혼합된다. 혼합물을 얼음 위에서 5분 동안, 다음으로 37 ℃에서 15 분 동안 인큐베이션한다. 혼합물에 성장 배지를 첨가하고 배양을 위해 6-웰 플레이트 (six-well plate) 로 옮겼다.

아세포 소기관들에 대한 라벨링 및 분류는 다음과 같이 수행될 수 있다. 세포들을 원심분리하고 HBSS 완충액으로 1 회 세척한다. ER 추적기 그린 및/또는 ER 추적기 블루/화이트의 1μM 용액이 HBSS에서 준비된다. 세포들을 염색 용액에 재현탁하고 37 ℃에서 30 분 동안 인큐베이션한다. 그런 다음 세포들을 PBS로 세척한다.

세포들이 분석 FACS에 사용되는 경우, 이들은 PBS에 재현탁되고; 분류해야 하는 경우, 1％ FBS가 보충된 PBS에 재현탁된다. ER Tracker 염료로 가장 많은 양의 염색을 나타내는 생존 가능한 군집의 10 ％가 수집되었다. 세포를 성장 배지가 포함된 튜브에 수집하고, 원심분리하고, 신선한 배지에 재현탁한 다음, 정상적으로 배양한다.

실시예 2

CHO-K1 세포들이 PEG 보조 융합 절차에 노출시되었다. 1 주일 동안 세포들이 리커버링되고(allowed to recover), 그 다음에 절차가 3번 반복되었다. 세 번째 융합에서 리커버링 후, 세포들이 바이탈 ER 추적 염료 (ER Tracker™ 그린 (글리벤클라미드 BODIPY® FL) ; 인비트로겐, E34251) 로 염색되고 FACSAriaII™ 세포 분류기 (BD 바이오사이언스; BD Biosciences) 를 이용하여 분류되었다. ER Tracker 염료로 가장 많은 양의 염색을 나타내는 생존 가능한 군집의 10 ％가 수집되었다. 배양에서 2주 리커버링후, 세포들을 최종 융합에 노출시키고, ER 추적 염료로 염색하고, LSRII™ 유동 세포 분석기 (BD Biosciences) 를 이용하여 분석하였다.

융합된 세포들 및 부모 CHO 군집에서 단백질 생산을 측정하기 위해, 세포들은 SEAP (분비된 알칼리성 포스파타제) 를 발현하기 위해 형질주입되었다. 형질주입은 다음과 같이 수행되었다:

1. 10⁶ 세포를 원심분리함

2. 상층액 폐기함

3. 100 μL 세포주 Nucleofector™ 용액 T에서 재현탁함

4. 2 ㎍ SEAP 발현 플라스미드를 첨가함

5. 전기천공 큐벳으로 옮김

6. Amaxa™ Nucleofector II 및 사전 설정 프로그램 U-023을 이용하여 전기천공함

7. 0.5 ml의 성장 배지를 첨가함

8. 세포들을 웰당 1 mL의 성장 배지가 들어 있는 6-웰 플레이트로 옮김

도 1은 소포체 (endoplasmic reticulum; ER) 수준에 대한 융합 및 염색 후 CHO 세포들의 FACS (형광 활성화 세포 분류) 프로필이다. 융합된 세포들은 출발 CHO 세포주와 비교하여 보다 높은 평균 수준의 ER을 나타내었다.

도 2는 형질주입 결과 (분비된 알칼리성 포스파타제의 비 생산성 (specific productivity)) 를 나타낸다. 융합된 세포들에서 마커 단백질의 발현은 4 배 이상의 개선을 나타낸다.

* * * * *

미국에서의 모든 목적들을 위해, 본 개시에서 언급된 각각의 모든 공보문 및 특허 문서는 마치 각각의 그러한 공보문 또는 문서가 구체적이고 개별적으로 참조로 본 명세서에 인용되는 것으로 표시된 것처럼 모든 목적들을 위해 그 전체가 참조로 본 명세서에 인용된다.

본 발명이 특정 실시예를 참조하여 설명되었지만, 일상적인 실험의 사항으로서 특정 문맥 또는 의도된 용도에 본 발명을 적용하기 위해 변경이 이루어질 수 있고 균등물이 대체될 수 있으므로, 청구항들의 범위를 벗어나지 않고 본 발명의 이점들을 달성한다.

Claims

단백질의 고 수준 생산 (high-level production) 세포주 (cell line) 의 조제 방법에 있어서,
(a) 배양된 세포들의 군집을 제공하는 단계로서, 상기 군집 내의 세포들은 이식 유전자로부터 단백질을 발현하는 능력이 이종적인 (heterogeneous), 상기 제공하는 단계;
(b) 배양된 세포들의 상기 군집으로부터 복수의 세포 하이브리드들 (cell hybrids) 을 형성하는 단계로서, 상기 복수의 세포 하이브리드들 각각은 상기 군집으로부터의 상기 세포들 중 2 개 이상을 포함하는, 상기 복수의 세포 하이브리드들을 형성하는 단계;
(c) 세포당 소포체의 밀도에 따라 상기 세포 하이브리드들을 분류하는 단계; 및
(d) 상대적으로 고 밀도의 세포당 소포체를 갖는 세포 하이브리드들 또는 상기 세포 하이브리드들의 차대 (progeny) 를 선별하는 단계를 포함하고;
이에 의해 출발 군집 내의 다른 세포들과 비교하여 재조합 단백질의 증가된 생산 및/또는 분비를 제공하는 생산자 세포주를 획득하는, 방법.
단백질의 고 수준 생산 (high-level production) 세포주 (cell line) 의 조제 방법에 있어서,
(a) 배양된 세포들의 군집을 제공하는 단계로서, 상기 군집 내의 세포들은 이식 유전자로부터 단백질을 발현하는 능력이 이종적인 (heterogeneous), 상기 제공하는 단계;
(b) 배양된 세포들의 상기 군집으로부터 복수의 세포 하이브리드들을 형성하는 단계로서, 상기 복수의 세포 하이브리드들 각각은 상기 군집으로부터 상기 세포들 중 2 개 이상의 세포들을 포함하는, 상기 복수의 세포 하이브리드들을 형성하는 단계;는
(c) 상기 (b) 단계 전, 도중 또는 후에 마커 단백질을 발현하도록 상기 배양된 세포들을 형질전환하는 단계;
(d) 상기 마커 단백질의 발현에 따라, 세포 하이브리드들 또는 상기 세포 하이브리드들의 차대를 분류하는 단계 및
(e) 상대적으로 높은 수준으로 상기 마커 단백질을 발현하는 세포 하이브리드들을 선별하는 단계를 포함하고,
이에 의해 상기 군집에서의 다른 세포들과 비교하여 재조합 단백질의 증가된 생산 및/또는 분비를 제공하는 생산자 세포주를 획득하는, 방법.
삭제
제 1 항 또는 제2 항에 있어서,
상기 단계 (a) 에서 제공된 상기 세포들은:
CHO 세포들, 마우스 골수종 NSO 세포들, 마우스 골수종 SP2/0 세포들, 인간 배아 신장 (Human Embryonic Kidney; HEK) 293 세포들 및 베이비 햄스터 신장 (Baby Hamster Kidney-21) 세포들;
이의 오토형 하이브리드들 (autotypic hybrids); 및
CHO 세포들의 하이브리드들 중 적어도 하나인 세포주를 포함하는, 방법.
제 1 항 또는 제2 항에 있어서,
상기 세포 하이브리드들은 단일 세포주로부터 형성되는, 방법.
제 1 항 또는 제2 항에 있어서,
상기 세포 하이브리드들은 CHO 세포들로부터 형성되는, 방법.
제 1 항 또는 제2 항에 있어서,
상기 세포 하이브리드들은 HEK 293 세포들로부터 형성되는, 방법.
제2 항에 있어서,
상기 마커 단백질은 융합 단백질이며, 상기 융합 단백질은 소포체에 의해 처리되는 펩타이드와 융합된 광학 신호를 생성하는 형광성 펩타이드 (fluorescent peptide) 또는 생물발광성 펩타이드 (bioluminescent peptide) 를 함유하는 것인,
방법.
제1 항에 있어서,
상기 단계 (c) 는 소포체를 염색하는 바이탈 염료 (vital dye) 로 상기 군집 내의 세포들을 인큐베이션하는 단계 (incubating), 및 세포 각각과 관련된 상기 바이탈 염료의 양에 따라 상기 세포들을 분류하는 단계를 포함하는, 방법.
제1 항의 방법에 있어서,
상기 단계 (c) 는 상기 군집 내의 다른 세포들과 비교하여, 세포 각각에 의해 생성된 특정 마커 단백질 또는 글리코실화 패턴 (glycosylation pattern) 의 수준에 따라 상기 세포들을 분류하는 단계를 포함하는, 방법.
삭제
삭제
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
세포 표면 리간드에 특이적인 항체와 상기 세포 하이브리드들을 바인딩하는 (binding) 단계, 및 항체로 라벨링된 세포 하이브리드들을 선별하여 상기 리간드를 발현하는 세포 하이브리드들에 대해 풍부해진 아군집 (subpopulation) 을 획득하는 단계를 포함하는, 방법.
제 1항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 세포들은 향상된 증식을 위해 추가로 선별되는, 방법.
제1 항의 방법에 있어서,
형질주입된 세포 군집 (transfected cell population) 을 획득하기 위해 상기 세포 군집으로부터 세포들을 이식 유전자로 형질주입시키는 단계, 및 상기 형질주입된 세포 군집의 다른 세포들에 비해, 상기 이식 유전자의 높은 수준의 단백질 생성물을 생성하는 상기 형질주입된 세포 군집으로부터 형질주입된 세포들을 선별하는 단계를 더 포함하는, 방법.
제 15 항에 있어서,
상기 형질주입은 상기 단계 (b) 전에 또는 상기 단계 (c) 후에 수행되는, 방법.
제2 항 또는 제 15 항에 있어서,
상기 생산자 세포주는
원하는 특이성을 갖는 항체를 생성하기 위해 결합하는 항체 중쇄 및 항체 경쇄 모두;
단쇄 항체; 또는 치료 효소, 호르몬, 성장 인자 또는 혈액의 자연 발생 성분인 단백질 중 어느 하나를 발현하도록 형질주입된, 방법.
제2 항 또는 제15 항에 있어서,
상기 생산자 세포주는 재조합적으로 삽입된 유전자들 중 하나 또는 조합으로부터 배양액 1 리터당 적어도 8 그램의 단백질을 발현하는, 방법.
삭제
제1 항, 제2 항 및 제15 항 중 어느 한 항에 따라 획득된 생산자 세포주.
군집 내의 세포들 중에서 상대적으로 고 밀도의 세포당 소포체를 가짐으로써, 단백질의 고 수준 생산 생산자 세포주에 있어서,
상기 생산자 세포주는,
(a) 출발 세포주로부터 배양된 세포들의 군집을 제공하는 단계로서, 상기 세포들은 이식 유전자로부터 단백질을 발현하는 능력이 이종적인, 상기 제공하는 단계;
(b) 복수의 세포 하이브리드들을 형성하는 단계로서, 상기 복수의 세포 하이브리드들 각각은 상기 군집으로부터의 상기 세포들 중 2 개 이상을 포함하는, 상기 복수의 세포 하이브리드들을 형성하는 단계;
(c) 세포당 소포체의 밀도에 따라 상기 복수의 세포 하이브리드들을 분류하는 단계;
(d) 상기 출발 세포주와 비교하여 상대적으로 고 밀도의 세포당 소포체를 갖는 세포 하이브리드들을 선별하는 단계; 및
(e) 상기 단계 (c) 에서 선별된 상기 세포들을 배양함으로써 상기 생산자 세포주를 확립하는 단계의 프로세스에 의해 상기 출발 세포주로부터 조제된, 생산자 세포주.
삭제
제 21 항에 있어서,
상기 출발 세포주는 CHO 세포들, 마우스 골수종 NSO 세포들, 마우스 골수종 SP2/0 세포들, 인간 배아 신장 293 (HEK 293) 세포들 및 베이비 햄스터 신장 (BHK-21) 세포들;
이의 오토형 하이브리드들; 및
CHO 세포들의 하이브리드들 중 적어도 하나인, 생산자 세포주.
제21 항에 있어서,
상업적 생산을 위한 관심 표적 단백질을 인코딩하는 이식 유전자를 함유하는, 생산자 세포주.
제24 항에 있어서,
상기 세포들은 이수성 (aneuploid) 이거나;
상기 세포들은 배양액 1 리터당 적어도 8 g의 표적 단백질을 생산하거나;
상기 세포들은 50 내지 200 pg/세포/일의 상기 표적 단백질을 생산하거나;
상기 세포들은 상기 출발 세포주의 세포들과 비교하여, 2 내지 10 배보다 많은 세포당 소포체를 함유하거나; 또는
상기 세포들은 상기 출발 세포주의 세포들과 비교하여, 2 내지 10 배보다 많은 세포당 표적 단백질을 생성하는, 생산자 세포주.
제24 항에 있어서,
상기 세포들은 배양액 1 리터당 10 g 내지 20 g의 표적 단백질을 생산하거나;
상기 세포들은 적어도 65 pg/세포/일의 표적 단백질을 생산하거나;
상기 세포들은 상기 출발 세포주의 세포들과 비교하여 적어도 4 배보다 많은 세포당 소포체를 함유하거나; 또는
상기 세포들은 상기 출발 세포주의 세포들과 비교하여 적어도 4 배보다 많은 세포당 표적 단백질을 생산하는, 생산자 세포주.
2 개 이상의 부모 세포주들의 게놈의 일부 또는 전부, 임의의 상기 부모 세포주들에 비해 보다 높은 농도의 소포체 및 재조합적으로 삽입된 유전자들 중 하나 또는 조합으로부터 배양액 1 리터당 적어도 8 g의 단백질을 생성하는 능력을 포함하는, 하이브리드 세포주.
의약품을 생산하는 방법에 있어서,
제24 항 내지 제27 항 중 어느 한 항에 따른 표적 단백질을 인코딩하는 재조합적으로 삽입된 이식 유전자를 함유하는 생산자 세포주 또는 하이브리드 세포주를 획득하는 단계;
상기 표적 단백질이 상기 이식 유전자로부터 발현되는 조건하에서 상기 생산자 세포주로부터 유래되는 세포들을 배양하는 단계;
상기 세포 배양으로부터 상기 표적 단백질을 정제하는 단계; 및
인간 투여용 제품으로서 상기 의약품을 생산하도록 상기 정제된 단백질을 배합하는 단계 (compounding) 를 포함하는, 방법.
제 28 항에 있어서,
상기 의약품은 항체 사슬, 치료 효소, 호르몬, 성장 인자 및 혈액의 자연 발생 성분으로부터 선별된 표적 단백질을 함유하는, 방법.
제 28 항의 방법에 따라 획득된 의약품.
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