JPH01501363A - 真核細胞発現系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 真核細胞発現系 発明の背景 本発明は真核細胞からの異種タンパク質の発現および分泌における改良に関する 。

分泌されたタンパク質の運命を決定する情報はその一次構造に含まれており、こ の情報の多くは適切な翻訳後修飾および正確なコンホメーションを指令すること に関係している。哺乳動物細胞における膜結合／分泌タンパク質のプロセッシン グおよび輸送のエキソサイト−シス通路の諸段階はすでに開示されている（再検 討のために、Ｆａｒｑｕｈａｒ＋　Ａ％ｓ、Ｒｅｖ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、＋　 １９８５　；Ｋｏｒｎｆｇｌｄ　＆　Ｋｏｒｎｆａｌｄ＋　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、 　Ｂｉｏｅｈｇｍ、　＋１９８５を参照されたい）。多数の研究により、細胞表 面へ行（よう運命づげられたタンパク質は、初めにその形成期ペプチド鎖のアミ ン末端またはその近傍にあるシグナル配列によって仲介された小胞体（＃％ｄｏ ｐｌαＢｍｉｃデａｔｉａｓｌｓｔ淋；　ＥＲと略す）の腔へ翻訳と同時に移行 することが知られているＣＥｌｏｂａｌ　＆　Ｄｏｂｂｇｒａｔａｉｎｔ　／。

Ｃａ１ｌ　Ｅｉｏｌ、　、１９７５　；Ｆａｌｔｅｒら、Ｃｅ１１．１９８４を 参照）。小胞体の内部でシグナル配列は通常除去され、高マンノース含量のオリ ゴｍコア単位が配列：Ａａｎ−Ｘ−５ｓデ／Ｔｈデ　（ここでＸは恐らくプロリ ンを除くいずれかのアミノ酸である）中のアスパラギン残基に移動する。

このＮ結合コアグリコジル化は翻訳と同時に起こり、グリコジル化効率はペプチ ド鎖が小胞体へ入るときのその適当なコンホメーションの提示に依存すると思わ れる。

タンパク質が折りたたまれた後では、潜在的Ｎ結合グリコジル化部位はもはや利 用することができないＣＫｏｒｎｆｅＬｄ　＆　Ｋｏｒｓｆａｌｄ　）。

タンパク質は小胞体からゴルジ装置へ移動し、そこで高マンノース含量オリゴ糖 鎖の硫酸化およびプロセッシングが起こって複雑な形体となり、その後タンパク 質はそれらの然るべき目的地へ導かれるＣＤ５ｑり五ν４　Ｒｏｔｈ−ｍａｓ、 Ｃａ１ｌ、１９８５）。ＥＲからゴルジ装置への移動は、細胞内輸送の律速段階 であると確認された（　Ｌｏｄｉａｈ　ら、　Ｎａｔｓｒａ　＊　１　９８３　 、＋　Ｆｉｔｔｉｎｇ　＆　Ｋａｂａｔ＋ＪＢＣ，１９８２、およびＪ、Ｃａ１ ｌ　Ｅｉｏｌ、、　１９８５）。

ＥＲに残存する少数のタンパク質は、その区画を通過する分泌タンパク質とそれ らとの相互作用について十分に研究されている。

熱ショックのような環境ストレスは、原核および真核細胞内での一群の高度に保 存された熱シヨツクタンパク質の合成を誘導するＣ３ｅｈｌａａｉ＊ｇａｒ＋　 ７．　Ｃａ１ｒ　Ｂｉｏｌ、＋１９８６）。ｋａｐ７０は誘導されたこれらのタ ンパク質のうちで最も豊富である。ｈａｐ’ＩＯと関連したタンパク質はストレ スを受けない哺乳動物細胞に見られる。哺乳動物ｈａｐ７０ミル７０様タンパク 主群して次の３種類：ｈａｐ７０、Ａａｃ７０およびＧＲＰ’１Ｂが含まれるＣ Ｐａ１ｈａｔｌＬ＋　Ｃａ１ｌｓ　１９８６　）ｏ熱ショック後、ｈａｐ７０の 合成が誘導され、そしてこのタンパク質は核へ移動して、核内の小体（仁）とし っかりと結合する。ｈａｐ　７０はｉ％ν１ｔｒｏにおいてＡＴＰの添加により この結合から解離される。ｈｓｐ７０はＡＴｐ依存性機構によって熱損傷タンパ ク質を分解して、熱シ冒ツクからの回復を促進すると仮定されたＣＬｇｗｉａ　 ＆　Ｐ＃ｌｈａｍ、ＥＭＢＯＪ。

１９８５）。ｈａｃ　７０は生長しつつある細胞中に高い基底レベルで存在し、 はんのわずかに熱誘導が可能であるＣＰ＃１ｈａｔｎ＊Ｃａ１ｌ＊　１９８６　 ）、　ｈａｔ　７０は最近、ＡＴＰ依存反応において被覆小胞からクラスリン・ トリスケリオンＣｃｌａｔｈｒｉｎ　ｔｒｉａｋａｌｉｏ＊）を放出する構成的 に発現された酵素“アンコーティングＡＴｐアーゼ（５ｎｃｏａｔｉ＊ｇ　ＡＴ Ｐ　ａｓｓ　）″として同定されたＣＣｈαｐ−ｐａｉｌら、Ｃａ１１．１９８ ６：Ｕ％ｇｇｗｉｃｋｅｌ　ｌ　＊　ＥＭＢＯ／、１９８５）。

ＧＲＰ７Ｂは初めにヒヨコの線維芽細胞においてグルコース飢餓により合成が誘 導される２種類のタンパク質のうちの１種であると報告された（　５ｋｉｓら、 ＰＮＡＳ、１９７７）。その合成はまたツニカマイシンＪグルコサミンまたは２ −デオキシグルコースのようなＮ結合グリコジル化阻害剤によっても誘導される （　０１４ｇ％ら、ＰＮＡＳ　＊　１　９７９　；　Ｐｏｓｙａｓａｇｓｒ　ら 、　ＣｅＬｌ、１９７７＞。

ＧＲＰ７ｇは熱誘導されず、その基底レベルは分泌細胞において高い。ＧＲＰ７ Ｂ遺伝子の転写活性化に関するいくつかの研究が報告されているＣＬｉ％ら、Ｍ ｏ１．ＣｇｌｌＥｉｏｌ　、　＋　１９８６　；　Ｒｅ５ａ九ｄｅｇら、ＪＩｏ ｌ、Ｃａ１ｌ　Ｂｉｏｌ、＋１９８５　；　Ｃｈａｎｇら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ 、Ａｃａｄ、Ｓｅｔ、１１９８７）。近年、ＧＲｐ７８は免疫グロブリン重鎖結 合ｐ７パク質ＣＢｉＰ）と同じでないにしても類似していることが分かった（Ａ ｉｗｎｒｏおよびＰｇｌｈａｍ＋　Ｃａ１ｌ　＋１９８６）。従って、ＧＲＰ７ Ｂは以後Ｂｉｐ／ＧＲｐ７８または単にＢ　ｉ　Ｐと呼ぶことにする。ＢｉＰは 初めに前Ｂ細胞（ｐｒｅ　−Ｂ　ｃａｌｌ）内での免疫グロブリン重鎖との結合 について開示された（Ｈαα８およびＷａ　ｂ　ｌ　ｇ　＋Ｎａｔｔｔｒａ、　 １９８３　）。ＢｉＰは分泌ハイブリドーマの小胞体内で免疫グロブリン重鎖と 一時的に複合体を形成する。

軽鎖との組立てが起こるとき、Ｅ　ｉ　Ｐはその複合体から解離する。軽鎖の不 在下では、Ｂ　ｉ　Ｐは重鎮と結合したままであり、そしてこの複合体は小胞体 からゴルジ装置へ輸送されないＣＢｏｌｅら、Ｊ、　Ｃａ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　、 　１９８６　）。

これらの細胞下分画の研究は、ＢｔＰが主として小胞体に局在化されることを示 した。重鎮−Ｂ　ｉ　ｐ複合体はＡＴＰの存在下で解離され、このことは熱ショ ックを受けた核小体におけるｈｓｐ７０複合体と機能的に類似〔ていることを示 唆する。ＣＭｓｎｒｏ　＆　Ｉｌｌｈａｍ、　Ｃａ１ｌ　、　１９８６　）。

我々は、Ｂ　ｉ　Ｐ／　Ｇ　ＲＰ　７８が分泌細胞において小胞体内のグリコジ ル化の不十分なタンパク質または不適当に折りたたまれたタンパク質と結合し、 そして核内のｈｏｐ　７０の仮定された役割に類似してそれらを取り除くのに役 立つと考えるＣＰａ１約扁、Ｃｍ！ｊ、１９８６）。このような機能は、Ｎ結合 グリコジル化を破壊する条件下でＧＲＰ７８の合成レベルが増加することと一致 する。

ＥＲから移動できない異常タンパク質に関する最近の研究は、ＧＲＰ７８とＥ　 ｉ　ｐとの同一性が論じられたけれども、ＢｉｐがＥＲ内でそれらの異常タンパ ク質と結合するように解釈されＣＧａｔｈｉｎｇら、ＣｓＪ！、１９８６；Ｓｈ ａｒｍａら、ＥＭＢＯＪ、１９８５）、そしてこのような結合の程度は特に明ら かにされなかった。Ｂ、ｉＰ／ＧＲＰ７８はまた部分的に組立てられたタンパク 質と結合し、そして免疫グロブリン重鎖のプロセッシングの場合ノヨうに、組立 ておよびプロセッシングが完了するまでそれら−１（ＥＲ内にとどめておくＣＥ ｏｌ−ら、Ｊ、Ｃａ１ｌ　Ｅｉｏｌｘ１９８６）。

上記のＢｉＰに関する研究とは独立して、我々は遺伝子工学的に操作された宿主 細胞による糖タンパク質（第１１因子を含む）の生産についての十分な研究を行 った。この研究の過程で、我々は驚いたことに、有意な割合の第ぶ）並びにｉｎ 　ｖｉｔｒｏ　（例えばＣＨＯ細胞内）で産生されたｔＰＡ類似体が培地中に分 泌されないことを見出した。我々は今や驚いたことに、第■因子および他のタン パク質の分泌レベルがＢ　ｉ　Ｐの細胞内レベルを上げることによって減少し、 そしてＢｉＰの細胞内レベルを下げることによって増加することを見出した。

本発明は、ＧＲＰ７８タンパク質ＣＢｉＰ）をコードするｍ　ＲＮＡに相補的な ｍ　ＲＡ’　Ａの転写を導くことができるアンチセンス（ｃＬ１％ｔｉ−ｓｅｎ ｓｅ　）発現ベクターを提供する。こうして、アンチセンス発現ベクターは真核 宿主細胞の内因性ＧＲＰ７８／ＥｉＰ　コード化惧ＲＮＡの一部または全部とハ イブリダイズし得る１アンチセンス”ｍ　ＲＡ’　Ａの転写を支配し、それによ ってＧＲＰ７８／Ｂ１Ｐｍ　ＲＡ’　Ａの翻訳レベル、ひいては本発明のアンチ センス発現ベクターで形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞中の Ｂｉｂ／ＧＲｐ７ｆ３タンパク質のレベルを抑制または減少させる（好ましくは 、有意に減少させる）。アンチセンス発現ベクターは、アンチセンスｍ　ＲＮＡ の転写を可能にする発現調節配列に対して逆方向に連結されたＧＲＰ７８タンパ ク質の一部または全部ｔコードするＤＮＡ配列もしくはその発現調節配列乞含む 。発現調節配列はプロモーター、場合によりそのプロモーターが応答しうるエン ハンサ−１およびその他の任意の遺伝要素から成り、これらは全て当分野でよく 知らレテイル。アンチセンス発現ベクター中のアンチセンスｔｐｈ　ＲＮＡおよ び対応するＤＮＡは、アンチセンスｍＲＡ’ＡカＧ　ＲＰ　７８　／Ｂ　ｉ　Ｐ 　ｍ　ＲＮ　、４の翻訳レベルを抑制または減少させる（好ましくは、有意に減 少させる）に足る宿主細胞のＧＲＰ７８／Ｂ１ＰｍＲＮＡ　の部分とハイブリダ イズする限り、（１）全長である必要はない、すなわち宿主細胞のＢｉＰコード 化ｍ　ＲＮＡまたはＤＮＡよりも少数の塩基または塩基対を含む、モして／また （１１）突然変異を誘発されるか、さもなければ、自然界に存在する塩基に代わ って多数の置換塩基または塩基対を含むことができる。翻訳の抑制または減少は 以後で説明する方法により有利に測定できる。アンチセンス発現ベクターはサラ ニ慣用方法による遺伝子コピー数の増幅を可能にする１つ以上の増幅マーカー、 １つ以上の選択マーカー、および発現ベクターにおいて有用であることが以前に よく知られたその他の要素を含むことができ、これらは以後でより詳しく説明す る。

本明細書中でより詳しく説明される適当なアンチセンス発現ベクターは、当分野 でよく知られた技術により合成される。細菌レプリコン、選択遺伝子、増幅マー カー、エンハンサ−、プロモーターなどのベクターの構成成分は天然源から得ら れるか、あるいは既知方法により合成できる。Ｋａｓ／ｗａｓら、１９８２、Ｊ 　、　Ｎｏ　ｌ　、　Ｂｓ　ｏ　ｌ　−ｅい。ＢｉＰアンチセンスｍ　ＲＡ’　 ＡをコードするＤＮＡ配列は以後で記載するようにして得られるか、または合成 される。

本発明はさらに第■因子ｚＬ−ＰＡｓフオン・ビルプラント因子ＣＶＷＦ＞；エ リトロポエチン；ＧＭ−Ｃ５Ｆ。

他のＣ５Ｆ類、１１−２．１１−３のようなリンフ才力イン；など、またはそれ らの類似体のような異種夕／パり質を発現するための改良された真核宿主細胞を 包含する。第■因子類似体は、例えば、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ８７１０１２９９ およびＰＣＴ／ＵＳ　８７１０００３３および米国特許出願第０６８８６５号（ １９８７年７月２日付）に記載されており、これらの技術内容は参照によりここ に引用される。ｔ−ＦＡ類似体は、例えば、米国特許出願第８６１６９９号、同 第８５３７８１号、同第８２５１０４号および同第８８２０５１号、並びにＰＣ Ｔ／ＵＳ　８７１００２５７に記載されており、これらの技術内容は参照により ここに引用される。本発明の改良された宿主細胞は、本発明のアンチセンス発現 ベクターで形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞もしくはその子 孫から成る。改良された宿主細胞は細菌、酵母、真菌、植物、昆虫または哺乳動 物の細胞もしくは細胞株であり得、好ましくは１乳動物細胞または細胞株である 。

樹立された細胞株（形質転換された細胞株を含む）は宿主として適している。通 常の二倍体細胞、ｉｎνｉｔｒ。

−次組織培養から誘導された細胞株、および−次外植片（造血幹細胞のような比 較的未分化な細胞を含む）もまた適している。候補細胞は、選択遺伝子が優勢に 作用する限り、選択遺伝子を欠損している必要はない。

宿主細胞は好ましくは樹立された咽乳動物細胞株であるだろう。染色体ＤＮＡへ のベクターＤＮＡの安定した組込みのために、および組込まれたベクターＤＮＡ のその後の増幅のために（両方とも慣用方法による）、目下のところＣＨＯＣチ ャイニーズ・ハムスター卵巣）細胞が好適である。これとは別に、ベクターＤＮ Ａはクシパピローマウィルスゲノムの全部首たは一部乞含むことができ（Ｌｕｓ ｋｙら、１９８４、Ｃｇ１１３６二３９１−４０１）、そして安定したエピソー ム因子としてＣ１２７マウス細胞のような細胞株に取り込まれる。その他の使用 可能な鴫乳動物細胞株にはＨａＬα、ｃｏｓ−１サル細胞、Ｂｃｎｕｅａ細胞の ような黒色腫細胞株、マウスＬ−９２９細胞、５ｗ１ｓｓ、Ｅａｌｂ−ｃまたは Ｎ　Ｉ　Ｂ　？ウス由来の３７３株、ＥＨＫまたはＥＡＩＣハムスター細胞株な どが含まれる。

改良された宿生細胞またはその子孫は、目的とするタンパク質の発現を導（こと ができる１つ以上の発現ベクターでさらに形質転換またはトランスフェクション される。これは、本発明のアンチセンスベクターによる宿主細胞の形質転換また はトランスフェクションの前あるいは後に、目的タンパク質をコードする発現ベ クターで宿主細胞またはその子孫を形質転換もしくはトランスフェクションする ことにより、直接的に達成される。別法として、これは、アンチセンスベクター で形質転換またはトランスフェクションした細胞あるいはそれらの子孫と、目的 タンパク質をコードするベクターで形質転換またはトランスフェクションした細 胞と、の融合によって、に適したベクターは当分野で知られており、広く入手可 能であるか、あるいは常法に従って合成することができる。例えば、次のタンパ ク質をコードするＤＮＡを含むベクターはメリーランド州ロックビルのアメリカ ン・タイプ・カルチャー・コレクションＣＡＴＣＣ）に寄託されている：第■因 子ＣｐＳＰ６４−■、ＡＴＣＣ３９８１２）；′　５８１個のアミノ酸を欠失し ている第■因子類似体”ＬＡ”ＣｐＤにＲ−２，ＡＴＣＣ５３１００）；　ｔ− ＦＡおよびその類似体（例えば、１９８７年８月１３日発行の国際特許出願ＷＯ ８７１０４７２２を参照）；Ａ７’Ｑ（）Ｒｆｌ−４，ＡＴＣＣ３９９４０；ｐ ｄＥＰＶＭＭＴｎａ。

３４２−１２ＣＢＰＶ型ベクター）、ＡＴＣＣ３７２２４）；およびＧＭ−Ｃ５ ＦＣｐＣ５Ｆ−１，ＡＴＣＣ３９７５４）。

こうして、異穐タンパク質（例えば第■因子など）を生産するための改良方法が 提供される。この方法は、異種タンパク質の発現を導くことができるベクターで 形質転換された真核宿主細胞またはその子孫であって、さらに（ａ１本発明のア ンチセンスＧＲＰ７８／ＥｉＰベクター：（６）下記の異種ＤＮＡ配列と実質的 に同じＤＮＡ配列、または一般にＥｉＰ発現を誘導する条件下でＥ　ｉ　Ｐ　誘 導を減少もしくは抑制することのできる下記ＤＮＡ配列の一部：（単純化するた めに、一本のコード鎖のみを示す）、あるいはそれらに少なくとも約７０％相同 なりＮＡ配列を含み、好ましくは多コピー数に増幅しうるベクター：もしくは（ ｃ）ベクター（α）および（６）の両方：で形質転換またはトランスフェクショ ンされた上記の宿主細胞またはその子孫を培養することから成っている。

ベクター（ｂｌ中のＤＮＡ挿入物は、恐ら＜ＢｉＰ誘導条件に応答して宿主細胞 によってもたらされる内因性のトランス作用性転写調節因子と結合することによ る、ＧＲＰ７８遺伝子の転写の誘導に必要とされる調節要素を含むと考えられる 。その因子は通常内因性ＢｉＰ遺伝子に連結された内因性転写調節要素と結合し 、それによってＢｉＰ誘導条件下でＢ１ＰｍＲＮＡレベルを増加させると考えら れる。ベクター（ｂ）（好ましくは、多コピー数へ増幅されるもの）の存在は、 転写開始因子との結合に対して内因性転写調節配列と競合し、その結果Ｂｉｐ誘 導経路を遮断すると考えられる。

この方法は、低下したレベルのＢｉＰ’ｌ含む真核（好ましくは哺乳動物）宿主 細胞を用いて、高レベルでの異種タンパク質の生産を可能にする。本明細薔中で 用いる“低下したレベルのＢ　ｉ　Ｐ″なる表現は、グルコース飢餓、第■因子 過剰発現、ツニカマイシンまたは、４２３１８７による処理などのＢｉｐ誘導条 件下におけるＣＥＯ細胞中のＢｉＰレベルよりも低い、好ましくは少なくとも２ ０％低い、より好ましくは少なくとも５０％低い、より一層好ましくは少なくと も７５％低いＢｉＰレベルを意味する。

ＢｉＰレベルはＢｉＰまたはＢ　ｉ　Ｐ−異種タンパク質複合体に対する抗体を 用いる免疫検定のような標準方法により都合よ（測定できる。別法として、Ｂ　 ｔ　ｐレベルはノザンまたはサザンプロツテイングのような標準方法を用いて、 Ｂ　ｉ　ｐ　ｆコードするＲＮＡの内在レベルを測定することにより間接的に測 定しうる。

この方法は、（α）の場合には、宿主細胞の内因性ＢｉＰコード化ｍＲＮＡの翻 訳レベルの低下によってＢｉＰのＥＲレベルが低下するために；（ｂ）の場合に は、宿主細胞の内因性ＢｉＰ遺伝子の誘導レベルが低下するために；そして（ｃ ｌの場合には、ＢｉＰの誘導および翻訳レベルが低下するために、さもなげれば ＥＲ内で強固に結合される異種タンパク質を回収可能な高収量で生産できると考 えられる。当分野で習熟した者が考えつくような、内因性ＢｉＰレベルを低下さ せる他の方法は、ここに記載した特定方法よりも多かれ少なかれ効果的であるこ とが期待され、それ故に均等方法と見なされるべきである。

本発明の実施に際して、上記改良方法で使用するために作られた安定した形質転 換体またはそれらの子孫は、標準免役検定または酵素検定により、ＥｔＰの低下 した発現および／または異種タンパク質の発現についてスクリーニングされる。

アンチセンス、ｎＲＮＡ、または異種り／バク質？コードするｍ　ＲＡ’　Ａお よび／ｉたは異種タンパク質をコードするＤＮＡ、もしくは上記ベクター（ｃＬ ）および／または（ｂ）中のＤＮＡ配列、の存在はそれぞれノザンまたはサザン プロツテイングのような標準方法により検出できる。ＣＯ５−１サル細胞へのベ クターの導入後数日間にわたるアンチセンスベクターおよび／または異種タンパ ク質をコードするＤＮＡの一時的発現は、培地中のタンパク質の活性または免疫 検定により測定される。

異種タンパク質をコードするＤＮＡの発現後、その生産されたタンパク質は既知 方法によって分離・精製され、かつ／また同定される。

本発明はまた発現調節配列に連結されたＧＲＰ７８／Ｂ　ｉ　ｐをコードするＤ ＮＡ配列を含む１センス”ＧＲＰ７８／Ｅ　ｉ　Ｐ発現ベクターを包含する。− 例としてのＧＲＰ７８／ＥｉＰ発現ベクターの構築を以下に詳しく説明するが、 他のＢｉＰ発現ベクターも、以後に述べる本発明ベクターの他の例と同様に、Ｇ ＲＰ８７７ＢｉＰ　コードイψＮＡ配列および容易に入手しうるか又は合成でき る成分を用いることにより、慣用方法で簡単に炸裂できることを理解すべきであ る。

本発明はまたＧ　ＲＰ　８７　／Ｅ　ｉ　Ｐ発現ベクターで形質転換またはトラ ンスフェクションされた上記のような真核宿主細胞を包含する。この種の遺伝子 操作された宿主細胞またはその子孫は、上記のような異種タンパク質の転写を導 （ことができる発現ベクターでさらに形質転換される。得られた細胞またはその 子孫はその後異種タンパク質を生産するための改良方法において培養され、その 際不適切にグリコジル化されたり又は折りたたされた異種タンパク質は培地中に 分泌されず、その代わり細胞内Ｅ　ｉ　Ｐと結合することによって宿主細胞内に 保持される。

我々は、安定したチャイニーズ・ハムスター卵巣＜ＣＥＯ）細胞株のような真核 宿主細胞において、ヒト第■因子（ハ１）およびその類似体、ヒト組織プラスミ ノーゲン活性化因子ＣｔＰＡ）およびその類似体、並びにヒトフオン・ビルプラ ント因子（τＷＦ）を含めたいろいろなタンパク質のプロセッシングおよび分泌 におけるＢｉｂ／ＧＲＰ７Ｂの役割を調べた。Ｆｌｌは約２５０Ｋｄの一本鎖前 駆体として合成され、その後約２００Ｋｄの“重鎖”と約８０Ｋｄの”軽鎖”ダ ブレットにプロセッシングされる。Ｆ■は多数の潜在的Ｎ結合グリコジル化部位 を有する。２５個のグリコジル化部位のうち２０個がＢドメインとして画定され たその分子の部分の−の中央部分に存在する（Ｔｏｏ！−ら、Ｎａｔｓｒａ　＋ 　１９８４　）。Ｆｌｌの”ＬＡ″変異聾ヲもたらすこのドメインの欠失は、比 較的高いレベルでＦｔｉｖ分泌させるＣＴｏｏｌａら、ＰＮＡＳ。

１９８６）。ｔｐＡは分子量が約６８０００Ｋｄであり、４つの潜在的Ｎ結合グ リコジル化部位を含み、そのうち３つが一般にグリコジル化されるＣＰｏｈｌら 、Ｅｉｏｅｈａ慣。

１９８４）。ｖＦＦは小胞体内で二量体を形成する約２６０．０００Ｋｄの前駆 体として合成される大きな糖タンパク質であり、その後ゴルジ体およびゴルジ体 以降の区画において約１００．０００Ｋｄと２２０，０００Ｋｄの形体にプロセ ッシングされる＜Ｂｏ九ｔｈｒｏｎら、Ｎａｔｓｒｍ＊１９８６）。プロセッシ ングを受けたこれらの形体は二量体間ジスルフィド結合により高分子量マルチマ ーを形成するＣＷａｇｎｇｒ　＆　Ｍａｒｄｉｒ＋　Ｊ、　Ｃａ１ｌ　Ｂｔｏｌ 、　＋　１９８４　）。

我々の結果は、タンパク質上のＮ結合グリコジル化部位の占有がＥｉＰ結合度に おいである役割を演じていることを示す。タンパク質のグリコジル化が不十分で あると、ＢｉＰ結合および細胞内部への残留が起こる。分泌に対するこのブロッ クは発現レベルに依存しうる。我々は、ＢｉＰ／ＧＲＰ７８が分泌される糖タン パク質のプロセッシングおよび輸送において主要な役割を演じていると考分泌経 路でのＢｔＰ／ＧＲＰ７８の役割を定性的に評価するために、我々はパルス・チ ェイス実験Ｃｐｓｌｓｇ　ａ％ｄｃｈａｓｍ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　）Ｋよっ ているいろなＣＥＯ細胞株を試験した。Ｆ■とＢｉＰとの結合の時間経過は、Ｂ 　ｉ　Ｐに特異的なモノクローナル抗体との免疫沈降により検出されたＦ■の量 と、Ｆｌｌｌに特異的なモノクローナル抗体により沈降したＦ■の量とを、比較 することにより分析した。ｓｓ５メチオニンによる１時間のパルス後、抗ＢｉＰ 免疫沈降により示されたＦｌｌｌと抗Ｆ■モノクローナル抗体によって沈降した Ｆｌｌｌとを比較したとき、約８５％の野生型（ｗｔ）ｊ”１ＮがＢ　ｉ　Ｐと の複合体中に検出された。

２５０ＫＤの一本領形のみがＢ　ｉ　Ｐと結合することが分かった。プロセッシ ングを受けた８０ＫＤ形は、この時点で細胞中に存在していたが、抗Ｂ（Ｐモノ クローナル”抗体によって沈降しなかった。ＢｉＰは８０ＫＤダブレツトよりも わずかに速く泳動することが観察された。

４時間のチェイス時点で、プロセッシングを受げた２　００ＫＤの重鎖と８０Ｋ Ｄの軽鎖ダブレットが調整培地中に検出される。その調整培地の免疫沈降はわず かな量のＢｉｂ？：検出した。しかしながら、結合したＦ■は全く観察されなか った。細胞内において、ＢｉＰと結合したＦ■の量は、その分子が細胞を通って 輸送されるにつれて、５０％以下に減少した。２０時間のチェイス時点では、Ｂ ｉｐ結合Ｆ■対非結合Ｆ　Ｓｌの比が変化した。−重鎖Ｆ■は、ゲル電気泳動に より分析したとき２５０ＫＤバンドの流れＣ３ｔｎ−αｒｉｎｇ　）　によって 示されるように、分解し始めた。そして、長時間のチェイス後に細胞内にとどま ったＦ■のほとんど全部はＥ　ｉ　Ｐと複合体を形成していることが判明した。

この時間経過の間中、調整培地中のＢｉＰ量は増加したが、分泌ＦＸｌとの結合 は検出されながらだ。２０時間のチェイス期間？通して、細胞内のＧＲｐ７Ｂの 量が有意に変化しないということに注意を払う価値がある。それは遅い速度で損 傷細胞から分泌または放出され、２０時間以上の半減期をもつ安定した細胞タン パク質であると考えられる。

その後、我々は同様の時間経過でＬＡとＢ　ｉ　Ｐとの結合について調べた。Ｌ ＡはｙｌＦＸｌが２５個の潜在的Ｎ結合グリコジル化部位をもつのに対してたっ た７個だけをもつＦ■の欠失体である。１時間のパルス時点で、約６０％の一本 鎖ＬＡがＢ　ｉ　Ｐと結合する。−重鎖ＬＡは約１５０ｆｄのダブレットである と思われる。ｗ　ｔ　Ｆ　Ｓｌと同様に、８０Ｋｄ形はＢ　ｉ　Ｐと複合体を形 成しないことが観察された。

４時間のチェイス期間中、ＬＡとＢｉＰの結合は初期時点と比べて有意に減少し た。−重鎖、９０ＫＤ付近に不明瞭なバンドとして泳動するプロセッシングされ た重鎖、および８０ＫＤの軽鎖ダブレットは、抗Ｆ■モノクローナル抗体との免 疫沈降により、４時間の調整培地中に検出される。また、培地中には微量の非結 合ＢｉＰも見られる。２０時間のチェイス時点では、少量のＬＡが細胞内に残存 し、ＢｉＰと結合したＬＡの割合はわずかである。

これらの実験は、ＬＡが細胞内でＥ　ｉ　Ｐと一時的に結合し、モしてｗｔＦ■ とは対照的に、Ｂ　ｉ　ｐと複合体を形成した状態で細胞内に保持されないこと を示した。このことは、ＬＡにおける高グリコジル化領域の欠失がｗｔＦ■より も低い程度にＥｉＦと結合するタンパク質をもたらしたので、ｗｔＦ■のグリコ ジル化の複雑性がＢｉＰ結合度に影響を及ぼしうろことを示唆した。これに関し て、ＧＲＰ７８はグルコース飢餓またはツニカマイシン処理のようなＮ結合グリ コジル化に影響を与えろ条件下に置かれたＣＢＯ細胞において高レベルで誘導さ れることに注意すべきである。

ＬＡとＢｉＰの結合に対するツニカマイシンの影響ｗｔＦ■分子の集団が長時間 のチェイス後にＢ　ｔ　Ｐと結合した状態で細胞内に滞まるのに対し、ＬＡは一 時的な結合を示すという観察から、我々はＬＡのグリコジル化の破壊がより多く のＢｔｐとの結合？もたらすかどうかについて調べた。この考えを明らかにする ために、ＬＡ産生細胞をｌＯμｆ／−のツニカマイシンで一晩処理した。この処 理はＮ結合グリコジル化を阻害し、ＧＲＰ７Ｂの合成レベルを増加させると報告 されたＣＭｘｎｒｏおよびＰａｌｈａｍ、　１９８６　）。３１５メチオニンに よる１時間のパルス後、未処理細胞と処理細胞の抽出物を抗Ｆ１Ｎモノクローナ ル抗体または抗ＥｉＰモノクローナル抗体と免疫沈降させた。ツニカマイシンの 不在下では、はんの少量の１５０Ｋｄ−重鎖ＬＡがＢｉＰと結合した。ツニカマ イシンの存在下では、ＬＡダブレットの分子量が減少し、そしてこの非グリコジ ル化ＬＡのほとんど全部が今やＢｉＰと結合した。従って、ＧＲＰ７８のレベル を増加させる条件下でのＬＡのグリコジル化の破壊は、普通にグリコジル化され たＬＡと比べてＢｉＰとの結合を増大させる。

このことは、ＦＸｌの不適当なグリコジル化がＢｉＰとの結合に影響を及ぼしう ろことを示唆した。

抗Ｂ４Ｆモノクローナル抗体との免疫沈降によってＢｉＰと同定されたタンパク 質と共泳動する、ツニカマイシン処理により誘導されたタンパク質の検出は特に 興味がもたれる。ＢｉＰの分子量はツニカマイシン処理後に変化せず、このこと はそれが通常Ｎ結合グリコジル化されていないことを示す。

ＣＥＯ細胞はいくつかの面でその分泌経路を欠き、そうして複雑な糖タンパク質 を適切にプロセッシングできないということが起こり得た。これを検討するため に、我々はパルス−チェイス実験で安定なＣＨＯ細胞株におけるｖＦＦのプロセ ッシングを調べた。νＷＦの前駆体はその分子に沿って広がった１７個のＮ結合 グリコジル化部位を有する。１時間のパルス時点で、２６０ＫＤのｖＦＦ前駆体 タンパク質はＣＥＯａ胞の内部に観察される。このタンパク質の約１０％がＢｉ Ｐと結合した状態で存在する。４時間のチェイス時点で、２６０ＫＤ前駆体の約 ９０％が細胞抽出物から消失し、調整培地が２７５ＫＤと２２０ＫＤのプロセッ シングされた形体を含むというように、ｖＦＦは効率よ（しかも速やかに分泌さ れる。プロセッシングを受けたこれらの形体は有意な程度に細胞内に観察されず 、このことは２６０ＬＤ前駆体の２７５および２２０ＫＤ形へのプロセッシング がνＷＦ分泌経路の後期に速やかに起こるという観察と一致する。

４時間のチェイス時点と２０時間のチェイス時点の両方において、ｖＦＦの大部 分が細胞から分泌された。４時間の時点で、若干のｖＦＦがＢ　ｉ　ｐとまだ結 合したままであるが、２０時間のチェイス時点では、Ｂ　ｉ　Ｐ　−ｖＷＦ複合 体が観察されるにしてもほんのわずかである。ｖＦＦは複雑な糖タンパク質であ るという事実にもかかわらず、ＢｔＰとの結合は一時点であり、大部分のタンパ ク質はＣｌｌ０細胞から効率よ（分泌される。これはｗｔＦ■の場合と対照的で あり、ＣＢＯ細胞が複雑な糖タンパク質を効率よく分泌する能力を持ち合わせて いることを示す。

タンパク質分泌およびＢｉＰ結合に対するグリコジル化の役割をさらに分析する ために、我々はＣＥＯ細胞におけるグリコジル化形および非グリコジル化形のｔ −ＰＡのプロセッシングを調べた。ｔ−ＰＡは４つの潜在的Ｎ結合グリコジル化 部位を有し、そのうちの３つが利用される。ｔ−ＰＡは３個のグリコジル化部位 のうちの１個の利用可変性ゆえに、ダブレットまたは約６８ＫＤ形として存在す る。ｔ−ＰＡ３％は遺伝子工学的に操作された変異型であり、この変異型では通 常利用される３個のＮ結合グリコジル化部位が正規の認識部位配列中のＡ　ａ　 ｓコドンをＧＪ％コドンへ変えることにより除かれている。

国際出願ｐＣＴ／ＵＳ　８７１０　Ｏ２５７を参照されたい。

グリコジル化された非修飾ｔ−ＰＡＣすなわち、野生型″’ｔ−ｐＡｗｔ”）は 高生産性ＣＥＯ細胞株のｔ−ＰＡｗｔ細胞株により効率よくプロセッシングされ て分泌された。パルス時点でｔ−ｐＡｗｔはＢ　ｉ　Ｐとのわずかな結合を示し た。１時間および３時間のチェイス期間中に、大部分のｔ−ＰＡｗｔは培地に分 泌され、これらの時点でＥ　ｔ　ｐとの結合が細胞内に検出されたとしてもほん のわずかであった。従って、高い細胞内濃度のｇ−ｐＡｗｔは正しくプロセッシ ングされて、Ｅ　ｉ　Ｐとの検出しうる結合なしに分泌された。次に、我々は、 ｔ−ＰＡ３Ｘ中のＮ結合グリコジル化の不在が、ＬＡに関する我々の観察と類似 して、その効率のよい分泌を妨げるかどうかを調べるために、低生産性細胞株の ｔ−ＰＡ３Ｘ−４におけるｔ−ＰＡ３Ｘのプロセッシングを調べた。この非グリ コジル化形のｔ−ＰＡはＢｉＰとの結合をほとんど示さず、効率よ（培地に分泌 された。細胞を通過する時間経過は、ｔ−ｐＡｗｔの場合に観察されたものと似 かよっている。大部分のタンパク質は１時間と３時間のチェイス時点までに細胞 から放出され、このことはｔ−ＰＡ３ｘが分泌経路のブロックに出合わないこと ｔ示している。従って、グリコジル化の不在下でもｔ−ＦＡはＢｉＰとの結合を ほとんど示さない分泌能力をもつ形体のままで存在する。

しかしながら、高生産性ｔ−ＰＡ３Ｘ細胞株のｔ−ＰＡ３Ｘ−１３の実験は、ｔ −ＰＡ３ＸとＢ　ｉ　Ｆ　との結合が発現レベルに依存することを示した。ｔ− ＰＡ３Ｘ−１３はｔ−ＰＡ３Ｘ−４よりも約２００倍高いレベルのｔ−ＰＡ３Ｘ Ｙ生産する。高い発現レベルにおいてｔ−ＦＡ３×は、ｔ−ＰＡ３Ｘ−４細胞株 の場合に観察されたものときわめて対照的に、ＢｉＰとの有意な結合？示す。Ｂ 　ｉ　Ｐと結合したｔ−ＰＡ３ｘの量は、パルス時点と１時間のチェイス時点と の間にわずかに減少する。しかしながら、ＢｉＰと結合した状態で存在するｔ− ｐＡ３Ｘの量は１時間と３時間のチェイス時点の間では同じままである。目立っ たこととして、ＢｉＰと結合したｔ−ＰＡ３ｘの割合は、３時間のチェイス時点 で細胞内に残存するｔ−ＰＡ３Ｘの大部分がＢｉＰと結合した状態にあるという ように、時間の経過を通して増加した。この実験の間中、ｔ−ｐＡ３Ｘは細胞か ら分泌されるが、効率のよい分泌能力をもたず明らかにＢｉＰとの安定した複合 体を形成する分子集団が存在する。

この場合は上記のｗｔハｌの場合に観察されたものを思い出させる。ｔ−ｐＡ３ Ｘの場合には、非グリコジル化タンパク質の分泌効率およびＢｉＰ結合度が発現 レベルによって影響を受けた。

非グリコジル化形のｔ−ＰＡ？：調べる別の方法は、ツニカマイシン処理によっ てＮ結合グリコジル化？妨げることである。免疫螢光分析は、ｔ−ＰＡｗｔ産生 細胞のツニカマイシン処理が小胞体にｔ−ＰＡＹ蓄積させることｔ示した。ｔ− ｐＡｗｔ細胞株を１０μ？／ゴのツニカマイシンで１時間処理すると、非グリコ ジル化ｔ−ＰＡとＢｔｐとの結合がｔ　−ＰＡｗｔ　と比較して有意に増加する 。

ｔ−ＰＡ−ＢｔＰ複合体はチェイス時点に検出され、若干の分泌阻害が認められ る。ｔ−ＰＡ３Ｘ−１３細胞株の同様な処理は、未処理細胞と比較して、Ｂ　ｉ 　Ｐと結合したｔ−ＰＡ３Ｘの量に変化をおこさず、そのタンパク質な分泌させ 、一方細胞内ｔ−ＰＡ　の分画はＢｉＰと結合したままである。ツニカマイシン 処理したｔ−ＦＡ３＜−１３７ｊａｌ胞におけるタンバク質プロセッシングのこ のパターンは、未処理の時間経過に類似していると思われる。このことは、ｔ− ＰＡｗｔ分泌に対するツニカマイシン処理の影響が、ツニカマイシンの間接的作 用によるのではなく、分子それ自体におけるグリコジル化の不在に起因すること を示した。

ツニカマイシンで処理したｔ−ＰＡｗｔのプロフィールは、高発現レベルでのｔ −ｐＡ３Ｘのプロフィールと非常によく似ていると思われる。両方の場合に、同 程度の割合の非グリコジル化分子が明らかに効率のよい分泌能力をもたず、Ｂｔ Ｐと細胞内で結合したままである。比較的低い発現レベルでは、ｔ　−Ｐ　Ａ　 ３８に’！、ＢｉＰとの有意な結合を示さない。低発現レベルでのｔ−ｐＡｗｔ は高生産性細胞株よりもツニカマイシン処理によって影響を受ける度合が少ない 。従って、非グリコジル化ｔ−ＰＡとＢｉＰとの結合はｔ−ＰＡ　の細胞内レベ ルによって左右される。

非グリコジル化ｔ−ＰＡはこれらの実験においてダブレットとして存在する。ｔ −ＦＡはそのアミノ末端に１２〜１５個のアミノ酸から成るプロペプチドをもつ 形で合成される（　Ｐｇｎｘｉｃａら、Ｎａ　ｔ　ｓｒ　＃　Ｉ　１９８３　） 　６恐らく、高分子量バンドは非切断プロｔ−ＰＡ前駆体を表し、そして低分子 量バンドはプロセッシングを受けてアミノ末端プロペプチドを除去された成熟体 を表すのであろう。

フロペプチドの切断はゴルジ体およびゴルジ体以降の区画で起こり、モしてＢｉ Ｐは小胞体に局在化されるので、プロｔ−ＰＡ前駆体のみがＢｉＰと同じ区画に 存在するはずである。この解釈は、ダブレットの高分子量物質のみがＥｉＰと結 合した状態で存在し、低分子量の物質のみが分泌されるという観察に合致してい る。

チャイニーズハムスターＧＲＰ７８ｆ）ｅＤＮＡ　：！　）’配列を発現ベクタ ーｐｍＴ２（ｐ９ｘ０２３ｂの誘導体）に挿入し、この発現ベクター、ＭＴＧＲ Ｐ７ＢをｗｔＦ■（、ＭＴ２〜１）またはＬＡ（ｐＭＴ２ＬＡ）発現ベクターと 共にＣＯＳ細胞に同時トランスフェクションし、それによりＦ■分泌に対するＧ ＲＰ７Ｂ　の過剰発現の結果を調べた。ＦＸｌの一時的発現はＦ■活性について ｉｉ４整培地を検定することにより監視した。ＧＲＰ７８の発現は抗ＥｉＰモノ クローナル抗体との免疫沈降により検出した。、ＭＴ２は以下に詳述するように ９Ｍ７２−νＩＦ（ＡＴＣＣ６７１２２”）から得られる。

ＣＯ５細胞によるＧＲＰ７８とＦ■の同時発現は一貫して、調整培地中の１％１ 活性レベルを６〜ｌＯ倍減少させた（以下の表］）。同一細胞内の２種類の異な る複製ベクターの存在は両ベクターの発現の低下をもたらす。この現象を補償す るために、ＦＸＭまたはＬＡベクターは常ＫｐｃｓＦ−１と同時トランスフェク ションされた。ｐｃｓＦ−１は、ＭＴ２と同様の複製および転写因子を保有する ＧＭ−Ｃ５Ｆの発現ベクターである（Ｆ、、、ら、５ｃｉｅｎｃｅ１９８５）。

Ｃ０５ｌｉｄ胞にＬるＬＡおＬびＧＲＰ７８　ｆ）同時発現は培地中のＬＡ活性 レベルを２〜３倍減少させた。ＬＡおよびｗｔＦ■活性の減少の度合は、ＣＨＯ 細胞内のＦ■およびＬＡとＢｉＰとの結合の度合に一致する。

高度にグリコジル化されたｗｔＦ■は一時的ＣＯ５系においてＬＡよりもＧＲＰ ７８　発現によって強く影響を受け、また安定したＣＨＯ細胞株内でＢ　ｉＰと のより強い結合を示す。このデータは、高レベルのＧＲＰ７ＢがＦ■の分泌を妨 害することを示し、そしてＥｉＰとＧＲＰ７８が機能的および荷造的に類似して いることを示唆する。

どのＧＲＰ７８　ｅＤＮＡを使用するかは選択の問題である。例えば、Ｌｅｇら 、ＪＲＣ，１９８３に記載されるようにして得られるチャイニーズ・ハムスター 　ｃＤＮＡクローン、ｐ３Ｃ５または以下で述べるチャイニーズ・ハムスター　 ｅ　ＤＮＡを用いることができる。これとは別に、ラット６ＤＮＡクローンもＡ ｆｔｓｒｏ　＆　Ｐ＃ｌｈａｍ＊Ｃｇｌ　ｌ　＊１９８６に記載されるようにし て得られる。塩基配列分析はこれらのクローンがともにＧＲ？　７８　と同定さ れた同じタンパク質をコードすることを示した。アミノ酸レベルで、ラットおよ びハムスターのタンパク質は９９．４チ相同である。機能的ＧＲＰ７８　ｃＤＮ Ａのクロー二／グは、発表されたＧＲＰ　７８　の配列から誘導された１つ以上 のオリゴヌクレオチド、およびＬｃ　らまたはＭｕｎｒ。

＆Ｐａ１ｈα惰の上記文献に記載される慣用方法を用いて行われる。また、クロ ーン化したラットｅ　Ｄ　Ａ’　ＡはＭＲＣＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｍｏ １ａｃｓｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｈｉｌｌｓ　Ｒｏａｄ＊Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ 　ＣＥ　２　２　ＱＨ＊　Ｅｎｇｌａｎｄ　）のＩｌｌｈａｍ博士から入手でき る。さらに、所望のＧＲＰ７８をコードするＤＮＡ配列は、例えば重複するオリ ゴヌクレオチド（−緒になって所望の配列を形成する）を使用して、合成するこ とができる。

チャイニーズ・ハムスターＧＲＰ７８　ｅＤＮＡは唾乳動物発現ベクターｐＭ７ ２に挿入した。このベクターは９９１０２３Ｂの誘導体であり、アメリカン・タ イプ・カルチャー・コレクションにＡＴＣＣ６７１２２として寄託された９Ｍ７ ２−１ＷＦのＥｃｏＲＩ　消化により得られる。

ＥｃｏＲＩ消化はｐＭＴ２−ｖＷＦ中に存在するｅ　Ｄ　Ａ’　Ａ挿入物を切除 して線状の、ＭＴ　２　も生成する。これは連結して、大腸菌ＨＢＩＯ１または ＤＨ５をアンピシリン耐性へ形質転換するために使用した。その後、プラスミド ｐＭ７２　ＤＮＡは慣用方法によって調製される。ハムスターＧＲＰ７Ｂ　をコ ードする１９６２ヌクレオチドのオーフン・リーティングｅフレームはＰｓｔｌ およびＥｅＯ１’ｌＶ消化により切り出した。さフタ−はＥｃＯＲＩで消化し、 そのＥｃｏ　ＲＩ末端をＫ　ｌ　ａ％ｏｗ断片を用いて修復し、その後ベクター なＰｓｔｌで消化した。

ハムスタークローンからの７ラグメ／トは上記のように調製したｐＭＴ２　ベク ターに連結した。しかしながら、先に示したように、他の真核発現ベクターも使 用することができる。得られたプラスミド、ＪｉＴＧＲＰ７８はアデノウィルス −ＶＡ遺伝子、ＳＶ４０複製起点（エンハンサ−を含む）、アデノウィルス主要 後期プロモーター（ＮＬＰ）（３分節リーダーを含む）、５′供与スプライス部 位、３′受容スプライス部位、ＧＲＰ７８　の発現のためにＮＬＰに対して適当 な方向のＧＲＰ７８　ＣＤＮＡ挿入物、ＤＨＦＲＣＤＮＡ挿入物、５Ｖ４Ｑ初期 ポリアデニル化部位および、ＢＲ３２２配列を含む。

ｐＭＴＧＲＰ７８はＤＥＡＥデキストラン法（Ｋａｓｂｆｍａ、ｙＰＮＡＳ、１ ９８５）を用いて、Ｆ■発発現ベクター中Ｔ２■またはｐＭＴ２ＬＡ（Ｔｏｏｌ ｅら、ｐＮＡｓ、１９８６）と共にＣＯ５−１細胞に同時トランスフェクション した。トランスフェクションの４８時間後から開始し℃適当な時間に調整培地を 収穫し、Ｔｏｏｌｓら、Ａ’ｏｔｓｒｓ＋１９８４に記載のととくＦ■活性につ いて検定した。これらの実験の結果を表■に要約する。

以前の研究は、２つの異なる発現ベクターの同時トランスフェクションが単一ベ クターのトランス７エクシヨ／に比べて発現レベルを低下させることを示した。

この現象を補償するために、Ｆ■発現ベクターはＧＭ−ＣＳＦら、５ｃｉａｔｔ ｅａ、　１９８５　）と同時トランスフェクションした。ｐＣ５Ｆ−１はアメリ カン・タイプ・カルチャー・コレクションから大腸菌ＭＣ１０６１中にＡＴＣＣ ３９７５４として入手可能である。表■の結果は、１％１またはＬＡとＧＭ−Ｃ ５Ｆの同時発現と比較したとき、ＧＲＰ７ＢとＦ■の同時発現が分泌されたＦ■ の活性レベルを約６〜１０倍低下させ、かつＧＲＰ７８とＬＡの同時発現が約２ 〜３倍低下させることを示した。、ＭＴＬＡおよび、ＭＴＧＲＰ７８、または’ ＪＪＭＴ２ＬＡおよび、ｃｓｐ−１で同時トランスフェクションし、その後パル ス／チェイス３５５メチオニ／標識にかげたｃｏ５．州胞抽出物の分析は、ｐＭ ＴＧＲＰ７Ｂを発現する細胞中のＬＡが１．Ｃ３Ｆ−１で同時トランスフェクシ ョンした細胞において観察されたものよりも、チェイス後にＢｉＰ／ＧＲＰ７Ｂ とより多く結合した状態にあることを示した。これらの結果は、ＧＲＰ７Ｂの過 剰発現がＦＸｌとＧｉ？Ｐ７８の細胞内結合およびＭｉ胞内への複合体の保持に よりＦｌｌの分泌を妨げることを示した。このことは、他の細胞では分泌能力を もつＦ■が高レベルのＧＲＡＳ８を発現する細胞ではその内部に捕捉されるので 、ＧＲＰ７８レベルを低下させればＦＸｌおよび他の分泌タンパク質の分泌が促 進されるであろうことを示唆した。

チャイニーズ・ハムスターＧＲＰ７８　ｅＤＮＡは上記発現ベクターの方向とは 反対の方向で、ＭＴ２　に挿入した。

１９６２ヌクレオチドのオープン・リーディング・フレームは次のようにして切 り出した。ノームスターＧＲＰ７ＢクローンはＥ、、ＲＶで消化し、Ｐ、を夏リ ンカ−を平滑Ａ’　ｅ　ｏ　ＲＶ末端に連結した。その後ＤＮＡ　ｆｔＰｓｔ　 Ｉで切断して１９６２　ｈｐのオープン・リーディング１１フレームを得た。ベ クターｐＭ７２はｐｓｔ■で消化することにより調製した。ノ・ムスター由米リ フラグメンＦをｐＭＴ　２のＰａｔ■部位へ連結した。得られたプラスミド、Ｍ ＴαＢ２は制限消化マツピングにより分析し、このベクターはＧＲＰ７８　ｃＤ ＮＡの３′末端がアデノウィルス主要後期プロモーターに最も近接する方向でＧ ＲＰ７８　ａＤＮＡ配列を含むことが決定された。

この方向において、アデノウィルス主要後期プロモーターから発現される転写物 は、ＧＲＰ７Ｂコード配列の相補配列を含む。このようなＲＮＡは通常アンチセ ンスＲＮＡと呼ばれている。アンチセンスＲＮＡは細胞内でその相補的センスｍ ＲＮＡと相互作用して、コードされたタンパク質の合成を遮断することが報告さ れている（ｆ＜惰およびＦｏｌｄ、Ｃａ１１．１９８５　）。

ｐＭＴ２αＢ２は米国２０８５２メリーランド州ロツクビル、パークローンドラ イブ１２３０１のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託番号Ａ ＴＣＣ４０３８７として寄託された。ＣＤＮＡ挿入物はＰａｔＩ消化により切り 取り、その切り取ったｅＤＮＡは、必要に応じて合成リンカ−を用いて、別の発 現ベクター中のいずれかの方向で再挿入されることに注意すべきである。

切り取ったｃＤＮＡはまた、ＢｉＰタンパク質をコードする他のＤＮＡ分子また は（ゲノムライブラリーを検索することにより＞ＢｉＰタンパク質の転写調節ヌ クレオチド配列を含む他のＤＮＡ分子を、慣用方法で同定し、クローニングする ためのハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。

、ＭＴαＢ２はＤＥＡＥデキストラフ法を用いて、Ｆ■発現ベクターと共にＣ０ ５−ｘ細胞に同時トランスフェクションした。調整培地はトランスフェクション の４８時間後から開始し工適当な時間に収穫し、Ｆ〜１活性について検定した。

これらの実験の結果を表■に要約する。この実験において、Ｆ■とアンチセンス ＧＲＰ７８　配列の同時発現は、７％１１とＧＭ−Ｃ５Ｆの同時発現と比較して 、調整培地中の１％ｌ活性を５０％増加させた。このデータは、アンチセンスベ クターを導入してＧＲＰ７Ｂ　の細胞内レベルを低下させると、Ｆ■の分泌レベ ルが上昇することを示している。

表　Ｉ Ｃ０５−１細胞でのＦｌｌおよびＧＲＰ７Ｂ発現ベクターの同時トランスフェク ション 色素原活性（ミリ単位／ｍ１） ＤＮＡなし　０　０　０　０ μＭＴ２Ｘ’Ｍ／ｐｃｓＦ−１６７９３３０３０μＭＴ２Ｘ’Ｌ’ｐＭＴＧＲＰ ７８　１０　１９　０　５、ＭＴ２ＬＡ／ｐｃｓＦ−１２９０−５３６４３６ｐ ＭＴ２ＬＡ７ｐＭＴａＲｐ７８　９０　−　２４０　２１７本　別々に行った４ 回の実験の結果を示す。表示したプラスミドはＣＯ５−１細胞に同時トランスフ ェクションし、調整培地はＫａｂｉ　Ｃｏａｔａａｔ　Ｆ（１ｍ）　’Ｃ法によ る検定のために回収した。

表　■ ＣＯ５−１ｍ胞でのＦ（■）およびアンチセンスＧＲＰ７８発現ベクターの同時 トランスフェクション色素原活性（ミリ単位／ｒｎｌ） ｐＭＴＸＶ、Ｃ３Ｆ−１９０ ｐ　ＭＴ　Ｘ’ｌ／　ｐ　ＭＴαＢ２　１３５ＤＮＡなし　０ 表示したプラスミドはＣＯ５−１ｆｄ胞に同時トランスフェクションし、調整培 地はＫａｂｉ　Ｃｏａｔｇｘｔ　Ｆ（Ｘ］Ｉ）　：Ｃ法による検定のために回収 した。

Ｄ、ＥｉＰ／Ｇ　ＲＰ　７８レベルが低下したＣＨＯ細胞株の形１）ＢｉＰ／Ｇ ＲＰ７８レベルが低下したＣＨＯ細胞の形成りＨＰＲ欠損チャイニーズ・ノーム スター卵巣ｃｃＢＯ）細胞株、ＣＨＣ”　（ＤＵＫＸ　−Ｂ１１　）Ｇ！　１０ １／Ｉ＋＋／’ｆツ＋７）Ｆ−ミジン、デオキシアデノシンおよびアデノシンを 補給したアルファ培地中で増殖させた。細胞はリン竣カルシウム共沈法（Ｋａｓ ｔｆｍａｓら、１Ｍ１３．１９８２）を用いて、ＭＴαＢ２（２０μ？）および ｐ　Ｓ　Ｖ　２　Ａ’　ｇ　ｏ　（，４Ｔ　ＣＣ３７１４９）（２μり）で同時 トランスフェクションした。

ｐｓＶ２Ｎｇｏ　は抗生物質０４１８耐性をコードする（Ｐ。

Ｓｏｓｔｈｇｒｎ　＆　Ｂｅｒｇ　Ｐ、、１９８２　、　Ｊ、Ｍｏ１．Ａｐｐｌ 、Ｇｇｎｇｔ。

１　３２７−３４１）。　トランスフェクションの４８時間後、上記のようにヌ クレオシド類を補給しさらにＳＦ３゜Ｎ−ｏ発現について選択す仝ために１　ｍ ｌ　／　ｍｌの０４１８を含むアルファ培地に細胞をまいた。、ＭＴαＢ２はア ンチセンスＧＲＰ７８　転写物の３′領域に完全なりＨＦＲコード領域を含む。

こうして、０４１８耐性形質転換細胞は続いてこの、ＢＲＮＡからのＤＨＦＲ発 現にりいて選択された。ヌクレオシド類を含まずｌＯ％透析クシ胎児血清を含む アルファ培地での増殖はＤＨＦＲ＋コローーをもたらした。５個のコロニーをプ ールしてＡ６Ｅ株を得た。この株はその後０．０２μＭの濃度の葉酸類似体メ） ）レキセードの存在下で生育について選択することにより増殖させた。

０．０２ｐＭのメトトレキセートに８回通過させた後、ＡＢＢ株におけるＥｉＰ ／ＧＲＰ７８レベルは、放射性標識細胞抽出物と抗ＢｉＰモノクローナル抗体と の免疫沈降おｘｒｊｓＤｓ−ｐＡＧＥｔｃＬる分析ｔｒ用いて、ＣＨＯＤＵＫＸ と比較した。さらに、ＢｉＰ／　ＧＲＰ　７８のレベルは抗ＢｉＰモノクローナ ル抗体を用いるウェスター／分析により測定した。Ａ６ＢはもとのＣＨＯ株と比 較したときＢ　ｉＰ／ＧＲＰ７８レベルの低下を示した。さらに、これらの細胞 におけるｐＭＴαＢ２白米のアンチセンスＧＲＰ７８ＲＮＡのレベルはノザン分 析により測定した。

２）Ｂ９とＢｉＰ／Ｇ　ＲＰ　７８レベル低下細胞株との融合Ａ６Ｂ細胞株は生 育不能にさせるべくそれらをＤＥＰＣで処理した後、標準的なポリエチレングリ コール法を用いてＦ■産生細胞株Ｈ９と融合させた（　ＦＥＷｒ　ｉ　ｇ　Ａ　 ｔ　＊ｃｈａｐ、５．　”″生化学的阻讐剤ヨードアセトアミドおよびジエチル ピロカルボネートを用いるヘテロカリオンおよび細胞ハイブリッドの選択”、Ｔ ａｃｈ％ｉｑｓｇａ　ｉｓ　ＳｕｍαｔｉｅＣａｌｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｊ Ｗ　５ｈａｙ　！ｉ果、プレナムプレス）。

細胞融合の２日後、細胞なｌ　ｐＨメトトレキセートおよび１　ｑ／ｍｌ　Ｇ　 ４１８を含む培地にまいた。Ｂ９は１μＭメトトレキセート中で生育し、モして Ｇ４１８はＡ６Ｂ細胞由米のアンチセンスＧＲＰ７Ｂ配列を含む染色体を選別す る。１１日間生育させた後、２２個のコロニーをプールしてＨｇ　ｘ　Ａ　６　 Ｂ　−９と呼ばれる細胞株を得た。

ＨｇｘＡ６Ｅ−９によって調整培地中に分節されたＦ■の凝固活性レベルの測定 は、この細胞株かもとの１９株よりも２倍以上の活性をもたらすことを示した。

３）　ｔ−ＰＡ−３ｘ細胞株とＢｉＰ／ＧＲＰ７８レベルが低下した細胞株との 融合 もう１つの細胞株は次のようにして作った。上記のＣＨＯＤＵＫＸｉｄ５胞株は リン駿カルシウム共沈法によって、ＭＴαＢ２（２０μ２）および、５Ｖ２Ａｄ Ａ（２μ２）で同時トランスフェクションした。ｐｓＶ２ＡｄＡはアデノシンデ アミナーゼをコードし、細胞毒濃度のアデノシンおよび薬物デオキシコホルマイ シン（ｄＣＦ）の存在下で細胞を生育させることができる。トランスフェクショ ンの４８時間後、デオキシアデノシン、チミジン、ウリジンＣＵ）、アラノシン ＣＡ）、アデノシン（Ａ）および０．０３ｐＭ　ｄＣＦを補給したアルファ培地 に細胞をまいた。

ＡＡＵおよびｄＣＦ中での生育はＡＤＡ発現を選択する。

コロニーをプールしてＣＢＢ株を得た。この株は続いて０．１１１Ｍおよびｌｐ Ｍ　ｄＣＦ中での生育について選択することＫより増殖させた。ＢｉＰ／Ｇ　Ｒ Ｐ　７８タンパク質レベルは放射性標識した細胞抽出物の免疫沈降お↓び抗Ｂｉ Ｐ　モノクローナル抗体を用いるウェスター／分析により測定した。ｃｘｐ７８ ／Ｅ４ＰのＲＮＡレベルもノザン分析によって測定した。ＣｅＥ株はＣＨＯＤＵ ＫＸと比較してＢｉＰ／ＧＲＰ７ｆ３タンパク質およびＲＮＡのレベルを低下さ せた。

１１’ＭｄＣＦ中で生育するＣ５Ｂ株はｔ−ＰＡ−３ｘ産生細胞法ｔＰＡ３ｘ− ９と融合させた。ｆｉＩ胞融合の２日後、ＡＡＵ％１ｐＭｄＣＦおよび０．０２ μＭメトトレキセートを含むアルファ培地に細胞をまいた。ｔＰＡ３ｘ−９は０ ．０２μＭメトトレキセート中で生育し、　ｄｃＦはア／テセンスＧＲＰ７Ｂ　 配列を含む染色体を選択する。１１日間の生育後、９個のコロニーをプールして ｌａＥ株を得た。調整培地中に分泌さｎたｔ−ＰＡの活性レベルの測定は、この 細胞株かもとのｔＰＡ３ｘ−９株よりも２〜５倍大きい活性をもたらすことを示 した。

および使用 ＥｉＰ／Ｇ　ＲＰ　７８調節要素を含むＤＮＡ配列はｐＵＣ２９１Ｒ（Ｌｉｎら 、Ｍｏ１．Ｃｇｌｌ　Ｂｉｏｌ、、１９８６）を５ｆｎｃＬＩＩおよびＨｉｎｃ Ｈで消化することにより取り出した。このようにして得られたＤＮＡフラグメン トは、ラットＧＲＰ７８遺伝子の誘導に必要とされる詞ｙｓ素を保有する２　９ １　（ＳｍａＩ／５ｔｓＩ）ヌクレオチド配列を含む。別法として、先に示した ３６０ヌクレオチドまたはその一部は慣用方法により、例えば重複するオリゴヌ クレオチド（−緒になって所望の配列を形成する）の合成を経て、合成すること ができる。他の動物種から誘導される対応ＧＲＰ７Ｂ調節配列もそれがゲノムＤ ＮΔライブラリ一本発明において使用できることを理解すべきである。トランス 作用性因子はこのようにして得られたＤＮＡフラグメント内の調節配列と結合し て、ＧＲＰ　７　ｇ　転写の誘導を仲介すると考えられる。このようなりＮＡ７ ラグメントはｉｎ　ｖｉｖｏ　で仮定されたトランス作用性因子について競合し うろことが報告された（　Ｌｉｎら、Ｍｏ１．Ｃａ１ｌＥｉｏ１．、１９８６） 。

使用すべき調節フラグメントの使用可能性は、Ｌｉ？＆ら、Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　 Ｂｉｏｌ、、　１９８６に記載されるような方法を用いて都合よく検定できる。

その後、使用すべき調節Ｄ　Ａ’　Ａ配列は、真核細胞（好ましくは唾乳動物細 胞）用の通常の発現ベクターに、直接あるいは所望により合成リンカ−を用いて 挿入される。

例えば、調節配列は発現ベクターｐ、ｖｒ２のＥｃｏＲ１部位に合成ＥｅｏＲＩ リンカ−を用いて挿入される。ｐＭＴ２は米国メリーランド州ロックビルのアメ リカン・タイプ轡カルチャー・コレクションに寄託番号ＡＴＣＣ６７１２２とし て寄託された（１９８６年５月２９日）ｐＭＴ２−ｖ　ＪＦ　ＦのＥｃｏＲＩ消 化により得られる。ＥｃｏＲＩ消化は、ＭＴ２−ＪＦ中に存在するｃＤＮＡ挿入 物を切除して、線状の１Ｍ１２をもたらし、これは連結後大腸ＭＨＥＩＯＩまた はＤＨ−５をアンピシリン耐性へ形質転換するために使用される。プラスミド、 ＭＴ２　ＤＮＡ慣用方法により作製できる。もちろん、当分野で知られた他の発 現ベクターも、必要に応じて過当なリンカ−を用いて１．ＭＴ２の代わりに使用 される。

調節配列を含む発現ベクターはその後、当分野でよく知られた１つ以上の選択マ ーカーおよび増幅マーカーをもつ所望の宿主細胞に同時形質転換または同時トラ ンスフェクションされる。そして、異種ＤＮＡの遺伝子コピー数は所望により慣 用方法を用いて増幅される。細胞ゲノム中の多コピー数の調節配列の存在は、Ｎ Ｍ合グリコジル化の阻止、Ｆ■：Ｃまたはその類似体の過剰発現などの条件によ る誘導後にトランス作用性因子との結合について、内因性のＧＲＰ７８発現調節 配列と競合するであろう。トランス作用性因子に対するこのような競合はメタロ チオネインＩ遺伝子について報告されており（Ｓｇｔｉｓｉｔ＠ら、Ｎａｔｓｒ ｍ＊　１９８４　）、そして熱シヨツクタンパク質についても示唆されている（ ＭｃＧａｒｖｙおよびＬｉｎｄｑｓｉｓｔ＋Ｐｒｏａ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ ａｉ、＋　１９８６　）。内因性ＢｉＰ遺伝子の転写誘導、並びに得られた細胞 およびそれらの子孫におけるＢｉＰ　タンパク質の誘導レベルはそれ故に有意に 低下するであろう。好ましくは、誘導されたＢ　ｉＰ転写レベル対正常のＢｉＰ 転写レベルの比は約２０以下、より好ましくは約１０以下、より一層好ましくは 約５以下、そして特に好ましくは約１以下である。

ベクターによって運ばれた調節配列を含む形質転換またはトランスフェクション された細胞またはそれらの子孫は、さらに目的の異種タンパク質の合成を導くこ とができる発現ベクターで形質転換またはトランスフェクションされる。別法と して、それらは目的の異種タンパク質の合成を導き得る発現ベクターで前もって 形質転換またはトランスフェクションされた他の細胞と融合させることができる 。異種タンパク質の合成誘導き得る適当なベクターは当分野で知られており、以 前に論じられている。

Ｆ、Ｅ　ｉ　Ｐ　／　Ｇ　ＲＰ　７８結合実験の結論上記のものを含む実験から 、我々は次の結論を引き出した。

１、ｗｔＦ■はＢｉＰと結合し、決して分泌されることのないＦ％ｌの大部分は ＥｉＰと結合したままである。２５個のＮＭ合グリコジル化部位のうち２０個は Ｆ■タンパク質の三方の−の中央部分に集中し又いる。

２、集中している２０個のグリコジル化部位のうち１８個が除去されたＦ■の欠 失体ＬＡはｗｔＦ■よりも効率よく分泌され、ＢｉＰとの一時的結合を示す。

３、ＬＡとＢｉＰの結合は、細胞をＮ結合グリコジル化阻害剤ツニカマイシンで 処理することにより有意に増加される。

４、ＣＨＯ細胞によって効率よく分泌される複雑な糖タンパク質のνＦＦはＢｉ Ｐとの一時的結合の＆を示す。

νＷＦの１７個のグリコジル化部位は、ｓａｔ　Ｆ■のように集中しているので はなく、分子に沿って間隔を取って配置されている。

５、ｔ−ＦＡはＢｉＰとのわずかな一時的結合のみを示す。しかしながら、ツニ カマイシンによるＮ結合グリコジル化の阻害は、Ｂ　ｉ／’と結合した状態で若 干の非グリコシル化分子を細胞内にとどまらせる。

６．７＃％ｆＧ１％で置換することによって３個の潜在的Ｎ結合グリコジル化部 位が除去さｎたｔ−ＰＡの変異型を−ｐＡ３×は、低発現レベルにおいてＢｉＰ とのわずかな結合を示すにすぎない。しかしながら、高発現レベルでは、プロセ ッシングを受けないタンパク質の分画がＢｉＰとの安定した結合を示し、明らか に効率よく分泌されない。この行動はグリコジル化が阻害されたときの５ａｔｔ −ＰＡについて観察されたものと似ている。

？、ＢｔＰと結合した状態での非グリコジル化ｔ−ＰＡの細胞内保持は発現レベ ルに依存している。低発現レベルでのｔ−ＰＡ３ｘ　はＥｉＰと結合せず、効率 よく分泌される。２００倍高い発現レベルでは、有意な割合のｔ−ＰＡ３ｘがＢ ｉＰと結合する。この細胞内保持は、Ｎ粘合グリコジル化が阻害されたときの高 生産性ｗｔ　ｔ−ＰＡ　細胞株について観察されたものと類似している。低生産 性ｗｔｔ−ＰＡ　細胞株Ｈ１２Ｂ　では、Ｎ結合グリコジル化の阻害の影響が高 生産性細胞はど顕著ではない。このことは、非グリコジル化ｔ−ＰＡがＥＲ中に 高濃度で存在するとき果合して、ＢｉＰと結合することを示唆している。

８、ＢｉＰは不適切にグリコジル化された又は折りたたまれたタンパク質と小胞 体内で結合し、それらの分泌を妨げる。ＥｉＰは恐らく熱ショックを受けた核小 体内のｈｓｐ７０と類似した機能で、集合タンパク質を小胞体から除去する働き をしている。ＥＲ内でのタンパク質の集合または不溶化の問題は、今や組換えＤ ＮＡ発現技術によ□って達成しうる高発現レベルにより一層悪化している。

そして、ＦＸＭのようないくつかの槍タンパク質の場合は、集合およびその結果 起こるＥｉＰとの結合が高レベル分泌に対するバリヤーとなるだろう。

９、ｗｔ　ＦＸＭの中央部分に集中した２０個のグリコジル化部位は効率悪くグ リコジル化されて、不適切に折りたたまれた分子の集合およびＢｉＰとの安定し た結合をもたらす。この高度にグリコジル化されたドメインは、たとえＮ結合グ リコジル化が適切であるとしても、ＢｉＰが異常として認識するコンホメーショ ンをとる可能性もある。この場合に、分泌能力をもつ分子はＢｉＰと結合した状 態で捕捉され、それ故にＥｉＰレベルの低下はより高い分泌レベルをもたらすで あろう。

１０、　Ｆ〜１産生細胞株におけるＢｉＰレベルの低下は、調整培地へのＦ４ｍ 活性の分泌を増加させる。従って、ＢｉＰレベルが低下したＣＨＯ細胞株はいく つかの複雑な糖タンパクの発現に投置つかも知れない。

１、Ｂｏｌｔ、Ｄ、Ｇ、ｒＨｅｎｄｅｒｓｈｏｔｅＬ、Ｍ、およびＫｇａｒｎｇ ｙ／、７’、（１９８６）”非分泌および分泌ハイブリドーマにおける免疫グロ ブリン重鎖結合タンパク質と形成期重鎮との翻訳後結合”Ｊ、ＣａＥＩ　Ｅｉｏ ｌ、、　１０２：２、Ｌｅｗｉａ、Ｍ、Ｊ、およびＰｇｌｈａｍ　Ｈ，Ｒ，Ｅ、 （１９８５）”７０ｋｄ熱シヨツクタンパク質の核および核小体機能へのＡＴＰ の関与”ＥＭＥＯＪ、４：３１３７３、Ｍｓｎｒｏ、Ｓ、およびＰｅｌｈａｍＨ ，Ｒ，Ｂ、（１９８６）ＮＥＲ中のｈａｐ７０ミル７０様タンパクｋｄグルコー ス調節タンパク質および免疫グロブリン重鎖結合タンパク質との同一性″Ｃｅ１ ｌ　４６：２９１　３００４、　５ｈｉｓｒＲ，Ｐ、＋Ｐｏｕｙａａｇｇｓｔｒ Ｊ、およびＰａｓｔｇｎ　Ｉ−（１９７７）″′グルコース飢餓はラウス肉腫ウ ィルス−形質転換ヒヨコ胚線維芽細胞において２種類のトランスフォーメーショ ン感受性膜タンパク質の誘導の原因となる”Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ ｅｔ、ＵＳＡ７４　：５、ＣｈａｐｐａｌｌＪ、Ｇ、ｐＷｅｌｃｈｉ、Ｊ、、Ｓ ａｈｌｏａａｍａ勧ＤＪｆ、。

Ｐａ１ｔａｒｓＫ、Ｂ、、ＳｃｈｌｍａｉｎｇａｒａＭ、Ｊ、ｒおよびＲｏｔｈ ｒｈａｓ、Ｊ　、Ｅ、（１９８６）″アンコーティングＡＴＰアーゼｋ”１７０ ＫＤＩＲのストレスタンパク質の一員であるＣａ１ｌ　４５　：　３−１３ ６、Ｕｎｇａｗｉｃｋｇｌｌ、Ｅ、（１９８５）″”７０ｋｄ晴乳動物熱シヨツ クタンパク質は被覆小胞からクラスリン・トリスケリオンを放出させるアンコー ティングタンパク質と構造的および機能的に関連がある”ＥＭＥＯＪ、４：３３ ８５−３３９１ ７、Ｐｅ１ｈａｔｎ、Ｈ，Ｒ，Ｂ　（１９８６）　’″　主な熱ショックおよび グルコース調節タンパク質の機能に関する推察”Ｃａ１ｌ　４６：９５９　９６ １ ８、Ｓｃｈｌｇｓｉｎｇｇｒ、Ｍ、Ｊ、（１９８６）”熱シヨツクタンパク質： その機能の追求″Ｊ、Ｃｇｌｌ　Ｅｉｏｌ、　１０３　：９、ＴＩ’１ｌｌｉａ ｔｎａｔＤ、Ｂ、、５ｗ１ａｄｌｅｒ＊Ｓ、Ｊ、およびＨａｒｔ、Ｇ。

Ｆ、（１９８５）“脱糖タンパク質の細胞内輸送：２種類の密接に関連した組緻 適合性抗原は細胞表面へのそれらの輸送速度において異なるＪ、Ｃａ１ｌ　Ｂｉ ｏｌ。

１０１ニア２５−７３４ ＩＱ、ＬｏｄｉｓｈＪ、Ｆ、、ＨｏｎｇＪ、＋ＳｎＳｎ１ｄ＋Ｍ、、５ｔｒｏｓ ｔａ、Ｇ。

！、（１９８３）′肝がん分泌タンパク質は粗面小胞体からゴルジ体へ特定速度 で移動する”Ｎａｔｓｒａ３０４：８０−８３ １１、Ｆｉｔｔｉｎｇ、Ｔ、およびＫａｂａｔ、Ｄ、（１９８２）　”　ａ胞子 オルガネラ間の輸送に関与する槍タ／バク質シグナルの証拠”Ｊ、ＢｉｏＬ、Ｃ ｈａｍ、２５７　：　１４０１１−１２、ＥｌｏｂａＬ、Ｇ、およびＤｏｂｂｇ ｒｓｔａｉｎ、Ｂ−（１９７５）ゞタンパク質の膜横断輸送。■異種成分からの 機能的粗面ミクロソームの再欄成”ノ、Ｃａ１ｌ　Ｂｉｏｌ、６７：１３、Ｆａ ｒｑｓｈａｒ、Ｍ、Ｇ、　（１９８６）　”ゴルジ体通路の解明”Ａｓｎ、Ｒｅ ｖ、ＣａＨＢｉｏｌ　、　１　：　４４７−４８８１４、ＫｏｒｎｆｇｌｔＬＲ ，およびＫｏｒｔ＊ｆｇｌｄ、Ｓ、　（１９８５）″′アスパラギンー結合オリ ゴ糖の組立て”　ＪｓｓＪｇｗＢｉｏｃｈｅｍ、　５４　：　６３１−６６４１ ５、Ｗａｌｔａｒ＊Ｐ、ｒＧｉｌｔｎｏｒｅ＋Ｒ，およびＢｌｏｂａｌｒＧ。

（１９８４）”小胞体を横断するタンパク質の移動”Ｃｇｌ１３８：５　８ １５、Ｇａｔｈｉｎ（ＢＭ、Ｊ、、ＭｅＣａｍｒｎｏｎｒＫ、＊およびＳａｍｂ ｒｏｅｋ。

／、（１９８６）　″′野生型および変異型インフルエンザ赤血球凝集素の発現 ：細胞内輸送における折りたたみ（ｆｏｌｄｉｎｇ）の役割″Ｃａ１ｌ　４６　 ：９３９　９５０１７、　５ｈｔＬｒｔｎｅＬ＋Ｓ−ｒＲＯＱｇｒ８ｒＬ−ｒＢ ｒ６ｎｄ８ｍｅＬＪ−ａＧｇＬｈ％ｎＱ＊Ｍ、Ｊ、およびＳａｍｂｒｏｏｋ、！ 、（１９８５）　”　ＳＦ３０Ｔ抗原およびそのエキソサイティック通路”ＥＭ ＢＯＪ、４：１４７９−１４８９ １８、　５ｈｉｓ＋Ｒ，ＰａＣ，＊ＰｏｕｙｓｓｇｇｓｔｒｒＲ，およびＰａａ ｔｇｎ慶Ｎ−（１９７７）″グルコース飢餓はラウス肉腫ウィルス−形質転換ヒ ヨコ胚融維芽細胞において２種類のトランスフォーメーション感受性膜タンパク 質の誘導の原因となるＰｒｏｃ、Ｎａｔ１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７４： １９、Ｈａａｘ、１．Ｇ、およびｊｉ’ａｂｌｅ、Ｍ、　（１９８３）″′免疫 グロブリン重鎮結合タンパク質″Ｎａｔｕｒｅ　３０６　：３８７２０．０１ｄ ｅｎ、に、　＊Ｐｒａｔ　ｔ　、Ｒ，ｋｆ、　、Ｊａｗｏａｚｋｉ＊Ｃ，および Ｙａｍａｍｄａ、に、Ｍ、　（１９７９）　”　罠輸送での糖タンパク質炭水化 物の役割の証拠：ツニカマイシンによる特異的阻害″Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ１．Ａｃ ａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７６：２１、’　Ｐｏｓｙａｓａｇｓｒ、１．．５ｈｉ ｓ＊Ｒ，Ｐ、Ｃ，およびＰａ５ｔｅｓ、Ｉ。

（１９７７）”穏タンパク質合成の遮断またはグルコース飢餓による正常線維芽 細胞における２糧類のトランスフォーメーション感受性膜ポリペプチドの誘導″ Ｃａ１ｌ　１１８９４１　９４７ ２２、Ｗａｇｎａｒ、Ｄ、Ｄ、およびＭａｒｄａｒ、Ｖ、Ｊ　、（１９８４）　 ”ヒト内皮細胞によるフォノ・ビルプラントタンパク質の生合成：プロセッシン グ工程およびそれらの細胞内局在化″Ｊ、Ｃｅ１ｌ　ＢｉｏＪ、９９：２１２３ 　２１３０２３、　０ｒｃｉ、Ｌ、、Ｒａｖａｚｔｏｌａ、Ｍ、、Ａｍｈａｒｄ ｔ炉Ｍ、、Ｍａｄｓａｎ。

０、、ＶａｓｓａｌｌｉＪ・およびＰｅｒｒｇｌｅｔ＊Ａ、（１９８５）”イン シュリン分泌細胞のプロホルモン変換部位の直接的同定”Ｃａ１ｌ　４２：６７ １−６８１２４、Ｐｇｎｎｉｃａ＊Ｄ、ｍＨｏ１ｍａａ＋１１’・、Ｋｏ　ｈ　 ｒ　Ｚ　１Ｈαｒｋｉｎｔ、Ｒ・Ａ’１Ｖ　ａｈａｒ、Ｇ、Ａ、　、ｌＪ’ａｒ ｄ　＊Ｃ、Ａ　、　ｒＥａｎｎｇ　ｔ　ｔ　＋ＴＶ、Ｆ、　ｒＹａｌｖａｒｔｏ ｎ、Ｅ、　＋Ｓｇｇｂｘｒｇ＋Ｐ、Ｈ，、Ｈｅｙｎｇｋａｒ＋Ｈ，＊Ｇｏｇｄｄ ａｌ＊ＤＪ、およびＣｏ１１ｔｎ、Ｄ、（１９８３）″大腸菌によるヒト組織型 プラスミノーゲン活性化因子ＣＤＮＡのクローニングおよび発現”Ｎａｔｓｒａ 　３０１：２１４−２５、Ｋａｕｆｍａｎ＊Ｒ，Ｊ、＋Ｗａｓ１ｇｙ＊Ｌ、Ｃ， ＋５ｐｉｌｉｏｔｅａ＊Ａ、Ｊ、＋Ｇｏｓａｅｌｓ＊Ｓ、Ｄ、、Ｌａｔｔ、Ｓ、 Ａ、、Ｌａｒａｇ＊＊Ｇ、Ｒ，およびＫａｙ、Ｒ，Ｍ、（１９８５）　’″チヤ イニーズノームスター卵巣細胞によるヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子お よびネズミジヒドロ葉酸還元酵素配列の同時増幅および同時発現”Ｍｏ１．Ｃａ １ｌ　Ｂｉｏｌ、５　：　ｌ　７５０２６、Ｔｏｏｌｅ、Ｊ、Ｊ、、Ｐｉｔｔｔ ｎａ％、Ｄ、Ｄ、、Ｏｒｒ、Ｅ、Ｃ，、Ｈｕｒｔ五α。

Ｐ−、Ｗａｓｌｇｙ、Ｌ、Ｃ，およびＫａｓｆｍａｎ、Ｒ，Ｊ　、　（１９８６ ）１ヒト第■因子の大きい領域（９５ＫＤａ　）は＋ｆｓ　ｖｉｔｒ６凝固活性 に必ずしも必要でないＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ　、Ａｃａｄ。

Ｓｃｔ、ＵＳＡ　８３：５９３９　５９４２２７、Ｌａｇｍｍｌｉ、Ｕ、に、（ １９７０）″′バクテリオ７アージＴ４の頭部の組立て期間中における構造タン パク質の切断ｌ″Ｎａｔｓｒｇ　２２７　：　６８０−６８５２８、Ｔｏｏｌｍ 、Ｊ、Ｊ、、に＊ｏｐｆＪ、Ｌ、ＪＦｏｔｎｇｙＪ、Ｍ、、Ｓｔｌｔｔ−ｍａｎ 、Ｌ、Ａ、　、ＢｓｍｅｋａｒＪ　、Ｌ、　＋Ｐｉ　ｔ　ｔｍａｎ、Ｄ、Ｄ、　 。

Ｋａｓｆｍａｎ＋Ｒｊ、＊ＢｒｏｗｎｙＥ、、５ｈｏａｔｎａｋａｒ＊ｃ、＋Ｏ ｒｒ＋Ｅ　、Ｃ、、Ａｍｐｈｌ　ａ　ｔ　ｔ　、Ｇ、Ｗ、　、Ｆｏｓ　ｔ　ｓｒ 、ｉ！’、Ｂ、　、ＣＨ、Ｍ、Ｌ、。

Ｋｓｓｔａｏｓ＊Ｇ、Ｊ、、Ｆａｎｓ、Ｄ、Ｎ、およびＨａｗｉｅｋｒＲ，Ｍ。

（１９８４）“ヒト抗血友病性因子をコードするＣ　ＤＮＡの分子クローニング ″Ｎａｔｕｒｅ　３１２，３４２２９、Ｇｉｂａｏｎ、Ｒ，ｍＳｃｈｌａａｉｎ ｇｇｒｒ５．およびＫｏｒｎｆｇｌｄ＊Ｓ。

（１９７９）”水痘性口内炎ウィルスの非グルコシル化糖タンパク質は温度感受 性であり、昇温で細胞内集合を受ける″Ｊ、Ｅｔｏ１．Ｃｈｇ惰、２５４．３６ ００−３０、ＧｉｂａｏｎａＲ，＋Ｋｏｒｎｆａｌｄ＊Ｓ−およびＳ６ｈｌａａ ｉｎｇｅｒ＊５゜（１９８１）”水痘性口内炎ウィルスのＧタンパク質の成熟化 および物理的性質に対する異なるサイズのオリゴＷ鎖の影響′″Ｊ、Ｂｉｏ１． Ｃｈａ溝、２５６，４５６−３１、Ｔａｋａｓｓｋｉ、Ａ、＊Ｋｏｈ＊ｏ、に、 およびＴａｍ５ｒａ、Ｇ、Ｃ１９７５）１ヒヨコ胚ミクロノームにおけるポリイ ソプレノール楯の生合成のツニカマイシンによる阻害”Ａｇｒｉｃ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈａｍ、３９．２０８９−２０９１３２、Ｂｏｎｔｈｒｏｓ、Ｄ、 Ｔ、、Ｈａ％ｄｉｓ、Ｒ，１，、Ｋａｓｆｔｎａ算、Ｒ，Ｊ、。

Ｗａｓ　ｌ　ｇｙ＃Ｌ、ｃ　、　、Ｏｒｒ、Ｅ　、Ｃ，、Ｍｉ　ｔ　ｓ　ｏａｋ 　、Ｌ　、Ｊ／、　、Ｅｗｔｎｓｔ−ａｉｎｌＢ、、Ｌｏａｃａｌｚｏｌｌ、＊ Ｇｉ＊ｘｂｓｒｇｅＤ、、ＵｒｋｉｎｔＳ。

Ｈｏ（１９８６）＠プレプローフオン・ビルプラント因子の構造および異ｍａ胞 によるその発現″Ｎａｔｓｒａ３２４．２７０−２７３ ３３、　Ｐｏｈｌ、Ｇ、＊ＫａｌｌａｔｒｏｍｒＭ、ｔＢｇｒｇｓｄｏｒｆ＊Ｎ 、１ａｌｌａｎ＋Ｐ、およびＪｏｒｎｖａＬｌｅＨ，（１９８４）　”組織プラ スミノーゲン活性化因子：ペプチド分析は間接的に誘導されたアミノ酸配列を確 認し、活性部位セリン残基を同定し、グリコジル化部位を確立し、そして変異型 の異なる位置を定める艷Ｂｉｏｃｈａｍｉｘｔｒν２３゜３４、Ｄｓｎｐｈｙ　 ＆　Ｒｏｔｈｍａｓ＊　１９８５、”ゴルジ装置の区画３５、Ｆｉｔｔｉｎｇ　 ＆　Ｋａｈａｔａ　１９８２　ｓ　”細胞下オルガネジ間の輸送に関与する糖タ ンパク質シグナルの証拠：ネズミ白血病ウィルスによりコードされる２種類の膜 種タンパク質は異なる速度で細胞表面に到達する”Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２ ５７＜２３）：　１４０１−１４１７３６、Ｌｉ％ら、１９８６、”カルシウム イオノフオア誘導性細胞プロモーターは高度に活性であり、エン−・フサ一様性 質をもつ”　、Ｍｏ１．Ｃａ１１．Ｂｉｏｌ、　６　（４）　−３７、Ｒｅａａ ｎｄａｔら、１９８５．”カルシウムイオノフオアＡ２３１８７はグルコース調 節遺伝子およびそれらの異種融合遺伝子の発現を誘導する”Ａｉｏｌ、ＣｅＬｌ 。

Ｂ１１１．互（６）：１２１２−１２１９３８、Ｃｈａｎｇら、１９８７．’　 ７８　ＫＤａ　グｙ：Ｉ−１１４節タンパク質（ｇｌｓｃｏａｇ−ｒａｇｓｌａ ｔａｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ）ＧＲＰ７８をコードするラット遺伝子：その調節配列 およびその発現に対するタンパク質グリコジル化の影響”Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａａａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８４：６８０　６８４３９、Ｗｏｎｇら、１９８５ ．”ＩＩニド組換え顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子：多系統造血″５ ｃｉｅｎｃｅ。

４０、Ｌｍ−ら、１９８３．″′ハムスター変異線維芽細胞株におけるグルコー ス飢餓により特異的に誘導された２１！類の遺伝子の転写調節”Ｊ、Ｅｉｏｌ、 Ｃｈｇｍ、２５Ｂ：４１、Ｋｉｍ　＆　Ｆｏｌｄ、１９８５　、　”レベルのア ンチセンスＲＮｉを発現する細胞におけるチミジンキナーゼ活４２、Ｓｅｇｕｉ ｓら、１９８４．”メタロチオネイン遺伝子転写を活性化する細胞因子の競合″ Ｎａｔｕｒｅ、３１２　ニア８１−７８５ ４３、ＭｃＧａｒｒｙ　＆　Ｌｉｎｄｑｗｉａｔ、　１９８６　、　”熱誘導性 アンチセンスＲＮＡによる熱ショックタンパク質合成の国際調査報告 １″Ｉ＃ＲａｌＮＩＭＩＩ　Ａ°５°ｌ′Ｍ　Ｎ＆、　、ｃ、、τ＋ＣＩニア／ 、−１：！Ｑ７１

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. １．ＤＮＡ配列の転写がＧＲＰ７８をコードするｍＲＮＡとハイブリダイズし得 るアンチセンスｍＲＮＡをもたらすように、発現調節配列に対して逆方向に連結 されたＧＲＰ７８タンパク質またはその一部をコードするＤＮＡ配列を含むアン チセンス発現ベクター。
2. ２．請求の範囲第１項のベクターで形質転換された真核宿主細胞から成る、異種 タンパク質を発現させるための改良された真核宿主細胞またはその子孫。
3. ３．請求の範囲第２項の酵母、真菌、昆虫、植物または哺乳動物宿主細胞。
4. ４．異種タンパク質の発現を導くことができるベクターでさらに形質転換された 請求の範囲第２項の改良された宿主細胞またはその子孫。
5. ５．異種タンパク穴は第ＶＩＩＩ因子またはその類似体である、請求の範囲第４ 項の改良された宿主細胞。
6. ６．異種タンパク質の発現を導くことができるベクターで形質転換され、さらに ａ．請求の範囲第１項のベクター； ｂ．次のＤＮＡ配列： 【配列があります】 またはその一部を含むベクター； ｃ．（ｂ）のＤＮＡ配列に少なくとも７０％相同なＤＮＡ配列を含むベクター； および ｄ．ベクター（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）の組合わせ；から成る群より 選ばれたベクターで形質転換された宿主細胞またはその子孫を培養することから 成る、異種タンパク質を生産するための改良方法。
7. ７．異種タンパク質は第ＶＩＩＩ：ｃ因子またはその類似体である、請求の範囲 第６項の改良方法。