ES2664095T3 - Fragmentos de anticuerpos monoméricos diseñados mediante ingeniería genética - Google Patents

Abstract

Un polipéptido monomérico que contiene Fc que comprende un dominio CH2 de IgG y un dominio CH3 de IgG, en el que el dominio CH3 comprende sitios de glicosilación en la interfase de dimerización CH3-CH3, en el que los sitios de glicosilación unido a N diseñados mediante ingeniería genética se selecciona entre el grupo que consiste en a) S364N e Y407N-X-K409T; b) S364N-X-T366S e Y407N-X-K409T; c) S364N e Y407N-X-K409S; y d) S364N-XT366S e Y407N-X-K409S, en el que X es cualquier aminoácido excepto Pro, y en el que la numeración de los restos se basa en el esquema de numeración de EU de Kabat.

Description

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de forma recombinante" como se usa en el presente documento.

Un "anticuerpo" es una molécula de inmunoglobulina capaz de unirse de forma específica a una diana, tal como un hidrato de carbono, polinucleótido, lípido, polipéptido, etc., a través de al menos un sitio de reconocimiento de antígeno, localizado en la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Como se usa en el presente documento, el término abarca no solo los anticuerpos policlonales o monoclonales intactos, sino también, a menos que se indique otra cosa, cualquier porción de unión a antígeno del mismo que compita con el anticuerpo intacto por la unión específica, proteínas de fusión que comprenden una porción de unión a antígeno, y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprende un sitio de reconocimiento del antígeno. Las porciones de unión a antígeno incluyen, por ejemplo, Fab, Fab’, F(ab’)2, Fd, Fv, anticuerpos de dominio (dAb, por ejemplo, anticuerpos de tiburón y camélido), fragmentos que incluyen regiones determinantes de la complementariedad (CDR), anticuerpos de fragmentos variables monocatenarios (scFv), maxicuerpos, minicuerpos, intracuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, v-NAR y bis-scFv, y los polipéptidos que contienen al menos una porción de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir unión específica de antígeno al polipéptido. Un anticuerpo incluye un anticuerpo de cualquier clase, tal como IgG, IgA, o IgM (o una subclase del mismo), y el anticuerpo no necesita ser de alguna clase concreta. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo de la región constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varias de estas clases se puede dividir adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Las regiones constantes de cadena pesada que se corresponden con las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan alfa, delta, épsilon, gamma, y mu, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas.

"Fragmentos de anticuerpos" comprenden solo una porción de un anticuerpo intacto, en el que la porción retiene preferentemente al menos una, preferentemente la mayoría o todas, las funciones normalmente asociadas con esta porción cuando está presente en un anticuerpo intacto.

Un "fragmento Fab" está comprendido por una cadena ligera y las regiones CH1 y variables de una cadena pesada. La cadena pesada de una molécula Fab no puede formar un enlace disulfuro con otra molécula de la cadena pesada.

Las designaciones de los restos en esta solicitud se basan en el esquema de numeración de la UE de Kabat (Kabat y col., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., ed. 5).

Un "anticuerpo bivalente" comprende dos sitios de unión a antígeno por molécula (por ejemplo, IgG). En algunos casos, los dos sitios de unión tienen las mismas especificidades del antígeno. Sin embargo, los anticuerpos bivalentes pueden ser biespecíficos.

Un "anticuerpo monovalente" o un "anticuerpo monomérico" comprende un sitio de unión a antígeno por molécula (por ejemplo, IgG). En algunos casos, un anticuerpo monovalente o un anticuerpo monomérico puede tener más de un sitio de unión a antígeno, pero los sitios de unión son de diferentes antígenos.

Un "anticuerpo multiespecífico" es uno que se dirige a más de un antígeno o epítopo. Un anticuerpo "biespecífico" "doblemente específico" o "bifuncional" es un anticuerpo híbrido que tiene dos sitios de unión a antígeno diferentes. Los anticuerpos biespecíficos son una especie de anticuerpo multiespecífico y se pueden producir mediante una variedad de procedimientos que incluyen, aunque no de forma limitativa, fusión de hibridomas o unión de fragmentos Fab'. Véase, por ejemplo, Songsivilai y Lachmann (1990), Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; y Kostelny y col. (1992),

J. Immunol. 148:1547-1553. Los dos sitios de unión de un anticuerpo biespecífico se unirán a dos epítopos diferentes, que pueden residir sobre las mismas dianas de proteínas o diferentes.

El término "anticuerpo monoclonal" tal como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos salvo por posibles mutaciones que se producen naturalmente que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos, dirigiéndose contra un único antígeno. Además, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales que de forma típica incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante en el antígeno.

Los anticuerpos monoclonales del presente documento pueden, en determinadas realizaciones, incluir específicamente anticuerpos "quiméricos" en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica a, u homóloga a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivadas de una especie concreta o que pertenecen a una clase o subclase concreta de anticuerpo, mientras que el(los) resto(s) de la(s) cadena(s) es(son) idéntico(s) a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como los fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada (patente de Estados Unidos n.º 4.816.567; y Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)).

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que

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contienen la secuencia derivada de inmunoglobulina no humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en donde los restos de la región hipervariable del receptor se sustituyen por restos de la región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como un ratón, rata, conejo o un primate no humano que tienen la especificidad, afinidad, y capacidad deseadas. En algunos casos, los restos de la región marco (FR) de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los restos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados pueden, además, comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se efectúan para refinar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en el que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia de la inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá de manera opcional al menos una porción de la región constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, véanse Jones y col., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann y col., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Véanse también los siguientes artículos de revisión y las referencias citadas en los anteriores: Vaswani y Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle y Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994).

Un "anticuerpo humano" es un anticuerpo que posee una secuencia de aminoácidos que se corresponde con la de un anticuerpo producido por un ser humano y/o que se ha preparado utilizando cualquiera de las técnicas para preparar anticuerpos humanos que se describen en el presente documento. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente a un anticuerpo humanizado que comprende restos de unión a antígeno no humanos.

Como se usa en el presente documento, el término "inmunoadhesina" designa moléculas similares a un anticuerpo o similares a una inmunoglobulina que combinan el "dominio de unión" de una proteína heteróloga (una "adhesina", por ejemplo, un receptor, ligando o enzima) con el componente efector de los dominios constantes de inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de la secuencia de aminoácidos de la adhesina con la especificidad de unión deseada que es diferente de la del reconocimiento del antígeno y el sitio de unión (sitio de combinación a antígeno) de un anticuerpo (es decir, es "heterólogo") y una secuencia del dominio constante de inmunoglobulina. La secuencia del dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina puede obtenerse de cualquier inmunoglobulina, tal como los subtipos IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, IgA, IgE, IgD o IgM.

Por "proteína de fusión de Fc", como se usa en el presente documento, se entiende una proteína en la que uno o más polipéptidos están unidos operativamente a un polipéptido Fc (por ejemplo, un polipéptido monomérico que contiene Fc, como se describe en el presente documento). Una fusión Fc combina la región Fc de una inmunoglobulina (por ejemplo, un polipéptido monomérico que contiene Fc como se describe en el presente documento) con un ligando, que en general puede ser cualquier proteína, polipéptido, o molécula pequeña. Virtualmente, cualquier proteína o molécula pequeña puede unirse a Fc para generar una fusión Fc. Los ligandos de las proteínas pueden incluir, aunque no de forma limitativa, la región de unión a diana de un receptor, una molécula de adhesión, un ligando, una enzima, una citoquina, una quimioquina, o alguna proteína o dominio de proteína diferente. Los ligandos de moléculas pequeñas pueden incluir cualquier agente terapéutico que dirija la fusión de Fc a un agente terapéutico. Dichas dianas pueden ser cualquier molécula, por ejemplo, sin limitación, un receptor extracelular que está implicado en la enfermedad.

La "región bisagra", la "secuencia bisagra", y variaciones de la misma, como se usa en el presente documento, incluyen el significado conocido en la materia, que se ilustra en, por ejemplo, Janeway y col., ImmunoBiology: the immune system in health and disease, (Elsevier Science Ltd., NY) (4ª ed., 1999); Bloom y col., Protein Science (1997), 6:407-415; Humphreys y col., J. Immunol. Methods (1997), 209:193-202.

Se pretende que el término "vector", como se usa en el presente documento, se refiera a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en el que pueden estar ligados segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector de fago. Otro tipo de vector es un vector vírico, en el que pueden estar ligados segmentos de ADN adicionales en el genoma vírico. Determinados vectores son capaces de replicación autónoma en una célula hospedadora en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episómicos de mamíferos). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episómicos de mamíferos) pueden integrarse en el genoma de una célula hospedadora tras la introducción en la célula hospedadora, y por tanto, se replican junto con el genoma hospedador. Además, determinados vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales está unidos operativamente. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión recombinante" (o simplemente, "vectores recombinantes"). En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante están a menudo en la forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" pueden usarse de manera indistinta ya que el plásmido es la forma más comúnmente utilizada de vector.

"Polinucleótido" o "molécula de ácido nucleico", que puede utilizarse de manera indistinta en el presente documento, se refiere a una forma polimérica, posiblemente aislada, de nucleósidos o nucleótidos de al menos 10 bases de

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longitud. El término incluye formas monocatenarias y bicatenarias. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos o bases modificados, y/o sus análogos, o cualquier sustrato que se pueda incorporar a un polímero mediante ADN polimerasa o ARN polimerasa, o mediante una reacción sintética.

Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tal como nucleótidos metilados y sus análogos. Si está presente, la modificación en la estructura del nucleótido puede trasmitirse antes o después del ensamblaje del polímero. La secuencia de nucleótidos puede estar interrumpida por componentes no nucleótidos. Un polinucleótido puede modificarse adicionalmente después de la síntesis, tal como mediante conjugación con un marcador. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, "protecciones", sustitución de uno o más de los nucleótidos que se producen naturalmente con un análogo, modificaciones internucleótidos tales como, por ejemplo, aquellas con enlaces no cargados (por ejemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquellos que contienen restos pendientes, tales como, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, poli-L-lisina, etc.), aquellos con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), aquellos que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radioactivos, boro, metales oxidativos, etc.), aquellos que contienen alquilantes, aquellos con enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), así como las formas no modificadas de los polinucleótido(s). Además, cualquiera de los grupos hidroxilo ordinariamente presentes en los azúcares puede estar sustituido, por ejemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegido por grupos protectores normalizados, o activado para preparar enlaces adicionales a nucleótidos, o puede estar conjugado a soportes sólidos o semisólidos. El OH 5' y 3' del extremo puede estar fosforilado o sustituido con aminas o restos de grupos protectores orgánicos de entre 1 a 20 átomos de carbono. Se pueden derivatizar también otros hidroxilos a grupos protectores normalizados. Los polinucleótidos pueden contener también formas análogas de azúcares de ribosa o desoxirribosa que se conocen generalmente en la técnica, incluyendo, por ejemplo, 2’-O-metilo-, 2’-O-alilo, 2’-fluoro-o 2’-azidoribosa, análogos de azúcares carbocíclicos, azúcares alfa anoméricos, azúcares epiméricos tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares de piranosa, azúcares de furanosa, sedoheptulosas, análogos acíclicos y análogos de nucleósidos abásicos tales como metil ribósido. Uno o más enlaces fosfodiéster pueden estar sustituidos por grupos enlazantes alternativos. Estos grupos enlazantes alternativos incluyen, aunque no de forma limitativa, realizaciones en las que el fosfato está sustituido por P(O)S("tioato"), P(S)S ("ditioato"), "(O)NR2 ("amidato"), P(O)R, P(O)OR’, CO

o CH2 ("formacetal"), en el que cada R o R' es, de forma independiente H o alquilo sustituido o no sustituido (C 1-20) que contiene opcionalmente un enlace éter (--O--), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No todos los enlaces de un polinucleótido deben ser idénticos. La descripción precedente se aplica a todos los polinucleótidos referidos en el presente documento, incluyendo ARN y ADN.

"Oligonucleótido", como se usa en el presente documento, generalmente se refiere a polinucleótidos cortos, generalmente monocatenarios, generalmente polinucleótidos sintéticos que tienen normalmente, pero no necesariamente, menos de aproximadamente 200 nucleótidos de longitud. Los términos "oligonucleótido" y "polinucleótido" no son mutuamente exclusivos. La descripción anterior de los polinucleótidos es igual y completamente aplicable a los oligonucleótidos.

Una referencia a una secuencia de nucleótidos como se usa en el presente documento abarca su complemento a menos que se especifique otra cosa. Por lo tanto, una referencia a un ácido nucleico que tiene una secuencia concreta debe entenderse que abarca su hebra complementaria, con su secuencia complementaria, a menos que el contexto defina otra cosa.

Una "célula hospedadora" incluye una célula o cultivo de células individuales que puede ser o ha sido un receptor de vector(es) para la incorporación de inserciones de polinucleótidos. Las células hospedadoras incluyen la progenie de una única célula hospedadora, y la progenie puede no se de forma necesaria completamente idéntica (en morfología o en el complemento del ADN genómico) a la célula precursora original debido a una mutación natural, accidental, o deliberada. Una célula hospedadora incluye células transfectadas in vivo con polinucleótido(s) de la presente invención.

Un "individuo" o un "sujeto" es un mamífero, más preferentemente, un ser humano. Los mamíferos incluyen también, aunque no de forma limitativa, animales de granja, animales de competición, mascotas, primates, caballos, perros, gatos, ratones y ratas.

Como se usa en el presente documento, "transportador farmacéuticamente aceptable" o "excipiente farmacéuticamente aceptable" incluye cualquier material que, cuando se combina con un principio activo, permite al principio retener la actividad biológica y no reacciona con el sistema inmunitario del sujeto. Los ejemplos incluyen, aunque no de forma limitativa, cualquiera de los transportadores farmacéuticos convencionales tales como una solución salina tamponada con fosfato, agua, emulsiones tales como una emulsión de aceite/agua, y diversos tipos de agentes humectantes. Los diluyentes preferidos para administración en aerosol o parenteral so solución salina tamponada con fosfato (PBS) o solución salina normal (0,9%). Las composiciones que comprenden dichos transportadores se formulan mediante procedimientos convencionales bien conocidos (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª edición, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; y Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21ª Ed. Mack Publishing, 2005).

Tal como se utiliza en la técnica, "Receptor de Fc" y "FcR" describe un receptor que se une a la región Fc de un

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anticuerpo. El FcR preferido es una secuencia natural de la FcR humana. Además, un FcR preferido es uno que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII, y FcyRIII, incluyendo las variantes alélicas y las formas de corte y empalme alternativas de estos receptores. Los receptores de FcyRII incluyen FcyRIlA (un "receptor de activación") y FcyRIIB (un "receptor de inhibición"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplásmicos de las mismas. Los FcR se revisaron en Ravetch y Kinet, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92, 1991; Capel y col., Immunomethods, 4:25-34, 1994; y de Haas y col., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41, 1995. "FcR" incluye también el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de las IgG de la madre al feto (Guyer y col., J. Immunol., 117:587, 1976; y Kim y col., J. Immunol., 24:249, 1994).

Una "región Fc funcional" posee al menos una función efectora de una región Fc de la secuencia natural. Las "funciones efectoras" ilustrativas incluyen la unión a C1q; citotoxicidad dependiente del complemento; unión al receptor Fc; citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo; fagocitosis; regulación por defecto de receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B), etc. Dichas funciones efectoras requieren generalmente que la región Fc se combine con un dominio de unión (por ejemplo, un dominio variable de anticuerpo) y se puede evaluar utilizando diversos ensayos conocidos en la técnica para evaluar dichas funciones efectoras del anticuerpo.

Las referencias a "aproximadamente" un valor o parámetro en el presente documento incluyen (y describen) realizaciones que se dirigen a esta valor o parámetro per se. Por ejemplo, la descripción que se refiere a "aproximadamente X" incluye la descripción de "X". Los intervalos numéricos son inclusive de los números que definen el intervalo. "Sobre" o "aproximadamente", cuando se usan vinculados a una variable numérica mensurable, se refieren al valor indicado de la variable y a todos los valores de la variable que están comprendidos en el erro experimental del valor indicado (por ejemplo, en el intervalo de confianza del 95% para la media) o en un 10 por ciento del valor indicado, el que sea mayor.

Se entiende que donde quiera que se describan las realizaciones en el presente documento con la terminología "que comprende", se proporcionan también por lo demás realizaciones análogas descritas en términos de "consiste de" y/o "consiste esencialmente de".

Cuando aspectos o realizaciones de la invención se describen en términos de un grupo Markush u otra agrupación de alternativas, la presente invención abarca no solo el grupo completo relacionado como un completo, sino cada miembro del grupo individualmente y todos los posibles subgrupos del grupo principal, pero también el grupo en el que están ausentes uno o más de los miembros del grupo. La presente invención también prevé la exclusión explícita de uno o más de cualquiera de los miembros del grupo en la invención reivindicada.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente una persona normalmente experta en la técnica a la cual pertenece la presente invención. Se describen en el presente documento procedimientos y materiales ilustrativos, Aunque se pueden usar procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o el ensayo de la presente invención. Todas las publicaciones y otras referencias mencionadas en el presente documento se incorporan por referencia en su totalidad. En caso de conflicto, la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones, establecerá el control. Aunque se citan numerosos documento en el presente documento, esta cita no constituye un reconocimiento de que alguno de estos documentos forme parte del conocimiento general común de la técnica. A lo largo de la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones, la palabra "comprende", o variaciones tales como "comprenden" o "que comprende" se entenderá que implican la inclusión de un número entero o grupo de números enteros indicados pero no la exclusión de cualquier otro entero o grupo de enteros. a menos que se requiere lo contrario por contexto, los términos en singular incluyen pluralidades y los términos en plural incluyen el singular.

Se describen en el presente documento procedimientos y materiales ilustrativos, Aunque se pueden usar procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o el ensayo de la presente invención. Los materiales, procedimientos, y ejemplos son solo ilustrativos y no se pretende que sean limitantes.

POLIPÉPTIDOS MONOMÉRICOS QUE CONTIENEN Fc

La memoria descriptiva desvela un polipéptido monomérico que contiene Fc que comprende un dominio CH2 de IgG y un dominio CH3 de IgG, en el que el dominio CH3 comprende uno o más sitio(s) de glicosilación unidos a N diseñados mediante ingeniería genética en la interfase de dimerización CH3-CH3, en el que el sitio de glicosilación unido a N diseñado mediante ingeniería genética comprende al menos una modificación de aminoácido para proporcionar la secuencia consenso de Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, en la que X es cualquier aminoácido excepto Pro.

Cualquier aminoácido excepto Pro, como se usa en el presente documento, incluye un resto de aminoácido que se produce naturalmente tal como Met, Ala, Val, Leu, Ile, Cys, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, Gly, Trp, Tyr, Phe, e His. En algunos aspectos, X es cualquier aminoácido excepto prolina o cisteína. En algunos aspectos, X se selecciona entre el grupo que consiste en G, A, I, L, V, M, F, W, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, y H. En algunos

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aspectos, X se selecciona entre el grupo que consiste en G, A, I, L, V, M, F, W, S, T, Y, N, Q, D, E, K, R, y H. En algunos aspectos, X es G. En algunos aspectos, X es A. En algunos aspectos, X es I. En algunos aspectos, X es L. En algunos aspectos, X es V. En algunos aspectos, X es M. En algunos aspectos, X es F. En algunos aspectos, X es

W. En algunos aspectos, X es S. En algunos aspectos, X es T. En algunos aspectos, X es C. En algunos aspectos, X es Y En algunos aspectos, X es N. En algunos aspectos, X es Q En algunos aspectos, X es D. En algunos aspectos, X es E. En algunos aspectos, X es K. En algunos aspectos, X es R. En algunos aspectos, X es H. Lo anterior se aplica a todas las referencias de X en la memoria descriptiva, salvo cuando se indica expresamente de otra forma o se encuentra técnicamente prohibido.

El procedimiento utilizado para determinar dónde incorporar sitios de glicosilación unidos a N (Asn-X-Ser o Asn-X-Thr) en la interfase de dimerización CH3-CH3 hidrófoba (véase la Figura 1) se describe en el Ejemplo 1 e incluye los siguiente: 1) identificar los restos localizados en la interfase de dimerización CH3-CH3 basándose en la estructura cristalina (por ejemplo, gamma 1 Fc humana) y calcular el porcentaje de superficie accesible (% de ASA) de cada resto en el dímero Fc y en una cadena del dímero Fc (monómero Fc teórico ya que, según el mejor conocimiento de los inventores, no se ha derivado la estructura monomérica cristalina del Fc antes de la presente invención); 2) evitar la mutagénesis de los restos de aminoácidos que juegan un papel importante en mantener el marco estructural de la proteína (por ejemplo, restos prolina, glicina, y cisteína); 3) incorporar la secuencia consenso de Asn-X-Ser o Asn-X-Thr a los restos de aminoácidos identificados en la interfase de dimerización CH3-CH3, en la que X es cualquier aminoácido excepto Pro; y 4) inspeccionar manualmente los restos de aminoácidos cartografiados en la estructura tridimensional de una cadena del dominio Fc, y eliminar las posiciones donde el sitio de glicosilación unido a N diseñado mediante ingeniería genética pueda tener poco impacto para separar la interfase CH3-CH3 (por ejemplo, Leu256 y 276Asp).

La memoria descriptiva desvela modificaciones de aminoácidos en la interfase de dimerización CH3-CH3 seleccionada entre el grupo que consiste en Q347N-X-Y349T, Q347N-X-Y349S, Y349N-X-L351T, Y349N-X-L351S, L351N-X-P353T, L351N-X-P353S, S354N-X-D356T, S354N-X-D356S, D356N-X-L358T, D356N-X-L358S, E357N-X-T359S, K360N-X-Q362T, K360N-X-Q362S, S364N-X-T366S, L368N-X-K370T, L368N-X-K370S, K370N-X-F372T, K370N-X-F372S, K392N-X-T394S, V397N-X-D399T, V397N-X-D399S, S400N-X-G402T, S400N-X-G402S, D401N-X-S403T, F405N-X-Y407T, F405N-X-Y407S, Y407N-X-K409T, Y407N-X-K409S, K409N-X-T411S, K439N-X-L441T, K439N-X-L441S, S444N-X-G446T y S444N-X-G446S, en la que X es cualquier aminoácido excepto Pro.

En algunas realizaciones, las modificaciones de aminoácidos en la interfase de dimerización CH3-CH3 se seleccionan entre el grupo que consiste en S364N-X-T366S, L368N-X-K370T, L368N-X-K370S, F405N-X-Y407T, F405N-X-Y407S, Y407N-X-K409T y Y407N-X-K409S. En algunas realizaciones, la modificación del aminoácido en la interfase de dimerización CH3-CH3 es S364N-X-T366S, Y407N-X-K409T o Y407N-X-K409S.

En algunas realizaciones, la región CH3 es una región CH3 de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En algunas realizaciones, la región CH3 comprende una región CH3 de IgG humana (por ejemplo, la región CH3 y/o CH2 de IgG1, IgG2, IgG3, o IgG4 humana). Los ejemplos del polipéptido monomérico que contiene Fc que se describen en el presente documento se proporcionan en las SEQ ID NOS: 17-52.

En otro aspecto, la invención proporciona también un polipéptido monomérico que contiene Fc que comprende un dominio CH2 de IgG y un dominio CH3 de IgG, en el que el dominio CH3 comprende dos sitios de glicosilación unidos a N diseñados mediante ingeniería genética en la interfase de dimerización CH3-CH3, en el que el sitio de glicosilación unido a N diseñado mediante ingeniería genética comprende una o más modificaciones de aminoácidos que tienen una secuencia consenso de Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, y en el que X es cualquier aminoácido excepto Pro.

Por consiguiente, en algunas realizaciones, las modificaciones de aminoácidos en la interfase de dimerización CH3-CH3 se seleccionan entre el grupo que consiste en a) S364N Y407N-X-K409T; b) S364N-X-T366S e Y407N-X-K409T; c) S364N e Y407N-X-K409S; y d) S364N-X-T366S y Y407N-X-K409S. Los polipéptidos monoméricos que contienen Fc ilustrativos de la invención comprenden dos sitios de glicosilación unidos a N diseñados mediante ingeniería genética se proporcionan en las SEQ ID NOS: 53-58.

En otro aspecto, la invención comprende además uno o más sitios de glicosilación unidos a N diseñados mediante ingeniería genética en la interfase CH2-CH2, en el que el sitio de glicosilación unido a N diseñado mediante ingeniería genética comprende una o más modificaciones de aminoácidos que tienen una secuencia consenso de Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, y en el que X es cualquier aminoácido excepto Pro. En algunas realizaciones, la modificación del aminoácido en el dominio CH2 se selecciona entre el grupo que consiste en S239N-X-F241S, S239N-X-F241T, F241N-X-F243T, F241N-X-F243S, E258N, E258N-X-T260S, T260N-X-V262T, T260N-X-V262S, V262N-X-V264S, V262N-X-V264T, K288T, K288S, K288N-K290T, K288N-K290S, V305N y V305-X-T307S. En otras realizaciones, la modificación del aminoácido en el dominio CH2 se selecciona entre el grupo que consiste en E258N, E258N-X-T260S, T260N-X-V262T, T260N-X-V262S, K288T, K288S, V305N y V305-X-T307S. Los ejemplos del polipéptido monomérico que contiene Fc que comprende los sitios de glicosilación unidos a N diseñados mediante ingeniería genética en la interfase de dimerización CH3-CH3 y la interfase CH2-CH2 se proporcionan en las SEQ ID NOS: 59-66.

En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido monomérico que contiene Fc que comprende al menos un

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sitio de glicosilación unido a N diseñado mediante ingeniería genética, en el que el sitio de glicosilación unido a N diseñado mediante ingeniería genética comprende al menos una modificación de aminoácido seleccionada entre el grupo que consiste en E258N-X-T260S, T260N-X-V262T, T260N-X-V262S, V305N, V305N-X-T307S, Q347N-X-Y349T, Q347N-X-Y349S, S364N-X-T366S, T366N-X-L368T, T366N-X-L368S, L368N-X-K370T, L368N-X-K370S, D401N, D401N-X-S403T, F405N-X-Y407T, F405N-X-Y407S, Y407N-X-K409T, Y407N-X-K409S y K409N-X-T411S, en la que X es cualquier aminoácido excepto Pro.

En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido que comprende al menos dos polipéptidos monoméricos que contienen Fc unidos de manera recombinante como se describe en el presente documento, en el que cada polipéptido que contiene Fc tiene el mismo, o diferentes sitios de gicosilación unidos a N diseñados mediante ingeniería genética en la interfase de dimerización CH3-CH3 o tanto en la interfase de dimerización CH3-CH3 y la interfase CH2-CH2.

Cada polipéptido monomérico que contiene Fc se puede unir de manera recombinante a otro polipéptido monomérico que contiene Fc directamente mediante un enlace en el extremo carboxilo-amino (C-N) o indirectamente mediante un enlazador o un separador. En algunas realizaciones, un enlazador o un separador puede ser un péptido de unión corto. Un ejemplo de un péptido de unión es (GGGGS)n (SEQ ID NO: 89), en el que n puede ser cualquiera de 1-20, 1-15, 1-10, o 1-5. Por ejemplo, n puede ser cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20. Se han diseñado y usado otros ejemplos de enlazadores o separadores (Bird y col., Science 242:423-426 (1988)). Los enlazadores o separadores son polipéptidos cortos, flexibles, y comprenden preferentemente menos de aproximadamente 20 restos de aminoácidos. Los enlazadores o separadores pueden, a su vez, modificarse para funciones adicionales, tales como la unión de fármacos o la unión a soportes adicionales.

Por consiguiente, en algunas realizaciones, la invención proporciona un polipéptido que comprende al menos dos polipéptidos monoméricos que contienen Fc unidos de manera recombinante, en el que cada polipéptido que contiene Fc comprende los mismos sitios de glicosilación unidos a N diseñados de manera recombinante en la interfase de dimerización CH3-CH3, y en el que cada polipéptido que contiene Fc está unido de manera recombinante mediante un enlazador. En algunas realizaciones, cada polipéptido que contiene Fc comprende los sitios de glicosilación S364N e Y407N-X-K409T unidos a N diseñados mediante ingeniería genética, en los que X es cualquier aminoácido excepto Pro (por ejemplo, Leu y Ser). En otras realizaciones, cada polipéptido que contiene Fc comprende los sitios de glicosilación S364N-X-T366S y Y407N-X-K409T unidos a N diseñados mediante ingeniería genética. En algunas realizaciones, el enlazador es GGGGS (SEQ ID NO: 89), GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 90), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 91), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 92), o GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 93). Los ejemplos del polipéptido que comprende al menos dos polipéptidos monoméricos idénticos que contienen Fc unidos de manera recombinante que se describen en el presente documento se proporcionan en las SEQ ID NOS: 79-88.

En otras realizaciones, la invención proporciona un polipéptido que comprende al menos dos polipéptidos monoméricos que contienen Fc unidos de manera recombinante, en el que cada polipéptido que contiene Fc comprende diferentes sitios de glicosilación unidos a N diseñados mediante ingeniería genética en la interfase de dimerización CH3-CH3, y en el que cada polipéptido que contiene Fc está unido de manera recombinante mediante un enlazador. En algunas realizaciones, el primer polipéptido que contiene Fc comprende los sitios de glicosilación S364N e Y407N-X-K409T unidos a N, diseñados mediante ingeniería genética y el segundo polipéptido que contiene Fc comprende los sitios de glicosilación S364N-X-T366S e Y407N-X-K409T unidos a N, diseñados mediante ingeniería genética en los que X es cualquier aminoácido excepto Pro (por ejemplo, Leu y Ser). En algunas realizaciones, el enlazador es GGGGS (SEQ ID NO: 89), GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 90), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 91), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 92), o GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 93).

En otra realización, la invención proporciona un polipéptido que comprende al menos dos polipéptidos monoméricos que contienen Fc unidos de manera recombinante, en el que cada polipéptido que contiene Fc comprende los mismos sitios de glicosilación unidos a N diseñados mediante ingeniería genética en la interfase de dimerización CH3-CH3, y en el que cada polipéptido que contiene Fc está unido de manera recombinante directamente mediante el extremo C-N. Por consiguiente, en algunas realizaciones, cada polipéptido que contiene Fc comprende los sitios de glicosilación S364N e Y407N-X-K409T unidos a N diseñados mediante ingeniería genética (véanse, por ejemplo, las SEQ ID NOS: 77-78) o S364N-X-T366S y Y407N-X-K409T. En algunas realizaciones, el primer polipéptido que contiene Fc comprende los sitios de glicosilación S364N y Y407N-X-K409T unidos a N, diseñados mediante ingeniería genética y el segundo polipéptido que contiene Fc comprende los sitios de glicosilación S364N-X-T366S e Y407N-X-K409T unidos a N, diseñados mediante ingeniería genética.

El polipéptido que comprende dos polipéptidos monoméricos que contienen Fc unidos de manera recombinante que se describe en el presente documento se une a FcRn con alta afinidad, similar a la de IgG natural que no comprende un sitio de glicosilación unido a N diseñado mediante ingeniería genética. Véase el Ejemplo 5. Dicho polipéptido que se describe en el presente documento se une también estrechamente a FcRn a pH ácido, se disocia de FcRn eficazmente a pH neutro, y muestra al menos una semivida en suero 2 veces más larga que la del polipéptido monomérico que comprende un Fc diseñado mediante ingeniería genética. Véanse, por ejemplo, los Ejemplos 5-6. Por consiguiente, en algunas realizaciones, el polipéptido que comprende al menos dos polipéptidos monoméricos

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que contienen Fc unidos de manera recombinante como se describe en el presente documento tiene una semivida en suero de al menos aproximadamente cualquiera de 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, y 9 veces más prolongada que la de la semivida en suero presentada por el polipéptido que comprende un polipéptido monomérico que contiene Fc que comprende dos sitios de glicosilación unidos a N diseñados mediante ingeniería genética.

Cualquier molécula que comprende un dominio Fc puede comprender un polipéptido monomérico que contiene Fc de la invención. Por ejemplo, el polipéptido monomérico que contiene Fc puede unirse, conjugarse, o fusionarse a, por ejemplo, un Fab o una secuencia del polipéptido heterólogo (por ejemplo, una proteína de fusión de Fc). Por consiguiente, en algunas realizaciones, un Fab se fusiona al polipéptido monomérico que contiene Fc que comprende uno o más sitios de glicosilación unidos a N diseñados mediante ingeniería genética en la interfase de dimerización CH3-CH3 o en la interfase CH2-CH2 y en la interfase de dimerización CH3-CH3. Véanse, por ejemplo, los Ejemplos 5 y 6. En otras realizaciones, un Fab se fusiona al polipéptido que comprende al menos dos polipéptidos monoméricos que contienen Fc unidos de manera recombinante como se describe en el presente documento. Véanse, por ejemplo, los Ejemplos 5 y 6.

En otras realizaciones, el polipéptido monomérico que contiene Fc puede modificarse o derivatizarse, tal como realizando una fusión de anticuerpo o inmunoadhesina que comprende todo o una parte del polipéptido monomérico que contiene Fc unido a otro polipéptido o agente molecular. Los polipéptidos monoméricos que contienen Fc que se describen en el presente documento pueden modificarse o derivatizarse, por ejemplo, para extender las semividas in vivo adicionalmente, produciendo moléculas de fusión más estables y/o mediante tratamiento con polímeros biocompatibles tales como polietilenglicol (PEG), denominado comúnmente "pegilación", o mediante cualquiera de numerosos procedimiento de ingeniería genética diferentes bien conocidos en la materia.

La proteína de fusión monomérica que contiene Fc puede derivatizarse con un grupo químico, incluyendo, aunque no de forma limitativa, polietilenglicol (PEG), un grupo metilo o etilo, un éster, un grupo de hidrato de carbono y similares, utilizando técnicas bien conocidas. Estos grupos químicos (y otros similares a ellos que se han usado para la estabilidad de los compuestos terapéuticos in vivo) son útiles para mejorar las características biológicas del polipéptido monomérico que contiene Fc, por ejemplo, para aumentar la semivida en suero y la bioactividad.

La proteína de fusión monomérica que contiene Fc puede también marcarse utilizando cualquiera de una multitud de procedimientos conocidos en la materia. Como se usa en el presente documento, los términos "marca" o "marcado" se refieren a la incorporación de otra molécula en el anticuerpo. En una realización, la marca es un marcador detectable, por ejemplo, la incorporación de un aminoácido radiomarcado o la unión a un polipéptido de restos biotinilo que se pueden detectar mediante la avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o la actividad enzimática que se puede detectar mediante procedimientos ópticos o colorimétricos). En otra realización, la marca o el marcador puede ser terapéutico, por ejemplo, un conjugado de fármaco o toxina. Se conocen en la técnica diversos procedimientos de marcado de polipéptidos y glicoproteínas y se pueden usar. Los ejemplos de marcas para polipéptidos, aunque no de forma limitativa: radioisótopos o radionucleidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 1251, 1311), marcas fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos basados en lantánidos), marcas enzimáticas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, β-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), marcadores quimioluminiscentes, grupos biotinilo, epítopos de polipéptidos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (por ejemplo, secuencias de pares de cremalleras de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, etiquetas de epítopos), agentes magnéticos, tales como quelatos de gadolinio, toxinas tales como toxina pertussis, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracindiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propanolol, y puromicina y análogos u homólogos de los mismos. En algunas realizaciones, las marcas se unen mediante brazos separadores de diversas longitudes para reducir el impedimento estérico potencial.

En otro aspecto de la invención, los polipéptidos monoméricos que contienen Fc que se describen en el presente documento pueden desinmunizarse para reducir la inmunogenicidad tras la administración a un sujeto utilizando técnicas conocidas tales como las descritas, por ejemplo, en la publicación PCT WO98/52976 y WO00/34317.

En otro aspecto de la invención, el polipéptido monomérico que contiene Fc puede comprender mutaciones y/o modificaciones adicionales para alterar las características (por ejemplo, PK, inmunogenicidad, agregación, o semivida en suero) del polipéptido. Por ejemplo, el polipéptido monomérico que contiene Fc que se describe en el presente documento puede comprender adicionalmente una leucina en la posición 428 y una serina en la posición

434. Véanse, por ejemplo, patente de Estados Unidos n.º 8.088.376.

ÁCIDOS NUCLEICOS, VECTORES Y CÉLULAS

La presente invención abarca también moléculas y secuencias de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos monoméricos que contienen Fc que se describen en el presente documento. En algunas realizaciones, las diferentes moléculas de ácidos nucleicos codifican una o más de o partes de los polipéptidos monoméricos que contienen Fc, como se describe en el presente documento. En otras realizaciones, la misma molécula de ácido nucleico codifica

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La expresión "secuencia control de la expresión", como se usa en el presente documento, significa secuencias de polinucleótidos que son necesarias para efectuar la expresión y el procesamiento de secuencias de codificación a las cuales están ligadas. Las secuencias control de la expresión incluyen un inicio de la transcripción adecuado, la terminación, las secuencias promotoras y potenciadoras; señales de procesamiento del ARN eficaces tales como las señales de corte y empalme y de poliadenilación; secuencias que estabilizan el ARNm citoplasmático; secuencias que potencian la eficacia de la traducción (es decir, la secuencia consenso de Kozak); secuencias que potencian la estabilidad de la proteína; y cuando se desea, secuencias que potencian la secreción de la proteína. la naturaleza de dichas secuencias control difiere dependiendo del organismo hospedador; en procariotas, dichas secuencias control incluyen generalmente un promotor, un sitio de unión a ribosoma, y una secuencia de terminación de la transcripción; en eucariotas, en general, dichas secuencias control incluyen promotores y secuencias de terminación de la transcripción. Se pretende que la expresión "secuencias control" incluya, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresión y procesamiento, y puede incluir también componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias de ligandos.

PROCEDIMIENTO PARA PRODUCIR POLIPÉPTIDOS MONOMÉRICOS QUE CONTIENEN Fc

En un aspecto, la presente invención proporciona procedimientos para producir un polipéptido monomérico que contiene Fc que comprende un dominio CH2 de IgG y un dominio CH3 de IgG, en el que el dominio CH3 comprende uno o más sitios de glicosilación unidos a N diseñados mediante ingeniería genética en la interfase de dimerización CH3-CH3, en el que el sitio de glicosilación unido a N diseñado mediante ingeniería genética se selecciona entre el grupo que consiste en a) S364N e Y407N-X-K409T; b) S364N-X-T366S e Y407N-X-K409T; c) S364N e Y407N-X-K409S; y d) S364N-X-T366S e Y407N-X-K409S, en la que X es cualquier aminoácido excepto Pro.

En algunas realizaciones, se proporciona un procedimiento de producir un polipéptido monomérico que contiene Fc que comprende las etapas de: a) cultivar una célula hospedadora que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido monomérico que contiene Fc que comprende un dominio CH2 de IgG y un dominio CH3 de IgG, en el que el dominio CH3 comprende uno o más sitios de glicosilación unidos a N diseñados mediante ingeniería genética en la interfase de dimerización CH3-CH3, en el que el sitio de glicosilación unido a N diseñado mediante ingeniería genética se selecciona entre el grupo que consiste en a) S364N e Y407N-X-K409T; b) S364N-X-T366S e Y407N-X-K409T; c) S364N e Y407N-X-K409S; y d) S364N-X-T366S e Y407N-X-K409S, en el que X es cualquier aminoácido excepto Pro; y, opcionalmente, b) recuperar el polipéptido monomérico que contiene Fc procedente del cultivo de la célula hospedadora. La memoria descriptiva desvela un sitio de glicosilación unido a N diseñado mediante ingeniería genética que comprende uno o más (por ejemplo, dos) modificaciones de aminoácidos que tienen una secuencia consenso de Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, y en el que X es cualquier aminoácidos excepto Pro.

La memoria descriptiva desvela un procedimiento de producir un polipéptido que comprende al menos dos polipéptidos monoméricos que contienen Fc unidos de manera recombinante que comprenden las etapas de: a) cultivar una célula hospedadora que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un primer polipéptido monomérico que contiene Fc que comprende un dominio CH2 de IgG y un dominio CH3 de IgG, en el que el dominio CH3 comprende uno o más sitios de glicosilación unidos a N diseñados mediante ingeniería genética en la interfase de dimerización CH3-CH3 o la interfase de dimerización CH3-CH3 y la interfase CH2-CH2, y la misma o una molécula de ácido nucleico diferente que codifica un segundo polipéptido monomérico que contiene Fc que tiene el mismo o diferente(s) sitio(s) de glicosilación unidos a N diseñados mediante ingeniería genética como el primer polipéptido que contiene Fc, en el que la célula hospedadora cultivada expresa en primer y el segundo polipéptido monomérico que contiene Fc; y b) recuperar el polipéptido. En algunas realizaciones, el sitio de glicosilación unido a N diseñado mediante ingeniería genética comprende una o más (por ejemplo, dos) modificaciones de aminoácidos que tienen una secuencia consenso de Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, y en la que X es cualquier aminoácido excepto Pro. La memoria descriptiva desvela, el primer y el segundo polipéptido monomérico que contiene Fc está unido de manera recombinante mediante un enlace en el extremo C-N o mediante un enlazador que utiliza los enlazadores que se divulgan en el presente documento.

La memoria descriptiva desvela un procedimiento de producir un polipéptido que comprende al menos dos polipéptidos monoméricos que contienen Fc unidos de manera recombinante que comprenden las etapas de: a) expresar un primer polipéptido monomérico que contiene Fc que comprende un dominio CH2 de IgG y un dominio CH3 de IgG, en el que el dominio CH3 comprende uno o más sitios de gicosilación unidos a N diseñados mediante ingeniería genética en la interfase de dimerización CH3-CH3 o la interfase de dimerización CH3-CH3 y la interfase CH2-CH2 en una primera célula hospedadora; b) expresar un segundo polipéptido monomérico que contiene Fc que tiene el mismo o diferente(s) sitio(s) de glicosilación unidos a N diseñados mediante ingeniería genética como el primer polipéptido monomérico que contiene Fc en una segunda célula hospedadora; c) aislar el primer polipéptido monomérico que contiene Fc de la etapa a)y el segundo polipéptido monomérico que contiene Fc de la etapa b); y

(d) incubar los dos polipéptidos monoméricos que contienen Fc de la etapa c) en una condición adecuada para la formación del polipéptido (por ejemplo, un polipéptido que comprende al menos dos polipéptidos monoméricos que contienen Fc unidos de manera recombinante). La memoria descriptiva desvela, el sitio de glicosilación unido a N diseñado mediante ingeniería genética comprende una o más (por ejemplo, dos) modificaciones de aminoácidos que tienen una secuencia consenso de Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, y en la que X es cualquier aminoácido excepto Pro. En algunas realizaciones, los dos polipéptidos monoméricos que contienen Fc de la etapa c) se incuban en presencia de enlazadores (por ejemplo, (GGGGS)n (SEQ ID NO: 89), en el que n es 1-10) como se desvela en el presente

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El polipéptido monomérico que contiene Fc o el polipéptido que comprende al menos dos polipéptidos monoméricos que contienen Fc unidos de manera recombinante como se describe en el presente documento pueden administrarse solo o en combinación con uno o más polipéptidos diferentes de la invención o en combinación con uno o más fármacos diferentes (o como cualquier combinación de los mismos). Las composiciones, procedimientos y usos farmacéuticos de la invención abarcan también por tanto realizaciones de combinaciones (coadministración) con otros principios activos, como se detalla a continuación.

Como se usa en el presente documento, las expresiones "coadministración", "coadministrarse" y "en combinación con", en referencia a los fragmentos de anticuerpos monoméricos de la invención y uno o más agentes terapéuticos diferentes, se pretende que signifiquen, y se refieran a e incluyan los siguiente: (i) administración simultánea de dicha combinación de un polipéptido monomérico que contiene Fc o un polipéptido que comprende al menos dos polipéptidos monoméricos que contienen Fc unidos de manera recombinante como se describe en el presente documento y agente(s) terapéuticos a un paciente que necesita tratamiento, cuando dichos componentes se formulan juntos en una forma de dosificación unitaria que libera dichos componentes prácticamente en el mismo momento a dicho paciente; (ii) administración sustancialmente simultánea de dicha combinación de un polipéptido monomérico que contiene Fc o un polipéptido que comprende al menos dos polipéptidos monoméricos que contienen Fc unidos de manera recombinante, como se describe en el presente documento y agente(s) terapéuticos a un paciente que necesita tratamiento, cuando dichos componentes se formulan por separado uno respecto del otro en formas de dosificación separadas que se toman prácticamente en el mismo momento por dicho paciente, después de los cual, dichos componentes se liberan prácticamente en el mismo momento a dicho paciente; (iii) administración secuencial de dicha combinación de un polipéptido monomérico que contiene Fc o un polipéptido que comprende al menos dos polipéptidos monoméricos que contienen Fc unidos de manera recombinante como se describe en el presente documento y agente(s) terapéuticos a un paciente que necesita tratamiento, cuando dichos componentes se formulan por separado entre sí en formas de dosificación separadas que se toman prácticamente en momentos consecutivos por dicho paciente con un intervalo de tiempo significativo entre cada administración, después de lo cual, dichos componentes se liberan prácticamente en el mismo momento a dicho paciente; y (iv) administración secuencial de dicha combinación de polipéptido monomérico que contiene Fc o un polipéptido que comprende al menos dos polipéptidos monoméricos que contienen Fc unidos de manera recombinante, como se describe en el presente documento y agente(s) terapéuticos a un paciente que necesita tratamiento, cuando dichos componentes se formulan juntos en una forma de dosificación unitaria que libera dichos componentes de una manera controlada, después de lo cual se liberan de forma concurrente, consecutiva, y/ solapada en el mismo y/o diferentes momentos a dicho paciente, donde cada parte puede administrarse mediante cualquiera de la misma o una ruta diferente.

Generalmente, el polipéptido monomérico que contiene Fc o el polipéptido que comprende al menos dos polipéptidos monoméricos que contienen Fc unidos de manera recombinante como se describe en el presente documento son adecuados para administrarse como una formulación en asociación con uno o más excipiente(s) farmacéuticamente aceptables. El término "excipiente" se usa en el presente documento para describir cualquier ingrediente distinto a los compuesto(s) de la invención. La elección del(de los) excipiente(s) dependerá en gran medida de factores tales como el modo particular de administración, el efecto del excipiente sobre la solubilidad y la estabilidad y la naturaleza de la forma de dosificación. Como se usa en el presente documento, un "excipiente farmacéuticamente aceptable" incluye a cualquiera y a todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción y similares, que sean fisiológicamente compatibles. Algunos ejemplos de excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol, y similares, así como combinaciones de los mismos. En muchos casos, será preferente incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro sódico en la composición. Los ejemplos adicionales de sustancias farmacéuticamente aceptables son agentes humectantes o cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que mejoran la vida útil o la efectividad del anticuerpo.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención y los procedimientos para su preparación serán fácilmente evidentes para los expertos en la materia. Tales composiciones y procedimientos para su preparación pueden encontrarse, por ejemplo, en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 21ª Edición (Mack Publishing Company, 2005). Las composiciones farmacéuticas se fabrican preferentemente en condiciones GMP.

Se puede preparar una composición farmacéutica de la invención, envasarse, o comercializarse a granel, como una dosis unitaria única, o como una pluralidad de dosis unitarias únicas. Como se usa en el presente documento, una "dosis unitaria" es una cantidad específica de la composición que comprende una cantidad predeterminada del principio activo. La cantidad del principio activo es generalmente igual a la dosificación del principio activo que se administraría a un sujeto o una fracción conveniente de dicha dosificación tal como, por ejemplo, una mitad o un tercio de dicha dosificación. Cualquier procedimiento para administrar péptidos, proteínas o anticuerpos aceptado en la técnica puede emplearse de forma adecuada para los polipéptidos monoméricos que contienen Fc descritos en el presente documento.

Las composiciones farmacéuticas de la invención son normalmente adecuadas para la administración parenteral. Como se usa en el presente documento, la "administración parenteral" de una composición farmacéutica incluye

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Por lo tanto, el experto en la materia apreciará, basándose en la divulgación proporcionada en el presente documento, que la dosis y el régimen de dosificación se ajusta de acuerdo con los procedimientos bien conocidos en las técnicas terapéuticas. Es decir, la dosis máxima tolerada se puede establecer fácilmente, y también se puede determinar la cantidad eficaz que proporciona un beneficio terapéutico detectable a un paciente, como también se pueden determinar los requisitos temporales para administrar cada agente para proporcionar un beneficio terapéutico detectable al paciente. Por consiguiente, aunque determinadas dosis y regímenes de administración se ejemplifican en el presente documento, estos ejemplos de ningún modo limitan la dosis y el régimen de administración que se puede proporcionar a un paciente en la práctica de la presente invención.

Cabe destacar que los valores de dosificación pueden variar con el tipo y la gravedad de la afección a aliviar, y pueden incluir dosis únicas o múltiples. Debe entenderse además que para cualquier sujeto particular, los regímenes de dosificación específicos se deberían ajustar con el tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el criterio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que los intervalos de dosificación establecidos en el presente documento son solo ilustrativos y no pretenden limitar el ámbito o la práctica de la composición reivindicada. Además, el régimen de dosificación con las composiciones de la presente invención pueden basarse en una variedad de factores, incluyendo el tipo de enfermedad, la edad, el peso, el sexo, la afección médica del paciente, la gravedad de la dolencia, la ruta de administración, y el anticuerpo concreto empleado. Por lo tanto, el régimen de dosificación puede variar ampliamente, pero puede determinarse rutinariamente usando procedimientos estándar. Por ejemplo, las dosis se pueden ajustar en función de parámetros farmacocinéticos o farmacodinámicos, que pueden incluir efectos clínicos tales como efectos tóxicos y/o valores de laboratorio. Por lo tanto, la presente invención abarca el aumento gradual de dosis intra-paciente según determine el experto. La determinación de dosificaciones y regímenes adecuados son bien conocidas en la técnica pertinente y el técnico experto entendería que están abarcadas una vez se proporcionen las enseñanzas desveladas en el presente documento.

Para su administración a sujetos humanos, la dosis mensual total de un polipéptido monomérico que contiene Fc o un polipéptido que comprende al menos dos polipéptidos monoméricos que contienen Fc unidos de manera recombinante como se describe en el presente documento está normalmente en el intervalo de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 1500 mg por paciente, dependiendo, por supuesto, del modo de administración. Por ejemplo, una dosis mensual intravenosa puede requerir aproximadamente 1 a aproximadamente 1000 mg/paciente. La dosis mensual total puede administrarse en dosis únicas o divididas y puede, a juicio del médico, caer fuera del intervalo típico proporcionado en el presente documento.

Un intervalo no limitante ilustrativo para una cantidad terapéutica o profiláctica eficaz de un polipéptido monomérico que contiene Fc o un polipéptido que comprende al menos dos polipéptidos monoméricos que contienen Fc unidos de manera recombinante, como se describe en el presente documento, es aproximadamente 1 a aproximadamente 1000 mg/paciente/mes. En determinadas realizaciones, el polipéptido monomérico que contiene Fc o un polipéptido que comprende el mismo puede administrarse de aproximadamente 1 a aproximadamente 200 o de aproximadamente 1 a aproximadamente 150 mg/paciente/mes.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos describen la generación y caracterización de polipéptidos monoméricos que contienen Fc que comprenden uno o más sitios de glicosilación unidos a N diseñados mediante ingeniería genética en la interfase de dimerización CH3-CH3 o la interfase de dimerización CH3-CH3 y la interfase CH2-CH2. Se proporciona también la generación y caracterización de polipéptidos que comprenden al menos dos polipéptidos monoméricos que contienen Fc unidos de manera recombinante. Se entiende que los ejemplos proporcionados a continuación ilustran los procedimientos y materiales de la presente invención.

Ejemplo 1: Monomerización de un Fc por otra parte dimérico mediante la incorporación de sitios de Nglicosilación en la interfase CH3-CH3

Se usó una estrategia de diseño de glicoingeniería para diseñar mediante ingeniería genética una forma monomérica estable de un dominio FC de un anticuerpo. De manera más específica, se introdujeron restos de hidratos de carbono voluminosos e hidrófilos en la interfase CH3-CH3, que separaron la forma dimérica de Fc en una forma monomérica. De forma sorprendente, esta glicoingeniería estabilizó también la interfase expuesta del dominio CH3. Se emplearon cuatro criterios para determinar cuando incorporar los sitios de mutación por N-glicosilación (para proporcionar la secuencia de señalización de la glicosilación unida a N convencional de Asn-X-Ser/Thr). En primer lugar, se identificaron los restos localizados sobre la interfase de CH3-CH3, con el fin de evitar la selección de los restos soterrados en el núcleo del dominio Ig o los restos expuestos al disolvente (Figura 1). Se usó la estructura cristalina de gamma 1 Fc humano (PDB ID:1HZH) para calcular el porcentaje de superficie accesible (% de ASA) de cada resto en el dímero Fc (forma natural) y en una cadena de un dímero Fc (es decir, un monómero de Fc hipotético) con el programa MOE (Chemical Computing Group). Los restos con un % de ASA mayor (dímero) deberían ser los restos que se exponen al disolvente. Se teorizó que era más probable que los restos con el valor del %de ASA mayor estuvieran expuestos al disolvente o soterrados en la interfase CH3-CH3. Por lo tanto, se determinó el grado de implicación de la interfase sustrayendo el % de ASA del monómero del dímero Fc como ΔASA = % de ASA (monómero) -% de ASA (dímero)) y se seleccionaron 22 restos de interfase cuyos ΔASA eran superiores a un

valor umbral del 10%. Véase la Tabla 1. En segundo lugar, se evitó la mutagénesis de restos de prolina, glicina y cisteína debido a que estos restos juegan generalmente un importante papel en el mantenimiento del marco estructural de una proteína. En tercer lugar, se consideró la probabilidad de ocupancia de la glicosilación. Los restos Asn-X-Ser/Thr-Y se incorporaron a la región donde ningún X (el aminoácido situado entre Asn and Ser/Thr) ni Y (el 5 aminoácido situado a continuación de Ser/Thr) es un resto de prolina, ya que la prolina en estas posiciones inhibe fuertemente la eficacia de la glicosilación. Cuando los restos en la tercera posición (es decir, Ser/Thr) de la secuencia de señalización de la glicosilación unida a N convencional de Asn-X-Ser/Thr deben mutarse, se seleccionó la treonina sobre la serina debido a que se ha mostrado que la treonina en la tercera posición proporciona mayor ocupancia del glicano en el resto asparagina que la serina en la tercera posición. Finalmente, se 10 cartografiaron los restos en la estructura tridimensional de una cadena de un dominio Fc y se inspeccionaron manualmente, y se eliminaron las posiciones donde los hidratos de carbono diseñados mediante ingeniería genética podrían tener poco impacto para separar la interfase CH3-CH3 (Leu256 y Asp276). Por lo tanto, se seleccionaron lógicamente un total de nueve posiciones para la N-glicosilación. Estos restos seleccionados están bien conservados entre todos los isotipos de IgG humana (1, 2, 3 y 4) así como los isotipos de IgG de ratón (2, 2a, 2b y 3) (Figura 2). 15 Se construyeron mutantes de N-glicosilación individuales utilizando el dominio Fc de IgG1 e IgG4 humanas sin la región bisagra (Gly226 to Lys497) como molde. Los ácidos nucleicos que codifican estos péptidos se expresaron transitoriamente en células HEK293. Para evaluar la expresión y la eficacia de la N-glicosilación, el sobrenadante del medio se sometió a SDS-PAGE en condiciones reductoras así como a análisis de transferencia Western. Los niveles de expresión de todos los mutantes fueron similares al dominio Fc natural excepto en que el mutante de la posición 20 366 se expresó mal. Pareció que las variantes N-glicosiladas migraron con la movilidad correspondiendo a un peso molecular de aproximadamente 25 kDa, mientras que las variantes no glicosiladas migraron a aproximadamente 22 kDa. Cinco sitios (364, 366, 368, 405 y 407) mostraron una N-glicosilación eficaz, mientras que cuatro sitios (347, 390, 401, 409) mostraron una incorporación de aproximadamente el 50% o menor de N-glicanos. Como los perfiles de expresión y glicosilación de los mutantes de IgG1 e IgG4 fueron similares, se usaron los mutantes de IgG1 para

25 los estudios adicionales.

Tabla 1: % de ASA

Restos de la interfase

% de ASA (dímero) % de ASA (monómero) n.º de Δ ASA

*Gln347

26,5 41,8 15,4

Tyr349

5,1 41,4 36,3

Leu351

3,8 41,9 38,0

Ser354

13,6 60,2 46,6

Asp356

47,9 74,4 26,5

Glu357

2,8 26,9 24,1

Lys360

42,7 62,9 20,2

*Ser364

3,8 18,5 14,8

*Thr366

0,7 21,2 20,5

*Leu368

1,4 15,2 13,8

Lys370

17,1 37,3 20,0

*Asn390

39,9 55,6 15,7

Lys392

42,8 77,6 34,9

Thr394

2,5 42,7 40,2

Val397

13,6 42,3 28,7

*Asp401

14,0 32,4 18,5

Ser400

56,7 89,2 32,5

*Phe405

0 24,2 24,2

*Tyr407

0 37,3 37,3

*Lys409

1,5 50,5 48,9

(continuación)

Restos de la interfase

% de ASA (dímero) % de ASA (monómero) n.º de Δ ASA

Lys439 Ser434

27,9 56,8 41,3 68,8 13,4 12,0

*Las posiciones seleccionadas para el diseño mediante ingeniería genética de la Nglicosilación.

Ejemplo 2: Caracterización de las variantes de la N-glicosilación

Se seleccionaron cuatro mutantes (posiciones 364, 368, 405 y 407) con N-glicosilación completa para purificación y caracterización adicionales. Estos mutantes de N-glicosilación, denotados como CH23-N364 (Fc-S364N), CH235 N368 (Fc-L368N/K370T), CH23-N405 (Fc-F405N/Y407T) y CH23-N407(Fc-Y407N/K409T), se purificaron como se describe en otra parte en el presente documento, dando como resultado una pureza >95% como se determinó mediante SDS-PAGE. Los rendimientos de la proteína purificada estuvieron en el intervalo de 20 -30 mg por litro de medio. A fin de evaluar los rendimientos relativos de las variantes glicosiladas y no glicosiladas en cada posición, se llevó a cabo un ensayo de electroforesis capilar en gel (CGE) de la proteína purificada con y sin tratamiento de la 10 PNGasa F. Los datos desvelados en el presente documento sugieren que estos cuatro mutantes contienen hasta un 10% de variantes no glicosiladas, lo que es similar al Fc natural (Tabla 2). Se usó una columna de exclusión molecular (SEC) analítica para estimar los pesos moleculares aparentes de las variantes de N-glicosilación. Los pesos moleculares mostraron un peso molecular aparente inferior (25 ~ 30 kDa) que el Fc natural (~ 48 kDa), lo que sugiere que la N-glicosilación incorporada perturbó satisfactoriamente la interfase CH3-CH3 del dímero Fc. Se usó 15 SEC-MALS (cromatografía de exclusión por tamaño-dispersión de luz multiángulo) para llevar a cabo un análisis más riguroso de la distribución de especies oligoméricas de los mutantes N-glicosilados, aunque estos mutantes parecieron ser monoméricos según SEC. La masa molecular determinada mediante la dispersión de la luz sobre la señal del índice de refracción mostró que CH23-N405 era completamente monomérico, sin embargo, se encontró que CH23-N364, CH23-N405 y CH23-N407 eran mezclas de formas monoméricas y diméricas. Se caracterizó

20 adicionalmente la estabilidad térmica de estos cuatro mutantes N-glicosilados mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC). Los termogramas del Fc natural dieron como resultado dos transiciones con las temperaturas de fusión de 72 y 83 °C. Estos valores fueron comparables al valor de 70,8°C y 83,3°C que se ha asignado a la fusión de los dominios CH2 y CH3. Por el contrario, los mutantes N-glicosilados individuales mostraron una única transición con la temperatura de fusión disminuida (Tabla 2).

25 Tabla 2: Sumario de la caracterización biofísica

Mutantes de N-glicosilación

% singlico (%) SEC-MALS Tf (°C) Kd, FcRn (nM)

Fc natural (c/s bisagra)

12 dímero 72/83 280

CH23-N364

6 monómero/dímero 64 340

CH23-N368

9 monómero/dímero 58 460

CH23-N405

7 monómero 62 290

CH23-N407

5 monómero/dímero 63 450

CH23-N364/N368

< 0,5 agregación 53/62 580

CH23-N364/N407

< 0,5 monómero 64 220

CH23-N258/N364/N407

< 0,5 monómero 62 230

CH23-N260/N364/N407

8 monómero 55 260

CH23-N286/N364/N407

< 0,5 monómero 64 520

CH23-N305/N364/N407

10 monómero 57 320

Ejemplo 3: Combinación de múltiples sitios

Para minimizar adicionalmente la parte no glicosilada de cada variante, se introdujeron dos sitios de N-glicosilación en el dominio CH3 mediante mutaciones individuales en la posiciones de 364, 368, 405 y 407, que dieron como resultado un 90% a 95% de ocupancia de la glicosilación. La Figura 3 resalta la alineación especial de la Ser364, 30 Leu368, Phe405 y Tyr407 en la interfase del dominio CH3. Basándose en esta observaciones, se teorizó que los dos

imagen10

5

10

15

20

25

(continuación)

Recogida de datos

α, β, γ (°)

90,0, 90,0, 120,0

Resolución (Å)

50,-1,9 (1,93-1,90)

N.º de reflexiones (total/único)

544,128/26.945

Completitud (%) Redundancia

96,8 (67,3) 4,7 (2,2)

Refinamiento

Resolución (Å)

1,9

Rtrabajo / Rlibre (%)

25,0 / 25,9

N.º de átomos

Proteína

1852

N.º de átomos de hidratos de carbono

187

Agua

74

B-factores promedio

Proteína

48,55

Desviaciones r.m.s.

longitudes de enlace (Å)

0,007

Ángulos de enlace (°)

1,09

Ejemplo 5: Producción y caracterización in vitro de variantes de Fab-CH23:

A fin de elucidar la implicación de FcRn en el tiempo de vida de CH23 en suero, un fragmento Fab derivado de un anticuerpo dirigido contra KJLH se fusionó a CH23 (denominado en el presente documento "Fab-CH23" que se denomina también Fab-CH23-N364/N407 (S364N-L355-T366 y Y407N-S408-K409T (por ejemplo, SEQ ID NO: 71)). El mismo fragmento Fab se fusionó también a la variante de FcRn inactivada genéticamente (FabCH23[H310A/H433A] (por ejemplo, SEQ ID NO: 75)) y a la variante de potenciación de FcRn (FabCH23[M428L/N434S] (por ejemplo, SEQ ID NO: 73)). Una construcción CH23 en tándem (Fab-CH23-CH23 (por ejemplo, SEQ ID NO: 85)) que comprende dos polipéptidos Fc diseñados mediante ingeniería genética se construyó también como un control de formato IgG1 regular (es decir, un anticuerpo dirigido contra KLH) para ensayar la hipótesis de que la avidez puede mejorar la propiedad farmacocinética de CH23 (Figura 5). Todas las construcciones se transfectaron en células CHO, y se purificaron las proteínas mediante cromatografía en columna de proteína G. Como control, se produjo Fab-CH23 producido en un sistema de expresión transitoria de células HEK293 (denominado "Fab-CH23-HEK"). Se investigaron la unión a FcRn de estas construcciones en un formato de unión 1 a 1 ("variante Fc" unida a la superficie de un chip BIAcore y el FcRn soluble flotó sobre la superficie del chip) y un formato de avidez (proteína FcRn de ratón unida a la superficie del chip BIAcore, y cada variante de Fc flotó sobre el chip). En la Tabla 4 se resumen los datos de unión en el equilibrio. La afinidad de unión 1 a 1 tanto de Fab-CH23 como de Fab-CH23-HEK (Tabla 4) era similar a la de CH23-N364/N407 (Tabla 1) sugiriendo que la fusión de Fab no afecta la unión de Fc a FcRn. Como era de esperar, la mayor afinidad de unión de FcRn se observó para FabCH23[M428L/N434S] mientras que no se observó unión de FcRn para Fab-CH23[H310A/H433A]. En el ensayo de unión 1 a 1, Fab-CH23-CH23 localizado sobre la superficie del chip mostró una afinidad de unión similar a la de Fab-CH23 para FcRn. De forma sorprendente, en el ensayo de avidez (FcRn localizado sobre la superficie del chip), sin embargo, Fab-CH23-CH23 mostró una afinidad mayor de aproximadamente 40 veces por la unión a FcRn que Fab-CH23. aunque la arquitectura de Fc de IgG y el tándem CH23-CH23 difieren, Se encontró que Fab-CH23-CH23 se une con alta afinidad a FcRn localizado sobre la superficie del biosensor de manera similar a la afinidad de IgG que comprende un único dominio Fc. A fin de evaluar qué Fab-CH23-CH23 se disoció de FcRn a pH neutro, se midió el porcentaje de Fab-CH23-CH23 unido a pH 7,4 y a pH 6,0 durante la fase de disociación. Se observó que el % unido de Fab-CH23-23 e IgG eran casi iguales. Estos resultados demuestran que Fab-CH23-CH23 no solo se une estrechamente a FcRn a pH ácido, sino que también se disocia de FcRn eficazmente a pH neutro de forma similar a

Fc de igG natural.

Tabla 4. Resumen de interacciones de FcRn de diversas fusiones de Fab-CH23

Variantes

Kd (1 a 1) (nM) Kd (avidez) (nM) % unido (%)

Fab-CH23-HEK

230 180 1,1

Fab-CH23

250 180 5,6

Fab-CH23[H310A/H433A]

- - -

Fab-CH23 [M428L/N434S]

68 35 20

Fab-CH23-CH23

250 4,5 14

IgG

280 9,3 11

Ejemplo 6: Farmacocinética de variantes de Fab-CH23: en ratones

Se determinaron los perfiles de concentración promedio en plasma tras una única dosis IV de 5 mg/kg de los

5 anticuerpos bivalentes o los polipéptidos monoméricos que contienen Fc que comprenden el mismo Fab que los anticuerpos de ratones Balb/c machos y en la Figura 6 se muestran los datos y en la Tabla 5 se resumen los parámetros PK. La variabilidad intersujeto era relativamente alta para Fab-CH23 y se observó una disminución significativa de la concentración en plasma tras 96 horas de dosificación, sugiriendo una posible inmunogenicidad (por ejemplo, aclaramiento mediante anticuerpos de ratón dirigidos contra Ig humana, AHA, contra las

10 construcciones). El aclaramiento (CL) para Fab-CH23 fue menor y comparable al CL de las IgG típicas a 0,3 ml/h/kg, y el T1/2 fue de 173 h (~7,2 d). Las velocidades de CL para Fab-CH23-HEK y Fab-CH23[H310A/H433A], a 18 y 14 ml/h/kg, respectivamente, fueron mucho mayores que las de la IgG natural a 0,3 ml/h. Por consiguiente, el T1/2 fue mucho más corto para estas dos variantes a 12 y 11 horas, respectivamente, en comparación con la IgG natural (173 horas). Cuando Fab-CH23-HEK se coadministró mediante la ruta intraperitoneal con 10 mg de manano (un

15 inhibidor natural de los receptores de manosa), el CL aumentó 2 veces en comparación con Fab-CH23 sin manano, lo que indica que el aclaramiento mediado por el receptor de manosa es un mecanismo de aclaramiento principal de Fab-CH23-HEK. Fab-CH23 y Fab-CH23 [M428L/N434S] mejoraron la PK sobre Fab-CH23-HEK y FabCH23[H310A/H433A] con un CL de ~9 ml/h/kg y un T1/2 de 32 y 42 h, respectivamente. El tándem Fab-CH23-CH23 tenía el CL más lento (3 ml/h/kg) y el T1/2 más largo (97 h) entre todas las fusiones Fab monoméricas. De forma

20 similar a la IgG natural, las concentraciones en plasma de Fab-CH23-CH23 disminuyeron también drásticamente 96 h después de la dosificación indicando que la inmunogenicidad potencial puede ser también responsable de todo el aclaramiento de Fab-CH23-CH23.

Tabla 5: Parámetros farmacocinéticos de diversas fusiones Fab-CH23

Variantes

ABCinf (µgxh/ml) ABCExtrap (%) Co(µg/m)l) T1/2 (h) CL (ml/h/ kg) Vdss (ml/kg)

Fab-CH23-HEK

323 1 92 12 18 78

Fab-CH23-HEK +m

508 0 91 14 10 42

Fab-CH23

579 1 70 32 9,0 177

Fab-CH23 [H310A/H433A]

364 0 72 11 14 93

Fab-CH23 [M428L/N434S]

548 1 58 42 9,2 213

Fab-CH23-CH23

1288 20 95 97 3,0 323

IgG

5955 62 140 173 0,3 78

Ejemplo 7: Procedimientos experimentales

25 Construcción del plásmido y expresión de la proteína El plásmido de expresión del fragmento Fc natural se construyó como una etiqueta de hexahistidina en el extremo N 25

imagen11

imagen12

5

10

15

20

25

30

Tabla 6: Resumen de los datos de SEC-MALS

Variantes Fc N-glicosiladas

PM teórico (Da) Masa de la proteína (Da) Masa de glicano (Da)

Fc natural

Monómero Dímero 25.010 50.020 Ninguno 51.860 Ninguno 5.958

Fc-N364

Monómero Dímero 25.037 50.074 28.390 47.490 5.062 3.161

Fc-N368

Monómero Dímero 24.984 49.964 29.370 42.110 5.539 2.939

Fc-N405

Monómero Dímero 24.915 49.830 27.090 Ninguno 4.389 Ninguno

Fc-N407*

Monómero Dímero 24.934 49.868 32.640 33.580 5.421 5.584

Fc-N364/N407

Monómero Dímero 24.963 49.926 29.270 Ninguno 6.392 Ninguno

*Se observaron dos picos amplios con masa molecular promedio entre el monómero y el dímero # SEC-MALS analito con índice de reflexión incluido y se utilizaron detectores UV en la determinación de la masa molar de monómero y dímero, así como de proteína y glicano

Estudio farmacocinético en ratones

Estudios con animales -Se adquirieron ratones Balb/c machos (machos de ~8 semanas de edad) de Charles River (Wilmington, MA). Se llevaron a cabo todos los estudios de acuerdo con la guía del National Institutes of Health para el cuidado y uso de recursos animales. Seis ratones por grupo recibieron una única dosis de variantes Fab-monoFc mediante ruta intravenosa. La dosis administrada de 5 mg/kg se basó en los pesos corporales previstos más recientes. Se prepararon las muestras de ensayo en PBS y el volumen de la dosificación fue de 4 ml/kg. A 0, 10 min, 6, 24 h, 2, 3, 4, 7, 14 y 21 días después de la dosis, se recogieron muestras de sangre de 10 µl procedentes de la vena de la cola mediante tubos capilares y se diluyeron inmediatamente en 90 µl de tampón Rexxip A (Gyros AB, Upsala, Suecia). Se centrifugó la muestra a 3000 x g durante 10 minutos a 4°C y el sobrenadante se transfirió a otro tubo y se congeló a -80°C para un futuro análisis.

Análisis de la muestra -Se cuantificaron las muestras de ensayo utilizando anticuerpo de cabra biotinilado dirigido contra IgG humana (Bethyl Laboratories) capturado sobre perlas revestidas de estreptavidina (columna de captura por afinidad de la microestructura Gyrolab CD). Se prepararon los patrones de referencia y los controles de calidad en tampón Rexxip A, y se diluyeron las muestras de estudio en el intervalo de cuantificación del ensayo. Tras capturarse en la columna de captura por afinidad, las variantes unidas a Fab-monoFc o la IgG natural bivalente se detectaron con anticuerpo de cabra marcado con Alexa647 dirigido contra IgG humana (Molecular Probes). La señal fluorescente en la columna permitió la detección de las variantes unidas. El instrumento Gyrolab leyó las unidades de respuesta en un contexto de un tubo fotomultiplicador al 1%. Se determinaron las concentraciones de la muestra mediante interpolación a partir de una curva patrón que se ajustó utilizando un ajuste de curva logística de 5 parámetros con una respuesta 1/y2 ponderada en Watson (Versión 7.4). El intervalo de cuantificación del ensayo para las variantes Fab-monoFc era de 10,0 µg/ml a 41,0 ng/ml en plasma de ratón Balb/c al 100%. El intervalo de cuantificación del ensayo para la variante de IgG bivalente fue de 4,0 µg/ml a 16,3 ng/ml en plasma de ratón Balb/c al 100%.

Análisis farmacocinético -Se calcularon los parámetros farmacocinéticos en plasma para las variantes monoFc de N-glicosilación de Fab diseñadas mediante ingeniería genética utilizando procedimientos no compartimentales con la ayuda de Watson (Versión 7.4). Se analizaron los datos en la fase linear-log terminal mediante regresión lineal para estimar la constante de velocidad terminal (k) y la semivida (T1/2 = 0,693/k). Se utilizaron al menos los últimos tres puntos temporales para calcular k. Se determinó el ABCinf total como la suma del ABC0-último y ABCextrap, donde ABC0último se calculó a partir de 0 hasta el último punto temporal (Túltimo) con la última concentración medible (Cúltima) utilizando la regla trapezoidal lineal y ABCextrap era la porción extrapolada del área de Túltimo hasta infinito utilizando Cúltima/k. Se calculó el aclaramiento total del cuerpo (CL) basándose en las concentraciones en plasma como la dosis/ ABCinf, y se calculó el volumen de distribución en estado estacionario (Vdss) como CLxABMC/ABC, donde

ABMC era el área bajo la curva en el primer momento. La variabilidad intersujeto era relativamente mayor para IgG que para otras construcciones.

Tabla de LISTADO DE SECUENCIAS

En las SEQ ID NOS: 1-8, los restos en negrita denotan las posiciones seleccionadas lógicamente para la Nglicosilación de acuerdo con la presente invención. En las SEQ ID NOS 17-88, los restos en negrita denotan las variaciones de aminoácidos/ácidos nucleicos, la primera región señalada es la secuencia señal/líder, y cuando está presente, la segunda región subrayada denota el enlazador.

SEQ ID NO:

DETALLES

1

hIgG1 Desde el resto 344

2

hIgG2 Desde el resto 344

3

hIgG3 Desde el resto 344

4

hIgG4 Desde el resto 344

5

mIgG1 Desde el resto 344

6

mIG2A Desde el resto 344 imagen13

7

mIG2B Desde el resto 344

8

mIgG3 Desde el resto 344

9

hIgG1 Desde el resto 396

10

hIgG2 Desde el resto 396

11

hIgG3 Desde el resto 396

12

hIgG4 Desde el resto 396

SEQ ID NO:

DETALLES

13

mIgG1 Desde el resto 396

14

mIG2A Desde el resto 396

15

mIG2B Desde el resto 396 imagen14

16

mIgG3 Desde el resto 396

17

variantes CH23:

Proteína IgG1-CH23-N347

18

variantes CH23: ADN IgG1-CH23-N347

19

variantes CH23: Proteína IgG1-CH23-N364

SEQ ID NO:

DETALLES

20

variantes CH23: ADN IgG1-CH23-N364

21

variantes CH23: Proteína IgG1-CH23-N366 imagen15

22

variantes CH23: ADN IgG1-CH23-N366

23

variantes CH23: Proteína IgG1-CH23-N368

imagen16

SEQ ID NO:

DETALLES

24

variantes CH23: ADN IgGl-CH23-N368

25

variantes CH23: Proteína IgG1-CH23-N390

26

variantes CH23: ADN IgG1-CH23-N390

27

variantes CH23: Proteína IgG1-CH23-N401

SEQ ID NO:

DETALLES

28

variantes CH23: ADN IgG1-CH23-N401

29

variantes CH23: Proteína IgG1-CH23-N405

30

variantes CH23: ADN IgG1-CH23-N405 imagen17

31

variantes CH23: Proteína IgG1-CH23-N407

SEQ ID NO:

DETALLES

32

variantes CH23: ADN IgG1-CH23-N407

33

variantes CH23: Proteína IgG1-CH23-N409

34

variantes CH23: ADN IgG1-CH23-N409

35

variantes CH23: Proteína IgG4-CH23-N347 imagen18

36

variantes CH23: ADN

SEQ ID NO:

DETALLES

IgG4-CH23-N347

37

variantes CH23: Proteína IgG4-CH23-N364

38

variantes CH23: ADN IgG4-CH23-N364 imagen19

39

variantes CH23: Proteína IgG4-CH23-N366

SEQ ID NO:

DETALLES

40

variantes CH23: ADN IgG4-CH23-N366

41

variantes CH23: Proteína IgG4-CH23-N368

42

variantes CH23: ADN IgG4-CH23-N368 imagen20

43

variantes CH23: Proteína IgG4-CH23-N390

SEQ ID NO:

DETALLES

44

variantes CH23: ADN IgG4-CH23-N390

45

variantes CH23: Proteína IgG4-CH23-N401

46

variantes CH23: ADN IgG4-CH23-N401 imagen21

47

variantes CH23: Proteína IgG4-CH23-N405

48

variantes CH23: ADN IgG4-CH23-N405

SEQ ID NO:

DETALLES

49

variantes CH23: Proteína IgG4-CH23-N407

50

variantes CH23: ADN IgG4-CH23-N407

51

variantes CH23: Proteína IgG4-CH23-N409

52

variantes CH23: ADN IgG4-CH23-N409

SEQ ID NO:

DETALLES

53

variantes CH23: Proteína IgG1-CH23-N364/N368

54

variantes CH23: ADN IgG1-CH23-N364/N368

55

variantes CH23: Proteína IgG1-CH23-N364/N405

56

variantes CH23: ADN IgG1-CH23-N364/N405

57

variantes CH23: Proteína IgG1-CH23-N364/N407

SEQ ID NO:

DETALLES

58

variantes CH23: ADN IgG1-CH23-N364/N407

59

variantes CH23: Proteína IgG1-CH23-N258/N364/N407

60

variantes CH23: ADN IgG1-CH23-N258/N364/N407

61

variantes CH23: IgG1-CH23-N260/N364/N407

SEQ ID NO:

DETALLES

62

variantes CH23: ADN IgG1-CH23-N260/N364/N407

63

variantes CH23: Proteína IgG1-CH23-N286/N364/N407

64

variantes CH23: ADN IgG1-CH23-N286/N364/N407 imagen22

65

variantes CH23: Proteína IgG1-CH23-N305/N364/N407

SEQ ID NO:

DETALLES

66

variantes CH23: ADN IgG1-CH23-N305/N364/N407

67

Variantes Fab-CH23: Proteína KLH-gamma

SEQ ID NO:

DETALLES

68

Variantes Fab-CH23: ADN KLHgamma

69

Variantes Fab-CH23: Proteína KLH-kappa

70

Variantes Fab-CH23: ADN KLHkappa

SEQ ID NO:

DETALLES

71

Variantes Fab-CH23: Proteína Fab-CH23

72

Variantes Fab-CH23: ADN Fab-CH23

SEQ ID NO:

DETALLES

73

Variantes Fab-CH23: Proteína Fab-CH23 [M428L/N434S]

74

Variantes Fab-CH23: ADN Fab-CH23 [M428L/N434S]

75

Variantes Fab-CH23: Proteína Fab-CH23 [H310A/H433A]

SEQ ID NO:

DETALLES

76

Variantes Fab-CH23: ADN Fab-CH23 [H310A/H433A]

77

Variantes Fab-CH23: Proteína Fab-CH23-0XGS-CH23

SEQ

DETALLES

ID NO:

78

Variantes Fab-

CH23: ADN Fab-

CH23-0XGS-CH23

79

Variantes Fab-CH23: Proteína Fab-CH23-1XGS-

CH23

SEQ

DETALLES

ID NO:

80

Variantes Fab-

CH23: ADN Fab-

CH23-1XGS-CH23

SEQ

DETALLES

ID NO:

81

Variantes Fab-CH23: Proteína Fab-CH23-2XGS-CH23

82

Variantes Fab-

CH23: ADN Fab-

CH23-2XGS-CH23

SEQ

DETALLES

ID NO:

83

Variantes Fab-CH23: Proteína Fab-CH23-3XGS-CH23

SEQ

DETALLES

ID NO:

84

Variantes Fab-

CH23: ADN Fab-

CH23-3XGS-CH23

SEQ

DETALLES

ID NO:

85

Variantes Fab-CH23: Proteína Fab-CH23-4XGS-CH23

86

Variantes Fab-

CH23: ADN Fab-

CH23-4XGS-CH23

SEQ

DETALLES

ID NO:

87

Variantes Fab-

CH23: Proteína Fab-CH23-5XGS-CH23

SEQ ID NO:

DETALLES

88

Variantes Fab-CH23: ADN Fab-CH23-5XGS-CH23

89

Péptido enlazador G4S

90

Péptido enlazador (G4S)2

91

Péptido enlazador (G4S)3

Claims (1)

1. imagen1