ES2623802T3 - Tratamiento de afecciones neurológicas - Google Patents

Abstract

Un agente que inhibe la actividad de G-CSF o de G-CSFR para su uso en el tratamiento o la profilaxis de una afección neurodegenerativa inflamatoria del SNC en un sujeto, en el que el agente se selecciona del grupo que consiste en: a) un anticuerpo específico para G-CSF o para G-CSFR o un fragmento de unión a G-CSF o a G-CSFR del mismo; y b) un G-CSFR soluble o una parte de unión a G-CSF del mismo.

Description

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Los términos "tratar" y "tratamiento", como se usan en este documento se refieren a tratamiento terapéutico y pueden incluir medidas profilácticas o preventivas. Por ejemplo, el tratamiento puede producir una reducción en la gravedad y/o la frecuencia de los síntomas de la afección neurodegenerativa inflamatoria del SNC, la eliminación de los síntomas y/o la causa subyacente de la afección, la prevención de la aparición de síntomas de la afección y/o su causa subyacente y mejora o remedio o alivio de los daños después de la afección neurodegenerativa inflamatoria. Dichos síntomas o características incluyen infiltración aumentada de neutrófilos, neutrófilos aumentados en fluido cefalorraquídeo, liberación aumentada de factores derivados de neutrófilos incluyendo, aunque sin limitación, factores antimicrobianos (tales como mieloperoxidasa y calprotectina), proteinasas (tales como elastasa), hidrolasas ácidas (tales como catepsinas), quimioquinas y citoquinas. Por tanto, el tratamiento puede no producir una "cura", sino en su lugar una mejora de los síntomas. Además, el tratamiento puede no comenzar hasta que aparezca un evento de exacerbación. En este contexto, el término "profiláctico" también se aplica a la prevención o al tratamiento de la probabilidad de que suceda un evento de exacerbación. Un ejemplo de un evento de exacerbación incluye una apoplejía u otro evento de la vasculatura sistémica y una infección por un agente patogénico tal como un virus.

Los anticuerpos también pueden ser quiméricos, que incluyen anticuerpos contra G-CSF o G-CSFR que comprenden las regiones variables de cadena pesada y ligera de anticuerpos de rata o de conejo contra G-CSF o G-CSFR y los dominios constantes de cadena pesada y ligera humana.

Los términos "afección" y "enfermedad" se usan de forma intercambiable en toda la presente memoria descriptiva.

Un "sujeto", como se usa en este documento se refiere a un animal, particularmente un mamífero y más particularmente un ser humano que puede beneficiarse de las composiciones farmacéuticas y agentes de la presente invención. No existe limitación sobre el tipo de animal que podría beneficiarse de las composiciones farmacéuticas y agentes descritos en la presente. Un sujeto independientemente de si es un ser humano o un animal no humano, puede mencionarse como individuo, paciente, animal, hospedador o destinatario, así como sujeto. Los compuestos y agentes de la presente invención tienen aplicaciones en medicina humana y en medicina veterinaria.

Los mamíferos particulares son seres humanos y animales de ensayo de laboratorio. Los ejemplos de animales de ensayo de laboratorio incluyen ratones, ratas, conejos, cobayas, hámsteres, gatos y perros y primates.

Un agente particularmente útil de la presente invención es un anticuerpo contra G-CSF o G-CSFR que inhibe la señalización de G-CSF a través del receptor de G-CSF. Dichos anticuerpos contra G-CSF pueden mencionarse como anticuerpos anti-G-CSF, y los anticuerpos contra G-CSFR pueden mencionarse como anticuerpos anti-G-CSFR. Cuando se pretende hacer referencia a un anticuerpo anti-G-CSF o un anticuerpo anti-G-CSFR, se puede hacer referencia simplemente a un anticuerpo o anticuerpos anti-G-CSF/G-CSFR.

Aunque tanto los anticuerpos policlonales como los monoclonales pueden producirse fácilmente, los anticuerpos monoclonales son particularmente preferidos ya que pueden generarse en grandes cantidades, son altamente específicos y están dirigidos contra un único sitio antigénico. Además, las preparaciones de anticuerpos monoclonales son homogéneas, haciéndolas ideales para generar fragmentos de unión a antígeno y otros derivados de anticuerpo modificados por ingeniería para aplicaciones terapéuticas.

Aunque los anticuerpos policlonales también se preparan de una manera relativamente fácil, no son tan útiles como los anticuerpos monoclonales ya que las preparaciones de anticuerpos policlonales típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes sitios antigénicos y, por tanto, no son tan adecuados para generar fragmentos de unión a antígeno y otros derivados de anticuerpo modificados por ingeniería para aplicaciones terapéuticas.

El método de hibridoma descrito anteriormente se usa en animales, tales como ratones, para producir anticuerpos monoclonales. Sin embargo, los anticuerpos derivados de animales generalmente son inadecuados para su administración a seres humanos ya que pueden causar una respuesta inmunitaria. Como se describe a continuación, dichos anticuerpos pueden modificarse para hacerlos adecuados para su administración a seres humanos o el sujeto no animal deseado.

Los anticuerpos anti-G-CSF/G-CSFR, por ejemplo, pueden producirse usando métodos recombinantes (por ejemplo, en un sistema de expresión de E. coli) bien conocidos en la técnica. En este enfoque, el ADN que codifica los anticuerpos monoclonales, tales como los anticuerpos monoclonales murinos descritos en este documento, pueden aislarse de las líneas celulares de hibridoma, secuenciarse usando procedimientos convencionales y opcionalmente manipularse usando tecnología de ADN recombinante. Por ejemplo, el ADN puede fusionarse a otro ADN de interés,

o alterarse (tal como por mutagénesis u otras técnicas convencionales) para añadir, delecionar o sustituir uno o más restos de ácido nucleico. El ADN puede colocarse en vectores que después se introducen por transfección o por transformación en células hospedadoras apropiadas usando métodos bien conocidos en la técnica (tal como se describe en las patentes de Estados Unidos n.º 4.399.216; 4.912.040; 4.740.461 y 4.959.455). El ADN aislado de las líneas celulares de hibridoma también puede modificarse para cambiar el carácter del anticuerpo producido por su expresión.

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ratones transgénicos o transcromosómicos que portan partes del sistema inmunitario humano en lugar del sistema murino. Estos ratones transgénicos y transcromosómicos incluyen ratones mencionados en este documento como ratones HuMAb y ratones KM.

Adicionalmente, están disponibles en la técnica sistemas de animales transgénicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humana y pueden usarse para crear anticuerpos. Por ejemplo, puede usarse un sistema transgénico alternativo mencionado como Xenomouse (Abgenix, Inc.); dichos ratones se describen en, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.º 5.939.598; 6.075.181; 6.114.598; 6.150.584 y 6.162.963.

Además, están disponibles en la técnica sistemas de animales transcromosómicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humana y pueden usarse para crear anticuerpos contra G-CSF o G-CSFR. Por ejemplo, pueden usarse ratones que portan tanto un transcromosoma de cadena pesada humana como un transcromosoma de cadena ligera humana, mencionados como "ratones TC"; dichos ratones se describen en Tomizuka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727, 2000.

Los anticuerpos monoclonales humanos también pueden prepararse usando métodos de presentación en fagos para explorar bibliotecas de genes de inmunoglobulina humana. Dichos métodos de presentación en fagos para aislar anticuerpos humanos están establecidos en la técnica. Véanse, por ejemplo: patentes de Estados Unidos n.º 5.223.409; 5.403.484; y 5.571.698; patentes de Estados Unidos n.º 5.427.908 y 5.580.717; Patentes de Estados Unidos n.º 5.969.108 y 6.172.197 y Patentes de Estados Unidos n.º 5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313;

6.582.915 y 6.593.081.

Los anticuerpos monoclonales humanos también pueden prepararse usando ratones SCID en que las células inmunitarias humanas se han reconstituido de modo que pueda generarse una respuesta de anticuerpos humanos tras la inmunización. Dichos ratones se describen en, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.º 5.476.996 y

5.698.767.

Los anticuerpos anti-G-CSF/G-CSFR para su uso en la presente invención también incluyen fragmentos de unión a antígeno tales como fragmentos Fv, Fab, Fab' y F(ab')2. Tradicionalmente, los fragmentos de unión a antígeno se generaron por la digestión proteolítica de anticuerpos completos (Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117,1992; Brennan et al., Science 229:81, 1985). Ahora se han desarrollado varios métodos recombinantes para producir fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos directamente en células hospedadoras recombinantes.

Por ejemplo, pueden recuperarse directamente fragmentos Fab'-SH de E. coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167, 1992). Los fragmentos F(ab')2 también pueden formarse usando la cremallera de leucina GCN4 para promover el ensamblaje de la molécula F(ab')2. Los fragmentos Fv, Fab o F(ab')2 también pueden aislarse directamente de cultivos de células hospedadoras recombinantes. Se han desarrollado varios métodos recombinantes para la producción de anticuerpos de cadena sencilla incluyendo los descritos en la patente de Estados Unidos n.º 4.946.778; Bird, Science 242:423, 1988, Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879, 1988 y Ward et al., Nature 334:544, 1989. Los anticuerpos de cadena sencilla pueden formarse uniendo fragmentos de la región variable (región Fv) de cadena pesada (VH) y ligera (VL) a través de un corto enlazador peptídico para proporcionar una única cadena polipeptídica (scFv). Los scFv también pueden formar dímeros o trímeros, dependiendo de la longitud de un enlazador peptídico entre las dos regiones variables (Kortt et al., Protein Engineering 10:423, 1997). La presentación en fagos es otro método recombinante bien conocido para producir los fragmentos de unión a antígeno para su uso en la presente invención.

Los fragmentos de unión a antígeno para su uso en la presente invención pueden explorarse para las propiedades deseadas. Los ensayos descritos en este documento proporcionan el medio para identificar fragmentos de unión a antígeno que se unen a G-CSF o a G-CSFR y que antagonizan la señalización de G-CSF a través de G-CSFR.

Las líneas celulares de mamífero disponibles como hospedadores para la expresión son bien conocidas en la técnica e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles en la American Type Culture Collection (ATCC). Estas incluyen, inter alia, células de ovario de hámster chino (CHO), NSO, células SP2, células HeLa, células de riñón de cría de hámster (BHK), células renales de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), células A549, células 3T3, y otras varias líneas celulares. Las células hospedadoras de mamífero incluyen células humanas, de ratón, de rata, de perro, de mono, de cerdo, de cabra, bovinas, de caballo y de hámster. Las líneas celulares de particular preferencia se seleccionan a través de la determinación de las líneas celulares que tienen altos niveles de expresión. Otras líneas celulares que pueden usarse son líneas celulares de insecto, tales como células Sf9, células de anfibio, células bacterianas, células vegetales y células fúngicas. Cuando se introducen vectores de expresión recombinantes que codifican la cadena pesada y la parte de unión a antígeno de la misma, la cadena ligera y/o la parte de unión a antígeno de la misma en células hospedadoras de mamífero, los anticuerpos se producen cultivando las células hospedadoras durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células hospedadoras o, más preferiblemente, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en que se cultivan las células hospedadoras.

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Los anticuerpos pueden recuperarse del medio de cultivo usando métodos convencionales de purificación de proteínas. Además, la expresión de los anticuerpos para su uso en la invención desde líneas de células hospedadoras puede potenciarse usando varias técnicas conocidas. Por ejemplo, el sistema de expresión del gen de la glutamina sintetasa (el sistema GS) es un enfoque común para potenciar la expresión en ciertas condiciones. El sistema GS se analiza en su totalidad o en parte en relación con las patentes europeas n.º 0 216 846, 0 256 055, y 0 323 997 y la solicitud de patente europea n.º 89303964.4.

Los anticuerpos expresados por diferentes líneas celulares o en animales transgénicos pueden tener diferentes patrones de glucosilación entre sí. Sin embargo, todos estos anticuerpos contra G-CSF o G-CSFR para su uso en el tratamiento de afecciones del SNC inflamatorias mediadas por el sistema inmunitario son parte de la presente invención, independientemente del patrón de glucosilación de los anticuerpos.

También se conocen técnicas para obtener un anticuerpo de una subclase o isotipo diferente de un anticuerpo de interés, es decir, cambio de subclase. Por tanto, pueden obtenerse anticuerpos monoclonales IgG1 o IgG4 a partir de un anticuerpo monoclonal IgM, por ejemplo, y viceversa. Dichas técnicas permiten la preparación de nuevos anticuerpos que poseen las propiedades de unión a antígeno de un anticuerpo dado (el anticuerpo precursor), pero también muestran propiedades biológicas asociadas con un isotipo o subclase de anticuerpo diferente del anticuerpo precursor. Pueden emplearse técnicas de ADN recombinante. El ADN clonado que codifica polipéptidos de anticuerpo particulares puede emplearse en dichos procedimientos, por ejemplo, el Y que codifica la región constante de un anticuerpo del isotipo de interés.

Los vectores disponibles para clonación y expresión en líneas de células hospedadoras son bien conocidos en la técnica, e incluyen, aunque sin limitación, vectores para la clonación y la expresión en líneas celulares de mamífero, vectores para clonación y la expresión en líneas celulares bacterianas, vectores para la clonación y la expresión en fagos y vectores para la clonación y la expresión en líneas celulares de insecto. Los anticuerpos pueden recuperarse usando métodos convencionales de purificación de proteínas.

En una realización particular, los anticuerpos para su uso en la presente invención son anticuerpos humanos o humanizados anti-G-CSF/G-CSFR que antagonizan la señalización de G-CSF a través de G-CSFR.

Particularmente, los anticuerpos humanos o humanizados anti-G-CSF/G-CSFR están en forma aislada, homogénea

o completa o parcialmente purificada.

Más particularmente, los anticuerpos humanos o humanizados anti-G-CSF/G-CSFR son anticuerpos monoclonales de longitud completa o fragmentos de unión a antígeno.

Como se indica anteriormente, la selección de fragmentos de unión a antígeno o de formas modificadas de los anticuerpos puede verse influenciada por el efecto que los fragmentos o las formas modificadas tienen sobre la semivida individual.

Otro ejemplo de un agente útil es una forma soluble del G-CSFR que compite con el G-CSFR asociado a membrana de origen natural por la interacción con G-CSF. Los expertos en la materia pueden preparar fácilmente formas solubles del receptor, véase, por ejemplo, el documento US 5.589.456 y Honjo et al., Acta Crystallograph Sect F Struck Biol Cryst Commun. 61 (Pt 8):788-790, 2005.

Las expresiones "ácidos nucleicos", "nucleótido" y "polinucleótido" incluyen ARN, ADNc, ADN genómico, formas sintéticas y polímeros mixtos, hebras tanto con sentido como antisentido, y pueden modificarse química o bioquímicamente o pueden contener bases nucleotídicas no naturales o derivatizadas, como apreciarán fácilmente los expertos en la materia. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, marcadores, metilación, sustitución de uno

o más de los nucleótidos de origen natural con un análogo (tal como el anillo morfolina), modificaciones internucleotídicas tales como enlaces no cargados (por ejemplo, metilfosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.), enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), restos colgantes (por ejemplo, polipéptidos), intercalantes (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), quelantes, alquilantes y enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos α-anoméricos, etc.). También se incluyen moléculas sintéticas que imitan los polinucleótidos en su capacidad de unirse a una secuencia indicada a través de enlaces de hidrógeno y otras interacciones químicas. Dichas moléculas son conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, aquellas en que los enlaces peptídicos se sustituyen por enlaces fosfato en la estructura de la molécula.

El aspecto descrito anteriormente puede lograrse por biología molecular convencional y técnicas de ADN recombinante. Las técnicas son bien conocidas en la técnica y se describen en diversas publicaciones, tales como Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; DNA Cloning: A Practical Approach, Volúmenes I y II, D. N. Glover ed. 1985 y Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1994.

Los ácidos nucleicos pueden estar flanqueados por secuencias reguladoras naturales (control de la expresión) o pueden asociarse con secuencias heterólogas, incluyendo promotores, sitios internos de entrada al ribosoma (IRES)

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estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos adecuados de preparación incluyen secado al vacío y la técnica de secado por congelación que produce un polvo de ingrediente activo más cualquier ingrediente adicionalmente deseado.

Cuando el modulador está protegido adecuadamente, se puede administrar por vía oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o con un vehículo comestible asimilable, o puede encerrarse en una capsula de gelatina de cubierta dura o blanda, o puede comprimirse en comprimidos, o puede incorporarse directamente con el alimento de la dieta

o administrarse a través de leche materna. Para la administración terapéutica oral, el ingrediente activo puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, trociscos, capsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares. Dichas composiciones y preparaciones deben contener al menos un 1 % en peso del modulador. El porcentaje de las composiciones y preparaciones pueden variarse, por supuesto, y puede ser convenientemente entre aproximadamente el 5 a aproximadamente el 80 % del peso de la unidad. La cantidad de modulador en dichas composiciones terapéuticamente útiles es tal que se obtendrá una dosificación adecuada. Las composiciones o preparaciones pueden prepararse de modo que una forma unitaria de dosificación oral contiene entre aproximadamente 0,1 µg y 200 mg de modulador. Las cantidades de dosificación alternativas incluyen de aproximadamente 1 µg a aproximadamente 1000 mg y de aproximadamente 10 µg a aproximadamente 500 mg. Estas dosificaciones pueden ser por individuo o por kg de peso corporal. La administración puede ser por hora, día, semana, mes o año.

Los comprimidos, trociscos, cápsulas, cremas y similares también pueden contener los componentes en enumerados a continuación en este documento. Puede añadirse un aglutinante tal como goma arábiga, almidón de maíz o gelatina; excipientes tales como fosfato dicálcico; un agente disgregante tal como almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico y similares; un lubricante tal como estearato de magnesio; un agente edulcorante tal como sacarosa, lactosa o sacarina o un agente aromatizante tal como menta, aceite de gaulteria o aroma de cereza. Cuando la forma unitaria de dosificación es una cápsula, puede contener, además de los materiales del tipo anterior, un vehículo líquido. Puede haber presentes otros diversos materiales como recubrimientos o para modificar de otro modo la forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo, los comprimidos, píldoras o cápsulas pueden recubrirse con goma laca, azúcar o ambos. Un jarabe o elixir puede contener el compuesto activo, sacarosa como agente edulcorante, metil y propil parabenos como conservantes, un colorante y aromatizante tal como aroma de cereza o de naranja. Por supuesto, cualquier material usado en la preparación de cualquier forma unitaria de dosificación debe ser farmacéuticamente puro y sustancialmente no tóxico en las cantidades empleadas. Además, el compuesto o compuestos activos pueden incorporarse en preparaciones y formulaciones de liberación sostenida.

Los vehículos y/o los diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción y similares. El uso de dichos medios y agentes para agentes activos farmacéuticos es bien conocido en la técnica y, excepto en la medida de que algún medio o agente convencional sea incompatible con el modulador, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. También pueden incorporarse en las composiciones compuestos activos suplementarios.

Como se indica anteriormente, la administración puede ser por cualquier medio.

Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, puede administrarse un único bolo, puede administrarse varias dosis divididas en el tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente según se indique por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular las composiciones parenterales en forma unitaria de dosificación para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación.

Un médico o un veterinario experto en la materia puede determinar fácilmente y prescribir la cantidad eficaz de la composición farmacéutica requerida. Por ejemplo, el medio o el veterinario podría empezar con dosis del anticuerpo anti-G-CSF/G-CSFR para su uso en la presente invención, empleadas en las composiciones farmacéuticas a niveles inferiores que las requeridas para conseguir el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosificación hasta que se consiga el efecto deseado. En general, una dosis diaria adecuada de una composición de la invención puede ser esa cantidad del compuesto que es la dosis más baja eficaz para producir un efecto terapéutico. Dicha dosis eficaz generalmente dependerá de los factores descritos anteriormente. Se prefiere que la administración sea por inyección, preferiblemente proximal al sitio de la diana (por ejemplo, pulmón). Si se desea, la dosis diaria eficaz de una composición farmacéutica puede administrarse como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más subdosis administradas por separado a intervalos apropiados durante todo el día.

Para aplicaciones terapéuticas, los anticuerpos anti-G-CSF/G-CSFR se administran a un mamífero, preferiblemente un ser humano, en una forma de dosificación farmacéuticamente aceptable tal como las analizadas anteriormente, incluyendo aquellas que pueden administrarse a un ser humano por vía intravenosa como un bolo o por infusión continua durante un periodo de tiempo.

Los modelos animales útiles para ensayar la inhibición de G-CSF o su receptor, u otros enfoques para antagonizar la señalización mediada por G-CSF, incluyen el modelo de encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE).

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Como se analiza en los siguientes ejemplos, la supresión de G-CSF con un antagonista de ensayo tuvo un impacto significativo sobre la cantidad de neutrófilos en el modelo de EAE y redujo el nivel de enfermedad en el modelo. Como los neutrófilos son mediadores clave de la inflamación del SNC, la reducción significativa en las cantidades de neutrófilos inducida por el antagonista de G-CSF en el modelo de EAE indica que el antagonismo de la actividad G-CSF es un enfoque terapéutico útil.

La presente invención se describe adicionalmente por los siguientes Ejemplos no limitantes. En los Ejemplos, se emplean los siguientes materiales y métodos.

Animales

Se usaron ratones hembra C57Bl/6 o ratones G-CSF KO (proporcionados por A. Dunn, Ludwig Institute for Cancer Research, Parkville, Australia).

Administración de fármacos

Se dio a los ratones las dosis especificadas de anticuerpo de control de isotipo o anti-G-CSF (como se resume en la sección 1) una vez al día, administrado por inyección i.v.

Anticuerpos

Para el análisis de la cantidad de neutrófilos, se adquirieron anticuerpos anti-CD11b (M1/70) y anti-GR (1A8) de BD pharmingen (San Diego, CA, EE. UU.). El HRPN de control de isotipo (IgG1 de rata) se adquirió de BioXcell (West Lebanon, NH, EE. UU.). El anticuerpo neutralizante anti-G-CSF (MAB414) se adquirió de R&D systems (Minneapolis, MN, EE. UU.).

Encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE)

La EAE se indujo en ratones hembra con edad de 8-12 semanas. Los ratones se inmunizaron por vía subcutánea con 100 µg de péptido35-55 de mielina MOG (Mimotopes, Clayton, Vic, Australia) emulsionado en CFA (Difco, BD San Diego, CA, EE. UU.), seguido por 200 ng de toxina pertussis (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE. UU.) administrada por vía intravenosa en el día 0 y en el día 2. Se evaluó el valor de parálisis clínica como se describe previamente (Langrish et al., J Exp Med 201(2):233-40, 2005) con un valor máximo de 6 para cada ratón.

Evaluación de la cantidad de neutrófilos

Para el análisis de la cantidad de neutrófilos durante el tratamiento anti-G-CSF en EAE, los animales se sacrificaron en el día 0 (sin tratamiento), en el día 7, en el día 14 y en el día 21. Se prepararon suspensiones de células individuales de bazo y LN cervical y se eliminaron los glóbulos rojos por lisis hipotónica con tampón de lisis de glóbulos rojos (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE. UU.). Para el análisis de la sangre, los glóbulos rojos se eliminaron por lisis hipotónica. Para el análisis de médula ósea, se retiraron los fémures y se lavaron abundantemente con PBS enfriado en hielo y se eliminaron los glóbulos rojos por lisis hipotónica. Para el análisis de células del SNC, se aislaron las células mononucleares como se describe previamente (Langrish et al., 2005 supra). Las suspensiones de células individuales de bazo, sangre, ganglio linfático, médula ósea y células del SNC se tiñeron con anticuerpos anti-CD11b y GR1 (dilución 1/100), se lavaron y se procesaron en FACS Canto (BD, San Jose, CA, EE. UU.). Los datos se analizaron usando el software Flowjo (Treestar, Ashland OR, EE. UU.).

Reactivación de células T y ensayos de citoquinas

Se recogieron LN de bazo, inguinal, auxiliar y braquial de ratones 10 días después de la inmunización subcutánea con MOG/CFA. Las células se aislaron por homogeneización a través de un filtro de 70 µm, después se lavaron dos veces en medio y se combinaron para cada grupo de tratamiento. Las células T CD4+ entonces se purificaron por selección MACS positiva de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania). La pureza de las células T fue de >95 % CD4+ determinada por FACS. Se cultivaron 2 × 105 células T CD4+ purificadas con 2 × 105 esplenocitos irradiados en 0,2 ml en pocillos triplicados en placas de 96 pocillos con 100 µg/ml de péptido MOG35-55 durante 3 días. Se recogió el sobrenadante y se midieron las citoquinas por ensayo Milliplex (Millipore, Billerica, MA, EE. UU.) en un instrumento Luminex 200 (Austin, TX, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Análisis estadístico

Se realizó un ensayo de Mann-Whitney bilateral usado para generar el análisis estadístico usando el software Prism [Marca Registrada].

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Después de la inducción de EAE, la cantidad de neutrófilos aumentaba en la sangre, en la médula ósea, en el SNC, en el ganglio linfático y en el bazo (Figura 3). El tratamiento con anticuerpo anti-G-CSF inhibía la neutrofilia en todos estos sitios (Figura 3), coherente con una función clave para G-CSF en el control de las respuestas de neutrófilos in vivo.

Ejemplo 4

El tratamiento anti-G-CSF inhibe las citoquinas proinflamatorias de células T en el modelo de EAE de inflamación autoinmunitaria neurológica

Las citoquinas de células T CD4+ son reguladores importantes de la inflamación. Para dilucidar el efecto del tratamiento anti-G-CSF sobre esta ruta, se usaron células T CD4+ purificadas de los bazos y los ganglios linfáticos de animales sacrificados en el día 10 de ratones tratados con anticuerpo de control de isotipo o anti-G-CSF en el modelo de EAE descrito anteriormente, y se reactivaron las células T CDR4+ purificadas con MOG y se analizó la expresión de citoquinas.

El tratamiento anti-G-CSF inhibía la expresión de citoquinas proinflamatorias en respuesta a la reactivación. El tratamiento anti-G-CSF reducía la expresión de IL-6, TNFα, GM-CSF e IL-17, todas citoquinas importantes para dirigir la EAE (Figura 4). El tratamiento anti-G-CSF también inhibía la expresión de quimioquinas de la familia CC importantes para el reclutamiento de células durante la inflamación neurológica (Boven et al., Clin Exp Immunol 122(2):257-63, 2000). La expresión de MIP-1α, MIP-1β, MCP-1 y RANTES por células T CD4+ durante la reactivación se inhibía por el tratamiento anti-G-CSF in vivo (Figura 4).

Ejemplo 5

Inhibición de la proliferación mediada por G-CSF en células Ba/F3 que expresan el receptor de hG-CSF por diversos antagonistas de G-CSF

Se cultivaron células BaF3 transfectadas de forma estable con hG-CSFR como se describe por Layton et al., J. Biol. Chem. 272:29735-29741, 1997 en placas de 96 pocillos a 20.000 células/pocillo en medio DMEM con FBS al 5 % v/v y 0,5 ng/ml de rh o mGCSF (R&D Systems n.º cat. 214-CS y n.º cat. 414-CS respectivamente). Se añadieron antagonistas de G-CSF (R&D Systems MAB414, mAb711 anti-hG-CSFR y hG-CSFR-Fc) a dosis de titulación de factor tres partiendo de 1 µM y se midió la proliferación celular por reducción de MTS (Cory et al., Cancer Commun. 3:207-12, 1991; Riss y Moravec, Mol. Cell Biol. 3(1):184a, 1993) después de 48 horas de cultivo.

A. Inhibición por anticuerpo anti-G-CSF:

El anticuerpo anti-G-CSF era capaz de inhibir la proliferación de mG-CSF con una CI50 de 10 pM.

B. Inhibición por anticuerpo anti-hG-CSFR:

Un anticuerpo monoclonal murino contra el receptor de hG-CSF, mAb711, (Layton et al., supra 1997) y su derivado humanizado eran capaces de inhibir la proliferación de mG-CSF con una CI50 de 1,1 nM y 1,5 nM respectivamente.

Un anticuerpo quimérico que comprendía las regiones variables de cadena pesada y ligera de mAb711 y las regiones contantes de cadena pesada y ligera de IgG1 humana inhibían la actividad G-CSF con una CI50 similar al anticuerpo monoclonal murino mAb711.

C. Inhibición por proteína hG-CSFR-Fc soluble:

Una proteína G-CSFR-Fc soluble (Honjo et al., Acta Cryst F61:788-790, 2005) era capaz de inhibir la proliferación de mG-CSF con una CI50 de 22 pM.

Estos resultados demuestran que la actividad biológica de G-CSF se inhibe por una diversidad de antagonistas, incluyendo anticuerpos contra G-CSF, anticuerpos contra G-CSFR y receptores solubles de G-CSF.

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