KR20120091057A

KR20120091057A - 신경 질환들의 치료

Info

Publication number: KR20120091057A
Application number: KR1020127008842A
Authority: KR
Inventors: 브렌트 스티븐 맥켄지; 피터 프레더릭 커웬; 유진 마라스코프스키
Original assignee: 씨에스엘 리미티드
Priority date: 2009-09-15
Filing date: 2010-09-14
Publication date: 2012-08-17
Also published as: EP2477656B1; EP2477656A4; DK2477656T3; PL2477656T3; AU2010295223A1; CA2773552C; KR101750426B1; CA2773552A1; WO2011032204A1; US9352038B2; EP2477656A1; CN102630167B; JP5785550B2; CN102630167A; AU2010295223B2; US20140234303A1; US20110091456A1; ES2623802T3; JP2013504603A; JP2015187135A

Abstract

본 발명은 일반적으로 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF) 또는 G-CSF 수용체(G-CSFR) 억제제를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 대상에서 중추신경계(CNS)의 염증성 신경퇴행성 질환 및 특히 다발성 경화증, 데빅병 또는 바이러스 감염 및 이들로부터 발생하는 증상 및 합병증의 영향을 치료 또는 예방하거나 개선하기 위한 방법에 관한 것이다.

Description

신경 질환들의 치료{TREATMENT OF NEUROLOGICAL CONDITIONS}

본 출원은 "신경 질환들의 치료"라는 제목으로 2009년 9월 15일에 출원된 미국 가출원번호 제61/242,503호와 관련되며 이의 우선권을 주장하며 이의 전체 내용은 본 발명에 참조로서 포함된다.

본 발명은 일반적으로 중추신경계(CNS)의 염증성 신경퇴행성 질환 및 특히 다발성 경화증, 데빅병 또는 바이러스 감염 및 이들로부터 발생하는 증상 및 합병증의 영향을 치료 또는 예방하거나 개선하기 위한 방법에 관한 것이다.

본 명세서에서 제공된 참고문헌들의 세부 사항은 명세서의 마지막에 열거되어 있다.

임의의 선행 기술에 대한 참조는 이 선행 기술이 임의의 지역에서 공통의 일반 상식의 일부를 구성한다는 인정 또는 어떠한 형태의 시사가 아니며 이렇게 받아들여져서는 안된다.

다발성 경화증(MS; Multiple sclerosis) 및 데빅병(Devic's disease)(시신경 척수염[NMO; Neuromyelitis Optica]으로도 알려짐)은 중추신경계(CNS)에 영향을 미치는 염증성 신경퇴행성 장애들이다. 이들은 염증성 세포들이 신경계를 침입하여 탈수초(demyelination)와 조직 파괴를 유도하는 자가면역 공격에 기인한다(Morales et al, Adv Neurol 98:27-45, 2006). 이러한 파괴 및 탈수초는 인식 기능의 장애 및 높은 사망률을 유도한다(Bergamaschi et al, Neuroepidemiology 25(1):15-8, 2005; Ragonese et al, Eur J Neurol 15(2):123-7, 2008). MS는 남성보다 여성에서 보다 흔하며 대략 100,000명당 3명에게 영향을 미치고(Alonso et al, Neurology 71(2):129-35, 2008), 재발완화형(대부분의 경우) 또는 빠른진행형(소수 [10%])으로 분류될 수 있다. 현재, 질병의 어느 형태에 대한 치유책도 없다. 신경 염증을 위한 표준 치료법들은 재조합 인터페론 치료 및 메틸프레드니솔론 또는 메토트렉세이트와 같은 면역억제제들을 포함한다(Lopez-Diego et al, Nat Rev Drug Discov 7(11):909-25, 2008). 이들 치료법들은 질병의 진행을 감소시키나 예방할 수는 없다. 효과적인 치료법을 개발할 필요가 있다.

MS 병변들은 T 세포들, 대식세포들, 수지상 세포들 및 호중구들을 포함하는 일련의 면역 세포들에 의한 침투를 특징으로 한다(Morales et al, 2006 supra). 또한 유사한 병변들이 척수 및 시신경의 우선적인 연루와 함께 보다 공격적이며 빠르게 진행하는 데빅병 환자들에게서 발견된다(Wingerchuk et al, Lancet Neurol 6(9):805-15, 2007; Wingerchuk et al, Curr Treat Options Neurol 10(1):55-66, 2008). 비록 두 가지 모든 장애들이 비정상적인 CD4+ 헬퍼 T 세포 반응들의 결과인 것으로 널리 믿어지지만 T 세포를 표적으로 하는 치료법들은 임상에서 상대적으로 성공적이지 못하였다(Lopez-Diego et al, 2008 supra). 이는 신경 병리학들에서 선천성 면역 세포들의 역할에 대한 새로운 관심을 유도하였다(Weiner et al, J Neurol 255( Suppl 1): 3-11, 2008).

호중구들은 중심적인 선천성 면역 이펙터 세포들 중 하나이며, 염증 부위들로 빠르게 소집되어 반응성 산소 대사산물들과 같은 손상 물질들(damaging agents)을 방출한다. 이들은 MS 및 데빅병 환자들 모두에서 신경계를 침투하는 다른 면역 세포들과 함께 발견될 수 있다. (종종 나쁜 예후를 가진 것으로 진단받은) 데빅병 환자들로부터 얻어진 병변 조직 및 뇌척수액은 특히 호중구가 풍부하다(Wingerchuk et al, 2007; 2008; supra). 하지만 CNS 병리학에서 호중구들의 역할은 여전히 불명확하다. 문헌에서 호중구들은 CNS 자가면역 염증의 동물 모델들에서 보호적인 역할 또는 병원성 역할을 가진 것으로 제안되어왔다. MS의 생쥐 모델에서 호중구 특이적인 단일클론 항체로 호중구들을 감소시키는 것은 질병의 심각성을 감소시켰다(McColl et al, J Immunol 161(11):6421-6, 1998). 반면, MS의 생쥐 모델에서 호중구들을 조사하는 다른 연구자들은 CNS로부터 분리된 호중구들이 효과적인 T 세포 억제제인 것을 발견하였다(Zehntner et al, J Immunol 174(8):5124-31, 2005).

염증성 반응들에 수반되는 사이토카인은 CSF -3 유전자에 의해 인코딩되는 과립구콜로니자극인자(G-CSF; granulocyte colony-stimulating factor)이다. G-CSF는 과립구들의 생산을 조절하는 조혈 성장인자이다(Nicola et al , Nature 314:625, 1985; Metcalf, International Journal of Cancer 25:225, 1980; Nicola et al , Journal of Biological Chemistry 258:9017, 1983). G-CSF는 I형 사이토카인 수용체 상과(superfamily)의 일원인 G-CSF 수용체(G-CSFR, CSFR -3 유전자에 의해 인코딩됨)와의 상호작용을 통해 G-CSF의 효과들을 매개한다(Demetri et al , Blood 78:2791-2808, 1991). 인간들 및 생쥐들에서 G-CSF의 주요 생물학적 작용은 골수로부터 호중구들의 생산 및 방출을 증가시키는 것(Souza et al , Science 232:61, 1986; Lord et al , Proc . Natl . Acad . Sci . USA 86:9499-9503, 1989), 골수로부터 말초혈액으로 조혈 전구 세포들을 동원하는 것(Bungart et al , British Journal of Haematology 22:1156, 1990; de Haan et al , Blood 86:2986-2992, 1995; Roberts et al , Blood 89:2736-2744, 1997) 및 성숙한 호중구들의 분화와 이펙터 기능들을 조절하는 것(Yong et al , European Journal of Haematology 49:251-259, 1992; Colotta et al , Blood 80:2012-2020, 1992; Rex et al , Transfusion 35:605-611, 1995; Gericke et al , Journal of Leukocyte Biology 57:455-461, 1995; Xu et al , British Journal of Haematology 93:558-568, 1996; Yong, British Journal of Haematology 94:40-47, 1996; Jacob et al , Blood 92:353-361, 1998)을 포함한다. 또한 G-CSF는 식세포 작용(Bialek et al, Infection 26(6):375-8, 1998), 세포자멸사(Dibbert et al, Proc Natl Acad Sci U S A 96(23):13330-5, 1999) 및 귀소(homing)(Dagia et al, Nat Med 12(10):1185-90, 2006; Eyles et al, Blood 112(13):5193-201, 2008)에 영향을 줌으로써 골수를 떠난 성숙한 체세포 분열 후(postmitotic) 호중구들에 작용한다. G-CSF는 호중구 감소증을 치료하는데 뿐만 아니라 자가 및 동종 줄기세포 이식을 위한 조혈모세포들(HSC; hemopoietic stem cells)의 동원을 유도하는데 사용된다(Welte et al , Blood 88:1907-1929, 1996).

상기에서 요약한대로, MS에서 G-CSF/호중구 축(axis)에 대한 전-염증성 기능을 뒷받침하는 호중구를 감소시키는 항체들을 이용한 실험적 증거가 있다. 또한 임상 사례 연구들은 G-CSF로 치료받은 일부 환자들이 임상 증상의 악화를 나타냄을 보고하였다(Openshaw et al, "Neurology 54(11):2147-50, 2000; Snir et al, J Neuroimmunol 172(1-2):145-55, 2006). 하지만 이들 보고들은 비교적 드믈고 CNS 질병 상태들에서 G-CSF에 대한 항-염증성 역할을 지지하는 상당한 증거가 존재한다. MS의 실험적 자가면역성 뇌척수염(EAE) 동물 모델에서, 전신성 및 국소적으로 (CNS) 전달된 G-CSF를 이용한 치료는 질병을 완화시킨다(Zavala et al, J Immunol 168(4):2011-9, 2002). 이는 다른 것들에 의해 G-CSF로 처방된 T 세포 내성 유도(tolerizing)(Rutella et al, Transplantation 84(1 Suppl ):S26-30, 2007) 및 신경보호 역할(Frank et al, BMC Neurosci 10:49, 2009)과 일치한다. 또한 G-CSF의 항-염증성 특성들이 I형 당뇨병(Hadaya et al, J Autoimmun 24(2):125-34, 2005) 및 염증성 장질환(Kudo et al, Scand J Gastroenterol 43(6):689-97, 2008)과 같은 다른 자가면역 질병들에서 잘 기록되어왔다. 사실 재조합 인간 G-CSF는 염증성 장질환을 치료하기 위해 임상에서 사용되어왔다(Barahona-Garrido et al, Biologics 2(3):501-4, 2008). 따라서 G-CSF는 다양한 역할들을 가진 다면발현성(pleiotropic) 사이토카인이다.

MS, 데빅병 및 뇌의 바이러스 감염들과 같은 CNS에서의 염증성 신경퇴행성 질환들을 위한 새로운 치료법들을 개발할 필요가 있다.

본 명세서 전체에서, 문맥에서 다르게 요구하지지 않는 한 단어 "포함하다", 또는 "포함한다" 또는 "포함하는"과 같은 변형들은 서술된 성분 또는 전체 또는 성분들 또는 전체들의 그룹의 포함을 의미하는 것으로 이해될 것이나 임의의 다른 성분 또는 전체 또는 성분들 또는 전체들의 그룹의 배제는 아니다.

뉴클레오티드 및 아미노산 서열들은 서열 식별자 번호(서열번호)에 의해 언급된다. 서열번호들은 숫자상으로 서열 식별자들 <400>1 (서열번호:1), <400>2 (서열번호:2) 등에 해당한다. 서열 식별자들의 요약은 표 1에서 제공된다. 서열 목록은 청구항들 이후에 제공된다.

본 발명은 일반적으로 CNS의 질병 상태들을 포함하는 염증성 신경퇴행성 질환들의 치료에서 G-CSF, 이의 수용체 및/또는 이들의 생산의 길항제들의 용도에 관한 것이다. 일반적으로, 염증성 신경퇴행성 질환들은 호중구들의 침투와 관련된다. 특히, 본 발명은 G-CSF, 이의 수용체 또는 이들의 생산을 길항하는 것에 의한 다발성 경화증(MS), 데빅병(시신경 척수염 또는 NMO로도 알려짐) 및 바이러스 감염의 치료를 고려한다.

따라서, 본 발명은 염증성 신경퇴행성 질환들의 치료에서 전신성으로 또는 국소적으로 G-CSF 또는 G-CSFR의 억제 및/또는 G-CSF 또는 G-CSFR의 발현의 하향 조절을 고려한다. 상기에서 나타난 바와 같이 신경퇴행성 질환들은 일반적으로 MS, 데빅병 및 바이러스 감염과 같은 호중구들의 침투와 관련된 것들이다.

"G-CSF" 또는 이의 전체 명칭인 "과립구콜로니자극인자(granulocyte-colony stimulating factor)" 에 대한 언급은 G-CSF의 동족체들 및 유도체들을 포함한다. "동족체" 또는 "유도체"는 G-CSF의 다형 변이체들을 포함한다.

용어 "G-CSFR" 또는 이의 전체 명칭인 "과립구콜로니자극인자 수용체"는 G-CSFR의 동족체들 및 유도체들을 포함한다. "동족체" 또는 "유도체"는 G-CSF의 다형 변이체들을 포함한다.

"G-CSF 또는 G-CSFR의 하향 조절 발현"은 전사, 번역 및/또는 mRNA 프로세싱의 억제를 포함하는 G-CSF 또는 G-CSFR을 인코딩하는 유전 물질의 발현을 억제하는 것을 포함한다.

"G-CSF 또는 G-CSFR의 억제" 또는 "G-CSF 또는 G-CSFR 길항"은 G-CSF 또는 G-CSFR의 활성 또는 신호전달 기능을 억제하는 것을 포함한다.

CNS의 염증성 신경퇴행성 질환은 질병 상태를 포함한다. 일반적으로, 상기 상태는 호중구들의 침투를 특징으로 하거나 또는 호중구들의 침투와 연관된다. 예들은 MS, 데빅병 및 바이러스 감염을 포함한다.

따라서, 본 발명의 일 양태는 대상에서 CNS의 염증성 신경퇴행성 질환의 치료 방법을 고려하며 방법은 G-CSF 또는 G-CSFR을 억제하거나 G-CSF 또는 G-CSFR의 발현을 하향 조절하기에 효과적인 제제의 양을 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.

특정 실시태양에서, 본 발명은 대상에서 CNS의 염증성 신경퇴행성 질환의 치료 방법을 제공하며 방법은 G-CSF 또는 G-CSFR에 특이적인 항체;이의 가용성 G-CSFR 또는 G-CSF-결합 부위 및 G-CSF를 인코딩하는 핵산 분자에 표적화된 20개 내지 30개 뉴클레오티드 센스 또는 안티센스 분자(상기 핵산 분자는 서열번호:3에 제시된 서열을 포함한다) 또는 G-CSFR를 인코딩하는 핵산 분자에 표적화된 20개 내지 30개 뉴클레오티드 센스 또는 안티센스 분자(상기 핵산 분자는 서열번호:7에 제시된 서열을 포함한다)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 G-CSF 또는 G-CSFR 억제제를 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.

따라서 대상에서 CNS의 염증성 신경퇴행성 질환을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 G-CSF 또는 G-CSFR을 억제하거나 G-CSF 또는 G-CSFR의 발현을 하향 조절하는 제제를 대상에게 투여하는 단계를 포함하며 상기 제제는

a. G-CSF 또는 G-CSFR에 특이적인 항체;

b. 이의 가용성 G-CSFR 또는 G-CSF-결합 부위;

c. G-CSF를 인코딩하는 핵산 분자에 표적화된 20개 내지 30개 뉴클레오티드 센스 또는 안티센스 분자(상기 핵산 분자는 서열번호:3에 제시된 서열을 포함한다); 또는 G-CSFR를 인코딩하는 핵산 분자에 표적화된 20개 내지 30개 뉴클레오티드 센스 또는 안티센스 분자(상기 핵산 분자는 서열번호:7에 제시된 서열을 포함한다)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

일반적으로, 제제는 CNS의 염증성 신경퇴행성 질환의 증상을 개선하기에 충분한 상태로 당분간 투여된다. 일반적으로, 질환은 MS, 데빅병 또는 바이러스 감염과 같은 호중구들의 침투와 연관된다.

보다 구체적으로, 본 발명은 대상에서 MS, 데빅병 또는 바이러스 감염의 치료 방법에 관한 것이며, 방법은 G-CSF 또는 G-CSFR를 억제하거나 G-CSF 또는 G-CSFR의 발현을 억제하기에 효과적인 제제의 양을 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.

투여는 전신성 또는 국소적일 수 있다. 전신성 투여가 특히 유용하다. "전신성 투여"에 대한 언급은 관절 내, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 및 피하 주사, 주입뿐만 아니라 경구, 직장 및 비강 경로들에 의한 투여, 또는 흡입을 통한 투여를 포함한다. 정맥 내 또는 피하 주사에 의한 투여가 특히 유용하다.

G-CSF, G-CSFR 또는 이들의 생산에 길항하는 제제들은 단백질성, 비단백질성(예를 들어 화학 독립체들) 및 핵산 분자들을 포함한다.

단백질성 및 비단백질성 분자들은 펩티드들, 폴리펩티드들 및 단백질들, 소형, 중형 또는 대형 화학 분자들뿐만 아니라 천연물 선별 또는 화학 라이브러리들의 선별로부터 확인된 분자들을 포함한다. 천연물 선별은 G-CSF 또는 G-CSFR 활성 또는 G-CSF 또는 G-CSFR 발현 수준에 영향을 미치는 분자들 또는 분자들의 그룹들을 위한 식물들, 미생물들, 토양 하천층, 산호, 수생 환경들 및 외계 환경들로부터의 추출물들 또는 샘플들의 선별을 포함한다. 또한 이들 분자들은 G-CSF/G-CSFR 상호작용에 영향을 미치거나 또는 G-CSF/G-CSFR-매개 신호전달을 조절할 수 있다.

본 발명은 CNS의 염증성 신경퇴행성 질환의 치료에 사용되는 또 다른 항염증제, 면역억제제 또는 다른 제제와 조합하여 G-CSF 및/또는 G-CSFR을 길항하는 것과 같은 조합 치료법을 추가로 고려한다.

따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 대상에서 MS, 데빅병 또는 바이러스 감염과 같은 하지만 이에 한정되지 않는 CNS의 염증성 신경퇴행성 질환의 치료 방법에 관한 것이며, 방법은 G-CSF 또는 G-CSFR을 억제하거나 G-CSF 또는 G-CSFR의 발현을 억제하는 제제 및 코르티코스테로이드(corticosteroids)와 같은 항-염증제, 마이토잔트론, 글라티라머 아세테이트, 인터페론, 또는 화학요법제와 같은 면역 억제제와 같은 적어도 하나의 다른 치료제를 투여하는 단계를 포함한다.

하나의 특정 G-CSF 또는 G-CSFR 길항 제제는 G-CSF 또는 G-CSFR의 활성을 억제하는 항체이다. 실시태양에서, 항체는 G-CSF 또는 G-CSFR에 특이적으로 또는 선택적으로 결합한다. 다른 유용한 제제들은 G-CSF 또는 G-CSFR 발현을 억제하는 소형 분자 억제제들, 이들의 가용성 G-CSF 수용체들 또는 G-CSF-결합 단편들, G-CSF의 수용체-결합 부위들 및 핵산 분자들을 포함한다. 항체는 단일 특이적(mono-specific) 또는 이중 특이적(bi-specific)을 포함한 다중 특이적(multi-specific)일 수 있다.

따라서, 일 실시태양에서 본 발명은 대상에서 MS, 데빅병 또는 뇌에서의 바이러스 감염의 치료 방법을 고려하며 방법은 G-CSF 또는 G-CSFR의 활성 또는 G-CSF가 G-CSFR과 상호작용하는 능력을 억제하기에 효과적인 항체의 양을 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 이러한 양태는 G-CSF/G-CSFR-매개 신호전달을 억제하기에 효과적인 항체의 투여를 포함한다.

G-CSF 유전자 또는 mRNA 또는 G-CSFR 유전자 또는 mRNA에 대한 센스 또는 안티센스 분자들이 제공되며, 또한 G-CSF 또는 G-CSFR 유전자 또는 mRNA의 선도 서열(leader sequence) 및 선택된 인트론들 또는 엑손들을 포함하는 코딩 또는 비-코딩 영역들의 임의의 일부에 대한 센스 또는 안티센스 분자들이 제공된다. 따라서, 20개 내지 30개 길이의 뉴클레오티드들의 센스 및 안티센스 분자들은 본 발명에서 서열번호들:2, 3, 6 및/또는 7 중 하나 이상으로 고려된다.

치료될 유용한 대상들은 포유류 및 특히 인간들이다.

본 발명은 G-CSF 또는 G-CSFR의 길항제들을 포함하는 약학적 조성물들의 사용으로 확장된다. 하나의 특히 유용한 조성물은 항-G-CSF 항체 또는 항-G-CSFR 항체를 포함한다. 상기에서 나타난 바와 같이, G-CSF 또는 G-CSFR의 길항제는 G-CSF 또는 G-CSFR 활성의 길항제를 포함한다.

본 발명은 대상에서 MS, 데빅병 또는 뇌에서의 바이러스 감염을 치료하기 위한 약제의 제조에서 G-CSF 또는 G-CSFR에 대한 항체의 사용을 추가로 고려한다.

또 다른 양태는 대상에서 CNS의 염증성 신경퇴행성 질환의 치료를 위한 약제의 제조에서 G-CSF 또는 G-CSFR을 억제 또는 G-CSF 또는 G-CSFR의 발현을 억제하는 제제의 사용을 제공하며 제제는

a. G-CSF 또는 G-CSFR에 특이적인 항체;

b. 이의 가용성 G-CSFR 또는 G-CSF-결합 부위;

본 명세서 전체에서 사용된 서열 식별자들의 요약이 표 1에서 제공된다. 약자들의 목록은 표 2에서 제공된다.

서열 식별자들의 요약

서열번호	설명
1	선도 서열을 포함하는 인간 G-CSF 아미노산 서열
2	인간 G-CSF 코딩 및 비-코딩 뉴클레오티드 서열
3	성숙한 단백질을 인코딩하는 인간 G-CSF 뉴클레오티드 서열
4	인간 G-CSF 성숙한 단백질 아미노산 서열
5	선도 서열을 포함하는 인간 G-CSFR3 아미노산 서열
6	인간 G-CSF3R 코딩 및 비-코딩 뉴클레오티드 서열
7	성숙한 단백질을 인코딩하는 인간 G-CSF3R 뉴클레오티드 서열
8	인간 G-CSF3R 성숙한 단백질 아미노산 서열

약자들

약자	설명
CNS	중추신경계
EAE	실험적 자가면역성 뇌척수염
G-CSF	과립구콜로니자극인자
G-CSFR	과립구콜로니자극인자 수용체
MS	다발성 경화증
NMO	시신경 척수염(데빅병으로도 알려짐)

본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.

도 1은 G-CSF 결핍 생쥐가 야생형(C57Bl/6) 생쥐에 비해 실험적 자가면역성 뇌척수염(EAE)으로부터 보호되는 것을 나타내는 그래프이다. 질병은 0일부터 30일까지 관찰되었으며 마비 점수는 실험 섹션에서 언급한 대로 결정되었다.
도 2는 야생형(C57Bl/6) 생쥐의 EAE 모델에서 G-CSF의 작용을 항-G-CSF 항체로 막는 것이 아이소타입 대조군(isotype control)으로 처리된 동물들과 비교하여 질병의 진행을 억제한다는 것을 나타내는 그래프이다. 질병은 0일부터 30일까지 관찰되었으며 마비 점수는 실험 섹션에서 언급한 대로 결정되었다.
도 3a 내지 e는 아이소타입 대조군 및 항-G-CSF 항체로 처리된 동물들로부터 얻어진 다양한 샘플들에서 호중구 백분율의 시간 경과 분석의 그래프이다.
도 4a 내지 i는 10일째에 희생된 아이소타입 대조군 및 항-G-CSF 항체로 처리된 동물들 모두로부터 정제된 T 세포들의 재활성화 이후 다양한 사이토카인들의 수준을 나타내는 그래프이다.

단수 형태 "하나", "하나의" 및 "그"는 문맥에서 달리 명확하게 지시하지 않는 한 복수형을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "하나의 신경퇴행성 질환"에 대한 언급은 단일 질환뿐만 아니라 두 가지 이상의 질환들을 포함하며; "하나의 제제"에 대한 언급은 단일 제제뿐만 아니라 두 가지 이상의 제제들을 포함하며; "그 발명"에 대한 언급은 발명의 단일 및 다중 양태들을 포함한다; 등.

용어들 "제제", "화합물", 및 "활성" 은 G-CSF, G-CSFR, G-CSF/G-CSFR 상호작용, G-CSF/G-CSFR-매개 신호전달 및/또는 G-CSF 또는 G-CSFR의 발현을 길항하는 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 유도하는 물질을 언급하기 위해 본 발명에서 교체되어 사용될 수 있다. 또한 용어들은 염을 포함하는 이들의 약학적으로 허용가능하고 약리학적으로 활성인 형태를 포함한다. 따라서, 원하는 효과는 G-CSF 활성 또는 신호전달 또는 기능의 억제 및 G-CSF 또는 이의 수용체의 발현의 하향 조절을 포함한다. "발현의 하향 조절"은 "발현의 억제"를 포함하며 G-CSF 또는 G-CSFR의 생산을 유도하는 전사 또는 번역 또는 RNA 프로세싱을 억제 또는 방해 또는 감소시키는 것을 의미한다. 따라서 G-CSF 및/또는 G-CSFR 수준들에서 감소의 어떠한 형태가 본 발명에서 고려된다.

G-CSF 또는 G-CSFR에 길항하는 본 발명에서 고려된 제제들은

a. G-CSF 또는 G-CSFR에 특이적인 항체;

b. 이의 가용성 G-CSFR 또는 G-CSF-결합 부위;

c. G-CSF를 인코딩하는 핵산 분자에 표적화된 20개 내지 30개 뉴클레오티드 센스 또는 안티센스 분자(상기 핵산 분자는 서열번호:3에 제시된 서열을 포함한다); 또는 G-CSFR를 인코딩하는 핵산 분자에 표적화된 20개 내지 30개 뉴클레오티드 센스 또는 안티센스 분자(상기 핵산 분자는 서열번호:7에 제시된 서열을 포함한다)를 포함한다.

CNS의 염증성 신경퇴행성 질환의 치료에 사용되는 항-염증성, 면역억제제 및/또는 다른 제제와 같은 다른 치료제와 함께 G-CSF 또는 G-CSFR 길항제의 사용을 수반하는 조합 치료법이 또한 본 발명에 의해 고려된다.

하나의 특히 유용한 제제는 G-CSF 또는 G-CSFR에 특이적 또는 선택적인 항체이며 및/또는 이는 G-CSF/G-CSFR 상호작용을 방해한다.

용어들 "항체" 및 "항체들"은 (예를 들어 온전한 Fc 영역을 가진) 전장 항체들, 예를 들어 Fv, Fab, Fab' 및 F(ab')₂ 단편들을 포함하는 항원-결합 단편들; 및 단일 사슬 항체들과 같은 재조합 방법들을 이용하여 생산된 항체-유래 폴리펩티드들을 포함하나 이에 제한되지 않는 다중클론과 단일클론 항체들 및 단일클론 항체들로부터 유래한 다양한 모든 형태를 포함한다. 또한 본 발명에서 사용된 용어들 "항체" 및 "항체들"은 예를 들어, 형질전환 동물들에서 또는 파지 디스플레이를 통해 생산된 인간 항체들뿐만 아니라 키메릭 항체들, 인간화 항체들, 영장류화 항체들 또는 탈면역화된 항체들을 언급한다. 또한 이는 치료적으로 허용가능할 수 있는 항체들의 다른 형태들 및 이의 항원-결합 단편들, 예를 들어 연골 해양 동물들(cartilage marine animals) 또는 낙타과(Camelidae), 또는 이러한 항체들을 기반으로 하는 라이브러리들로부터 유래한 단일 도메인 항체들을 포함한다. 항체들의 단편 또는 변형된 형태들의 선택은 또한 단편 또는 변형된 형태들이 이들의 반감기에 대해서 가지는 임의의 효과를 수반할 수 있다. 예를 들어, 특정 상황에서 호중구 감소증과 같은 항-G-CSF/G-CSFR 치료의 전반적인 영향을 피하기 위해 항체가 짧은 반감기를 가지는 것이 유리할 수 있다. 선택적으로, 악화가 일반적이거나 확실한 듯한 경우 긴 반감기를 가진 항체가 유리할 수 있다. 본 발명에서 항체에 대한 "반감기"는 2일 이하인 경우 짧은 것으로 여겨진다. 항체에 대한 긴 반감기는 2일을 초과하는 임의의 반감기일 것이며, 특히 7일보다 클 수 있다.

용어 "단일클론 항체"는 본 발명에서 실질적으로 동종 항체들의 집단으로부터 얻어진 항체를 언급하기 위해 사용된다. 즉, 집단을 포함하는 개별 항체들은 미량으로 존재할 수 있는 자연발생 돌연변이들을 제외하고는 동일하다. 따라서 본 발명에서 사용된 수식어 "단일클론"은 실질적으로 항체의 동종 집단으로부터 얻어진 항체의 특성을 나타내며 항체가 특정 방법에 의해 생산되는 것을 나타내기 위해 사용되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따른 단일클론 항체들은 콜러(Kohler)와 밀스테인(Milstein), Nature 256:495-499, 1975에 기술된 하이브리도마 방법, 또는 (미국특허 4,816,567에 기술된 것과 같은) 재조합 DNA 방법들에 의해 만들어질 수 있다. 또한 단일클론 항체들은 클락슨(Clackson) 등, Nature 352:624-628, 1991 또는 막스(Marks) 등, J. Mol . Biol . 222:581-597, 1991에 기술된 기술들을 이용하는 파지 항체 라이브러리들로부터 분리될 수 있다.

본 발명에 사용된 용어들 "유효량" 및 "치료적 유효량"은 G-CSF 또는 G-CSFR을 억제 또는 G-CSF 또는 G-CSFR의 발현을 억제하는 원하는 치료적 또는 생리학적 효과 또는 성과를 제공하는 제제의 충분한 양을 의미한다. 또한 효과는 MS, 데빅병 또는 뇌에서의 바이러스 감염과 같은 CNS의 염증성 신경퇴행성 질환 증상의 개선일 수 있다. 바람직하지 않은 효과들, 예를 들어 부작용들은 때때로 원하는 치료 효과와 함께 나타날 수 있다; 따라서 의사는 무엇이 적절한 "유효량"인지를 결정하는데 있어 잠재적 위험과 잠재적 이익을 비교 검토한다. 필요한 제제의 정확한 양은 대상의 종, 나이 및 일반적인 상태, 투여의 형태 등에 의존하며 대상에 따라 다양할 것이다. 따라서 정확한 "유효량"을 특정하는 것이 불가능할 수 있다. 하지만 임의의 개별적인 경우에서 적절한 "유효량"은 통상적인 실험을 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, MS, 데빅병 또는 뇌에서의 바이러스 감염의 영향들을 개선하는 항-G-CSF/G-CSFR 항체의 능력은 동물 모델 시스템에서 평가될 수 있다. 당업자는 대상의 크기, 대상의 증상의 심각성, 및 특정 조성물 또는 선택된 투여 경로와 같은 인자들에 기초하여 필요한 양을 결정할 수 있을 것이다.

본 발명의 일 실시태양이 G-CSF 또는 이의 수용체에 대한 항체들의 사용에 관한 것인 한 유효량은 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100μg/kg체중, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000μg/kg체중 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20mg/kg체중과 같은 약 10μg/kg체중 내지 20mg/kg체중의 항체를 포함한다. 유사한 양이 단일 또는 조합 치료법에 대해 제공된다.

"CNS의 염증성 신경퇴행성 질환"에 대한 언급은 CNS에서 임의의 비대한 또는 과도한 또는 장기적인 염증성 반응과 같은 CNS의 질병 상태를 포함한다. 일반적으로 염증성 신경퇴행성 질환은 CNS에서 호중구들의 침투와 관련된다. CNS 질환은 만성 또는 급성 또는 그 사이의 단계일 수 있다. 또한 만성 질환의 악화와 같은 재발하는 급성 형태들(recurring acute forms)이 본 발명에 의해 고려된다. 본 발명은 특히 MS, 데빅병(NMO) 및 뇌에서의 바이러스 감염에 관한 것이다.

일반적으로, 제제는 약학적으로 또는 약리학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 제공된다.

"약학적으로 허용가능한" 담체, 희석제 및/또는 부형제는 생물학적으로 또는 그 밖의 부적합하지 않은 물질로 이루어진 약학적 비히클이며, 즉 물질은 임의의 또는 실질적인 부작용을 일으키지 않고 선택된 G-CSF/G-CSFR-길항 제제와 함께 대상에게 투여될 수 있다. 담체들은 임의의 모든 용매, 분산매, 코팅, 항박테리아 및 항진균제, 긴장성 조절용 제제, 완충액, 킬레이트제, 및 흡수지연제 등을 포함할 수 있다.

유사하게 본 발명에서 제공된 제제의 "약리학적으로 허용가능한" 염은 생물학적으로 또는 그 밖의 부적합하지 않은 염이다.

본 발명에서 사용된 용어들 "치료하는" 및 "치료"는 치료를 언급하며 예방 또는 방지 조치들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 치료는 염증성 신경퇴행성 질환 이후 CNS의 염증성 신경퇴행성 질환의 심각성 및/또는 증상의 빈도 감소, 질환의 증상 및/또는 근본 원인의 제거, 질환 증상 출현 및/또는 이들의 근본 원인의 예방 및 손상의 호전 또는 교정 또는 개선을 초래할 수 있다. 이러한 증상 또는 특징들은 증가된 호중구 침투, 뇌척수액에서 증가된 호중구들, (미엘로퍼옥시다아제 및 칼프로텍틴과 같은) 항미생물 인자들, (엘라스타아제와 같은) 단백질분해효소, (카텝신과 같은) 산 가수분해효소, 케모카인들 및 사이토카인들을 포함하나 이에 제한되지 않는 호중구 유래 인자들의 증가된 방출을 포함한다. 따라서 치료는 증상의 "치유"가 아닌 개선을 나타낼 수 있다. 또한 치료는 악화 사건이 발생하기 전까지 시작되지 않을 수 있다. 이러한 내용에서 또한 용어 "예방"은 악화 사건 발생의 가능성의 방지 또는 치료에 적용된다. 악화 사건의 예는 뇌졸중 또는 전신성 맥관 구조의 다른 사건 또는 바이러스와 같은 병원체에 의한 감염을 포함한다.

또한 항체들은 G-CSF 또는 G-CSFR에 대한 쥐 또는 토끼 항체들의 중쇄 및 경쇄 가변 영역들 및 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인들을 포함하는 G-CSF 또는 G-CSFR에 대한 항체들을 포함하는 키메릭일 수 있다.

용어들 "질환" 및 "질병"은 본 명세서 전체에서 교환적으로 사용된다.

본 발명에서 사용된 "대상"은 본 발명의 약학적 조성물들 및 방법들로부터 이익을 얻을 수 있는 동물, 특히 포유동물 및 보다 특히 인간을 언급한다. 현재 기술된 약학적 조성물들 및 방법들로부터 이익을 얻을 수 있는 동물의 형태에 대한 제한은 없다. 대상은 인간 또는 비-인간인지에 관계없이 대상뿐만 아니라 개인, 환자, 동물, 숙주 또는 수용자로 언급될 수 있다. 본 발명의 화합물들 및 방법들은 인간 의학 및 수의학에서 적용성을 가진다.

특정 포유류들은 인간들 및 실험실 실험 동물들이다. 실험실 실험 동물들의 예들은 생쥐, 쥐, 토끼, 기니피그, 햄스터, 고양이 및 개 및 영장류를 포함한다.

본 발명의 하나의 특히 유용한 제제는 G-CSF 수용체를 통해 G-CSF 신호전달을 억제하는 G-CSF 또는 G-CSFR에 대한 항체이다. G-CSF에 대한 이러한 항체들은 항-G-CSF 항체들로 언급될 수 있으며 G-CSFR에 대한 항체들은 항-G-CSFR 항체들로 언급될 수 있다. 항-G-CSF 항체 또는 항-G-CSFR 항체를 언급하는 것으로 의도되는 경우 단순히 항-G-CSF/G-CSFR 항체 또는 항체들로 언급할 수 있다.

비록 다중클론 및 단일클론 항체들 모두가 쉽게 생산될 수 있다고 하더라도 단일클론 항체들이 대량으로 생성될 수 있기 때문에 특히 선호되며, 이들은 매우 특이적이고 단일항원 부위들(single antigenic sites)을 향해 유도된다. 또한 단일클론 항체 제제들은 동종으로 이루어져서 이들을 치료적 사용을 위한 항원-결합 단편들 및 다른 제작된 항체 유도체들을 생성하는데 이상적으로 만든다.

비록 다중클론 항체들이 또한 상대적으로 쉽게 제조되더라도 이들은 단일클론 항체들만큼 유용하지 않으며, 이는 다중클론 항체 제제들이 일반적으로 서로 다른 항원 부위들에 대한 서로 다른 항체들을 포함하며 따라서 치료적 사용을 위한 항원-결합 단편들 및 다른 제작된 항체 유도체들을 생성하는데 적합하지 않기 때문이다.

상기에서 기술된 하이브리도마 방법이 단일클론 항체들을 생산하기 위해 생쥐와 같은 동물들에서 사용된다. 하지만 동물들로부터 유래한 항체들은 면역 반응을 일으킬 수 있기 때문에 일반적으로 인간으로의 투여에 적합하지 않다. 아래에서 기술된대로 이러한 항체들은 인간 또는 원하는 비-인간 대상으로의 투여에 적합하도록 변경될 수 있다.

예를 들어, 항-G-CSF/G-CSFR 항체들은 당업계에 주지된 (예를 들어, 대장균(E. coli) 발현 시스템에서) 재조합 방법들을 이용하여 제조될 수 있다. 이러한 접근법에서 본 발명의 뮤린(murine) 단일클론 항체들과 같은 단일클론 항체들을 인코딩하는 DNA가 하이브리도마 세포주들로부터 분리되고, 표준 절차들을 이용하여 유전자 배열 순서를 밝히고 재조합 DNA 기술을 이용하여 선택적으로 조작될 수 있다. 예를 들어, DNA는 또 다른 관심 DNA와 융합될 수 있거나 (돌연변이 생성 또는 다른 통상적인 기술들에 의해) 하나 이상의 핵산 잔기들을 첨가, 결실 또는 치환하도록 변화될 수 있다. DNA는 벡터들 내에 위치할 수 있으며 그런 다음 (미국특허 4,399,216; 4,912,040; 4,740,461 및 4,959,455에 기술된 것과 같은) 당업계에 주지된 방법들을 이용하여 적절한 숙주 세포들로 형질감염 또는 형질전환된다. 하이브리도마 세포주들로부터 분리된 DNA는 이의 발현에 의해 생산되는 항체의 특성을 변화시키기 위하여 변경될 수 있다.

예를 들어, 뮤린 항-G-CSF/G-CSFR 단일클론 항체들의 키메릭 형태들은 미국특허 4,816,567 및 모리슨(Morrison) 등, Proc . Nat . Acad . Sci . 81:6851, 1984에 기술된 것과 같이 선택된 뮤린 중쇄 및 경쇄 불변 도메인들을 인코딩하는 뉴클레오티드들을 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인들을 인코딩하는 뉴클레오티드들로 교체함으로써 만들어질 수 있다. 그런 다음 키메릭 항체들이 변형된 DNA로 형질감염된 뮤린 골수종 세포주와 같은 적절한 세포주에서 만들어질 수 있다.

따라서 본 발명에 의해 고려되는 항체들은 비-뮤린 중쇄 및 경쇄 항체 불변 도메인들과 융합한 뮤린 항-G-CSF/G-CSFR 단일클론 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역들을 포함하는 키메릭 항-G-CSF/G-CSFR 항체들이다. 특정 실시태양에서, 비-뮤린 중쇄 및 경쇄 불변 도메인들은 인간 중쇄 및 경쇄 항체 불변 도메인들이다. 유사하게, 키메릭 항체들은 G-CSF 또는 G-CSFR에 대한 쥐 또는 토끼 항체들의 중쇄 및 경쇄 가변 영역들 및 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인들을 포함하는 G-CSF 또는 G-CSFR에 대한 항체들을 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용하기 위한 항-G-CSF/G-CSFR 항체들은 또한 인간화 항체들을 포함한다. 일반적으로, 인간화 항체들은 인간 항체들(수용자 항체)이며 상보성 결정 영역(CDR) 잔기들은 생쥐, 쥐, 토끼 또는 비-인간 영장류로부터와 같은 비-인간 종(공여자 항체)으로부터의 CDR 영역 잔기들에 의해 교체된다. 또한 일부 경우에 인간 항체의 특정 프레임워크 영역(FR) 잔기들은 상응하는 비-인간 잔기들에 의해 교체될 수 있으며, 또는 인간화 항체들은 수용자 항체 또는 공여자 항체에서는 발견되지 않는 잔기들을 포함할 수 있다. 항체 성능 및 친화도를 증가시키기 위해 이들 변형들이 이루어진다. 일반적으로 인간화 항체는 실질적으로 적어도 하나, 및 일반적으로 두 개의 가변 영역들의 모두를 포함할 것이며, 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역들은 비-인간 항체의 CDR 영역들에 상응하며 모든 또는 실질적으로 모든 FR들은 인간 항체 서열의 FR들이다. 또한 인간화 항체는, 일반적으로 인간 항체의 항체 불변 영역(Fc)인, 항체 불변 영역(Fc)의 적어도 일부를 선택적으로 포함할 수 있다(Jones et al , Nature 321:522-525, 1986; Reichmann et al , Nature 332:323-329, 1988; Presta, Curr . Op . Struct . Biol . 2:593-596, 1992; Liu et al , Proc . Natl. Acad . Sci . USA 84:3439, 1987; Larrick et al , Bio / Technology 7:934, 1989; Winter & Harris, TIPS 14:139, 1993; Carter et al, Proc . Nat . Acad . Sci . 89:4285 1992). 유사하게, 영장류화 항체를 만들기 위하여 뮤린 CDR 영역들이 당업계에 알려진 방법들을 이용하여 영장류 프레임워크 내로 삽입될 수 있다(예를 들어 WO 93/02108 및 WO 99/55369 참조).

선택적으로, 인간화 항체가 "버니어링(veneering)" 과정에 의해 만들어질 수 있다. 특유의 인간 및 뮤린 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 가변 영역들의 통계적 분석은 노출된 잔기들의 미세 패턴들이 인간 및 뮤린 항체들에서 서로 다르다는 것을 밝혀내었으며, 대부분의 개별 표면 위치들은 소수의 다른 잔기들에 대한 강한 선호도를 가진다(Padlan et al, Mol . lmmunol . 28:489- 498, 1991 and Pedersen et al, J. Mol . Biol . 235:959-973, 1994 참조). 따라서 프레임워크 영역들에서 인간 항체들에서 일반적으로 발견되는 것들과 다른 노출된 잔기들을 교체함으로써 비-인간 Fv의 면역원성을 감소시키는 것이 가능하다. 단백질 항원성은 표면 접근성과 연관될 수 있기 때문에 표면 잔기들의 교체는 생쥐 가변 영역이 인간 면역 시스템에 "보이지 않게" 하는데 충분할 수 있다. 인간화의 이러한 절차는 항체의 오직 표면만이 변형되고 지탱하는 잔기들은 영향을 받지 않기 때문에 "버니어링"으로 언급된다.

또한 WO 2004/006955는 비-인간 항체의 가변 영역의 CDR 서열들에 대한 기준 CDR 구조 형태들을 인간 항체 서열들, 예를 들어 생식세포 계열 항체 유전자 세그먼트들의 라이브러리로부터의 상응하는 CDR들에 대한 기준 CDR 구조 형태들과 비교함으로써 인간 항체 유전자들로부터의 가변 영역 프레임워크 서열들을 선택하는 것에 기반한 항체들을 인간화하기 위한 방법들을 기술한다. 비-인간 CDR들과 유사한 기준 CDR 구조 형태들을 가진 인간 항체 가변 영역들은 인간 항체 서열들 일원의 부분 집합을 형성하며 이들로부터 인간 프레임워크 서열들을 선택한다. 부분 집합 일원들은 인간 및 비-인간 CDR 서열들 사이의 아미노산 유사성에 의해 추가로 정렬될 수 있다. WO 2004/006955의 방법에서, 상위 랭킹 인간 서열들은 선택된 부분 집합 일원 인간 프레임워크를 이용하여 인간 CDR 서열들을 비-인간 CDR 대응물로 기능적으로 대체하는 키메릭 항체를 구성하기 위한 프레임워크 서열들을 제공하도록 선택되며 이로 인해 비-인간 및 인간 항체들 사이의 프레임워크 서열들을 비교할 필요 없이 높은 친화성 및 낮은 면역원성의 인간화 항체를 제공한다.

해당 항체의 CDR들은 예를 들어, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., US Department of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication No. 91-3242, 1991에서 카밧(Kabat) 등에 의해 기술된 시스템을 사용하여 쉽게 확인될 수 있다.

특정 실시태양에서, 본 발명에서 사용하기 위한 항체들은 인간 단일클론 항체들이다. G-CSF 또는 G-CSFR로 유도되는 이러한 인간 단일클론 항체들은 생쥐 시스템 보다는 인간 면역 시스템의 일부를 가지는 유전자 이식(transgenic) 또는 염색체 이식(transchromosomic) 생쥐를 이용하여 생성될 수 있다. 이들 유전자 이식 및 염색체 이식 생쥐는 본 발명에서 HuMAb 생쥐 및 KM 생쥐로 언급되는 생쥐를 포함한다.

더 나아가 인간 면역글로불린 유전자들을 발현하는 대안적인 유전자 이식 동물 시스템이 당업계에서 이용 가능하며 항체들을 증가시키는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 제노마우스(Xenomouse)(Abgenix, Inc.)로 언급되는 대안적인 유전자 이식 시스템이 사용될 수 있다; 이러한 생쥐는 예를 들어, 미국특허 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6,150,584 및 6,162,963에 기술된다.

또한 인간 면역글로불린 유전자들을 발현하는 대안적인 염색체 이식 동물 시스템이 당업계에서 이용 가능하며 G-CSF 또는 G-CSFR에 대한 항체들을 증가시키는데 이용될 수 있다. 예를 들어, "TC 생쥐"로 언급되는 인간 중쇄 트랜스염색체(transchromosome) 및 인간 경쇄 트랜스염색체를 모두 가지는 생쥐가 사용될 수 있다; 이러한 생쥐는 토미주카(Tomizuka) 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 97:722-727, 2000에 기술된다.

인간 단일클론 항체들은 또한 인간 면역글로불린 유전자들의 라이브러리들을 선별하기 위한 파지 디스플레이(phage display) 방법들을 이용하여 제조될 수 있다. 인간 항체들을 분리하기 위한 이러한 파지 디스플레이 방법들은 당업계에 확립되어 있다. 예를 들어: 미국특허 5,223,409; 5,403,484; 및 5,571,698; 미국특허 5,427,908 및 5,580,717; 미국특허 5,969,108 및 6,172,197 및 미국특허 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 및 6,593,081 참조.

또한 인간 단일클론 항체들은 면역 조치에 대해서 항체 반응이 일어날 수 있도록 하기 위하여 그 안으로 인간 면역 세포들이 재구성되는 SCID 생쥐를 이용하여 제조될 수 있다. 이러한 생쥐는 예를 들어, 미국특허 5,476,996 및 5,698,767에 기술된다.

또한 본 발명의 항-G-CSF/G-CSFR 항체들은 Fv, Fab, Fab' 및 F(ab')₂ 단편들과 같은 항원-결합 단편들을 포함한다. 통상적으로 항원-결합 단편들은 완전한 항체들의 단백질 가수분해 소화에 의해 생성된다(Morimoto et al, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117,1992; Brennan et al, Science 229:81, 1985). 재조합 숙주 세포들에서 바로 항체들의 항원-결합 단편들을 제조하기 위한 수많은 재조합 방법들이 현재 개발되었다.

예를 들어, Fab'-SH 단편들은 대장균으로부터 바로 회수될 수 있으며 화학적으로 결합되어 F(ab')₂ 단편들을 형성할 수 있다(Carter et al, Bio / Technology 10:163-167, 1992). 또한 F(ab')₂단편들은 F(ab')₂ 분자의 조립을 촉진시키기 위해 류신 지퍼(leucine zipper) GCN4를 이용하여 형성될 수 있다. 또한 Fv, Fab 또는 F(ab')₂단편들은 재조합 숙주 세포 배양액들로부터 바로 분리될 수 있다. 미국특허 4,946,778; Bird, Science 242:423, 1988, Huston et al , Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85:5879, 1988 및 Ward et al , Nature 334:544, 1989에 기술된 것들을 포함하는 단일 사슬 항체들의 생산을 위한 수많은 재조합 방법들이 개발되었다. 단일 사슬 항체들은 단일 폴리펩티드 사슬(scFvs)을 제공하기 위하여 짧은 펩티드 링커를 통해 중쇄(V_H) 및 경쇄(V_L) 가변 영역(Fv 영역) 단편들을 연결함으로써 만들어질 수 있다. 또한 scFvs는 두 개의 가변 영역들 사이의 펩티드 링커의 길이에 따라 2량체들(dimers) 또는 3량체들(trimers)을 형성할 수 있다(Kortt et al , Protein Engineering 10:423, 1997). 파지 디스플레이는 본 발명의 항원-결합 단편들을 제조하기 위한 또 다른 주지된 재조합 방법이다.

본 발명의 항원-결합 단편들은 원하는 특성들을 위해 선별될 수 있다. 본 발명에 기술된 분석법들은 G-CSF 또는 G-CSFR에 결합하며 G-CSFR을 통해 G-CSF 신호전달을 길항하는 항원-결합 단편들을 확인하는 수단을 제공한다.

발현을 위한 숙주들로 이용가능한 포유류 세포주들이 당업계에 주지되어 있으며 미국 미생물보존센터(ATCC; American Type Culture Collection)로부터 입수가능한 많은 불멸화 세포주들을 포함한다. 이들은 그 중에서도 중국 햄스터 난소(CHO) 세포들, NSO, SP2 세포들, HeLa 세포들, 새끼 햄스터 신장(BHK) 세포들, 원숭이 신장 세포들(COS), 인간 간세포성 암 세포들(예를 들어, Hep G2), A549 세포들, 3T3 세포들, 및 수많은 다른 세포주들을 포함한다. 포유류 숙주 세포들은 인간, 생쥐, 쥐, 개, 원숭이, 돼지, 염소, 소, 말 및 햄스터 세포들을 포함한다. 특히 선호되는 세포주들은 높은 발현 수준을 가지는 세포주들에 대한 결정을 통해 선택된다. 사용될 수 있는 다른 세포주들은 Sf9. 세포들과 같은 곤충 세포주들, 양서류 세포들, 박테리아 세포들, 식물 세포들 및 균류 세포들이다. 중쇄 또는 이의 항원-결합 부위, 경쇄 및/또는 이의 항원-결합 부위를 인코딩하는 재조합 발현 벡터들이 포유류 숙주 세포들 내로 도입되는 경우, 항체들은 숙주 세포들에서 항체의 발현 또는 보다 바람직하게 숙주 세포들이 자란 배지로의 항체 분비를 나타내기에 충분한 시간 동안 숙주 세포들을 배양함으로써 만들어진다.

항체들은 표준 단백질 정제 방법들을 이용하여 배지로부터 회수될 수 있다. 또한, 숙주 세포주들로부터의 본 발명의 항체들의 발현은 수많은 알려진 기술들을 이용하여 촉진될 수 있다. 예를 들어, 글루타민 합성효소 유전자 발현 시스템(GS 시스템)은 특정 질환들 하에서 발현을 증진시키기 위한 일반적인 접근법이다. GS 시스템은 유럽특허 0 216 846, 0 256 055, 및 0 323 997 및 유럽특허출원 89303964.4와 관련되어 전체 또는 일부에서 논의된다.

서로 다른 세포주들에 의해 또는 형질전환 동물들에서 발현되는 항체들은 서로 다른 다양한 글리코실화 패턴을 가질 수 있다. 하지만 면역-매개 염증성 CNS 질환들의 치료에서 사용되는 G-CSF 또는 G-CSFR에 대한 이러한 항체들 모두는 항체들의 글리코실화 패턴에 상관없이 본 발명의 일부이다.

또한 관심 항체로부터의 다양한 서브클래스 또는 아이소타입의 항체를 얻기 위한 기술들, 즉 서브클래스 스위칭이 알려져 있다. 따라서 IgG1 또는 IgG4 단일클론 항체들은 예를 들어, IgM 단일클론 항체로부터 얻어질 수 있으며 그 반대도 같다. 이러한 기술들은 해당 항체(모 항체)의 항원-결합 특성들을 가지지만 또한 모 항체의 것과는 다른 항체 아이소타입 또는 서브클래스와 관련된 생물학적 특성들을 나타내는 새로운 항체들의 제조를 가능하게 한다. 재조합 DNA 기술들이 사용될 수 있다. 특정 항체 폴리펩티드들을 인코딩하는 복제된 DNA, 예를 들어, 원하는 아이소타입의 항체의 불변 영역을 인코딩하는 DNA가 이러한 절차들에서 사용될 수 있다.

숙주 세포주들에서 클로닝 및 발현을 위해 이용가능한 벡터들이 당업계에 주지되어 있으며 포유류 세포주들에서 클로닝 및 발현을 위한 벡터들, 박테리아 세포주들에서 클로닝 및 발현을 위한 벡터들, 파지에서 클로닝 및 발현을 위한 벡터들 및 곤충 세포주들에서 클로닝 및 발현을 위한 벡터들을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 항체들은 표준 단백질 정제 방법들을 이용하여 회수될 수 있다.

특정 실시태양에서, 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 항체들은 G-CSFR를 통해 G-CSF 신호전달을 길항하는 인간 또는 인간화 항-G-CSF/G-CSFR 항체들이다.

특히, 인간 또는 인간화 항-G-CSF/G-CSFR 항체들은 분리된, 균질한 또는 완전히 또는 부분적으로 정제된 형태이다.

보다 특히 인간 또는 인간화 항-G-CSF/G-CSFR 항체들은 전장 단일클론 항체들 또는 항원-결합 단편들이다.

상기에서 나타난 바와 같이, 항체들의 항원-결합 단편들 또는 변형된 형태들의 선택은 단편들 또는 변형된 형태들이 개개의 반감기에 대해 가지는 효과에 의해 영향을 받을 수 있다.

유용한 제제의 또 다른 예는 G-CSF 상호작용을 위한 자연발생 막-연관(membrane-associated) G-CSFR과 경쟁하는 G-CSFR의 가용성 형태이다. 당업자는 수용체의 가용성 형태들을 용이하게 준비할 수 있다, 예를 들어 US 5,589,456 및 혼조(Honjo) 등, Acta Crystallograph Sect F Struct Biol Cryst Commun . 61( Pt 8):788-790, 2005 참조.

선택적으로, 제제들은 G-CSF 또는 G-CSFR-유전 물질들에 결합하는 이들에 능력에 대해 선별될 수 있다. 일 실시태양에서, G-CSF- 또는 G-CSFR- 인코딩 cDNA 또는 게놈 DNA 또는 mRNA 전사물(transcript) 또는 EST 또는 SAGE 태그와 같은 이들의 일부분이 나노입자 또는 마이크로스피어와 같은 고체 지지체에 고정된다. 그런 다음 잠재적인 제제들이 고정된 핵산 분자들과 접촉하게 되고 결합은 복사, 방출, 원자 여기, 질량 및/또는 밀도의 변화에 의해 탐지된다.

일단 확인되면 제제는 핵산 분자에서 용리되며 보다 자세히 특성화된다. 예를 들어, G-CSF/G-CSFR 유전 물질에 결합하는 제제들은 발현(전사 및/또는 번역)을 억제할 수 있다.

본 발명은 G-CSF 또는 이의 수용체의 길항제로 G-CSF 또는 G-CSFR의 화학 유사체들의 사용을 추가로 고려한다. 상기에서 나타난 바와 같이, 가용성 G-CSF 수용체들이 또한 사용될 수 있다.

본 발명에서 고려된 화학 유사체들은 측쇄들의 변형들, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 합성 동안 인위적인 아미노산들 및/또는 이들의 유도체들의 포함 및 가교제들의 사용 및 단백질성 분자 또는 이들의 유사체들에 형태적 제약을 가하는 다른 방법들을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 의해 고려된 다른 제제들은 사이토카인들 또는 이들의 수용체들을 인코딩하는 유전자들의 안티센스- 또는 센스-매개 메커니즘들에 의한 침묵(silencing)을 유도하기에 유용한 RNA 또는 DNA와 같은 핵산 분자들을 포함한다. 센스-매개 유전자 침묵은 또한 동시-침묵(co-suppression)이라고도 언급되며 RNAi의 유도를 포함하는 여러 메커니즘들을 수반한다. 따라서 전사 및 전사 후 유전자 침묵이 본 발명에서 고려된다.

용어들 "핵산들", "뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 당업자에 의해 용이하게 이해될 RNA, cDNA, 게놈 DNA, 합성 형태들 및 혼합 폴리머들, 센스 및 안티센스 가닥들 모두를 포함하며, 화학적 또는 생화학적으로 변형될 수 있거나 비-자연적인 또는 유도체화된(derivatized) 뉴클레오티드 염기들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 변형들은 (모르폴린 고리와 같은) 유사체들, 비하전 결합들(uncharged linkages)과 같은 뉴클레오티드들 사이 변형들(예를 들어 메틸 포스포네이트들, 포스포트리에스터들, 포스포아미데이트들, 카바메이트들 등), 하전된 결합들(예를 들어 포스포로티오에이트들, 포스포로디티오에이트들 등), 펜던트 모이어티들(pendent moieties)(예를 들어 폴리펩티드들), 인터컬레이터들(intercalators)(예를 들어 아크리딘, 소랄렌 등), 킬레이터들, 알킬화제들 및 변형 결합들(예를 들어 α-아노머 핵산들 등)을 가진 자연발생 뉴클레오티드들의 하나 이상의 표지, 메틸화, 치환을 포함한다. 또한 수소 결합 및 다른 화학적 상호작용들을 통해 지정된 서열에 결합하는 폴리뉴클레오티드들의 능력을 모방하는 합성 분자들을 포함한다. 이러한 분자들은 당업계에 알려져 있으며 예를 들어, 분자의 백본에서 펩티드 결합들이 포스페이트 결합들을 대체하는 것들을 포함한다.

예를 들어, 안티센스 폴리뉴클레오티드 서열들은 G-CSF 유전 서열 또는 G-CSFR 유전 서열의 전사물들을 침묵시키는데 유용하다(Geng et al, Molecular Immunology 44:5121-529, 2007 참조). 또한 G-CSF 유전자 좌위의 전부 또는 일부를 포함하는 폴리뉴클레오티드 벡터들은 센스 또는 안티센스 배향에서 프로모터의 제어 하에 위치할 수 있으며 세포 내로 도입될 수 있다. 세포 내에서 이러한 센스 또는 안티센스 구조체의 발현은 목표로 하는 전사 및/또는 번역을 방해한다. 또한, RNAi 또는 siRNA를 유도하기 위한 동시-억제(즉, 센스-억제 이용) 및 메커니즘이 사용될 수 있다. 선택적으로, 안티센스 또는 센스 분자들이 직접 투여될 수 있다. 후자의 실시태양에서, 안티센스 또는 센스 분자들은 조성물로 제제화되어 다양한 수단을 통해 표적 세포들로 투여될 수 있다.

안티센스 및 센스 분자들에 대한 변형은 모르폴린 뉴클레오티드 유도체들 및 포스포로디아미데이트 결합들로 이루어진 올리고뉴클레오티드들인 모르폴린의 사용을 수반한다(예를 들어, Summerton and Weller, Antisense and Nucleic Acid Drug Development 7:187-195, 1997).

일 실시태양에서, 본 발명은 G-CSF 또는 G-CSFR을 인코딩하는 핵산 분자들의 기능 또는 효과를 조절하는데 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드들 및 유사한 종들과 같은 화합물들을 사용하며, 즉 올리고뉴클레오티드들은 전사 또는 전사 후 유전자 침묵을 유도한다. 이는 표적 핵산을 인코딩하는 하나 이상 핵산 분자들과 특이적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드들을 제공함으로써 수행된다. 올리고뉴클레오티드들은 세포로 직접 제공되거나 세포 내에서 생성될 수 있다. 본 발명에서 사용된 대로, 용어들 "표적 핵산" 및 "G-CSF 또는 G-CSFR을 인코딩하는 핵산 분자"는 DNA, 및 또한 RNA로부터 유래한 cDNA로부터 전사된 인코딩 DNA, RNA(pre-mRNA 및 mRNA 또는 이들의 일부를 포함)를 포함하기 위해 편의적으로 사용되었다. 본 발명의 화합물의 이의 표적 핵산과의 혼성화는 일반적으로 "안티센스"로 언급된다. 결론적으로, 본 발명의 일부 바람직한 실시태양들의 실시에 포함되는 것으로 여겨지는 바람직한 메커니즘은 본 발명에서 "안티센스 억제"로 언급된다. 이러한 안티센스 억제는 일반적으로 올리고뉴클레오티드 가닥들 또는 세그먼트들의 수소 결합-기반 혼성화에 기초하여 적어도 하나의 가닥 또는 세그먼트가 쪼개지고, 분해되고, 또는 동작 불능이 된다. 이러한 관점에서, 이러한 안티센스 억제를 위해 핵산 분자들 및 이들의 기능들을 표적으로 하는 것이 바람직하다.

방해받는 DNA의 기능들은 복제 및 전사를 포함할 수 있다. 예를 들어, 복제 및 전사는 내생 세포 주형(cellular template), 벡터, 플라스미드 구조체 또는 다른 것으로부터일 수 있다. 방해받는 RNA의 기능들은 단백질 번역의 위치로의 RNA의 전좌, RNA 합성의 위치와 떨어진 세포 내 위치들로의 RNA의 전좌, RNA로부터의 단백질의 번역, 하나 이상의 RNA 종을 산출하는 RNA의 스플라이싱, 및 RNA가 관여할 수 있거나 RNA에 의해 촉진될 수 있는 RNA를 수반하는 촉매 활성 또는 복합체 형성과 같은 기능들을 포함할 수 있다.

본 발명의 내용에서, "혼성화"는 올리고머 화합물들의 상보적인 가닥들의 페어링(pairing)을 의미한다. 본 발명에서 페어링의 바람직한 메커니즘은 올리고머 화합물들의 가닥들의 상보적인 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 염기들(핵염기들) 사이의 왓슨-크릭, 후그스틴 또는 역 후그스틴(reversed Hoogsteen) 수소 결합인 수소 결합을 수반한다. 예를 들어, 아데닌 및 티민은 수소 결합들의 형성을 통해 페어링하는 상보적인 핵염기들이다. 혼성화는 다양한 환경들 하에서 나타날 수 있다.

안티센스 화합물은 표적 핵산에 대한 화합물의 결합이 표적 핵산의 정상적인 기능을 방해하여 활성의 손실을 일으키기 위한 경우 특히 혼성화할 수 있으며, 특이적 결합이 요구되는 조건들 하에서 비-표적 핵산 서열들에 대한 안티센스 화합물의 비-특이적인 결합을 피하기 위하여 충분한 정도의 상보성이 있다.

본 발명에서 사용된 "상보적인"은 올리고머 화합물의 두 핵염기들 사이에서 정확하게 페어링하기 위한 능력을 언급한다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드(올리고머 화합물)의 특정 위치에서 핵염기들이 표적 핵산의 특정 위치에서 핵염기들과 수소 결합할 수 있는 경우, 상기 표적 핵산은 DNA, RNA 또는 올리고뉴클레오티드 분자이며 올리고뉴클레오티드 및 표적 핵산 사이의 수소 결합의 위치는 상보적인 위치로 여겨진다. 각 분자에서 충분한 수의 상보적인 위치들이 서로 수소 결합할 수 있는 핵염기들에 의해 차지되는 경우 올리고뉴클레오티드 및 또 다른 DNA, RNA, 또는 올리고뉴클레오티드 분자는 서로에 대해 상보적이다. 따라서 "특히 혼성화할 수 있는" 및 "상보적인"은 올리고뉴클레오티드 및 표적 핵산 사이에서 안정하고 특이적인 결합이 나타나도록 충분한 수의 핵염기들에 걸친 충분한 정도의 정확한 페어링 또는 상보성을 나타내기 위해 사용되는 용어들이다.

본 발명에 따라, 화합물들은 안티센스 올리고머 화합물들, 안티센스 올리고뉴클레오티드들, 리보자임들, 외부 가이드 서열(EGS) 올리고뉴클레오티드들, 교대(alternate) 스플라이서들, 프라이머들, 프로브들, 및 표적 핵산의 적어도 일부에 혼성화하는 다른 올리고머 화합물들을 포함한다. 이와 같이, 이들 화합물들은 단일-가닥, 이중 가닥, 원형 또는 헤어핀 올리고머 화합물들 형태로 도입될 수 있으며 내부 또는 말단 돌출들(bulges) 또는 루프들과 같은 구조적 요소들을 포함할 수 있다. 일단 시스템으로 도입되고 나면 본 발명의 화합물들은 표적 핵산의 변형을 가져오기 위한 하나 이상 효소들 또는 구조적 단백질들의 작용을 끌어낼 수 있다. 이러한 효소의 하나의 비제한적인 예는 RNA:DNA 이중나선(duplex)의 RNA 가닥을 쪼개는 세포 제한효소인 RNAse H이다. "DNA-유사"인 단일-가닥 안티센스 화합물들이 RNAse H를 끌어낸다는 것이 당업계에 알려져 있다. 따라서, RNase H의 활성화는 RNA 표적의 벽개(cleavage)를 초래하여 유전자 발현의 올리고뉴클레오티드-매개 억제의 효율을 크게 향상시킨다. 유사한 역할들이 RNase III 및 리보핵산가수분해효소 L 집단의 효소들과 같은 다른 리보핵산가수분해효소들에 대해 가정되었다.

안티센스 화합물의 바람직한 형태가 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드인 반면 많은 종에서 이중 가닥 RNA(dsRNA) 분자들과 같은 이중 가닥 구조들의 도입은 유전자 또는 이와 연관된 유전자 산물들의 기능의 효과적이며 특이적인 안티센스-매개 감소를 유도하는 것을 보여주었다.

본 발명의 내용에서, 용어 "올리고머 화합물"은 다수의 모노머 단위들을 포함하는 폴리머 또는 올리고머를 언급한다. 본 발명의 내용에서, 용어 "올리고뉴클레오티드"는 리보핵산(RNA) 또는 데옥시리보핵산(DNA)의 올리고머 또는 폴리머 또는 이들의 모방체들(mimetics), 키메라들, 유사체들 및 동족체들을 언급한다. 이 용어는 자연발생 핵염기들, 당들 및 공유 인터뉴클레오시드(백본) 결합들로 이루어진 올리고뉴클레오티드들뿐만 아니라 유사하게 기능하는 비-자연발생 일부들을 가진 올리고뉴클레오티드들을 포함한다. 예를 들어, 증가된 세포 흡수, 표적 핵산에 대한 증가된 친화도 및 핵산가수분해효소의 존재하에서 증가된 안정성과 같은 바람직한 특성들 때문에 이러한 변형된 또는 치환된 올리고뉴클레오티드들이 종종 본래의 형태보다 선호된다.

올리고뉴클레오티드들이 본 발명의 화합물들의 선호되는 형태인 반면 본 발명은 본 발명에서 기술된 것들과 같은 올리고뉴클레오티드 유사체들 및 모방체들을 포함하지만 이에 제한되지 않는 화합물들의 다른 집단들을 또한 이해한다.

안티센스 화합물들의 국소 전달을 위해 이들 올리고뉴클레오티드들은 변형된 백본들 또는 비자연적인 인터뉴클레오시드 결합들을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 정의된 대로 변형된 백본들을 가진 올리고뉴클레오티드들은 백본에 인 원자를 가지는 것들 및 백본에 인 원자를 가지지 않는 것들을 포함한다. 본 명세서의 목적을 위하여, 때때로 당업계에서 언급되는 바대로, 인터뉴클레오시드 백본에 인 원자를 가지지 않는 변형된 올리고뉴클레오티드들은 올리고뉴클레오시드인 것으로 여겨질 수 있다.

인 원자를 포함하는 특정한 변형된 올리고뉴클레오티드 백본들은 예를 들어, 포스포로티오에이트들, 키랄 포스포로티오에이트들, 포스포로디티오에이트들, 포스포트리에스터들, 아미노알킬포스포트리에스터들, 3'-알킬렌 포스포네이트들, 5'-알킬렌 포스포네이트들 및 키랄 포스포네이트들을 포함하는 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트들, 포스피네이트들, 3'-아미노 포스포르아미데이트들 및 아미노알킬포스포르아미데이트들을 포함하는 포스포르아미데이트들, 티오노포스포르아미데이트들, 티오노알킬포스포네이트들, 티오노알킬포스포트리에스터들, 셀레노포스페이트들 및 정상 3'-5' 결합들, 이들의 2'-5' 연결된 유사체들, 및 하나 이상의 인터뉴클레오티드 결합들이 3'에서 3', 5'에서 5' 또는 2'에서 2' 연결인 역전된 극성(inverted polarity)을 가진 것들을 가지는 보라노포스페이트들(boranophosphates)을 포함한다. 역전된 극성을 가진 바람직한 올리고뉴클레오티드들은 3'-최대 인터뉴클레오티드 결합, 즉 (핵염기가 손실되거나 이의 위치에서 하이드록실 그룹을 가지는) 염기성인 하나의 역전된 뉴클레오시드 잔기에서 하나의 3'에서 3' 연결을 포함한다. 또한 다양한 염들, 혼합된 염들 및 유리 산 형태들이 포함된다.

본 발명에서 고려되는 센스 및 안티센스 뉴클레오티드 서열들은 특히 20개 내지 30개 길이의 뉴클레오티드 염기들을 포함한다. "20개 내지 30개"에 대한 언급은 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 또는 20개 내지 30개 뉴클레오티드들 범위 밖의 이들의 등가물들을 포함한다. 용어들 "핵염기들" 및 "뉴클레오티드들"은 교환적으로 사용될 수 있다. 특히 유용한 센스 및 안티센스 분자들은 성숙한 단백질(서열번호:4)을 인코딩하는 G-CSF 유전자 또는 mRNA(서열번호:2 및 3) 또는 성숙한 단백질(서열번호:8)을 인코딩하는 G-CSFR 유전자 또는 mRNA(서열번호:6 및 7)이다.

센스 또는 안티센스 분자들이 G-CSF 유전자 또는 mRNA 또는 G-CSFR 유전자 또는 mRNA에 관한 것인 반면 센스 또는 안티센스 분자들은 G-CSF 또는 G-CSFR 유전자 또는 mRNA의 선도 서열 및 선택된 인트론들 또는 엑손들을 포함하는 코딩 또는 비코딩 영역들의 임의의 부분에 대해 고려된다. 따라서 길이로 20개 내지 30개의 뉴클레오티드 센스 및 안티센스 분자들이 서열번호:2, 3, 6 또는 7의 하나 이상에 대해 고려된다.

대안적인 실시태양에서, DNA "백신들"을 포함하는 유전 구조체들이 안티센스 또는 센스 분자 포유류 세포들을 만들기 위해 사용된다. 또한 상기에서 기술된 많은 바람직한 특징들이 센스 핵산 분자들을 위해 적합하다.

본 발명의 이 양태는 종래의 분자 생물학 및 재조합 DNA 기술들에 의해 실시될 수 있다. 기술들은 당업계에 주지되어 있으며 샘브룩, 프릿쉬 및 매니아티스의 Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II, D. N. Glover ed. 1985 and Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1994와 같은 다양한 문헌들에 기술된다.

본 발명의 핵산들은 프로모터들, 내부 리보솜 유입 위치들(IRES) 및 다른 리보솜 결합 위치 서열들, 인핸서들, 반응 요소들(response elements), 억제자들(suppressors), 신호 서열들, 폴리아데닐화(polyadenylation) 서열들, 인트론들, 5'-및 3'-비-코딩 영역들 등을 포함하는 자연발생 조절(발현 제어) 서열들과 접할 수 있거나 이종 기원(heterologous) 서열들과 관련될 수 있다.

"프로모터" 또는 "프로모터 서열"은 세포에서 RNA 중합효소와 결합하고 코딩 서열의 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 영역이다. 프로모터 서열은 임의의 수준에서 전사를 개시하는데 필요한 최소 갯수의 염기들 또는 구성요소들을 포함하기 위하여 일반적으로 전사 개시점에 의해 이의 3'말단에 제한되며 5' 방향에서 업스트림으로 확장한다. RNA 중합효소의 결합에 원인이 되는 전사 개시점뿐만 아니라 단백질 결합 도메인들(공통 서열들)은 프로모터 서열 내에서 발견될 수 있다. 프로모터는 인핸서 및 억제 서열들을 포함하는 다른 발현 제어 서열들 또는 본 발명의 핵산과 작동가능하게 연결될 수 있다. 유전자 발현을 조절하는데 사용될 수 있는 프로모터들은 거대세포바이러스(CMV) 프로모터 및 SV40 초기 프로모터 영역을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

코딩 서열은 서열들이 코딩 서열의 RNA로의, 바람직하게는 (인트론들을 포함하는 경우) 이후 트랜스-RNA 스플라이싱되고, 선택적으로, 코딩 서열에 의해 인코딩되는 단백질로 번역되는 mRNA로의 RNA 중합효소 매개 전사를 지시하는 경우 세포에서 전사 또는 번역 제어 서열들의 "조절 하에 있거나", 전사 또는 번역 제어 서열들과 "기능적으로 관련되거나" 또는 전사 또는 번역 제어 서열들과 "작동가능하게 연결된다".

용어들 "발현하다" 및 "발현"은 유전자, RNA 또는 DNA 서열의 정보가 산물로 전환되는 것을 가능하게 하거나 유발하는 것; 예를 들어, 뉴클레오티드 서열의 전사 및 번역에 수반되는 세포 기능들을 활성화함으로써 단백질을 생산하는 것을 의미한다. DNA 서열은 (mRNA 또는 이중가닥의 짧은 RNA인 헤어핀 RNA 또는 안티센스 RNA와 같은) RNA 또는 (사이토카인 활성의 길항제 또는 항-사이토카인 항체의 일부와 같은) 단백질과 같은 "발현 산물"을 형성하기 위해 세포에서 또는 세포에 의해 발현된다. 또한 발현 산물 그 자체는 세포에 의해 "발현되는" 것으로 일컬어진다.

용어들 "벡터", "클론 벡터" 및 "발현 벡터"는 숙주를 형질전환시키고, 선택적으로, 도입된 서열의 발현 및/또는 복제를 증진시키기 위하여, DNA 또는 RNA 서열이 숙주 세포 내로 도입될 수 있게 하는 (플라스미드와 같은) 비히클을 의미한다.

용어 "형질감염" 또는 "형질전환"은 세포로의 핵산 도입을 의미한다. 이들 용어들은 사이토카인 교차-반응(cross-reactive) 항체 또는 이들의 단편을 인코딩하는 핵산의 세포로의 도입을 언급할 수 있다. 도입된 DNA 또는 RNA를 받아들이는 숙주 세포는 "형질전환"되었으며 이는 "형질전환체" 또는 "클론"이다. 숙주 세포로 도입된 DNA 또는 RNA는 숙주 세포로 동일한 속 또는 종의 세포들, 또는 다른 속 또는 종의 세포들을 포함하는 임의의 공급원으로부터 비롯될 수 있다.

용어 "숙주 세포"는 세포에 의한 물질의 생산, 예를 들어, 단백질의 발현 또는 유전자의 복제를 위해 임의의 방식으로 선택되고, 변형되고, 형질감염되고, 형질전환되고, 길러지고, 또는 사용된 또는 조작된 임의 유기체의 임의의 세포를 의미한다.

용어 "발현 시스템"은 적절한 조건들 하에서 벡터에 의해 운반되고 숙주 세포로 도입되는 단백질 또는 핵산을 발현할 수 있는 숙주 세포 및 적합한 벡터를 의미한다. 일반적인 발현 시스템은 대장균 숙주 세포들 및 플라스미드 벡터들, 곤충 숙주 세포들 및 바큘로바이러스(Baculovirus) 벡터들, 및 포유류 숙주 세포들 및 벡터들을 포함한다.

본 발명에 따라 확인된 제제들(예를 들어 항체들, G-CSF의 비-신호전달 돌연변이 형태들과 같은 단백질들, 소형 화학 분자들, 가용성 수용체들 등)은 약학적 조성물들에 알맞게 공급된다.

주사 용도에 적합한 조성물 형태들은 (물에 용해되는) 멸균 수용액들 및 멸균 주사 용액들의 즉석 제조를 위한 멸균 분말들을 포함한다. 이는 제조 및 보관 조건들 하에서 안정해야만 하며 박테리아 및 균류와 같은 미생물들의 오염 작용들에 대비하여 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물들 및 식물성 오일들을 포함하는 용매 또는 희석 매질일 수 있다. 적절한 유동성이 예를 들어, 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물들의 작용의 방지는 다양한 항-박테리아 및 항-진균 제제들, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등에 의해 이루어질 수 있다. 많은 경우에 긴장성(tonicity)을 조절하기 위한 제제들, 예를 들어, 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사 조성물들의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 제제들, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 조성물들의 사용에 의해 이루어질 수 있다.

적절한 용매에서 필요한 양의 활성 화합물들을 활성 성분들 및 선택적으로 필요한 다른 활성 성분들과 결합시키고 이후 여과 멸균 또는 다른 적절한 수단의 멸균을 통해 멸균 주사 용액들이 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조용 멸균 분말의 경우, 적합한 제조 방법들은 활성 성분의 분말 및 임의의 추가적으로 원하는 성분을 산출하는 진공 건조 및 동결 건조 기술을 포함한다.

조절인자가 적절하게 보호되는 경우, 이들은 예를 들어 불활성 희석제 또는 소화가능한 식이용 담체와 함께 경구적으로 투여될 수 있거나 경질 또는 연질 외피 젤라틴 캡슐에 포함될 수 있거나 정제로 압축될 수 있거나, 또는 식이 음식물과 함께 직접 결합될 수 있거나 모유를 통해 투여될 수 있다. 경구 치료제 투여에 있어서, 활성 성분은 부형제들과 함께 결합되고 섭취가능한 정제, 구강 정제, 트로키제, 캡슐제, 엘릭서제, 현탁제, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 이러한 조성물 및 제제는 적어도 1 중량%의 조절인자를 포함해야 한다. 조성물 및 제제의 백분율은 물론 달라질 수 있고, 편의상 단위 중량의 약 5 내지 80 중량%일 수 있다. 이러한 치료적으로 유용한 조성물 중 조절인자의 양은 적당한 투여량이 얻어질 수 있는 양이다. 본 발명에 따른 바람직한 조성물 및 제제는 경구 투여 단위 형태가 조절인자의 약 0.1 μg 내지 200 mg을 함유하도록 제조된다. 선택적인 투여량은 약 1 μg 내지 약 1000 mg 및 약 10 μg 내지 약 500 mg을 포함한다. 이들 투여들은 개인당 또는 kg 체중당일 수 있다. 투여는 시간당, 일당, 주당, 월당 또는 년당일 수 있다.

정제, 트로키제, 알약, 캡슐제, 크림제 등은 이하에 기재된 성분들을 함유할 수 있다. 검, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴과 같은 결합제; 인산이칼슘과 같은 부형제; 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 등과 같은 붕해제; 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제; 및 수크로오스, 락토오스 또는 사카린과 같은 감미제가 첨가될 수 있거나, 페파민트, 윈터그린 오일 또는 체리향과 같은 향미제가 첨가될 수 있다. 투여 단위 형태가 캡슐인 경우, 이것은 상기 형태의 물질 이외에, 액체 담체를 포함할 수 있다. 다양한 다른 물질들이 코팅제로서 존재하거나, 또는 투여 단위의 물리적 형태를 변형시키기 위하여 존재할 수 있다. 예를 들어, 정제, 알약 또는 캡슐제는 쉘락, 당 또는 두 가지 모두로 코팅될 수 있다. 시럽 또는 엘릭서제는 활성 화합물, 감미제로서 수크로오스, 보존제로서 메틸 및 프로필파라벤, 착색제 및 체리 또는 오렌지 향과 같은 향미제를 포함할 수 있다. 물론, 임의의 투여 단위 형태를 제조하는데 사용되는 임의의 물질은 사용된 양에서 약학적으로 순수하고, 실질적으로 비독성이어야 한다. 또한, 활성 화합물(들)은 서방성 제제 및 제형들 내로 혼입될 수 있다.

약학적으로 허용가능한 담체들 및/또는 희석제들은 임의의 모든 용매들, 분산매, 코팅제, 항-박테리아 및 항-진균 제제들, 등장성 및 흡수 지연 제제 등을 포함한다. 약학적 활성 제제들을 위한 이러한 매질 및 제제들의 사용은 당업계에 주지되어 있으며, 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 조절인자와 양립할 수 없는 것을 제외하는 한에 있어서는 치료 조성물들에서의 이들의 사용이 고려된다. 추가적인 활성 화합물들이 조성물 내에 포함될 수 있다.

상기에서 나타난 바와 같이, 투여는 임의의 수단에 의할 수 있다.

투여 요법들은 최적의 원하는 반응(예를 들어 치료적 반응)을 제공하기 위해 조절될 수 있다. 예를 들어, 단일의 한 회 분이 투여될 수 있으며, 여러 번 나누어진 투여량들이 여러 시간에 걸쳐 투여될 수 있거나 투여는 치료적 상황의 긴급 상태에 의해 지시된 대로 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있다. 쉬운 투여 및 투여의 균일성을 위해 투여 단위 형태로 비경구 조성물들을 제제화하는 것이 특히 유리하다.

당업계에서 통상의 기술을 가진 의사 또는 수의사는 필요한 약학적 조성물의 유효량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 의사 또는 수의사는 원하는 치료 효과를 달성하기 위하여 필요한 수준보다 낮은 수준에서 약학적 조성물에서 사용되는 본 발명의 항-G-CSF/G-CSFR 항체의 투약을 시작할 수 있으며 원하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점차적으로 증가시킨다. 일반적으로 본 발명의 조성물의 적합한 일일 투여량은 치료 효과를 제공하기에 효과적인 가장 낮은 투여량인 화합물의 양일 수 있다. 이러한 효과적인 투여량은 일반적으로 상기에서 기술된 인자들에 의존할 것이다. 바람직하게는 표적(예를 들어 폐)의 위치에 가까운 주사에 의한 투여가 바람직하다. 원하는 경우 약학적 조성물의 효과적인 일일 투여는 일일 동안 적절한 간격으로 분리되어 투여되는 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 서브투여들(subdoses)의 투여일 수 있다.

치료적 사용을 위하여, 한 회 분으로 또는 일정 시간 동안의 연속적 투입에 의해 인간 정맥내로 투여되는 것들을 포함하는 상기에서 기술된 것과 같은 약학적으로 허용가능한 투여 형태로 항-G-CSF/G-CSFR 항체들이 포유동물, 바람직하게는 인간에 투여된다.

또한 조성물은 표적 세포들을 형질감염시킬 수 있는 벡터와 같은 유전 분자들을 포함할 수 있으며, 벡터는 조절인자가 단백질성 분자인 경우 조절인자를 인코딩할 수 있는 핵산 분자를 운반할 수 있다. 벡터는 예를 들어, 바이러스성 벡터일 수 있다. 이와 관련하여 특정 세포들을 분리, 유전적 조작 및 동일한 대상 또는 유전적으로 관련되거나 유사한 대상으로의 세포 돌려보내기를 포함하는 유전자 치료들이 본 발명에 의해 고려된다.

따라서, 본 발명은 본 발명의 추가 양태를 고려하며 대상에서 CNS의 염증성 신경퇴행성 질환의 치료 방법을 고려하며, 방법은 G-CSF 또는 G-CSFR을 억제하거나 또는 G-CSF 또는 G-CSFR의 발현을 억제하기에 효과적인 제제의 양을 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.

또 다른 양태는 CNS의 염증성 신경퇴행성 질환의 치료를 위한 방법을 제공하며, 방법은

a. G-CSF 또는 G-CSFR에 특이적인 항체;

b. 이의 가용성 G-CSFR 또는 G-CSF-결합 부위;

c. G-CSF를 인코딩하는 핵산 분자에 표적화된 20개 내지 30개 뉴클레오티드 센스 또는 안티센스 분자(상기 핵산 분자는 서열번호:3에 제시된 서열을 포함한다); 또는 G-CSFR를 인코딩하는 핵산 분자에 표적화된 20개 내지 30개 뉴클레오티드 센스 또는 안티센스 분자(상기 핵산 분자는 서열번호:7에 제시된 서열을 포함한다)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 G-CSF 또는 G-CSFR 억제제를 대상에게 투여하는 단계를 포함한다

또 다른 양태에서, 본 발명은 대상에서 MS 또는 데빅병을 치료하는 방법에 관한 것이며, 방법은 G-CSF 또는 G-CSFR의 활성을 억제하거나 또는 G-CSF 또는 G-CSFR의 발현을 억제하기에 효과적인 제제의 양을 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태는 대상에서 MS, 데빅병 또는 뇌에서의 바이러스 감염과 같은 하지만 이에 한정되지 않는 CNS의 염증성 신경퇴행성 질환의 치료 방법에 관한 것이며, 방법은 G-CSF 또는 G-CSFR을 억제하거나 G-CSF 또는 G-CSFR의 발현을 억제하는 제제 및 CNS의 염증성 신경퇴행성 질환의 치료에서 사용되는 항-염증제, 면역 억제제 또는 다른 제제와 같은 적어도 하나의 다른 치료제를 투여하는 단계를 포함한다.

특정 실시태양에서, 본 발명은 대상에서 MS, 데빅병 또는 뇌에서의 바이러스 감염을 치료하는 방법을 고려하며, 방법은 G-CSF 또는 G-CSFR의 활성 또는 G-CSF/G-CSFR 상호작용을 억제하기에 효과적인 항체 또는 이의 항원-결합 부위의 양을 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명은 대상에서 CNS에 대한 염증성 신경퇴행성 질환의 치료의 약제의 제조에서 G-CSF 또는 G-CSFR의 활성을 억제하거나 G-CSF 또는 G-CSFR의 발현을 억제하는 제제의 사용을 추가로 고려한다.

또 다른 추가적인 양태는 CNS의 염증성 신경퇴행성 질환을 치료하기 위한 약제의 제조에서 G-CSF 또는 G-CSFR을 억제하거나 G-CSF 또는 G-CSFR의 발현을 억제하는 제제의 사용을 고려하며, 제제는

a. G-CSF 또는 G-CSFR에 특이적인 항체;

b. 이의 가용성 G-CSFR 또는 G-CSF-결합 부위;

특정 실시태양에서, 본 발명은 대상에서 MS, 데빅병 또는 뇌에서의 바이러스 감염을 치료하기 위한 약제의 제조에서 G-CSF 또는 G-CSFR에 대한 항체의 사용에 관한 것이다.

본 발명의 이들 양태들에 따라 CNS의 염증성 신경퇴행성 질환은 호중구들의 침투와 연관되거나 이를 특징으로 하는 것이다. 특정 질환들은 MS, 데빅병 및 뇌에서의 바이러스 감염이다.

G-CSF 또는 이의 수용체의 억제를 테스트하는데 유용한 동물 모델들, 또는 G-CSF-매개 신호전달의 길항작용에 대한 다른 접근법들은 실험적 자가면역성 뇌척수염(EAE) 모델을 포함한다.

본 발명에 따라 테스트 길항제를 이용한 G-CSF의 억제는 EAE 모델에서 호중구 수에 대한 현저한 영향을 나타냈으며 모델에서 질병의 감소된 수준을 가졌다. 호중구들이 CNS 염증의 주요 매개체들이기 때문에 EAE 모델에서 G-CSF 길항제에 의해 유발된 호중구 수의 현저한 감소는 G-CSF 활성의 길항작용이 유용한 치료적 접근법임을 나타낸다.

본 발명은 다음 비제한적인 실시예들에 의해 추가로 기술된다. 실시예들에서 다음 물질들 및 방법들이 사용된다.

동물들

암컷 C57Bl/6 생쥐 또는 G-CSF KO 생쥐(A. Dunn, Ludwig Institute for Cancer Research, Parkville, Australia에 의해 제공)가 사용되었다.

약물 투여

생쥐들은 하루에 한번 정맥내 주사에 의해 지정된 양의 아이소타입 대조군 또는 항-GSCF 항체(섹션 1에 요약)를 투여받았다.

항체들

호중구 수의 분석을 위해 항-CD11b(M1/70) 및 항-GR1(1A8)을 BD pharmingen(San Diego, CA, USA)으로부터 구입하였다. 아이소타입 대조군(쥐 IgG1) HRPN은 BioXcell(West Lebanon, NH, USA)로부터 구입하였다. 중화 항-G-CSF(MAB414)는 R&D systems(Minneapolis, MN, USA)로부터 구입하였다.

실험적 자가면역성 뇌척수염( EAE )

EAE가 8-12주령의 암컷 생쥐에서 유도되었다. 생쥐들은 CFA(Difco, BD San Diego, CA, USA)에서 유화된 100 μg의 미엘린 펩티드₃₅ _-55 MOG(Mimotopes, Clayton, Vic, Australia)를 이용하여 피하로 면역화하고, 이후 200 ng의 백일해독소(pertussis toxin)(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)를 d0 및 d2에 정맥내로 투여하였다. 각 생쥐에 대해 6점의 최고 점수를 가지는 임상 마비 점수(clinical paralysis score)가 이전에 기술된 대로(Langrish et al, J Exp Med 201(2):233-40, 2005) 평가되었다.

호중구 수의 평가

EAE에서 항-G-CSF 치료 동안 호중구 수들의 분석을 위해 동물들을 d0(치료 없음), d7, d14 및 d21에 희생시켰다. 단일 세포 현탁액들이 비장 및 경부 림프절(cervical LN)로부터 만들어졌으며 적혈구들이 적혈구 용해 완충액(Red cell lysis buffer)(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)을 이용한 저장성 용해에 의해 제거되었다. 혈액 분석을 위해 적혈구들을 저장성 용해로 제거하였다. 골수 분석을 위해, 대퇴골을 제거하고 얼음처럼 차가운 PBS로 씻고 세포들을 저장성 용해로 제거하였다. CNS 세포들의 분석을 위하여 단핵 세포들을 이전에 기술된 대로(Langrish et al, 2005 supra) 분리하였다. 비장, 혈액, 림프절, 골수 및 CNS 세포들의 단일 세포 현탁액들을 항-CD11b 및 GR1 항체들(1/100 희석)로 염색하고, 세척한 후 FACS Canto(BD, San Jose, CA, USA) 상에서 실행하였다. 플로우조 소프트웨어를(Flowjo software)(Treestar, Ashland OR, USA)를 이용하여 데이터를 분석하였다.

T 세포 재활성화 및 사이토카인 분석

비장, 서혜부(inguinal), 보조 및 팔의 림프절을 MOG/CFA를 이용한 피하 면역 10일 이후 생쥐로부터 얻었다. 세포들을 70 μm 필터를 통한 균질화에 의해 분리한 후 매질에서 두 번 세척하고 각각의 치료 그룹에 대해 모았다. 그런 다음 CD4+ T-세포들을 제조 설명서(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)에 따라 MACS 양성 선택에 의해 정제하였다. FACS에 의해 측정된 T-세포 정제는 >95% CD4+이었다. 2 x 10⁵ 정제된 CD4+ T 세포들을 3일 동안 100μg/ml의 MOG₃₅ _-55 펩티드를 가진 96 웰 플레이트의 3중 웰 0.2 ml에서 2 x 10⁵ 조사된 지라세포와 함께 배양하였다. 상층액을 얻고 사이토카인들을 제조 설명서에 따라 루미넥스 200 장비(Luminex 200 instrument)(Austin, TX, USA) 상에서 밀리플렉스 분석(Milliplex assay)(Millipore, Billerica, MA, USA)에 의해 측정하였다.

통계적 분석

통계적 분석을 생성하기 위해 사용되는 투 테일드 맨 위트니 테스트(two tailed Mann-Whitney test)를 프리즘(Prism)[상표]소프트웨어를 이용하여 수행하였다.

실시예 1

신경 자가면역 염증의 EAE 모델에서 G- CSF 결핍 생쥐들은 질병의 임상증상들로부터 보호된다

신경 자가면역 염증에서 G-CSF의 역할을 테스트하기 위하여 실험적 자가면역성 뇌척수염(EAE) 생쥐 모델을 사용하였다. EAE는 운동 뉴런 기능의 퇴화를 포함하는 MS 및 데빅병의 많은 임상적 및 병리조직학적 증상들을 모사하는 널리 사용되는 동물 모델이다.

EAE는 야생형(C57Bl/6) 또는 G-CSF 낙아웃(KO) 생쥐에서 유도된다. 질병이 0일 내지 30일에서 모니터링되었으며 임상 마비(clinical paralysis)가 점수화되었다.

G-CSF가 결핍된 생쥐(G-CSF 낙아웃 생쥐, G-CSF KO)가 진행성 운동 뉴런 장애로부터 보호되는 것으로 발견되었다(도 1). 이는 자가면역 CNS 파괴의 병원성 메커니즘에서 생체 내 G-CSF가 중요한 전-염증성(pro-inflammatory) 역할을 한다는 것을 나타낸다.

실시예 2

G- CSF 블로킹( blocking )은 신경 자가면역 염증의 EAE 모델에서 질병의 임상증상들을 억제한다

생체 내에서 G-CSF의 치료적 억제가 도움이 되는지를 테스트하기 위하여 EAE가 상기에 기술된 대로 야생형 생쥐에서 유도되고 이들을 중화 항-G-CSF 단일클론 항체(mAb)로 처리하였다. 중화 항-G-CSF mAb를 이용한 생쥐의 치료가 EAE의 임상적 진행을 억제한다는 것이 발견되었다(도 2). 항-G-CSF는 임상적 발현의 평균일(점수 1)[표 3] 또는 최대에 이른 질병에 대한 평균일(표 4)에 영향을 미치지 않았다. 하지만 중화 항-G-CSF mAb를 이용한 치료는 평균 임상 점수를 억제하고 동물들을 진행성 마비로부터 보호하였다(표 5). 따라서 최초 발현 이후 질병 진행이 늦춰졌다.

질병 발현의 평균일

치료	발현의 평균일 (+/- std er )
아이소타입 대조군	7.25 (+/- 0.8)
항-G-CSF	8.8 (+/- 1.2)

*현저하지 않음

최대 임상 점수에 대한 평균일

치료	최대 질병 점수에 대한 평균일 (+/- std er )
아이소타입 대조군	20.4 (+/- 1.4)
항-G-CSF	22.3 (+/- 2.1)

*현저하지 않음

평균 임상점수

치료	평균 최대 임상 점수 (+/- std er )
아이소타입 대조군	5.7 (+/- 0.18)
항-G-CSF	3.0 (+/- 0.7)

*p = 0.005.

실시예 3

항-G- CSF 치료는 신경 자가면역 염증의 EAE 모델에서 질병 유도된 호중구들을 억제한다

생체 내에서 호중구 수에 대한 G-CSF 차단의 효과를 평가하기 위하여 상기에서 기술된 EAE 모델에서 아이소타입 대조군 또는 항-G-CSF 치료 동안 시간 경과 분석을 수행하였다. 동물들은 d0(치료 없음), d7, d14 및 d21에 희생되었으며 호중구 수들이 측정되었다.

EAE의 유도 이후 호중구 수들이 혈액, 골수, CNA, 림프절 및 비장에서 증가하였다(도 3). 항-G-CSF를 이용한 치료는 이들 위치들의 전부에서 호중구 증가증을 억제하였으며 생체 내 호중구 반응들을 조절하는데 있어 G-CSF에 대한 주요 역할과 일치하였다.

실시예 4

신경 자가면역 염증의 EAE 모델에서 항-G- CSF 치료는 전염증성( proinflammatory ) T 세포 사이토카인들을 억제한다

CD4+ T 세포 사이토카인들은 중요한 염증 조절자들이다. 이 경로에 대한 항-G-CSF 치료의 효과를 설명하기 위하여 상기 기술된 EAE 모델에서 아이소타입 대조군 또는 항-G-CSF 처리된 생쥐 모두로부터 10일째에 희생된 동물들의 비장 및 림프절로부터의 정제된 CD4+ T 세포들이 사용되었으며 시험관 내에서 정제된 CD4+ T 세포들을 MOG로 재활성화하고 사이토카인 발현을 분석하였다.

항-G-CSF 치료는 재활성화에 응답하여 전염증성 사이토카인들의 발현을 억제한다. 항-G-CSF 치료는 모두 EAE를 나타내는데 중요한 사이토카인들인 IL-6, TNFα, GM-CSF 및 IL-17의 발현을 감소시킨다(도 4). 또한 항-G-CSF 치료는 신경 염증 동안 세포 동원에 중요한 CC-집단(family) 케모카인들의 발현을 억제한다(Boven et al, Clin Exp Immunol 122(2):257-63, 2000). 재활성화 동안 CD4+ T 세포에 의한 MIP-1α, MIP-1β, MCP-1 및 RANTES의 발현은 생체 내 항-G-CSF 치료에 의해 억제된다(도 4).

실시예 5

다양한 G- CSF 길항제들에 의해 Ba /F3 세포들을 발현하는 hG - CSF 수용체에서 G-CSF 매개 증식의 억제

레이튼(Layton) 등, J. Biol . Chem . 272:29735-29741, 1997에 의해 기술된 대로 hG-CSFR로 안정하게 형질감염된 BaF3 세포들이 5% v/v FBS 및 0.5ng/ml rh 또는 mGCSF(각각 R&D Systems Cat # 214-CS 및 Cat# 414-CS)를 가진 DMEM 배지에서 20,000 세포들 / 웰의 96 웰 플레이트에서 배양되었다. 배양 3시간 이후 G-CSF 길항제들(R&D Systems MAB414, 항-hG-CSFR mAb711 및 hG-CSFR-Fc)을 1μM부터 시작하는 3배의 적정 양에서 첨가하고 세포 증식을 MTS 감소(Cory et al, Cancer Commun . 3:207-12, 1991; Riss and Moravec, Mol . Cell Biol . 3(1):184a, 1993)에 의해 측정하였다.

A. 항-G-CSF 항체에 의한 억제:

항-G-CSF는 10pM의 IC₅₀을 가지고 mG-CSF 증식을 억제할 수 있었다.

B. 항-hG-CSFR 항체에 의한 억제:

hG-CSF 수용체, mAb711, (Layton et al, supra 1997) 및 이의 인간화 유도체에 대한 뮤린 단일클론 항체는 각각 1.1nM 및 1.5nM의 IC₅₀을 가지고 mG-CSF 증식을 억제할 수 있었다.

mAb711의 중쇄 및 경쇄 가변 영역들 및 인간 IgG1 중쇄 및 경쇄 불변 영역들을 포함하는 키메릭 항체는 뮤린 단일클론 항체 mAb711과 유사한 IC₅₀을 가지고 G-CSF 활성을 억제한다.

C. 가용성 hG-CSFR-Fc 단백질에 의한 억제:

가용성 G-CSFR-Fc 단백질(Honjo et al, Acta Cryst F61:788-790, 2005)은 22pM의 IC₅₀을 가지고 mG-CSF 증식을 억제할 수 있었다.

이들 결과들은 G-CSF의 생물학적 활성이 G-CSF에 대한 항체들, G-CSFR에 대한 항체들, 및 가용성 G-CSF 수용체들을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 길항제들에 의해 억제된다는 것을 설명한다.

당업자는 본 명세서에 기재된 발명이 구체적으로 기술된 것들 이외의 변형 또는 변화가 가능하다는 것을 이해할 것이다. 본 발명이 모든 이러한 변형 및 변화들을 포함한다는 것이 이해될 것이다. 또한 본 발명은 본 명세서에서 언급되거나 지시된 개별적이거나 집합적인 모든 단계들, 특징들, 조성물들 및 화합물들, 및 상기 단계들 또는 특징들의 임의의 둘 이상의 모든 조합들을 포함한다.

참고문헌

Alonso et al, Neurology 71(2): 129-35, 2008

Barahona-Garrido et al, Biologics 2(3):501-4, 2008

Bergamaschi et al, Neuroepidemiology 25(1): 15-8, 2005

Bialek et al, Infection 26(6):375-8, 1998

Bird, Science 242:423, 1988

Boven et al, Clin Exp Immunol 122(2):257-63, 2000

Brennan et al, Science 229:81, 1985

Bungart et al , British Journal of Haematology 22:1156, 1990

Carter et al, Bio / Technology 10:163-167, 1992

Clackson et al , Nature 352:624-628, 1991

Colotta et al , Blood 80:2012-2020, 1992

Cory et al, Cancer Commun . 3:207-12, 1991

Dagia et al, Nat Med 12(10):1185-90, 2006

de Haan et al , Blood 86:2986-2992, 1995

Demetri et al , Blood 78:2791-2808, 1991

Dibbert et al, Proc Natl Acad Sci U S A 96(23):13330-5, 1999

Eyles et al, Blood 112(13):5193-201, 2008

Frank et al, BMC Neurosci 10:49, 2009

Geng et al, Molecular Immunology 44:5121-529, 2007

Gericke et al , Journal of Leukocyte Biology 57:455-461, 1995

Hadaya et al, J Autoimmun 24(2):125-34, 2005

Honjo et al, Acta Crystallograph Sect F Struct Biol Cryst Commun . 61( Pt 8):788-790, 2005

Huston et al , Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85:5879, 1988

Jacob et al , Blood 92:353-361, 1998

Jones et al , Nature 321:522-525, 1986

Kabat et al in Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., US Department of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication No. 91-3242, 1991

Kohler and Milstein, Nature 256:495-499, 1975

Kortt et al , Protein Engineering 10:423, 1997

Kudo et al, Scand J Gastroenterol 43(6):689-97, 2008

Langrish et al, J Exp Med 201(2):233-40, 2005

Larrick et al , Bio / Technology 7:934, 1989

Layton et al, J. Biol . Chem . 272:29735-29741, 1997

Liu et al , Proc . Natl . Acad . Sci . USA 84:3439, 1987

Lopez-Diego et al, Nat Rev Drug Discov 7(11): 909-25, 2008

Lord et al , Proc . Natl . Acad . Sci . USA 86:9499-9503, 1989

McColl et al, J Immunol 161(11):6421-6, 1998

Marks et al , J. Mol . Biol . 222:581-597, 1991

Metcalf, International Journal of Cancer 25:225, 1980

Morales et al, Adv Neurol 98:27-45, 2006

Morimoto et al, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117,1992

Morrison et al, Proc . Nat . Acad . Sci . 81:6851, 1984

Nicola et al , Journal of Biological Chemistry 258:9017, 1983

Nicola et al , Nature 314:625, 1985

Openshaw et al, " Neurology 54(11):2147-50, 2000

Padlan et al, Mol . lmmunol . 28:489- 498, 1991

Pedersen et al, J. Mol . Biol . 235:959-973, 1994

Presta, Curr . Op . Struct . Biol . 2:593-596, 1992

Ragonese et al, Eur J Neurol 15(2):123-7, 2008

Reichmann et al , Nature 332:323-329, 1988

Rex et al , Transfusion 35:605-611, 1995

Riss and Moravec, Mol . Cell Biol . 3(1):184a, 1993

Roberts et al , Blood 89:2736-2744, 1997

Rutella et al, Transplantation 84(1 Suppl ):S26-30, 2007

Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II, D. N. Glover ed. 1985 and Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1994

Snir et al, J Neuroimmunol 172(1-2):145-55, 2006

Souza et al , Science 232:61, 1986

Summerton and Weller, Antisense and Nucleic Acid Drug Development 7:187-195, 1997

Ward et al , Nature 334:544, 1989

Weiner et al, J Neurol 255( Suppl 1): 3-11, 2008

Welte et al , Blood 88:1907-1929, 1996

Wingerchuk et al, Lancet Neurol 6(9):805-15, 2007

Wingerchuk et al, Curr Treat Options Neurol 10(1):55-66, 2008

Winter & Harris, TIPS 14:139, 1993; Carter et al, Proc . Nat . Acad . Sci . 89:4285 1992

Xu et al , British Journal of Haematology 93:558-568, 1996

Yong et al , European Journal of Haematology 49:251-259, 1992

Yong, British Journal of Haematology 94:40-47, 1996

Zavala et al, J Immunol 168(4):2011-9, 2002

Zehntner et al, J Immunol 174(8):5124-31, 2005

SEQUENCE LISTING <110> CSL LIMITED MCKENZIE, Brent Steven CURWEN, Peter Frederick MARASKOVSKY, Eugene <120> TREATMENT OF NEROLOGICAL CONDITIONS <130> 31018763/EJH <150> US 61/242,503 <151> 2009-09-15 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 204 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Met Ala Gly Pro Ala Thr Gln Ser Pro Met Lys Leu Met Ala Leu Gln 1 5 10 15 Leu Leu Leu Trp His Ser Ala Leu Trp Thr Val Gln Glu Ala Thr Pro 20 25 30 Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu 35 40 45 Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys 50 55 60 Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu 65 70 75 80 Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser 85 90 95 Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu 100 105 110 Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu 115 120 125 Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala 130 135 140 Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu 145 150 155 160 Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg 165 170 175 Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu 180 185 190 Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 195 200 <210> 2 <211> 1498 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 2 ggagcctgca gcccagcccc acccagaccc atggctggac ctgccaccca gagccccatg 60 aagctgatgg ccctgcagct gctgctgtgg cacagtgcac tctggacagt gcaggaagcc 120 acccccctgg gccctgccag ctccctgccc cagagcttcc tgctcaagtg cttagagcaa 180 gtgaggaaga tccagggcga tggcgcagcg ctccaggaga agctgtgtgc cacctacaag 240 ctgtgccacc ccgaggagct ggtgctgctc ggacactctc tgggcatccc ctgggctccc 300 ctgagcagct gccccagcca ggccctgcag ctggcaggct gcttgagcca actccatagc 360 ggccttttcc tctaccaggg gctcctgcag gccctggaag ggatctcccc cgagttgggt 420 cccaccttgg acacactgca gctggacgtc gccgactttg ccaccaccat ctggcagcag 480 atggaagaac tgggaatggc ccctgccctg cagcccaccc agggtgccat gccggccttc 540 gcctctgctt tccagcgccg ggcaggaggg gtcctagttg cctcccatct gcagagcttc 600 ctggaggtgt cgtaccgcgt tctacgccac cttgcccagc cctgagccaa gccctcccca 660 tcccatgtat ttatctctat ttaatattta tgtctattta agcctcatat ttaaagacag 720 ggaagagcag aacggagccc caggcctctg tgtccttccc tgcatttctg agtttcattc 780 tcctgcctgt agcagtgaga aaaagctcct gtcctcccat cccctggact gggaggtaga 840 taggtaaata ccaagtattt attactatga ctgctcccca gccctggctc tgcaatgggc 900 actgggatga gccgctgtga gcccctggtc ctgagggtcc ccacctggga cccttgagag 960 tatcaggtct cccacgtggg agacaagaaa tccctgttta atatttaaac agcagtgttc 1020 cccatctggg tccttgcacc cctcactctg gcctcagccg actgcacagc ggcccctgca 1080 tccccttggc tgtgaggccc ctggacaagc agaggtggcc agagctggga ggcatggccc 1140 tggggtccca cgaatttgct ggggaatctc gtttttcttc ttaagacttt tgggacatgg 1200 tttgactccc gaacatcacc gacgcgtctc ctgtttttct gggtggcctc gggacacctg 1260 ccctgccccc acgagggtca ggactgtgac tctttttagg gccaggcagg tgcctggaca 1320 tttgccttgc tggacgggga ctggggatgt gggagggagc agacaggagg aatcatgtca 1380 ggcctgtgtg tgaaaggaag ctccactgtc accctccacc tcttcacccc ccactcacca 1440 gtgtcccctc cactgtcaca ttgtaactga acttcaggat aataaagtgc ttgcctcc 1498 <210> 3 <211> 525 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 3 acccccctgg gccctgccag ctccctgccc cagagcttcc tgctcaagtg cttagagcaa 60 gtgaggaaga tccagggcga tggcgcagcg ctccaggaga agctgtgtgc cacctacaag 120 ctgtgccacc ccgaggagct ggtgctgctc ggacactctc tgggcatccc ctgggctccc 180 ctgagcagct gccccagcca ggccctgcag ctggcaggct gcttgagcca actccatagc 240 ggccttttcc tctaccaggg gctcctgcag gccctggaag ggatctcccc cgagttgggt 300 cccaccttgg acacactgca gctggacgtc gccgactttg ccaccaccat ctggcagcag 360 atggaagaac tgggaatggc ccctgccctg cagcccaccc agggtgccat gccggccttc 420 gcctctgctt tccagcgccg ggcaggaggg gtcctagttg cctcccatct gcagagcttc 480 ctggaggtgt cgtaccgcgt tctacgccac cttgcccagc cctga 525 <210> 4 <211> 174 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 4 Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys 1 5 10 15 Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln 20 25 30 Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val 35 40 45 Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys 50 55 60 Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser 65 70 75 80 Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser 85 90 95 Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp 100 105 110 Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro 115 120 125 Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe 130 135 140 Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe 145 150 155 160 Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 165 170 <210> 5 <211> 863 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 5 Met Ala Arg Leu Gly Asn Cys Ser Leu Thr Trp Ala Ala Leu Ile Ile 1 5 10 15 Leu Leu Leu Pro Gly Ser Leu Glu Glu Cys Gly His Ile Ser Val Ser 20 25 30 Ala Pro Ile Val His Leu Gly Asp Pro Ile Thr Ala Ser Cys Ile Ile 35 40 45 Lys Gln Asn Cys Ser His Leu Asp Pro Glu Pro Gln Ile Leu Trp Arg 50 55 60 Leu Gly Ala Glu Leu Gln Pro Gly Gly Arg Gln Gln Arg Leu Ser Asp 65 70 75 80 Gly Thr Gln Glu Ser Ile Ile Thr Leu Pro His Leu Asn His Thr Gln 85 90 95 Ala Phe Leu Ser Cys Cys Leu Asn Trp Gly Asn Ser Leu Gln Ile Leu 100 105 110 Asp Gln Val Glu Leu Arg Ala Gly Tyr Pro Pro Ala Ile Pro His Asn 115 120 125 Leu Ser Cys Leu Met Asn Leu Thr Thr Ser Ser Leu Ile Cys Gln Trp 130 135 140 Glu Pro Gly Pro Glu Thr His Leu Pro Thr Ser Phe Thr Leu Lys Ser 145 150 155 160 Phe Lys Ser Arg Gly Asn Cys Gln Thr Gln Gly Asp Ser Ile Leu Asp 165 170 175 Cys Val Pro Lys Asp Gly Gln Ser His Cys Cys Ile Pro Arg Lys His 180 185 190 Leu Leu Leu Tyr Gln Asn Met Gly Ile Trp Val Gln Ala Glu Asn Ala 195 200 205 Leu Gly Thr Ser Met Ser Pro Gln Leu Cys Leu Asp Pro Met Asp Val 210 215 220 Val Lys Leu Glu Pro Pro Met Leu Arg Thr Met Asp Pro Ser Pro Glu 225 230 235 240 Ala Ala Pro Pro Gln Ala Gly Cys Leu Gln Leu Cys Trp Glu Pro Trp 245 250 255 Gln Pro Gly Leu His Ile Asn Gln Lys Cys Glu Leu Arg His Lys Pro 260 265 270 Gln Arg Gly Glu Ala Ser Trp Ala Leu Val Gly Pro Leu Pro Leu Glu 275 280 285 Ala Leu Gln Tyr Glu Leu Cys Gly Leu Leu Pro Ala Thr Ala Tyr Thr 290 295 300 Leu Gln Ile Arg Cys Ile Arg Trp Pro Leu Pro Gly His Trp Ser Asp 305 310 315 320 Trp Ser Pro Ser Leu Glu Leu Arg Thr Thr Glu Arg Ala Pro Thr Val 325 330 335 Arg Leu Asp Thr Trp Trp Arg Gln Arg Gln Leu Asp Pro Arg Thr Val 340 345 350 Gln Leu Phe Trp Lys Pro Val Pro Leu Glu Glu Asp Ser Gly Arg Ile 355 360 365 Gln Gly Tyr Val Val Ser Trp Arg Pro Ser Gly Gln Ala Gly Ala Ile 370 375 380 Leu Pro Leu Cys Asn Thr Thr Glu Leu Ser Cys Thr Phe His Leu Pro 385 390 395 400 Ser Glu Ala Gln Glu Val Ala Leu Val Ala Tyr Asn Ser Ala Gly Thr 405 410 415 Ser Arg Pro Thr Pro Val Val Phe Ser Glu Ser Arg Gly Pro Ala Leu 420 425 430 Thr Arg Leu His Ala Met Ala Arg Asp Pro His Ser Leu Trp Val Gly 435 440 445 Trp Glu Pro Pro Asn Pro Trp Pro Gln Gly Tyr Val Ile Glu Trp Gly 450 455 460 Leu Gly Pro Pro Ser Ala Ser Asn Ser Asn Lys Thr Trp Arg Met Glu 465 470 475 480 Gln Asn Gly Arg Ala Thr Gly Phe Leu Leu Lys Glu Asn Ile Arg Pro 485 490 495 Phe Gln Leu Tyr Glu Ile Ile Val Thr Pro Leu Tyr Gln Asp Thr Met 500 505 510 Gly Pro Ser Gln His Val Tyr Ala Tyr Ser Gln Glu Met Ala Pro Ser 515 520 525 His Ala Pro Glu Leu His Leu Lys His Ile Gly Lys Thr Trp Ala Gln 530 535 540 Leu Glu Trp Val Pro Glu Pro Pro Glu Leu Gly Lys Ser Pro Leu Thr 545 550 555 560 His Tyr Thr Ile Phe Trp Thr Asn Ala Gln Asn Gln Ser Phe Ser Ala 565 570 575 Ile Leu Asn Ala Ser Ser Arg Gly Phe Val Leu His Gly Leu Glu Pro 580 585 590 Ala Ser Leu Tyr His Ile His Leu Met Ala Ala Ser Gln Ala Gly Ala 595 600 605 Thr Asn Ser Thr Val Leu Thr Leu Met Thr Leu Thr Pro Glu Gly Ser 610 615 620 Glu Leu His Ile Ile Leu Gly Leu Phe Gly Leu Leu Leu Leu Leu Thr 625 630 635 640 Cys Leu Cys Gly Thr Ala Trp Leu Cys Cys Ser Pro Asn Arg Lys Asn 645 650 655 Pro Leu Trp Pro Ser Val Pro Asp Pro Ala His Ser Ser Leu Gly Ser 660 665 670 Trp Val Pro Thr Ile Met Glu Glu Leu Pro Gly Pro Arg Gln Gly Gln 675 680 685 Trp Leu Gly Gln Thr Ser Glu Met Ser Arg Ala Leu Thr Pro His Pro 690 695 700 Cys Val Gln Asp Ala Phe Gln Leu Pro Gly Leu Gly Thr Pro Pro Ile 705 710 715 720 Thr Lys Leu Thr Val Leu Glu Glu Asp Glu Lys Lys Pro Val Pro Trp 725 730 735 Glu Ser His Asn Ser Ser Glu Thr Cys Gly Leu Pro Thr Leu Val Gln 740 745 750 Thr Tyr Val Leu Gln Gly Asp Pro Arg Ala Val Ser Thr Gln Pro Gln 755 760 765 Ser Gln Ser Gly Thr Ser Asp Gln Val Leu Tyr Gly Gln Leu Leu Gly 770 775 780 Ser Pro Thr Ser Pro Gly Pro Gly His Tyr Leu Arg Cys Asp Ser Thr 785 790 795 800 Gln Pro Leu Leu Ala Gly Leu Thr Pro Ser Pro Lys Ser Tyr Glu Asn 805 810 815 Leu Trp Phe Gln Ala Ser Pro Leu Gly Thr Leu Val Thr Pro Ala Pro 820 825 830 Ser Gln Glu Asp Asp Cys Val Phe Gly Pro Leu Leu Asn Phe Pro Leu 835 840 845 Leu Gln Gly Ile Arg Val His Gly Met Glu Ala Leu Gly Ser Phe 850 855 860 <210> 6 <211> 3024 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 6 gaagctggac tgcagctggt ttcaggaact tctcttgacg agaagagaga ccaaggaggc 60 caagcagggg ctgggccaga ggtgccaaca tggggaaact gaggctcggc tcggaaaggt 120 gaagtaactt gtccaagatc acaaagctgg tgaacatcaa gttggtgcta tggcaaggct 180 gggaaactgc agcctgactt gggctgccct gatcatcctg ctgctccccg gaagtctgga 240 ggagtgcggg cacatcagtg tctcagcccc catcgtccac ctgggggatc ccatcacagc 300 ctcctgcatc atcaagcaga actgcagcca tctggacccg gagccacaga ttctgtggag 360 actgggagca gagcttcagc ccgggggcag gcagcagcgt ctgtctgatg ggacccagga 420 atctatcatc accctgcccc acctcaacca cactcaggcc tttctctcct gctgcctgaa 480 ctggggcaac agcctgcaga tcctggacca ggttgagctg cgcgcaggct accctccagc 540 cataccccac aacctctcct gcctcatgaa cctcacaacc agcagcctca tctgccagtg 600 ggagccagga cctgagaccc acctacccac cagcttcact ctgaagagtt tcaagagccg 660 gggcaactgt cagacccaag gggactccat cctggactgc gtgcccaagg acgggcagag 720 ccactgctgc atcccacgca aacacctgct gttgtaccag aatatgggca tctgggtgca 780 ggcagagaat gcgctgggga ccagcatgtc cccacaactg tgtcttgatc ccatggatgt 840 tgtgaaactg gagcccccca tgctgcggac catggacccc agccctgaag cggcccctcc 900 ccaggcaggc tgcctacagc tgtgctggga gccatggcag ccaggcctgc acataaatca 960 gaagtgtgag ctgcgccaca agccgcagcg tggagaagcc agctgggcac tggtgggccc 1020 cctccccttg gaggcccttc agtatgagct ctgcgggctc ctcccagcca cggcctacac 1080 cctgcagata cgctgcatcc gctggcccct gcctggccac tggagcgact ggagccccag 1140 cctggagctg agaactaccg aacgggcccc cactgtcaga ctggacacat ggtggcggca 1200 gaggcagctg gaccccagga cagtgcagct gttctggaag ccagtgcccc tggaggaaga 1260 cagcggacgg atccaaggtt atgtggtttc ttggagaccc tcaggccagg ctggggccat 1320 cctgcccctc tgcaacacca cagagctcag ctgcaccttc cacctgcctt cagaagccca 1380 ggaggtggcc cttgtggcct ataactcagc cgggacctct cgccccaccc cggtggtctt 1440 ctcagaaagc agaggcccag ctctgaccag actccatgcc atggcccgag accctcacag 1500 cctctgggta ggctgggagc cccccaatcc atggcctcag ggctatgtga ttgagtgggg 1560 cctgggcccc cccagcgcga gcaatagcaa caagacctgg aggatggaac agaatgggag 1620 agccacgggg tttctgctga aggagaacat caggcccttt cagctctatg agatcatcgt 1680 gactcccttg taccaggaca ccatgggacc ctcccagcat gtctatgcct actctcaaga 1740 aatggctccc tcccatgccc cagagctgca tctaaagcac attggcaaga cctgggcaca 1800 gctggagtgg gtgcctgagc cccctgagct ggggaagagc ccccttaccc actacaccat 1860 cttctggacc aacgctcaga accagtcctt ctccgccatc ctgaatgcct cctcccgtgg 1920 ctttgtcctc catggcctgg agcccgccag tctgtatcac atccacctca tggctgccag 1980 ccaggctggg gccaccaaca gtacagtcct caccctgatg accttgaccc cagaggggtc 2040 ggagctacac atcatcctgg gcctgttcgg cctcctgctg ttgctcacct gcctctgtgg 2100 aactgcctgg ctctgttgca gccccaacag gaagaatccc ctctggccaa gtgtcccaga 2160 cccagctcac agcagcctgg gctcctgggt gcccacaatc atggaggagc tgcccggacc 2220 cagacaggga cagtggctgg ggcagacatc tgaaatgagc cgtgctctca ccccacatcc 2280 ttgtgtgcag gatgccttcc agctgcccgg ccttggcacg ccacccatca ccaagctcac 2340 agtgctggag gaggatgaaa agaagccggt gccctgggag tcccataaca gctcagagac 2400 ctgtggcctc cccactctgg tccagaccta tgtgctccag ggggacccaa gagcagtttc 2460 cacccagccc caatcccagt ctggcaccag cgatcaggtc ctttatgggc agctgctggg 2520 cagccccaca agcccagggc cagggcacta tctccgctgt gactccactc agcccctctt 2580 ggcgggcctc acccccagcc ccaagtccta tgagaacctc tggttccagg ccagcccctt 2640 ggggaccctg gtaaccccag ccccaagcca ggaggacgac tgtgtctttg ggccactgct 2700 caacttcccc ctcctgcagg ggatccgggt ccatgggatg gaggcgctgg ggagcttcta 2760 gggcttcctg gggttccctt cttgggcctg cctcttaaag gcctgagcta gctggagaag 2820 aggggagggt ccataagccc atgactaaaa actaccccag cccaggctct caccatctcc 2880 agtcaccagc atctccctct cctcccaatc tccataggct gggcctccca ggcgatctgc 2940 atactttaag gaccagatca tgctccatcc agccccaccc aatggccttt tgtgcttgtt 3000 tcctataact tcagtattgt aaac 3024 <210> 7 <211> 2520 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 7 gagtgcgggc acatcagtgt ctcagccccc atcgtccacc tgggggatcc catcacagcc 60 tcctgcatca tcaagcagaa ctgcagccat ctggacccgg agccacagat tctgtggaga 120 ctgggagcag agcttcagcc cgggggcagg cagcagcgtc tgtctgatgg gacccaggaa 180 tctatcatca ccctgcccca cctcaaccac actcaggcct ttctctcctg ctgcctgaac 240 tggggcaaca gcctgcagat cctggaccag gttgagctgc gcgcaggcta ccctccagcc 300 ataccccaca acctctcctg cctcatgaac ctcacaacca gcagcctcat ctgccagtgg 360 gagccaggac ctgagaccca cctacccacc agcttcactc tgaagagttt caagagccgg 420 ggcaactgtc agacccaagg ggactccatc ctggactgcg tgcccaagga cgggcagagc 480 cactgctgca tcccacgcaa acacctgctg ttgtaccaga atatgggcat ctgggtgcag 540 gcagagaatg cgctggggac cagcatgtcc ccacaactgt gtcttgatcc catggatgtt 600 gtgaaactgg agccccccat gctgcggacc atggacccca gccctgaagc ggcccctccc 660 caggcaggct gcctacagct gtgctgggag ccatggcagc caggcctgca cataaatcag 720 aagtgtgagc tgcgccacaa gccgcagcgt ggagaagcca gctgggcact ggtgggcccc 780 ctccccttgg aggcccttca gtatgagctc tgcgggctcc tcccagccac ggcctacacc 840 ctgcagatac gctgcatccg ctggcccctg cctggccact ggagcgactg gagccccagc 900 ctggagctga gaactaccga acgggccccc actgtcagac tggacacatg gtggcggcag 960 aggcagctgg accccaggac agtgcagctg ttctggaagc cagtgcccct ggaggaagac 1020 agcggacgga tccaaggtta tgtggtttct tggagaccct caggccaggc tggggccatc 1080 ctgcccctct gcaacaccac agagctcagc tgcaccttcc acctgccttc agaagcccag 1140 gaggtggccc ttgtggccta taactcagcc gggacctctc gccccacccc ggtggtcttc 1200 tcagaaagca gaggcccagc tctgaccaga ctccatgcca tggcccgaga ccctcacagc 1260 ctctgggtag gctgggagcc ccccaatcca tggcctcagg gctatgtgat tgagtggggc 1320 ctgggccccc ccagcgcgag caatagcaac aagacctgga ggatggaaca gaatgggaga 1380 gccacggggt ttctgctgaa ggagaacatc aggccctttc agctctatga gatcatcgtg 1440 actcccttgt accaggacac catgggaccc tcccagcatg tctatgccta ctctcaagaa 1500 atggctccct cccatgcccc agagctgcat ctaaagcaca ttggcaagac ctgggcacag 1560 ctggagtggg tgcctgagcc ccctgagctg gggaagagcc cccttaccca ctacaccatc 1620 ttctggacca acgctcagaa ccagtccttc tccgccatcc tgaatgcctc ctcccgtggc 1680 tttgtcctcc atggcctgga gcccgccagt ctgtatcaca tccacctcat ggctgccagc 1740 caggctgggg ccaccaacag tacagtcctc accctgatga ccttgacccc agaggggtcg 1800 gagctacaca tcatcctggg cctgttcggc ctcctgctgt tgctcacctg cctctgtgga 1860 actgcctggc tctgttgcag ccccaacagg aagaatcccc tctggccaag tgtcccagac 1920 ccagctcaca gcagcctggg ctcctgggtg cccacaatca tggaggagct gcccggaccc 1980 agacagggac agtggctggg gcagacatct gaaatgagcc gtgctctcac cccacatcct 2040 tgtgtgcagg atgccttcca gctgcccggc cttggcacgc cacccatcac caagctcaca 2100 gtgctggagg aggatgaaaa gaagccggtg ccctgggagt cccataacag ctcagagacc 2160 tgtggcctcc ccactctggt ccagacctat gtgctccagg gggacccaag agcagtttcc 2220 acccagcccc aatcccagtc tggcaccagc gatcaggtcc tttatgggca gctgctgggc 2280 agccccacaa gcccagggcc agggcactat ctccgctgtg actccactca gcccctcttg 2340 gcgggcctca cccccagccc caagtcctat gagaacctct ggttccaggc cagccccttg 2400 gggaccctgg taaccccagc cccaagccag gaggacgact gtgtctttgg gccactgctc 2460 aacttccccc tcctgcaggg gatccgggtc catgggatgg aggcgctggg gagcttctag 2520 <210> 8 <211> 839 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 8 Glu Cys Gly His Ile Ser Val Ser Ala Pro Ile Val His Leu Gly Asp 1 5 10 15 Pro Ile Thr Ala Ser Cys Ile Ile Lys Gln Asn Cys Ser His Leu Asp 20 25 30 Pro Glu Pro Gln Ile Leu Trp Arg Leu Gly Ala Glu Leu Gln Pro Gly 35 40 45 Gly Arg Gln Gln Arg Leu Ser Asp Gly Thr Gln Glu Ser Ile Ile Thr 50 55 60 Leu Pro His Leu Asn His Thr Gln Ala Phe Leu Ser Cys Cys Leu Asn 65 70 75 80 Trp Gly Asn Ser Leu Gln Ile Leu Asp Gln Val Glu Leu Arg Ala Gly 85 90 95 Tyr Pro Pro Ala Ile Pro His Asn Leu Ser Cys Leu Met Asn Leu Thr 100 105 110 Thr Ser Ser Leu Ile Cys Gln Trp Glu Pro Gly Pro Glu Thr His Leu 115 120 125 Pro Thr Ser Phe Thr Leu Lys Ser Phe Lys Ser Arg Gly Asn Cys Gln 130 135 140 Thr Gln Gly Asp Ser Ile Leu Asp Cys Val Pro Lys Asp Gly Gln Ser 145 150 155 160 His Cys Cys Ile Pro Arg Lys His Leu Leu Leu Tyr Gln Asn Met Gly 165 170 175 Ile Trp Val Gln Ala Glu Asn Ala Leu Gly Thr Ser Met Ser Pro Gln 180 185 190 Leu Cys Leu Asp Pro Met Asp Val Val Lys Leu Glu Pro Pro Met Leu 195 200 205 Arg Thr Met Asp Pro Ser Pro Glu Ala Ala Pro Pro Gln Ala Gly Cys 210 215 220 Leu Gln Leu Cys Trp Glu Pro Trp Gln Pro Gly Leu His Ile Asn Gln 225 230 235 240 Lys Cys Glu Leu Arg His Lys Pro Gln Arg Gly Glu Ala Ser Trp Ala 245 250 255 Leu Val Gly Pro Leu Pro Leu Glu Ala Leu Gln Tyr Glu Leu Cys Gly 260 265 270 Leu Leu Pro Ala Thr Ala Tyr Thr Leu Gln Ile Arg Cys Ile Arg Trp 275 280 285 Pro Leu Pro Gly His Trp Ser Asp Trp Ser Pro Ser Leu Glu Leu Arg 290 295 300 Thr Thr Glu Arg Ala Pro Thr Val Arg Leu Asp Thr Trp Trp Arg Gln 305 310 315 320 Arg Gln Leu Asp Pro Arg Thr Val Gln Leu Phe Trp Lys Pro Val Pro 325 330 335 Leu Glu Glu Asp Ser Gly Arg Ile Gln Gly Tyr Val Val Ser Trp Arg 340 345 350 Pro Ser Gly Gln Ala Gly Ala Ile Leu Pro Leu Cys Asn Thr Thr Glu 355 360 365 Leu Ser Cys Thr Phe His Leu Pro Ser Glu Ala Gln Glu Val Ala Leu 370 375 380 Val Ala Tyr Asn Ser Ala Gly Thr Ser Arg Pro Thr Pro Val Val Phe 385 390 395 400 Ser Glu Ser Arg Gly Pro Ala Leu Thr Arg Leu His Ala Met Ala Arg 405 410 415 Asp Pro His Ser Leu Trp Val Gly Trp Glu Pro Pro Asn Pro Trp Pro 420 425 430 Gln Gly Tyr Val Ile Glu Trp Gly Leu Gly Pro Pro Ser Ala Ser Asn 435 440 445 Ser Asn Lys Thr Trp Arg Met Glu Gln Asn Gly Arg Ala Thr Gly Phe 450 455 460 Leu Leu Lys Glu Asn Ile Arg Pro Phe Gln Leu Tyr Glu Ile Ile Val 465 470 475 480 Thr Pro Leu Tyr Gln Asp Thr Met Gly Pro Ser Gln His Val Tyr Ala 485 490 495 Tyr Ser Gln Glu Met Ala Pro Ser His Ala Pro Glu Leu His Leu Lys 500 505 510 His Ile Gly Lys Thr Trp Ala Gln Leu Glu Trp Val Pro Glu Pro Pro 515 520 525 Glu Leu Gly Lys Ser Pro Leu Thr His Tyr Thr Ile Phe Trp Thr Asn 530 535 540 Ala Gln Asn Gln Ser Phe Ser Ala Ile Leu Asn Ala Ser Ser Arg Gly 545 550 555 560 Phe Val Leu His Gly Leu Glu Pro Ala Ser Leu Tyr His Ile His Leu 565 570 575 Met Ala Ala Ser Gln Ala Gly Ala Thr Asn Ser Thr Val Leu Thr Leu 580 585 590 Met Thr Leu Thr Pro Glu Gly Ser Glu Leu His Ile Ile Leu Gly Leu 595 600 605 Phe Gly Leu Leu Leu Leu Leu Thr Cys Leu Cys Gly Thr Ala Trp Leu 610 615 620 Cys Cys Ser Pro Asn Arg Lys Asn Pro Leu Trp Pro Ser Val Pro Asp 625 630 635 640 Pro Ala His Ser Ser Leu Gly Ser Trp Val Pro Thr Ile Met Glu Glu 645 650 655 Leu Pro Gly Pro Arg Gln Gly Gln Trp Leu Gly Gln Thr Ser Glu Met 660 665 670 Ser Arg Ala Leu Thr Pro His Pro Cys Val Gln Asp Ala Phe Gln Leu 675 680 685 Pro Gly Leu Gly Thr Pro Pro Ile Thr Lys Leu Thr Val Leu Glu Glu 690 695 700 Asp Glu Lys Lys Pro Val Pro Trp Glu Ser His Asn Ser Ser Glu Thr 705 710 715 720 Cys Gly Leu Pro Thr Leu Val Gln Thr Tyr Val Leu Gln Gly Asp Pro 725 730 735 Arg Ala Val Ser Thr Gln Pro Gln Ser Gln Ser Gly Thr Ser Asp Gln 740 745 750 Val Leu Tyr Gly Gln Leu Leu Gly Ser Pro Thr Ser Pro Gly Pro Gly 755 760 765 His Tyr Leu Arg Cys Asp Ser Thr Gln Pro Leu Leu Ala Gly Leu Thr 770 775 780 Pro Ser Pro Lys Ser Tyr Glu Asn Leu Trp Phe Gln Ala Ser Pro Leu 785 790 795 800 Gly Thr Leu Val Thr Pro Ala Pro Ser Gln Glu Asp Asp Cys Val Phe 805 810 815 Gly Pro Leu Leu Asn Phe Pro Leu Leu Gln Gly Ile Arg Val His Gly 820 825 830 Met Glu Ala Leu Gly Ser Phe 835

Claims

G-CSF 또는 G-CSFR에 특이적인 항체; 이의 가용성 G-CSFR 또는 G-CSF-결합 부위; 및 G-CSF를 인코딩하는 핵산 분자에 표적화된 20개 내지 30개 뉴클레오티드 센스 또는 안티센스 분자(상기 핵산 분자는 서열번호:3에 제시된 서열을 포함한다); 또는 G-CSFR를 인코딩하는 핵산 분자에 표적화된 20개 내지 30개 뉴클레오티드 센스 또는 안티센스 분자(상기 핵산 분자는 서열번호:7에 제시된 서열을 포함한다)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 G-CSF 또는 G-CSFR 억제제를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 대상에서 CNS의 염증성 신경퇴행성 질환의 치료 방법.
제 1 항에 있어서,
G-CSF 항체가 G-CSF 또는 G-CSFR에 특이적인 항원 결합 단편인 방법.
제 1 항에 있어서,
염증성 신경퇴행성 질환은 다발성 경화증(MS); 데빅병; 및 뇌에서의 바이러스 감염인 방법.
제 1 항에 있어서,
대상이 인간인 방법.
제 1 항에 있어서,
CNS의 염증성 신경퇴행성 질환의 치료에서 사용되는 항염증제, 면역억제제 또는 다른 제제로 이루어진 목록으로부터 선택되는 치료제의 투여를 추가로 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서,
G-CSF 또는 G-CSFR에 특이적인 항체는 단일클론 항체인 방법.
제 1 항에 있어서,
항체는 키메릭, 인간 또는 인간화 항체인 방법.
제 1 항에 있어서,
항체는 인간 항체인 방법.
대상에서 호중구 침투과 관련된 CNS 질환을 치료하기 위한 약제의 제조에서 G-CSF 또는 G-CSFR의 활성을 억제하거나 G-CSF 또는 G-CSFR을 인코딩하는 유전자의 발현을 억제하는 제제의 용도로, 상기 제제는 G-CSF 또는 G-CSFR에 특이적인 항체; 이의 가용성 G-CSFR 또는 G-CSF-결합 부위; 및 G-CSF를 인코딩하는 핵산 분자에 표적화된 20개 내지 30개 핵염기 길이의 20개 내지 30개 뉴클레오티드 센스 또는 안티센스 분자(상기 핵산 분자는 서열번호:3에 제시된 서열을 포함한다); 또는 G-CSFR를 인코딩하는 핵산 분자에 표적화된 20개 내지 30개 핵염기 길이의 20개 내지 30개 뉴클레오티드 센스 또는 안티센스 분자(상기 핵산 분자는 서열번호:7에 제시된 서열을 포함한다)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 용도.
제 9 항에 있어서,
G-CSF 항체가 G-CSF 또는 G-CSFR에 특이적인 항원 결합 단편인 용도.
제 9 항에 있어서,
상기 CNS 질환은 다발성 경화증인 용도.
제 9 항에 있어서,
CNS 질환은 데빅병인 용도.
제 9 항에 있어서,
CNS 질환은 뇌에서의 바이러스 감염인 용도.
제 9 항에 있어서,
대상은 인간인 용도.
제 9 항에 있어서,
CNS의 염증성 신경퇴행성 질환의 치료에서 사용되는 항염증제, 면역억제제 또는 다른 제제로 이루어진 목록으로부터 선택되는 치료제의 용도를 추가로 포함하는 용도.
제 9 항에 있어서,
G-CSF 또는 G-CSFR에 특이적인 항체는 단일클론 항체인 용도.
제 16 항에 있어서,
항체는 키메릭, 인간 또는 인간화 항체인 용도.
제 15 항에 있어서,
항체는 인간 항체인 용도.