EA006501B1

EA006501B1 - Полипептиды zalpha 11 рецептора цитокина человека класса i, кодирующие их полинуклеотиды и способы их применения

Info

Publication number: EA006501B1
Application number: EA200100276A
Authority: EA
Inventors: Скотт Р. Преснелл; Даррелл К. Конклин; Джулия Э. Новак; Анджела К. Хэммонд
Original assignee: Займодженетикс, Инк.
Priority date: 1998-09-23
Filing date: 1999-09-23
Publication date: 2005-12-29
Also published as: CN1344320A; DK1115862T3; IL185764A0; IL142164A; PL349068A1; EP1115862B1; JP2002526062A; NZ510744A; CA2343839C; EP2105446A2; IL185764A; EP1115862A2; AU772172B2; KR20010085838A; JP2011015700A; WO2000017235A3; NO20011460D0; DE69941126D1; EP2105446A3; IL142164A0

Abstract

Новые полипептиды, полинуклеотиды, кодирующие эти полипептиды, и относящиеся к ним композиции и способы описаны для zalpha11, нового рецептора цитокинов. Эти полипептиды могут быть использованы в способах для детектирования лигандов, которые стимулируют пролиферацию и/или развитие гемопоэтических, лимфоидных и миелоидных клеток in vitro и in vivo. Лигандсвязывающие рецепторные полипептиды могут быть также использованы для блокирования лигандной активности in vitro и in vivo. Полинуклеотиды, кодирующие zalpha11, локализованы на хромосоме 16 и могут быть использованы для идентификации района генома, связанного с патологическими состояниями человека. Данное изобретение относится также к способам получения этого белка, его применениям и антителам к этому белку.

Description

Предпосылки изобретения

Пролиферация и дифференциация клеток многоклеточных организмов регулируются гормонами и полипептидными факторами роста. Эти диффундируемые молекулы позволяют клеткам осуществлять коммуникацию друг с другом и действовать совместно для образования клеток и органов и репарации поврежденной ткани. Примеры гормонов и факторов роста включают в себя стероидные гормоны (например, эстроген, тестостерон), паратиреоидный гормон, фолликулостимулирующий гормон, интерлейкины, тромбоцитарный фактор роста (ΡΌΟΡ), эпидермальный фактор роста (ЕОР), гранулоцитарномакрофагальный колониестимулирующий фактор (ОМ-С8Р), эритропоэтин (ЕРО) и кальцитонин.

Г ормоны и факторы роста влияют на клеточный метаболизм путем связывания с рецепторами. Рецепторы могут быть интегральными мембранными белками, которые связаны с путями передачи сигналов в клетке, такими как системы вторичных мессенджеров. Другие классы рецепторов являются растворимыми молекулами, такими как факторы транскрипции. Особый интерес представляют рецепторы для цитокинов, молекул, которые стимулируют пролиферацию и/или дифференцировку клеток. Примеры цитокинов включают в себя эритропоэтин (ЕРО), который стимулирует развитие эритроцитов; тромбопоэтин (ТРО), который стимулирует развитие клеток мегакариоцитарной линии дифференцировки; и гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (О-С8Р), который стимулирует развитие нейтрофилов. Эти цитокины применимы в восстановлении нормальных уровней кровяных клеток в пациентах, страдающих от анемии, тромбоцитопении и нейтропении, или получающих химиотерапию по поводу рака.

Продемонстрированные ίη νίνο активности этих цитокинов иллюстрируют огромный клинический потенциал или потребность в отношении других цитокинов, агонистов цитокинов и антагонистов цитокинов. Данное изобретение удовлетворяет эти потребности путем обеспечения нового рецептора гемопоэтического цитокина, а также относящихся к нему композиций и способов.

Данное изобретение обеспечивает такие полипептиды для этих и других применений, которые должны быть очевидны лицам с обычной квалификацией в данной области из приведенных здесь описаний.

Сущность изобретения

В первом аспекте настоящего изобретения заявляется выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид ζηΐρΐιη 11 рецептора цитокина человека класса I полной длины или его функциональные компоненты, включающие последовательности аминокислот, выбранные из группы, состоящей из (a) последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 237 (Ηίκ) 8ЕО ΙΌ N0:2 (цитокинсвязывающий домен);

(b) последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 255 (Ьеи) 8ЕО ΙΌ N0:2 (цитокинсвязывающий домен и трансмембранный домен);

(c) последовательности от аминокислоты номер 256 (Ьук) до аминокислоты номер 538 (8ег) 8Е0 ΙΌ N0:2 (внутриклеточный домен);

(б) последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 538 (8ег) 8Е0 ΙΌ N0:2 (зрелый полипептид);

(е) последовательности от аминокислоты номер 1 (Ме!) до аминокислоты номер 538 (8ег) 8Е0 ΙΌ N0:2 (полипептид полной длины) или последовательностей, которые по меньшей мере на 90% гомологичны указанным, и полученных согласно тому, как раскрыто в описании.

Во втором аспекте настоящего изобретения заявляется выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид ζ;·ι1ρ1ι;·ι11 рецептора цитокина человека класса Ι полной длины или его функциональные компоненты, включающий последовательность полинуклеотидов, выбранную из группы, состоящей из (a) полинуклеотидной последовательности от нуклеотида 69 до нуклеотида 1682 8Е0 ΙΌ N0:1 (полинуклеотид, кодирующий полипептид полной длины);

(b) полинуклеотидной последовательности от нуклеотида 1 до нуклеотида 1614 8Е0 ΙΌ N0:4 (вырожденный полинуклеотид по отношению к указанному в (а), кодирующий полипептид полной длины);

(c) полинуклеотидной последовательности от нуклеотида 126 до нуклеотида 779 8Е0 ΙΌ N0:1 (полинуклеотид, кодирующий цитокинсвязывающий домен);

(б) полинуклеотидной последовательности от нуклеотида 126 до нуклеотида 833 8Е0 ΙΌ N0:1 (полинуклеотид, кодирующий цитокинсвязывающий домен и трансмембранный домен);

(е) полинуклеотидной последовательности от нуклеотида 834 до нуклеотида 1682 8Е0 ΙΌ N0:1 (полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный домен);

(1) полинуклеотидной последовательности от нуклеотида 126 до нуклеотида 1682 8Е0 ΙΌ N0:1 (полинуклеотид, кодирующий зрелый полипептид);

Кроме того, полипептид ζ;·ι1ρ1ι;·ι11 включает последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из (a) последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 237 (Ηίκ) 8Е0 ΙΌ N0:2 (цитокинсвязывающий домен);

(b) последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 255 (Ьеи) 8Е0 ΙΌ N0:2 (цитокинсвязывающий домен и трансмембранный домен);

- 1 006501 (ά) последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 538 (8ет) 8ЕО ΙΌ N0:2 (зрелый полипептид); и (е) последовательности от аминокислоты номер 1 (Ме!) до аминокислоты номер 538 (8ет) 8ЕО ΙΌ N0:2 (полипептид полной длины).

А также полипептид ζαΐρΐια 11 имеет последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из (a) последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 237 (Ηίκ) 8Е0 ΙΌ N0:2 (цитокинсвязывающий домен);

(c) последовательности от аминокислоты номер 256 (Ьук) до аминокислоты номер 538 (8ет) 8Е0 ΙΌ N0:2 (межклеточный домен);

(ά) последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 538 (8ет) 8Е0 ΙΌ N0:2 (зрелый полипептид); и (е) последовательности от аминокислоты номер 1 (Ме!) до аминокислоты номер 538 (8ет) 8Е0 ΙΌ N0:2 (полипептид полной длины).

Дополнительно полипептид содержит домен \С8Х\У8 (8Е0 ΙΌ N0:3), или полипептид (а), (с), (ά), (е) дополнительно содержит трансмембранный домен, который может состоять из остатков 238 (Ьеи)-255 (Ьеи) 8ЕО ΙΌ N0:2.

Кроме того, полипептид (а), (Ь), (е), (ά) дополнительно содержит внутриклеточный домен, который может состоять из остатков 256 (Ьук)-538 (8ет) 8Е0 ΙΌ N0:2 и содержать сайты Вох Ι и Вох ΙΙ.

И, дополнительно, полипептид содержит аффинную метку.

В другом аспекте настоящего изобретения заявляется экспрессирующий вектор, содержащий следующие функционально связанные элементы:

промотор транскрипции;

сегмент ДНК, кодирующий зрелый полипептид ζαΐρΐιαΐ 1 рецептора цитокина человека класса Ι, имеющий последовательность от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 538 (8ет) 8Е0 ΙΌ N0:2; и терминатор транскрипции, причем промотор функционально связан с сегментом ДНК, а сегмент ДНК функционально связан с терминатором транскрипции.

Кроме того, экспрессирующий вектор дополнительно содержит второй сегмент ДНК, экспрессирующий секреторную сигнальную последовательность, функционально связанную с сегментом ДНК, кодирующим зрелый полипептид ζαΐρΐιαΐΐ.

Еще в одном аспекте настоящего изобретения заявляется культивируемая клетка, содержащая указанный экспрессирующий вектор, экспрессирующая зрелый полипептид ζαΐρΐιαίΐ.

В другом аспекте настоящего изобретения заявляется экспрессирующий вектор, содержащий промотор транскрипции;

сегмент ДНК, кодирующий цитокинсвязывающий домен полипептида ζαΐρΐιηΐΐ рецептора цитокина человека класса Ι, имеющий последовательность от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 237 (Н1к) 8ЕО ΙΌ N0:2; и терминатор транскрипции, причем промотор, сегмент ДНК и терминатор функционально связаны.

Дополнительно экспрессирующий вектор может содержать второй сегмент ДНК, экспрессирующий секреторную сигнальную последовательность, функционально связанную с сегментом ДНК, кодирующим цитокинсвязывающий домен полипептида ζαΐρΐιαΐΐ;

фрагмент ДНК, кодирующий трансмембранный домен полипептида ζαΐρΐιαίΐ, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим цитокинсвязывающий домен указанного полипептида; а трансмембранный домен содержит остатки 238 (Ьеи)-255 (Ьеи) 8Е0 ΙΌ N0:2;

фрагмент ДНК, кодирующий внутриклеточный домен полипептида ζαΐρΐιαΐΐ, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим цитокинсвязывающий домен указанного полипептида, а внутриклеточный домен состоит из остатков 256 (Ьук)-538 (8ет) 8Е0 ΙΌ N0:2.

Еще в одном аспекте настоящего изобретения заявляется культивируемая клетка, в которую был введен экспрессирующий вектор, экспрессирующая растворимый рецепторный полипептид, ζαΐρΐιαΐΐ.

Кроме того, пролиферация клетки зависит от экзогенного гемопоэтического фактора роста.

В другом аспекте настоящего изобретения заявляется конструкция ДНК, кодирующая слитый белок, в состав которого входит полипептид ζαΐρΐια 11 рецептора цитокина человека класса Ι полной длины или его функциональные компоненты, содержащая первый сегмент ДНК, кодирующий полипептид, имеющий последовательность аминокислотных остатков, выбранную из группы, состоящей из (а) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 2 (Ме!) до аминокислоты номер ΐ9 (01у) 8Е0 ΙΌ N0:2 (секреторная сигнальная последовательность ζαρίΐιαΐΐ);

- 2 006501 (b) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 237 (Н1к) 8ЕО ГО N0:2 (цитокинсвязывающий домен ζαΐρΐιαΐΐ):

(c) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 255 (Ьеи) 8ЕО ГО N0:2 (цитокинсвязывающий домен и трансмембранный домен ζαΐρΐιαΐΐ):

(6) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 238 (Ьеи) до аминокислоты номер 255 (Ьеи) 8Е0 ГО N0:2 (трансмембранный домен ζαΐρΐιαίΐ):

(е) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 238 (Ьеи) до аминокислоты номер 538 (8ег) 8Е0 ГО N0:2 (трансмембранный домен и внутриклеточный домен ζαΐρΐιηΐΐ):

(ί) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 256 (Ьук) до аминокислоты номер 538 (8ег) 8Е0 ГО N0:2 (внутриклеточный домен ζαΐρΐιηΐΐ):

(д) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 538 (8ег) 8Е0 ГО N0:2 (зрелый полипептид ζαΐρΐιαΐΐ): и, по меньшей мере, один другой сегмент ДНК, кодирующий дополнительный полипептид, причем первый и другие сегменты ДНК соединены в рамке считывания.

В следующем аспекте настоящего изобретения заявляется экспрессирующий вектор, содержащий следующие функционально связанные элементы:

промотор транскрипции;

конструкцию ДНК, кодирующую слитый белок; и терминатор транскрипции, причем промотор функционально связан с конструкцией ДНК, а конструкция ДНК функционально связана с терминатором транскрипции.

Еще в одном аспекте настоящего изобретения заявляется культивируемая клетка, содержащая указанный экспрессирующий вектор, причем клетка экспрессирует слитый белок.

В дополнительном аспекте настоящего изобретения заявляется способ получения слитого белка, предусматривающий культивирование указанной клетки и выделение полипептида, продуцируемого этой клеткой.

В следующем аспекте настоящего изобретения заявляется выделенный полипептид ζαΐρΐια 11 рецептора цитокина человека класса I полной длины или его функциональные компоненты, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (a) последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 237 (Ηίκ) 8Е0 ГО N0:2 (цитокинсвязывающий домен);

(b) последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 255 (Ьеи) 8Е0 ГО N0:2 (цитокинсвязывающий домен и трансмембранный домен);

(c) последовательности от аминокислоты номер 256 (Ьук) до аминокислоты номер 538 (8ег) 8Е0 ГО N0:2 (полный внутриклеточный домен);

(6) последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 538 (8ег) 8Е0 ГО N0:2 (зрелый полипептид); и (е) последовательности от аминокислоты номер ΐ (Ме!) до аминокислоты номер 538 (8ег) 8Е0 ГО N0:2 (полипептид полной длины) или последовательностей, которые по меньшей мере на 90% гомологичны указанным и получены, как раскрыто в описании.

Кроме того, выделенный полипептид содержит последовательность аминокислотных остатков, выбранную из группы, состоящей из (a) последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 237 (Н1к) 8Е0 ГО N0:2 (цитокинсвязывающий домен);

(c) последовательности от аминокислоты номер 256 (Ьук) до аминокислоты номер 538 (8ег) 8Е0 ГО N0:2 (внутриклеточный домен);

(6) последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 538 (8ег) 8Е0 ГО N0:2 (зрелый полипептид);

(е) последовательности от аминокислоты номер ΐ (Ме!) до аминокислоты номер 538 (8ег) 8Е0 ГО N0:2 (полипептид полной длины).

А также полипептид ζ.αΐρΐιη 11 имеет последовательность аминокислотных остатков, выбранную из группы, состоящей из (a) последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 255 (Ьеи) 8Е0 ГО N0:2 (цитокинсвязывающий домен);

- 3 006501 (е) последовательности от аминокислоты номер 1 (Ме!) до аминокислоты номер 538 8ЕО ΙΌ N0:2 (полипептид полной длины).

Кроме того, полипептид дополнительно содержит домен \78Х\У8. как показано в 8Е0 ΙΌ N0:3, а полипептид (а), (с), (ά), (е) дополнительно содержит трансмембранный домен, который состоит из остатков 238 (Ьеи)-255 (Ьеи) 8ЕО ΙΌ N0:2.

Дополнительно полипептид (а), (Ь), (ά), (е) содержит внутриклеточный домен, который может состоять из остатков 256 (Ьук)-538 (8ег) 8Е0 ΙΌ N0:2 и дополнительно содержать сайты Вох I и Вох II.

Кроме того, полипептид дополнительно содержит аффинную метку, маркер биотин/авидин, радионуклид, маркер фермент/субстрат, кофактор, ингибитор, флуоресцентную индикаторную частицу, хемилюминесцентную индикаторную частицу, токсин, цитотоксичную молекулу или домен иммуноглобулина Ес.

Дополнительно полипептид состоит из последовательности аминокислотных остатков от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 237 (Н1к) 8Е0 ΙΌ N0:2 (цитокинсвязывающий домен) и дополнительно содержит трансмембранный домен гетерологичного рецептора циктокина, который является рецептором цитокина класса Ι.

Также полипептид может содержать трансмембранный домен и межклеточный домен из гетерологичного рецептора цитокина, который является рецептором цитокина класса Ι.

Кроме того, полипептид состоит из последовательности аминокислотных остатков от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 255 (Ьеи) 8Е0 ΙΌ N0:2 (цитокинсвязывающий домен и трансмембранный домен) и дополнительно содержит внутриклеточный домен гетерологичного рецептора цитокина, который является рецептором цитокина класса Ι.

Полипептид дополнительно состоит из последовательности аминокислотных остатков от аминокислоты номер 256 (Ьук) до аминокислоты номер 538 (Ьеи) 8Е0 ΙΌ N0:2 (внутриклеточный домен) и дополнительно содержит трансмембранный домен и цитокинсвязывающий домен гетерологичного рецептора цитокина, который является рецептором цитокина класса Ι.

Кроме того, выделенный полипептид состоит из последовательности аминокислотных остатков от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 538 (Ьеи) 8Е0 ΙΌ N0:2 (зрелый полипептид).

Еще в одном аспекте настоящего изобретения заявляется способ получения зрелого полипептида ζ;·ι1ρ1ι;·ι11. предусматривающий культивирование клетки; и выделение полипептида ζ;·ι1ρ1ι;·ι1Ε продуцируемого этой клеткой.

В другом аспекте настоящего изобретения заявляется выделенный полипептид ζ;·ι1ρ1ι;·ι11. включающий аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:2 от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 237 (Н1к) (цитокинсвязывающий домен); и, по существу, не содержащий трансмембранного и внутриклеточного доменов, обычно связанных с гемопоэтическими рецепторами.

Кроме того, выделенный полипептид дополнительно может содержать аффинную метку;

аффинную метку, маркер биотин/авидин, радионуклид, маркер фермент/субстрат, кофактор, ингибитор, флуоресцентную индикаторную частицу, хемилюминесцентную индикаторную частицу, токсин, цитотоксичную молекулу или домен иммуноглобулина Ес.

В следующем аспекте настоящего изобретения заявляется способ получения цитокинсвязывающего домена полипептида ζαΐρΐια 11, предусматривающий культивирование клетки; и выделение полипептида, продуцируемого этой клеткой.

Еще в одном аспекте настоящего изобретения заявляется способ получения антитела к полипептиду ζ;·ι1ρ1ι;·ι11. предусматривающий введение животному полипептида, выбранного из группы, состоящей из (a) полипептида, содержащего любые из 9-519 аминокислот, которые составляют непрерывную последовательность в пределах последовательности 8Е0 ΙΌ N0:2 от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 538 (8ег) (зрелый полипептид);

(b) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0:2 от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 237 (Н1к) (цитокинсвязывающий домен);

(c) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0:2 от аминокислоты номер 101 (Ьеи) до аминокислоты номер 122 (С1у);

(ά) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0:2 от аминокислоты номер 141 (Акп) до аминокислоты номер 174 (А1а);

(е) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0:2 от аминокислоты номер 193 (Сук) до аминокислоты номер 261 (Уа1);

(!) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0:2 от аминокислоты номер 51 (Тгр) до аминокислоты номер 61 (С1и);

(д) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0:2 от аминокислоты 136 (Не) до аминокислоты номер 143 (С1и);

- 4 006501 (11) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8ЕО ΙΌ N0:2 от аминокислоты 187 (Рго) до аминокислоты номер 195 (8ет);

(ί) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0:2 от аминокислоты номер 223 (Р1е) до аминокислоты номер 232 (С1и); и (ί) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0:2 от аминокислоты номер 360 (О1и) до аминокислоты номер 368 (Акр), причем указанный полипептид индуцирует синтез антител в организме животного, и выделение антитела, специфически связывающегося с полипептидом ζ;·ι1ρ1ι;·ι11, из организма животного.

В другом аспекте настоящего изобретения заявляется моноклональное антитело, полученное при иммунизации животного полипептидом ζ;·ι1ρ1ι;·ι11, выбранным из группы, состоящей из (a) полипептида, содержащего любые из 9-519 аминокислот, которые составляют непрерывную последовательность в пределах последовательности 8Е0 ΙΌ N0:2 от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 538 (8ет) (зрелый полипептид);

(b) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0:2 от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 237 (Ηίκ) (цитокинсвязывающий домен):

(6) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0:2 от аминокислоты номер 141 (Акп) до аминокислоты номер 174 (А1а);

(ί) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0:2 от аминокислоты номер 51 (Тгр) до аминокислоты номер 61 (С1и);

(1) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0:2 от аминокислоты 187 (Рго) до аминокислоты номер 195 (8ет);

(ί) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0:2 от аминокислоты номер 223 (Р1е) до аминокислоты номер 232 (С1и); и (ί) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0:2 от аминокислоты номер 360 (01и) до аминокислоты номер 368 (Акр).

Еще в одном аспекте настоящего изобретения заявляется антитело, которое специфически связывается с полипептидом.

В дополнительном аспекте настоящего изобретения заявляется способ обнаружения в тест-пробе присутствия модулятора активности полипептида ζ;·ι1ρ1ι;·ι11. предусматривающий культивирование клетки, в которую был введен экспрессирующий вектор, причем эта клетка экспрессирует цитокинсвязывающий домен полипептида ζ;·ι1ρ1ι;·ι11, в присутствии и в отсутствие тестпробы; и сравнение уровней активности указанного домена ζ;·ι1ρ1ι;·ι11 в присутствии и в отсутствие тестпробы при помощи биологического или биохимического анализа; и определение по результатам сравнения присутствия модулятора активности ζ;·ι1ρ1ι;·ι11 в данной тестпробе.

В другом аспекте настоящего изобретения заявляется способ обнаружения лиганда рецептора ζ;·ι1ρ1ι;·ι11 в тест-пробе, предусматривающий обеспечение контактирования тест-пробы с полипептидом ζ;·ι1ρ1ι;·ι11, содержащим последовательность от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 237 (Н1к) 8Е0 ΙΌ N0:2 (цитокинсвязвающий домен); и выявление связывания указанного полипептида с лигандом в пробе.

Кроме того, согласно способу указанный полипептид дополнительно содержит трансмембранный и внутриклеточный домены и указанный полипептид связан с мембраной культивируемой клетки, а стадия выявления предусматривает измерение биологического ответа в культивируемой клетке.

А также согласно способу биологический ответ представляет собой пролиферацию клеток, активность сигнальной трансдукции или активацию транскрипции репортерного гена и полипептид иммобилизован на твердом носителе.

Дополнительно согласно способу тест-проба содержит лимфоидные клетки, гемопоэтические клетки, активированные Т-клетки или раковые клетки или кондиционированную среду из лимфоидных клеток, гемопоэтических клеток, активированных Т-клеток или раковых клеток.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1 представляет собой график гидрофильности Норр-\Уоо6к ζ;·ι1ρ1ι;·ι 11 человека.

Фиг. 2 представляет собой сопоставление ζ;·ι1ρ1ι;·ι11 человека (ζ;·ι1ρ1ι;·ι) (8Е0 ΙΌ N0:2) и ζ;·ι1ρ1ι;·ι11 мыши (ιηι.ιζ;·ι1ρ) (8Е0 ΙΌ N0:85).

- 5 006501

Подробное описание изобретения

Перед подробным изложением данного изобретения может быть полезным для его понимания определение следующих терминов.

Термин «аффинная метка» используется здесь для обозначения полипептидного сегмента, который может быть присоединен ко второму полипептиду для очистки или детектирования второго полипептида или обеспечения сайтов для присоединения второго полипептида к субстрату. В принципе, любой пептид или белок, для которого доступны антитело или другой агент специфического связывания, может быть использован в качестве аффинной метки. Аффинные метки включают в себя полигистидиновый участок (тракт), белок Α (Νίΐδδοη е1 а1., ЕМВО 1. 4:1075, 1985; ΝίΕκοπ е1 а1., Ме1йоб8 Еи7уто1. 198:3, 1991), глутатион 8-трансферазу (διηίΐΐι аиб Ιοίιηδοη. Сеие 67:31, 1988), аффинную метку С1и-С1и (Сгиккеитеуег е1 а1., Ргос. №111. Асаб. δει. И8А 82:7952-4, 1985), вещество Р, пептид Е1ад™ (Ηορρ е1 а1., Βΐοΐ£θΗηο1ο^ 6:120410, 1988), стрептавидинсвязывающий пептид или другой антигенный эпитоп или связывающий домен. См., в общем, Εογ6 е1 а1., Рю1еш Ехргеккюи аиб ΡυΓίΓίεηΙίοη 2: 95-107, 1991. ДНК, кодирующие аффинные метки, доступны от коммерческих поставщиков (например, Рйагтас1а Вю1есй, Р1кса1а^ау, N1).

Термин «аллельный вариант» используется здесь для обозначения любой из двух или нескольких альтернативных форм гена, занимающих один и тот же хромосомный локус. Аллельная вариация возникает природно через мутацию и может приводить к фенотипическому полиморфизму в популяциях. Мутации генов могут быть молчащими (без изменения в кодируемом полипептиде) или могут кодировать полипептиды, имеющие измененную аминокислотную последовательность. Термин аллельный вариант используется здесь также для обозначения белка, кодируемого аллельным вариантом гена.

Термины «амино-концевой» и «карбоксил-концевой» используются здесь для обозначения положений внутри полипептидов. Там, где позволяет контекст, эти термины используются со ссылкой на конкретную последовательность или часть полипептида для обозначения близости или относительного положения. Например, некоторая последовательность, расположенная карбоксил-терминально относительно ссылочной последовательности в полипептиде, расположена проксимально относительно карбоксил-конца ссылочной последовательности, но не обязательно находится при карбоксил-конце полного полипептида.

Термин «пара комплемент/антикомплемент» обозначает неидентичные части молекулы, которые образуют нековалентно связанную, стабильную пару при подходящих условиях. Например, биотин и авидин (или стрептавидин) являются членами-прототипами пары комплемент/антикомплемент. Другие примеры пар комплемент/антикомплемент включают в себя пары рецептор/лиганд, пары антитело/антиген (или гаптен или эпитоп), пары смысловой/антисмысловой полинуклеотид и т. п. В случае, когда желательна последующая диссоциация пары комплемент/антикомплемент, пара комплемент/антикомплемент предпочтительно имеет аффинность связывания <10⁹ М^-1.

Термин «комплементы полинуклеотидной молекулы» обозначает полинуклеотидную молекулу, имеющую комплементарную последовательность оснований и обращенную ориентацию в сравнении со ссылочной последовательностью. Например, последовательность 5'-АТССАСССС-3' комплементарна 5'ССССТССАТ-3'.

Термин «контиг» обозначает полинуклеотид, который имеет непрерывный отрезок идентичной или комплементарной последовательности относительно другого полинуклеотида. Г оворят, что непрерывные последовательности (контиги) «перекрывают» конкретный отрезок полинуклеотидной последовательности либо полностью, либо вдоль частичного отрезка этого полинуклеотида. Например, характерными контигами к полинуклеотидной последовательности 5'-АТСССТТАССТТ-3' являются 5'-ТАССТТдад1с1-3' и 3'§1с§асТАСССА-5'.

Термин «вырожденная нуклеотидная последовательность» обозначает последовательность нуклеотидов, которая включает в себя один или более вырожденных кодонов (в сравнении со ссылочной полинуклеотидной молекулой, которая кодирует полипептид). Вырожденные кодоны содержат различные триплеты нуклеотидов, но кодируют один и тот же аминокислотный остаток (т.е. триплеты САИ и САС, каждый, кодируют Акр).

Термин «экспрессирующий вектор» используется для обозначения молекулы ДНК, линейной или кольцевой, которая содержит сегмент, кодирующий представляющий интерес полипептид, функционально связанный с дополнительными сегментами, которые обеспечивают его транскрипцию. Такие дополнительные элементы включают в себя промоторную и терминаторную последовательности и могут также включать в себя одну или несколько точек начала репликации, один или несколько селектируемых маркеров, энхансер, сигнал полиаденилирования и т.д. Экспрессирующие векторы обычно произведены из плазмидной или вирусной ДНК или могут содержать элементы обеих.

Термин «выделенный», в применении к полинуклеотиду, обозначает, что этот полинуклеотид был удален из его природной генетической среды и, следовательно, не содержит других посторонних или нежелательных кодирующих последовательностей и находится в форме, подходящей для применения в генетически сконструированных системах продуцирования белков. Такие выделенные молекулы являются молекулами, которые выделены из их природного окружения, и включают в себя кДНК-клоны и геномные клоны. Выделенные молекулы ДНК данного изобретения не содержат других генов, с которыми они обычно связаны, но могут включать в себя природно встречающиеся 5'- и 3'-нетранслируемые

- 6 006501 районы, такие как промоторы и терминаторы. Идентификация связанных районов будет очевидной лицу с обычной квалификацией в данной области (см., например, Иупап апб Туап, ИаЩте 316:774-78, 1985).

«Выделенным» полипептидом или белком является полипептид или белок, который обнаруживается в условиях, иных, чем его природное окружение, например отдельно от крови и ткани животного. В предпочтительной форме выделенный полипептид является, по существу, не содержащим других полипептидов, в частности других полипептидов животного происхождения. Предпочтительно обеспечение полипептидов в высокоочищенной форме, т.е. имеющих чистоту более 90%, более предпочтительно чистоту более 99%. При использовании в этом контексте термин «выделенный» не исключает присутствия того же самого полипептида в альтернативных физических формах, таких как димеры или альтернативно гликозилированные или дериватизованные формы.

Термин «функционально (операбельно) связанные», при ссылке на ДНК-сегменты, указывает, что эти сегменты расположены таким образом, что они функционируют совместно для их предполагаемых целей, например транскрипция инициируется в промоторе и протекает через кодирующий сегмент до терминатора.

Термин «ортолог» обозначает полипептид или белок, полученный из одного вида, который является функциональной копией полипептида или белка из другого вида. Различия последовательностей среди ортологов являются результатом видообразования.

«Паралоги» являются отличающимися, но структурно родственными белками, производимыми организмом. Считается, что паралоги возникают в результате дупликации генов. Например, α-глобин, βглобин и миоглобин являются паралогами друг друга.

Термин «полинуклеотид» обозначает одно- или двухцепочечный полимер дезоксирибонуклеотидных или рибонуклеотидных оснований, считываемых от 5'-конца к 3'-концу. Полинуклеотиды включают в себя РНК и ДНК и могут быть изолированы из природных источников, синтезированы ш νίΐτο или получены из комбинации природных и синтетических молекул. Размеры полинуклеотидов выражаются как пары нуклеотидов (сокращенно «п.н.»), нуклеотиды («нт») или тысячи пар нуклеотидов («т.п.н.»). Там, где позволяет контекст, два последних термина могут описывать полинуклеотиды, которые являются одноцепочечными или двухцепочечными. При применении этого термина к двухцепочечным молекулам его используют для обозначения общей длины, и должно быть понятно, что он является эквивалентным термину «пары нуклеотидов». Специалистам в данной области будет понятно, что две цепи двухцепочечного полинуклеотида могут слегка отличаться по длине и что их концы могут быть расположены зигзагами в результате ферментативного расщепления; таким образом, не все нуклеотиды в двухцепочечной полинуклеотидной молекуле могут быть спаренными.

«Полипептид» является полимером аминокислотных остатков, соединенных пептидными связями, получен ли он природным путем или синтетическим путем. Полипептиды, имеющие менее приблизительно 10 аминокислотных остатков, обычно называют «пептидами».

Термин «промотор» используется здесь в его признанном в данной области значении для обозначения части гена, содержащей последовательности ДНК, которые обеспечивают связывание РНКполимеразы и инициацию транскрипции. Промоторные последовательности обнаруживаются обычно, но не всегда, в 5'-некодирующих районах генов.

«Белок» обозначает макромолекулу, содержащую одну или несколько полипептидных цепей. Белок может включать в себя также непептидные компоненты, такие как углеводные группы. Углеводы и другие непептидные компоненты могут быть присоединены к белку клеткой, в которой продуцируется данный белок, и будут варьироваться в зависимости от типа клетки. Белки определены здесь в терминах их аминокислотных каркасных структур; заместители, такие как углеводные группы, обычно не указаны, но, тем не менее, они могут присутствовать.

Термин «рецептор» используется здесь для обозначения связанного с клеткой белка или полипептидной субъединицы такого белка, которые связываются с биоактивной молекулой («лигандом») и медиируют действие этого лиганда на клетку. Связывание лиганда с рецептором приводит к конформационному изменению в рецепторе (и, в некоторых случаях, мультимеризации рецептора, т.е. ассоциации идентичных или различных субъединиц рецептора), которое вызывает взаимодействия между эффекторным доменом (доменами) и другой молекулой (молекулами) в клетке. Эти взаимодействия, в свою очередь, приводят к изменениям в метаболизме клетки. Метаболические события, связанные с взаимодействиями рецептор-лиганд, включают в себя транскрипцию генов, фосфорилирование/дефосфорилирование, пролиферацию клеток, увеличения продуцирования циклического АМФ, мобилизацию клеточного кальция, мобилизацию мембранных липидов, клеточную адгезию, гидролиз инозитлипидов и гидролиз фосфолипидов. Рецепторы цитокинов клеточной поверхности характеризуются мультидоменной структурой, как обсуждается более подробно ниже. Эти рецепторы закреплены в клеточной мембране трансмембранным доменом, характеризующимся последовательностью гидрофобных аминокислотных остатков (обычно приблизительно 21-25 остатков), которая обычно фланкирована положительно заряженными остатками (Ьу8 или Агд). Обычно рецепторы могут быть мембраносвязанными, цитозольными или ядерными; мономерными (например, рецептор тиреоидстимулирующего гормона, β-адренергического гормона) или мультимерными (например, ΡΌΟΡ-рецептор, рецептор гормона роста, 1Ь-3-рецептор, ОМ-С8Р

- 7 006501 рецептор, О-С8Е-рецептор, рецептор эритропоэтина и 1Ь-6-рецептор). Термин «рецепторный полипептид» используется для обозначения полипептидных цепей полного рецептора и его частей, в том числе выделенных функциональных доменов (например, лигандсвязывающих доменов).

Термин «секреторная сигнальная последовательность» обозначает последовательность ДНК, которая кодирует полипептид («секреторный полипептид»), который, как компонент большего полипептида, направляет этот больший полипептид через секреторный путь клетки, в которой он синтезируется. Этот больший полипептид обычно расщепляется с удалением секреторного пептида во время прохождения через этот секреторный путь.

«Растворимый рецептор» является рецепторным полипептидом, который не связан с клеточной мембраной. Растворимые рецепторы являются наиболее обычно лигандсвязывающими рецепторными полипептидами, которые не имеют трансмембранного и цитоплазматического доменов. Растворимые рецепторы могут содержать дополнительные аминокислотные остатки, такие как аффинные метки, которые обеспечивают очистку этого полипептида или обеспечивают сайты для присоединения этого полипептида к субстрату, или последовательности константной области иммуноглобулина. Многие рецепторы клеточной поверхности имеют природно встречающиеся, растворимые копии, которые продуцируются протеолизом. Считается, что рецепторные полипептиды являются, по существу, не содержащими трансмембранного и внутриклеточного полипептидных сегментов, когда они не имеют достаточных частей этих сегментов для обеспечения мембранного прикрепления или трансдукции (передачи) сигнала, соответственно.

Термин «сплайсинговый вариант» используется здесь для обозначения альтернативных форм РНК, транскрибированных из гена. Сплайсинговая вариация возникает природно посредством использования альтернативных сайтов сплайсинга в транскрибируемой молекуле РНК или менее обычно между раздельно транскрибируемыми молекулами РНК и может приводить к нескольким мРНК, транскрибируемым из одного и того же гена. Сплайсинговые варианты могут кодировать полипептиды, имеющие измененную аминокислотную последовательность. Термин «сплайсинговый вариант» используют здесь также для обозначения белка, кодируемого сплайсинговым вариантом мРНК, транскрибируемым из гена.

Должно быть понятно, что молекулярные массы и длины полимеров, определяемые неточными аналитическими методами (например, гель-электрофорезом), являются приблизительными величинами. Когда такая величина выражается как «около» Х или «приблизительно» X, указанная величина Х должна пониматься как величина, определенная в точностью до ±10%.

Все цитируемые здесь ссылки включены в качестве ссылки в полном виде.

Данное изобретение основано частично на открытии новой последовательности ДНК, которая кодирует белок, имеющий структуру рецептора цитокинов класса I. Расшифрованная аминокислотная последовательность показала, что кодируемый рецептор принадлежит к подсемейству рецепторов, которое включает в себя β-субъединицу 1Ь-2-рецептора и β-общий рецептор (т.е. β-субъединицы 1Ь-3-, 1Ь-5- и СМ-С8Р-рецепторов). Анализ тканевого распределения мРНК, соответствующей этой новой ДНК, показал экспрессию в лимфатическом узле, лейкоцитах периферической крови (РВЬ), селезенке и тимусе. Кроме того, эта мРНК была обильной по количеству в клеточной линии Кау (АТСС Νο. СС1-86), полученной из лимфомы Беркитта. Этот полипептид был назван ζ;·ι1ρ1ι;·ι11.

Новые полипептиды ζ.αΙρΗαΙΙ данного изобретения были первоначально идентифицированы запросом в базе данных Е8Т (маркерных экспрессирующихся последовательностей). Была обнаружена Е8Т (маркерная экспрессирующаяся последовательность), и ее соответствующая кДНК была секвенирована. Новый полипептид, кодируемый этой кДНК, обнаружил гомологию с рецепторами цитокинов класса I. Полину клеотидная последовательность ζ;·ι1ρ1ι;·ι11 кодирует всю кодирующую последовательность предсказанного белка. Ζ;·ι1ρ1ι;·ι11 представляет собой новый рецептор цитокинов, который может быть вовлечен в апоптотический клеточный путь, может быть молекулой передачи сигнала клетка-клетка, рецептором фактора роста или связанным с внеклеточным матриксом белком с активностью гормона фактора роста или т.п.

Последовательность полипептида ζ;·ι1ρ1ι;·ι11 была расшифрована из единственного клона, который содержал его соответствующую полинуклеотидную последовательность. Этот клон был получен из библиотеки спинного мозга. Другие библиотеки, которые также могут быть подвергнуты поиску на такие последовательности, включают в себя РВЬ, тимус, селезенку, лимфатический узел, клеточные линии эритролейкоза человека (например, ТЕ-1), клетки Кау, клеточные линии острого моноцитарного лейкоза, другие линии лимфоидных и гемопоэтических клеток и т.п.

Нуклеотидная последовательность репрезентативной ζа1ρйа11-кодирующей ДНК описана в 8ЕО ГО N0:1 (от нуклеотида 69 до нуклеотида 1682), а расшифрованная последовательность ζ;·ι1ρ1ι;·ι11 из 538 аминокислот описана в 8Е0 ГО N0:2. В его полном виде полипептид ζ.αΙρΗαΙΙ представляет полноразмерный полипептидный сегмент (остаток 1 (Ме!) - остаток 538 (8ег) 8Е0 ГО N0:2). Домены и структурные признаки полипептида ζ;·ι1ρ1ι;·ι11 дополнительно описаны ниже.

Анализ полипептида ζαΐρΐιαίΐ. кодируемого ДНК-последовательностью 8Е0 ГО N0:1, выявил открытую рамку считывания, кодирующую 538 аминокислот (8Е0 ГО N0:2), содержащую предсказанный секреторный сигнальный пептид из 19 аминокислотных остатков (остаток 1 (Ме!) - остаток 19 (С1у) 8Е0 ГО N0:2) и зрелый полипептид из 519 аминокислотных остатков (остаток 20 (Сук) - остаток 538 (8ег) 8Е0 ГО N0:2). Кроме мотива \У8Х\У8 (8Е0 ГО N0:3), соответствующего остаткам 214-218 8Е0 ГО

- 8 006501

N0:2, этот рецептор содержит цитокинсвязывающий домен из приблизительно 200 аминокислотных остатков (остатки 20 (Сук) - 237 (Ηίκ) 8ЕО ΙΌ N0:2); линкер доменов (остатки 120 (Рго) - 123 (Рго) 8Е0 ГО N0:2); предпоследний район цепи (остатки 192 (Бук) - 202 (А1а) 8Е0 ΙΌ N0:2); трансмембранный домен (остатки 238 (Беи) - 255 (Беи) 8Е0 ΙΌ N0:2); полный внутриклеточный сигнальный домен (остатки 256 (Бук) - 538 (8ег) 8Е0 ΙΌ N0:2), который содержит сайт передачи сигнала «Вох I» (остатки 267 (Не) - 273 (Рго) 8Е0 ΙΌ N0:2) и сайт передачи сигнала «Вох II» (остатки 301 (Беи) - 304 (01у) 8Е0 ΙΌ N0:2). Специалистам в данной области будет понятно, что эти границы доменов являются приблизительными и основаны на сопоставлениях с известными белками и предсказаниями укладки белка. Кроме этих доменов, консервативные признаки рецепторов в кодируемом рецепторе включают в себя (как показано в 8Е0 ΙΌ N0:2), консервативный остаток Тгр в положении 138 и консервативный остаток Лтд в положении 201. Соответствующие полинуклеотиды, кодирующие эти районы, домены, мотивы, остатки и последовательности полипептида ха1рйа11. описанные выше, представлены в 8Е0 ΙΌ N0:1.

Присутствие трансмембранных районов и консервативных мотивов и мотивов с малой дисперсией обычно коррелирует с важными структурными районами (или определяет эти районы) в белках. Районы с малой дисперсией (например, гидрофобные кластеры) обычно присутствуют в районах структурной важности (811еррагб. Р. е1 а1., кирга). Такие районы малой дисперсии часто содержат редкие или нечастые аминокислоты, такие как триптофан. Фланкирующие районы и районы между такими консервативными мотивами и мотивами малой дисперсии могут быть более вариабельными, но являются часто функционально значимыми, так как они могут относиться к важным структурам или определять важные структуры и активности, такие как связывающие домены, домены биологической и ферментативной активности, трансдукции сигнала, взаимодействия клетка-клетка, домены тканевой локализации и т.п.

Районы консервативных аминокислотных остатков в ха1рПа 11, описанные выше, могут быть использованы в качестве инструментов для идентификации новых членов семейства. Например, полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) может быть использована для амплификации последовательностей, кодирующих консервативные районы, из РНК, полученной из множества источников тканей или клеточных линий. В частности, высоковырожденные праймеры, сконструированные из ζα1ρ1ια11, применимы для этой цели. Конструирование и использование таких вырожденных праймеров может быть легко выполнено лицами с квалификацией в данной области.

Данное изобретение обеспечивает полинуклеотидные молекулы, в том числе молекулы ДНК и РНК, которые кодируют описанные здесь полипептиды ζα1ρ1ια11. Специалистам в данной области будет понятно, что, в связи с вырожденностью генетического кода, возможна значительная вариация среди этих полинуклеотидных молекул. 8Е0 ΙΌ N0:4 является вырожденной последовательностью ДНК, которая включает в себя все ДНК, которые кодируют полипептид ζα1ρ1ια11 8Е0 ΙΌ N0:2. Специалистам в данной области будет понятно, что вырожденная последовательность 8Е0 ΙΌ N0:4 обеспечивает также все последовательности РНК, кодирующие 8Е0 ΙΌ N0:2, путем замены и (урацилом) Т (тимина). Таким образом, кодирующие полипептид ζα1ρ1ια 11 полинуклеотиды, содержащие район от нуклеотида 1 до нуклеотида 1614 8Е0 ΙΌ N0:4, и их РНК-эквиваленты рассматриваются данным изобретением. Табл. 1 дает однобуквенные коды, используемые в 8Е0 ΙΌ N0:4 для обозначения положений вырожденных нуклеотидов. «Разрешения» представляют собой нуклеотиды, обозначенные кодовой буквой. «Комплемент» указывает код для комплементарного нуклеотида (комплементарных нуклеотидов). Например, код Υ обозначает либо С, либо Т, а его комплемент К обозначает Л или О, причем Л является комплементарным Т, а О является комплементарным С.

Таблица 1

Нуклеотид	Разрешение	Комплемент	Разрешение
Л	Л	Т	Т
С	С	0	0
0	0	С	С
Т	Т	Л	Л
К	А\|0	Υ	С\|Т
Υ	С\|Т	К	А\|0
М	Л\|С	К	0\|Т
К	0\|Т	М	Л\|С
8	С]0	8	С\|0
№	Л\|Т	№	Л\|Т
Η	Л\|С\|Т	Ό	А\|О\|Т
В	С\|О\|Т	V	А\|С\|О
V	А\|С\|О	В	С\|О\|Т
Ό	А\|О\|Т	Η	А\|С\|Т
N	А\|С\|О\|Т	N	А\|С\|О\|Т

- 9 006501

Вырожденные кодоны, используемые в ВЕО ЕО N0:4, включающие в себя все возможные кодоны для конкретной аминокислоты, представлены в табл. 2.

Таблица 2

АминоКислота	Однобуквенный год	Кодоны	Вырожденный кодон
Зуз	С	ТСС ТСТ	ТСУ
Зег	3	АСС АСТ ТСА ТСС ТСС ТСТ	Ν3Ν
ТЬг	Т	АСА АСС АСС АСТ	АСЫ
Рго	Р	ССА ССС ССС ССТ	ССЫ
А1а	А	ССА ССС ССС ССТ	ССЫ
СЬу	0	ССА ССС ССС ССТ	ссц
Азп	N	ААС ААТ	ΑΑΥ
Азр	Ц	САС САТ	САУ
СЬи	Е	САА САС	САК
СЬп	Ω	САА САС	САК
ΗΪ3	Н	САС САТ	САУ
Агд	К	АСА АСС ССА ССС ССС ССТ	МСЫ
Ьуз	К	ААА ААС	ААК
МеЕ	М	АТС	АТС
Не	I	АТА АТС АТТ	АТН
Ьеи	ь	СТА СТС СТС СТТ ТТА ТТС	ΥΤΝ
УаЬ	V	СТА СТС СТС СТТ	СТЫ
РЬе	г	ТТС ТТТ	ΤΤΥ
Туг	Υ	ТАС ТАТ	ΤΑΥ
Тгр	N	ТСС	ТСС
Тег		Т/кА ТАС ТСА	ткк
Азп/Азр	в		ВАУ
СЬи/СЬп	. Ζ		ЗАК
Апу	X		ΝΝΝ

Специалисту с обычной квалификацией в данной области будет понятно, что некоторая двусмысленность вводится в определение вырожденного кодона, представляющего все возможные кодоны, кодирующие каждую аминокислоту. Например, вырожденный кодон для серина (№8Ν) может, в некоторых обстоятельствах, кодировать аргинин (ЛОВ), а вырожденный кодон для аргинина (ΜΟΝ) может, в некоторых обстоятельствах, кодировать серин (ΑΟΥ). Сходная взаимосвязь существует между кодонами, кодирующими фенилаланин и лейцин. Таким образом, некоторые полинуклеотиды, охватываемые вырожденной последовательностью, могут кодировать вариантные аминокислотные последовательности, но специалист с обычной квалификацией в данной области может легко идентифицировать такие вариантные последовательности сравнением с аминокислотной последовательностью ВЕО Ш N0:2. Вариантные последовательности могут быть легко тестированы на функциональность, как описано здесь.

Специалисту с обычной квалификацией в данной области будет также понятно, что различные виды могут проявлять предпочтительное (преферентивное) использование кодонов. В общем, см., Огап!Ьат, е! а1., Жс. АскЕ Ве§. 8: 1893-912, 1980; Наа§, е! а1., Сигг. Βΐοΐ. 6: 315-24, 1996; Ααίη-ΗοΕ^οη, е! а1., Оепе 13: 355-64, 1981; Огоуеап апб Р1ег§, Оепе 18: 199-209, 1982; Но1т, Жс. Αοϊάδ Ве§. 14: 3075-87, 1986; Екетига, 3. Μο1. Βΐο1. 158: 573-97, 1982. В применении здесь термин предпочтительное (преферентивное) использование кодонов или предпочтительные (преферентивные) кодоны является термином данной области, относящимся к кодонам трансляции белка, которые наиболее часто используются в клетках определенных видов, отдавая, следовательно, предпочтение одному или немногим представителям возможных кодонов, кодирующих каждую аминокислоту (см. табл. 2). Например, аминокислота треонин (ТЬг) может кодироваться АСА, АСС, АСО или АСТ, но в клетках млекопитающих наиболее обычно используемым кодоном является АСС; в других видах, например в клетках насекомых, дрожжей, вирусов или бактерий, могут быть предпочтительными другие кодоны ТЬг. Предпочтительные кодоны для конкретных видов могут быть введены в полинуклеотиды данного изобретения различными способами, известными в этой области. Введение предпочтительных последовательностей кодонов в рекомбинантную ДНК может, например, усиливать продуцирование этого белка, делая трансляцию белка более эффективной в конкретном типе клеток или виде. Таким образом, вырожденная последовательность кодонов, описанная в ВЕР ΕΌ N0:4, служит в качестве матрицы для оптимизации экспрессии полинуклеотидов в различных типах клеток и видах, обычно используемых в данной области и описанных здесь. Последовательности, содержащие предпочтительные кодоны, могут быть тестированы и оптимизированы для экспрессии в различных видах и тестированы на функциональность, как описано здесь.

В предпочтительных вариантах данного изобретения выделенные полинуклеотиды будут гибридизоваться с районами одинакового размера ВЕР ΕΌ N0:1 или с комплементарной ей последовательностью при строгих условиях. Обычно строгие условия выбирают таким образом, чтобы температура была приблизительно на 5°С ниже, чем точка термического плавления (Т_т) для специфической последовательности при определенных ионной силе и рН. Тт является температурой (при определенных ионной силе и

- 10 006501 рН), при которой 50% последовательности-мишени гибридизуются с точно совместимым зондом. Многочисленные уравнения для расчета Т_т известны в данной области и являются специфическими для ДНК, РНК и гибридов ДНК-РНК и полинуклеотидных последовательностей-зондов варьирующей длины (см., например, 8атЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1опшд. А ЬаЬога1оту Мапиа1, 8есопб Εάίΐίοη (Со1б 8ргшд НатЬот Ргекк 1989); АикиЬе1 е! а1., (ебк.), Сштеп! Рго!осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду (1окп У11еу апб 8опк, 1пс., 1987); Вегдег апб К1тте1 (ебк.), Ошбе !о Мо1еси1аг С1ошпд Тес11пк|иек (Асабетк Ргекк, 1пс. 1987); и ХУеИпиг. Сгй. Кеу. ВюсЫт. Мо1. Вю1. 26:227 (1990)). Программное обеспечение для анализа последовательности, такое как ОЬЮО 6.0 (Ь8К; Ьопд Ьаке, МЫ) и Рптег Ргет1ег 4.0 (Ргет1ег Вюкой 1п1егпайопа1; Ра1о А1!о, СА), а также сайты в Интернете, являются доступными инструментами для анализа конкретной последовательности и расчета Тт на основе определенных пользователем критериях. Такие программы могут также анализировать конкретную последовательность при определенных условиях и идентифицировать подходящие зондовые последовательности. Обычно гибридизацию более длинных полинуклеотидных последовательностей (например, >50 пар оснований) выполняют при температуре приблизительно на 2025°С ниже рассчитанной Т_т. Для меньших зондов (например, <50 пар оснований) гибридизацию обычно проводят при Т_т или на 5-10°С ниже. Это позволяет достичь максимальной скорости гибридизации для гибридов ДНК-ДНК и ДНК-РНК. Более высокие степени строгости при более низких температурах могут быть достигнуты добавлением формамида, который снижает Тт гибрида приблизительно на 1°С для каждого 1% формамида в буферном растворе. Условия гибридизации подходящей строгости эквивалентны инкубации от приблизительно 5 ч до ночи при приблизительно 42°С в растворе, содержащем приблизительно 40-50% формамида, до приблизительно 6Х 88С, приблизительно 5Х раствора Денхардта, от 0 до приблизительно 10% сульфата декстрана и приблизительно 10-20 мкг/мл денатурированной коммерчески доступной ДНК-носителя. Обычно такие строгие условия включают в себя температуры 20-70°С и гибридизационный буфер, содержащий до 6х 88С и 0-50% формамид; затем гибридизацию сопровождают промыванием фильтров в 88С до приблизительно 2х 88С. Например, подходящая строгость промывки эквивалентна 0,1Х 88С-2Х 88С при 55°С-65°С. Различные степени строгости могут быть использованы во время гибридизации и промывания для достижения максимального специфического связывания с последовательностью-мишенью. Обычно промывки после гибридизации выполняют при увеличивающихся степенях строгости для удаления негибридизовавшихся полинуклеотидных зондов из гибридизованных комплексов. Строгие условия гибридизации и промывок зависят от длины зонда, отраженной в Тт, используемых гибридизационных и промывочных растворов и рутинно определяются эмпирически специалистом в данной области.

Как отмечалось ранее, выделенные полинуклеотиды данного изобретения включают в себя ДНК и РНК. Способы выделения ДНК и РНК хорошо известны в данной области. Обычно РНК выделяют из ткани или клетки, которая продуцирует большие количества РНК ха1рка 11. Такие ткани и клетки идентифицируют Нозерн-блоттингом (Тйотак, Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А 77:5201, 1980) и включают в себя РВЬ, селезенку, тимус и лимфатические ткани, клетки Кар, линии клеток эритролейкоза человека (например, ТЕ-1), линии клеток острого моноцитарного лейкоза, другие лимфоидные и гемопоэтические клеточные линии и т.п. Тотальная РНК может быть получена с использованием экстракции изотиоцианатом гуанидиния с последующим выделением центрифугированием в градиенте СкС1 (СЫтдМп е! а1., Вюсйетщйу 18: 52-94, 1979). Поли(А)⁺ РНК получают из тотальной РНК с использованием способа Ау1у апб Ьебет, (Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А 69: 1408-1412 (1972)). Комплементарную ДНК (кДНК) получают из поли (А)⁺РНК при помощи известных способов. Альтернативно может быть выделена геномная ДНК. Затем полинуклеотиды, кодирующие полипептиды ха1р11а1к идентифицируют и выделяют, например, с использованием гибридизации или полимеразной цепной реакции (ПЦР) (МцШк, И.8. Ра!еп! Ыо. 4683202).

Полноразмерный клон, кодирующий ха1р11а1к может быть получен общепринятыми процедурами клонирования. Клоны комплементарной ДНК (кДНК) являются предпочтительными, хотя для некоторых применений (например, экспрессиии в трансгенных животных) могут быть предпочтительными использование геномного клона или модификация клона кДНК с целью включения по меньшей мере одного геномного интрона. Способы получения клонов кДНК и геномных клонов хорошо известны и находятся в пределах обычной квалификации в данной области и включают в себя использование описанной здесь последовательности или ее частей для зондирования или праймирования библиотеки. Экспрессионные библиотеки могут быть зондированы антителами к ха1р11а11. фрагментам рецептора или другим партнерам специфического связывания.

Полинуклеотиды данного изобретения могут быть также синтезированы с использованием автоматических приборов для синтеза ДНК. В настоящее время предпочтительным способом является фосфорамидитный способ. Если химически синтезированная двухцепочечная ДНК требуется для такого применения, как синтез гена или фрагмента гена, то каждую комплементарную цепь получают отдельно. Получение коротких полинуклеотидов (60-80 п.н.) является технически простым и может быть выполнено синтезом комплементарных цепей и затем их отжигом. Однако для получения более длинных полинуклеотидов (>300 п.н.) обычно используют специальные стратегии, так как эффективность связывания каждого цикла во время химического синтеза ДНК редко является 100%. Для преодоления этой пробле

- 11 006501 мы синтетические гены (двухцепочечные) собирают в модулярной форме из одноцепочечных фрагментов, имеющих длину 20-100 нуклеотидов.

Один из способов для построения синтетического гена требует первоначального получения набора перекрывающихся, комплементарных олигонуклеотидов, каждый из которых имеет длину между 20 и 60 нуклеотидами. Каждый внутренний участок этого гена имеет комплементарные 3'- и 5'-концевые удлинения, сконструированные для образования пар нуклеотидов точно с соседним участком. Таким образом, после сборки данного гена процесс завершают заделыванием разрывов (ников) вдоль каркасов этих двух цепей с использованием ДНК-лигазы Т4. Кроме кодирующей белок последовательности, синтетические гены могут быть сконструированы с концевыми последовательностями, которые облегчают встраивание в сайт рестрикционной эндонуклеазы (рестриктазы) клонирующего вектора. Кроме того, должны быть добавлены другие последовательности, которые содержат сигналы для правильной инициации и терминации транскрипции и трансляции.

Альтернативным способом получения полноразмерного гена является синтез описанного набора перекрывающихся олигонуклеотидов (40-100 нуклеотидов). После отжига 3' и 5' коротких перекрывающихся комплементарных районов (6-10 нуклеотидов) большие промежутки (гэпы) все еще остаются, но эти короткие районы спаренных нуклеотидов являются как достаточно длинными, так и стабильными для удерживания вместе этой структуры. Гэпы заполняются, и ДНК-дуплекс завершается через ферментативный синтез ДНК ДНК-полимеразой I Е. сой. После завершения ферментативного синтеза разрывы (ники) заделываются ДНК-лигазой Т4. Двухцепочечные конструкции последовательно связывают друг с другом с образованием полной последовательности гена, которую проверяют анализом последовательности ДНК. См. Сйск апб Ра81етпак, Мо1еси1аг Вю1сс1то1оду. Рг1пс1р1сз апб Аррйсабопк о£ ВесотЫпап! ΌΝΛ (А8М Ргекк, ХУаЧйпДоп. Ό.Ο 1994); Йакита е! а1., Аипи. Веу. Вюсйет. 53:323-56, 1984; и С11т1е е! а1., Ргос. N311. Асаб. 8с1. И8А 87:633-7, 1990.

Далее, данное изобретение обеспечивает копии полипептидов и полинуклеотидов из других видов (ортологи). Эти виды включают в себя, но не ограничиваются ими, виды млекопитающих, птиц, земноводных, пресмыкающихся, рыб, насекомых и другие виды позвоночных и беспозвоночных. Особый интерес представляют собой полипептиды ха1рйа11 из других видов млекопитающих, в том числе полипептиды мышей, свиньи, овцы, коровы, псовых, кошачьих, лошадиных видов и полипептиды других приматов. Ортологи ха1р11а11 человека могут быть клонированы с использованием информации и композиций, обеспеченных данным изобретением, в сочетании с общепринятыми способами клонирования. Например, кДНК может быть клонирована с использованием мРНК, полученной из типа ткани или клеток, которые экспрессируют этот белок. Подходящие источники мРНК могут быть идентифицированы зондированием Нозерн-блотов зондами, сконструированными из описанных здесь последовательностей. Затем готовят библиотеку из мРНК позитивной ткани или линии клеток. Затем кодирующая полипептид ха1р11а11 кДНК может быть выделена различными способами, такими как зондирование полной или частичной кДНК человека или одним или несколькими наборами вырожденных зондов, основанных на описанных последовательностях. Эта кДНК может быть также клонирована с использованием полимеразной цепной реакции, или ПЦР (МиШк, кирга), с применением праймеров, сконструированных из описанной здесь характерной последовательности ха1р11а11 человека. В дополнительном способе, эта библиотека кДНК может быть использована для трансформации или трансфекции клеток-хозяев, и экспрессия представляющей интерес кДНК может быть детектирована антителом к полипептиду ха1р11а11. Подобные способы могут быть применены также для выделения геномных клонов.

Субъединицы рецепторов цитокинов характеризуются мультидоменной структурой, содержащей внеклеточный домен, трансмембранный домен, который закрепляет этот полипептид в клеточной мембране, и внутриклеточный домен. Внеклеточный домен может быть лигандсвязывающим доменом, а внутриклеточный домен может быть эффекторным доменом, участвующим в трансдукции (передаче) сигнала, хотя лигандсвязывающая и эффекторная функции могут находиться на различных субъединицах мультимерного рецептора. Лигандсвязывающий домен сам является мультидоменной структурой. Мультимерные рецепторы включают в себя гомодимеры (например, изоформы αα и ββ ΡΌΟΕ-рецептора, рецептор эритропоэтина, МРЬ и О-С8Е-рецептор), гетеродимеры, каждая из субъединиц которых имеет лигандсвязывающие и эффекторные домены (например, изоформа αβ ΡΌΟΕ-рецептора), и мультимеры, имеющие компоненты-субъединицы с, по существу, различными функциями (например, рецепторы 1Ь-2, 1Ь-3, 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-6, 1Ь-7 и ОМ-С8Е). Некоторые субъединицы рецепторов являются общими для множества рецепторов. Например, субъединица А1С2В, которая сама не может связывать лиганд, но включает в себя домен внутриклеточной трансдукции сигнала, является компонентом рецепторов 1Ь-3 и ОМ-С8Е. Многие рецепторы цитокинов могут быть помещены в одно из четырех родственных семейств на основе их структуры и функции. Например, гемопоэтические рецепторы отличаются присутствием домена, содержащего консервативные остатки цистеина и мотива \У8Х\У8 (8ЕО ΙΌ N0:3). Структура рецепторов цитокинов обсуждалась в обзоре Игба1, Апи. Веройк Меб. С1ет. 26:221-228, 1991 и Соктап, Су!окте 5:95-106, 1993. Под селективным давлением потребности организмов в приобретении новых биологических функций новые члены семейств рецепторов, по-видимому, возникают из дупликации существую

- 12 006501 щих генов рецепторов, приводя к существованию мультигенных семейств. Таким образом, члены семейств содержат остатки (признаки) предкового гена (гена предков), и эти характерные признаки могут быть использованы в выделении и идентификации дополнительных членов семейств. Таким образом, суперсемейство рецепторов цитокинов подразделяется на несколько семейств, например семейство иммуноглобулинов (в том числе рецепторы С8Е-1, МОЕ, 1Ь-1 и ΡΌΟΓ); семейство гематопоэтинов (в том числе β-субъединица 1Ь-2-рецептора, α-субъединица ОМ-С8Е-рецептора, β-субъединица ОМ-С8Ерецептора; и рецепторы О-С8Е, ЕРО, 1Ь-3, 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-6, 1Ь-7 и 1Ь-9); семейство ΤΝΕ-рецепторов (в том числе рецепторы ΤΝΕ (р80), ΤΝΕ (р60), СО27, СО30, (040, Раз и ΝΟΡ).

Анализ последовательности ζαΐρΐια 11 предполагает, что он является членом того же самого подсемейства рецепторов, что и подсемейство β-субъединицы 1Ь-2-рецептора, 1Ь-3-, 1Ь-4- и 1Ь-6-рецепторов. Некоторые рецепторы в этом подсемействе (например, О-С8Е) связываются с образованием гомодимеров, которые осуществляют передачу сигнала. Другие члены этого подсемейства (например, 1Ь-6-, ΣΠ-11и Ь1Е-рецепторы) объединяются со второй субъединицей (называемой β-субъединицей) для связывания лиганда и трансдукции сигнала. Специфические β-субъединицы связываются со множеством специфических субъединиц рецепторов цитокинов. Например, β-субъединица др130 (Н1Ы е! а1., Се11 63:1149-1157, 1990) связывается с субъединицами рецепторов, специфическими для 1Ь-6, 1Ь-11 и Ь1Е (Оеагшд е! а1., ЕМВО 1. 10:2839-2848, 1991; Оеагшд е! а1., ϋ.δ. Ра!еп! Νο. 5284755). Онкостатин М связывается с гетеродимером Ь1Е-рецептора и др130. ΟΝΤΕ связывается с тримерными рецепторами, содержащими ΟΝΤΕрецептор, Ь1Е-рецептор и субъединицы др130.

Полинуклеотидная последовательность для мышиного ортолога ζа1рЬа11 человека была идентифицирована и показана в 8ЕО ΙΌ ΝΟ:84, а соответствующая аминокислотная последовательность показана в 8ЕО ΙΌ ΝΟ:85. Анализ мышиного полипептида ζ31ρΗ311. кодируемого последовательностью ДНК 8ЕО ΙΌ ΝΟ:84, выявил открытую рамку считывания, кодирующую 529 аминокислот (8ЕО ΙΌ ΝΟ:85), содержащих предсказанный секреторный сигнальный пептид из 19 аминокислотных остатков (остаток 1 (Ме!)остаток 19 (8ег) 8ЕО ΙΌ ΝΟ:85) и зрелый полипептид из 510 аминокислот (остаток 20 (Суз) - остаток 529 (8ег) 8ЕО ΙΌ ΝΟ:2). Кроме мотива \У8Х\У8 (8ЕО ΙΌ ΝΟ:3), соответствующего остаткам 214-218 8ЕО ΙΌ ΝΟ:85, этот рецептор содержит цитокинсвязывающий домен из приблизительно 200 аминокислотных остатков (остатки 20 (Суз)-237 (Н15) 8ЕО ΙΌ ΝΟ:85); линкер доменов (остатки 120 (Рго)-123 (Рго) 8ЕО ΙΌ ΝΟ:85); предпоследний район цепи (остатки 192 (Ьу5)-202 (А1а) 8ЕО ΙΌ ΝΟ:85); трансмембранный домен (остатки 238 (Ме!)-254 (Ьеи) 8ЕО ΙΌ ΝΟ:85); полный внутриклеточный домен передачи сигнала (остатки 255 (Ьу8)-529 (8ег) 8ЕО ΙΌ ΝΟ:85), который содержит сайт передачи сигнала «Вох Ι» (остатки 266 (Пе)273 (Рго) 8ЕО ΙΌ ΝΟ:85) и сайт передачи сигнала «Вох ΙΙ» (остатки 301 (Пе)-304 (Уа1) 8ЕО ΙΌ ΝΟ:2). Сравнение аминокислотных последовательностей полипептидов человека и мыши выявило, что как человеческий полипептид, так и полипептид-ортолог содержат соответствующие структурные признаки, описанные выше (см., например, фиг. 2). Зрелая последовательность для мышиного ζη^Ιη-ιΟ начинается при Суз₂₀ (как показано в 8ЕО ΙΌ ΝΟ:85), который соответствует Суз₂₀ (как показано в 8ЕО ΙΌ ΝΟ:2) в человеческой последовательности. Существует приблизительно 63% идентичность между мышиной и человеческой последовательностями на протяжении всей аминокислотной последовательности, соответствующей 8ЕО ΙΌ ΝΟ:2 и 8ЕО ΙΌ ΝΟ:85. Существует приблизительно 69% идентичность между мышиной и человеческой последовательностями ζа1рЬа11 на протяжении внеклеточного цитокинсвязывающего домена, соответствующего остатками 20 (Суз)-237 (Н1з) 8ЕО ΙΌ ΝΟ:2 и остаткам 20 (Суз)-237 (Н1з) 8ЕО ΙΌ ΝΟ:85. Существует приблизительно 60% идентичность между мышиной и человеческой последовательностями ζ31ρ1ΐ311 на протяжении внутриклеточного домена передачи сигнала, соответствующего остаткам 256 (Ьу8)-538 (8ег) 8ЕО ΙΌ ΝΟ:2 и остаткам 255 (Ьу8)-529 (8ег) 8ЕО ΙΌ ΝΟ:85. Приведенные выше процентные идентичности определяли с использованием программы ЕА8ТА с к!ир=1, репа1!у открывания гэпа=12, репа1!у удлинения гэпа=2 и матрицей замен=В^Ο8υМ62, с другими параметрами по умолчанию. Соответствующие полинуклеотиды, кодирующие описанные выше районы, домены, мотивы, остатки и последовательности мышиного полипептида 7а1рЬа11, показаны в 8ЕО ΙΌ ΝΟ:84.

Специалистам в данной области будет понятно, что последовательность, описанная в 8ЕО ΙΌ ΝΟ:1, представляет отдельный аллель ДНК ζа1рйа11 человека и что ожидается существование аллельной вариации и альтернативного сплайсинга. Аллельные варианты этой последовательности могут быть клонированы зондированием библиотек кДНК или геномных библиотек из различных индивидуумов в соответствии со стандартными процедурами. Аллельные варианты последовательности ДНК, показанной в 8ЕО ΙΌ ΝΟ:1, в том числе варианты, содержащие молчащие мутации, и варианты, в которых мутации приводят к изменениям в последовательности аминокислот, находятся в объеме данного изобретения, так же как и белки, которые являются аллельными вариантами 8ЕО ΙΌ ΝΟ:2. кДНК, генерируемые из образованных альтернативным сплайсингом мРНК, которые сохраняют свойства полипептида ζа1рйа11, включены в объем данного изобретения, так же как полипептиды, кодируемые такими кДНК и мРНК. Аллельные варианты и сплайсинговые варианты этих последовательностей могут быть клонированы зондированием библиотек кДНК или геномных библиотек из различных индивидуумов или тканей в соответствии со стандартными процедурами, известными в данной области.

- 13 006501

Данное изобретение обеспечивает также выделенные полипептиды ζα1ρήα11, которые являются, по существу, одинаковыми с полипептидами 8Е0 Ш N0:2 и их ортологами. Термин по существу одинаковый используется здесь для обозначения полипептидов, имеющих по меньшей мере 70%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 80%-ную идентичность последовательностям, показанным в 8Е0 Ш N0:2, или их ортологам. Такие полипептиды будут более предпочтительно по меньшей мере на 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 95% или более идентичны 8Е0 Ш N0:2 или ее ортологам. Процентную идентичность последовательности определяют общепринятыми способами. См., например, А11ксйи1 е! а1., Ви11. Ма1И. Βίο. 48: 603-616 (1986) и Нешко££ апб Нешко££, Ргос. №11. Асаб. 8е£ и8А 89: 10915-10919 (1992). Вкратце, две последовательности аминокислот сопоставляют выстраиванием для оптимизации оценок сопоставления с использованием репа1!у открывания гэпа 10 и репа1!у удлинения гэпа 1 и оценочной матрицы Ь1окот 62 Нетко££ апб Нетко££ (1Ь1б.), показаной в табл. 3 (аминокислоты представлены с использованием стандартных однобуквенных кодов). Затем процентную идентичность рассчитывают как ____________________Общее число идентичных совпадений_______________ _х юо [Длина более длинной последовательности плюс число гэпов, введенных в более длинную последовательность для сопоставления этих двух последовательностей]

Таблица 3

	А	К	Ν Ό	С	Ω	Е С	Н	I	ь	к	М	Е	Р	3 Т К	Υ V
А	4
К	-1	5
N	-2	0	6
Ό	-2	-2	1	б
С	0	-3	-3	-3	9
Ω	-1	1	0	0	-3	5
Е	-1	0	0	2	-4	2 5
С	0	-2	0	-1	-з	2 -2	б
Н	-2	0	1	-1	-3 0	0	-2	8
I	-1	-3	-3	-3	-1 -3 -3	-4	-3	4
ь	-1	-2	-3	-4	-1	! -3	-4	-3	2	4
к	-1	2	0	-1	-3 11	-2	-1	-3	-2	5
м	-1	-1	-2	-3	-1 0 -2	-3	-2	1	2	-1	5
Е	-2	-3	-3	-3	-2 -3	! -3	-3	-1	0	0	-3	0	6
Р	-1	-2	-2	-1	-3 -]	. -1	-2	-2	-3	-3	-1	-2	-4	7
3	1	-1	1	0	-1 с	) 0	0	-1	-2	-2	0	-1	-2	-1	4
Т	0	-1	0	-1	-1 -1	. -1	-2	-2	-1	-1	-1	-1	-2	-1	1 5
И	-3	-3	-4	-4	-2 -2	! -3	-2	-2	-3	-2	-3	-1	1	-4	-3 -2 11
Υ	-2	-2	-2	-3	-2 -1	. -2	-3	2	-1	-1	-2	-1	3	-3	-2 -2 2	7
V	0	-3	-3	-3	-1 -2	1 -2	-3	-3	3	1	-2	1	-1	-2	-2 0 -3	-1 4

Идентичность последовательности полинуклеотидных молекул определяют подобными способами с использованием отношения, описанного выше.

Специалистам в данной области должно быть понятно, что имеется много установленных алгоритмов для сопоставления аминокислотных последовательностей. Алгоритм поиска сходства «РА8ТА» Реагкоп и Ыртап представляет собой подходящий способ сопоставления белков для исследования уровня идентичности, разделяемой описанной здесь аминокислотной последовательностью и аминокислотной последовательностью возможного варианта ζа1ρйа11. Алгоритм РА8ТА описан Реагкоп апб Ыртап, Ргос. №11. Асаб. 8с1. И8А 85:2444 (1988) и Реагкоп, М1е1Ь. Е^уто1. 183:63 (1990).

Вкратце, РА8ТА сначала характеризует сходство последовательностей путем идентификации районов, общих у запрашиваемой последовательности (например, 8Е0 Ш N0:2) и тест-последовательности, которые имеют либо более высокую плотность идентичностей (если переменная к!ир=1), либо пар идентичностей (если к!ир=2), без учета консервативных аминокислотных замен, инсерций или делеций. Затем десять районов с наиболее высокой плотностью идентичностей повторно оценивают сравнением сходства всех спаренных аминокислот с использованием матрицы аминокислотных замен, а концы районов «подравнивают» для включения только остатков, которые способствуют наивысшей оценке. Если имеется несколько районов с оценками, большими, чем величина «отсечения» (рассчитанная по предварительно определенной формуле на основе длины данной последовательности и ее величины к!ир), то приведенные в порядок подравниванием первоначальные районы исследуют для определения, могут ли эти районы быть соединены с образованием приближенного сопоставления с гэпами. Наконец, районы с

- 14 006501 наивысшей оценкой двух аминокислотных последовательностей сопоставляют с использованием модификации алгоритма №е61етап-\Уипкс11-8е11егк (№е61етап апб ХУипкеН. 1. Мо1. ΒίοΙ. 48:444 (ΐ970): 8е11егк. 81ЛМ 1. Αρρ1. Ма!й. 26:787 (ΐ974)). который делает возможными инсерции и делеции аминокислот. Предпочтительными параметрами для анализа ΡΑδΤΑ являются к!ир= ΐ. репа1!у открывания гэпа=10, репа1!у удлинения гэпа=1 и оценочная матрица=ВЬ08иМ62, с другими параметрами, установленными по умолчанию. Эти параметры могут быть введены в программу ΡΑδΤΑ модификацией файла оценочной матрицы («8МΑΤΚ1X»). как объясняется в приложении 2 Реагкоп. №111. Епгуток ΐ83:63 (ΐ990).

Программа ΡΑ8ΤΑ может быть использована для определения идентичности последовательности молекул нуклеиновых кислот с использованием приведенного выше отношения. Для сравнений нуклеотидных последовательностей величина к!ир может быть в диапазоне между ΐ и 6. предпочтительно от 3 до 6. наиболее предпочтительно 3. с другими параметрами, установленными по умолчанию.

Таблица ВЬ08ИМ62 (табл. 3) является матрицей замен аминокислот, полученной из приблизительно 2000 локальных множественных сопоставлений сегментов белковых последовательностей, представляющих высококонсервативные районы более чем 500 групп родственных белков (Немкой апб Нешкой. Ргос. №!1. Αса6. 8с1. υδΑ 89:ΐ09ΐ5 (ΐ992)). Таким образом, частоты замен ВЬ08ИМ62 могут быть использованы для определения консервативных аминокислотных замен, которые могут быть введены в аминокислотные последовательности данного изобретения. Хотя можно сконструировать аминокислотные замены на основе лишь химических свойств (как описано ниже). выражение «консервативные аминокислотные замены» предпочтительно относится к замене, представленной величиной ВЬ08иМ62. большей чем -ΐ. Например, аминокислотная замена является консервативной, если эта замена характеризуется величиной ВЬ08иМ62 0. ΐ. 2 или 3. В соответствии с этой системой предпочтительные консервативные аминокислотные замены характеризуются величиной ВЬ08иМ62 по меньшей мере ΐ (например, ΐ. 2 или 3). хотя более предпочтительные консервативные аминокислотные замены характеризуются величиной ВЬ08иМ62 по меньшей мере 2 (например, 2 или 3).

Вариантные полипептиды ζη1ρΠί·ι 11 или, по существу, гомологичные полипептиды ζπ1ρ1ιπΐΐ характеризуются тем, что они имеют одну или несколько аминокислотных замен, делеций или присоединений. Эти изменения предпочтительно имеют минорный характер, то есть замены консервативных аминокислот (см. табл. 4) и другие замены, которые не влияют значимо на укладку или активность полипептида; небольшие делеции, обычно от одной до ~30 аминокислот; и небольшие амино- или карбоксил-концевые удлинения, такие как аминоконцевой остаток метионина, небольшой линкерный пептид до приблизительно 20-25 остатков, или аффинная метка. Таким образом, данное изобретение включает в себя полипептиды из приблизительно от 489 до приблизительно 568 аминокислотных остатков, которые включают в себя последовательность, которая по меньшей мере на 80%. предпочтительно на 90% и более предпочтительно на 95% или более идентична соответствующему району 8ЕО ΙΌ N0:2. Полипептиды, содержащие аффинные метки, могут дополнительно содержать сайт протеолитического расщепления между полипептидом ζπ1ρ1ιπΐΐ и этой аффинной меткой. Подходящие сайты включают в себя сайты расщепления тромбином и сайты расщепления фактором Ха.

Таблица 4

Замены консервативных аминокислот

Основные	Аргинин Лизин Гистидин
Кислые	Г лутаминовая кислота Аспарагиновая кислота
Полярные	Глутамин Аспарагин
Гидрофобные	Лейцин Изолейцин Валин
Ароматические	Фенилаланин Триптофан Тирозин
Небольшие	Глицин Аланин Серин Треонин Метионин

Данное изобретение дополнительно обеспечивает далее множество других слитых полипептидов и родственных мультимерных белков, содержащих один или несколько слитых полипептидов. Например, полипептид ζπ1ρ1ιπ 11 может быть получен в виде слитого полипептида для димеризации белка, как описано в патентах США с №№ 5155027 и 5567584. Предпочтительная димеризация белков в этом отноше- ΐ5 нии включает в себя домены константной области иммуноглобулина. Слитые белки иммуноглобулин7а1рйаП могут экспрессироваться в генетически сконструированных клетках с получением множества мультимерных аналогов ζαΐρΐια 11. Вспомогательные домены могут быть слиты с полипептидами ζαΐρΗαΐΐ для нацеливания их на специфические клетки, ткани или макромолекулы (например, коллаген). Полипептид ζαΐρΗαΐΐ может быть слит с двумя или более частями молекулы, такими как аффинная метка для очистки белка и нацеливающий домен. Слитые (гибридные) полипептиды могут также содержать один или несколько сайтов расщепления, в частности, между доменами. См. Тиап е! а1., СоппесЦуе Т|ккие Векеатсй 34:ΐ-9, ΐ996.

Белки данного изобретения могут также содержать не встречающиеся природно аминокислотные остатки. Не встречающиеся природно аминокислоты включают в себя, без ограничения, транс-3метилпролин, 2,4-метанпролин, цис-4-гидроксипролин, транс-4-гидроксипролин, Ν-метилглицин, аллотреонин, метилтреонин, гидроксиэтилцистеин, гидроксиэтилгомоцистеин, нитроглутамин, гомоглутамин, пипеколиновую кислоту, тиазолидинкарбоновую кислоту, дегидропролин, 3- и 4-метилпролин, 3,3диметилпролин, трет-лейцин, норвалин, 2-азафенилаланин, 3-азафенилаланин, 4-азафенилаланин и 4фторфенилаланин. В данной области известны несколько способов для включения природно не встречающихся аминокислотных остатков в белки. Например, может быть использована система ίη νίίΓΟ. в которой нонсенс-мутации подавляются с использованием химически аминоацилированных супрессорных тРНК. Способы синтеза аминокислот и аминоацилирования тРНК известны в данной области. Транскрипцию и трансляцию плазмид, содержащих нонсенс-мутации, проводят в бесклеточной системе, содержащей экстракт Е. со11 830 и коммерчески доступные ферменты и другие реагенты. Белки очищают хроматографией (см., например, КоЬейкоп е! а1., 1. Ат. Сйет. 8ос. ΐΐ3: 2722, ΐ99ΐ; Е11тап е! а1.. Ме!йоάκ Епгутой 202: 30ΐ, ΐ99ΐ; Сйипд е! а1., 8аепсе 259: 806-9, ΐ993 и Сйипд е! а1., Ргос. №!1. Асаά. 8сБ И8А 90: ΐ0ΐ45-9, ΐ993). Во втором способе трансляцию проводят в ооцитах Хепорик микроинъекцией мутированной мРНК и химически аминоацилированных супрессорных тРНК (ТитсаШ е! а1., 1. Вю1. Сйет. 271: ΐ999ΐ-8, ΐ996). В третьем способе клетки Е. со11 культивируют в отсутствие природной аминокислоты, которую предстоит заменить (например, фенилаланина), и в присутствии желательной природно не встречающейся аминокислоты (аминокислот) (например, 2-азафенилаланина, 3-азафенилаланина, 4азафенилаланина или 4-фторфенилаланина). Природно не встречающаяся аминокислота включается в этот белок вместо ее природной копии. См. Κо^άе е! а1., Вюсйет. 33: 7470-7476, ΐ994. Природно встречающиеся аминокислотные остатки могут быть превращены в природно не встречающиеся разновидности химической модификацией ίη νίΐΐΌ. Химическая модификация может комбинироваться с сайтнаправленным мутагенезом для дополнительного расширения диапазона замен (\Супп ηηά КтсйаМк, Рто!еш 8ст 2: 395-403, ΐ993).

Аминокислотные остатки /а1рйа11 могут быть заменены ограниченным числом неконсервативных аминокислот, аминокислот, которые не кодируются генетическим кодом, не встречающихся природно аминокислот и неприродных аминокислот.

Незаменимые аминокислоты в полипептидах данного изобретения могут быть идентифицированы в соответствии с процедурами, известными в данной области, такими как сайт-направленный мутагенез или аланинсканирующий мутагенез (Сиптпдйат ηηά ^е11к, 8аепсе 244:ΐ08ΐ-5, ΐ989; Вакк е! а1., Ргос. №!1. Асаά. 8а. И8А 88: 4498-502, ΐ99ΐ). В последнем способе отдельные мутации аланина вводят при каждом остатке в молекуле и полученные в результате мутантные молекулы тестируют на биологическую активность (например, на связывание лиганда и трансдукцию сигнала), как описано ниже, для идентификации аминокислотных остатков, которые являются критическими для активности данной молекулы. См. также Н11!оп е! а1., 1. Вю1. Сйет. 27ΐ: 4699-4708, ΐ996. Сайты взаимодействия лигандрецептор, белок-белок или другого биологического взаимодействия могут быть также определены физическим анализом структуры, определяемой такими способами, как ядерный магнитный резонанс, кристаллография, дифракция электронов или фотоаффинное мечение, в связи с мутацией аминокислот предполагаемого сайта контакта. См., например, άе Уок е! а1., 8аепсе 255: 306-3ΐ2, ΐ992; 8тйй е! а1., 1. Мо1. Вю1. 224: 899-904, ΐ992; ХСМатег е! а1., РЕВ8 Ьей. 309: 59-64, ΐ992. Идентичности незаменимых аминокислот могут быть также выведены из анализа гомологии с родственными рецепторами.

Могут быть выполнены определения аминокислотных остатков, которые находятся в районах или доменах, которые являются критическими для сохранения структурной целостности. В этих районах можно определить специфические остатки, которые будут более или менее устойчивыми к изменению или сохранению общей третичной структуры молекулы. Способы анализа структуры последовательности включают в себя, но не ограничиваются ими, сопоставление множественных последовательностей с высокой идентичностью аминокислот или нуклеотидов и компьютерный анализ с использованием доступного программного обеспечения (например, программа просмотра !пк1дН1 ΙΙ® и инструменты моделирования гомологии; М8Б 8ап О|едо. СА), склонности к образованию вторичной структуры, бинарные распределения, комплементарную упаковку и скрытые полярные взаимодействия (Ваг!оп, Ситтеп! 0рт. 8!гис!. Вю1. 5: 372-376, ΐ995 и СоМек е! а1., Ситтеп! 0рш. 8!гис!. Вю1. 6: 3-ΐ0, ΐ996). Обычно при конструировании модификаций для молекул или идентификации специфических фрагментов определение структуры будет сопровождаться оценкой активности модифицированных молекул.

- ΐ6 006501

Изменения аминокислотной последовательности выполняют в полипептидах ζ;·ι1ρ1ι;·ι11 таким образом, чтобы минимизировать разрушение структуры более высокого порядка, существенной для биологической активности. Например, когда полипептид ζηΐρΐιηΐΐ содержит одну или несколько спиралей, изменения в аминокислотных остатках будут выполняться таким образом, чтобы не нарушить геометрию спиралей и другие компоненты молекулы, где изменения в конформации уменьшают некоторую критическую функцию, например связывание данной молекулы с ее партнерами связывания. Эффекты изменений аминокислотной последовательности могут быть прогнозированы, например, компьютерным моделированием, как описано выше, или определены анализом структуры кристалла (см., например, Барбюгп е1 а1., №11. 81гис1. ΒίοΙ. 2: 266-268, 1995). Другие способы, которые хорошо известны в данной области, сравнивают укладку вариантного белка со стандартной молекулой (например, нативным белком). Например, может быть сделано сравнение распределения цистеина в вариантной и стандартной молекулах. Масс-спектрометрия и химическая модификация с использованием восстановления и алкилирования обеспечивают способы для определения остатков цистеина, которые ассоциированы с дисульфидными связями или свободны от таких ассоциаций (Веап е! а1., Апа1. Вюсйет. 201: 216-226, 1992; Сгау. Рго!еш 8с1. 2: 1732-1748, 1993 и Райегкоп е! а1., Апа1. СНет. 66:3727-3732, 1994). Обычно считается, что, если модифицированная молекула не имеет такого же распределения дисульфидных связей, что и стандартная молекула, укладка может быть нарушенной. Другим хорошо известным и общепринятым способом измерения укладки является круговой дихроизм (КД). Измерение и сравнение КД-спектров, генерируемых модифицированной молекулой и стандартной молекулой, является рутиной ИоНикот Рго1ешк 7: 205-214, 1990). Кристаллография представляет собой другой хорошо известный способ для анализа укладки и структуры. Ядерный магнитный резонанс (ЯМР), ферментативное пептидное картирование и картирование эпитопов также являются известными способами для анализа сходства укладки и структуры между белками и полипептидами (8сНаапап е! а1., 8с1епсе 257: 961-964, 1992).

Может быть получен профиль гидрофильности Ηορρ/Ψοοάδ белковой последовательности ζιΙρΗιΙΙ, показанной в 8ЕО ГО N0:2 (Ηορρ е! а1., Ргос. ИаИ. Асаб. 8сЕ 78: 3824-3828, 1981; Ηορρ, 1. 1ттип. Ме!Н. 88: 1-18, 1986 и Тпс.|шег е! а1., Рго!еш Епдшеегшд 11: 153-169, 1998). См. фиг. 1. Этот профиль основан на скольжении окна для шести остатков. Скрытые остатки О, 8 и Т и экспонированные (открытые) остатки Н, Υ и не принимаются во внимание. Например, в ζι1ρ1ιι1 гидрофильные районы включают в себя аминокислотные остатки 55-60 8Е0 ГО N0:2, аминокислотные остатки 56-61 8Е0 ГО N0:2, аминокислотные остатки 139-144 8Е0 ГО N0:2, аминокислотные остатки 227-232 8Е0 ГО N0:2 и аминокислотные остатки 364-369 8Е0 ГО N0:2.

Специалистам в данной области будет понятно, что гидрофильность или гидрофобность следует учитывать при конструировании модификаций в аминокислотной последовательности полипептида ζιΙρΙιιΙΕ так чтобы не нарушить общий структурный и биологический профиль. Особый интерес для замены представляют гидрофобные остатки, выбранные из группы, состоящей из Уа1, Ьеи и 11е, или из группы, состоящей из Ме!, 01у, 8ег, А1а, Туг и Тгр. Например, остатки, устойчивые к замене, могли бы включать в себя такие остатки, как показано в 8Е0 ГО N0:2. Однако остатки цистеина могли бы быть относительно неустойчивыми к замене.

Идентичности незаменимых аминокислот могут быть также выведены из анализа сходства последовательности между членами рецепторов цитокинов класса I с ζιΙρΗιΙΙ. С использованием способов, таких как анализ «РА8ТА», описанный выше, районы высокого сходства идентифицируют в семействе белков и используют для анализа аминокислотной последовательности для консервативных районов. Альтернативным подходом к идентификации вариантного полинуклеотида ζιΙρΙκι 11 на основе структуры является определение, может ли молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая потенциальный вариантный полинуклеотид ζιΙρΗιΙΙ, гибридизоваться с молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность 8Е0 ГО N0:1, как обсуждалось выше.

Другими способами идентификации незаменимых аминокислот в полипептидах данного изобретения являются процедуры, известные в данной области, такие как сайт-направленный мутагенез или аланинсканирующий мутагенез (Сиппшдйат апб ХУеПк, 8аепсе 244: 1081 (1989); Вакк е! а1., Ргос. №И. Асаб. 8с1. И8А 88: 4498 (1991), СоотЬк апб Согеу, «8йе-01гес!еб Ми1адепек1к апб Рго!еш Епдшеегшд» ш Рго!ешк: Апа1ук1к апб Иеыдп, Апде1е!!1 (еб.), ρадек 259-311 (Асабетк Ргекк, 1пс. 1998)). В последнем способе отдельные мутации аланина вводят при каждом остатке в молекуле и полученные в результате мутантные молекулы тестируют на биологическую активность, как описано ниже, для идентификации аминокислотных остатков, которые являются критическими для активности данной молекулы. См. также НШоп е! а1., 1. Вю1. СНет. 271: 4699 (1996).

Данное изобретение относится также к функциональным фрагментам полипептидов ζιΙρΙκιΙΙ и молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим такие функциональные фрагменты. «Функциональный» ζιΙρΙκιΙΙ или его фрагмент, определенный здесь, отличается его пролиферативной и дифференцирующей активностью, его способностью индуцировать или ингибировать специализированные клеточные функции или его способностью специфически связываться с антителом против ζ81ρΗ311 или лигандом ζιΙρΙκιΙΙ (растворимым или иммобилизованным). Как описано ранее, ζηΐρΐιηΐΐ характеризуется структурой рецептора цитокина класса I. Таким образом, данное изобретение дополнительно обеспечивает сли- 17 006501 тые (гибридные) белки, включающие в себя (а) полипептидные молекулы, содержащие описанные здесь внеклеточный или внутриклеточный домены; и (Ь) функциональные фрагменты, содержащие один или несколько из этих доменов. Другая полипептидная часть слитого белка может состоять из другого рецептора цитокина класса Ι, например β-субъединицы 1Ь-2-рецептора и β-субъединицы, общей для ряда рецепторов (т.е. β-субъединиц ΙΕ-3-, ГЬ-5- и СМ-С8Е-рецепторов) или из ненативного и/или неродственного секреторного сигнального пептида, который облегчает секрецию слитого белка.

Рутинный делеционный анализ молекул нуклеиновых кислот может быть проведен для получения функциональных фрагментов молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид ζα1ρΗα11. В качестве иллюстрации, молекулы ДНК, имеющие нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:1 или ее фрагменты, могут быть расщеплены нуклеазой Ва131 с получением ряда «вмонтированных» делеций. Затем эти фрагменты ДНК вставляют в экспрессирующие векторы в правильной рамке считывания и экспрессированные полипептиды выделяют и тестируют на активность ζ;·ι1ρ1ι;·ι11 или на способность связываться с антителами против ζ;·ι1ρ1ι;·ι11 или лигандом ζα1ρΗα11. Альтернативой расщеплению экзонуклеазой является использование олигонуклеотид-направленного мутагенеза для введения делеций или стопкодонов для особого определения получения желательного фрагмента ζα1ρΗα 11. Альтернативно, определенные фрагменты полинуклеотида ζ;·ι1ρ1ι;·ι11 могут быть синтезированы с использованием полимеразной цепной реакции.

Стандартные способы идентификации функциональных доменов хорошо известны лицам с обычной квалификацией в данной области. Например, исследования на одном или на обоих концах укороченных интерферонов суммированы НопкЬегдег апй Όί Магсо, Ркагтас. Ткег. 66:507 (1995). Кроме того, стандартные способы для функционального анализа белков описаны, например, Тгеи!ег е! а1., Мо1ес. Сеп. Сепе!. 240: 113 (1993); Соп!еп! е! а1., «Ехргеккюп апй ргектшагу йе1ейоп апа1ук1к о! 1Не 42 кПа 2-5А куп!ке!аке шйисей Ьу Нитап ш1егГегоп» ш Вю1од1са1 [ШегГегоп 8ук!етк, Ргосеей1пдк о! ^£^N0 Мее!шд оп ЕиегГегоп 8ук!етк, Сап!е11 (ей.), радек 65-72 (^1)НоГГ 1987); Негксктап, «ТНе ЕСЕ £есер!ог» ш Соп1го1 о! Ап1та1 Се11 РгоНГегаНоп 1, Воуп!оп е! а1., (ейк.) радек 169-199 (Асайетк Ргекк 1985); СоитаШеаи е! а1., 1. Вю1. Скет. 270:29270 (1995); Еикипада е! а1., 1. Вю1. Скет. 270:25291 (1995); УатадисЫ е! а1., Вюскет. РНагтасок 50:1295 (1995) и Ме1ке1 е! а1., Р1ап! Мо1ес. Вю1. 30:1 (1996).

Многочисленные аминокислотные замены могут быть произведены и тестированы с использованием известных способов мутагенеза и скрининга, таких как описанные £е1йкааг-01коп апй 8аиег (8скпсе 241:53-57, 1988) или Во\\к апй 8аиег (Ргос. №!1. Асай. 8а. И8А 86: 2152-2156, 1989). Вкратце, эти авторы описывают способы одновременной рандомизации двух или более положений в полипептиде, отбора на функциональный полипептид и затем секвенирования мутагенизированных полипептидов для определения спектра допустимых замен в каждом положении. Другие способы, которые могут быть использованы, включают в себя способ фагового представления (например, Ьо^тап е! а1., Вюскет. 30: 1083210837, 1991; Ьайпег е! а1., и.8. Ра!еп! №. 5 223 409; Нике, 7^0 РиЬксакоп 70 92/062045) и районнаправленный мутагенез (ПегЬукк1ге е! а1., Сепе 46: 145, 1986; №г е! а1., ЭкА 7: 127, 1988).

Варианты описанных последовательностей ДНК и полипептида ζη1ρΗη11 могут быть образованы перетасовкой ДНК, описанной 8!еттег, №Шге 370: 389-91, 1994, 8!еттег, Ргос. №11. Асай. 8а. И8А 91: 10747-51, 1994 и 7Ф0 РиЬксакоп 70 97/20078. Вкратце, вариантные ДНК генерируют посредством гомологичной рекомбинации ш уйго случайной фрагментацией исходной ДНК с последующей повторной сборкой при помощи ПЦР, приводящей к случайно введенным точковым мутациям. Этот способ может быть модифицирован с использованием семейства исходных ДНК, таких как аллельные варианты или ДНК из различных видов, для введения дополнительной вариабельности в этот процесс. Отбор или скрининг на желательную активность с последующими дополнительными повторениями мутагенеза и анализа обеспечивает быструю эволюцию последовательностей посредством отбора на желательные мутации с одновременным отбором против вредных изменений.

Способы мутагенеза, описанные выше, могут комбинироваться с высокопроизводительными автоматизированными способами скрининга для обнаружения активности клонированных мутагенизированных полипептидов рецепторов ζη1ρ1ιη 11 в клетках-хозяевах. Предпочтительные анализы включают в себя анализы пролиферации и анализы связывания лиганда на основе биосенсора, которые описаны ниже. Мутагенизированные молекулы ДНК, кодирующие активные рецепторы или их части (например, лигандсвязывающие фрагменты, домены передачи сигналов и т.п.), могут быть извлечены из клеток-хозяев и быстро секвенированы с использованием современного оборудования. Эти способы делают возможным быстрое определение важности индивидуальных аминокислотных остатков в представляющем интерес полипептиде и могут применяться к полипептидам неизвестной структуры.

Кроме того, белки данного изобретения (или их полипептидные фрагменты) могут быть соединены с другими биоактивными молекулами, в частности другими цитокинами, для обеспечения полифункциональных молекул. Например, одна или несколько спиралей из ζη1ρ1ιη 11 могут быть соединены с другими цитокинами для усиления их биологических свойств или эффективности получения.

Таким образом, данное изобретение обеспечивает ряд новых, гибридных молекул, у которых сегмент, содержащий одну или несколько спиралей /а1рка11, слит с другим полипептидом. Слияние пред

- 18 006501 почтительно производят сплайсингом на уровне ДНК, чтобы сделать возможной экспрессию химерных молекул в рекомбинантных системах получения. Полученные молекулы анализируют затем на такие свойства, как улучшенная растворимость, улучшенная стабильность, пролонгированный полупериод выведения, улучшенные уровни экспрессии и секреции и фармакодинамику. Такие гибридные молекулы могут, кроме того, содержать дополнительные аминокислотные остатки (например, полипептидный линкер) между компонентами-белками или компонентами-полипептидами.

При помощи обсуждаемых здесь способов специалист с обычной квалификацией в данной области может идентифицировать и/или получить многочисленные полипептидные фрагменты или варианты 8 ЕС ΙΌ N0:2, которые сохраняют активность трансдукции сигналов или лигандсвязывающую активность. Например, можно получить «растворимый рецептор» ζα1ρ1α11 путем получения множества полипептидов, которые являются, по существу, гомологичными цитокинсвязывающему домену (остаткам 20 (Сук)-237 (Н1к) 8Е0 ΙΌ N0:2 или ее аллельным вариантам или видовым ортологам) и сохраняют лигандсвязывающую активность белка ζ;·ι1ρ1ι;·ι11 дикого вида. Такие полипептиды могут включать в себя дополнительные аминокислоты, например, из части или полных трансмембранного и внутриклеточного доменов. Такие полипептиды могут также содержать дополнительные полипептидные сегменты, как в общем виде описано здесь, такие как метки, аффинные метки и т. п.

Для любого полипептида ζα1ρ1α11, в том числе вариантов, растворимых рецепторов и слитых полипептидов или белков, специалист с обычной квалификацией в данной области сможет легко получить полностью вырожденную полинуклеотидную последовательность, кодирующую такой вариант, с использованием информации, приведенной в табл. 1 и 2 выше.

Полипептиды ζα1ρ1α11 данного изобретения, в том числе полноразмерные полипептиды, биологически активные фрагменты и гибридные полипептиды, могут продуцироваться в генетически сконструированных клетках-хозяевах в соответствии с общепринятыми способами. Подходящими клеткамихозяевами являются те типы клеток, которые могут быть трансформированы или трансфицированы экзогенной ДНК и выращены в культуре, и они включают в себя бактерии, грибковые клетки и культивируемые высшие эукариотические клетки. Эукариотические клетки, в частности культивируемые клетки многоклеточных организмов, являются предпочтительными. Способы манипулирования клонированными молекулами ДНК и введения экзогенной ДНК в различные клетки-хозяева описаны в 8атЬгоок е1 а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога1огу Мапиа1, 2пб еб., Со1б 8ргтд НагЬог ЬаЬогаЮгу Ргекк, Со1б 8ргшд НагЬог, ΚΥ, 1989 и АикиЬе1 е! а1. (ебк.) Сиггей Рго1осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду, 1о1т №беу апб 8опк, Шс., ΚΥ, 1987.

В общих чертах, последовательность ДНК, кодирующую полипептид /а1рка11, функционально связывают с другими генетическими элементами, требующимися для ее экспрессии, обычно включающими в себя промотор и терминатор транскрипции, в экспрессирующем векторе. Этот вектор обычно будет содержать один или несколько селектируемых маркеров и одну или несколько точек инициации репликации, хотя специалистам в данной области будет понятно, что в некоторых системах селектируемые маркеры могут быть обеспечены на отдельных векторах и репликация экзогенной ДНК может быть обеспечена интеграцией в геном клетки-хозяина. Выбор промоторов, терминаторов, селектируемых маркеров, векторов и других элементов является предметом рутинного конструирования в пределах обычной квалификации в данной области. Многие такие элементы описаны в литературе и являются доступными через коммерческих поставщиков.

Для направления полипептида /а1рка11 в секреторный путь клетки-хозяина в экспрессирующем векторе обеспечивают секреторную сигнальную последовательность (также известную как лидерная последовательность, пре-пропоследовательность или пре-последовательность). Секреторная сигнальная последовательность может быть сигнальной последовательностью /а1рка11 или может быть произведена из другого секретируемого белка (например, ΐ-РА (тканевого активатора плазминогена)) или синтезирована бе поуо. Секреторная сигнальная последовательность функционально соединена с последовательностью ДНК /а1рка11, т.е. эти две последовательности соединены в правильной рамке считывания и правильно помещены для направления вновь синтезированного полипептида в секреторный путь клеткихозяина. Секреторные сигнальные последовательности обычно расположены 5' (слева) от последовательности ДНК, кодирующей представляющий интерес полипептид, хотя некоторые сигнальные последовательности могут быть расположены в другом месте в представляющей интерес последовательности ДНК (см., например, \Ме1сН е! а1., И.8. Ра1ей №. 5 037 743; Но11апб е! а1., И.8. Ра1ей №. 5 143 830).

Альтернативно, секреторная сигнальная последовательность, содержащаяся в полипептидах данного изобретения, используется для направления других полипептидов в секреторный путь. Данное изобретение обеспечивает такие гибридные (слитые) полипептиды. Может быть изготовлен сигнальный гибридный полипептид, в котором секреторная сигнальная последовательность, полученная из аминокислотных остатков 1 (Ме!)-19 (С1у) 8Е0 ΙΌ N0:2, функционально связана с другим полипептидом с использованием способов, известных в этой области и описанных здесь. Секреторная сигнальная последовательность, содержащаяся в гибридных полипептидах данного изобретения, предпочтительно слита на амино-конце с дополнительным пептидом для направления этого дополнительного пептида в секреторный путь. Такие конструкции имеют многочисленные применения, известные в данной области. Например, эти новые гибридные конструкции с секреторной сигнальной последовательностью могут направ

- 19 006501 лять секрецию активного компонента обычно несекретируемого белка. Такие гибридные белки могут быть использованы ш νίνο и ш νίίτο для направления пептидов через секреторный путь.

Культивируемые клетки млекопитающих являются подходящими хозяевами в данном изобретении. Способы введения экзогенной ДНК в клетки-хозяева млекопитающих включают в себя опосредованную фосфатом кальция трансфекцию (^1д1ег е1 а1., Се11 14:725, 1978; Согкаго аиб Реагкои, δοιηπίχ Се11 Сеиейск 7:603, 1981; Сгайат аиб Уаи бег ЕЬ, Уйо1оду 52:456, 1973), электропорацию (№итаии е1 а1., ЕМВО 1. 1:841-845, 1982), опосредованную ДЭАЭ-декстраном трансфекцию (АикиЬе1 е1 а1., 1Ь1б.) и опосредованную липосомами трансфекцию (НаМеу-№1кои е1 а1., Еосик 15:73, 1993; Сксагоие е1 а1., Еосик 15:80, 1993) и вирусные векторы (МШег аиб Коктаи, ВюТескшциек 7:980-90, 1989; ^аид аиб Ешег, №Ш.1ге Меб. 2:714716, 1996). Получение рекомбинантных полипептидов в культивируемых клетках млекопитающих описано, например, Бетткои е1 а1., υ.δ. Ра1ен1 Νο. 4 713 339; Надеи е1 а1., υ.δ. Ра1еи1 Νο. 4 784 950; Ра1тйег е1 а1., υ.δ. Ра1ен1 Νο. 4 579 821; и Кшдо1б, υ.δ. Ра1ен1 Νο. 4 656 134. Подходящие культивируемые клетки млекопитающих включают в себя клеточные линии СО8-1 (АТСС Νο. СКЬ 1650), СО8-7 (АТСС Νο. СКЬ 1651), ВНК (АТСС Νο. СКЬ 1632), ВНК 570 (АТСС Νο. СКЬ 10314), 293 (АТСС Νο. СКЬ 1573; Сгакат е1 а1., 1. Сеи. У1го1. 36:59-72 (1977)) и линии клеток яичника китайского хомячка (например, СНО-К1; АТСС Νο. ССЬ 61). Дополнительные подходящие клеточные линии известны в данной области и доступны из общественных депозитариев, таких как Атепсаи Туре СиИиге Со11ес11ои, КоскуШе, Магу1аиб. В общем, предпочтительны сильные промоторы транскрипции, такие как промоторы из 8У-40 или цитомегаловируса. См., например, υ.δ. Ра1ео1 Νο. 4 956 288. Другие подходящие промоторы включают в себя промоторы из генов металлотионеина (υ.δ. Ра1еи1 Νο. 4 579 821 и υ.δ. Ра1еи1 Νο. 4 601 978) и основной поздний промотор аденовируса.

Отбор с лекарственным средством обычно применяют для отбора на культивируемые клетки млекопитающих, в которые была встроена чужеродная ДНК. Такие клетки обычно называют трансфектантами. Клетки, которые культивировались в присутствии селективного агента и способны передавать представляющий интерес ген их потомству, называют стабильными трансфектантами. Предпочтительным селектируемым маркером является ген, кодирующий устойчивость к антибиотику неомицину. Отбор проводят в присутствии лекарственного средства типа неомицина, такого как С-418 или т.п. Системы отбора могут быть также использованы для увеличения уровня экспрессии представляющего интерес гена, т.е. для способа, называемого амплификацией. Амплификацию проводят культивированием трансфектантов в присутствии низкого уровня селективного агента и затем увеличением количества селективного агента для отбора клеток, которые продуцируют высокие уровни продуктов введенных генов. Предпочтительным амплифицируемым селектируемым маркером является дигидрофолатредуктаза, которая сообщает клеткам устойчивость к метотрексату. Другие гены устойчивости к лекарственным средствам (например, устойчивости к гигромицину, множественной устойчивости к лекарственным средствам, пуромицинацетилтрансферазе) также могут быть использованы. Альтернативные маркеры, которые вводят измененный фенотип, такие как зеленый флуоресцентный белок или белки клеточной поверхности, такие как СЭ4, СЭ8, МНС класса I, щелочная фосфатаза плаценты, могут быть использованы для сортинга трансфицированных клеток от нетрансфицированных клеток такими способами, как ЕΑСδсортинг (сортинг клеток с возбуждением флуоресценции) или способ разделения при помощи магнитных гранул.

Другие высшие эукариотические клетки могут быть также использованы в качестве хозяев, в том числе клетки растений, клетки насекомых и клетки птиц. Применение АдгоЬас1егшт бн/оденек в качестве вектора для экспрессии генов в клетках растений рассмотрено δίοΙ^Η е1 а1., ί. Вюкск (Ваида1оге) 11:4758, 1987. Трансформация клеток насекомых и получение в них чужеродных полипептидов описаны Сиагшо е1 а1. , υ.δ. Ра1еи1 Νο. 5 162 222 и \У1РО риЬйсайои \УО 94/06463. Клетки насекомых могут быть инфицированы рекомбинантным бакуловирусом, обычно произведенным из вируса ядерного полиэдроза Аи1одгарйа сайГогшса (Ас№У). См. Кшд Ь.А. аиб Роккее Η.Ό., Тке Васи1оу1гик Ехргеккюи δукΐет: А ЬаЬога1огу Сшбе, ковбои, Скартаи аиб На11; О'КеШу Ό.Η. е1 а1., Васи1оу1гик Ехргеккюи УесЮгк: А ЬаЬога1огу Магшак Νον Уогк, ОхГогб υη^νе^к^(у Ргекк., 1994; и К^ска^бкοη. С.Э., Еб., Васи1оу1гик Ехргеккюи Рго1осо1к. МеЙюбк ш Мо1еси1аг Вю1оду, То1ота, М, Нитаиа Ргекк, 1995. Второй способ получения рекомбинантного ха1рка11-бакуловируса использует систему на основе транспозона, описанную Ьискоте (Ьискоте, У.А., е1 а1., ί. У1го1. 67: 4566-79, 1993). Эта система, которая использует векторы-переносчики, продается в наборе Вас-1о-Вас™ (Ъ1Ге Тескио1од1ек, КоскуШе, МО). Эта система использует вектор-переносчик, рЕак1Вас1™ (Ь1Ге Тескио1од1ек), содержащий транспозон Ти7, для перемещения ДНК, кодирующей полипептид ха1рка11, в геном бакуловируса, поддерживаемый в Е. сой, в виде большой плазмиды, названной бакмидой. См. НШ-Регкшк, М^. аиб Роккее, Η.Ό., I. Сеи. У1го1. 71: 971-6. 1990; Воиизид, В.С. е1 а1., I. Сеи. У1го1. 75: 1551-6, 1994 и СкахеикаПс С.О., аиб Каророй, В., I. Вю1. Скет. 270: 1543-9, 1995. Кроме того, векторы-переносчики могут содержать в рамке считывания с ДНК, кодирующей метку эпитопа, на С- или Ν-конце экспрессируемого полипептида ха1рка11, например, метку эпитопа С1и-С1и (Сгиккеитеуег, Т. е1 а1., Ргос. Νη11. Асаб. δα. 82: 7952-4, 1985). При помощи способа, известного в данной области, вектор-переносчик, содержащий ха1рка1к трансформируют в Е. сой и подвергают скринингу на бакмиды, которые содержат прерванный ген 1ас2, свидетельствующий о рекомбинантном бакуловирусе.

- 20 006501

Бакмидную ДНК, содержащую рекомбинантный геном бакуловируса, выделяют при помощи известных способов и используют для трансфекции клеток 8робор!ега Ггид|регба, например клеток 8Г9. Затем получают рекомбинантный вирус, экспрессирующий ζα1ρ1ια11. Исходные материалы рекомбинантного вируса готовят способами, обычно используемыми в данной области.

Этот рекомбинантный вирус используют для инфицирования клеток-хозяев, обычно клеточной линии, полученной из осенних походных (ратных) червей, 8робор!ега Ггид1регба. См., в общих чертах, Ойск аиб Рак!егиак, Мо1еси1аг Вю!есйио1оду: Рпиар1ек аиб Аррйсабоик оГ КесотЫиаи! ЭНА, А8М Ргекк, ^акЫид!ои, Э.С., 1994. Другой подходящей клеточной линией является клеточная линия Н1дй Е1уе0™ Циуйгодеи), произведенная из ТпсйорЫма Ы (и.8. Ра!еи! № 5 300 435). Для выращивания и поддержания этих клеток используют коммерчески доступные бессывороточные среды. Подходящими средами являются 8Г900 ΙΙ™ (И1Ге Тесйио1од1ек) или Е8Б 921™ (Ехргеккюи 8ук!етк) для клеток 8Г9; или Ех-се110405™ (ЖН ВюкЫеисек, ^еиеxа, К8) или Ехргекк Б1уе0™ (И1Ге Тесйио1од1ек) для клеток Т. ш. Используемые процедуры, в общем, описаны в доступных лабораторных руководствах (Ктд, ЕЛ. аиб Роккее, Κ.Ό. 1Ыб.; 0'КеШу, Ό.Κ. е! а1., 1Ыб.; Кюйагбкои, С.Э., 1Ыб.). Последующая очистка полипептида ζа1рйа11 из супернатанта может быть достигнута с использованием описанных здесь способов.

Грибковые клетки, в том числе дрожжевые клетки, могут быть также использованы в данном изобретении. Виды дрожжей, представляющие особый интерес в этом отношении, включают в себя 8ассйаготусек сегеу1йае, РюЫа рак!опк и РюЫа те!йаиойса. Способы трансформации клеток 8. сегсутмае экзогенной ДНК и получения из них рекомбинантных полипептидов описаны, например, Ка^акак1, и.8. Ра!еи! №. 4 599 311; Катакай е! а1., и.8. Ра!еи! №. 4 931 373; Вгаке, и.8. Ра!еи! №. 4 870 008; \е1сй е! а1., и.8. Ра!еи! №. 5 037 743 и Миггау е! а1., и.8. Ра!еи! №. 4 845 075. Трансформированные клетки отбирают по фенотипу, определяемому селектируемым маркером, обычно по устойчивости к лекарственному средству или по способности расти в отсутствие определенного питательного вещества (например, лейцина). Предпочтительной векторной системой для применения в 8ассйаготусек сегеу1к1ае является векторная система РОТ1, описанная Ка^акаЫ е! а1. (И.8. Ра!еи! №. 4 931 373), которая позволяет отбирать трансформированные клетки по росту в содержащей глюкозу среде. Подходящие промоторы и терминаторы для применения в дрожжах включают в себя промоторы и терминаторы из генов гликолитических ферментов (см., например, Кауеакакк и.8. Ра!еи! №. 4 599 311; Ктдктаи е! а1., и.8. Ра!еи! №. 4 615 974 и Вй!ег, и.8. Ра!еи! №. 4 977 092) и генов алкогольдегидрогеназы. См. также патенты СШЛ с №№ 4 990 446, 5 063 154, 5 139 936 и 4 661 454. Системы трансформации для других дрожжей, в том числе НаикемЫи ро1утогрйа, 8сй^ζокассйа^отусек ротйе, К1цууеготусек 1асбк, К1цууеготусек ГгадШк, ИкШадо тауб1к, РюЫа рак!опк, РюЫа теби-тойса, РюЫа диШегтоиби и Саиб1ба та1!ока, известны в данной области. См., например, О1еекои е! а1., I. Оеи. МюгоЫок 132:3459-3465, 1986 и Сгедд, и.8. Ра!еи! №. 4 882 279. Клетки АкрегдШик могут быть использованы в соответствии со способами МсКЫдй! е! а1., и.8. Ра!еи! №. 4 935 349. Способы трансформации АсгетоЫит сйгукодеиит описаны 8итто е! а1., и.8. Ра!еи! №. 5 162 228. Способы трансформации №игокрога описаны ^атЬо^^!ζ, и.8. Ра!еи! №. 4 486 533.

Применение РюЫа те!йаиойса в качестве хозяина для получения рекомбинантных белков описано в \\'!Р0 РиЫюабош \\Ό 97/17450, \\Ό 97/17451, \\Ό 98/02536 и \\Ό 98/02565. Молекулы ДНК для применения в трансформации Р. те!йаиобса обычно получают в виде двухцепочечных кольцевых плазмид, которые предпочтительно линеаризуют перед трансформацией. Для получения полипептидов в Р. те!йаиобса предпочтительно, чтобы промотор и терминатор в этой плазмиде были промотором и терминатором гена Р. те!йаиобса, таким как ген утилизации спирта Р. те!йаиобса (АИО1 или АИО2). Другие применимые промоторы включают в себя промоторы генов дигидроксиацетонсинтазы (ЭНА8), формиатдегидрогеназы (БМЭ) и каталазы (САТ). Для облегчения интеграции этой ДНК в хромосому хозяина предпочтительно иметь весь сегмент экспрессии этой плазмиды, фланкированный на обоих концах последовательностями ДНК хозяина. Предпочтительным селектируемым маркером для применения в РюЫа те!йаиобса является ген АОЕ2 Р. те!йаиойса, который кодирует фосфорибозил-5-аминоимидазолкарбоксилазу (А1КС; ЕС 4.1.1.21), который позволяет клеткам-хозяевам абе2 расти в отсутствие аденина. Для крупномасштабных, промышленных процессов, где желательно минимизировать применение метанола, предпочтительно использовать клетки-хозяева, в которых делетированы оба гена утилизации метанола (АиО1 и АиО2). Для получения секретируемых белков предпочтительны клетки-хозяева, дефектные по генам вакуолярных протеаз (РЕР4 и РКВ1). Электропорацию используют для облегчения введения плазмиды, содержащей ДНК, кодирующую представляющий интерес полипептид, в клетки Р. те^йаиойса. Предпочтительно трансформировать клетки Р. те!йаиойса электропорацией с использованием экспоненциально затухающего, пульсирующего электрического поля, имеющего напряженность поля от 2,5 до 4,5 кВ/см, предпочтительно примерно 3,75 кВ/см, и константу времени (!) от 1 до 40 мс, наиболее предпочтительно примерно 20 мс.

Прокариотические клетки-хозяева, в том числе штаммы бактерий ЕксйепсЫа сой, ВасШик и другие роды, также являются применимыми клетками-хозяевами в данном изобретении. Способы трансформации этих хозяев и экспрессии клонированных в них чужеродных ДНК хорошо известны в данной области (см, например, 8атйгоок е! а1., 1Ыб.). При экспрессии полипептида ζа1рйа11 в бактериях, таких как Е. сой, этот полипептид может сохраняться в цитоплазме, обычно в виде нерастворимых гранул, или может

- 21 006501 быть направлен в периплазматическое пространство бактериальной секреторной последовательностью. В первом случае эти клетки лизируют и гранулы извлекают и денатурируют при помощи, например, гуанидинизотиоцианата или мочевины. Затем денатурированный полипептид может быть повторно уложен и димеризован путем разведения продукта денатурации, например, диализом против раствора мочевины и комбинацией восстановленного и окисленного глутатиона, с последующим диализом против забуференного солевого раствора. В последнем случае этот полипептид может быть извлечен из периплазматического пространства в растворимой и функциональной форме путем разрушения этих клеток (например, обработкой ультразвуком или осмотическим шоком) для высвобождения содержимого периплазматического пространства и извлечения этого белка, посредством чего устраняется необходимость денатурации и повторной укладки.

Трансформированные и трансфицированные клетки-хозяева культивируют в соответствии с общепринятыми процедурами в культуральной среде, содержащей питательные вещества и другие компоненты, необходимые для роста выбранных клеток-хозяев. Различные подходящие среды, в том числе среды с определенным составом среды и комплексные среды, известны в данной области и обычно включают в себя источник углерода, источник азота, незаменимые аминокислоты, витамины и минеральные соединения. Среды могут также содержать такие компоненты, как факторы роста или сыворотка, если требуется. Среда для выращивания будет обычно производить отбор на клетки, содержащие экзогенно добавленную ДНК, посредством, например, отбора с использованием лекарственного средства или недостаточности незаменимого питательного компонента, который дополняется селектируемым маркером, имеющимся на экспрессирующем векторе или котрансфицируемым в клетку-хозяина. Клетки Р. те!йапо11са культивируют в среде, содержащей адекватные источники углерода, азота и микроэлементов, при температуре приблизительно 25-35°С. Жидкие культуры обеспечивают достаточной аэрацией с использованием общепринятых средств, таких как встряхивание небольших колб или барботирование ферментеров. Предпочтительной культуральной средой для Р. те!йапо1юа является УЕРЭ (2% Ό-глюкоза, 2% Бакто™ пептон (Όίίοο ЬаЬога!ог1ек, Пе!гой, М1), 1% бакто™ дрожжевой экстракт (Όίίοο ЬаЬога!ог1ек), 0,004% аденин и 0,006% Ь-лейцин).

В одном аспекте данного изобретения рецептор цитокинов ζ;·ι1ρ1ι;·ι11 (в том числе трансмембранный и внутриклеточный домены) получают в культивируемой клетке и эту клетку используют для скрининга на лиганды для этого рецептора, в том числе природный лиганд, а также на агонисты и антагонисты природного лиганда. Для суммирования этого подхода кДНК или ген, кодирующие рецептор, объединяют с другими генетическими элементами, требующимися для их экспрессии (например, промотором транскрипции), и полученный экспрессирующий вектор встраивают в клетку-хозяина. Клетки, которые экспрессируют эту ДНК и продуцируют функциональный рецептор, отбирают и используют в разнообразных системах скрининга.

Клетки млекопитающих, пригодные для экспрессии новых рецепторов данного изобретения и трансдукции опосредованного рецептором сигнала, включают в себя клетки, которые экспрессируют βсубъединицу, такую как др130, и клетки, которые коэкспрессируют др130 и ЫЕ-рецептор (Оеаппд е! а1., ЕМВ0 I. 10:2839-2848, 1991; Оеагшд е! а1., И.8. Ра!еп! №. 5284755). В этом отношении, обычно предпочтительно использовать клетку, которая является отвечающей на другие цитокины, которые связываются с рецепторами в том же самом подсемействе, такие как 1Ь-6 или Ь1Е, поскольку такие клетки будут содержать требующийся путь (пути) трансдукции сигнала. Предпочтительные клетки этого типа включают в себя линию клеток ТЕ-1 человека (АТСС №. СКЬ-2003) и клеточную линию ΌΑ-1 (ВгапсЕ е! а1. , В1ооб 69:1782, 1987; Вгоибу е! а1., В1ооб 75:1622-1626, 1990). Альтернативно, подходящие клетки-хозяева могут быть сконструированы для продуцирования β-субъединицы или другого клеточного компонента, требующегося для желательного клеточного ответа. Например, мышиная клеточная линия ВаЕ3 (Ра1асюк апб ЗЮттеР, Се11 41:727-734, 1984; МаШеу-Ргеуо! е! а1., Мо1. Се11. Вю1. 6:4133-4135, 1986), клеточная линия почки детеныша хомячка (ВНК) или клеточная линия СТЬЬ-2 (АТСС Т1В-214) могут быть трансфицированы для экспрессии мышиной субъединицы др130 или мышиной др130 и рецептора ЫЕ, кроме /а1рйа11. Обычно предпочтительно использовать клетку-хозяина и рецептор (рецепторы) из одного и того же вида, однако, этот подход позволяет сконструировать клеточные линии, экспрессирующие множественные субъединицы рецепторов из любого вида, преодолевая потенциальные ограничения, возникающие из видовой специфичности. Альтернативно, видовые гомологи кДНК рецептора человека могут быть клонированы и использованы в клеточных линиях из того же самого вида, например мышиная кДНК в клеточной линии ВаЕ3. Клеточные линии, которые зависят от одного гемопоэтического фактора роста, такого как 1Ь-3, могут быть, следовательно, сконструированы таким образом, что они становятся зависимыми от лиганда /а1рйа11.

Клетки, экспрессирующие функциональный 7а1рйа11, используют в тестах-скринингах. Многочисленные подходящие анализы известны в данной области. Эти анализы основаны на детектировании биологического ответа в клетке-мишени. Одним из таких анализов является анализ пролиферации. Клетки культивируют в присутствии или в отсутствие тест-соединения и пролиферацию клеток детектируют, например, измерением включения тритированного тимидина или колориметрическим анализом, осно

- 22 006501 ванным на метаболическом расщеплении красителя А1утаг В1ие™ (АссиМеб, СЫсадо, ЕЬ) или 3-(4,5диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолийбромида (МТТ) (Моктап, 1. Еттипо1. Ме!к. 65:55-63, 1983). Альтернативный формат анализа использует клетки, которые дополнительно конструируют для экспрессии репортерного гена. Репортерный ген связывают с промоторным элементом, который является чувствительным к связанному с данным рецептором пути, и этот анализ детектирует активацию транскрипции данного репортерного гена. Предпочтительным промоторным элементом в этой связи является сывороточный чувствительный элемент или ВКЕ (см., например, В11а\у е! а1., Се11 56:563-572, 1989). Предпочтительным подобным геном является ген люциферазы (бе \¥е1 е! а1., Мо1. Се11. Βίο1. 1:125, 1987). Экспрессию гена люциферазы детектируют по люминесценции с использованием способов, известных в данной области (например, ВаитдаПпет е! а1., 1. Βίο1. СЬет. 269:19094-29101, 1994; ВсНепЬогп апб СоИПп. Рготеда №!ек 41:11, 1993). Наборы для анализа с люциферазой являются коммерчески доступными, например, из Рготеда Согр., Маб1коп, XVI. Клеточные линии-мишени этого типа могут быть использованы для скрининга библиотек химикалиев, клеточно-кондиционированных культуральных сред, грибковых бульонов, почвенных проб, проб воды и т. п. Например, банк проб клеточно- или тканекондиционированных сред может быть анализирован на клетку-мишень для идентификации клеток, которые продуцируют лиганд. Затем положительные клетки используют для получения библиотеки кДНК в экспрессирующем векторе для клеток млекопитающих, который разделяют на два пула, трансфицируют в клетки-хозяева и экспрессируют. Затем пробы сред из трансфицированных клеток анализируют, с последующим разделением пулов, повторно трансфицируют, субкультивируют и повторно анализируют положительные клетки для выделения клональной клеточной линии, экспрессирующей лиганд. Пробы сред, кондиционированные почкой, печенью, селезенкой, тимусом, другими лимфоидными тканями или Т-клетками, являются предпочтительными источниками лиганда для использования в процедурах скрининга.

Природный лиганд для ха1рНа11 может быть также идентифицирован мутагенизацией цитокинзависимой клеточной линии, экспрессирующей ха1рНа11, и культивированием ее в условиях, которые производят отбор на аутокринный рост. См. νΐΡ0 риЫюабоп ν0 95/21930. В типичной процедуре клетки, экспрессирующие ха1рНа11, мутагенизируют, например, с ЕМВ. Затем клеткам дают придти в нормальное состояние в присутствии требуемого цитокина, затем переносят в культуральную среду, не содержащую цитокина. Выжившие клетки подвергают скринингу на продуцирование лиганда для ха1р11а1Е например, добавлением растворимого (лигандсвязывающего) рецепторного полипептида в культуральную среду или анализом кондиционированной среды на клетки дикого типа и трансфицированные клетки, экспрессирующие ха1рНа11. Предпочтительные клеточные линии для применения в данном способе включают в себя клетки, которые трансфицируют для экспрессии др130 или др130 в сочетании с ЬЕЕрецептором. Предпочтительные подобные линии клеток-хозяев включают в себя трансфицированные клетки СТЬЬ-2 (С1Шк апб ВтйЬ, №1Шге 268:154-156, 1977) и трансфицированные клетки ΒаΓ3.

Кроме того, способ секреторной ловушки, использующий растворимый рецепторный полипептид ха1рНа11, может быть использован для выделения лиганда ха1рНа11 (А1бпс11 е! а1., Се11 87:1161-1169, 1996). Экспрессионную библиотеку кДНК, полученную из известного или предполагаемого источника лиганда, трансфицируют в клетки С0В-7. Вектор этой библиотеки кДНК обычно имеет начало репликации ВУ40 для амплификации в клетках С0В-7 и промотор СМУ для высокой экспрессии. Трансфицированные клетки С0В-7 выращивают в монослое и затем фиксируют и делают проницаемыми. Затем меченый или биотин-меченый растворимый рецептор ха1р11а1Е описанный здесь, помещают в контакт с этим слоем клеток и дают связать клетки в монослое, которые экспрессируют антикомплементарную молекулу, т.е. лиганд ха1рНа11. Таким образом, клетка, экспрессирующая лиганд, будет связана с рецепторными молекулами. Антитело против метки (анти-1д для 1д-гибридов, М2 или анти-ЕЕЛС для ЕЬЛС-меченых гибридов, стрептавидин и т.п.), которое конъюгировано с пероксидазой хрена (НКР) используют для визуализации клеток, с которыми связан меченый или биотин-меченый растворимый рецептор ха1рНа11. НКР катализирует депонирование тирамидного реагента, например тирамид-Е1ТС. Коммерчески доступный набор может быть использован для этого детектирования (например, Кепащкапсе ТВА-Эиес!™ Κι!; NЕN ЬИе Вс1епсе Ргобис!к, ΒοκΙοπ, МА). Клетки, которые экспрессируют лиганд рецептора ха1рНа11, идентифицируют под флуоресцентным микроскопом в виде зеленых клеток и выскребают для последующего клонирования лиганда с использованием процедур для спасения плазмид, как описано в А1бпс11 е! а1., кирга, с последующими раундами анализа с секреторной ловушкой до тех пор, пока не будут идентифицированы отдельные клоны.

Рецепторная активность полипептида ха1рНа11 может быть измерена биосенсорным микрофизиометром на основе кремния, который измеряет скорость внеклеточного подкисления или экскрецию протонов, связанную со связыванием рецептора и последующими физиологическими клеточными ответами. Примером устройства является микрофизиометр Су!окепког™, изготовляемый Мо1еси1аг Эеуюек, Виппууа1е, СА. Разнообразные клеточные ответные реакции, такие как пролиферация клеток, ионный транспорт, продуцирование энергии, воспалительный ответ, регуляторная и рецепторная активация и т. п., могут быть измерены этим способом. См., например, МсСоппе11, Н.М. е! а1., Ваепсе 257:1906-1912, 1992; РйсЫотб, В. е! а1., Ме!к. Епхуто1. 228:84-108, 1997; АптПН, В. е! а1., 1. Еттипо1. Ме!к. 212:49-59, 1998; Уап ЫеЕбе, Е. е! а1., Еиг. 1. РЬагтасо1. 346:87-95, 1998. Микрофизиометр может быть использован для анализа эука

- 23 006501 риотических, прокариотических, прикрепленных или неприкрепленных клеток. Путем измерения изменений внеклеточного подкисления в клеточных средах во времени микрофизиометр измеряет непосредственно клеточные ответные реакции на различные стимулы, в том числе агонисты, лиганды или антагонисты полипептида ζ;·ι1ρ1ι;·ι11. Предпочтительно микрофизиометр используют для измерения ответов экспрессирующей ζ;·ι1ρ1ι;·ιΐΐ эукариотической клетки в сравнении с контрольной эукариотической клеткой, которая не экспрессирует полипептид ζη1ρΗηΐΐ. Экспрессирующие ζη1ρΗηΐΐ эукариотические клетки включают в себя клетки, в которые был трансфицирован 7а1рЬаИ. как описано здесь, с образованием клетки, которая отвечает на модулирующие 7а1рЬаП стимулы, или клетки, природно экспрессирующие 7а1рЬаИ. такие как экспрессирующие 7а1рЬаИ клетки, полученные из лимфоидной ткани, ткани селезенки, ткани тимуса или РВЬ. Различия, измеренные по увеличению или уменьшению во внеклеточном подкислении в ответной реакции клеток, экспрессирующих 7а1рЬаИ. относительно контроля, являются прямым измерением модулируемых 7а1рЬаИ клеточных ответов. Кроме того, такие модулированные 7а1рЬаИ ответы могут анализироваться при действии различных стимулов. С использованием микрофизиометра обеспечен также способ идентификации агонистов и антагонистов полипептида 7а1рЬаИ. предусматривающий обеспечение клеток, экспрессирующих полипептид 7а1рЬаИ. культивирование первой порции этих клеток в отсутствие тест-соединения, культивирование второй порции этих клеток в присутствии тест-соединения и детектирование увеличения или уменьшения в клеточной ответной реакции второй порции клеток в сравнении с первой порцией клеток. Антагонисты и агонисты, в том числе природный лиганд для полипептида 7а1рЬаИ. могут быть быстро идентифицированы с использованием этого способа.

Дополнительные анализы, обеспечиваемые данным изобретением, включают в себя применение гибридных рецепторных полипептидов. Эти гибридные полипептиды подразделяются на два основных класса. В первом классе внутриклеточный домен 7а1рЬаИ. содержащий приблизительно остатки 256 (Ьук)-528 (8ег) 8Е0 ΙΌ N0:2. соединен с лигандсвязывающим доменом второго рецептора. Предпочтительно, чтобы второй рецептор был рецептором гемопоэтического цитокина, таким как тр1-рецептор (8оиуг1 е! а1.. Се11 63:ΐΐ37-ΐΐ47. ΐ990). Этот гибридный рецептор будет дополнительно содержать трансмембранный домен, который может происходить из любого рецептора. Затем конструкцию ДНК, кодирующую этот гибридный рецептор, встраивают в клетку хозяина. Клетки, экспрессирующие гибридный рецептор, культивируют в присутствии лиганда для связывающего домена и анализируют на ответную реакцию. Эта система обеспечивает средство для анализа трансдукции сигнала, опосредованной 7а1рЬаИ. с использованием легкодоступных лигандов.

Эта система может быть также использована для определения, способны ли конкретные клеточные линии отвечать на сигналы, трансдуцируемые /а1рЬа11. Второй класс гибридных рецепторных полипептидов включает в себя внеклеточный (лигандсвязывающий) домен 7а1рЬаИ (приблизительно остатки 20 (Сук)-237 (Н1к) 8Е0 ΙΌ N0:2) с цитоплазматическим доменом второго рецептора, предпочтительно рецептора цитокина, и трансмембранным доменом. Трансмембранный домен может происходить из любого рецептора. Гибридные рецепторы этого второго класса экспрессируются в клетках, о которых известно, что они способны отвечать на сигналы, передаваемые вторым рецептором. Вместе эти два класса гибридных рецепторов способны использовать широкий спектр клеточных типов в системах анализа на основе рецепторов.

Клетки, которые, как обнаруживается, экспрессируют 7а1рЬаИ. используют затем для приготовления библиотеки кДНК, из которой кодирующая лиганд кДНК может быть выделена, как описано выше. Таким образом, данное изобретение обеспечивает, кроме новых рецепторных полипептидов, способы для клонирования полипептидных лигандов для этих рецепторов.

Тканеспецифичность экспрессии 7а1рЬаИ предполагает роль в раннем развитии тимоцитов и регуляции иммунного ответа. Эти процессы включают в себя стимуляцию пролиферации и дифференцировки клеток в ответ на связывание одного или нескольких цитокинов с их родственными рецепторами. Ввиду тканевого распределения, наблюдаемого для этого рецептора, агонисты (в том числе природный лиганд) и антагонисты имеют огромный потенциал в применениях как ίη У1!го, так и ίη у1уо. Соединения, идентифицированные в качестве агонистов рецептора, применимы для стимуляции пролиферации и развития клеток-мишеней ίη У1!го и ίη у1уо. Например, соединения-агонисты применимы в качестве компонентов определенных сред для культуры клеток и могут использоваться отдельно или в комбинации с другими цитокинами и гормонами для замены сыворотки, которую обычно применяют в клеточной культуре. Таким образом, агонисты применимы в специфической стимуляции роста и/или развития Т-клеток, Вклеток и других клеток лимфоидной и миелоидной линий дифференцировки и гемопоэтических клеток в культуре.

Лиганды-агонисты для /а1рЬа11 могут быть полезны в стимуляции клеточно-опосредованного иммунитета и для стимуляции пролиферации лимфоцитов, например в лечении инфекций, включающих в себя иммуносупрессию, в том числе некоторых вирусных инфекций. Дополнительные применения включают в себя супрессию опухолей, когда злокачественное превращение приводит к опухолевым клеткам, которые являются антигенными. Лиганды-агонисты могли бы использоваться для индукции цитотоксичности, которая может быть опосредована активацией эффекторных клеток, таких как Т-клет

- 24 006501 ки, ΝΚ-клетки (природные клетки-убийцы) или БАК-клетки (лимфоид-активируемые клетки-убийцы), или индуцирована непосредственно через апоптотические пути. Лиганды-агонисты могут быть также использованы в лечении лейкопений путем увеличения уровней пораженного клеточного типа и усиления регенерации набора Т-клеток после трансплантации костного мозга.

Лиганды-антагонисты или соединения-антагонисты могут найти применение в супрессии иммунной системы, например в лечении аутоиммунных заболеваний, в том числе ревматоидного артрита, множественного склероза, сахарного диабета, воспалительного заболевания пищеварительного тракта, болезни Крона и т.д. Иммуносупрессия может быть также использована для уменьшения отторжения трансплантатов и имплантатов тканей или органов и для лечения Т-клеточно-специфических лейкозов или лимфом ингибированием пролиферации пораженного клеточного типа.

2а1рЬа11 может быть также использован в диагностических системах для обнаружения уровней лиганда в кровотоке. В родственном варианте, антитела или другие агенты, которые специфически связываются с ха1рБа11. могут быть использованы для детектирования рецепторных полипептидов в кровообращении. Повышенные или пониженные уровни полипептидов лиганда или рецептора могут свидетельствовать о патологических состояниях, в том числе о раке. Растворимые рецепторные полипептиды могут способствовать патологическому процессу и могут быть прямым маркером скрытого заболевания. Например, повышенные уровни растворимого ББ-2-рецептора в сыворотке человека были ассоциированы с большим разнообразием воспалительных и неопластических состояний, таких как инфаркт миокарда, астма, тяжелая псевдопаралитическая миастения, ревматоидный артрит, острый Т-клеточный лейкоз, Вклеточные лимфомы, хронический лимфоцитарный лейкоз, рак ободочной кишки, рак молочной железы и рак яичника (Неапеу е! а1., В1ооб 87:847-857, 1996).

Лигандсвязывающий полипептид рецептора ха1рНа11, или «растворимый рецептор», может быть получен экспрессией укороченной ДНК, кодирующей цитокинсвязывающий домен ха1рБа11 (приблизительно остатки 20(Сук)-237 (Ηίκ) человеческого рецептора (8Е0 ΙΌ N0:2)) или соответствующий район рецептора не человека. Предпочтительно, чтобы внеклеточный домен был получен в форме, по существу, не содержащей полипептидных сегментов трансмембранного и внутриклеточного доменов. Кроме того, лигандсвязывающие полипептидные фрагменты в цитокинсвязывающем домене ха1рНа11, описанном выше, могут служить в качестве растворимых рецепторов ха1рБа11 для описанных здесь применений. Для направления экспорта рецепторного полипептида из клетки-хозяина ДНК рецептора связывают со вторым ДНК-сегментом, кодирующим секреторный пептид, такой как секреторный пептид !-РА или секреторный пептид ха1рБа11. Для облегчения очистки секретируемого рецепторного полипептида Сконцевое удлинение, такое как полигистидиновая метка, вещество Р, пептид ЕБАС™ (Норр е! а1., В1о/ТесЬпо1о§у 6:1204-1210, 1988; доступный из Еак!тап Кобак Со., №\ν Науеп, СТ) или другой полипептид или белок, для которого доступны антитело или другой агент специфического связывания, может быть слито с рецепторным полипептидом.

В альтернативном подходе, рецепторный внеклеточный домен может экспрессироваться в виде слитого белка с константными областями тяжелой цепи иммуноглобулина, обычно с Ес-фрагментом, который содержит домены двух константных областей и не содержит вариабельной области. Такие слияния обычно секретируются в виде мультимерных молекул, где Ес-части связаны друг с другом дисульфидной связью, а два рецепторных полипептида выстроены в тесной близости друг с другом. Слитые белки этого типа могут быть использованы для аффинной очистки родственного лиганда из раствора, в качестве инструмента анализа ш νίΙΐΌ, для блокирования сигналов ш νίΙΐΌ посредством специфического «оттитровывания» лиганда и в качестве антагонистов ш у1уо путем введения их парентерально для связывания находящегося в кровотоке лиганда и выведения его из кровотока. Для очистки лиганда химеру ха1рНа 11 -иммуноглобулин добавляют к пробе, содержащей лиганд (например, клеточно-кондиционированной культуральной среде или экстрактам тканей) в условиях, которые облегчают связывание рецептор-лиганд (обычно при почти физиологических температуре, рН и ионной силе). Затем комплекс химера-лиганд выделяют смешиванием с использованием белка А, который иммобилизован на твердом носителе (например, на нерастворимых гранулах смолы). Затем лиганд элюируют при помощи общепринятых химических способов, таких как градиент соли или рН. Альтернативно, сама химера может быть связана с твердым носителем, причем связывание и элюцию проводят, как описано выше. Собранные фракции могут быть повторно фракционированы до тех пор, пока не будет достигнут желаемый уровень чистоты.

Кроме того, растворимые рецепторы ха1рБа11 могут быть использованы в качестве «стока лиганда», т.е. антагониста, для связывания лиганда ш у1уо или ш νίΙΐΌ в терапевтических или других применениях, когда присутствие лиганда является нежелательным. Например, в случае раков, которые экспрессируют большое количество биоактивного лиганда /а1р11а1Б растворимые рецепторы ха1рБа11 могут быть использованы в качестве прямых антагонистов этого лиганда ш у1уо и могут способствовать снижению прогрессирования и симптомов, связанных с данным заболеванием. Кроме того, растворимый рецептор ха1рБа11 может быть использован для замедления прогрессирования раков, которые сверхэкспрессируют рецепторы /а1р11а1Б связыванием лиганда ш у1уо, который в противном случае усиливал бы пролиферацию этих раков. Подобно применениям ш уйго для /а1р11а1Б растворимый рецептор может быть исполь

- 25 006501 зован, например, в качестве инструмента негативного отбора для отбора клеточных линий, которые растут в отсутствие лиганда ζа1ρЬа11.

Кроме того, растворимый рецептор ζαφ^αΠ может быть использован ш уйго или в диагностических применениях для детектирования экспрессирующих лиганд ζαφ^αΠ раков ш νί\Ό или в пробах тканей. Например, растворимый рецептор ζαφΕαΠ может быть конъюгирован с радиоактивной меткой или флуоресцентной меткой, как описано выше, и использован для детектирования присутствия лиганда в пробе ткани с применением анализа связывания ш уйго типа лиганд-рецептор или анализа с флуоресцентной визуализацией. Кроме того, радиоактивно меченный растворимый рецептор 7а1рЬа11 мог бы вводиться 1п νί\Ό для детектирования экспрессирующих лиганд твердых опухолей при помощи способа радиотомографии, известного в данной области.

Анализ тканевого распределения мРНК, соответствующей этой новой ДНК, показал экспрессию в лимфоидных тканях, в том числе в тимусе (вилочковой железе), селезенке, лимфатических узлах и лейкоцитах периферической крови. Эти данные указывают на роль рецептора 7а1рЬа11 в пролиферации, дифференцировке и/или активации иммунных клеток и предполагают роль в развитии и регуляции иммунных ответов. Эти данные предполагают также, что взаимодействие ζа1ρ11а11 с его лигандом может стимулировать пролиферацию и развитие миелоидных клеток и может, подобно ΙΌ-2, ΙΕ-6, ЫЕ, ΙΕ-11 и 08М (Ваитапп е! а1., 1. Вю1. СНет. 268:8414-8417, 1993), индуцировать белковый синтез острой фазы в гепатоцитах.

Предпочтительно очищать полипептиды данного изобретения до >80% чистоты, более предпочтительно до >90% чистоты, еще более предпочтительно до >95% чистоты и особенно предпочтительно до фармакологически чистого состояния, т.е. до чистоты более 99,9%, в отношении загрязняющих макромолекул, в частности, других белков и нуклеиновых кислот, и инфекционных и пирогенных агентов. Предпочтительно очищенный полипептид является, по существу, не содержащим других полипептидов, в частности других полипептидов животного происхождения.

Экспрессируемые рекомбинантные полипептиды ζа1ρ11а11 (или химерные или слитые полипептиды 7а1рйа11) могут быть очищены с использованием фракционирования и/или общепринятых способов и сред очистки. Для фракционирования проб могут быть использованы осаждение сульфатом аммония и кислотная или хаотропная экстракция. Примеры стадий очистки могут включать в себя применение гидроксиапатита, гель-фильтрацию, жидкостную экспресс-хроматографию белков (РРЬС) и высокоэффективную жидкостную хроматографию с обращенной фазой. Подходящие хроматографические среды включают в себя производные декстрана, агарозу, целлюлозу, полиакриламид, специальные диоксиды кремния и т.п. Предпочтительными являются производные РЕЕ ΌΕΛΕ, ОЛЕ и О. Примеры хроматографических сред включают в себя среды, дериватизованные фенильной, бутильной или октильной группами, такие как Рйепу1-8ерйагоке РР (Рйагтас1а), Тоуореаг1 Ьи1у1 650 (Токо Наак, МоШдотегууШе. РА), 0с1у 18ерйагоке (Рйагтааа) и т.п.; или полиакриловые смолы, такие как АтЬегсйгот СО 71 (Токо Наак) и т.п. Подходящие твердые носители включают в себя стеклянные гранулы, смолы на основе диоксида кремния, целлюлозные смолы, агарозные гранулы, сшитые агарозные гранулы, полистироловые гранулы, сшитые полиакриламидные смолы и т.п., которые являются нерастворимыми в условиях, в которых они должны использоваться. Эти носители могут быть модифицированы реакционноспособными группами, позволяющими присоединение белков посредством аминогрупп, карбоксильных групп, сульфгидрильных групп, гидроксильных групп и/или углеводных частей молекул. Примеры химических способов связывания включают в себя активацию цианогенбромидом, активацию ^гидроксисукцинимидом, активацию эпоксидом, активацию сульфгидрильными группами, активацию гидразидом и карбоксил- и аминопроизводные для способов сочетания с использованием карбодиимида. Эти и другие твердые среды являются хорошо известными и широко используемыми в данной области и доступны из коммерческих источников. Способы связывания рецепторных полипептидов со средами-носителями хорошо известны в данной области. Выбор конкретного способа является рутинным и определяется отчасти свойствами выбранного носителя. См., например. Айшйу Сйгота!одгарйу: Ргтс1р1ек & Ме!Нобк, Рйагтааа ЬКВ Вю!есйпо1оду, Иррка1а, 8^ебеп, 1988.

Полипептиды данного изобретения могут быть выделены путем использования их биохимических, структурных и биологических свойств. Например, адсорбционная хроматография с иммобилизованным ионом металла (ГМАС) может быть использована для очистки богатых гистидином белков или белков, имеющих полигистидиновые метки. Вкратце, гель сначала загружают ионами двухвалентного металла с образованием хелата (8и1ко^кк1, Тгепбк ш ВюсНет. 3:1-7, 1985). Богатые гистидином белки будут адсорбироваться на этом матриксе с различными аффинностями в зависимости от используемого иона металла и будут элюироваться конкурентной элюцией, понижением рН или применением сильных хелатообразователей. Другие способы очистки включают в себя очистку гликозилированных белков аффинной хроматографией с иммобилизованным лектином и ионообменной хроматографией (Ме!Нобк ш Εηζутο1., Уо1. 182:529-39, Сшбе !о Рго!еш Рипйсайоп, М. Пеи!ксйег, (еб.), Асаб. Ргекк, 8ап Э/едо, 1990). В дополнительных вариантах данного изобретения может быть сконструирован гибрид представляющего интерес

- 26 006501 полипептида и аффинной метки (например, мальтозусвязывающего белка, домена иммуноглобулина) для облегчения очистки.

Кроме того, при помощи способов, описанных в данной области, слитые полипептиды или гибридные белки ха1рНа11 конструируют с использованием районов или доменов ха1рНа11 данного изобретения в комбинации с районами или доменами других белков семейства рецепторов цитокинов человека или гетерологичных белков (8атЬгоок е! а1., 1Ь1б., А11ксНи1 е! а1., 1Ь1б., Рюагб, Сиг. Орт. В1о1оду, 5:511-5, 1994 и приведенные в них ссылки). Эти способы позволяют определить биологическую важность более крупных доменов или районов в представляющем интерес полипептиде. Такие гибриды могут изменять кинетику реакции, связывание, сужать или расширять субстратную специфичность или изменять клеточную локализацию полипептида и могут быть применены к полипептидам неизвестной структуры.

Слитые полипептиды или белки могут быть получены способами, известными в данной области, посредством получения каждого компонента слитого белка и химического конъюгирования их. Альтернативно, полинуклеотид, кодирующий один или несколько компонентов слитого белка в правильной рамке считывания, может быть получен с использованием известных способов и экспрессирован при помощи описанных здесь способов. Например, часть домена (доменов) или весь домен, сообщающий биологическую функцию, может быть подвергнут обмену между ха1рНа11 данного изобретения и функционально эквивалентным доменом (доменами) из другого члена семейства цитокинов. Такие домены включают в себя, но не ограничиваются ими, секреторную сигнальную последовательность, внеклеточный связывающий цитокин домен, трансмембранный домен и внутриклеточный передающий сигнал домен, сайты Вох I и Вох II, как описано здесь. Можно было бы ожидать, что такие гибридные белки имеют биологические функциональные особенности, которые являются одинаковыми или подобными особенностям полипептидов данного изобретения или белков других известных семейств, в зависимости от сконструированного слитого полипептида. Кроме того, такие слитые белки могут проявлять другие свойства, как описано здесь.

Стандартные способы молекулярной биологии и клонирования могут быть использованы для обмена эквивалентных доменов между полипептидом ха1рНа11 и полипептидами, с которыми их сливают. Обычно сегмент ДНК, который кодирует представляющий интерес домен, например описанный здесь домен ха1р11а1Е функционально (операбельно) связывают в рамке считывания по меньшей мере с одним другим сегментом ДНК, кодирующим дополнительный полипептид (например, домен или район из рецептора другого цитокина, такого как 1Ь-2-рецептор), и встраивают в подходящий экспрессирующий вектор, как описано здесь. Обычно конструкции ДНК конструируют таким образом, что несколько сегментов ДНК, кодирующих соответствующие районы полипептида, функционально связывают в рамке считывания для получения единой конструкции, кодирующей весь слитый белок или его функциональную часть. Например, конструкция ДНК кодировала бы от Ν-конца до С-конца слитый белок, содержащий сигнальный полипептид, за которым следуют цитокинсвязывающий домен, затем трансмембранный домен и внутриклеточный передающий сигнал домен. Такие слитые белки могут быть экспрессированы, выделены и тестированы на активность, как описано здесь.

Полипептиды ха1рНа11 или их фрагменты могут быть также получены при помощи химического синтеза. Полипептиды ха1рНа11 могут быть мономерами или мультимерами; гликозилированными или негликозилированными; пэгилированными или непэгилированными и могут содержать или могут не содержать исходный аминокислотный остаток метионин.

Полипептиды данного изобретения могут быть также синтезированы эксклюзивным (т.е. только) твердофазным синтезом, частичными твердофазными способами, конденсацией фрагментов или классическим синтезом в растворе. Способы синтеза полипептидов хорошо известны в данной области. См., например, Метйе1б, I. Ат. СНет. 8ос. 85:2149, 1963; Какег е! а1., Апа1. Вюсйет. 34:595, 1970. После полного синтеза желаемого пептида на твердом носителе комплекс пептид-смола обрабатывают реагентом, который отщепляет полипептид от смолы и удаляет большую часть защитных групп боковых цепей. Такие способы хорошо разработаны в данной области.

Активность молекул данного изобретения может быть измерена с использованием различных тестов, которые измеряют дифференцировку и пролиферацию клеток. Такие тесты хорошо известны в данной области.

Белки данного изобретения применимы, например, в лечении лимфоидных, иммунных, воспалительных, связанных с селезенкой, кровью и костями нарушений и могут быть измерены ш уйго с использованием культивируемых клеток или ш у1уо путем введения молекул данного изобретения подходящему животному-модели. Например, клетки-хозяева, экспрессирующие растворимый рецепторный полипептид ха1р11а11, могут быть заделаны в альгинатную среду и инъецированы (имплантированы) в животных-реципиентов. Микроинкапсулирование в альгинат-поли-Ь-лизин, инкапсулирование в мембрану с избирательной проницаемостью и диффузионные камеры являются средствами заключения в них трансфицированных клеток млекопитающих или первичных клеток млекопитающих. Эти типы неиммуногенных «инкапсулирований» делают возможной диффузию белков и других макромолекул, секретируемых или высвобождаемых захваченными клетками в реципиентное животное. Наиболее важно, что капсулы маскируют и защищают чужеродные заделанные в них клетки от иммунного ответа реципиентного жи

- 27 006501 вотного. Такие инкапсулирования могут продлевать жизнь инъецируемых клеток от нескольких часов или дней («голые клетки») до нескольких недель («заделанные» клетки). Альгинатные нити обеспечивают простое и быстрое средство для получения заделанных клеток.

Материалы, необходимые для получения альгинатных нитей, известны в данной области. В примерной процедуре 3% альгинат готовят в стерильной Н₂О и стерильно фильтруют. Непосредственно перед приготовлением альгинатных нитей раствор альгината снова фильтруют. Приблизительно 50% суспензию клеток (содержащую приблизительно 5х10⁵ -приблизительно 5х10⁷ клеток/мл) смешивают с 3% раствором альгината. 1 мл суспензии альгинат/клетки экструдируют в 100 мМ стерильно профильтрованный раствор СаС1₂ на протяжении периода времени ~15 мин с образованием «нити». Затем экструдированную нить переносят в раствор 50 мМ СаС1₂ и затем в раствор 25 мМ СаС1₂. Затем эту нить промывают деионизованной водой перед нанесением покрытия на нить инкубированием в 0,01% растворе поли-Ь-лизина. Наконец, нить промывают лактированным раствором Рингера и вытягивают из раствора в цилиндр шприца (без иглы). Затем к шприцу присоединяют иглу с большим отверстием и нить инъецируют внутрибрюшинно в реципиента в минимальном объеме лактированного раствора Рингера.

Подход 1п νί\Ό для тестирования белков данного изобретения включает в себя вирусные системы доставки. Примеры вирусов для этой цели включают в себя аденовирус, герпесвирус, ретровирусы, вирус коровьей оспы и аденоассоциированный вирус (ААУ). Аденовирус, двухцепочечный ДНК-вирус, является в настоящее время наиболее исследованным вектором переноса генов для доставки гетерологичной нуклеиновой кислоты (в отношении обзора см. Т.С. Вескег е! а1., МеШ. Се11 Вю1. 43:161-89, 1994 и ЬТ. Оопд1ак апб Ό.Τ. Сипе1. 8степсе & Мебюте 4:44-53, 1997). Аденовирусная система предоставляет несколько преимуществ: (ί) аденовирус может вместить относительно большие инсерционные сегменты (вставки) ДНК; (ίί) может выращиваться до высокого титра; (ίίί) инфицирует широкий спектр типов клеток млекопитающих и (ίν) может быть использован с большим числом различных промоторов, в том числе вездесущих, тканеспецифических и регулируемых промоторов. Поскольку аденовирусы являются стабильными в кровотоке, они могут вводиться также внутривенной инъекцией.

С использованием аденовирусных векторов, в которых части аденовирумного генома делетированы, инсерционные сегменты (вставки) включают в вирусную ДНК прямым лигированием или гомологичной рекомбинацией с котрансфицируемой плазмидой. В приводимой в качестве примера системе основной ген Е1 был делетирован из вирусного вектора и вирус не реплицировался, пока ген Е1 не обеспечивался клеткой-хозяином (примером является клеточная линия 293 человека). При внутривенном введении интактным животным аденовирус, прежде всего, поражал печень. Если эта аденовирусная система доставки имеет делецию гена Е1, этот вирус не может реплицироваться в клетках-хозяевах. Однако ткань хозяина (например, печень) будет экспрессировать и процессировать (и, если присутствует секреторная сигнальная последовательность, секретировать) гетерологичный белок. Секретированные белки будут входить в кровоток в высоковаскуляризованной печени, и могут быть определены действия на инфицированное животное.

Кроме того, аденовирусные векторы, содержащие различные делеции вирусных генов, могут быть использованы в попытке уменьшения или элиминации иммунных ответов на вектор. Такие аденовирусы являются лишенными Е1 и, кроме того, содержат делеции Е2А или Е4 (Ьикку, М. е1 а1., ί. У1го1. 72:20222032, 1998; Карег, 8.Е. е! а1., Нитап Сепе Тйегару 9:671-679, 1998). Кроме того, сообщалось, что делеция Е2Ь снижает иммунные ответы (АтаНйапо, А. е1 а1., ί. У1го1. 72:926-933, 1998). Кроме того, посредством делеции всего аденовирусного генома могут быть помещены очень большие инсерции гетерологичной ДНК. Г енерирование так называемых «безвольных» аденовирусов, в которых все вирусные гены делетированы, является особенно выгодным для инсертирования больших инсерционных сегментов гетерологичной ДНК. В качестве обзора, см. Уек Р. апб РегпсаибеЕ М. РА8ЕВ ί. 11:615-623, 1997.

Аденовирусная система может быть также использована для получения белков ш νίΙΐΌ. Культивированием инфицированных аденовирусом не-293 клеток в условиях, в которых эти клетки не являются быстро делящимися, эти клетки могут продуцировать белки в течение продолжительных периодов времени. Например, клетки ВНК выращивают до конфлюэнтности в клеточных фабриках (кассетах биореакторов для крупномасштабного производства клеток), затем экспонируют аденовирусному вектору, кодирующему представляющий интерес секретируемый белок. Затем клетки выращивают в бессывороточных условиях, которые позволяют инфицированным клеткам выживать в течение нескольких недель без существенного деления клеток. Альтернативно, инфицированные аденовирусным вектором клетки 293 могут выращиваться в виде прикрепленных клеток или в виде суспензионной культуры при относительно высокой плотности клеток для продуцирования значительных количеств белка (см. Сагшег е1 а1., Су1о1ес11по1. 15:145-55, 1994). В случае любого протокола, экспрессируемый, секретируемый гетерологичный белок может периодически выделяться из супернатанта, лизата или мембранных фракций клеточной культуры, в зависимости от локализации экспрессируемого белка в клетке. В протоколе с продуцированием инфицированными клетками 293 также могут быть эффективно получены несекретируемые белки.

Ввиду тканевого распределения, наблюдаемого для /а1рйа11, агонисты (в том числе природный лиганд/субстрат/кофактор и т.д.) и антагонисты имеют огромный потенциал в применениях как ш νίΙΐΌ, так

- 28 006501 и ίη у1уо. Соединения, идентифицированные в качестве агонистов ζа1рйа11, применимы для стимуляции роста иммунных и гемопоэтических клеток ίη убго и ίη νί\Ό. Например, ζιΦ^ιΠ и соединения-агонисты применимы в качестве компонентов определенных сред для культуры клеток и могут использоваться отдельно или в комбинации с другими цитокинами и гормонами для замены сыворотки, которую обычно применяют в клеточной культуре. Таким образом, агонисты применимы в специальной стимуляции роста и/или развития Т-клеток, В-клеток и других клеток лимфоидной и миелоидной линий дифференцировки в культуре. Кроме того, растворимый рецептор ζι^^Ο, агонист или антагонист могут быть использованы ίη уЦго в тесте для измерения стимуляции образования колоний из первичных культур выделенного костного мозга. Такие тесты хорошо известны в данной области.

Антагонисты применимы также в качестве реагентов исследования для характеристики сайтов взаимодействия лиганд-рецептор. Ингибиторы активности ζι^^^ (антагонисты ζι^^Ο) включают в себя антитела против ζа1рНа11 и растворимых рецепторов ζа1рйа11, а также другие пептидные и непептидные агенты (в том числе рибозимы).

2а1рНа11 может быть использован также для идентификации модуляторов (например, антагонистов) его активности. Тест-соединения добавляют к описанным здесь тестам для идентификации соединений, ингибирующих активность ζа1рНа11. Кроме этих описанных здесь тестов, пробы могут быть тестированы на ингибирование активности ζа1рНа11 в многочисленных анализах, предназначенных для измерения связывания, олигомеризации ζа1рНа11 или стимуляции/ингибирования ха1рНа11 -зависимых клеточных ответных реакций. Например, экспрессирующие ζа1рНа11 клеточные линии могут быть трансфицированы конструкцией с репортерным геном, которая отвечает на стимулируемый ζа1рНа11 клеточный путь. Конструкции с репортерным геном этого типа известны в данной области и обычно будут содержать чувствительный к ζιΦ^ιΠ ДНК-элемент, функционально связанный с геном, кодирующим детектируемый тестом белок, такой как люцифераза. Чувствительные ДНК-элементы могут включать в себя, но не ограничиваются ими, циклический АМФ-чувствительный элемент (СКЕ), гормон-чувствительные элементы (НЕЕ), инсулин-чувствительный элемент (ΙΚΕ) (№1зпп е! а1., Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А 87:5273-7, 1990) и сыворотка-чувствительные элементы (8КЕ) (8На\у е! а1., Се11 56:563-72, 1989). Циклический АМФ-чувствительные элементы рассматриваются в обзоре Коезбег е! а1., ί. Вю1. СНет 263 (19):9063-6; 1988 и НаЬепег, Мо1ес. Епбосгшо1. 4 (8): 1087-94; 1990. Гормон-чувствительные элементы рассматриваются в Веа!о, Се11 56:335-44; 1989. Соединения-кандидаты, растворы, смеси или экстракты или кондиционированные среды от различных типов клеток тестируют на их способность усиливать активность рецептора 7а1рЬа11, определяемую увеличением стимуляции 7а1рЬа11 экспрессии репортерного гена. Тесты этого типа будут детектировать соединения, которые непосредственно стимулируют активность трансдукции (передачи) сигнала ζιΦ^ιΠ через связывание рецептора или стимуляцией иным образом части каскада сигналов. Таким образом, обеспечен способ идентификации агонистов полипептида 7а1рЬа11, предусматривающий обеспечение клеток, чувствительных к полипептиду ζι^^Ο, культивирование первой порции этих клеток в отсутствие тест-соединения, культивирование второй порции этих клеток в присутствии тест-соединения и детектирование увеличения клеточного ответа второй порции этих клеток в сравнении с первой порцией этих клеток. Кроме того, третья клетка, содержащая конструкцию с репортерным геном, описанную выше, но не экспрессирующая рецептор 7а1рЬа11, может быть использована в качестве контрольной клетки для оценки неспецифической, или не опосредованной рецептором 7а1рЬа11, стимуляции данного репортера. Таким образом, агонисты, в том числе природный лиганд, применимы для стимуляции или увеличения функции полипептида ζι^^Ο.

Лигандсвязывающий полипептид 7а1рЬа11, такой как цитокинсвязывающий домен, описанный здесь, может быть также использован для очистки лиганда. Этот полипептид иммобилизуют на твердом носителе, таком как гранулы из агарозы, сшитой агарозы, стекла, целлюлозных смол, смол на основе диоксида кремния, полистирола, сшитого полиакриламида, или подобных материалах, которые являются стабильными в условиях использования. Способы связывания полипептидов с твердыми носителями известны в данной области и включают в себя аминную химию, активацию цианогенбромидом, активацию Ν-гидроксисукцинимидом, активацию эпоксидом, сульфгидрильную активацию и гидразидную активацию. Полученную среду обычно готовят в форме колонки и жидкости, содержащих лиганд, пропускают через эту колонку 1 или несколько раз, чтобы позволить лиганду связаться с рецепторным полипептидом. Затем этот лиганд элюируют при помощи изменений концентрации соли, хаотропных агентов (гуанидина-НС1) или рН для разрушения связывания лиганд-рецептор.

Тест-система, которая использует лигандсвязывающий рецептор (или антитело, один член пары комплемент/антикомплемент) или его связывающий фрагмент, и коммерчески доступный биосенсорный прибор (Высоте™, РНагтааа Вюзепзог Р1зса1атау, Νί; или технологию ЗЕЕОГ™, Орйегдеп, Шс., Ра1о А1!о, СА) могут быть выгодно использованы. Такой рецептор, антитело, член пары комплемент/антикомплемент или фрагмент иммобилизуют на поверхности рецепторного кристалла. Применение этого прибора описано Каг1ззоп, ί. Iттиηο1. Ме!Нобз 145: 229-240, 1991 и СипптдНат апб ^е11з, ί. Мо1. Вю1. 234: 554-63, 1993. Такой рецептор, антитело, член пары или фрагмент присоединяют ковалентно при помощи аминной или сульфгидрильной химии к волокнам декстрана, которые присоединены к пленке золота в проточной ячейке. Тест-пробу пропускают через эту ячейку. Если лиганд, эпитоп или противопо

- 29 006501 ложный член пары комплемент/антикомплемент присутствует в этой пробе, он будет связываться с иммобилизованным рецептором, антителом или членом пары, соответственно, вызывая изменение в показателе преломления среды, которое детектируется как изменение в резонансе поверхностных плазмонов золотой пленки. Эта система позволяет определить скорости включения и выключения (оп- и о££скорости), из которых может быть рассчитана аффинность связывания и сделана оценка стехиометрии связывания.

Лигандсвязывающие рецепторные полипептиды могут быть также использованы в других системах анализа, известных в данной области. Такие системы включают в себя анализ Скетчарда для определения аффинности связывания (см. 8са1сН;пЛ Апп. ΚΥ Асаά. 8сг 5ΐ: 660-672, ΐ949) и калориметрические анализы (СипшпдНат е! а1., 8аепсе 253: 545-48, ΐ99ΐ; СиптпдНат е! а1., 8аепсе 245: 82ΐ-25, ΐ99ΐ).

Полипептиды /а1рНа11 могут быть также использованы для получения антител, которые связываются с эпитопами, пептидами или полипептидами /аЦлНаЫ. Полипептид /а1рНаИ или его фрагмент служит в качестве антигена (иммуногена) для инокуляции животного и индукции иммунного ответа. Специалисту с квалификацией в данной области будет ясно, что антигены или иммуногенные эпитопы могут состоять из отрезков аминокислот в более длинном полипептиде, от приблизительно ΐ0 аминокислот и до полной длины полипептида или более длинного полипептида в зависимости от конкретного полипептида. Подходящие антигены включают в себя полипептид /афНаИ, кодируемый 8ЕО ΙΌ N0:2 от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 538 (8ег) или его фрагмент из непрерывных аминокислот 9-5ΐ9. Предпочтительными пептидами для применения в качестве антигенов являются цитокинсвязывающий домен, внутриклеточный передающий сигнал домен, сайты Вох Ι и Вох ΙΙ, описанные здесь, и гидрофильные пептиды /афНаИ, такие как предсказанные специалистом в данной области из графика гидрофобности, определенные, например, из профиля гидрофильности Норр/Ψооάκ на основе скользящего окна для шести остатков, со скрытыми остатками С, 8 и Т и экспонированными (открытыми) остатками Н, Υ и (см. фиг. ΐ). Гидрофильные пептиды /а1рНа 11 включают в себя пептиды, содержащие аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из (ΐ) аминокислоты номер 5ΐ (Тгр) - аминокислоты номер 6ΐ (С1и) 8Е0 ΙΌ N0:2; (2) аминокислоты номер ΐ36 (Не) - аминокислоты номер ΐ43 (С1и) 8Е0 ΙΌ N0:2; (3) аминокислоты номер ΐ87 (Рго) - аминокислоты номер ΐ95 (8ег) 8Е0 ΙΌ N0:2; (4) аминокислоты номер 223 (РНе) - аминокислоты номер 232 (С1и) 8Е0 ΙΌ N0:2 и (5) аминокислоты номер 360 (С1и) - аминокислоты номер 368 (Акр) 8Е0 ΙΌ N0:2. Кроме того, подходящими антигенами являются консервативные мотивы и вариабельные районы между консервативными мотивами /афНаИ. Кроме того, соответствующие районы мышиного полипептида /а1рНаИ (8Е0 ΙΌ N0:85) могут быть использованы для генерирования антител против мышиного /а1рЬаП. Антитела, генерированные из этого иммунного ответа, могут быть выделены и очищены, как описано выше. Способы получения и выделения поликлональных и моноклональных антител хорошо известны в данной области (см., например Сиггеп! Рго!осо1к 1п Iттиηо1оду, СооНдап, е! а1., ^к.). №11юпа1 !пк11(и(ек о£ Неа1(Н, ЬоНп \УПеу ηΐ'ΐά 8опк, Мс., ΐ995; 8атЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, 8есо1Л Εά^ι^оη. СоИ 8рппд НагЬог, ΗΥ, ΐ989 и Нигге11, 1.С.Я., Εά., Мопос1опа1 НуЬ^^άота АпНЬоФек: ТесНтциек ;πιά АррНса!юпк, СЯС Ргекк, Шс., Воса Ка!оп, РЬ, ΐ982).

Как должно быть очевидно специалисту с обычной квалификацией в данной области, поликлональные антитела могут быть получены инокуляцией различных теплокровных животных, таких как лошади, коровы, козы, овцы, собаки, куры, кролики, мыши и крысы, полипептидом /а1рНа11 или его фрагментом. Иммуногенность полипептида /а1рЬаП может быть увеличена путем применения адъюванта, такого как квасцы (гидроксид алюминия) или полный или неполный адъювант Фрейнда. Полипептиды, применимые для иммунизации, включают в себя также слитые (гибридные) полипептиды, такие как гибриды /а1рНаИ или его части с полипептидом иммуноглобулина или с мальтозусвязывающим белком. Полипептидный иммуноген может быть полноразмерной молекулой или ее частью. Если эта часть полипептида является гаптен-подобной, такая часть может быть предпочтительно соединена или связана с макромолекулярным носителем (таким как гемоцианин фиссуреллы (КЬН), бычий сывороточный альбумин (БСА) или столбнячный токсоид) для иммунизации.

В применении здесь термин антитела включает в себя поликлональные антитела, аффинноочищенные поликлональные антитела, моноклональные антитела и антигенсвязывающие фрагменты, такие как протеолитические Р(аЬ')₂- и РаЬ-фрагменты. Также включены генетически сконструированные интактные антитела или фрагменты, такие как химерные антитела, Ρν-фрагменты, одноцепочечные антитела и т.п., а также синтетические антигенсвязывающие пептиды и полипептиды. Антитела не из человека могут быть очеловечены (гуманизированы) прививкой СЭЯ не человека на каркасные и константные области иммуноглобулина человека или включением полных вариабельных доменов не человека (необязательно окутыванием их подобной человеческой поверхностью путем замены экспонированных остатков, результатом чего является облицованное антитело). В некоторых случаях гуманизированные антитела могут сохранять остатки иммуноглобулина не человека в каркасных доменах вариабельной области человека для усиления характеристик правильного связывания. Посредством гуманизирования антител может быть увеличен биологический полупериод существования в организме, и потенциал неблагоприятных иммунных реакций при введении людям уменьшается.

- 30 006501

Альтернативные способы генерирования или отбора антител, применимые здесь, включают в себя экспонирование ш νίΙΐΌ лимфоцитов белку или пептиду ζπ1ρ1ιπ11 и отбор библиотек представления антител в фаговых или подобных векторах (например, посредством использования иммобилизованного или меченого белка или пептида ζπίρΐιπίΐ). Гены, кодирующие полипептиды, имеющие потенциальные домены связывания полипептида ζι1ρΗη11, могут быть получены скринингом случайных пептидных библиотек, представленных на фагах (фаговое представление) или на бактериях, таких как Е. со11. Нуклеотидные последовательности, кодирующие эти полипептиды, могут быть получены различными путями, такими как случайный мутагенез или случайный синтез полинуклеотидов. Эти случайные библиотеки представления пептидов могут быть использованы для скрининга на пептиды, которые взаимодействуют с известной мишенью, которая может быть белком или полипептидом, таким как лиганд или рецептор, биологическая или синтетическая макромолекула или органические или неорганические вещества. Способы создания и скрининга таких случайных библиотек представления пептидов известны в данной области (Ьабпег е! а1., И8 Ра!еп! №. 5 223 409; Ьабпег е! а1., и.8. Ра!еп! №. 4 946 778; Ьабпег е! а1., и.8. Ра!еп! №. 5 403 484 и Ьабпег е! а1., и.8. Ра!еп! №. 5 571 698), и случайные библиотеки представления пептидов и наборы для скрининга таких библиотек коммерчески доступны, например, из С1оп!есН (Ра1о А1!о, СА), 1пу|1годеи 1пс. (8ап П1едо, СА), №\ν Епд1апб Вю1аЬк, 1пс. (ВесеНу, МА) и РНагтас1а ЬКВ Вю!есйио1оду 1пс. (Р1кса1а\\ау. N1). Случайные библиотеки представления пептидов могут быть подвергнуты скринингу с использованием последовательностей ζιΙρΗι 11, описанных здесь, для идентификации белков, которые связываются с ζπίρΐιπίΐ. Эти связывающие пептиды, которые взаимодействуют с полипептидами ζιΙρΗιΙΙ, могут быть использованы для мечения клеток; для выделения гомологичных полипептидов аффинной очисткой; они могут быть прямо или опосредованно конъюгированы с лекарственными средствами, токсинами, радионуклидами и т. п. Эти связывающие пептиды могут быть также использованы в аналитических способах, например, для скрининга экспрессионных библиотек и нейтрализующей активности. Связывающие пептиды могут быть также использованы для диагностических тестов для определения уровней полипептидов ζπίρΐιπίΐ в кровотоке; для обнаружения или количественного определения растворимых полипептидов ζπίρΐιπίΐ как маркера скрытых патологии или заболевания. Эти связывающие пептиды могут также действовать как «антагонисты» ζπίρΐιπίΐ для блокирования связывания ζπίρΐιπίΐ и трансдукции сигнала 1п νίΙΐΌ и 1п νί\Ό. Эти анти^афйаП-связывающие пептиды были бы полезны для ингибирования действия лиганда, который связывается с ζπίρΐιπίΐ.

Антитела определяются как специфически связывающие, если 1) они проявляют пороговый уровень связывающей активности и/или 2) они не имеют значимой перекрестной реактивности с родственными полипептидными молекулами. Во-первых, описанные здесь антитела специфически связываются, если они связываются с полипептидом, пептидом или эпитопом ζπίρΐιπίΐ с аффинностью, по меньшей мере в 10 раз большей, чем аффинность связывания с контрольным (не ζπίρΐιπίΐ) полипептидом. Предпочтительно, чтобы эти антитела проявляли аффинность связывания (К_а) 10⁶ моль^-1 или большую, предпочтительно 10⁷ моль^-1 или большую, более предпочтительно 10⁸ моль^-1 или большую и наиболее предпочтительно 10⁹ моль^-1 или большую. Аффинность связывания антитела может быть легко определена специалистом с обычной квалификацией в этой области, например, при помощи анализа Скетчарда (8са!сНагб, О., Апп. ΧΥ Асаб. 8с1. 51: 660-672, 1949).

Во-вторых, антитела специфически связываются, если они не имеют значимой перекрестной реактивности с родственными полипептидами. Антитела не имеют значимой перекрестной реактивности с родственными полипептидными молекулами, например, если они обнаруживают полипептид ζιΙρΗιΙΙ, но не обнаруживают известные родственные полипептиды, используемые в стандартном Вестерн-блот анализе (АикиЬе1 е! а1., 1Ь1б.). Примеры известных родственных полипептидов включают в себя ортологи, белки из того же вида, которые являются членами семейства белков (например, 1Ь-6), полипептиды ζπίρΐιπίΐ и ζπίρΐιπίΐ не человека. Кроме того, антитела могут быть скринированы (просеяны) против известных родственных полипептидов для выделения популяции, которая специфически связывается с полипептидами данного изобретения. Например, антитела, индуцированные к ζιΙρΗι 11, адсорбируют с родственными полипептидами, прикрепленными к нерастворимому матриксу; антитела, специфические для ζιΙρΗιΙΙ, будут протекать через этот матрикс при подходящих буферных условиях. Такое просеивание позволяет выделить поликлональные и моноклональные антитела, не имеющие перекрестной реактивности с близкородственными полипептидами (Ап!1Ьоб1ек: А ЬаЬога!огу Мапиа1, Наг1о\г апб Ьапе (ебк.), Со1б 8цг1пд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, 1988; Сиггеп! Рго!осо1к ш 1ттипо1оду, СооЬдап, е! а1. (ебк.). №!юпа1 1пкй!и!ек оГ Неа1!Н, 1оНп \УПеу апб 8опк, 1пс., 1995). Скрининг и выделение специфических антител хорошо известны в этой области (см. Рипбатеп1а1 1ттипо1оду, Раи1 (ебк.). Касеп Ргекк, 1993; Се№ГГ е! а1., Абс. 1п 1ттипо1. 43: 1-98, 1988; Мопос1опа1 АпйЬоб1ек: Рг1пс1ц1ек апб Ргасйсе, Собтд, 1.\У. (ебк.). Асабетю Ргекк Ь!б., 1996; Вефатт е! а1., Апп. Кес. 1ттипо1. 2: 67-101, 1984).

Различные анализы, известные лицам с обычной квалификацией в данной области, могут быть использованы для детектирования антител, которые специфически связывают белки и пептиды ζπίρΐιπίΐ. Примеры анализов описаны подробно в АпйЬоб1ек: А ЬаЬога!огу Мапиа1, Наг1о\\' апб Ьапе (Ебк.), Со1б 8цг1пд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, 1988. Характерные примеры таких анализов включают в себя конкурентный иммуноэлектрофорез, радиоиммуноанализ, радиоиммунопреципитацию, твердофазный иммунофер

- 31 006501 ментный анализ (ЕЫ8А), дот-блот или Вестерн-блот анализ, ингибиторный или конкурентный анализ и сэндвич-анализ. Кроме того, антитела могут быть подвергнуты скринингу на связывание с белком или полипептидом дикого типа в сравнении с мутантным белком или полипептидом /а1рка11.

Антитела к /а1рка11 могут быть использованы для мечения клеток, экспрессирующих /а1рка11; для выделения /а1рка11 аффинной очисткой; для диагностических тестов для определения уровней в кровотоке полипептидов /а1рка11; для обнаружения или количественного определения растворимого /а1рка11 как маркера скрытых патологии или заболевания; в аналитических способах с использованием ЕАС8; для скрининга экспрессионных библиотек; для генерирования антиидиотипических антител и в качестве нейтрализующих антител или в качестве антагонистов для блокирования активности /а1рка11 ΐπ νίΙΐΌ и ΐπ У1уо. Подходящие прямые тэги (маркеры) или метки включают в себя радионуклиды, ферменты, субстраты, кофакторы, ингибиторы, флуоресцентные маркеры, хемилюминесцентные маркеры, магнитные частицы и т.п.; непрямые тэги (маркеры) или метки могут выводить на первое место применение пары биотин-авидин или других пар комплемент/антикомплемент в качестве промежуточных продуктов. Описанные здесь антитела могут быть также прямо или опосредованно конъюгированы с лекарственными средствами, токсинами, радионуклидами и т.п., и эти конъюгаты могут быть использованы для диагностических или терапевтических применений ш у1уо. Кроме того, антитела к /а1рка11 или его фрагментам могут быть использованы т νίΙΐΌ для обнаружения денатурированного /а1рка 11 или его фрагментов в анализах, например Вестерн-блотах или других анализах, известных в этой области.

Антитела к /а1рка11 могут быть использованы для мечения клеток, экспрессирующих рецептор, и определения уровней экспрессии /а1рка11; для аффинной очистки, в диагностических тестах для определения уровней в кровотоке растворимых рецепторных полипептидов, в аналитических способах, использующих клеточный сортинг с возбуждением флуоресценции. Бивалентные антитела могут быть использованы в качестве агонистов для имитации действия лиганда /а1рка11.

Описанные здесь антитела могут быть также прямо или опосредованно конъюгированы с лекарственными средствами, токсинами, радионуклидами и т.п., и эти конъюгаты могут быть использованы для диагностических или терапевтических применений т у1уо. Например, антитела или связывающие полипептиды, которые узнают /а1рка11 данного изобретения, могут быть использованы для идентификации или обработки тканей или органов, которые экспрессируют соответствующую антикомплементарную молекулу (например, рецептор /а1рка11). Более конкретно, антитела против /а1рка11 или их биоактивные фрагменты или части могут быть связаны с детектируемыми или цитотоксическими молекулами и доставлены в млекопитающее, имеющее клетки, ткани или органы, экспрессирующие молекулу /а1рка11.

Подходящие детектируемые молекулы могут быть прямо или опосредованно присоединены к полипептидам, которые связывают /а1рка11 («связывающим полипептидам», в том числе описанным здесь связывающим пептидам), антителам или их биоактивным фрагментам или частям. Подходящие детектируемые молекулы включают в себя радионуклиды, ферменты, субстраты, кофакторы, ингибиторы, флуоресцентные маркеры, хемилюминесцентные маркеры, магнитные частицы и т. п. Подходящие цитотоксические молекулы могут быть прямо или опосредованно присоединены к этому полипептиду или антителу и включают в себя бактериальные или растительные токсины (например, дифтерийный токсин, экзотоксин Ркеийотопак, рицин, абрин и т.п.), а также терапевтические радионуклиды, такие как иод-131, рений-188 или иттрий-90 (либо непосредственно присоединенные к полипептиду или антителу, либо опосредованно присоединенные, например, через хелатирующую часть молекулы). Связывающие полипептиды или антитела могут быть также конъюгированы с цитотоксическими лекарственными средствами, такими как адриамицин. Для непрямого присоединения детектируемой или цитотоксической молекулы эта детектируемая или цитотоксическая молекула может быть конъюгирована с членом пары комплемент/антикомплемент, где другой член связан с этим связывающим полипептидом или частью антитела. Для этих целей примером комплементарной/антикомплементарной пары является биотин/стрептавидин.

В другом варианте гибридные белки полипептид-токсин или гибридные белки антитело-токсин могут быть использованы для нацеленного ингибирования или разрушения клетки или ткани (например, для обработки раковых клеток или тканей). Альтернативно, если связывающий полипептид имеет множественные функциональные домены (а именно, активирующий домен или лигандсвязывающий домен, плюс нацеливающий домен), гибридный белок, включающий в себя только нацеливающий домен, может быть пригодным для направления детектируемой молекулы, цитотоксической молекулы или комплементарной молекулы в представляющий интерес тип клеток или тканей. В тех случаях, когда гибридный белок только с единственным доменом включает в себя комплементарную молекулу, антикомплементарная молекула может быть конъюгирована с детектируемой или цитотоксической молекулой. Таким образом, такие гибридные белки, содержащие домен-комплементарную молекулу, представляют характерный для определенного типа клеток нацеливающий носитель для клетко/тканеспецифической доставки характерных для этого типа клеток конъюгатов антикомплементарно-детектируемых/цитотоксических молекул.

В другом варианте гибридные белки ζαΐρНа 11 -связывающий полипептид-цитокин или антителоцитокин могут быть использованы для усиления убивания т у1уо тканей-мишеней (например, раков крови, лимфоидов, ободочной кишки и костного мозга), если гибридсвязывающий полипептид-цитокин или антитело против /а1рка11 поражает гиперпролиферативную клетку (см., в общем, Ногшск е! а1., В1оой

- 32 006501

89:4437-47, 1997). Они описывают слитые белки, способные нацеливать цитокин в желаемый участок действия, обеспечивая посредством этого повышенную локальную концентрацию цитокина. Подходящие антитела против ζη1ρΗη11 поражают нежелательную клетку или ткань (т.е. опухоль или лейкоз), и слитый цитокин медиирует улучшенный лизис клетки-мишени эффекторными клетками. Подходящие цитокины для этой цели включают в себя, например, интерлейкин-2 и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (СМ-С8Е).

Альтернативно, слитые с 7а1рйа11-связывающим полипептидом или антителом белки, описанные здесь, могут быть использованы для усиления убивания ίη у1уо тканей-мишеней прямой стимуляцией модулируемого ζ;·ι1ρ1ι;·ι11 апоптотического пути, приводящего к некрозу гиперпролиферативных клеток, экспрессирующих ζ;·ι1ρ1ι;·ι11.

Биоактивные содержащие связывающий полипептид или антитело конъюгаты, описанные здесь, могут доставляться перорально, внутривенно, внутриартериально или внутрипротоково или могут быть введены локально в предполагаемом месте действия.

Состоящие из четырехспирального пучка цитокины, которые связываются с рецепторами цитокинов, а также другие белки, продуцируемые активированными лимфоцитами, играют важную биологическую роль в дифференцировке клеток, активации, рекрутинге и гомеостазе клеток во всем теле. Терапевтическая применимость включает в себя лечение заболеваний, которые требуют иммунной регуляции, в том числе аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, множественный склероз, тяжелая псевдопаралитическая миастения, системная красная волчанка и диабет. Антагонисты или агонисты /а1рйа11, в том числе растворимые рецепторы и природный лиганд, могут быть важными в регуляции воспаления и, следовательно, были бы полезны в лечении ревматоидного артрита, астмы, язвенного колита, воспалительного заболевания пищеварительного тракта, болезни Крона и сепсиса. Возможна роль антагонистов или агонистов 7а1рйа11, в том числе растворимых рецепторов и природного лиганда, в медиировании онкогенеза, и, следовательно, они были бы полезны в лечении рака. Антагонисты или агонисты 7а1рйа11, в том числе растворимые рецепторы и природный лиганд, могут быть потенциальными терапевтическими агентами в супрессии иммунной системы, что было бы важным для уменьшения отторжения трансплантата. Лиганд 7а1рйа11 может иметь применение в предупреждении реакции трансплантат против хозяина.

Альтернативно, антагонисты или агонисты 7а1рйа11, в том числе растворимые рецепторы и природный лиганд, могут активировать иммунную систему, что было бы важным в бустинге иммунитета к инфекционным заболеваниям, лечении пациентов с ослабленным иммунитетом, таких как ВИЧ+ пациенты, или в улучшении вакцин. В частности, антагонисты или агонисты 7а1рйа11, в том числе растворимые рецепторы и природный лиганд, могли бы модулировать, стимулировать или размножать ΝΚ-клетки или их потомство и могли бы обеспечивать терапевтическую пользу в лечении вирусных инфекций и в качестве антинеопластического фактора. Считается, что ΝΚ-клетки играют главную роль в элиминации метастатических опухолевых клеток, и пациенты как с метастазами, так и с твердыми опухолями имеют пониженные уровни активности NΚ-клеток (\У1Шек1бе е! а1., Сигг. Тор. МюгоЬю1. 1гптипо1. 230:221-244, 1998).

Полинуклеотиды, кодирующие полипептиды 7а1рйа11, применимы в способах генной терапии, где желательно увеличить или ингибировать активность /а1рйа11. Если млекопитающее имеет мутированный или отсутствующий ген 7а1рйа11, этот ген /а1рйа11 может быть введен в клетки этого млекопитающего. В одном варианте ген, кодирующий полипептид 7а1рйа11, вводят ίη у1уо в вирусном векторе. Такие векторы включают в себя аттенуированный или дефектный ДНК-вирус, такой как, но не ограничиваемый ими, вирус простого герпеса (Н8У), вирус папилломы, вирус Эпстайна-Барр (ЕВУ), аденовирус, аденоассоциированный вирус (ААУ) и т.п. Предпочтительными являются дефектные вирусы, которые полностью или почти полностью лишены вирусных генов. Дефектный вирус не является инфекционным после введения в клетку. Применение дефектных вирусных векторов делает возможным введение в клетки в специфической, локализованной зоне, без опасения по поводу того, что этот вектор может инфицировать другие клетки. Примеры конкретных векторов включают в себя, но не ограничиваются ими, вектор дефектного вируса простого герпеса 1 (Н8У1) (Кар1й! е! а1., Мо1ес. Се11. №игокс1., 2: 320-30, 1991), аттенуированный аденовирусный вектор, такой как вектор, описанный 8!гаЛогб-Ретсаибе! е! а1., ί. С1т. 1пуек!. 90; 626-30, 1992, и дефектный аденоассоциированный вирусный вектор (8ати1кк1 е! а1., ί. У1го1., 61: 3096101, 1987; 8ати1кк1 е! а1., 1. У1го1., 63; 3822-8, 1989).

В другом варианте ген 7а1рйа11 может быть введен в ретровирусном векторе, например, как описано в Апбегкоп е! а1., и.8. Ра!еп! №. 5 399 346; Мапп е! а1., Се11, 33:153, 1983; Тетт е! а1., и.8. Ра!еп! №. 4 650 764; Тетт е! а1., и.8. Ра!еп! №. 4 980 289; МагкоМР е! а1., 1. У1го1. 62:1120, 1988; Тетт е! а1., и.8. Ра!еп! №. 5 124 263; 1п!егпайопа1 Ра!еп! РиЬйсайоп №. У0 95/07358, риЬйкйеб Магсй 16, 1995 Ьу ОоидкеПу е! а1.; и Кио е! а1., В1ооб, 82:845, 1993. Альтернативно этот вектор может быть введен липофекцией ш У1уо с использованием липосом. Синтетические катионные липиды могут быть использованы для получения липосом для трансфекции ш у1уо гена, кодирующего маркер (Ее1дпег е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8с/ И8А, 84: 7413-7, 1987; Маскеу е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8ск И8А, 85: 8027-31, 1988). Использование липофекции для введения экзогенных генов в специфические органы ш у1уо имеет определенные практиче

- 33 006501 ские преимущества. Молекулярное нацеливание липосом в специфические клетки является одной областью преимущества. Более конкретно, направление трансфекции в конкретные клетки представляет одну область преимущества. Например, направление трансфекции в конкретные типы клеток было бы особенно выгодным в ткани с клеточной гетерогенностью, такой как поджелудочная железа, печень, почка и мозг. Липиды могут быть химически связаны с другими молекулами для нацеливания. Нацеленные пептиды (например, гормоны или нейротрансмиттеры). белки, такие как антитела, или непептидные молекулы могут быть связаны с липосомами химически.

Возможно удалить эти клетки из тела; ввести этот вектор в виде голой ДНК-плазмиды и затем повторно имплантировать эти трансформированные клетки в тело. Голые ДНК-векторы для генной терапии могут быть введены в желательные клетки-хозяева способами, известными в данной области, например трансфекцией, электропорацией, микроинъекцией, трансдукцией, клеточным слиянием, ДЭАЭдекстрановым способом, кальций-фосфатным осаждением, с использованием генного дробовика (шотган-способа) или с использованием переносчика ДНК-вектора. См.. например. Уи е! а1.. 1. Вю1. СНет. 267: 963-7. ΐ992: Уи е! а1.. 1. Вю1. СНет. 263:ΐ462ΐ-4. ΐ988.

Антисмысловая методология может быть использована для ингибирования транскрипции гена /а1рНа11, например, для ингибирования клеточной пролиферации ίη у1уо. Конструируются полинуклеотиды, которые комплементарны сегменту кодирующего /а1рНаИ полинуклеотида (например, полинуклеотида, представленного в 8Е6 ΙΌ N04) для связывания с кодирующей /а1рНаИ мРНК и ингибирования трансляции такой мРНК. Такие антисмысловые олигонуклеотиды применимы для ингибирования экспрессии кодирующих полипептиды /а1рНаИ генов в клеточной культуре или в субъекте.

Кроме того, в качестве молекулы клеточной поверхности полипептид /а1рНаИ может быть использован в качестве мишени для введения генной терапии в клетку. Это применение было бы полезным, в частности, для введения терапевтических генов в клетки, в которых обычно экспрессируется полипептид /а1рНаИ. такие как лимфоидная ткань и РВЬ или раковые клетки, которые экспрессируют полипептид /а1рНаИ. Например, вирусная генная терапия, описанная выше, может быть нацелена на специфические типы клеток, в которых экспрессируется клеточный рецептор, такой как полипептид /а1рНаИ. а не вирусный рецептор. Антитела или другие молекулы, которые узнают молекулы /а1рНаИ на поверхности клетки-мишени, могут быть использованы для направления этого вируса для инфицирования и введения генного терапевтического материала в эту клетку-мишень. См. Уоо. 8.Б.С.. №!иге Вю!есН. ΐ4:ΐ538. ΐ996: ХУюкНат. Τ.Ι е! а1.. №!иге Вю!есН. ΐ4:ΐ570-ΐ573. ΐ996: Ооид1ак. ΙΤ. е! а1.. №!иге Вю!есН. ΐ4:ΐ574ΐ578. ΐ996: КлНоуа. В.. Сгй. Кеу. ВюйсНпоР ΐ7:ΐ49-ΐ69. ΐ997 и У11е. К.6. е! а1.. Мо1. Меб. Щбау 4:84-92. ΐ998. Например, биспецифическое антитело, содержащее вирус-нейтрализующий РаЬ-фрагмент, связанный с ха1р11а11 -специфическим антителом, может быть использовано для направления этого вируса к клеткам, экспрессирующим рецептор /а1рНа11, и позволит эффективно ввести этот вирус, содержащий генетический элемент, в клетки. См., например, У1скНат. ΤΤ.. е! а1.. 1. У1го1. 7ΐ:7663-7669. ΐ997 и УюкНат. Τ.Ρ. е! а1.. 1. У1го1. 70:683ΐ-6838. ΐ996.

Данное изобретение обеспечивает также реагенты, которые найдут применение в диагностических приложениях. Например, ген /а1рНаИ. зонд, содержащий ДНК или РНК /а1рНаИ или их субпоследовательность, могут быть использованы для определения, присутствует ли ген /а1рНаИ на хромосоме ΐ6 или имела ли место мутация. 2а1рНаИ локализован в районе 16р11.1 хромосомы ΐ6 (см. пример 3). Детектируемые хромосомные аберрации в локусе гена /а1рНаИ включают в себя, но не ограничиваются ими, анеуплоидию, изменения копийности гена, инсерции, делеции, изменения сайтов рестрикции и реаранжировки. Такие аберрации могут быть детектированы с использованием полинуклеотидов данного изобретения путем применения молекулярно-генетических способов, таких как анализ полиморфизма длины фрагментов рестрикции (КЕЬР). флуоресцентных способов гибридизации ίη кРи, анализа коротких тандемных повторов (δΤΚ) с использованием ПЦР-способов и других способов анализа генетического сцепления, известных в данной области (8атЬгоок е! а1.. 1Ь16: ΑиκиЬе1 е! а1.. 1Ь16: Манан. СНек! ΐ08:25565. ΐ995).

Точное знание положения гена может быть полезным для ряда целей, в том числе ΐ) определения, является ли последовательность частью существующего контига, и получения дополнительных окружающих генетических последовательностей в различных формах, таких как ΥΑΟ, ВАС или кДНКклоны; 2) обеспечения возможного гена-кандидата для наследственного заболевания, который обнаруживает сцепление с тем же самым хромосомным районом; и 3) перекрестно-ссылочных модельных организмов, таких как мышь, которые могут способствовать определению, какую функцию может иметь конкретный ген.

Ген /а1рНа11 локализован в районе 16р11.1 хромосомы ΐ6. Несколько генов известной функции картированы в этом районе. Например, альфа-субъединица рецептора цитокина (1Ь-4). члена семейства рецепторов гемопоэтина, картирована в 16р12.1-р11.2. Эта субъединица может образовывать гетеродимер с /а1рНаИ. Кроме того, зонды полинуклеотида /а1рНаИ могут быть использованы для обнаружения отклонений от нормы или генотипов, связанных с дефектами в рецепторе 1Ь-4. например таких, которые участвуют в некоторых аллергических воспалительных нарушениях и астме (ПеюНтащ К.А. е! а1.. Ехр. Л11егду 28:ΐ5ΐ-ΐ55: ΐ998: Мйкиуаки. Н. е! а1.. №!иге Сене!. ΐ9:ΐΐ9-ΐ20. ΐ998). Кроме того, зонды поли

- 34 006501 нуклеотида ха1рНа11 могут быть использованы для детектирования отклонений от нормы или генотипов, связанных с воспалительным заболеванием пищеварительного тракта, где маркер восприимчивости картирован на 16р12щ13 (СНо, кН. е! а1., Ргос. №111. Асаб. 8с1. 95:7502-7507, 1998). Далее, зонды полинуклеотида ха1рНа11 могут быть использованы для детектирования отклонений от нормы или генотипов, связанных с локусами гемоглобина, локализованными в 16р!ег-р13.3, и в частности дефектов гемоглобина альфа, ассоциированных с синдромами альфа-талассемии, такими как иммунная водянка плода (обзор СНш, М.Р. апб Уауе, 1.8. В1ооб 91:2213-2222, 1998). Кроме того, среди других генных локусов, локусы для опухоли Вильмса, типа III (16с|), синдрома КнЬепк!ет-ТауЬ1 (16р13.3), тяжелого поликистозного заболевания детей (16р13.3), все проявляются в патологических состояниях человека, а также картированы в этом районе генома человека. См. Оп1те МепбеШап IпНегНапсе о£ Мап (ОМ!М) депе тар и ссылки в ней, в отношении этого района хромосомы 16 на общественно доступном сервере \У\У\У (1111р://\\л\лу3. ЫсЬ1. N1111. N111. Соу/Н1Ып-рок1/От1т/де1тар? СЬготокоте=16р11.1). Все эти гены служат возможными генами-кандидатами для наследственных болезней, которые обнаруживают сцепление с одним и тем же хромосомным районом, в котором находится ген ха1рНа11.

Подобным образом, дефекты в самом локусе ха1рНа11 могут приводить к наследственному патологическому состоянию человека. Молекулы данного изобретения, такие как полипептиды, антагонисты, агонисты, полинуклеотиды и антитела данного изобретения, могли бы способствовать детектированию, предупреждению диагноза и лечению, связанным с генетическим дефектом ха1рНа11.

Мыши, сконструированные для экспрессии гена ха1р11а1Е называемые трансгенными мышами, и мыши, которые обнаруживают полное отсутствие функции гена ха1рНа11, называемые мышами с нокаутом (гена), также могут быть получены (8пои\\'аег1 е! а1., 8с1епсе 257: 1083, 1992; Ьо^е11 е! а1., Ыа!иге 366: 740-42, 1993; СарессЫ, М.К., 8с1епсе 244:1288-1292, 1989; Ра1тйег, Κ.Ό. е! а1., Аппи. Кеу. Сепе!. 20:465-499, 1986). Например, трансгенные мыши, которые сверхэкспрессируют ха1рНа11, либо повсюду, либо под контролем тканеспецифического промотора или рестриктированного в отношении ткани промотора, могут быть использованы для выяснения, обусловливает ли сверхэкспрессия определенный фенотип. Например, сверхэкспрессия полипептида ха1рНа11 дикого типа, фрагмента полипептида или его мутанта может изменять нормальные клеточные процессы, приводя к фенотипу, который идентифицирует ткань, в которой экспрессия ха1рНа11 является функционально релевантной, и может указывать на терапевтическую мишень для ха1рНа11, его агонистов или антагонистов. Например, предпочтительной трансгенной мышью для «конструирования» является мышь, которая экспрессирует «доминантнонегативный» фенотип, такой, при котором сверхэкспрессируется внеклеточный цитокинсвязывающий домен ха1рНа11 с присоединенным трансмембранным доменом (приблизительно аминокислоты 20 (Сук)25 (Ьеи) 8ЕО ГО ЫО:2). Кроме того, такая сверхэкспрессия может приводить к фенотипу, который обнаруживает сходство с заболеваниями человека. Подобным образом, мыши с нокаутом ха1рНа 11 могут быть использованы для определения, где ха1рНа11 является абсолютно необходимым ш у1уо. Фенотип мышей с нокаутом предсказывает эффекты т у1уо, которые может иметь антагонист ха1рНа11, такой как описанные здесь. кДНК мышиного или человеческого ха1рНа11 может быть использована для выделения мышиной мРНК, кДНК или геномной ДНК ха1рНа11, которые затем используют для получения мышей с нокаутом гена. Эти мыши могут быть использованы для исследования гена ха1рНа11 и белка, кодируемого им, в системе т у1уо и могут быть использованы в качестве моделей т у1уо для соответствующих заболеваний человека. Кроме того, экспрессия трансгенными мышами антисмысловых полинуклеотидов ха1рНа11 или направленных против ха1рНа11 рибозимов, описанных здесь, может быть использована аналогично экспрессии трансгенных мышей, описанной выше.

Для фармацевтического применения растворимые рецепторные полипептиды данного изобретения готовят для парентеральной, в частности внутривенной или подкожной, доставки в соответствии с общепринятыми способами. Внутривенное введение может быть болюсной инъекцией или инфузией на протяжении обычного периода времени одного-нескольких часов. Обычно фармацевтические композиции будут включать в себя растворимый рецепторный полипептид ха1рНа11 в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, таким как солевой раствор, забуференный солевой раствор, 5% декстроза в воде или т.п. Композиции могут дополнительно содержать один или несколько наполнителей, консервантов, солюбилизаторов, буферящих агентов, альбумин для предупреждения потери белка на поверхностях флаконов и т.д. Способы приготовления композиций хорошо известны в данной области и описаны, например, в Кеттд!оп: ТНе 8с1епсе апб Ргасйсе о£ РНагтасу, Сеппаго, еб., Маск РиЬНкЫпд Со., Еак!оп, РА, 19^!1 еб., 1995. Терапевтические дозы обычно будут находиться в диапазоне от 0,1 до 100 мкг/кг массы тела в сутки, предпочтительно 0,5-20 мг/кг в сутки, причем точная доза должна определяться врачом в соответствии с принятыми стандартами, с учетом природы и тяжести подлежащего лечению состояния, особенностей пациента и т.д. Определение дозы находится в пределах обычной квалификации специалиста в данной области. Белки могут вводиться, для остро требующегося лечения, на протяжении 1 недели или менее, часто на протяжении периода 1 -3 дней или могут вводиться, в продолжительном лечении, на протяжении нескольких месяцев или лет. Обычно, терапевтически эффективное количество растворимого рецепторного полипептида ха1рНа11 составляет количество, достаточное для получения клинически значимого эффекта.

- 35 006501

Далее данное изобретение иллюстрируется следующими ниже неограничительными примерами.

Примеры

Пример 1. Идентификация 7а1рЬа11 человека с использованием Е8Т-последовательности для получения полноразмерного ζαφΕαΠ.

Сканирование базы данных транслируемых ДНК привело к идентификации маркерной экспрессирующейся последовательности (Е8Т), которая оказалась членом семейства рецепторов цитокинов класса Ι и была названа ζα^ΙαΟ.

Подтверждение этой Е8Т-последовательности было выполнено анализом последовательности кДНК, из которой происходила эта Е8Т. Этот кДНК-клон был получен и секвенирован с использованием следующих праймеров: 2С 447 (8 ЕС) ΙΌ N0:5), 2С 976 (8 ЕС) ΙΌ N0:6), 2С 19345 (8 ЕС) ΙΌ N0:7), 2С 19346 (8ЕС) ΙΌ N0:8), 2С 19349 (8ЕС) ΙΌ N0:9), 2С 19350 (8Е() ΙΌ N0:10), 2С 19458 (8ЕС) ΙΌ N0:11), 2С 19459 (8Е() ΙΌ N0:12), 2С 19460 (8ЕС) ΙΌ N0:13), 2С 19461 (8ЕС) ΙΌ N0:14), 2С 19572 (8ЕС) ΙΌ N0:15), 2С 19573 (8ЕЦ ΙΌ N0:16), 2С 19657 (8ЕЦ ΙΌ N0:17). Вставка (инсерция) была 2945 п.н. и была полноразмерной.

Пример 2. Тканевое распределение.

Нозерн-блот-анализы проводили с использованием Нозерн™ блотов множественных тканей человека (МТN Ι, МТN ΙΙ и МТN ΙΙΙ) (С1оп!ес1). кДНК, описанные в примере 1, использовали в ПЦР-реакции с использованием олигонуклеотидов (олиго) 2С 19181 (8ЕЦ ΙΌ N0:18) и 2С 19182 (8ЕЦ ΙΌ N0:19) в качестве праймеров. Условия ПЦР были следующими: 94°С в течение 1,5 мин; 35 циклов при 94°С в течение 15 с, затем 68°С в течение 30 с; 72°С в течение 10 мин; 4°С в течение ночи. Пробу продукта ПЦР-реакции подвергали электрофорезу на 1,5% агарозном геле. Наблюдали полосу ожидаемого размера 175 п.н. ПЦР-фрагмент 175 п.н. очищали на геле с использованием коммерчески доступного набора (Р1аехП™; Ц/адеп) и затем радиоактивно метили ³²Р-бСТР с использованием Реб|рпте ΙΙ™ (АтегкИат), системы мечения со случайным праймированием, в соответствии с описаниями изготовителя. Затем зонд очищали при помощи колонки Мю-Тгар'¹™ (81га!адепе) в соответствии с инструкциями изготовителя. Раствор ЕхргеккНуЬ™ (С1оп!есИ) использовали для предгибридизации и в качестве гибридизационного раствора для Нозернблотов. Гибридизация имела место в течение ночи при 65°С с использованием 1-2х10⁶ имп./мин/мл меченого зонда. Затем блоты промывали 4 раза в течение 15 мин в 2Х 88С/1% ДСН при 25°С с последующим промыванием в 0,1Х 88С/0,1 ДСН при 50°С. Транскрипты приблизительно 3 т.п.н. и 5 т.п.н. детектировали в лимфатическом узле, лейкоцитах периферической крови и вилочковой железе (тимусе).

Дот-блоты получали с использованием блотов Нитап РКА Мак!ег В1о!к™ (С1оп!есИ). Способы и условия для дот-блотов были такими же, что и условия для блотов множественных тканей, описанных выше. Дот-блот имел наиболее сильный сигнал в тимусе, лимфатическом узле и селезенке.

Нозерн-анализ проводили также с использованием клеточной линии МТ^™ рака человека (С1оп!есИ). кДНК, описанную в примере 1, использовали в ПЦР-реакции с применением олиго 2С 19907 (8ЕЦ ΙΌ N0:20) и 2С 19908 (8ЕЦ ΙΌ N0:21) в качестве праймеров. Условия ПЦР были следующими: 35 циклов при 95°С в течение 1 мин, затем 60°С в течение 1 мин; 72°С в течение 1,5 мин; 4°С в течение ночи. Пробу продукта ПЦР-реакции подвергали электрофорезу на 1,5% агарозном геле. Наблюдали полосу ожидаемого размера 1,2 т.п.н. ПЦР-фрагмент 1,2 т.п.н. очищали на геле с использованием коммерчески доступного набора ((^аРшскП™ Се1 Ехйасйоп Кй; Ц/адеп) и затем радиоактивно метили ³²Р-бСТР с использованием Рпте-Ι! ΙΙ™ (81га!адепе), системы мечения со случайным праймированием, в соответствии с описаниями изготовителя. Затем зонд очищали при помощи колонки №.1с-Тгар™ (8!га!адепе) в соответствии с инструкциями изготовителя. Раствор ЕхргеккНуЬ™ (С1оп!есИ) использовали для предгибридизации и в качестве гибридизационного раствора для Нозерн-блотов. Гибридизация имела место в течение ночи при 65°С с использованием 1-2х10⁶ имп./мин/мл меченого зонда. Затем блоты промывали 4 раза в течение 15 мин в 2Х 88С/1% ДСН при 25°С с последующими двумя 30-минутными промываниями в 0,1Х 88С/0,1 ДСН при 50°С. Сильный сигнал наблюдали в клеточной линии Ка_ц, полученной из лимфомы Беркитта.

Пример 3.

Хромосомное картирование гена ζα1ρНа 11 на основе ПЦР.

2а1рНа 11 картировали на хромосоме 16 с использованием коммерчески доступной панели «СепеВпбде 4 Каб1а!юп НуЬпб Рапе1» (РекеагсН Сепейск, Ιμ., Нипк(кмП1е, АЬ). СепеВпбде 4 Каб1айоп НуЬпб Рапе1 содержит пригодные для ПЦР ДНК из каждого из 93 радиационных (облученных) гибридных клонов, плюс две контрольные ДНК (НЕЬ-донор и А23-реципиент). Общественно доступный сервер \ν\ν\ν (1Шр://\\л\л\-депоте. νί. Мй. Еби/сд1Ьш/сопйд/гйтаррег.р1) позволяет картирование относительно карты радиационных гибридов генома человека (карты радиационных гибридов «ΧνΙί,ΌΡ») Центра исследований генома ^НйеНеаб Iηκ!^!и!е/МIТ Сеп!ег £ог Сепоте РекеагсН, которая была сконструирована с использованием панели радиационных гибридов СепеВпбде 4 Раб/аРом НуЬпб Рапе1.

Для картирования гена 7а1рЬа11 с панелью СепеВпбде 4 РН Рапе1 реакции по 20 мкл устанавливали в 96-луночном микротитрационном планшете (81га1адепе, Ьа 1о11а, СА) и использовали термоциклер РоЬоСус1ег Сгаб1еп! 96 (8!га!адепе). Каждая из этих 95 ПЦР-реакций состояла из 2 мкл 10Х реакционного буфера для ПЦР-реакции (С1оп!есН ЬаЬога!ог1ек, Шс., Ра1о А1!о, СА), 1,6 мкл смеси бЭТР (2,5 мМ каждый,

- 36 006501

РЕККШ-ЕЬМЕВ, Еок!ег Сйу, СА), 1 мкл смыслового праймера 2С 19954 (8ЕО ΙΌ N0:22), 1 мкл антисмыслового праймера 2С 19955 (8Е0 ΙΌ N0:23), 2 мкл Кеб1Ьоаб (Кекеагсй Сепейск, 1пс., Нип!ку111е, АЬ), 0,4 мкл 50Х смеси Абуап!аде К1епТас| Ро1утегаке (С1оп!ес1), 25 нг ДНК из индивидуального гибридного клона или контроля и ббН20 для общего объема 20 мкл. На реакции наслаивали равное количество минерального масла и их герметизировали. Условия ПЦР-циклера были следующими: 1 начальный цикл 4минутной денатурации при 94°С, 35 циклов 45 с при 94°С, 45 с при 68°С и 1 мин при 72°С; с последующими 7 мин при 72°С. Реакции разделяли электрофорезом на 2% агарозном геле (ЫГе Тесйпо1о§1ек).

Результаты показали, что 2а1рйа11 картируется 9,54 сВ_3000 от каркасного маркера νΙ-3768 на хромосоме 16 карты радиационных (облученных) гибридов \У1ССР. Проксимальный и дистальный каркасные маркеры были ^У1-3768 и ТЮВ-А002К05, соответственно. Применение окружающих маркеров помещает ха1р11а11 в район 16р11.1 на интегрированной карте ЬЬВ хромосомы 16 (Т1е Сепебс Ьосабоп Па!аЬаке, Ишуегкйу оГ 8ои11111атр1оп, сервер \ν\ν\ν: (ййр://себаг.депебск.ко!оп.ас.ик/риЬ11с_Ыт1/).ко!оп.ас.ик/риЬ11с_Ыт1/).

Пример 4. Конструирование химеры полипептидов человека МРЬ-ха1р11а11: внеклеточный и ТМдомен МРЬ, слитые с внутриклеточным передающим сигнал доменом ха1р11а11.

Внеклеточный и трансмембранный домены МРЬ-рецептора выделяли из плазмиды, содержащей МРЬ-рецептор плазмиды (РН21/МРБ) с использованием ПЦР с праймерами ΖΟ7212 (8Е0 ΙΌ N0:24) и ΖΟ9914 (8Е0 ΙΌ N0:25). Условия реакции были следующими: 95°С в течение 1 мин; 35 циклов при 95°С в течение 1 мин, 45°С в течение 1 мин, 72°С в течение 2 мин; затем 72°С в течение 10 мин; затем пропитывание при 1 0°С. ПЦР-продукт подвергали электрофорезу на 1% агарозе с низкой точкой плавления (Воейппдег Маппйет, Шбхапаройк, Ш) и фрагмент МРЬ-рецептора приблизительно 1,5 т.п.н. выделяли с использованием набора для экстракции гелей О|ас.|шск'™ (О|адеп) согласно инструкциям изготовителя.

Внутриклеточные домены ха1р11а11 выделяли из плазмиды, содержащей кДНК рецептора ха1рНа11, с использованием ПЦР с праймерами ΖΟ9913 (8Е0 ΙΌ N0:26) и ΖС20097 (8Е0 ΙΌ N0:27). Полинуклеотидная последовательность, соответствующая кодирующей ха1рНа 11 -рецептор последовательности, показана в 8Е0 Ш N0:1 от нуклеотида 69 до нуклеотида 1682. Условия реакции были такие же, что и описанные выше. ПЦР-продукт подвергали электрофорезу на 1% агарозе с низкой точкой плавления (Воейбпдег Маппйейп) и фрагмент ха1р11а11 приблизительно 900 т.п.н. выделяли с использованием набора для экстракции гелей О|ас.|шск согласно инструкциям изготовителя.

Каждый из выделенных фрагментов, описанных выше, смешивали при отношении объемов 1 : 1 и использовали в ПЦР-реакции с применением ΖΟ7212 (8Е0 ΙΌ N0:24) и ΖС20097 (8Е0 ΙΌ N0:27) для создания химеры МРЬ-ха1р11а11. Условия реакции были следующими: 95°С в течение 1 мин; 35 циклов при 95°С в течение 1 мин; 55°С в течение 1 мин, 72°С в течение 2 мин; затем 72°С в течение 10 мин; затем пропитывание при 1 0°С. Полный ПЦР-продукт подвергали электрофорезу на 1% агарозе с низкой точкой плавления (Воейппдег Маппйет) и химерный фрагмент МРЬ-ха1р11а11 приблизительно 2,4 т.п.н. выделяли с использованием набора для экстракции гелей О|ас.|шск^|Л| (О|адеп) согласно инструкциям изготовителя. Химерный фрагмент МРЬ-ха1р11а 11 расщепляли ЕсоЫ (ВВЬ) и ХЫй (Воейппдег Маппйейп) согласно инструкциям изготовителя. Весь продукт расщепления подвергали электрофорезу на 1% агарозе с низкой точкой плавления (Воейппдег Маппйет) и отщепленную химеру МРЬ-ха1р11а11 выделяли с использованием набора для экстракции гелей О|ас.|шск^|Л| (О|адеп) согласно инструкциям изготовителя. Полученную отщепленную химеру МРЬ-ха1р11а11 встраивали в экспрессирующий вектор, как описано ниже.

Реципиентный экспрессирующий вектор рΖР-5N расщепляли ЕсоШ (ВВЬ) и НтбШ (ВВЬ) согласно инструкциям изготовителя и очищали на геле, как описано выше. Этот векторный фрагмент объединяли с отщепленной ЕсоШ и ХЬа! химерой МРЬ-ха1р11а11, выделенной, как описано выше, и ХЬаЕШпбШлинкерным фрагментом в реакции лигирования. Лигирование проводили с лигазой Т4 (ВКЬ) при 15°С в течение ночи. Пробу лигирования подвергали электрофорезу в электрокомпетентных относительно ОН 10В Е1ес!гоМАХ™ клетках Е. сой (25 мкФ, 200 Ом, 2,3 В). Трансформанты высевали на чашки с ЬВ+ампициллин и отдельные колонии подвергали скринингу при помощи ПЦР для подтверждения химеры МРЬ-ха1р11а 11 с использованием ΖΟ7212 (8Е0 ΙΌ N0:24) и ΖС20097 (8Е0 ΙΌ N0:27) с применением условий ПЦР, описанных выше.

Подтверждение последовательности химеры МРЬ-ха1р11а11 выполняли при помощи анализов последовательности с использованием следующих праймеров: Ζ02700 (8Е0 ΙΌ N0:28), ΖС5020 (8Е0 ΙΌ N0:29), ΖС6675 (8 ЕС) ΙΌ N0:30), ΖС7727 (8 ЕС) ΙΌ N0:31), ΖС8290 (8 ЕС) ΙΌ N0:32), ΖΌ19572 (8 ЕС) ΙΌ N0:15), ΖС6622 (8ЕС) ΙΌ N0:33), ΖС7736 (8ЕС) ΙΌ N0:34) и ΖС9273 (8ЕС) ΙΌ N0:35). Вставка была приблизительно 2,4 т.п.н. и была полноразмерной.

Пример 5. Пролиферация на основе химеры МРЬ-ха1р11а11 в ВАЕ3-тесте с использованием А1атаг В1ие.

А. Конструирование клеток ВаЕ3, экспрессирующих химеру МРЬ-ха1р11а11.

ВаЕ3, интерлейкин-3- (ШЩ-зависимую прелимфоидную клеточную линию, полученную из мышиного костного мозга (Ра1асюк апб 8!е1пте!7, Се11 41:727-734, 1985; Ма!йеу-Ргеуо! е! а1., Мо1. Се11. Вю1. 6:4133-4135, 1986), поддерживали в полной среде (среде ВР/Ш (ГВН Вюкаепсе Шс., Ьепеха, К8), допол

- 37 006501 ненной 10% инактивированной нагреванием фетальной телячьей сывороткой, 2 нг/мл мышиного ЕЬ-3 (шЕЬ-3) (В & Ό, М1ппеаро11к, МЦ), 2 мМ Ь-д1и1аМах-1™ (С1Ьсо ΒΕΣ), 1 мМ пируватом натрия (С1Ьсо ΒΕΣ) и ΡδΝ-антибиотиками (С1Ьсо ΒΕΣ)) . Перед электрофорезом ДНК р2Р-5^МРЕ-ха1р11а 11 (пример 4) получали и очищали с использованием набора Р|адеп Мах1 Ргер к1! (Р|адеп) согласно инструкциям изготовителя. Клетки ΒаΕ3 для электропорации промывали 1 раз в среде ВРМЕ и затем ресуспендировали в среде ВРМЕ при плотности клеток 10⁷ клеток/мл. 1 мл ресуспендированных клеток ΒаΓ3 смешивали с 30 мкг ДНК плазмиды р2Р-5^МРЕ-ха1р11а11 и переносили в отдельные одноразовые камеры для электропорации (С1Ьсо ΒΕΕ). После 15-минутного инкубирования при комнатной температуре клетки подвергали двум последовательным электрошокам (800 МФ/300 В; 1180 МФ/300 В), подаваемым прибором для электропорации (СЕЬЬ-Р0ЕАТ0Е™; С1Ьсо ΒΕΕ). После 5 мин восстановления до нормы электропорированные клетки переносили в 50 мл полной среды и помещали в термостат на 15-24 ч (37°С, 5% С0₂). Затем эти клетки откручивали и ресуспендировали в 50 мл полной среды, содержащей Сеиейсш™ (С1Ьсо) для отбора (500 мкг/мл С418) в колбу Т-162 для выделения С418-резистентного пула. Пулы трансфицированных клеток ΒаΕ3, далее называемых клетками ΒаΓ3/ΜΡ^-ζа1рйа11, анализировали на способность передачи сигнала, как описано ниже.

В. Тестирование способности передачи сигнала клеток ΒаΕ3/ΜΡ^-ζа1рйа11 с использованием теста пролиферации с А1атаг Β1ικ.

Клетки ΒаΕ3/ΜΡ^-ζа1р11а11 откручивали и промывали в полной среде, как описано выше, но без тЕЬ-3 (далее называемой «не содержащей тЕЬ-3 средой»). Клетки откручивали и промывали 3 раза для гарантии удаления тЕЬ-3. Затем клетки считали в гемоцитометре. Клетки высевали в 96-луночный планшет при 5000 клеток на лунку в объеме 100 мкл на лунку с использованием не содержащей тЕЬ-3 среды.

Пролиферацию клеток ΒаΕ3/ΜΡ^-ζа1рйа11 оценивали с использованием тромбопоэтина (ТРО), разведенного не содержащей тЕЬ-3 средой до концентраций 500, 250, 125, 62 нг/мл, 30, 15, 7,5, 3,75, 1,8, 0,9, 0,5 и 0,25 нг/мл. 100 мкл разведенного ТРО добавляли к клеткам ΒаΕ3/ΜΡ^-ζа1рΗа11. Общий объем теста равен 200 мкл. Негативные контроли оценивали параллельно с использованием только не содержащей тЕЬ-3 среды, без добавления ТРО. Тест-планшеты инкубировали при 37°С, 5% С0₂ в течение 3 дней, после чего добавляли А1атаг Β1ικ (Асситеб, СЫсадо, ЕЬ) при 20 мкл на лунку. А1атаг Β1ικ дает флуорометрические показания на основе числа живых клеток и является, следовательно, прямым измерением пролиферации клеток в сравнении с негативным контролем. Планшеты опять инкубировали при 37°С, 5% С0₂ в течение 24 ч. Планшеты считывали на планшет-ридере Етах™ (Мо1еси1аг Эеу1сек Випиууа1е, СА) с использованием программы ВойМах™ Рго при длинах волн 544 (возбуждение) и 590 (эмиссия).

Результаты подтвердили способность передачи сигнала внутриклеточной части /а1рНа 11 -рецептора, так как тромбопоэтин индуцировал пролиферацию приблизительно в 10 раз более высокую, чем уровень фона, при 62 нг/мл и больших концентрациях.

Пример 6. Конструирование экспрессирующего вектора, экспрессирующего полноразмерный /а1рНа11.

Полный /а1р11а 11 -рецептор выделяли из плазмиды, содержащей кДНК /а1р11а 11 -рецептора, при помощи ПЦР с использованием праймеров ΖΟ9905 (ВЕР ГО N0:36) и ΖΟ9906 (ВЕР ГО N0:37). Условия реакции были следующими; 95 °С в течение 1 мин; 35 циклов при 95°С в течение 1 мин; 55°С в течение 1 мин, 72°С в течение 2 мин; затем 72°С в течение 10 мин; затем пропитывание при 10°С. ПЦР-продукт подвергали электрофорезу на 1% агарозе с низкой точкой плавления (Βοей^^ηде^ Маппйет) и кДНК /а1р11а11 приблизительно 1,5 т.п.н. выделяли с использованием набора для экстракции гелей Р|ас.|шск^т™ (Р1адеи) согласно инструкциям изготовителя.

Очищенную кДНК /а1р11а11 расщепляли ΒатΗЕ (ΒοеЬ^^ηде^ Маппйет) и ЕсоЕЕ (ΒΕΕ) согласно инструкциям изготовителя. Весь продукт расщепления подвергали электрофорезу на 1% агарозе с низкой точкой плавления (Βοей^^пде^ Маппйеип) и очищали отщепленный фрагмент /а1р11а11 с использованием набора для экстракции гелей Р|ас.|шск согласно инструкциям изготовителя. Полученный отщепленный /а1рЬа 11 -фрагмент встраивали в экспрессирующий вектор, как описано ниже.

Реципиентный экспрессирующий вектор рΖΡ-5N расщепляли ΒатΗЕ (ΒοеЬ^^ηде^ Маппйет) и ЕсоШ (ΒΕΕ) согласно инструкциям изготовителя и очищали на геле, как описано выше. Этот векторный фрагмент объединяли с отщепленным ΒатΗЕ (ΒοеЬ^^ηде^ Маппйет) и ЕсоЕ1 (ВЕЬ) /а1рЬа 11 -фрагментом, выделенным, как описано выше, в реакции лигирования. Лигирование проводили с лигазой Т4 (ΒΕΕ) при 15°С в течение ночи. Пробу лигирования подвергали электрофорезу в электрокомпетентных относительно ^Η10Β Е1есйоМАХ™ клетках Е. сой (25 мкФ, 200 Ом, 2,3 В). Трансформанты высевали на чашки с ЬВ+ампициллин и отдельные колонии подвергали скринингу при помощи ПЦР для подтверждения последовательности /а1р11а11 с использованием ΖΟ9905 (ВЕР ГО N0:36) и ΖΟ9906 (ВЕР ГО N0:37) с применением условий ПЦР, описанных выше.

Подтверждение последовательности МРЬ-ха1рйа11 выполняли при помощи анализов последовательности с использованием следующих праймеров: Ζί.Ί2700 (ВЕР ГО N0:28), ΖС5020 (ВЕР ГО N0:29), ΖС20114 (ВЕР ГО N0:38), ΖΟ19459 (ВЕР ГО N0:12), ΖΟ19954 (ВЕР ГО N0:39) и ΖС20116 (ВЕР ГО N0:40). Вставка была приблизительно 1,6 т.п.н. и была полноразмерной.

- 38 006501

Пример 7. Пролиферация на основе ζа1рйа11 в ВЛР3-тесте с использованием А1атаг В1ие.

Л. Конструирование клеток ВаР3, экспрессирующих ζа1рйа11 -рецептор.

Клетки ВаР3, экспрессирующие полноразмерный ζа1рйа11 -рецептор, конструировали, как в примере 5Л выше, с использованием 30 мкг экспрессирующего вектора ζа1рйа11, описанного в примере 6 выше. Клетки ВаР3, экспрессирующие мРНК ζαΐρΐια 11-рецептора, были названы ВаР3^а1рйа 11. Эти клетки использовали для скрининга на активность ζа1рйа11. как описано ниже в примерах 8 и 12.

Пример 8. Скрининг активности ζа1р11а11 с использованием клеток ВаР3^а1рйа11 при помощи теста пролиферации с А1атаг В1ие.

Л. Источник первичных клеток обезьяны, используемый для тестирования на присутствие активности ζа1рйа11.

Кондиционированную среду от первичных клеток селезенки обезьяны использовали для тестирования на присутствие активности, как описано ниже. Клетки селезенки обезьяны активировали 5 нг/мл форбол12-миристат-13-ацетата (ФМЛ) (Са1Ьюсйет, 8аи Б1едо, СЛ) и 0,5 мкг/мл иономицина™ (Са1Ыосйет) в течение 72 ч. Супернатант от этих стимулированных клеток селезенки обезьяны использовали для анализа пролиферации клеток ВаР3^а1рйа11, как описано ниже.

B. Скрининг на активность ζа1р11а11 с использованием клеток ВаР3^а1рйа11 при помощи теста пролиферации с А1атаг В1ие.

Клетки ВаР3^а1рйа11 откручивали и промывали в не содержащей тРБ-3 среде. Клетки откручивали и промывали 3 раза для гарантии удаления тГБ-3. Затем клетки считали в гемоцитометре. Клетки высевали в 96-луночный планшет при 5000 клеток на лунку в объеме 100 мкл на лунку с использованием не содержащей ιη1-3 среды.

Пролиферацию клеток ВаР3^а1рйа11 оценивали с использованием кондиционированной среды от активированных клеток селезенки обезьяны (см. пример 8Л выше), которая была разведена не содержащей тШ-3 средой до концентраций 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,5, 0,75 и 0,375%. 100 мкл разведенной кондиционированной среды добавляли к клеткам ВаР3^а1рйа11. Общий объем теста равен 200 мкл. Тестпланшеты инкубировали при 37°С, 5% С0₂ в течение 3 дней, после чего добавляли А1атаг В1ие (Асситеб, СЫсадо, ГБ) при 20 мкл на лунку. Планшеты опять инкубировали при 37°С, 5% СО₂ в течение 24 ч. Планшеты считывали на планшет-ридере Ртах™ (Мо1еси1аг Беукек), как описано выше.

Результаты подтвердили пролиферативный ответ клеток ВаР3/2а1рйа11 на фактор, присутствующий в активированных кондиционированных средах клеток селезенки обезьяны. Этот ответ согласно измерениям был приблизительно в 4 раза выше фона при концентрации 50%. Клетки ВаР3 дикого типа не пролиферировали в ответ на этот фактор, что указывает на то, что этот фактор является специфическим для 2а1рйа 11-рецептора.

C. Источник первичных клеток человека, используемый для выделения активности ζа1рйа11.

По 100 мл крови брали из шести доноров. Кровь извлекали с использованием 10Х 10 мл вакуумных пробирок (уаси!а1иег), содержащих гепарин. Кровь объединяли из шести доноров (600 мл), разводили 1:1 в ЗФР и разделяли с использованием ИсоП-Радие® РББ8 (Рйагтааа Вю1есБ Иррка1а, 8^ебеи). Выход выделенных первичных клеток человека после разделения на градиенте фиколла был равен 1,2х10⁹ клеток.

Клетки суспендировали в 9,6 мл буфера МАС8 (ЗФР, 0,5% ЭДТЛ, 2 мМ ЭДТЛ). 1,6 мл клеточной суспензии извлекали и добавляли 0,4 мл микрогранул СБ3 (М11!еиу1 Вю!ес. АиЬиги, СЛ). Смесь инкубировали в течение 15 мин при 4°С. Клетки, меченные гранулами СБ3, промывали 30 мл буфера МАС8 и затем ресуспендировали в 2 мл буфера МАС8.

Колонку ν8+ (М11!еиу1) готовили согласно инструкциям изготовителя. Затем колонку ν8+ помещали в магнитное поле Vа^^оМАС8™ (М11!еиу1). Колонку уравновешивали 5 мл буфера МАС8. Затем выделенные первичные клетки человека наносили на эту колонку. СБ3-негативным клеткам давали пройти через колонку. Колонку промывали 9 мл (3х3мл) буфера МАС8. Затем колонку удаляли из магнитного поля и помещали над пробиркой из Га1сои на 15 мл. СБ3+ клетки элюировали добавлением 5 мл буфера МАС8 на колонку и связавшиеся клетки вымывали с использованием поршня (плунжера), обеспечиваемого изготовителем. Инкубирование этих клеток с СБ3-магнитными гранулами, промывки и стадии колонки ν8+ (инкубирование-элюция), описанные выше, повторяли еще 5 раз. Полученные СБ3+ фракции из шести разделений на колонке объединяли. Общий выход СБ3+ отобранных Т-клеток человека был равен 3х10⁸ клеток.

Пробу объединенных СБ3+ отобранных Т-клеток человека брали для окрашивания и сортинга на клеточном сортере с возбуждением флуоресценции (РАС8) для оценки их чистоты. СБ3+ отобранные Тклетки человека содержали 91% СБ3+ клеток.

СБ3+ отобранные Т-клетки человека активировали инкубированием в КРМI+5% ФТС+ФМЛ 10 нг/мл и иномицине 0,5 мкг/мл (Са1Ь1осйет) в течение 13 ч при 37°С. Супернатант от этих активированных СБ3+ отобранных Т-клеток человека тестировали на активность ζа1рйа 11, как описано ниже.

Ό. Тестирование супернатанта от активированных СБ3+ отобранных Т-клеток человека на ζαΐρΐια 11 -активность с использованием клеток ВаР3^а1рйа11 и теста пролиферации с использованием А1атаг В1ие.

- 39 006501

Клетки ВаЕ3/ха1рка 11 откручивали и промывали в не содержащей т1Ь-3 среде. Клетки откручивали и промывали 3 раза для гарантии удаления т1Ь-3. Затем клетки считали в гемоцитометре. Клетки высевали в 96-луночный планшет при 5000 клеток на лунку в объеме 100 мкл на лунку с использованием не содержащей т1Ь-3 среды.

Пролиферацию клеток ВаЕ3/ха1рка 11 оценивали с использованием кондиционированной среды от активированных СЭ3+ отобранных Т-клеток человека (см. пример 8С выше), разведенной не содержащей т1Ь-3 средой до концентраций 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,5, 0,75 и 0,375%. 100 мкл разведенной кондиционированной среды добавляли к клеткам ВаЕ3/ха1рка11. Общий объем теста равен 200 мкл. Тестпланшеты инкубировали и анализировали, как описано в примере 8В выше.

Результаты подтвердили пролиферативный ответ клеток ВаЕ3/ха1рка11 на фактор, присутствующий в активированной кондиционированной среде СЭ3+ отобранных Т-клеток человека. Этот ответ согласно измерениям был приблизительно в 10 раз выше фона при концентрации 50%. Клетки ВаЕ3 дикого типа не пролиферировали в ответ на этот фактор, что указывает на то, что этот фактор является специфическим для 2а1рка11-рецептора.

Пример 9. Конструирование экспрессирующих векторов млекопитающих, которые экспрессируют растворимые рецепторы ха1рка11: хафкаИСЕЕ, ха1рйа11СЕЬС, ха1рка11СНК и ха1рка11-Ес4.

A. Конструирование экспрессирующего вектора млекопитающих, содержащего /а1рйа11СЕЕ, ха1рйа11СЕЬС, ха1рка11СНК.

Получали экспрессирующий вектор для экспрессии растворимого внеклеточного домена полипептида ха1рка11, рС4ха1рка11СЕЕ, причем эта конструкция предназначена для экспрессии полипептида ха1р11а1Е содержащего предсказанный инициирующий метионин и укороченного вблизи предсказанного трансмембранного домена, имеющего С-концевую О1и-О1и-метку КЕО ΙΌ NО:41).

ПЦР-генерируемый фрагмент ДНК ха1рка11 700 п.н. создавали с использованием ΖΟ9931 КЕО ΙΌ NО:42) и ΖΟ9932 КЕО ΙΌ NО:43) в качестве ПЦР-праймеров для добавления сайтов рестрикции Акр718 и ВатН1. Плазмиду, содержащую кДНК ха1рка 11-рецептора, использовали в качестве матрицы. ПЦР-амплификацию фрагмента ха1рка11 проводили следующим образом: 25 циклов при 94°С в течение 0,5 мин; 5 циклов при 94°С в течение 10 с, 50°С в течение 30 с, 68°С в течение 45 с; затем выдерживание при 4°С. Реакцию очищали экстракцией смесью хлороформ/фенол и осаждением изопропанолом и расщепляли Акр718 и ВатН1 (С1Ьсо ВКЬ) согласно инструкциям изготовителя. Полосу предсказанного размера, 700 п.н., визуализировали при помощи электрофореза на 1% агарозном геле, вырезали и эту ДНК очищали с использованием системы очистки 0|аех1Г™ (01адеи) согласно инструкциям изготовителя.

Вырезанную ДНК субклонировали в плазмиду рС4ЕЕ, которая была разрезана ВатНГ и Акр718. Экспрессирующий вектор рС4ха1рка11СЕЕ использует сигнальный пептид нативного ха1рка11 и присоединяет О1и-О1и-метку КЕО ΙΌ NО:41) к С-концу полинуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид ха1рка11. Плазмида рС4ЕЕ является экспрессирующим вектором млекопитающих, содержащим экспрессионную кассету, имеющую мышиный промотор металлотионеина-1, множественные сайты рестрикции для встраивания кодирующих последовательностей, стоп-кодон и терминатор гормона роста человека. Эта плазмида имеет также начало репликации Е. со11, экспрессионную единицу селектируемых маркеров млекопитающих, имеющую промотор, энхансер и начало репликации δν40, ген ЭНЕЕ и терминатор δν40.

Приблизительно 30 нг рестрикционно отщепленной ха1рка 11 -вставки и приблизительно 12 нг расщепленного вектора лигировали в течение ночи при 16°С. 1 мкл каждой реакции лигирования независимо электропорировали в ЭН10В-компетентные клетки (С1Ьсо ВКЬ, СаййегкЬигд, МО) согласно инструкциям изготовителя, и высевали на ЬВ-планшеты, содержащие 50 мг/мл ампициллина, и инкубировали в течение ночи. Колонии подвергали скринингу при помощи рестрикционного анализа ДНК, полученных из 2 мл жидких культур индивидуальных колоний. Последовательность вставки положительных клонов подтверждали анализом последовательности. Крупномасштабное получение плазмиды проводили с использованием набора О1АСЕ№ Мах1 ргер кй (01адеи) согласно инструкциям изготовителя.

Тот же самый процесс использовали для получения растворимых рецепторов ха1рка11 с С-концевой Ηίδ-меткой, состоящей из 6 остатков Н1к подряд, и С-концевой ЕЬЛО-меткой КЕО ΙΌ NО:49), ха1рйа11СЕЬАС. Для конструирования этих конструкций вышеуказанный вектор имеет либо НК, либо ЕЬАС®-метку вместо д1и-д1и-метки КЕО ΙΌ NО:41).

B. Экспрессионная конструкция млекопитающих для растворимого рецептора ха1рка11, ха1рка11-Ес4.

Экспрессионную плазмиду, содержащую весь полинуклеотид или его часть, кодирующую ха1рка1Е конструировали гомологичной рекомбинацией. Фрагмент кДНК ха1рка11 выделяли при помощи ПЦР, которая включает в себя полинуклеотидную последовательность из внеклеточного домена рецептора ха1рка11. Два праймера использовали в получении этого фрагмента ха1рка11: (1) каждый из праймеров для ПЦР включает в себя от 5' к 3' концу: 40 п.н. фланкирующей последовательности вектора (5' от вставки) и 17 п.н., соответствующих 5'-концу внеклеточного домена ха1рка11 КЕО ΙΌ NО:44); и (2) 40 п.н. 5'-конца полинуклеотидной последовательности Ес4 КЕО ΙΌ NО:45) и 17 п.н., соответствующих 3'-концу внеклеточного домена ха1рка11 КЕО ΙΌ NО:46). Фрагмент Ес4 для слияния с ха1рка11 генерировали при помощи ПЦР сходным образом. Двумя праймерами в получении фрагмента Ес4 были (1) 5'-праймер, состоящий из 40 п.н. последовательности из 3'-конца внеклеточного домена ха1рка11 и 17 п.н. 5'-конца

- 40 006501

Ес-4 (8ЕЦ ΙΌ N0:47) и (2) З'-праймер, состоящий из 40 п.н. векторной последовательности (3' от вставки) и 17 п.н. 3'-конца Ес-4 (8ЕЦ ΙΌ N0:48).

ПЦР-амплификацию каждой из реакций, описанных выше, проводили следующим образом: 1 цикл при 94°С в течение 2 мин; 25 циклов при 94°С в течение 30 с, 60°С в течение 30 с, 72°С в течение 1 мин; 1 цикл при 72°С в течение 5 мин; с последующим выдерживанием при 4°С. 10 мкл из 100 мкл ПЦРреакции подвергали электрофорезу на 0,8% ЬМР-агарозном геле (8еар1ас.|ие СТС) с 1хТВЕ-буфером для анализа. Остальные 90 мкл ПЦР-реакции осаждали добавлением 5 мкл 1 М №101 и 250 мкл абсолютного этанола. Используемый экспрессирующий вектор получали из плазмиды рС2К199 (депонированный в Атепсап Туре Си11иге СоПесбоп, 10801 ишуегкПу Вои1еуагб, Мапаккак, УА 20110-2209 и названный №. 98668) и разрезали 8та! (ВКЬ). Экспрессирующий вектор был произведен из плазмиды рС2К199 и представляет собой экспрессирующий вектор млекопитающих, содержащий экспрессионную кассету, имеющую немедленно ранний промотор СМУ, консенсусный интрон из вариабельной области локуса тяжелой цепи мышиного иммуноглобулина, множественные сайты рестрикции для встраивания кодирующих последовательностей, стоп-кодон и терминатор гормона роста человека. Этот экспрессирующий вектор имеет также начало репликации Е. соб, экспрессионную единицу селектируемых маркеров млекопитающих, имеющую промотор, энхансер и начало репликации 8У40, ген ОНЕК и терминатор 8У40. Этот используемый экспрессирующий вектор конструировали из рС2К199 заменой промотора металлотионеина немедленно ранним промотором СМУ.

100 мкл компетентных дрожжевых клеток (8. сегеуыае) объединяли с 10 мкл, содержащими приблизительно 1 мкг каждой из вставок /а1рЬа11 и Ес4 и 100 нг расщепленного 8таI (ВКЕ) экспрессирующего вектора, и переносили в кювету для электропорации 0,2 см. Смеси дрожжи/ДНК подвергали электрошокам при 0,75 кВ (5 кВ/см), «неопределенном» числе Ом, 25 мкФ. В каждую кювету добавляли 600 мкл 1,2 М сорбита и дрожжи высевали в двух аликвотах по 300 мкл на две чашки ИЯА-Ό и инкубировали при 30°С.

Спустя приблизительно 48 ч Ига+ дрожжевые трансформанты из отдельной чашки ресуспендировали в 1 мл Н20 и откручивали быстро для осаждения дрожжевых клеток. Клеточный осадок ресуспендировали в 1 мл лизисного буфера (2% тритон Х-100, 1% ДСН, 100 мМ №С1, 10 мМ Трис, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА). 500 мкл лизисной смеси добавляли в пробирку Эппендорфа, содержащую 300 мкл промытых кислотой стеклянных гранул и 200 мкл смеси фенол/хлороформ, встряхивали на вортексе 2 или 3 раза с интервалами 1 мин, с последующим 5-минутным откручиванием в центрифуге Эппендорфа при максимальной скорости. 30 мкл водной фазы переносили в свежую пробирку и ДНК осаждали 600 мкл этанола (ЕЮН) с последующим центрифугированием в течение 10 мин при 4°С. Осадок ДНК ресуспендировали в 100 мкл Н₂0.

Трансформацию электрокомпетентных клеток Е. соб (ОН10В, С1Ьсо ВКЬ) проводят с 0,5-2 мл препдрожжевой ДНК и 40 мкл клеток НН10В. Клетки подвергали электроимпульсам при 2,0 кВ, 25 мФ и 400 Ом. После электропорации 1 мл 80С (2% бактотриптон (01Гсо, Ое1го11, МЦ 0,5% дрожжевой экстракт (О1Гсо), 10 ММ №С1, 2,5 мМ КС1, 10 мМ МдС1₂, 10 мМ Мд80₄, 20 мМ глюкоза) высевали в аликвотах 250 мкл на четыре ЬВ АМР чашки (ЬВ-бульон (Ьепиох), 1,8% бактоагар (ОгГсо), 100 мг/л ампициллина).

Индивидуальные клоны, улавливающие правильную экспрессионную конструкцию для /а1рЬа11-Ес4, идентифицировали рестрикционным расщеплением для подтверждения присутствия вставки /а1рЬа11-Ес4 и для подтверждения, что различные последовательности ДНК были корректно соединены друг с другом. Вставку положительных клонов подвергали анализу последовательности. При крупномасштабном получении плазмидную ДНК выделяют с использованием набора ΟΙΛΟΕΧ Мах1 ΚίΙ (Ц1адеп) согласно инструкциям изготовителя.

Пример 10. Трансфекция и экспрессия растворимых рецепторных полипептидов /а1рЬа11.

Клетки ВНК 570 (АТСС №. СКЕ-10314), пассаж 21, высевали в чашки при 1,2х10⁶ клеток на лунку (6-луночная чашка) в 800 мкл бессывороточной (ВС) среды ОМЕМ (ОМЕМ, С1Ьсо/ВКБ Н1дб С1исоке), (СШС0 ВКЬ, СайбегкЬигд, МЛ). Эти клетки трансфицировали экспрессионными плазмидами, содержащими /афкаЩЕЕ/СЕЕС/СНК, описанными выше (см. пример 9), с использованием липофектина™ (С1Ьсо ВКЬ) в бессывороточной (ВС) среде ОМЕМ. 3 мкг ζа1рЬа11/0Е^С/0ΗI8 отдельно разводили в пробирки на 1,5 мл до общего объема 100 мкл БС-ОМЕМ. В отдельных пробирках 15 мкл липофектина™ (С1Ьсо ВКБ) смешивали с 100 мкл БС-ΌΜΕΜ. Смесь с липофектином™ инкубировали при комнатной температуре в течение 30-45 мин, затем добавляли смесь ДНК и давали инкубироваться приблизительно 10-15 мин при комнатной температуре.

Всю смесь ДНК: липофектин™ добавляли к посеянным клеткам и равномерно распределяли на них. Чашки инкубировали при 37°С в течение приблизительно 5 ч, затем переносили в отдельные чашки МΛXI 150 мм в конечном объеме 30 мл ОМЕМ/5% фетальная телячья сыворотка (ФТС) (Нус1опе, Ьодап, ИТ). Чашки инкубировали при 37°С, 5% С0₂, в течение ночи и смесь ДНК:липофектин™ заменяли свежей селективной средой (5% ФТС/ΟΜΕΜ с 1 мкМ метотрексата (МТХ) на следующий день).

Приблизительно при 10-12 днях после трансфекции чашки промывали 10 мл БС-ΌΜΕΜ. Промывочную среду отсасывали и заменяли 7,25 мл бессывороточной ОМЕМ. Затем стерильные тефлоновые сетки (8рес1гнш Мебюа1 Шбикбтек, Бок Апде1ек, СА), предварительно пропитанные в БС-ΟΜΕΜ, помещали на колонии клональных клеток. Затем на эту сетку помещали стерильный нитроцеллюлозный

- 41 006501 фильтр, предварительно пропитанный в БС-ЭМЕМ. Метки для ориентации на нитроцеллюлозе переносили на чашку с культурой. Затем эти чашки инкубировали в течение 5-6 ч в термостате при 37°С, 5% С0₂.

После инкубирования фильтры/сетки удаляли и среду отсасывали и заменяли средой 5% ФТС/ИМЕМ с 1 мкМ МТХ. Затем фильтры блокировали в 10% нежирном сухом молоке/буфере Вестерн А (Вестерн А: 50 мМ Трис, рН 7,4, 5 мМ ЭДТА, 0,05% №-40, 150 мМ №С1 и 0,25% желатин) в течение 15 мин при комнатной температуре на ротационном шейкере. Затем фильтры инкубировали с конъюгатами антитело против С1и. С1и, антитело против ЕЬАС® или антитело против Ш8-НКР (пероксидаза хрена), соответственно, в 2,5% нежирном сухом молоке/буфере Вестерн А в течение 1 ч при комнатной температуре на ротационном шейкере. Затем фильтры промывали 3 раза при комнатной температуре буфером Вестерн А в течение 5-10 мин на одну промывку. Фильтры проявляли реагентом и1!га ЕСЬ (Атегккат Согр., Агкпд!оп Не1дк!к, ГЪ) в соответствии с указаниями изготовителя и визуализировали на приборе для получения изображений Ьипи-Ипадег (Коске Согр.).

Положительные экспрессирующие клональные колонии механически выскребали в 12-луночные чашки в одном мл 5% ФТС/ИМЕМ с 5 мкМ МТХ, затем выращивали до конфлюэнтности. Затем пробы кондиционированных сред тестировали на уровни экспрессии при помощи электрофореза в ДСН-ПААГ и Вестерн-анализа. Три наиболее сильно экспрессирующих клона для каждой конструкции выскребали; два из трех замораживали в качестве резерва, а один размножали для тестирования на микоплазму и крупномасштабного посева в клеточной фабрике.

В. Экспрессия растворимого рецептора /а1рка11-Ес4 в клетках млекопитающих.

Клетки ВНК 570 (АТСС №. СКЕ-10314) высевали в чашки 10 см для культуры ткани и давали им расти до приблизительно 50-70% конфлюэнтности в течение ночи при 37°С, 5% С0₂, в среде ИМЕМ/ФТС (ИМЕМ, С1Ьсо/ВКЬ Н1дк С1исоке, (ИВС0 ВКЬ, СайкегкЬигд, МО), 5% фетальной телячьей сыворотке (Нус1опе, Ьодап, ИТ), 1 мМ Ь-глутамине (ЖН Вюкаепсек, Ьепеха, К8), 1 мМ пирувате натрия (С1Ьсо ВКЬ)). Затем клетки трансфицировали плазмидой, содержащей /а1рка11-Ес4 (см. пример 9), с использованием липофектамина™ (С1Ьсо ВКЬ) в бессывороточной (БС) среде (ИМЕМ, 10 мг/мл трансферрина, 5 мг/мл инсулина, 2 мг/мл фетуина, 1% Ь-глутамина и 1% пирувата натрия). Плазмиду, содержащую /а1рка11-Ес4, разводили в пробирках на 15 мл до общего конечного объема 640 мл БС-средой. 35 мл липофектамина™ (С1Ьсо ВКЬ) смешивали с 605 мл БС-среды. Эту смесь с липофектамином™ добавляли к смеси ДНК и давали инкубироваться в течение приблизительно 30 мин при комнатной температуре. 5 мл ВС-среды добавляли к смеси ДНК:липофектамин™. Клетки промывали 1 раз 5 мл БС-среды, отсасывали и добавляли смесь ДНК:липофектамин™. Клетки инкубировали при 37°С в течение 5 ч, затем в каждую чашку добавляли 6,4 мл среды ИМЕМ/10% ФТС, 1% Р8К Чашки инкубировали при 37°С в течение ночи и смесь ДНК:липофектамин™ заменяли свежей средой 5% ФТС/ИМЕМ на следующий день. В день 2 после трансфекции клетки разделяли в селективную среду (среду ИМЕМ/ФТС, описанную выше, с добавлением 1 мМ метотрексата (81дта Скетюа1 Со., 8!. Ьошк, МО)) в чашках 150 мм при разведении 1:10, 1:20 и 1:50. Среду на этих клетках заменяли свежей селективной средой в день 5 после трансфекции. Приблизительно в день 10 после трансфекции две культуральные чашки 150 мм с устойчивыми к метотрексату колониями из каждой трансфекции трипсинизировали и клетки объединяли и высевали в колбу Т-162 и переносили в крупномасштабную культуру.

Пример 11. Очистка растворимых рецепторов /а1рка11 из клеток ВНК 570.

А. Очистка полипептида /а1рка11СЕЕ из ВНК 570.

Если нет других указаний, все операции проводили при 4°С. Следующую процедуру использовали для очистки полипептида /а1рка11, содержащего С-концевые метки С1и-С1и (ЕЕ). 30 л кондиционированной среды из клеточной фабрики концентрировали до 1,6 л при помощи спирального картриджа Аписон 810Υ3 на РгоЕ1их А30. Раствор протеазного ингибитора добавляли к концентрированным 1,6 л кондиционированной среды клеточной фабрики от трансфицированных клеток ВНК 570 (см. пример 10) до конечных концентраций 2,5 мМ этилендиаминотетрауксусной кислоты (ЭДТА, 81дта Скет1са1 Со. 8!. Ьошк, МО), 0,003 мМ лейпептина (Воекппдег Маппкет, ШФапарокк, Ш), 0,001 мМ пепстатина (Воекппдег Маппкет) и 0,4 мМ РеГаЬ1ос (Воекппдег Маппкепи). Пробы извлекали для анализа и общий объем замораживали при -80°С до начала очистки. Концентрации общего целевого белка концентрированной кондиционированной среды клеточной фабрики определяли при помощи электрофореза в ДСН-ПААГ и Вестерн-блот-анализа с антителами против ЕЕ, конъюгированными с НКР (пероксидазой хрена).

100 мл субстрата для колонки анти-ЕЕ-С-§еркагоке (приготовленной, как описано ниже) выливали в стеклянную колонку 7а!егк АР-5, 5 см х 10 см. Колонку упаковывали проточно и уравновешивали на ВюСай 8рпп! (Рег8ер!1уе Вю8ук!етк, Егаттдкат, МА) забуференным фосфатом солевым раствором (ЗФР) рН 7,4. Концентрированную кондиционированную среду клеточной фабрики оттаивали, стерильно фильтровали с фильтром 0,2 мкм, рН доводили до 7,4, затем наносили на колонку в течение ночи со скоростью тока 1 мл/мин. Колонку промывали 10 колоночными объемами (КО) забуференного фосфатом солевого раствора (ЗФР, рН 7,4), затем элюировали с подачей элюента через пробку 200 мл ЗФР (рН 6,0), содержащего 0,5 мг/мл ЕЕ-пептида (Апакрес, 8ап 1оке, СА), при скорости тока 5 мл/мин. Используемый ЕЕ-пептид имеет последовательность ЕΥМРМЕ (8ЕО ΙΌ N0:41). Колонку промывали 10 колоночными объемами (КО) ЗФР, затем элюировали 5 колоночными объемами 0,2 М глицина, рН 3,0. рН элюируемой

- 42 006501 глицином колонки доводили до 7,0 2 колоночными объемами 5Х ЗФР, затем уравновешивали в ЗФР (рН

7,4). Фракции по 5 мл собирали на протяжении всей элюционной хроматографии и поглощение при 280 и 215 нм подвергали мониторингу; проходящие через колонку и промывочные пулы также сохраняли и анализировали. Фракции пика элюции ЕЕ-полипептида анализировали на целевой белок электрофорезом в ДСН-ПААГ с окрашиванием серебром и Вестерн-блоттингом с конъюгированным антителом анти-ЕЕНКР. Представляющие интерес фракции элюции полипептида объединяли и концентрировали с 60 мл до 5,0 мл с использованием центрифужного концентратора с мембраной, отсекающей молекулярную массу 10000 Да (М1Шроге, ВебТогб, МА), согласно инструкциям изготовителя.

Для отделения ζа1рНа11СЕЕ от других соочищающихся белков концентрированные слитые фракции элюции полипептида подвергали очистке на ΡΟКΟ8 НО-50 (сильной анионообменной колонке из Рег8ерйуе Вю8уз1етз, Егатшдйат, МА) при рН 8,0. Колонку 1,0х6,0 см заливали и проточно упаковывали на ВюСаб 8рпп!. Колонку загружали противоионом и затем уравновешивали в 20 мМ Трис рН 8,0 (Трис(гидроксиметиламинометан)). Пробу разводили 1:13 (для уменьшения ионной силы ЗФР), затем наносили на колонку ΡΟКΟ8 НО при скорости тока 5 мл/мин. Колонку промывали 10 колоночными объемами (КО) 20 мМ Трис рН 8,0, затем элюировали 40 колоночными объемами градиента 20 мМ Трис/1 М хлорид натрия (№С1) при скорости тока 10 мл/мин. Фракции по 1,5 мл собирали на протяжении всей хроматографии и поглощение при 280 и 215 нм подвергали мониторингу. Фракции пика элюции анализировали электрофорезом в ДСН-ПААГ с окрашиванием серебром. Представляющие интерес фракции объединяли и концентрировали до 1,5-2 мл с использованием центрифужного концентратора с мембраной, отсекающей молекулярную массу 10000 Да (М1Шроге, ВебТогб, МА), согласно инструкциям изготовителя.

Для отделения полипептида ζа1рНа11СЕЕ от свободного пептида ЕЕ и любых примесных соочищающихся белков объединенные концентрированные фракции подвергали хроматографии на колонке 1,5х90 см ЗерНабех 8200 (РЬагтас1а, Р1зса1атау, ΝΙ), уравновешенной и загруженной в ЗФР при скорости тока 1,0 мл/мин, при помощи ВюСаб 8рпп!. Фракции по 1,5 мл собирали на протяжении всей хроматографии и поглощение при 280 и 215 нм подвергали мониторингу. Фракции пика элюции характеризовали при помощи электрофореза в ДСН-ПААГ с окрашиванием серебром и объединяли только наиболее чистые фракции. Этот материал представлял очищенный полипептид ζа1рНа11СЕЕ.

Этот очищенный материал подвергали наконец очистке на колонке 4 мл АсОС1еап Е!ох (81егодепе) для удаления любых оставшихся эндотоксинов. Пробу пропускали через уравновешенную ЗФР колонку под действием силы тяжести 4 раза, затем колонку промывали 1 раз 3 мл ЗФР и эту промывку объединяли с «очищенной» пробой. Затем этот материал стерильно фильтровали (0,2 мкм) и хранили при -80°С до приготовления аликвот.

На Вестерн-блотированных, окрашенных Кумасси синим и серебром гелях электрофореза в ДСНПААГ полипептид ζа1рНа11СЕЕ был одной основной полосой со средней молекулярной массой 50000 Да. Подвижность этой полосы была одинаковой на восстанавливающем и на невосстанавливающем гелях.

Концентрацию белка очищенного материала определяли согласно анализу БСА (Р1егсе, КоскТогб) и белок делили на аликвоты и хранили при -80°С в соответствии с обычными процедурами авторов изобретения. На 1ЕЕ-гелях (изоэлектрическое фокусирование) белок перемещался с ΡI менее 4,5. Концентрация полипептида ζа1рНа11СЕЕ была 1,0 мг/мл.

Очищенный полипептид ζа1рйа11СЕЕ готовили для инъекции в кроликов и отсылали в К & К КезеагсЬ апб Эеуе1ортеп! (81апетооб, ^А) для получения антител. Кроликов инъецировали для получения сыворотки против 1и.^а1р11а-СЕЕ-ВНК (пример 15 ниже).

Для получения анти-ЕЕ-сефарозы объем слоя 100 мл протеин О-сефарозы (РНагтааа, Р1зса1атау, Ν1) промывали 3 раза 100 мл ЗФР, содержащего 0,02% азида натрия, с использованием фильтрующего элемента 0,45 мкм Ка1депе на 500 мл. Гель промывали 6,0 объемами 200 мМ триэтаноламина, рН 8,2 (ТЭА, 81дта, 8!. Ьошз, МО) и добавляли равный объем раствора антител против ЕЕ, содержащего 900 мг антитела. После инкубирования в течение ночи при 4°С несвязавшееся антитело удаляли промыванием смолы 5 объемами 200 мМ ТЭА, как описано выше. Смолу ресуспендировали в 2 объемах ТЭА, переносили в подходящий резервуар и добавляли диметилпимилимидат-2НС1 (Р1егсе, КоскТогб, Ш), растворенный в ТЭА, до конечной концентрации 36 мг/мл рго!ет О-8ерЬаго5е-геля. Гель качали при комнатной температуре в течение 45 мин и жидкость удаляли при помощи фильтрующего элемента, как описано выше. Затем неспецифические сайты на этом геле блокировали инкубированием в течение 10 мин при комнатной температуре с 5 объемами 20 мМ этаноламина в 200 мМ ТЭА. Затем гель промывали 5 объемами ЗФР, содержащего 0,02% азида натрия, и хранили в этом растворе при 4°С.

В. Очистка полипептида ζа1рЬа11СЕ^А6 из ВНК 570.

Если нет других указаний, все операции проводили при 4°С. Следующую процедуру использовали для очистки полипептида ζι^^Η, содержащего С-концевые метки ЕЬАО® (ЕЬО) (8щта-А1бпс11 Со.). 30 л кондиционированной среды из клеточной фабрики концентрировали до 1,7 л при помощи спирального картриджа Аннсоп 810Υ3 на РгоЕ1их А30. Раствор протеазного ингибитора добавляли к концентрированным 1,7 л кондиционированной среды клеточной фабрики от трансфицированных клеток ВНК 570 (см. пример 10) до конечных концентраций 2,5 мМ этилендиаминотетрауксусной кислоты (ЭДТА, 81дта С11еннса1 Со. 8!. Ьошз, МО), 0,003 мМ лейпептина (Воейппдег МаппЬет, ЫбхапароНз, ΙΝ), 0,001 мМ пеп

- 43 006501 статина (ВоеНппдег МаппНепп) и 0,4 мМ Ре£аЬ1ос (ВоеНппдег МаппНепп). Пробы брали для анализа и общий объем замораживали при -80°С до начала очистки. Концентрации общего целевого белка кондиционированной среды клеточной фабрики определяли при помощи электрофореза в ДСН-ПААГ и Вестернблот-анализа с антителами против ЕЬАС® (^ά-φ, конъюгированными с НКР (пероксидазой хрена). Колонку 125 мл анти-РЬЛб® М2-агарозного аффинного геля (ЫСМА-АИпсН Со.) выливали в стеклянную колонку ^а!егк АР-5, 5 см х ΐ0 см. Колонку упаковывали проточно и уравновешивали на ВюС;-Л 8рг1п( (Рег8ерЩе Вю8ук!етк, ЕгаттдНат, МА) забуференным фосфатом солевым раствором (ЗФР) рН 7,4. Концентрированную кондиционированную среду клеточной фабрики оттаивали, стерильно фильтровали с фильтром 0,2 мкм, рН доводили до 7,4, затем наносили на колонку в течение ночи со скоростью тока ΐ мл/мин. Колонку промывали ΐ0 колоночными объемами (КО) зафуференного фосфатом солевого раствора (ЗФР, рН 7,4), затем элюировали с подачей элюента через пробку 250 мл ЗФР (рН 6,0), содержащего 0,5 мг/мл ЕЬАС® (8|дта-АИпсН Со.) пептида, при скорости тока 5 мл/мин. Используемый ЕЬАС®пептид имеет последовательность ΌΥΚΌΌΌΌΚ (8ЕО ΙΌ N0:49). Колонку промывали ΐ0 колоночными объемами (КО) ЗФР, затем элюировали 5 колоночными объемами 0,2 М глицина, рН 3,0. рН элюируемой глицином колонки доводили до 7,0 2 колоночными объемами 5Х ЗФР, затем уравновешивали в ЗФР (рН

7,4). Фракции по 5 мл собирали на протяжении всей элюционной хроматографии и поглощение при 280 и 2ΐ5 нм подвергали мониторингу; проходящие через колонку и промывочные пулы также сохраняли и анализировали. Фракции пика элюции ЕЬАС®-полипептида анализировали на целевой белок электрофорезом в ДСН-ПААГ с окрашиванием серебром и Вестерн-блоттингом с конъюгированным антителом анти-РЬАС®-НКР. Представляющие интерес фракции элюции полипептида объединяли и концентрировали с 80 до ΐ2 мл с использованием центрифужного концентратора с мембраной, отсекающей молекулярную массу ΐ0000 Да (МННроге, Веά£о^ά, МА), согласно инструкциям изготовителя.

Для отделения /а1рНа11СЕЬС от других соочищающихся белков слитые фракции элюции полипептида подвергали очистке на Р0К08 НО-50 (сильной анионообменной колонке из Рег8ер1Ке В|о8ук1етк, ЕгаттдНат, МА) при рН 8,0. Колонку 1,0х6,0 см заливали и проточно упаковывали на ВюС-ά 8рпп1. Колонку загружали противоионом и затем уравновешивали в 20 мМ Трис рН 8,0 (Трис(гидроксиметиламинометан)). Пробу разводили ΐ:ΐ3 (для уменьшения ионной силы ЗФР), затем наносили на колонку Р0К08 НО-50 при скорости тока 5 мл/мин. Колонку промывали 10 колоночными объемами (КО) 20 мМ Трис рН 8,0, затем элюировали 40 колоночными объемами градиента 20 мМ Трис/1 М хлорид натрия (№1С1) при скорости тока 10 мл/мин. Фракции по 1,5 мл собирали на протяжении всей хроматографии и поглощение при 280 и 2ΐ5 нм подвергали мониторингу. Фракции пика элюции анализировали электрофорезом в ДСН-ПААГ с окрашиванием серебром. Представляющие интерес фракции объединяли и концентрировали до 1,5-2 мл с использованием центрифужного концентратора с мембраной, отсекающей молекулярную массу 10000 Да (МННроге, Веά£о^ά, МА), согласно инструкциям изготовителя.

Для отделения полипептида /а1рНа11СЕЬС от свободного пептида ЕЬАС® и любых примесных соочищающихся белков объединенные концентрированные фракции подвергали хроматографии на колонке 1,5х90 см 8ерНасгуе 8200 (РНагтас1а, Р|кса1агоау, N1), уравновешенной и загруженной в ЗФР при скорости тока 1,0 мл/мин при помощи ВюС;-Л 8рг1п(. Фракции по 1,5 мл собирали на протяжении всей хроматографии и поглощение при 280 и 2ΐ5 нм подвергали мониторингу. Фракции пика элюции характеризовали при помощи электрофореза в ДСН-ПААГ с окрашиванием серебром и объединяли только наиболее чистые фракции. Этот материал представлял очищенный полипептид 7а1рНа11СЕЬС.

Этот очищенный материал подвергали, наконец, очистке на колонке 4 мл АсНС1еап Е!ох (8!егодепе) для удаления любых оставшихся эндотоксинов. Пробу пропускали через уравновешенную ЗФР колонку под действием силы тяжести 4 раза, затем колонку промывали 1 раз 3 мл ЗФР и эту промывку объединяли с «очищенной» пробой. Затем этот материал стерильно фильтровали (0,2 мкм) и хранили при -80°С до приготовления аликвот.

На Вестерн-блотированных, окрашенных Кумасси синим и серебром гелях электрофореза в ДСНПААГ полипептид /а1рНа11СРЕС был одной основной полосой со средней молекулярной массой 50000 Да. Подвижность этой полосы была одинаковой на восстанавливающем и на невосстанавливающем гелях.

Концентрацию белка очищенного материала определяли согласно анализу БСА (Пегсе, Коск£оМ, ГЬ) и белок делили на аликвоты и хранили при -80°С в соответствии с обычными процедурами авторов изобретения. На ΙΕΕ-гелях (изоэлектрическое фокусирование) белок перемещался с РI менее 4,5. Концентрация полипептида /а1рНа11СРЕС была 1,2 мг/мл.

С. Очистка полипептида /а1рНа11-Рс4 из трансфицированных клеток ВНК 570.

Если нет других указаний, все операции проводили при 4°С. Следующую процедуру использовали для очистки полипептида /а1рНа11, содержащего С-концевое слияние с ЦС/Рс человека (/а1рНа11-Рс4; примеры 8 и 9). 12000 мл кондиционированной среды от клеток ВНК 570, трансфицированных /а1рНа11Рс4 (пример ΐ0), фильтровали через стерилизующий фильтр 0,2 мм и затем дополняли раствором протеазных ингибиторов, до конечных концентраций 0,001 мМ лейпептина (ВоеНппдег МаппНе1т, Iηά^аηаро1^κ, Ш), 0,001 мМ пепстатина (ВоеНппдег МаппНе1т) и 0,4 мМ Ре£аЬ1ос (ВоеНппдег МаппНе1т). Протеин Ссефарозу (объем слоя 6 мл, РНагтааа Вю1есН) упаковывали и промывали 500 мл ЗФР (СФсо ВКЬ). Дополненную кондиционированную среду пропускали через колонку при скорости тока ΐ0 мл/мин с после

- 44 006501 дующим промыванием 1000 мл ЗФР (ВЙБ/С1Ьсо). Полипептид ζι1ρ1ιι11^4 элюировали из колонки 0,1 М глицином рН 3,5 и фракции по 2 мл собирали непосредственно в 0,2 мл 2 М Триса рН 8,0 для доведения конечного рН до 7,0 в этих фракциях.

Элюированные фракции характеризовали при помощи электрофореза в ДСН-ПААГ и Вестернблоттинга с антителами против Ес человека (АтегкНат). Вестерн-блот-анализ гелей восстанавливающего электрофореза в ДСН-ПААГ выявил иммунореактивный белок 80000 кДа во фракциях 2-10. Окрашенные серебром гели электрофореза в ДСН-ПААГ также выявили полипептид ζа1ρНа11-Ес4 80000 кДа во фракциях 2-10. Фракции 2-10 объединяли.

Концентрацию белка объединенных фракций определяли согласно анализу БСА (Р1егсе, ЯоскГогб, 1Ь) и материал делили на аликвоты и хранили при -80°С в соответствии с обычными процедурами заявителей. Концентрация белка объединенных фракций была 0,26 мг/мл.

Пример 12. Тест с использованием растворимых рецепторов ζηΐρΐιηΐ КЕЕ, ζηΙρΗηΙ 1СЕБС и (мутантного) растворимого рецептора ζι1ρ1ιι11-Ε^4 в конкурентном ингибиторном анализе.

Клетки ВаЕ-ХУа^эНа 11 откручивали и промывали в не содержащей т1Ь-3 среде. Клетки откручивали и промывали 3 раза для гарантии удаления т1Ь-3. Затем клетки считали в гемоцитометре. Клетки высевали в 96-луночный планшет при 5000 клеток на лунку в объеме 100 мкл на лунку с использованием не содержащей т1Ь-3 среды.

Как среду от активации клеток селезенки обезьяны, так и СЕ3+ отобранные клетки, описанные в примере 8 выше, добавляли в отдельных экспериментах при концентрациях 50, 25, 12,5%, 6,25, 3,125, 1,5, 0,75 и 0,375%, с растворимыми рецепторами ζ81ρΗ311 или без них (конструкциями СЕЕ, С-ЕБАС и Ес4; см. пример 10 и 11) при 10 мкг/мл. Общий объем теста был 200 мл.

Тест-планшеты инкубировали при 37°С, 5% С0₂ в течение 3 дней, после чего добавляли А1атаг В1ие (Асситеб) при 20 мкл на лунку. Планшеты опять инкубировали при 37°С, 5% С0₂ в течение 24 ч. Планшеты считывали на планшет-ридере Етах™ (Мо1еси1аг Оеуюек), как описано выше (пример 5). Результаты продемонстрировали полное ингибирование клеточного роста каждой из различных конструкций растворимых рецепторов ζηΐρΐιηΐΐ при 10 мкг/мл, подтверждая, что этот фактор в каждой пробе был специфическим для рецептора ζιΙρΙκιΙΙ.

Кривые титрования с разведениями этих растворимых рецепторов также определяли с использованием описанного выше теста. Как ζа1ρйа11СЕЕ, так и ζа1ρНа11СЕ^С. растворимые рецепторы ζη^^ΐΐ, были способны полностью ингибировать рост при такой низкой концентрации, как 20 нг/мл. Мутантный растворимый рецептор ζι1ρ1ιι11^4 был эффективным только при 1,5 мкг/мл.

Пример 13. Экспрессия ζι1ρΗι11 человека в Е. сой.

А. Конструирование экспрессирующего вектора ρСΖΚ225, который экспрессирует слитый полипептид Ιιιιζαΐρΐια 11/МВР-6Н.

Экспрессионную плазмиду, содержащую полинуклеотид, кодирующий растворимый рецептор ζηΙρΗηΙΙ человека, слитый на С-конце с мальтозусвязывающим белком (МБР), конструировали гомологичной рекомбинацией. Полинуклеотидная последовательность для слитого полипептида растворимого рецептора МВР^афйаН показана в 8ЕО ΙΌ N0:50 с соответствующей белковой последовательностью, показанной в 8ЕО ΙΌ N0:51. Слитый полипептид, названный 1и.аа1р11а11/МВР-6Н, в примере 14 содержит МБР-часть (аминокислоты 1 (Ме!)-388 (8ег) 8ЕО ΙΌ N0:51), слитую с растворимым рецептором ζιΙρΙκιΙΙ человека (аминокислоты 389 (Сук)-606 (Н1к) 8ЕО ΙΌ N0:51). Фрагмент кДНК ζιΙρΗι 11 человека (8Е0 ΙΌ N0:52) выделяли с использованием ПЦР. Два праймера использовали в получении фрагмента ζιΙρΙκιΙΙ человека в ПЦР-реакции: (1) праймер ΖС20187 (8Е0 ΙΌ N0:53), содержащий 40 п.н. векторной фланкирующей последовательности и 25 п.н., соответствующих амино-концу ζιΙρΙκιΙ 1 человека, и (2) праймер ΖС20185 (8Е0 ΙΌ N0:54), содержащий 40 п.н. 3'-конца, соответствующих фланкирующей векторной последовательности, и 25 п.н., соответствующих карбоксил-концу ζιΙρΗι 11 человека. Условия ПЦР-реакции были следующими: 25 циклов 94°С в течение 30 с, 50°С в течение 30 с и 72°С в течение 1 мин, с последующим пропитыванием при 4°С, реакции проводили в двух повторностях. 2 мкл из 100 мкл ПЦР-реакции подвергали электрофорезу на 1,0% агарозном геле с 1 х ТВЕ-буфером для анализа и наблюдали ожидаемый фрагмент приблизительно 660 п.н. Оставшиеся 90 мкл ПЦР-реакции объединяли со второй ПЦР-пробиркой, осаждали 400 мкл абсолютного этанола. Осажденную ДНК использовали для рекомбинации в разрезанный 8та1 реципиентный вектор рТАР98 для получения конструкции, кодирующей слитый полипептид МВР^афйаП, как описано ниже.

Плазмиду рТАР98 получали из плазмид ρΚ8316 и цМАБ-с2. Плазмида ρΚ8316 является челночным вектором 8ассйаготусек сеге\зк1ае (Н1е!ег Р. апб 81когкк1, Κ., Сепейск 122:19-27, 1989). цМАБ-с2 (ХЕВ) является экспрессионной плазмидой Е. сой. Она несет промотор !ас, запускающий Ма1Е (ген, кодирующий МВР), за которым следуют Н 15-метка, сайт расщепления тромбина, клонирующий сайт и терминатор ггпВ. Вектор рТАР98 конструировали с использованием гомологичной рекомбинации дрожжей. 100 нг разрезанной ЕсоШ цМАЕ-с2 рекомбинировали с 1 мкг разрезанной РуЛ ρΚ8316, 1 мкг линкера и 1 мкг разрезанной 8саI/ЕсοΒI ρΚ8316. Линкер состоял из олигонуклеотидов ΖΟ9372 (8Е0 ΙΌ N0:55) (100 пмоль)^С19351 (8 ЕС) ΙΌ N0:56) (1 пмоль)Ж19352 (8 ЕС) ΙΌ N0:57) (1 пмоль) и ΖΌ19371 (8 ЕС) ΙΌ N0:58) (100 пмоль), объединенных в ПЦР-реакции. Условия ПЦР-реакции были следующими: 10 циклов

- 45 006501

94°С в течение 30 с, 50°С в течение 30 с и 72°С в течение 30 с; затем пропитывание при 4°С. ПЦРпродукты концентрировали осаждением 100% этанолом.

100 мкл компетентных дрожжевых клеток (8. сегемыае) объединяли с 10 мкл, содержащими приблизительно 1 мкг ПЦР-продукта рецептора /а1рйа11 человека, описанного выше, и 100 нг расщепленного 8та1 вектора рТАР98 и переносили в кювету для электропорации 0,2 см. Смесь дрожжи/ДНК подвергали электрошокам при 0,75 кВ (5 кВ/см), «неопределенным» числом Ом, 25 мкФ. В каждую кювету добавляли 600 мкл 1,2 М сорбита и дрожжи высевали в двух аликвотах по 300 мкл на две чашки ИКА-Э и инкубировали при 30°С.

Спустя приблизительно 48 ч Ига+ дрожжевые трансформанты из отдельной чашки ресуспендировали в 1 мл Н20 и откручивали быстро для осаждения дрожжевых клеток. Клеточный осадок ресуспендировали в 1 мл лизисного буфера (2% тритон Х-100, 1% ДСН, 100 ММ №С1, 10 мМ Трис, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА). 500 мкл лизисной смеси добавляли в пробирку Эппендорфа, содержащую 300 мкл промытых кислотой стеклянных гранул и 200 мкл смеси фенол/хлороформ, встряхивали на вортексе 2 или 3 раза с интервалами 1 мин с последующим 5-минутным откручиванием в центрифуге Эппендорфа при максимальной скорости. 30 мкл водной фазы переносили в свежую пробирку и ДНК осаждали 600 мкл этанола (Е!0Н) с последующим центрифугированием в течение 10 мин при 4°С. Осадок ДНК ресуспендировали в 100 мкл Н₂0.

Трансформацию электрокомпетентных клеток Е. сой (МС1061, СакабаЬап е! а1., 1. Мо1. Вю1. 138, 179-207) проводили с 1 мкл преп-дрожжевой ДНК и 40 мкл клеток МС1061. Клетки подвергали электроимпульсам при 2,0 кВ, 25 мФ и 400 Ом. После электропорации 0,6 мл 80С (2% бакто™-триптон (Эбсо, Це!го1!, М1), 0,5% дрожжевой экстракт (Эйсо), 10 мМ №С1, 2,5 ММ КС1, 10 мМ МдС1₂, 10 мМ Мд80₄, 20 мМ глюкоза) высевали в виде одной аликвоты на чашки с ММ/СА+АМР 100 мг/л (Ргуог апб Ьейшд, Рго!еш Ехргеккюп апб РигШса!юп 10:309-319, 1997).

Клетки, несущие правильную экспрессионную конструкцию для рецептора /а1рйа11 человека, идентифицировали по экспрессии. Клетки выращивали в ММ/СА с 100 мкг/мл ампициллина в течение 2 ч при встряхивании при 37°С. 1 мл культуры индуцировали 1 мМ 1РТС. Спустя 2-4 ч 250 мкл каждой культуры смешивали с 250 мкл промытых кислотой стеклянных гранул и 250 мкл буфера Торнера с 5% βМЭ и красителем (8 М мочевина, 100 мМ Трис рН 7,0, 10% глицерин, 2 мМ ЭДТА, 5% ДСН). Пробы встряхивали на вортексе в течение 1 мин и нагревали до 65°С в течение 10 мин. 20 мкл наносили на дорожку на 4-12% ПААГ для электрофореза ^0УЕХ). Разделение на гелях происходило в буфере 1хМЕ8. Положительные клоны были названы ρСΖК225, и их подвергали секвенированию. Полинуклеотидная последовательность слитого белка МВР^а1рНа 11 показана в 8ЕО ГО N0:50.

В. Бактериальная экспрессия слитого полипептида 1и.^а1рНа11/МВР-6Н.

мкл ДНК секвенирования использовали для трансформации штамма ВЬ21. Клетки подвергали электроимпульсам при 2,0 кВ, 25 мкФ и 400 Ом. После электропорации добавляли 0,6 мл ММ/СА со 100 мг/л ампициллина.

Клетки выращивали в ММ/СА с 100 мкг/мл ампициллина в течение 2 ч при встряхивании при 37°С. 1 мл культуры индуцировали 1 мМ 1РТС. Спустя 2-4 ч 250 мкл каждой культуры смешивали с 250 мкл промытых кислотой стеклянных гранул и 250 мкл буфера Торнера с 5% βМЭ и красителем (8 М мочевина, 100 мМ Трис рН 7,0, 10% глицерин, 2 мМ ЭДТА, 5% ДСН). Пробы встряхивали на вортексе в течение 1 мин и нагревали до 65°С в течение 10 мин. 20 мкл наносили на дорожку на 4-12% ПААГ для электрофореза ^0УЕХ). Разделение на гелях происходило в буфере 1хМЕ8. Положительные клоны были использованы для выращивания для очистки слитого белка 1шха1р11а 11/МВР-6Н (пример 14 ниже).

Пример 14. Очистка растворимого рецептора 1шха1р11а 11/МВР-6Н из ферментации Е. сой.

Если нет других указаний, все операции проводили при 4°С. Следующую процедуру использовали для очистки растворимого рецепторного полипептида 1шха1рНа11/МВР-6Н. Клетки Е. сой, содержащие конструкцию ρСΖК225 и экспрессирующие растворимый рецептор 1шха1р11а11/МВР-6Н (пример 13), выращивали в супербульоне II (12 г/л казеина, 24 г/л дрожжевого экстракта, 11,4 г/л дикалий-фосфата, 1,7 г/л монокалий-фосфата; Вес!оп Оккепкоп, СоскеукуШе, МО) и замораживали в 0,5% глицерине. 20 г замороженных клеток в супербульоне II + глицерин использовали для очистки белка. Замороженные клетки оттаивали и разводили 1:10 в растворе протеазного ингибитора (буфера для экстракции) перед лизисом этих клеток и высвобождением растворимого рецепторного белка 1шха1рНа11/МВР-6Н. Разведенные клетки содержали конечные концентрации 20 мМ Трис НТ Вакег, РЫйркЬигд, N1), 100 мМ хлорид натрия (№С1, МаШпкгоб!, Рапк, ΚΥ), 0,5 мМ фенилметилсульфонилфторид (РМ8Е, 81дта СНет1са1 Со., 8!. Ьошк, МО), 2 мкг/мл лейпептина (Е1ика, 8^1!/ег1апб) и 2 мкг/мл апротинина (81дта). Систему разрушения клеток ЕгепсН Ргекк (Сопк!ап! 8ук!етк Ь!б., УагМск, ИК) с температурой от -7 до -10°С и 30 кф/кв.дюйм использовали для лизиса клеток. Разведенные клетки проверяли на разрушение считываниями А₆₀₀ до и после ЕгепсН Ргекк. Лизированные клетки центрифугировали при 18000 д в течение 45 мин для удаления дебриса разрушенных клеток и супернатант использовали для очистки белка. Концентрации общего белка супернатанта определяли по БСА-способу (Р1егсе, КоскЕогб, ГО) согласно инструкциям изготовителя.

- 46 006501

Субстрат колонки (25 мл) Τη^η Ме!а11 Мйш!у (НойесН. Ра1о ΑίΦ. СΑ) (приготовленный, как описано ниже) выливали в стеклянную колонку Вю-Каб. 2.5 см диаметр х ΐ0 см высота. Колонку упаковывали и уравновешивали под действием силы тяжести ΐ0 колоночными объемами (КО) буфера для уравновешивания Τа1οη (20 мМ Трис, ΐ00 мМ №С1. рН 8.0). Супернатант периодически наносили на аффинную смолу Τа1οη Ме!а11 Αίίίη^ гект и качали в течение ночи. Смолу выливали обратно в колонку и промывали ΐ0 колоночными объемами буфера для уравновешивания Τа1οη под действием силы тяжести, затем проводили элюцию под действием силы тяжести ΐ40 мл буфера для элюции (буфер для уравновешивания Τа1οη + 200 мМ имидазол, Р1ика СНет1са1). Та1оп-колонку очищали 5 колоночными объемами 20 мМ 2-(№морфолино)этансульфоновой кислоты рН 5.0 (МЕ8. 81дта). 5 колоночными объемами дистиллированной Н₂0, затем хранили в смеси 20% этанол/0,1% азид натрия. Фракции по 14 мл собирали на протяжении всей элюционной хроматографии и фракции считывали по поглощению при 280 и 320 нм и белок определяли по БСА-способу; проходящий через колонку и промывочный пулы также сохраняли и анализировали. Фракции элюции представляющего интерес белка объединяли и наносили сразу на амилозную смолу (№\ν ЕпдЕшб Вю1аЬк. Веуег1у. МΑ).

Для получения более чистого полипептида Нц7а1рНаИ/МВР-6Н объединенные фракции элюции с Та1оп-аффинной колонки подвергали хроматографии на амилозной смоле (22 мл) при рН 7.4. Колонку В1о-Каб с диаметром 2.5 см и высотой ΐ0 см заливали, упаковывали и уравновешивали в ΐ0 колоночных объемах амилозного буфера для уравновешивания 20 мМ Трис (ТГ Вакег). ΐ00 мМ №С1 (МаПшктоб!). ΐ мМ ПМСФ (81дта). ΐ0 мМ бета-меркаптоэтанол (ВМЕ, IСN Вютеб1са1к 1пс.. Αи^ο^а, ОН) рН 7.4. Пробу наносили под действием силы тяжести при скорости тока 0.5 мл/мин. Колонку промывали ΐ0 колоночными объемами амилозного буфера для уравновешивания, затем элюировали ~2 колоночными объемами смеси амилозный буфер для уравновешивания + ΐ0 мМ мальтоза (Р1ика. В1осНетка1 8\уГОегктб) под действием силы тяжести. Фракции по 5 мл собирали на протяжении всей хроматографии и измеряли поглощение при 280 и 320 нм. Амилозную колонку регенерировали ΐ колоночным объемом дистиллированной Н₂0. 5 колоночными объемами 0.ΐ% (мас./об.) ДСН (81дта). 5 колоночными объемами дистиллированной Н20 и затем 5 колоночными объемами амилозного буфера для уравновешивания.

Представляющие интерес фракции объединяли и диализовали в 81^бе-Α-^уζе^ (Р1егсе) с 4х4л ЗФР рН 7.4 (81дта) для удаления низкомолекулярных примесей, смены буфера и обессоливания. После замен ЗФР собранный материал представлял собой очищенный полипептид 1шха1рНа11/МВР-6Н. Очищенный полипептид 1шха1р11а 11 /МВР-6Н анализировали электрофорезом на ДСН-ПААГ с окрашиванием Кумасси и Вестерн-блот-анализом с антикроличьим антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена (НКР) (КоскЕ-тб. СИЬеПкуШе. РΑ). Концентрация полипептида 1шха1р11а11/МВР-6Н была ΐ.92 мг/мл, как определено БСА-анализом.

Очищенный полипептид 1шха1р11а 11 /МВР-6Н готовили для инъекции в кроликов и отсылали в К & К КекеагсН аиб ЭеуекртегИ (8!аиетооб. \νΑ) для получения антител. Кроликов инъецировали для получения антисыворотки против 11иха1р11а11/МВР-6Н (пример ΐ5 ниже).

Пример ΐ5. Поликлональные антитела к ζа1ρНа11.

Поликлональные антитела получали иммунизацией двух самок новозеландских белых кроликов очищенным полипептидом 1шха1рНа11/МВР-6Н (пример ΐ4) или очищенным рекомбинантным растворимым рецептором ζа1ρНа11СЕЕ (пример 11А). Соответствующие поликлональные антитела были названы кроличье антитело анти-Н^а1рНа11/МВР-6Н и кроличье антитело анти-НиζаίρНа11-СЕЕ-ΒΗК, соответственно. Каждый кролик получал исходную внутрибрюшинную инъекцию (1Р) 200 мг очищенного белка в полном адъюванте Фрейнда (Р1егсе. КоскПогб. 1Ь) с последующими бустерными инъекциями 1Р ΐ00 мг очищенного белка в неполном адъюванте Фрейнда каждые 3 недели. Спустя 7-10 недель после введения третьей бустерной инъекции производили кровоизвлечение у животных и собирали сыворотку. Затем кроликам продолжали вводить бустер-инъекции и брали кровь каждые 3 недели.

Ζ;·ι1ρ1ι;·ι11 -специфические поликлональные антитела очищали аффинно из сывороток кроликов с использованием колонки СNΒ^-8ЕРΗЛК08Е 4В рго!еш (РНагташа ЬКВ). которую готовили с использованием ΐ0 мг очищенного полипептида Ниха1рНа11/МВР-6Н (пример ΐ4) на грамм СNΒ^-8ЕРΗЛК08Е с последующим 20Х диализом в ЗФР в течение ночи. Ζ;·ι1ρ1ι;·ι 11 -специфические антитела характеризовали проверкой титра при помощи Е^I8Л с применением ΐ мг/мл подходящего белкового антигена в качестве мишени антител. Нижним порогом детектирования (ЬЬП) кроличьего аффинно очищенного антитела анти-Н^а1рНа11/МВР-6Н является разведение 500 пг/мл. ΗΕΌ кроличьего аффинно очищенного антитела анти-11иха1р11а 11-СЕЕ-ВНК является разведение 50 пг/мл.

Пример ΐ6. Идентификация клеток, экспрессирующих ха1рка 11-рецептор, при помощи ОТ-ПЦР.

Специфические типы клеток человека выделяли и подвергали скринингу на экспрессию ζа1ρНа11 при помощи ОТ-ПЦР. В-клетки выделяли из свежих миндалин человека механическим разрушением через найлоновые клеточные деформаторы (ΐ00 мкм) (Ри1соп™: Весиог1 ^^скеηκοη. РгаикИп Ζакеκ. N1). Вклеточные суспензии обогащали СЭ19+ В-клетками положительным отбором с магнитной колонкой Vа^^οМΑС8 У8+ и СО 19 микрогранулами (МШет Вю!ес. Α^υη, СА) согласно инструкциям изготовителя. Т-клетки и моноциты выделяли из прикрепленных проб крови человека. СЭ3+ Т-клетки очищали положительным отбором с использованием СЭ3 микрогранул Vа^^οМΑС8, а моноциты очищали при

- 47 006501 помощи колонок отрицательного отбора Vа^^оМАС8 (Мб!еиу1) согласно инструкциям изготовителя. Пробы из каждой популяции окрашивали и анализировали клеточным сортингом с возбуждением флуоресценции (РАС8) (Весбои ^^ск^ηкоη. 8аи 1оке, СА) для определения процента обогащения и полученных выходов. СБ19+ В-клетки имели чистоту приблизительно 96%, СБ3+ Т-клетки имели чистоту приблизительно 95%, и моноциты имели чистоту приблизительно 96%.

РНК получали при помощи стандартного в данной области способа из всех трех типов, которые были либо покоящимися, либо активированными. РНК выделяли из покоящихся клеток непосредственно из описанных выше колоночных препаратов. СБ19+ и СБ3+ клетки активировали культивированием при 500000 клеток/мл в среде КРМI + 10% ФТС, содержащей ФМЛ 5 нг/мл (Са1Ьюсбет, Ба 1о11а, СА) и иономицин 0,5 мкг/мл (Са1Ьюсбет), в течение 4 и 24 ч. Моноциты активировали культивированием в КРМI + 10% ФТС, содержащей БР8 10 нг/мл (81дта 8!. Бошк МО) и гЫРк-уд 10 нг/мл (К & Ό, М^еаробк, М№), в течение 24 ч. Клетки собирали и промывали в ЗФР. РНК получали из клеточных осадков с использованием набора КХеаку М1б1ргер™ (О|адеп Vа1еис^а, СА) согласно инструкциям изготовителя и синтез первой цепи кДНК выполняли с набором 8ирегкспр! ΙΙ™ (О1Ьсо ВКБ, Огаиб Ыаиб, ΠΥ) согласно инструкциям изготовителя.

Олигонуклеотиды ΖΟ9907 (8ЕО ΙΌ N0:20) и ΖΟ9908 (8ЕО ΙΌ N0:21) использовали в ПЦР-реакции для скрининга вышеописанных проб на фрагмент 1,2 т.п.н., соответствующий ζа1рЬа 11-сигналу. ПЦР-амплификацию проводили с полимеразой Тад (ВКБ Огаиб Ыаиб ΠΥ) и следующими условиями: 35 циклов 95°С в течение 1 мин, 60°С в течение 1 мин, 72°С в течение 30 с; 1 цикл при 72°С в течение 10 мин и пропитывание при 4°С. 10 мкл каждого реакционного объема 50 мкл подвергали электрофорезу на 2% агарозном геле 1ХТЛЕ для идентификации полученных продуктов. ПЦР-продукты оценивали как (-) отсутствие продукта, (+) видимая полоса, (++) увеличенное присутствие полосы и (+++) наиболее преобладающая полоса, результаты показаны в табл. 5 ниже.

Таблица 5

Источник кДНК	Лктивация	ПЦР-продукт
СБ19+ клетки	0 ч покоящиеся 4 ч активированные 24 ч активированные	+ ++ +++
СБ3+ клетки	0 ч покоящиеся 4 ч активированные 24 ч активированные	++
Моноциты	0 ч покоящиеся 24 ч активированные	-

Эти результаты показывают, что ζα1ρ1ια11 -сигнал присутствует в покоящихся СБ19+ В-клетках и увеличивается митогенной активацией. Он, по-видимому, экспрессируется СБ3+ Т-клетками человека только после 4 ч активации. Нет видимого сигнала ни в покоящихся, ни в активированных моноцитах человека.

Пример 17. Иммуногистохимия ζа1рйа11.

Л. Препараты клеток и тканей.

Положительные контрольные ткани состояли из клеток ВаР3, трансфицированных ζа1рйа11 (пример 7) и лимфоидных тканей, которые, как известно, экспрессируют ζа1рЬа11, в том числе лимфатического узла, селезенки и тимуса мышей, полученных из Η8Ό (Наг1аи 8ргадие Ба\\!еу, ШбхаиароБк, Ш), лимфатического узла и селезенки обезьян, полученных из Регионального Центра исследований приматов (Бшуегкйу оГ \акбшд!ои, 8еа!бе, \А), лимфатического узла и селезенки человека, полученных из СΗТN (С1еуе1аиб, ОН). Отрицательные контроли, проводимые на каждой из проб ткани, включали (1) нетрансфицированные клетки ВаР3, (2) печень и мозг мышей и человека, которые, как известно, не экспрессируют ζа1рЬа11, (3) окрашивание буфером для разведения антител ^еШаии Вю!еск 8ук!етк, Тискои ΛΖ) в отсутствие первичного антитела и (4) использование растворимого белка ζа1р11а11 в конкурентных экспериментах.

Испытывали пробы других клеток. Тестировали как нестимулированные, так и стимулированные клетки НБ60. Клетки НБ60 являются промиелоцитарной клеточной линией, которая может быть дифференцирована в миелоидную или гранулоцитарную линию дифференцировки различными реагентами. Стимулированные пробы НБ60 готовили следующим образом: клетки НБ60 обрабатывали 10 нг/мл форбол-миристат-ацетата (ФМЛ) (81дта, 8!. Бошк, МО) в течение 48 ч для дифференцировки в клетки моноцитарной линии; и (2) клетки НБ60 обрабатывали 1,25% ДМСО (81дта) в течение 4 дней для дифференцировки в нейтрофилподобные клетки. Кроме того, исследовали полиморфонуклеарные (РМП) клетки человека, гранулоциты человека, лимфоциты периферической крови человека (РВБ) и моноциты человека из свежей крови человека (полученные в лаборатории с использованием рутинных способов в данной области). Эти клетки и ткани, описанные выше, фиксировали в течение ночи в 10% ПВР (8игд1ра!б, Кюбшоиб, К) и заделывали в рагара1к! Х-!га (0хГогб 8с1еибйс, 8!. Бошк, МО) и делали срезы 5 мкм на микротоме Кекбаб-киид 2050 (Бека Iηй^итеи!к ОтЬН, Шкйосб Оегтаиу).

- 48 006501

В. Иммуногистохимия.

Тканевые микроскопические препараты депарафинизировали, гидратировали в буфере (воде) и подвергали паровой обработке ШЕК в буфере АпБдеп Ке1пеуа1 Сйга ЬиГГег (ВюСепех, 8ап Котап, СА) в течение 20 мин. 5% нормальную козью сыворотку (Уес!ог, ВигБпдате, СА) использовали для блокирования неспецифического связывания в течение 10 мин. Иммуноцитохимические анализы-скрининги проводили с использованием поликлональных антител к растворимому рецепторному белку ха1рНа11 (кроличье антитело анти-Ниха1рНа11/МВР-6Н и кроличье антитело анти-Ниха1рНа11-СЕЕ-ВНК, см. пример 15) в качестве первичных антител, при разведениях 1:200 и 1:400, соответственно. Конъюгированные с биотином козьи антитела против кроличьего ^С (Уес!ог, Са!. ЫО. ВА-1000, 1,5 мг/мл) использовали в качестве вторичного антитела при разведении 1:200. В отдельных пробах конкуренцию белков проводили с использованием добавления растворимого рецепторного белка ха1рНа11СЕЕ (в 10-кратном избытке) (пример 11А) к первичному антителу для предблокирования иммунной реакции первичных антител. Эту конкуренцию использовали в качестве контроля на специфичность кроличьих поликлональных антител в отношении ха1рНа11. Детектирование проводили на приборе УегИапа СНетМа!е 500 с использованием набора СНетМа!е ЭЛВ к1! (меченый стрептавидином-биотином набор с применением конъюгата стрептавидин-пероксидаза хрена и ΌΆΒ-субстрата) согласно инструкциям изготовителя и с использованием контрастного красителя гематоксилина изготовителя в течение 30 с (Уеп!апа В1о!еск 8ук!етк, Тископ, А2).

Высокую экспрессию ха1рНа11 наблюдали в ФМА-активированных клетках. Низкий уровень экспрессии наблюдали в РВЬ и клетках НЬ60 без стимуляции. Субпопуляция клеток в селезенке, тимусе и лимфатическом узле мыши обнаружила положительное окрашивание. Лимфатический узел и селезенка как человека, так и обезьяны и клетки НЬ60 со стимуляцией ДМСО обнаружили минимальное окрашивание или вообще не обнаружили окрашивания. Сигнал, наблюдаемый в этих клетках и тканях, большей частью устранялся в результате конкуренции при использовании избытка растворимого рецепторного белка ха1рНа11. Отрицательные контрольные ткани мозга и печени не обнаружили окрашивания.

Пример 18. Идентификация мононуклеарных клеток периферической крови (РВМЫС), которые экспрессируют рецептор ха1рНа1Е с использованием поликлональных кроличьих антисывороток к растворимому рецептору ха1рНа11.

200 мл свежей гепаринизированной крови получали из нормального донора. Кровь разводили 1:1 в ЗФР и разделяли в градиенте Е|со11-Рас.|ие РЬИ8 (РНагтаДа В1о!есН, Иррка1а, 8\уебеп) и лимфоциты собирали на границе раздела. Клетки промывали 2Х в ЗФР и ресуспендировали в КРМI + 5% ФТС при концентрации 2х 1 0⁶ клеток/мл.

Для определения, действует ли на экспрессию рецептора ха1рНа11 активированное состояние лимфоцитов, т.е. между покоящимися или активированными клетками, использовали несколько состояний стимуляции: 1) нестимулированные, т.е. только среда (среда КРМI + 5% ФТС); 2) стимулированные ФМА 10 нг/мл + иономицин 0,5 мкг/мл (оба из (Са1ЬюсНет)); и 3) активация ФГА (фитогемагглютининР, Э|Гсо/УУК). Клетки инкубировали при 37°С в течение 17 ч, затем собирали для окрашивания для детектирования рецептора ха1рНа11.

Использовали протокол непрямого окрашивания. Вкратце, лимфоциты человека суспендировали в буфере для окрашивания (ЗФР + 0,02% ЫаЫ₃ + БСА 1%, сыворотка здорового человека 2%) и высевали при 2х10⁵ клеток в 50 мкл на лунку в 96-луночном микротитрационном планшете. Антитела к растворимому рецептору ха1рНа11 СЕЕ (пример 15) использовали для определения, окрашиваются ли они вместе с В-клеточным (СО-19), Т-клеточным (СО-3) или моноцитарным (СО-14) маркером на выделенных лимфоцитах человека. Кроличьи поликлональные сыворотки к растворимому рецептору ха1рНа11 (кроличьи анти-1шха1р11а11-СЕЕ-ВНК) (пример 15) при 10 мкг/мл использовали в качестве антитела для идентификации ха1рНа11 на лимфоцитах. Второе антитело, козьи антитела против кроличьего ^-Е^С (Вюкоигсе, СашагШо, СА) использовали для визуализации связывания кроличьего антитела анти-1шха1р11а11-СЕЕВНК с рецепторами ха1рНа11. Другие антитела одновременно использовали для окрашивания Т-клеток (СО3-РЕ; РЬагМшдеп, 8ап О1едо, СА), В-клеток (СО19-РЕ) (РЬагМшдеп) и моноцитов (СО-14-РЕ) (РЬагМшдеп) для идентификации совместного окрашивания антитела против рецептора ха1рНа11 на этих типах клеток. Различные контроли использовали для определения неспецифического связывания и уровней фона окрашивания: (1) посторонние кроличьи поликлональные сыворотки использовали в качестве неспецифического контроля, и (2) одно вторичное антитело использовали для определения фонового связывания этого реагента. Очищенный растворимый рецептор ха1рНа11СЕЕ (пример 1) использовали приблизительно в 1 0-кратном избытке в качестве конкурентного ингибитора для подтверждения специфичности кроличьего антитела анти-1шха1рЬа 11 -СЕЕ-ВНК в отношении растворимого рецептора ха1рНа11.

После посева этих клеток и добавления первичных и одновременно окрашивающих антител клетки инкубировали на льду в течение 30 мин, промывали 2Х буфером для окрашивания и окрашивали вторичным антителом, козьими антителами против кроличьего ^-Е^С (Вюкоигсе), в течение 30 мин на льду. Клетки промывали 2Х буфером для окрашивания и ресуспендировали при 200 мкл на лунку в буфере для окрашивания, содержащем жизнеспособный штамм 7АА.О при конечной концентрации 1 мкг/мл (81дта, 8!. Ьошк, МО). Пробы считывали на приборе ЕАС8-СаЪЬег (ВесБоп Оюкшкоп, 8апЛоке, СА) и жизнеспособные клетки анализировали.

- 49 006501

Кроличьи поликлональные антитела к рецептору /а1рйа11 окрашивали покоящиеся В-клетки. Сигнал на покоящихся В-клетках был более ярким, чем сигнал, полученный с использованием посторонних кроличьих сывороток, и сигнал уменьшался в большей степени на В-клетках, чем на Т-клетках, с добавлением избытка растворимого рецептора /а1рйа11СЕЕ. Этот эксперимент повторяли с использованием разделенных В-клеток и Т-клеток, и результаты были очень похожими. Опять окрашивание поликлональными кроличьими антителами анти-1и.аа1рНа11СЕЕ-ВН1< к рецептору /а1рйа11 было наивысшим на покоящихся В-клетках.

Пример 19. Экспрессия рецептора /а1рЬа11 в различных тканях с использованием количественной ОТ-ПЦР реального времени.

A. Праймеры и зонды для количественной ОТ-ПЦР.

Количественная ОТ-ПЦР реального времени с использованием системы детектирования последовательностей ΛВI РК18М 7700 (РЕ АррНеб В1окук!етк, Шс., Еок!ег Сйу, СА) была описана ранее (См. Не1б,

С.А. е! а1., Сепоте Кекеагсй 6:986-994, 1996; С1Ькоп, и.Е.М. е! а1., Сепоте Кекеагсй 6:995-1001, 1996; 8ипбагекап, 8. е! а1., Епбосппо1оду 139:4756-4764, 1998). Этот способ включает в себя применение генспецифического зонда, содержащего как репортерный, так и гасящий флуоресцентные красители. Когда зонд является интактным, излучение репортерного красителя гасится вследствие тесной близости гасящего красителя. Во время ПЦР-удлинения с использованием ген-специфических прямого и обратного праймеров зонд расщепляется 5'-нуклеазной активностью полимеразы Тад, что высвобождает репортерный краситель из зонда, приводя к увеличению флуоресцентного излучения.

Праймеры и зонды, используемые для количественных ОТ-ПЦР-анализов реального времени экспрессии /а1рЬа11, сконструированы с использованием программного обеспечения для конструирования праймеров Рпшег Ехргекк™ (РЕ АррНеб В1окук!етк, Еок!ег Сйу, СА). Праймеры для /а1рЬа11 человека сконструированы простирающимися с охватыванием интрон-экзонного сочленения для элиминации амплификации геномной ДНК. Прямой праймер, 2С22277 (8ЕЦ ΙΌ N0:59), и обратный праймер, 2С22276 (8ЕЦ ΙΌ N0:60), использовали в ПЦР-реакции (ниже) в концентрации приблизительно 300 нМ для синтеза продукта 143 п.н. Соответствующий зонд /а1рЬа11 ТадМап®, названный 2С31 (8ЕЦ ΙΌ N0:61), был синтезирован и помечен РЕ АррНеб Вюкук1етк. Зонд 2С31 метили на 5'-конце репортерным флуресцентным красителем (6-карбоксифлуоресцеином) (ЕАМ) (РЕ АррНеб Вшкук!етк) и на 3'-конце гасящим флуоресцентным красителем (6-карбокситетраметилродамином) (ТАМКА) (РЕ АррНеб Вшкук!етк).

В качестве контроля для тестирования целостности и качества тестируемых проб РНК все пробы РНК (ниже) подвергали скринингу на рРНК с использованием набора праймеров и зондов из РЕ АррНеб Вюкук!етк (са! №. 4304483). Этот набор содержит прямой праймер рРНК (8ЕЦ ΙΌ N0:66) и обратный праймер рРНК (8ЕЦ ΙΌ N0:67), рРНК-зонд ТадМап® (8ЕЦ ΙΌ N0:68). рРНК-зонд был помечен на 5'-конце репортерным флуоресцентным красителем УТС (РЕ АррНеб Вшкук!етк) и на 3'-конце гасящим флуоресцентным гасителем ТАМКА (РЕ АррНеб Вюкук!етк). Результаты с рРНК служат также в качестве эндогенного контроля и позволяют нормализовать результаты по экспрессии мРНК /а1рйа11, наблюдаемые в тест-пробах.

Пробы РНК из СО3, СО 19 и моноцитарных типов клеток человека получали и описывали, как в примере 16 выше. Контрольную РНК получали с использованием набора КЫеаку М1шргер™ Κι! (О|адеп, Уа1епс1а, СА) согласно инструкциям изготовителя из приблизительно 10 млн клеток ВаЕ3, экспрессирующих рецептор /а1рйа11 человека (пример 7).

B. Количественная ОТ-ПЦР реального времени.

Относительные уровни мРНК /а1рйа11 определяли анализом проб тотальной РНК с использованием одностадийного способа ОТ-ПЦР (РЕ АррНеб Вюкук!етк). Тотальную РНК из клеток ВаЕ3, экспрессирующих рецептор /а1рйа11 человека, выделяли стандартными способами и использовали для получения стандартной кривой, используемой для количественного определения. Кривая состояла из 1 0-кратных серийных разведении в диапазоне от 2,5-2,6 х 10^-4 нг/мкл для скрининга рРНК и 250-0,025 нг/мкл для скрининга /а1рйа11, причем каждую точку стандартной кривой анализировали в трех повторностях. Пробы тотальной РНК из СО3, СЭ19 клеток и моноцитов человека также анализировали в трех повторностях для уровней транскрипта /а1рйа11 человека и для уровней рРНК в качестве эндогенного контроля. В общем объеме 25 мкл каждую пробу РНК подвергали одностадийной ОТ-ПЦР-реакции, содержащей приблизительно 25 нг тотальной РНК в буфере А (50 мМ КС1, 10 мМ Трис-НС1); внутренний стандартный краситель, карбокси-х-родамин (К0Х); подходящие праймеры (приблизительно 50 нМ рРНК-праймеры (8ЕЦ ΙΌ N0:66 и 8ЕЦ ΙΌ N0:67) для проб рРНК; и приблизительно 300 нМ праймеры 2С22277 (8ЕЦ ΙΌ N0:59) и 2С22276 (8ЕЦ ΙΌ N0:60) для проб /а1рйа11); подходящий зонд (приблизительно 50 нМ рРНКзонд Тас.|Мап^к' (8ЕЦ ΙΌ N0:68) для проб рРНК, приблизительно 100 нМ 2С31 (8ЕЦ ΙΌ N0:61) для проб /а1рйа11); 5,5 мМ МдС1₂; 300 мкМ каждого из б-СТР, б-АТР и б-СТР и 600 мкМ б-ИТР; обратную транскриптазу МиЬУ (0,25 Е/мл); ДНК-полимеразу АтрИТад'™ Со1б (0,025 Е/мкл) (РЕ АррНеб Вшкук!етк) и ингибитор РНКазы (0,4 Е/мкл) (РЕ АррНеб Вюкук!етк). Условия термоциклирования ПЦР были следующими: начальная стадия обратной транскрипции (ОТ) из одного цикла при 48°С в течение 30 мин; с последующей стадией активации АтрНТад Со1б™ (РЕ АррНеб Вшкук!етк) из 1 цикла при 95°С в течение 10 мин; с последующими 40 циклами амплификации при 95°С в течение 15 с и 60°С в течение 1 мин.

- 50 006501

Относительные уровни РНК 7а1рЬа11 определяли с использованием способа стандартных кривых, как описано изготовителем, РЕ Вюкук!етк (Икег Ви11е!ш №. 2: ΛΒI Рпкт 7700 8ециепсе Пе!ес!юп 8ук!ет, Ре1аНуе ОиапШаРоп о£ Сепе Ехргеккюп, ОесетЬег 11, 1997). Измерения рРНК использовали для нормализации уровней 7а1рЬа11, а пробу РНК покоящихся СЭ3+ клеток использовали в качестве калибратора. Покоящиеся ί'Ό3+ клетки выбирали произвольно в качестве калибратора и давали им величину 1,00. Остальные пробы сравнивали относительно калибратора. Данные показаны в табл. 6 ниже.

Таблица 6

Проба	Покоящиеся	4 ч стимуляция	24 ч стимуляция
СО3	1,00	15,27	16,70
СО19	20,14	65,08	25,42
Моноциты	0,05	Нет данных	0,26

Наблюдали 15-кратное увеличение в экспрессии рецептора ζαφΙαΠ в СЭ3+ при 4 и 24 ч. Покоящиеся ί'Ό19 имели 20-кратное увеличение в экспрессии рецептора относительно покоящихся СЭ3+. 3-кратное увеличение имело место с 4-часовой стимуляцией, которое возвращалось к уровню покоящихся клеток при 24 ч. Моноциты не обнаружили детектируемой экспрессии рецептора ζαφΙαΠ в этом анализе.

Пример 20. Идентификация клеток, экспрессирующих рецептор 7а1рЬа11, с использованием гибридизации ш кйи.

Специфические ткани человека выделяли и подвергали скринингу на экспрессию ζαφΙαΠ ш кйи. Получали различные ткани человека, делали срезы и подвергали их гибридизации ш кйи, в том числе тимус, селезенку, миндалину, лимфатический узел и легкое. Ткани фиксировали в 10% забуференном формалине и заключали в парафин с использованием стандартных способов (пример 17). Делали срезы тканей при 4-8 мкм. Препараты тканей готовили с использованием стандартного протокола («Оеуе1ор1пеп1 о£ поп-1ко!ор1с т кйи НуЬг1б1ха(1оп» в 1Шр://бй.ше11к. шй. до\7бй1ер/|к11.1ит1). Вкратце, срезы тканей депарафинизировали при помощи Н1к!оС1еаг (№Ропа1 П1адпок!1ск, А11ап!а, СА) и затем дегидратировали этанолом. Затем их расщепляли протеиназой К (50 мкг/мл) (Воейппдег П1адпокйск, Ыбхапаройк, Ш) при 37°С в течение 2-20 мин. Эта стадия сопровождалась ацетилированием и регидратацией тканей.

Два 1п кйи зонда, генерируемых ПЦР, были сконструированы на основе последовательности 7а1рйа11 человека. Были сконструированы два набора олигонуклеотидов для генерирования зондов для отдельных районов кДНК ха1рНа11: (1) олигонуклеотиды 2С23684 (8ЕЦ ΙΌ N0:62) и 2С23656 (8ЕЦ ΙΌ N0:63) использовали для генерирования зонда 413 п.н. для 7а1рЬа11; и (2) олигонуклеотиды ΖΟ23685 (8ЕЦ ΙΌ N0:64) и ΖС23657 (8ЕЦ ΙΌ N0:65) использовали для генерирования зонда 430 п.н. для 7а1рЬа11. Второй зонд находится на 1500 п.н. 3' от первого зонда 7а1рЬа11. Антисмысловой олигонуклеотид из каждого набора также содержал рабочую последовательность для промотора РНК-полимеразы Т7, чтобы сделать возможной легкую транскрипцию антисмыловых РНК-зондов из этих ПЦР-продуктов. Условия ПЦР-реакции были следующими: 30 циклов при 94°С в течение 30 с, 60°С в течение 1 мин, 72°С в течение 1,5 мин. ПЦР-продукты очищали ротационными колонками Ц/адеи с последующими экстракцией смесью фенол/хлороформ и осаждением этанолом. Зонды затем метили диоксигенином (Воейппдег) или биотином (Воейппдег) с использованием системы транскрипции ш уйго (Рготеда, Мабйоп, νΙ) согласно инструкциям изготовителя.

Гибридизацию ш кйи проводили с меченным диоксигенином или биотином зондом ха1рНа11 (см. выше). Зонд добавляли к микроскопическим перпаратам (предметным стеклам) в концентрации 1-5 пмоль/мл в течение 12-16 ч при 55-60°С. Затем препараты промывали в 2Х 88С и 0,1Х 88С при 50°С. Сигналы усиливали с использованием тирамидного усиления сигналов (Т8А) (Т8А, ш кйи непрямой набор; ЫЕЩ и визуализировали с набором Уес!ог Реб киЬкйа! кй (Уес!ог ЬаЬ) согласно инструкциям изготовителя. Затем предметные стекла окрашивали контрастным красителем гематоксилином (Уес!ог ЬаЬога!опек, Вигйпдате, СА).

Сигнал наблюдали в тимусе, миндалине, легком и лимфатическом узле. Положительно окрашивающиеся клетки, по-видимому, являются лимфоцитами и родственными клетками.

Пример 21. Выделение мышиного рецептора ζαφΙαΠ.

А. Скрининг мышиной геномной библиотеки.

Исходную частичную последовательность мышиного ζαφΙαΠ получали зондированием мышиной геномной библиотеки полинуклеотидным зондом рецептора 7а1рЬа11 человека, содержащим полную кДНК. кДНК 7а1рЬа11 человека генерировали при помощи ПЦР с праймерами ΖΟ9905 (8ЕЦ ΙΌ N0:36) и ΖΟ9906 (8ЕЦ ΙΌ N0:37) и плазмиду, содержащую полноразмерный ζαφΙαΠ человека (например, примера 1), использовали в качестве матрицы. Условия ПЦР были следующими: 35 циклов при 98°С в течение 1 мин, 68°С в течение 1 мин и 72°С в течение 2 мин; затем 1 цикл при 72°С в течение 10 мин. ПЦР-продукт подвергали электрофорезу на 1% агарозе с низкой точкой плавления (Воейппдег Маппйеш) и кДНК ха1рНа11 человека приблизительно 1,5 т.п.н. выделяли с использованием набора для экстракции гелей О/асцнск'¹™ (Ц/адеп) согласно инструкциям изготовителя. Эту кДНК ха1рНа 11 человека использовали для скрининга мышиной библиотеки геномной ДНК (ниже).

- 51 006501

Используемой мышиной библиотекой геномной ДНК была клонированная библиотека етЬ13 ВР6/Т7 1атЬба ΒатΗЕ (С1оп!есЬ, Ра1о А1!о, СА). Эту библиотеку, представляющую 7,2х10⁵ БОЕ, высевали на «газон» хозяина Е. со11 Κ802 на чашках 24 NΖΥ. Подъемы бляшек выполняли с использованием фильтров НуЬопб^ (АтегкЬат РБагтас1а, Βиск1шдаткй^^е, Епд1апб, ИК) согласно инструкциям изготовителя. Фильтры денатурировали в 1,5 М №1С1 и 0,5 М №10Н в течение 10 мин и затем нейтрализовали в

1,5 М №1С1 и 0,5 М Трис-НС1 (рН 7,2) в течение 10 мин. ДНК прикрепляли к фильтру с использованием сшивающего агента ВТΕΑТΑ^ЕNΚЕΕ ИУ (В1га!адеие) при 1200 Дж. Фильтры предварительно промывали для удаления клеточного дебриса при 65°С в буфере для предварительной промывки (0,25 х ВВС, 0,25% ДСН и 1 мМ ЭДТА), со сменой раствора 3 раза в течение 45 мин (в целом). Фильтры предгибридизовали в течение ночи при 50°С в растворе ЕхргеккЬуЬ™ (С1оп!есЬ), содержащем 0,1 мг/мл денатурированной ДНК спермы лосося. Приблизительно 50 нг очищенной кДНК ха1рНа11 человека (см. выше) метили ³²Р с использованием системы мечения Εеб^р^^те ЕЕ Εаибοт Рпте ЬаЬе1шд Вук!ет (АтегкЬат Рйатташа) согласно инструкциям изготовителя. Невключившуюся радиоактивность удаляли из кДНК-зонда ха1рНа11 с использованием рикй-колонки ШсТгар™ (В1га!адепе, Ьа 1о11а, СА). Фильтры гибридизовали в растворе ЕхргеккЬуЬ™ (С1оп!есЬ), содержащем приблизительно 0,5-приблизительно 1х10⁶ имп./мин/мл кДНКзонда ха1рНа11, приблизительно 0,1 мг/мл денатурированной ДНК спермы лосося и 0,5 мкг/мл денатурированной ДНК со!-1. Гибридизация имела место в течение ночи при 50°С. Фильтры промывали в 2х ВВС, 0,1% ДСН при комнатной температуре в течение 2 ч (со сменой промывок несколько раз), затем температуру повышали до 60°С на 1 ч (со сменой буфера 1 раз). Экспонирование в течение ночи при -80°С обнаружило 6 бляшек, представляющих первичные изоляты.

Для получения вторичных изолятов бляшек 6 бляшек, представляющих первичные изоляты, извлекали пастеровской пипеткой и элюировали в течение ночи при 4°С в 1 мл ВМ (0,1 М №С1, 50 мМ Трис рН 7,5, 10 мМ МдВ0₄, 0,02% желатина), содержащем несколько капель хлороформа. После определения титров фага приблизительно 12,5Х оцененного количества фага в исходной извлеченной «пробке» (12,5Х покрытие) 6 первичных изолятов высевали на газон клеток Е. со11 К802, заделанных в 10 мМ ΜдВ0₄/NΖΥ верхней агарозы, на макси-чашках NXΥ и выращивали в течение ночи при 37°С. Подъемы бляшек производили с использованием фильтров НуЬопб^ (АтегкЬат РБагташа) согласно инструкциям изготовителя. Фильтры фиксировали, как описано выше. Эти фильтры второго раунда предварительно промывали для удаления клеточного дебриса при 65°С в буфере для предварительной промывки (2х ВВС, 0,1% ДСН и 1 мМ ЭДТА), со сменой раствора 3 раза в течение 45 мин (в целом). Затем фильтры второго раунда предгибридизовали и кДНК-зонд ха1рНа11 готовили, как описано выше.

Фильтры второго раунда гибридизовали, как описано выше, в растворе ЕхргеккЬуЬ™ (С1оп!есЬ), содержащем приблизительно 10⁶ имп/мин/мл кДНК-зонда ха1рНа11 и приблизительно 0,1 мг/мл денатурированной ДНК спермы лосося. Гибридизация имела место в течение ночи при 50°С. Условия промывок, описанные выше для первичного скрининга, повторяли для этого вторичного скрининга. После экспонирования в течение ночи при -80°С две из 6 первоначальных первичных бляшек были подтверждены как положительные во втором скрининге. Положительные бляшки, гибридизующиеся с кДНК ха1р1111 человека во втором скрининге, извлекали в виде «пробки» пастеровской пипеткой, и они были названы 7Ь1 и 20Ь1.

Выделенные бляшки №. 7Ь1 и 20Ь1 элюировали в 200 мкл ВМ в течение ночи при 4°С. Серийные 10-кратные разведения в диапазоне от 10^-2 до 10^-6 каждого изолята высевали на клетки-хозяева Е. со11 Κ802 для определения титра. Изолят 20Ь1 имел титр 4х10³ БОЕ/мкл, и им занимались далее. Готовили 4 чашки посевом 10⁵ БОЕ на чашку на конфлюэнтные клетки (газоны) Е. со11 К802 для получения препарата ДНК фага. Чашки выращивали при 37°С в течение приблизительно 6,5 ч, пока фаговый лизис не начинал становиться конфлюэнтным. Затем фаг элюировали в течение ночи при 4°С в 12 мл ВМ на одну чашку. Затем чашки встряхивали при комнатной температуре в течение 1 ч, супернатант удаляли; добавляли 1% хлороформ и супернатант встряхивали опять в течение 15 мин. ДНК фага 20Ь1 получали с использованием системы для очистки препаратов ДНК νί/агб ЬашЬба Ргерк ^NΑ (Рготеда, Маб1коп, VЕ; разделы ЕУ и УЕ).

Пробы ДНК фага 20Ь1 разрезали несколькими рестриктазами для получения ДНК-фрагментов для блоттинга по Саузерну. Продукты расщепления подвергали электрофорезу на 1% ТВЕ-агарозном геле. Гель вымачивали в 0,25 М НС1 в течение 30 мин; промывали в дистиллированной Н₂0; вымачивали в 0,5 М №0Н и 1,5 М №С1 в течение 40 мин с одной сменой раствора и нейтрализовали в 1,5 М №С1 и 0,5 М Трис-НС1 (рН 7,2) в течение 40 мин с одной сменой раствора. Систему быстрого переноса ТυΕΒΟΒ^ΟТТЕΕ™ Ε3Ρι6 По^нетатб ТгапкГег Вук!ет (ВсЫекЬет & ВсЬие11, Кеепе, NΗ) использовали для переноса этой ДНК на мембрану ^йап^А-В (ВсЫекЬет & ВсЬие11) в течение ночи. ДНК прикрепляли к №1гап при помощи сшивающего агента ВТΕΑТΑ^ЕNΚЕΕ ИУ (В1та1адепе ЬА 1о11а, СА) при 1200 Дж. Блот предгибридизовали, как описано выше. Приблизительно 50 нг кДНК ха1р11а11 человека метили и очищали для зонда, как описано выше. Фильтры гибридизовали, как описано выше, в растворе ЕхргеккЬуЬ™ (С1оп!есЬ), содержащем приблизительно 10⁶ имп./мин/мл кДНК-зонда ха1р11а11 и приблизительно 0,1 мг/мл денатурированной ДНК спермы лосося. Гибридизация имела место в течение ночи при 50°С. Блот промывали, как описано выше, и экспонировали на пленке в течение ночи при -80°С.

Анализ по Саузерну обнаружил ДНК-фрагмент, полученный из продукта расщепления ΒашΗЕ/В!иЕ, который гибридизовался с кДНК-зондом ха1р!1а11 человека в ожидаемом диапазоне размеров 1,3-1,6 т.п.н.

- 52 006501

Этот фрагмент использовали далее. Приблизительно 3 мкг ДНК 20Ь1 разрезали 20 единицами ВатН (Воекппдег Маппкет, Ш^а^рокк, Ш) и 20 единицами 8Н.Н (ИЕВ, Веуег1у, МА) в течение 2 ч при 37°С. Продукт расщепления подвергали электрофорезу на 1% ТВЕ-геле и дублетные полосы 1,3 т.п.н. и 1,6 т.п.н. вырезали из геля и ДНК экстрагировали из агарозы с использованием набора для экстракции гелей Οίηсциск'™ (Р1адеп, Уа1епаа, СА). Вследствие низкого выхода ДНК из этого получения было невозможно определить дополнительным анализом с расщеплением рестриктазами, были ли фрагменты, которые гибридизовались с кДНК-зондом /а1рка11 человека, ВатШ/ЗЫ- или 8!иI/8!иI-фрагментами. Таким образом, лигирования тупых концов с использованием 5 мкл дублетного фрагмента 1,3 т.п.н. и 5 мкл дублетного фрагмента 1,3 т.п.н. выполняли с использованием набора для ПЦР-клонирования 2его В1ип! РСК С1ошпд К1! (Iпν^1^одеп, Саг1кЬай, СА). Лигирование тупых концов давало положительные клоны как с фрагментами 1,6 т.п.н., так и с одним из фрагментов 1,3 т.п.н.. Эти клоны расщепляли ЕсоШ (ЬгГе Тескпо1од1ек), которая фланкирует Т-выступающий сайт, где встраивали фрагменты 1,6 и 1,3 т.п.н. Другой Саузерн-блоттинг проводили для определения, какой фрагмент был исходным фрагментом, гибридизующимся с кДНК-зондом /а1рка11 человека. 1% ТВЕ-гель обрабатывали и ДНК переносили на ку1гапблот, как описано выше.

Этот блот предгибридизовали, как описано выше, в 10 мл гибридизационного раствора. Получали отличающийся зонд полинуклеотида /а1рка11 человека. Другой фрагмент кДНК /а1рка11 человека из полноразмерной кДНК /а1рка11 генерировали для применения в качестве зонда в ПЦР с олигонуклеотидами ΖΟ9905 (8ЕО ΙΌ N0:36) и 2С20097 (8Е0 ΙΌ N0:27). Условия ПЦР-реакции были следующими: 95°С в течение 1 мин; 35 циклов 95°С в течение 1 мин, 55°С в течение 1 мин и 72°С в течение 2 мин; затем 1 цикл при 72°С в течение 10 мин. ПЦР-продукт подвергали электрофорезу на 1% агарозе с низкой точкой плавления (Воекппдег Маппкет) и кДНК /а1рка 11 человека приблизительно 1,5 т.п.н. выделяли с использованием набора для экстракции гелей О|ас.|шск'™ (01адеп) согласно инструкциям изготовителя. Приблизительно 50 нг этого выделенного кДНК-фрагмента /а1рка11 человека метили ³²Р и очищали, как описано выше. Фильтры гибридизовали в растворе ЕхргекккуЬ™ (С1оп!еск), содержащем приблизительно 10⁶ имп./мин/мл кДНК-зонда /а1рка11, приблизительно 0,1 мг/мл денатурированной ДНК спермы лосося и 0,5 мкг/мл денатурированной ДНК со!-1. Гибридизацию и промывание выполняли, как описано выше. Блот экспонировали на пленке 1,5 ч при -80°С, и вставка 1,3 т.п.н. сильно гибридизовалась с зондом /а1рка11 человека.

Этот клон секвенировали и обнаружили, что он содержит 3' кодирующий экзон мышиного /а1рка11 с терминирующим кодоном и последовательностью интрона выше по ходу транскрипции. Использовали следующие секвенирующие праймеры: ΖС3424 (8Е0 ΙΌ N0:86), ΖС694 (8Е0 ΙΌ N0:87), ΖС24399 (8Е0 ΙΌ N0:88) и ΖС24400 (8Е0 ΙΌ N0:89). Геномная последовательность мышиного /а1рка11, включающая в себя 3'-экзон, показана в 8Е0 ΙΌ N0:69. Кодирующая последовательность 3'-экзона начинается при нуклеотиде 543 и заканчивается при нуклеотиде 1262 в 8Е0 ΙΌ N0:69, кодируя 240 аминокислот (8Е0 ΙΌ N0:70).

B. ПЦР-скрининг панели мышиных кДНК.

Панель доступных у себя в лаборатории и коммерческих мышиных кДНК (С1оп!еск; Ь1Ее Тескпо1од1ек, СайкегкЬигд, МО) подвергали скринингу при помощи ПЦР с использованием ΖС24432 (8Е0 ΙΌ N0:71) и ΖС24433 (8Е0 ΙΌ N0:72) в качестве праймеров (приблизительно по 20 пмоль каждого). Условия ПЦРреакции были следующими: 94°С, 2 мин; 32 цикла 94°С в течение 20 с, 64°С в течение 30 с и 72°С в течение 30 с; затем 1 цикл при 72°С в течение 5 мин. Селезенка, дендритные клетки, неонатальная кожа, костный мозг мышей, клетки ВаЕ3 дикого типа, клетки ЕЬ4 и легкое мышей обнаружили сильно выраженные ПЦР-продукты предсказанного размера 450 п.н.

C. 5'-КАСЕ с вмонтированными праймерами.

5'-КАСЕ-реакции (быстрая амплификация концов кДНК) проводили с использованием 20 пмоль каждого из праймеров ΖС9739 (8Е0 ΙΌ N0:73) и ΖС24434 (8Е0 ΙΌ N0:74) и тага!коп (марафонской)кДНК СЭ90+ отобранных клеток селезенки мыши в качестве матрицы. Мага!кои-кДНК получали с использованием набора для амплификации тага!кои-кДНК (С1оп!еск) согласно инструкциям изготовителя. Условия ПЦР-реакции были следующими: 94°С в течение 1 мин; 5 циклов 94°С в течение 20 с и 70°С в течение 1,5 мин; затем 25 циклов 94°С в течение 20 с, 64°С в течение 20 с и 70°С в течение 1,5 мин; затем 1 цикл при 72°С в течение 5 мин.

Для обогащения в отношении 5'-КАСЕ-продукта мышиного /а1рка11 проводили 5'-КАСЕ с вмонтированными (пек!ей) праймерами с использованием описанных выше условий ПЦР-реакции для начальной 5'-КАСЕ, за исключением использования вмонтированных праймеров ΖС24431 (8Е0 ΙΌ N0:75) и ΖС9719 (8Е0 ΙΌ N0:76) и 1 мкл разведения 1/20 исходной 5'-КАСЕ-реакции (выше) в качестве матрицы. Продукты очищали гель-электрофорезом, ДНК элюировали с использованием набора для экстракции агарозных гелей 01аех ΙΙ (01адеп) и субклонировали с использованием набора для клонирования ТОТО ТА С1ошпд К1! (Iпν^1^одеп). Положительные клоны идентифицировали при помощи ПЦР колоний с использованием 10 пмоль каждого из ΖС24431 (8Е0 ΙΌ N0:75) и ΖС24511 (8Е0 ΙΌ N0:77). Условия ПЦРреакции были следующими: 94°С, 2 мин; 35 циклов 94°С в течение 20 с, 64°С в течение 20 с и 72°С в течение 30 с; затем 1 цикл при 72°С в течение 5 мин. Секвенировали два субклона из каждой из 5'-КАСЕреакций с вмонтированными праймерами. Все эти клоны содержали часть последовательности /а1рка11,

- 53 006501 но не были полными. Компилированную последовательность получали из неполных 5'-КЛСЕ-клонов и 3'-последовательности экзона (8Е0 ΙΌ ΝΟ:70) с получением предварительной частичной последовательности полинуклеотида и соответствующего полипептида мышиного ζа1рНа11. Эта предварительная последовательность частичной кДНК мышиного ζа1рНа11 показана в 8ЕО ΙΌ ΝΟ:78 (5'-конец) и 8ЕО ΙΌ ΝΟ:80 (3'-конец); имелись приблизительно 330 нуклеотидов еще неизвестной последовательности между 8ЕО ΙΌ ΝΟ:78 (5'-концом) и 8ЕО ΙΌ ΝΟ:80 (3'-концом) для получения полной кДНК мышиного ζа1рНа11 (см. ниже). Соответствующие аминокислотные последовательности для 8Е0 ΙΌ ΝΟ:78 и 8Е0 ΙΌ ΝΟ:80 показаны в 8Е0 ΙΌ ΝΟ:79 (Ν-конец) и 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 81 (С-конец), соответственно.

Ό. Полноразмерная ПЦР.

Были сконструированы праймеры из мышиногс ИТК выше по ходу транскрипции (слева) от инициирующего Ме! и ниже по ходу транскрипции (справа) от терминирующего кодона для полноразмерной ПЦР. 20 пмоль каждого из праймеров 2С24616 (8ЕО ΙΌ ΝΟ:82) и 2С24615 (8ЕО ΙΌ ΝΟ:83) использовали в ПЦР-реакциях с использованием марафонской кДНК мышиных дендритных клеток или библиотеки кДНК кожи новорожденных мышей, имеющейся в лаборатории, в качестве матрицы. Условия ПЦРреакции были следующими: 94°С, 1 мин; 30 циклов 94°С в течение 20 с и 66°С в течение 2 мин; затем 1 цикл при 72°С в течение 5 мин. ПЦР-продукты очищали гель-электрофорезом и кДНК элюировали с использованием набора для экстракции гелей 01ас|ы1ск и субклонировали с использованием набора для клонирования ТА НпуЦгодеп). Секвенировали 2 субклона из каждой ПЦР-реакции. Использовали следующие секвенирующие праймеры: 2С694 (8ЕО ΙΌ ΝΟ:87), 2С3424 (8ЕО ΙΌ ΝΟ:86), 2С24431 (8ЕО ΙΌ ΝΟ:75), 2С24511 (8ЕО ΙΌ ΝΟ:77), 2С24806 (8ЕО ΙΌ ΝΟ:90) и 2С24807 (8ЕО ΙΌ ΝΟ:91). Последовательность полноразмерной кДНК мышиного 7а1рЬа11 показана в 8ЕО ΙΌ ΝΟ:84. Соответствующая аминокислотная последовательность показана в 8ЕО ΙΌ ΝΟ:85.

Из приведенного выше описания должно быть понятно, что, хотя здесь были описаны для иллюстрации характерные варианты данного изобретения, различные модификации могут быть произведены без отклонения от идеи и сферы действия данного изобретения. Таким образом, данное изобретение не ограничивается ничем, кроме прилагаемой формулы изобретения.

Перечень последовательностей <110> Займодженегикс, инк.

<120> Рецептор цитокина га1рМа11 <130 98-55РС <150 09/159,254 <151> 1998-09-23 <150> 09/265.117 <151> 1999-03-09 <150 09/347.930 <151=- 1999-07-06 <160 91 <170 Еаз15Е0 Тог Ытпдоиз Уегзтоп 3.0 <210> 1 <211> 2887 <212> ДНК <213=· Ното зартепз <220>

<221> С05 <222> (69)...(1682) <400> 1 даадсадсад дЬасссссЬс саса1сссЬа дддсЬЛдЬд аТдТаддсад аддсссдТдд 60 дадгсадс а1д ссд сдЬ ддс Ьдд дсс дсс ссс Ид сЬс сЬд сЬд с!д сЬс 110

Ме! Рго Агд 61у Тгр А1а АТ а Рго Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи 1_еи

5 10

сад

дда

ддс

199

99С

1дс

ссс

дас

С1С

д!с

1дс

1ас

асе

дат

1ас

С1С

61п

61у

Тгр

61у

Суз

Рго

Азр

Ьеи

Уа1

Суз

Туг

ТЬг

Азр

Туг

Ьеи

15

20

25

30

сад

асд

д!с

а!с

1дс

а!с

с!д

даа

аЬд

1дд

аас

СЬС

сас

ссс

аде

асд

61 η

ТО г

Уа1

Не

Суз

Не

Ьеи

61и

Ме!

Тгр

Азп

Ьеи

ΗΊ5

Рго

Зег

ТИг

35

40

45

СЬС

асе

СИ

асе

199

саа

дас

сад

Ьа!

даа

дад

с1д

аад

дас

дад

дсс

- 54 006501

Ьеи

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Тгр

61п

Азр

61 п

Туг

61и <

61и

Ьеи

Ьуз ,

Азр I

□1 и А1 а

50

55

60

асе

гсс

где

аде

сгс

сас

адд

гсд

дсс

сас

ааг '

дсс

асд

саг ΐ

дсс асе

302

ТЬг

Зег

Суз

Зег

Ьеи

Нтз

Агд

Зег

АТа

Нтз .

Азп .

А1а '

ТЬг 1

Нтз 1

Ма ТЬг

65

70

75

1ас

асе

где

сас

агд

даг

дга

ггс

сас

ггс

агд '

дсс

дас

дас ΐ

агг ггс

350

Туг

ТЬг

Суз

Шз

Мег

Азр

Уа1

РЬе

Н15

РЬе

Мег .

А1а ,

Азр ΐ

Азр

Пе 1

³Ье

80

85

90

адг

дгс

аас

аге

аса

дас

сад

гсг

ддс

аас

Ьас

Ьсс

сад ΐ

дад '

гдг ддс

398

Зег

Уа!

Азп

Не

ТЬг

Азр

61 п

Зег

61у

Азп

Туг

Зег ΐ

61п 1

31 и 1

Ьуз 61у

95

100

105

110

аде

ггг

сгс

егд

дсг

дад

аде

аге

аад

ссд

дсг

ссс

ссг

ггс

аас ΐ

зьд

446

Зег

РЬе

Ьеи

А1 а

61и

Зег

Не

Ьуз

Рго

А1а

Рго

РЬе ,

Азп ’

Уа1

115

120

125

асг

дгд

асе

ггс

гса

дда

сад

гаг

ааг

аге

гсс

ьдд

сдс

гса

даг

Рас

494

ТЬг

Уа!

ТЬг

РЬе

Зег

61у

61 п

Туг

Азп

Пе

Зег

Тгр

Агд

Зег ,

Азр '

Туг

130

135

140

даа

дас

ссЬ

дсс

ггс

гас

агд

егд

аад

ддс

аад

егг

сад

гаг

дад

егд

542

61и

Азр

Рго

А! а

РЬе

Туг

Мег

Ьеи

Ьуз

61у

Ьуз

Ьеи

61 п

Туг

61и

Ьеи

145

150

155

сад

гас

адд

аас

едд

дда

дас

ссс

гдд

дсг

дгд

адг

ссд

адд

ада

аад

590

61 η

Туг

Агд

Азп

Агд

61у

Азр

Рго

Тгр

А1а

Уа1

Зег

Рго

Агд

Ьуз

160

165

170

сТд

аЬс

Ьса

дгд

дас

Ьса

ада

адЬ

дгс

Ьсс

сгс

СЬС

ссс

егд

дад

Ыс

638

Ьеи

Пе

Зег

Уа1

Азр

Зег

Агд

Зег

Уа1

5ег

Ьеи

Рго

Ьеи

61 и

РЬе

175

180

185

190

сдс

ааа

дас

гсд

аде

гаг

дад

егд

сад

дгд

едд

дса

ддд

ссс

агд

ссг

686

Агд

Ьуз

Азр

Зег

Туг

61 и

Ьеи

61 π

Уа1

Агд

А! а

61у

Рго

Мег

Рго

195

200

205

ддс

гсс

Ьсс

гас

сад

ддд

асе

гдд

адг

даа

гдд

адг

дас

ссд

дгс

аге

734

61у

Зег

Туг

61 п

61у

ТЬг

Тгр

Зег

61и

Тгр

Зег

Азр

Рго

Уа1

Ие

210

215

220

ггг

сад

асе

сад

гса

дад

гга

аад

даа

ддс

гдд

аас

ссг

сас

егд

782

РЬе

61 η

ТЬг

61 п

Зег

61и

61 и

Ьеи

ьуз

61 и

б1у

Тгр

Азп

Рго

Н1 5

Ьеи

225

230

235

с1д

егг

сгс

егд

егг

дгс

ага

дгс

ггс

агг

ссг

дсс

ггс

гдд

аде

830

Ьеи

Уа1

Пе

Уа1

РЬе

Пе

Рго

А1 а

РЬе

Тгр

Зег

240

245

250

егд

аад

асе

саг

сса

ггд

гдд

адд

сга

гдд

аад

ага

ьдд

дсс

дгс

878

Ьеи

Ьуз

ТЬг

Н15

Рго

Ьеи

Тгр

Агд

Ьеи

Тгр

Ьуз

Пе

Тгр

А! а

Уа1

255

260

265

270

ссс

аде

ссг

дад

едд

ггс

агд

ссс

егд

гас

аад

ддс

где

аде

дда

926

Рго

Зег

Рго

61 и

Агд

РЬе

Мег

Рго

Ьеи

Туг

Ьуз

61у

Суз

Зег

61у

275

280

285

дас

ггс

аад

ааа

гдд

дтд

ддг

дса

ссс

ггс

асг

ддс

гсс

аде

егд

дад

974

Азр

РЬе

Ьуз

Тгр

Уа1

61у

АТа

Рго

РЬе

ТЬг

61у

Зег

Ьеи

61 и

290

295

300

с1д

дда

ссс

гдд

аде

сса

дад

дтд

ссс

гсс

асе

егд

дад

дгд

Ьас

аде

1022

Ьеи

61у

Рго

Тгр

$ег

Рго

61 и

Уа1

Рго

Зег

ТЬг

Ьеи

61 и

Уа!

Туг

Зег

305

310

315

Ьдс

сас

сса

едд

аде

сед

дсс

аад

адд

егд

сад

сгс

асд

дад

сга

1070

Суз

Нтз

Рго

Агд

Зег

Рго

А1а

ьуз

Агд

Ьеи

61 п

Ьеи

ТЬг

61 и

Ьеи

320

325

330

саа

даа

сса

дса

дад

егд

дгд

дад

гсг

дас

ддг

дьд

ссс

аад

ссс

аде

1118

61п

61 и

Рго

А1а

61 и

Ьеи

Уа1

61 и

Зег

Азр

61у

Уа1

Рго

Ьуз

Рго

Зег

335

340

345

350

ггс

гдд

ссд

аса

дсс

сад

аас

гсд

ддд

ддс

гса

дсг

гас

адг

дад

1166

РЬе

Тгр

Рго

ТИг

А1а

61 п

Азп

Зег

61у

Зег

А1а

Туг

Зег

61 и

355

360

365

адд

даг

едд

сса

гас

ддс

егд

дгд

гсс

агг

дас

аса

дгд

асг

дгд

сга

1214

Агд

Азр

Агд

Рго

Туг

61у

Ьеи

Уа!

Зег

11е

Азр

ТЬг

УаТ

ТЬг

Уа!

Ьеи

370

375

380

даг

дса

дад

ддд

сса

где

асе

ьдд

ССС

где

аде

гдь

дад

да!

дас

ддс

1262

Азр

А! а

61 и

61у

Рго

Суз

ТЬг

Тгр

> Ргс

| Суз

Зег

Суз

61 и

ΐ Азр

> 61у

385

390

395

гас

сса

дсс

с1д

дас

егд

даг

дсг

• 99С

: егд

дад

ссс

: аде

: сса

ддс

: сга

1310

-55 006501

Туг

Рго 400

А1а Ьеи Азр Ьеи

Азр А1а 61у Ьеи 61 и Рго

Зег

Рго

61у

Ьеи

405

410

дад

дас

сса

сТс

ТТд

дат

дса

ддд

асе

аса

д!с йд

!сс

!д!

ддс

!д!

1358

61и

Азр

Рго

Ьеи

Азр

А1а

61У

ТЬг

Уа1

1еи

Зег

Суз

61у

Суз

415

420

425

430

дТс

Тса

дсТ

ддс

аде

ссТ

ддд

йа

дда

ддд

ССС

сТд

дда

аде

йс

йд

1406

Уа1

5ег

А1а

61у

Зег

Рго

61у

Ьеи

Е1у Е1у

Рго

Ьеи

61у

Зег

Ьеи

435

440

445

дас

ада

с1а

аад

сса

ССС

СЙ

дса

да!

ддд

дад

дас

тдд

дй

ддд

дда

1454

Азр Агд

Ьеи

ЬуЗ

Рго

1_еи

А1 а

Азр

61 у

61 и

Азр Тгр

А1 а

61у 61у

450

455

460

<йд

ССС

тдд

дд!

ддс

едд

!са

сс!

дда

ддд

дТс

!са

дад

ад!

дад

дед

1502

Ьеи

Рго

Тгр

61у

61у Агд

Зег

Рго

61у 61у

Уа1

Зег

61и

Зег

61 и

А1а

465

470

475

ддс

1са

ССС

йд

дсс

ддс

йд

да!

аТд

дас

асд

!Й

дас

ад!

ддс

!Й

1550

Е1у

5ег

Рго

Ьеи

А1а

61у

Ьеи

Азр

МеТ

Азр

ТЬг

РЬе Азр

Зег

61у

РЬе

480

485

490

дЬд

ддс

ТсТ

дас

1дс

аде

сс!

д!д

дад

ТдТ

дас

Ис

асе

аде

ССС

1598

Уа!

С1у

5ег

Азр Суз

Зег

Рго

Уа1

61 и

Суз Азр

РЬе

ТЬг

Зег

Рго

495

500

505

510

ддд

дас

даа

дда

ССС

едд

аде

Тас

йс

сдс

сад

тдд

дтд

д!с

ай

1646

61у Азр

61и 61у

Рго

Агд

Зег

Туг

Ьеи

Агд

61п

Тгр

Уа!

Не

515

520

¹

525

ссТ

ссд

сса

СТТ

Тед

аде

сс!

дда

ССС

сад

дсс

аде

ТааТдаддсТ

1692

Рго

Ьеи

Зег

5ег

Рго

61у

Рго

61п

А1 а

Зег

530 535 дасОддаШ ссададсгдд ссаддссай дддсссОдад ссададасаа ддОсассОдд 1752 дс!д!да!д! даадасасс! дсадсййд д!с!сс!дда !дддсййд адссЬдаСд! 1812 йасад!д!с !д!д!д!д!д !д!дса!а1д !д!д!д!д!д са!а!дса!д !д!д!д!д!д 1872 ЬдадЬдЬйт. аддЬдсдсад ОддсагдОсс асд!д!д!д! дЬдагЬдсас дЬдссЬдЬдд 1932 дссЬдддаЬа аЬдссса!дд !айсса!дс айсасс!дс ссгд!дсаЬд ЬсЬддасЬса 1992 сддадсйас сса!д!дсас аад!дЬдсас адЬааасдЬд й!д!дд!са асадаЬдаса 2052 асадссдасс !сссЬсс!ад дд!сйд!д! Ьдсаадйдд ЬссасадсаЬ с1ссддддс1 2112 йд!ддда!с адддсайдс с!д!дас!да ддсддадссс адссс!ссад сд!йдсйс 2172 саддадсЬдс аадаадйса !айд!!сй !а!сасйдс саасаддаад сдааадддда 2232 !ддад!дадс сса!дд!дас с!сдддаа!д дсааййй дддсддсссс !ддасдаадд 2292 ШдааЬссс даййда!а ссйс!ддс! д!дс!асс!д адссаадЬсд сйсссйй 2352 йдддйада дЬйссйа! ссадасадЬд дддааддса! дасасасйд ддддааайд2412 дсдаьдйас ссд!д!асдд Ьасдсадссс ададсадасс йсаа!ааас д!садй!сс2472 йссййдс ддссададсс даддсдддсд ддддЬдадаа са!саа!сд! садсдасадс2532 йдддсассс дсддддссд! сссдсйдса дадддссас! сдддддддй йсаддсйа2592 ааайадйс дй!сд!йс йддааасад йссссасса ассаадаШ ййййаа2652 сййдйас ЬаадЬййа аааайссй йаЬдсассс аадада!ай !айааасас2712 саайасдЬа дсаддссаЬд дс!са!ддда сссасссссс д!ддсайса Ьддадддддс2772 !дсаддйдд аас!а!дсад !д!дйссдд ссасасаЬсс !дс!дддссс сйассйдс2832 сссаайсаа ЬссЬдссаа! аааЬсс!дЬс йаЬйдйс а!сс!ддада айда2887 <210> 2 <211’ 538 <212’ Белок <213’ Ното зартепз <400> 2

Ме! Рго Агд 61у Тгр А1а А1а Рго Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи 61л 61у 15 10 15

61у Тгр 61у Суз Рго Азр Ьеи Уа! Суз Туг ТНг Азр Туг 1_еи 61п ТЬг

25 ‘ 30

Уа!

Не

Суз

Не

Ьеи

61 и

Ме!

Тгр

Азп

Ьеи

Н13

-Рго

Зег

ТЬг

Ьеи

ТЬг

35

40

45

Ьеи

ТЬг

Тгр

61п

Азр

61п

Туг

61и

Ьеи

Ьуз

Азр

61и

А1 а

ТЬг

5ег

50

55

60

Суз

Зег

Ьеи

Н1 5

Агд

Зег

А1 а

Нтз

Азп

А1 а

ТЬг

Нтз

А1а

ТЬг

Туг

ТЬг

65

70

75

80

Суз

Н1з

Ме!

Азр

Уа1

РЬе

Нтз

РЬе

Ме!

А1 а

Азр

Не

РЬе

Зег

Уа1

85

90

95

Азп

Не

ТЬг

Азр

61П

Зег

61у

Азп

Туг

Зег

61 п

61 и

Суз

61у

Зег

РЬе

100

105

110

Ьеи

А1а

Б! и

Зег

Не

ЬУЗ

Рго

А1а

Рго

РЬе

Азп

Уа!

ТЬг

Уа!

115

120

125

ТЬг

РЬе

Зег

61у

61 η

Туг

Азп

Не

Зег

Тгр

Агд

Зег

Азр

Туг

61 и

Азр

130

135

140

Рго

А! а

РЬе

Туг

Ме!

Ьеи

Ьуз

61у

Ьуз

Ьеи

61 п

Туг

61 и

Ьеи

61 π

Туг

145

150

155

160

Агд

Азп

Агд

Е1у

Азр

Рго

Тгр

А1а

Уа1

Зег

Рго

Агд

ьуз

Ьеи

Не

165

170

175

Зег

Уа1

Азр

Зег

Агд

Зег

Уа1

Зег

Ьеи

Рго

Ьеи

61 и

РЬе

Агд

Ьуз

180

185

190

Азр

5ег

Зег

Туг

61 и

Ьеи

61 п

Уа!

Агд

А1а

Б1у

Рго

Ме!

Рго

61у

Зег

195 200 205

8ег Туг εΐη 61у ТЬг Тгр Зег Е1и Тгр 8ег Азр Рго УаТ 11е РЬе 61п

210 215 220

- 56 006501

ТЬг 61η Зег 61и СТ и Ьеи Ьуз 61и 61у Тгр Азп Рго Нтз Ьеи Ьеи 1_еи

225 230 235240

Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Уа! Не Уа! РЬе Не Рго А1а РЬе Тгр 5ег ЬеиЬуз

245 250255

ТЬг Нтз Рго Ьеи Тгр Агд Ьеи Тгр Ьуз Ьуз Не Тгр А1а УаТ Рго Зег 260 265270

Рго 31 и Агд РЬе РЬе МеЬ Рго Ьеи Туг Ьуз 61 у Суз Зег 61у Азр РЬе 275 280285

Ьуз Ьуз Тгр Уа1 61у А1а Рго РЬе ТЬг 61у Зег Зег Ьеи 61 и Ьеи 61у 290 295300

Рго Тгр Зег Рго 61 и Уа1 Рго Зег ТЬг Ьеи 61 и 1/а1 Туг Зег СузНт 5

305 310 315320

Рго Рго Агд Зег Рго А1а Ьуз Агд Ьеи 61 η Ьеи ТЬг 61 и Ьеи 61 η61 и

325 330335

Рго А1а 61и Ьеи Уа! 61и Зег Азр 61у Уа! Рго Ьуз Рго Зег РЬе Тгр

340 345350

Рго ТЬг А1а 61 η Азп Зег 61у 61у Зег А1а Туг Зег 61 и 61 и Агд Азр

355 360365

Агд Рго Туг 61у Ьеи Уа! Зег Не Азр ТЬг Уа! ТЬг Уа! Ьеи Азр А1а

370

375

380.

61 и

61у

Рго

Суз

ТЬг

Тгр

Рго

Суз

Зег

Суз

61и

Азр

61у

Туг

Рго

385

390

395

400

А! а

Ьеи

Азр

Ьеи

Азр

А1а

61у

Ьеи

61и

Рго

Зег

Рго

61у

Ьеи

61 и

Азр

405

410

415

Рго

Ьеи

Азр

А1 а

61у

ТЬг

Уа!

Ьеи

Зег

Суз

61у

Суз

Уа1

Зег

420

425

430

А1 а

61у

Зег

Рго

61у

Ьеи

61у

Рго

Ьеи

61у

Зег

Ьеи

Азр

Агд

435

440

445

Ьеи

Ьуз

Рго

Ьеи

А! а

Азр

61у

61 и

Азр

!гр

А! а

61у

Ьеи

Рго

450

455

460

Тгр

61у

Агд

Зег

Рго

61у

Уа!

Зег

61 и

Зег

61 и

А1а

61у

Зег

465

470

475

480

Рго

Ьеи

А! а

61у

Ьеи

Азр

Ме!

Азр

ТЬг

РЬе

Азр

Зег

61у

РЬе

Уа1

61у

485

490

495

Зег

Азр

Суз

Зег

Рго

Уа1

61и

Суз

Азр

РЬе

ТЬг

Зег

Рго

61у

Азр

500

505

510

61 и

61у

Рго

Агд

Зег

Туг

Ьеи

Агд

61 η

Тгр

Уа!

Уа1

Не

Рго

515

520

525

Рго

Ьеи

Зег

Рго

61у

Рго

61 η

А! а

Зег

530

535

<210=· 3 <211> 5 <212> Белок <213= Синтетическая последовательность <220= <223> Консенсусный мотив аминокислот <221> Вариант <222> (1)...(5) <223> Хаа - Любая аминокислота <221> Вариант <222> (1)...(5) <223> Хаа = Любая аминокислота <400> 3

Тгр Зег Хаа Тгр Зег

5 <210> 4 <211> 1614 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вырожденная нуклеотидная последовательность га1рЬа11 <221> пп зс_СеаЬиге <222> (1)...(1614) <223> η - А.Т.Силиб <221> ппзс_ГеаТиге <222> (1)...(1614) <223> η = А.Т.Силиб <400= 4 аЬдссптдпд дпЬдддспдс псспуЬпуЬп уЬпуЬпуЬпу Ьпсагддпдд пТддддпЬду60 сспдаууЬпд ЬпЬдуЬауас пдауЬаууЬп сагаспдЬпа ЬЬЬдуаЬЬуЬ пдагаЬдЬдд120 ааууЬпсаус спизпаспу! паспуЬпасп Ьддсагдаус агЬаудагда гуЬпаагдау180 дагдспаспи зпЬдуизпуЬ псаутдпизп дспсауаауд спаслсаудс паспТауасп240

ЬдусауаЬдд аудЬпЬЬуса уЬТуаЬддсп даудауаЬЬЬ ЬумзпдЬпаа уаЬЬаспдау300 сагизпддпа ауТауизпса гдагТдуддп мзпЬЬууЬпу Ьпдспдагиз паТЬаагссп360 дспсспсспЬ ЬуааудЬпас пдТпаспЫу мзлддпсаП ауаауаЬЬиз пТддтдпизп420 дауЬаудагд аусспдспЬТ уСауаЬдуЬп аагддпаагу ЬпсагЬауда гуЬпсагТау480 тдпааутдпд дпдаусспЬд ддспдЬпизп ссптдптдпа агуЬпаЬЬиз пдЬпдауизп540 тдпызпдЬпи зпуЬпуЬпсс пуЬпдагЬЬу тдлаагдауи зпызпЬауда гуЬпсагдЬп600 тдпдспддпс спаЬдсспдд пмзпизпЬау сагддпаслЬ ддизпдагЬд дизпдауссп660 дЬпаШЬус агаспсагиз пдагдагуЬп аагдагддпЬ ддааусспса уу-пуТпуТп720

- 57 006501 уТпу1пуТпу ТпдТпаТпдТ пТТуаШсп дспШуЬддм зпуТпаагас псаусспубп780

СддтдпуШ ддаагаага! №дддспд1п сспизпсспд агтдпНуТТ уаГдсспу1п840

Тауаагддйб дуызпддпда уПуаагааг бдддбпддпд спсспИуас пддпизпизп900 уЩдагуСпд дпссп1ддиз псспдагдГп сспизпаспу ТпдагдШа у«5п1дусау960 сспсспгадпи зпсспдспаа гтдпуТпсаг уЪпаспдагу 1псагдагсс пдспдагуТп1020 дбпдагизпд ауддпдТпсс паагсспмзп ТТу1ддсспа спдспсагаа уизпддпддп1080 изпдсгЛауи зпдагдагтд пдаутдпссп бауддпуЬпд ТпизпаТНда уаспдЬпасп1140 дТпуТпдауд спдагддпсс пТдуаспТдд ссп1дуизп1 дудагдауда уддп1ауссп1200 дспуШдауу Тпдаудспдд пуЪпдагссп изпсспддпу бпдагдаусс пуЪпу1пдау1260 дспддпаспа спд!пу1гмз пТдуддпТду дЪпизпдспд дпизпсспдд пуТпддпддп1320 сспуГпддпи зпу1пу1пда утдпуШааг сспсспуГпд спдауддпда гдаубдддсп1380 ддпддпуТлс спТддддпдд птдпмзпссп ддпддпдШк зпдагизпда гдспддпызп1440 сспуЩдспд дпуЩдауаб ддауаспНу дауизпддпг ТудТпддпиз пдаубдумзп1500 изпсспдбпд апдудауи уаслизпссп ддпдаудагд дпсспссптд пизп1ауу1п1560 тдпсагЬддд 1пд1па111сс псспсспуТп изпнзпсспд дпсспсагдс пизп1614 <210> 5 <211> 17 <212= ДНК <213=* Синтетическая последовательность <220= <223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ447 <400> 5

1аасааШс асасадд 17 <210= 6 <211= 18 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ976 <400=» 6 сдТТдТаааа сдасддсс 18 <210=- 7 <211= 21 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ19345 <400> 7 дассадШд дсаас!ас1с с 21 <210> 8 <211> 20 <212= ДНК <213= Синтетическая последовательность <220= <223=- Олигонуклеотидный праймер ΖΘ19346 <400=» 8 дсТсТсадсс аддадааадс 20 <210= 9 <211> 20 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220= <223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ19349 <400= 9

99ΐΐ99ΐ999 дадЛдШс 20 <210> 10 <211= 20 <212= ДНК <213= Синтетическая последовательность <220= <223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ19350 <400> 10 дддТдадаас аТсааТсдТс 20 <210> 11 <211= 21 <212> ДНК <213= Синтетическая последовательность <220>

<223= Олигонуклеотидный праймер ΖΘ19458

- 58 006501 <400> И саШсНсЬ 1сса1адсс1 с 21 <210> 12 <211> 21 <212= ДНК <213* Синтетическая последовательность <220>

<223= Олигонуклеотидный праймер ΖΟ19459 <400=- 12 с1сс!сс1дс 1Тд1са1ад1 с 21 <210> 13 <211> 21 <212= ДНК <213> Синтетическая последовательность <220=- .

<223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ19460 <400> 13 дТааасдТдТ ИдТддТсаа с 21 <210=- 14 <211> 20 <212=· ДНК <213=- Синтетическая последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ19461 <400= 14

ТдссСТдаГс ссасааадсс 20 <210> 15 <211> 20 <212=- ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ19572 <400> 15 дСсс1д!ддс 1д1д1с1сад 20 <210> 16 <211> 20 <212= ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ19573 <400= 16 садТсададс ссасааадсс 20 <210> 17 <211= 20 <212= ДНК <213=- Синтетическая последовательность <220>

<223= Олигонуклеотидный праймер ΖΘ19657 <400> 17 сТдадасаса дссасаддас 20 <210> 18 <211= 24 <212= ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223= Олигонуклеотидный праймер ΖΟ19181 <400> 18

ТссасаТссс 1адддс1с1д 1да1 24 <210> 19 <211> 25 <212> ДНК <213= Синтетическая последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ19182 <400> 19 даддйссас аШссадда Тдсад 25

- 59 006501 <210* 20 <211> 24 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220 <223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ19907 <400> 20 аТддаТдТа! ТссасТТса! ддсс 24 <210* 21 <211> 24 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер Ζ019908 <400> 21 асШсааас дТдТссаТаТ ссад 24 <210> 22 <211> 18 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер 2С19954 <400> 22 асТдддсТдд дддасТдс 18 <210 23 <211> 18 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220* <223> Олигонуклеотидный праймер гС19955 <400 23 ссссддддсТ ддТдаад! 18 <210> 24 <211» 33 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ17212 <400* 24 ддддааПсд аадсса!дсс сТсПдддсс сТс 33 <210> 25 <211* 30 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер Ζ019914 <400 25 сааТддаТдд дТсШадса дсад1аддсс 30 <210> 26 <211> 30 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ19913 <400> 26 ддсс£ас!дс !дс1ааадас сса£сса1!д 30 <210> 27 <211> 33 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер Ζ020097 <400> 27 асаГс!ада! 1адсТддсс1 ддддГссадд сдт 33 <210» 28

- 60 006501 <211> 21 <212» ДНК <213» Синтетическая последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер Ζ012700 <400» 28 ддаддГсТа! аТаадсадад с 21 <210» 29 <211> 21 <212> ДНК <213» Синтетическая последовательность <220» <223> Олигонуклеотидный праймер гС5020 <400> 29 сасТддадТд дсаасНсса д <210» 30 <211> 20 <212» ДНК <213> Синтетическая последовательность <220» <223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ6675 <400» 30 дсддаГдссд аасссадбсс 20 <210= 31 =211» 21 <212> ДНК <213= Синтетическая последовательность <220» <223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ7727 <400> 31

ГдИсасадс 1ассТдддсТ с <210> 32 <211» 26 <212> ДНК <213» Синтетическая последовательность <220» <223> Олигонуклеотидный праймер Ζ08290 <400= 32 ссассдадас ТдсИддаТс ассйд 26 <210» 33 <211» 21 <212» ДНК <213» Синтетическая последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер гС6622 <400» 33 СТдддсТдда аайддсаса с <210> 34 <211> 18 <212» ДНК <213» Синтетическая последовательность <220>

<223» Олигонуклеотидный праймер ΖΟ7736 <400> 34 сасТдТсада ааГддадс 18 <210» 35 <211» 24 <212» ДНК <213» Синтетическая последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ9273 <400> 35 ддТссЛссс сдддсассда дада <210» 36 <211» 36 <212= ДНК

- 61 006501 <213= Синтетическая последовательность <220= <223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ199Ο5 <400= 36 асаддаЬссд ЬсадсаЬдсс дсдЬддсЬдд дссдсс 36 <210 37 <211= 33 <212= ДНК <213= Синтетическая последовательность <220 <223> Олигонуклеотидный праймер Ζ019906 <400 37 асадааЬЬс! ЬадсЬддссЬ ддддЬссадд сдЬ зз <210> 38 <211> 22 <212= ДНК <213> Синтетическая последовательность <220 <223> Олигонуклеотидный праймер Ζ020114 <400= 38 ссЬдссЬЬсЬ асаЬдсЬдаа дд 22 <210= 39 <211> 18 <212= ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер гС19954 <400= 39 асЬдддсЬдд дддаИдс 18 <210> 40 <211> 22 <212= ДНК <213= Синтетическая последовательность <220>

<223= Олигонуклеотидный праймер Ζ020116 <400= 40 адсасадЬса сЬдЬдЬсааЬ дд 22 <210= 41 <211= 6 <212= Белок <213= Синтетическая последовательность <220>

<223> 61 ιι-ΕΙιι (СЕЕ)-меченая аминокислотная последовательность <400= 41 и Туг МеЬ Рго Ме! 61 и

5 <210= 42 <211= 36 <212= ДНК <213= Синтетическая последовательность <220= <223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ19931 <400= 42 ддПддСасс дсаадаЬдсс дсдЬддсЬдд дссдсс 36 <210= 43 <211= 29 <212= ДНК <213= Синтетическая последовательность <220= <223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ19932 <400= 43 сддадда!сс дЬдадддТЬс садссЫсс 29 <210= 44 <211> 66 <212= ДНК <213= Синтетическая последовательность

- 62 006501 <220= <223> Олигонуклеотидный праймер, простирающийся на фланкирующий район вектора и 5' конец га1рЬа11 <400> 44

ТссасШдс сШсТсТсс асаддТдТсс адддааТТса ТсдаТааТдс сдсдТддсТд 60 ддссдс 66 <210> 45 <211=- 699 <212> ДНК <213> Ното 5ар1еп5 <400> 45 дадсссада! сйсадасаа аасРсасаса ТдсссассдТ дсссадсасс Тдаадссдад60 ддддсассдТ садТсТТссТ сТТсссссса ааасссаадд асасссТсаТ даТсТсссдд120 ассссТдадд Тсаса1дсд1 ддТддТддас дТдадссасд аадасссТда ддТсаадПс180 аасТддТасд Тддасддсд! ддаддТдсаТ ааТдссаада сааадссдсд ддаддадсад240

Тасаасадса сдТассдТд! дд1садсдрс с1сассд!сс !дсассадда С1ддс1даа1300 ддсааддадр асаадТдсаа дд1с!ссаас ааадсссРсс саТссТссаТ сдадаааасс360 аРсГссааад ссааадддса дссссдадаа ссасаддТдТ асасссТдсс сссаТсссдд420 даТдадсТда ссаадаасса дд!садсс!д ассРдссРдд 1саааддс11 с!а!сссадс480 дасаТсдссд ТддадТддда дадсааТддд садссддада асаасТасаа дассасдсс!540 сссдТдсТдд асТссдасдд сРссИсТТс сТсТасадса адсТсассдТ ддасаададс600 аддТддсадс аддддаасдТ сйсТсаТдс 1ссд1даТдс аТдаддсТс! дсасаассас660

Тасасдсада ададссТсТс сс1д1с!ссд дд1ааа1аа699 <210> 46 <211> 62 <212* ДНК <213> Синтетическая последовательность <220= <223> Первый олигонуклеотидный праймер, простирающийся на 3' конец внеклеточного домена га1рИа11 и 5' конец Рс4 <400> 46 дсасдд1ддд саТд1д!дад Ш1д1сРда адаТсТдддс ТсдРдадддТ 1ссадссйс 60 с! 62 <210> 47 <211> 61 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Второй олигонуклеотидный праймер, простирающийся на 3' конец внеклеточного домена га1р1та11 и 5' конец Рс4 <400> 47 адасссадТс ададдадПа ааддааддсТ ддаасссТса сдадсссада ТсТТсадаса 60 а 61 <210> 48 <211> 67 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223* Олигонуклеотидный праймер, простирающийся на 3' конец Рс4 и фланкирующий район вектора <400> 48 дТдддссТсТ ддддТдддТа саассссада дсРдРШаа ТсТадаПаТ йасссддад 60 асаддда 67 <210> 49 <211> 8 <212> Белок <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> ПАЗ - меченая аминокислотная последовательность <400=- 49

Азр Туг |_уз Азр Азр Азр Азр 1уз

5 <210=- 50 <211> 1821 <212= ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Полинуклеотид, кодирующий слитый белок

МВР - растворимый рецептор га1рЬа11

- 63 006501 <221> СОЗ <222> (1)...(1821) <400> 50

а!д ааа а!с даа даа дд! ааа

с!д д!а а!с !дд аП аас ддс

да! Азр 15

ааа Ьуз

48

Ме! Ьуз Пе 61и 61и

61 у Ьуз

Ьеи

Уа] Не 10

Тгр

Пе

Азп

61у

1

5

ддс

1аЬ

аас

дд!

с!с

дс!

даа

д!с дд!

аад

ааа

Йс

дад

ааа да!

асе

96

61у

Туг

А$п

Е1у

Ьеи

АТа

61и

УаТ

61у

Ьуз

РЬе

СЗи

Ьуз Азр

ТЬг

20

25

30

дда

ай

ааа

д!с

асе

дй

дад

саТ

сед

да!

ааа

с!д

даа

дад

ааа

!!с

144

СТу

11е

1-У5

УаТ

ТЬг

\/а1

61и

ΗΊ5

Рго

Азр Ьуз

Ьеи

61и

61 и

Ьуз

РЬе

35

40

45

сса

сад

ди

дед

дса

ас!

ддс

даН

ддс

сс! дас

ай

аи

!!с

!дд

дса

192

Рго

61 п

Уа!

А1а

АТа

ТЬг

61у Азр 61у Рго Азр

Пе

Не

РИе Тгр

А1а

50

55

60

сас

дас

еде

!Й

дд!

ддс

!ас

дс!

саа

!с!

ддс

с!д !!д

дет

даа

а!с

240

Ηί 5

Азр Агд

РЬе 61у 61у

Туг

АТа

61 п

5ег

61у

Ьеи

АТа

61 и

Пе

65

70

75

80

асе

сед

дас

ааа

дед

!!с

сад

дас

аад

с!д

!а!

ссд

!!Ь

асе

тдд

да!

288

ТИг

Рго

Азр Ьуз

АТа

РЬе

61 п

Азр

Ьуз

Ьеи

Туг

Рго

РЬе

ТИг

Тгр

Азр

85

90

95

дес

дТа

сдТ ±ас

аас

ддс

аад

с!д

ай

дс!

!ас

ссд

а!с

дет

ди

даа

336

АТ а

УаТ

Агд Туг

Азп

61у

Ьуз

Ьеи

Не

АТа

Туг

Рго

Не

А1 а

УаТ

61 и

100

105

110

дед

Па

!сд

сТд

а!!

!а!

аас

ааа

да! с!д

с!д

ссд

аас

ссд

сса

ааа

384

АТ а

1_еи

5ег

Ьеи

Пе

Туг

Азп

Ьуз Азр Ьеи

Ьеи

Рго

Азп

Рго

Ьуз

115

120

125

асе

^дд

даа

дад

а!с

сед

дед

с!д

да! ааа

даа

с!д

ааа

дед

ааа

дд!

432

ТИг

Тгр

61 и

61и

Пе

Рго

АТ а

Ьеи

Азр Ьуз

61 и

Ьеи

Ьуз

АТа

Ьуз 61 у

130

135

140

аад

аде

дед

сЪд

а!д

!!с

аас

с!д

саа

даа

ссд

!ас

!!с

асе

!дд

ссд

480

1_У£

Зег

АТа

Ьеи

Ме!

РЬе

Азп

Ьеи

61п

61 и

Рго

Туг

РЬе

ТИг

Тгр

Рго

145

150

155

160

сТд

а и

дс! дс!

дас

ддд

дд!

!а!

дед

!!с

аад

!а!

даа

аас

ддс

аад

528

Ьеи Не А1а АТ а Азр 61у 61у Туг АТа РЬе Ьуз Туг 61и Азп Е1у Ьуз

165 170 175

!ас дас а!! ааа

дас д!д ддс

д!д да! аас дс! ддс дед

ааа Ьуз 190

дед АТа

дд! 6Ту

576

Туг

Азр

Пе

Ьуз 180

Азр

УаТ

61у

\/а1 Азр 185

Азп

А1 а

61у

А1 а

с!д

асе

!!с

с!д

дй

дас

с!д

а!!

ааа

аас

ааа

сас

а!д

аа!

дса

дас

624

Ьеи

ТИг

РЬе

Ьеи

УаТ

Азр

Ьеи

Не

Ьуз

Азп

Ьуз

Ηί 5

Ме!

Аэп

А1а

Азр

195

200

205

асе

дат

!ас

!сс

а!с

дса

даа

дс!

дсс

!Й

аа!

ааа

ддс

даа

аса

дед

672

ТИг Азр Туг

5ег

Пе

АТа

61 и

А1 а

АТа

РЬе

Азп

Ьуз

61у

61 и

ТЬг АТа

210

215

220

а!д

асе

а!с

аас

ддс

ссд

!дд

дса

!дд

!сс

аас

а!с

дас

асе

аде

ааа

720

Ме!

ТЬг

Пе

Азп

61у

Рго

Тгр

АТа

Тгр

5ег

Азп

Пе

Азр

ТЬг

8ег

Ьуз

225

230

235

240

дЬд

аа!

!а!

дд! д!а

асд

д!а с!д

ссд

асе

!!с

аад

дд!

саа

сса

!сс

768

νβΐ

Азп

Туг

61у

УаТ

ТЬг

Уа1

Ьеи

Рго

ТЬг

РЬе

Ьуз

61у

ЕТп

Рго

5ег

245

250

255

ааа

ссд

!!с

д!!

ддс

д!д

с!д

аде

дса

дд!

а!!

аас

дсс

ад!

ссд

816

Ьуз

Рго

РЬе

Уа1

61у

УаТ

Ьеи

5ег АТа

61у

Не

Азп

АТа

А1а

Зег

Рго

260

265

270

аас

ааа

дад

с!д

дса

ааа

дад

Йс

с!с

даа

аас

!а!

с!д

ас!

да!

864

Азп

Ьуз

61 и

Ьеи

А1 а

Ьуз

61 и

РЬе

Ьеи

61 и

Азп

Туг

Ьеи

ТЬг

Азр

275

280

285

даа

дд!

с!д

даа

дед

дй

аа!

ааа

дас

ааа

ссд

с!д

дд!

дсс

дЬа

дед

912

61и 61у

Ьеи

61 и

АТа

Уа1

Азп

Ьуз

Азр

Ьуз

Рго

Ьеи

61у

АТа

Уа1

АТа

290

295

300

с!д

аад

!с!

!ас

дад

даа

дад

!!д

дед

ааа

да!

сса

сд!

ай

дсс

960

Ьеи

Ьуз

Зег

Туг

61и

61 и

Ьеи

АТа

Ьуз

Азр

Рго

Агд

Пе

АТа

305

310

315

320

асе

а!д

даа

аас

дес

сад

ааа

ддь

даа

а!с

а!д

ссд

аас

а!с

ссд

сад

1008

ТЬг

Ме!

61 и

Азп

АТа

61 п

Ьуз

61у 61 и

Пе

Ме!

Рго

Азп

Пе

Рго

61п

325

330

335

а!д

!сс

дс!

!!с

Ьдд

!а!

дес

д!д сд!

ас!

дед

д!д

а!с

аас

дсс

1056

- 64 006501

МеТ

Зег

А1а РЬе 340

Тгр

Туг

А1а

Уа! Агд ТЬг А1а Уа! 11е Азп А1а

А1а

345

350

аде

ддр сдГ

сад

асГ

дгс

даГ

даа

дсс

сГд

ааа

дас

дед

сад

асГ

ааГ

1104

$ег

61у Агд

61 п

ТЬг

Уа!

Азр

61и

А! а

Геи

1-У5 Азр

А1а

61п

ТЬг

Азп

355

360

365

Тед

аде

Гсс

сас

саГ

сас

саГ

сас

дед

ааГ

йд

дГа

ссд

сГд дГГ

1152

$ег

Зег

Н15

Н1з

Ж з

Нтз

Н15

А1а

Азп

Зег

Уа1

Рго

Ьеи

Уа!

370

375

380

сед

сдр

дда

Гсс

Где

ссс

дас

сГс

дГс Где

Гас

асе

даГ

Ъас

сТс

сад

1200

Рго

Агд 61 у

Зег

Суз

Рго

Азр

Ьеи

Уа!

Суз

Туг

ТЬг

Азр Туг

Ьеи

61 п

385

390

395

400

асд

дГс

аТс

Где

ай

сСд

даа

аГд

гдд

аас

СЙ

сас

ссс

аде

асд

ей

1248

ТЬг

Уа1

Не

Суз

Не

Ьеи

61 и

МеГ

Тгр

Азп

Геи

Н15

Рго

Зег

ТЬг

Геи

405

410

415

асе

сГГ

асе

гдд

саа

дас

сад

ГаГ

даа

дад

сГд

аад

дас

дад

дсс

асе

1296

ТЬг

Реи

ТЬг

Тгр

61п

Азр

61 п

Туг

61 и

Ьеи

ЬУЗ

Азр

61 и

А1 а

ТЬг

420

425

430

1СС

Где

аде

сГс

сас

адд

йд

дсс

сас

ааГ

дсс

асд

саГ

дсс

асе

Гас

1344

5ег

Суз

5ег

Геи

Н1з

Агд

Зег

А1 а

Нтз

Азп

А! а

ТЬг

Н1 з

А! а

ТЬг

Туг

435

440

445

асе

Где

сас

аГд

да± д£а

йс

сас

ГГс

аГд

дсс

дас

аГГ

ΐΐο

адГ

1392

ТЬг

Суз

Н15

МеГ

Азр

Уа1

РЬе

Нтз

РЬе

МеГ

А! а

Азр

Не

РЬе

Зег

450

455

460

дТс

аас

аТс

аса

дас

сад

ГсГ

ддс

аас

Гас

Гсс

сад

дад

ГдГ

99С

аде

1440

Уа!

Азп

Не

ТЬг

Азр

61 п

Зег

61у Азп

Туг

Зег

61 п

61 и

Суз

С1у

Зег

465 470 475 480

ГГГ ей сГд дсГ дад аде а 1с аад сед дсГ есс ссГ йс аас дГд асГ1488

РНе Геи Ьеи А1а 61и Зег 11е 1у5 Рго А1а Рго Рго РЬе Азп Уа1ТЬг

485 490495 дГд асе йс йа дда сад ГаГ ааГ ай йс Гдд сдс йа дат Гас даа1536

Уа1 ТЬг РЬе Зег 61у 61п Туг Азп Не Зег Тгр Агд Зег Азр Туг61и

500 505510

дас Азр

ссГ дсс ГГс Рго А1а РЬе 515

Гас аГд сГд Туг МеГ Геи

аад ЬУЗ 520

ддс аад ей сад

ГаГ дад сГд

сад 61п

1584

61у Ьуз

1_еи

61п

Туг 525

С1и

Ееи

Гас

адд

аас

едд

дда

дас

ссс

гдд

дсГ

дГд

адГ

ссд

адд

ада

аад

с!д

1632

Туг

Агд

Азп

Агд 6!у Азр

Рго

Тгр

А! а

Уа!

Зег

Рго Агд Агд Ьуз

Ьеи

530

535

540

аГс

Гса

дтд

дас

Ьса

ада

адЪ

дгс

Гсс

сГс

ссс

сГд

дад

ГГс

сдс

1680

11е

Зег

Уа!

Азр

5ег

Агд

Зег

Уа!

Зег

Геи

Рго

Геи

61и

РЬе

Агд

545 550 555 560 ааа дас Тед аде ГаГ дад сГд сад дГд едд дса ддд ссс аГд сер ддс1728

1_уз Азр Зег Зег Туг СТи 1_еи 61п Уа1 Агд А1а 6Ту Рго Мер Рго 61у

565 570575

1сс

1ас

сад

ддд

асе

гдд

адГ

даа

Гдд

адГ

дас

ссд

дй

ай

ш

1776

Зег

Туг

61п

6!у

ТЬг

Тгр

Зег

61 и

Тгр

Зег

Азр

Рго

Уа1

Не

РЬе

580

585

590

сад

асе

сад

Гса

дад

ГГа

аад

даа

ддс

Гдд

аас.

ссГ

сас

Гад

1821

61п

ТЬг

61 п

Зег

61 и

Геи

Ьуз

61 и

61у

Тгр

Азп

Рго

Нтз

*

595

600

605

<210* 51 <211> 606 <212> Белок <213* Синтетическая последовательность <400> 51

МеГ

Ьуа

Не

61 и

61у

Ьуз

Геи

Уа1

11е

Тгр

11е

Азп

61у

Азр

Ьуз

1

5

10

15

61у

Туг

Азп

61у

Геи

ΑΊ а

61 и

Уа!

61у

ьуз

Ьуз

РЬе

61и

Ьуз

Азр

ТЬг

20

25

30

61у

Не

ЬУ5

Уа!

ТЬг

Уа!

61 и

Нтз

Рго

Азр

Ьуа

Геи

61 и

Ьуз

РЬе

35

40

45

Рго

61 п

Уа1

А! а

А1а

ТЬг

61у

Азр

61 у

Рго

Α5Ρ

Не

РЬе

Тгр

А1а

50

55

60

Н1з

Азр

Агд

РЬе

61у

Туг

А1а

61 п

Зег

61у

Геи

А1а

61 и

Не

65

70

75

80

ТЬг

Рго

Азр

Ьуз

А1 а

РЬе

61 п

Азр

Ьуа

Ьеи

Туг

Рго

РЬе

ТЬг

Тгр

Азр

85

90

95

А1 а

Уа1

Агд

Туг

Азп

61у

Ьуа

Геи

11е

А1а

Туг

Рго

Не

А1а

Уа1

61 и

100

105

110

А1а

Геи

Зег

Геи

Не

Туг

Азп

Ьуа

Азр

Геи

Рго

Азп

Рго

Ьуз

115 120 125

- 65 006501

ТНг

Тгр 130

61 и 61и 11е

Рго

А1а Ьеи Азр 135

Ьуз 61 и

Ьеи 140

Ьуз

А1 а

Ьуз

61у

Ьуз

Зег

А1 а

Ьеи

Ме!

РЬе

Азп |_еи

61п

61 и

Рго

Туг

РЬе

ТЬг

Тгр

Рго

145

150

155

160

Ьеи

Не

А! а

А1а

Азр 61у 61у Туг

А1а

РЬе

Ьуз Туг

61и

Азп

61у

Ьуз

165

170

175

Туг Азр

Не

Ьуз Азр

Уа!

61у

Уа1

Азр

Азп

А! а

61у

А1а

Ьуз

А1 а

61у

180

185

190

1_еи

ТНг

РЬе

Ьеи

Уа1

Азр

Ьеи

Не

ьуз

Азп

Ьуз

Нтз

Ме!

Азп

А1а

Азр

195

200

205

ТНг

Азр Туг

Зег

11е

А1а

61 и

А1 а

А1а

РЬе

Азп

Ьуз 61у 61 и

ТЬг

А1 а

210

215

220

Ме!

ТНг

Не

Азп

61у

Рго

Тгр

А1 а

Тгр

Зег

Азп

Не Азр ТЬг

Зег

Ьуз

225

230

235

240

Уа1

Азп

Туг 61у

Уа1

ТЫ

Уа1

1еи

Рго

ТЬг

РЬе

Ьуз С1у 01 п

Рго

Зег

245

250

255

Ьуз

Рго

РЬе

Уа!

61у

Уа1

Ьеи

Зег

А1а

61у

Не

Азп

А1а

Зег

Рго

260

265

270

Азп

1уь

61 и

Ьеи

А1а

Ьуз

61 и

РЬе

Ьеи

61 и

Азп

Туг

Ьеи

ТЬг

Азр

275

280

285

61 и

6!у

Ьеи

61и А1а

Уа!

Азп

Ьуз Азр Ьуз

Рго

Ьеи

61у А1а

Уа!

АТ а

290

295

300

Ьеи

1-У5

Зег

Туг

61 и

61и

61 и

Ьеи

А1 а

Ьуз Азр

Рго

Агд

Пе

А1а

305

310

315

320

ТНг

Ме!

61и

Азп

А1 а

61 п

Ьуз 61у

61 и

Не Ме!

Рго

Азп

Не

Рго

61 π

325

330

335

Ме!

Зег

А1 а

РЬе

Тгр Туг

А1а

Уа!

Агд

ТЬг

А1 а

Уа1

Не

Азп

А1а

ΑΊ а

340

345

350

Бег

61у Агд

61 п

ТЬг

Уа1

Азр

61и

А1 а

Ьеи

Ьуз Азр

А! а

61 п

ТЬг

Азп

355

360

365

Зег

Зег Зег

Н1з

НТЗ

Нтз

Н1 з

А! а

Азп Зег

Уа!

Рго

Ьеи

Уа1

370

375

380

Рго

Агд 61у

Зег

Суз

Рго

Азр

Ьеи

Уа!

Суз Туг ТЬг Азр Туг

Ьеи

61 п

385

390

395

400

ТНг

Уа1

Не

Суз

Не

Ьеи

61 и

Ме!

Тгр

Азп

Ьеи

Нтз

Рго

Зег

ТЬг

Ьеи

405

410

415

ТНг

Ьеи

ТЬг

Тгр

61 ь

Азр

61п

Туг

61 и

Ьеи

Ьу5 Азр

61 и

А1 а

ТЬг

420

425

430

Зег

Суз

Зег

Ьеи

Нтз

Агд

Зег

А1 а

Нтз

Азп

А1 а

ТЬг

Нтз

А! а

ТЬг

Туг

435

440

445

ТНг

Суз

Н15

Ме!

Азр

Уа1

РЬе

Нт 5

РЬе

Ме!

А1а

Азр Азр

Пе

РЬе

Зег

450

455

460

Уа!

Азп

Не

ТЬг

Азр

61 п

Зег

61у

Азп

Тут

Зег

61п 61и

Суз 61у

Зег

465 470 475 480

РЬе

Ьеи

ΑΊ а

61 и

Зег

Пе

Ьуз

Рго

А1а

Рго

РЬе

Азп

Уа!

ТЬг

485

490

495

Уа1

ТЬг

РЬе

Зег

61у

61п

Туг

Азп

Пе

Зег

Тгр

Агд

Зег

Азр

Туг

61и

500

505

510

Азр

Рго

А1а

РЬе

Туг

Ме!

Ьеи

Ьуз

61у

ьуз

Ьеи

61п

Туг

61 и

Ьеи

61 п

515

520

525

Туг

Агд

Азп

Агд

61у

Азр

Рго

Тгр

А1а

Уа!

Зег

Рго

Агд

Ьуз

Ьеи

530

535

540

Пе

Зег

Уа1

Азр

Зег

Агд

Зег

Уа1

Зег

Ьеи

Рго

Ьеи

61 и

РЬе

Агд

545

550

555

560

Ьуз

Азр

Зег

Туг

61 и

Ьеи

61п

Уа1

Агд

А1а

61у

Рго

Ме!

Рго

61у

565

570

575

Зег

Туг

61 п

61у

ТЬг

Тгр

Зег

61 и

Тгр

Зег

Азр

Рго

Уа1

Пе

РЬе

580

585

590

61 п

ТЬг

61 п

Зег

61 и

Ьеи

Ьуз

61 и

61у

Тгр

Азп

Рго

Нтз

595

600

605

<210* 52 <211> 657 <212> ДНК <213> Ното зартепз <400 52 !дссссдасс Ьсд!с!дс!а сассда!!ас йссадасдд 1саОсОдсаО сс!ддааа!д60 !ддаасс!сс ассссадсас дсЬсассс!! асЛддсаад ассад!а!да ададйдаад120 дасдаддсса сс!сс!дсад сс1ссасадд Ьсддсссаса а!дссасдса !дссасс!ас180 асйдссаса 1дда1д1аИ ссас!!са!д дссдасдаса !1!1сад!д! сааса!саса240 дассадЬсЬд дсаас!ас!с ссаддад!д! ддсадсШс !сс!ддс!да дадса!саад300 ссддйсссс сШсаасд! дас!д!дасс ЫсЬсаддас адТаТааГаТ с1ссрддсдс360 [садаШсд аадасссЬдс с!!с!аса!д сЬдаадддса адс!!сад!а !дадс!дсад420

Сасаддаасс ддддадассс с!дддс!д!д адЮсдадда дааадсЬда! сОсадОддас480

ЬсаадаадЬд !с!ссс!сс! сссссЬддад йссдсааад ас!сдадс!а ЬдадЛдсад540 дЬдсдддсад ддссса!дсс !ддс!сс!сс 1ассадддда сс!ддад!да а!ддад1дас600 ссдд!са!с! Исадассса д!сададдад йаааддаад дс!ддаассс !сас!ад657 <210> 53 <211> 65 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер Ζ020187 <400> 53

Тсассасдсд аа!!сдд!ас сдс!дд!!сс дсд!дда!сс Тдссссдасс ЬсдЬсЬдсЬа 60

- 66 006501 сассд 65 <2ΐσ> 54 <211’ 68 <212’ ДНК <213’ Синтетическая последовательность <220’ <223> Олигонуклеотидный праймер Ζ020185 <400’ 54 гЛдЫсад дсТдааааТс Йа1с1са1с сдссааааса сТадТдаддд йссадссй 60 ссШаас 68 <210> 55 <211> 40 <212> ДНК <213’ Синтетическая последовательность <220’ <223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ19372 <400’ 55

ТдТсдаТдаа дсссТдааад асдсдсадас Таайсдадс 40 <210’ 56 <211’ 60 <212’ ДНК <213=- Синтетическая последовательность <220= <223= Олигонуклеотидный праймер ΖΟ19351 <400> 56 асдсдсадас ТааИсдадс ТсссассаТс асса1сасса сдсдааисд дТассдсТдд 60 <210> 57 <211> 60' <212= ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223= Олигонуклеотидный праймер ΖΟ19352 <400= 57 асТсасбаТа дддсдааТТд сссдддддат ссасдсддаа ссадсддТас сдааТТсдсд 60 <210= 58 <211= 42 <212= ДНК <213> Синтетическая последовательность <220= <223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ19371 <400= 58 асддссадТд ааТТдТааТа сдасТсасТа ТадддсдааТ Тд 42 <210= 59 <211> 20 <212’ ДНК <213> Синтетическая последовательность <220’ <223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ22277.

<400’ 59 ссаддадШ ддсадсШс 20 <210’ 60 <211’ 21 <212’ ДНК <213’ Синтетическая последовательность <220’ <223’Олигонуклеотидный праймер ΖΟ22276 <400’ 60 дсПдсссИ садса1д1ад а 21 <210’ 61 <211> 23 <212’ ДНК <213> Синтетическая последовательность <220’ <223’Зонд ТадМап га1рЬа11, ΖΟ31 <400’ 61 сддЛссссс Шсаасд1д ас1 ²³

- 67 006501 <210> 62 <2ϊί> 20 <212» ДНК <213> Синтетическая последовательность <220» <223» Олигонуклеотидный праймер ΖΟ23684 <400> 62

ТсасссШс сТддсаадас 20 <210» 63 <211» 41 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ23656 <400> 63

1аа1асдас1 сасТаТаддд адддддадас асИсйдад ΐ 41 <210> 64 <211» 20 <212» ДНК <213> Синтетическая последовательность <220» <223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ23685 <400» 64 аддТсТдааТ сссдас1с1д 20 <210» 65 <211» 41 <212» ДНК <213> Синтетическая последовательность <220» <223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ23657 <400» 65 .

1аа1асдас1 сасШаддд аддасд!аа1 Тдд1дШаа ΐ ⁴ <210> 66 <211» 20 <212» ДНК <213» Синтетическая последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер, рРНК - прямой праймер <400* 66 сддЛассас а1ссааддаа 20 <210» 67 <211» 18 <212» ДНК <213» Синтетическая последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер, рРНК - обратный праймер <400> 67 дсТддааТТа ссдсддсб 18 <210» 68 <211> 22 <212» ДНК <213»Синтетическая последовательность <220>

<223> рРНК ТадМап зонд <400> 68

1дс1ддсасс адасйдссс 1с 22 <210» 69 <211» 1298 <212» ДНК <213» Миз тизси1из <220>

<221> С05 <222> (543)...(1262) <400» 69 аддссШса асасддсШ Иад1ааПс айсса1с1а 1ааасата Тдд1асасЛ 60 ас1д1д!дсс аддТасТдад дасасадйд 1даТсадддс 1ад1д1адас асасаадсаа 120

- 68 006501 асссддаадк сасасдксск скддддсаск дддаасасдд садасаксак ссссдкскск сасасссдас дксаддадас ддадкададд скдддссаск кадассксад саадасскка ддаеккадда ддкааскадс дкддакакда дскскдадаа сддасадкак ддсдсдскск скскскскск ддсккдкссс кдкасксссс сккдккдксс ссадсксакд аскдкдкдкк асскддкссс дасададдас кдддаассса сксксксскд сссссасссс адсасссадс адксадксск скдддсаддд кккксЫдкк сакскккддс ксккксксак «д дтд 1еи Уа!

180

240

300

360

420

480

540

587 ааскададас дскскссскд кдккссккдд каскаааддк ддкксасада сккскдсккк кскскскдкк ад ааа кдд дкк аак асе сск ккс асд дсс ксс аде ака дад

Ьуз Тгр УаТ Азп ТЬг Рго РЬе ТЬг А!а 5ег Зег Не 61 и

1

5

10

15

сса

сад

адк

ксс

аса

кса

дсс

кка

сак

скд

кса

ккд

как

сса

635

Рго

61 п

Зег

ТЬг

Зег

А1а

Ьеи

Н1 5

кеи

Зег

Ьеи

Туг

Рго

20

25

30

дсс

аад

дад

аад

ккс

ссд

ддд

скд

ссд

ддт

скд

даа

дад

саа

скд

683

А1а

куз

61 и

Суз

1-У5

РЬе

Рго

61У

Ьеи

Рго

61у

кеи

61 и

61 п

кеи

35

40

45

дад

кдк

дак

дда

акд

кек

дад

сск

ддт

сас

тдд

кде

ака

акс

ссс

ккд

731

61 и

Суз

Азр

61у

Мек

Зег

61 и

Рго

61у

Н1 5

Тгр

Суз

Не

11е

Рго

кеи

50

55

60

дса

дек

ддс

саа

дед

дкс

кса

дсс

кас

адк

дад

ада

дас

едд

сса

779

А1а

61у

61 п

А1 а

Уа!

Зег

А1 а

Туг

Зег

61 и

Агд

Азр

Агд

Рго

65

70

75

как

ддк

скд

дкд

ксс

акк

дас

аса

дкд

аск

дкд

дда

дак

дса

дад

ддс

827

Туг

61у

кеи

Уа!

Зег

Не

Азр

ТЬг

Уа!

ТЬг

Уа!

61у

Азр

АТа

61 и

61у

80

85

90

95

скд

кдк

дкс

кдд

ссс

кдк

аде

кдк

дад

дак

ддс

как

сса

дсс

акд

875

кеи

Суз

Уа1

Тгр

Рго

Суз

Зег

Суз

61 и

Азр

61у

Туг

Рго

А1 а

Мек

100

105

110

аас

скд

дак

дек

ддс

еда

дад

кек

ддс

сск

аак

кса

дад

дак

скд

скс

923

Азп

кеи

Азр

А! а

61у

Агд

61 и

Зег

61у

Рго

Азп

Зег

61 и

Азр

Ьеи

кеи

115

120

125

ккд

дкс

аса

дас

сск

дек

ккк

скд

кек

кде

ддс

кдк

дкс

кса

ддт

адк

971

кеи

УаТ

ТЬг

Азр

Рго

А1 а

РЬе

кеи

Зег

Суз

61у

Суз

Уа1

Зег

61у

Зег

130

135

140

ддь

скс

адд

екк

дда

ддс

ксс

сса

ддс

аде

ска

скд

дас

адд

ккд

адд

1019

Зег

Азр Агд Ьеи Агд кеи кеи Агд

145

Ьеи кеи

155

61у 61у Зег Рго 61у

150 скд

1_еи

160 дса аск ТЬг ддт

61у аде Зег

240 кса ккк Зег РЬе А!а ддд ксс

61у 5ег скд дас

1_еи Азр сса Рго акд Мек

195 аад даа ддд дас кдд куз 61и 61у Азр Тгр

165 дда ддд ддс кек

61у 61у 61у Зег

180 дад и

аса ТЬг дса дас

А1а Азр

170 даа дса 5ег 61 и АТа 185 ад!

дас Азр аса ТЬг адк сса асе кдд ада

Рго ТЬг Тгр Агд

175

1067 ддт

61у

Тсс Зег ссс Рго

190 сск Рго

1115 ккк дас

РЬе Азр Зег 61у

200 ддс ΐίΐ дса

РЬе А1а ддт

61у кса

5ег

205 дас Азр кдк Суз

1163 сад η

ддс

61у

аде

ссс

дкд

дад

ас!

дак

даа

дда

ссс

ссТ

еда аде

как

скс

сдс

1211

Зег

Рго

Уа1

61и

ТЬг

Азр

61 и

61у

Рго

Агд Зег

Туг

кеи

Агд

210

215

220

кдд

дкд

дкс

адд

асе

сск

сса

сск

дкд

дас

адк -дда

дсс

сад

аде

1259

Тгр

Уа!

Уа1

Агд

ТЬг

Рго

Уа!

Азр

5ег 61у

АТа

61п

5ег

225

230

235 кадсакакаа каассадска кадкдадаад аддсск

1298 <210> 70 <211» 240 <212> Белок <213> Низ шизси1из <400» 70

куз

Тгр Уа1

Азп

ТЬг

Рго

РЬе

ТЬг

А1а

Зег

Зег Не

61 и

кеи

Уа!

Рго

1

5

10

15

61 п

Зег Зег

ТЬг

ТЫ

Зег

ΑΊ а

кеи

Н15

кеи Зег

кеи

Туг

Рго

АТа

20

25

30

куз

61 и куз

куз

РЬе

Рго

61у

кеи

Рго

61у

кеи 61 и

61 и

61 п

кеи

61и

35

40

45

Суз

Азр 61у

Мек

Зег

61 и

Рго

61у

Н15

Тгр

Суз Не

Не

Рго

кеи

А1а

50

55

60

АТа

61у 61п

А1 а

Уа1

Зег

А1а

Туг

Зег

61 и

61 и Агд

Агр

Агд

Рго

Туг

65

70

75

80

С1у

кеи Уа!

Зег

Не

Азр

ТЬг

Уа!

ТЬг

Уа!

61у Азр

АТа

61и

6!у

кеи

90 95

- 69 006501

СУЗ

УаТ

Тгр

Рго

Суз

Зег

Суз

61и

Азр

61у

Туг

Рго

АТа

МеС

Азп

100

105

по

Ьеи

Азр

А1а

6Ту

Агд

61 и

Зег

61у

Рго

Азп

Зег

61 и

Азр

Сеи

115

120

125

УаТ

ТЬг

Азр

Рго

АТ а

РЬе

геи

Зег

Суз

61у

Суз

УаТ

Зег

61у

Зег

61у

130

135

140

Ьеи

Агд

Ьеи

61у

Зег

Рго

61у

Зег

геи

Сеи

Азр

Агд

Сеи

Агд

Сеи

145

150

155

160

8ег

РЬе

АТ а

суз

61 и

61у

Азр

Тгр

ТЬг

АТ а

Азр

Рго

ТЬг

Тгр

Агд

ТЬг

165

170

175

61у

Зег

Рго

61у

5ег

С1и

Зег

61 и

АТ а

ету

Зег

Рго

61у

180

185

190

Ьеи

Азр

Мег

Азр

ТЬг

РЬе

Азр

Зег

61у

РЬе

АТа

61у

Зег

Азр

Суз

ету

195

200

205

5ег

Рго

УаТ

91 и

ТЬг

Азр

61 и

61у

Рго

Агд

Зег

Туг

Сеи

Агд

61 η

210

215

220

Тгр

УаТ

Агд

ТЬг

Рго

УаТ

Азр

Зег

61у

АТ а

61п

Зег

225

230

235

240

<210= 71 <211=- 23 <212= ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223= Олигонуклеотидный праймер ΖΟ24432 <400> 71 аЬдШдадс сСддСсасСд дгд 23 <210> 72 <211> 23 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ24433 <400= 72

ЬсгдаассТд сааадссасг дгс <210> 73 <211> 27 <212= ДНК <213* Синтетическая последовательность <220 <223> Олигонуклеотидный праймер Ζ09739 <400> 73 ссаЬссЬааг асдасгсасг агадддс <210> 74 <211= 22 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223= Олигонуклеотидный праймер ΖΟ24434 <400=- 74 сассадСдас саддсСсада са <210 75 <211> 23 <212= ДНК <213= Синтетическая последовательность <220 <223> Олигонуклеотидный праймер Ζ024431 <400 75 ссагсасасг ссадЬЬдсгс ггс <210 76 <211> 23 <212= ДНК <213> Синтетическая последовательность <220=<220 Олигонуклеотидный праймер ΖΟ9719 <400> 76 асгсасгага дддсгсдадс ддс <210= 77 <211> 23 <212= ДНК <213> Синтетическая последовательность

- 70 006501 <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ24511 <400> 77 бссадсабад адббддбдсс аса <210>

<211= <212» <213»

592

ДНК

Низ тизси1из <220= <221» <222>

<400>

сдсссдддса ддбсбссдсб ддбддсссбд бдбббсадбс дсдсасадсб дбсбдсссас ббсбссбдбд дбдбдссбса сддбсасббд сббдбсбдас сдсаадбсбд сссабсссбд дддсадссаа адсссбасбд ддасбабсбс ссбсааассб дадассассс ддбсбдддас сбддссбсад сссдбдсссс аддсдбдссс бдбебебдбе бддсбдсссс бсббссбсбд бдбаддсбсб дсссадабдс ссддсбддбс сбсадссбса адсадбдасб ссссбдаббс бддаеббдеа ссбдасбдаа сбссбдссса бсассбссса ссассассас бссдадбссс дсбдбдасбс ссасдсссад аадбдсссса дссбааадаа бддебббебд аддаадабсс бдааддадба асадс абд ссс едд ддс сса дбд дсб дес На сбс ебд ебд Меб Рго Агд 01у Рго Уа1 А1а А1а беи беи беи беи 1 5

120

180

240

300

360

420

471

абб

сбс

са!

дда дсТ

Тдд

аде

бде

ебд

дгс

сбс

ас1

бде

Тае

асе

дас

519

Пе

беи

Н13

Е1у А1а

Тгр

5ег

Суг

беи

Хаа

беи

ТЬг

Суз

Туг

ТЬг

Азр

15

20

25

бас

сбс

тдд

асе а!с

асе

бдб

дбе

ебд

дад

аса

едд

аде

ссс

аас

ссс

567

Туг

беи

Тгр

ТЬг Не

ТНг

Суг

Уа!

беи

61и

ТЬг

Агд

Зег

Рго

Азп

Рго

30

35

40

592 аба сбс адб

Не Ьеи 5ег сбс беи аде

5ег асе бдд саа

ТЬг Тгр 81 η <220>

<210» 79 <211> 52 <212> Белок <213> Миг тигси1иг

<221>

Вар

мант

<222>

(1).

...(51)

<223=

Хаа

= л

юба

я амино

КИСЛ

ота

<400»

79

Меб

Рго Агд

61у

Рго

Уа1

АТа

А1а

беи

Не

беи

Н15

61у

1

5

10

15

А1 а

Тгр 5ег

Суг

беи

Хаа

беи

ТЬг

Суг

Туг

ТЬг

Агр

Туг

беи

Тгр

ТЬг

20

25

30

Не

ТЬг Суг

Уа!

беи

61 и

ТЬг

Агд

5ег

Рго

Агп

Рго

Зег

Пе

беи

8ег

35

40

45

беи

ТЬг Тгр

61 п

50

<210» <211=· <212» <213>

1229

ДНК

Миг тигси1иг <220>

<221» <222>

СОЗ (3)...(1196) <400= да сдс баб даб абс бее бдд дас бса дсб баб дас даа ссс бее аас Агд Туг Агр 11е 5ег Тгр Агр 8ег А1а Туг Агр 61 и Рго 5ег Агл

1

5

10

15

бас

дбд

ебд

ада

ддс

аад

сба

саа

баб

дад

ебд

сад

баб

едд

аас

сбс

95

Туг

Уа!

беи

Агд

61у

Суг

беи

61л

Туг

61 и

беи

61л

Туг

Агд

Аеп

беи

20

25

30

ада

дас

ссс

баб

дсб

дбд

адд

ссд

дбд

асе

аад

ебд

абс

бса

дбд

дас

143

Агд

Агр

Рго

Туг

А1а

Уа1

Агд

Рго

Уа1

ТЬг

буг

беи

Не

Зег

Уа1

Агр

35

40

45

бса

ада

аас

дбе

бсб

ебб

сбс

ссб

даа

дад

ббс

сас

ааа

даб

бсб

аде

191

5ег

Агд

Агп

Уа1

Зег

беи

Рго

61 и

РЬе

Н1 г

буе

Аер

Зег

50

55

60

бас

сад

ебд

сад

абд

едд

дса

дед

ссб

сад

сса

ддс

асб

бса

ббс

адд

239

Туг

61п

беи

61 л

Меб

Агд

А1а

А1 а

Рго

61п

Рго

61у

ТЬг

Зег

РЬе

Агд

65

70

75

999

асе

бдд

адб

дад

бдд

адб

дас

ссс

дбе

абс

ббб

едд

асе

сад

дсб

287

- 71 006501

61у 80

ТКг Тгр Зег

61 и

Тгр 85

Зег

Азр

Рго

Уа1

Не РЬе Агд ТЬг 61п АТа

90

95

ддд

дад

ССС

дад

дса

ддс !дд дас

сс!

сас

а!д с!д

с!д

с!с

с!д

дс!

335

сту

61 и

Рго

61 и

А1 а

61у Тгр Азр

Рго

Ηί 5

Ме!

1еи

Ьеи

А1 а

100

105

110

дЬс

ЬЬд

аТс

аМ

дТ.с сТд дТТ

!!с

а!д

дд! с!д

аад

а!с

сас

с!д

сс!

383

УаТ

Ьеи

Пе

Не

УаТ

Ьеи

Уа1

РЬе

Ме!

61у

Ьеи

Ьуз

Пе

Н1з

Ьеи

Рго

115

120

125

тдд

адд

сТа

Ьдд

ааа

аад

а!а

ьдд

дса

сса

д!д

ссс

асе

сс!

дад

ад!

431

Тгр Агд

Ьеи Тгр

Ьуз Ьуз

Пе Тгр

АТа

Рго

Уа1

Рго

ТЬг

Рго

61 и

Зег

130

135

140

Мс

ТТс

сад

ссс

сЬд Ьдс

адд

дад

сас

аде

ддд

аас

!!с

аад

ааа

!дд

479

РЬе

61п

Рго

Ьеи Суз

Агд

61 и

Нтз

Зег

61у

Азп

РЬе

Ьуз

Тгр

145

150

155

дм

ааТ

асе

ссТ

ЬЬс асд

дсс

Ьсс

аде

а!а

дад

«9 д!д

сса

сад

ад!

527

Уа1

Азп

ТЬг

Рго

РЬе ТЬг

А1а

Зег

Пе

61 и

Ьеи

УаТ

Рго

61 л

Зег

160

165

170

175

Ьсс

аса

Ьса

дсс

Ма

саЬ

с!д

Ьса

Мд

ТаТ

сса

дсс

аад

дад

575

Зег

ТЬг ТЬг ТЬг

Зег

А1 а

Ьеи

Нтз

Ьеи

Зег

Ьеи

Туг

Рго

А1а

Ьуз

61 и

180

185

190

аад

ЬЬс

ссд

ддд

с!д

ссд

ддь сьд

даа

дад

саа

с!д

дад

!д!

да!

623

Ьуг

Ьуз

РЬе

Рго

61у

Ьеи

Рго

61у Ьеи

61 и

61п

Ьеи

61 и

Суз

Азр

195

200

205

дда

аЬд

ЬсЬ

дад

сс!

дд!

сас

Ьдд Ьдс

а!а

а!с

ссс

Мд

дса

дс!

ддс

671

С1у

Ме!

Зег

61 и

Рго

61у

Н15

Тгр Суз

Пе

Рго

Ьеи

АТа

А1а

б1у

210

215

220

саа

дед

дЬс

Ьса

дсс

!ас

ад!

дад

ада

дас

едд

сса

!а!

ддь

с!д

719

Εΐη А1а Уа1 Зег А1а Туг Зег 61и 61и Агд Азр Агд Рго Туг 61у Ьеи

225 230 235 д!д Ьсс аМ дас аса дЬд асЬ д!д дда да! дса дад ддс с!д !д! дЬс767

Уа1 5ег Не Азр ТЬг УаТ ТЬг УаТ 61у Азр А1 а 61и 61у Ьеи СузУа1

240 245 250255

!дд Тгр

ссс !д! аде !д! дад

да! да!

ддс Ьа! сса дсс а!д

аас с!д

дат Азр

815

Рго

Суз

Зег

Суз 260

61 и

Азр

61у

Туг 265

Рго

АТа

МеЬ

Азп

Ьеи 270

дс!

ддс

еда

дад

ЬсЬ

ддс

сс!

аа!

Ьса

дад

да!

с!д

с!с

Мд дЬс

аса

863

АТ а

61у Агд

61 и

Зег

61 у

Рго

Азп

Зег

61и

Азр

Ьеи

УаТ

ТЬг

275

280

285

дас

ссТ

дс!

пь

с!д

ТсТ

Ьдс

ддс

!д! д!с

Ьса

дд!

ад!

дд!

с!с

адд

911

Азр

Рго

АТа

РЬе

Ьеи

Зег

Суз

СПу

Суз

Уа1

Зег

61у

Зег

61у

Ьеи

Агд

290

295

300

сН

993

ддс

Ьсс

сса

ддс

аде

с!а

с!д

дас

адд

Мд

адд

с!д

Ьса

ТТТ

959

Ьеи

61у

61у Зег

Рго 61у

Зег

Ьеи

Азр Агд

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

РЬе

305

310

315

дса

аад

даа

дд9

дас Ьдд

аса

дса

дас

сса

асе

ьдд

ада

ас!

ддд

Тсс

1007

А1а

ЬУЗ

61 и

61у Азр Тгр

ТЬг А1а

Азр

Рго

ТЬг

Тгр

Агд

ТЬг

61у

Зег

320

325

330

335

сса дда ддд ддс ЬсЬ дад ад! даа дса дд! Ьсс ссс.ссЬ ддЬ сЬд дас 1055

Рго ОТу 61у 61у Зег 61и 5ег 61и А1а 61у Зег Рго Рго 61у Ьеи Азр

340

345

350

а!д

дас

аса

МЬ

дас

ад!

ддс

М!

дса

ддь

Ьса

дас

!д!

ддс

аде

ссс

1103

Ме!

Аър

ТЬг

РЬе

Азр

Зег

61У

РЬе

А1 а

61у

Зег

Азр

Суз

61у

Зег

Рго

355

360

365

д!д

дад

ас!

да!

даа

дда

ссс

сс!

еда

аде

Ьа!

с!с

еде

сад

!дд

д!д

1151

Уа1

61 и

ТЬг

Азр

61 и

61у

Рго

Агд

Зег

Туг

Ьеи

Агд

61п

Тгр

Уа!

370

375

380

д!с

адд

асе

ее!

сса

сс!

дьд

дас

ад!

дда

дсс

сад

аде

Ьад

1196

Уа!

Агд

ТЫ

Рго

Уа1

Азр

Зег

61у

АТа

61п

Зег

★

385

390

395

саЬаЬааЬаа ссадсЬаЬад Ьдадаададд ссЬ1229 <210= 81 <211= 397 <212> Белок <213= Низ птизсиТиз <400= 81

Агд Туг Азр 11е Зег Тгр Азр Зег А1а Туг Азр 61и Рго Зег Азп Туг 15 10 15

- 72 006501

Уа! Ьеи Агд 61у

Ьуз

Ьеи

61 п Туг

Е1и Ьеи 25

61п Туг

Агд Азп 30

Ьеи

Агд

20

Азр

Рго

Туг

АТа

Уа!

Агд

Рго

Уа!

ТЬг

Ьуз

Ьеи

Не

Зег

УаТ

Азр

Зег

35

40

45

Агд

Азп

Уа!

Зег

Ьеи

Рго

61 и

РКе

Н15

Ьуз

Азр

Зег

Туг

50

55

60

61п

Ьеи

61п

МеЬ

Агд

А1 а

Рго

етп

Рго 61у

ТЬг

Зег

РЬе

Агд 61у

65

70

75

80

ТЬг

Тгр

Зег

61 и

Тгр

Зег

Азр

Рго

Уа!

Не

РКе

Агд

ТНг

61 п

А! а

61у

85

90

95

61 и

Рго

61и

АТ а

ЕТу Тгр Азр

Рго

Ж 3

МеЬ

Ьеи

АТ а

Уа!

100

105

по

Ьеи

Не

Уа!

Ьеи

Уа1

РЬе

МеЬ

61у

Ьеи

Ьуз

Не

Нтз

Ьеи

Рго Тгр

115

120

125

Агд

Ьеи

Тгр Ьуз

1-У5

Не

Тгр

АТа

Рго

Уа!

Рго ТЬг

Рго

61 и

Зег

РЬе

130

135

140

РЬе

61п

Рго

Ьеи

Суз Агд

61 и

Ηί з

Зег

61у

Азп

РЬе

Ьуз

Ьуз Тгр

Уа1

145

150

155

160

Азп

ТНг

Рго

РЬе

ТНг

А1 а

Зег

Не

6! и

Ьеи

УаТ

Рго

61 п

Зег

165

170

175

ТЬг

Зег

А! а

Ьеи

Н15

Ьеи

Зег

Ьеи

Туг

Рго

А! а

Ьуз

61 и

Ьуз

180

185

190

Ьуз РЬе Рго 61у Ьеи Рго 61у Ьеи 61и 61и 61п Ьеи ВТ и Суз Азр 61у

195 200205

МеЬ 5ег 61и Рго 61у Жз Тгр Суз 11е Не Рго Ьеи А1 а А1а 61у 61п 210 215220

АТа Уа! Зег А1а Туг Зег ЕТи 61и Агд Азр Агд Рго Туг 61у ЬеиУа1

225 230 235240

Зег Не Азр ТНг Уа1 ТЬг Уа! Е1у Азр АТа 61и 61у Ьеи Суз Уа1Тгр

245 250255

Рго Суз Зег Суз 61и Азр Азр 61у Туг Рго АТа МеЬ Азп Ьеи Азр АТа 260 265270

61у Агд 61 и Зег 61у Рго Азп Зег 61 и Азр Ьеи Ьеи Ьеи Уа1 ТНг Азр 275 280285

Рго АТа РЬе Ьеи Зег Суз 61у Суз Уа! Зег 61 у Зег 61у Ьеи Агд Ьеи 290 295300

61у 61у Зег Рго 61у Зег Ьеи Ьеи Азр Агд Ьеи Агд Ьеи Зег РЬеА1а

305 310 315320

Ьуз В1и В1у Азр Тгр ТНг АТа Азр Рго ТЬг Тгр Агд ТНг 61у ЗегРго

325 330335

61у 61у 61у Зег 61и Зег 61и АТа 61у Зег Рго Рго 61у Ьеи Азр МеЬ 340 345350

Азр ТЬг РЬе Азр Зег В1у РЬе АТа В1у Зег Азр Суз 61у Зег Рго Уа1

355 360365

61 и	ТЬг Азр	61 и	61 у	Рго	Рго	Агд	Зег	Туг	Ьеи	Агд	61п Тгр УаТ Уа1
	370				375					380
Агд	ТЬг Рго	Рго	Рго	Уа1	Азр	Зег	61у	А1а	61 п	5ег	Зег
385				390					395
	<210>	82
	<211»	23

<212» ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ24616 <400=· 82 сЬдсссассЬ сааассЬЬса ссЬ23 <210» 83 <211» 24 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220» <223=· Олигонуклеотидный праймер ΖΟ24615 <400» 83 аЬдсЬадсЬд сЬсЬдддсЬс сасЬ 24 <210> 84 <211> 1735 <212> ДНК <213> Миз тизси1из <220>

<221» СОЗ <222> (143)...(1729) <400=· 84 сЬдсссассЬ сааассЬЬса ссЬсссасса ссассасЬсс дадЬсссдсЬ дЬдасЬссса60 сдсссаддад ассасссаад Ьдссссадсс ЬааадааЬдд сЬЬЬсЬдада аадасссЬда120 аддадЬаддЬ сЬдддасаса дс а1д ссс сдд ддс сса дЬд дсЬ дсс Ыа сЬс172

МеЬ Рго Агд 61у Рго УаТ А1а АТа Ьеи Ьеи

5Ю сЬд сЬд аЬЬ сЬс саЬ дда дсЬ Ьдд аде Тдс сЬд дас сЬс асЬ Ьдс Ьас 220

- 73 006501

1еи

Ьеи

Не

Ьеи

Н15

61у

А1 а

Тгр

Зег

Суз

Ьеи

Азр

Ьеи

ТЬг

Суз

Туг

15

20

25

асТ

дас

!ас

с!с

!дд

асе

а!с

асе

!д!

дтс

сТд

дад

аса

едд

аде

ссс

268

ТЬг

Аар

Туг

1_еи

Тгр

ТЬг

11е

ТЬг

Суз

Уа1

Ьеи

61и

ТЬг

Агд

8ег

Рго

30

35

40

аас

ссс

аде

а!а

с!с

ад!

с!с

асе

!дд

саа

дат

даа

!а!

дад

даа

с!!

316

Αδη

Рго

5ег

11е

Ьеи

8ег

Ьеи

ТЫ

Тгр

61п

Азр

61и

Туг

61и

61 и

Ьеи

45

50

55

сад

дас

саа

дад

асе

Йс

!дс

аде

с!а

сас

адд

ТсТ

ддс

сас

аас

асе

364

61п

Азр

61 п

61 и

ТЬг

РЬе

Суз

8ег

Ьеи

Н15

Агд

Зег

61у

Нтз

Азп

ТЬг

60

65

70

аса

са!

а!а

!дд

!ас

асд

!дс

са!

а!д

сдс

ТТд

ТсТ

саа

Йс

с!д

!сс

412

ТЬг

Нтз

Пе

Тгр

Туг

ТЬг

Суз

Нтз

Ме!

Агд

Ьеи

Зег

61п

РЬе

Ьеи

Зег

75

80

85

90

дат

даа

д!!

Йс

ай

д!с

аа!

д!д

асд

дас

сад

ТсТ

ддс

аас

!сс

460

Азр

81 и

Уа!

РЬе

Не

Уа!

Азп

УаТ

ТЬг

Азр

61п

Зег

61 у

Азп

Зег

95

100

105

саа

дад

!д!

ддс

аде

!!!

д!с

с!д

дс!

дад

аде

аТс

ааа

сса

дс!

ссс

508

61п

81 и

Суз

61у

8ег

РЬе

Уа1

1_еи

А1 а

61 и

Зег

Не

Ьуз

Рго

А1 а

Рго

110

115

120

ссс

йд

аас

д!д

ас!

д!д

дсс

!!с

!са

дда

сдс

ТаТ

да!

а!с

!сс

Тдд

556

Рго

Ьеи

Азп

Уа!

ТЬг

Уа1

А1 а

РЬе

Зег

61 у

Агд

Туг

Азр

Не

5ег

Тгр

125

130

135

дас

!са

дс!

Ьа!

дас

даа

ссс

Ьсс

аас

Тас

дтд

сТд

адд

ддс

аад

ста

604

Азр

8ег

А1а

Туг

Азр

61и

Рго

8ег

Азп

Туг

Уа1

Ьеи

Агд

61у

Ьуз

1_еи

140

145

150

саа

!а!

дад

с!д

сад

!а!

едд

аас

с!с

ада

дас

ссс

!а!

дс!

дтд

адд

652

61п

Туг

61и

Ьеи

61 п

Туг

Агд

Азп

1_еи

Агд

Азр

Рго

Туг

А1а

Уа!

Агд

200

190

195

дед а

сс!

сад п

205

сса

ддс

ас!

!са

асе !дд

Агд

210 ддд

ад!

215 дад и

!дд ад!

796

дас ссс Азр Рго 220

д!с а!с !Й Уа! 11е РЬе

сад асе сад дс! ддд дад ссс дад дса

ддс 61у

тдд Тгр

61п

ТЬг 225

61 п

А! а

61у В1и

Рго 230

61 и

А1а

дас

сс!

сас

аТд

с!д с!д

с!с

с!д

дс! д!с Йд

а!с

ай

д!с

с!д д!!

Азр

Рго

Ш з

МеТ

Ьеи

А1а

Уа!

Ьеи

Не

Пе

Уа1

Ьеи

Уа1

235

240

245

250

Йс

а!д

дд! С!д

аад

а!с

сас

с!д

сс!

Ϊ99 адд

с!а

!дд

ааа

аад

а!а

РЬе

Ме!

61у

Ьеи

ЬУ5

Пе

Нтз

Ьеи

Рго

Тгр Агд

Ьеи

Тгр

Ьуз

11е

255

260

265

!дд

дса

сса

дед

ссс

асе

сс!

дад

ад!

!!с

ттс

сад

ссс

с!д

!ас

адд

Тгр А1а

Рго

Уа!

Рго

ТЬг

Рго

61 и

Зег

РЬе

61 п

Рго

Ьеи

Туг Агд

270

275

280

дад

сас

аде

ддд

аас

!!с

аад

ааа

!дд дтт

ааТ

асе

сс!

!!с

асд

дсс

61 и

Н15

Зег

61у

Азп

РЬе

Ьуз

Ьуз Тгр

Уа1

Азп

ТЬг

Рго

РЬе

ТЬг

А1а

285

290

295

!сс

аде

аТа

дад

ид д!д

сса

сад

адТ

!сс

аса

!са

дсс

ТТа

Зег

Не

61 и

Ьеи

Уа!

Рго 61п

Зег

ТЬг

ТЫ

Зег

А1 а

1_еи

1036

1084

300

305

310

892

940

988

са!

с!д

!са

!1:д

ТаТ

сса

дсс

аад

дад

аад

ТТс

ссд

ддд

сТд

ссд

Нтз

Ьеи

Зег

Ьеи

Туг

Рго

А1а

Ьуз

61 и

Ьуз

РЬе

Рго

61 у

1_еи

Рго

315

320

325

330

дд!

с!д

даа

дад

саа

с!д

дад

!д!

да!

дда

а!д

ТсТ

дад

сс!

дд!

сас

б1у

Ьеи

61 и

61п

Ьеи

61 и

Суз

Азр

61у

Ме!

Зег

61 и

Рго

61 у

Нтз

335

340

345

Тдд

!дс

а!а

а!с

ссс

йд

дса

дс!

ддс

саа

дед

дТс

!са

дсс

!ас

ад!

Тгр

Суз

Пе

Рго

Ьеи

А1 а

А! а

61у

61 п

АТа

Уа1

Зег

А1 а

Туг

Зег

350

355

360

1132

1180

1228 дад дад ада дас едд сса !а! дд!

с!д д!д !сс ай дас аса д!д ас!

1276

- 74 006501

61 и

61и

Агд

Азр

Агд

Рго

Туг

61у

Ьеи

Уа!

Зег

Не

Азр

ТЬг

Уа!

ТЫ

365

370

375

д!д

дда

даЬ

дса

дад

ддс

с!д

!д!

д!с

!дд

ссс

!д!

аде

!д!

дад

да!

1324

Уа!

61у

Азр

А1 а

61 и

61у

Ьеи

Суз

Уа1

Тгр

Рго

Суз

Зег

Суз

61 и

Азр

380

385

390

да!

ддс

!а!

сса

дсс

а!д

аас

с!д

да!

дс!

ддс

еда

дад

!с!

ддс

сс!

1372

Азр

61у

Туг

Рго

А1 а

Ме!

Азп

Ьеи

Азр

А1 а

61у

Агд

61 и

Зег

61у

Рго

395

400

405

410

а а!

Ьса

дад

да!

с!д

с!с

Ь!д

д!с

аса

дас

сс!

дс!

ίίί

с!д

!с!

!дс

1420

Азп

Зег

61 и

Азр

Ьеи

Уа1

ТЬг

Азр

Рго

А! а

РЬе

Ьеи

Зег

Суз

415

420

425

99С

!д!

д!с

!са

дд!

ад!

дд!

с!с

адд

с!!

дда

ддс

!сс

сса

ддс

аде

1468

61у

Суз

Уа1

Зег

61у

Зег

61у

Ьеи

Агд

Ьеи

61у

61 у

Зег

Рго

61у

Зег

430

435

440

с!а

сЬд

дас

адд

!!д

адд

с!д

!са

!!!

дса

аад

даа

ддд

дас

!дд

аса

1516

Ьеи

Азр

Агд

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

РЬе

А! а

Ьуз

61и

61у

Азр

Тгр

ТЬг

445

450

455

дса

дас

сса

асе

!дд

ада

ас!

ддд

!сс

сса

дда

ддд

ддс

!с!

дад

ад!

1564

А1 а

Азр

Рго

ТЬг

Тгр

Агд

ТЬг

61у

Зег

Рго

61у

61 у

Зег

61 и

Зег

460

465

470

даа

дса

дд!

!сс

ССС

сс!

дд!

с!д

дас

а!д

дас

аса

ίίί

дас

ад!

ддс

1612

61 и

А1 а

61 у

Зег

Рго

61у

Ьеи

Азр

Ме!

Азр

ТЬг

РЬе

Азр

Зег

61у

475

480

485

490

ίίί

дса

дд!

!са

дас

!д!

ддс

аде

ссс

д!д

дад

ас!

да!

даа

дда

ссс

1660

РЬе

А1а

61у

Зег

Азр

Суз

61у

Зег

Рго

Уа!

61 и

ТЬг

Азр

61 и

61у

Рго

495

500

505

сс!

еда

аде

!а!

с!с

сдс

сад

ьдд

д!д

д!с

адд

асе

сс!

сса

сс!

д!д

1708

Рго

Агд

Зег

Туг

Ьеи

Агд

61 п

Тгр

Уа!

Агд

ТЬг

Рго

Уа!

510

515

520

дас

ад!

дда

дсс

сад

аде

!ад|

:а!

1735

Азр

Зег

61у

А1 а

61п

Зег

525 <210> 85 <211= 529 <212= Белок <213> Низ тизси1из

<400>

85

Ме!

Рго

Агд

61у

Рго

Уа!

А1а

А! а

Ьеи

Не

Ьеи

НТ 5

61у

1

5

10

15

А1 а

Тгр

Зег

Суз

Ьеи

Азр

Ьеи

ТЬг

Суз

Туг

ТЬг

Азр

Туг

Ьеи

Тгр

ТЬг

20

25

30

Не

ТЬг

Суз

Уа!

Ьеи

61и

ТЬг

Агд

Зег

Рго

Азп

Рго

Зег

Не

Ьеи

Зег

35

40

45

Ьеи

ТЬг

Тгр

61п

Азр

61 и

Туг

61 и

Ьеи

61 п

Азр

61 п

61 и

ТЬг

РЬе

50

55

60

Суз

Зег

Ьеи

Нтз

Агд

Зег

61у

Н15

Азп

ТЬг

Нтз

Не

Тгр

Туг

ТЬг

65

70

75

80

Суз

Нтз

Ме!

Агд

Ьеи

Зег

61п

РЬе

Ьеи

Зег

Азр

61и

Уа!

РЬе

Не

Уа!

85

90

95

Азп

Уа!

ТЬг

Азр

61 п

Зег

61у

Агп

Азп

Зег

61 п

61 и

Суг

61у

Зег

РЬе

100

105

110

Уа!

Ьеи

А! а

61и

Зег

Не

1-У5

Рго

А1а

Рго

Ьеи

Азп

Уа!

ТЬг

Уа!

115 120 125

А1а РЬе Зег 61у Агд Туг Азр Не 8ег Тгр А5р 8ег А1а Туг Азр 61и 130 135 140

Рго

Зег

Азп

Туг

Уа1

Ьеи

Агд

61у

Ьуз

Ьеи

61 п

Туг

61 и

Ьеи

61п

Туг

145

150

155

160

Агд

Азп

Ьеи

Агд

Азр

Рго

Туг

А1а

Уа!

Агд

Рго

Уа!

ТЬг

Ьуз

Ьеи

Не

165

170

175

Зег

Уа!

Азр

Зег

Агд

Азп

Уа!

Зег

Ьеи

Рго

61 и

РЬе

Нтз

1-У5

180

185

190

Азр

Зег

Туг

61 п

Ьеи

61 п

Уа!

Агд

А1а

Рго

61 п

Рго

61у

ТЬг

195

200

205

Зег

РЬе

Агд

61у

ТЬг

Тгр

Зег

61 и

Тгр

Зег

Агр

Рго

Уа!

Не

РЬе

61 п

210

215

220

ТЬг

61п

А1а

61у

61и

Рго

61 и

А1а

61у

Тгр

Азр

Рго

Н13

Ме!

Ьеи

225

230

235

240

Ьеи

А! а

Уа1

Ьеи

Не

Уа!

Ьеи

Уа!

РЬе

Ме!

61у

Ьеи

Ьуз

Не

245

250

255

Н1з

Ьеи

Рго

Тгр

Агд

Ьеи

Тгр

!У5

Не

Тгр

А1 а

Рго

Уа!

Рго

ТЬг

260

265

270

Рго

61 и

Зег

РЬе

61 п

Рго

Ьеи

Туг

Агд

61и

Нтз

Зег

61у

Азп

РЬе

275

280

285

Ьуз

Тгр

Уа!

Азп

ТЬг

Рго

РЬе

ТЬг

А! а

Зег

Не

61 и

Ьеи

Уа!

290

295

300

Рго 61л 5ег Зег ТЬг ТЬг ТЬг Зег А1а Ьеи Нтз Ьеи Зег Ьеи Туг Рго

305 310 315 320

- 75 006501

А1а

иу$

61 и

Ьуз

РЬе

Рго

61у

Ьеи

Рго

61у

Ьеи

61 и

61п

Ьеи

325

330

335

61и

Суз

Азр

61у

МеЬ

5ег

61 и

Рго

61у

Н15

Тгр

Суз

Не

11е

Рго

Ьеи

340

345

350

А1а

61у

61 η

А1а

Уа!

8ег

АТ а

Туг

Зег

61 и

61и

Агд

Азр

Агд

Рго

355

360

365

Туг

61у

Ьеи

Уа1

5ег

11е

Азр

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

61у

Азр

А1а

61 и

61у

370

375

380

Ьеи

Суз

Уа1

Тгр

Рго

Суз

Зег

Суз

61 и

Азр

61у

Туг

Рго

А1 а

МеЬ

385

390

395

400

Азп

Ьеи

Азр

А1а

61у

Агд

61 и

Зег

61у

Рго

Азп

Зег

61 и

Азр

Ьеи

410

Суз 61у Суз

Ьеи

Уа!

ТЬг

61у

Ьеи

Азр

420 Ьеи

405 Рго А1а

РЬе

Ьеи

Зег

450

Агд

435

РЬе А1а

415 61у Зег

Зег

425 у

Уа!

Зег

430

Агд

Зег

Рго

440

Ьуз 61и 61у Азр Тгр

455

61у СТу

5ег

ТЬг

Ьеи

А1а

Ьеи

Азр

460

Азр

445

Рго

ТЬг

Ьеи Агд

Тгр Агд

ТЬг

61у

Зег

Рго

61у

Зег

61 и

Зег

61 и

ΑΊ а

61у

Зег

Рго

465

470

475

Зег

480

61у

Ьеи

Азр

МеЬ

Азр

ТЬг

РЬе

Азр

Зег

61у

РЬе

А1а

61у

Азр

Суз

485

490

495

61у

Зег

Рго

Уа!

61и

ТЬг

Азр

61 и

61у

Рго

Агд

Зег

Туг

Ьеи

Агд

500

505

510

61п

Тгр

Уа1

Агд

ТЬг

Рго

Уа1

Азр

Зег

61у

АТ а

61л

Зег

515

520

525

Зег <210>

<211= <212> ДНК <213= Синтетическая последовательность <220» <223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ3424 <400=- 86 аасадсЬаЬд ассаЬд <210=· 87 <211> 20 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ694 <400> 87

ЬааТасдасЬ сасЬаЬаддд <210=- 88 <211> 20 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223= Олигонуклеотидный праймер ΖΟ24399 <400> 88 адсддЬсЬса дссЬасадЬд <210> 89 <211> 20 <212= ДНК <213= Синтетическая последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер Ζ024400 <400> 89

ЬдадсЬдддд асаасааддЬ <210» 90 <211=- 20 <212> ДНК <213» Синтетическая последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ24806 <400=· 90

Ьдасдаассс ЬссаасЬасд <210> 91 <211= 20 <212>ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер Ζ024807 <400> 91

ТдсЬсЬсадс саддасааад

- 76 006501

Claims

1. Выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид ха1рка11 рецептора цитокина человека класса Ι полной длины или его функциональные компоненты, включающие последовательности аминокислот, выбранные из группы, состоящей из (a) последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 237 (Н1к) δΕρ ΙΌ NО:2 (цитокинсвязывающий домен);

(b) последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 255 (Ьеи) δΕρ ΙΌ NО:2 (цитокинсвязывающий домен и трансмембранный домен);

(c) последовательности от аминокислоты номер 256 (Ьук) до аминокислоты номер 538 Кег) δΕρ ΙΌ NО:2 (внутриклеточный домен);

(б) последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 538 Кег) δΕρ ΙΌ NО:2 (зрелый полипептид);

(е) последовательности от аминокислоты номер 1 (Ме1) до аминокислоты номер 538 Кег) δΕρ ΙΌ NО:2 (полипептид полной длины) или последовательностей, которые по меньшей мере на 90% гомологичны указанным, и полученных согласно тому, как раскрыто в описании.

2. Выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид ха1рка11 рецептора цитокина человека класса Ι полной длины или его функциональные компоненты, включающий последовательность полинуклеотидов, выбранную из группы, состоящей из (a) полинуклеотидной последовательности от нуклеотида 69 до нуклеотида 1682 δΕρ ΙΌ NО:1 (полинуклеотид, кодирующий полипептид полной длины);

(b) полинуклеотидной последовательности от нуклеотида 1 до нуклеотида 1614 δΕρ ΙΌ NО:4 (вырожденный полинуклеотид по отношению к указанному в (а), кодирующий полипептид полной длины);

(c) полинуклеотидной последовательности от нуклеотида 126 до нуклеотида 779 δΕρ ΙΌ NО:1 (полинуклеотид, кодирующий цитокинсвязывающий домен);

(б) полинуклеотидной последовательности от нуклеотида 126 до нуклеотида 833 δΕρ ΙΌ NО:1 (полинуклеотид, кодирующий цитокинсвязывающий домен и трансмембранный домен);

(е) полинуклеотидной последовательности от нуклеотида 834 до нуклеотида 1682 δΕρ ΙΌ NО:1 (полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный домен);

(Γ) полинуклеотидной последовательности от нуклеотида 126 до нуклеотида 1682 δΕρ ΙΌ NО:1 (полинуклеотид, кодирующий зрелый полипептид).

3. Выделенный полинуклеотид по п.1, где полипептид ха1рка11 включает последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из (a) последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 237 (Н1к) δΕρ ΙΌ NО:2 (цитокинсвязывающий домен);

(б) последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 538 Кег) δΕρ ΙΌ NО:2 (зрелый полипептид) и (е) последовательности от аминокислоты номер 1 (Ме1) до аминокислоты номер 538 Кег) δΕρ ΙΌ NО:2 (полипептид полной длины).

4. Выделенный полинуклеотид по п.3, где полипептид ха1рка11 имеет последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из (a) последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 237 (Н1к) δΕρ ΙΌ NО:2 (цитокинсвязывающий домен);

(c) последовательности от аминокислоты номер 256 (Ьук) до аминокислоты номер 538 ^ег) δΕρ ΙΌ NО:2 (межклеточный домен);

(б) последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 538 ^ег) δΕρ ΙΌ NО:2 (зрелый полипептид) и (е) последовательности от аминокислоты номер 1 (Ме1) до аминокислоты номер 538 ^ег) δΕρ ΙΌ NО:2 (полипептид полной длины).

5. Выделенный полинуклеотид по п. 1, где полипептид дополнительно содержит домен \νδΧ\νδ (δΕρ ΙΟ ^:3).

6. Выделенный полинуклеотид по п. 1, где полипептид (а), (с), (б), (е) дополнительно содержит трансмембранный домен.

7. Выделенный полинуклеотид по п.6, где трансмембранный домен состоит из остатков 238 (Ьеи)255 (Ьеи) δΕρ ГО ^:2.

- 77 006501

8. Выделенный полинуклеотид по п.1, где полипептид (а), (Ь), (е), (б) дополнительно содержит внутриклеточный домен.

9. Выделенный полинуклеотид по п.8, где внутриклеточный домен состоит из остатков 256 (Ьук)538 (8ег) 8ЕО ΙΌ N0:2.

10. Выделенный полинуклеотид по п.9, где внутриклеточный домен дополнительно содержит сайты Вох Ι и Вох ΙΙ.

11. Выделенный полинуклеотид по п.1, где полипептид дополнительно содержит аффинную метку.

12. Экспрессирующий вектор, содержащий следующие функционально связанные элементы: промотор транскрипции;

сегмент ДНК, кодирующий зрелый полипептид 7а1рЬа11 рецептора цитокина человека класса 1, имеющий последовательность от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 538 (8ег) 8ЕЦ ΙΌ N0:2; и терминатор транскрипции, причем промотор функционально связан с сегментом ДНК, а сегмент ДНК функционально связан с терминатором транскрипции.

13. Экспрессирующий вектор по п. 12, где он дополнительно содержит второй сегмент ДНК, экспрессирующий секреторную сигнальную последовательность, функционально связанную с сегментом ДНК, кодирующим зрелый полипептид ха1рНа11.

14. Культивируемая клетка, содержащая экспрессирующий вектор по п. 12, экспрессирующая зрелый полипептид ха1рНа11.

15. Экспрессирующий вектор, содержащий промотор транскрипции;

сегмент ДНК, кодирующий цитокинсвязывающий домен полипептида 7а1рйа11 рецептора цитокина человека класса Ι, имеющий последовательность от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 237 (Н1к) 8ЕО ΙΌ N0:2; и терминатор транскрипции, причем промотор, сегмент ДНК и терминатор функционально связаны.

16. Экспрессирующий вектор по п. 15, дополнительно содержащий второй сегмент ДНК, экспрессирующий секреторную сигнальную последовательность, функционально связанную с сегментом ДНК, кодирующим цитокинсвязывающий домен полипептида 7а1рЬа11.

17. Экспрессирующий вектор по п. 15, дополнительно содержащий фрагмент ДНК, кодирующий трансмембранный домен полипептида 7а1рЬа11, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим цитокинсвязывающий домен указанного полипептида.

18. Экспрессирующий вектор по п. 17, где трансмембранный домен содержит остатки 238 (Ьеи)-255 (Ьеи) 8ЕС) ΙΌ N0:2.

19. Экспрессирующий вектор по п. 15, дополнительно содержащий фрагмент ДНК, кодирующий внутриклеточный домен полипептида ζα^ΙαΌ, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим цитокинсвязывающий домен указанного полипептида.

20. Экспрессирующий вектор по п. 19, где внутриклеточный домен состоит из остатков 256 (Ьук)538 (8ег) 8ЕО ΙΌ N0:2.

21. Культивируемая клетка, в которую был введен экспрессирующий вектор по п.15, экспрессирующая растворимый рецепторный полипептид, ζα^^αΚ.

22. Клетка по п. 21, пролиферация которой зависит от экзогенного гемопоэтического фактора роста.

23. Конструкция ДНК, кодирующая слитый белок, в состав которого входит полипептид ζαφΙαΠ рецептора цитокина человека класса Ι полной длины или его функциональные компоненты, содержащая первый сегмент ДНК, кодирующий полипептид, имеющий последовательность аминокислотных остатков, выбранную из группы, состоящей из (a) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 2 (Ме!) до аминокислоты номер 19 (С1у) 8ЕЦ ΙΌ N0:2 (секреторная сигнальная последовательность хар1На11);

(b) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 237 (Н1к) 8ЕЦ ΙΌ N0:2 (цитокинсвязывающий домен ха1рНа11);

(c) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 255 (Ьеи) 8ЕЦ ΙΌ N0:2 (цитокинсвязывающий домен и трансмембранный домен ха1рНа11);

(б) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 238 (Ьеи) до аминокислоты номер 255 (Ьеи) 8ЕЦ ΙΌ N0:2 (трансмембранный домен ха1рНа11);

(е) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 238 (Ьеи) до аминокислоты номер 538 (8ег) 8ЕЦ ΙΌ N0:2 (трансмембранный домен и внутриклеточный домен ха1рНа11);

(£) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 256 (Ьук) до аминокислоты номер 538 (8ег) 8ЕЦ ΙΌ N0:2 (внутриклеточный домен ха1рНа11);

(д) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 538 (8ег) 8ЕЦ ΙΌ N0:2 (зрелый полипептид ха1рНа11) и по меньшей мере один другой сегмент ДНК, кодирующий дополнительный полипептид,

- 78 006501 причем первый и другие сегменты ДНК соединены в рамке считывания.

24. Экспрессирующий вектор, содержащий следующие функционально связанные элементы:

промотор транскрипции;

конструкцию ДНК по п.23, кодирующую слитый белок; и терминатор транскрипции, причем промотор функционально связан с конструкцией ДНК, а конструкция ДНК функционально связана с терминатором транскрипции.

25. Культивируемая клетка, содержащая экспрессирующий вектор по п.24, причем клетка экспрессирует слитый белок.

26. Способ получения слитого белка, предусматривающий культивирование клетки по п. 25 и выделение полипептида, продуцируемого этой клеткой.

27. Выделенный полипептид ζοίρΐιοίΐ рецептора цитокина человека класса Ι полной длины или его функциональные компоненты, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (a) последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 237 (Н1к) 8ЕС ΙΌ N0:2 (цитокинсвязывающий домен);

(b) последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 255 (Ьеи) 8ЕС ΙΌ N0:2 (цитокинсвязывающий домен и трансмембранный домен);

(c) последовательности от аминокислоты номер 256 (Ьук) до аминокислоты номер 538 (8ег) 8ЕС ΙΌ N0:2 (полный внутриклеточный домен);

(б) последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 538 (8ег) 8ЕС ΙΌ N0:2 (зрелый полипептид) и (е) последовательности от аминокислоты номер 1 (Ме!) до аминокислоты номер 538 (8ег) 8ЕС ΙΌ N0:2 (полипептид полной длины) или последовательностей, которые по меньшей мере на 90% гомологичны указанным и получены, как раскрыто в описании.

28. Выделенный полипептид по п.27, который содержит последовательность аминокислотных остатков, выбранную из группы, состоящей из (a) последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 237 (Н1к) 8ЕС ΙΌ N0:2 (цитокинсвязывающий домен);

(c) последовательности от аминокислоты номер 256 (Ьук) до аминокислоты номер 538 (8ег) 8ЕС ΙΌ N0:2 (внутриклеточный домен);

(б) последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 538 (8ег) 8ЕС ΙΌ N0:2 (зрелый полипептид).

(е) последовательности от аминокислоты номер 1 (Ме!) до аминокислоты номер 538 (8ег) 8ЕС ΙΌ N0:2 (полипептид полной длины).

29. Выделенный полипептид по п.27, где полипептид ζι1ρ1ιι11 имеет последовательность аминокислотных остатков, выбранную из группы, состоящей из (a) последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 255 (Ьеи) 8ЕС ΙΌ N0:2 (цитокинсвязывающий домен);

(б) последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 538 (8ег) 8ЕС ΙΌ N0:2 (зрелый полипептид);

(е) последовательности от аминокислоты номер 1 (Ме!) до аминокислоты номер 538 8ЕС ΙΌ N0:2 (полипептид полной длины).

30. Выделенный полипептид по п.27, дополнительно содержащий домен У8ХУ8, как показано в 8ЕС ΙΌ N0:3.

31. Выделенный полипептид по п.27, где полипептид (а), (с), (б), (е) дополнительно содержит трансмембранный домен.

32. Выделенный полипептид по п.31, где трансмембранный домен состоит из остатков 238 (Ьеи)255 (Ьеи) 8ЕС ΙΌ N0:2.

33. Выделенный полипептид по п. 27, где полипептид (а), (Ь), (б), (е) дополнительно содержит внутриклеточный домен.

34. Выделенный полипептид по п.33, где внутриклеточный домен состоит из остатков 256 (Ьук)-538 (8ег) 8ЕС ΙΌ N0:2.

35. Выделенный полипептид по п.34, где внутриклеточный домен дополнительно содержит сайты Вох Ι и Вох ΙΙ.

- 79 006501

36. Выделенный полипептид по п.27 или 28, дополнительно содержащий аффинную метку, маркер биотин/авидин, радионуклид, маркер фермент/субстрат, кофактор, ингибитор, флуоресцентную индикаторную частицу, хемилюминесцентную индикаторную частицу, токсин, цитотоксичную молекулу или домен иммуноглобулина Рс.

37. Выделенный полипептид по п.29, состоящий из последовательности аминокислотных остатков от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 237 (Шк) 8ЕЦ ΙΌ N0:2 (цитокинсвязывающий домен) и дополнительно содержащий трансмембранный домен гетерологичного рецептора цитокина.

38. Выделенный полипептид по п.37, где гетерологичный рецептор цитокина является рецептором цитокина класса Ι.

39. Выделенный полипептид по п.37, дополнительно содержащий трансмембранный домен и межклеточный домен из гетерологичного рецептора цитокина.

40. Выделенный полипептид по п.39, где гетерологичный рецептор цитокина является рецептором цитокина класса Ι.

4ΐ.

Выделенный полипептид по п.29, состоящий из последовательности аминокислотных остатков от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 255 (Ьеи) 8ЕЦ ΙΌ N0:2 (цитокинсвязывающий домен и трансмембранный домен) и дополнительно содержащий внутриклеточный домен гетерологичного рецептора цитокина.

42. Выделенный полипептид по п. 4ΐ, где гетерологичный рецептор цитокина является рецептором цитокина класса Ι.

43. Выделенный полипептид по п.29, состоящий из последовательности аминокислотных остатков от аминокислоты номер 256 (Ьук) до аминокислоты номер 538 (Ьеи) 8ЕЦ ΙΌ N0:2 (внутриклеточный домен) и дополнительно содержащий трансмембранный домен и цитокинсвязывающий домен гетерологичного рецептора цитокина.

44. Выделенный полипептид по п.43, где гетерологичный рецептор цитокина является рецептором цитокина класса Ι.

45. Выделенный полипептид по п.29, состоящий из последовательности аминокислотных остатков от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 538 (Ьеи) 8ЕЦ ΙΌ N0:2 (зрелый полипептид).

46. Способ получения зрелого полипептида /а1рНа11, предусматривающий культивирование клетки по п. ΐ4 и выделение полипептида /афНаН, продуцируемого этой клеткой.

47. Выделенный полипептид /афНаИ, включающий аминокислотную последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0:2 от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 237 (Шк) (цитокинсвязывающий домен) и, по существу, не содержащий трансмембранного и внутриклеточного доменов, обычно связанных с гемопоэтическими рецепторами.

48. Выделенный полипептид по п.47, дополнительно содержащий аффинную метку.

49. Выделенный полипептид по п.47, дополнительно содержащий аффинную метку, маркер биотин/авидин, радионуклид, маркер фермент/субстрат, кофактор, ингибитор, флуоресцентную индикаторную частицу, хемилюминесцентную индикаторную частицу, токсин, цитотоксичную молекулу или домен иммуноглобулина Рс.

50. Способ получения цитокинсвязывающего домена полипептида /а1рНа11, предусматривающий культивирование клетки по п. 2ΐ и выделение полипептида, продуцируемого этой клеткой.

51. Способ получения антитела к полипептиду /афНаН, предусматривающий введение животному полипептида, выбранного из группы, состоящей из (a) полипептида, содержащего любые из 9-5ΐ9 аминокислот, которые составляют непрерывную последовательность в пределах последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0:2 от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 538 (8ег) (зрелый полипептид);

(b) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0:2 от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 237 (Шк) (цитокинсвязывающий домен);

(c) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0:2 от аминокислоты номер 101 (Ьеи) до аминокислоты номер 122 (С1у);

(ά) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0:2 от аминокислоты номер 141 (Акп) до аминокислоты номер 174 (А1а);

(е) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0:2 от аминокислоты номер 193 (Сук) до аминокислоты номер 261 (Уа1);

(£) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0:2 от аминокислоты номер 51 (Тгр) до аминокислоты номер 61 (С1и);

(д) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0:2 от аминокислоты 136 (Не) до аминокислоты номер 143 (С1и);

(Н) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0:2 от аминокислоты 187 (Рго) до аминокислоты номер 195 (8ег);

- 80 006501 (ΐ) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0:2 от аминокислоты номер 223 (РНе) до аминокислоты номер 232 (С1и): и (ί) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0:2 от аминокислоты номер 360 (61и) до аминокислоты номер 368 (Αφ).

причем указанный полипептид индуцирует синтез антител в организме животного, и выделение антитела, специфически связывающегося с полипептидом /а1рНа11. из организма животного.

52. Моноклональное антитело, полученное при иммунизации животного полипептидом /а1рНа11. выбранным из группы, состоящей из (a) полипептида, содержащего любые из 9-5ΐ9 аминокислот, которые составляют непрерывную последовательность в пределах последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0:2 от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 538 (8ег) (зрелый полипептид);

(b) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0:2 от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 237 (Н1к) (цитокинсвязывающий домен);

(c) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0:2 от аминокислоты номер 101 (Ьеи) до аминокислоты номер ΐ22 (С1у):

(б) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0:2 от аминокислоты номер 141 (Α^) до аминокислоты номер ΐ74 (ΑΕι):

(е) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0:2 от аминокислоты номер 193 (Сук) до аминокислоты номер 26ΐ (Уа1):

(ί) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0:2 от аминокислоты номер 5ΐ (Тгр) до аминокислоты номер 6ΐ (С1и):

(д) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0:2 от аминокислоты 136 (Не) до аминокислоты номер 143 (С1и):

(Н) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0:2 от аминокислоты 187 (Рго) до аминокислоты номер 195 (8ег):

(ί) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0:2 от аминокислоты номер 223 (РНе) до аминокислоты номер 232 (С1и): и (ί) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0:2 от аминокислоты номер 360 (61и) до аминокислоты номер 368 (Αφ).

53. Антитело, которое специфически связывается с полипептидом по п.27.

54. Способ обнаружения в тест-пробе присутствия модулятора активности полипептида /а1рНа11. предусматривающий культивирование клетки, в которую был введен экспрессирующий вектор по п.15. причем эта клетка экспрессирует цитокинсвязывающий домен полипептида /а1рНа11. в присутствии и в отсутствие тестпробы; и сравнение уровней активности указанного домена /а1рНа11 в присутствии и в отсутствие тестпробы при помощи биологического или биохимического анализа; и определение по результатам сравнения присутствия модулятора активности /а1рНа11 в данной тестпробе.

55. Способ обнаружения лиганда рецептора /а1рНа11 в тест-пробе, предусматривающий обеспечение контактирования тест-пробы с полипептидом /а1рНа11. содержащим последовательность от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 237 (Н1к) 8ЕЦ ΙΌ N0:2 (цитокинсвязывающий домен); и выявление связывания указанного полипептида с лигандом в пробе.

56. Способ по п.55. согласно которому указанный полипептид дополнительно содержит трансмембранный и внутриклеточный домены.

57. Способ по п.55. согласно которому указанный полипептид связан с мембраной культивируемой клетки, а стадия выявления предусматривает измерение биологического ответа в культивируемой клетке.

58. Способ по п.57. согласно которому биологический ответ представляет собой пролиферацию клеток, активность сигнальной трансдукции или активацию транскрипции репортерного гена.

59. Способ по п.55. согласно которому полипептид иммобилизован на твердом носителе.

60. Способ по п.56. согласно которому тест-проба содержит лимфоидные клетки, гемопоэтические клетки, активированные Т-клетки или раковые клетки или кондиционированную среду из лимфоидных клеток, гемопоэтических клеток, активированных Т-клеток или раковых клеток.