EA014417B1 - Экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий зрелый полипептид zalpha11 рецептора цитокина человека класса i или его функциональные компоненты, культивируемые клетки, содержащие экспрессирующий вектор, способ получения зрелого полипептида zalpha11 или его функциональных компонентов, полипептид, полученный данным способом, антитело, которое связывается с полипептидом, и полинуклеотид, кодирующий полипептид - Google Patents

Abstract

Предлагаются новые полипептиды, полинуклеотиды, кодирующие эти полипептиды, и относящиеся к ним композиции и способы, которые описаны для zalpha11, нового рецептора цитокинов. Эти полипептиды могут быть использованы в способах для детектирования лигандов, которые стимулируют пролиферацию и/или развитие гемопоэтических, лимфоидных и миелоидных клеток in vitro и in vivo. Лигандсвязывающие рецепторные полипептиды могут быть также использованы для блокирования лигандной активности in vitro и in vivo. Полинуклеотиды, кодирующие zalpha11, локализованы на хромосоме 16 и могут быть использованы для идентификации района генома, связанного с патологическими состояниями человека. В изобретении описан экспрессирующий вектор, содержащий зрелый полипептид zalpha11 рецептора цитокина человека класса I или его функциональные компоненты. Данное изобретение относится также к способам получения белка, его применениям и антителам к этому белку, культивированным клеткам, содержащим экспрессирующий вектор, способу получения зрелого полипептида zalpha11 или его функциональных компонентов, антителам, которые связываются с полипептидом, а также полинуклеотидам, кодирующим полипептиды.

Description

Пролиферация и дифференциация клеток многоклеточных организмов регулируются гормонами и полипептидными факторами роста. Эти диффундируемые молекулы позволяют клеткам осуществлять коммуникацию друг с другом и действовать совместно для образования клеток и органов и репарации поврежденной ткани. Примеры гормонов и факторов роста включают в себя стероидные гормоны (например, эстроген, тестостерон), паратиреоидный гормон, фолликулостимулирующий гормон, интерлейкины, тромбоцитарный фактор роста (ΡΌ6Ρ), эпидермальный фактор роста (Е6Р), гранулоцитарномакрофагальный колониестимулирующий фактор (СМ-С8Р), эритропоэтин (ЕРО) и кальцитонин.

Гормоны и факторы роста влияют на клеточный метаболизм путем связывания с рецепторами. Рецепторы могут быть интегральными мембранными белками, которые связаны с путями передачи сигналов в клетке, такими как системы вторичных мессенджеров. Другие классы рецепторов являются растворимыми молекулами, такими как факторы транскрипции. Особый интерес представляют рецепторы для цитокинов, молекул, которые стимулируют пролиферацию и/или дифференцировку клеток. Примеры цитокинов включают в себя эритропоэтин, который стимулирует развитие эритроцитов; тромбопоэтин (ТРО), который стимулирует развитие клеток мегакариоцитарной линии дифференцировки; и гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (С-С8Р). который стимулирует развитие нейтрофилов. Эти цитокины применимы в восстановлении нормальных уровней кровяных клеток в пациентах, страдающих от анемии, тромбоцитопении и нейтропении или получающих химиотерапию по поводу рака.

Продемонстрированные ίη νίνο активности этих цитокинов иллюстрируют огромный клинический потенциал или потребность в отношении других цитокинов, агонистов цитокинов и антагонистов цитокинов. Данное изобретение удовлетворяет эти потребности путем обеспечения нового рецептора гемопоэтического цитокина, а также относящихся к нему композиций и способов.

Данное изобретение обеспечивает такие полипептиды для этих и других применений, которые должны быть очевидны лицам с обычной квалификацией в данной области из приведенных здесь описаний.

Сущность изобретения

В одном аспекте данное изобретение обеспечивает экспрессирующий вектор, содержащий следующие функционально связанные элементы: промотор транскрипции, полинуклеотид, кодирующий зрелый полипептид ζα1ρ1ι;·ι11 рецептора цитокина человека класса I или его функциональные компоненты, имеющие аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична полипептиду, выбранному из группы, состоящей из:

(a) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 237 (Ηίκ) 8ЕО ΙΌ N0: 2 (цитокинсвязывающий домен);

(b) последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 255 (Ьеи) 8Е0 ΙΌ N0: 2 (цитокинсвязывающий домен и трансмембранный домен);

(c) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 256 (Бук) до аминокислоты номер 538 (8ет) 8Е0 ΙΌ N0: 2 (внутриклеточный домен) и (6) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 538 (8ет) 8Е0 ΙΌ N0: 2 (зрелый полипептид) и терминатор транскрипции;

причем промотор функционально связан с полинуклеотидом, а полинуклеотид функционально связан с терминатором транскрипции.

В другом аспекте описан вектор, приведенный выше, в котором полинуклеотид кодирует зрелый полипептид ζα1ρ1ι;·ι11 рецептора цитокина человека класса I или его функциональные компоненты, имеющие последовательность полинуклеотидов, выбранную из группы, состоящей из:

(a) полинуклеотидной последовательности от нуклеотида 126 до нуклеотида 779 8ЕР ΙΌ N0: 1 (полинуклеотид, кодирующий цитокинсвязывающий домен);

(b) полинуклеотидной последовательности от нуклеотида 126 до нуклеотида 833 8 Ер ΙΌ N0: 1 (полинуклеотид, кодирующий цитокинсвязывающий домен и трансмембранный домен);

(c) полинуклеотидной последовательности от нуклеотида 834 до нуклеотида 1682 8ЕР ΙΌ N0: 1 (полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный домен) и (6) полинуклеотидной последовательности от нуклеотида 126 до нуклеотида 1682 8ЕР ΙΌ N0: 1 (полинуклеотид, кодирующий зрелый полипептид).

В следующем варианте данное изобретение обеспечивает вектор, описанный выше, в котором полипептид ζ.αΐρΐιαίΐ имеет последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из:

(a) последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 237 (Ηίκ) 8ЕР ΙΌ N0: 2 (цитокинсвязывающий домен);

(b) последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 255 (Беи) 8ЕР ΙΌ N0: 2 (цитокинсвязывающий домен и трансмембранный домен);

(c) последовательности от аминокислоты номер 256 (Бук) до аминокислоты номер 538 (8ег) 8ЕР ΙΌ N0: 2 (внутриклеточный домен) и (6) последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 538 (8ег) 8ЕР ΙΌ N0: 2 (зрелый полипептид).

- 1 014417

В следующем варианте данное изобретение обеспечивает вектор, описанный выше, в котором полипептид дополнительно содержит домен ^8X^8 (8ЕО ГО N0: 3).

В другом аспекте данное изобретение обеспечивает вектор, в котором полипептид (а), (с), (Д) дополнительно содержит трансмембранный домен.

В следующем аспекте данное изобретение обеспечивает вектор, где трансмембранный домен состоит из остатков 238 (Ьеи)-255 (Ьеи) 8Е0 ГО N0: 2.

В другом варианте данного изобретения обеспечивается вектор, в котором полипептид (а), (Ь), (Д) дополнительно содержит внутриклеточный домен.

В следующем варианте изобретение обеспечивает вектор, в котором внутриклеточный домен состоит из остатков 256 (Ьук)-538 (8ег) 8Е0 ГО N0: 2.

В другом варианте данное изобретение обеспечивает вектор, в котором внутриклеточный домен дополнительно содержит сайты Вох I и Вох II.

В следующем аспекте изобретение обеспечивает вектор, в котором полипептид дополнительно содержит аффинную метку, кофактор, ингибитор, флуоресцентный маркер, хемилюминесцентный маркер, аффинную метку, метку биотина/авидина, радионуклида, метку фермент/субстрат, токсин, цитотоксическую молекулу или домен Ес иммуноглобулина.

В следующем варианте данное изобретение обеспечивает культивируемую клетку, содержащую экспрессирующий вектор, и продуцирующую зрелый полипептид ха1рНа11 или его функциональные компоненты.

В другом варианте данное изобретение обеспечивает способ получения зрелого полипептида ха1р11а11 или его функциональных компонентов, включающий культивирование клетки и выделение полипептида ха1р11а11 или его функциональных компонентов, продуцируемых культивированной клеткой.

В другом варианте изобретение обеспечивает получение зрелого полипептида ха1рНа11 или его функциональных компонентов.

В следующем варианте данное изобретение обеспечивает зрелый полипептид ха1рНа11 или его функциональные компоненты, имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из:

a) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 255 (Ьеи) 8Е0 ГО N0: 2 (цитокинсвязывающий домен);

b) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 255 (Ьеи) 8Е0 ГО N0: 2 (цитокинсвязывающий домен и трансмембранный домен);

c) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 256 (Ьук) до аминокислоты номер 538 (8ег) 8Е0 ГО N0: 2 (полный внутриклеточный домен);

Д) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 538 (8ег) 8Е0 ГО N0: 2 (зрелый полипептид);

В следующем варианте осуществления данное изобретение обеспечивает зрелый полипептид ха1рНа11 или его функциональные компоненты, имеющий последовательность аминокислотных остатков, выбранную из группы, состоящей из:

a) последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 255 (Ьеи) 8Е0 ГО N0: 2 (цитокинсвязывающий домен);

b) последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 255 (Ьеи) 8Е0 ГО N0: 2 (цитокинсвязывающий домен и трансмембранный домен);

c) последовательности от аминокислоты номер 256 (Ьук) до аминокислоты номер 538 (8ег) 8Е0 ГО N0: 2 (внутриклеточный домен) и

Д) последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 538 (8ег) 8Е0 ГО N0: 2 (зрелый полипептид).

В следующем варианте данное изобретение обеспечивает зрелый полипептид ха1рНа11 или его функциональные компоненты, дополнительно содержащие домен \У8Х\У8 (8Е0 ГО N0: 3)

В другом варианте данное изобретение обеспечивает зрелый полипептид ха1рНа11 или его функциональные компоненты по пп.14, 15 или 16, в котором полипептид (а), (с), (Д) дополнительно содержит трансмембранный домен.

В следующем варианте данное изобретение обеспечивает зрелый полипептид ха1рНа11 или его функциональные компоненты, в котором трансмембранный домен состоит из остатков 238 (Ьеи) - 255 (Ьеи) 8ЕС ГО N0: 2.

В следующем варианте данное изобретение обеспечивает зрелый полипептид ха1рНа11 или его функциональные компоненты, в котором полипептид (а), (Ь), (Д) дополнительно содержит внутриклеточный домен.

В другом варианте данное изобретение обеспечивает зрелый полипептид ха1рНа11 или его функциональные компоненты, где внутриклеточный домен включает остатки 256 (Ьук) - 538 (8ег) 8ЕС ГО N0: 2.

В следующем варианте изобретение обеспечивает зрелый полипептид ха1рНа11 или его функциональные компоненты, в котором внутриклеточный домен дополнительно содержит сайты Вох I и Вох II.

- 2 014417

В следующем варианте данное изобретение обеспечивает зрелый полипептид ζαΐρΐιαΐ 1 или его функциональные компоненты, дополнительно содержащий аффинную метку, кофактор, ингибитор, флуоресцентную индикаторную частицу, хемилюминесцентную индикаторную частицу, маркер биотин/авидин, радионуклид, маркер фермент/субстрат, токсин, цитотоксическую молекулу или домен Ре иммуноглобулина.

В другом варианте данное изобретение обеспечивает зрелый полипептид ζαΐρΐιηΐΐ или его функциональные компоненты, состоящий из последовательности аминокислотных остатков от аминокислоты номер 20 (Су®) до аминокислоты номер 237 (Ηί®) 8ЕО Ш N0: 2 (цитокинсвязывающий домен) и дополнительно содержащий трансмембранный домен гетерологичного рецептора цитокина.

В следующем варианте осуществления изобретение обеспечивает зрелый полипептид ζαΐρΐιηΐΐ или его функциональные компоненты, в котором гетерологичный рецептор цитокина является рецептором цитокина класса I.

В следующем варианте осуществления изобретения обеспечивается зрелый полипептид ζαΐρΐιαΐ ΐ или его функциональные компоненты, дополнительно содержащий трансмембранный домен и внутриклеточный домен гетерологичного рецептора цитокина.

В еще одном варианте осуществления изобретение обеспечивает зрелый полипептид ζαΐρΐια ΐΐ или его функциональные компоненты, в котором гетерологичный рецептор цитокина является рецептором цитокина класса I.

В другом аспекте данное изобретение обеспечивает зрелый полипептид ζαΐρΐιαΐΐ или его функциональные компоненты, состоящий из последовательности аминокислотных остатков от аминокислоты номер 20 (Су®) до аминокислоты номер 255 (Ьеи) 8Е0 Ш N0: 2 (цитокинсвязывающий домен и трансмембранны домен) и дополнительно содержащий внутриклеточный домен гетерологичного рецептора цитокина.

В другом варианте данное изобретение обеспечивает зрелый полипептид ζαΐρΐιαΐΐ или его функциональные компоненты, в котором гетерологичный рецептор цитокина является рецептором цитокина класса I.

В следующем варианте данное изобретение обеспечивает зрелый полипептид ζαΐρΐιαΐ ΐ или его функциональные компоненты, состоящий из последовательности аминокислотных остатков от аминокислоты номер 256 (Ьу®) до аминокислоты номер 538 (Ьеи) 8Е0 Ш N0: 2 (внутриклеточный домен) и дополнительно содержащий трансмембранный домен и цитокинсвязывающий домен гетерологичного рецептора цитокина.

В другом варианте осуществления изобретение обеспечивает зрелый полипептид ζαΐρΐιαΐΐ или его функциональные компоненты, в котором гетерологичный рецептор является рецептором цитокина класса I.

В следующем аспекте данное изобретение обеспечивает зрелый полипептид или его функциональные компоненты, состоящий из последовательности аминокислотных остатков от аминокислоты номер 20 (Су®) до аминокислоты номер 538 (Ьеи) 8Е0 Ю N0: 2 (зрелый полипептид).

В другом аспекте данное изобретение обеспечивает антитело, которое специфически связывается с полипептидом.

В другом аспекте данное изобретение обеспечивает конструкцию ДНК, кодирующую слитый белок, в состав которого входит зрелый полипептид ζαΐρΐιαΐΐ рецептора цитокина человека класса I или его функциональных компонентов, содержащий первый сегмент ДНА, кодирующий полипептид, имеющий последовательность аминокислотных остатков, выбранную из группы, состоящей из:

(a) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 2 (Ме1) до аминокислоты номер ΐ9 (С1у) 8Е0 Ш N0: 2 (секреторная сигнальная последовательность);

(b) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 20 (Су®) до аминокислоты номер

237 (Ηί®) 8Е0 Ю N0: 2 (цитокинсвязывающий домен);

(c) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 20 (Су®) до аминокислоты номер 255 (Ьеи) 8Е0 Ш N0: 2 (цитокинсвязывающий домен и трансмембранный домен);

(б) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 255 (Ьеи) до аминокислоты номер 255 (Ьеи) 8ес.| Ю N0: 2 (трансмембранный домен);

(е) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 238 (Ьеи) до аминокислоты номер 538 (8ет) 8Е0 Ш N0:2 (трансмембранный домен и внутриклеточный домен);

(1) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 256 (Ьу®) до аминокислоты номер

238 (8ет) 8Е0 Ю N0: 2 (внутриклеточный домен);

(д) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 20 (Су®) до аминокислоты номер 538 (8ет) 8Е0 Ш N0: 2 (зрелый полипептид) и по меньшей мере один сегмент ДНК, кодирующий дополнительный полипептид, причем первый и другие сегменты ДНК соединены в рамке считывания.

В другом аспекте данное изобретение обеспечивает экспрессирующий вектор, содержащий следующие функционально связанные элементы: промотор транскрипции; конструкцию ДНК, кодирующую слитый белок; и терминатор транскрипции, причем промотор функционально связан с конструкцией ДНК, а конструкция ДНК функционально связана с терминатором транскрипции.

- 3 014417

В другом аспекте данное изобретение обеспечивает культивируемую клетку, содержащую экспрессирующий вектор, продуцирующую слитый белок.

В другом аспекте данное изобретение обеспечивает способ получения слитого белка, предусматривающий культивирование клетки и выделение полипептида, продуцируемого этой клеткой.

В другом аспекте данное изобретение обеспечивает выделенный полинуклеотид, кодирующий зрелый полипептид ζ;·ι1ρ1ι;·ι11 рецептора цитокина человека класса I или его функциональные компоненты.

В другом аспекте данное изобретение обеспечивает выделенный полинуклеотид, в котором полинуклеотид, кодирующий зрелый полипептид ζ;·ι1ρ1ι;·ι11 рецептора цитокина человека класса I, или его функциональные компоненты имеют последовательность полинуклеотидов, выбранный из группы, состоящей из:

(a) последовательности полинуклеотидов от нуклеотида 126 до нуклеотида 779 8ЕО ГО N0: 1 (полинуклеотид, кодирующий цитокинсвязывающий домен);

(b) последовательность полинуклеотидов от нуклеотида 126 до нуклеотида 833 8Е0 ГО N0: 1 (полинуклеотид, кодирующий цитокинсвязывающий домен и трансмембранный домен);

(c) последовательности полинуклеотидов от нуклеотида 834 до нуклеотида 1682 8Е0 ГО N0: 1 (полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный домен) и (б) последовательности нуклеотидов от нуклеотида 126 до нуклеотида 1682 8Е0 N0: 1 (полинуклеотид, кодирующий зрелый полипептид).

В другом аспекте данное изобретение обеспечивает выделенный полинуклеотид, в котором зрелый полипептид ζ.αΙρΒα 11 или его функциональные компоненты состоят из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из:

(a) аминокислотной последовательности от номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 237 (Ηίκ) 8Е0 ГО N0: 2 (цитокинсвязывающий домен);

(b) аминокислотной последовательности от номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 255 (Ьеи) 8Е0 ГО N0: 2 (цитокинсвязывающий домен и трансмембранный домен);

(c) аминокислотной последовательности от номер 256 (Ьук) до аминокислоты номер 538 (8ег) 8Е0 ГО N0: 2 (внутриклеточный домен) и (б) аминокислотной последовательности от номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 538 (8ег) 8Е0 ГО N0: 2 (зрелый полипептид).

В другом аспекте данное изобретение обеспечивает выделенный полинуклеотид, в котором зрелый полипептид ζ.ηΐρΐιη 11 или его функциональные компоненты дополнительно содержат домен \У8Х\У8 (8ЕО ГО N0: 3).

В следующем аспекте данное изобретение обеспечивает выделенный полинуклеотид, в котором полипептид (а), (с) дополнительно содержит трансмембранный домен.

В другом аспекте данное изобретение обеспечивает выделенный полинуклеотид, в котором трансмембранный домен состоит из остатков 238 (Ьеи) - 255 (Ьеи) 8Е0 ГО N0: 2.

В следующем аспекте данное изобретение обеспечивает выделенный полинуклеотид, в котором полипептид (а), (Ь) дополнительно содержит внутриклеточный домен.

В другом аспекте данное изобретение обеспечивает выделенный полинуклеотид, в котором внутриклеточный домен состоит из остатков 256 (Ьук) - 538 (8ег) 8Е0 ГО N0: 2.

В другом варианте данное изобретение обеспечивает выделенный полинуклеотид, в котором внутриклеточный домен дополнительно содержит сайты Вох I и Вох II.

В следующем варианте данное изобретение обеспечивает выделенный полинуклеотид, в котором полипептид дополнительно содержит аффинную метку, маркер биотин/авидин, радионуклид, маркер фермент/субстрат, кофактор, ингибитор, флуоресцентный маркер, хемилюминесцентный маркер, токсин, цитотоксичную молекулу или домен иммуноглобулина Ес.

Эти и другие аспекты данного изобретения станут очевидными при ссылке на следующее далее подробное описание данного изобретения.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1 представляет собой график гидрофильности Норр-\Уообк ζ;·ι1ρ1ι;·ι11 человека.

Фиг. 2 представляет собой сопоставление ζ;·ι1ρ1ι;·ι11 человека (ζηΐρΐιη) (8Е0 ГО N0: 2) и ζ;·ι1ρ1ι;·ι11 мыши (ιηιιζαΐρ) (8Е0 ГО N0: 85).

- 4 014417

Подробное описание изобретения

Перед подробным изложением данного изобретения может быть полезным для его понимания определение следующих терминов.

Термин аффинная метка используется здесь для обозначения полипептидного сегмента, который может быть присоединен ко второму полипептиду для очистки или детектирования второго полипептида или обеспечения сайтов для присоединения второго полипептида к субстрату. В принципе, любой пептид или белок, для которого доступны антитело или другой агент специфического связывания, может быть использован в качестве аффинной метки. Афинные метки включают в себя полигистидиновый участок (тракт), белок А (ΝίΗδοη е! а1., ЕМВО. 1. 4:1075, 1985; ΝίΕκοπ е! а1., Мебюбк Еи7уто1. 198:3, 1991), глутатион δ-трансферазу (8тбй аиб Ιοίιηδοη. Сеие 67:31, 1988), аффинную метку С1и-С1и (Стиккеитеует е! а1., Ргас. №11. Асаб. δει. И8А 82:7952-4, 1985), вещество Р, пептид Над™ (Ηορρ е! а1., В^ο!есЬηο1οду 6:1204-10, 1988), стрептавидинсвязывающий пептид или другой антигенный эпитоп или связывающий домен. См. в общем Εοτ6 е! а1., Рго!еш Ехртеккюи аиб ΡυΓίΓίεηΙίοη 2:95-107, 1991. ДНК, кодирующие аффинные метки, доступны от коммерческих поставщиков (например, Рйаттааа Вю!есй, Р1кса!агау, N1).

Термин аллельный вариант используется здесь для обозначения любой из двух или нескольких альтернативных форм гена, занимающих один и тот же хромосомный локус. Аллельная вариация возникает природно через мутацию и может приводить к фенотипическому полиморфизму в популяциях. Мутации генов могут быть молчащими (без изменения в кодируемом полипептиде) или могут кодировать полипептиды, имеющие измененную аминокислотную последовательность. Термин аллельный вариант используется здесь также для обозначения белка, кодируемого аллельным вариантом гена.

Термины аминоконцевой и карбоксилконцевой используются здесь для обозначения положений внутри полипептидов. Там, где позволяет контекст, эти термины используются со ссылкой на конкретную последовательность или часть полипептида для обозначения близости или относительного положения. Например, некоторая последовательность, расположенная карбоксил-терминально относительно ссылочной последовательности в полипептиде, расположена проксимально относительно карбоксилконца ссылочной последовательности, но не обязательно находится при карбоксилконце полного полипептида.

Термин пара комплемент/антикомплемент обозначает неидентичные части молекулы, которые образуют нековалентно связанную, стабильную пару при подходящих условиях. Например, биотин и авидин (или стрептавидин) являются членами-прототипами пары комплемент/антикомплемент. Другие примеры пар комплемент/антикомплемент включают в себя пары рецептор/лиганд, пары антитело/антиген (или гаптен или эпитоп), пары смысловой/антисмысловой полинуклеотид и т.п. В случае когда желательна последующая диссоциация пары комплемент/антикомплемент, пара комплемент/антикомплемент предпочтительно имеет аффинность связывания <10⁹ М^-1.

Термин комплементы полинуклеотидной молекулы обозначает полинуклеотидную молекулу, имеющую комплементарную последовательность оснований и обращенную ориентацию в сравнении со ссылочной последовательностью. Например, последовательность 5'-АТССАСССС-3' комплементарна 5'-ССССТССАТ-3'.

Термин контиг обозначает полинуклеотид, который имеет непрерывный отрезок идентичной или комплементарной последовательности относительно другого полинуклеотида. Говорят, что непрерывные последовательности (контиги) перекрывают конкретный отрезок полинуклеотидной последовательности либо полностью, либо вдоль частичного отрезка этого полинуклеотида. Например, характерными контигами к полинуклеотидной последовательности 5'-АТСССТТАССТТ-3' являются 5'-ТАССТТдад!с!-3' и 3'-д!сдасТАСССА-5'.

Термин вырожденная нуклеотидная последовательность обозначает последовательность нуклеотидов, которая включает в себя один или более вырожденных кодонов (в сравнении со ссылочной полинуклеотидной молекулой, которая кодирует полипептид). Вырожденные кодоны содержат различные триплеты нуклеотидов, но кодируют один и тот же аминокислотный остаток (т.е. триплеты САИ и САС, каждый, кодируют Акр).

Термин экспрессирующий вектор используется для обозначения молекулы ДНК, линейной или кольцевой, которая содержит сегмент, кодирующий представляющий интерес полипептид, функционально связанный с дополнительными сегментами, которые обеспечивают его транскрипцию. Такие дополнительные элементы включают в себя промоторную и терминаторную последовательности и могут также включать в себя одну или несколько точек начала репликации, один или несколько селектируемых маркеров, энхансер, сигнал полиаденилирования и т.д. Экспрессирующие векторы обычно произведены из плазмидной или вирусной ДНК или могут содержать элементы обеих.

Термин выделенный в применении к полинуклеотиду обозначает, что этот полинуклеотид был удален из его природной генетической среды, следовательно, не содержит других посторонних или нежелательных кодирующих последовательностей и находится в форме, подходящей для применения в генетически сконструированных системах продуцирования белков. Такие выделенные молекулы являются молекулами, которые выделены из их природного окружения, и включают в себя кДНК-клоны и геномные клоны. Выделенные молекулы ДНК данного изобретения не содержат других генов, с которы

- 5 014417 ми они обычно связаны, но могут включать в себя природно встречающиеся 5'- и З'-нетранслируемые районы, такие как промоторы и терминаторы. Идентификация связанных районов будет очевидной лицу с обычной квалификацией в данной области (см., например, Эупап аиб Туаи, Ыа1иге. 316:774-78, 1985).

Выделенным полипептидом или белком является полипептид или белок, который обнаруживается в условиях, иных, чем его природное окружение, например отдельно от крови и ткани животного. В предпочтительной форме выделенный полипептид является, по существу, не содержащим других полипептидов, в частности других полипептидов животного происхождения. Предпочтительно обеспечение полипептидов в высокоочищенной форме, т.е. имеющих чистоту более 90%, более предпочтительно чистоту более 99%. При использовании в этом контексте термин выделенный не исключает присутствия того же самого полипептида в альтернативных физических формах, таких как димеры или альтернативно гликозилированные или дериватизованные формы.

Термин функционально (операбельно) связанные при ссылке на ДНК-сегменты указывает, что эти сегменты расположены таким образом, что они функционируют совместно для их предполагаемых целей, например, транскрипция инициируется в промоторе и протекает через кодирующий сегмент до терминатора.

Термин ортолог обозначает полипептид или белок, полученный из одного вида, который является функциональной копией полипептида или белка из другого вида. Различия последовательностей среди ортологов являются результатом видообразования.

Паралоги являются отличающимися, но структурно родственными белками, производимыми организмом. Считается, что паралоги возникают в результате дупликации генов. Например, α-глобин, β-глобин и миоглобин являются паралогами друг друга.

Термин полинуклеотид обозначает одно- или двухцепочечный полимер дезоксирибонуклеотидных или рибонуклеотидных оснований, считываемых от 5'-конца к 3'-концу. Полинуклеотиды включают в себя РНК и ДНК и могут быть изолированы из природных источников, синтезированы ш νίΐτο или получены из комбинации природных и синтетических молекул. Размеры полинуклеотидов выражаются как пары нуклеотидов (сокращенно п.н.), нуклеотиды (нт) или тысячи пар нуклеотидов (т.п.н.). Там, где позволяет контекст, два последних термина могут описывать полинуклеотиды, которые являются одноцепочечными или двухцепочечными. При применении этого термина к двухцепочечным молекулам его используют для обозначения общей длины и должно быть понятно, что он является эквивалентным термину пары нуклеотидов. Специалистам в данной области будет понятно, что две цепи двухцепочечного полинуклеотида могут слегка отличаться по длине и что их концы могут быть расположены зигзагами в результате ферментативного расщепления; таким образом, не все нуклеотиды в двухцепочечной полинуклеотидной молекуле могут быть спаренными.

Полипептид является полимером аминокислотных остатков, соединенных пептидными связями, получен ли он природным путем или синтетическим путем. Полипептиды, имеющие менее приблизительно 10 аминокислотных остатков, обычно называют пептидами.

Термин промотор используется здесь в его признанном в данной области значении для обозначения части гена, содержащей последовательности ДНК, которые обеспечивают связывание РНКполимеразы и инициацию транскрипции. Промоторные последовательности обнаруживаются обычно, но не всегда, в 5'-некодирующих районах генов.

Белок обозначает макромолекулу, содержащую одну или несколько полипептидных цепей. Белок может включать в себя также непептидные компоненты, такие как углеводные группы. Углеводы и другие непептидные компоненты могут быть присоединены к белку клеткой, в которой продуцируется данный белок, и будут варьироваться в зависимости от типа клетки. Белки определены здесь в терминах их аминокислотных каркасных структур; заместители, такие как углеводные группы, обычно не указаны, но тем не менее они могут присутствовать.

Термин рецептор используется здесь для обозначения связанного с клеткой белка или полипептидной субъединицы такого белка, которые связываются с биоактивной молекулой (лигандом) и медиируют действие этого лиганда на клетку. Связывание лиганда с рецептором приводит к конформационному изменению в рецепторе (и, в некоторых случаях, мультимеризации рецептора, т.е. ассоциации идентичных или различных субъединиц рецептора), которое вызывает взаимодействия между эффекторным доменом (доменами) и другой молекулой (молекулами) в клетке. Эти взаимодействия, в свою очередь, приводят к изменениям в метаболизме клетки. Метаболические события, связанные с взаимодействиями рецептор-лиганд, включают в себя транскрипцию генов, фосфорилирование, дефосфорилирование, пролиферацию клеток, увеличения продуцирования циклического АМФ, мобилизацию клеточного кальция, мобилизацию мембранных липидов, клеточную адгезию, гидролиз инозитлипидов и гидролиз фосфолипидов. Рецепторы цитокинов клеточной поверхности характеризуются мультидоменной структурой, как обсуждается более подробно ниже. Эти рецепторы закреплены в клеточной мембране трансмембранным доменом, характеризующимся последовательностью гидрофобных аминокислотных остатков (обычно приблизительно 21-25 остатков), которая обычно фланкирована положительно заряженными остатками (Ьуз или Агд). Обычно рецепторы могут быть мембраносвязанными, цитозольными или

- 6 014417 ядерными; мономерными (например, рецептор тиреоидстимулирующего гормона, β-адренергического гомона) или мультимерными (например, ΡΌΟΕ-рецептор, рецептор гормона роста, 1Ь-3-рецептор, СМ-С8Е-рецептор, С-С8Е-рецептор, рецептор эритропоэтина и 1Ь-6-рецептор).

Термин рецепторный полипептид используется для обозначения полипептидных цепей полного рецептора и его частей, в том числе выделенных функциональных доменов (например, лигандсвязывающих доменов).

Термин секреторная сигнальная последовательность обозначает последовательность ДНК, кодирующую полипептид (секреторный полипептид), который как компонент большего полипептида направляет этот больший полипептид через секреторный путь клетки, в которой он синтезируется. Этот больший полипептид обычно расщепляется с удалением секреторного пептида во время прохождения через этот секреторный путь.

Растворимый рецептор является рецепторным полипептидом, который не связан с клеточной мембраной. Растворимые рецепторы являются наиболее обычно лигандсвязывающими рецепторными полипептидами, которые не имеют трансмембранного и цитоплазматического доменов. Растворимые рецепторы могут содержать дополнительные аминокислотные остатки, такие как аффинные метки, которые обеспечивают очистку этого полипептида или обеспечивают сайты для присоединения этого полипептида к субстрату, или последовательности константной области иммуноглобулина. Многие рецепторы клеточной поверхности имеют природно встречающиеся, растворимые копии, которые продуцируются протеолизом. Считается, что рецепторные полипептиды являются, по существу, не содержащими трансмембранного и внутриклеточного полипептидных сегментов, когда они не имеют достаточных частей этих сегментов для обеспечения мембранного прикрепления или трансдукции (передачи) сигнала соответственно.

Термин сплайсинговый вариант используется здесь для обозначения альтернативных форм РНК, транскрибированных из гена. Сплайсинговая вариация возникает природно посредством использования альтернативных сайтов сплайсинга в транскрибируемой молекуле РНК или менее обычно между раздельно транскрибируемыми молекулами РНК и может приводить к нескольким мРНК, транскрибируемым из одного и того же гена. Сплайсинговые варианты могут кодировать полипептиды, имеющие измененную аминокислотную последовательность. Термин сплайсинговый вариант используют здесь также для обозначения белка, кодируемого сплайсинговым вариантом мРНК, транскрибируемым из гена.

Должно быть понятно, что молекулярные массы и длины полимеров, определяемые неточными аналитическими методами (например, гель-электрофорезом), являются приблизительными величинами. Когда такая величина выражается как около X или приблизительно X, указанная величина X должна пониматься как величина, определенная в точностью до ±10%.

Все цитируемые здесь ссылки включены в качестве ссылки в полном виде.

Данное изобретение основано частично на открытии новой последовательности ДНК, которая кодирует белок, имеющий структуру рецептора цитокинов класса I. Расшифрованная аминокислотная последовательность показала, что кодируемый рецептор принадлежит к подсемейству рецепторов, которое включает в себя β-субъединицу 1Ь-2-рецептора и β-общий рецептор (т.е. β-субъединицы 1Ь-3-, 1Ь-5- и СМ-С8Р-рецепторов). Анализ тканевого распределения мРНК, соответствующей этой новой ДНК, показал экспрессию в лимфатическом узле, лейкоцитах периферической крови (РВЬ), селезенке и тимусе. Кроме того, эта мРНК была обильной по количеству в клеточной линии Вау (АТСС Νο. СС1-86), полученной из лимфомы Беркитта. Этот полипептид был назван /а1рйа11.

Новые полипептиды ζαΐρΐιαίΐ данного изобретения были первоначально идентифицированы запросом в базе данных Е8Т (маркерных экспрессирующихся последовательностей). Была обнаружена Е8Т (маркерная экспрессирующаяся последовательность) и ее соответствующая кДНК была секвенирована. Новый полипептид, кодируемый этой кДНК, обнаружил гомологию с рецепторами цитокинов класса I. Полинуклеотидная последовательность ζηΐρΐιη 11 кодирует всю кодирующую последовательность предсказанного белка. ζηΐρίκι 11 представляет собой новый рецептор цитокинов, который может быть вовлечен в апоптотический клеточный путь, может быть молекулой передачи сигнала клетка-клетка, рецептором фактора роста или связанным с внеклеточным матриксом белком с активностью гормона фактора роста или т.п.

Последовательность полипептида ζηΐρΐιη 11 была расшифрована из единственного клона, который содержал его соответствующую полинуклеотидную последовательность. Этот клон был получен из библиотеки спинного мозга. Другие библиотеки, которые также могут быть подвергнуты поиску на такие последовательности, включают в себя РВЬ, тимус, селезенку, лимфатический узел, клеточные линии эритролейкоза человека (например, ТЕ-1), клетки Вау, клеточные линии острого моноцитарного лейкоза, другие линии лимфоидных и гемопоэтических клеток и т. п.

- 7 014417

Нуклеотидная последовательность репрезентативной ζαΐρΐια 11 -кодирующей ДНК описана в 8ЕО ΙΌ N0: 1 (от нуклеотида 69 до нуклеотида 1682), а расшифрованная последовательность ζαΐρΗαΙΙ из 538 аминокислот описана в 8Е0 ΙΌ N0: 2. В его полном виде полипептид ζα1ρΗα11 представляет полноразмерный полипептидный сегмент (остаток 1 (Ме!) - остаток 538 (8ег) 8Е0 ΙΌ N0: 2). Домены и структурные признаки полипептида ζα1ρ1ια11 дополнительно описаны ниже.

Анализ полипептида ζα1ρ1ια11. кодируемого ДНК-последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 1, выявил открытую рамку считывания, кодирующую 538 аминокислот (8 ЕС ΙΌ N0: 2), содержащую предсказанный секреторный сигнальный пептид из 19 аминокислотных остатков (остаток 1 (Ме!) остаток 19 (С1у) 8Е0 ΙΌ N0: 2) и зрелый полипептид из 519 аминокислотных остатков (остаток 20 (Сук) остаток 538 (8ег) 8Е0 ΙΌ N0: 2). Кроме мотива А8ХА8 (8Е0 ΙΌ N0: 3), соответствующего остаткам 214-218 8Е0 ΙΌ N0: 2, этот рецептор содержит цитокинсвязывающий домен из приблизительно 200 аминокислотных остатков (остатки 20 (Сук) - 237 (Ηίκ) 81Е) ΙΌ N0: 2);

линкер доменов (остатки 120 (Рго) - 123 (Рго) 8 ЕС ΙΌ N0: 2); предпоследний район цепи (остатки 192 (Ъук) - 202 (А1а) 8ЕС ΙΌ N0: 2);

трансмембранный домен (остатки 238 (Ьеи) - 255 (Ьеи) 8Е0 ΙΌ N0: 2);

полный внутриклеточный сигнальный домен (остатки 256 (Ьук) - 538 (8ег) 8Е0 ΙΌ N0: 2), который содержит сайт передачи сигнала Вох Ι (остатки 267 (Не) - 273 (Рго) 8Е0 ΙΌ N0: 2) и сайт передачи сигнала Вох ΙΙ (остатки 301 (Ьеи) - 304 (С1у) 8Е0 ΙΌ N0: 2).

Специалистам в данной области будет понятно, что эти границы доменов являются приблизительными и основаны на сопоставлениях с известными белками и предсказаниями укладки белка. Кроме этих доменов, консервативные признаки рецепторов в кодируемом рецепторе включают в себя (как показано в 8Е0 ΙΌ N0: 2), консервативный остаток Тгр в положении 138 и консервативный остаток Агд в положении 201. Соответствующие полинуклеотиды, кодирующие эти районы, домены, мотивы, остатки и последовательности полипептида ζαΙρΙν-ΒΕ описанные выше, представлены в 8Е0 ΙΌ N0: 1.

Присутствие трансмембранных районов и консервативных мотивов и мотивов с малой дисперсией обычно коррелирует с важными структурными районами (или определяет эти районы) в белках. Районы с малой дисперсией (например, гидрофобные кластеры) обычно присутствуют в районах структурной важности (8йеррагб, Р. е! а1., кирга). Такие районы малой дисперсии часто содержат редкие или нечастые аминокислоты, такие как триптофан. Фланкирующие районы и районы между такими консервативными мотивами и мотивами малой дисперсии могут быть более вариабельными, но являются часто функционально значимыми, так как они могут относиться к важным структурам или определять важные структуры и активности, такие как связывающие домены, домены биологической и ферментативной активности, трансдукции сигнала, взаимодействия клетка-клетка, домены тканевой локализации и т.п.

Районы консервативных аминокислотных остатков в /а1рйа11, описанные выше, могут быть использованы в качестве инструментов для идентификации новых членов семейства. Например, полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) может быть использована для амплификации последовательностей, кодирующих консервативные районы, из РНК, полученной из множества источников тканей или клеточных линий. В частности, высоковырожденные праймеры, сконструированные из /а1рйа11, применимы для этой цели. Конструирование и использование таких вырожденных праймеров может быть легко выполнено лицами с квалификацией в данной области.

Данное изобретение обеспечивает полинуклеотидные молекулы, в том числе молекулы ДНК и РНК, которые кодируют описанные здесь полипептиды /а1рйа11. Специалистам в данной области будет понятно, что в связи с вырожденностью генетического кода возможна значительная вариация среди этих полинуклеотидных молекул. 8Е0 ΙΌ N0: 4 является вырожденной последовательностью ДНК, которая включает в себя все ДНК, которые кодируют полипептид /а1рйа11 8Е0 ΙΌ N0: 2. Специалистам в данной области будет понятно, что вырожденная последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 4 обеспечивает также все последовательности РНК, кодирующие 8Е0 ΙΌ N0: 2, путем замены урацилом (И) тимина (Т). Таким образом, кодирующие полипептид /а1рйа11 полинуклеотиды, содержащие район от нуклеотида 1 до нуклеотида 1614 8Е0 ΙΌ N0: 4, и их РНК-эквиваленты рассматриваются данным изобретением. Табл. 1 дает однобуквенные коды, используемые в 8Е0 ΙΌ N0: 4 для обозначения положений вырожденных нуклеотидов. Разрешения представляют собой нуклеотиды, обозначенные кодовой буквой. Комплемент указывает код для комплементарного нуклеотида (комплементарных нуклеотидов). Например, код Υ обозначает либо С, либо Т, а его комплемент Я обозначает А или С, причем А является комплементарным Т, а С является комплементарным С.

- 8 014417

Таблица 1

Нуклеотид А	Разрешение А	Комплемент Т	Разрешение Т
С	С	С	е
(3	0	с	с
Т	Т	А	А
В	А|0	Υ	С|Т
Υ	С|Т	К	А|С
м	А|С	к	С|Т
к	С|Т	м	А[С
3	С|С	3	С|С
νν	А|Т	νν	А[Т
н	А|С|Т	□	А(О|Т
в	С|С|Т	V	А|С|<3
V	А|С|С	в	С|О|Т
ϋ	А|С|Т	н	А|С!Т
N	А[С|О|Т	N	А|С|С[Т

Вырожденные кодоны, используемые в 8ЕО ГО N0: 4, включающие в себя все возможные кодоны для конкретной аминокислоты, представлены в табл. 2.

- 9 014417

Таблица 2

Амино- Кислота	Однобуквенный год	Кодоны	Вырожденный кодон
Зуз	с	ТСС тст	ΤΟΥ
Зег	3	АСС АСТ ТСА ТСС ТСС ТСТ	УУЗЫ
ТИг	т	АСА АСС АСС АСТ	АСЫ
Рго	Р	ССА ССС ССС ССТ	ССЫ
А1а	А	ССА ССС ССС ССТ	ссы
С1у	С	ССА ОСС ССС ССТ	ΟΟΝ
Азп	N	ААС ДАТ	ΑΑΥ
Αερ	ϋ	САС САТ	ΟΑΥ
С1и	Е	САА САС	САК
С1п	0	САА САС	САК
Ηιβ	н	САС САТ	САУ
Агд	к	АСА АСС ССА ССС ССС ССТ	ΜΘΝ
куз	к	ААА ААС	ААК
Ме1	м	АТС	АТС
Не	1	АТА АТС АТТ	АТН
Беи	ί	СТА СТС СТС СТТ ТТА ТТС	ΥΤΝ
Уа1	V	СТА СТС СТС СТТ	сты
РПе	Р	ТТС ТТТ	ΤΤΥ
Туг	Υ	ТАС ΤΑΤ	ΤΑΥ
Тгр	νν	ТСС	ТСС
Тег		ТАА ТАС ΤΘΑ	ТКК
Азп/Азр	в		ΚΑΥ
61и/б1п	Ζ		ЗАК

Апу

X

ΝΝΝ

Специалисту с обычной квалификацией в данной области будет понятно, что некоторая двусмысленность вводится в определение вырожденного кодона, представляющего все возможные кодоны, кодирующие каждую аминокислоту. Например, вырожденный кодон для серина (^8Ν) может в некоторых обстоятельствах, кодировать аргинин (АСВ), а вырожденный кодон для аргинина (ΜΟΝ) может в некоторых обстоятельствах кодировать серин (АСУ). Сходная взаимосвязь существует между кодонами, кодирующими фенилаланин и лейцин. Таким образом, некоторые полинуклеотиды, охватываемые вырожденной последовательностью, могут кодировать вариантные аминокислотные последовательности, но специалист с обычной квалификацией в данной области может легко идентифицировать такие вариантные последовательности сравнением с аминокислотной последовательностью 8ЕЦ ΙΌ N0: 2. Вариантные последовательности могут быть легко тестированы на функциональность, как описано здесь.

Специалисту с обычной квалификацией в данной области будет также понятно, что различные виды могут проявлять предпочтительное (преферентивное) использование кодонов. В общем см., СгапШаш. е! а1., Νπε. Αοίάκ Век. 8:1893-912, 1980; Наак, е! а1., Сигг. ΒίοΙ. 6:315-24, 1996; ^аш-НоЬкоп, е! а1., Сепе 13:355-64, 1981; Стоуеап ап4 Иетк, Сепе 18:199-209, 1982; Но1т, Νυε. Αοίάκ Век. 14:3075-87, 1986; 1кетига, 1. Μο1. Βίο1. 158:573-97, 1982. В применении здесь термин предпочтительное (преферентивное) использование кодонов или предпочтительные (преферентивные) кодоны является термином данной области, относящимся к кодонам трансляции белка, которые наиболее часто используются в клетках определенных видов, отдавая, следовательно, предпочтение одному или немногим представителям возможных кодонов, кодирующих каждую аминокислоту (см. табл. 2). Например, аминокислота треонин (ТПг) может кодироваться АСА, АСС, АСС или АСТ, но в клетках млекопитающих наиболее обычно используемым кодоном является АСС; в других видах, например в клетках насекомых, дрожжей, вирусов или бактерий, могут быть предпочтительными другие кодоны Т1п. Предпочтительные кодоны для

- 10 014417 конкретных видов могут быть введены в полинуклеотиды данного изобретения различными способами, известными в этой области. Введение предпочтительных последовательностей кодонов в рекомбинантную ДНК может, например, усиливать продуцирование этого белка, делая трансляцию белка более эффективной в конкретном типе клеток или виде. Таким образом, вырожденная последовательность кодонов, описанная в 8ΕΟ ГО N0: 4, служит в качестве матрицы для оптимизации экспрессии полинуклеотидов в различных типах клеток и видах, обычно используемых в данной области и описанных здесь. Последовательности, содержащие предпочтительные кодоны, могут быть тестированы и оптимизированы для экспрессии в различных видах и тестированы на функциональность, как описано здесь.

В предпочтительных вариантах данного изобретения выделенные полинуклеотиды будут гибридизоваться с районами одинакового размера 8Ε0 ГО N0: 1 или с комплементарной ей последовательностью при строгих условиях. Обычно строгие условия выбирают таким образом, чтобы температура была приблизительно на 5°С ниже, чем точка термического плавления (Т_т) для специфической последовательности при определенных ионной силе и рН. Т_т является температурой (при определенных ионной силе и рН), при которой 50% последовательности-мишени гибридизуются с точно совместимым зондом. Многочисленные уравнения для расчета Т_т известны в данной области и являются специфическими для ДНК, РНК и гибридов ДНК-РНК и полинуклеотидных последовательностей-зондов варьирующей длины (см., например, 8атЬгоок с1 а1., Мо1еси1аг С1ошпд. А ЬаЬотаЮгу Мапиа1, 8есопб Εάίΐίοη (Со1б 8ргшд НагЬог Рте88 1989); Аи8иЬе1 е1 а1. (ебб.), Ситееп! Рто1осо18 ίη Мо1еси1аг Вю1оду (1о1ш \УПеу апб 8опз, 1пс., 1987); Вегдег апб К1тте1 (ебб.), Ошбе Ю Мо1еси1аг С1ошпд Тес11пк|ие8 (Асабетк Рте88, 1пс. 1987) и \Уе1тиг, Сгй. Кеу. ВюсЫт. Мо1. Вю1. 26:227 (1990)). Программное обеспечение для анализа последовательности, такое как 0ЬЮ0 6.0 (Ь8К; Ьопд Ьаке, М№) и Рптег Ргет1ег 4.0 (Ргет1ег Вюзой 1п1егпа1юпа1; Ра1о Айо, СА), а также сайты в Интернете, являются доступными инструментами для анализа конкретной последовательности и расчета Тт на основе определенных пользователем критериях. Такие программы могут также анализировать конкретную последовательность при определенных условиях и идентифицировать подходящие зондовые последовательности. Обычно гибридизацию более длинных полинуклеотидных последовательностей (например, >50 пар оснований) выполняют при температуре приблизительно на 20-25°С ниже рассчитанной Т_т. Для меньших зондов (например, <50 пар оснований) гибридизацию обычно проводят при Т_т или на 5-10°С ниже. Это позволяет достичь максимальной скорости гибридизации для гибридов ДНК-ДНК и ДНК-РНК. Более высокие степени строгости при более низких температурах могут быть достигнуты добавлением формамида, который снижает Т_т гибрида на приблизительно 1°С для каждого 1% формамида в буферном растворе. Условия гибридизации подходящей строгости эквивалентны инкубации от приблизительно 5 ч до ночи приблизительно при 42°С в растворе, содержащем приблизительно 40-50% формамида, приблизительно до 6Х 88С, приблизительно 5Х раствора Денхардта, от 0 до приблизительно 10% сульфата декстрана и приблизительно 10-20 мкг/мл денатурированной коммерчески доступной ДНК-носителя. Обычно такие строгие условия включают в себя температуры 20-70°С и гибридизационный буфер, содержащий до 6Х 88С и 0-50% формамид; затем гибридизацию сопровождают промыванием фильтров в 88С до приблизительно 2Х 88С. Например, подходящая строгость промывки эквивалентна 0,1Х 88С-2Х 88С при 55-65°С. Различные степени строгости могут быть использованы во время гибридизации и промывания для достижения максимального специфического связывания с последовательностью-мишенью. Обычно промывки после гибридизации выполняют при увеличивающихся степенях строгости для удаления негибридизовавшихся полинуклеотидных зондов из гибридизованных комплексов. Строгие условия гибридизации и промывок зависят от длины зонда, отраженной в Т_т используемых гибридизационных и промывочных растворов, и рутинно определяются эмпирически специалистом в данной области.

Как отмечалось ранее, выделенные полинуклеотиды данного изобретения включают в себя ДНК и РНК. Способы выделения ДНК и РНК хорошо известны в данной области. Обычно РНК выделяют из ткани или клетки, которая продуцирует большие количества РНК ха1р11а11. Такие ткани и клетки идентифицируют нозерн-блоттингом (ТЬотаз, Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А. 77:5201, 1980) и включают в себя РВЬ, селезенку, тимус и лимфатические ткани, клетки Вар, линии клеток эритролейкоза человека (например, ТЕ-1), линии клеток острого моноцитарного лейкоза, другие лимфоидные и гемопоэтические клеточные линии и т. п. Тотальная РНК может быть получена с использованием экстракции изотиоцианатом гуанидиния с последующим выделением центрифугированием в градиенте СбС1 (СЫтдМп е! а1., Вюс11ет№гу 18:52-94, 1979). Поли(А)⁺ РНК получают из тотальной РНК с использованием способа Ау1у апб Ьебег (Ргос. №111. Асаб. 8ск И8А. 69:1408-1412 (1972)). Комплементарную ДНК (кДНК) получают из поли(А)⁺ РНК при помощи известных способов. Альтернативно, может быть выделена геномная ДНК. Затем полинуклеотиды, кодирующие полипептиды ха1рПа 11, идентифицируют и выделяют, например, с использованием гибридизации или полимеразной цепной реакции (ПЦР) (МиШб, и.8. Ра1еп1 №о. 4683202).

Полноразмерный клон, кодирующий ха1рПа 11, может быть получен общепринятыми процедурами клонирования. Клоны комплементарной ДНК (кДНК) являются предпочтительными, хотя для некоторых применений (например, экспрессиии в трансгенных животных) могут быть предпочтительными использование геномного клона или модификация клона кДНК с целью включения по меньшей мере одного

- 11 014417 геномного интрона. Способы получения клонов кДНК и геномных клонов хорошо известны и находятся в пределах обычной квалификации в данной области и включают в себя использование описанной здесь последовательности или ее частей для зондирования или праймирования библиотеки. Экспрессионные библиотеки могут быть зондированы антителами к ζ;·ι1ρ1ι;·ι11. фрагментам рецептора или другим партнерам специфического связывания.

Полинуклеотиды данного изобретения могут быть также синтезированы с использованием автоматических приборов для синтеза ДНК. В настоящее время предпочтительным способом является фосфорамидитный способ. Если химически синтезированная двухцепочечная ДНК требуется для такого применения. как синтез гена или фрагмента гена. то каждую комплементарную цепь получают отдельно. Получение коротких полинуклеотидов (60-80 п.н.) является технически простым и может быть выполнено синтезом комплементарных цепей и затем их отжигом. Однако для получения более длинных полинуклеотидов (>300 п.н.) обычно используют специальные стратегии. так как эффективность связывания каждого цикла во время химического синтеза ДНК редко является 100%. Для преодоления этой проблемы синтетические гены (двухцепочечные) собирают в модулярной форме из одноцепочечных фрагментов. имеющих длину 20-100 нуклеотидов.

Один из способов для построения синтетического гена требует первоначального получения набора перекрывающихся комплементарных олигонуклеотидов. каждый из которых имеет длину между 20 и 60 нуклеотидами. Каждый внутренний участок этого гена имеет комплементарные 3'- и 5'-концевые удлинения. сконструированные для образования пар нуклеотидов точно с соседним участком. Таким образом. после сборки данного гена процесс завершают заделыванием разрывов (ников) вдоль каркасов этих двух цепей с использованием ДНК-лигазы Т4. Кроме кодирующей белок последовательности. синтетические гены могут быть сконструированы с концевыми последовательностями. которые облегчают встраивание в сайт рестрикционной эндонуклеазы (рестриктазы) клонирующего вектора. Кроме того. должны быть добавлены другие последовательности. которые содержат сигналы для правильной инициации и терминации транскрипции и трансляции.

Альтернативным способом получения полноразмерного гена является синтез описанного набора перекрывающихся олигонуклеотидов (40-100 нуклеотидов). После отжига 3' и 5' коротких перекрывающихся комплементарных районов (6-10 нуклеотидов) большие промежутки (гэпы) все еще остаются. но эти короткие районы спаренных нуклеотидов являются как достаточно длинными. так и стабильными для удерживания вместе этой структуры. Гэпы заполняются и ДНК-дуплекс завершается через ферментативный синтез ДНК ДНК-полимеразой I Е.сой. После завершения ферментативного синтеза разрывы (ники) заделываются ДНК-лигазой Т4. Двухцепочечные конструкции последовательно связывают друг с другом с образованием полной последовательности гена. которую проверяют анализом последовательности ДНК. См. Ойск апб РаЛегпак. Мо1еси1аг Вю1сс1то1оду. Рг1пс1р1с5 апб Аррйсабопз о! РесотЬтаШ ΌΝΑ (АЗМ Рге88. \Уа51нп§1оп. Ό.Ο. 1994); Иакита е! а1.. Аппи. Кеу. Вюсйет. 53:323-56. 1984 и Сйтэе е! а1.. Ргос. Асаб. 8с1. ИЗА. 87:633-7. 1990.

Далее. данное изобретение обеспечивает копии полипептидов и полинуклеотидов из других видов (ортологи). Эти виды включают в себя. но не ограничиваются ими. виды млекопитающих. птиц. земноводных. пресмыкающихся. рыб. насекомых и другие виды позвоночных и беспозвоночных. Особый интерес представляют собой полипептиды ζ.ηΙρΗη11 из других видов млекопитающих. в том числе полипептиды мышей. свиньи. овцы. коровы. псовых. кошачьих. лошадиных видов и полипептиды других приматов. Ортологи ζ.ηΙρ1ιη11 человека могут быть клонированы с использованием информации и композиций. обеспеченных данным изобретением. в сочетании с общепринятыми способами клонирования. Например. кДНК может быть клонирована с использованием мРНК. полученной из типа ткани или клеток. которые экспрессируют этот белок. Подходящие источники мРНК могут быть идентифицированы зондированием нозерн-блотов зондами. сконструированными из описанных здесь последовательностей. Затем готовят библиотеку из мРНК позитивной ткани или линии клеток. Затем кодирующая полипептид ζη1ρ1ιη11 кДНК может быть выделена различными способами. такими как зондирование полной или частичной кДНК человека или одним или несколькими наборами вырожденных зондов. основанных на описанных последовательностях. Эта кДНК может быть также клонирована с использованием полимеразной цепной реакции или ПЦР (МцШ§. кцрта) с применением праймеров. сконструированных из описанной здесь характерной последовательности ζ.ηΐρΐιη 11 человека. В дополнительном способе. эта библиотека кДНК может быть использована для трансформации или трансфекции клеток-хозяев и экспрессия представляющей интерес кДНК может быть детектирована антителом к полипептиду ζ.ηΙρΗη 11. Подобные способы могут быть применены также для выделения геномных клонов.

Субъединицы рецепторов цитокинов характеризуются мультидоменной структурой. содержащей внеклеточный домен. трансмембранный домен. который закрепляет этот полипептид в клеточной мембране. и внутриклеточный домен. Внеклеточный домен может быть лигандсвязывающим доменом. а внутриклеточный домен может быть эффекторным доменом. участвующим в трансдукции (передаче) сигнала. хотя лигандсвязывающая и эффекторная функции могут находиться на различных субъединицах мультимерного рецептора. Лигандсвязывающий домен сам является мультидоменной структурой. Мультимерные рецепторы включают в себя гомодимеры (например. изоформы αα и ββ ΡΌΟΕ-рецептора.

- 12 014417 рецептор эритропоэтина, МРЬ и С-С8Р-рецептор), гетеродимеры, каждая из субъединиц которых имеет лигандсвязывающие и эффекторные домены (например, изоформа αβ ΡΌΟΕ-рецептора), и мультимеры, имеющие компоненты-субъединицы, по существу, с различными функциями (например, рецепторы ГЬ-2, ГЬ-3, ГЬ-4, ГЬ-5, ГЬ-6, ГЬ-7 и СМ-С8Р). Некоторые субъединицы рецепторов являются общими для множества рецепторов. Например, субъединица А1С2В, которая сама не может связывать лиганд, но включает в себя домен внутриклеточной трансдукции сигнала, является компонентом рецепторов 1Ь-3 и СМ-С8Р. Многие рецепторы цитокинов могут быть помещены в одно из четырех родственных семейств на основе их структуры и функции. Например, гемопоэтические рецепторы отличаются присутствием домена, содержащего консервативные остатки цистеина и мотива \У8Х\У8 (8ЕО ГО N0: 3). Структура рецепторов цитокинов обсуждалась в обзоре игба1, Апп. РероПк Меб. Сйет. 26:221-228, 1991 и Соктаи, Су!ок1ие 5:95-106, 1993. Под селективным давлением потребности организмов в приобретении новых биологических функций, новые члены семейств рецепторов, по-видимому, возникают из дупликации существующих генов рецепторов, приводя к существованию мультигенных семейств. Таким образом, члены семейств содержат остатки (признаки) предкового гена (гена предков), и эти характерные признаки могут быть использованы в выделении и идентификации дополнительных членов семейств. Таким образом, суперсемейство рецепторов цитокинов подразделяется на несколько семейств, например семейство иммуноглобулинов (в том числе рецепторы С8Р-1, МСР, ГС-1 и ΡΌΟΡ); семейство гематопоэтинов (в том числе β-субъединица ГЬ-2-рецептора, α-субъединица СМ-С8Р-рецептора, β-субъединица СМ-С8Р-рецептора и рецепторы С-С8Р, ЕР0, 1Ь-3, 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-6, 1Ь-7 и 1Ь-9), семейство ΤΝΡ-рецепторов (в том числе рецепторы ΤΝΡ (р80), ΤΝΡ (р60), СЭ27. СЭ30. СЭ40. Рак и ΝΟΡ).

Анализ последовательности ζαΐρΐια 11 предполагает, что он является членом того же самого подсемейства рецепторов, что и подсемейство β-субъединицы ГЬ-2-рецептора, ГЬ-3-, 1Ь-4- и 1Ь-6-рецепторов. Некоторые рецепторы в этом подсемействе (например, С-С8Р) связываются с образованием гомодимеров, которые осуществляют передачу сигнала. Другие члены этого подсемейства (например, 1Ь-6-, ГС-11и ПР-рецепторы) объединяются со второй субъединицей (называемой β-субъединицей) для связывания лиганда и трансдукции сигнала. Специфические β-субъединицы связываются с множеством специфических субъединиц рецепторов цитокинов. Например, β-субъединица др 130 (Н1Ы е! а1., Се11 631149-1157, 1990) связывается с субъединицами рецепторов, специфическими для 1Ь-6, ГС-11 и Ь1Р (Сеапид е! а1., ЕМВ0. 1. 10:2839-2848, 1991; Сеапид е! а1., и.8. Ра!еи! Νο. 5284755). Онкостатин М связывается с гетеродимером ПР-рецептора, и др 130 ΟΝΤΈ связывается с тримерными рецепторами, содержащими СNΤΡ-рецептор, ПР-рецептор и субъединицы др130.

Полинуклеотидная последовательность для мышиного ортолога ζа1рйа11 человека была идентифицирована и показана в 8Е0 ГО Ν0:84, а соответствующая аминокислотная последовательность показана в 8Е0 ГО Ν0: 85. Анализ мышиного полипептида ζа1рйа11, кодируемого последовательностью ДНК 8Е0 ГО Ν0:84, выявил открытую рамку считывания, кодирующую 529 аминокислот (8Е0 ГО Ν0: 85), содержащих предсказанный секреторный сигнальный пептид из 19 аминокислотных остатков (остаток 1 (Ме!)-остаток 19 (8ег) 8Е0 ГО Ν0: 85) и зрелый полипептид из 510 аминокислот (остаток 20 (Сук)-остаток 529 (8ег) 8ЕО ГО Ν0: 2). Кроме мотива \У8Х\У8 (8ЕО ГО Ν0: 3), соответствующего остаткам 214-218 8ЕО ГО Ν0: 85, этот рецептор содержит цитокинсвязывающий домен из приблизительно 200 аминокислотных остатков (остатки 20 (Сук) - 237 (Н1к) 8ЕО ГО Ν0: 85); линкер доменов (остатки 1 20 (Рго) - 123 (Рго) 8ЕО ГО Ν0: 85); предпоследний район цепи (остатки 192 (Ьук) - 202 (А1а) 8ЕО ГО Ν0: 85); трансмембранный домен (остатки 238 (Ме!) - 254 (Ьеи) 8ЕО ГО Ν0: 85); полный внутриклеточный домен передачи сигнала (остатки 255 (Ьук) - 529 (8ег) 8ЕО ГО Ν0: 85), который содержит сайт передачи сигнала Вох I (остатки 266 (11е) - 273 (Рго) 8ЕО ГО Ν0: 85), и сайт передачи сигнала Вох II (остатки 301 (11е) - 304 (Уа1) 8ЕО ГО Ν0: 2). Сравнение аминокислотных последовательностей полипептидов человека и мыши выявило, что как человеческий полипептид, так и полипептид-ортолог содержат соответствующие структурные признаки, описанные выше (см., например, фиг. 2). Зрелая последовательность для мышиного ζа1рйа11 начинается при Сук₂₀ (как показано в 8ЕО ГО Ν0: 85), который соответствует Сук₂₀ (как показано в 8ЕО ГО Ν0: 2) в человеческой последовательности.

Существует приблизительно 63%-ная идентичность между мышиной и человеческой последовательностями на протяжении всей аминокислотной последовательности, соответствующей 8ЕО ГО Ν0: 2 и 8ЕС) ГО Ν0: 85.

Существует приблизительно 69%-ная идентичность между мышиной и человеческой последовательностями ζа1рйа11 на протяжении внеклеточного цитокинсвязывающего домена, соответствующего остатками 20 (Сук) - 237 (Н1к) 8ЕС) ГО Ν0: 2 и остаткам 20 (Сук) - 237 (Н1к) 8ЕС) ГО Ν0: 85.

Существует приблизительно 60%-ная идентичность между мышиной и человеческой последовательностями ζа1рйа11 на протяжении внутриклеточного домена передачи сигнала, соответствующего остаткам 256 (Ьук) - 538 (8ег) 8ЕО ГО Ν0: 2 и остаткам 255 (Ьук)-529 (8ег) 8ЕО ГО Ν0: 85.

Приведенные выше процентные идентичности определяли с использованием программы РА8ТА с к!ир=1, реиа1!у открывания гэпа=12, реиа1!у удлинения гэпа=2 и матрицей замен=ВЬ08иМ62, с другими параметрами по умолчанию. Соответствующие полинуклеотиды, кодирующие описанные выше районы,

- 13 014417 домены, мотивы, остатки и последовательности мышиного полипептида ζαΙρΙν-ΠΕ показаны в 8ЕС ΙΌ N0: 84.

Специалистам в данной области будет понятно, что последовательность, описанная в 8ЕР ΙΌ N0: 1, представляет отдельный аллель ДНК ζα1ρ1ι;·ι11 человека и что ожидается существование аллельной вариации и альтернативного сплайсинга. Аллельные варианты этой последовательности могут быть клонированы зондированием библиотек кДНК или геномных библиотек из различных индивидуумов в соответствии со стандартными процедурами. Аллельные варианты последовательности ДНК, показанной в 8ЕР ΙΌ N0: 1, в том числе варианты, содержащие молчащие мутации, и варианты, в которых мутации приводят к изменениям в последовательности аминокислот, находятся в объеме данного изобретения, так же как и белки, которые являются аллельными вариантами 8ЕР ΙΌ N0: 2. кДНК, генерируемые из образованных альтернативным сплайсингом мРНК, которые сохраняют свойства полипептида ζαΐρΗα 11, включены в объем данного изобретения, так же как полипептиды, кодируемые такими кДНК и мРНК. Аллельные варианты и сплайсинговые варианты этих последовательностей могут быть клонированы зондированием библиотек кДНК или геномных библиотек из различных индивидуумов или тканей в соответствии со стандартными процедурами, известными в данной области.

Данное изобретение обеспечивает также выделенные полипептиды ζαΙρΙν-ΠΕ которые являются, по существу, одинаковыми с полипептидами 8ЕР ΙΌ N0: 2 и их ортологами. Термин по существу, одинаковый используется здесь для обозначения полипептидов, имеющих по меньшей мере 70%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 80%-ную идентичность последовательностям, показанным в 8ЕР ΙΌ N0: 2, или их ортологам. Такие полипептиды будут более предпочтительно по меньшей мере на 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 95% или более идентичны 8ЕР ΙΌ N0: 2 или ее ортологам. Процентную идентичность последовательности определяют общепринятыми способами. См., например, А11кс1и.11 е1 а1., Ви11. Ма111. Βίο. 48:603-616 (1986) и Нешко££ апб Неп1ко££, Ргос. №111. Аса6. 8с1. и8А. 89:10915-10919 (1992). Вкратце, две последовательности аминокислот сопоставляют выстраиванием для оптимизации оценок сопоставления с использованием репайу открывания гэпа 10 и репайу удлинения гэпа 1 и оценочной матрицы Ь1окот 62 Нешко££ апб Неп1ко££ (1Ь16.), показанной в табл. 3 (аминокислоты представлены с использованием стандартных однобуквенных кодов). Затем процентную идентичность рассчитывают как

Общее число идентичных совпадений х 100 [длина более длинной последовательности плюс число гэпов, введенных в более длинную последовательность для сопоставления этих двух последовательностей]

- 14 014417

Таблица 3 А К Ν ϋ С О Е е Н 1 ί К М Е Р 3 Т Й νν
А 4
К-15
N -2 0 6
Ό-2 -2	1 6
С 0-3-3	-3 9
О-1 1	0 0-3 5
Е-1 О	0 2 -4 2 5

С О -2 0-1-3 -2 -2 6

Н -2 0 1 -1 -3 0 0 -2 8 ί -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3-4 -3 4

I _1 _2 -3 -4 -1 -2 -3 -4-3 2 4

К -1 2 0-1-31 1-2 -1 -3 -2 5

М -1 -1 -2 -3 -1 0-2-3-2 1 2-15

Р -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1 0 0-3 0 6 Р-1-2-2-1 -3-1-1 -2 -2-3 -3-1-2-4 7

1 -1 1 0 -1 0 0 0 -1 -2 -2 0-1 -2-1 4

Т 0 -1 0-1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2-1 15 \Л/ -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 1-4-3-2 11

Υ -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3-3-2-2 27

V 0-3-3 -3 -1 -2 -2 -3 -3 3 1 -2 1 -1 -2 -2 0 -3 -14

Идентичность последовательности полинуклеотидных молекул определяют подобными способами с использованием отношения, описанного выше.

Специалистам в данной области должно быть понятно, что имеется много установленных алгоритмов для сопоставления аминокислотных последовательностей. Алгоритм поиска сходства ЕА8ТА Реагкоп и Ыртаи представляет собой подходящий способ сопоставления белков для исследования уровня идентичности, разделяемой описанной здесь аминокислотной последовательностью и аминокислотной последовательностью возможного варианта ζα1ρ1ια11. Алгоритм ЕА8ТА, описанный Реагкоп апб Ыртаи, Ргос. №И. Асаб. 8с1. И8А. 85:2444 (1988) и Реагкоп, Ме111. Е1^уто1. 183:63 (1990).

Вкратце, РА8ТА сначала характеризует сходство последовательностей путем идентификации районов, общих у запрашиваемой последовательности (например, 8ЕО ГО N0: 2) и тест-последовательности, которые имеют либо более высокую плотность идентичностей (если переменная к4ир равна 1) либо пар идентичностей (если к!ир=2) без учета консервативных аминокислотных замен, инсерций или делеций. Затем десять районов с наиболее высокой плотностью идентичностей повторно оценивают сравнением сходства всех спаренных аминокислот с использованием матрицы аминокислотных замен, а концы районов подравнивают для включения только остатков, которые способствуют наивысшей оценке. Если имеется несколько районов с оценками, большими, чем величина отсечения (рассчитанная по предварительно определенной формуле на основе длины данной последовательности и ее величины к!ир), то приведенные в порядок подравниванием первоначальные районы исследуют для определения, могут ли эти районы быть соединены с образованием приближенного сопоставления с гэпами. Наконец, районы с наивысшей оценкой двух аминокислотных последовательностей сопоставляют с использованием модификации алгоритма №еб1етап-\Уипкс11-8е11егк (№еб1етап апб \Уипкс11.1. Мо1. Вю1. 48:444 (1970); 8е11егк, 8IАМ I. Арр1. Ма4й. 26:787 (1974)), который делает возможными инсерции и делеции аминокислот. Предпочтительными параметрами для анализа ЕА8ТА являются к!ир=1, репа11у открывания гэпа=10, репайу удлинения гэпа=1 и оценочная матрица=ВЬ08иМ62, с другими параметрами, установленными по умолчанию. Эти параметры могут быть введены в программу ЕА8ТА модификацией файла оценочной матрицы (8МАТКЕХ), как объясняется в приложении 2 Реагкоп, №111. Е1^уто1. 183:63(1990).

Программа ЕА8ТА может быть использована для определения идентичности последовательности молекул нуклеиновых кислот с использованием приведенного выше отношения. Для сравнений нуклеотидных последовательностей величина 1<1ир может быть в диапазоне между 1 и 6, предпочтительно от 3

- 15 014417 до 6, наиболее предпочтительно 3 с другими параметрами, установленными по умолчанию.

Таблица ВЬО8ИМ62 (табл. 3) является матрицей замен аминокислот, полученной из приблизительно 2000 локальных множественных сопоставлений сегментов белковых последовательностей, представляющих высококонсервативные районы более чем 500 групп родственных белков (НешкоГГ аиб Нешко£Г, Ргос. №11. Асаб. 8с1. И8А. 89:10915 (1992)). Таким образом, частоты замен ВЬО8ИМ62 могут быть использованы для определения консервативных аминокислотных замен, которые могут быть введены в аминокислотные последовательности данного изобретения. Хотя можно сконструировать аминокислотные замены на основе лишь химических свойств (как описано ниже), выражение консервативные аминокислотные замены предпочтительно относится к замене, представленной величиной ВЬО8ИМ62, большей чем -1. Например, аминокислотная замена является консервативной, если эта замена характеризуется величиной ВЬО8ИМ62 0, 1, 2 или 3. В соответствии с этой системой предпочтительные консервативные аминокислотные замены характеризуются величиной ВЬО8ИМ62 по меньшей мере 1 (например, 1, 2 или 3), хотя более предпочтительные консервативные аминокислотные замены характеризуются величиной ВЬО8ИМ62 по меньшей мере 2 (например, 2 или 3).

Вариантные полипептиды ха1р11а11 или, по существу, гомологичные полипептиды ха1р11а11 характеризуются тем, что они имеют одну или несколько аминокислотных замен, делеций или присоединений. Эти изменения предпочтительно имеют минорный характер, т. е. замены консервативных аминокислот (см. табл. 4) и другие замены, которые не влияют значимо на укладку или активность полипептида; небольшие делеции, обычно от одной до ~30 аминокислот; и небольшие амино- или карбоксилконцевые удлинения, такие как аминоконцевой остаток метионина, небольшой линкерный пептид до приблизительно 20-25 остатков, или аффинная метка. Таким образом, данное изобретение включает в себя полипептиды из приблизительно от 489 до приблизительно 568 аминокислотных остатков, которые включают в себя последовательность, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 90% и более предпочтительно на 95% или более идентична соответствующему району 8ЕЦ Ш ΝΌ: 2. Полипептиды, содержащие аффинные метки, могут дополнительно содержать сайт протеолитического расщепления между полипептидом ха1р11а11 и этой аффинной меткой. Подходящие сайты включают в себя сайты расщепления тромбином и сайты расщепления фактором Ха.

Таблица 4

Замены консервативных аминокислот

Основные: Кислые: Полярные: Гидрофобные:	аргинин лизин гистидин глутаминовая кислота аспарагиновая кислота глутамин аспарагин лейцин изолейцин валин
Ароматические:	фенилаланин
	триптофан
	тирозин
Небольшие:	глицин
	аланин
	серин
	треонин
	метионин

Данное изобретение дополнительно обеспечивает далее множество других слитых полипептидов и родственных мультимерных белков, содержащих один или несколько слитых полипептидов. Например, полипептид ха1р11а11 может быть получен в виде слитого полипептида для димеризации белка, как описано в патентах США № 5155027 и 5567584. Предпочтительная димеризация белков в этом отношении

- 16 014417 включает в себя домены константной области иммуноглобулина. Слитые белки иммуноглобулинζαΐρΐιαΐΐ могут экспрессироваться в генетически сконструированных клетках с получением множества мультимерных аналогов ζαΐρΐιαΐΐ. Вспомогательные домены могут быть слиты с полипептидами ζαΐρΐιαΐΐ для нацеливания их на специфические клетки, ткани или макромолекулы (например, коллаген). Полипептид ζαΐρΐιαΐΐ может быть слит с двумя или более частями молекулы, такими как аффинная метка для очистки белка и нацеливающий домен. Слитые (гибридные) полипептиды могут также содержать один или несколько сайтов расщепления, в частности, между доменами. См. Тиап е1 а1., Ооппесиге Т1®®ие Ке®еагсй 34:ΐ-9, ΐ996.

Белки данного изобретения могут также содержать не встречающиеся природно аминокислотные остатки. Не встречающиеся природно аминокислоты включают в себя, без ограничения, транс-3-метилпролин, 2,4-метанпролин, цис-4-гидроксипролин, транс-4-гидроксипролин, №метилглицин, алло-треонин, метилтреонин, гидроксиэтилцистеин, гидроксиэтилгомоцистеин, нитроглутамин, гомоглутамин, пипеколиновую кислоту, тиазолидинкарбоновую кислоту, дегидропролин, 3- и 4-метилпролин, 3,3-диметилпролин, трет-лейцин, норвалин, 2-азафенилаланин, 3-азафенилаланин, 4-азафенилаланин и 4-фторфенилаланин. В данной области известны несколько способов для включения природно не встречающихся аминокислотных остатков в белки. Например, может быть использована система ίη νίΐτο, в которой нонсенс-мутации подавляются с использованием химически аминоацилированных супрессорных тРНК. Способы синтеза аминокислот и аминоацилирования тРНК известны в данной области. Транскрипцию и трансляцию плазмид, содержащих нонсенс-мутации, проводят в бесклеточной системе, содержащей экстракт Е.соБ 830 и коммерчески доступные ферменты и другие реагенты. Белки очищают хроматографией. См., например, КоЬей®оп е1 а1., ί. Ат. Сйет. 8ос. ΐΐ3:2722, ΐ99ΐ; Е11тап е1 а1., Ме11юб® Е1^уто1. 202:30ΐ, ΐ99ΐ; Сйипд е1 а1. 8с1епсе 259:806-9, ΐ993 и Сйипд е1 а1., Ргос. №И. Асаб. 8с1. И8А. 90:ΐ0ΐ45-9, ΐ993). Во втором способе трансляцию проводят в ооцитах Хепори® микроинъекцией мутированной мРНК и химически аминоацилированных супрессорных тРНК (ТитсаШ е1 а1., 1. Бю1. Сйет. 27ΐ:ΐ999ΐ-8, ΐ996). В третьем способе клетки Е.сой культивируют в отсутствие природной аминокислоты, которую предстоит заменить (например, фенилаланина), и в присутствии желательной природно не встречающейся аминокислоты (аминокислот) (например, 2-азафенилаланина, 3-азафенилаланина, 4-азафенилаланина или 4-фторфенилаланина). Природно не встречающаяся аминокислота включается в этот белок вместо ее природной копии. См. Ко1бе е1 а1., Вюсйет. 33:7470-7476, ΐ994. Природно встречающиеся аминокислотные остатки могут быть превращены в природно не встречающиеся разновидности химической модификацией ш νίΙΐΌ. Химическая модификация может комбинироваться с сайтнаправленным мутагенезом для дополнительного расширения диапазона замен (Аупп апб Кгсйатб®, Рто1ет 8сг 2:395-403, ΐ993).

Аминокислотные остатки /афйаП могут быть заменены ограниченным числом неконсервативных аминокислот, аминокислот, которые не кодируются генетическим кодом, не встречающихся природно аминокислот и неприродных аминокислот.

Незаменимые аминокислоты в полипептидах данного изобретения могут быть идентифицированы в соответствии с процедурами, известными в данной области, такими как сайт-направленный мутагенез или аланинсканирующий мутагенез (Сипшпдйат апб Ае11®, 8с1епсе 244:ΐ08ΐ-5, ΐ989; Ва®® е1 а1., Ргос. №И. Асаб. 8с1. И8А. 88:4498-502, ΐ99ΐ. В последнем способе отдельные мутации аланина вводят при каждом остатке в молекуле и полученные в результате мутантные молекулы тестируют на биологическую активность (например, на связывание лиганда и трансдукцию сигнала), как описано ниже, для идентификации аминокислотных остатков, которые являются критическими для активности данной молекулы, см. также Η Шоп е1 а1., Т Вю1. Сйет. 271:4699-4708, ΐ996. Сайты взаимодействия лигандрецептор, белок-белок или другого биологического взаимодействия могут быть также определены физическим анализом структуры, определяемой такими способами, как ядерный магнитный резонанс, кристаллография, дифракция электронов или фотоаффинное мечение, в связи с мутацией аминокислот предполагаемого сайта контакта. См., например, бе Уо® е1 а1., 8с1епсе 255:306-3ΐ2, ΐ992; 8тйй е1 а1., Т Мо1. Вю1. 224:899-904. ΐ992; А1обатег е1 а1., РЕВ8 Ьей. 309:59-64, ΐ992. Идентичности незаменимых аминокислот могут быть также выведены из анализа гомологий с родственными рецепторами.

Могут быть выполнены определения аминокислотных остатков, которые находятся в районах или доменах, которые являются критическими для сохранения структурной целостности. В этих районах можно определить специфические остатки, которые будут более или менее устойчивыми к изменению или сохранению общей третичной структуры молекулы. Способы анализа структуры последовательности включают в себя, но не ограничиваются ими, сопоставление множественных последовательностей с высокой идентичностью аминокислот или нуклеотидов и компьютерный анализ с использованием доступного программного обеспечения (например, программа просмотра [п®1дИ1 II® и инструменты моделирования гомологии; М8Е 8ап И1едо, СА), склонности к образованию вторичной структуры, бинарные распределения, комплементарную упаковку и скрытые полярные взаимодействия (Вайоп, СиггегИ 0рт. 81гис1. Вю1. 5:372-376, ΐ995 и Согбе® е1 а1., СиггегИ 0рш. 81тис1. Вю1. 6:3-ΐ0, ΐ996). Обычно при конструировании модификаций для молекул или идентификации специфических фрагментов определение структуры будет сопровождаться оценкой активности модифицированных молекул.

- ΐ7 014417

Изменения аминокислотной последовательности выполняют в полипептидах ζ;·ι1ρ1ι;·ι11 таким образом, чтобы минимизировать разрушение структуры более высокого порядка, существенной для биологической активности. Например, когда полипептид ζ;·ι1ρ1ι;·ι11 содержит одну или несколько спиралей, изменения в аминокислотных остатках будут выполняться таким образом, чтобы не нарушить геометрию спиралей и другие компоненты молекулы, где изменения в конформации уменьшают некоторую критическую функцию, например, связывание данной молекулы с ее партнерами связывания. Эффекты изменений аминокислотной последовательности могут быть прогнозированы, например, компьютерным моделированием, как описано выше, или определены анализом структуры кристалла (см., например, Ьар!йот е! а1., Ναι. 8!гис!. ΒίοΙ. 2:266-268, 1995). Другие способы, которые хорошо известны в данной области, сравнивают укладку вариантного белка со стандартной молекулой (например, нативным белком). Например, может быть сделано сравнение распределения цистеина в вариантной и стандартной молекулах. Масс-спектрометрия и химическая модификация с использованием восстановления и алкилирования обеспечивают способы для определения остатков цистеина, которые ассоциированы с дисульфидными связями или свободны от таких ассоциаций (Веап е! а1., Апа1. Вюсйет. 201:216-226, 1992; Сгау, Рго!ет 8с1. 2:1732-1748, 1993 и Райегкоп е! а1., Апа1. СЬет. 66:3727-3732, 1994). Обычно считается, что, если модифицированная молекула не имеет такого же распределения дисульфидных связей, что и стандартная молекула, укладка может быть нарушенной. Другим хорошо известным и общепринятым способом измерения укладки является круговой дихроизм (КД). Измерение и сравнение КД-спектров, генерируемых модифицированной молекулой и стандартной молекулой, является рутиной (1оЬпкоп, РгсИеюк 7:205-214, 1990). Кристаллография представляет собой другой хорошо известный способ для анализа укладки и структуры. Ядерный магнитный резонанс (ЯМР), ферментативное пептидное картирование и картирование эпитопов также являются известными способами для анализа сходства укладки и структуры между белками и полипептидами (8с11аапап е! а1., 8с1епсе. 257:961-964, 1992).

Может быть получен профиль гидрофильности Норр/^ообк белковой последовательности ζη1ρ1ιη11. показанной в 8ЕС ГО N0: 2 (Норр е! а1., Ргос. №Й. Асаб. 8сЕ 78:3824-3828, 1981; Норр, I. 1ттип. Ме!Ь. 88:1-18, 1986 и Тпцшег е! а1., Рго!ет Епдтеегтд 11:153-169, 1998), см. фиг. 1. Этот профиль основан на скольжении окна для шести остатков. Скрытые остатки С, 8 и Т и экспонированные (открытые) остатки Н, Υ и не принимаются во внимание. Например, в ζа1р11а11. гидрофильные районы включают в себя аминокислотные остатки 55-60 8ЕС ГО N0: 2, аминокислотные остатки 56-61 8ЕС ГО N0: 2, аминокислотные остатки 139-144 8ЕС ГО N0: 2, аминокислотные остатки 227-232 8ЕС ГО N0: 2 и аминокислотные остатки 364-369 8ЕС ГО N0: 2.

Специалистам в данной области будет понятно, что гидрофильность или гидрофобность следует учитывать при конструировании модификаций в аминокислотной последовательности полипептида ζη1рЬа11, так чтобы не нарушить общий структурный и биологический профиль. Особый интерес для замены представляют гидрофобные остатки, выбранные из группы, состоящей из Уа1, Ьеи и 11е, или из группы, состоящей из Ме!, С1у, 8ег, А1а, Туг и Тгр. Например, остатки, устойчивые к замене, могли бы включать в себя такие остатки, как показано в 8ЕС ГО N0: 2. Однако остатки цистеина могли бы быть относительно неустойчивыми к замене.

Идентичности незаменимых аминокислот могут быть также выведены из анализа сходства последовательности между членами рецепторов цитокинов класса I с ζа1р11а 11. С использованием способов, таких как анализ ЕА8ТА, описанный выше, районы высокого сходства идентифицируют в семействе белков и используют для анализа аминокислотной последовательности для консервативных районов. Альтернативным подходом к идентификации вариантного полинуклеотида ζа1рЬа11 на основе структуры является определение, может ли молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая потенциальный вариантный полинуклеотид ζа1р11а11. гибридизоваться с молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность 8ЕС ГО N0: 1, как обсуждалось выше.

Другими способами идентификации незаменимых аминокислот в полипептидах данного изобретения являются процедуры, известные в данной области, такие как сайт-направленный мутагенез или аланинсканирующий мутагенез (Сиишпдйат апб ^е11к, 8с1епсе 244:1081 (1989); Вакк е! а1., Ргос. №Й. Асаб. 8с1. И8А 88:4498 (1991), СоотЬк апб Согеу, 8йе-0пес!еб Ми1адепек1к апб Рго!ет Епдтеегтд т Рго!етк: Апа1ук1к апб Оекщп. Апде1ей1 (еб.), радек 259-311 (Асабетю Ргекк, 1пс. 1998)). В последнем способе отдельные мутации аланина вводят при каждом остатке в молекуле и полученные в результате мутантные молекулы тестируют на биологическую активность, как описано ниже, для идентификации аминокислотных остатков, которые являются критическими для активности данной молекулы. См. также Н11!оп е! а1., I. Вю1. СЬет. 271:4699 (1996).

Данное изобретение относится также к функциональным фрагментам полипептидов ζа1р11а11 и молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим такие функциональные фрагменты. Функциональный ζа1р11а11 или его фрагмент, определенный здесь, отличается его пролиферативной и дифференцирующей активностью, его способностью индуцировать или ингибировать специализированные клеточные функции или его способностью специфически связываться с антителом против ζа1р11а11 или лигандом ζа1рЬа11 (растворимым или иммобилизованным). Как описано ранее, ζа1рЬа11 характеризуется структурой рецептора цитокина класса I. Таким образом, данное изобретение дополнительно обеспечивает сли

- 18 014417 тые (гибридные) белки, включающие в себя:

(a) полипептидные молекулы, содержащие описанные здесь внеклеточный или внутриклеточный домены; и (b) функциональные фрагменты, содержащие один или несколько из этих доменов.

Другая полипептидная часть слитого белка может состоять из другого рецептора цитокина класса I, например β-субъединицы 1Ь-2-рецептора и β-субъединицы, общей для ряда рецепторов (т.е. β-субъединиц 1Ь-3-, 1Ь-5- и СМ-С8Р-рецепторов) или из ненативного и/или неродственного секреторного сигнального пептида, который облегчает секрецию слитого белка.

Рутинный делеционный анализ молекул нуклеиновых кислот может быть проведен для получения функциональных фрагментов молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид ха1рка11. В качестве иллюстрации молекулы ДНК, имеющие нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 1 или ее фрагменты, могут быть расщеплены нуклеазой Ва131с получением ряда вмонтированных делеций. Затем эти фрагменты ДНК вставляют в экспрессирующие векторы в правильной рамке считывания и экспрессированные полипептиды выделяют и тестируют на активность ха1рПа11, или на способность связываться с антителами против ха1рка11 или лигандом ха1рка11. Альтернативой расщеплению экзонуклеазой является использование олигонуклеотид-направленного мутагенеза для введения делеций или стопкодонов для особого определения получения желательного фрагмента ха1рка11. Альтернативно, определенные фрагменты полинуклеотида ха1рка11 могут быть синтезированы с использованием полимеразной цепной реакции.

Стандартные способы идентификации функциональных доменов хорошо известны лицам с обычной квалификацией в данной области. Например, исследования на одном или на обоих концах укороченных интерферонов суммированы Ηογικ^γ^γ аиб Όί Магот, Ркагтас. Ткег. 66:507 (1995). Кроме того, стандартные способы для функционального анализа белков описаны, например, Тгеи!ег е! а1., Мο1ес. Сеи. Сеие!. 240:113 (1993); СоЩеШ е! а1., Ехргеккюи аиб ргекшшагу бе1е!юи ана1ук1к οΓ !ке 42 ЕЭа 2-5А куШкеЕже шбисеб Ьу китаи т!егГегои, ш ВюИд^к 1и!егГегои 8ук!етк, Ргосеебшдк οΓ ΙδΙΚ-ΊΝΟ Меебид οη 1и!егГегои 8ук!етк, Саи!е11 (еб.), радек 65-72 (Νί|ΗοΓΓ 1987); Негксктаи, Тке ЕСЕ КесерЮг, т ΕοπΙγο1 οΓ Ашта1 Се11 Р^ο1^Γе^аΐ^οи 1, Вοуи!οи е! а1. (ебк.) радек 169-199 (Асабепис Ргекк 1985); СоитаШеан е! а1., I. Вю1. Скет. 270:29270 (1995); Еикииада е! а1., I. Вю1. Скет. 270:25291 (1995); УатадисЫ е! а1., Вюскет. Ркагтаотк 50:1295 (1995) и Ме1ке1 е! а1., Р1аи! Мο1ес. Вю1. 30:1 (1996).

Многочисленные аминокислотные замены могут быть произведены и тестированы с использованием известных способов мутагенеза и скрининга, таких как описанные Κе^бкаа^-Ο1кοη аиб 8аиег (8аеисе 241:53-57, 1988) или Εο\\Χ аиб 8аиег (Ргос. №ΐ1. Асаб. 8ск И8А. 86:2152-2156, 1989). Вкратце, эти авторы описывают способы одновременной рандомизации двух или более положений в полипептиде, отбора на функциональный полипептид и затем секвенирования мутагенизированных полипептидов для определения спектра допустимых замен в каждом положении. Другие способы, которые могут быть использованы, включают в себя способ фагового представления (например, Ещутан е! а1., Вюскет. 30:1083210837, 1991; Ьабиег е! а1., и.δ. Ра!еи! Νο. 5 223 409; Нике, \У1Р0 РиЬ1юа!юи XVО 92/062045) и районнаправленный мутагенез (ОегЬукЫге е! а1., Сеие 46:145, 1986; №г е! а1., ^NА 7:127, 1988).

Варианты описанных последовательностей ДНК и полипептида ха1рка11 могут быть образованы перетасовкой ДНК, описанной δ!етте^, №!иге. 370:389-91, 1994, δ^ιηιι^Γ, Ргас. №!1. Асаб. δα. υδΛ 91:10747-51, 1994 и ΧνΦΟ РиЬ11са!юи νΟ 97/20078. Вкратце, вариантные ДНК генерируют посредством гомологичной рекомбинации 1и νίίτο случайной фрагментацией исходной ДНК с последующей повторной сборкой при помощи ПЦР, приводящей к случайно введенным точковым мутациям. Этот способ может быть модифицирован с использованием семейства исходных ДНК, таких как аллельные варианты или ДНК из различных видов, для введения дополнительной вариабельности в этот процесс Отбор или скрининг на желательную активность с последующими дополнительными повторениями мутагенеза и анализа обеспечивает быструю эволюцию последовательностей посредством отбора на желательные мутации с одновременным отбором против вредных изменений.

Способы мутагенеза, описанные выше, могут комбинироваться с высокопроизводительными автоматизированными способами скрининга для обнаружения активности клонированных мутагенизированных полипептидов рецепторов ха1рка11 в клетках-хозяевах. Предпочтительные анализы включают в себя анализы пролиферации и анализы связывания лиганда на основе биосенсора, которые описаны ниже. Мутагенизированные молекулы ДНК, кодирующие активные рецепторы или их части (например, лигандсвязывающие фрагменты, домены передачи сигналов и т.п.), могут быть извлечены из клеток-хозяев и быстро секвенированы с использованием современного оборудования. Эти способы делают возможным быстрое определение важности индивидуальных аминокислотных остатков в представляющем интерес полипептиде и могут применяться к полипептидам неизвестной структуры.

Кроме того, белки данного изобретения (или их полипептидные фрагменты) могут быть соединены с другими биоактивными молекулами, в частности, другими цитокинами, для обеспечения полифункциональных молекул. Например, одна или несколько спиралей из ха1рка11 могут быть соединены с другими цитокинами для усиления их биологических свойств или эффективности получения.

- 19 014417

Таким образом, данное изобретение обеспечивает ряд новых, гибридных молекул, у которых сегмент, содержащий одну или несколько спиралей /а1р11а1к слит с другим полипептидом. Слияние предпочтительно производят сплайсингом на уровне ДНК, чтобы сделать возможной экспрессию химерных молекул в рекомбинантных системах получения. Полученные молекулы анализируют затем на такие свойства, как улучшенная растворимость, улучшенная стабильность, пролонгированный полупериод выведения, улучшенные уровни экспрессии и секреции и фармакодинамику. Такие гибридные молекулы могут, кроме того, содержать дополнительные аминокислотные остатки (например, полипептидный линкер) между компонентами-белками или компонентами-полипептидами.

При помощи обсуждаемых здесь способов специалист с обычной квалификацией в данной области может идентифицировать и/или получить многочисленные полипептидные фрагменты или варианты 8ЕО ГО N0: 2, которые сохраняют активность трансдукции сигналов или лигандсвязывающую активность. Например, можно получить растворимый рецептор ха1рНа11 путем получения множества полипептидов, которые являются, по существу, гомологичными цитокинсвязывающему домену (остаткам 20 (Сук) - 237 (Н1к) 8Е0 ГО N0: 2 или ее аллельным вариантам или видовым ортологам) и сохраняют лигандсвязывающую активность белка ха1рНа11 дикого вида. Такие полипептиды могут включать в себя дополнительные аминокислоты, например, из части или полных трансмембранного и внутриклеточного доменов. Такие полипептиды могут также содержать дополнительные полипептидные сегменты, как в общем виде описано здесь, такие как метки, аффинные метки и т. п.

Для любого полипептида ха1р11аН. в том числе вариантов, растворимых рецепторов и слитых полипептидов или белков, специалист с обычной квалификацией в данной области сможет легко получить полностью вырожденную полинуклеотидную последовательность, кодирующую такой вариант, с использованием информации, приведенной в табл. 1 и 2.

Полипептиды ха1рНа11 данного изобретения, в том числе полноразмерные полипептиды, биологически активные фрагменты и гибридные полипептиды, могут продуцироваться в генетически сконструированных клетках-хозяевах в соответствии с общепринятыми способами. Подходящими клеткамихозяевами являются те типы клеток, которые могут быть трансформированы или трансфицированы экзогенной ДНК и выращены в культуре, и они включают в себя бактерии, грибковые клетки и культивируемые высшие эукариотические клетки. Эукариотические клетки, в частности культивируемые клетки многоклеточных организмов, являются предпочтительными. Способы манипулирования клонированными молекулами ДНК и введения экзогенной ДНК в различные клетки-хозяева описаны в 8атЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, 2^пД еД., Со1Д 8рппс.| НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, Со1Д 8рппд НагЬог, КУ, 1989 и АикиЬе1 е! а1. (еДк.) Сиггеп! Рго!осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду, 1о1т \УПеу апД 8опк, Шс., КУ, 1987.

В общих чертах, последовательность ДНК, кодирующую полипептид /а1р11а1к функционально связывают с другими генетическими элементами, требующимися для ее экспрессии, обычно включающими в себя промотор и терминатор транскрипции, в экспрессирующем векторе. Этот вектор обычно будет содержать один или несколько селектируемых маркеров и одну или несколько точек инициации репликации, хотя специалистам в данной области будет понятно, что в некоторых системах селектируемые маркеры могут быть обеспечены на отдельных векторах и репликация экзогенной ДНК может быть обеспечена интеграцией в геном клетки-хозяина. Выбор промоторов, терминаторов, селектируемых маркеров, векторов и других элементов является предметом рутинного конструирования в пределах обычной квалификации в данной области. Многие такие элементы описаны в литературе и являются доступными через коммерческих поставщиков.

Для направления полипептида ха1рНа11 в секреторный путь клетки-хозяина в экспрессирующем векторе обеспечивают секреторную сигнальную последовательность (также известную как лидерная последовательность, пре-пропоследовательность или пре-последовательность). Секреторная сигнальная последовательность может быть сигнальной последовательностью ха1рНа11 или может быть произведена из другого секретируемого белка (например, !-РА (тканевого активатора плазминогена)) или синтезирована Де поуо. Секреторная сигнальная последовательность функционально соединена с последовательностью ДНК /а1р11а1к т.е. эти две последовательности соединены в правильной рамке считывания и правильно помещены для направления вновь синтезированного полипептида в секреторный путь клеткихозяина. Секреторные сигнальные последовательности обычно расположены 5' (слева) от последовательности ДНК, кодирующей представляющий интерес полипептид, хотя некоторые сигнальные последовательности могут быть расположены в другом месте в представляющей интерес последовательности ДНК (см., например, \Уе1с11 е! а1., и.8. Ра!еп! №. 5037743; Но11апД е! а1., и.8. Ра!еп! №. 5143830).

Альтернативно, секреторная сигнальная последовательность, содержащаяся в полипептидах данного изобретения, используется для направления других полипептидов в секреторный путь. Данное изобретение обеспечивает такие гибридные (слитые) полипептиды. Может быть изготовлен сигнальный гибридный полипептид, в котором секреторная сигнальная последовательность, полученная из аминокислотных остатков 1 (Ме!) - 19 (С1у) 8Е0 ГО N0: 2, функционально связана с другим полипептидом с использованием способов, известных в этой области и описанных здесь. Секреторная сигнальная последовательность, содержащаяся в гибридных полипептидах данного изобретения, предпочтительно слита на аминоконце с дополнительным пептидом для направления этого дополнительного пептида в секретор

- 20 014417 ный путь. Такие конструкции имеют многочисленные применения, известные в данной области. Например, эти новые гибридные конструкции с секреторной сигнальной последовательностью могут направлять секрецию активного компонента обычно несекретируемого белка. Такие гибридные белки могут быть использованы ίη νίνο и ίη νίίΓο для направления пептидов через секреторный путь.

Культивируемые клетки млекопитающих являются подходящими хозяевами в данном изобретении. Способы введения экзогенной ДНК в клетки-хозяева млекопитающих включают в себя опосредованную фосфатом кальция трансфекцию (^1§1ег с1 а1., Се11 14:725, 1978; Согкаго апб Реагкоп, 8ота!ю Се11 Сепе!1С8 7:603, 1981; Сгайат апб Уап бег ЕЬ, У1го1оду 52:456, 1973), электропорацию (№итапп е! а1., ЕМВО I. 1:841-845, 1982), опосредованную ДЭАЭ-декстраном трансфекцию (АикиЬе1 е! а1., 1Ь1б.) и опосредованную липосомами трансфекцию (На\\'1еу-№1коп е! а1., Еосик 15:73, 1993; Сюсагопе е! а1., Еосик 15:80, 1993) и вирусные векторы (МШег апб Воктап, ВюТес11пк|иек 7:980-90, 1989; ^апд апб Етег, №!иге Меб. 2:714716, 1996) Получение рекомбинантных полипептидов в культивируемых клетках млекопитающих описано, например, Ьетткоп е! а1., и.8. Ра!еп! №. 4713339; Надеп е! а1., и.8. Ра!еп! №. 4784950; Ра1тйег е! а1., и.8. Ра!еп! №. 4579821 и В1пдо1б, И8 Ра!еп! №. 4656134. Подходящие культвируемые клетки млекопитающих включают в себя клеточные линии СО8-1 (АТСС №. СВЬ 1650), СО8-7 (АТСС №. СВЬ 1651), ВНК (АТСС №. СВЬ 1632), ВНК 570 (АТСС №. СВЬ 10314), 293 (АТСС № СВЬ 1573; Сгайат е! а1., I. Сеп. У1го1. 36:59-72 (1977) и линии клеток яичника китайского хомячка (например, СНО-К1, АТСС №. ССЬ 61) Дополнительные подходящие клеточные линии известны в данной области и доступны из общественных депозитариев, таких как Атепсап Туре Си1!иге Со11есбоп, ВосЫШе, Магу1апб. В общем предпочтительны сильные промоторы транскрипции, такие как промоторы из 8У-40 или цитомегаловируса. См., например, И.8. Ра!еп! №. 4956288. Другие подходящие промоторы включают в себя промоторы из генов металлотионеина (И.8. Ра!еп! №. 4579821 и и.8. Ра!еп! №. 4601978) и основной поздний промотор аденовируса.

Отбор с лекарственным средством обычно применяют для отбора на культивируемые клетки млекопитающих, в которые была встроена чужеродная ДНК. Такие клетки обычно называют трансфектантами. Клетки, которые культивировались в присутствии селективного агента и способны передавать представляющий интерес ген их потомству, называют стабильными трансфектантами. Предпочтительным селектируемым маркером является ген, кодирующий устойчивость к антибиотику неомицину. Отбор проводят в присутствии лекарственного средства типа неомицина, такого как С-418 или т.п Системы отбора могут быть также использованы для увеличения уровня экспрессии представляющего интерес гена, т.е. для способа, называемого амплификацией. Амплификацию проводят культивированием трансфектантов в присутствии низкого уровня селективного агента и затем увеличением количества селективного агента для отбора клеток, которые продуцируют высокие уровни продуктов введенных генов Предпочтительным амплифицируемым селектируемым маркером является дигидрофолатредуктаза, которая сообщает клеткам устойчивость к метотрексату. Другие гены устойчивости к лекарственным средствам (например, устойчивости к гигромицину, множественной устойчивости к лекарственным средствам, пуромицинацетилтрансферазе) также могут быть использованы. Альтернативные маркеры, которые вводят измененный фенотип, такие как зеленый флуоресцентный белок или белки клеточной поверхности, такие как СЭ4, СЭ8, МНС класса I, щелочная фосфатаза плаценты, могут быть использованы для сортинга трансфицированных клеток от нетрансфицированных клеток такими способами, как РАС8сортинг (сортинг клеток с возбуждением флуоресценции) или способ разделения при помощи магнитных гранул.

Другие высшие эукариотические клетки могут быть также использованы в качестве хозяев, в том числе клетки растений, клетки насекомых и клетки птиц. Применение АдгоЬас!егшт ^Ыζοдеηек в качестве вектора для экспрессии генов в клетках растений рассмотрено 8юкаг е! а1., 1. Вюкс! (Вапда1оге) 11:4758, 1987. Трансформация клеток насекомых и получение в них чужеродных полипептидов описаны Сиаппо е! а1., и.8. Ра!еп! №. 5162222 и \У1РО риЫюабоп XVО 94/06463. Клетки насекомых могут быть инфицированы рекомбинантным бакуловирусом, обычно произведенным из вируса ядерного полиэдроза Аи!одгарйа сайГогшса (Ас№У). См. Ктд Ь.А. апб Роккее ΡΌ.. Тйе Васи1о\згик Ехргеккюп 8ук!ет: А ЬаЬога!огу Сшбе, Ьопбоп, Сйартап апб На11; О'ВеШу Э.В. е! а1., Васи1о\згик Ехргеккюп Уес!огк: А ЬаЬога!огу Мапиа1, №\ν Уогк, ОхГогб Ипгуегкйу Ргекк., 1994 и Вюйагбкоп, СО., Еб., Васи1о\згик Ехргеккюп Рго!осо1к. Ме!йобк ш Мо1еси1аг Вю1оду, То!о^а, N1, Нитапа Ргекк, 1995. Второй способ получения рекомбинантного ζа1ρйа11-бакуловируса использует систему на основе транспозона, описанную Ьискоте (Ьискоте, У.А., е! а1., I. У1го1. 67:4566-79, 1993). Эта система, которая использует векторыпереносчики, продается в наборе Вас-!о-Вас™ (ЫГе Тесйпо1од1ек, ВосЫШе, МО). Эта система использует вектор-переносчик, рРак!Вас1™ (ЫГе Тесйпо1од1ек), содержащий транспозон Тп7, для перемещения ДНК, кодирующей полипептид ζа1ρйа11, в геном бакуловируса, поддерживаемый в Е.со11, в виде большой плазмиды, названной бакмидой. См. НШ-Регктк, М.8. апб Роккее, В.О., 1. Сеп. У1го1. ТУ. 971-6. 1990; Вопшпд, В.С. е! а1., I. Сеп. У1го1. 75:1551-6, 1994 и СйаζеηЬа1к, С.О., апб Варорог!, В., I. Вю1. Сйет. 270:1543-9, 1995. Кроме того, векторы-переносчики могут содержать в рамке считывания с ДНК, кодирующей метку эпитопа, на С- или Ν-конце экспрессируемого полипептида ζа1ρ11а11, например метку

- 21 014417 эпитопа С1и-С1и (Сгиккептеуег, Т. е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8εί. 82:7952-4, 1985). При помощи способа, известного в данной области, вектор-переносчик, содержащий ха1р11а1к трансформируют в Е.со11 и подвергают скринингу на бакмиды, которые содержат прерванный ген 1ас2, свидетельствующий о рекомбинантном бакуловирусе. Бакмидную ДНК, содержащую рекомбинантный геном бакуловируса, выделяют при помощи известных способов и используют для трансфекции клеток Зробор!ега Гтид1регба, например, клеток 8Г9. Затем получают рекомбинантный вирус, экспрессирующий ха1рНа11. Исходные материалы рекомбинантного вируса готовят способами, обычно используемыми в данной области.

Этот рекомбинантный вирус используют для инфицирования клеток-хозяев, обычно клеточной линии, полученной из осенних походных (ратных) червей, Зробор!ега Ггидрегба. См., в общих чертах, С11ск апб Рак!егпак, Мо1еси1аг Вю1ес11по1оду: Ргшс1р1ек апб Арр1юа!юпк оГ ВесошЫпап! ^NΑ. А8М Ргекк, ХУакЫпЦоп, И.С., 1994. Другой подходящей клеточной линией является клеточная линия Шдк Б1уе0™ (1пуйтодеп), произведенная из ТпсЬор1ик1а ш (И.8. Ра!еп! № 5300435). Для выращивания и поддержания этих клеток используют коммерчески доступные бессывороточные среды. Подходящими средами являются 8Г900 II™ (Ь1Ге Тес11по1ощек) или Е8Б 921™ (Ехртеккюп 8ук!етк) для клеток 8Г9 или Ех-се110405™ (1ВН Вюкаепсек, Ьепеха, К8) или Ехргекк Б1уе0™ (Ь1Ге ТесЬпо1од1ек) для клеток Т. ш. Используемые процедуры в общем описаны в доступных лабораторных руководствах (Кшд, Ь.А. апб Роккее, Β.Ό. ШШ; 0'ВеШу, Ό.Β. е! а1., 1Ь1б.; Вюкатбкоп, СИ., ШШ). Последующая очистка полипептида ха1рНа11 из супернатанта может быть достигнута с использованием описанных здесь способов.

Грибковые клетки, в том числе дрожжевые клетки, могут быть также использованы в данном изобретении. Виды дрожжей, представляющие особый интерес в этом отношении, включают в себя Засскатошусек сетеуШае, РюЫа рак!опк и Рю1иа теШапокса. Способы трансформации клеток З.СетеуШае экзогенной ДНК и получение из них рекомбинантных полипептидов описаны, например, Ка^акак1, И.8. Ра!еп! №. 4599311; Ка^акак1 е! а1., И.8. Ра!еп! №. 4931373; Вгаке, И.8. Ра!еп! №. 4870008; Ше1сИ е! а1., И.8. Ра!еп! №. 5037743 и Миггау е! а1., И.8. Ра!еп! №. 4845075. Трансформированные клетки отбирают по фенотипу, определяемому селектируемым маркером, обычно по устойчивости к лекарственному средству или по способности расти в отсутствие определенного питательного вещества (например, лейцина). Предпочтительной векторной системой для применения в Засскатошусек сегеуыае является векторная система Р0Т1, Ка\уакак| е! а1. (И.8. Ра!еп! №. 4931373), которая позволяет отбирать трансформированные клетки по росту в содержащей глюкозу среде. Подходящие промоторы и терминаторы для применения в дрожжах включают в себя промоторы и терминаторы из генов гликолитических ферментов (см., например, Ка\\'акакт И.8. Ра!еп! №. 4599311; Кшдкшап е! а1., И.8. Ра!еп! №. 4615974 и ВШет, и.З. Ра!еп! №. 4977092) и генов алкогольдегидрогеназы. См. также патенты США № 4990446, 5063154, 5139936 и 4661454. Системы трансформации для других дрожжей, в том числе Напкепи1а ро1ушотрка, ЗсЫхокассНаготусек ротЬе, К1иууеготусек 1ас!1к, К1иууеготусек ГгадШк, ИкШадо тауШк, РюЫа рак!опк, Рю1иа теШапойса, Рю1иа диШегтопби и СапбШа та1!ока, известны в данной области. См., например, С1еекоп е! а1., 1. Сеп. М1стоЬю1. 132:3459-3465, 1986 и Сгедд, И.8. Ра!еп! №. 4882279. Клетки АкретдШик могут быть использованы в соответствии со способами МсКшдк! е! а1., И.8. Ра!еп! №. 4935349. Способы трансформации Астетошиш сЬтукодепит описаны Зитшо е! а1., И.8. Ра!еп! №. 5162228. Способы трансформации №игокрога описаны ЬатЬотей/, и.З. Ра!еп! №. 4486533.

Применение РюЫа теШапокса в качестве хозяина для получения рекомбинантных белков описано в \М1Р0 РиЬ11са!юпк \\'0 97/17450, \\'0 97/17451, \\'0 98/02536 и \\'0 98/02565. Молекулы ДНК для применения в трансформации Р.теШапокса обычно получают в виде двухцепочечных кольцевых плазмид, которые предпочтительно линеаризуют перед трансформацией. Для получения полипептидов в Р.шеШапоНса предпочтительно, чтобы промотор и терминатор в этой плазмиде были промотором и терминатором гена Р.теШапоКса, таким как ген утилизации спирта Р.теШапокса (АИС1 или АИС2). Другие применимые промоторы включают в себя промоторы генов дигидроксиацетонсинтазы (ЭНА8), формиатдегидрогеназы (БМЭ) и каталазы (САТ). Для облегчения интеграции этой ДНК в хромосому хозяина предпочтительно иметь весь сегмент экспрессии этой плазмиды, фланкированный на обоих концах последовательностями ДНК хозяина. Предпочтительным селектируемым маркером для применения в РюЫа шеШапокса является ген АЭЕ2 Р.теШапоКса, который кодирует фосфорибозил-5аминоимидазолкарбоксилазу (А1ВС, ЕС 41121), который позволяет клеткам-хозяевам абе2 расти в отсутствие аденина. Для крупномасштабных промышленных процессов, где желательно минимизировать применение метанола, предпочтительно использовать клетки-хозяева, в которых делетированы оба гена утилизации метанола (АИС1 и АИС2). Для получения секретируемых белков предпочтительны клеткихозяева, дефектные по генам вакуолярных протеаз (РЕР4 и РВВ1). Электропорацию используют для облегчения введения плазмиды, содержащей ДНК, кодирующую представляющий интерес полипептид, в клетки Р.шеШапоНса. Предпочтительно трансформировать клетки Р.шеШапоНса электропорацией с использованием экспоненциально затухающего, пульсирующего электрического поля, имеющего напряженность поля от 2,5 до 4,5 кВ/см, предпочтительно примерно 3,75 кВ/см и константу времени (!) от 1 до 40 мс, наиболее предпочтительно примерно 20 мс.

- 22 014417

Прокариотические клетки-хозяева, в том числе штаммы бактерий ЕксйепсЫа сой, ВасШик и другие роды, также являются применимыми клетками-хозяевами в данном изобретении. Способы трансформации этих хозяев и экспрессии клонированных в них чужеродных ДНК хорошо известны в данной области (см., например, 8атЬгоок е1 а1., 1Ь16). При экспрессии полипептида /а1рйа11 в бактериях, таких как Е.сой, этот полипептид может сохраняться в цитоплазме обычно в виде нерастворимых гранул или может быть направлен в периплазматическое пространство бактериальной секреторной последовательностью. В первом случае эти клетки лизируют и гранулы извлекают и денатурируют при помощи, например, гуанидинизотиоцианата или мочевины. Затем денатурированный полипептид может быть повторно уложен и димеризован путем разведения продукта денатурации, например, диализом против раствора мочевины и комбинацией восстановленного и окисленного глутатиона, с последующим диализом против забуференного солевого раствора. В последнем случае этот полипептид может быть извлечен из периплазматического пространства в растворимой и функциональной форме путем разрушения этих клеток (например, обработкой ультразвуком или осмотическим шоком) для высвобождения содержимого периплазматического пространства и извлечения этого белка, посредством чего устраняется необходимость денатурации и повторной укладки.

Трансформированные и трансфицированные клетки-хозяева культивируют в соответствии с общепринятыми процедурами в культуральной среде, содержащей питательные вещества и другие компоненты, необходимые для роста выбранных клеток-хозяев. Различные подходящие среды, в том числе среды с определенным составом среды и комплексные среды, известны в данной области и обычно включают в себя источник углерода, источник азота, незаменимые аминокислоты, витамины и минеральные соединения. Среды могут также содержать такие компоненты, как факторы роста или сыворотка, если требуется. Среда для выращивания будет обычно производить отбор на клетки, содержащие экзогенно добавленную ДНК, посредством, например, отбора с использованием лекарственного средства или недостаточности незаменимого питательного компонента, который дополняется селектируемым маркером, имеющимся на экспрессирующем векторе или котрансфицируемым в клетку-хозяина. Клетки Р.теШапойса культивируют в среде, содержащей адекватные источники углерода, азота и микроэлементов, при температуре приблизительно 25-35°С. Жидкие культуры обеспечивают достаточной аэрацией с использованием общепринятых средств, таких как встряхивание небольших колб или барботирование ферментеров. Предпочтительной культуральной средой для Р.те!1апо11са является ΎΕΡΌ (2% Ό-глюкоза, 2% Бакто™ Пептон (Эйсо БаЬога!опек, Пе!гой, М1), 1% Бакто™ дрожжевой экстракт (Эйсо БаЬога!опек), 0,004% аденин и 0,006% Б-лейцин).

В одном аспекте данного изобретения рецептор цитокинов /а1рйа11 (в том числе трансмембранный и внутриклеточный домены) получают в культивируемой клетке и эту клетку используют для скрининга на лиганды для этого рецептора, в том числе природный лиганд, а также на агонисты и антагонисты природного лиганда. Для суммирования этого подхода кДНК или ген, кодирующие рецептор, объединяют с другими генетическими элементами, требующимися для их экспрессии (например, промотором транскрипции), и полученный экспрессирующий вектор встраивают в клетку-хозяина. Клетки, которые экспрессируют эту ДНК и продуцируют функциональный рецептор, отбирают и используют в разнообразных системах скрининга.

Клетки млекопитающих, пригодные для экспрессии новых рецепторов данного изобретения и трансдукции опосредованного рецептором сигнала, включают в себя клетки, которые экспрессируют β-субъединицу, такую как др130, и клетки, которые коэкспрессируют др 130 и ЫР-рецептор (Сеаппд е1 а1., ЕМВ0 1. 10.2839-2848, 1991; Сеаппд е! а1., и.8. Ра!еп! №. 5284755). В этом отношении обычно предпочтительно использовать клетку, которая является отвечающей на другие цитокины, которые связываются с рецепторами в том же самом подсемействе, такие как ГБ-6 или ЫР, поскольку такие клетки будут содержать требующийся путь (пути) трансдукции сигнала. Предпочтительные клетки этого типа включают в себя линию клеток ТР-1 человека (АТСС №. СКБ-2003) и клеточную линию ΌΑ-1 (Вгапсй е! а1., В1ооб. 69:1782, 1987; Вгоибу е! а1., В1ооб. 75:1622-1626, 1990). Альтернативно, подходящие клеткихозяева могут быть сконструированы для продуцирования β-субъединицы или другого клеточного компонента, требующегося для желательного клеточного ответа. Например, мышиная клеточная линия ВаР3 (Ра1асюк апб 8!е1пте!/, Се11 41:727-734, 1984; Ма111еу-Ргето1 е! а1., Мо1. Се11. Вю1. 6:4133-4135, 1986), клеточная линия почки детеныша хомячка (ВНК) или клеточная линия СТББ-2 (АТСС ТГВ-214) могут быть трансфицированы для экспрессии мышиной субъединицы др130 или мышиной др 130 и рецептора ЫР, кроме /а1рйа11. Обычно предпочтительно использовать клетку-хозяина и рецептор (рецепторы) из одного и того же вида, однако этот подход позволяет сконструировать клеточные линии, экспрессирующие множественные субъединицы рецепторов из любого вида, преодолевая потенциальные ограничения, возникающие из видовой специфичности. Альтернативно, видовые гомологи кДНК рецептора человека могут быть клонированы и использованы в клеточных линиях из того же самого вида, например мышиная кДНК в клеточной линии ВаР3. Клеточные линии, которые зависят от одного гемопоэтического фактора роста, такого как ГБ-3, могут быть, следовательно, сконструированы таким образом, что они становятся зависимыми от лиганда /а1рйа11.

- 23 014417

Клетки, экспрессирующие функциональный /афкаИ, используют в тестах-скринингах. Многочисленные подходящие анализы известны в данной области. Эти анализы основаны на детектировании биологического ответа в клетке-мишени. Одним из таких анализов является анализ пролиферации. Клетки культивируют в присутствии или в отсутствие тест-соединения и пролиферацию клеток детектируют, например, измерением включения тритированного тимидина или колориметрическим анализом, основанным на метаболическом расщеплении красителя А1утаг В1ие™ (АссиМеб, СЫсадо, 1Ь) или 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолийбромида (МТТ) (Мозтаи, 1. 1ттиио1. Ме111. 65:55-63, 1983).

Альтернативный формат анализа использует клетки, которые дополнительно конструируют для экспрессии репортерного гена. Репортерный ген связывают с промоторным элементом, который является чувствительным к связанному с данным рецептором пути, и этот анализ детектирует активацию транскрипции данного репортерного гена. Предпочтительным промоторным элементом в этой связи является сывороточный чувствительный элемент или 8КЕ (см., например, 8йате е1 а1., Се11. 56:563-572, 1989). Предпочтительным подобным геном является ген люциферазы (бе \¥е1 е1 а1., Мо1. Се11. Вю1. 7:725, 1987). Экспрессию гена люциферазы детектируют по люминесценции с использованием способов, известных в данной области (например, Ваитдайиег е1 а1., 1. Вю1. Скет. 269:19094-29101, 1994; 8сйеиЬот аиб СогГйи, Рготеда ЫоГез 41:11, 1993). Наборы для анализа с люциферазой являются коммерчески доступными, например, из Рготеда Согр., Мабкои, ^1. Клеточные линии-мишени этого типа могут быть использованы для скрининга библиотек химикалиев, клеточно-кондиционированных культуральных сред, грибковых бульонов, почвенных проб, проб воды и т.п. Например, банк проб клеточно- или тканекондиционированных сред может быть анализирован на клетку-мишень для идентификации клеток, которые продуцируют лиганд. Затем положительные клетки используют для получения библиотеки кДНК в экспрессирующем векторе для клеток млекопитающих, который разделяют на два пула, трансфицируют в клетки-хозяева и экспрессируют. Затем пробы сред из трансфицированных клеток анализируют, с последующим разделением пулов, повторно трансфицируют, субкультивируют и повторно анализируют положительные клетки для выделения клональной клеточной линии, экспрессирующей лиганд. Пробы сред, кондиционированные почкой, печенью, селезенкой, тимусом, другими лимфоидными тканями или Т-клетками, являются предпочтительными источниками лиганда для использования в процедурах скрининга.

Природный лиганд для ха1р11а11 может быть также идентифицирован мутагенизацией цитокинзависимой клеточной линии, экспрессирующей ха1рйа11, и культивированием ее в условиях, которые производят отбор на аутокринный рост. См. \У1РО риЫюаЛои \УО 95/21930. В типичной процедуре клетки, экспрессирующие ха1рка11, мутагенизируют, например, с ЕМ8. Затем клеткам дают придти в нормальное состояние в присутствии требуемого цитокина, затем переносят в культуральную среду, не содержащую цитокина. Выжившие клетки подвергают скринингу на продуцирование лиганда для /афкаИ, например, добавлением растворимого (лигандсвязывающего) рецепторного полипептида в культуральную среду или анализом кондиционированной среды на клетки дикого типа и трансфицированные клетки, экспрессирующие ха1рка11. Предпочтительные клеточные линии для применения в данном способе включают в себя клетки, которые трансфицируют для экспрессии др 130 или др 130 в сочетании с ЫЕ-рецептором. Предпочтительные подобные линии клеток-хозяев включают в себя трансфицированные клетки СТЬЬ-2 (6111к аиб 8ткй, Ыа1иге 268:154-156, 1977) и трансфицированные клетки ВаЕ3.

Кроме того, способ секреторной ловушки, использующий растворимый рецепторный полипептид /а1рка11, может быть использован для выделения лиганда ха1рка11 (А1бпск е1 а1., Се11. 87:1161-1169, 1996). Экспрессионную библиотеку кДНК, полученную из известного или предполагаемого источника лиганда, трансфицируют в клетки СО8-7. Вектор этой библиотеки кДНК обычно имеет начало репликации 8У40 для амплификации в клетках СО8-7 и промотор СМУ для высокой экспрессии. Трансфицированные клетки СО8-7 выращивают в монослое и затем фиксируют и делают проницаемыми. Затем меченый или биотин-меченый растворимый рецептор /а1рка1к описанный здесь, помещают в контакт с этим слоем клеток и дают связать клетки в монослое, которые экспрессируют антикомплементарную молекулу, т. е. лиганд ха1рка11. Таким образом, клетка, экспрессирующая лиганд, будет связана с рецепторными молекулами. Антитело против метки (анти-1д для 1д-гибридов, М2 или анти-ЕЬАС для ЕЬАС-меченых гибридов, стрептавидин и т.п.), которое конъюгировано с пероксидазой хрена (НКР) используют для визуализации клеток, с которыми связан меченый или биотин-меченый растворимый рецептор ха1рка11. НКР катализирует депонирование тирамидного реагента, например тирамид-Е1ТС. Коммерчески доступный набор может быть использован для этого детектирования (например, Кеиакзаисе Т8А-Э1гес1™ Κίΐ; ΝΕΝ Ь1£е 8с1еисе Ргобиск, Воз1ои, МА). Клетки, которые экспрессируют лиганд рецептора ха1рка11, идентифицируют под флуоресцентным микроскопом в виде зеленых клеток и выскребают для последующего клонирования лиганда с использованием процедур для спасения плазмид, как описано в А1бпск е1 а1., зирга, с последующими раундами анализа с секреторной ловушкой до тех пор, пока не будут идентифицированы отдельные клоны.

- 24 014417

Рецепторная активность полипептида ζ;·ι1ρ1ι;·ι11 может быть измерена биосенсорным микрофизиометром на основе кремния. который измеряет скорость внеклеточного подкисления или экскрецию протонов. связанную со связыванием рецептора и последующими физиологическими клеточными ответами. Примером устройства является микрофизиометр Су!о8епког™. изготовляемый Мо1еси1аг Оеу1се8. Зиппууа1е. СА. Разнообразные клеточные ответные реакции. такие как пролиферация клеток. ионный транспорт. продуцирование энергии. воспалительный ответ. регуляторная и рецепторная активация и т.п.. могут быть измерены этим способом. См.. например. МсСоппе11. Н.М. е! а1.. Зс1епсе 257:1906-1912. 1992; РПсНГогб. З. е! а1.. Ме111. Е1^уто1. 228:84-108. 1997; АптПН. З. е! а1.. 1. 1ттипо1. Ме111. 212:49-59. 1998; Уап ЫеЕбе. I. е! а1.. Еиг. 1 РЬагтасо1. 346:87-95. 1998. Микрофизиометр может быть использован для анализа эукариотических. прокариотических. прикрепленных или неприкрепленных клеток. Путем измерения изменений внеклеточного подкисления в клеточных средах во времени микрофизиометр измеряет непосредственно клеточные ответные реакции на различные стимулы. в том числе агонисты. лиганды или антагонисты полипептида ζη1ρΗ311. Предпочтительно микрофизиометр используют для измерения ответов экспрессирующей ζη1ρΗη 11 эукариотической клетки в сравнении с контрольной эукариотической клеткой. которая не экспрессирует полипептид /а1рка11. Экспрессирующие ζ;·ι1ρ1ι;·ι11 эукариотические клетки включают в себя клетки. в которые был трансфицирован /а1рка11. как описано здесь. с образованием клетки. которая отвечает на модулирующие /а1рка11 стимулы. или клетки. природно экспрессирующие /а1рка11. такие как экспрессирующие /а1рка11 клетки. полученные из лимфоидной ткани. ткани селезенки. ткани тимуса или РВЬ. Различия. измеренные по увеличению или уменьшению во внеклеточном подкислении в ответной реакции клеток. экспрессирующих /а1рка11. относительно контроля. являются прямым измерением модулируемых /а1рЬа11 клеточных ответов. Кроме того. такие модулированные /а1рка11 ответы могут анализироваться при действии различных стимулов. С использованием микрофизиометра обеспечен также способ идентификации агонистов и антагонистов полипептида /а1рка11. предусматривающий обеспечение клеток. экспрессирующих полипептид /а1рка11. культивирование первой порции этих клеток в отсутствие тест-соединения. культивирование второй порции этих клеток в присутствии тест-соединения и детектирование увеличения или уменьшения в клеточной ответной реакции второй порции клеток в сравнении с первой порцией клеток. Антагонисты и агонисты. в том числе природный лиганд для полипептида /а1рка11. могут быть быстро идентифицированы с использованием этого способа.

Дополнительные анализы. обеспечиваемые данным изобретением. включают в себя применение гибридных рецепторных полипептидов. Эти гибридные полипептиды подразделяются на два основных класса. В первом классе внутриклеточный домен /а1рка11. содержащий приблизительно остатки 256 (Ьук) - 528 (Зег) ЗЕО ГО N0: 2. соединен с лигандсвязывающим доменом второго рецептора. Предпочтительно. чтобы второй рецептор был рецептором гемопоэтического цитокина. таким как тр1-рецептор (Зонуп е! а1.. Се11 63:1137-1147. 1990). Этот гибридный рецептор будет дополнительно содержать трансмембранный домен. который может происходить из любого рецептора. Затем конструкцию ДНК. кодирующую этот гибридный рецептор. встраивают в клетку хозяина. Клетки. экспрессирующие гибридный рецептор. культивируют в присутствии лиганда для связывающего домена и анализируют на ответную реакцию. Эта система обеспечивает средство для анализа трансдукции сигнала. опосредованной /а1рка11. с использованием легкодоступных лигандов.

Эта система может быть также использована для определения. способны ли конкретные клеточные линии отвечать на сигналы. трансдуцируемые /а1рЬа11. Второй класс гибридных рецепторных полипептидов включает в себя внеклеточный (лигандсвязывающий) домен /а1рка11 (приблизительно остатки 20 (Сук)-237 (Н1к) ЗЕО ГО N0: 2) с цитоплазматическим доменом второго рецептора. предпочтительно рецептора цитокина. и трансмембранным доменом. Трансмембранный домен может происходить из любого рецептора. Гибридные рецепторы этого второго класса экспрессируются в клетках. о которых известно. что они способны отвечать на сигналы. передаваемые вторым рецептором. Вместе эти два класса гибридных рецепторов способны использовать широкий спектр клеточных типов в системах анализа на основе рецепторов.

Клетки. которые. как обнаруживается. экспрессируют /а1рка11. используют затем для приготовления библиотеки кДНК. из которой кодирующая лиганд кДНК может быть выделена. как описано выше. Таким образом. данное изобретение обеспечивает. кроме новых рецепторных полипептидов. способы для клонирования полипептидных лигандов для этих рецепторов.

Тканеспецифичность экспрессии /а1рка11 предполагает роль в раннем развитии тимоцитов и регуляции иммунного ответа. Эти процессы включают в себя стимуляцию пролиферации и дифференцировки клеток в ответ на связывание одного или нескольких цитокинов с их родственными рецепторами. Ввиду тканевого распределения. наблюдаемого для этого рецептора. агонисты (в том числе природный лиганд) и антагонисты имеют огромный потенциал в применениях как ш У1!го. так и ш у1уо. Соединения. идентифицированные в качестве агонистов рецептора. применимы для стимуляции пролиферации и развития клеток-мишеней ш νίΙΐΌ и ш у1уо. Например. соединения-агонисты применимы в качестве компонентов определенных сред для культуры клеток и могут использоваться отдельно или в комбинации с другими цитокинами и гормонами для замены сыворотки. которую обычно применяют в клеточной культуре. Та

- 25 014417 ким образом, агонисты применимы в специфической стимуляции роста и/или развития Т-клеток, В-клеток и других клеток лимфоидной и миелоидной линий дифференцировки и гемопоэтических клеток в культуре.

Лиганды-агонисты для /а1рба11 могут быть полезны для стимуляции клеточно-опосредованного иммунитета и для стимуляции пролиферации лимфоцитов, например в лечении инфекций, включающих в себя иммуносупрессию, в том числе некоторых вирусных инфекций. Дополнительные применения включают в себя супрессию опухолей, когда злокачественное превращение приводит к опухолевым клеткам, которые являются антигенными. Лиганды-агонисты могли бы использоваться для индукции цитотоксичности, которая может быть опосредована активацией эффекторных клеток, таких как Т-клетки, ПК-клетки (природные клетки-убийцы) или ЬАК-клетки (лимфоид-активируемые клеткиубийцы), или индуцирована непосредственно через апоптотические пути. Лиганды-агонисты могут быть также использованы в лечении лейкопении путем увеличения уровней пораженного клеточного типа и усиления регенерации набора Т-клеток после трансплантации костного мозга.

Лиганды-антагонисты или соединения-антагонисты могут найти применение в супрессии иммунной системы, например в лечении аутоиммунных заболеваний, в том числе ревматоидного артрита, множественного склероза, сахарного диабета, воспалительного заболевания пищеварительного тракта, болезни Крона и т.д. Иммуносупрессия может быть также использована для уменьшения отторжения трансплантатов и имплантатов тканей или органов и для лечения Т-клеточно-специфических лейкозов или лимфом ингибированием пролиферации пораженного клеточного типа.

2а1рба11 может быть также использован в диагностических системах для обнаружения уровней лиганда в кровотоке. В родственном варианте антитела или другие агенты, которые специфически связываются с /а1рба11, могут быть использованы для детектирования рецепторных полипептидов в кровообращении. Повышенные или пониженные уровни полипептидов лиганда или рецептора могут свидетельствовать о патологических состояниях, в том числе о раке. Растворимые рецепторные полипептиды могут способствовать патологическому процессу и могут быть прямым маркером скрытого заболевания. Например, повышенные уровни растворимого ΙΕ-2-рецептора в сыворотке человека были ассоциированы с большим разнообразием воспалительных и неопластических состояний, таких как инфаркт миокарда, астма, тяжелая псевдопаралитическая миастения, ревматоидный артрит, острый Т-клеточный лейкоз, В-клеточные лимфомы, хронический лимфоцитарный лейкоз, рак ободочной кишки, рак молочной железы и рак яичника (Неапеу е! а1, В1ооб. 87:847-857, 1996).

Лигандсвязывающий полипептид рецептора /а1рЬа11, или растворимый рецептор, может быть получен экспрессией укороченной ДНК, кодирующей цитокинсвязывающий домен /а1рба 11 (приблизительно остатки 20 (Сук) - 237 (Н1к) человеческого рецептора (8ЕО ΙΌ N0: 2)) или соответствующий район рецептора не человека. Предпочтительно, чтобы внеклеточный домен был получен в форме, по существу, не содержащей полипептидных сегментов трансмембранного и внутриклеточного доменов. Кроме того, лигандсвязывающие полипептидные фрагменты в цитокинсвязывающем домене /а1рйа11, описанном выше, могут служить в качестве растворимых рецепторов /а1рйа11 для описанных здесь применений. Для направления экспорта рецепторного полипептида из клетки-хозяина ДНК рецептора связывают со вторым ДНК-сегментом, кодирующим секреторный пептид, такой как секреторный пептид !-РА или секреторный пептид /а1рйа11. Для облегчения очистки секретируемого рецепторного полипептида С-концевое удлинение, такое как полигистидиновая метка, вещество Р, пептид ЕЬАС™ (Норр е! а1., В|о/Тее11по1оду. 6:1204-1210, 1988; доступный из Еак!тап Кобак Со., №\ν Начеп, СТ) или другой полипептид или белок, для которого доступны антитело или другой агент специфического связывания, может быть слито с рецепторным полипептидом.

В альтернативном подходе рецепторный внеклеточный домен может экспрессироваться в виде слитого белка с константными областями тяжелой цепи иммуноглобулина, обычно с Ес-фрагментом, который содержит домены двух константных областей и не содержит вариабельной области. Такие слияния обычно секретируются в виде мультимерных молекул, где Ес-части связаны друг с другом дисульфидной связью, а два рецепторных полипептида выстроены в тесной близости друг с другом. Слитые белки этого типа могут быть использованы для аффинной очистки родственного лиганда из раствора в качестве инструмента анализа ίη ч1бо, для блокирования сигналов ίη чбго посредством специфического оттитровывания лиганда и в качестве антагонистов ίη νί\Ό путем введения их парентерально для связывания находящегося в кровотоке лиганда и выведения его из кровотока. Для очистки лиганда химеру /а1рба11иммуноглобулин добавляют к пробе, содержащей лиганд (например, клеточно-кондиционированной культуральной среде или экстрактам тканей) в условиях, которые облегчают связывание рецепторлиганд (обычно при почти физиологических температуре, рН и ионной силе). Затем комплекс химералиганд выделяют смешиванием с использованием белка А, который иммобилизован на твердом носителе (например, на нерастворимых гранулах смолы). Затем лиганд элюируют при помощи общепринятых химических способов, таких как градиент соли или рН. Альтернативно, сама химера может быть связана с твердым носителем, причем связывание и элюцию проводят, как описано выше. Собранные фракции могут быть повторно фракционированы до тех пор, пока не будет достигнут желаемый уровень чистоты.

- 26 014417

Кроме того, растворимые рецепторы /а1рйа11 могут быть использованы в качестве стока лиганда, т.е. антагониста, для связывания лиганда ίπ νί\Ό или ίπ νίΙΐΌ в терапевтических или других применениях, когда присутствие лиганда является нежелательным. Например, в случае раков, которые экспрессируют большое количество биоактивного лиганда /а1рйа11, растворимые рецепторы /а1рйа11 могут быть использованы в качестве прямых антагонистов этого лиганда ш νί\Ό и могут способствовать снижению прогрессирования и симптомов, связанных с данным заболеванием. Кроме того, растворимый рецептор /а1рйа11 может быть использован для замедления прогрессирования раков, которые сверхэкспрессируют рецепторы /а1рйа11, связыванием лиганда ш у1уо, который в противном случае усиливал бы пролиферацию этих раков. Подобно применениям ш νίΙΐΌ для /а1рйа11, растворимый рецептор может быть использован, например, в качестве инструмента негативного отбора для отбора клеточных линий, которые растут в отсутствие лиганда /а1рйа11.

Кроме того, растворимый рецептор /а1рйа11 может быть использован 1п νίΙΐΌ или в диагностических применениях для детектирования экспрессирующих лиганд /а1рйа11 раков 1п у1уо или в пробах тканей. Например, растворимый рецептор /а1рЬа11 может быть конъюгирован с радиоактивной меткой или флуоресцентной меткой, как описано выше, и использован для детектирования присутствия лиганда в пробе ткани с применением анализа связывания 1п ν 11го типа лиганд-рецептор или анализа с флуоресцентной визуализацией. Кроме того, радиоактивно меченый растворимый рецептор /а1рйа11 мог бы вводиться 1п νί\Ό для детектирования экспрессирующих лиганд твердых опухолей при помощи способа радиотомографии, известного в данной области.

Анализ тканевого распределения мРНК, соответствующей этой новой ДНК, показал экспрессию в лимфоидных тканях, в том числе в тимусе (вилочковой железе), селезенке, лимфатических узлах и лейкоцитах периферической крови. Эти данные указывают на роль рецептора /а1рйа11 в пролиферации, дифференцировке и/или активации иммунных клеток и предполагают роль в развитии и регуляции иммунных ответов. Эти данные предполагают также, что взаимодействие /а1рйа11 с его лигандом может стимулировать пролиферацию и развитие миелоидных клеток и может, подобно ГЕ-2, [П-6, ЫЕ, ГЬ-11 и 08М (Ваитапп е! а1., I. Вю1. С1ет. 268:8414-8417, 1993), индуцировать белковый синтез острой фазы в гепатоцитах.

Предпочтительно очищать полипептиды данного изобретения до >80% чистоты, более предпочтительно до >90% чистоты, еще более предпочтительно до >95% чистоты и особенно предпочтительно до фармакологически чистого состояния, т.е. до чистоты более 99,9%, в отношении загрязняющих макромолекул, в частности других белков и нуклеиновых кислот, и инфекционных и пирогенных агентов. Предпочтительно очищенный полипептид является, по существу, не содержащим других полипептидов, в частности других полипептидов животного происхождения.

Экспрессируемые рекомбинантные полипептиды /а1рйа11 (или химерные или слитые полипептиды /а1рйа11) могут быть очищены с использованием фракционирования и/или общепринятых способов и сред очистки. Для фракционирования проб могут быть использованы осаждение сульфатом аммония и кислотная или хаотропная экстракция. Примеры стадий очистки могут включать в себя применение гидроксиапатита, гель-фильтрацию, жидкостную экспресс-хроматографию белков (РРЬС) и высокоэффективную жидкостную хроматографию с обращенной фазой. Подходящие хроматографические среды включают в себя производные декстрана, агарозу, целлюлозу, полиакриламид, специальные диоксиды кремния и т.п. Предпочтительными являются производные РЕЕ ЭЕЛЕ, ОЛЕ и О. Примеры хроматографических сред включают в себя среды, дериватизованные фенильной, бутильной или октильной группами, такие как Рйепу1-8ерйагоке ЕЕ (Рйагтааа), Тоуореаг1 Ьи1у 1 650 (Токо Наак, МоШдотег^Ше, РА), 0с1у1-8ерйагоке (Рйагтас1а) и т.п.; или полиакриловые смолы, такие как АтЬегсЬгот СО 71 (Токо Наак) и т.п. Подходящие твердые носители включают в себя стеклянные гранулы, смолы на основе диоксида кремния, целлюлозные смолы, агарозные гранулы, сшитые агарозные гранулы, полистироловые гранулы, сшитые полиакриламидные смолы и т.п., которые являются нерастворимыми в условиях, в которых они должны использоваться. Эти носители могут быть модифицированы реакционноспособными группами, позволяющими присоединение белков посредством аминогрупп, карбоксильных групп, сульфгидрильных групп, гидроксильных групп и/или углеводных частей молекул. Примеры химических способов связывания включают в себя активацию цианогенбромидом, активацию №гидроксисукцинимидом, активацию эпоксидом, активацию сульфгидрильными группами, активацию гидразидом и карбоксил- и аминопроизводные для способов сочетания с использованием карбодиимида. Эти и другие твердые среды являются хорошо известными и широко используемыми в данной области и доступны из коммерческих источников. Способы связывания рецепторных полипептидов со средами-носителями хорошо известны в данной области. Выбор конкретного способа является рутинным и определяется отчасти свойствами выбранного носителя. См., например, Айгпйу СЬгота1оцгарйу: Рппар1ек & МеЛобк, Рйагтааа ЬКВ Вю1есЬпо1оду, Иррка1а, 8мебеп, 1988.

- 27 014417

Полипептиды данного изобретения могут быть выделены путем использования их биохимических, структурных и биологических свойств. Например, адсорбционная хроматография с иммобилизованным ионом металла (1МАС) может быть использована для очистки богатых гистидином белков или белков, имеющих полигистидиновые метки. Вкратце, гель сначала загружают ионами двухвалентного металла с образованием хелата (8и1котек1, Тгепбз ш Вюсйет. 3:1-7, 1985). Богатые гистидином белки будут адсорбироваться на этом матриксе с различными аффинностями в зависимости от используемого иона металла и будут элюироваться конкурентной элюцией, понижением рН или применением сильных хелатообразователей. Другие способы очистки включают в себя очистку гликозилированных белков аффинной хроматографией с иммобилизованным лектином и ионообменной хроматографией (Ме1йоб8 ш Еп/утой уо1. 182:529-39, Сшбе !о Рго!ет Рипйсайоп, М. Пеиксйег (еб.), (Асаб. Ргекк, 8ап Ояедо, 1990). В дополнительных вариантах данного изобретения может быть сконструирован гибрид представляющего интерес полипептида и аффинной метки (например, мальтозусвязывающего белка, домена иммуноглобулина) для облегчения очистки.

Кроме того, при помощи способов, описанных в данной области, слитые полипептиды или гибридные белки ха1рНа11 конструируют с использованием районов или доменов ха1рНа11 данного изобретения в комбинации с районами или доменами других белков семейства рецепторов цитокинов человека или гетерологичных белков (8атЬгоок е! а1., 1Ь1б., АИксйш е! а1., 1Ь1б, Ркагб, Сиг. Орт. Вю1оду, 5511-5, 1994 и приведенные в них ссылки). Эти способы позволяют определить биологическую важность более крупных доменов или районов в представляющем интерес полипептиде. Такие гибриды могут изменять кинетику реакции, связывание, сужать или расширять субстратную специфичность или изменять клеточную локализацию полипептида и могут быть применены к полипептидам неизвестной структуры.

Слитые полипептиды или белки могут быть получены способами, известными в данной области, посредством получения каждого компонента слитого белка и химического конъюгирования их. Альтернативно, полинуклеотид, кодирующий один или несколько компонентов слитого белка в правильной рамке считывания, может быть получен с использованием известных способов и экспрессирован при помощи описанных здесь способов. Например, часть домена (доменов) или весь домен, сообщающий биологическую функцию, может быть подвергнут обмену между ха1рНа11 данного изобретения и функционально эквивалентным доменом (доменами) из другого члена семейства цитокинов. Такие домены включают в себя, но не ограничиваются ими, секреторную сигнальную последовательность, внеклеточный связывающий цитокин домен, трансмембранный домен и внутриклеточный передающий сигнал домен, сайты Вох I и Вох II, как описано здесь. Можно было бы ожидать, что такие гибридные белки имеют биологические функциональные особенности, которые являются одинаковыми или подобными особенностям полипептидов данного изобретения или белков других известных семейств, в зависимости от сконструированного слитого полипептида. Кроме того, такие слитые белки могут проявлять другие свойства, как описано здесь.

Стандартные способы молекулярной биологии и клонирования могут быть использованы для обмена эквивалентных доменов между полипептидом ха1р11а11 и полипептидами, с которыми их сливают. Обычно сегмент ДНК, который кодирует представляющий интерес домен, например описанный здесь домен 7а1рйа11, функционально (операбельно) связывают в рамке считывания по меньшей мере с одним другим сегментом ДНК, кодирующим дополнительный полипептид (например, домен или район из рецептора другого цитокина, такого как 1Ь-2-рецептор), и встраивают в подходящий экспрессирующий вектор, как описано здесь. Обычно конструкции ДНК конструируют таким образом, что несколько сегментов ДНК, кодирующих соответствующие районы полипептида, функционально связывают в рамке считывания для получения единой конструкции, кодирующей весь слитый белок или его функциональную часть. Например, конструкция ДНК кодировала бы от Ν-конца до С-конца слитый белок, содержащий сигнальный полипептид, за которым следуют цитокинсвязывающий домен, затем трансмембранный домен и внутриклеточный передающий сигнал домен. Такие слитые белки могут быть экспрессированы, выделены и тестированы на активность, как описано здесь.

Полипептиды ха1р11а11 или их фрагменты могут быть также получены при помощи химического синтеза. Полипептиды ха1р11а11 могут быть мономерами или мультимерами; гликозилированными или негликозилированными; пэгилированными или непэгилированными и могут содержать или могут не содержать исходный аминокислотный остаток метионин.

Полипептиды данного изобретения могут быть также синтезированы эксклюзивным (т.е. только) твердофазным синтезом, частичными твердофазными способами, конденсацией фрагментов или классическим синтезом в растворе. Способы синтеза полипептидов хорошо известны в данной области. См., например, Метйе1б, I. Ат. Сйет. 8ос. 85:2149, 1963; Кайег е! а1., Апа1. Вюсйет. 34:595, 1970. После полного синтеза желаемого пептида на твердом носителе комплекс пептид-смола обрабатывают реагентом, который отщепляет полипептид от смолы и удаляет большую часть защитных групп боковых цепей. Такие способы хорошо разработаны в данной области.

Активность молекул данного изобретения может быть измерена с использованием различных тестов, которые измеряют дифференцировку и пролиферацию клеток. Такие тесты хорошо известны в данной области.

- 28 014417

Белки данного изобретения применимы, например, в лечении лимфоидных, иммунных, воспалительных, связанных с селезенкой, кровью и костями нарушений и могут быть измерены ш νίΙΐΌ с использованием культивируемых клеток или т νί\Ό путем введения молекул данного изобретения подходящему животному-модели. Например, клетки-хозяева, экспрессирующие растворимый рецепторный полипептид ха1рНа11, могут быть заделаны в альгинатную среду и инъецированы (имплантированы) в животных-реципиентов. Микроинкапсулирование в альгинат-поли-Ь-лизин, инкапсулирование в мембрану с избирательной проницаемостью и диффузионные камеры являются средствами заключения в них трансфицированных клеток млекопитающих или первичных клеток млекопитающих. Эти типы неиммуногенных инкапсулирований делают возможной диффузию белков и других макромолекул, секретируемых или высвобождаемых захваченными клетками в реципиентное животное. Наиболее важно, что капсулы маскируют и защищают чужеродные заделанные в них клетки от иммунного ответа реципиентного животного. Такие инкасулирования могут продлевать жизнь инъецируемых клеток от нескольких часов или дней (голые клетки) до нескольких недель (заделанные клетки). Альгинатные нити обеспечивают простое и быстрое средство для получения заделанных клеток.

Материалы, необходимые для получения альгинатных нитей, известны в данной области. В примерной процедуре 3% альгинат готовят в стерильной Н₂О и стерильно фильтруют. Непосредственно перед приготовлением альгинатных нитей раствор альгината снова фильтруют. Приблизительно 50% суспензию клеток (содержащую приблизительно 5х10⁵ - приблизительно 5х10⁷ клеток/мл) смешивают с 3% раствором альгината; 1 мл суспензии альгинат/клетки экструдируют в 100 мМ стерильно профильтрованный раствор СаС1₂ на протяжении периода времени ~15 мин с образованием нити. Затем экструдированную нить переносят в раствор 50 мМ СаС1₂ и затем в раствор 25 мМ СаС1₂. Затем эту нить промывают деионизованной водой перед нанесением покрытия на нить инкубированием в 0,01% растворе поли-Ь-лизина. Наконец, нить промывают лактированным раствором Рингера и вытягивают из раствора в цилиндр шприца (без иглы). Затем к шприцу присоединяют иглу с большим отверстием и нить инъецируют внутрибрюшинно в реципиента в минимальном объеме лактированного раствора Рингера.

Подход т у1уо для тестирования белков данного изобретения включает в себя вирусные системы доставки. Примеры вирусов для этой цели включают в себя аденовирус, герпесвирус, ретровирусы, вирус коровьей оспы и аденоассоциированный вирус (ААУ). Аденовирус, двухцепочечный ДНК-вирус, является в настоящее время наиболее исследованным вектором переноса генов для доставки гетерологичной нуклеиновой кислоты (в отношении обзора см. Т.С. Вескег е! а1., Ме!1. Се11 Вю1. 43:161-89, 1994 и 1.Т. ЭонДак апД Ό.Τ. Сипе1, 8аепсе & МеДюте 4:44-53, 1997). Аденовирусная система предоставляет несколько преимуществ: аденовирус (1) может вместить относительно большие инсерционные сегменты (вставки) ДНК; (ίί) может выращиваться до высокого титра; (ш) инфицирует широкий спектр типов клеток млекопитающих и (ίν) может быть использован с большим числом различных промоторов, в том числе вездесущих, тканеспецифических и регулируемых промоторов. Поскольку аденовирусы являются стабильными в кровотоке, они могут вводиться также внутривенной инъекцией.

С использованием аденовирусных векторов, в которых части аденовирумного генома делетированы, инсерционные сегменты (вставки) включают в вирусную ДНК прямым лигированием или гомологичной рекомбинацией с котрансфицируемой плазмидой. В приводимой в качестве примера системе, основной ген Е1 был делетирован из вирусного вектора и вирус не реплицировался, пока ген Е1 не обеспечивался клеткой-хозяином (примером является клеточная линия 293 человека). При внутривенном введении интактным животным аденовирус прежде всего поражал печень. Если эта аденовирусная система доставки имеет делецию гена Е1, этот вирус не может реплицироваться в клетках-хозяевах. Однако ткань хозяина (например, печень) будет экспрессировать и процессировать (и, если присутствует секреторная сигнальная последовательность, секретировать) гетерологичный белок. Секретированные белки будут входить в кровоток в высоковаскуляризованной печени, и могут быть определены действия на инфицированное животное.

Кроме того, аденовирусные векторы, содержащие различные делеции вирусных генов, могут быть использованы в попытке уменьшения или элиминации иммунных ответов на вектор. Такие аденовирусы являются лишенными Е1 и, кроме того, содержат делеции Е2А или Е4 (Ьикку, М. е! а1., 1. У1го1. 72:20222032, 1998; Карег, 8.Е. е! а1., Нитап Сепе ТБегару 9:671-679, 1998). Кроме того, сообщалось, что делеция Е2Ь снижает иммунные ответы (АтаИДапо, А. е! а1., 1. У1го1. 72:926-933, 1998). Кроме того, посредством делеции всего аденовирусного генома могут быть помещены очень большие инсерции гетерологичной ДНК. Генерирование так называемых безвольных аденовирусов, в которых все вирусные гены делетированы, является особенно выгодным для инсертирования больших инсерционных сегментов гетерологичной ДНК. В качестве обзора см. Уеп, Р. апД РетсаиДе!, М. ЕА8ЕВ 1. 11:615-623, 1997.

Аденовирусная система может быть также использована для получения белков ш νίΙΐΌ. Культивированием инфицированных аденовирусом не-293 клеток в условиях, в которых эти клетки не являются быстро делящимися, эти клетки могут продуцировать белки в течение продолжительных периодов времени. Например, клетки ВНК выращивают до конфлюэнтности в клеточных фабриках (кассетах биореакторов для крупномасштабного производства клеток), затем экспонируют аденовирусному вектору, кодирующему представляющий интерес секретируемый белок. Затем клетки выращивают в бессывороточ

- 29 014417 ных условиях, которые позволяют инфицированным клеткам выживать в течение нескольких недель без существенного деления клеток. Альтернативно, инфицированные аденовирусным вектором клетки 293 могут выращиваться в виде прикрепленных клеток или в виде суспензионной культуры при относительно высокой плотности клеток для продуцирования значительных количеств белка (см. Са11йег с1 а1., СуЮ1сс11по1. 15:145-55, 1994). В случае любого протокола экспрессируемый, секретируемый гетерологичный белок может периодически выделяться из супернатанта, лизата или мембранных фракций клеточной культуры в зависимости от локализации экспрессируемого белка в клетке. В протоколе с продуцированием инфицированными клетками 293 также могут быть эффективно получены несекретируемые белки.

Ввиду тканевого распределения, наблюдаемого для ха1рйа11. агонисты (в том числе природный лиганд/субстрат/кофактор и т.д.) и антагонисты имеют огромный потенциал в применениях как ίη νίΐτο, так и ίη νίνο. Соединения, идентифицированные в качестве агонистов ха1рЬа11, применимы для стимуляции роста иммунных и гемопоэтических клеток ίη νίΐτο и ίη νίνο. Например, ζοίρΐιοίΐ и соединения-агонисты применимы в качестве компонентов определенных сред для культуры клеток и могут использоваться отдельно или в комбинации с другими цитокинами и гормонами для замены сыворотки, которую обычно применяют в клеточной культуре. Таким образом, агонисты применимы в специальной стимуляции роста и/или развития Т-клеток, В-клеток и других клеток лимфоидной и миелоидной линий дифференцировки в культуре. Кроме того, растворимый рецептор ζοίρΐιοίΐ, агонист или антагонист могут быть использованы ίη νίΐτο в тесте для измерения стимуляции образования колоний из первичных культур выделенного костного мозга. Такие тесты хорошо известны в данной области.

Антагонисты применимы также в качестве реагентов исследования для характеристики сайтов взаимодействия лиганд-рецептор. Ингибиторы активности ζοίρΐιοίΐ (антагонисты ζαΐρΗαΙΙ) включают в себя антитела против ζοίρΐιοίΐ и растворимых рецепторов ζαΙρΗαΙΙ, а также другие пептидные и непептидные агенты (в том числе рибозимы).

Ζαΐρΐιαΐ 1 может быть использован также для идентификации модуляторов (например, антагонистов) его активности. Тест-соединения добавляют к описанным здесь тестам для идентификации соединений, ингибирующих активность ζαΐρΐιοΐΐ. Кроме этих описанных здесь тестов, пробы могут быть тестированы на ингибирование активности ζοίρΐιοΐ 1 в многочисленных анализах, предназначенных для измерения связывания, олигомеризации ζοίρΐιοΐ 1 или стимуляции/ингибирования ζαΐρΐιο 11 -зависимых клеточных ответных реакций. Например, экспрессирующие ζαΐρΐιοΐΐ клеточные линии могут быть трансфицированы конструкцией с репортерным геном, которая отвечает на стимулируемый /афйаП клеточный путь. Конструкции с репортерным геном этого типа известны в данной области и обычно будут содержать чувствительный к /афйаП ДНК-элемент, функционально связанный с геном, кодирующим детектируемый тестом белок, такой как люцифераза. Чувствительные ДНК-элементы могут включать в себя, но не ограничиваются ими, циклический АМФ-чувствительный элемент (СКЕ), гормон-чувствительные элементы (НКЕ), инсулин-чувствительный элемент (1КЕ) (Νοδππ с1 ай, Ргас. ΝοΙΐ. Лсаб. 8с1. И8А 87:5273-7, 1990) и сыворотка-чувствительные элементы (8КЕ) (81ι;·ι\ν с1 аР, СеП 56:563-72, 1989). Циклические АМФ-чувствительные элементы рассматриваются в обзоре КлеШет еΐ аР, 1. Βίοΐ. Сйет. 263 (19):9063-6; 1988 и Наденет ΜοΚα Εηάο^ίηοΐ. 4 (8): 1087-94; 1990. Гормон-чувствительные элементы рассматриваются в ВезЮ, Сей 56 335-44; 1989. Соединения-кандидаты, растворы, смеси или экстракты или кондиционированные среды от различных типов клеток тестируют на их способность усиливать активность рецептора /афйаП, определяемую увеличением стимуляции ζηΐρΗηΐ 1 экспрессии репортерного гена. Тесты этого типа будут детектировать соединения, которые непосредственно стимулируют активность трансдукции (передачи) сигнала /афйаП через связывание рецептора или стимуляцией иным образом части каскада сигналов. Таким образом, обеспечен способ идентификации агонистов полипептида /афйаП, предусматривающий обеспечение клеток, чувствительных к полипептиду /афйаП, культивирование первой порции этих клеток в отсутствие тест-соединения, культивирование второй порции этих клеток в присутствии тест-соединения и детектирование увеличения клеточного ответа второй порции этих клеток в сравнении с первой порцией этих клеток. Кроме того, третья клетка, содержащая конструкцию с репортерным геном, описанную выше, но не экспрессирующая рецептор ζ.ηΐρίηΐΐ, может быть использована в качестве контрольной клетки для оценки неспецифической, или не опосредованной рецептором /афйаП, стимуляции данного репортера. Таким образом, агонисты, в том числе природный лиганд, применимы для стимуляции или увеличения функции полипептида /афйаП.

Лигандсвязывающий полипептид /афйаП, такой как цитокинсвязывающий домен, описанный здесь, может быть также использован для очистки лиганда. Этот полипептид иммобилизуют на твердом носителе, таком как гранулы из агарозы, сшитой агарозы, стекла, целлюлозных смол, смол на основе диоксида кремния, полистирола, сшитого полиакриламида, или подобных материалах, которые являются стабильными в условиях использования. Способы связывания полипептидов с твердыми носителями известны в данной области и включают в себя аминную химию, активацию цианогенбромидом, активацию Ν-гидроксисукцинимидом, активацию эпоксидом, сульфгидрильную активацию и гидразидную активацию. Полученную среду обычно готовят в форме колонки и жидкости, содержащих лиганд, пропускают через эту колонку один раз или несколько раз, чтобы позволить лиганду связаться с рецепторным поли

- 30 014417 пептидом. Затем этот лиганд элюируют при помощи изменений концентрации соли, хаотропных агентов (гуанидина-НС1) или рН для разрушения связывания лиганд-рецептор.

Тест-система, которая использует лигандсвязывающий рецептор (или антитело, один член пары комплемент/антикомплемент) или его связывающий фрагмент, и коммерчески доступный биосенсорный прибор (ВГАсоге™, РЕагтас1а Вюкеиког, Р1кса!атау, Ν1; или технология 8ЕЬП1™, СрЕегдеи, Гис., Ра1о А1!о, СА) могут быть выгодно использованы. Такой рецептор, антитело, член пары комплемент/антикомплемент или фрагмент иммобилизуют на поверхности рецепторного кристалла. Применение этого прибора описано Каг1ккои, 1. 1ттиио1. Ме!1юбк. 145:229-240, 1991 и СиишидЕат аиб ^е11к, 1. Мо1. Вю1. 234:554-63, 1993. Такой рецептор, антитело, член пары или фрагмент присоединяют ковалентно при помощи аминной или сульфгидрильной химии к волокнам декстрана, которые присоединены к пленке золота в проточной ячейке. Тест-пробу пропускают через эту ячейку. Если лиганд, эпитоп или противоположный член пары комплемент/антикомплемент присутствует в этой пробе, он будет связываться с иммобилизованным рецептором, антителом или членом пары, соответственно, вызывая изменение в показателе преломления среды, которое детектируется как изменение в резонансе поверхностных плазмонов золотой пленки. Эта система позволяет определить скорости включения и выключения (ои- и о££-скорости), из которых может быть рассчитана аффинность связывания и сделана оценка стехиометрии связывания.

Лигандсвязывающие рецепторные полипептиды могут быть также использованы в других системах анализа, известных в данной области. Такие системы включают в себя анализ Скетчарда для определения аффинности связывания (см. 8са!сЕагб, Аии. ΝΥ Асаб. 8с£ 51:660-672, 1949) и калориметрические анализы (СиишидЕат е! а1., 8с1еисе. 253:545-48, 1991; СиишидЕат е! а1., 8с1еисе. 245:821-25, 1991).

Полипептиды ζη^Ιη-ιΗ могут быть также использованы для получения антител, которые связываются с эпитопами, пептидами или полипептидами ζа1рйа11. Полипептид ζа1рЕа11 или его фрагмент служит в качестве антигена (иммуногена) для инокуляции животного и индукции иммунного ответа. Специалисту с квалификацией в данной области будет ясно, что антигены или иммуногенные эпитопы могут состоять из отрезков аминокислот в более длинном полипептиде от приблизительно 10 аминокислот и до полной длины полипептида или более длинного полипептида в зависимости от конкретного полипептида. Подходящие антигены включают в себя полипептид ζа1рЕа11, кодируемый 8ЕО ГО Ν0: 2 от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 538 (8ег), или его фрагмент из непрерывных аминокислот 9-519. Предпочтительными пептидами для применения в качестве антигенов являются цитокинсвязывающий домен, внутриклеточный передающий сигнал домен, сайты Вох I и Вох II, описанные здесь, и гидрофильные пептиды ζа1рЕа11, такие как предсказанные специалистом в данной области из графика гидрофобности, определенные, например, из профиля гидрофильности НоррАУообк на основе скользящего окна для шести остатков со скрытыми остатками С, 8 и Т и экспонированными (открытыми) остатками Н, Υ и (см. фиг. 1). Гидрофильные пептиды ζа1рЕа11 включают в себя пептиды, содержащие аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из:

(1) аминокислоты номер 51 (Тгр) - аминокислоты номер 61 (С1и) 8ЕО ГО Ν0: 2;

(2) аминокислоты номер 136 (Не) - аминокислоты номер 143 (С1и) 8ЕО ГО Ν0: 2;

(3) аминокислоты номер 187 (Рго) - аминокислоты номер 195 (8ег) 8ЕО ГО Ν0: 2;

(4) аминокислоты номер 223 (РЕе) - аминокислоты номер 232 (С1и) 8ЕО ГО Ν0: 2;

(5) аминокислоты номер 360 (С1и) - аминокислоты номер 368 (Акр) 8ЕО ГО Ν0: 2.

Кроме того, подходящими антигенами являются консервативные мотивы и вариабельные районы между консервативными мотивами ζа1рЕа11. Кроме того, соответствующие районы мышиного полипептида ζа1рЕа11 (8ЕО ГО Ν0: 85) могут быть использованы для генерирования антител против мышиного ζа1рЕа11. Антитела, генерированные из этого иммунного ответа, могут быть выделены и очищены, как описано выше. Способы получения и выделения поликлональных и моноклональных антител хорошо известны в данной области (см., например, Сштеи! Рго!осо1к ш Iттииο1οду, Соойдаи, е! а1. (ебк.), №боиа1 [нкШШек о£ НеаЕЕ, 1о1т \УПеу аиб 8оик, Шс., 1995; 8атЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошид: А ЬаЬогаЮгу Маииа1, 8есоиб Ебйюи, Со1б 8рпид НагЬог, ΝΥ, 1989 и Ншге11, ЕС.К., Еб., Моиос1оиа1 НуЬпбота АибЬоб1ек: Тесйшциек аиб Аррйсайоик, СКС Ргекк, Шс., Воса Ка!ои, РЬ, 1982).

Как должно быть очевидно специалисту с обычной квалификацией в данной области, поликлональные антитела могут быть получены инокуляцией различных теплокровных животных, таких как лошади, коровы, козы, овцы, собаки, куры, кролики, мыши и крысы, полипептидом ζа1рЕа11 или его фрагментом. Иммуногенность полипептида ζа1рЕа11 может быть увеличена путем применения адъюванта, такого как квасцы (гидроксид алюминия) или полный или неполный адъювант Фрейнда. Полипептиды, применимые для иммунизации, включают в себя также слитые (гибридные) полипептиды, такие как гибриды ζа1рЕа11 или его части с полипептидом иммуноглобулина или с мальтозусвязывающим белком. Полипептидный иммуноген может быть полноразмерной молекулой или ее частью. Если эта часть полипептида является гаптен-подобной, такая часть может быть предпочтительно соединена или связана с макромолекулярным носителем (таким как гемоцианин фиссуреллы (КЬН), бычий сывороточный альбумин (БСА) или столбнячный токсоид) для иммунизации.

- 31 014417

В применении здесь термин антитела включает в себя поликлональные антитела, аффинноочищенные поликлональные антитела, моноклональные антитела, и антигенсвязывающие фрагменты, такие как протеолитические Р(аЬ')₂- и РаЬ-фрагменты. Также включены генетически сконструированные интактные антитела или фрагменты, такие как химерные антитела, Ρν-фрагменты, одноцепочечные антитела и т. п., а также синтетические антигенсвязывающие пептиды и полипептиды. Антитела не из человека могут быть очеловечены (гуманизированы) прививкой СОК. не человека на каркасные и константные области иммуноглобулина человека или включением полных вариабельных доменов не человека (необязательно окутыванием их подобной человеческой поверхностью путем замены экспонированных остатков, результатом чего является облицованное антитело). В некоторых случаях гуманизированные антитела могут сохранять остатки иммуноглобулина не человека в каркасных доменах вариабельной области человека для усиления характеристик правильного связывания. Посредством гуманизирования антител может быть увеличен биологический полупериод существования в организме и потенциал неблагоприятных иммунных реакций при введении людям уменьшается.

Альтернативные способы генерирования или отбора антител, применимые здесь, включают в себя экспонирование ш νίΙΐΌ лимфоцитов белку или пептиду ζη1ρΗηΐΐ и отбор библиотек представления антител в фаговых или подобных векторах (например, посредством использования иммобилизованного или меченого белка или пептида 7афка11). Гены, кодирующие полипептиды, имеющие потенциальные домены связывания полипептида 7а1рка11, могут быть получены скринингом случайных пептидных библиотек, представленных на фагах (фаговое представление) или на бактериях, таких как Е.сой. Нуклеотидные последовательности, кодирующие эти полипептиды, могут быть получены различными путями, такими как случайный мутагенез или случайный синтез полинуклеотидов. Эти случайные библиотеки представления пептидов могут быть использованы для скрининга на пептиды, которые взаимодействуют с известной мишенью, которая может быть белком или полипептидом, таким как лиганд или рецептор, биологическая или синтетическая макромолекула или органические или неорганические вещества. Способы создания и скрининга таких случайных библиотек представления пептидов известны в данной области (Ьабпег е1 а1., И8 Ра1еп1 №. 5223409; Ьабпег е1 а1., и.8. Ра1еп1 №. 4946778; Ьабпег е1 а1., и.8. Ра1еп1 №. 5403484 и Ьабпег е1 а1., и.8. Ра1еп1 №. 557ΐ698), и случайные библиотеки представления пептидов и наборы для скрининга таких библиотек коммерчески доступны, например, из С1оп1ес11 (Ра1о А11о, СА), Шуйтодеп Ичс. (8ап Э1едо, СА), №\ν Епд1апб Вю1аЬ®, Шс. (Веуег1у, МА) и Ркаттааа ЬКВ Вю1ес1то1оду Мс. (Р|®са1а\уау. N1). Случайные библиотеки представления пептидов могут быть подвергнуты скринингу с использованием последовательностей 7а1рка11, описанных здесь, для идентификации белков, которые связываются с 2афка11. Эти связывающие пептиды, которые взаимодействуют с полипептидами 2а1рка11, могут быть использованы для мечения клеток; для выделения гомологичных полипептидов аффинной очисткой; они могут быть прямо или опосредованно конъюгированы с лекарственными средствами, токсинами, радионуклидами и т. п. Эти связывающие пептиды могут быть также использованы в аналитических способах, например, для скрининга экспрессионных библиотек и нейтрализующей активности. Связывающие пептиды могут быть также использованы для диагностических тестов для определения уровней полипептидов ζη 1рка ΐΐ в кровотоке; для обнаружения или количественного определения растворимых полипептидов ζа1р11а11 как маркера скрытых патологии или заболевания. Эти связывающие пептиды могут также действовать как антагонисты 2а1рка11 для блокирования связывания ζπ 1 рка 11 и трансдукции сигнала ш У11го и ш νί\Ό. Эти анти /а1ркаП связывающие пептиды были бы полезны для ингибирования действия лиганда, который связывается с /афкаИ.

Антитела определяются как специфически связывающие, если они: ΐ) проявляют пороговый уровень связывающей активности и/или 2) не имеют значимой перекрестной реактивности с родственными полипептидными молекулами. Во-первых, описанные здесь антитела специфически связываются, если они связываются с полипептидом, пептидом или эпитопом зафкаП с аффинностью, по меньшей мере в ΐ0 раз большей, чем аффинность связывания с контрольным (не 7а1рка11) полипептидом. Предпочтительно, чтобы эти антитела проявляли аффинность связывания (К_а) ΐ0⁶ моль^-1 или более, предпочтительно ΐ0⁷ моль^-1 или более, более предпочтительно ΐ0⁸ моль^-1 или более и наиболее предпочтительно ΐ0⁹ моль^-1 или более. Аффинность связывания антитела может быть легко определена специалистом с обычной квалификацией в этой области, например, при помощи анализа Скетчарда (8са1скатб, 6., Апп. ИУ Асаб. 8ск 51:660-672, 1949).

Во-вторых, антитела специфически связываются, если они не имеют значимой перекрестной реактивности с родственными полипептидами. Антитела не имеют значимой перекрестной реактивности с родственными полипептидными молекулами, например, если они обнаруживают полипептид 7афка11, но не обнаруживают известные родственные полипептиды, используемые в стандартном вестерн-блот анализе (Аи®иЬе1 е1 а1., 1Ь1б.). Примеры известных родственных полипептидов включают в себя ортологи, белки из того же вида, которые являются членами семейства белков (например, ГЬ-6), полипептиды 7а1рка11 и 7а1рка11 не человека. Кроме того, антитела могут быть скринированы (просеяны) против известных родственных полипептидов для выделения популяции, которая специфически связывается с полипептидами данного изобретения. Например, антитела, индуцированные к 7афка11, адсорбируют с родственными полипептидами, прикрепленными к нерастворимому матриксу; антитела, специфические

- 32 014417 для ζη^Ιη-ιΗ будут протекать через этот матрикс при подходящих буферных условиях. Такое просеивание позволяет выделить поликлональные и моноклональные антитела, не имеющие перекрестной реактивности с близкородственными полипептидами (Ап!1Ьоб1ек: А ЬаЬога!огу Мапиа1, Наг1оте апб Ьапе (ебк.), Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, 1988; Сиггеп! Рго!осо1к ш 1ттипо1оду, СооНдап, е! а1. (ебк.), №Юопа1 1пкй!и!ек оГ НеаИй, Ло11п \УПеу апб 8опк, 1пс., 1995). Скрининг и выделение специфических антител хорошо известны в этой области (см. Еипбатеп1а1 1ттипо1оду, Раи1 (ебк.), Кауеп Ргекк, 1993; СеРоГГ е! а1., Абу. т 1ттипо1. 43:1-98, 1988; Мопос1опа1 АпйЬоб1ек: Ргтар1ек апб Ргасбсе, Собтд, !\У. (ебк.), Асабеиис Ргекк Ь!б., 1996; Вещают е! а1., Апп. Кеу. 1ттипо1. 2:67-101, 1984).

Различные анализы, известные лицам с обычной квалификацией в данной области, могут быть использованы для детектирования антител, которые специфически связывают белки и пептиды ζа1р11а11. Примеры анализов описаны подробно в Ап!1Ьоб1ек: А ЬаЬога!огу Мапиа1, Наг1о\у апб Ьапе (Ебк.), Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, 1988. Характерные примеры таких анализов включают в себя конкурентный иммуноэлектрофорез, радиоиммуноанализ, радиоиммунопреципитацию, твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЫ8А), дот-блот или вестерн-блот анализ, ингибиторный или конкурентный анализ и сэндвич-анализ. Кроме того, антитела могут быть подвергнуты скринингу на связывание с белком или полипептидом дикого типа в сравнении с мутантным белком или полипептидом ζа1р11а11.

Антитела к ζа1рΗа11 могут быть использованы для мечения клеток, экспрессирующих ζа1рΗа11; для выделения ζа1р11а11 аффинной очисткой; для диагностических тестов для определения уровней в кровотоке полипептидов ζа1р11а11; для обнаружения или количественного определения растворимого ζа1рΗа11 как маркера скрытых патологии или заболевания; в аналитических способах с использованием ЕАС8; для скрининга экспрессионных библиотек; для генерирования антиидиотипических антител и в качестве нейтрализующих антител или в качестве антагонистов для блокирования активности ζа1р11а11 т уйго и ш У1уо. Подходящие прямые тэги (маркеры) или метки включают в себя радионуклиды, ферменты, субстраты, кофакторы, ингибиторы, флуоресцентные маркеры, хемилюминесцентные маркеры, магнитные частицы и т.п.; непрямые тэги (маркеры) или метки могут выводить на первое место применение пары биотин-авидин или других пар комплемент/антикомплемент в качестве промежуточных продуктов. Описанные здесь антитела могут быть также прямо или опосредованно конъюгированы с лекарственными средствами, токсинами, радионуклидами и т.п. и эти конъюгаты могут быть использованы для диагностических или терапевтических применений т у1уо. Кроме того, антитела к ζа1рЬа11 или его фрагментам могут быть использованы ш νίΙΐΌ для обнаружения денатурированного ζа1рЬа 11 или его фрагментов в анализах, например вестерн-блотах или других анализах, известных в этой области.

Антитела к ζа1рЬа 11 могут быть использованы для мечения клеток, экспрессирующих рецептор, и определения уровней экспрессии ζа1рΗа11; для аффинной очистки, в диагностических тестах для определения уровней в кровотоке растворимых рецепторных полипептидов, в аналитических способах, использующих клеточный сортинг с возбуждением флуоресценции. Бивалентные антитела могут быть использованы в качестве агонистов для имитации действия лиганда ζа1рΗа11.

Описанные здесь антитела могут быть также прямо или опосредованно конъюгированы с лекарственными средствами, токсинами, радионуклидами и т.п. и эти конъюгаты могут быть использованы для диагностических или терапевтических применений ш у1уо. Например, антитела или связывающие полипептиды, которые узнают ζа1рЬа 11 данного изобретения, могут быть использованы для идентификации или обработки тканей или органов, которые экспрессируют соответствующую антикомплементарную молекулу (например, рецептор ζа1р11а11) Более конкретно, антитела против ζа1рЬа11 или их биоактивные фрагменты или части могут быть связаны с детектируемыми или цитотоксическими молекулами и доставлены в млекопитающее, имеющее клетки, ткани или органы, экспрессирующие молекулу ζа1рЬа11

Подходящие детектируемые молекулы могут быть прямо или опосредованно присоединены к полипептидам, которые связывают ζа1рЬа11 (связывающим полипептидам, в том числе описанным здесь связывающим пептидам), антителам или их биоактивным фрагментам или частям. Подходящие детектируемые молекулы включают в себя радионуклиды, ферменты, субстраты, кофакторы, ингибиторы флуоресцентные маркеры, хемилюминесцентные маркеры, магнитные частицы и т.п. Подходящие цитотоксические молекулы могут быть прямо или опосредованно присоединены к этому полипептиду или антителу и включают в себя бактериальные или растительные токсины (например, дифтерийный токсин, экзотоксин Ркеиботопак, рицин, абрин и тп), а также терапевтические радионуклиды, такие как йод-131, рений-188 или иттрий-90 (либо непосредственно присоединенные к полипептиду или антителу, либо опосредованно присоединенные, например, через хелатирующую часть молекулы). Связывающие полипептиды или антитела могут быть также конъюгированы с цитотоксическими лекарственными средствами, такими как адриамицин. Для непрямого присоединения детектируемой или цитотоксической молекулы эта детектируемая или цитотоксическая молекула может быть конъюгирована с членом пары комплемент/антикомплемент, где другой член связан с этим связывающим полипептидом или частью антитела Для этих целей примером комплементарной/антикомплементарной пары является биотин/стрептавидин.

В другом варианте гибридные белки полипептид-токсин или гибридные белки антитело-токсин могут быть использованы для нацеленного ингибирования или разрушения клетки или ткани (например, для обработки раковых клеток или тканей).

- 33 014417

Альтернативно, если связывающий полипептид имеет множественные функциональные домены (а именно, активирующий домен или лигандсвязывающий домен плюс нацеливающий домен), гибридный белок, включающий в себя только нацеливающий домен, может быть пригодным для направления детектируемой молекулы, цитотоксической молекулы или комплементарной молекулы в представляющий интерес тип клеток или тканей. В тех случаях, когда гибридный белок только с единственным доменом включает в себя комплементарную молекулу, антикомплементарная молекула может быть конъюгирована с детектируемой или цитотоксической молекулой. Таким образом, такие гибридные белки, содержащие домен-комплементарную молекулу, представляют характерный для определенного типа клеток нацеливающий носитель для клетко/тканеспецифической доставки характерных для этого типа клеток конъюгатов антикомплементарно-детектируемых/цитотоксических молекул.

В другом варианте гибридные белки /а1рйа 11-связывающий полипептид-цитокин или антителоцитокин могут быть использованы для усиления убивания ш νί\Ό тканей-мишеней (например, раков крови, лимфоидов, ободочной кишки и костного мозга), если гибрид, связывающий полипептид-цитокин или антитело против /а1рйа11, поражает гиперпролиферативную клетку (см. в общем Ногшск е! а1., В1ооб. 89:4437-47, 1997). Они описывают слитые белки, способные нацеливать цитокин в желаемый участок действия, обеспечивая посредством этого повышенную локальную концентрацию цитокина. Подходящие антитела против /а1рйа11 поражают нежелательную клетку или ткань (т.е. опухоль или лейкоз), и слитый цитокин медиирует улучшенный лизис клетки-мишени эффекторными клетками. Подходящие цитокины для этой цели включают в себя, например, интерлейкин 2 и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (СМ-С8Р).

Альтернативно, слитые с /а1рйа 11-связывающим полипептидом или антителом белки, описанные здесь, могут быть использованы для усиления убивания ш νί\Ό тканей-мишеней прямой стимуляцией модулируемого ζι1 р1а 11 апоптотического пути, приводящего к некрозу гиперпролиферативных клеток, экспрессирующих /а1рйа11.

Биоактивные содержащие связывающий полипептид или антитело конъюгаты, описанные здесь, могут доставляться перорально, внутривенно, внутриартериально или внутрипротоково или могут быть введены локально в предполагаемом месте действия.

Состоящие из четырехспирального пучка цитокины, которые связываются с рецепторами цитокинов, а также другие белки, продуцируемые активированными лимфоцитами, играют важную биологическую роль в дифференцировке клеток, активации, рекрутинге и гомеостазе клеток во всем теле. Терапевтическая применимость включает в себя лечение заболеваний, которые требуют иммунной регуляции, в том числе аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, множественный склероз, тяжелая псевдопаралитическая миастения, системная красная волчанка и диабет. Антагонисты или агонисты /а1рйа11, в том числе растворимые рецепторы и природный лиганд, могут быть важными в регуляции воспаления и, следовательно, были бы полезны в лечении ревматоидного артрита, астмы, язвенного колита, воспалительного заболевания пищеварительного тракта, болезни Крона и сепсиса. Возможна роль антагонистов или агонистов /а1рйа11, в том числе растворимых рецепторов и природного лиганда, в медиировании онкогенеза, и, следовательно, они были бы полезны в лечении рака. Антагонисты или агонисты /а1рйа11, в том числе растворимые рецепторы и природный лиганд, могут быть потенциальными терапевтическими агентами в супрессии иммунной системы, что было бы важным для уменьшения отторжения трансплантата. Лиганд /а!рйа11 может иметь применение в предупреждении реакции трансплантат против хозяина.

Альтернативно, антагонисты или агонисты /а1рйа11, в том числе растворимые рецепторы и природный лиганд, могут активировать иммунную систему, что было бы важным в бустинге иммунитета к инфекционным заболеваниям, лечении пациентов с ослабленным иммунитетом, таких как ВИЧ+ пациенты, или в улучшении вакцин. В частности, антагонисты или агонисты /а1рйа11, в том числе растворимые рецепторы и природный лиганд, могли бы модулировать, стимулировать или размножать ИК-клетки или их потомство и могли бы обеспечивать терапевтическую пользу в лечении вирусных инфекций и в качестве антинеопластического фактора. Считается, что №<-клетки играют главную роль в элиминации метастатических опухолевых клеток, и пациенты как с метастазами, так и с твердыми опухолями имеют пониженные уровни активности НК-клеток (^Ы!ек16е е! а1., Сигг. Тор. МюгоЬю1. Iттиηο1. 230:221-244, 1998).

Полинуклеотиды, кодирующие полипептиды /а1рйа11, применимы в способах генной терапии, где желательно увеличить или ингибировать активность /а1рйа11. Если млекопитающее имеет мутированный или отсутствующий ген /а1рйа11, этот ген /а1рйа11 может быть введен в клетки этого млекопитающего. В одном варианте ген, кодирующий полипептид /а1рйа11, вводят ш νί\Ό в вирусном векторе. Такие векторы включают в себя аттенуированный или дефектный ДНК-вирус, такой как, но не ограничиваемый ими, вирус простого герпеса (Н8У), вирус папилломы, вирус Эпстайна-Барр (ЕВУ), аденовирус, аденоассоциированный вирус (ААУ) и т.п. Предпочтительными являются дефектные вирусы, которые полностью или почти полностью лишены вирусных генов. Дефектный вирус не является инфекционным после введения в клетку. Применение дефектных вирусных векторов делает возможным введение в клетки в специфической, локализованной зоне без опасения по поводу того, что этот вектор может инфицировать

- 34 014417 другие клетки. Примеры конкретных векторов включают в себя, но не ограничиваются ими, вектор дефектного вируса простого герпеса 1 (Н8У1) (Карб!! е! а1., Мо1ес. Се11. №игокс1, 2:320-30, 1991), аттенуированный аденовирусный вектор, такой как вектор, описанный 8баГогб-Ретсаибе! е! а1., 1 С1ш. Шчек!. 90:626-30, 1992), и дефектный аденоассоциированный вирусный вектор (8ати1кк1 е! а1., Е У1го1., 61:3096101, 1987; 8ати1кк1 е! а1.. 1. Убо1., 63:3822-8, 1989).

В другом варианте ген /а1рка11 может быть введен в ретровирусном векторе, например, как описано в Апбегкоп е! а1., и.8. Ра!еп! №. 5399346; Мапп е! а1., Се11. 33:153, 1983; Тетт е! а1., и.8. Ра!еп! №. 4650764; Тетт е! а1., и.8. Ра!еп! №. 4980289; Магко\\'Ш е! а1., 1. У1го1. 62:1120, 1988; Тетт е! а1., и.8. Ра!еп! №. 5124263; !п(егпа(1опа1 Ра!еп! РиЬбсабоп №. А0 95/07358, риЬбккеб Магск 16, 1995 Ьу ИоидкеНу е! а1. и Кио е! а1., В1ооб, 82:845, 1993. Альтернативно, этот вектор может быть введен липофекцией 1п ч1чо с использованием липосом. Синтетические катионные липиды могут быть использованы для получения липосом для трансфекции ш ч1чо гена, кодирующего маркер (Ее1дпег е! а1, Ргос. №11. Асаб. 8с1. И8А, 84:7413-7, 1987; Маскеу е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8ск И8А, 85:8027-31, 1988). Использование липофекции для введения экзогенных генов в специфические органы ш ч1чо имеет определенные практические преимущества. Молекулярное нацеливание липосом в специфические клетки является одной областью преимущества. Более конкретно, направление трансфекции в конкретные клетки представляет одну область преимущества. Например, направление трансфекции в конкретные типы клеток было бы особенно выгодным в ткани с клеточной гетерогенностью, такой как поджелудочная железа, печень, почка и мозг. Липиды могут быть химически связаны с другими молекулами для нацеливания. Нацеленные пептиды (например, гормоны или нейротрансмиттеры), белки, такие как антитела, или непептидные молекулы могут быть связаны с липосомами химически.

Возможно удалить эти клетки из тела; ввести этот вектор в виде голой ДНК-плазмиды и затем повторно имплантировать эти трансформированные клетки в тело. Голые ДНК-векторы для генной терапии могут быть введены в желательные клетки-хозяева способами, известными в данной области, например трансфекцией, электропорацией, микроинъекцией, трансдукцией, клеточным слиянием, ДЭАЭдекстрановым способом, кальций-фосфатным осаждением, с использованием генного дробовика (шотган-способа) или с использованием переносчика ДНК-вектора. См., например, Аи е! а1., 1. Вю1. Скет. 267:963-7, 1992; Ан е! а1., 1. Вю1. Скет. 263:14621-4, 1988.

Антисмысловая методология может быть использована для ингибирования транскрипции гена ζη1рка11, например, для ингибирования клеточной пролиферации ш ч1чо. Конструируются полинуклеотиды, которые комплементарны сегменту кодирующего /а1рка11 полинуклеотида (например, полинуклеотида, представленного в 8ЕО ΙΌ N0: 1) для связывания с кодирующей /а1рба11 мРНК и ингибирования трансляции такой мРНК. Такие антисмысловые олигонуклеотиды применимы для ингибирования экспрессии кодирующих полипептиды /а1рка11 генов в клеточной культуре или в субъекте.

Кроме того, в качестве молекулы клеточной поверхности полипептид /а1рка11 может быть использован в качестве мишени для введения генной терапии в клетку. Это применение было бы полезным, в частности, для введения терапевтических генов в клетки, в которых обычно экспрессируется полипептид /а1рка11, такие как лимфоидная ткань и РВЬ или раковые клетки, которые экспрессируют полипептид /а1ркаН. Например, вирусная генная терапия, описанная выше, может быть нацелена на специфические типы клеток, в которых экспрессируется клеточный рецептор, такой как полипептид /а1рка11, а не вирусный рецептор. Антитела или другие молекулы, которые узнают молекулы /а1рка11 на поверхности клетки-мишени, могут быть использованы для направления этого вируса для инфицирования и введения генного терапевтического материала в эту клетку-мишень. См., Аоо, 8.Б.С., №!иге Вю!еск. 14:1538, 1996; Аюккат, Т.1. е! а1., №!иге Вю!еск. 14:1570-1573, 1996; Ооид1ак, 1.Т. е! а1., №!иге Вю!еск. 14:15741578, 1996; Шкоча, В., Си!. Яеч. Вю!есбпо1. 17:149-169, 1997 и Убе, Я.С. е! а1., Мо1. Меб. Тобау 4:84-92, 1998. Например, биспецифическое антитело, содержащее вирус-нейтрализующий ЕаЬ-фрагмент, связанный с /а1рка11-специфическим антителом, может быть использовано для направления этого вируса к клеткам, экспрессирующим рецептор /а1рба11, и позволит эффективно ввести этот вирус, содержащий генетический элемент, в клетки. См., например, Аюккат, Т.1., е! а1., 1. У1го1. 71:7663-7669, 1997 и Аюккат, Т.1., е! а1., 1. Убо1. 70:6831-6838, 1996.

Данное изобретение обеспечивает также реагенты, которые найдут применение в диагностических приложениях. Например, ген /а1рка11, зонд, содержащий ДНК или РНК /а1рба11 или их субпоследовательность, могут быть использованы для определения, присутствует ли ген /а1рка11 на хромосоме 16 или имела ли место мутация. 2а1рка11 локализован в районе 16р11.1 хромосомы 16 (см. пример 3). Детектируемые хромосомные аберрации в локусе гена /а1рка11 включают в себя, но не ограничиваются ими, анеуплоидию, изменения копийности гена, инсерции, делеции, изменения сайтов рестрикции и реаранжировки. Такие аберрации могут быть детектированы с использованием полинуклеотидов данного изобретения путем применения молекулярно-генетических способов, таких как анализ полиморфизма длины фрагментов рестрикции (ЯЕЬР), флуоресцентных способов гибридизации ш кби, анализа коротких тандемных повторов (8ТЯ) с использованием ПЦР-способов, и других способов анализа генетического сцепления, известных в данной области (8атЬгоок е! а1., 1Ь1б; АикиЬе1 е! а1., 1Ь1б; Мапап, Скек!. 108:25565, 1995).

- 35 014417

Точное знание положения гена может быть полезным для ряда целей, в том числе для:

1) определения, является ли последовательность частью существующего контига, и получения дополнительных окружающих генетических последовательностей в различных формах, таких как УАС, ВАС или кДНК-клоны;

2) обеспечения возможного гена-кандидата для наследственного заболевания, который обнаруживает сцепление с тем же самым хромосомным районом; и

3) перекрестно-ссылочных модельных организмов, таких как мышь, которые могут способствовать определению, какую функцию может иметь конкретный ген.

Ген ζαΐρΐιαΐ 1 локализован в районе 16р11.1 хромосомы 16. Несколько генов известной функции картированы в этом районе. Например, альфа-субъединица рецептора цитокина (1Ь-4), члена семейства рецепторов гемопоэтина, картирована в 16р12.1-р11.2. Эта субъединица может образовывать гетеродимер с ζα1ρΗα11. Кроме того, зонды полинуклеотида ζα1ρΗα11 могут быть использованы для обнаружения отклонений от нормы или генотипов, связанных с дефектами в рецепторе 1Ь-4, например, таких, которые участвуют в некоторых аллергических воспалительных нарушениях и астме (Реюйтап, К.А. е! а1., Ехр. А11егду. 28:151-155; 1998; Мйьиуази, Н. е! а1., Ма1иге Сепе!. 19:119-120, 1998). Кроме того, зонды полинуклеотида ζ;·ι1ρ1ι;·ι11 могут быть использованы для детектирования отклонений от нормы или генотипов, связанных с воспалительным заболеванием пищеварительного тракта, где маркер восприимчивости картирован на 16р12-д13 (Сйо, 1.Н. е! а1., Ргос. Ыа11. Асаб. 8с1. 95:7502-7507, 1998). Далее, зонды полинуклеотида ζа1рйа11 могут быть использованы для детектирования отклонений от нормы или генотипов, связанных с локусами гемоглобина, локализованными в 16р!ег-р13.3, и, в частности, дефектов гемоглобина альфа, ассоциированных с синдромами альфа-талассемии, такими как иммунная водянка плода (обзор Сйш, М.Р. апб \Уауе. 1.8. В1ооб. 91:2213-2222, 1998). Кроме того, среди других генных локусов локусы для опухоли Вильмса, типа III (16ц), синдрома КиЬеп81ет-ТауЫ (16р13.3), тяжелого поликистозного заболевания детей (16р13 3), все проявляются в патологических состояниях человека, а также картированы в этом районе генома человека. См. Оп1ше МепбеШап 1пйеп!апсе о! Мап (ΟΜΙΜ) депе тар и ссылки в ней, в отношении этого района хромосомы 16 на общественно доступном сервере \ν\ν\ν (ййр://ет^ет3. ЫсЫ. Ы1т. Νίΐι. Соу/ЫЬт-роЧ/Отпп/деОпар? Сйгото8оте=16р11.1). Все эти гены служат возможными генами-кандидатами для наследственных болезней, которые обнаруживают сцепление с одним и тем же хромосомным районом, в котором находится ген ζа1рйа11.

Подобным образом, дефекты в самом локусе ζа1рйа11 могут приводить к наследственному патологическому состоянию человека. Молекулы данного изобретения, такие как полипептиды, антагонисты, агонисты, полинуклеотиды и антитела данного изобретения, могли бы способствовать детектированию, предупреждению диагноза и лечению, связанным с генетическим дефектом ζа1рйа11.

Мыши, сконструированные для экспрессии гена ζа1рйа11, называемые трансгенными мышами, и мыши, которые обнаруживают полное отсутствие функции гена ζа1рйа11, называемые мышами с нокаутом (гена), также могут быть получены (8пои\\'аег1 е! а1., 8с1епсе 257:1083, 1992; Ьоте11 е! а1., №Щ.1ге. 366:740-42, 1993; СарессЫ, М.В., 8с1епсе 244:1288-1292, 1989; Ра1тйет, Β.Ό. е! а1., Аппи. Реу. Сепе!. 20:465-499, 1986). Например, трансгенные мыши, которые сверхэкспрессируют ζа1рйа11, либо повсюду, либо под контролем тканеспецифического промотора или рестриктированного в отношении ткани промотора могут быть использованы для выяснения, обусловливает ли сверхэкспрессия определенный фенотип. Например, сверхэкспрессия полипептида ζη^Ιη-ιΗ дикого типа, фрагмента полипептида или его мутанта может изменять нормальные клеточные процессы, приводя к фенотипу, который идентифицирует ткань в которой экспрессия ζа1рйа11 является функционально релевантной, и может указывать на терапевтическую мишень для ζа1рйа11, его агонистов или антагонистов. Например, предпочтительной трансгенной мышью для конструирования является мышь, которая экспрессирует доминантнонегативный фенотип, такой, при котором сверхэкспрессируется внеклеточный цитокинсвязывающий домен ζа1рйа11 с присоединенным трансмембранным доменом (приблизительно аминокислоты 20 (Суз) 25 (Ьеи) 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 2). Кроме того, такая сверхэкспрессия может приводить к фенотипу, который обнаруживает сходство с заболеваниями человека. Подобным образом, мыши с нокаутом ζа1рйа11 могут быть использованы для определения, где ζа1рйа11 является абсолютно необходимым ш у1уо. Фенотип мышей с нокаутом предсказывает эффекты ш у1уо, которые может иметь антагонист ζа1рйа11, такой как описанные здесь кДНК мышиного или человеческого, ζа1рйа11 может быть использована для выделения мышиной мРНК, кДНК или геномной ДНК ζа1рйа11, которые затем используют для получения мышей с нокаутом гена. Эти мыши могут быть использованы для исследования гена ζа1рйа11 и белка, кодируемого им, в системе ίπ у1уо и могут быть использованы в качестве моделей ίπ у1уо для соответствующих заболеваний человека. Кроме того, экспрессия трансгенными мышами антисмысловых полинуклеотидов ζа1рйа11 или направленных против ζа1рйа11 рибозимов, описанных здесь, может быть использована аналогично экспрессии трансгенных мышей, описанной выше.

Для фармацевтического применения растворимые рецепторные полипептиды данного изобретения готовят для парентеральной, в частности внутривенной или подкожной, доставки в соответствии с общепринятыми способами. Внутривенное введение может быть болюсной инъекцией или инфузией на протяжении обычного периода времени одного-нескольких часов. Обычно фармацевтические композиции

- 36 014417 будут включать в себя растворимый рецепторный полипептид ха1р11а11 в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, таким как солевой раствор, забуференный солевой раствор, 5% декстроза в воде или т. п. Композиции могут дополнительно содержать один или несколько наполнителей, консервантов, солюбилизаторов, буферящих агентов, альбумин для предупреждения потери белка на поверхностях флаконов и т. д. Способы приготовления композиций хорошо известны в данной области и описаны, например, в Κет^ид!οи: Тке δ№ι^ аиб Ргасбсе οΓ Ркагтасу, Сеннаго, еб., Маск РиЬккктд Οο., Еакйи, РА, 19'¹' еб., 1995. Терапевтические дозы обычно будут находиться в диапазоне от 0,1 до 100 мкг/кг массы тела в сутки, предпочтительно 0,5-20 мг/кг в сутки, причем точная доза должна определяться врачом в соответствии с принятыми стандартами, с учетом природы и тяжести подлежащего лечению состояния, особенностей пациента и т. д. Определение дозы находится в пределах обычной квалификации специалиста в данной области. Белки могут вводиться для остро требующегося лечения на протяжении одной недели или менее, часто на протяжении периода одного-трех дней или могут вводиться в продолжительном лечении на протяжении нескольких месяцев или лет. Обычно терапевтически эффективное количество растворимого рецепторного полипептида ха1р11а11 составляет количество, достаточное для получения клинически значимого эффекта.

Далее данное изобретение иллюстрируется следующими ниже неограничительными примерами.

Примеры

Пример 1. Идентификация ха1р11а11 человека с использованием ЕδТ-последовательности для получения полноразмерного ха1р11а11.

Сканирование базы данных транслируемых ДНК привело к идентификации маркерной экспрессирующейся последовательности (Е£Т), которая оказалась членом семейства рецепторов цитокинов класса I и была названа ха1р11а11.

Подтверждение этой ЕδТ-последовательности было выполнено анализом последовательности кДНК, из которой происходила эта ЕδТ. Этот кДНК-клон был получен и секвенирован с использованием следующих праймеров:

N0:5), ΖΟ 976 (ЗЕО ГО N0:6), ΖΟ 19345 (ЗЕО ГО N0:7), Ζ0 19346 (ЗЕО ГО N0:8), Ζ0 19349 (ЗЕО Ю N0:9), Ζ0 19350 (ЗЕО ГО N0:10), Ζ0 19458 (ЗЕО ГО N0:11), Ζ0 19459 (ЗЕО ГО N0:12), Ζ0 19460 (ЗЕО ГО N0:13), Ζ0 19461 (ЗЕО ГО N0:14), Ζ0 19572 (ЗЕО ГО N0:15), Ζ0 19573 (ЗЕО ГО N0:16), Ζ0 19657 (ЗЕО ГО N0:17).

Вставка (инсерция) была 2945 п.н и была полноразмерной.

Пример 2. Тканевое распределение.

Нозерн-блот анализы проводили с использованием Нозерн™-блотов множественных тканей человека (МТN I, МТN II и МТN III) (СИгИеск). кДНК, описанные в примере 1, использовали в ПЦР-реакции с использованием олигонуклеотидов (олиго) 2С 19181 (δΞΟ ГО N0: 18) и 2С 19182 (δΞΟ ГО N0: 19) в качестве праймеров.

Условия ПЦР были следующими: 94°С в течение 1,5 мин; 35 циклов при 94°С в течение 15 с, затем 68°С в течение 30 с; 72°С в течение 10 мин; 4°С в течение ночи. Пробу продукта ПЦР-реакции подвергали электрофорезу на 1,5% агарозном геле.

Наблюдали полосу ожидаемого размера 175 п.н. ПЦР-фрагмент 175 п.н. очищали на геле с использованием коммерчески доступного набора (01аех11™; Р1адеи) и затем радиоактивно метили ³²Р-бСТР с использованием Кеб1рпте II™ (Атегкйат), системы мечения со случайным праймированием, в соответствии с описаниями изготовителя. Затем зонд очищали при помощи колонки №с-Тгар™ ^!га!адеие) в соответствии с инструкциями изготовителя. Раствор ЕхргеккНуЬ™ (С1οи!есй) использовали для предгибридизации и в качестве гибридизационного раствора для нозерн-блотов. Гибридизация имела место в течение ночи при 65°С с использованием 1-2х10⁶ имп/мин/мл меченого зонда. Затем блоты промывали 4 раза в течение 15 мин в 2Х δδΌ/1% ДСН при 25°С с последующим промыванием в 0,1Х δδΌ/θ,1 ДСН при 50°С. Транскрипты приблизительно 3 т.п.н. и 5 т.п.н. детектировали в лимфатическом узле, лейкоцитах периферической крови и вилочковой железе (тимусе).

Дот-блоты получали с использованием блотов Нитаи КИА Мак!ег ВЫк™ (СВШеск). Способы и условия для дот-блотов были такими же, что и условия для блотов множественных тканей, описанных выше. Дот-блот имел наиболее сильный сигнал в тимусе, лимфатическом узле и селезенке.

Нозерн-анализ проводили также с использованием клеточной линии МТУ™ рака человека (СкШесЬ). кДНК, описанную в примере 1, использовали в ПЦР-реакции с применением олиго 2С 19907 (δΞΟ ГО N0: 20) и 2С 19908 (δΞΟ ГО N0: 21) в качестве праймеров.

Условия ПЦР были следующими: 35 циклов при 95°С в течение 1 мин, затем 60°С в течение 1 мин; 72°С в течение 1,5 мин; 4°С в течение ночи.

Пробу продукта ПЦР-реакции подвергали электрофорезу на 1,5% агарозном геле. Наблюдали полосу ожидаемого размера 1,2 т.п.н. ПЦР-фрагмент 1,2 т.п.н. очищали на геле с использованием коммерче

- 37 014417 ски доступного набора (О|аОшск11™ Се1 Ех!гасбоп Κί!; О1адеп) и затем радиоактивно метили ³²Р-бСТР с использованием Рпте-Н II™ (З!га!адепе). системы мечения со случайным праймированием. в соответствии с описаниями изготовителя. Затем зонд очищали при помощи колонки М1с-Тгар™ (З!га!адепе) в соответствии с инструкциями изготовителя. Раствор ЕхргеккНуЬ™ (С1оп!есН) использовали для предгибридизации и в качестве гибридизационного раствора для нозерн-блотов. Гибридизация имела место в течение ночи при 65°С с использованием 1-2х10⁶ имп/мин/мл меченого зонда. Затем блоты промывали 4 раза в течение 15 мин в 2Х ЗЗС/1% ДСН при 25°С с последующими двумя 30-минутными промываниями в 0.1Х ЗЗС/0.1 ДСН при 50°С. Сильный сигнал наблюдали в клеточной линии Кар. полученной из лимфомы Беркитта.

Пример 3. Хромосомное картирование гена /а1рйа11 на основе ПЦР.

2а1рНа11 картировали на хромосоме 16 с использованием коммерчески доступной панели СепеВпбде 4 Ваб1а!юп НуЬпб Рапе1 (Кекеагсй Сепебск. Ыс.. Нипк!куб1е. АЬ). СепеВпбде 4 Ваб1абоп НуЬпб Рапе1 содержит пригодные для ПЦР ДНК из каждого из 93 радиационных (облученных) гибридных клонов плюс две контрольные ДНК (НРЬ-донор и А23-реципиент). Общественно доступный сервер \ν\ν\ν (1Шр://\\л\л\-депоте. \νί. Мй. Еби/сд1Ып/сопбд/гйтаррег.р1) позволяет картирование относительно карты радиационных гибридов генома человека (карты радиационных гибридов \νΚ'.ΌΚ) Центра исследований генома ^Ы!ейеаб !пк111и1е/М[Т Сеп!ег £ог Сепоте Кекеагсй. которая была сконструирована с использованием панели радиационных гибридов СепеВпбде 4 Ваб1абоп НуЬпб Рапе1.

Для картирования гена /а1рйа11 с панелью СепеВпбде 4 КН Рапе1 реакции по 20 мкл устанавливали в 96-луночном микротитрационном планшете (З1га!адепе. Ьа До11а. СА) и использовали термоциклер КоЬоСус1ег Сгаб1еп! 96 (ЗйЫадепе). Каждая из этих 95 ПЦР-реакций состояла из 2 мкл 10Х реакционного буфера для ПЦР-реакции (С1оп!есН ЬаЬогаЮпек. Шс.. Ра1о А1!о. СА). 1.6 мкл смеси б№ТР (2.5 мМ каждый. РЕККШ-ЕЬМЕК. Рок!ег С11у. СА). 1 мкл смыслового праймера 2С 19954 (ЗЕО ГО N0: 22). 1 мкл антисмыслового праймера 2С 19955 (ЗЕО ГО N0: 23). 2 мкл КебгЬоаб (Кекеагсй Сепебск. Ечс.. Нип!ку111е. АЬ). 0.4 мкл 50Х смеси АбуаШаде К1епТас.| Ро1утегаке (С1оп!есН). 25 нг ДНК из индивидуального гибридного клона или контроля и ббН₂0 для общего объема 20 мкл. На реакции наслаивали равное количество минерального масла и их герметизировали.

Условия ПЦР-циклера были следующими: 1 начальный цикл 4-минутной денатурации при 94°С. 35 циклов 45 с при 94°С. 45 с при 68°С и 1 мин при 72°С; с последующими 7 мин при 72°С. Реакции разделяли электрофорезом на 2% агарозном геле (Ь1£е ТесНпо1од1ек).

Результаты показали. что /а1рба11 картируется 9.54 сК_3000 от каркасного маркера \νΕ3768 на хромосоме 16 карты радиационных (облученных) гибридов \νΚ'.ΌΚ. Проксимальный и дистальный каркасные маркеры были ν-3768 и ТЮК-А002К05 соответственно. Применение окружающих маркеров помещает /а1рба11 в район 16р11.1 на интегрированной карте ЬЬВ хромосомы 16 (ТНе Сепебс Ьосабоп Ьа1аЬаке. Ишуегкйу о£ ЗоЫббатр!оп. сервер ^^^:(Ьбр://себаг.депебск.ко!оп.ас.ик/риЬ11с_б!т1/).ко!оп. ас.ик/риЬйс_йр!т1/).

Пример 4. Конструирование химеры полипептидов человека МРЬ-/а1рба11: внеклеточный и ТМдомен МРЬ. слитые с внутриклеточным передающим сигнал доменом /а1рба11.

Внеклеточный и трансмембранный домены МРЬ-рецептора выделяли из плазмиды. содержащей МРЬ-рецептор (плазмиды (РН21/МРБ) с использованием ПЦР с праймерами ΖΟ7212 (ЗЕО ГО N0: 24) и ΖΟ9914 (ЗЕО ГО N0: 25).

Условия реакции были следующими: 95°С в течение 1 мин; 35 циклов при 95°С в течение 1 мин. 45°С в течение 1 мин. 72°С в течение 2 мин; затем 72°С в течение 10 мин; затем пропитывание при 10°С.

ПЦР-продукт подвергали электрофорезу на 1% агарозе с низкой точкой плавления (ВоегЫпдег МаппНенп. Ыбхапаробк. ГО) и фрагмент МРЬ-рецептора приблизительно 1.5 т.п.н. выделяли с использованием набора для экстракции гелей 01ас.|шск™ (01адеп) согласно инструкциям изготовителя.

Внутриклеточные домены /а1рба11 выделяли из плазмиды. содержащей кДНК рецептора /а1рба11. с использованием ПЦР с праймерами ΖΟ9913 (ЗЕО ГО N0: 26) и ΖС20097 (ЗЕО ГО N0: 27). Полинуклеотидная последовательность. соответствующая кодирующей /а1рба11-рецептор последовательности. показана в ЗЕО ГО N0: 1 от нуклеотида 69 до нуклеотида 1682. Условия реакции были такие же. что и описанные выше. ПЦР-продукт подвергали электрофорезу на 1% агарозе с низкой точкой плавления (ВоегЫпдег МаппНе1т) и фрагмент /а1рба11 приблизительно 900 т.п.н. выделяли с использованием набора для экстракции гелей О|ас.|шск согласно инструкциям изготовителя.

Каждый из выделенных фрагментов. описанных выше. смешивали при отношении объемов 1:1 и использовали в ПЦР-реакции с применением ΖΟ7212 (ЗЕО ГО N0: 24) и ΖС20097 (ЗЕО ГО N0: 27) для создания химеры МРЬ-/а1рба11.

Условия реакции были следующими: 95°С в течение 1 мин; 35 циклов при 95°С в течение 1 мин; 55°С в течение 1 мин. 72°С в течение 2 мин; затем 72°С в течение 10 мин; затем пропитывание при 10°С.

Полный ПЦР-продукт подвергали электрофорезу на 1% агарозе с низкой точкой плавления (ВоегЫпдег Маппбет) и химерный фрагмент МРЬ-/а1рба11 приблизительно 2.4 т.п.н. выделяли с использованием набора для экстракции гелей О|ас.|шск™ (01адеп) согласно инструкциям изготовителя. Химерный

- 38 014417 фрагмент МРЬ^а1рйа11 расщепляли ЕсоВ1 (ВВЬ) и ХЬа1 (ВоегЫпдег МаппНепп) согласно инструкциям изготовителя. Весь продукт расщепления подвергали электрофорезу на 1% агарозе с низкой точкой плавления (ВоегЫпдег МаппНепп) и отщепленную химеру МРЬ^а1рйа11 выделяли с использованием набора для экстракции гелей О|ас.|шск™ (О1адеп) согласно инструкциям изготовителя. Полученную отщепленную химеру МРЬ^а1рйа11 встраивали в экспрессирующий вектор, как описано ниже.

Реципиентный экспрессирующий вектор ρΖΡ-5N расщепляли ЕсоВ1 (ВВЬ) и НтбШ (ВВЬ) согласно инструкциям изготовителя и очищали на геле, как описано выше. Этот векторный фрагмент объединяли с отщепленной ЕсоВ1 и ХЬа1 химерой МРЬ^а1рйа11, выделенной, как описано выше, и ХЬа1/НшбШлинкерным фрагментом в реакции лигирования. Лигирование проводили с лигазой Т4 (ВВЬ) при 15°С в течение ночи. Пробу лигирования подвергали электрофорезу в электрокомпетентных относительно ОН10В Е1ес!гоМАХ™ клетках Е.со11 (25 мкФ, 200 Ом, 2,3 В). Трансформанты высевали на чашки с ЬВ+ампициллин и отдельные колонии подвергали скринингу при помощи ПЦР для подтверждения химеры МРЬ^а1рйа11 с использованием ΖΟ7212 (8ЕО ΙΌ NО: 24) и 2С20097 (8ЕО ΙΌ NО: 27) с применением условий ПЦР, описанных выше.

Подтверждение последовательности химеры МРЬ^а1рйа11 выполняли при помощи анализов последовательности с использованием следующих праймеров: Ζί.’12700 (8ЕО ΙΌ NО: 28), ΖС5020 (8ЕО ΙΌ 29), ΖС6675 (8ЕО ΙΌ 30), ΖС7727 (8ЕО ΙΌ 31), ΖС8290 (8ЕО ΙΌ 32), ΖΟ19572 (8ЕО ΙΌ 15), ΖС6622 (8ЕО ΙΌ 33), ΖС7736 (8ЕО ΙΌ 34) и ΖС9273 (8ЕО ΙΌ 35). Вставка была приблизительно 2,4 т.п.н. и была полноразмерной.

Пример 5. Пролиферация на основе химеры МРЬ^а1рйа11 в ВАР3-тесте с использованием А1атаг В1ие.

A. Конструирование клеток ВаР3, экспрессирующих химеру МРЬ^а1рйа11.

ВаР3, интерлейкин-3-([к-3)-зависимую прелимфоидную клеточную линию, полученную из мышиного костного мозга (Ра1асюк апб 8!е1птеЫ, Се11 41:727-734, 1985; Маΐйеу-Ρ^еνο! е! а1., Мо1. Се11. Вю1. 6:4133-4135, 1986), поддерживали в полной среде (среде ВΡМI (1ВН Вюкаепсе Ыс., Ьепеха, К8), дополненной 10% инактивированной нагреванием фетальной телячьей сывороткой, 2 нг/мл мышиного ΙΌ-3 (тГЬ-3) (В & Ό, М1ппеаро11к, МЦ), 2 мМ Ь-д1и!аМах-1™ (С1Ьсо ВВЬ), 1 мМ пируватом натрия (С1Ьсо ВВЬ) и Р8№антибиотиками (С1Ьсо ВВЬ). Перед электрофорезом ДНК ρΖΡ-5N/МΡ^-ζа1ρНа11 (пример 4) получали и очищали с использованием набора 01адеп Мах1 Ргер кй (01адеп) согласно инструкциям изготовителя. Клетки ВаР3 для электропорации промывали один раз в среде ВΡМI и затем ресуспендировали в среде ВΡМI при плотности клеток 10⁷ клеток/мл. 1 мл ресуспендированных клеток ВаР3 смешивали с 30 мкг ДНК плазмиды ρΖΡ-5N/МΡ^-ζа1ρНа 11 и переносили в отдельные одноразовые камеры для электропорации (С1Ьсо ВВЬ). После 15-минутного инкубирования при комнатной температуре клетки подвергали двум последовательным электрошокам (800 МФ/300 В; 1180 МФ/300 В), подаваемым прибором для электропорации (СЕЬЬ-РОВАТОВ™; С1Ьсо ВВЬ). После 5 мин восстановления до нормы электропорированные клетки переносили в 50 мл полной среды и помещали в термостат на 15-24 ч (37°С, 5% СО₂). Затем эти клетки откручивали и ресуспендировали в 50 мл полной среды, содержащей Сепейсш™ (С1Ьсо) для отбора (500 мкг/мл С418) в колбу Т-162 для выделения С418-резистентного пула. Пулы трансфицированных клеток ВаР3, далее называемых клетками ВаР3/МРЬ^а1рйа11, анализировали на способность передачи сигнала, как описано ниже.

B. Тестирование способности передачи сигнала клеток ВаР3/МРЬ^а1рйа11 с использованием теста пролиферации с А1атаг В1ие.

Клетки ВаР3/МРЬ^а1рйа11 откручивали и промывали в полной среде, как описано выше, но без тХЬ-3 (далее называемой не содержащей тГЕ-3 средой). Клетки откручивали и промывали 3 раза для гарантии удаления тГЕ-3. Затем клетки считали в гемоцитометре. Клетки высевали в 96-луночный планшет при 5000 клеток/лунку в объеме 100 мкл/ лунку с использованием не содержащей тГЕ-3 среды.

Пролиферацию клеток ВаР3/МРЬ^а1рйа11 оценивали с использованием тромбопоэтина (ТРО), разведенного не содержащей шЕ-Л средой до концентраций 500, 250, 125, 62, 30, 15, 7,5, 3,75, 1,8, 0,9, 0,5 и 0,25 нг/мл. 100 мкл разведенного ТРО добавляли к клеткам ВаР3/МРЬ^а1рйа11. Общий объем теста равен 200 мкл. Негативные контроли оценивали параллельно с использованием только не содержащей 111^-3 среды, без добавления ТРО. Тест-планшеты инкубировали при 37°С, 5% СО₂ в течение 3 дней, после чего добавляли А1атаг В1ие (Асситеб, СЫсадо, ΙΌ) при 20 мкл/лунку. А1атаг В1ие дает флуорометрические показания на основе числа живых клеток и является, следовательно, прямым измерением пролиферации клеток в сравнении с негативным контролем. Планшеты опять инкубировали при 37°С, 5% СО₂ в течение 24 ч. Планшеты считывали на планшет-ридере Ртах™ (Мо1еси1аг Оетюек 8иппууа1е, СА) с использованием программы 8ойМах™ Рго при длинах волн 544 (возбуждение) и 590 (эмиссия).

Результаты подтвердили способность передачи сигнала внутриклеточной части ζа1ρНа11-рецеηтора. так как тромбопоэтин индуцировал пролиферацию, приблизительно в 10 раз более высокую, чем уровень фона, при 62 нг/мл и больших концентрациях.

Пример 6. Конструирование экспрессирующего вектора, экспрессирующего полноразмерный ζа1ρНа11.

- 39 014417

Полный ха1рка11-рецептор выделяли из плазмиды, содержащей кДНК /афкаИ-рецептора, при помощи ПЦР с использованием праймеров ΖΟ9905 (8ЕЦ ΙΌ NО: 36) и ΖΟ9906 (8ЕЦ ГО NО: 37).

Условия реакции были следующими; 95°С в течение 1 мин; 35 циклов при 95°С в течение 1 мин; 55°С в течение 1 мин, 72°С в течение 2 мин; затем 72°С в течение 10 мин; затем пропитывание при 10°С.

ПЦР-продукт подвергали электрофорезу на 1% агарозе с низкой точкой плавления (ВоегЫидег Маиикет) и кДНК ха1рка11 приблизительно 1,5 т.п.н. выделяли с использованием набора для экстракции гелей О|ас.|шск™ (Р1адеи) согласно инструкциям изготовителя.

Очищенную кДНК ха1рка11 расщепляли ВатН1 (ВоегЫидег Маипкекп) и ЕсоК1 (ВКЬ) согласно инструкциям изготовителя. Весь продукт расщепления подвергали электрофорезу на 1% агарозе с низкой точкой плавления (ВоегЫидег Маиикет) и очищали отщепленный фрагмент ха1рка11 с использованием набора для экстракции гелей О|ас.|шск согласно инструкциям изготовителя. Полученный отщепленный ха1рка11-фрагмент встраивали в экспрессирующий вектор, как описано ниже.

Реципиентный экспрессирующий вектор рΖР-5N расщепляли ВатН1 (ВоегЫидег Маиийет) и ЕсоК1 (ВКЬ) согласно инструкциям изготовителя и очищали на геле, как описано выше. Этот векторный фрагмент объединяли с отщепленным ВатН1 (ВоегЫидег МатФеки) и ЕсоК1 (ВКЬ) ха1рка11фрагментом, выделенным, как описано выше, в реакции лигирования. Лигирование проводили с лигазой Т4 (ВКЬ) при 15°С в течение ночи. Пробу лигирования подвергали электрофорезу в электрокомпетентных относительно ЭН10В Е1ес1гоМАХ™ клетках Е.сок (25 мкФ, 200 Ом, 2,3 В). Трансформанты высевали на чашки с ЬВ+ампициллин и отдельные колонии подвергали скринингу при помощи ПЦР для подтверждения последовательности ха1рка11 с использованием ΖΟ9905 (8ЕЦ ГО NО: 36) и Ζί’19906 (8ЕЦ ГО NО: 37) с применением условий ПЦР, описанных выше.

Подтверждение последовательности МРЬ-ха1рка11 выполняли при помощи анализов последовательности с использованием следующих праймеров ΖΕ12700 (8ЕЦ ΙΌ NО: 28), ΖС5020 (81Ь) ΙΌ ΝΦ 29), ΖС20114 (8ЕО ΙΌ Να 38), ΖΟ9459 (8ЕС) ΙΌ Να 12), ΖΟ9954 (8 ЕС) ΙΌ Να 39) и ΖС20116 (8ЕЦ ΙΌ NО: 40). Вставка была приблизительно 1,6 т.п.н. и была полноразмерной.

Пример 7. Пролиферация на основе ха1рка11 в ВАР3-тесте с использованием А1атаг В1ие.

А. Конструирование клеток ВаЕ3, экспрессирующих ха1рка11-рецептор.

Клетки ВаЕ3, экспрессирующие полноразмерный /афкаИ-рецептор, конструировали, как в примере 5А выше, с использованием 30 мкг экспрессирующего вектора ха1рка11, описанного в примере 6. Клетки ВаЕ3, экспрессирующие мРНК ха1рка11-рецептора, были названы ВаЕ3/ха1рка11. Эти клетки использовали для скрининга на активность ха1р11а1Е как описано в примерах 8 и 12.

Пример 8. Скрининг активности ха1рка11 с использованием клеток ВаЕ3/ха1рка11 при помощи теста пролиферации с А1атаг В1ие.

A. Источник первичных клеток обезьяны, используемый для тестирования на присутствие активности ха1рка11.

Кондиционированную среду от первичных клеток селезенки обезьяны использовали для тестирования на присутствие активности, как описано ниже. Клетки селезенки обезьяны активировали 5 нг/мл форбол-12-миристат-13-ацетата (ФМА) (Са1Ыоскет, 8аи О1едо, СА) и 0,5 мкг/мл иономицина™ (Са1Ыоскет) в течение 72 ч. Супернатант от этих стимулированных клеток селезенки обезьяны использовали для анализа пролиферации клеток ВаЕ3/ха1рка1Е как описано ниже.

B. Скрининг на активность ха1рка11 с использованием клеток ВаЕ3/ха1рка11 при помощи теста пролиферации с А1атаг В1ие.

Клетки ВаЕ3/ха1рка11 откручивали и промывали в не содержащей тГЬ-3 среде. Клетки откручивали и промывали 3 раза для гарантии удаления тГЬ-3. Затем клетки считали в гемоцитометре. Клетки высевали в 96-луночный планшет при 5000 клеток на лунку в объеме 100 мкл на лунку с использованием не содержащей тГО-3 среды.

Пролиферацию клеток ВаЕ3/ха1рка 11 оценивали с использованием кондиционированной среды от активированных клеток селезенки обезьяны (см. пример 8А), которая была разведена не содержащей тГО-3 средой до концентраций 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,5, 0,75 и 0,375%. 100 мкл разведенной кондиционированной среды добавляли к клеткам ВаЕ3/ха1рка11. Общий объем теста равен 200 мкл. Тестпланшеты инкубировали при 37°С, 5% СО₂ в течение 3 дней, после чего добавляли А1атаг В1ие (Асситеб, СЫсадо, ГО) при 20 мкл/лунку. Планшеты опять инкубировали при 37°С, 5% СО₂ в течение 24 ч. Планшеты считывали на планшет-ридере Етах™ (Мо1еси1аг Ое^зсез), как описано выше.

Результаты подтвердили пролиферативный ответ клеток ВаЕ3/ха1рка11 на фактор, присутствующий в активированных кондиционированных средах клеток селезенки обезьяны. Этот ответ согласно измерениям был приблизительно в 4 раза выше фона при концентрации 50%. Клетки ВаЕ3 дикого типа не пролиферировали в ответ на этот фактор, что указывает на то, что этот фактор является специфическим для ха1рка11-рецептора.

- 40 014417

С. Источник первичных клеток человека, используемый для выделения активности /а1рйа11.

По 100 мл крови брали от шести доноров. Кровь извлекали с использованием 10Х 10 мл вакуумных пробирок фаси1ашег), содержащих гепарин. Кровь объединяли от шести доноров (600 мл), разводили 1:1 в ЗФР и разделяли с использованием ЕкоП-Рацие® РЬИ8 (Рйагтааа Вюксй, Иррка1а, 8\уебеп). Выход выделенных первичных клеток человека после разделения на градиенте фиколла был равен 1,2х10⁹ клеток.

Клетки суспендировали в 9,6 мл буфера МАС8 (ЗФР, 0,5% ЭДТА, 2 мМ ЭДТА); 1,6 мл клеточной суспензии извлекали и добавляли 0,4 мл микрогранул СИ3 (М111епу1 Вю1ес. АиЬигп, СА). Смесь инкубировали в течение 15 мин при 4°С. Клетки, меченные гранулами СИ3, промывали 30 мл буфера МАС8 и затем ресуспендировали в 2 мл буфера МАС8.

Колонку У8+ (М11!епу1) готовили согласно инструкциям изготовителя. Затем колонку У8+ помещали в магнитное поле УапоМАС8™ (М111епу1). Колонку уравновешивали 5 мл буфера МАС8. Затем выделенные первичные клетки человека наносили на эту колонку. СИ3-негативным клеткам давали пройти через колонку. Колонку промывали 9 мл (3x3мл) буфера МАС8. Затем колонку удаляли из магнитного поля и помещали над пробиркой из Га1соп на 15 мл. СИ3+ клетки элюировали добавлением 5 мл буфера МАС8 на колонку и связавшиеся клетки вымывали с использованием поршня (плунжера), обеспечиваемого изготовителем. Инкубирование этих клеток с СП3-магнитными гранулами, промывки и стадии колонки У8+ (инкубирование-элюция), описанные выше, повторяли еще пять раз. Полученные СИ3+ фракции из шести разделений на колонке объединяли. Общий выход СГО3+ отобранных Т-клеток человека был равен 3х 10⁸ клеток.

Пробу объединенных СГО3+ отобранных Т-клеток человека брали для окрашивания и сортинга на клеточном сортере с возбуждением флуоресценции (ЕАС8) для оценки их чистоты. СИ3+ отобранные Т-клетки человека содержали 91% СИ3+ клеток.

СГО3+ отобранные Т-клетки человека активировали инкубированием в ΒРМI + 5% ФТС + ФМА 10 нг/мл и иномицине 0,5 мкг/мл (Са1Ыосйет) в течение 13 ч при 37°С. Супернатант от этих активированных СГО3+ отобранных Т-клеток человека тестировали на активность /а1рйа11, как описано ниже.

Ό. Тестирование супернатанта от активированных СИ3+ отобранных Т-клеток человека на /а1рйа11-активность с использованием клеток ВаЕ3®а1рйа11 и теста пролиферации с использованием А1атаг В1ие.

Клетки ВаЕ3®а1рйа11 откручивали и промывали в не содержащей тГО-3 среде. Клетки откручивали и промывали 3 раза для гарантии удаления тШ-3. Затем клетки считали в гемоцитометре. Клетки высевали в 96-луночный планшет при 5000 клеток/лунку в объеме 100 мкл/лунку с использованием не содержащей тШ-3 среды.

Пролиферацию клеток ВаЕ3®а1рйа 11 оценивали с использованием кондиционированной среды от активированных СГО3+ отобранных Т-клеток человека (см. пример 8С), разведенной не содержащей тШ-3 средой до концентраций 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,5, 0,75 и 0,375%. 100 мкл разведенной кондиционированной среды добавляли к клеткам ВаЕ3®а1рйа11. Общий объем теста равен 200 мкл. Тестпланшеты инкубировали и анализировали, как описано в примере 8В.

Результаты подтвердили пролиферативный ответ клеток ВаЕ3®а1рйа11 на фактор, присутствующий в активированной кондиционированной среде СГО3+ отобранных Т-клеток человека. Этот ответ согласно измерениям был приблизительно в 10 раз выше фона при концентрации 50%. Клетки ВаЕ3 дикого типа не пролиферировали в ответ на этот фактор, что указывает на то, что этот фактор является специфическим для /а1рйа11-рецептора.

Пример 9. Конструирование экспрессирующих векторов млекопитающих, которые экспрессируют растворимые рецепторы /а1рйа11: /а1рйа11СЕЕ, 7а1рЬа11СЕЬ6, 7а1рЬа11СШ8 и /а1рЬа11-Ес-4.

А. Конструирование экспрессирующего вектора млекопитающих, содержащего /а1рЕа11СЕЕ, /а1рЬа11СЕЕО, 7а1рЬа11СШ8.

Получали экспрессирующий вектор для экспрессии растворимого внеклеточного домена полипептида /а1рйа11, рС42а1рЬ11СЕЕ, причем эта конструкция предназначена для экспрессии полипептида /а1рйа11, содержащего предсказанный инициирующий метионин и укороченного вблизи предсказанного трансмембранного домена, имеющего С-концевую О1и-О1и-метку (8ЕО ГО N0: 41).

ПЦР-генерируемый фрагмент ДНК /а1рйа11 700 п.н. создавали с использованием ΖΕ19931 (8ЕО ГО N0: 42) и ΖΟ9932 (8ЕО ГО N0: 43) в качестве ПЦР-праймеров для добавления сайтов рестрикции Акр718 и ВатНЕ Плазмиду, содержащую кДНК /а1рйа 11-рецептора, использовали в качестве матрицы. ПЦР-амплификацию фрагмента /а1рйа11 проводили следующим образом: 25 циклов при 94°С в течение 0,5 мин; 5 циклов при 94°С в течение 10 с, 50°С в течение 30 с, 68°С в течение 45 с; затем выдерживание при 4°С. Реакцию очищали экстракцией смесью хлороформ/фенол и осаждением изопропанолом и расщепляли Акр718 и ВатН (01Ьсо ВКЕ) согласно инструкциям изготовителя. Полосу предсказанного размера, 700 п.н., визуализировали при помощи электрофореза на 1% агарозном геле, вырезали и эту ДНК очищали с использованием системы очистки О|аехП^т™ (01адеп) согласно инструкциям изготовителя.

- 41 014417

Вырезанную ДНК субклонировали в плазмиду рС4ЕЕ, которая была разрезана ВатН1 и Акр718. Экспрессирующий вектор рС4ха1р1111СЕЕ использует сигнальный пептид нативного ха1рНа11 и присоединяет С1и-С1и-метку (8Е0 ΙΌ N0: 41) к С-концу полинуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид ха1рНаН. Плазмида рС4ЕЕ является экспрессирующим вектором млекопитающих, содержащим экспрессионную кассету, имеющую мышиный промотор металлотионеина-1, множественные сайты рестрикции для встраивания кодирующих последовательностей, стоп-кодон и терминатор гормона роста человека. Эта плазмида имеет также начало репликации Е. сой, экспрессионную единицу селектируемых маркеров млекопитающих, имеющую промотор, энхансер и начало репликации 8У40, ген ЭНЕИ и терминатор 8У40.

Приблизительно 30 нг рестрикционно отщепленной ха1рНа 11 -вставки и приблизительно 12 нг расщепленного вектора лигировали в течение ночи при 16°С. 1 мкл каждой реакции лигирования независимо электропорировали в ОН10В-компетентные клетки (С1Ьсо ВКЬ, СаййегкЬигд, МО) согласно инструкциям изготовителя, высевали на ЬВ-планшеты, содержащие 50 мг/мл ампициллина, и инкубировали в течение ночи. Колонии подвергали скринингу при помощи рестрикционного анализа ДНК, полученных из 2 мл жидких культур индивидуальных колоний. Последовательность вставки положительных клонов подтверждали анализом последовательности. Крупномасштабное получение плазмиды проводили с использованием набора 0ΙΛ6ΕΝ® Мах1 ргер кй (01адеп) согласно инструкциям изготовителя.

Тот же самый процесс использовали для получения растворимых рецепторов ха1рНа11 с С-концевой Ηίκ-меткой, состоящей из 6 остатков Ηίκ подряд, и С-концевой ЕЬАС-меткой (8Е0 ΙΌ N0: 49), 7а1рйа11СЕЬАС. Для конструирования этих конструкций вышеуказанный вектор имеет либо Ηίκ, либо ЕЬА6®-метку вместо д1и-д1и-метки (8Е0 ΙΌ N0: 41).

В. Экспрессионная конструкция млекопитающих для растворимого рецептора ха1рйа 11, /а1рйа11Ес-4.

Экспрессионную плазмиду, содержащую весь полинуклеотид или его часть, кодирующую /а1рйа11, конструировали гомологичной рекомбинацией. Фрагмент кДНК ха1рйа11 выделяли при помощи ПЦР, которая включает в себя полинуклеотидную последовательность из внеклеточного домена рецептора ха1р11аН. Два праймера использовали в получении этого фрагмента ха1рйа11:

(1) каждый из праймеров для ПЦР включает в себя от 5'- к 3'-концу: 40 п.н фланкирующей последовательности вектора (5' от вставки) и 17 п.н., соответствующих 5'-концу внеклеточного домена ха1рйа11 (8ЕС) ΙΌ N0: 44); и (2) 40 п.н. 5'-конца полинуклеотидной последовательности Ес-4 (8Е0 ΙΌ N0: 45) и 17 п.н., соответствующих 3'-концу внеклеточного домена ха1рйа11 (8Е0 ΙΌ N0: 46).

Фрагмент Ес-4 для слияния с ха1р11а 11 генерировали при помощи ПЦР сходным образом. Двумя праймерами в получении фрагмента Ес-4 были:

(1) 5'-праймер, состоящий из 40 п.н. последовательности из 3'-конца внеклеточного домена ха1рйа11 и 17 п.н. 5'-конца Ес-4 (8Е0 ΙΌ N0: 47), и (2) 3'-праймер, состоящий из 40 п.н. векторной последовательности (3' от вставки) и 17 п.н. 3'-конца Ес-4 (8ЕС) ΙΌ N0: 48).

ПЦР-амплификацию каждой из реакций, описанных выше, проводили следующим образом: один цикл при 94°С в течение 2 мин; 25 циклов при 94°С в течение 30 с, 60°С в течение 30 с, 72°С в течение 1 мин; один цикл при 72°С в течение 5 мин; с последующим выдерживанием при 4°С. 10 мкл из 100 мкл ПЦР-реакции подвергали электрофорезу на 0,8% ЬМР-агарозном геле (8еар1ас.|ие СТО) с 1х ТВЕ-буфером для анализа. Остальные 90 мкл ПЦР-реакции осаждали добавлением 5 мкл 1 М №С1 и 250 мкл абсолютного этанола. Используемый экспрессирующий вектор получали из плазмиды рС2К199 (депонированный в Атепсап Туре СиЙиге Сойесйоп, 10801 Ищуегкйу Вои1еуагб, Мапаккак, УА 201102209 и названный №. 98668) и разрезали 8та1 (ВКЬ). Экспрессирующий вектор был произведен из плазмиды рС2К199 и представляет собой экспрессирующий вектор млекопитающих, содержащий экспрессионную кассету, имеющую немедленно ранний промотор СМУ, консенсусный интрон из вариабельной области локуса тяжелой цепи мышиного иммуноглобулина, множественные сайты рестрикции для встраивания кодирующих последовательностей, стоп-кодон и терминатор гормона роста человека. Этот экспрессирующий вектор имеет также начало репликации Е.сой, экспрессионную единицу селектируемых маркеров млекопитающих, имеющую промотор, энхансер и начало репликации 8У40, ген ЭНЕИ и терминатор 8У40. Этот используемый экспрессирующий вектор конструировали из рС2К199 заменой промотора металлотионеина немедленно ранним промотором СМУ.

100 мкл компетентных дрожжевых клеток (8.сегеу1К1ае) объединяли с 10 мкл, содержащими приблизительно 1 мкг каждой из вставок ха1р11а 11 и Ес-4 и 100 нг расщепленного 8та1 (БРЬ) экспрессирующего вектора, и переносили в кювету для электропорации 0,2 см. Смеси дрожжи/ДНК подвергали электрошокам при 0,75 кВ (5 кВ/см), неопределенном числе Ом, 25 мкФ. В каждую кювету добавляли 600 мкл 1,2 М сорбита и дрожжи высевали в двух аликвотах по 300 мкл на две чашки иИА-Ό и инкубировали при 30°С.

- 42 014417

Спустя приблизительно 48 ч Ига+ дрожжевые трансформанты из отдельной чашки ресуспендировали в 1 мл Н₂О и откручивали быстро для осаждения дрожжевых клеток. Клеточный осадок ресуспендировали в 1 мл лизисного буфера (2% Тритон Х-100, 1% ДСН, 100 мМ №С1, 10 мМ Трис, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА) 500 мкл лизисной смеси добавляли в пробирку Эппендорфа, содержащую 300 мкл промытых кислотой стеклянных гранул и 200 мкл смеси фенол/хлороформ, встряхивали на вортексе 2 или 3 раза с интервалами 1 мин, с последующим 5-минутным откручиванием в центрифуге Эппендорфа при максимальной скорости. 300 мкл водной фазы переносили в свежую пробирку и ДНК осаждали 600 мкл этанола (Е!0Н) с последующим центрифугированием в течение 10 мин при 4°С. Осадок ДНК ресуспендировали в 100 мкл Н2О.

Трансформацию электрокомпетентных клеток Е. сой (ОН10В, С1Ьсо ВКЬ) проводят с 0,5-2,0 мл преп-дрожжевой ДНК и 40 мкл клеток ЭН10В. Клетки подвергали электроимпульсам при 2,0 кВ, 25 мФ и 400 Ом. После электропорации 1 мл 80С (2% Бактотриптон (Ойсо, ОеКоИ, М1), 0,5% дрожжевой экстракт (Ойсо), 10 мМ №С1, 2,5 мМ КС1, 10 мМ МдС1₂, 10 мМ Мд80₄, 20 мМ глюкоза) высевали в аликвотах 250 мкл на четыре ЬВ АМР чашки (ЬВ-бульон (Ьеппох), 1,8% Бактоагар (ОИсо), 100 мг/л ампициллина).

Индивидуальные клоны, улавливающие правильную экспрессионную конструкцию для ха1рНа11Ес-4, идентифицировали рестрикционным расщеплением для подтверждения присутствия вставки ха1рНа11-Ес-4 и для подтверждения, что различные последовательности ДНК были корректно соединены друг с другом. Вставку положительных клонов подвергали анализу последовательности. При крупномасштабном получении плазмидную ДНК выделяют с использованием набора О!АСЕН Мах1 к1! (01адеп) согласно инструкциям изготовителя.

Пример 10. Трансфекция и экспрессия растворимых рецепторных полипептидов ха1рНа11.

Клетки ВНК 570 (АТСС №. СКЬ-10314), пассаж 27, высевали в чашки при 1,2х10⁶ клеток/лунку (6-луночная чашка) в 800 мкл бессывороточной (БС) среды ОМЕМ (ОМЕМ, 61Ьсо/ВВЬ Н1дЬ С1исоке) (СШС0 ВВЬ, СаДЬегкЬигд, МО). Эти клетки трансфицировали экспрессионными плазмидами, содержащими /афЬаНСЕЕ/СЕЬб/СНК, описанными выше (см. пример 9), с использованием Липофектина™ (С1Ьсо ВВЬ) в бессывороточной среде ЭМЕМ. 3 мкг ха1рНа11/СЕЕС/СН!8 отдельно разводили в пробирки на 1,5 мл до общего объема 100 мкл БС-ЭМЕМ. В отдельных пробирках 15 мкл Липофектина™ (С1Ьсо ВВЬ) смешивали с 100 мкл БС-ЭМЕМ. Смесь с Липофектином™ инкубировали при комнатной температуре в течение 30-45 мин, затем добавляли смесь ДНК и давали инкубироваться приблизительно 10-15 мин при комнатной температуре.

Всю смесь ДНК Липофектин™ добавляли к посеянным клеткам и равномерно распределяли на них. Чашки инкубировали при 37°С в течение приблизительно 5 ч, затем переносили в отдельные чашки МАXI 150 мм в конечном объеме 30 мл ЭМЕМ/5% фетальная телячья сыворотка (ФТС) (Нус1опе, Ьодап, ИТ). Чашки инкубировали при 37°С, 5% СО₂ в течение ночи и смесь ДНК:Липофектин™ заменяли свежей селективной средой (5% ФТС/ЭМЕМ с 1 мкМ метотрексата (МТХ) на следующий день.

Приблизительно при 10-12 днях после трансфекции чашки промывали 10 мл БС-ЭМЕМ. Промывочную среду отсасывали и заменяли 7,25 мл бессывороточной ОМЕМ. Затем стерильные тефлоновые сетки (8рес!гит МеДюа1 ШДикЕтек, Ьок Апде1ек, СА), предварительно пропитанные в БС-ЭМЕМ, помещали на колонии клональных клеток. Затем на эту сетку помещали стерильный нитроцеллюлозный фильтр, предварительно пропитанный в БС-ЭМЕМ. Метки для ориентации на нитроцеллюлозе переносили на чашку с культурой. Затем эти чашки инкубировали в течение 5-6 ч в термостате при 37°С, 5% СО2.

После инкубирования фильтры/сетки удаляли и среду отсасывали и заменяли средой 5% ФТС/ЭМЕМ с 1 мкМ МТХ. Затем фильтры блокировали в 10% нежирном сухом молоке/буфере Вестерн А (Вестерн А: 50 мМ Трис, рН 7,4, 5 мМ ЭДТА, 0,05% №-40, 150 мМ №С1 и 0,25% желатин) в течение 15 мин при комнатной температуре на ротационном шейкере. Затем фильтры инкубировали с конъюгатами антитело против С1и, С1и, антитело против ЕБАС® или антитело против Ш8-НКР (пероксидаза хрена) соответственно в 2,5% нежирном сухом молоке/буфере Вестерн А в течение 1 ч при комнатной температуре на ротационном шейкере. Затем фильтры промывали три раза при комнатной температуре буфером Вестерн А в течение 5-10 мин на одну промывку. Фильтры проявляли реагентом и1!га ЕСЬ (АтегкЬат Согр., Аг1тд1оп Не1дЬ!к, ГО) в соответствии с указаниями изготовителя и визуализировали на приборе для получения изображений ЬитЫтадег (ВосЬе Согр.).

Положительные экспрессирующие клональные колонии механически выскребали в 12-луночные чашки в 1 мл 5% ФТС/ЭМЕМ с 5 мкМ МТХ, затем выращивали до конфлюэнтности. Затем пробы кондиционированных сред тестировали на уровни экспрессии при помощи электрофореза в ДСН-ПААГ и вестерн-анализа. Три наиболее сильно экспрессирующих клона для каждой конструкции выскребали; два из трех замораживали в качестве резерва, а один размножали для тестирования на микоплазму и крупномасштабного посева в клеточной фабрике.

- 43 014417

В. Экспрессия растворимого рецептора ха1рЬа11-Ес-4 в клетках млекопитающих.

Клетки ВНК 570 (АТСС №. СВЬ-10314) высевали в чашки 10 см для культуры ткани и давали им расти до приблизительно 50-70% конфлюэнтности в течение ночи при 37°С, 5% СО₂, в среде ЭМЕМ/ФТС (ОМЕМ, С1Ьсо/ВВЬ Н1дЬ С1исоке (С1ВС0 ВВЬ, СаЬЬегкЬигд, МО), 5% фетальной телячьей сыворотке (Нус1опе, Ьодап, ИТ), 1 мМ Ь-глутамине (ДВН Вюкшепсек, Ьепеха, КЗ), 1 мМ пирувате натрия (С1Ьсо ВВЬ)). Затем клетки трансфицировали плазмидой, содержащей ха1рЬа11-Ес-4 (см. пример 9), с использованием Липофектамина™ (С1Ьсо ВВЬ) в бессывороточной среде (ОМЕМ, 10 мг/мл трансферрина, 5 мг/мл инсулина, 2 мг/мл фетуина, 1% Ь-глутамина и 1% пирувата натрия). Плазмиду, содержащую /а1рЬа11-Ес-4, разводили в пробирках на 15 мл до общего конечного объема 640 мл БС-средой. 35 мл Липофектамина™ (С1Ьсо ВВЬ), смешивали с 605 мл БС-среды. Эту смесь с Липофектамином™ добавляли к смеси ДНК и давали инкубироваться в течение приблизительно 30 мин при комнатной температуре. 5 мл БС-среды добавляли к смеси ДНК: Липофектамин™. Клетки промывали один раз 5 мл БС-среды, отсасывали и добавляли смесь ДНК: Липофектамин™. Клетки инкубировали при 37°С в течение 5 ч, затем в каждую чашку добавляли 6,4 мл среды ЭМЕМ/10% ФТС, 1% Р8К Чашки инкубировали при 37°С в течение ночи и смесь ДНК Липофектамин™ заменяли свежей средой 5% ФТС/ЭМЕМ на следующий день. В день 2 после трансфекции клетки разделяли в селективную среду (среду ЭМЕМ/ФТС, описанную выше с добавлением 1 мМ метотрексата (81дта СЬетюа1 Со., 8!. Ьошк, МО)) в чашках 150 мм при разведении 1:10, 1:20 и 1:50. Среду на этих клетках заменяли свежей селективной средой в день 5 после трансфекции. Приблизительно в день 10 после трансфекции две культуральные чашки 150 мм с устойчивыми к метотрексату колониями из каждой трансфекции трипсинизировали и клетки объединяли и высевали в колбу Т-162 и переносили в крупномасштабную культуру.

Пример 11. Очистка растворимых рецепторов ха1рЬа11 из клеток ВНК 570.

А. Очистка полипептида ха1рЬа11СЕЕ из ВНК570.

Если нет других указаний, все операции проводили при 4°С. Следующую процедуру использовали для очистки полипептида ха1рЬа1Ь содержащего С-концевые метки С1и-С1и (ЕЕ). 30 л кондиционированной среды из клеточной фабрики концентрировали до 1,6 л при помощи спирального картриджа Атюоп 810Υ3 на РгоИих А30. Раствор протеазного ингибитора добавляли к концентрированным 1,6 л кондиционированной среды клеточной фабрики от трансфицированных клеток ВНК 570 (см. пример 10) до конечных концентраций 2,5 мМ этилендиаминотетрауксусной кислоты (ЭДТА, 81дта СЬетюа1 Со. 8!. Ьошк, М0), 0,003 мМ лейпептина (ВоеЬппдег МатЬет, 1пб1апаро11к, ΙΝ), 0,001 мМ пепстатина (ВоеЬппдег МаппЬет) и 0,4 мМ РеГаЬ1ос (ВоеЬппдег МаппЬет). Пробы извлекали для анализа и общий объем замораживали при -80°С до начала очистки. Концентрации общего целевого белка концентрированной кондиционированной среды клеточной фабрики определяли при помощи электрофореза в ДСНПААГ и вестерн-блот-анализа с антителами против ЕЕ, конъюгированными с НВР (пероксидазой хрена).

100 мл субстрата для колонки анти-ЕЕ-С-8ерЬагоке (приготовленной, как описано ниже) выливали в стеклянную колонку ^а!егк АР-5, 5x10 см. Колонку упаковывали проточно и уравновешивали на ВюСаб 8рпп! (Рег8ербуе Вю8ук!етк, ЕгатшдЬат, МА) забуференным фосфатом солевым раствором (ЗФР) рН 7,4. Концентрированную кондиционированную среду клеточной фабрики оттаивали, стерильно фильтровали с фильтром 0,2 мкм, рН доводили до 7,4, затем наносили на колонку в течение ночи со скоростью тока 1 мл/мин. Колонку промывали 10 колоночными объемами (КО) зафуференного фосфатом солевого раствора (ЗФР, рН 7,4), затем элюировали с подачей элюента через пробку 200 мл ЗФР (рН 6,0), содержащего 0,5 мг/мл ЕЕ-пептида (Апакрес, 8ап 1оке, СА), при скорости тока 5 мл/мин Используемый ЕЕ-пептид имеет последовательность ЕΥΜРΜЕ (8ЕО ΙΌ Ν0 41). Колонку промывали 10 колоночными объемами ЗФР, затем элюировали 5 колоночными объемами 0,2 М глицина, рН 3,0 рН элюируемой глицином колонки доводили до 7,0 2 колоночными объемами 5Х ЗФР, затем уравновешиали в ЗФР (рН 7,4) Фракции по 5 мл собирали на протяжении всей элюционной хроматографии и поглощение при 280 и 215 нм подвергали мониторингу, проходящие через колонку и промывочные пулы также сохраняли и анализировали. Фракции пика элюции ЕЕ-полипептида анализировали на целевой белок электрофорезом в ДСН-ПААГ с окрашиванием серебром и вестерн-блоттингом с конъюгированным антителом анти-ЕЕ-НВР. Представляющие интерес фракции элюции полипептида объединяли и концентрировали с 60 до 5,0 мл с использованием центрифужного концентратора с мембраной, отсекающей молекулярную массу 10000 Да (МИЬроге, ВебГогб, МА), согласно инструкциям изготовителя.

Для отделения ха1рЬа11СЕЕ от других соочищающихся белков концентрированные слитые фракции элюции полипептида подвергали очистке на Р0В08 НО-50 (сильной анионообменной колонке из Рег8ербуе Вю8ук!етк, ЕгаттдЬат, МА) при рН 8,0. Колонку 1,0х6,0 см заливали и проточно упаковывали на ВюСаб 8рпп!. Колонку загружали противоионом и затем уравновешивали в 20 мМ Трис рН 8,0 (трис-(гидроксиметиламинометан)). Пробу разводили 1:13 (для уменьшения ионной силы ЗФР), затем наносили на колонку Р0В08 НО при скорости тока 5 мл/мин. Колонку промывали 10 колоночными объемами 20 мМ Трис рН 8,0, затем элюировали 40 колоночными объемами градиента 20 мМ Трис/1 М хлорид натрия (№С1) при скорости тока 10 мл/мин. Фракции по 1,5 мл собирали на протяжении всей хроматографии и поглощение при 280 и 215 нм подвергали мониторингу. Фракции пика элюции анализирова

- 44 014417 ли электрофорезом в ДСН-ПААГ с окрашиванием серебром. Представляющие интерес фракции объединяли и концентрировали до 1,5-2,0 мл с использованием центрифужного концентратора с мембраной, отсекающей молекулярную массу 10000 Да (МЬЬроге, ВебГогб, МА), согласно инструкциям изготовителя.

Для отделения полипептида /а1рЬа11СЕЕ от свободного пептида ЕЕ и любых примесных соочищающихся белков объединенные концентрированные фракции подвергали хроматографии на колонке 1,5x90 см 8ерЬабех 8200 (РЬагтааа, Р1кса!атау, N1), уравновешенной и загруженной в ЗФР при скорости тока 1,0 мл/мин при помощи ВюСаб 8рпп!. Фракции по 1,5 мл собирали на протяжении всей хроматографии и поглощение при 280 и 215 нм подвергали мониторингу. Фракции пика элюции характеризовали при помощи электрофореза в ДСН-ПААГ с окрашиванием серебром и объединяли только наиболее чистые фракции. Этот материал представлял очищенный полипептид 7а1рЬа11СЕЕ.

Этот очищенный материал подвергали наконец очистке на колонке 4 мл АсйС1еап Е!ох (8!егодепе) для удаления любых оставшихся эндотоксинов. Пробу пропускали через уравновешенную ЗФР колонку под действием силы тяжести 4 раза, затем колонку промывали один раз 3 мл ЗФР и эту промывку объединяли с очищенной пробой. Затем этот материал стерильно фильтровали (0,2 мкм) и хранили при -80°С до приготовления аликвот.

На вестерн-блотированных, окрашенных Кумасси синим и серебром гелях электрофореза в ДСН-ПААГ полипептид /а1рЬа11СЕЕ был одной основной полосой со средней молекулярной массой 50000 Да. Подвижность этой полосы была одинаковой на восстанавливающем и на невосстанавливающем гелях.

Концентрацию белка очищенного материала определяли согласно анализу БСА (Р1егсе, КоскГогб) и белок делили на аликвоты и хранили при -80°С в соответствии с обычными процедурами авторов изобретения. На [ЕР-гелях (изоэлектрическое фокусирование) белок перемещался с ΡΙ менее 4,5. Концентрация полипептида /а1рЬа11СЕЕ была 1,0 мг/мл.

Очищенный полипептид 7а1рЬа11СЕЕ готовили для инъекции в кроликов и отсылали в К & К КекеагсЬ апб ^еνе1ορтеη! (81апетооб, \УА) для получения антител. Кроликов инъецировали для получения сыворотки против 1и.^а1р11а-СЕЕ-ВНК (см. пример 15).

Для получения анти-ЕЕ-сефарозы объем слоя 100 мл протеин С-сефарозы (РЬагташа, Р1кса!а^ау, N1) промывали 3 раза 100 мл ЗФР, содержащего 0,02% азида натрия, с использованием фильтрующего элемента 0,45 мкмн Nа1деηе на 500 мл. Гель промывали 6,0 объемами 200 мМ триэтаноламина, рН 8,2 (ТЭА, 81дта, 8!. Бошк, МО) и добавляли равный объем раствора антител против ЕЕ, содержащего 900 мг антитела. После инкубирования в течение ночи при 4°С несвязавшееся антитело удаляли промыванием смолы 5 объемами 200 мМ ТЭА, как описано выше. Смолу ресуспендировали в 2 объемах ТЭА, переносили в подходящий резервуар и добавляли диметилпимилимидат-2НС1 (Р1егсе, КоскГогб, ЬЬ), растворенный в ТЭА, до конечной концентрации 36 мг/мл рго!ет С-8ерЬагоке-геля. Гель качали при комнатной температуре в течение 45 мин и жидкость удаляли при помощи фильтрующего элемента, как описано выше. Затем неспецифические сайты на этом геле блокировали инкубированием в течение 10 мин при комнатной температуре с 5 объемами 20 мМ этаноламина в 200 мМ ТЭА. Затем гель промывали 5 объемами ЗФР, содержащего 0,02% азида натрия, и хранили в этом растворе при 4°С.

В. Очистка полипептида /а1рЬа11СРБАС из ВНК 570.

Если нет других указаний, все операции проводили при 4°С. Следующую процедуру использовали для очистки полипептида /а1рЬа11, содержащего С-концевые метки ЕЬАС® (РБС) (81дта-А1бпсЬ Со.). 30 л кондиционированной среды из клеточной фабрики концентрировали до 1,7 л при помощи спирального картриджа Атюоп 810Υ3 на РгоР1их А30. Раствор протеазного ингибитора добавляли к концентрированным 1,7 л кондиционированной среды клеточной фабрики от трансфицированных клеток ВНК 570 (см. пример 10) до конечных концентраций 2,5 мМ этилендиаминотетрауксусной кислоты (ЭДТА, 81дта С11ет1са1 Со. 8!. Ьошк, М0), 0,003 мМ лейпептина (ВоеЬппдег МаппЬеш, Ыбзапарокк, Ш), 0,001 мМ пепстатина (ВоеЬппдег МаппЬет) и 0,4 мМ РеГаЬ1ос (ВоеЬппдег МаппЬеш). Пробы брали для анализа и общий объем замораживали при -80°С до начала очистки. Концентрации общего целевого белка кондиционированной среды клеточной фабрики определяли при помощи электрофореза в ДСН-ПААГ и вестернблот-анализа с антителами против ЕЬАС® (Кобак), конъюгированными с НКР (пероксидазой хрена). Колонку 125 мл анти-РБАС® М2-агарозного аффинного геля (8ЮМА-А1бпсЬ Со.) выливали в стеклянную колонку ^а!егк АР-5,5х10 см. Колонку упаковывали проточно и уравновешивали на ВюСаб 8рпп! (Рег8ерЖе Вю8ук!етк, РгатшдЬат, МА) забуференным фосфатом солевым раствором (ЗФР) рН 7,4. Концентрированную кондиционированную среду клеточной фабрики оттаивали, стерильно фильтровали с фильтром 0,2 мкм, рН доводили до 7,4, затем наносили на колонку в течение ночи со скоростью тока 1 мл/мин. Колонку промывали 10 колоночными объемами зафуференного фосфатом солевого раствора (ЗФР, рН 7,4), затем элюировали с подачей элюента через пробку 250 мл ЗФР (рН 6,0), содержащего 0,5 мг/мл РБАС ® (81дта-А1бпсЬ Со.) пептида, при скорости тока 5 мл/мин. Используемый РБАС®пептид имеет последовательность ΌΥΙ<ΌΌΌΌΙ< (8ЕР ΙΌ N0: 49). Колонку промывали 10 колоночными объемами ЗФР, затем элюировали 5 колоночными объемами 0,2 М глицина, рН 3,0. рН элюируемой глицином колонки доводили до 7,0 2 колоночными объемами 5Х ЗФР, затем уравновешивали в ЗФР (рН

- 45 014417

7,4). Фракции по 5 мл собирали на протяжении всей элюционной хроматографии и поглощение при 280 и 2ΐ5 нм подвергали мониторингу; проходящие через колонку и промывочные пулы также сохраняли и анализировали. Фракции пика элюции РЬАС®-полипептида анализировали на целевой белок электрофорезом в ДСН-ПААГ с окрашиванием серебром и вестерн-блоттингом с конъюгированным антителом анти-РЬА6®-НКР.

Представляющие интерес фракции элюции полипептида объединяли и концентрировали с 80л до ΐ2 мл с использованием центрифужного концентратора с мембраной, отсекающей молекулярную массу 10000 Да (М1Шроге, ВебГогб, МА), согласно инструкциям изготовителя.

Для отделения 7а1рка11СРЬС от других соочищающихся белков слитые фракции элюции полипептида подвергали очистке на Р0К08 НО-50 (сильной анионообменной колонке из Рег8ерйуе Вю8у®1ет®, Ргаттдкат, МА) при рН 8,0. Колонку 1,0х6,0 см заливали и проточно упаковывали на ВюСаб 8рпп1. Колонку загружали противоионом и затем уравновешивали в 20 мМ Трис рН 8,0 (трис(гидроксиметиламинометан)). Пробу разводили 1:13 (для уменьшения ионной силы ЗФР), затем наносили на колонку Р0К08 НО-50 при скорости тока 5 мл/мин. Колонку промывали 10 колоночными объемами 20 мМ Трис рН 8,0, затем элюировали 40 колоночными объемами градиента 20 мМ Трис/1 М хлорид натрия (№С1) при скорости тока 10 мл/мин. Фракции по 1,5 мл собирали на протяжении всей хроматографии и поглощение при 280 и 2ΐ5 нм подвергали мониторингу. Фракции пика элюции анализировали электрофорезом в ДСН-ПААГ с окрашиванием серебром. Представляющие интерес фракции объединяли и концентрировали до 1,5-2,0 мл с использованием центрифужного концентратора с мембраной, отсекающей молекулярную массу 10000 Да (М1Шроге, ВебГогб, МА), согласно инструкциям изготовителя.

Для отделения полипептида 7а1рка11СРЬС от свободного пептида РЬАС® и любых примесных соочищающихся белков, объединенные концентрированные фракции подвергали хроматографии на колонке 1,5x90 см 8еркасгуе 8200 (Ркагтааа, Р1®са1а^ау, N1), уравновешенной и загруженной в ЗФР при скорости тока 1,0 мл/мин при помощи ВюСаб 8рпп1. Фракции по 1,5 мл собирали на протяжении всей хроматографии и поглощение при 280 и 2ΐ5 нм подвергали мониторингу. Фракции пика элюции характеризовали при помощи электрофореза в ДСН-ПААГ с окрашиванием серебром и объединяли только наиболее чистые фракции. Этот материал представлял очищенный полипептид 7а1рка11СРЬС.

Этот очищенный материал подвергали наконец очистке на колонке 4 мл АсйС1еап ЕЮх (81егодепе) для удаления любых оставшихся эндотоксинов. Пробу пропускали через уравновешенную ЗФР колонку под действием силы тяжести 4 раза, затем колонку промывали один раз 3 мл ЗФР, и эту промывку объединяли с очищенной пробой. Затем этот материал стерильно фильтровали (0,2 мкм) и хранили при -80°С до приготовления аликвот.

На вестерн-блотированных, окрашенных Кумасси синим и серебром гелях электрофореза в ДСН-ПААГ полипептид 7а1рка11СРЬС был одной основной полосой со средней молекулярной массой 50000 Да. Подвижность этой полосы была одинаковой на восстанавливающем и на невосстанавливающем гелях.

Концентрацию белка очищенного материала определяли согласно анализу БСА (Р1егсе, КоскГогб, ГЬ) и белок делили на аликвоты и хранили при -80°С в соответствии с обычными процедурами авторов изобретения. На ШР-гелях (изоэлектрическое фокусирование) белок перемещался с РI менее 4,5. Концентрация полипептида 7а1рка11СРЬС была 1,2 мг/мл.

С. Очистка полипептида 7а1рка11-Рс-4 из трансфицированных клеток ВНК 570.

Если нет других указаний, все операции проводили при 4°С. Следующую процедуру использовали для очистки полипептида 7а1рка11, содержащего С-концевое слияние с фС/Ес человека (7а1рка11-Рс-4; примеры 8 и 9). 12000 мл кондиционированной среды от клеток ВНК 570, трансфицированных 7а1рка11Рс-4 (пример 10), фильтровали через стерилизующий фильтр 0,2 мм и затем дополняли раствором протеазных ингибиторов до конечных концентраций 0,001 мМ лейпептина (Воейппдег Маппйет, ЫбхапароН®, ЕЫ), 0,001 мМ пепстатина (Воейппдег Маппкепп) и 0,4 мМ РеГаЬ1ос (Воейппдег Маппйет). Протеин 6-сефарозу (объем слоя 6 мл, Ркагтааа Вю1еск) упаковывали и промывали 500 мл ЗФР (61Ьсо ВКЕ).

Дополненную кондиционированную среду пропускали через колонку при скорости тока 10 мл/мин с последующим промыванием 1000 мл ЗФР (ВКЕ)/61Ьсо). Полипептид 7а1рка11-Рс-4 элюировали из колонки 0,1 М глицином рН 3,5 и фракции по 2 мл собирали непосредственно в 0,2 мл 2 М Триса рН 8,0 для доведения конечного рН до 7,0 в этих фракциях.

Элюированные фракции характеризовали при помощи электрофореза в ДСН-ПААГ и вестернблоттинга с антителами против Рс человека (Атег®кат). Вестерн-блот-анализ гелей восстанавливающего электрофореза в ДСН-ПААГ выявил иммунореактивный белок 80000 кДа во фракциях 2-10. Окрашенные серебром гели электрофореза в ДСН-ПААГ также выявили полипептид 7а1рка11-Рс-4 80000 кДа во фракциях 2-10. Фракции 2-10 объединяли.

Концентрацию белка объединенных фракций определяли согласно анализу БСА (Р1егсе, КоскГогб, Ш) и материал делили на аликвоты и хранили при -80°С в соответствии с обычными процедурами заявителей. Концентрация белка объединенных фракций была 0,26 мг/мл.

- 46 014417

Пример 12. Тест с использованием растворимых рецепторов /а1рка11СЕЕ, ха1р6а11СРЬС и (мутантного) растворимого рецептора ха1р11а11-Ес-4 в конкурентном ингибиторном анализе.

Клетки ВаЕ3/ха1р11а11 откручивали и промывали в не содержащей 1166-3 среде. Клетки откручивали и промывали 3 раза для гарантии удаления пбЕ-3. Затем клетки считали в гемоцитометре. Клетки высевали в 96-луночный планшет при 5000 клеток/лунку в объеме 100 мкл/лунку с использованием не содержащей 1166-3 среды.

Как среду от активации клеток селезенки обезьяны, так и СГО3+ отобранные клетки, описанные в примере 8, добавляли в отдельных экспериментах при концентрациях 50, 25, 12,5; 6,25; 3,125; 1,5; 0,75 и 0,375% с растворимыми рецепторами ха1рНа11 или без них (конструкциями СЕЕ, С-РЬАС и Рс-4, см. пример 10 и 11) при 10 мкг/мл. Общий объем теста был 200 мл.

Тест-планшеты инкубировали при 37°С, 5% СО₂ в течение 3 дней, после чего добавляли А1атаг В1ие (Асситеб) при 20 мкл/лунку. Планшеты опять инкубировали при 37°С, 5% СО₂ в течение 24 ч. Планшеты считывали на планшет-ридере Ртах™ (Мο1еси1а^ Ое^зсек), как описано выше (пример 5). Результаты продемонстрировали полное ингибирование клеточного роста каждой из различных конструкций растворимых рецепторов ха1рНа11 при 10 мкг/мл, подтверждая, что этот фактор в каждой пробе был специфическим для рецептора ха1р6а11.

Кривые титрования с разведениями этих растворимых рецепторов также определяли с использованием описанного выше теста. Как /афНаИСЕЕ, так и 7а1рка11СРЬС, растворимые рецепторы ха1р11а1Е были способны полностью ингибировать рост при такой низкой концентрации, как 20 нг/мл. Мутантный растворимый рецептор ха1р11а11-Ес-4 был эффективным только при 1,5 мкг/мл.

Пример 13. Экспрессия ха1рНа11 человека в Е.^Н.

А. Конструирование экспрессирующего вектора рС2К225, который экспрессирует слитый полипептид 11иха1р11а11/МВР-6Н.

Экспрессионную плазмиду, содержащую полинуклеотид, кодирующий растворимый рецептор ха1рка11 человека, слитый на С-конце с мальтозусвязывающим белком (МВР), конструировали гомологичной рекомбинацией. Полинуклеотидная последовательность для слитого полипептида растворимого рецептора МВР-ха1рНа11 показана в δ60 ГО N0:50 с соответствующей белковой последовательностью, показанной в δ60 ГО N0:51. Слитый полипептид, названный 11иха1р11а11/МВР-6Н, в примере 14 содержит МВР-часть (аминокислоты 1 (Ме!) - 388 ^ег) δ60 ГО N0: 51), слитую с растворимым рецептором ха1рНа11 человека (аминокислоты 389 (Сук) - 606 (Н1к) δ60 ГО N0: 51).

Фрагмент кДНК ха1рНа11 человека (ЯЕО ГО N0: 52) выделяли с использованием ПЦР. Два праймера использовали в получении фрагмента ха1рНа11 человека в ПЦР-реакции:

(1) праймер 2С20187 (ЬЕО ГО N0: 53), содержащий 40 п.н. векторной фланкирующей последовательности и 25 п.н., соответствующих аминоконцу ха1рНа11 человека; и (2) праймер 2С20185 (ЬЕО ГО N0: 54), содержащий 40 п.н. 3'-конца, соответствующих фланкирующей векторной последовательности, и 25 п.н., соответствующих карбоксилконцу ха1р6а11 человека.

Условия ПЦР-реакции были следующими: 25 циклов 94°С в течение 30 с, 50°С в течение 30 с и 72°С в течение 1 мин с последующим пропитыванием при 4°С, реакции проводили в двух повторностях. 2 мкл из 100 мкл ПЦР-реакции подвергали электрофорезу на 1,0% агарозном геле с 1х ТВЕ-буфером для анализа и наблюдали ожидаемый фрагмент приблизительно 660 п.н. Оставшиеся 90 мкл ПЦР-реакции объединяли со второй ПЦР-пробиркой, осаждали 400 мкл абсолютного этанола. Осажденную ДНК использовали для рекомбинации в разрезанный δта1 реципиентный вектор рТАР98 для получения конструкции, кодирующей слитый полипептид МВР-ха1р11а1Е как описано ниже.

Плазмиду рТАР98 получали из плазмид ]3Κδ316 и рМАЕ-с2. Плазмида ]3Κδ316 является челночным вектором δассйа^οтусек сеге\зк1ае (Н1е!ег Р. аиб δί^Νά, К., Сеиейск 122:19-27, 1989). рМАЕ-С2 (МВ) является экспрессионной плазмидой 6χο1ί. Она несет промотор !ас, запускающий МАЬ-Е (ген, кодирующий МБР), за которым следуют Н1к-метка, сайт расщепления тромбина, клонирующий сайт и терминатор ггпВ. Вектор рТАР98 конструировали с использованием гомологичной рекомбинации дрожжей. 100 нг разрезанной ЕтоМ рМАЬ-с2 рекомбинировали с 1 мкг разрезанной Рνи1 р^316, 1 мкг линкера и 1 мкг разрезанной δса1/ЕсοΚ1 рКБ316. Линкер состоял из олигонуклеотидов ΖΕ69372 (ЬЕО ГО N0: 55) (100 пмоль): ΖΟ9351 (δ ЕС) ГО N0: 56) (1 пмоль), ΖΌ19352 (δ ЕС) ГО N0: 57) (1 пмоль) и ΖΌ19371 (ЬЕО ГО N0: 58) (100 пмоль), объединенных в ПЦР-реакции.

Условия ПЦР-реакции были следующими: 10 циклов 94°С в течение 30 с, 50°С в течение 30 с и 72°С в течение 30 с; затем пропитывание при 4°С. ПЦР-продукты концентрировали осаждением 100% этанолом.

100 мкл компетентных дрожжевых клеток (8.сег^181ае) объединяли с 10 мкл, содержащими приблизительно 1 мкг ПЦР-продукта рецептора ха1р6а11 человека, описанного выше, и 100 нг расщепленного δта1 вектора рТАР98 и переносили в кювету для электропорации 0,2 см. Смесь дрожжи/ДНК подвергали электрошокам при 0,75 кВ (5 кВ/см), неопределенным числе Ом, 25 мкФ. В каждую кювету добавляли 600 мкл 1,2 М сорбита и дрожжи высевали в двух аликвотах по 300 мкл на две чашки иКАГО и инкубировали при 30°С.

- 47 014417

Спустя приблизительно 48 ч ига+ дрожжевые трансформанты из отдельной чашки ресуспендировали в 1 мл Н₂О и откручивали быстро для осаждения дрожжевых клеток. Клеточный осадок ресуспендировали в 1 мл лизисного буфера (2% Тритон Х-100, 1% ДСН, 100 мМ №С1, 10 мМ Трис, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА). 500 мкл лизисной смеси добавляли в пробирку Эппендорфа, содержащую 300 мкл промытых кислотой стеклянных гранул и 200 мкл смеси фенол/хлороформ, встряхивали на вортексе 2 или у раза с интервалами 1 мин с последующим 5-минутным откручиванием в центрифуге Эппендорфа при максимальной скорости. 300 мкл водной фазы переносили в свежую пробирку и ДНК осаждали 600 мкл этанола (ЕЮН) с последующим центрифугированием в течение 10 мин при 4°С. Осадок ДНК ресуспендировали в 100 мкл Н2О.

Трансформацию электрокомпетентных клеток Е.со11 (МС1061, СакабаЬаи е! а1., I. Мо1. Вю1. 138, 179-207) проводили с 1 мкл преп-дрожжевой ДНК и 40 мкл клеток МС1061. Клетки подвергали электроимпульсам при 2,0 кВ, 25 мФ и 400 Ом. После электропорации 0,6 мл 80С (2% Бакто™-триптон (О1£со, Пе!гой, МЦ 0,5% дрожжевой экстракт (О1£со), 10 мМ №С1, 2,5 мМ КС1, 10 мМ МдС1₂, 10 мМ Мд80₄, 20 мМ глюкоза) высевали в виде одной аликвоты на чашки с ММ/СА+АМР 100 мг/л (Ргуог аиб ЬеШид, Рго!еш Ехргеккюи аиб Рипйсабои 10:309-319, 1997).

Клетки, несущие правильную экспрессионную конструкцию для рецептора ζа1рЕа11 человека, идентифицировали по экспрессии. Клетки выращивали в ММ/СА с 100 мкг/мл ампициллина в течение 2 ч при встряхивании при 37°С. 1 мл культуры индуцировали 1 мМ [РТС. Спустя 2-4 ч 250 мкл каждой культуры смешивали с 250 мкл промытых кислотой стеклянных гранул и 250 мкл буфера Торнера с 5% βМЭ и красителем (8 М мочевина, 100 мМ Трис рН 7,0, 10% глицерин, 2 мМ ЭДТА, 5% ДСН). Пробы встряхивали на вортексе в течение 1 мин и нагревали до 65°С в течение 10 мин; 20 мкл наносили на дорожку на 4-12% ПААГ для электрофореза (ΝΟνΉΧ). Разделение на гелях происходило в буфере 1х МЕ8 Положительные клоны были названы рС2К225 и их подвергали секвенированию. Полинуклеотидная последовательность слитого белка МВР^а1рЕа11 показана в 8ЕС ГО Ν0: 50.

В. Бактериальная экспрессия слитого полипептида Е^а1рЕа11/МВР-6Н.

мкл ДНК секвенирования использовали для трансформации штамма ВЬ21. Клетки подвергали электроимпульсам при 2,0 кВ, 25 мкФ и 400 Ом. После электропорации добавляли 0,6 мл ММ/СА со 100 мг/л ампициллина.

Клетки выращивали в ММ/СА с 100 мкг/мл ампициллина в течение 2 ч при встряхивании при 37°С. 1 мл культуры индуцировали 1 мМ ГОТС Спустя 2-4 ч 250 мкл каждой культуры смешивали с 250 мкл промытых кислотой стеклянных гранул и 250 мкл буфера Торнера с 5% РМЭ и красителем (8 М мочевина, 100 мМ Трис рН 7,0, 10% глицерин, 2 мМ ЭДТА, 5% ДСН). Пробы встряхивали на вортексе в течение 1 мин и нагревали до 65°С в течение 10 мин; 20 мкл наносили на дорожку на 4-12% ПААГ для электрофореза (ΝΟνΈΧ). Разделение на гелях происходило в буфере 1х МЕ8. Положительные клоны были использованы для выращивания для очистки слитого белка Е^а1рЕа11/МВР-6Н (пример 14).

Пример 14. Очистка растворимого рецептора Е^а1рЕа11/МВР-6Н из ферментации Е.со11.

Если нет других указаний, все операции проводили при 4°С. Следующую процедуру использовали для очистки растворимого рецепторного полипептида Е^а1рЕа11/МВР-6Н. Клетки Е.со11, содержащие конструкцию рС2К225 и экспрессирующие растворимый рецептор Е^а1рЕа11/МВР-6Н (пример 13), выращивали в супербульоне II (12 г/л казеина, 24 г/л дрожжевого экстракта, 11,4 г/л дикалий-фосфата, 1,7 г/л монокалий-фосфата; Вес!ои Пюкеикои, СоскеукуШе, МО) и замораживали в 0,5% глицерине. 20 г замороженных клеток в супербульоне II + глицерин использовали для очистки белка. Замороженные клетки оттаивали и разводили 1:10 в растворе протеазного ингибитора (буфера для экстракции) перед лизисом этих клеток и высвобождением растворимого рецепторного белка Е^а1рЕа11/МВР-6Н. Разведенные клетки содержали конечные концентрации 20 мМ Трис (РТ Вакег, РЫЕркЬигд, ΝΙ), 100 мМ хлорид натрия (№С1, МаШикгоб!, Рапк, ΚΥ), 0,5 мМ фенилметилсульфонилфторид (РМ8Р, 81дта СЕетюа1 Со., 8ΐ. Ьошк, МО), 2 мкг/мл лейпептина (Р1ика, 8\уГОег1анб) и 2 мкг/мл апротинина (81дта). Систему разрушения клеток РгеисЕ Ргекк (СонкЕт! 8ук!етк Ыб., ^агоюк, иК) с температурой от -7 до -10°С и 30 кф/кв.дюйм использовали для лизиса клеток. Разведенные клетки проверяли на разрушение считываниями А₆₀₀ до и после РгеисЕ Ргекк. Лизированные клетки центрифугировали при 18000д в течение 45 мин для удаления дебриса разрушенных клеток и супернатант использовали для очистки белка. Концентрации общего белка супернатанта определяли по БСА-способу (Р1егсе, РоскГогб, ГО) согласно инструкциям изготовителя.

Субстрат колонки (25 мл) Та1ои Ме!а11 АГПпЦу (С1ои!есЕ, Ра1о А1!о, СА) (приготовленный, как описано ниже) выливали в стеклянную колонку Вю-Каб, 2,5 см диаметрх10 см высота. Колонку упаковывали и уравновешивали под действием силы тяжести 10 колоночными объемами буфера для уравновешивания Та1ои (20 мМ Трис, 100 мМ №С1, рН 8,0). Супернатант периодически наносили на аффинную смолу Та1ои Ме!а11 АГГ^п^!у гект и качали в течение ночи. Смолу выливали обратно в колонку и промывали 10 колоночными объемами буфера для уравновешивания Та1ои под действием силы тяжести, затем проводили элюцию под действием силы тяжести 140 мл буфера для элюции (буфер для уравновешивания Та1ои + 200 мМ имидазол, Р1ика СЕетка1). Та1ои-колонку очищали 5 колоночными объемами 20 мМ

- 48 014417

2-(Ы-морфолино)этансульфоновой кислоты, рН 5,0 (МЕ8, 81дта), 5 колоночными объемами дистиллированной Н₂О, затем хранили в смеси 20% этанол/0,1% азид натрия. Фракции по 14 мл собирали на протяжении всей элюционной хроматографии и фракции считывали по поглощению при 280 и 320 нм и белок определяли по БСА-способу; проходящий через колонку и промывочный пулы также сохраняли и анализировали. Фракции элюции представляющего интерес белка объединяли и наносили сразу на амилозную смолу (Νο\ν Εηβΐηηά Βίοΐηόδ, ВеуеНу, МА).

Для получения более чистого полипептида йиζа1ρйа11/МВР-6Н объединенные фракции элюции с Такп-аффинной колонки подвергали хроматографии на амилозной смоле (22 мл) при рН 7,4. Колонку Βίο-Наб диаметром 2,5 см и высотой 10 см заливали, упаковывали и уравновешивали в 10 колоночных объемах амилозного буфера для уравновешивания (20 мМ Трис (ТТ Вакег), 100 мМ ΝηΟΊ (МаШпкгоб^, 1 мМ ПМСФ (81дта), 10 мМ бета-меркаптоэтанол (ВМЕ, Κ,’Ν ВктебкаИ 1пс., Ашота, ОН) рН 7,4. Пробу наносили под действием силы тяжести при скорости тока 0,5 мл/мин. Колонку промывали 10 колоночными объемами амилозного буфера для уравновешивания, затем элюировали ~2 колоночными объемами смеси амилозный буфер для уравновешивания + 10 мМ мальтоза (Ийка, Втскеш^-б Зтакебапб) под действием силы тяжести. Фракции по 5 мл собирали на протяжении всей хроматографии и измеряли поглощение при 280 и 320 нм. Амилозную колонку регенерировали 1 колоночным объемом дистиллированной Н₂О, 5 колоночными объемами 0,1% (мас./об.) ДСН (81дта), 5 колоночными объемами дистиллированной Н2О и затем 5 колоночными объемами амилозного буфера для уравновешивания.

Представляющие интерес фракции объединяли и диализовали в 81^бе-А-^уζе^ (Р1егсе) с 4x4 л ЗФР рН 7,4 (8фша) для удаления низкомолекулярных примесей, смены буфера и обессоливания. После замен ЗФР собранный материал представлял собой очищенный полипептид йиζа1ρйа11/ΜΒР-6Н. Очищенный полипептид йиζа1ρйа11/ΜΒР-6Н анализировали электрофорезом на ДСН-ПААГ с окрашиванием Кумасси и вестерн-блот-анализом с антикроличьим антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена (НКР) (Кοск1аηб, СПЬегЕгШе, РА). Концентрация полипептида йиζа1ρйа11/ΜΒР-6Н была 1,92 мг/мл, как определено БСА-анализом.

Очищенный полипептид йютафкП 1/МВР-6Н готовили для инъекции в кроликов и отсылали в К & К Кекеагсй апб ^еνе1ορтеηΐ (8ΐаηνοοб, ХА) для получения антител. Кроликов инъецировали для получения антисыворотки против йиζа1ρйа11/ΜΒР-6Н (см. пример 15).

Пример 15. Поликлональные антитела к ζ^ρ^ΐΕ

Поликлональные антитела получали иммунизацией двух самок Ново-Зеландских белых кроликов очищенным полипептидом йиζа1ρйа11/ΜΒР-6Н (пример 14) или очищенным рекомбинантным растворимым рецептором ζа1ρйа11СЕЕ (пример 11 А). Соответствующие поликлональные антитела были названы кроличье антитело анти-йиζа1ρйа11/ΜΒР-6Н и кроличье антитело анти-йота^йаН-СЕЕ-ВНК соответственно. Каждый кролик получал исходную внутрибрюшинную инъекцию (1Р) 200 мг очищенного белка в полном адъюванте Фрейнда (Р1егсе, КοскΓο^б. 1Ь) с последующими бустерными инъекциями 1Р 100 мг очищенного белка в неполном адъюванте Фрейнда каждые три недели. Спустя 7-10 недель после введения третьей бустерной инъекции производили кровоизвлечение у животных и собирали сыворотку. Затем кроликам продолжали вводить бустер-инъекции и брали кровь каждые три недели.

Ζа1ρйа11-специфические поликлоналыные антитела очищали аффинно из сывороток кроликов с использованием колонки С'ШВг-8ЕРНАКО8Е 4В ргокш (Рйагташа ЬКВ), которую готовили с использованием 10 мг очищенного полипептида йиζа1ρйа11/ΜΒР-6Н (пример 14) на 1 г С'ШВг-8ЕРНАКО8Е с последующим 20Х диализом в ЗФР в течение ночи. Ζа1ρйа11-специфические антитела характеризовали проверкой титра при помощи ЕЫ8А с применением 1 мг/мл подходящего белкового антигена в качестве мишени антител. Нижним порогом детектирования (БББ) кроличьего аффинно очищенного антитела анти-йиζа1ρйа11/ΜΒР-6Н является разведение 500 пг/мл. БББ кроличьего аффинно очищенного антитела анти-йота^йаН-СЕЕ-ВНК является разведение 50 пг/мл.

Пример 16. Идентификация клеток, экспрессирующих ζа1ρйа11-рецептор, при помощи ОТ-ПЦР.

Специфические типы клеток человека выделяли и подвергали скринингу на экспрессию ζη^εΙΙ при помощи ОТ-ПЦР. В-клетки выделяли из свежих миндалин человека механическим разрушением через найлоновые клеточные деформаторы (100 мкм) (ΡπΕοη™; Вес1кп ^^скеη5οη. РгапкБп Ζηΐ^δ, Νί). В-клеточные суспензии обогащали СБ19+ В-клетками положительным отбором с магнитной колонкой УагюМАСЗ У8+ и СБ19 микрогранулами (МШепу| Вккс, АиЬигп, СА) согласно инструкциям изготовителя. Т-клетки и моноциты выделяли из прикрепленных проб крови человека. СБ3+ Т-клетки очищали положительным отбором с использованием СБ3 микрогранул УагюМАСЗ, а моноциты очищали при помощи колонок отрицательного отбора УагюМАС8 (МШепу|) согласно инструкциям изготовителя. Пробы из каждой популяции окрашивали и анализировали клеточным сортингом с возбуждением флуоресценции (ЕАС8) (Вески Όκΐίηδοη, 8ап кке, СА) для определения процента обогащения и полученных выходов СБ19+ В-клетки имели чистоту приблизительно 96%, СБ3+ Т-клетки имели чистоту приблизительно 95% и моноциты имели чистоту приблизительно 96%.

- 49 014417

РНК получали при помощи стандартного в данной области способа из всех трех типов, которые были либо покоящимися, либо активированными. РНК выделяли из покоящихся клеток непосредственно из описанных выше колоночных препаратов. СГО19+ и СЭ3+ клетки активировали культивированием при 500000 клеток/мл в среде КРМ1 + 10% ФТС, содержащей ФМА 5 нг/мл (Са1Ьюсйет, Ьа 1о11а, СА) и иономицин 0,5 мкг/мл (Са1Ь1осЬет), в течение 4 и 24 ч. Моноциты активировали культивированием в КРМ1 + 10% ФТС, содержащей ЬР8 10 нг/мл (81дта 8!. Ьошк МО) и гЫЕХу 10 нг/мл (Κ&Ό, М^ииеарο1^к, МХ) в течение 24 ч. Клетки собирали и промывали в ЗФР. РНК получали из клеточных осадков с использованием набора К№аку М1б1ргер™ (Р1адеп, Уа1епс1а, СА) согласно инструкциям изготовителя и синтез первой цепи кДНК выполняли с набором 8ирегкспр! II™ (С1Ьсо ВКЬ, Сгапб 1к1апб, N¥3 согласно инструкциям изготовителя.

Олигонуклеотиды ΖΟ9907 (8ЕО ГО N0: 20) и ΖΟ9908 (8ЕО ГО N0: 21) использовали в ПЦРреакции для скрининга вышеописанных проб на фрагмент 1,2 т.п.н., соответствующий ζа1рйа11-сигналу. ПЦР-амплификацию проводили с полимеразой Тас.| (ВКЬ Сгапб Шапб NΥ) и следующими условиями. 35 циклов 95°С в течение 1 мин, 60°С в течение 1 мин, 72°С в течение 30 с; 1 цикл при 72°С в течение 10 мин и пропитывание при 4°С. 10 мкл каждого реакционного объема 50 мкл подвергали электрофорезу на 2% агарозном геле 1Х ТАЕ для идентификации полученных продуктов. ПЦР-продукты оценивали как (-) отсутствие продукта, (+) видимая полоса, (++) увеличенное присутствие полосы и (+++) наиболее преобладающая полоса, результаты показаны в табл. 5.

Таблица 5

Источник кДНК	Активация	ПЦР-продукт
Οϋ19+ клетки	0 ч покоящиеся + 4 ч активированные	++
	24 ч активированные	+++
С03+ клетки	0 ч покоящиеся -
	4 ч активированные	++
	24 ч активированные	-
моноциты	0 ч покоящиеся -
	24 ч активированные	-

Эти результаты показывают, что ζа1рΗа 11 -сигнал присутствует в покоящихся СГО19+ В-клетках и увеличивается митогенной активацией. Он, по-видимому, экспрессируется СГО3+ Т-клетками человека только после 4 ч активации. Нет видимого сигнала ни в покоящихся, ни в активированных моноцитах человека.

Пример 17. Иммуногистохимия ζа1р11а11.

А. Препараты клеток и тканей.

Положительные контрольные ткани состояли из клеток ВаЕ3, трансфицированных ζа1рΗа11 (пример 7) и лимфоидных тканей, которые, как известно, экспрессируют ζа1р11а11. в том числе лимфатического узла, селезенки и тимуса мышей, полученных из Н8Э (Наг1ап 8ргадие Оа^1еу, [пб1апароНк, ГО), лимфатического узла и селезенки обезьян, полученных из Регионального Центра исследований приматов (ЦшуегкПу оГ ^акЫпд!оп, 8еай1е, ^А), лимфатического узла и селезенки человека, полученных из СНТN (С1еуе1апб, ОН). Отрицательные контроли, проводимые на каждой из проб ткани, включали:

(1) нетрансфицированные клетки ВаЕ3;

(2) печень и мозг мышей и человека, которые, как известно, не экспрессируют ζа1р11а11;

(3) окрашивание буфером для разведения антител (УегИапп Вю!еск 8ук!етк, Тископ ΆΖ) в отсутствие первичного антитела и (4) использование растворимого белка ζа1р11а11 в конкурентных экспериментах.

Испытывали пробы других клеток. Тестировали как нестимулированные, так и стимулированные клетки НЬ60. Клетки НЬ60 являются промиелоцитарной клеточной линией, которая может быть дифференцирована в миелоидную или гранулоцитарную линию дифференцировки различными реагентами. Стимулированные пробы НЬ60 готовили следующим образом: (1) клетки НЬ60 обрабатывали 10 нг/мл форбол-миристат-ацетата (ФМА) (81дта, 8!. Ьошк, МО) в течение 48 ч для дифференцировки в клетки моноцитарной линии и (2) клетки НЬ60 обрабатывали 1,25% ДМСО (81дта) в течение 4 дней для дифференцировки в нейтрофил-подобные клетки. Кроме того, исследовали полиморфонуклеарные (РМХ) клетки человека, гранулоциты человека, лимфоциты периферической крови человека (РВЬ) и моноциты человека из свежей крови человека (полученные в лаборатории с использованием рутинных способов в

- 50 014417 данной области). Эти клетки и ткани, описанные выше, фиксировали в течение ночи в 10% ΝΒΕ (8игд1ра!к, ВюЬшопб, 1Ь), заделывали в рагарак! Х-1га (ОхГогб 8с1еп!йю, 8!. Ьошк, МО) и делали срезы 5 мкм на микротоме Ве1скаг1-1ипд 2050 (Ьеюа 1п81гитеп!8 СтЬН, Ш^осй Сегтапу).

В. Иммуногистохимия.

Тканевые микроскопические препараты депараффинизировали, гидратировали в буфере (воде) и подвергали паровой обработке Н1ЕВ в буфере Апбдеп Ве1пеуа1 Сйга ЬиГГег (ВюСепех, 8ап Вотап, СА) в течение 20 мин, 5% нормальную козью сыворотку (Уес!ог, ВигЕпдаше, СА) использовали для блокирования неспецифического связывания в течение 10 мин. Иммуноцитохимические анализы-скрининги проводили с использованием поликлональных антител к растворимому рецепторному белку ζа1рΗа11 (кроличье антитело анти-1п.^а1р11а11/МВР-6Н и кроличье антитело анти-Ь^а1рЬа11-СЕЕ-ВНК, см. пример 15) в качестве первичных антител при разведениях 1:200 и 1:400 соответственно. Конъюгированные с биотином козьи антитела против кроличьего 1дС (Уес!ог, са! №. ВА-1000, 1,5 мг/мл) использовали в качестве вторичного антитела при разведении 1:200. В отдельных пробах конкуренцию белков проводили с использованием добавления растворимого рецепторного белка ζа1рЬа11СЕЕ (в 10-кратном избытке) (пример 11А) к первичному антителу для предблокирования иммунной реакции первичных антител. Эту конкуренцию использовали в качестве контроля на специфичность кроличьих поликлональных антител в отношении ζа1р11а11. Детектирование проводили на приборе Уеп!апа С1етМа!е 500 с использованием набора С1етМа!е ИАВ к1! (меченый стрептавидином-биотином набор с применением конъюгата стрептавидин-пероксидаза хрена и ИАВ-субстрата) согласно инструкциям изготовителя и с использованием контрастного красителя гематоксилина изготовителя в течение 30 секунд (Уеп!апа Вю!еск 8у5!ет5, Тисзоп, А2).

Высокую экспрессию ζа1рЬа11 наблюдали в ФМА-активированных клетках. Низкий уровень экспрессии наблюдали в РВЬ и клетках НЬ60 без стимуляции. Субпопуляция клеток в селезенке, тимусе и лимфатическом узле мыши обнаружила положительное окрашивание. Лимфатический узел и селезенка как человека, так и обезьяны и клетки НЬ60 со стимуляцией ДМСО обнаружили минимальное окрашивание или вообще не обнаружили окрашивания. Сигнал, наблюдаемый в этих клетках и тканях, большей частью устранялся в результате конкуренции при использовании избытка растворимого рецепторного белка ζа1р11а11. Отрицательные контрольные ткани мозга и печени не обнаружили окрашивания.

Пример 18. Идентификация мононуклеарных клеток периферической крови (РВМ^С), которые экспрессируют рецептор ζа1р11а11. с использованием поликлональных кроличьих антисывороток к растворимому рецептору ζа1рΗа11.

200 мл свежей гепаринизированной крови получали из нормального донора. Кровь разводили 1:1 в ЗФР и разделяли в градиенте Нсо11-Рас.|ие РЬИ8 (Ркагтааа Вю!еск, ИррааИ, 8^ебеп), лимфоциты собирали на границе раздела. Клетки промывали 2Х в ЗФР и ресуспендировали в ВРМ1+ 5% ФТС при концентрации 2х10⁶ клеток/мл.

Для определения, действует ли на экспрессию рецептора ζа1р11а11 активированное состояние лимфоцитов, т.е. между покоящимися или активированными клетками, использовали несколько состояний стимуляции:

1) нестимулированные, т.е. только среда (среда ВРМ1 + 5% ФТС);

2) стимулированные ФМА 10 нг/мл + иономицин 0,5 мкг/мл (оба из (Са1Ьюскет) и

3) активация ФГА (фитогемагглютинин-Р, ИйсоЖУВ).

Клетки инкубировали при 37°С в течение 17 ч, затем собирали для окрашивания для детектирования рецептора ζа1р11а11.

Использовали протокол непрямого окрашивания. Вкратце, лимфоциты человека суспендировали в буфере для окрашивания (ЗФР+0,02% №№+БС.’А 1%, сыворотка здорового человека 2%) и высевали при 2х10⁵ клеток в 50 мкл на лунку в 96-луночном микротитрационном планшете. Антитела к растворимому рецептору ζа1рЬа11 СЕЕ (пример 15) использовали для определения, окрашиваются ли они вместе с В-клеточным (СИ-19), Т-клеточным (СИ-3) или моноцитарным (СИ-14) маркером на выделенных лимфоцитах человека. Кроличьи поликлональные сыворотки к растворимому рецептору ζа1р11а11 (кроличьи анти-Ьща1рЬа11-СЕЕ-ВНК) (пример 15) при 10 мкг/мл использовали в качестве антитела для идентификации ζа1рЬа11 на лимфоцитах. Второе антитело, козьи антитела против кроличьего 1д-Р1ТС (Вюзоигсе, СатагШо, СА) использовали для визуализации связывания кроличьего антитела анти-1и^а1р11а11-СЕЕВНК с рецепторами ζа1рЬа11. Другие антитела одновременно использовали для окрашивания Т-клеток (СИ3-РЕ, РЬагМтдеп, 8ап И1едо, СА), В-клеток (СИ19-РЕ) (РЬагМшдеп) и моноцитов (СИ-14-РЕ) (РЬагМтдеп) для идентификации совместного окрашивания антитела против рецептора ζа1рΗа11 на этих типах клеток. Различные контроли использовали для определения неспецифического связывания и уровней фона окрашивания:

(1) посторонние кроличьи поликлональные сыворотки использовали в качестве неспецифического контроля и (2) одно вторичное антитело использовали для определения фонового связывания этого реагента.

- 51 014417

Очищенный растворимый рецептор /а1рка11СЕЕ (пример 1) использовали в приблизительно 10-кратном избытке в качестве конкурентного ингибитора для подтверждения специфичности кроличьего антитела анти-ки/а1рка11-СЕЕ-ВНК в отношении растворимого рецептора /а1рка11.

После посева этих клеток и добавления первичных и одновременно окрашивающих антител клетки инкубировали на льду в течение 30 мин, промывали 2Х буфером для окрашивания и окрашивали вторичным антителом, козьими антителами против кроличьего [д-ЕПС (Вюкоигсе) в течение 30 мин на льду. Клетки промывали 2Х буфером для окрашивания и ресуспендировали при 200 мкл на лунку в буфере для окрашивания, содержащем жизнеспособный штамм 7ΛΛΌ при конечной концентрации 1 мкг/мл (81дта, 8!. Ьошк, МО). Пробы считывали на приборе ЕАС8-СабЬег (Вес!оη-^^ск^ηκоη. 8ап-1оке, СА) и жизнеспособные клетки анализировали.

Кроличьи поликлональные антитела к рецептору /а1рка11 окрашивали покоящиеся В-клетки. Сигнал на покоящихся В-клетках был более ярким, чем сигнал, полученный с использованием посторонних кроличьих сывороток, и сигнал уменьшался в большей степени на В-клетках, чем на Т-клетках, с добавлением избытка растворимого рецептора /а1рка11СЕЕ. Этот эксперимент повторяли с использованием разделенных В-клеток и Т-клеток и результаты были очень похожими. Опять окрашивание поликлональными кроличьими антителами анти-ки7а1рка11СЕЕ-ВНК к рецептору /а1рка11 было наивысшим на покоящихся В-клетках.

Пример 19. Экспрессия рецептора /а1рка11 в различных тканях с использованием количественной ОТ-ПЦР реального времени.

A. Праймеры и зонды для количественной ОТ-ПЦР.

Количественная ОТ-ПЦР реального времени с использованием системы детектирования последовательностей АВI РК18М 7700 (РЕ Аррбеб Вюкук!етк, Шс., Еок!ег Сбу, СА) была описана ранее (см. Не1б, С.А. е! а1., Сепоте Яекеагск 6:986-994, 1996; С1Ькоп, и.Е.М. е! а1., Сепоте Яекеагск 6:995-1001, 1996; 8ипбагекап, 8. е! а1., Епбосппо1оду 139:4756-4764, 1998). Этот способ включает в себя применение ген-специфического зонда, содержащего как репортерный, так и гасящий флуоресцентные красители. Когда зонд является интактным, излучение репортерного красителя гасится вследствие тесной близости гасящего красителя. Во время ПЦР-удлинения с использованием ген-специфических прямого и обратного праймеров зонд расщепляется 5'-нуклеазной активностью полимеразы Тад, что высвобождает репортерный краситель из зонда, приводя к увеличению флуоресцентного излучения.

Праймеры и зонды, используемые для количественных ОТ-ПЦР-анализов реального времени экспрессии /а1рка11, сконструированы с использованием программного обеспечения для конструирования праймеров Рптег Ехргекк™ (РЕ Аррбеб Вюкук!етк, Еок!ег Сбу, СА). Праймеры для /а1рка11 человека сконструированы простирающимися с охватыванием интрон-экзонного сочленения для элиминации амплификации геномной ДНК. Прямой праймер, 2С22277 (8ЕО ΙΌ N0: 59), и обратный праймер, 2С22276 (8ЕО ΙΌ N0: 60), использовали в ПЦР-реакции (ниже) в концентрации приблизительно 300 нМ для синтеза продукта 143 п.н. Соответствующий зонд /а1рка11 ТадМап®, названный 2С31 (8Е0 ΙΌ N0: 61), был синтезирован и помечен РЕ Аррбеб Вюкук!етк. Зонд 2С31 метили на 5'-конце репортерным флуоресцентным красителем (6-карбоксифлуоресцеином) (ЕАМ) (РЕ Аррбеб В1окук!етк) и на 3'-конце гасящим флуоресцентным красителем (6-карбокситетраметилродамином) (ТАМЯА) (РЕ Аррбеб В1окук!етк).

В качестве контроля для тестирования целостности и качества тестируемых проб РНК все пробы РНК (ниже) подвергали скринингу на рРНК с использованием набора праймеров и зондов из РЕ Аррбеб В1окук!етк (са! №. 4304483). Этот набор содержит прямой праймер рРНК (8Е0 ΙΌ N0:66) и обратный праймер рРНК (8Е0 ΙΌ N0:67), рРНК-зонд ТадМап® (8Е0 ΙΌ N0:68). рРНК-зонд был помечен на 5'-конце репортерным флуоресцентным красителем УК.’ (РЕ Аррбеб Вюкук!етк) и на 3'-конце - гасящим флуоресцентным гасителем ТАМЯА (РЕ Аррбеб В1окук!етк). Результаты с рРНК служат также в качестве эндогенного контроля и позволяют нормализовать результаты по экспрессии мРНК 7а1рба11, наблюдаемые в тест-пробах.

Пробы РНК из СЭ3, СЭ19 и моноцитарных типов клеток человека получали и описывали, как в примере 16. Контрольную РНК получали с использованием набора ЯЫеаку М1шргер™ Кб (О|адеп, Уа1епс1а, СА) согласно инструкциям изготовителя из приблизительно 10 миллионов клеток ВаЕ3, экспрессирующих рецептор /а1рка11 человека (пример 7).

B. Количественная ОТ-ПЦР реального времени.

Относительные уровни мРНК /а1рба11 определяли анализом проб тотальной РНК с использованием одностадийного способа ОТ-ПЦР (РЕ Аррбеб Вюкук!етк). Тотальную РНК из клеток ВаЕ3, экспрессирующих рецептор /а1рка11 человека, выделяли стандартными способами и использовали для получения стандартной кривой, используемой для количественного определения. Кривая состояла из 10-кратных серийных разведений в диапазоне от 2,5-2,6х10^-4 нг/мкл для скрининга рРНК и 250-0,025 нг/мкл для скрининга /а1рка11, причем каждую точку стандартной кривой анализировали в трех повторностях. Пробы тотальной РНК из СЭ3, СЭ19 клеток и моноцитов человека также анализировали в трех повторностях для уровней транскрипта /а1рка11 человека и для уровней рРНК в качестве эндогенного контроля. В общем объеме 25 мкл каждую пробу РНК подвергали одностадийной ОТ-ПЦР-реакции, содержащей: при

- 52 014417 близительно 25 нг тотальной РНК в буфере А (50 мМ КС1, 10 мМ Трис-НС1); внутренний стандартный краситель, карбокси-х-родамин (И0Х)); подходящие праймеры (приблизительно 50 нМ рРНК-праймеры (8ЕО ΙΌ N0: 66 и 8Е0 ΙΌ N0: 67) для проб рРНК и приблизительно 300 нМ праймеры 2С22277 (8Е0 ΙΌ N0: 59) и 2С22276 (8Е0 ΙΌ N0: 60) для проб ха1рйа11); подходящий зонд (приблизительно 50 нМ рРНК-зонд ТацМап® (8Е0 ΙΌ N0: 68) для проб рРНК, приблизительно 100 нМ ΖΟ31 (8Е0 ΙΌ N0: 61) для проб ха1рйа11); 5,5 мМ МдС1₂; 300 мкМ каждого из б-СТР, б-АТР и б-СТР и 600 мкМ б-ИТР; обратную транскриптазу МиЬУ (0,25 Е/мл); ДНК-полимеразу АтрйТац™ Со1б (0,025 Е/мкл) (РЕ Аррйеб Вюкук1етк) и ингибитор РНКазы (0,4 Е/мкл) (РЕ Аррйеб Вюкук1етк).

Условия термоциклирования ПЦР были следующими: начальная стадия обратной транскрипции (ОТ) из одного цикла при 48°С в течение 30 мин; с последующей стадией активации АтрйТац Со1б™ (РЕ Аррйеб Вюкук1етк) из одного цикла при 95°С в течение 10 мин; с последующими 40 циклами амплификации при 95°С в течение 15 с и 60°С в течение 1 мин.

Относительные уровни РНК ха1рйа11 определяли с использованием способа стандартных кривых, как описано изготовителем, РЕ Вюкук1етк (Икег Ви11е1ш №. 2. ΛБI Рпкт 7700 8ес.|иепсе Ое1ес1юп 8ук!ет, Ке1айуе Риапйайоп о£ Сепе Ехргеккюп, ЭесетЬег 11, 1997). Измерения рРНК использовали для нормализации уровней ха1рНа11, а пробу РНК покоящихся СЭ3+ клеток использовали в качестве калибратора. Покоящиеся СЭ3+ клетки выбирали произвольно в качестве калибратора и давали им величину 1,00. Остальные пробы сравнивали относительно калибратора. Данные показаны в табл. 6.

Таблица 6

Проба Покоящиеся 4 ч стимуляция 24 ч стимуляция

СОЗ 1,00 15,27 16,70

ССЙ9 20,14 65Д8 25,42

Моноциты 0,05 нет данных 0,26

Наблюдали 15-кратное увеличение в экспрессии рецептора ха1р11а 11 в СЭ3+ при 4 и 24 ч. Покоящиеся СЭ19 имели 20-кратное увеличение в экспрессии рецептора относительно покоящихся СЭ3+. 3-кратное увеличение имело место с 4-часовой стимуляцией, которое возвращалось к уровню покоящихся клеток при 24 ч. Моноциты не обнаружили детектируемой экспрессии рецептора ха1р11а11 в этом анализе.

Пример 20. Идентификация клеток, экспрессирующих рецептор ха1рНа11, с использованием гибридизации 1п кйи.

Специфические ткани человека выделяли и подвергали скринингу на экспрессию ха1р11а11 ш кйи. Получали различные ткани человека, делали срезы и подвергали их гибридизации 1п кйи, в том числе тимус, селезенку, миндалину, лимфатический узел и легкое. Ткани фиксировали в 10% забуференном формалине и заключали в парафин с использованием стандартных способов (пример 17). Делали срезы тканей при 4-8 мкм. Препараты тканей готовили с использованием стандартного протокола (Оеуе1ортеп1 о£ поп-1ко1ор1с т кйи НуЬгябяхаНоп в ййр://бп.шейк. шй. доу/б1г1ер/1кй.й1т1). Вкратце, срезы тканей депараффинизировали при помощи Н1к1оС1еаг Щайопа! Пяадпокйск, А11ап1а, СА) и затем дегидратировали этанолом. Затем их расщепляли протеиназой К (50 мкг/мл) (Воейппдег Пяадпокйск, Шбяапаройк, Щ) при 37°С в течение 2-20 мин. Эта стадия сопровождалась ацетилированием и регидратацией тканей.

Два 1п кйи зонда, генерируемые ПЦР, были сконструированы на основе последовательности ха1р11а11 человека. Были сконструированы два набора олигонуклеотидов для генерирования зондов для отдельных районов кДНК ха1рйа11:

(1) олигонуклеотиды ΖС23684 (8Е0 ΙΌ N0: 62) и ΖС23656 (8Е0 ΙΌ N0: 63) использовали для генерирования зонда 413 п.н. для ха1р11а11 и (2) олигонуклеотиды ΖС23685 (8Е0 ΙΌ N0: 64) и ΖС23657 (8Е0 ΙΌ N0: 65) использовали для генерирования зонда 430 п.н. для ха1р11а11.

Второй зонд находится на 1500 п.н. 3' от первого зонда ха1р11а11. Антисмысловой олигонуклеотид из каждого набора также содержал рабочую последовательность для промотора РНК-полимеразы Т7, чтобы сделать возможной легкую транскрипцию антисмыловых РНК-зондов из этих ПЦР-продуктов. Условия ПЦР-реакции были следующими: 30 циклов при 94°С в течение 30 с, 60°С в течение 1 мин, 72°С в течение 1,5 мин.

ПЦР-продукты очищали ротационными колонками О|адеп с последующими экстракцией смесью фенол/хлороформ и осаждением этанолом. Зонды затем метили диоксигенином (Воейппдег) или биотином (Воейппдег) с использованием системы транскрипции ш уйго (Рготеда, Маб1коп, νΙ) согласно инструкциям изготовителя.

- 53 014417

Гибридизацию ш кПа проводили с меченным диоксигенином или биотином зондом ха1рка11 (см. выше). Зонд добавляли к микроскопическим перпаратам (предметным стеклам) в концентрации 1-5 пмоль/мл в течение 12-16 ч при 55-60°С. Затем препараты промывали в 2Х 88С и 0,1Х 88С при 50°С. Сигналы усиливали с использованием тирамидного усиления сигналов (Т8А) (Т8А, т к1!и непрямой набор; №М) и визуализировали с набором Уес!ог КеД киЬк!га! кй (Уес!ог ЬаЬ) согласно инструкциям изготовителя. Затем предметные стекла окрашивали контрастным красителем гематоксилином (Уес!ог ЬаЬога!ог1ек, Вигйпдате, СА).

Сигнал наблюдали в тимусе, миндалине, легком и лимфатическом узле. Положительно окрашивающиеся клетки, по-видимому, являются лимфоцитами и родственными клетками.

Пример 21. Выделение мышиного рецептора ха1рНа11.

А. Скрининг мышиной геномной библиотеки.

Исходную частичную последовательность мышиного ха1рНа11 получали зондированием мышиной геномной библиотеки полинуклеотидным зондом рецептора ха1рка11 человека, содержащим полную кДНК. кДНК ха1рка11 человека генерировали при помощи ПЦР с праймерами Ζί.Ί9905 (8ЕО ГО N0: 36) и Ζί.’19906 (8Е0 ГО N0: 37) и плазмиду, содержащую полноразмерный ха1рка11 человека (например, примера 1), использовали в качестве матрицы.

Условия ПЦР были следующими: 35 циклов при 98°С в течение 1 мин, 68°С в течение 1 мин и 72°С в течение 2 мин; затем один цикл при 72°С в течение 10 мин.

ПЦР-продукт подвергали электрофорезу на 1% агарозе с низкой точкой плавления (ВоегЫпдег МаппНеип) и кДНК ха1рка11 человека приблизительно 1,5 т.п.н. выделяли с использованием набора для экстракции гелей 01ас|шск™ (01адеп) согласно инструкциям изготовителя. Эту кДНК ха1рка11 человека использовали для скрининга мышиной библиотеки геномной ДНК (ниже).

Используемой мышиной библиотекой геномной ДНК была клонированная библиотека етЬ13 8Р6/Т7 1атЬДа ВатШ (С1оп!есЬ, Ра1о А1!о, СА). Эту библиотеку, представляющую 7,2х10⁵ БОЕ, высевали на газон хозяина Е. о11 К802 на чашках 24 NΖΥ. Подъемы бляшек выполняли с использованием фильтров НуЬопД-Ы (АтегкЬат РЬагташа, Виск1шдаткЫге, Епд1апД, ИК) согласно инструкциям изготовителя. Фильтры денатурировали в 1,5 М №1С1 и 0,5 М №0Н в течение 10 мин и затем нейтрализовали в 1,5 М №1С1 и 0,5 М Трис-НС1 (рН 7,2) в течение 10 мин. ДНК прикрепляли к фильтру с использованием сшивающего агента 8ТКАТАЕ[М<ЕК ИУ (81га!адепе) при 1200 Дж. Фильтры предварительно промывали для удаления клеточного дебриса при 65°С в буфере для предварительной промывки (0,25Х 88С, 0,25% ДСН и 1 мМ ЭДТА) со сменой раствора 3 раза в течение 45 мин (в целом). Фильтры предгибридизовали в течение ночи при 50°С в растворе ЕхргеккЬуЬ™ (С1оп!есЬ), содержащем 0,1 мг/мл денатурированной ДНК спермы лосося. Приблизительно 50 нг очищенной кДНК ха1рНа11 человека (см. выше) метили ³²Р с использованием системы мечения ВеД1рпте II ВапДот Рпте ЬаЬе1шд 8ук!ет (АтегкЬат РЬагташа) согласно инструкциям изготовителя. Невключившуюся радиоактивность удаляли из кДНК-зонда ха1рка11 с использованием рикЬ-колонки ШсТгар™ (81га!адепе, Ьа 1о11а, СА). Фильтры гибридизовали в растворе ЕхргеккЬуЬ™ (С1оп!есЬ), содержащем приблизительно 0,5 - приблизительно 1х10⁶ имп/мин/мл кДНКзонда ха1рНа11, приблизительно 0,1 мг/мл денатурированной ДНК спермы лосося и 0,5 мкг/мл денатурированной ДНК со!-1. Гибридизация имела место в течение ночи при 50°С. Фильтры промывали в 2Х 88С, 0,1% ДСН при комнатной температуре в течение 2 ч (со сменой промывок несколько раз), затем температуру повышали до 60°С на 1 ч (со сменой буфера 1 раз). Экспонирование в течение ночи при -80°С обнаружило 6 бляшек, представляющих первичные изоляты.

Для получения вторичных изолятов бляшек 6 бляшек, представляющих первичные изоляты, извлекали пастеровской пипеткой и элюировали в течение ночи при 4°С в 1 мл 8М (0,1 М №С1, 50 мМ Трис рН 7,5, 10 мМ Мд80₄, 0,02% желатина), содержащем несколько капель хлороформа. После определения титров фага приблизительно 12.5Х оцененного количества фага в исходной извлеченной пробке (12.5Х покрытие) 6 первичных изолятов высевали на газон клеток Е.соН К802, заделанных в 10 мМ Мд80₄/NΖΥ верхней агарозы, на макси-чашках NXΥ и выращивали в течение ночи при 37°С. Подъемы бляшек производили с использованием фильтров НуЬопД-Ы (АтегкЬат РЬагташа) согласно инструкциям изготовителя. Фильтры фиксировали, как описано выше. Эти фильтры второго раунда предварительно промывали для удаления клеточного дебриса при 65°С в буфере для предварительной промывки (2Х 88С, 0,1% ДСН и 1 мМ ЭДТА), со сменой раствора три раза в течение 45 мин (в целом). Затем фильтры второго раунда предгибридизовали и кДНК-зонд ха1рка11 готовили, как описано выше

Фильтры второго раунда гибридизовали, как описано выше, в растворе ЕхргеккЬуЬ™ (С1оп!есЬ), содержащем приблизительно 10⁶ имп/мин/мл кДНК-зонда ха1рка11 и приблизительно 0,1 мг/мл денатурированной ДНК спермы лосося. Гибридизация имела место в течение ночи при 50°С. Условия промывок, описанные выше для первичного скрининга, повторяли для этого вторичного скрининга. После экспонирования в течение ночи при -80°С две из шести первоначальных первичных бляшек были подтверждены как положительные во втором скрининге. Положительные бляшки, гибридизующиеся с кДНК ха1рка11 человека во втором скрининге, извлекали в виде пробки пастеровской пипеткой, и они были названы 7Ь1 и 20Ь1.

- 54 014417

Выделенные бляшки 7Ь1 и 20Ь1 элюировали в 200 мкл ЗМ в течение ночи при 4°С. Серийные 10-кратные разведения в диапазоне от 10^-2 до 10^-6 каждого изолята высевали на клетки-хозяева Е.сок Κ802 для определения титра. Изолят 20Ь1 имел титр 4х10³ БОЕ/мкл и им занимались далее. Готовили 4 чашки посевом 10⁵ БОЕ на чашку на конфлюэнтные клетки (газоны) Е.сок Κ802 для получения препарата ДНК фага. Чашки выращивали при 37°С в течение приблизительно 6,5 ч, пока фаговый лизис не начинал становиться конфлюэнтным. Затем фаг элюировали в течение ночи при 4°С в 12 мл 8М на одну чашку. Затем чашки встряхивали при комнатной температуре в течение 1 ч, супернатант удаляли; добавляли 1% хлороформ и супернатант встряхивали опять в течение 15 мин. ДНК фага 20Ь1 получали с использованием системы для очистки препаратов ДНК Χνί/агб ЬатЬба Ргерз ΌΝΛ (Рготеда, Маб1зои, νΙ; разделы Ιν и νΙ).

Пробы ДНК фага 20Ь разрезали несколькими рестриктазами для получения ДНК-фрагментов для блоттинга по Саузерну. Продукты расщепления подвергали электрофорезу на 1% ТВЕ-агарозном геле. Гель вымачивали в 0,25 М НС1 в течение 30 мин; промывали в дистиллированной Н₂О; вымачивали в 0,5 М №1ОН и 1,5 М №1С1 в течение 40 мин с одной сменой раствора и нейтрализовали в 1,5 М №1С1 и 0,5 М Трис-НС1 (рН 7,2) в течение 40 мин с одной сменой раствора. Систему быстрого переноса ТИКВОВЬОТТЕК™ Кар1б Эозутгагб ТгаизГег 8уз1ет (ЗсЫеюкег & Зскией, Кееие, Ν4) использовали для переноса этой ДНК на мембрану ^Чаи/ВА-З (8ск1е1скег & Зские11) в течение ночи. ДНК прикрепляли к Νλ-Ιηπ при помощи сшивающего агента ЗТКАТАЬЕМКЕК υν (31га!адеие ЬА 1о11а, СА) при 1200 Дж. Блот предгибридизовали, как описано выше. Приблизительно 50 нг кДНК ха1рка11 человека метили и очищали для зонда, как описано выше. Фильтры гибридизовали, как описано выше, в растворе ЕхргеззкуЬ™ (С1ои1есй), содержащем приблизительно 10⁶ имп/мин/мл кДНК-зонда ха1рка11 и приблизительно 0,1 мг/мл денатурированной ДНК спермы лосося. Гибридизация имела место в течение ночи при 50°С. Блот промывали, как описано выше, и экспонировали на пленке в течение ночи при -80°С.

Анализ по Саузерну обнаружил ДНК-фрагмент, полученный из продукта расщепления ВатНI/8ΐиI, который гибридизовался с кДНК-зондом ха1рка11 человека в ожидаемом диапазоне размеров 1,3-1,6 т.п.н. Этот фрагмент использовали далее. Приблизительно 3 мкг ДНК 20Ь1 разрезали 20 единицами ВатЮ (Воекгшдег Маηηке^т. ^затроНз, ΙΝ) и 20 единицами 8ΐιιΙ (ЫЕВ, Веνе^1у, МА) в течение 2 ч при 37°С. Продукт расщепления подвергали электрофорезу на 1% ТВЕ-геле и дублетные полосы 1,3 т.п.н. и 1,6 т.п.н. вырезали из геля и ДНК экстрагировали из агарозы с использованием набора для экстракции гелей О|ас.|шск ™ (Р1адеи, Уа1еис1а, СА). Вследствие низкого выхода ДНК из этого получения было невозможно определить дополнительным анализом с расщеплением рестриктазами, были ли фрагменты, которые гибридизовались с кДНК-зондом ха1рка11 человека, ВатЮ/ЗЫ- или 8ΐιιΙ/8ΐιιΙфрагментами. Таким образом, лигирования тупых концов с использованием 5 мкл дублетного фрагмента 1,3 т.п.н. и 5 мкл дублетного фрагмента 1,3 т.п.н. выполняли с использованием набора для ПЦРклонирования Ζе^ο В1иЩ РСК С1ошид Κίΐ (^йгодеи, Саг1зЬаб, СА). Лигирование тупых концов давало положительные клоны как с фрагментами 1,6 т.п.н., так и с одним из фрагментов 1,3 т.п.н.. Эти клоны расщепляли ЕсоШ (Ь1£е Тескио1од1ез), которая фланкирует Т-выступающий сайт, где встраивали фрагменты 1,6 и 1,3 т.п.н. Другой саузерн-блоттинг проводили для определения, какой фрагмент был исходным фрагментом, гибридизующимся с кДНК-зондом ха1рка11 человека. 1% ТВЕ-гель обрабатывали и ДНК переносили на ^1гаи-блот, как описано выше.

Этот блот предгибридизовали, как описано выше, в 10 мл гибридизационного раствора. Получали отличающийся зонд полинуклеотида ха1рка11 человека. Другой фрагмент кДНК ха1рка11 человека из полноразмерной кДНК ха1рка11 генерировали для применения в качестве зонда в ПЦР с олигонуклеотидами ΖΟ9905 (8ЕО ΙΌ ΝΦ 36) и ΖС20097 (8ЕО ΙΌ ΝΦ 27).

Условия ПЦР-реакции были следующими: 95°С в течение 1 мин; 35 циклов 95°С в течение 1 мин, 55°С в течение 1 мин и 72°С в течение 2 мин; затем один цикл при 72°С в течение 10 мин.

ПЦР-продукт подвергали электрофорезу на 1% агарозе с низкой точкой плавления (Воеклидег Маипкейп) и кДНК ха1рка11 человека приблизительно 1,5 т.п.н. выделяли с использованием набора для экстракции гелей О|ас.|шск™ (Р1адеи) согласно инструкциям изготовителя. Приблизительно 50 нг этого выделенного кДНК-фрагмента ха1рка11 человека метили ³²Р и очищали, как описано выше. Фильтры гибридизовали в растворе ЕхргеззйуЬ™ (С1ои1есй), содержащем приблизительно 10⁶ имп/мин/мл кДНКзонда ха1рка1Е приблизительно 0,1 мг/мл денатурированной ДНК спермы лосося и 0,5 мкг/мл денатурированной ДНК со1-1. Гибридизацию и промывание выполняли, как описано выше. Блот экспонировали на пленке 1,5 ч при -80°С и вставка 1,3 т.п.н. сильно гибридизовалась с зондом ха1рка11 человека.

Этот клон секвенировали и обнаружили, что он содержит 3' кодирующий экзон мышиного ха1рка11 с терминирующим кодоном и последовательностью интрона выше по ходу транскрипции. Использовали следующие секвенирующие праймеры: ΖС3424 (8ЕЦ ΙΌ NО: 86), ΖС694 (8ЕЦ ΙΌ NО: 87), ΖС24399 (8ЕЦ ΙΌ NО: 88) и ΖС24400 (8ЕЦ ΙΌ NО: 89). Геномная последовательность мышиного ха^каИ, включающая в себя 3'-экзон, показана в 8ЕЦ ΙΌ NО: 69. Кодирующая последовательность 3'-экзона начинается при нуклеотиде 543 и заканчивается при нуклеотиде 1262 в 8ЕЦ ΙΌ NО: 69, кодируя 240 аминокислот (8ЕО ΙΌ ΝΦ 70).

- 55 014417

B. ПЦР-скрининг панели мышиных кДНК.

Панель доступных у себя в лаборатории и коммерческих мышиных кДНК (С1оп!есН; ЫГе Тесйпо1од1ек, СаййегкЬигд, МО) подвергали скринингу при помощи ПЦР с использованием ΖС24432 (8ЕО ΙΌ NО: 71) и ΖС24433 (8ЕО ΙΌ NО: 72) в качестве праймеров (приблизительно по 20 пмоль каждого).

Условия ПЦР-реакции были следующими: 94°С, 2 мин; 32 цикла 94°С в течение 20 с, 64°С в течение 30 с и 72°С в течение 30 с; затем один цикл при 72°С в течение 5 мин. Селезенка, дендритные клетки, неонатальная кожа, костный мозг мышей, клетки ВаР3 дикого типа, клетки ЕЬ4 и легкое мышей обнаружили сильно выраженные ПЦР-продукты предсказанного размера 450 п.н.

C. 5'-ВАСЕ с вмонтированными праймерами.

5'-ВАСЕ-реакции (быстрая амплификация концов кДНК) проводили с использованием 20 пмоль каждого из праймеров ΖС9739 (8ЕО ΙΌ NО: 73) и ΖС24434 (8ЕО ΙΌ NО: 74) и тагаШоп (марафонской)кДНК СЭ90+ отобранных клеток селезенки мыши в качестве матрицы. Мага!йоп-кДНК получали с использованием набора для амплификации тагаШоп-кДНК (С1оп!есН) согласно инструкциям изготовителя.

Условия ПЦР-реакции были следующими: 94°С в течение 1 мин; 5 циклов 94°С в течение 20 с и 70°С в течение 1,5 мин; затем 25 циклов 94°С в течение 20 с, 64°С в течение 20 с и 70°С в течение 1,5 мин; затем один цикл при 72°С в течение 5 мин.

Для обогащения в отношении 5'-ВАСЕ-продукта мышиного ζа1ρНа11 проводили 5'-ВАСЕ с вмонтированными (пек!еб) праймерами с использованием описанных выше условий ПЦР-реакции для начальной 5'-ВАСЕ, за исключением использования вмонтированных праймеров ΖС24431 (8ЕО ΙΌ NО: 75) и ΖС9719 (8ЕО ΙΌ NО: 76) и 1 мкл разведения 1/20 исходной 5'-ВАСЕ-реакции (выше) в качестве матрицы. Продукты очищали гель-электрофорезом, ДНК элюировали с использованием набора для экстракции агарозных гелей О1аех ΙΙ (О|адеп) и субклонировали с использованием набора для клонирования ТОТО ТА С1ошпд К1! Д^йгодеп). Положительные клоны идентифицировали при помощи ПЦР колоний с использованием 10 пмоль каждого из ΖС24431 (8ЕО ΙΌ NО: 75) и ΖС24511 (8ЕО ΙΌ NО: 77).

Условия ПЦР-реакции были следующими: 94°С, 2 мин; 35 циклов 94°С в течение 20 с, 64°С в течение 20 с и 72°С в течение 30 с; затем один цикл при 72°С в течение 5 мин.

Секвенировали два субклона из каждой из 5'-ВАСЕ-реакций с вмонтированными праймерами. Все эти клоны содержали часть последовательности ζа1ρйа11, но не были полными. Компилированную последовательность получали из неполных 5'-ВАСЕ-клонов и 3'-последовательности экзона (8ЕО ΙΌ NО: 70) с получением предварительной частичной последовательности полинуклеотида и соответствующего полипептида мышиного ζа1ρ11а11. Эта предварительная последовательность частичной кДНК мышиного ζа1ρйа11 показана в 8ЕО ΙΌ NО: 78 (5'-конец) и 8ЕО ΙΌ NО: 80 (3'-конец); имелись приблизительно 330 нуклеотидов еще неизвестной последовательности между 8ЕО ΙΌ NО: 78 (5'-концом) и 8ЕО ΙΌ NО: 80 (3'-концом) для получения полной кДНК мышиного ζη^Ιη-ιΗ (см. ниже). Соответствующие аминокислотные последовательности для 8ЕО ΙΌ NО: 78 и 8ЕО ΙΌ NО: 80 показаны в 8ЕО ΙΌ NО: 79 (Ν-конец) и 8ЕО ΙΌ NО:81 (С-конец) соответственно.

Ό. Полноразмерная ПЦР.

Были сконструированы праймеры из мышиного ИТВ выше по ходу транскрипции (слева) от инициирующего Ме! и ниже по ходу транскрипции (справа) от терминирующего кодона для полноразмерной ПЦР. 20 пмоль каждого из праймеров ΖС24616 (8ЕО ΙΌ NО: 82) и ΖС24615 (8ЕО ΙΌ NО: 83) использовали в ПЦР-реакциях с использованием марафонской кДНК мышиных дендритных клеток или библиотеки кДНК кожи новорожденных мышей, имеющейся в лаборатории, в качестве матрицы.

Условия ПЦР-реакции были следующими: 94°С, 1 мин, 30 циклов 94°С в течение 20 с и 66°С в течение 2 мин; затем один цикл при 72°С в течение 5 мин. ПЦР-продукты очищали гель-электрофорезом и кДНК элюировали с использованием набора для экстракции гелей О|ас.|шск и субклонировали с использованием набора для клонирования ТА (Iην^!^οдеη). Секвенировали 2 субклона из каждой ПЦР-реакции. Использовали следующие секвенирующие праймеры: ΖС694 (8ЕО ΙΌ NО: 87), ΖС3424 (8ЕО ΙΌ NО: 86), ΖС24431 (8 ЕС) ΙΌ ^: 75), ΖС24511 (8 ЕС) ΙΌ 77), ΖС24806 (8 ЕС) ΙΌ 90) и ΖС24807 (8ЕО ΙΌ NО: 91). Последовательность полноразмерной кДНК мышиного ζа1ρйа11 показана в 8ЕО ΙΌ NО: 84. Соответствующая аминокислотная последовательность показана в 8ЕО ΙΌ NО: 85.

Из приведенного выше описания должно быть понятно, что, хотя здесь были описаны для иллюстрации характерные варианты данного изобретения, различные модификации могут быть произведены без отклонения от идеи и сферы действия данного изобретения. Таким образом, данное изобретение не ограничивается ничем, кроме прилагаемой формулы изобретения.

- 56 014417

Перечень последовательностей <110> Займодженетикс, инк.

=120= Рецептор цитокина га1рпа11 <130> 98-55РС <150> 09/159.254 <151= 1998-09-23 <150> 09/265.117 <151> 1999-03-09 <150> 09/347,930 <151> 1999-07-06 <160> 91 <170> газТЗЕО Гог Итпйоиз Уегзтоп 3.0 <210=· 1 <211> 2887 <212> ДНК <213> Ното зарТепз <220 <221> С05 <222= (69)...(1682) <400> 1 даадсадсад дТасссссТс сасаТсссЕа дддсСсСдСд аТдТаддсад аддсссдТдд 60 дадТсадс аТд ссд сдТ ддс Ьдд дсс дсс ссс СТд ссс сТд сТд с1д сТс 110

МеЕ Рго Агд 61у Тгр А1а А1а Рго Теи Теи 1_еи 1еи Теи 1_еи

5 10

сад

дда

ддс

Сдд

ддс

Сдс

ссс

дас

сТс

дСс

Сдс

Тас

асе

дат

Сас

сТс

61п

61у

61у

Тгр

61 у

Суз

Рго

Азр

Теи

УаТ

Суз

Туг

ΤίΤΓ

Азр

Туг

Теи

15

20

25

30

сад

асд

дТс

аТс

Сдс

аТс

сТд

даа

аСд

сдд

аас

сТс

сас

ссс

аде

асд

61 η

ТИг

Уа1

Пе

Суз

Не

Теи

61 и

МеТ

Тгр

А5П

Теи

Н15

Рго

Зег

ТЬг

35

40

45

С1С

асе

СТС

асе

сдд

саа

дас

сад

ТаТ

даа

дад

сСд

аад

дас

дад

дсс

- 57 014417

ЬУЗ

Азр 61и А1а асе Есс Еде аде

ТЬг Зег Суз Зег

Лс сас адд Есд дсс сас ааЕ дсс асд

Ьеи Н1з Агд Зег А1а Н1з Азп АТ а ТЬг

75 саЕ дсс асе

Я1з А1а ТЬг

302

Еас асе Еде сас

Туг ТЬг Суз Н1з аЕд даЕ дЕа ЕЕс сас

МеЕ Азр Уа1 Рке Н1з

ЕЕс аЕд дсс дас дас

РЬе МеЕ А1а Азр Азр аЕЕ ЕЕс

Не РЬе

350 адЕ дЕс аас

Зег Уа1 Азп аде ЕЕЕ сЕс Зег Рпе Ьеи аЕс

Не сЕд Ьеи аса

ТЬг дсЕ

АТа

115

дас	сад	ЕсЕ	ддс	аас	Еас	Есс	сад	дад
Азр	61 п	Зег	61у	Азп	Туг	Зег	61 п	61 и
100					105
дад	аде	аЕс	аад	сед	дсЕ	ссс	ссЕ	ЕЕс
61 и	Зег	Не	Ьуе	Рго	АТа	Рго	Рго	Рке

120

ЕдЕ

Суз ддс

61у но

398 аас

Азп

125 дьд

Уа1

446 асЕ дЕд асе ЕЕс Еса дда сад ЕаЕ

Тпг Уа1 ТЬг РЬе Зег 61у 61п Туг 130 даа дас ссЕ дсс ЕЕс Еас аЕд сЕд <31 и Азр Рго А1а Рке Туг МеЕ Ьеи ¹⁴⁵ 150 сад Еас адд аас едд дда дас ссс 61п Туг Агд Азп Агд 61у Азр Рго ¹⁶θ 165

ааЕ	аЕс	Есс	Ьдд	сде	Еса	даЕ	Еас
Азп	Не	Зег	Тгр	Агд	Зег	Азр	Туг
135					140
аад	ддс	аад	сЕЕ	сад	ЕаЕ	дад	сЕд
Ьуз	61у	Ьуз	Ьеи	61п	Туг	61 и	Ьеи
				155
£дд	дсЕ	дтд	адЕ	ссд	адд	ада	аад
Тгр	А1 а	УаТ	Зег	Рго	Агд	Агд	Ьуз

170

494

542

590 сЕд аЕс Еса

Ьеи Не Зег

175 дЬд дас Еса ада адЕ дЕс Есс сЕс сЕс

Уа1 Азр Зег Агд Зег Уа1 Зег Ьеи Ьеи ¹⁸⁰ 185 ссс сед дад ЕЕс

Рго Ьеи 61 и Рке

190

638 сде ааа дас Есд аде ЕаЕ дад

Агд Ьу₃ Азр з_ег з_{ег Туг е1и}

195 сЕд сад дЕд едд дса

Ьеи 61п Уа1 Агд А1а

200 ддд

61у ссс аЕд ссЕ

Рго МеЕ Рго

205

686 ддс Есс Есс Еас сад ддд асе Едд адЕ даа Едд адЕ дас С1у 5ег Зег Туг 61 п 61у ΤΙίγ Тгр Зег 61 и Тгр Зег Азр

210 215

ЕЕЕ сад асе сад Еса дад дад ЕЕа аад даа ддс Едд аас ссд дЕс аЕс

Рго Уа1 IIе

220 ссЕ сас сЕд

734

782

- 58 014417

РЬе

01 η

ТЬг

61 η

Зег

61и

61 и

Ьеи

Ьуз

61 и

61у

Тгр

Азп

Рго

Н1з

Ьеи

225

230

235

с!д

си

с!с

с!с

с!д

с!!

д!с

а!а

д!с

!!с

аи

сс!

дсс

!!с

!дд

аде

830

[_еи

Ьеи

Ьеи

Ьеи

Ьеи

Ьеи

Уа1

Пе

Уа1

РЬе

Пе

Рго

А1а

РЬе

Тгр

Зег

240

245

250

с!д

аад

асе

са!

сса

«д

!дд

адд

с!а

ьдд

аад

аад

а!а

едд

дсс

д!с

878

Ьеи

Ьуз

Ό1Γ

Ж 5

Рго

Ьеи

Тгр

Агд

Ьеи

Тгр

Ьуз

Ьуз

Пе

Тгр,

А1а

Уа1

255

260

265

270

ссс

аде

ссЬ

дад

едд

!!с

!!с

а!д

ссс

с!д

Сас

аад

ддс

!дс

аде

дда

926

Рго

Зег

Рго

61 и

Агд

РЬе

РЬе

Ме!

Рго

Ьеи

Туг

Суз

61у

Суз

Зег

61 у

275

280

285

дас

ис

аад

ааа

!дд

дтд

дд-с

дса

ссс

!!с

ас!

ддс

!сс

аде

ссд

дад

974

Азр

РИе

Ьуз

Тгр

Уа1

61у

А1а

Рго

РЬе

ТЬг

61 у

Зег

Зег

Ьеи

61 и

290

295

300

с!д

дда

ссс

!дд

аде

сса

дад

д!д

ссс

!сс

асе

с!д

дад

дед

!ас

аде

1022

Ьеи

61у

Рго

Тгр

Зег

Рго

61 и

Уа1

Рго

Зег

ТЬг

Ьеи

61и

Уа1

Туг

Зег

305

310

315

1дс

сас

сса

сса

едд

аде

ссд

дсс

аад

адд

с!д

сад

с!с

асд

дад

с! а

1070

Су 5

Н15

Рго

Рго

Агд

Зег

Рго

А1 а

Ьуз

Агд

Ьеи

61 п

Ьеи

ТЬг

61 и

Ьеи

320

325

330

саа

даа

сса

дса

дад

с!д

д!д

дад

!с!

дас

дд!

дед

ссс

аад

ссс

аде

1118

61п

61 и

Рго

А1а

61 и

Ьеи

Уа1

61и

Зег

Азр

б1у

1/а1

Рго

Ьуз

Рго

Зег

335

340

345

350

!!с

£дд

ссд

аса

дсс

сад

аас

!сд

ддд

ддс

!са

дс!

!ас

ад!

дад

дад

1166

РЬе

Тгр

Рго

ТЬг

А1 а

61 η

Азп

Зег

61у

61У

Зег

А1а

Туг

Зег

б1и

61 и

355

360

365

адд

да!

едд

сса

Ьас

ддс

с!д

дтд

!сс

а!!

дас

аса

дед

ас!

д!д

с!а

1214

Агд

Азр

Агд

Рго

Туг

С1у

Ьеи

Уа1

Зег

Не

Азр

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

Ьеи

370

375

380

да!

дса

дад

ддд

сса

Ьдс

асе

тдд

ссс

!дс

аде

Сд!

дад

да!

дас

ддс

1262

Азр

А1 а

61 и

61 у

Рго

Суз

ТЬг

Тгр

Рго

Суз

Зег

Суз

61и

Азр

Азр

61у

385

390

395

Ьас

сса

дсс

с!д

дас

с!д

да!

дс!

ддс

с!д

дад

ссс

аде

сса

ддс

с!а

1310

- 59 014417

Туг

Рго 400

ΑΊа Ьеи Азр Ьеи

Азр А1а 61у Ьеи 61 и Рго

Зег

Рго

61 у

Ьеи

405

410

дад

дас

сса

скс

ид дак

дса

ддд

асе

аса

дке

скд

ксс

кдк

ддс

кдк

1358

61и

Азр

Рго

Ьеи

Ьеи

Азр

А1а

61У

Τ1ΊΓ

ТЬг

Уа1

Ьеи

Бег

Суз

61у

Суз

415

420

425

430

дке

кса

дек

ддс

аде

сск

ддд

ска

дда

ддд

ссс

скд

дда

аде

скс

скд

1406

УаТ

Зег А1а

61у

Бег

Рго

61у

Ьеи

61у 61у

Рго

Ьеи

61 у

Зег

Ьеи

Ьеи

435

440

445

дас

ада

ска

аад

сса

ссс

сП

дса

дак

ддд

дад

дас

кдд

дек

ддд

дда

1454

Азр Агд

Ьеи

Ьуз

Рго

Рго

Ьеи

А1а

Аэр

61у

61 и Азр

Тгр

АТ а

61у

61у

450

455

460

скд

ссс

тдд

ддт

ддс

едд

кса

сек

дда

ддд

дке

кса

дад

адк

дад

дед

1502

Ьеи

Рго

Тгр

61 у

61у Агд

Бег

Рго

61у 61у

Уа1

Бег 61 и

Зег

61 и

А1а

465

470

475

ддс

кса

ссс

скд

дсс

ддс

скд

дак

акд дас

асд

ккк

дас

адк

ддс

ккк

1550

61у

5ег

Рго

Ьеи А1а

61У

Ьеи

Азр

Мек Азр

ТИг

РЬе

Азр

Бег

61 у

РЬе

480

485

490

дкд

ддс

кек

дас кдс

аде

аде

сек

дкд дад кдк

дас

ккс

асе

аде

ссс

1598

Уа1

61 у

Бег Азр Суз

Бег

Зег

Рго

Уа1

61 и

Суз

Азр

РЬе

ТЬг

5ег

Рго

495

500

505

510

ддд

дас

даа

дда

ссс

ссс

едд

аде

кас

скс

сдс

сад

ьдд

дкд дке

акк

1646

61у Азр

61 и 61у

Рго

Рго

Агд

Бег

Туг

Ьеи

Агд

61п

Тгр

Уа1

Уа1

Не

515

520

г

525

сск

ссд

сса

сьг

кед

аде

сск

дда

ссс

сад

дсс

аде

каакдаддск

1692

Рго

Рго

Рго Ьеи

Бег

Зег

Рго

61 у

Рго

61 η

А1а

Зег

530 535 даскддакдк ссададстдд ссаддссаск дддссскдад ссададасаа ддксасскдд 1752 дсГдБдаБдБ даадасасск дсадссШд дксксскдда кдддсскккд адсскдакдк 1812 ккасадкдкс БдБдБдБдБд кдкдсакакд кдкдкдкдкд сакакдсакд кдкдкдкдкд 1872 ЕдБдБдБсББ аддкдсдсад кддсакдксс асдкдкдкдк дкдаккдсас дкдсскдкдд 1932 дсскдддака акдсссакдд каскссакдс акксасскдс сскдкдсакд кскддаскса 1992 сддадсксас ссакдкдсас аадкдкдсас адкааасдкд кккдкддкса асадакдаса 2052 асадссдксс ксссксскад ддксккдкдк кдсаадккдд кссасадсак скссддддск 2112 ккдкдддакс адддсаккдс скдкдаскда ддсддадссс адссскссад сдкскдсскс 2172 саддадскдс аадаадксса каккдкксск каксасскдс саасаддаад сдааадддда 2232 БддадГдадс ссакддкдас сксдддаакд дсаакккккк дддсддсссс кддасдаадд 2292

- 60 014417

РсРдааРссс дасРсРдаРа ссРРсРддсР дрдсбассрд адссаадРсд ссРссссРср 2352 сРдддсРада дССРссССаР ссадасадрд дддааддсаР дасасассРд ддддаааРРд 2412 дсдаРдСсас ссдРдРасдд Расдсадссс ададсадасс сРсааРааас дРсадсРРсс 2472 ССссССсРдс ддссададсс даддсдддсд ддддрдадаа саРсааРсдР садсдасадс 2532 сгдддсассс дсддддссдР сссдссРдса дадддссаср сдддддддрр РссаддсСРа 2592 аааРсадРсс дРРРсдЬсРс Ррддааасад сРссссасса ассаадаШ сСРРСРсРаа 2652 сРРсРдсРас СаадССРССа ааааРРсссР РРаРдсассс аададаРаРР РаРРааасас 2712 сааРРасдРа дсаддссаРд дсРсаРддда сссасссссс дРддсасСса рддадддддс 2772 РдсаддРРдд аасРаРдсад РдРдсРссдд ссасасаРсс РдсРдддссс ссРасссРдс 2832 сссааРРсаа РссРдссааС аааРссРдРс ССаССРдРРс аРссРддада аРРда 2887 <210> 2 <211=· 538 <212> Белок <213> Ното зартепз <400 2

Мер Рго Агд 61у Тгр А1а А1а Рго Сеи Ьеи 1_еи Сеи Сеи Ьеи 61п 61у 15 1015

61у Тгр 61 у Суз Рго Азр Сеи УаТ Суз Туг ТЬг Азр Туг Ьеи 61 η ТЬг

25 '30

УаТ Не Суз Пе Сеи 61и Мер Тгр Азп Ьеи Нтз-Рго Зег ТЬг Сеи ТЬг 35 4045

Ьеи ТЬг Тгр 61п Азр 61П Туг 61и СТ и Сеи Ьуз Азр 61и АТ а ТЬг 5ег

50

55

60

Суз

Зег

Сеи

Н15

Агд

Зег

АТа

Н15

Азп

АТа

ТЬг

Н15

АТа

ТЬг

Туг

ТЬг

65

70

75

80

Суз

Нт 5

МеР

Азр

УаТ

РЬе

Н15

РЬе

МеТ

АТа

Аэр

Азр

Не

РЬе

Зег

УаТ

85

90

95

Азп

Не

ТЬг

Азр

61 п

Зег

61у

Азп

Туг

Зег

61 п

61 и

Суз

61 у

‘Зег

РЬе

100

105

110

Сеи

1_еи

АТа

61 и

Зег

11 е

Рго

АТа

Рго

Рго

РЬе

Азп

Уа1

ТЬг

УаТ

115

120

125

ТЬг

РЬе

Зег

61у

61п

Туг

Азп

Пе

Зег

Тгр

Агд

Зег

Азр

Туг

61 и

Азр

130

135

140

Рго

АТ а

РЬе

Туг

Мер

Ьеи

Суз

61 у

1у5

1еи

61п

Туг

61 и

Сеи

61 п

Туг

145

150

155

160

Агд

Аэп

Агд

61у

Азр

Рго

Тгр

АТа

УаТ

Зег

Рго

Агд

Агд

куз

Сеи

Не

165

170

175

Зег

УаТ

Аэр

Зег

Агд

Зег

7аТ

Зег

Сеи

Ьеи

Рго

Сеи

61и

РЬе

Агд

Суз

180

185

190

Азр

Зег

Зег

Туг

61 и

Ьеи

61 п

УаТ

Агд

АТа

61у

Рго

Мер

Рго

61у

Зег

195

200

205

Зег

Туг

61 п

61у

ТЬг

Тгр

Зег

61 и

Тгр

Зег

Азр

Рго

УаТ

Не

РЬе

61 п

210

215

220

- 61 014417

ТЬг

61п

Зег

61 и

61 и

кеи куз

61и

61у

Тгр

Азп

Рго

Н1з

кеи

кеи

кеи

225

230

235

240

кеи

кеи

кеи

кеи

УаТ

Не Уа1

РЬе

Не

Рго

А1а

РЬе

Тгр

Зег

кеи

куз

245

250

255

ТЬг

Н15

Рго

кеи

Тгр

Агд кеи

Тгр

куз

Не

Тгр

А1а

УаТ

Рго

Зег

260

265

270

Рго

61 и

Агд

РЬе

РЬе

Мек Рго

кеи

Туг

куз

61у

Суз

Зег

61у

Азр

РЬе

275 280 285

куз

куз

Тгр

Уа!

61у

А1а

Рго

РЬе

ТЬг

61у

Зег

Зег

кеи

61 и

кеи

61у

290

295

300

Рго

Тгр

Зег

Рго

61и

Уа1

Рго

Зег

ТЫ

кеи

61 и

Уа1

Туг

Зег

Суз

Жз

305

310

315

320

Рго

Рго

Агд

Зег

Рго

А1а

Ьуз

Агд

кеи

61 п

кеи

ТЬг

61 и

кеи

61 п

61 и

325 330 335

Рго А1а 61и кеи 9а1 61и Зег Азр 61у Уа1 Рго куз Рго Зег РЬе Тгр 340 345 350

Рго ТЬг А1а 61 η Азп 5ег 61у 61у 5ег А1а Туг Зег 61 и 61 и Агд Азр 355 360 365

Агд Рго Туг 61у кеи Уа1 Зег Не Азр ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 кеи Азр А1а

370 375 380

61 и

61у

Рго

Суз

ТЬг

Тгр

Рго

Суз

Зег

Суз

61 и

Азр

Азр

61у

Туг

Рго

385

390

395

400

А1а

кеи

Аэр

кеи

Азр

А1а

61у

кеи

61и

Рго

Зег

Рго

61 у

кеи

61 и

Азр

405

410

415

Рго

кеи

кеи

Азр

ΑΊ а

61у

ТЬг

ТЬг

Уа1

кеи

Зег

Суз

61у

Суз

Уа1

Зег

420

425

430

А1а

61у

Зег

Рго

61у

кеи

61у

61 у

Рго

кеи

61у

Зег

кеи

кеи

Азр

Агд

435

440

445

кеи

куз

Рго

Рго

кеи

А1а

А5Р

61у

61 и

Азр

Тгр

А1 а

61у

61у

кеи

Рго

450 455 460

Тгр

61у

61у

Агд

5ег

Рго

61у

61у

УаТ

Зег

61 и

Зег

61и

А1а

61у

Зег

465

470

475

480

Рго

кеи

АТ а

61у

кеи

Агр

Мек

Азр

ТЬг

РЬе

Азр

Зег

61у

РЬе

Уа1

61у

485

490

495

Зег

Азр

Суз

Зег

Зег

Рго

УаТ

61 и

Суз

Азр

РЬе

ТЬг

Зег

Рго

61у

Азр

500

505

510

61 и

61 у'

Рго

Рго

Агд

Зег

Туг

кеи

Агд

61 п

Тгр

УаТ

Уа1

Не

Рго

Рго

515

520

525

Рго

кеи

Зег

Зег

Рго

61у

Рго

61 п

А1а

Зег

530

535

<210 3 <211> 5 <212> Белок <213> Синтетическая последовательность

- 62 014417 <220 <223> Консенсусный мотив аминокислот <221> Вариант <222> (1)...(5) <220 Хаа = Любая аминокислота <221> Вариант <222> (1)...(5) <223> Хаа = Любая аминокислота <400> 3

Тгр Зег Хаа Тгр Зег

5 <210> 4 <211> 1614 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220 <223> Вырожденная нуклеотидная последовательность га1рЕа11 <221> зс_£еа1иге <222> (1)..,(1614) <223> η = А,Т,Сили6 <221> пп зс_£еа£иге <222> (1)..,(1614) <223> η = А.Т.СилиЕ <400> 4 аЕдссптспд дптдддспдс псспуТпу1п у1пу1пу1пу Епсагддпдд пХддддпгду60 сспдаууТпд Ш;ду£ауас пдауТаууТп сагаспдЕпа 1Шдуа№уГ пдага1д1дд120 аауу£псаус сгмзпаспу! паспуЕпасп Тддсагдаус аг£аудагда гуТпаагдау180 дагдспасгм зпТдуизпуТ псаутдпызп дспсауаауд спаспсаудс паспТауасп240

ТдусауаТдд аудТпйуса уПуагддсп даудауаШ Ш/зпдТпаа уаЪЬаспдау300 сагазпддпа ау1ауызпса гдагЕдуддп ы5пН:уу1пу Тпдспдагаз паЕЬаагссп360 дспсспсспТ гуааудТпас пдТпаспНу изпддпсаг! ауаауаТОз п1ддтдпи5п420 дауЕаудагд аусслдспи уТауаТдуФп аагддпаагу ТпсагСауда гу1псаг!ау480 тдпааутдпд дпдауссШд ддспдГгмзп ссптдпгодпа агуЕпаИтоз пд^пдауизп540 тдгмзпдтпм зпуТпуТпсс пуТпдагИу тдпаагдауи зп^зпгауда гуЬпсагдТп600 тдпдспддпс спа£дсспдд пи5пизп1ау сагддпасп! ддмзпдагТд дизпдауссп660 дТпаШТус агаспсагиз пдагдагу1п аагдагддп! ддааусспса ууТпу1лу1п720

- 63 014417 утлуСпуЕпу ТпдСпаТНдС пСВуаСИссп дстй±у1дды зпу^паагас псаусспуСп780

Ъддшдпуйпй ддаагаага! Мдддспдкп ссгмзпсспд аплдпНуй уаСдсспуСп840

СауаагддпЁ дунзпддпда уПуаагааг СдддЪпддпд спсспйуас пддпизпмзп900 уТпдагуЬлд дпсслТддиз псспдагдСп сспизпаспу ТпдагдШа уизпйдусау960 сспссптдпы зпсспдспаа гтдпуСпсаг уСпаспдагу йпсагдагсс пдспдагуЬп1020 дЪпдагизпд ауддпдйпсс паагсспизп йуСддсспа спдспсагаа уизпддпддпЮ80 изпдспСауи зпдагдагтд пдаутдпссп 1ауддпу1пд йпизпаЩда уаспдйласп1140 дСпуТпдауд спдагддпсс пТдуасгйдд сспгдуизпт дудагдауда уддпгауссп1200 дспуТпдауу йпдаудспдд пуГпдагссп изпсспддлу Тлдагдаусс пуйпуЬпдау1260 дспддпаспа спдЪпуШй МдуддпСду дШзпдспд дгшпсспдд пуЬпддпддп1320 сспуСпддпи зпуЩуйпда утдпукпааг сспсспуйпд спдауддпда гдаугдддсп1380 ддпддпуйлс спйддддпдд птдпмзпссп ддпддпдйпи зпдагизпда гдспддпизп1440 сспуСпдспд дпуЕлдауак ддауаспМу дауизпддгй ЕудСпддгмз пдауЬдумзп1500 ызпсспдЕпд аМдудауН уасгмзпссп ддпдаудагд дпсспссптд гмзпЪаууйп1560 тдпсагГддд ТпдТпаТНсс псспсспуйп изпызпсспд дпсспсагдс гмзп1614 <210> 5 <211> 17 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ447 <400> 5 каасааШс асасадд 17 <210 6 <211> 18 <212* ДНК <213> Синтетическая последовательность <220 <223> Олигонуклеотидный праймер ИС976 <400* 6 сдйдГаааа сдасддсс 18 <210> 7 <211* 21 <212> ДНК <213=- Синтетическая последовательность <220 <223> Олигонуклеотидный праймер 7С19345

- 64 014417 <400= 7 дассадКсРд дсаасХаскс с 21 <210= 8 <211=- 20 <212> ДНК <213=- Синтетическая последовательность <220= <223> Опигонуклеотидный праймер ΖΟ19346 <400> 8 дсБсРсадсс аддадааадс 20 <210= 9 <211= 20 <212> ДНК <213=- Синтетическая последовательность <220= <223> Опигонуклеотидный праймер ΣΟ19349 <400=* 9 ддПддРддд дадсРдШс 20 <210> 10 <211= 20 <212= ДНК <213> Синтетическая последовательность <220= <223=- Опигонуклеотидный праймер ΖΟ19350 <400= 10 дддБдадаас аБсааРсдРс 20 <210> 11 <211= 21 <212> ДНК <213=· Синтетическая последовательность <220= <223> Опигонуклеотидный праймер Ζ019458

- 65 014417 <400> 11 са1а£с11с1 -Сссакадсс! с 21 <210> '12 <211> 21 <212> ДНК <213* Синтетическая последовательность <220 <223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ19459 <400 12 с1сс1сс1дс Пдбсакадб с 21 <210> 13 <21 > 21 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер Ζ019460 <400> 13 а+ааасдШ Т1д1дд1саа с 21 <210> 14 <211> 20 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220 <223> Олигонуклеотидный праймер Ζ019461 <400> 14

Ьдссс1да1с ссасааадсс 20 <210> 15 <211> 20 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220 <223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ19572 <400 15

- 66 014417 дСссТдЬддс ЬдТдЬсСсад 2С <21'0> 16 <211> 20 <212=- ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Олипонуклеотидный праймер ΖΟ19573 <400= 16 садТсададс ссасааадсс 20 <210= 17 <211> 20 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Олипонуклеотидный праймер 2С19657 <400 17 сТоааасаса ассасаааас оп <210> 18 <211> 24 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Опигонуклеотидный праймер 2С19181 <400= 18

СссасаСссс СадддсСсСд ТдаС 24 <210 19 <211= 25 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220= <223> Олипонуклеотидный праймер ΖΟ19182 <400= 19 даддПссас аШхсадда Сдсад 25

- 67 014417 <210 20 <21 > 24 <212>ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер ΖΘ19907 <400= 20 аЕддаЕдЕаЕ ЕссасЕЕсаЕ ддсс 24 <210= 21 <211> 24 <212= ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223=- Олигонуклеотидный праймер Ζΰ19908 <400> 21 асЕдЕсааас дЕдЕссаЕаЕ ссад 24 <210=- 22 <211> 18 <212=- ДНК <213> Синтетическая последовательность <220=<223= Олигонуклеотидный праймер Ζ019954 <400=- 22 асЕдддсЕдд дддасЕдс 18 <210= 23 <211=- 18 <212=- ДНК <213=- Синтетическая последовательность <220=· <223=- Олигонуклеотидный праймер ΖΟ19955 <400> 23 ссссддддсЕ ддЕдаадЕ 18

- 68 014417 <210> 24 <211> 33 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220 <223> Опипонуклеотидный праймер Ζ017212 <400> 24 ддддааНсд аадссаТдсс сксИдддсс ссс 33 <210> 25 <211> 30 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Опипонуклеотидный праймер Ζ019914 <400> 25 сааТдда!дд дЪсШадса дсадТаддсс 30 <210> 26 <211* 30 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ19913 <400> 26 ддсс!ас1дс 1дс1ааадас ссаЪссаНд 30 <210> 27 <211> 33 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер Ζ020097 <400> 27 аса1с1ада1; 1адс1ддсс1 ддддтссадд сдТ 33 <210> 28

- 69 014417 <211=- 21 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Опигонуклеотидный праймер Ζ012700 <400= 28 ддаддБсТаТ аБаадсадад с 21 <210=· 29 <211> 21 <212=· ДНК <213> Синтетическая последовательность <220=<223> Опигонуклеотидный праймер Ζ05020 <400 29 сасТддадТд дсаасБРсса д 21 <210= 30 ' <211=· 20 <212= ДНК <213=- Синтетическая последовательность <220>

<223> Опигонуклеотидный праймер ΖΟ6675 <400=· 30 дТддаРдссд аасссадТсс 20 <210> 31 <211> 21 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Опигонуклеотидный праймер ΖΟ7727 <400= 31

РдИсасадс РассТдддсТ с 21 <210=- 32 <211> 26

- 70 014417 <212= ДНК <213> Синтетическая последовательность <220 <223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ8290 <400=- 32 ссассдадас ЬдсПддаХс ассйд 26 <210=- 33 ' <211=- 21 <212=- ДНК <213= Синтетическая последовательность <220= <223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ6622 <400= 33 сГдддс1дда аасЕддсаса с 21 <210=- 34 ' <211=- 13 <212> ДНК <213= Синтетическая последовательность <220> .

<223=· Олигонуклеотидный праймер ΖΟ7736 <400= 34 сасЬдгсада ааЕддадс 18 <210 35 <211> 24 <212=- ДНК <213=- Синтетическая последовательность <220=· <223= Олигонуклеотидный праймер ΖΟ9273 <400 35 ддЮссЬссс сдддсассда дада 24 <210= 36 <211=- 36 <212=- ДНК

- 71 014417 <213=- Синтетическая последовательность <220=· <223= Олигонуклеотидный праймер Ζ019905 <400= 36 асаддаТссд ТсадсаТдсс дсдТддсКдд дссдсс зб <210=- 37 <211> 33 <212=- ДНК <213=- Синтетическая последовательность <220= <223= Олигонуклеотидный праймер Ζ019906 <400=· 37 асадааИс! !адс!ддсс! ддддЬссадд сдТ 33 <210= 38 <211> 22 <212> ДНК <213= Синтетическая последовательность <220= <223= Олигонуклеотидный праймер Ζ020114 <400= 38 сСТдссйс! аса!дс1даа дд 22 <210=- 39 <211= 18 <212= ДНК <213= Синтетическая последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер Ζϋ19954 <400= 39 асТдддсТдд дддаСТдс 18 <210> 40 <211> 22 <212> ДНК <213=- Синтетическая последовательность

- 72 014417 <220 <223> Олигонуклеотидный праймер Ζ020116 <400 40 адсасадТса сТдШсааТ дд 22 <210> 41 <211* 6 <212> Белок <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> 61и-61и (СЕЕ)-меченая аминокислотная последовательность <400* 41 и Туг МеТ Рго Ме1 21 и

5 <210> 42 <211> 36 <212=- ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ19931 <400> 42 ддйддисс дсаадаТдсс дсдТддсТдд дссдсс 36 <210 43 <211> 29 <212> ДНК <213= Синтетическая последовательность <220 <223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ19932 <400= 43 сддаддагсс д£даддд££с садссйсс 29 <210> 44 <211* 66 <212= ДНК <213> Синтетическая последовательность

- 73 014417 <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер, простирающийся на фланкирующий район вектора и 5’ конец га1рЬа11 <400> 44

РссасРРРдс сРРРсРсРсс асаддрдрсс адддааРРса РсдаРааРдс сдсдрддсрд 60 ддссдс 66 <210> 45 <211> 699 <212> ДНК <213> Ното зартепз <400 45 дадсссадаР сисадасаа аасрсасаса РдсссассдР дсссадсасс Рдаадссдад60 ддддсассдТ садРсРРссР сРРсссссса ааасссаадд асасссРсаР даРсРсссдд120 ассссРдадд РсасаРдсдР ддрддтддас дрдадссасд аадасссРда ддРсаадРРс180 аасРддРасд РддасддсдР ддаддрдсар ааРдссаада сааадссдсд ддаддадсад240

Расаасадса сдрассдрдр ддРсадсдРс сРсассдРсс Рдсассадда сРддсРдааР300 ддсааддадр асаадрдсаа ддРсРссаас ааадсссРсс саРссРссаР сдадаааасс360 аРсРссааад ссааадддса дссссдадаа ссасаддрдр асасссрдсс сссаРсссдд420 дардадсрда ссаадаасса ддРсадссРд ассРдссРдд РсаааддсРР сРаРсссадс480 дасаРсдссд РддадРддда дадсааРддд садссддада асаасРасаа дассасдссР540 сссдРдсРдд асРссдасдд сРссРРсРРс сРсРасадса адсРсассдР ддасаададс600 аддРддсадс аддддаасдр сРРсРсаРдс РссдРдаРдс аРдаддсРсР дсасаассас660 расасдсада ададссРсРс ссРдРсРссд ддРаааРаа699 <210> 46 <211=· 62 <212= ДНК <213> Синтетическая последовательность <220= <223> Первый олигонуклеотидный праймер, простирающийся на 3' конец внеклеточного домена га1рЬа11 и 5' конец Ес4 <400= 46 дсасддрддд сардрдрдад РРРРдРсРда адаРсРдддс РсдРдадддР РссадссРРс 60 сР 62 <210= 47 <211= 61 <212> ДНК

- 74 014417 <213> Синтетическая последовательность <220 <223> Второй олигонуклеотидный праймер, простирающийся на 3' конец внеклеточного домена га!рпа11 и 5’ конец Рс4 <400> 47 адасссадЕс ададдадЕЕа ааддааддсТ ддаасссЕса сдадсссада ТЛЕсадаса 60 ^а 61 <210> 48 <211> 67 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220= <223= Олигонуклеотидный праймер, простирающийся на 3' конец Рс4 и фланкирующий район вектора <400 48 дЕдддссЕсЕ ддддЕдддЕа саассссада дсЕдЕЕТЕаа ЕсЕадаЕЕаЕ ЕЕасссддад 60 асаддда 67 <210= 49 <211> 8 <212> Белок <213> Синтетическая последовательность <220 <223= Е1А8- меченая аминокислотная последовательность <400> 49

Азр Туг ΐγε Азр Азр Азр Азр Еуз

5 <210= 50 <211> 1821 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220 <223> Полинуклеотид, кодирующий слитый белок МБР - растворимый рецептар га!р1та11

- 75 014417

<221> <222> <400> акд ааа акс

СК (1). 50 даа 51 и

..(1821)

даа ддк ааа скд

дка УаТ

акс кдд аН аас ддс дак

ааа куз

48

Мек 1

Ьуз 11 е

ети С1у 5

Ьуз кеи

Пе 10

Тгр

Не

Азп

31у

Азр 15

ддс

как

аас

ддк

скс

дек даа

дке ддк

аад

ааа

Не

дад

ааа

дак

асе

96

61у

Туг

Азп

51у

кеи А1а 51 и

УаТ

51У Ьуз

РЬе

51 и

куз

Азр

ТЬг

20

25

30

дда

аН

ааа

дке

асе

ди

дад

сак

сед

дак

ааа

скд

даа

дад

ааа

ккс

144

61у

П е

кУ5

УаТ

ТЬг

УаТ

51 и

Ж 5

Рго

Азр Ьуз

Ьеи

61и

51 и

1-УЗ

РЬе

35

40

45

сса

сад

дкк

дед

дса

аск

ддс

дак

ддс

сек

дас

аП

акс

ккс

кдд

дса

192

Рго

51 η

Уа1

АТ а

АТа

ТЬг

51у Азр

51У

Рго

Азр

Не

Не

РЬе Тгр А1а

50

55

60

сас

дас

сдс

кН

ддк

ддс

Тае

дек

саа

кек

ддс

скд

Нд

дек

даа

акс

240

Н13

Азр Агд

РЬе

61у 51у

Туг

АТа

б1п

5ег

61у

Ьеи

Ьеи

А1а

О1и

Пе

- 65

70

75

80

асе

ссд дас

ааа

дед

НС

сад

дас

аад

скд

как

ссд

ккк

асе

кдд дак

288

ТЬг

Рго Азр

куз

А1 а

РЬе

61п

Азр ку5

Ьеи

Туг

Рго

РЬе

ТЬг

Тгр Азр

85

90

95

дсс

дка едк

кас

аас

ддс

аад

скд

акк

дек

кас

сед

акс

дек

дкк

даа

336

А1а

Уа1

Агд Туг

Азп

51у

куз

кеи

Пе

А1а

Туг

Рго

Пе

А1а

Уа1

51 и

100

105

по

дед

На

кед

скд

аН

как

аас

ааа

дак

скд скд

ссд

аас

ссд

сса

ааа

384

А1а

кеи

5ег

кеи

Не

Туг

А5П

Ьуз

Азр

1_еи

Ьеи

Рго

Азп

Рго

Рго

Ьуз

115

120

125

асе

кдд

даа

дад

акс

ссд

дед

скд

дак

ааа

даа

скд

ааа

дед

ааа

ддк

432

ТЬг

Тгр

51и 51и

Не

Рго

А1 а

Ьеи

Азр Ьуз

61и

Ьеи

Ьуз

А1а

Ьуз

С1у

130

135

140

аад

аде

дед

скд

акд

Нс

аас

скд

саа

даа

ссд

кас

ккс

асе

кдд

ссд

480

куз

5ег

А1а

кеи

Мер

РЬе Азп

Ьеи

61п

01 и

Рго

Туг

РЬе

ТЬг

Тгр

Рго

145

150

155

160

скд

акк

дек

дсЬ

дас

ддд ддк

как

дед

Не

аад

как

даа

аас

ддс

аад

528

- 76 014417

Ьей

Не

А1а

АТ а

Азр

61 у

61 у

Туг

АЧа

РЬе

Ьуз

Туг

61 и

А5П

61у

ьуз

165

170

175

Рас

дас

ай

ааа

дас

дрд

ддс

дрд

даР

аас

дсР

ддс

дед

ааа

дед

ддр

576

Туг

Азр

Не

Ьуз

Азр

Уа1

61у

УаЧ

Азр

Азп

А1а

61у

А1а

Ьуз

А1а

61у

180

185

190

сРд

асе

РРс

сРд

дРР

дас

сРд

аРР

ааа

аас

ааа

сас

аРд

ааР

дса

дас

624

Ьей

ТЬг

РЬе

Ьей

Уа1

Азр

Ьей

Не

Ьуз

Азп

Ьуз

Ж 5

Мер

Азп

А1а

Азр

195

200

205

асе

даР

Тае

Рсс

аРс

дса

даа

дсР

дсс

РРР

ааР

ааа

ддс

даа

аса

дед

672

ТЬг

Азр

Туг

Зег

Не

А1а

61и

А1а

А1а

РЬе

Азп

Ьуз

61 у

61 и

ТЬг

А1а

210

215

220

аРд

асе

аРс

аас

ддс

сед

рдд

дса

рдд

Рсс

аас

аРс

дас

асе

аде

ааа

720

Мер

ТЬг

Не

Азп

61у

Рго

Тгр

АЧа

Тгр

Зег

Азп

Не

Азр

ТЬг

Зег

ьуз

225

230

235

240

дТд

ааР

ТаР

ддр

дРа

аед

дРа

сРд

сед

асе

РРс

аад

ддр

саа

сса

Рсс

768

Уа1

Азп

Туг

61у

Уа1

ТЬг

Уа1

Ьей

Рго

ТЬг

РЬе

Ьуз

61у

61 п

Рго

Зег

245

250

255

ааа

сед

РРс

дРР

ддс

дрд

сРд

аде

дса

ддр

аРР

аас

дсс

дсс

адр

ссд

816

Рго

РЬе

Уа1

61У

УаЧ

Ьей

Зег

А1а

61у

Не

Азп

ΑΊ а

АЧа

Зег

Рго

260

265

270

аас

ааа

дад

сРд

дса

ааа

дад

РРс

сРс

даа

аас

РаР

сРд

сРд

асР

даР

864

Азп

Ьуз

61и

Ьей

А1 а

Ьуз

61 и

РЬе

Ьей

61 и

Азп

Туг

Ьеи

Ьеи

ТЬг

Азр

275

280

285

даа

ддр

сРд

даа

дед

дРР

ааР

ааа

дас

ааа

сед

сРд

ддр

дсс

дРа

дед

912

61и

61у

Ьей

61 и

А1а

УаТ

Азп

Ьуз

Азр

Ьуз

Рго

Ьеи

61у

А1а

УаЧ

АЧа

290

295

300

сРд

аад

РсР

Рас

дад

даа

дад

РРд

дед

ааа

даР

сса

сдр

аРР

дсс

дсс

960

Ьей

ьуз.

Зег

Туг

61 и

61 и

61и

Ьей

АТа

Ьуз

Азр

Рго

Агд

Не

АЧа

АЧа

305

310

315

320

асе

аРд

даа

аас

дсс

сад

ааа

ддр

даа

аРс

аРд

ссд

аас

аРс

ссд

сад

1008

ТЬг

Мер

51 и

Азп

А1 а

61 π

Ьуз

61у

61 и

Не

Мер

Рго

Азп

Не

Рго

61 п

325

330

335

аРд

Ьсс

дсР

РРс

рдд

Та!

дсс

дрд

сдр

асР

дед

дрд

аРс

аас

дсс

дсс

1056

- 77 014417

МеТ

Зег

А1а

РЬе

Тгр

Туг

АТа

Уа1

Агд

ТЬг

АТа

Уа1

Не

Азп

АТа

АТа

340

345

350

аде

ддт

едТ

сад

асТ

дрс

дат

даа

дсс

сТд

ааа

дас

дед

сад

асТ

ааТ

1104

Зег

61у

Агд

е!п

ТЬг

Уа1

Азр

61и

А1а

Ьеи

Ьуз

Азр

А1а

61п

ТЬг

Азп

355

360

365

Тед

аде

Тсс

сас

саТ

сас

саТ

сас

сас

дед

ааТ

Тед

дТа

ссд

сТд

дп

1152

Зег

Зег

Зег

НТ 5

НТ з

НТз

Ж 5

НТ з

НТ з

А1а

Азп

Зег

Уа1

Рго

Ьеи

УаТ

370

375

380

ссд

едТ

дда

Тсс

Тдс

ссс

дас

сТс

дТс

где

Тас

асе

дат

Тас

сТс

сад

1200

Рго

Агд

61у

Зег

Суз

Рго

Азр

Ьеи

Уа1

Суз

Туг

ТЬг

Азр

Туг

Ьеи

61п

385

390

395

400

асд

дТс

аТс

Тдс

аТс

сТд

даа

аТд

тдд

аас

сТс

сас

ссс

аде

асд

сТс

1248

ТЬг

УаТ

Не

Суз

Не

Ьеи

61 и

МеТ

Тгр

Азп

Ьеи

Нтз

Рго

Зег

ТЬг

Ьеи

405

410

415

асе

сТТ

асе

рдд

саа

дас

сад

ТаТ

даа

дад

сТд

аад

дас

дад

дсс

асе

1296

ТЬг

Ьеи

ТИг

Тгр

51 η

Азр

61 η

Туг

61 и

61 и

Ьеи

Ьуз

Азр

61и

А1 а

ТЬг

420

425

430

Тсс

Тдс

аде

сТс

сас

адд

Тед

дсс

сас

ааТ

дсс

асд

саТ

дсс

асе

Тас

1344

Зег

Суз

Зег

Ьеи

НТ з

Агд

Зег

АТ а

НТ 5

Азп

А1а

ТЬг

НТз

АТа

ТИг

Туг

435

440

445

асе

Тдс

сас

аТд

даТ

дТа

ТТс

сас

ТТс

аТд

дсс

дас

дас

аТТ

ТТс

адТ

1392

Тб г

Суз

Н1 5

МеТ

Азр

УаТ

РЬе

Нтз

РЬе

МеТ

А1 а

Азр

Азр

Не

РЬе

Зег

450

455

460

дТс

аас

аТс

аса

дас

сад

ТсТ

ддс

аас

Тас

Тсс

сад

дад

ТдТ

ддс

аде

1440

Уа1

Азп

Не

ТЬг

Азр

61 η

Зег

61у

Азп

Туг

Зег

61 π

С1и

Суз

61у

Зег

465

470

475

480

ΐίΐ

сТс

сТд

дет

дад

аде

аТс

аад

ссд

дсТ

ссс

ссТ

ТТс

аас

дтд

асТ

1488

РЬе

Ьеи

Ьеи

АТ а

61 и

Зег

Не

Ьуз

Рго

А1а

Рго

Рго

РЬе

Азп

Уа1

ТЬг

485

490

495

дтд

асе

«с

Тса

дда

сад

ТаТ

ааТ

аТс

Тсс

Тдд

сдс

Тса

да!

Тас

даа

1536

Уа1

ТЬг

РЬе

Зег

61 у

6Ίη

Туг

Азп

Не

Зег

Тгр

Агд

Зег

Азр

Туг

61 и

500

505

510

дас

ССЬ

дсс

ТТс

Тас

аТд

сТд

аад

ддс

аад

сТТ

сад

ТаТ

дад

сТд

сад

1584

- 78 014417

Акр Рго А1а РЬе Туг МеХ Ьеи Ьуз 61 у Ьуз

515 520

Ьеи 61 η Туг 61 и Ьеи 61 η

525

Хае адд

аас едд дда дас

ссс Хдд дсС дХд адХ ссд адд ада

аад Ьуз

сХд Ьеи

1632

Туг

Агд 530

А5П Агд

61у

Акр

Рго 535

Тгр

А1а Уа1

Зег Рго 540

Агд

Агд

аХс

Хса

дьд

дас

Хса

ада

адХ дХс

Хсс

сХс

сХс

ссс

сХд

дад

ΐΐε

сдс

1680

11 е Зег

Уа1

Азр

Зег

Агд

Зег

Уа1

Зег

Ьеи

Ьеи

Рго

Ьеи

61и

РЬе

Агд

545

550

555

560

ааа

дас

Хед

аде

ХаХ

дад

сХд

сад

дтд

едд

дса

ддд

ссс

аХд

СС1

ддс

1728

Ьуз

Азр

Зег

Зег Туг

61 и

Ьеи

61п

νβΐ

Агд

А1а

61у

Рго

МеХ

Рго 61у

565

570

575

Тсс

Хсс

Хас

сад

ддд

асе

Хдд

адХ

даа

Хдд

адХ

дас

ссд

дХс

аХс

XXX

1776

Зег

Зег

Туг

61л

61у ТЬг Тгр

5ег

61и Тгр

Зег

Азр

Рго

Уа1

Не РЬе

580

585

590

сад

асе

сад

Хса

дад дад

ХХа

аад

даа

ддс

тдд

аас. ссХ

сас

Хад

1821

61 η

ТЬг

61л

Зег 61и 61 и

Ьеи

Ьуз

61 и 61у Тгр

Азп

Рго

Н15

*

595

600

605

<210> 51 <211> 606 <212> Белок <213> Синтетическая последовательность

<400>

51

МеХ

Ьуз

Не

61 и

61 и

61у

Ьуз

Ьеи

Уа1

Не

Тгр

Не

Αεη

61у

Азр

Ьуз

1

5

10

15

61у

Туг

Азп

61 у

Ьеи

А1а

61 и

Уа1

61 у

Ьуз

Ьуз

РЬе

61 и

Ьуз

Азр

ТЬг

20

25

30

61у

Не

Ьуз

Уа1

ТЬг

Уа1

61и

Н1з

Рго

Азр

Ьуз

Ьеи

61и

61 и

Ьуз

РЬе

35

40

45

Рго

61 η

Уа1

А1а

А1 а

ТЬг

61у

Азр

61у

Рго

Азр

Не

Не

РЬе

Тгр

А1а

50

55

60

Нтз

Азр

Агд

РЬе

61у

61у

Туг

А1а

61 п

Зег

61у

Ьеи

Ьеи

АТ а

61 и

Не

65

70

75

80

ТЬг

Рго

Азр

Ьуз

А1а

РЬе

61п

Азр

Ьуз

Ьеи

Туг

Рго

РЬе

ТЫ

Тгр

Азр

85

90

95

А1а

Уа1

Агд

Туг

Азп

61у

ьуз

Ьеи

11е

А1 а

Туг

Рго

Не

А1а

Уа1

61 и

100

105

ПО

А1а

Ьеи

Зег

Ьеи

Не

Туг

Азп

Ьуз

Азр

Ьеи

Ьеи

Рго

Азп

Рго

Рго

Ьуз

115

120

125

- 79 014417

ТЬг

Тгр

6Ти

61и

Не

Рго

АТа

Теи

Азр

ьуз

61 и

Теи

Туз

А1а

Туз

61у

130

135

140

ТуЗ

Зег

АТ а

Теи

МеС

РЬе

Азп

Теи

61 п

61 и

Рго

Туг

РЬе

ТЬг

Тгр

Рго

145

150

155

160

Теи

Пе

АТа

АТа

Азр

СИу

6Ту

Туг

АТа

РЬе

Туз

Туг

61 и

Азп

61у

Туз

165

170

175

Туг

Азр

Не

Туз

Азр

Уа1

6Ту

Уа1

Аяр

А5П

АТа

61у

АТа

Туз

АТа

61у

180

185

190

1_еи

ТТ1Г

РЬе

Теи

УаТ

Азр

Теи

Пе

Туз

Азп

Туз

Нтз

МеС

Азп

АТа

Азр

195

200

205

ТЬг

Азр

Туг

Зег

Не

АТа

61 и

АТа

АТа

РЬе

Азп

туз

61у

61 и

ТЬг

АТа

210

215

220

МеС

ТЬг

Не

Азп

61у

Рго

Тгр

А1а

Тгр

Зег

Азп

Пе

Азр

ТЬг

Зег

Туз

225

230

235

240

Уа1

Азп

Туг

61у

УаТ

ТЬг

Уа1

Теи

Рго

ТЬг

РЬе

Туз

61 у

61 п

Рго

Зег

245

250

255

Ту2

Рго

РЬе

УаЧ

61 у

Уа1

Теи

Зег

АТа

61у

Пе

Азп

АТа

АТа

Зег

Рго

260

265

270

Азп

1уз

61и

Теи

АТа

Туз

61 и

РЬе

Теи

61и

Азп

Туг

Теи

Теи

ТЬг

Азр

275

280

285

61 и

61у

Теи

61 и

А1 а

Уа1

Азп

Туз

Азр

Туз

Рго

Теи

61у

А1а

УаТ

АТ а

290

295

300

1_еи

ЬУЗ

Зег

Туг

61и

61 и

61 и

Теи

АТа

Туз

Азр

Рго

Агд

Не

АТа

АТа

305

310

315

320

ТЬг

МеС

61 и

Азп

АТа

61 п

Туз

61у

61 и

Пе

МеС

Рго

Азп

Не

Рго

61 π

325

330

335

МеС

Зег

АТа

РЬе

Тгр

Туг

АТа

УаТ

Агд

ТЬг

АТа

УаТ

Пе

Азп

А1 а

А1а

340

345

350

Зег

61У

Агд

61 п

ТЬг

Уа1

Азр

61 и

А1а

Теи

Туз

Азр

АТа

61п

ТЬг

Азп

355

360

365

Зег

Зег

Зег

Η1 з

Ηί 5

Н1з

Н15

НС 5

Н13

А1 а

Азп

Зег

Уа1

Рго

Теи

Уа1

370

375

380

Рго

Агд

61у

Зег

Суз

Рго

Азр

Теи

УаТ

Суз

Туг

ТЬг

Азр

Туг

Теи

СНп

385

390

395

400

ТЬг

УаТ

Не

Суз

Не

Теи

61 и

МеС

Тгр

Азп

Теи

Жз

Рго

Зег

ТЬг

Теи

405

410

415

ТЬг

Теи

ТЬг

Тгр

61 п

Азр

61 п

Туг

61 и

61и

Теи

Азр

61 и

АТа

ТЬг

420

425

430

Зег

Суз

Зег

Теи

Н1 з

Агд

5ег

АТа

НТ 5

Азп

АТа

ТЬг

Н15

АТа

ТЬг

Туг

435

440

445

ТЬг

Суз

Жз

МеС

Азр

Уа1

РЬе

Н15

РЬе

МеС

АТа

Азр

Азр

Не

РЬе

Зег

450

455

460

УаТ

Азп

Не

ТЬг

Азр

61п

Зег

61у

Азп

Туг

Зег

61 п

61 и

Суз

61у

Зег

465

470

475

480

- 80 014417

РЬе

Ьеи

Ьеи

АТа

61 и

Зег

Пе

Ьуз

Рго

АТа

Рго

Рго

РЬе

Азп

УаТ

ТЬг

485

490

495

Уа1

ТЬг

'РЬе

Зег

61у

61 п

Туг

Азп

Пе

Зег

Тгр

Агд

Зег

Азр

Туг

61и

500

505

510

Азр

Рго

АТ а

РЬе

Туг

МеЬ

Ьеи

ьуз

61у

ьуз

Ьеи

61п

Туг

61и

Ьеи

61 η

515

520

525

Туг

Агд

Азп

Агд

61у

Азр

Рго

Тгр

АТа

УаТ

5ег

Рго

Агд

Агд

ьуз

Ьеи

530

535

540

Не

Зег

Уа1

Азр

Зег

Агд

5ег

УаТ

Зег

Ьеи

Ьеи

Рго

Ьеи

61 и

РЬе

Агд

545

550

555

560

ЬуЗ

Азр

Зег

Бег

Туг

61и

Ьеи

61 п

Уа1

Агд

АТа

61у

Рго

Мер

Рго

61у

565

570

575

Зег

Зег

Туг

61 п

61у

ТЬг

Тгр

Зег

61 и

Тгр

Зег

Азр

Рго

УаТ

Пе

РЬе

580

585

590

31 η

ТЬг

61п

Зег

61 и

61и

Ьеи

Ьуз

61 и

61у

Тгр

Аэп

Рго

Н1з

595

600

605

<210

52

<211>

657

<212> ДНК <213> Ното зартелз <400> 52

Ьдссссдасс ТсдкскдсТа сассдабЬас скссадасдд ЬсаЬскдсак ссЬддаааЬд60

ЬддаассТсс ассссадсас дсТсасссН ассСддсаад ассадкакда ададскдаад120 дасдаддсса ссксскдсад ссТссасадд Ьсддсссаса аЬдссасдса Ьдссасскас180 асскдссаса РддаЬдкаЬТ ссасПсаЬд дссдасдаса ЬЫТсадЬдЬ сааса1саса240 дассадксЬд дсааскас!с ссаддадТдЬ ддсадсйЬс Тсс1ддсЬда дадсаЬсаад300 ссддсЬсссс сШсаасд! дасЬдЬдасс ЬЬсЬсаддас адЬаТааЬаЬ сЬссЬддсдс360

ИсадаЬЬасд аадасссЬдс сЬкскасаЬд сЬдаадддса адсйсадга ЬдадсЬдсад420

Гасаддаасс ддддадассс сГдддсЬдЬд адЬссдадда дааадскдак сбсадРддас480

РсаадаадРд ЬсЬсссЬссЬ. ссссскддад ЬТссдсааад асЬсдадска 1дадс1дсад540

Окдсдддсад ддсссаТдсс 1ддс1сс1сс Ьассадддда ссЬддадЬда акддадкдас600 ссддксакск Нсадассса дксададдад Паааддаад дскддаассс т.сас!ад657 <210* 53 ’<211> 65 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ20187 <400> 53

Тсассасдсд ааЬТсддкас сдсРддЬЬсс дсдЬддаЬсс Рдссссдасс Ссд1с1дс1а 60

- 81 014417 сассд 65 <210> 54 <211> 68 <212> ДНК <213* Синтетическая последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер Ζ020185 <400 54

ТАдТаТсад дсТдааааТс НаТЛсаЕс сдссааааса сТадЪдаддд ПссадссИ. 60 ссйЛаас 68 <210 55 <211> 40 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220 <223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ19372 <400> 55 гдСсдаТдаа дсссСдааад асдсдсадас Таайсдадс 40 <210> 56 <211> 60 <212* ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ19351 <400 56 асдсдсадас Таайсдадс ТсссассаТс ассаТсасса сдсдаайсд дТассдсТдд 6С '<210> 57 <211> 60' <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ19352 <400> 57

- 82 014417 астсасТаТа дддсдааНд сссддддда! ссасдсддаа ссадсддТас сдааПсдсд 60 <210= 58 <2И> 42 <212= ДНК <213= Синтетическая последовательность <220= <223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ19371 <400= 58 асддссадТд аа1ЯдЬаа!а сдасТсасТа тадддсдааТ !д 42 <210= 59 <211> 20 <212> ДНК <213= Синтетическая последовательность <220= <223= Олигонуклеотидный праймер ΖΟ22277.

<400= 59 ссаддадТдТ адсадсШс 20 <210= 60 <211> 21 <212= ДНК <213= Синтетическая последовательность <220= <223= Олигонуклеотидный праймер ΖΟ22276 <400= 60 дсйдссс!! садсатдтад а 21 <210= 61 <211> 23 <212= ДНК <213= Синтетическая последовательность <220= <223= Зонд ТарМап га1рИа11, ΖΘ31 <400= 61 сддсЬссссс ШсаасдТд ас! 23

- 83 014417 <210> 62 <2ίϊ> 20 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Оли гону клеотидный праймер ΖΟ23684 <400* 62

Ъсзсссйас йддсаадас 20 <210> 63 <211> 41 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223* Олигонуклеотидный праймер ΖΟ23656 <400> 63

1ааТасдас£ сасТаТаддд адддддадас асПсИдад ί 41 <210> 64 <211* 20 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220 <223> Олигонуклеотидный праймер Ζϋ23685 <400> 64 аддТсТдаа! сссдас1Лд 20 <210> 65 <211> 41 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ23657 <400> 65

1аа£асдас1 сасШаддд аддасд£аа1 £дд!д1Ша ΐ 41

- 84 014417 <210 66 <211> 20 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер, рРНК - прямой праймер <400> бб сддЛассас аЬссааддаа 20 <210> 67 <211> 13 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер, рРНК - обратный праймер <400> 67 дсТддаайа ссдсддс!13 <210> 68 <211> 22 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность' <220* <223> рРНК ТадМал зонд <400> 68

ЬдсЬддсасс адасйдссс 1с22 <210> 69 <211> 1298 <212> ДНК <213> Низ пш5си1ц5 <220>

<221=* С05 <222=- (543)...(1262) <400* 69 аддссШса асасддсШ ЫадЬааПс а11ссаЬс1а 1аааса«1а ТддШасс! 60 ас1д1д£дсс аддСасЬдад дасасадйд ГдаКсадддс ГадГдЬадас асасаадсаа 120

- 85 014417 аасЕададас аЕссддаадЕ дЕсаддадас ддадЕададд сЕдддссасЕ ЕадассЕсад 180 дсЕсЕсссЕд сасасдЕссЕ саадассЕЕа ддасЕЕадда ассЕддЕссс адсасссадс 240 ЕдЕЕссЕЕдд сЕддддсасЕ ддЕаасЕадс дЕддаЕаЕда дасададдас адРсадТссЕ 300 ЕасЕаааддЕ дддаасасдд дсЕсЕдадаа сддасадЕаЕ Едддаассса сЕдддсаддд 360 ддЕЕсасада садасаЕсаЕ ддсдсдсЕсЕ сЕсЕсЕсЕсЕ сЕсЕсЕссЕд ЕЕЕЕсЕЕдЕЕ 420 сЕЕсЕдсЕЕЕ ссссдЕсЕсЕ ддсЕЕдЕссс ЕдЕасЕсссс сссссасссс саЕсЕЕРддс 480 РсРсРсЕдРР сасасссдас сЕЕдЕЕдЕсс ссадсРсаЕд асЕдЕдРдРЕ ЕсЕЕЕсЕсаЕ 540 ад ааа Рдд дЕЕ ааЕ асе ссЕ ЕЕс асд дсс Есс аде аЕа дад ЕЕд дЕд 587

Ьуз Тгр УаТ Азп ТЬг Рго РЬе ТЬг А1а Зег Зег 11е 61и Ееи Уа1

1

5

10

15

сса

сад

адЕ

Рос

аса

аса

аса

Еса

дсс

СЕа

саР

сЕд

Еса

ЕЕд

ЕаЕ

сса

635

Рго

61 п

Зег

Зег

ТЫ

ТЬг

ТЬг

Зег

АТа

Ееи

Н1з

Ееи

Зег

Ьеи

Туг

Рго

20

25

30

дсс

аад

дад

аад

аад

РРс

ссд

ддд

сЕд

ссд

ддЕ

сЕд

даа

дад

саа

ерд

683

А1а

Еуз

61 и

Ьуз

Ьуз

РЬе

Рго

01у

Ьеи

Рго

61у

Ееи

61 и

61ц

61 п

Ьеи

35

40

45

дад

ЕдЕ

даЕ

дда

аЕд

ЕсЕ

дад

ССЕ

ддс

сас

Едд

Еде

аЕа

аЕс

ссс

ЕЕд

731

51 и

Суз

Азр

61у

Мер

Зег

61 и

Рго

6Ту

Н15

Тгр

Суз

Пе

Пе

Рго

Ееи

50

55

60

дса

дсЕ

ддс

саа

дед

дЕс

Еса

дсс

Еас

адЕ

дад

дад

ада

дас

едд

сса

779

А1а

А1а

61у

61п

АТа

Уа1

Зег

АТ а

Туг

Зег

61 и

61 и

Агд

Азр

Агд

Рго

65

70

75

ЕаЕ

ддЕ

сЕд

дрд

Есс

аЕЕ

дас

аса

дед

асЕ

дед

дда

даР

дса

дад

ддс

827

Туг

61 у

Ееи

Уа1

Зег

Не

Азр

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

61 у

Азр

А1а

61 и

61у

80

85

90

95

сРд

ЕдЕ

дЕс

Едд

ссс

ЕдЕ

аде

ЕдЕ

дад

даЕ

даЕ

ддс

ЕаЕ

сса

дсс

аРд

875

Ееи

Суз

Уа1

Тгр

Рго

Суз

Зег

Суз

61 и

А5Р

А5р

61у

Туг

Рго

А1а

МеЕ

100

105

110

аас

сЕд

дар

дсЕ

ддс

еда

дад

СсЕ

ддс

ссЕ

ааР

Еса

дад

даЕ

сРд

сЕс

923

Азп

Ееи

Азр

А1 а

61у

Агд

61и

Зег

61У

Рго

Азп

Зег

61 и

Азр

Ееи

Ееи

115

120

125

ЕЕд

дЕс

аса

дас

ссЕ

дсЕ

ЕЕЕ

сРд

СсЕ

Еде

ддс

ЕдЕ

дЕс

Еса

ддЕ

адЕ

971

Ьеи

Уа1

ТЬг

Азр

Рго

А1 а

РЬе

Ьеи

Зег

Суз

61у

Суз

Уа1

Зег

61у

Зег

130

135

140

ддЕ

СРС

адд

сЕЕ

.дда

ддс

Ссс

сса

ддс

аде

сЕа

сЕд

дас

адд

ЕЕд

адд

1019

- 86 014417

61у

Сеи

Агд

Сеи

61у

61у

Зег

Рго

61у

Зег

Сеи

Сеи

Азр

Агд

Сеи

Агд

145

150

155

сРд

Рса

РРР

дса

аад

даа

ддд

дас

рдд

аса

дса

дас

сса

асе

рдд

ада

1067

Сеи

Зег

РЬе

АТа

Суз

61 и

61 у

Азр

Тгр

ТЬг

АТа

Азр

Рго

ТЬг

Тгр

Агд

160

165

170

175

ас!

ддд

Рсс

сса

дда

ддд

ддс

РсС

дад

адР

даа

дса

ддр

Ссс

ссс

ссР

1115

ТЬг

61 у

Зег

Рго

61у

61у

61у

Зег

61 и

Зег

61 и

АТа

61 у

Зег

Рго

Рго

180

185

190

ддр

сРд

дас

аРд

дас

аса

РРР

дао

адР

ддс

РРР

дса

ддр

Рса

дас

рдр

1163

61У

Сеи

Азр

Мер

Азр

ТЬг

РЬе

Азр

Зег

61у

РЬе

А1а

61у

Зег

Азр

Суз

195

200

205

ддс

аде

ссс

д£д

дад

асР

да!

даа

дда

ссс

ссР

еда

аде

Рас

сСс

сдс

1211

61у

Зег

Рго

УаТ

61 и

ТЬг

Азр

61 и

61у

Рго

Рго

Агд

Зег

Туг

Сеи

Агд

210

215

220

сад

рдд

дрд

д£с

адд

асе

ССР

сса

ссР

дрд

дас

адР

дда

дес

сад

аде

1259

61 п

Тгр

УаТ

Уа1

Агд

ТЬг

Рго

Рго

Рго

УаТ

Азр

Зег

61у

АТ а

61 п

Зег

225

230

235

аде СадсаРаСаа РаассадсРа РадРдадаад аддсср 1298

Зег

240 <210=· 70 <211> 240 <212> Белок <213> Миз тизсиШ <400> 70

Суз Тгр УаТ Азп ТЬг Рго РЬе ТЬг А1а Зег Зег Не 61 и Сеи УаТ Рго

10 15

61п 5ег Зег ТЬг ТЬг ТЬг Зег АТа Сеи Н1з Сеи Зег Сеи Туг Рго АТа

25 30

Суз 61 и Суз Суз РЬе Рго 61у Сеи Рго 61у Сеи 61 и 61 и 61п Сеи 61 и

40 45

Суз

Азр

6Ту

Мер

Зег

61 и

Рго

61у

Н15

Тгр

Суз

Пе

Не

Рго

Сеи

АТа

50

55

60

АТа

61у

61 п

АТа

Уа1

Зег

АТа

Туг

Зег

61 и

61и

Агд

Азр

Агд

Рго

Туг

65

70

75

80

61у

Сеи

УаТ

Зег

Не

Азр

ТЬг

Уа1

ТЬг

УаТ

61у

Азр

АТа

61 и

61у

Сеи

90 95

- 87 014417

Суз \/а1 Тгр Рго Суз Зег Суз 61и Азр Азр 61у Туг Рго А1а Ме1 Азп . . 100 105110

Ьеи Азр А1а 61у Агд 61 и Зег 61у Рго Азп Бег 61 и Азр 1еи 1_еи1_еи

115' 120125

Уа1 ТЬг Азр Рго А1а РЬе Ьеи Зег Суз 61у Суз 1/а1 Зег 61у Зег 61у 130 135140

Ьеи Агд 1_еи 61у 61у Зег Рго 61у Зег 1еи Ьеи Азр Агд 1_еи АгдЬеи

145 150 155160

Зег РЬе А1а Ьуз 61 и 61у Азр Тгр ТЬг А1а Азр Рго ТЬг Тгр АгдТЬг

165 170175

61у Зег Рго 61у 61у 61у Зег 61и Зег 61и А1а 61у Зег Рго Рго 61у

180 185190

Ьеи

Азр

Ме1

Азр

ТЬг

РЬе

Азр

Зег

61у

РЬе

А1а

61у

Зег

Азр

Суз

61у

195

200

205

Зег

Рго

7а1

61 и

ТЬг

Азр

61 и

61у

Рго

Рго

Агд

Зег

Туг

1еи

Агд

61 η

210

215

220

Тгр

Уа1

Уа1

Агд

ТЬг

Рго

Рго

Рго

Уа1

Азр

Зег

61у

А1а

61 η

Зег

Зег

225

230

235

240

<210> 71 <211=· 23 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220= <223= Олигонуклеотидный праймер ΖΟ24432 <400> 71 аСдРсбдадс с1ддгсас1д д±д 23 <210= 72 <211= 23 <212=- ДНК <213> Синтетическая последовательность <220= '<223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ24433 <400=· 72

РсТдаассТд сааадссас! дТс 23 <210> 73 <211> 27 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность

- 88 014417 <220 <223= Олигонуклеотидный праймер ΖΟ9739 <400= 73 сса!сс!аа! асдас!сас! а!адддс 27 <210 74 <211= 22 <212= ДНК <213= Синтетическая последовательность <220= <223= Олигонуклеотидный праймер ИС24434 <400> 74 сассад!дас саддсРсада са 22 <210= 75 <211= 23 <212= ДНК <213> Синтетическая последовательность <220 <223= Олигонуклеотидный праймер ΖΟ24431 <400= 75 сса!сасас! ссад!!дс!с !!с 23 <210= 76 ' <211= 23 <212= ДНК <213= Синтетическая последовательность <220= <223= Олигонуклеотидный праймер ΖΟ9719 <400= 76 ас!сас!а!а дддсТсдадс ддс 23 <210= 77 <211= 23 <212= ДНК <213= Синтетическая последовательность

- 89 014417 <220= <223= Олигонуклеотидный праймер ΖΟ24511 <400 77

РссадсаРад адРРддРдсс аса <210>

<211= <212>

<213=

592

ДНК

Миз тизсиТиз <220=* <221= <222=

СОЗ (436)...(592) <400= сдсссдддса ддРсРссдсР ддРддсссРд РдРРРсадРс дсдсасадсР дрсрдсссас РРсРссРдРд дРдРдссРса сддРсасРРд сРРдРсРдас сдсаадРсРд сссаРсссРд дддсадссаа сРддссРсад сссдрдсссс аддсдрдссс РдРсРсРдРс РддсРдсссс адсссРасРд РсРРссРсРд РдРаддсРсР дсссадаРдс ссддсРддРс сРсадссРса ддасРаРсРс адсадРдасР ссссРдаРРс РддасРРдса ссРдасРдаа сРссРдссса ссРсааассР РсассРссса ссассассас рссдадРссс дсРдРдасРс ссасдсссад дадассассс аадрдсссса дссРааадаа РддсРРСсТд аддаадаРсс рдааддадРа ддРсРдддас асадс аРд ссс сдд ддс сса дрд дсР дсс РРа сРс сРд сРд Мер Рго Агд 61у Рго Уа1 А1а А1а Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи 5

120

180

240

300

360

420

471

аРР

сРс

саР

дда

дсР

Рдд аде

рдс сРд

дгс

сРс

а ср

Рдс

Рас

асР

дас

Не

Ьеи

Н1з

61у

АЧа

Тгр Зег

Суз Ьеи

Хаа

Ьеи

ТЬг

Суз

туг

ТЬг

Азр

15

20

25

Рас

сРс

тэд

асе

аРс

асе РдР

дРс сРд

дад

аса

сдд

аде

ссс

аас

ссс

Туг

Ьеи

Тгр

ТЬг

Не

ТЬг Суз

УаЧ Ьеи

61 и

ТЬг

Агд

Зег

Рго

Азп

Рго

30

35

40

аде

аРа

сРс

адР

сРс

асе Рдд

саа д

Зег

11е

Ьеи

5ег

Ьеи

ТЬг Тгр

61п

519

567

592 <210>

<211= <212= <213=

Белок

Миз гаизси1из <220>

- 90 014417 <221> Вариант <222> (1)...(51) <223> Хаа = Любая аминокислота

-=400=- 79

МеТ

Рго

Агд

61у

Рго

\1а1

А1а

А1 а

|_еи

!еи

Ьеи

Ьеи

Не

Ьеи

Ηί 5

31у

1

5

10

15

А1а

Тгр

5ег

Суз

Ьеи

Хаа

Ьеи

ТЬг

Суз

Туг

ТЬг

Азр

Туг

Ьеи

Тгр

ТЬг

20

25

30

Не

ТЬг

Суз

УаТ

Ьеи

61 и

ТЬг

Агд

Зег

Рго

Аэп

Рго

Зег

11е

Теи

Зег

35

40

45

Ьеи ТЬг Тгр 51 и •=210=· 80 =211= 1229 <212= ДНК <213> Миз яизсиТиз <220= <221= СОЗ <222> (3)...(1196) <400= 80 да сдс Та! да! а!с !сс !дд дас !са дс! !а! дас даа ссс Тсс аас 47

Агд Туг Азр 11е Зег Тгр Азр 5ег А1а Туг Азр 61и Рго Зег Азп

1

5

10

15

!ас

д!д

с!д

ада

ддс

аад

с!а

саа

Та!

дад

с!д

сад

!а!

сдд

аас

с!с

95

Туг

Уа1

Ьеи

Агд

61у

Ьуз

Ьеи

61п

Туг

61 и

Ьеи

61п

Туг

Агд

Азп

Ьеи

20

25

30

ада

дас

ссс

Та!

дс!

д£д

аад

ссд

дтд

асе

аад

с!д

а!с

!са

д!д

дас

143

Агд

Азр

Рго

Туг

А1а

Уа1

Агд

Рго

Уа1

ТЬг

Ьуз

Ьеи

Не

Зег

Уа1

Азр

35

40

45

!са

ада

аас

д!с

!с!

с!!

с!с

сс!

даа

дад

!!с

сас

ааа

да!

!с!

аде

191

Зег

Агд

Азп

\1а1

5ег

Ьеи

Ьеи

Рго

61 и

61 и

РЬе

Нт з

Ьуз

Азр

Зег

Зег

50

55

60

Тае

сад

стд

сад

а!д

сдд

дса

дед

сс!

сад

сса

ддс

ас!

!са

!!с

адд

239

Туг

61п

Ьеи

61 п

Ме!

Агд

А1а

А1 а

Рго

61п

Рго

б1у

ТЬг

Зег

РЬе

Агд

65

70

75

999

асе

С99

ад!

дад

!дд

ад!

дас

ссс

д!с

а!с

!!!

сдд

асе

сад

дс!

237

- 91 014417

61у

ТЬг

Тгр

Зег

61 и

Тгр

Зег

Азр

Рго

УаТ

Не

РИе

Агд

ТЫ

61 п

А1 а

80

85

90

95

999

дад

ссс

Зад

дса

ддс

кдд

дас

сск

сас

акд

скд

скд

скс

скд

дек

335

61у

61и

Рго

61 и

А1а

61 у

Тгр

Азр

Рго

НТЗ

Мек

кеи

кеи

кеи

Ьеи

А1 а

100

105

110

Экс

ккд

акс

абк

дке

скд

дкк

ккс

акд

ддк

скд

аад

акс

сас

скд

сск

383

Уа1

кеи

Пе

Пе

Уа1

Ьеи

УаТ

РЬе

Мек

61у

кеи

куз

Не

Нт з

кеи

Рго

115

120

125

кдд

адд

ска

кдд

ааа

аад

ака

кдд

дса

сса

дкд

ссс

асе

сск

дад

адк

431

Тгр

Агд

кеи

Тгр

Ьуз

куз

Не

Тгр

А1а

Рго

Уа1

Рго

ТЫ

Рго

61 и

5ег

130

135

140

ккс

ккс

сад

ссс

скд

кде

адд

дад

сас

аде

ддд

аас

ккс

аад

ааа

кдд

479

РКе

Р1те

61 п

Рго

1еи

Суз

Агд

61 и

НТЗ

Зег

61 у

Азп

Рбе

куз

Ьуз

Тгр

145

150

155

дкк

аак

асе

сск

ккс

асд

дсс

ксс

аде

аТа

дад

ккд

дкд

сса

сад

адк

527

Уа1

Азп

ТЬг

Рго

РЬе

ТЫ

А1а

Зег

Зег

Пе

61 и

Ьеи

Уа1

Рго

61 п

Зег

160

165

170

175

ксс

аса

аса

аса

кса

дсс

кка

сак

скд

кса

ккд

как

сса

дсс

аад

дад

575

Зег

ТЫ

ТЬг

ТЫ

Зег

А1а

1еи

Н15

кеи

Зег

кеи

Туг

Рго

А1а

куз

61 и

180

185

190

аад

аад

ккс

ссд

ддд

скд

ссд

ддк

скд

даа

дад

саа

скд

дад

кдк

дак

623

куз

куз

РГте

Рго

61у

кеи

Рго

61у

кеи

61 и

61и

61п

кеи

61и

Суз

Азр

200

195

205

дда

акд

кек

дад

сск

ддк

сас

кдд

кде

ака

акс

ссс

ккд

дса

дек

ддс

61у

Мек

Зег

61 и

Рго

61 у

Н1з

Тгр

Суз

Пе

Не

Рго

1_еи

А1 а

А1а

61 у

210

215

220

саа

дед

дке

кса

дсс

кас

адк

дад

дад

ада

дас

сдд

сса

как

ддк

скд

61п

А1а

Уа1

Зег

А1а

Туг

Зег

61и

61 и

Агд

Азр

Агд

Рго

Туг

61У

Ьеи

225

230

235

дкд

ксс

акк

дас

аса

дкд

аск

дкд

дда

дак

дса

дад

ддс

скд

кдк

дке

УаТ

Зег

11е

Азр

ТЫ

УаТ

ТЪг

Уа1

61 у

Азр

А1 а

61 и

б1у

Ьеи

суз

УаТ

240

245

250

255

кдд

ссс

кдк

аде

кдк

дад

дак

дак

ддс

как

сса

дсс

акд

аас

скд

дак

671

719

767

815

- 92 014417

Тгр

Рго

Суз

Зег

Суз

61 и

Азр

Азр

61у

Туг

Рго

А1а

МеС

Азп

Сеи

Азр

260

265

270

дет

ддс

еда

дад

СсС

ддс

ссС

ааС

Сса

дад

даС

сСд

сСс

ССд

дСс

аса

863

А1а

61у

Агд

61 и

Зег

61у

Рго

АЗП

5ег

61и

Азр

Сеи

Сеи

Сеи

УаТ

ТЬг

275

280

285

дас

ссс

дсс

т

сСд

сес

Сдс

ддс

СдС

дСс

Сса

ддс

адС

ддс

сСс

адд

911

Азр

Рго

А1 а

РЬе

Сеи

Зег

Суз

61у

Суз

Уа1

Зег

61у

Зег

•61у

Сеи

Агд

290

295

300

ей

дда

ддс

Ссс

сса

ддс

аде

сСа

сСд

дас

адд

ССд

адд

сСд

Сса

ССС

959

Сеи

61у

61у

Зег

Рго

61у

Зег

1_еи

1_еи

Азр

Агд

Ьеи

Агд

Сеи

Зег

РЬе

305

310

315

дса

аад

даа

ддд

дас

Сдд

аса

дса

дас

сса

асе

едд

ада

асС

ддд

Ссс

1007

А1 а

Суз

61 и

61у

Азр

Тгр

ТЬг

А1а

Азр

Рго

ТЬг

Тгр

Агд

ТЬг

61у

Зег

320

325

330

335

сса

дда

ддд

ддс

СсС

дад

адС

даа

дса

ддс

Ссс

ссс

.ссС

ддс

сСд

дас

1055

Рго

б1у

61у

61у

Зег

61и

Зег

61 и

А1а

61у

5ег

Рго

Рго

61у

Сеи

Азр

340

345

350

аСд

дас

аса

ссс

дас

адС

ддс

ССС

дса

ддс

Сса

дас

СдС

ддс

аде

ссс

1103

МеС

А5Р

ТЬг

РЬе

Азр

Зег

61у

РЬе

А1а

61у

Зег

Азр

Суз

61у

Зег

Рго

355

360

365

Г-д

дад

асС

дат

даа

дда

ссс

ссС

еда

аде

СаС

сСс

сде

сад

едд

дтд

1151

Уа1

61 и

ТЬг

Азр

61 и

61у

Рго

Рго

Агд

5ег

Туг

Сеи

Агд

61п

Тгр

Уа1

370*

375

380

дСс

адд

асе

ссС

сса

ССС

дед

дас

адС

дда

дсс

сад

аде

аде

Сад

1196

УаТ

Агд

ТЬг

Рго

Рго

Рго

Уа1

Азр

Зег

61у

А1а

61п

Зег

Зег

*

385

390

395

саСаСааСаа ссадсСаСад Сдадаададд ссС 1229 <210> 81 <211> 397 <212> Белок <213> Миз тизси1из <400* 31

Агд Туг Азр Не Зег Тгр Азр 5ег А1а Туг Азр 61и Рго Зег Азп Туг 15 Ю 15

- 93 014417

Уа1

Ьеи

Агд

61у

Ьуз

Ьеи

61 п

Туг

61 и

Ьеи

61п

Туг

Агд

Азп

Ьеи

Агд

20

25

30

Азр

Рго

Туг

АТа

1/а1

Агд

Рго

Уа1

ТЬг

Ьу£

Ьеи

Не

Зег

Уа1

Азр

Зег

35

40

45

Агд

Азп

Уа1

Зег

Ьеи

Ьеи

Рго

61 и

61 и

РЬе

Н1 з

Ьуз

Азр

Зег

Зег

Туг

50

55

50

31 η

Ьеи

61п

МеЬ

Агд

А1а

АТа

Рго

61 п

Рго

61у

ТЬг

Зег

РЬе

Агд

61 у

65

70

75

80

ТИг

Тгр

Зег

61 и

Тгр

Зег

Азр

Рго

Уа1

Не

РЬе

Агд

ТЬг

61 п

ΑΊ а

61у

55

90

95

61 и

Рго

61 и

А1а

61у

Тгр

Азр

Рго

Ж 5

МеЬ

Ьеи

Ьеи

Ьеи

Ьеи

А1 а

Уа1

100

105

110

Ьеи

Не

11е

Уа1

Ьеи

Уа1

РЬе

МеЬ

61у

Ьеи

Ьуз

Не

Ж 5

Ьеи

Рго

Тгр

115

120

125

Агд Ьеи Тгр Ьуз Ьуз Не Тгр АТа Рго Уа1 Рго ТЬг Рго 61и Зег РЬе

130

135

140

РЬе

61 п

Рго

Ьеи

Суз

Агд

61 и

Жз

Зег

61у

Азп

РЬе

Ьуз

Ьуз

Тгр

УаТ

145

150

155

160

Азп

ТЬг

Рго

РЬе

ТЬг

А1а

Зег

Зег

11е

61 и

Ьеи

Уэ1

Рго

61 п

Зег

Зег

165

170

175

ТЬг

ТЬг

ТЬг

Зег

АТа

Ьеи

НТ 5

Ьеи

Зег

Ьеи

Туг

Рго

АТа

Ьуз

61 и

ьуз

180

185

190

ьуз

РЬе

Рго

61 у

Ьеи

Рго

61у

Ьеи

61 и

61 и

61п

Ьеи

61и

Суз

Азр

61у

195

200

205

МеЬ

Зег

61 и

Рго

61у

Н15

Тгр

Суз

Не

Не

Рго

Ьеи

А1а

А1а

61 у

61 п

210

215

220

А1а

Уа1

Зег

ΑΊ а

Туг

Зег

61 и

61и

Агд

Аэр

Агд

Рго

Туг

61у

Ьеи

УаТ

225

230

235

240

Зег

Не

Азр

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

61у

Азр

АТа

61и

61у

Ьеи

Суз

Уа1

Тгр

245

250

255

Рго

Суз

Зег

Суз

61 и

Азр

Азр

61 у

Туг

Рго

А1а

МеЬ

Азп

Ьеи

Азр

А1а

260

265

270

61у

Агд

61 и

Зег

61у

Рго

Азп

Зег

61 и

Азр

Ьеи

Ьеи

Ьеи

УаТ

ТЬг

Азр

275

280

285

Рго

А1 а

РЬе

Ьеи

Зег

Суз

61У

Суз

Уа1

Зег

61у

Зег

С1у

Ьеи

Агд

Ьеи

290

295

300

61у

61у

Зег

Рго

61У

Зег

Ьеи

Ьеи

Азр

Агд

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

РЬе

А1а

305

310

315

320

ЬУЗ

61 и

61У

Азр

Тгр

ТЬг

АТ а

Азр

Рго

ТЬг

Тгр

Агд

ТЬг

61у

Зег

Рго

325

330

335

61у

61у

61у

Зег

61 и

Зег

61 и

АТа

61у

Зег

Рго

Рго

61у

Ьеи

Азр

МеЬ

340

345

350

Азр

ТЬг

РЬе

Азр

Зег

61у

РЬе

А1 а

61 у

Зег

Азр

Суз

21У

Зег

Рго

Уа1

355

360

365

- 94 014417

Θ1 и ТЫ Азр 61 и 21у Рго Рго Агд 5ег Туг Геи Агд 51 η Тгр Уа1 Уа1

370 375 зао

Агд ТЬг Рго Рго Рго Уа1 А5р 5ег 61у А1а 61п Зег 5ег

385 390 395 <210 82 <211> 23 <212=· ДНК <213= Синтетическая последовательность <220= <223= Олигонуклеотидный праймер ΖΟ24616 <400> 82 сЬдсссассг сааасспса ссТ 23 <210= 83 <211= 24 <212= ДНК <213= Синтетическая последовательность <220= <223= Олигонуклеотидный праймер Ζ024615 <400= 83 атдсЬадсЬд сТсГдддсЬс сасГ 24 <210= 84 <211» 1735 <212=- ДНК <213= Миз тизси1из <220= <221= Сй5 <222= (143)...(1729) <400= 84 срдсссасср сааассЫса ссЬсссасса ссассасЬсс дадТсссдсЬ дрдастссса60 сдсссаддад ассасссаад гдссссадсс ЬааадааЬдд сШхЬдада аадасссЬда120 аддадЬаддЬ сЬдддасаса дс аЬд ссс сдд ддс сса дед дсЬ дсс Па сЬс172

МеТ Рго Агд 61у Рго Уа1 А)а А1а Ьеи Ьеи

1510 сЬд сЬд аЫ сТс саЬ дда дет Ьдд аде Ьдс сЬд дас сЬс ась где Ьас 220

- 95 014417

268

асХ дас Хас сХс Хдд асе аХс асе Хдх дхс

ТЬг Азр Туг Ьеи Тгр ТЫ Не ТЫ Суз Уа1

35 сХд дад аса едд аде ссс

Ьеи 61 и ТЫ Агд Зег Рго аас ссс аде аХа сХс адХ сХс асе Хдд саа

Азп Рго Зег Не Ьеи Зег Хеи ТЫ Тгр 67п

50 даХ даа ХаХ дад даа

Азр 61и Туг 61и 61и еХХ Ьеи

316 сад дас саа дад асе ХХс где аде сХа

С1п Азр 61 п 61 и ТЫ РЬе Суз Зег Ьеи 60 65 сас адд ХсХ

Н1з Агд Зег ддс сас аас асе

61у Нтз Азп ТЫ

364

аса

саХ

аХа

ьдд

Хас

асд

Хдс

саХ

аХд

сде

ХХд

ХсХ

саа

ίΐο

с£а

1сс

ТЬг 75

Н15

Не

Тгр

Туг

ТЫ 80

Суз

Н1з

МеХ

Агд

Хеи 85

Зег

61п

РЬе

Хеи

Зег 90

даХ

даа

дхх

ХХс

аХХ

дХс

ааХ

дтд

асд

дас

сад

ХсХ

уде

аас

аас

1сс

Азр

61 и

Уа1

РЬе

Не

УаТ

Азп

Уа1

ТЫ

Азр

61 п

Зег

61у

Азп

Азп

Зег

95

100

105

412

460 саа дад ХдХ ддс аде XXX дХс сХд дсХ дад аде аХс ааа п 61 и Суз 61у Зег РЬе V® Хеи А1 а 61 и Зег Не Ьуз

110 115 сса дсХ ссс

Рго А1а Рго

120

508 ссс ХХд аас дХд асХ

Рго Хеи Азп Уа1 ТЫ

125 дХд дсс ХХе Хса дда еде ХаХ даХ

7а1 А1а РЬе Зег 61у Агд Туг Азр ¹³⁰ 135 аХс Хсс Хдд Не Зег Тгр

556 дас Хса дсХ ХаХ дас даа

Азр Зег А1а Туг Азр 61 и

140 ссс Хсс аас Хас дХд сХд адд ддс аад сХа

Рго Зег Азп Туг Уа 1 Ьеи Агд 61у Хус Хеи

145 150

604

саа	ХаХ	дад	сХд
61п	Туг	61и	Хеи
155
ссд	дтд	асе	аад
Рго	Уа1	ТЬг	Ьуз
ссХ	даа	дад	ХХс

сад	ХаХ	едд	аас	сХс	ада	дас	ссс	ХаХ	дсХ	дхд	адд
61 п	Туг	Агд	Азп	Хеи	Агд	Азр	Рго	Туг	А1а	Уа 1	Агд
	160					165					170
сХд	аХс	Хса	дтд	дас	Хса	ада	аас	дхс	ХсХ	сХХ	сХс
Хеи	Не	Зег	Уа1	Азр	Зег	Агд	Азп	Уа1	Зег	Хеи	Хеи
175					180					185
сас	ааа	даХ	ХсХ	аде	Хас	сад	сХд	сад	дХд	едд	дса

652

700

748

Рго

61и

61 и

РЬе

Нтз

Ьуз

Азр

Зег

Зег

Туг

61п

Ьеи

61п

Уа1

Агд

А1 а

190

195

200

дед

ссЕ

сад

сса

ддс

асЕ

Еса

ЕЕс

адд

ддд

асе

Едд

адЕ

дад

Едд

адЕ

796

А1а

Рго

61п

Рго

СТу

ТЬг

Зег

РЬе

Агд

61у

ТЬг

Тгр

Зег

61 и

Тгр

Зег

205

210

215

дас

ссс

дЕс

аЕс

ЕЕЕ

сад

асе

сад

дсЕ

ддд

дад

ссс

дад

дса

ддс

Едд

844

Азр

Рго

Уа1

Не

РЬе

61 п

ТЬг

61 п

АТа

61У

61 и

Рго

61и

АТа

б1у

Тгр

220

225

230

дас

ссЕ

сас

а Ед

сЕд

сЕд

сЕс

сЕд

дсЕ

дЕс

ЕЕд

аЕс

аЕЕ

дЕс

сЕд

дЕЕ

892

Азр

Рго

Нтз

МеЕ

Ьеи

Ьеи

Ьеи

Ьеи

А1 а

Уа1

Ьеи

Не

Не

Уа1

Ьеи

Уа1

235

240

245

250

ЕЕс

аЕд

ддЕ

сЕд

аад

аЕс

сас

сЕд

ссЕ

Едд

адд

сЕа

Едд

ааа

аад

аЕа

940

РЬе

МеЕ

С1у

Ьеи

Ь№

Не

Нтз

Ьеи

Рго

Тгр

Агд

Ьеи

Тгр

Ьуз

Ьуз

Не

255

260

265

Едд

дса

сса

дтд

ссс

асе

ссЕ

дад

адЕ

ЕЕс

ЕЕс

сад

ссс

сЕд

Еас

адд

988

Тгр

АТа

Рго

Уа1

Рго

ТЬг

Рго

61 и

Зег

РЬе

РЬе

61 п

Рго

Ьеи

Туг

Агд

270

275

280

дад

сас

аде

999

аас

ЕЕс

аад

ааа

Едд

дЕЕ

ааЕ

асе

ССЕ

ЕЕс

асд

дсс

1036

51 и

Нтз

Зег

61у

Азп

РЬе

Ьуз

Ьуз

Тгр

УаТ

Азп

ТЬг

Рго

РЬе

ТЬг

А1а

285

290

295

Есс

аде

аЕа

дад

ЕЕд

дЕд

сса

сад

адЕ

Есс

аса

аса

аса

Еса

дсс

ЕЕа

1084

Зег

5ег

Не

61и

Ьеи

Уа1

Рго

61 п

Зег

Зег

ТЬг

ТЬг

ТЬг

Зег

А1 а

Ьеи

300

305

310

саЕ

сЕд

Еса

ЕЕд

ЕаЕ

сса

дсс

аад

дад

аад

аад

ЕЕс

ссд

ддд

сЕд

ссд

1132

Нтз

Ьеи

Зег

Ьеи

Туг

Рго

АТа

Ьуз

61 и

Ьуз

Ьуз

РЬе

Рго

61 у

Ьеи

Рго

315

320

325

330

ддЕ

сЕд

даа

дад

саа

сЕд

дад

ЕдЕ

даЕ

дда

аЕд

ЕсЕ

дад

ссЕ

ддЕ

сас

1180

61 у

Ьеи

.61 и

61 и

61п

Ьеи

61и

Суз

Азр

61у

МеЕ

Зег

61 и

Рго

61 у

Нтз

335

340

345

Тдд

Еде

аЕа

аТс

ссс

ЕЕд

дса

дсЕ

ддс

саа

дед

дЕс

Еса

дсс

Еас

адЕ

1228

Тгр

Суз

Не

Не

Рго

Ьеи

А1а

А1а

61у

61 η

АТа

Уа1

Зег

А1 а

Туг

Зег

350

355

360

дад

дад

ада

дас

едд

сса

ЕаЕ

ддЕ

сЕд

дЕд

Есс

аЕЕ

дас

аса

дЕд

асЕ

1276

- 97 014417

61и

61и

Агд

Азр

Агд

Рго

Туг

61у

!еи

Уа1

Зег

Пе

Азр

ТЬг

Уа1

ТЬг

365

370

375

д!д

дда

да!

дса

дад

ддс

с!д

!д!

д!с

!дд

ссс

!д!

аде

!д!

дад

да!

1324

Уа1

51у

Азр

А1а

61 и

61у

Ьеи

Суз

Уа1

Тгр

Рго

Суз

Зег

Су5

61 и

Азр

380

385

390

да!

ддс

!а!

сса

дсс

а!д

аас

с!д

да!

дс!

ддс

еда

дад

!с!

ддс

сс!

1372

Αερ

61у

Туг

Рго

А1а

Ме!

Азп

Ьеи

Азр

А1а

61у

Агд

61 и

Зег

61у

Рго

395

400

405

410

а а!

!са

дад

да!

с!д

С!С

!!д

д!с

аса

дас

сс!

дс!

!!!

с!д

!с!

!дс

1420

Азп

Зег

61 и

Азр

Ьеи

Ьеи

Ьеи

Уа1

ТЬг

Азр

Рго

А1а

РЬе

!еи

Зег

Суз

415

420

425

ддс

!д!

дсс

!са

дд!

ад!

дд!

с!с

адд

с!!

дда

ддс

!сс

сса

ддс

аде

1468

61у

Суз

Уа1

Зег

61у

Зег

61у

Ьеи

Агд

!еи

61у

61у

Зег

Рго

61у

5ег

430

435

440

с!а

с!д

дас

адд

!!д

адд

с!д

!са

!!!

дса

аад

даа

ддд

дас

!дд

аса

1516

Ьеи

Ьеи

Азр

Агд

Ьеи

Агд

1_еи

Зег

РЬе

А1а

Ьуз

61 и

61у

Азр

Тгр

ТЬг

445

450

455

дса

дас

сса

асе

!дд

ада

ас!

ддд

!сс

сса

дда

ддд

ддс

!с!

дад

ад!

1564

А1а

Азр

Рго

ТЬг

Тгр

Агд

ТЬг

61у

Зег

Рго

61у

61у

61у

Зег

61 и

Зег

460

465

470

даа

дса

дд!

!сс

ссс

сс!

дд!

с!д

дас

а!д

дас

аса

!!!

дас

ад!

90С

1612

61и

А1 а

61у

Зег

Рго

Рго

61у

Ьеи

А5р

Ме!

Азр

ТЬг

РЬе

Азр

Зег

61у

475

480

485

490

!!!

дса

дд!

!са

дас

!д!

ддс

аде

ссс

д!д

дад

ас!

да!

даа

дда

ссс

1660

Гте

А1а

61у

Зег

Азр

Суз

61у

Зег

Рго

Уа1

61 и

ТЬг

Азр

61 и

31у

Рго

495

500

505

ее!

еда

аде

!а!

с!с

сдс

сад

!дд

д!д

д!с

адд

асе

ее!

сса

ее!

д!д

1708

Рго

Агд

Зег

Туг

Ьеи

Агд

61п

Тгр

Уа1

Уа1

Агд

ТЬг

Рго

Рго

Рго

УаТ

510

515

520

дас ад! дда дсс сад аде аде !адса! 1735

Азр Зег 61 у А1а 61 η Зег Зег

525 <210> 85

- 98 014417 <211> 529 <212=- Белок <213> Миз шизсиСиз <400= 85

МеС Рго Агд 61у Рго Уа1 АТа АТа [.ей Сеи Сеи Сеи IIе Сеи Нтз 61у 15 10 15

АТа Тгр Зег Суз Сеи Азр Сеи ΤΤίγ Суз Туг ТЬг Азр Туг Сеи Тгр ТЬг 20 25 30

Не ТЬг Суз УаТ Сеи 61 и ТЬг Агд Зег Рго Азп Рго 5ег Не Сеи Зег

35

40

45

Сеи

ТЬг

Тгр

61 п

Азр

61и

Туг

61 и

61 и

Сеи

61 п

Азр

61 п

61 и

ТЬг

РЬе

50

55

60

Суз

Зег

Сеи

Нтз

Агд

5ег

61у

Нтз

Азп

Птг

ТЬг

Н15

Пе

Тгр

Туг

ТЬг

65

70

75

80

Суз

Н1 3

МеС

Агд

Сеи

Зег

61 η

РЬе

Сеи

Зег

Азр

61 и

Уа1

РЬе

Не

УаТ

85

90

95

Азп

УаТ

Тпг

Азр

61п

Зег

61у

Азп

Азп

Зег

61 п

61 и

Суз

61 у

Зег

РЬе

100

105

110

УаТ

Сеи

АТа

61и

Зег

Пе

Суз

Рго

АТ а

Рго

Рго

Сеи

Азп

УаТ

ТЬг

УаТ

115

120

125

АТа РЬе 5ег 61у Агд Туг Азр Не Зег Тгр Азр Зег АТа Туг Азр 61и

130

135

140

Рго

Зег

Азп

Туг

Уа1

Сеи

Агд

61у

суз

Сеи

61 п

Туг

61 и

Сеи

61 п

Туг

145

150

155

160

Агд

Азп

Сеи

Агд

Азр

Рго

Туг

А1а

УаТ

Агд

Рго

УаТ

ТЬг

Суз

Сеи

Не

165

170

175

Зег

УаТ

Азр

Зег

Агд

Азп

УаТ

Зег

Сеи

Сеи

Рго

61 и

61 и

РЬе

Нтз

Суз

180

185

190

Азр

Зег

Зег

Туг

61 п

Сеи

61 п

Уа1

Агд

АТа

АТ а

Рго

61 п

Рго

61у

ТЬг

195

200

205

Зег

РЬе

Агд

ету

ТЬг

Тгр

Зег

61 и

Тгр

Зег

Азр

Рго

УаТ

Пе

РЬе

61 π

210

215

220

ТЬг

61п

АТа

61у

61 и

Рго

61и

АТа

61у

Тгр

Азр

Рго

Нтз

МеС

Сеи

Сеи

225

230

235

240

Сеи

Сеи

АТа

Уа1

Сеи

11е

Не

УаТ

Сеи

УаТ

РЬе

МеС

61у

Сеи

Суз

Пе

245

250

255

Нтз

Сеи

Рго

Тгр

Агд

Сеи

Тгр

Суз

Суз

Пе

Тгр

АТа

Рго

УаТ

Рго

ТЬг

260

265

270

Рго

61 и

Зег

РЬе

РЬе

етп

Рго

Сеи

Туг

Агд

61и

Н1з

Зег

61у

Азп

РЬе

275

280

285

Суз

Суз

Тгр

Уа1

Азп

ТЬг

Рго

РЬе

ТЬг

АТа

Зег

Зег

Не

61 и

Сеи

УаТ

290

295

300

Рго

61 п

Зег

Зег

ТЬг

ТЬг

ТЬг

Зег

АТа

Сеи

Нтз

Сеи

Зег

Сеи

Туг

Рго

305

310

315

320

- 99 014417

АТа

Суз

61 и

Суз

Суз

РЬе

Рго

61у

Сеи

Рго

61у

Сеи 61 и

61 и

61 п

Сеи

325

330

335

61 и

Суз

Азр

61 у

МеС

Зег

61 и

Рго

61у

Нтз

Тгр

Суз Не

Пе

Рго

Сеи

340

345

350

А1а

А1а

61у

61 п

АТа

УаТ

Зег

А1а

Туг

Зег

61 и

61 и Агд

Азр

Агд

Рго

355

360

365

Туг

СТу

Ьеи

УаТ

Зег

Пе

Азр

ТЬг

УаТ

ТЬг

УаТ

61у Азр

АТа

61и

61у

370

375

380

Сеи

Суз

УаТ

Тгр

Рго

Суз

Зег

Суз

61 и

Αερ

Азр

61у Туг

Рго

АТ а

МеС

385

390

395

400

Азп

Сеи

Азр

А1а

61у

Агд

61 и

Зег

61 у

Рго

Азп

Зег 61 и

Азр

Сеи

Сеи

405

410

415

Ьеи

УаТ

ТЬг

Азр

Рго

АТа

РЬе

Сеи

Зег

Суз

61у

Суз УаТ

Зег

61у

Зег

420

425

430

61у Ьеи Агд Ьеи 61у 61у Зег Рго 61 у Зег Сеи Сеи Азр Агд Сеи Агд

435

440

445

Сеи

Зег РЬе

АТа

Суз

61и

61у

Азр

Тгр

ТЬг

АТа

Азр

Рго

ТЬг

Тгр

Агд

450

455

460

ТЬг

61у Зег

Рго

61у

61 у

61у

Зег

61 и

Зег

61 и

АТа

61у

Зег

Рго

Рго

465

470

475

480

61у

Сеи Азр

МеС

Азр

ТЫ

РЬе

Азр

Зег

61у

РЬе

АТа

61у

Зег

Азр

Суз

485

490

495

61у

Зег Рго

УаТ

61и

ТЬг

Азр

61 и

61у

Рго

Рго

Агд

Зег

Туг

Сеи

Агд

500

505

510

61 п

Тгр Уа1

Уа1

Агд

ТЫ

Рго

Рго

Рго

УаТ

Азр

Зег

61у

АТа

61 п

Зег

515

520

525

Зег <210 86 <211= 16 <212= ДНК

-=213=- Синтетическая последовательность <220>

<223=- Олигонуклеотидный праймер Ζ03424 <400= 86 аасадсСаСд ассаСд 16 <210> 87 <211> 20 <212=- ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

- 100 014417

-=223=- Олигонуклеотидный праймер ΖΟ694 <400= 87

1аа1асдасС сасбаСаддд 20 <210> 88 <211=- 20 <212= ДНК <213= Синтетическая последовательность <220= <223= Олигонуклеотидный праймер ΖΟ24399 <400= 88 адсддСсСса дссТасадТд 20 <210= 89 <211= 20 <212= ДНК <213= Синтетическая последовательность <220= \_/дин ипуплсм ι идпрм праймер <400> 89

СдадсСдддд асаасааддС 20 <210= 90 <211= 20 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220= <223= Олигонуклеотидный праймер ΖΟ24806 <400= 90

Тдасдаассс Гссаасбасд 20 <210= 91 <211= 20 <212= ДНК <213= Синтетическая последовательность <220= <223= Олигонуклеотидный праймер ΖΟ24807 <400= 91

Тдсис+садс саддасааад

Claims (46)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Экспрессирующий вектор, содержащий следующие функционально связанные элементы: промотор транскрипции;

   полинуклеотид, кодирующий зрелый полипептид /а1рка11 рецептора цитокина человека класса Ι или его функциональные компоненты, имеющие аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична полипептиду, выбранному из группы, состоящей из:

   (a) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 237 (Н1к) 8ЕО ΙΌ N0: 2 (цитокинсвязывающий домен);

   (b) последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 255 (Ьеи) 8ЕО ΙΌ N0: 2 (цитокинсвязывающий домен и трансмембранный домен);

   (c) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 256 (Ьук) до аминокислоты номер 538 (8ег) 8ЕО ΙΌ N0: 2 (внутриклеточный домен) и (б) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 538 (8ег) 8ЕО ΙΌ N0: 2 (зрелый полипептид); и терминатор транскрипции;

   причем промотор функционально связан с полинуклеотидом, а полинуклеотид функционально связан с терминатором транскрипции.
2. 2. Вектор по п.1, в котором полинуклеотид кодирует зрелый полипептид /а1рка11 рецептора цитокина человека класса Ι или его функциональные компоненты, имеющие последовательность полинуклеотидов, выбранную из группы, состоящей из:

   (a) полинуклеотидной последовательности от нуклеотида 126 до нуклеотида 779 8ЕР ΙΌ N0: 1 (полинуклеотид, кодирующий цитокинсвязывающий домен);

   (b) полинуклеотидной последовательности от нуклеотида 126 до нуклеотида 833 8 Ер ΙΌ N0: 1

   - 101 014417 (полинуклеотид, кодирующий цитокинсвязывающий домен и трансмембранный домен);

   (с) полинуклеотидной последовательности от нуклеотида 834 до нуклеотида 1682 8ЕЦ ГО N0: 1 (полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный домен) и (б) полинуклеотидной последовательности от нуклеотида 126 до нуклеотида 1682 8ЕЦ ГО N0: 1 (полинуклеотид, кодирующий зрелый полипептид).
3. 3. Вектор по п.1, в котором полипептид 7а1рка11 имеет последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из (a) последовательности от аминокислоты номер 20 (Су®) до аминокислоты номер 237 (Ηί®) 8ЕЦ ГО N0: 2 (цитокинсвязывающий домен);

   (b) последовательности от аминокислоты номер 20 (Су®) до аминокислоты номер 255 (Ьеи) 8ЕЦ ГО N0: 2 (цитокинсвязывающий домен и трансмембранный домен);

   (c) последовательности от аминокислоты номер 256 (Ьу®) до аминокислоты номер 538 (8ег) 8ЕЦ ГО N0: 2 (внутриклеточный домен) и (б) последовательности от аминокислоты номер 20 (Су®) до аминокислоты номер 538 (8ег) 8ЕЦ ГО N0: 2 (зрелый полипептид).
4. 4. Вектор по п.1, в котором полипептид дополнительно содержит домен \С8Х\С8 (8ЕЦ ГО N0: 3).
5. 5. Вектор по любому из пп.1-3, в котором полипептид (а), (с), (б) дополнительно содержит трансмембранный домен.
6. 6. Вектор по п.5, где трансмембранный домен состоит из остатков 238 (Ьеи) - 255 (Ьеи) 8ЕО ГО N0: 2.
7. 7. Вектор по любому из пп.1-3, в котором полипептид (а), (Ь), (б) дополнительно содержит внутриклеточный домен.
8. 8. Вектор по п.7, в котором внутриклеточный домен состоит из остатков 256 (Ьу®) - 538 (8ег) 8ЕО ГО N0: 2.
9. 9. Вектор по п.8, в котором внутриклеточный домен дополнительно содержит сайты Вох I и Вох II.
10. 10. Вектор по любому из пп.1-3, в котором полипептид дополнительно содержит аффинную метку, кофактор, ингибитор, флуоресцентный маркер, хемилюминесцентный маркер, аффинную метку, метку биотина/авидина, радионуклида, метку фермент/субстрат, токсин, цитотоксическую молекулу или домен Рс иммуноглобулина.
11. 11. Культивируемая клетка, содержащая экспрессирующий вектор по любому из пп.1-10, продуцирующая зрелый полипептид 7а1рка11 или его функциональные компоненты.
12. 12. Способ получения зрелого полипептида 7а1рка11 или его функциональных компонентов, включающий культивирование клетки согласно п.11 и выделение полипептида 7а1рка11 или его функциональных компонентов, продуцируемых культивированной клеткой.
13. 13. Зрелый полипептид 7а1рка11 или его функциональные компоненты, полученные способом по п.12.
14. 14. Зрелый полипептид 7а1рка11 или его функциональные компоненты по п.13, имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из:

    a) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 20 (Су®) до аминокислоты номер 255 (Ьеи) 8ЕЦ ГО N0: 2 (цитокинсвязывающий домен);

    b) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 20 (Су®) до аминокислоты номер 255 (Ьеи) 8ЕЦ ГО N0: 2 (цитокинсвязывающий домен и трансмембранный домен);

    c) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 256 (Ьу®) до аминокислоты номер 538 (8ег) 8ЕЦ ГО N0: 2 (полный внутриклеточный домен);

    б) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 20 (Су®) до аминокислоты номер 538 (8ег) 8ЕЦ ГО N0: 2 (зрелый полипептид).
15. 15. Зрелый полипептид 7а1рка11 или его функциональные компоненты по п.14, имеющий последовательность аминокислотных остатков, выбранную из группы, состоящей из:

    a) последовательности от аминокислоты номер 20 (Су®) до аминокислоты номер 255 (Ьеи) 8ЕЦ ГО N0: 2 (цитокинсвязывающий домен);

    b) последовательности от аминокислоты номер 20 (Су®) до аминокислоты номер 255 (Ьеи) 8ЕЦ ГО N0: 2 (цитокинсвязывающий домен и трансмембранный домен);

    c) последовательности от аминокислоты номер 256 (Ьу®) до аминокислоты номер 538 (8ег) 8ЕЦ ГО N0: 2 (внутриклеточный домен) и

    б) последовательности от аминокислоты номер 20 (Су®) до аминокислоты номер 538 (8ег) 8ЕЦ ГО N0: 2 (зрелый полипептид).
16. 16. Зрелый полипептид 7а1рка11 или его функциональные компоненты по п.14, дополнительно содержащий домен \С8Х\С8 (8ЕЦ ГО N0: 3).
17. 17. Зрелый полипептид 7а1рка11 или его функциональные компоненты по пп.14, 15 или 16, в котором полипептид (а), (с), (б) дополнительно содержит трансмембранный домен.
18. 18. Зрелый полипептид 7а1рка11 или его функциональные компоненты по п.17, в котором транс

    - 102 014417 мембранный домен состоит из остатков 238 (Ьеи)-255 (Ьеи) 8ЕО ΙΌ N0: 2.
19. 19. Зрелый полипептид ха1р11а11 или его функциональные компоненты по пп.14, 15 или 16, в котором полипептид (а), (Ь), (б) дополнительно содержит внутриклеточный домен.
20. 20. Зрелый полипептид ха1рйа11 или его функциональные компоненты по п.19, в котором внутриклеточный домен включает остатки 256 (Ьук)-538 (8ег) 8Е0 ΙΌ N0: 2.
21. 21. Зрелый полипептид ха1рйа11 или его функциональные компоненты по п.20, в котором внутриклеточный домен дополнительно содержит сайты Вох Ι и Вох ΙΙ.
22. 22. Зрелый полипептид ха1рйа11 или его функциональные компоненты по пп.14, 15 или 16, дополнительно содержащий аффинную метку, кофактор, ингибитор, флуоресцентную индикаторную частицу, хемилюминесцентную индикаторную частицу, маркер биотин/авидин, радионуклид, маркер фермент/субстрат, токсин, цитотоксическую молекулу или домен Ес иммуноглобулина.
23. 23. Зрелый полипептид ха1р11а11 или его функциональные компоненты по п.15, состоящий из последовательности аминокислотных остатков от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 237 (Н1к) 8Е0 ΙΌ N0: 2 (цитокинсвязывающий домен) и дополнительно содержащий трансмембранный домен гетерологичного рецептора цитокина.
24. 24. Зрелый полипептид ха1р11а11 или его функциональные компоненты по п.23, в котором гетерологичный рецептор цитокина является рецептором цитокина класса Ι.
25. 25. Зрелый полипептид ха1р11а11 или его функциональные компоненты по п.23, дополнительно содержащий трансмембранный домен и внутриклеточный домен гетерологичного рецептора цитокина.
26. 26. Зрелый полипептид ха1р11а11 или его функциональные компоненты по п.25, в котором гетерологичный рецептор цитокина является рецептором цитокина класса Ι.
27. 27. Зрелый полипептид ха1р11а11 или его функциональные компоненты по п.15, состоящий из последовательности аминокислотных остатков от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 255 (Ьеи) 8Е0 ΙΌ N0: 2 (цитокинсвязывающий домен и трансмембранный домен) и дополнительно содержащий внутриклеточный домен гетерологичного рецептора цитокина.
28. 28. Зрелый полипептид ха1р11а11 или его функциональные компоненты по п.27, в котором гетерологичный рецептор цитокина является рецептором цитокина класса Ι.
29. 29. Зрелый полипептид ха1р11а11 или его функциональные компоненты по п.15, состоящий из последовательности аминокислотных остатков от аминокислоты номер 256 (Ьук) до аминокислоты номер 538 (Ьеи) 8Е0 ΙΌ N0: 2 (внутриклеточный домен), и где полипептид дополнительно содержит трансмембранный домен и цитокинсвязывающий домен гетерологичного рецептора цитокина.
30. 30. Зрелый полипептид ха1р11а11 или его функциональные компоненты по п.29, в котором гетерологичный рецептор является рецептором цитокина класса Ι.
31. 31. Зрелый полипептид или его функциональные компоненты по п.15, состоящий из последовательности аминокислотных остатков от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 538 (Ьеи) 8Е0 ΙΌ N0: 2 (зрелый полипептид).
32. 32. Антитело, которое специфически связывается с полипептидом по п.14.
33. 33. Конструкция ДНК, кодирующая слитый белок, в состав которого входит зрелый полипептид ха1р11а11 рецептора цитокина человека класса Ι или его функциональных компонентов по п.13, содержащая первый сегмент ДНА, кодирующий полипептид, имеющий последовательность аминокислотных остатков, выбранную из группы, состоящей из:

    (a) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 2 (Ме!) до аминокислоты номер 19 (С1у) 8Е0 ΙΌ N0: 2 (секреторная сигнальная последовательность);

    (b) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер

    237 (Н1к) 8Е0 ΙΌ N0: 2 (цитокинсвязывающий домен);

    (c) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 255 (Ьеи) 8Е0 ΙΌ N0: 2 (цитокинсвязывающий домен и трансмембранный домен);

    (б) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 255 (Ьеи) до аминокислоты номер 255 (Ьеи) 8ес.| ΙΌ N0: 2 ( трансмембранный домен);

    (е) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 238 (Ьеи) до аминокислоты номер 538 (8ег) 8Е0 ΙΌ N0: 2 (трансмембранный домен и внутриклеточный домен);

    (1) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 256 (Ьук) до аминокислоты номер

    238 (8ег) 8Е0 ΙΌ N0: 2 (внутриклеточный домен);

    (д) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 538 (8ег) 8Е0 ΙΌ N0: 2 (зрелый полипептид), и по меньшей мере один сегмент ДНК, кодирующий дополнительный полипептид, причем первый и другие сегменты ДНК соединены в рамке считывания.
34. 34. Экспрессирующий вектор, содержащий следующие функционально связанные элементы: промотор транскрипции; конструкцию ДНК, кодирующую слитый белок по п.33; и терминатор транскрипции, причем промотор функционально связан с конструкцией ДНА, а конструкция ДНА функционально связана с терминатором транскрипции.
35. 35. Культивируемая клетка, содержащая экспрессирующий вектор по п.34, продуцирующая слитый

    - 103 014417 белок.
36. 36. Способ получения слитого белка, предусматривающий культивирование клетки по п.35 и выделение полипептида, продуцируемого этой клеткой.
37. 37. Выделенный полинуклеотид, кодирующий зрелый полипептид ха1рНа11 рецептора цитокина человека класса Ι или его функциональные компоненты по любому из пп.13-22.
38. 38. Выделенный полинуклеотид по п.37, в котором полинуклеотид, кодирующий зрелый полипептид ха1рНа11 рецептора цитокина человека класса Ι или его функциональные компоненты, имеет последовательность полинуклеотидов, выбранную из группы, состоящей из:

    (a) последовательности полинуклеотидов от нуклеотида 126 до нуклеотида 779 8 Ер ΙΌ NО: 1 (полинуклеотид, кодирующий цитокинсвязывающий домен);

    (b) последовательности полинуклеотидов от нуклеотида 126 до нуклеотида 833 8ЕР ΙΌ NО: 1 (полинуклеотид, кодирующий цитокинсвязывающий домен и трансмембранный домен);

    (c) последовательности полинуклеотидов от нуклеотида 834 до нуклеотида 1682 8Ер ΙΌ NО: 1 (полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный домен) и (б) последовательности нуклеотидов от нуклеотида 126 до нуклеотида 1682 8Ер ΙΌ NО: 1 (полинуклеотид, кодирующий зрелый полипептид).
39. 39. Выделенный полинуклеотид по п.37, в котором зрелый полипептид ха1рНа11 или его функциональные компоненты состоят из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из:

    (a) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер

    237 (Н1к) 8Ер ΙΌ NО: 2 (цитокинсвязывающий домен);

    (b) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 255 (Ьеи) 8Ер ΙΌ NО: 2 (цитокинсвязывающий домен и трансмембранный домен);

    (c) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 256 (Ьук) до аминокислоты номер 538 (8ег) 8Ер ΙΌ NО: 2 (внутриклеточный домен) и (б) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 20 (Сук) до аминокислоты номер 538 (8ег) 8Ер ΙΌ NО: 2 (зрелый полипептид).
40. 40. Выделенный полинуклеотид по п.37, в котором зрелый полипептид ха1рНа11 или его функциональные компоненты дополнительно содержат домен ν8Χν8 (8Ер ΙΌ NО: 3).
41. 41. Выделенный полинуклеотид по пп.37, 38 или 39, в котором полипептид (а), (с) дополнительно содержит трансмембранный домен.
42. 42. Выделенный полинуклеотид по п.41, в котором трансмембранный домен состоит из остатков

    238 (Ьеи) - 255 (Ьеи) 8Ер ΙΌ ^: 2.
43. 43. Выделенный полинуклеотид по пп.37, 38 или 39, в котором полипептид (а), (Ь) дополнительно содержит внутриклеточный домен.
44. 44. Выделенный полинуклеотид по п.43, в котором внутриклеточный домен состоит из остатков 256 (Ьук) - 538 (8ег) 8Ер ΙΌ ^: 2.
45. 45. Выделенный полинуклеотид по п.44, в котором внутриклеточный домен дополнительно содержит сайты Вох Ι и Вох ΙΙ.
46. 46. Выделенный полинуклеотид по пп.37, 38 или 39, в котором полипептид дополнительно содержит аффинную метку, маркер биотин/авидин, радионуклид, маркер фермент/субстрат, кофактор, ингибитор, флуоресцентный маркер, хемилюминесцентный маркер, токсин, цитотоксичную молекулу или домен иммуноглобулина Рс.