JPH06503961A - Ｇ蛋白結合性グルタミン酸受容体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

Ｇ蛋白結合性グルタミン酸受容体 背東技街 神経細胞接合部の大部分は化学シナプスである。神経伝達物質は、典型的にはニ ューロンでの活性電位の出現に応じて前シナプス末端から放出され、後シナプス 末端の膜受容体蛋白質に結びつくためにシナプス間を渡って拡散する。膜受容体 への神経伝達物質の結合は、前シナプス細胞の透過性の変化や、代謝の変化の発 生のどちらにも共役されている。 神経伝達物質は、それらが結合する受容体の型によって異なる効果を生ずる。 一般には、開始が迅速で接続が短い効果を生み出すものはりガント−ゲーテイツ トイオンチャネルとして働く受容体に結合し、そこでの結合はほとんど直ちにシ ナプス後細胞の膜を越えるイオン流動を起こす、より好ましい局所化学メディエ ータ−として作用する神経伝達物質は、細胞内酵素に連結されている受容体に結 合する。その結果、よりゆっくりとした開始とより長くのばされた効果を生ずる 。 それらの神経伝達物質は、シナプス後細胞の中で、細胞内セカンドメソセンジャ ーの濃度を変える。 ４つのセカンドメツセンジャーシステムは、神経伝達細胞やホルモン受容体に連 結されており、神経の興奮性の制御におけるそれらの役目が研究されてきた。 それらは、アデニシートシクラーゼ／サイクリックＡＭＰ依存性プロティンキナ ーゼシステム、アデニレートシクラーゼおよびｃＧＭＰ依存性プロティンキナー ゼ、イノシトール三リン酸／ジアシルグリセロール−プロティンキナーゼＣシス テム、カルシウムイオンによって活性化されるシステム（カルシウム／カルモジ ュリン依存性プロティンキナーゼシステムのような）である、このように、レセ プターへの伝達物質の結合は、例えば、アデニレートシクラーゼを活性化し、そ の結果、ｃＡＭＰの細胞内濃度が上昇する。ｅＡＭＰは、細胞中の蛋白質をリン 酸化するプロティンキナーゼを活性化してイオンチャネルが形成され、それによ り細胞の電気的挙動を変化させる。リガンド−ゲーテイソトイオンチャネル伝達 物質については、その効果は、興奮性および抑制性の両方である。そして、遺伝 子発現のパターンを含む細胞に、多くのレベルで影響を及ぼすであろう、セカン ドメソセンジャーシステムを付随するこれらの化学シナプスには学ぶことと記憶 の細胞的根拠を含む長期の変化が含まれているであろうと信じられている。 リガンドで活性化された膜受容体は、直接セカンドメンセンジャーシステムを活 性化しないが、しかしながら、膜結合タンパク質を経て、細胞膜の細胞質表面上 にＧＴＰを結合しているＧＴＰ−結合蓋白質（Ｇ−蛋白）を活性化し、そしてそ の結果、膜受容体にアデニレートシクラーゼを結合させるように作用する。膜受 容体への神経伝達物質の結合は脂質二重層中のＧ蛋白の活性化を可能にするため に受容体蛋白質のコンホメーションを変化させると信じられており、次に細胞質 表面でＧＴＰを結合し、Ｇ蛋白の活性化（例えばアデニレートシクラーゼ分子の ｃＡＭＰの合成）を可能にするＧ蛋白中の更なる変化を生み出す、リガンドが受 容体に結合した場合、酵素のカスケードは、それぞれの受容体がＧ−蛋白のいろ いろな分子を活性化することの結果として生ずる。そのＧ蛋白のいろいろな分子 は、次にさらにたくさんのＡＴＰをｃＡＭＰ分子に変えるアデニレートシクラー ゼの分子を活性化させ、最初の出来事から著しい増幅を生ずる。 グルタミン酸、アスパラギン酸およびそれらの内因性誘導体は、を推動物の中枢 神経組織中で、主な興奮性神経伝達物質であると考えられている。　（Ｋｒｉｎ ｊｒｖｉｃ。 伽珈、５４：４１８−５４０．１９７４）最近、グルタミン酸は神経内分泌ニュ ーロンの制御において、あるいは神経内分泌システムばかりでなくさらに視床下 部領域での制御においても主要で広範囲な役目を果たしていると記載されている 。グルタミン酸受容体の４つの主なサブクラスは、それらの特性付けが最近まで は薬理学的、そして電気生理学的機能の分析に限られてきたと記載されている。 一般的には、Ｈｏ１ｌｓａｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３４２：６４３− ６４８（１９８９）およびＳｏｗｅｒ　ｅｔ　ａｌ、＋　５ｃｉｅｎｃｅ@２４ ９： １５８０−１５８５（１９９０）を参照、３つのレセプターは、キスカル酸（Ｑ ＾／ＡＭＰＡ）　、カイニン酸（Ｋ＾）、Ｎ−メチル−Ｄ−アルパラギン酸（Ｎ ＭＤＡ）受容体であるが、それらは、直接、陽イオン特異イオンチャネルに結合 すると考えられており、従ってリガンド−ゲーテイツトイオン性の受容体として 分類されている。４番目のグルタミン酸受容体はイオン性受容体（キスカル酸、 グルタミン酸、しかし八ＭＰＡを除く）の一部のアゴニストに結合する。しかし 、アンタゴニストを共有することなく、Ｇ−タンパク質に結合されてしまう、従 ってＧ蛋白結合グルタミン酸受容体またはＧ１１１゜Ｒと称されるこの受容体は 他の主なグルタミン酸受容体とは薬理学的、機能的に異なる。この受容体もまた 、代謝性受容体と呼ばれてきた。 Ｇｌｕ　ａ　Ｒへのアゴニストの結合は研究された系に依存し、多数のセカンド メツセンジャーシステムの活性化を生しることが示されている。最もよい特徴づ けのひとつは、イノシトールリン脂質代謝の促進を導くＧ蛋白結合相互作用を通 したホスホリパーゼＣのキスカル酸活性化である。この活性は、グルタミン酸に よる？＋１激に応した放射性同位元素によってｌｊ［議されたイノシトール−リ ン酸の蓄積を測定するシステムで研究されている。典型的にはそのシステムでは 、海馬状隆起、線条体、大脳皮質、視床下部のような領域からの脳スライスや、 （Ｎｉｃｏｌｅｔｔｉ、ｅｔａｌ、、　Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｅｉ 、ｌｌ５Ａ　８３：１９３１−１９３５（１９８６）、およびＮ１ｃｏｌｅｔｔ ｉ、ｅｔ@ａｌ、。 Ｊ、Ｎｅｕｒｏｅｈｅ＋ｓ、４６：４Ｏ−４６（１９８６））　、マウス胎児お よびラットの小脳、線条体、大脳皮質から誘導された神経細胞の培養組織（Ｎｉ ｅｏｌｅｔｔｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、６：１９０５−１９ １１　（１９８６）、５ｌａｄｅｃｚｅｋ　ｅｔ　ａｌ、Ｊ夏（吐Ｌ３１７：７ １７−７１９（１９８５）　、Ｄｕ＊ｕｉｓ、ｅｔ　ａ戟A。 與恍ヒ３４７　：１８２−１８４　（１９９０）、および、Ｄｒｅｊｅｒ　ｏｔ 　ａｌ、、Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、７：２９１０−２９１６i１９８７））、 ラットの脳ンナプトソーム（Ｒｅｃａｓｅｎｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｐ ｈａｒｍ、１４１：８７−９３　（１９８７）、およびＲｅｃａｓｅｎｓ　ｅｔ 　ａｌ、、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｓ、Ｉｎｔ、　１３：４６３−４６７（１９８８） ）を用いている。それぞれのそれらのモデルシステムの主な不都合な点は、ムス カリンとセロトニン受容体のような他のグルタミン酸受容体とＧ蛋白結合受容体 が存在する環境で、薬理学的、機能的なＧｌｕ　Ｇ　Ｈの活性を分析することは 難しいということである。 ゼノバス（χｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞システムは、Ｇ蛋白結合性受容体のファミ リーの一員としてのＧｌｕ　Ｇ　Ｒを同定するために用いられてきた。卵母細胞 中の内因性イノシトール三リン酸セカンドメンセンジャー媒介経路は全うット脳 ｓ＋ＲＮＡの注入後のＧｌｕ　ｅ　Ｒの検出を可能にし、そこでは電圧固定記録 により遅延した脈動電流として検出できる卵母細胞Ｇ蛋白結合性Ｐ　１．、、　 Ｃ媒介塩素チャネルの活性を経て卵母細胞はりガントに応答する。（Ｈｏｕａｍ ｅｄ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３１０：３１８−３２１（１９８４）、 Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　、　す匹」η鮭」匹、Ｂ２２１：１２７− １４３（１９８４）　、Ｄａｓｃａｌ　ｅｔ　ａｌ、　。 Ｍｏ１．Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　１：３０１−３０９（１９８６）、Ｖｅｒｄｏ ｏｒｎ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２３８：１１１４|１１１６（１９８ ７）、 Ｓｕｇｉｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３２５：５３１−５３３（１ ９８７）、旧ｒｏｎｏ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎｅｕｒｏｓ、Ｒｅ刀A６：１０６ １１４（＋９８８）　、ＶｅｒｄｏｏｒｎとＤｉｎｇｌｅｄｉｎｅ、　顕しハａ ｒ−ａｃｏ１．３４：２９８−３０７（１９８８）、およびＳｕｇｉｙａｍａ　 ｅｔ　ａｌ、、Ｎｅｕｒｏｎ　３：１２９−１３２（１９８９）、）？ｉｌ域特 異性脳ｗＲＮ＾の注入と、大きさを分けた＋＊ＲＮＡの注入は、Ｇｌｕ　Ｇ　Ｒ が巨大な一１１Ｎ＾（６−７ｋｂ）であろうということと、小脳中に豊富である ということを暗示している。　（Ｆｏｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　鉦凹匹Ｌ２：６５ ７−６６５（１９８８）およびＨｏｒｉｋｏｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｅｕｒ ｏｓｃｉ、Ｌｅｔｔ−１１０５：３４０−３４３（１９８９）、j 単離されおよび精製されたＧｌｕ　ＧＲ、ならびに他の神経伝達物質受容体から 分離されたＧｌｕ　ｃ　Ｒを発現できる系に対し本分野ではかなりの要求がある 。さらにまた、細胞中や組織中でのＧｌｕ　Ｇ　Ｈの存在を特異的に同定するこ とが望まれており、それにより時間を浪費し、複雑で特異的でない機能的な電気 生理学的および薬理学的分析を避けることができる。　Ｇｌｕ　ＧＲに特異的な 新しいアゴニストおよび／またはアンタゴニストをスクリーンし、開発すること もまた望ましい、しかし現在のところこれは実際的ではない０本当に驚くことに 、本発明は、それらのそして他の関連のある要求を満たしている。 発盟少開示 本発明は哺乳類のＧ蛋白結合性グルタミン酸受容体およびその断片の単離されお よび実質的に純粋な調製試料を提供する。好適な実施１！様においては、受容体 はを推動物の細胞中で（Ｊ白に結合し、グルタミン酸とキスカル酸を結合しその 結果ホスホリパーゼＣを活性化させ、イノシトールリン脂質代謝に刺激を与える ことを可能にしている。単離し、精製した形でそのような受容体を提供するとと もに発明はまた、抗血清および／またはモノクローナル抗体の形で受容体に対す る抗体も提供する。 本発明の他の！ａ樺では岨換え法によって好適には真核生物の細胞を培養して、 哺乳類のＧ蛋白結合グルタミン酸受容体とポリペプチドおよびその断片を産生ず るための手段を提供している。発現された受容体または断片は対応する天然の受 容体の生物学的活性をもっていてもいなくもよく、および発現に使用された細胞 中のＧ蛋白に結合しても結合しなくてもよい、従って単離精製されたポリヌクレ オチドは、受容体とその断片をコードしており、ここでポリヌクレオチドはｃＤ ＮＡのようなりＮＡまたはＲＮＡの形で存在しているであろう、これらの配列に 基づいて哺乳類Ｇ蛋白結合性グルタミン酸受容体をコード化してい今これらおよ び関連する遺伝子にハイブリダイズおよび同定するためのプローブが使用される であろう、プローブは完全長ｃＤＮＡまたは１４から２５ヌクレオチドのように 小さなものでもよいが、より頻繁には約４０から約５０またはそれ以上のヌクレ オチドである。 関連した実施Ｕ様においては、本発明は転写プロモータ、受容体または断片をコ ードしているＤＮＡ配列、および転写ターミネータ（各々は受容体の発現のため に作動可能なように結合されている）を含むＤＮＡ構成物に関している０発現の ため構成物はまた少くとも１つのシグナル配列を含んでいるであろう、構成物は 好適には真核生物細胞を形質転換またはトランスフェクトするのに使用される、 より好適には内因性Ｇ蛋白結合グルタミン酸受容体を発現しない哺乳類細胞、グ ルタミン酸やキスカル酸のような適当なりガントが結合された場合、受容体は宿 主細胞中でＧ蛋白との結合を通してホスホリパーゼＣを活性化するであろう。さ らに、大規模産生のため、発現された受容体は細胞から例えば免疫親和性精製に より単離されるであろう。 Ｇ蛋白結合グルタミン酸受容体を発現する細胞はまた真核生物細胞の受容体媒介 代謝を変えることができる化合物の同定に使用できるであろう、化合物は受容体 への結合および／または宿主細胞中の受容体媒介代謝の変化に影響を与えること でスクリーニングされる。Ｇ蛋白結合グルタミン酸受容体のアゴニストおよび／ またはアンタゴニストもまた細胞を含まない系中で精製受容体またはその結合断 片を用いて、リガンド−受容体相互作用により、または代謝的変化を評価する能 力を提供するミセルのような再構成系を用いてスクリーニングされた。 さらに別の実施態様においては、本発明は診断のための方法に関しており、生物 試料中の哺乳ＭＧ蛋白結合グルタミン酸受容体の存在が決定されるであろう。 例えばＧ蛋白結合グルタミン酸受容体を特異的に結合する単一特異性抗体が免疫 複合体形成の助けとなる条件下試料とインキスベートされ、次に複合体が検出さ れる（典型的には酵素、蛍光発色団、放射性核種、化学発光物質、粒子または第 ２１１１抗体のような標識手段により）、従って、問題とする受容体のための脳 組織を含む組織の免疫組織化学染色のための手段が提供される。 図面の簡単な説明 図４はプラスミドｐＶＥＧＴの作製を示しており、図ＩＡはｐＶＥＧの作製を示 しており、図ＩＢはｐＶＥＧ’の作製を示しており、および図１ｃはｐＶＥＧＴ 　’を示している。 使用された記号、Ｔ　７　ｐｒｏはＴ７プロモータ；ＴｌおよびＴ２は各々合成 および天然Ｔ７ターミネータ；Ｍ１３はＭ１３遺伝子間領域；括弧はベクター作 製で破壊された制限部位を示しており；およびｐＡはアルペルキスニガ−（組上 ユ旦１ｕｓ恒茫旦ポリアデニル酸配列である。 図２は陽性プールからのＲＮＡを注入された卵母細胞の電圧固定アッセイにおけ る代表的応答を示している。 図３はクローン４５−Ａの部分的制限地図を示している。 図４はクローン４５−Ａに存在する受容体ｃＤＮＡのＺｅｍ２２８Ｒ内へのクロ ーニングを示している。 図５はクローン４５−ＡのＤＮＡ配列および演縄されるアミノ酸配列（配列ＴＤ 番号Ｉおよび２に対応する）を示している。線の下の番号はアミノ酸配列を表わ し、線の上の番号はヌクレオチド番号を表わしている。推定のトランスメンプラ ン領域は全面にわたって線が引いてあり、推定のＮ一連結グリコシル化部位は黒 丸で示されている。 図６はＬ−グルタミン酸の濃度変化に対する代表的な用量応答曲線を示している 。エラーパーは（記号より大きな場合）ＳＥＭを表わしている。 図７は亜型１ｂグルタミン酸受容体クローンのＤＮＡ配列および演縄されたアミ ノ酸配列（配列ＩＤ番号１６および１７）を示している。線の下の番号はアミノ 酸配列を表わしている。線の上の番号はヌクレオチド配列を表わしている。 図８は亜型２ａグルタミン酸受容体クローンのＤＮＡ配列および演鐸されたアミ ノ酸配列（配列ＩＤ番号１８および１９）を示している。線の下の番号はアミノ 酸配列を表わしている。線の上の番号はヌクレオチド配列を表わしている。 図９は部分亜型２ｂグルタミン酸受容体クローンのＤＮＡ配列（配列ＩＤ番号２ ０）を示している０番号はヌクレオチド配列を表わしている。 性定Ω！施慈梯 Ｇｌｕ　Ｇ　Ｒは神経伝達物質グルタミン酸に対するＧ蛋白−結合膜受容体の一 族である。グルタミン酸がニューロン（特に神経内分泌ニューロン）の制御に主 要な役割を持っているごとく、Ｇｌｕ　Ｇ　Ｒはそのような制御を有効にする決 定的な役割を果たしているであろう、従って、Ｇｌｕ　Ｇ　Ｒ〜リガンド相互作 用およびＧｌｕ　、　Ｒ−媒介代謝のアゴニストおよびアンタゴニストの開発は 非常に興味が持たれている。 本発明は単離されたＧｌｕ　Ｇ　Ｒ’Ｅ提供することにより、Ｇｌｕ　＠　Ｒ− リガンド相互作用のアゴニストおよびアンタゴニストを同定する手段を与える。 術語”Ｇｌｕ　ｃ　Ｒ″は天然に存在するＧｌｕ　ｅ　Ｒから誘導されるまたは 天然に存在するＧｌｕ　ｅ　Ｒに独特の重要な構造的およびＩｌ能的特性を共有 する蛋白質を意味している。そのような受容体は天然に存在する受容体の領域が 類似の機能を持つ蛋白質を得るような様式で欠失または置換されることにより生 じるであろう。相同的配列、対立遺伝子変異および天然の突然変異体；誘導され た点欠失および挿入突然変異体；変質されて発現された変異体−天然に存在する Ｇｌｕ　ｃ　Ｒコード化核酸をコードしている核酸に高いまたは低いストリンジ ェント条件下ハイブリダイズするＤＮＡによりコード化されている蛋白質；天然 に存在する物質から回収される蛋白質；およびにＩｕ　ＧＲ蛋白質に対して指向 性のある抗血清から回収される非常に相関した蛋白質もまた含まれる。 米国特許Ｎｏ、４，８５９，６０９　（参照により本明細書に含まれる）中に概 説されている類似体；またはキメラＧｌｕ　ｓ　Ｒｅ分子は化学的に合成しても 又は天然に存在するものでもよい、リガンドはアゴニストおよびアンタゴニスト に群分けできる。アゴニストはその受容体への結合が細胞内の応答経路を誘導す る分子である。アンタゴニストはその受容体への結合が細胞内の応答経路を遮断 する分子である。 “単離された”Ｇｌｕ　Ｇ　ＲとはＧｌｕ　ｃ　Ｒがニューロンのような天然の 環境以外にあることを意味し、例えばここで下に定義されるような実質的に純粋 なＧｌｕ　Ｇ　Ｒも含まれている。より一般的には単離されたとは細胞または他 の系の不均一な成分としてＧｌｕ　６　Ｒが含まれていることを意味している０ 例えばＧｌｕ　Ｇ　Ｒは細胞から分離されたＧｌｕ　６　ＲをコードしているＤ ＮＡ構成物で細胞をトランスフェクトし、他の選択された受容体を含むミセルへ 加えることにより発現されるであろう。 以下に記載する別の実施例においては、Ｇｌｕ　ｅ　Ｒはムスカリン性受容体を コードしている遺伝子で同時トランスフェクトされた細胞により発現される。従 って、本文においては、単離されたＧｌｕ　ｃ　Ｒの環境とはそれが天然の状態 で存在しているものではなく、特に外因性成分として系中に存在している場合で ある。 本発明はＧｌｕ　ＧＲ蛋白を発現できるクローン化Ｇｌｕ　ｔ、　Ｒコード化配 列を提供する。　Ｇｌｕ　Ｇ　Ｒをコード化している相補ＤＮＡは例え：よ、脳 組織がらのｍ　ＲＮ　ＡからのｃＤＮ＾ライブラリーを作製することにより得ら れるであろう。ライブラリーを転写し、得られたｍＲＮＡを卵母細胞内へ圧入し 、Ｇｌｕ　ＧＲを発現する卵母細胞を機能的アッセイにより検定することにより ライブラリーがスクリーニングされるであろう。もしくは、クローンは相補的標 識オリゴヌクレオチドプローブによりスクリーニングされるであろう。 本発明はＧｌｕ　ｃ　Ｒをコード化しているｃＤＮＡの首尾よい単離にも関する 。多くのｃＤＮＡクローニングおよび分子生物学技術の実質的な改変および改良 によりＧｌｕ　ｃ　Ｒの分画クローニングが達成された。最初に＞４ｋｂ長ラツ ト小脳ポリ（Ａ）　＋＋ｍＲＮＡのシ：！塘濃度勾配遠心分離により調製された Ｇｌｕ　ｃ　ＲｍＲＮＡの濃縮源がｃＤＮＡ合成の鋳型として使用された。さら に、用いられたｃＤＮＡクローニングヘクターはポリ（Ａ）尾（それによりｃＤ ＮＡ挿入物の転写生成物の翻訳効率が４０倍増加する）およびプロモータおよび ポリ（Ａ）尾の間のベクター内へのｃＤＮＡの方向性のあるクローニングを可能 にするポリリンカ一部位を含んでいる。方向性のあるクローニングのためのベク ター作製は係争中のＵ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、０７／３２０．１９１　（ここに引例とし て含まれている）にも記載されている。ｃＤＮＡクローニングベクターは縦列で 、ポリ（Ａ）配列に続き非コードプラスミドまたはウィルス配列なしで単位長転 写体を効率よく発生させ、ＤＮＡ鋳型を線状化するのに制限エンドヌクレアーゼ を必要としない（標準的にはｃＤＮ＾のコード領域内のエンドヌクレアーゼの存 在のため作業の機能的クローニング戦略がしばしば訪客されるであろう）２つの 転写クーミ不一夕と共に使用される。ｃＤＮＡ合成戦略は挿入物の大きさを最大 化しポモポリマー尾を導入することなく　ｃＤＮＡの５′末端を再形成する。ｃ ＤＮＡ挿入物はベクター内へ挿入する前に４ｋｂより大きなものに選択された。 １００，０００のプール中の１０”のｃＤＮ＾挿入物のライブラリーは連続的な より小さなプールの分画における増幅工程の数を減少させるためにレプリカに塗 布された。さらに、−ムスカリン性ｃＤＮＡ　（ホスホイノントール代謝と共役 した別のＧｉ白結合受容体）鋳型が副分画されたプールの転写反応に含まれてお り、そのため、各々のプールからの４ｙ　Ｅ１三の転写体を注入する前に調口Ｎ Ａの相対酌量および譬を評価するためにノーザンブロノト分析によりアッセイで き、卵母細胞の電圧固定ではキスカル酸またはグルタミン酸に応答しない各々の 卵母細胞のための内部陽性対昭物となる。転写体において５ＥＡＩ”　ＶＥＧＴ 　′（アルカリ性ホスフＴターゼの分泌形）鋳型の希釈物の介在物も用いられ、 そのため電圧固定分析で選ｔＲされる卵母細胞はより高いレヘルで同時ｌ玉入さ れたＧｌｕ　、　ＲｍＲＮＡを合成ｊ、５ているものである。さらに、非常に稀 な転写体から最初発生される小さな信号をモニターするため低雑音電気記録技術 が使用された。 上記の方法は“亜型１ａ”と称されるＧｌｕ　ｅ　Ｒをコード化しているｃＤＮ Ａクローンの巾蛭に使用された。亜型１ａクローンの配列に基づいたオリゴヌク レオチドプローブが別の脳および小脳ｃＤＮＡライブラリーを調べるために使用 された。これ１４のライブリーからＩｂ、２ａＪよび２ｂと称される追加の亜型 をコート化しているクローンが得られた。 こ、：にＧｌｕ　６　ＲおよびそのｃＤＮＡクローンが提供されたので、ジデオ キシシーフェンシングなどの通常の方法によりヌク１／オチドおよびアミノ酸配 列が決定されるであろう、一般的にはＳａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、、分子ク ローら乙Ａユ実験憲−アニュアル、２版、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ ｒ、ＮＹ、　１X８９．　（こ 、二に引例として含まれている）を参照されたい。Ｇｌｕ　ｃ　Ｒおよびこのフ ァミリーの相同的受容体をコード化しているゲノムまたはｃＤＮ＾配列は、よく 知られた方法に従って他の哺乳類種から調製されたライブラリーから得られるで あろう。例えば、げっ歯１ＧＩｕ　、、Ｒからのオリゴヌクレオチドプローブを 用いて（完全長ｃＤＮＡまたは少くとも約１４のヌクレオチドから２５またはそ れ以上の長さのヌクレオチドのより短いプし７−ブ；しばしば４０から５０はど のヌクレオチド）、ウサギ類、鳥類、ウノ、ブ先マウスのような他の哺乳類種の Ｇｌｕ　、　ＲをコードしているＤＮＡ配列が得られるであろう。もし部分クロ ーンが得られたら、エンドヌクレアーゼ切断、結合およびルーブアうト突然変異 発生のような技術を用いて、適切な解読枠中にそれらを結合させ、完全長のクロ ーンを作り出す必要がある。 Ｇ１１Ｊａ　Ｒをコード化しているＤＮＡ配列が適切な発現ベクター内へ挿入さ れたら、それは次に真核生物細胞をトランスフェクトするためＧこ使用される。 本発明の実施に使用される発現ベクターはクローン化ＤＮＡの転写を指示できる プロモーターおよび転写ターミネータを含んでいるであろう。 本発明の蛍白質を原形質膜へ連ふためには少くとも１つのシグナル配列が問題と するＤＮＡ配列へ作動可能なように連結されている。シグナル配列はＧｌｕ　ｃ 　Ｒコート配列から、本分野で記載されている他のソゲナル配列から誘導される がまたは初めから合成される。 本発明の実施に使用される宿主細胞には哺乳類、鳥類、植物、昆虫および真菌類 細胞が含まれるが、好適には哺乳類細胞である。酵母の種（例えばサノヵロマ４ 　＋７　（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）ｓｐｐ、、特に互、セレビシェ（ｃｅ ｒｅｖｉｓｉａｅ）　、之’／”＋／左ｒｙｑ４＋Ｚ　（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈ ａｒｏｍｃｅｓ）ｓｐｐ）または糸状菌類（例えばアスペルギルス（顛理」田］ 眩λｓｐｐ、　、三五二三玉ボｌ　伍些改鉦虹虹朋ム、）を含む真菌細胞もまた 本発明内の宿主細胞として使用してもよい。本発明で使用される適した酵母ベク ターにはＹＲｐ７（Ｓｔｒｕｈｌ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ ｄ　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７６：１０３５−１０３９．１９７W）、 ＹＥｐ１３（Ｂｒｏａｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ　８：１２１−１３３．１ ９７９）、ＰＯＴベクター（Ｋａｗａｓａｋｉ　ｅｔ　ａｌA。 米国特許第４，９３１，３７３　、ここに引例として含まれている）　、ｐＪＤ Ｂ２４９およびｐＪＤＢ２１９（Ｂｅｇｇｓ、　５裁住２１５：　１０４−１０ ８．１９７８）およびそれらの誘導体が含まれる。そのようなベクターは一般的 に選択可能なマーカーを含んでおり、それは形質転換体の選択を可能にする表現 型アッセイが存在する優性な表現型を示す多くの遺伝子の１つである。好適な選 択可能マーカーは、宿主細胞の栄養素要求性を補足するが、抗生物質耐性を与え るかまたは細胞を特異的炭素源が利用可能なようにさせ、」弗（Ｂｒｏａｃｈ　 ｅｔ　ａｌ、、上記文献）　、ＬＩＲＡ３（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、 　Ｇｅｎｅ　８：１７，１９７９）　、ＨhＳ３ （Ｓｔｒｕｈｌ　ｅｔ　ａｌ、、上記文献）またはＰＯＴＩ（Ｋａｗａｓａｋｉ ：ｅｔ　ａｌ、、上記文献）が含まれる。他の適した選択可能マーカーはＣＡＴ 遺伝子であり、それは酵母細胞にクロラムフェニコール耐性を与える。 酵母において本発明の受容体の発現に使用される別のベクター、プロモータおよ びターミネータは本分野ではよく知られており、例えばＥ■ｒ、艶ｕＪ旺ハＬ、 　１８５：２３１−２７９（１９９０）　（ここに引例としても含まれている） に総括されている。本発明の受容体はアスペルギルス（組匹」ｕｌｓ）　ｓｐｐ 、で発現されてもよい（ＭｃｋｎｉｇｈｔおよびＵｐｓｈａｌｌ、ここに引例と して含まれている米国特許第４，９３５，３４９に記載されている。）存用なプ ロモーターにはアスペルギルス　ニデユランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌ＋ｕｓｎ　ｉ ｄｕ　Ｊａｎｓ）解糖系遺伝子から誘導されるものが挙げられる０例えば囮プロ モータ（Ｍｃｋｎｉｇｈｔ　ｅｔ　ａｌ、、　ＥＭＢＯＪ、４：２０９３−２０ ９９．１９８５）および止［＾プロモータ。適したター＼不一々の例は世１３タ ーミ名−タ（ＭｃｋｎｉｇＭ　ｅｔ　ａｌ、、上記文献）である。 真菌を形質転換する技術１！文献Ｃ１−よに知ｔ７れており、記載されている。 例えばＢ＋４訃（−に記文献）、　Ｈｉｎｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ、　（ｒｒｏｃ、 、Ｎ鮎１−：Ａｔ…ツ９ｉ、ＵＳＡ　７５：１９２９−１９３３．１９７８k Ｙｅｌｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　（貞ｏｃ−、−襲旦」９坤ｔｉ、１ＩＳＡ　８１ ：　１７４０−１７４７．１９８４）　、およびＲｕ５ｓｅ戟@Ｉ （すｊｐ、ｒｅ　３０１・１６７−１６９．１９８３）　（、これらの各々はこ こニこ引例として含まれている）。 神々のより高等な真核生物細胞もＧｌｕ　ｃ　Ｒの発現のための宿主細胞として 働く、−とができるであろうが、すべての細胞株が受容体の細胞の第２メツセン ジヤー系への機能的適合が可能ではｉ（いであろう。ＢＨＫ、Ｃ）１０．Ｙｉ（ Ｓｈａｐｉｒｏ　ｅｔ　ａｌ、、ＴＩＰＳ−５−ＩＪｐｌリ−４３−４６（＋９ ８９）、Ｎ６１０８−４５（Ｄａｗｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅ ｎｅｅ　ｔ１ｐ３ｒｑ；Rｃｉｅ−ｄ、ｌ膣ゴ狂叱九− （：ｑ！ｌ　ｊｕｊｐｕ、−ｙ２２巻、　８９−１１４ページ（１９８９））　 、ＮＩＥ−１１５（Ｌｉｌｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｂｉ盾戟B ｆ；ｈｅｃ２６１：５３０７５３１３（１９８６））　、ＰＣｌ３およびＣＯ３ １（ＡＴＣＣＣＲ１，１６５０）なと′の培養されている哺乳類細胞が好適であ る。好適なりｌ（Ｋ細胞株はｔｋ−Ｃｅ１３　ＢＨＫ細胞株（Ｗａｅｃｈｔｅｒ およびＢａ５ｅｒｚａ　Ｐｒ匹２勺見、Ｂｉｃａｄ、−８ｃｉ、ＬＩＳＡ　７魁 １１０６−１１１０（１９８２））お■ びＢｌ［５７０細胞株（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１ １ｅｃｔｉｏｎ、１２３０１　Ｐａｒｋｌａｉｍｎ　Ｄｒ、AＲｏｃｋｖｉｌｌ ｅ。 ’１０．４こ受入番号ＣＲＬ１０３１４で寄託されている）である。ｔｋ−ＢＨ Ｋ細胞株は訂ｃｃから受入番号ＣＲＬ１６３２で入手可能である。 本発明の実施に使用２される噛■４Ｍの発現ベクターはり１コーン化遺伝子また ；まｃＤＮＡの転写を指示できるプロモータを含んでいるであろう。好適なプロ モータ乙こ：：て２イ１１．スイロモータおよび細胞性プロモータが含まれる。 ウィルスプロモータＬｍ　＋”即時初期サイドメガ１−１ウイルスプロモータ（ Ｂｏｓｈａｒｔ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｊ

【ＬＬ４１：５２１−５３０゜１９８５ ）およびＳＶ４０フ゛ロモータ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ＋、 Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、１：８５４−８６４．１９８P） が含まれる。細胞性プロモーターータウスメタロチオｌイン−１プロモーク（Ｐ ａｌｍｉｔｃｒｅｔａｌ、＋米国特許第４．５７９．８２１号）、マウスＶＫプ ロモータ（Ｂｅｒｇａ＋ａｎ　ｅｔ　ａｌ、。 Ｐ　ｒｏｃ　＝）４３μ、、’ｙｃｉ−０ＬＩＳＡ　８１：’、０４１−７０４ ５．１９８３；Ｇｒａｎｔ　ｅｔ　ａｌ、　、Ｎｕｃ、ＡｃPｄｓ　Ｒｅｓ、１ ５：　５４９６゜ １９８７）　ｈよびマウスｖ、プロモー９　ｒＬｏｈ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅｊｌ 　３３：８５−９３．１９８３）が含まれる。特に好適なブロモ＝りはアデノウ ィルス２がらの王後期プロモータ（Ｋａｕｆｍａｎおよび５ｈａｒｐ、Ｍｏ１． Ｃｅ１ｌ−↓−ｐｊ、　２：１３０１４３１９．ｌ９８２：ｌである。そのよう な発現ベクターはまた問題とするペプチドまたは蛋白質をコート化しているＤＮ Ａ配列のト流およびブロモ−々から下流に位置している一絵のＲＮＡスプライス 部位も含んでいる。好適なＲＮＡスプライス部位はアデノウィルスおよび／また はイムノグロブリン遺伝子から得られるであろう。 発現ベクター中にまた含まれているものは問題とするコード配列の下流に位Ｉす るポリアデニル化信号である。ポリアデニル化信号はＳＶ４０からの初期または 後期ポリアデニル化信号（Ｋａｕｆｍａｎおよび５ｈａｒｐ、上記文献）、アデ ノウィルス５ＥＩＢ領域からのポリアデニル化信号およびヒト増殖ホルモン遺伝 子ターミネータ（ＤｅＮｏ　ｔ。 ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、９：３７１９−３７３０．１９ ８１）を含んでいる。発現ベクターは、プロモータおよびＲＮＡスプライス部位 の間にアデノウィルス２３分節系リーダーのような非コートウィルスリーダー配 列を含んでいてもよい。好適なベクターはまたＳＶ４０エンハンサ−およびマウ スμエンハンサ−（Ｇｉｌｌｉｅｓ、　Ｃｅ１ｌ　３３ニア１７−７２８゜１９ ８３）のようなエンハンサ−配列を含んでいてもよい。発現ベクターはまたアデ ノウィルスＶＡ　ＲＮＡをコード化している配列を含んでいてもよい。 クローン化ＤＮＡ配列は例えばリン酸カルシウムー媒介トランスフェクション（ Ｗｉｇｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　１４ニア２５．１９７８；Ｃｏｒｓ ａｒｏ　およびＰｅａｒｓｏｎ、Ｓｏｍ　ｔｉｃ　Ｃｅ１戟@Ｇｅｎｅｔ、１ｃ ｓ− ７：６０３，１９８１；ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌ ｏｇＹ　５２：４５６，１９７３）により培養哺乳類細胞内に導入されるであろ う。エレクトロボレーシラン（Ｎｅｕ＋＋ａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、、ＥＭＢｏ　Ｊ 。 １　：８４１−８４５．１９８２）のような哺乳類細胞内へクローン化ＤＮＡを 導入する他の技術もまた使用してもよい。クローン化ＤＮＡが組込まれた細胞を 同定するために問題とする遺伝子またはｃＤＮＡと一緒に細胞内へ選択可能マー カーが一般的に導入される、培養哺乳類細胞での使用に好適な選択可能マーカー には例えばネオマイシン、ヒグロマイシンおよびメトトレキセートのような薬剤 に対する耐性を与える遺伝子が挙げられる。選択可能マーカーは増幅可能な選択 可能マーカーであろう。 好適な増幅可能選択マーカーはＤ）ＩＦＲ遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子 である。 選択可能マーカーはＴｈ１ｌｌｙ！こより総括されている（Ｍ　ｗａｌｉａｎ　 Ｃｅ１ｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏ　。 Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｓｔｏｎｅｈａｍ、ＭＡ、こ こに引例として含まれている）。選択可能マーカーの選択は当業者の判断による 。 選択可能マーカーは細胞内へ問題とする遺伝子と同時に別のプラスミドで導入し てもよいし、それらは同一のプラスミド上で導入されてもよい。もし同しプラス ミド上ならば、選択可能マーカーおよび問題とする遺伝子は異なったプロモ−タ または同一のプロモータの制限下にあるが、後者の配置はジンストロニックなメ ツセージを産生ずる。この型の構成物は本分野では既知である（例えば、Ｌｅｖ ｉｓｏｎおよびＳｉｍｏｎｓｅｎ、米国特許第４，７１３，３３９号）。細胞内 へ導入される混合物へ゛キャリアＤＮＡ”として知られている追加のＤＮＡを付 加するのもまた都合が良いであろう。 トランスフェクトされた哺乳類細胞はある期間（典型的には１−２日）増殖させ て問題とするＤＮＡ配列を発現開始させる。安定な様式で選択可能マーカーを発 現している細胞の増殖を選択するため薬剤選択を次に応用する。トランスフェク トされた細胞はまた受容体の活性を阻害するアンタゴニストの存在下で選択され てもよい。これに関連して通したアンタゴニストにはり、Ｌ、２−アミノ−３− ホスホノプロピオネートが含まれる。増幅可能な選択可能マーカーでトランスフ ェクトされている細胞に対してはクローン化配列のコピー数を増加させて選択す るため段階的様式で薬剤濃度を増加させてもよく、それにより発現レヘルが増加 する。 組換えＧｌｕ　Ｇ　Ｒをコード化している発現ベクターの植物、鳥類、および昆 虫細胞内への導入に適したプロモータ、ターミネータおよび方法は本分野では既 知である１例えば異種ＤＮＡ配列を昆虫細胞中で発現するためのベクターとして のバキュロウィルスの使用がＡｔｋｉｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　（Ｐｅｓｔｉ ｃ　Ｓｃｉ、２８：２１５−２２４．１９９０）により総括されている。植物細 胞における遺伝子発現のためのベクターとしての１ｚロハクテリウム　リゾゲネ ス（組些堕叩肛ｉｕｍ　士堕弧肪亜）の使用は５ｉｎｋａｒ　ｅｔａｌ、　Ｊ、 Ｂｉｏｓｃｉ（Ｂａｎ　１ａｏｒｅ）１１：４７−５８．１９８７）により総括 されている。 本発明のＤＮＡ　ｆｌＩ成物を含む宿主細胞は次に組換えＧｌｕ　Ｇ　Ｒを産生 させるため培養される。細胞は受け入れられた方法に従って哺乳類または他の宿 主細胞の増殖に必要とされる栄養素を含む培養培地中で培養される。種々の遺し た培地が本分野では知られているが、一般的には炭素源、窒素源、必須アミノ酸 、ビタミン、ミｉｐラルおよび増殖因子が含まれている。増殖培地は一般的には 例えば薬剤選択または必須栄養素の欠損（これはＤＮＡ構成物上の選択可能マー カーまたはＤＮＡ構成物の同時トランスフェクソ３ンにより補給される）を基に 、ＤＮＡ構成物を含んだ細胞に対して選択されるであろう。 クローン化Ｇｌｕ　Ｇ　Ｒを発現しているトランスフェクトされた細胞はいくつ かの方法で検出できる。Ｇｌｕ　、　Ｒおよびレポーター遺伝子（例えばルシフ ェラーゼ）の両方の発現単位を含む発現ベクターで細胞をトランスフェクトする ことにより、レポーター遺伝子の活性が同時トランスフェクトされたＧｌｕ　Ｇ 　Ｒクローンの発現の指標となる。１つまたはそれ以上のサイクリックＡＭＰ応 答性要素（ＣＲＥ）をレポーター遺伝子発現ユニットに含ませることにより、第 ２メツセンジヤーアデニレートシクラーゼの刺激または抑制のどちらかに結合さ れたレセプターをコード化しているクローンは加えたりガントに応答したレポー ター遺伝子発現の変化により同定できる。結合されたＣＲＥおよびレポーター遺 伝子を含むＤＮＡ構成物は本分野では既知である。例えばＭｅｌｌｏｎ　ｅｔ　 ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、υ５Ａ８６：４８８７−４８ ９１　（１９８９）　（ここに引例として含まれている）を参照されたい。機能 的受容体を発現している細胞株はまたアゴニスト誘導チャネル活性の電気生理学 的測定により検出できる。受容体活性はまたトランスフェクトされた細胞中の細 胞質ゾル遊離カルシウム濃度を測定することによってもアッセイできる０例えば Ｔｈａｓｔｒｕｐｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ Ｓ＾８７　：２４６６−２４７０　（１９９０）およびＰｉｃａｒｄ　ａｔ　≠ 戟A＋ ５ｃｉｅｎｓｅ　２４７：３２７−３２９（１９９０）　（これらはここに引例 として含まれている）を参照されたい、細胞質ゾル遊離カルシウムの測定に好適 な方法はビデオカメラに連結された蛍光顕微鏡で細胞をスキャンすることである 。細胞に蛍光性Ｃａ”指示薬を注射しく例えばＦｌｕｏ　３またはＦｌｕｏ−２ ，Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ、Ｅｕｇｅｎｅ＋ＯＲ）リガンド に暴露された。 本発明に従って産生されるＧｌｕ　Ｇ　Ｒは組換え体発現系または他の供給源か ら、当業者には一般的に利用可能な技術を用いる精製プロトコールを用いて精製 されるであろう、大量のＧｌｕ　Ｇ　Ｒを得るために最も都合の良い供給源は組 換え体受容体を発現する細胞である。しかしながら、組織のような他の供給源、 特にＧｌｕ　ＧＲを含む小脳のような脳組織もまた使用される。 精製は液体クロマトグラフィー、レクチンアフィニティクロマトグラフィー、濃 度勾配遠心分離および特にゲル電気泳動のような通常の化学的精製手段により達 成されるであろう、蛋白質精製法は本分野では既知であり（一般的には５ｃｏｐ ｅｓ。 Ｒ，、Ｍ製、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ＮＹ（１９８２）、（ここに引 例として含まれている）を参照されたい）　、Ｇｌｕ　ｃ　Ｒ特にここに記載さ れている組換え的に産生されたＧｌｕ　ａ　Ｒの精製に応用されるであろう。好 適な実施Ｂ様においては、ここに記載したようにＧｌｕ　、　Ｒに対する抗体を 用いたイムノアフィニティクロマトグラフィーが使用される。他の精製法におい ては、Ｇｌｕ　ｃ　Ｒまたはその一部をコード化している組換え遺伝子は、米国 特許第４，７０３，００４および４，７８２，１３７号（ここに引例として含ま れている）に記載されているように、シグナルペプチドの直ぐ後のアミノ末端が 小さな親水性ペプチドをコードしている配列で修飾できる。このペプチドに対す る特異的抗体はＧｌｕ　ｃ　Ｒの迅速な精製を容易にし、短いペプチドは続いて エンテロキナーゼにより除去できる。 従−）で、上述のように本発明はその天然細胞環境がら単離されたＧｌｕ　Ｇ　 Ｒを提供し、実質的に他のＧ蛋白結合性グルタミン酸受容体は含まれていない。 精製されたＧｌｕ　Ｇ　Ｒもまた提供される。少くとも約５０％の実質的に純粋 なＧｌｕ　、　Ｒが好適であり、少くとも約７０−８０χがより好適であり、９ ５−９９χまたはそれ以上の均質性が、特に医薬としての使用には最も好適であ る。一度精製されたら（部分的にしろまたは均質までにしろ必要に応し）組換え Ｇｌｕ　Ｇ　Ｒまたは天然Ｇｌｕ　ＧＲは次に抗体を発生させるのに使用される であろう（アンセイ法その他で）。 別のＢ様において、本発明はＧｌｕ　ｓ　Ｒのポリペプチドおよび断片に関係す る。 Ｇｌｕ　ｃ　Ｒのポリペプチドおよび断片は組換え体発現系がら単離されるがま たはＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　Ｆｅｄ、Ｐｒｏｅ、２１：４１２（１９６２）、 Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　Ｊ、Ａｅｘ、Ｃｈｅａｒ、Ｓｏｃ、　W５：２１４９ （１９６３） またはＢａｒａｎｙおよびＭｅｒｒｔｆｊｅｌｄ、　＜ブＱ、２巻、　ｐｐ　１ −２８４（１９７９）　Ａｃａｄａｓｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。 ）ｉＹ、　（、これらの各々はここに引例として含まれている）の面相法による が、または自動ペプチド合成機を使用して合成されるであろう、“ポリペプチド ”とは少くとも約３のアミノ酸、典型的には６またはそれ以上から１００−２０ ０のアミノ酸またはそれ以上の配列を意味している（全蛋白質を含む）、例えぼ りガントに結合するＧｌｕ　Ｇ　Ｒ蛋白質の一部分は種々の方法により同定され るであろう。例えば精製された受容体をプロテアーゼまたは化学試薬で処理して 断片化し、リガンドプロントでどの断片が標識グルタミン酸に結合できるかを決 定する。ポリペプチドは次に合成され、リガンド−Ｇｌｕ　ＧＲ相互作用その他 を阻害するための抗原として使用されるであろう、ここで使用されるかぎり、特 に文脈が指示しない限り、Ｇｌｕ　ＧＲに関しては蛋白質、ポリペブチ１′およ びその断片が含まれていると理解しなければならない。 他のＨ様においては、本発明はＧｌｕ　ｃ　Ｒ−リガンド相互作用を制御するた めの、従ってＧｌｕ　Ｇ　Ｒまたはグルタミン酸、および他の内因性興奮性アミ ノ酸のようなそのリガンドと直接的または間接的に結合できる障害を処置（治療 的におよび／または予防的に）する手段を提供する０本発明の受容体を持つこと により、リガンドとＧｌｕ　Ｇ　Ｒの相互作用を促進または阻害するアゴニスト またはアンタゴニストが同定されるであろう。アゴニストまたはアンタゴニスト により受容体を発現する細胞の代謝および反応性が制御さ也それにより、問題と する疾患を軽減するまたはいくつかの例においては予防する手段が提供される。 従って、本発明はりガント−Ｇｌｕ　６　Ｒ相互作用により媒介されるアゴニス トまたはアンタゴニストの作用を同定するためのスクリーニング法が提供される 。そのようなスクリーニングアッセイはリガンド／受容体／Ｇ蛋白相互作用のど の面を標的にするかにある程度依存して広範囲な構成が用いられるであろう０例 えば、受容体に結合し、それにより受容体とりガントの相互作用を遮断または阻 害する化合物を同定するようなアッセイが計画される。別のアッセイは、リガン ドと１換できそれによりＧｌｕ　Ｇ　Ｒ−媒介細胞内経路を刺激するような化合 物を同定するように計画できる。さらに別のアッセイはＧ蛋白へのＧｌｕ　６　 Ｒの会合を阻害または容易にし、それによりＧｌｕ　ｅ　Ｒリガンドに対する細 胞応答が媒介される化合物を同定するために使用できる。 １つの機能的スクリーニングアッセイにおいては、例えばＧｌｕ　Ｇ　Ｒをコー ドしている―ＲＮＡが注入され続いて適当なりガントと一緒にまたは別々にスク リーニングされる選択された化合物に曝露されている卵の受精活性化の開始がモ ニターされる。一般的にはＫ１１ｎｅ　ｅｔ　ａｌ、　、　５ｃｉｅｎｃｅ　２ ４１：４６４−４６７（１９８８）　（ここに引例として含まれている）を参照 されたい。Ｇｌｕ　Ｇ　Ｒをコードしている健ＲＮＡを注入された卵細胞もまた 上述のごとく遊離の細胞質ゾルＣａ　”を測定することによりアッセイできる。 別のスクリーニングアッセイは機能的に哺乳ＭＧ蛋白に結合されたＧｌｕ　Ｇ　 Ｒを発現する哺乳類細胞株の使用に基づいている。このアッセイにおいては、相 対的受容体占有率から第２メノンジヤー代謝のりガント誘導促進または阻害の程 度までを比較することにより受容体アゴニストまたはアンタゴニストとしての化 合物の相対的親和性で化合物がスクリーニングされる０例えば、ホスホリパーゼ Ｃの活性化はイノシトール−リン酸代謝の増加を導く、イノシトール−リン酸代 謝測定法は一般的に５ｕｂｅｒｓおよびＮａｔｈａｎｓｏｎ、、ｊ、Ｍ２ム阜山 」凌士回、　２０　：１３１−１４０　（１９８Ｂ）（ここに引例として含まれ ている）により記載されている。前に指摘したごとく、第２メツセンジヤーアデ ニレートシクラーゼの刺激または阻害に共役している受容体亜型はレポーター遺 伝子（例えばルシフェラーゼ）活性が受容体−リガント相互作用に連結している アッセイ系で使用可能である。 スクリーニング法は受容体に特異的に結合し、例えばその相互作用が実質的にリ ガンドにより影響を受ける抗体のような試薬の同定に使用できる。抗体はモノク ローナルまたはポリクローナル（抗血清の形で）、または単一特異性抗体（精製 抗血清のごとき）またはモノクローナル抗体またはその混合物でもよい。ヒトに 投与するには（例えば、４７ｔ；、ｆ診断またはイメージングのための組成物の 成分として）抗体は好適には免疫原性を最小にするため実質的にヒトであり、実 質的に純粋な形である。実質的にヒトとは一般的に少（とも約７０％のヒト抗体 配列を好適には少くとも約８０％、および最も好適にはヒトにおける免疫原性を 最小にするため少くとも約９０−９５χまたはそれ以上のヒト抗体配列を含んで いる。 Ｇｌｕ　ｃ　Ｒに結合する抗体は種々の方法により産生されるであろう、非ヒト 抗血清またはモノクローナル抗体（例えば、マウス、ウサギ、ウマその他）の産 生は例えば動物を受容体分子またはりガント結合に寄与する領域（類）のような 受容体分子の所望の部分を含む調製試料で免疫することにより達成されるであろ う。 受容体亜型特異性抗体は特異的ペプチドで免疫化することにより発生できる。小 さなペプチド（例えば約１４−２０のアミノ酸）は例えば、キーホールカサガイ へモノアニンに結合でき免疫原性が促進される。モノクローナル抗体の産生のた めには免疫された動物から得られた抗体産生細胞力坏死化されスクリーンされる か、または受容体蛋白に結合する抗体の産生が最初にスクリーンされ、次に不死 化される。ヒトＧＩｕ　ａ　Ｒ抗原に対するヒトモノクローナル抗体の発生は通 常の技術では困難であろうので、組換えＤＮＡ技術により、非ヒト抗体の抗原結 合領域（例えばＦ（ａｂ’　）りまたは超可変領域をヒト定常領域（Ｆｃ）また は読み枠領域に移して実質的にヒト分子を産生ずることが望ましいであろう、そ のような方法は本分野では一般的に知られており、例えば米国特許第４．８１６ ，３９７号およびＥＰ特許公開１７３．４９４および２３９．４００号（これら はここに引例として含まれている）に記載されている。もしくは、Ｍｕｓｅ　ｅ ｔ　ａｌ、　、５ｃｉｅｎｃｅ　２４６：１２７５−１２８０１９８９）　（こ こに引例として含まれている）により概説されている一般的なプロトコールに従 って、ヒトＢ細胞からのＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、 ヒト受容体蛋白に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体またはその一部をコ ードするＤＮＡ配列を単離し、次に所望の特異性の抗体（または結合断片）をコ ード化している配列をクローニングおよび増幅する。 他の実施態様において、本発明は受容体を発現できる細胞の工＞ｂ上三で実施さ れるスクリーニングアッセイが提供される０例えば、本分野では既知の方法を用 いて（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ａｔ　ａｌ、＋　クローニング、マニュアル 。 ２版、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒ ｅｓｓ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ＋Ｎ、Ｙ、P９８９＋こ こに引例として含まれている。を参照されたい）受容体またはその選択された部 分をコード化しているＤＮＡが例えばＢＨＥまたはＣＨＯのような哺乳類細胞株 のような確立された細胞株内へトランスフェクトされるであろう、受容体は次に 培養細胞により発現され、グルタミン酸またはキスカル酸のような適当なりガン トと一緒に、または別々に、選択された薬剤が細胞に対する所望の効果でスクリ ーニングされた。受容体またはその一部をコード化している配列を増幅するのに 使用されるであろう核酸配列の増幅手段は米国特許第４，６８３．１９５および ４．６８３．２０２号（ここに引例として含まれている）に記載されている。 さらに別の態様では、本発明により提供されるスクリーニングアッセイはその生 殖細胞および体性細胞がＧｌｕ　Ｇ　Ｒ蛋白または受容体の選択された一部（例 えばそれはリガンド、ＧＴＰ結合蛋白などを結合する）をコード化しているヌク レオチド配列を含んでいるトランスジェニック動物に関する０例えばヒトＧｌｕ 　Ｇ　Ｒをコードしている配列を非−ヒト哺乳類胚内へ導入するいくつかの方法 があり、そのいくつかは例えば米国特許第４，７３６，８６６　、Ｊａｅｎｉｓ ｃｈ、　５ｃｅｉｎｃｅ　２４０：１４６８−１４７４（１９８８）および−ｅ ｓｔｐｈａｌ　ｅｔ　ａｌ、、Ａｎｎ　、Ｒｅｖ、Ｃｅ１１．Ｂ’ｏ１．５：１ ８１−１９６（１９８６）　（これ轤■ 、二、−に引例として含まれている）に記数されている。動物の細胞は次に受容 体を発現させ、選択されたアゴニストまたはアンタゴニストの試験またはスクリ ーニ゛２・グするための都合の良いモデルとして使用できる。 本発明の別の態様は診断のための方法および組成物に関１．ている。　Ｇｌｕ　 ｃ　Ｒ分子および（れに対する抗体を持つことにより種々の診断的アッセイが提 供される。 例えばＧｌｕ　ｃ　ＲＬこ対する抗体（モ、ツクロー　ナル抗体を含む）で、問 題とする個体または培養物の選択された細胞または組織中の受容体の存在および ／または濃度が決定できる。これらのアッセイは例えば脳虚血、パー・キンラン 病、老人性痴呆およびその他の童諏障害、ハンチントン田踏病、筋萎縮性側索硬 化症　嘔吐、偏頭癲その他のよ−）な疾患の診断および／または処１に使用でき る。 数多くの型のイムノアッセイが′！！ｉ業者には知られており利用可能であるや 例え１、ｆ競合アンイ！イ、づンＩ′イノチーアッセイなどで一般的には、例え ば米国特許第４　、６４２．２８５　：４　、３７６、１１０　：Ａ、　０１６ 　、０４３　：３．８７９．２６２：　３．８！５２．１５７　：３．８T０． ７５２；３．８３９．１５３： ３．７９１．９３２号およびＨａｒｌｏｗおよびＬａ１ｘｅ、抗有（二丸塘寥！ 丘Ｊ２７　）！ｉ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　ｌ’ｕｂｌｉｃａ ｔｉｏｎ＋　Ｎ、Ｙ、（１９８８）　（各々ここに引例として含まれている）に 記載ｃ５’＋１でいる０　１つのアッセイ構成においてば、標識された抗体（好 適には例えば皮質、線条体、海馬状隆起、小脳のような脳組織と反応させ、その 特異的結合をｌた定するモノ・クローナル抗体）を用いることによりＧｌｕ　Ｇ 　Ｒが同定され沫夕よび／または定量され、アッセイは典型的（翳よ免疫複合体 形成が遂行される条件下で実施される。非、１ｍ−次抗体は受容体を検出するた めに一次抗体と反応性のある標識とｔＵ合わせて使用できる３、例えば、−次抗 体は、−次抗体を特異的に検出するよ・うに作製された積重二次抗体ｒより間接 的に検出される。もしくは、抗−Ｇｌｕ　ＧＲ抗体を直接的に４！！！識できる 。多くの種類の標識が使用できる例えば放射性核種、粒子（例えば金、フェリイ ーン、磁気粒子、赤血球細胞）、蛍光発色団、化学発光物質、酵素、酵素基質、 酵素補酵素、酵素阻害剤、リガンド（特にハブテン）など、 Ｇｌｕ　、　ＲＤＮＡはザザンまたはドツトプロットに類似のハイブリダイゼー ション法において標識Ｇｌｕ　ＧＲＤＮＡまたは合成アリゴヌクレオチドブロー ブにより細胞中で直接的に検出されるであろう。また、ポリメラーゼ連鎖反応（ Ｓａｉｋｉ　ｅｔ　ａｌ、。 ５ｃｉｅｎｃｅ　２３９：４８７（１９８Ｂ）および米国特許第４，６８３，１ ９５号がＤＮＡ配列の増幅に使用でき、それらは続いてアガロースゲル上の特徴 的な大きさ、Ｇｌｕ　Ｇ　ＲＤＮＡまたはオリゴヌグレオチドブローブを用いる これらのゲルのサザンプロット、または類似のプローブを用いるドツトプロット により検出される。プローブは約１４ヌクレオチドから約２５またはそれ以上の ヌクレオチドを含み、（好適には４ｏがら６０ヌクレオチド）、ある場合にはＧ ｌｕ　６　Ｒの実質的な部分または全ｃＤＮ＾までも使用してもよい、プローブ は酵素、ビオチン、放射性核種、蛍光発色団、化学発光物、常磁性粒子などのよ うな検出可能信号で標識されている。 自己免疫疾患の場合に必要とされるであろうが、受容体またはそれに対する抗体 の存在の検出における本発明の受容体と伴に使用するためのキットもまた供給さ れる。従って、Ｇｌｕ　ｓ　Ｒに対する抗体（好適にはモノクローナル抗体のよ うな単一特異性抗体、または受容体の組成物は通常容器中、分離されてまたは抗 −抗体、標識、遺伝イブローブ、ポリメラーゼ連鎖反応プライマーおよびポリ、 メラーセ゛などのような追加の試薬と組合わせて凍結乾燥されて提供されるであ ろう。 以下の実施例は例示のために与えられるものでおり、制限のためではない。 実施例↓ ｑ！！−克工乏濃榛銹ユ尺ＮΔｐｍ造 グアニジン　イソチオシアネート（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｒｉｏｃ ｈｅｍｉｓｔｒ３１１８：５２−９４（１９７９））およびｅｓｃｌ遠心分離を 用いてラットの小脳から全ＲＮＡが調製された。ポリ（Ａ）十ＲＮＡはオリゴｄ （Ｔ）セルロース　クロマトグラフィーを用いて騙された。オリゴｄ　（Ｔ）セ ルロース」：で２回クロマトグラフィーを行った後、ＲＮ　Ａ　（８００ｕ　ｇ ）を２′）に分けＳ　Ｗ２８０−ター用チューブ内の１０−４０χ直線シ！１ｍ 濃度勾配液上に層積した。濃度勾配液を２５．０００ｒｐｍで２８時間遠心分離 し４ｋｂより大きなＲＮＡをベレント化Ｌ７た。ｆｌＡ縮されたＲＮＡはカエル 卵母細胞内−５注入されＧｌｕ　Ｇ　Ｒの存在を検定した。 の汁　およびＧ１．！ｕＬ１」廿υグ覗圧固定ヱヱ皇イ卵母細胞は麻酔した埜ｌ バス　葛ｇｇｕ　ｓ　１１メスから手術的に除去された卵巣葉から′！＄備され た。卵巣葉は洗浄し、小さな塊りに引き切り、一定速度で緩やかにかき混ぜなが ら２０℃で２−３時間コラ−ゲナーゼで処理して解離させた。卵母細胞の解離お よび脱小胞化はコラゲナーゼを除去後手で完了させた。健康と判定され直径が１ 閣より大きな卵母細胞は５０■の無菌組織培養皿へ移し、無菌で抗生物質を補給 したハース培地（８８ｍＭ　ＮａＣ１，１ｍＭＫＣｌ、０．８２ｓ＋Ｍ　Ｍｇ５ Ｏａ、　０．３３ｍＭ　Ｃａ（ＮＯＪｚ。 ０．４１ｍＭ　ＣａＣＩｔ、２．４＠Ｍ　ＮａＨＣＯｓ、　１０＋ｗＭ　ＨＥＰ ＥＳ、ｐＨ７，４，０，１ｍｇ／ｄゲンタマイシン、　０．O１ｍｇ ／ｄペニシリン、０．０１ｍｇ／ｄストレプトマイシン、０．５ｍＭテオフィリ ン、および２．５１ピルビン酸ナトリウム）中１９℃にてインキユベートした。 注入ピペットは改良７００ＣＫｏｐｆ垂直引き延ばし器を用いて硬質ガラス管（ Ｄｒｕ＋ｎｏｎｄ）を引き延ばして作った。先端をこわし、Ｌｉｇｈｔ　Ｍｅｄ ｉｃａｌマイクロホルジを用いて斜めに切断した。ピペットの先端の直径は２０ −３０閣の範囲であった。注入ピペットは２８５℃で一夜加熱してＲＮａｓｅを 除いた。 −夜インキュヘーシッンを行った後、健康な卵母細胞を注入用に選択した。 ＤＥＰＣ処理水中に一７０℃で貯蔵されていたＲＮＡを融解し、１５．０００ｇ で５分間遠心分離した。注入は改良ピペンティング装置（Ｄｒｕｍｓｏｎｄ）を 用いて実施された。注入後、卵母細胞は新鮮な無菌パース培地中でインキユベー トしく培地は毎日交換した）、非健康な卵母細胞を除去した。 電圧固定アッセイは約５００μ！の容量の小さな室に置かれ標準カエルリンゲル 液（１１５ｇＭ　ＮａＣ１，２，５ｇＭ　Ｅｌ、１．８ｍＭ　ＣａＣ１ｇ、　１ ０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７，２）を１−６　ｍ／分で連続的に潅流されている 注入卵母細胞で実施された。記録のため３ＭＫＣｌを満たした場合、０．５から ７．０メガオームの先端抵抗を持つ２つのガラス微小電極を卵母細胞に突き刺し た。２つの電極の１つは銀／塩化銀半電池を通して示差増幅器に接続した。示差 増幅器の他の極をｉ！／塩化銀ペレットおよびリンガ−／寒天橋を通して櫂に接 続することにより膜電位を測定した。低雑音、高応答性の電圧固定システム（Ｎ Ｐ［）が膜電位の制御および膜電流の測定に使用された。卵母細胞膜電位は一６ ０ｍＶに維持された（細胞内側が陰性）、１ミリモルグルタミン酸塩（Ｓｉｇｍ ａ）　＋１００μＭキスカル酸塩（Ｓｉｇ厳ａ）１ｍＭカルバミルコリンセイで 使用されるその他の薬剤は潅流培養液を約３分間薬剤を含む培養液に交換するこ とにより作用させ、膜電流をチャート記録計（Ｌｉｎｅａｒ　Ｔｎｓｔｒｕ卿ｅ ｎｔｓ）で記録した。 ２つの微小電極を卵母細胞に突き刺した後、Ｉｌｌｉｔ流（ホールディング電流 ）は数分かかって徐々に定常状態まで減少する．ホールディング電流が安定化し た時（チャート記録が水平である）、薬物を１から３分間作用させる。もし、急 速な内部の電流のスパイク（チャート上で下方への片寄り）、続いて強度を減少 させてのゆっくりした電流の振動が観察されたら卵母細胞は陽性応答を持ってい ると判断される．検出の下方の限界は薬剤を作用させる前のホールディング電流 の安定度に依存しているが、５　−ＩＯｎへの範囲であった。 式匹り二□□□構成 先になされるべきエンドヌクレアーゼ消化なしでクローン化ｃＤＮＡの転写を可 能にするためにバクテリオファージエフ転写ターミネータをクローニングベクタ ーに加えた。プラスミドｐｔｌＥＧＴ　’は係争中（７）［１．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０ ７１５８１，３４２　（、：、：ニ引例として含まれている）に記載されている ．バクテリオファージＴ７の遺伝子１０および遺伝子１１の間にある推定Ｔ７１ ？ＩｆＡ転写ターミネータの配列はＤｕｎｎおよびＳｔｕｄｉｅｒ便２唖り坦劇 よ１６６：４７７−５３６（１９８３））により記述されている。図５に示した ごとく、この配列からの４つの合成オリゴヌクレオチドが設計され細菌の複製開 始点、アンピシリン耐性遺伝子および多クローニング部位に隣接するＴ７ブロモ ータを含むプラスミドｐＧＥＭ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ．Ｍａｄｉ ｓｏｎＪＩから入手された）内へ結合された．標準的条件下（Ｍａｎｉａｔｉｓ 　ｅｔ　ａｌ．＋上記文献）、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびＡＴＰでオ リゴヌクレオチドＺＣ７７６およびＺＣ７７７（配列番号４および５）の５′末 端へ末端リン酸が付加された．（これらおよびここで参照された他のオリゴヌク レオチドの配列は表１に示されている。）インキュベーション後、６５℃に１０ 分間加熱してキナーゼを失活させた．２５ナノグラムのオリゴヌクレオチドＺＣ ７７５（配列ＩＤ番号３）および２５ｎｇのオリゴヌクレオチドＺＣ７７６（ａ Ｅ列ＩＤ番号４）を６５℃で１５分間インキキスートし、次に５００　ｍの水中 室温まで放置して冷却してアニーリングされた．オリゴヌクレオチドＺＣ７７７ およびＺＣ７７８６：列ＩＤ番号５および６）も同様にアニーリングされた．ア ニール化されたオリゴヌクレオチドは使用まで一２０℃で貯蔵された。ベクター ｐＧＥ？！−１をＰｓ　ｔｌおよび）ｌｉｎｄｌＩＩで消化し、直線状化された ベクターＤＮＡはアガロースゲル電気泳動により精製された。合成Ｔ７ターミネ ータ（アニール化されたオリゴヌクレオチドＺＣ７７５。 Ｚ　Ｃ７７６、　Ｚ　Ｃ７７７およびＺＣ７７８　ｉ配列ＩＤ番号３，４．５お よび６）が次にｐＧＥＭ−１内ヘクローン化された．２５ナノグラムのベクター に等モル量の各々のアニール化オリゴヌクレオチドＺ　Ｃ７７５／Ｚ　Ｃ７７６ （配列！Ｄ番号３および４）およびＺＣ７７７／ＺＣ７７Ｂ　（配列ＩＤ番号５ および６）を１０μｌの反応液に混合した．１４℃で一夜結合させた後、ＤＮＡ を導入でき状態にある大腸菌Ｊ　Ｍ８３細胞内へ入れ、形質転換された細胞はア ンピシリン耐性で選択した。プラスミドＤＮＡはアルカリ溶菌法（Ｂｉｒｕｂｏ ｉｎおよびＤｏｌｙ，　Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．７：１５１３−１５２３ （１９７９））により選択された形質転換体から調製された。これらの試料から のＤＮＡの一部がＰｓｔｌおよびＨｉｎｄｌＩＩで切断され、８０ｂｐＰｓｔｌ −Ｈｉｎｄｌ１１断片が放出されたクローンを同定するため４％ポリアクリルア ミドゲル上で分析された。他の診断用切断物（ＥｃｏＲ［およびＮｏｔｌのよう な）もまた作製された。ｐＧＥＭＴと名付けられた１つの単離物が制限分析によ りＴ７ターミ不ータ断片を含んでいることが示された。 表土 オリゴヌクレオチド配列（５’　−３’　）ＺＣ７７５代列ＩＤ番号３）： ＧＣＴ　ＡＧＣ　ＡＴＡ　ＡＣＣ　ＣＣＴ　ＴＧＧ　ＧＧＣ　ＣＴＣ　ＴＡＡ　 ＡＣＧ　ＧＧＴ　ＣＴＺＣ７７６（配列ＩＤ番号４）： ＣＴＣ　ＡＡＧ　ＡＣＣ　ＣＧＴ　ＴＴＡ　ＧＡＧ　ＧＣＣ　ＣＣＡ　ＡＧＧ　 ＧＧＴ　ＴＡＴ　ＧＣＴ　ＡＧＣ　ＴＧＣ　ＡＺＣ７７７（ｈ！．列ＩＤ番号５ ）： ＴＧＡ　ＧＧＧ　ＧＴＴ　ＴＴＴ　ＴＧＣ　ＴＧＡ　ＡＡＧ　ＧＡＧ　ＧＡＡ　 ＣＴＡ　ＴＧＣ　ＧＧＣ　ＣＧＣ　ＡＺＣ７７８（ｊｆｆｉ列ＩＤ番号６）：Ａ ＧＣ　ＴＴＧ　ＣＧＧ　ＣＣＧ　ＣＡＴ　ＡＧＴ　ＴＣＣ　ＴＣＣ　ＴＴＴ　Ｃ ＡＧ　ＣＡＡ　ＡＡＡ　ＡＣＣ　ＣＺＣ１７５１（配列ＩＤ番号７）： ＡＡＴ　ＴＣＴ　ＧＴＧ　ＣＴＣ　ＴＧＴ　ＣＡＡ　ＧＺＣ１７５２（配列ＩＤ 番号８）： ＧＡＴ　ＣＣＴ　ＴＧＡ　ＣＡＧ　ＡＧＣ　ＡＣＡ　ＧＺＣ２０６３（配列ＩＤ 番号９）： ＧＡＴ　ＣＣＡ　ＡＡＣ　ＴＡＧ　ＴＡＡ　ＡＡＧ　ＡＧＣ　ＴＺＣ２０６４（ 配列ＩＤ番号１０）： ＣＴＴ　ＴＴＡ　ＣＴＡ　ＧＴＴ　ＴＧＺＣ２９３８（配列１［番号１１）　： ＧＡＣ　ＡＧＡ　ＧＣＡ　ＣＡＧ　ＡＴＴ　ＣＡＣ　ＴＡＧ　ＴＧＡ　ＧＣＴ　 ＣＴＴ　ＴＴＴ　ＴＴＴ　ＴＴＴ　ＴＴＴ　ＴＺ　Ｃ３０１．５　（配列ＩＤ番 号１２）：ＴＴＣ　ＣＡＴ　ＧＧＣ　ＡＣＣ　ＧＴＣ　ＡＡＧ　ＧＣＴＺ　Ｃ３ ０１６　（配列ＩＤ番号１３）：ＡＧＴ　ＧＡＴ　ＧＧＣ　ＡＴＧ　ＧＡＣ　Ｔ ＧＴ　ＧＧＴＺ　Ｃ３６５２　（配列ＴＤ番号１４）：ＡＣＡ　ＴＧＣ　ＡＣＣ 　ＡＴＧ　ＣＴＣ　ＴＧＴ　ＧＴＺ　Ｃ３６５４　（配列ＩＤ番号１５）：ＡＧ Ｔ　ＧＡＴ　ＧＧＣ　ＡＴＧ　ＧＡＣ　ＴＧＴ　ＧＧＴプラスミドｐＡＩ１２５ ２９からの天然のＴ７ターミネータ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ．　Ｇｅ ｎｅ　５６：１２５−　１３５　（１９８７）　）がプラスミドｐＧＥＭＴ　ヘ 加えられた。プラスミドｐＧＥＭＴがＢａｍＨＩで消化され、プラスミドｐＡＲ ２５２９はＢａｍＨ　ＩおよびＢｇｌ　Ｉ　Ｉで消化された（図１　）　、　ｐ ＡＲ２５２９からのＢａａｌｌ−ＢｇｌｌＩターミネータ断片はアガロースゲル 電気泳動により精製された。ターミネータ断片はＢａｉｓＨＩ消化ｐＧＥ？ｌＴ へ結合され、ＤＮＡは導入できる状態の大腸菌ＬＭ１０３５細胞内へ形質転換さ れた．アンピシリン耐性であるコロニーを５ｄの培養液へ接種し一夜増殖させた ．アルカリ溶菌法により調製されたプラスミドＤＮＡはＢａｍＨＩ−Ｓａｉｌ消 化および８％ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動により正しいターミネータ 配向がスクリーニングされた．正しい配向性でターミネータを含んでいるクロー ン（１３０ｂｐ　ＢａｍＨＩ−Ｓａｉｌ断片の存在により確認された）が選択さ れｐＧＥ？ＩＴＴと名付けられた（図４）。 Ｍ１３ファージ蛋白質存在下、ｐＧＥＭＴＴが一本鎖ＤＮＡとしてパンケージソ ゲされているのを可能にするため、ｐＵＣ３８２からのＭ１３遺伝子間領域（Ｖ ｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ血功μ埃」ＭＰ製工１５３：３．、１１（１９ ８７）により記載されているようにｐＵｃ１１８および１１９に類似）がｐＧＥ ＭＴＴに加えられた（図１）、プラスミドｐＧＥＭＴＴはＦｓｐｌおよびＮａｒ ｌで消化され、Ｔ７ブロモータおよび転写ターミネータを含む断片が精製された 。プラスミドｐＵｃ３８２はＦｓｐＩおよびＮａｒＩで消化され、アンピシリン 耐性遺伝子およびＭ１３遺伝子間領域をコードしている断片がゲルで精製された ．これらの断片は次にＴ４ＤＮＡリガーゼ存在下互いに連結された．連結された ＤＮＡは導入できる状態の大腸菌１．、　Ｍ　１０３５細胞内へ形質転換された 。１２のアンピノリン耐性コロニーからのプラスミドＤＮＡがアルカリ溶菌法に より調製されＤＮＡはＡｖａｌによる消化によリスクリーニングされた。遺した 構成物は２つのバンドを与えた（１つは２４３０ｂＰおよび他方は７０９ｂｐ） 。そのような単ｌｌＩ物の１つが選択されｐＶＥＧと名付けられた。 開始配列をコードしている合成オリゴヌクレオチドがｐＶＥＧのＢａｍＨＩおよ びＥｃｏＲＴ部位の間に加えられた（図１）、プラスミドｐＶＥＧはＢａｗＨＩ およびＥｃｏＲＩで消化されベクター断片はゲルで精製された。各々９６ナノグ ラムのオリゴヌクレオチドＺＣ１７５１およびＺＣ１７５２（配列ＩＤ番号７お よび８）を４．５ｕｌの１０ｍＭ）リスＰ　Ｈ７，５，２０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚお よび１０ｍＭ　ＮａＣ１中、６５°Ｃで２０分間アニールし、次に混合物は３０ 分以上かけて室温まで冷却した。アニール化されたオリゴヌクレオチドはＴ４　 ＤＮＡリガーゼによりｐＶＦＧベクター断片へ連結され、導入できる状態の大腸 菌Ｌ　Ｍ　１０３５細胞内へ形質転換された。−夜増殖させてコロニーを発達さ せた後、寒天プレート上のコロニーのフィルターリフトを取った。フィルターは １叩標識オリゴヌクレオチドＺＣ１７５１（配列ＩＤ番号７）で調べた。すべて のコロニーが陽性であった。プラスミドＩ）　Ｎ　Ａは１２のコロニーからの培 養増殖物から調製された。 プラスミドＤＮＡはｐＶＥＧのＥｃｏＲＩおよびＢａ＠Ｈ１部位間に５ｓｔｌ部 位がないことを確認するために５ｓｔｌによる消化によりスクリーニングされた 。１２のプラスミドＤＮＡのすべてが５ｓｔｌ消化に対し陰性であった。これら １２の単離物の１つが選択されｐＶＥＧ’　と名付けられた。 アー不ｒ塑ゲ１ｙ入（へり４１月↓部ｙアルコールデヒドロゲナーゼｃＤＮＡか ら誘導されたポリアデニル酸配列がｐＶＥＧに加えられた０図１に示したごとく 、プラスミドｐＭ０９８（公開された欧州特許比１１１ＥＰ　２７２，２７７に 開示され、＾−ｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ に受入番号５３４２８で寄託されている）がＤｒａ　ＩおよびＢａ５ＨＩで消化 され、約１５０ｂｐポリ（Ａ）断片がアガロースゲル電気泳動により精製された 。この断片は大部分ポリ（＾）配列から成っており非常に小さな隣接するｅＤＮ Ａを持つ。ポリ（Ａ）ｃＤＮＡ断片をｐＶＩｉＧ内へクローン化するためｐＶＥ ＧをＢａｗｌ　ＩおよびＳｍａｌで消化し、３．４ｋｂベクタ一断片をゲルで精 製した。ベクターおよびポリ（Ａ）断片をＴ４　ＤＮＡリガーゼでお互いに連結 し、ベクターｐＶＥＧＴを作製した（図１）。 開始配列をコードしている合成オリゴヌクレオチドをｐＶＥＧＴに加えた。この ことを完成させるには、ｐＶＥＲＴをＮｏｔｌおよび５ｓｔｌで消化し、ポリ（ Ａ）配列および２つのＴ７転写ターミネータを含む３７０ｂｐ断片をアガロース ゲル電気泳動により精製した。プラスミドｐＶＥＧ’をＮｏ１ＩおよびＢａｍＨ Ｉで消化し、３．２ｋｂヘクタ一断片をゲルで精製した。アニールされた時Ｂａ ｍＨＩ−５ｓｔｌアダプターを形成する２つのオリゴヌクレオチド（ＺＣ２０６ ３およびＺＣ２０６４：配列番号ＩＤ番号９および１０）が合成された。２つの オリゴヌクレオチドは個々にキナーゼ処理されアニールされ、直線状化ベクター およびポリ（Ａ）−ターミネータ断片と結合された。、ＶＥＧＴ’　（図１）と 称され、Ｔ７　ＲＮＡ転写ブローモータ開始配列に隣接するＥｃｏＲＩクローニ ング部位、ポリ（Ａ）　８Ｎ域、および２つのＴ７　ＲＮＡポリメラーゼターミ ネータを含むベクターが得られた。 うｒす（Ａ）＋ＲＮＡからのｃＲＮＡライフ゛−ｉ−の　１Ｇｌｕ　ｅ　Ｒが７ ｋｂの非常に大きなａｌＲＮＡによりコードされている（Ｆｏｎｇ、　Ｄａｖｉ ｄｓｏｎおよびＬｅｓｔｅｒ、　鉦匣凹Ｌ２：６５７（１９８８）　）ことを示 唆する証拠があるため、およびコード配列を含んでいる完全長ｃＤＮＡがｃＤＮ Ａの機能的クローニングに必要とされているため、大きなりＮＡの合成を最適化 するための方策が取られた。大きな完全長ｃＤＮＡを得るｃＤＮＡ合成の新規方 法が開発された。この方法は完全長７．５ｋｂ　ｃＤＮＡがモデル７．５ｋｂ　 ｍＲＮＡから合成できたこと、およびサザンプロフト分析により示されるごとく 、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡから構成されたライブラリー中に大きな完全長が存在した ことを示すことにより明らかであろう、さらに、この方法で重要であったすべて の酵素は商業的供給元から入手可能な非常に多くの酵素のロフトから前もって試 験さ＆選択された。満足のゆくロフトが一度特定されたら多量の酵素が購入され 酵素は使用するまで一７０℃で貯蔵された。一度使用されたら酵素は一２０℃で ２．３ケ月貯蔵されるがそれ以後は廃棄される。スーパースクリプト逆転写酵素 （ＢＲＬ）　、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ　（Ａｓｅｒｓｈａｓ）およびヤエ ナリヌクレアーゼ（ＮＥＢ）　（これらはｃＤＮＡ合成に使用される）のロフト を含む商業的供給元からの酵素の異なった“ロッドは試験合成アッセイでの譬で スクリーンされた。スーパースクリプト逆転写酵素ロフトは７．５ｋｂ　ＲＮＡ （ＢＲＬ）対照物から単位長（７，５ｋｂ）の第１の１ｊｃＤＮＡ合成能力でア ッセイされた。スーパースクリプト逆転写酵素ロフトによる第１の鎖合成のため の条件は以下に記載するように調整された。放射標識された第１の鎖ｃＤＮＡは アルカリ性アガロースゲル電気泳動により分析された。単位長、７．５ｋｂ　ｃ ｌｌＮ八を製造できるスーパースクリプトロットが使用するために選択された。 大ｉＩＪ！菌ＤＮＡポリメラーゼＩの口、トは７．５ｋｂ　串位長第１鎖ｃＤＮ Ａからの完全長第２ｖｈｃＤＮＡを製造する（へ？ビンＤＮＡ形成による）能力 でアッセイされた。第２鎖ｃｒｌＮＡ合成は以下に記載されているごと〈実施さ れた。第２１ｉ合成の質は放射性標識生成物のアルカリアガロース電気泳動によ り評価された。７．５ｋｂ単位長第１鎖ｃＤＮＡから１５ｋｂ第２鎖ＤＮＡを産 生できるＤＮＡポリメラーゼＩのロノＩ・が使用するために選択された。 ヤエナリヌク１ノアーゼのロットはｃＤＮＡを分解することなく第２の鎮合成の 間に形成されるヘアピンＤＮＡを切り取る能力で試験された。さらに、以下に示 した条件のための最適の酵素濃度を決定するため、濃度を変化させた酵素が添加 された。反応はアルカリアガロース電気泳動により評価さねた。７．５ｋ１１単 位長ｃＤＮＡを産生ずるロフトおよび濃度が選択された。 Ｉアニジンイソチオシアネ−１・（Ｃｈｉｒ＊ｗｉｎ　ｅｔ　ａｌ、Ｂｊｏｃｈ ｅｑｉｓｔＨ１８：５２−９４１９７９）才９よびＣｓＣｌ遠心分Ｍ（Ｇｉｌｓ ｉｎ　ｅｔ　ａｌ、ｌ□ａｉ１α１３：２６３３−２６３７１９７４）を用いて 二・１・小脳から全ＲＮＡが調製された。ボｊｌ（Ａ）＋ＲＮＡはオリゴｄ　（ Ｔ）　ノ！ルロースクロマＩ・グラフィーを用いて全ＲＮＡから選択された（Ａ ｖｉｒおよび１．ｅｄｅｒ、　Ｐｒｏｃ。 ）、！、−１５−駐ａ、ｒｊ　、、、、３す、μ５１１−６９・１４０８（１９ ７２））。 第１饋ｃＤＮ酎よ２回の別々の反応で、１度ポリｄ　（Ｔ）で選択された小脳ポ リ（Ａ）　＋ＲＮＡか〔ｌ）合成された。１つの反応は放射性標識ｄ＾ＴＰを含 んでおり、第１鎖合成の百の評価に使用された。２回目の反応は放射性標識ｄＩ ′ｌＴＰ不在下で実施され、一部第２鎖合成の質の評価に使用された、スーパー スクリプト逆転写酵素（ＢＲＬ）は、そりわけ以下に記載するごとく使用された 。順に、１Ｏｔｔ１２の５×逆転写酵素緩衝液（ＢＲＬ：２５０−トｌｌスーＨ ＣＩ、ｐＨ８，３，３７５ｄ　ＫＣＩおよび１５５Ｍ　ＭｇＣｈ）　−２，５ｕ 　Ｅの２００５Ｍジチオスレイトール（新ｊバ作製するかまたは少しづつわけて 一７０℃で貯蔵）および各１０ｍＭのｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄＴＴＰおよび ５−メチルｄＣＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａｌｌを含む？、５〃２のデオキシヌク レオチド三リン酸溶液を混合することにより室温で２．５Ｉ反応混合物を調製し た。反応混合物は各々７．５μ！づつ２つのチＪ、−ブに分けた。第１の千１− ブには１．３ｕｌの１０μＣｉ／　ｕｎのα”　Ｐ　−ｄＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈ ａｓ）を加え、Ｌ、３ｕｌの水を第２のチューブに加えた。１４ｕｌの５ｍＭト リス−１１ｃＩ：Ｐ　Ｈ７，４，５０μｌ’ｌ　ＥＤＴＡに希釈した１０μｇの 小脳ポリ（Ａ）　＋ｌ１ｌｌＩＡを含む１４μｉの溶液を２μ尼の１Ｉｇ／μｌ 　第ｉｉ＊プライマー、ＺＣ２９３８（表１：配列ＩＤ番号１１）と混合し、混 合物を６５℃に４分間加熱し、続いて氷水で冷却することによりプライマーはＲ ＮＡに（アニール）された、２つの反応チューブに８μｌのＲＮＡ−プライマー 混合物、続いて５μｌの２０００／μｌのスーパースクリプト逆転写酵素（ＢＲ Ｌ）を添加した。反応液は緩かに混合し、チューブは４５℃で３０分間インキュ ベートした。インキュヘーシラン後、各々のチューブに８０μ２の１０ｍＭ　ト リス−ＨＣＩ　、ｐ　Ｈ７，４，１ｄ　ＥＤＴＡを加え、試料をポルテックスし 、軽く遠心分離した。 全カウントおよびＴＣＡ沈殿カウント（取り込まれたカウント）を決定するため 各々の反応液から３μｉを採取した。各々の試料の２μｌが第１鎖合成の譬を評 価するためにアルカリゲル電気泳動により分析された。各々の試料の残りばＪり 、ノール沈殿を行った。核酸は遠心分離によりベレット化さ娠８０％エタノール で洗浄され１０分間風乾された。第１鎖合成で１．４Ｉｇの小脳ｃＤＮＡまたは ２８％のＲＮＡのＤＮＡの変換が得られた。 第２　［ｃＤＮＡ合成はヘアピン形成を生じる第１鎖開始第２饋合成を促進する 条件丁１、第１饋反応液からのＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド上で実施された。第 １鎖ｃＤＮＡを含む核酸ペレットを７１〃ｌの水に再懸濁した。第２１合成の質 を評価するため、α”　Ｐ−ｄＡＴＰを非欅議第１鎖ｃＤＮＡに加えた、−＼ア ビン構造の形成を促進さ（えるため酵素を除くすべての試薬は室温１二で暖め、 反応混合物は室温で１！備された。 （もしくは、試薬は氷上にあってもよいが、反応混合物は室温でつくり上げ、Ｉ ＧｏＣでのインキｉヘーシグンに先立って短い時間室温で平衡化させる。）各々 の合成に２つの反応チプーブが用意された。１つの反応チューブは非標識第１　 鎖ｃＤＮＡを含んでおり、他の反応チューブは放射性１ｍ第１１ｃＤＮＡを含ん でいる。各々の反応チューブに、２０／７ｊ２の５×第２鎖緩衝液（１００１１ Ｍトリス、ｐＨ７，４，４５０５ＭＫＣｌ、２３ｍＭＭｇＣｈ　５０ｍＭ（ＮＨ ４）ｔｓＯｇ）、３μｍのベーターＮＡＤおよび各々１０ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧ ＴＰ、　ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含む１μｌのデオキ シヌクレオチド三リン酸溶液、１μｉのα”　Ｐ−ｄＡＴＰまたは１μＥの水（ 放射性標識ｄＡＴＰが非標識第１鎖ｃＤＮＡを含むチューブに添加された）、０ ．６μｊ２の７　ＩＪ／ｕ　Ｎ大腸菌ＤＮＡリガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉ　ｎｇｅｒ −Ｍａｎｎｈｅｉｍ）　、３．１　ｕ　Ｉ！の８Ｕ／ｕ１．大腸菌ＤＮＡポリメ ラーゼＩ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ）および１ｕｌの２Ｕ／μｇのＲＮａｓｅ　Ｈ（ ＢＲｌ、）を加えた０反応液は１６”Ｃで２時間インキュベートした。インキュ ベーシッン後、全およびＴＣＡ沈殿可能カウントを決定するため、各々の反応チ ューブから３μ２を採った。約２倍の単位長のバンドの存在による第２１１合成 の質を評価するため各々の試料の２μ２がアルカリゲル電気泳動により分析され た。各々の試料の残りに２μ２の２．５μｇ／μ２カキグリコーゲ７．５ｕ１． の０．５Ｍ　ＥＤＴＡおよび２００　ｐ　ｌ　（７）１０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ 、ｐＨ７，４゜１ｍＭ　＋１ＤＴＡ　を添加し、試料をフエノールークロロホル 抽出し、イソプロパツールで沈殿させた。核酸は遠心分離によりペレット化し、 ８０％エタノールで洗浄し、風乾した。各々の反応液の２末鎖ｃＤＮＡの収量は 約２ｔ１ｇであった。 ヘアピン構造中の一本ｌＤＮＡはヤエナリヌクレアーゼを用いて切り取った。 各々の第２鎖ＤＮＡ試料は１２μｌの水に再懸濁された。２μｌのＩＯｘヤエナ リ緩衝液（０，３Ｍ　ＮａｏＡｃ、ｐ）１４．６．３Ｍ　ＮａＣ＋、１０ｍＭ　 Ｚｎ５Ｏａ）　、２　ｕ　１の１０ｍＭジチオスレイトール、２μ！の５０％グ リセロール、および２ｔｔｌｌのＩＯＵ／μｉヤエナリヌクレアーゼ（ＮＥＢ、 　ロット７）を各々のチューブに加え、反応液は３０”Ｃで３０分間インキキス ートした。インキュベーシッン後、各々のチューブに８０μｌの１０ｍＭ）リス −Ｍ　ＣＩ　、　ｐ　Ｈ７，４，１ｓＭ　ＥＤＴＡを加え、各々の試料の２μ２ をアルカリゲル電気泳動にかけ、第２鎖生成物の単位長ｃＤＮ＾への切断を評価 した。１００ｕｊ！の１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，４を各々の試料に加え、フ ェノール−クロロホルムで２回抽出した。最終フェノール−クロロホルム抽出に 続いてＤＮＡをイソプロパツールで沈殿させた。遠心分離してＤＮＡをペレット 化し、８０％エタノールで洗浄し、風乾した。各々の反応で約２μｇのＤＮＡが 得られた。 ｃＤＮＡペレットを１２μ２の水に再懸濁した後Ｔ４　ＯＮ＾ポリメラーゼでｃ ＤＮＡを平滑端にした。２ｕｌｌの１０刈４　ＯＮＡポリメラーゼ緩衝液（３３ ０ｍＭ）リス−酢酸、ｐＨ７，９゜６７０ｍＭにＡｃ、　１００＋＋Ｍ　ＭｇＡ ｃ、　ｂ＋ｇ／　ｍゼラチン）、２μＮの１−門ｄＮＴＰ、２μ／！５０−ジチ オスレイトールおよび２μ２のＩ　Ｕ／ｕ　ｌ　Ｔ４　ＤＮ＾ポリメラーゼ（Ｂ ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｕｈｅｉｍ）を各々のチューブに加えた。１５°Ｃ で１時間インキュベートした後、各々の試料に１．８０　ｕ　！ｌの１０ｍＭ　 トリス−ＭＣＩ、ｐＨ７，４，１＋＋＋ＭＥＤＴＡを加え、試料をフェノール− クロロホルム抽出し、続いてイソプロパツール沈殿を行った。遠心分離によりｃ ＤＮＡをペレット化し８０％エタノールで洗浄し風乾した。各々の反応液からの ＤＮＡを６．５μ２の水に再懸濁した後平滑端化ｃＤＮＡにＥｅｏＲＩアダプタ ー（Ｔｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｎ４０９−２０）を連結した。 第１鎖プライマーは発現ベクター内へのｃＤＮＡの方向指示的クローン化を可能 にするＳｓｔ■クローニング部位をコードしている。フェノール−クロロボルム 抽出およびイソプロパツール沈澱後ｃＤＮＡを５ｓｔｌで消化した。消化後、ｃ ＤＮＡは０．８χ低融点アガロースゲル中で電気泳動し、４．２ｋｂ以上のｃＤ ＮＡをＥｌｕＬｒａｐ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄＳｃｈｕｓｌｌ、Ｋｅｅ ｎｅ、ＮＨ）を用いて電気溶出した。５ｏｏμ！の緩衝液中の電気溶出されたｃ ＤＮＩＩｌよイソプロパツールで沈殿し、遠心分離によりペレット化した。ｃＤ ＮＡペレットは８０％エタノールで洗浄した。 小脳ｃＤＮＡライブラリーはｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ−５ｓｔｌ消化、アガロース ゲル精製ｐＶＥＧＴ　’に連結することにより確立された。 各々百万のクローンの１０のサブライブラリーが構成され一千万の独立したクロ ーンをライブラリー表わしている。各々のサブライブラリーを製造するには５ｏ ｎＨの線状化ベクターに４ＯａｇのｃＯＮＡが連結された。室温で１１時間イン キュベージタン後、２．５μｇ（ＤｆＪキグルコーゲンおよび８０ｕＩｌ（７） １０ｍＭ）’ＪスＨＣＩ、１＊ＭＥＤＴＡを加え、試料はフェノール−クロロホ ルムで抽出し、続いてエタノールで沈殿させた。遠心分離によりＤＮＡをペレッ ト化し、ＤＮＡベレットは８０％エタノールで洗浄した。風乾後、ＤＮＡを３μ ２の水に再懸濁した。３７μｌのエレクトロポシーシッンーコンビテントＤＨＩ ＯＢ細胞（ＢＲＬ）をＤＮＡに加えＢｉｏＲａｄエレクトロポレーションユニッ トを用いてエレクトロポレーションを完了させた。エレクトロポレーション後、 ４ｄのＳ　ＯＣ（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、）を細胞に加え、４００ｕｊ ！を各々１０−１５０輪ＬＢアンピシリンプレーシーに拡げた。各々のプレート は１００，０００クローンのサブライブラリーを表わしている。−夜インキュベ ーシ町ン後、各々のプレートに１０Ｍ１のＬＢチアンシリン培地を加え細胞を培 地内へかき取ることにより細胞を採取した。各々のプレートからグリセロールス トックおよびプラスミドＤＮＡを調製した。ライブラリーバックグラウンド（挿 入物を持たないベクター）は約１５％と確立された。 ｃＤＮＡ−イブ−１−か゛のＧｌｕＲ゛　のゼノバス（ｋ匹四１卵母細胞は効率 良く外から加えられた５ＲＮＡを翻訳する。予備的実験はｐＶＥＧＴ　’内へク ローン化されたマウス−ムスカリン性受容体ｃＤＮＡ　（電圧固定により検出で きるＧ蛋白質結合性受容体を用いて行われた。インビトロで赦鋳型ＤＮＡの希釈 を増すことにより転写されたＲＮＡの注入は一アゴニスト誘導活性が１００．０ ００のプールサイズ中の１つのクローンを検出できることを示した。 小脳サブライブラリーは１００，０００の独特のクローンのＩＯのプール内へ塗 布した。 プールはまたニトロセルロースフィルター上へレプリカ塗布することができ、本 来のものおよびレプリカは数時間増殖させた０本来のプレートは削り取ってすべ てのコロニーを採取した。プラスミドＤＮＡは塩化セシウム濃度勾配超遠心分層 により製造および精製された。各々のプールからのＤＮＡは翻訳効率を上げるた め７−メチル−Ｇ（キャップされたヌクレオチド）存在下、盃Ｚ　監上三でＴ７ ＲＮＡポリメラーゼにより転写された。鋳型ＤＮＡ転写反応はｐＶＥＧＴ　’内 へクローン化された２つの制御遺伝子の希釈によりだめにされる：マウスｄ遺伝 子およびヒト胎盤アルカリ性ホスファターゼ遺伝子の分泌型のもの（ＳＥＡＰ； Ｔａｔｅ　ｅｔ　ａｌ、、Ｆｅｄ。 Ａｓ、Ｓｏｃ、Ｅｘｐ、Ｂｉｏ！、　８　：２２７−２３１（１９９０）、ここ に引例として含まれている）。対照遺伝子からの転写はより効率よく注入された ＲＮＡを翻訳する卵母細胞の分泌およびＧｌｕ　ｒ、　Ｒに対して陰性である卵 母細胞が本当に陰性か（即ち、まだ検出可能なｄアゴニスト−誘導応答を示すか ）を決定することを可能にするであろう。 １００．０００クローンの１０のプールの各々から調製されたプラスミドＤＮＡ 　（総計で小脳ｃＤＮＡライブラリーの百万のクローンの１つのサブライブラリ ーを表わしている）は塩化セシウム濃度勾配超遠心分離により精製された。ＤＮ Ａはキャップされたヌクレオチド（ＧｐｐｐＧ、　Ｐｈａｌ＋５ａｃｉａ）存在 下：ｉ７　ＹＦＯで７７１１Ｎ＾ポリメラーゼ（Ｐｈａｒｓａｃｉａ）で転写さ れた。　ｐＶＥＧＴ　’中のポリ（Ａ）配列および２つのＴ７　ＲＮＡポリメラ ーゼターミ名−夕が存在するとキャップされた５′末端（ｃＤＮＡ挿入物の配列 ）および３′ポリ（Ａ）尾を持フＲＮＡを生じる。キャンプされたＲＮＡは卵母 ！ｌＩ胞においての効率の良い翻訳に必要と信しられており（Ｎｏｍａ　ｅｔ　 ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ　３１９：６４０（１９８６））、ポリ（Ａ）配列は卵母細 胞における査白質の合成を４０倍以上増加させることが示されている。転写反応 チューブは１２μｌの５×転写緩衝液（Ｓ　ｔｒａ　ｔａｇｅｎｅＣＩｏｎｉｎ ＨＳｙｓｔｅｍｓｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ　）　、各々１０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴ Ｐ、ＧＴＰおよびｔＪＴＰを３ｔｔ１．６ｕｌｌの１０ｍＭ　ＧｐｐｐＧ（Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ）、　６　ｕ　Ｅのｌｌ１ｇ／ｄＢｓ＾、３ｕｌ！の２００５Ｍ 　ＤＴＰ、１．５　ｕ　１．の４０Ｕ／ｐｉ　ＲＮａｓｉｎ（ＰｒｏＭｅｇａ、 Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＭａｄｉｓｏｎＪＩ）、８．T ｕＪの水、５から１ＯａｇのＤＮＡを含む１０μＡのｃＤＮＡ、およびｌｌ！ｆ の７０Ｕ／ａｌのＴ７　ＲＮＡポリメラーゼを加えることにより１！備された。 混合後、全カウント数およびＲＮＡ内へ取り込まれたカウント数を決定するため 、反応液の１０μ２を０．５μＣ４のα”−ＵＴＰ含んでいるチューブへ移した 。試料は３７℃で１時間インキュベートした。非標識試料中のｃＤＮＡは１ｕｅ の２ＯａＭ　［ｌＴＴ、　２　ｇ　ｌの３０Ｕ／　ａ　ｌ　ＤＮａｓｅ　Ｉおよ び０８５μ２の４０Ｕ／μ７！ＲＮａｓｉｎを加え、３７℃で１５分間インキュ ベージジンを続けることにより分解された。放射性４Ｗ識反応液へ４０ｕ　ｌの 水を加え、各々の試料から１μ２を取り、カウントして全カウント数を決定した 。標準試料の残りはエタノールで沈殿させた。試料は遠心分離してＲＮＡを集め 、ＲＮＡペレットをカウントしてＲＮＡ内へ取り込まれたカウント数を決定した 。非標識試料はＤＮＡ分解反応後、７０μｆｆｉの１０ｍＭ）’ＪスーＨＣｌ、 １ｍＭＥＤＴＡを各ｋ（１）試料に加え、試料は２回フェノール−クロロホルム で、続いてクロロホルムで１回抽出した。ＲＮＡはエタノールで沈殿させた。遠 心分離後ＲＮＡを集め、ペレットは８０％エタノールで洗浄し、続いて１０９間 風乾した。非標識ＲＮＡの典型的な収率は２０から３Ｏａｇであった。非接ｍＲ ＮＡはジエチルピロカーボネート（ＤＨＰＣ，Ｓｉｇｎａ）処理水に２μｇ／μ ｌで再！！ｉ！濁し、−７０″Ｃで貯蔵された。 卵母細胞へのマイクロインジェクションに先立って、ＲＮＡ試料は融解され、５ 分間マイクロファージ中で遠心分離し、マイクロインジエクシッンピペットをつ まらせるであろう粒子を除去する。遠心分離後、各々の試料の８０％をとり２つ のチューブに分けた。 １０のサブライブラリーの各々からのＲＮＡが上記のように卵母細胞内へ注入さ れ、４日間翻訳させた。　Ｇｌｕ　６　Ｒ活性の発現は前記の電圧固定アッセイ により評価された。１０のサブライブラリーの１つ、Ｚ９３−１．９は卵母細胞 へのキスカル酸の投与により信号を発生させた。 なＧＩｕ　ｃ　Ｒクローン　′るためのｃＤＮＡ−イブーリーブールのＤＮＡプ ール（Ｚ９３−１．９）　ｌよグリセロールストックからのクローンをＬＢチア ンピシリンプレート上塗布することにより副分割された。陽性クローンを同定す るためｔｏｏ、　ｏｏｏのクローンプールの副分割で塗布されなければならない クローン数を決定するため確率方稈弐Ｎ−１ｎ（１−Ｐ）／Ｉｎ（１ｆ）（Ｍａ ｎｉａｔｉｓｅｔａｌ、、上記文献）が使用された（式中、Ｐは問題とするクロ ーンを含んでいる所望の確率であり、ｒはブール中の陽性クローンの割合であり 、Ｎは与えられた確率を提供するために塗布されなければならないクローンの数 である）　、　１００．０００のプール号イズに対し、９９．８％の確率で１つ の陽性クローンが含まれるには６２１．４６１クローンが塗布されなければなら ない。 ４８の１５０　ｍｌ−Ｂアンピシリンプレートにｉｏｏ、ｏｏｏの陽性ブール（ Ｚ９３−１．９）を示すグリセロールストックをプレート当り約１４，０００ク ローンの密度で塗布すると総計で６７０．０００クローンとなる。３７℃で一夜 インキュヘーション後、各々のプレートＬの細菌を１０ｍの溶液１　（Ｒｉｒｎ ｂｏｉｓおよび１）０１ｙ、　Ｎｕｃ、Ａｃ可ｓ、Ｒｅｓ、　７：１５１３（１ ９７９）に記載されている、ここに引例として含まれている）中に採取した。細 胞の一部からグリセロールストックを調製し、プラスミドＤＮＡは細胞の残りか ら調製された。各々ＬＢチアンシリンプレートの８つを代表する６つのＤＮＡの プールが８つのプレートの群からのプラスミドＤＮＡの１吟の１を各々のプール へ混合させることにより調製された。これらの６つのプールからのプラスミドＤ ＮＡが塩化セシウム濃度勾配遠心分離により精製された。ＤＮＡは前に概記した ごとくＲＮＡに転写された。親ブールＺ９５−１．９の転写が陽性対照物として 含まれている。 卵母細胞にＲＮＡが注入され、卵母細胞の電圧固定アッセイによりＧｌｕ　６　 Ｒに対づ−る陽性物としてプールＺ９９−２５−３２が同定された。プールＺ９ ９−２５−３２はプレート２５から３３から調製されたＤＮＡを含有していた。 プレート２５から３２からのプラスミドＤＮＡは塩化セシウムでバンド化され、 陽性の親グールＺ　９９−２５−３２と共に上述のごと＜ＲＮＡへ転写された。 卵母細胞にＲＮＡが注入され、上述のように電圧固定アッセイが実施され、Ｚ　 １０４−２５およびＺｌｌｌ−３２が弱陽性、Ｚ　１０６−２７およびＺ　１０ ９−３０が中程度の陽性およびＺ　１０８−２９およびＺ　１１０−２９および ＺＩＩＯ−３１が最も強い陽性のプールと同定された。　ＺＩＩＯ−３１からの プールが更なる副分割に選択された。 グリセロールストックからの１４，０００の陽性プール（ＺＩＩＯ−３１）の副 分割による陽性プールの同定は成功しなかった。従って、Ｚｌｌｌ−３１を生じ るプールから調製されたプラスミドＤＮＡは細菌内へエレクトロボレートされ、 １，０００クローン／プレートの密度で６０のプレートへ塗布された。細菌によ り製造されたプラスミドＤＮＡが各々のプレートから採取された。各々のプレー トからのプラスミドＤＮＡの一部が混合され、各々１０のプレートを代表する６ つのプールを作製した。プラスミドＤＮＡを塩化セシウムでバンド化し、上述の ようにＲＮＡに転写された。 プール２１０８−２９．　２１１０−３１およびムスカリン性受容体ｃＤＮ＾（ １１１）から転写されたＲＮＡが陽性対照物として使用された。ＲＮＡが卵母細 胞に注入され、上述のように電圧固定アッセイが実施された。アッセイによりプ ールＺ　１３３−２１から３０が陽性と同定された。 グリセロールストックからの陽性プールＺ　１４２−２２の副分割による陽性プ ールの同定は成功しなかった。プールＺ１１０−３１（１４，０００のプール） およびＺ　１４２−２２（１０００のプール）から無作為に選択されたクローン から調製されたプラスミドＤＮＡの制限分析はプール２１１０−３１の５０％お よびプールＺ　１４２−２２の６８％は興味が持たれないクローンであったこと を示した。 Ｇｌｕ　ｓ　Ｒクローンをｉｌｌ！縮するための物理的方法を評価するため、お よびＧｌｕ　Ｇ　Ｒクローンを含むようにアッセイするにはプールＺ　１４２− ２２からどのくらいの数のクローンが必要とされるかを確立するためにプールＺ 　１４２−２２からの未消化ブラスミミドＤＮＡがアガロースゲルで電気泳動さ れた。興味が示されないベクターを表わすスーパーコイルバンドは切断して除き 、ＤＮＡの残りをゲルから溶出した。 ＤＮＡは細菌細胞内へエレクトロボレーシジンされ、プレート当り、３，４００ ．６．９００および１３，８００クローンの密度で塗布された。プレートはレプ リカに塗布され、−夜増殖させた６各々のプレートのレプリカから採取された細 胞からプラスミドＤＮＡがｔＩｌ製された。プラスミドＤＮＡは転写され、上述 のごとく卵母細胞中でＲＮＡがアッセイされた。対照としては、各々のプールは 内部陽性対照としてｄの１つのコロニーの等個物を含んでいた。さらに、ｄは外 部陽性対照としても使用された。電圧固定アッセイは６，９００クロンブール（ ２１６７−７）からのＤＮＡを陽性と同定した。 陽性プールＺ　１６７−７から得られる６、　９００クローンプレート上に発現 されるクローンはＬＢチアンピシリンプレート上Ｂｉｏｄｙｎｅ−Ａナイロン膜 上へのマスターブレーＩのドブリカブレーティングにより副分割された。レプリ カプレートは３７°Ｃで４時間インキュへ−１・された。インキ工ヘーパノヨン 後、プレートから膜を除くこと（こより、ザブブールを作り、膜をライ１〜ボン クス上の無菌ガラスプレー１・にテープで止め、膜を１００の部分に分割する格 子を持つ膿を重積した。格子の各部分および下にある膜部分をアルコールにつけ たかみそりの刃で切断し、各々の切断の間は炎で消ＩＬＬ、た。アルコール処理 、炎消毒ビンセットを１２．５−のＬＢアンビソリ〉・培地を含む試験チューブ への各々の膜部分の移送へ使用した。膜の一部分を含む培養液を３７゛Ｃで一夜 インキュベートし、た。インキュヘーシゴン後、各々の培養液の０．５　ｍを０ ．５ｄの５０％グリ七〇−ルと混合し、−７０”Ｃで貯蔵し、各々のザブブール のグリセロールストックとする。１００の培養物の一部をＫＦ＋（１１から００ の横座標および試料（ａ）から（」）の縦座標を待つｌ０ＸＩＯのマトリックス にプールした。 例えば培養物（１）から００の１ｍをチューブ１に加え、培養物（１）、　（Ｉ Ｉ）、（２１）、（３１）、（４１）。 （５１）、（６ｕ）、（７１）、（８１）および（９１）のＩＲｌ、をチ１−ブ （ａ）へ加え各々ｉｏの培養物のブールを含む１０列および１０段が完成１゛る まで続、ける。内部対照として各々のプール・・・ｄ形質転換細菌を含むｌＯμ ｐの一夜培養物を加え六−、プラスミドＤＮＡは２０のザブプールから調製され 、ＤＮＡは塩化セシウム濃度勾配遠心分離により精製した。グ）スミドＤＮＡか らＲＮＡが転写され、−上述のごとく卵母細胞中で゛アッセイされた６陽性対照 は親ブール２１６７−７および純粋なｄＲＮＡてあった。電圧固定アッセイはプ ールＺ　１７５−１およびＺ１９Ｌｇのみが陽性であったことを示ｊまた。 マ［リノクスを調べると３、このことり１番号（７）の膜分画がＧｌｕ　、、、 　Ｒクローンを含んでいることを示していた。 分画（７）を含まれるクローンを副分割するため、分画（７）を含むマスタープ レート１にＢｉｏｄｙｎｃ　Ａ膜片が適用され１、膿は分画（７）から各々の辺 で分１ｉｉｉｉ（７）の幅の半分はど超えで拡がっている。膜をプレートから除 き、新鮮な■、■３アンピシリンプレート’：Ｎ５Ｑ−側を上に１７で応用し、 ３７’［：で−夜インキュへ−１−シた。膜は上述のごおく膜の中心９Ｍ域（実 際の分画（７）の領域）をとり、小さな等し２い大きさの正方形９つに分画され 、分画（７）の各々の辺上の膜は４つの追加の領域として取られるように膜分画 された。各々の膜分画は１０ｄの液体培地への接種ｒ使用された。−クローンで 形質転換された細菌が上述のごとく各々の培養においての内部対照とじて使用さ れた。３７°Ｃで一夜インキスヘーションした後、プラスミドＤＮＡを調製し、 ＤＮＡは塩化セシウム濃度勾配遠心分離により精製された。ＲＮＡが転写され、 上述のごとくｄおよび親プール番号（７）からのＲＮＡを陽性対照として用いて 卵母細胞にてアッセイされた。　Ｇｌｕ　ｃ　Ｒ活性は膜分画番号（７）に対応 するプールＺ　２０３−７のみから観察された。 プール２２０３−７は膜分画番号（７）から調製されるプラスミドＤＮＡをＤＨ ＩＯＲエレクトロボレーシヲシーコンビテント細胞内へエレクトロボレーシ巧ン を行うことにより膜分画された。形質転換体は個々のコロニーをひろうことがで きる密度で塗布された。個々のクローンはマスタープレートおよび２ｄＬＢアン ピシリン培地−・ひろい上げられた。培養液は一夜インキコヘートし、プラスミ ドＤＮＡはＨｏ１ｍ３およびＱｕｉｇ　ｌｅｙ　（Ａｎ吐、Ｒ４ｏｃ、１１４： １９３．　（１９８１））により本質的に記載されている方法により調製した。 制限分析はクローンは７つの異なった群のクローンへ群分けされることを示した 。各々の群から製造されたＤＮＡ（５０のクローンを代表する）がｔｌｌ製され 、転写され、１述のように卵母細胞中でアッセイされた。しかしながら、陽性で あったクローンはなかった。 陽性クローンをスクリーンするため、エレクトロボレーシ式ンーコンピテン（− 大ＩＪＩ菌Ｄ　Ｈ１０ＢｍｌｔｉＣ１０ｍ１１号口）　（Ｚ２０３−７　）　カ ラ調１サレタＤＮＡ＋７＋エレクトロボレーシコンを行い、プレート当り１８０ ．３６０．９００および１８００　′：１０ニーで塗布された。プレートは一夜 インキュベートし７、レプリカプレートが上述のように調製された。各々のレプ リカプレートから調製されたプラスミドＤＮＡは内部標準としてのｄの１から１ ０００部と混合された。ＤＮＡブール、ｎｌクローンおよび親ブールＺ２０３− ７が転写され、ＲＮＡは卵母細胞注入によりアッセイされた。第４の転写および 注入は陽性物を示さなかったが、しかしながら、再転写および再分析により１日 ００クローンブール（２２６４〜１８００）がＧｌｕ　ｅ　Ｒ活性に対し陽性で あった。 １８００の陽性プール（Ｚ　２６４−１８００）を副分割するため、１８００の プレートからの全部のコロニー（総計１５２８）が１００コロニー格子上の２つ の１００■　ＬＢアンピシリン寒天プレートへ各々拾い出された。−夜増殖させ た後、−組の二重のプレートはマスターセットと称され、４℃に置かれた。他の 紐はプレートの第３の紐へ塗布されたレプリカであった。これらのプレートを一 夜インキスベーションした後、レプリカブレート上の細胞は培地内へ採取し、プ ラスミドＤＮＡはプールされた細胞から調製された。上述のごとく、各々のＤＮ Ａ調製試料中に内部ｄ対照物が含まれている。ｄＤＮＡおよびＩＩ　Ｚ　２６４ −１８００　Ｄ　Ｎ　Ａが外部陽性対照として使用された。１６のプレートから 調製されたプラスミドＤＮＡが転写され、ＲＮＡは上述のごとく、卵母細胞中で アッセイされた。１００クローンのプールの１つ、Ｚ２５６−１がＧｌｕ　Ｇ　 Ｒ活性を示した。 Ｚ２５６−１からの１００クローンのどのクローンがＧｌｕ　Ｇ　Ｒ活性を産生 ずるかを同定するためにクローンのｌ０ＸＩＯのマトリックスが構成された。各 々のクローンの液体培養物を増殖させた。各々の培養物のＩＭｉを適切なｌ０Ｘ ＩＯマトリツクスの列および段を表わしている各々２つのチューブへ加えた。前 に記載したごとくｄをコードしているプラスミドＤＮＡが内部陽性対照物として 使用された。各々のチューブから調製されたプラスミドＤＮＡ、ｄＤＮＡおよび 観ブールＺ２６４−１８００からのＤＮＡが転写され、上述のごとく卵母細胞中 でアッセイされた。　Ｇｌｕ　Ｇ　Ｒ活性は列（５）および段（ｅ）にのみ同定 された。それ故、陽性クローン番号４５がＧｌｕ　ｃ　Ｒ活性を含むものとして 同定された。 結果を確認するため、クローン＃４５からプラスミドＤＮＡが調製され、転写さ れ上述のごとく卵母細胞中でアッセイされた。アッセイの結果はクローン＃４５ はＧｌｕ　Ｇ　Ｒ活性を産生できることを示していた０図２は小脳ライブラリー の膜分画化のいくつかの段階での電圧固定記録からとられたデータを示している 。パネル（川は１００，０００の独立したコロニーのラット小脳サブライブラリ ーから不Ｚ　且上三で転写されたＲＮＡを前もって注入した卵母細胞のキスカル 酸に対する応答が記録されている；パネルＣｂ）は１４，０００コロニーの膜分 画化プールから転写されたＲＮＡを前もって注入された細胞中のキスカル酸への 応答を示している。ピーク電流はチャート記録計により頭が切られているが実際 のピーク電流（デジタルパネルメータから見積られた）は約１３００　ｎ　Ａで あった。バネ／１４Ｃ）はクローン４５−＾からの純粋なＧｌｕ　Ｇ　ＲＲＮＡ を注入された細胞のキスカル酸への応答を示している。 卵母細胞当り注入されたＲＮＡ量は約１１００ｎであり、バネＭＣ）を除いてＲ ＮＡ量は５０μｇであった。 以下には陽性プールを副分割およびスクリーニングする別の方法が記載されてい る。ラムダに基づくヘクターよりもむしろプラスミド中のｃＤＮＡ挿入物に基づ いて作業すると副分割化プロトコールが影響を受ける。一度陽性プールが同定さ れたら、別の無菌ニトロセルロースフィルターとともにレプリカフィルターを上 にかぶせる。フィルターは格子を形成するようにｌ０ＪＩおよび１０段の等しい 間隔のカンタ−を用いて８８の小片へ切断する。８８片の各々をＬｏＷｌの無菌 ＬＢ＋Ａｍｐへ移し、数時間増殖させる。２０のプールが形成される１ｃ１−１ ０（段番号に対応する）およびＲｌ−１０（列番号に対応する）。８８の膜分画 の各々の一部をピペットで２つのチューブに加える　（その位置が列および段に 対応するように）。ＤＮＡが２０のプールから単離され、ＣｓＣ１濃度勾配によ り精製され、対照ｄおよび５ＥＡＰプラスミドを含んでいるんで４ｙ　Ｙ１三反 応で転写される。卵母細胞へ注入および電圧固定の記録後に２つの陽性プールが 存在し、８８の本来の膜分画の１の位置が正確に指摘される。 陽性クローンはまだプールの一部であるため、更なる副分割がなされねばならな い。前述の確率方程式が次のプールの副分割に塗布されるべきクローンの数を決 定するために使用された。陽性プールからのグリセロールストックが例えばプレ ート当り３，０００．６，０００および１８，０００クローンで塗布された。レ プリカブレーティング後ＤＮＡを集め転写、注入およびアッセイを行った。陽性 であるプールは上述のように８８の格子内へ副分割される。アッセイを繰返すと 格子の一つの四角が陽性である。プールの副分割の次の工程はプレート上の１０ ０の個々のコロニーを選びとり、レプリカに塗布し、２０のプールが転写および アッセイのために作製される。陽性クローンが画線され、いくつかのコロニーが 選びとられ、制限地図が作製され注入およびアッセイのための鋳型および転写体 が作製される。 旦上止Ｊ９逝ｌ クローン４５−ＡによりコードされるＧｌ　ｕｃＲをＧ蛋白質に結合させるため 、上記に従ってクローン４５　Ａ　ＧＩｕａＲのＲＮＡを転写し、そして卵母細 胞に注入した。注入から２日後に卵母細胞を対照群と毒物処理群に分けた。毒物 処理群の卵母細胞を最終濃度４ｕｇ／ｍＩのＢ、ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素（Ｌｉ ｓｔ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、、Ｃａｍｐ ｂｅ　ｌ　ｌ、ＣＡ）で処理し、そして両群を２４時間１９℃においてインキュ ベートしたか、この方法はスギャ７　（Ｓｕｇ　ｉ　ｙａｍａ）ら、Ｎａｔｕｒ ｅ　３２５：５３１　（１９８７）およびモリアリティ　（Ｍｏｒｉａｒｉ　ｔ ｙ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６４：１３５２１　（１９８９）に記載さ れており、これら文献は引用により本明細書の一部をなす。対照群と毒物処理群 の両群の卵母細胞を前記電位固定アッセイに供した。１例において、１００μＭ のし一グルタミン酸で上記のように潅流された卵母細胞は、対照群で２６４．２ ｎＡ＋／−７３ｎＡ（ＳＥＭ、ｎ＝６）および毒物処理群で５７．７ｎＡ＋／− １９ｎＡ　（ＳＥＭ。 ｎ＝９）の平均Ｉ７−グルタミン酸誘導電流を示した。毒物処理群の平均膜電流 は対照群の電流より顕著に低いことから（ｐ＜０．０１）、４５−Ａ　ＲＮＡを 注入された卵母細胞は百日咳毒素感受性Ｇ蛋白質を結合したものであることが示 唆された。 投薬量依存性の様式においてＧｌｕｃＲの電流を活性化することが知られている し一グルタミン酸およびその構造上の誘導体のいくつかを、４５−Ａクローンか ら転写されたＲＮＡを注入した卵母細胞に適用した。前記のとおりに、ＲＮＡを 転写し、そして卵母細胞を調製し、そして注入した。電位固定アッセイにより投 薬量依存性の応答を測定したが、該アッセイはＬ−グルタミン酸（シグマ）、キ スカル酸（ｑｕｉｓｑｕａｌｉｃ　ａｃｉｄ）（シグマ）、イボテン酸（ｉｂｏ ｔｅｎｉｅ　ａｃｉｄ）　（シグマ）、またはトランス１−アミノ−シクロベン チルー１．３ジカルボン酸（ｔＡＣＰＤ；Ｔｏｃｒｉｓ　Ｎｅｕｒａｍｉｎ、Ｅ ５　ｓ　ｅ　ｘ、英国）存在下で、これらの濃度を増加させて実施した。特定の 薬剤の連続投与の間は３０分間間隔を開けながら、該薬剤の濃度を増加させて４ または５個の別々の卵母細胞を潅流することにより、感度低下により生じ得る妨 害を最小にした。応答は、１００μＭのＬ−グルタミン酸に対する次の応答に対 して基準化した。データは以下の等式により分析した：（画分１ｉ流）　＝　（ 投薬Ｉｎ）　／　（投薬量″′）　＋　（ＥＣ５０）　ｎ（式中、投薬量は、１ ００μＭのし一グルタミン酸の次の投与により引き起こされた投薬量に対して基 準化された投薬量であり；両分電流は、上記のとおり、投薬量により引き起こさ れたピーク電流であり； ＥＣ，ｏは、５０％の応答を引き起こす有効濃度（アゴニストの潜在効力の指標 ）であり：そして ｎは、ヒル（Ｈｉｌｌ）定数、反応の協調性の指標を表す。）。 この等式を用いて、１００μＭのＬ−グルタミン酸に対する５０％の刺激におけ る有効濃度が各投薬量応答実験に関して測定された。図６は、Ｌ−グルタミン酸 濃度の変化に関する代表的投薬量応答カーブを示す。グルタミン酸類似体の潜在 効力のシリーズおよびそれらに関連したＥＣ５ｏを表２に示す。 表２ グルタミン　゛　の　（ＥＣ。 キスカル酸　０．６８１μＭ Ｌ−グルタミン酸　１２．３２μＭ イボテン酸　３２．３７μＭ ｔＡＣＰＤ　３７６μＭ さらに、卵母細胞を以下のし一グルタミン類似体：アスパラギン酸（Ｔｏｃｒｔ ｓ　Ｎｅｕｒｍａｎ）、カイニン酸、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤ Ａ；シグマ）、２−アミノ−４−ホスホノビチリツク酸（ＡＰＢ；シグマ）、α −アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−イソキサゾール−４−プロピオン酸（ ＡＭＰＡ：Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　Ｉｎｃ、、Ｗａｙｌ ａｎｄ、ＭＡ）に飽和濃度で暴露し、応答を１００μＭのし一グルタミン酸に対 する次の応答に対して基準化した。有効でないことがわ力じたＬ−グルタミン酸 類似体は１ｍＭアスパラギン酸、１ｍＭカイニン酸、１００μＭ　ＮＭＤＡ＋１ ０μＭグリシン、１００μＭ　ＡＰＢおよび１００μＭ　ＡＭＦＡＴあった。 注入された卵母細胞に関し、て電位固定アッセイを実施することにより、仮想グ ルタミン酸Ｇ−蛋白質結合すセプターアンタゴニスト、２−アミノ−３−ホスホ ノプロピオン酸（ＡＲ３）による阻害も測定ｌ−だ。電位固定アッセイにより、 １゜０１１Ｍグルタミン酸により引き起こされた電流を、］、ｍＭのＤＬ−ＡＰ ３　Ｃシグマ）が対照の５９．３＋／−７，３％に低下させたことが示された。 クローン４５の細胞をＬＢのＡｍｐｍｐ−レート上トリークし、そして幾つかの コロニーを拾いあげ、生育させ、そしてＤＮＡを単離し、た。生成された４５− ＡのＤＮＡを中離し１、そして標準的な方法により制限地図を作製した。クロー ン４５−Ａはアメリカンタイプカルチャーコｌツクジョン（１２３０１Ｐａｒｋ ｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉ　ｌ　ｌｅ、Ｍｄ、２０８５２）に、寄託 番号Ａ”Ｔ”ＣＣ６８４９７として寄託されている。Ｄ　Ｎ　、Ａは単一または 複数の酵素により消化した。断片を１％アガロースゲルおよびヌシーブ（Ｎｕｓ ｉｅｖｅ）ゲルＪ二で電気泳動Ｉ７て分離した。電気泳動後、サザントランスフ ァーの標準的プロトコルによりＤＮＡをニトロセルロースフィルターにトランス ファーした。４５−Ａ　ＤＮＡの大きさおよびＰｓｔｌザブクローンに対するハ イブリダイゼーションに基づいて制限部位をマツプ（また。さらに、ＮｏｔＩ制 限酵素による消化により完全な４５−ＡｃＤＮＡ挿入物を単離することができる 。ＮｏｔＩ挿入物をγ−”Ｐ−ＡＴＰでリン酸化し、そして試料の半分をＢａｍ ＨＩで消化することにより３゛標識を除去した後、挿入物中の制限部位が１カ所 であることがわかっている制限酵素を多数用いて両方の試料を消化Ｉ７た。この 方法により、唯一の部位の位置を知ることかできた。ＧＩ　ｕｃＲクローン４５ −Ａの制限地図を図３に示す。 完全４５−Ａクローンの塩基配列を両方向からグイデオキシヌクレオチドチ２イ ンクーミネーション法Ｅサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）とクールソン（Ｃｏｕｌｓｏ ｎ）、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、９４：４４１　（１９７５）、引用により本明細 書の一部をなずコにより決定した。図５（配列番号Ｊ、および２）は、クローン ４５−ＡのＤＮＡ配列および推定されるアミノ酸配列を示す。図５は、仮想Ｎ− 結合グリコシル化部位も示すか、該部位はＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒのアミノ酸配列の 所で生じることが予測されている。 図５に示すとおり、アイゼンｔ　＜−グ（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ）ら、Ｊ、Ｍｏｌ 。 Ｂｉｏｌ、１７９：１２５−１４２　（１９８４）（引用により本明細書の一部 をなす）に記載された方法により、クローン４５−Ａの推定アミノ酸配列がら７ つの仮想膜貫通領域が予測された。膜貫通多重領域（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ　ｄ ｏｍａｉｎｓ）であると予測されたもののみを含んでいた。さらなる膜貫通領域 （第３）は、フープ（Ｈｏｏｐ）とウッズ（Ｗｏｏｄｓ）　、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ 　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ　７８：３８２４−３８３８（１９８１）の 方法により予測された。これらの予測に基づくと、クローン４５−Ａによりコー ドされる蛋白質は２つの異常に大きな領域をアミノ末端およびカルボキシル末端 に有するらしく、該領域は７つの予測された膜拡張領域（ｓｐａｎｎｉｎｇ　ｒ ｅｇｉｏｎ）を共通の構造的特徴とする、他に報告されたあらゆるＧ蛋白質結合 リセブターにおいては見いだされないものである。クローン４５−Ａの推定アミ ノ酸配列の分析がら、該配列のアミノ末端に一つを含む３つの他の疎水性範囲（ ｓｔｒｅｔｃｈ）が予測される。このアミノ末端の疎水性範囲はシグナル配列で あるがもしれないが、該配列の下流にはシグナル分割部位は予測されない。 アビブ（Ａｖｉｖ）とリーダー（Ｌｅｄｅｒ）（前記）において記載されている とおりに、オリゴｄ　（Ｔ）セルロースクロマトグラフィーにより、ラット全一 およびラット小脳からポリ（Ａ）＋ＲＮＡを単離した。ラット網膜、ラット心臓 、ラット肝臓、ラット腎臓、ラット膵臓、ラット精巣、ラット卵巣およびラット 膵臓のポリ（Ａ）＋ＲＮＡはクロンチック社（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ）から購入した 。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ試料をノーサン法［トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）、Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｅｉ、ＵＳＡ　７７：５２０１−５２０５　（１９ ８０）］により分析したが、該文献は引用により本明細書の一部をなす。ＲＮＡ をグリオキサル中で変性し、アガロースゲル電気泳動し、そしてニトロセルロー ス膜にトランスファーしたが、これらの方法はトーマス（Ｔｈｏｍａｓ）（前記 ）に記載されているとおりであるａ４５−Ａクローンの３４７３ｂｐのＥｃｏＲ Ｉ−ＸｂａＩ断片を放射線標識したものでノーザンプロットをハイブリダイズし た。 該プロットのオートラジオグラフィーにより、ラット全−ＲＮＡおよびラット小 ［ＲＮ　Ａの約７ｋｂの主要バ：／１−へのハイブリダイゼーション、および約 ３．８ｋｂのより短いハンドへのハイブリダイゼーションが観察された。 ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ１μｌＺを用いて、スーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒ ｉ　ｐ　ｔ　）リバーストランスクリブターセ（ＢＲＩ、）により、製造者の指 示する条件において一本鎖ｃＤＮＡを合成Ｌ　ｆｌ二。ｃＤＮＡの４分の］は、 ＰＣＲ増幅の鋳型とし、て使用し、該増幅は各４０ｐｍｏ　ｌ　ｅのＧｌｕｃＲ 特異的プライマーＺＣ３６５２（表］−；配列番号コ４）およびＺＣ３６５４（ 表１．配列番号１５）および２．５ＵのＴａｑｌボリメラーセ（Ｐｅｒｋｉｎ　 Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ、Ｎｏ＋−Ｗａｌｋ、〜’Ａ）を用いて、製造者により 特定された条件において行われた。内的な（ｉｎｔｅｒｎａｌ）対照として、該 ＰＣＲ反応は、各２ｐｍｏｌｅのグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナー ゼ特異的プライマーＺＣ３０１５（表〕：配列番号１２）およびＺＣ３０１６（ 表ｊ、配列番号］３）も含ん／、：、、３０サイクル（９４℃において］分間、 ６０℃において１分間、７２℃におい″ｒ９０秒間）後、試料をフェノール−ク ロロホルムにより抽出し、そ（７て各反応の２０％をアガロースゲルで電気泳動 １−７だ。Ｄ　Ｎ　Ａをニトロセルロース膜に両方向にトランスファーし、そし てフィルターをそれぞれ放射線標識されたＺＣ３６５２、ＺＣ３６５４，ＺＣ３ ０１５おＪ：びＺ　Ｃ３０’ｌ−６（ソｔｔソｔｔ配列番号］１１、コ５．１２ および】２３）と、または上記４５−Ａクローンの放射線標識Ｅｅｏ　ＲＩ　− Ｘ　ｂ　ａ　Ｉ断片と１１イブリダ・ｆズした。ハイブリダイズされたプロット のオー　トラジオグラフィ・−により、ＧＩＬｌｃＲ転写物は主としてラット全 一およびラット小脳に限られることが観察されたが、長時間の露出においては、 網膜および精巣にもＧＩｕａＲ転写物か観察された。 前頭皮質、小脳、海四、皮質、線条、脳橋髄質および脳のそれ以外の部分を含む 特定のラットの脳の領域から、上記の１１：おりに全ＲＮＡを調製した。上記の とおり、５０μｌ中の全ＲＮＡ２０μｇを用いて、スーペースクリプトリバース トランスクリブターゼ（ＢＲＬ）により製造者の記載する条件により一本鎖ｃＤ ＮＡを合成［、た。さらに１時間４２℃においてインキュベートした後、試料を ＲＮＡ５ｅ（ベーリンガーマ）・ハイムバイオケミカルズ社、Ｉｎｄ　ｉ　ａｎ ａｐｏ　Ｉ　ｉｓ、ＩＮ）で処理し、フェノール−クロロホルムで抽出し、そし 、てエタノールで沈殿させた。試料を水に再懸濁し、そして各試料の半分をＰＣ Ｒ増幅に供した。 各ＰＣＲ増幅は、各４０ｐｍｏｌｅのＧ１ｕａＲ特異的プライ７−ＺＣ３６５２ およびＺＣ３６５４（上記；配列番号１４および１５）、各２ｐｍｏｌｅのグル コース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ特異的プライマーＺＣ３０１５およ びＺＣ３０１６、および２．５ＵのＴａｑＩポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌ ｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）を含み、製造者により記載された条件により行った。３５ サイクル（９４℃において１分間、６０℃において１分間、７２℃において９０ 秒間）後、試料をフェノール−クロロホルム抽出し、そして各反応物２０％をア ガロースゲル電気泳動に供した。上記のとおり、ＤＮＡをニトロセルロース膜に トランスファーし、そして波膜をクローン４５−Ａの放射線標識ＥｃｏＲＩ−Ｘ ｂａｌ断片とハイブリダイズした。ハイブリダイズされたプロットのオートラジ オグラフィーの結果から、脳を通じてＧｌｕａＲ転写物が広い範囲で分配されて いることが観察されたが、前頭皮質および小脳ではいくらか豊富ら１．い。 Ｂ１１ｎら（Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、３：２３０３　（１９７６）、引用 により本明細書の一部をなす）の記載に本質的に従った方法により、ラットおよ びヒトゲノミックＤＮＡのサザン分析を実施した。詳細には、ラットセルライン ＵＭＲ１０６（ＡＴＣＣＣＲＬ１６６１）およびヒトへバトーマセルライン（Ａ ＴＣＣＨＴＢ５２）から、それぞれラットおよびヒトゲノミツクＤＮＡを調製し た。該ゲノミックＤＮＡをＥｃｏＲＩまたはＰｓｔｌで消化し、そしてアガロー スゲル電気泳動した。ＤＮＡをニトロセルロース膜にトランスファーし、モして 波膜をクローン４５−Ａの放射線機１ｋ１．６ｋｂ　Ｐｓｔｌ断片とハイブリダ イズした。ハイブリダイズされたプロットのオートラジオグラフィーの結果から 、ヒト遺伝子はラットＧ　Ｉ　ｕＧＲと類似の配列を有し、そしてＧＩ　ｕａＲ 遺伝子は少なくとも一つのイントロンを含み、そして少数の密接に関連した遺伝 子があることが示唆された。 咀乳勉複皿鳳但ぎ訪ゑ魚貝 ＮｏｔＩおよびＸｂａｌを用いてｐＶＥＧＴ’　クローニングベクターから完全 なＧｌ　ｕＧＲのｃＤＮＡ挿入物を取り出した。ＤＮＡポリメラーゼＩ　（クレ ノー断片）およびｄＮＴＰｓを用いてその両末端を平滑にし、そして次にＥｃｏ ＲＩ（Ｓｒｎａ　ｒ　ｔ）リンカ−と連結した。リンカ−の連結の後、ＥｃｏＲ Ｉ末端を有する挿入物をリン酸化し、そしてＥｃｏＲＩカットされてキャップさ れた（Ｃａｐｐｅｄ）Ｚｅｍ２２８発現ベクターと連結した。連結反応でバクテ リアを形質転換し、そして制限分析および部分配列決定によりクローンを特徴付 けた（図４を参照せよ）。 培養された哺乳動物細胞、例えばＢＨＫ５７０およびＢＨＫｔｓ１３を、発現の ための宿主細胞として用いた。２５μｇのＣｓＣ１精製ＤＮＡをリン酸カルシウ ムで沈殿させ、そして１５０ｍｍプレート中の組織培養細胞に加えた。４時間後 に、細胞をグリセロールショックに供し、そして次に非選択培地に入れた。特定 の場合、特定の量の自己活性化を発生させるのに十分な高いレベルのＧｌｕ。 Ｒが発現される細胞においては、培地中にＱｌｕａＲに対するアンタゴニストを 含ませることによりそれら細胞の毒性応答の発現を防止する必要があるかもしれ ない。一時的に発現されたＧ１ｕａＲリガンド結合活性またはＰＬＯ活性化によ り、４８時間後に細胞を回収する。安定な発現は選択から２週間後に検出された 。Ｚｅｍ２２８発現ベクターはＧｌｕａＲ遺伝子の転写を制御できるプロモータ ー、およびバクテリアのネオマイシン耐性遺伝子を選択可能なマーカーとして含 む。蛋白質合成阻害剤である薬剤Ｇ−４１８に対する耐性を用いることにより安 定にトランスフェクトされたクローンを同定した。ベクター上にＳＶ４０の複製 開始領域が存在すると、該発現構築物は一時的発現にも使用される。幾つかの例 において、他の選択マーカーであるＤＨＦＲ遺伝子のＤＮＡをトランスフエクシ ジンプロトコルに含むことが好ましかった。Ｇ−４１８およびメトトレキサート 両方を用いた選択により、培地に高濃度のメトトレキサートを添加することによ りＧ　Ｉ　ｕａＲの発現を引き続いて増幅することができるクローンが単離され た。 トランスフェクト細胞からの膜間製物にＨ３−グルタミン酸が結合することによ り、ＧｌｕｃＲを発現するトランスフェクトセルラインが同定された。低または 中程度のレベルのＧｌｕａＲを発現するセルラインを使用することにより、機能 的スクリーニングアッセイを設定した。 ラットＧ蛋白質結合グルタミン酸すセプターｃＤＮＡを発現するＢＨＫ５７０細 胞およびＢＨＫ　ＴＫ−ｔｓ１３のクローンを２または３の１５０ｍｍ特大プレ ート培養皿にプレートし、そしてコンフルエントになるまで生育させた。各プレ ートの細胞を予め４℃に冷やした５ｍｌのＰＢＳ　（リン酸バッファー塩、Ｓ　 ｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）中にかき集め た。冷やした遠心分離チューブに該細胞を取り出し、上記プレートはそれぞれ５ ｍｌの冷やしたＰＢＳで洗浄し、洗液は上記細胞と共にプールした。上記冷やし たチューブを１．ＯＯＯｒｐｍにて２分間遠心分離し、モして上清を捨てた。細 胞を一７０℃またはドライアイス上で凍らせた。特定の場合、細胞は一７０℃で 一晩放置した。氷上で細胞を解凍し、そして細胞を約１５秒間ホモジェナイズす ることにより、３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ７，０，２，５ｍＭ　ＣａＣＩｚ、Ｌ ｍＭ　ＰＭＳＦを含む予め４℃に冷やしたバッファー１０ｍ１に再懸濁した。懸 濁液を冷やした遠心分離チューブに入れた。冷やした同じ溶液でホモジェナイザ ーを洗浄し、そして洗浄液を懸濁液に混ぜた。遠心分離チューブを４０．ＯＯＯ ｘｇにて４℃で１５分間遠心分離し、そして上溝を捨てた。３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ 。 ｐＨ７，０，２，５ｍＭ　ＣａＣ１２を含む予め４℃に冷やしたバッファーで沈 殿物をホモジエナイズした。冷やした溶液でホモジエナイザーを洗浄し、そして 洗浄液を懸濁液に混ぜた。ホモジェナイズされたものを上記のとおりに遠心分離 した。２番目のホモジエナイズ操作を該沈殿物に繰り返した。最終的な沈殿物を 予め４℃に冷やした３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ７，０，２，５ｍＭ　ＣａＣ１ｇ を含むバッファー２〜５ミリリドツルに懸濁した。キスカル酸アッセイの各プラ ス点およびマイナス点に関して、９６ウエルのマイクロタイタープレートのウェ ルに各ホモジェネート試料２５０μｍアリコートを加えるようにして、３つ１組 の試料を調製した。３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ７，０，２，５ｍＭ　ＣａＣ１゜ を含む予め４℃に冷やしたバッファーに、最終濃度で１０ｎＭのトリチウム化グ ルタミン酸を加え、そして該溶液を半分に分けた。その一方に、最終濃度で１ｍ Ｍのキスカル酸を加えた。３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ７，０，２，５ｍＭ　Ｃａ Ｃｌ２，５ｎＭトリチウム化グルタミン酸および５００ｍＭキスカル酸、または 、３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ７，０，２，５ｍＭ　ＣａＣ１，，５ｎＭ）リチウ ム化グルタミン酸のいずれかのアリコート２５０マイクロリツトルを上記３つ１ 組の試料に加えた。該試料を室温において３０分間インキュベートした。次に、 真空下でＬＫＢ１２９５−００１自動細胞回収装置（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫ Ｂ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）により試料をガラスフィルター上に回収し、 直ちに氷冷した３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ７，０，２，５ｍＭ　ＣａＣ１ｚで洗 浄した。マイクロウェーブオーブン上で該フィルターを乾燥し、そしてガンマカ ウンターでカウントした。 蛋白質の測定は、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ　（Ｒｏｃ ｋ　ｆ　ｏ　ｒ　ｄ、Ｉ　Ｌ）のクマジーーブルーに基づくアッセイにより、製 造者の指示する条件下で実施した。希釈されていない細胞ホモジエネートまたは ＢＳＡ標準１００マイクロリットルを２ｍｌの試薬に加え、そして光学密度を５ ９５ｎｍにおいて測定した。上記試料の蛋白質濃度は、３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐ Ｈ７，０゜２、　５　ｍＭ　Ｃａ　Ｃｌ　Ｚ中に希釈したＢＳＡ標準を用いて作 成された標準曲線によりめた。 これらアッセイの結果から、キスカル酸が、トランスフェクトされたＢＨＫ細胞 により発現されたグルタミン酸すセプターを競争的に結合できることか示唆され た。 アゴニストおよびてンタゴニストの　・スクリーニングＧ　ｌ　ｕ、Ｒを発現す るＢＨＫ５７０細胞または偽トランスフェクトされたＢＨＫ５７０細胞を、ウェ ルあたり約１００，０００になるように２４ウエルの組織培養皿にブレートする 。２４時間後、細胞をウェルあたり０．　２μＣ４のミオ−（２−３８）イノシ トール（特異活性：２０Ｃｉ／ｍｍｏｌ；Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅ ａｒ）で標識する。２４から４８時間インキュベートの終わりに、１０ｍＭ　Ｌ 　ｉ　Ｃｌを含むＨｅｐｅｓバッファー　（Ｓ　ｉ　ｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ 　Ｃｏ、）でｐＨ７，４に緩衝され予め暖められたＤＭＥＭ　（Ｄ　ｕ　Ｉ　ｂ ｅｃｃｏの修飾Ｅａｇｌｅｓ培地、製品番号５コー４３２、ＪＲＨＢｉｏｓｃｉ ｅｎｃｅｓ、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）で細胞を洗浄し、そして細胞を３７℃におい て５分間インキュベートする。次に、選択された薬剤を加え、そして３７℃にお いて細胞をさらに３０分間インキュベートする。細胞を氷上に置くことにより反 応を停止させ、そして培地を吸引して０．５ｍｌの冷やしたＤＭＥＭおよび０５ ｍ１の水冷１０％過塩素酸を加えることにより細胞を溶解する。１０分後、１０ ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７，０を２５０μＩ含む氷上のチューブに細胞溶解物を移 す。６０ｍＭのＨｅｐｅｓバッファー中の１．５ＭのＫＯＨ３２５μｍで該試料 を中和する。沈殿物が安定した後、１．０ｍｌの上清をＡｍｐｒｅｐミ二カラム （Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ、ＲＰＮ１９ ０８）にのせる。イノシトールリン酸をカラムから溶出し、そして試料をシンチ レーションカウンターでカウントする。陽性の応答は、標識イノシトールリン酸 レベルの上昇により示される。 去施何旦 さらに別のグルタメートリセプターサブタイプのスクリーらｚグツローン４５− Ａから誘導されたプローブを用いてさらに別のグルタメートリセブターサブタイ プを単離した。グルタメートリセブターサブタイプは、ライゲーションの前に３ ｋｂのインサートについてサイズ選択した、ラムダＺａｐ　ＩＩ中の全ラット脳 ｃＤＮＡライブラリー（ＣＡ、ラホヤ（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ）のＳｔｒａｔａｇｅ ｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社により、カナダ、ブリティッシュ　コ ロンビア、バンク−バーのブリティッシュ　コロンビア大学のＴｅｒｒｙ　５ｎ ｕｔｅｈ博士のために調製されたもの）から、およびライゲージ３ンの前に３ｋ ｂのインサートについてサイズ選択した、ラムダＺａｐ　ＩＩ中のラット小脳ｅ ＤＮＡライブラリー（ＣＡ、ラホヤ（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ）のＳｔｒａｔａｇｅｎ ａ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社）から、単離した。 全うット脳ライブラリーおよびラット小脳ライブラリーを、Ｅ、ｃｏｌｉＸＬ− １細胞と一緒にＮＺＹ寒天プレート上にブレーティングし０表３）、約２、ｌＸ ｌ０’のプラークを得た。サブタイプ１ａをコードするクローン４５−ＡをＰｓ ｔＩで消化して１．　３および１．　６ｋｂフラグメントを単離した。この４５ −Ａ　ＰｓｔＩフラグメントを、アマ−ジャム・ランダム−ブライミング・キッ ト（イリノイ州、アーリントンハイツのＡｍｅｒｓｈａｍ社）を用いて、ランダ ム・ブライミングにより標識した。プレートから二連の転写を行い、これらのフ ィルターを５０％ホルムアミド中で３７℃でハイブリダイズした。−夜のハイブ リダイゼーションの後、フィルターを２ＸＳＳＣ＋０，１％ＳＤＳにより５０℃ で洗浄した。陽性プラークを数回のグイリューンヨンブレーティングの繰り返し 及びランダム・プライム　プローブによる繰り返しスクリーニングにより単離し た表１ Ｎ１−η基因 ９５０ｍｌの脱イオン水に次のものを添加：１０ｇのＮＺアミン・カゼインの酵 素的加水分解物（ＩＣＮ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅａｌｓ社製） ５ｇのＮａＣ１ ５ｇのバクトーイースト　エキス １ｇのカザミノ酸 ２ｇのＭ　ｇ　Ｓ　０４　・７Ｈ，０ 溶質が溶解するまで撹拌し、５Ｎ　ＮａＯＨ（約０．　２ｍ１）でｐＨ７，０に 調整する。溶液量を脱イオン水で１リツトルに調整する。オートクレーブで２０ 分間滅菌する。 ０ｘＳＳＣ ＮａＣ１１７５，３ｇ及びクエン酸ナトリウム８８．２ｇを８’００ｍ１の水に 溶解する。１．ＯＮのＮａＯＨ数滴でｐＨを７．０に調整する。液量を水で１リ ツトルに調整する。オートクレーブで滅菌する。 プラスミドＤＮＡは、ブルースクリプト°システム（Ｓ　ｔ　ｒａ　ｔ　ａｇｅ ｎｅＣｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、陽性プラークから調製した 。このプラスミドＤＮＡを制限酵素分析及びザザンプロット分析（Ｓａｍｂｒｏ ｏｋら、Ｌ記、参照により本明細書に含まれる）に付した。二つのクローン、即 ち全うット脳ライブラリーに由来する５Ｎ２３及びラット小脳ライブラリーに由 来するＳＲ２が、４５−Ａクローンと異なるクローンとして見つかったので配列 を調べた。配列分析により、これらは二つの追加的サブタイプであることがわか った。５Ｎ２３はサブタイプ１ｂをコードし、これは２０アミノ酸の新規ストレ ッチをコードするさらなるーっの８５ｂｐエクソンと細胞内ドメイン内の終止コ ドンを有し、４５−Ａクローンに比較して２９２アミノ酸だけ短い。クローンＳ Ｎ２３の塩基配列と推定アミノ酸配列を図７に示す。ＳＲ２はサブタイプ２ａを コードする部分ｅＤＮＡ配列を含み、これは４５−Ａクローンのトランスメンブ レンドメイン及び細胞外ドメインに対して４２％のホモロジーを有する。 前記両ライブラリーを、クローン４５−Ａからの放射標識した１、３ｋｂのＰｓ ｔｌフラグメント及びＳＲ２からの放射標識した１、４ｋｂのＥｃｏＲＩ　−Ｐ ｖｕＩＩフラグメントで再クローニングして、完全サブタイプ２ａクローンを得 た。二つのさらなるクローンが得られた。全うット脳ライブラリーに由来する５ Ｎ３０は、完全なサブタイプ２ａをコードする配列を含んでいた。クローン５Ｎ ３０のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を図８に示す。ラット小脳ライブ ラリーに由来する５ＲＩ３は、新規リセプターサブタイプ２ｂの不完全配列を含 んでいた。５Ｒ１３の配列分析により、そのコード配列は３′末端で不完全で、 そして５Ｎ３０の配列と実質的に同一であったが、但し５Ｎ３０の３′末端内に ６１０塩基対の削除を含んでいる。クローン５Ｒ１３に挿入されたｃＤＮＡのＤ ＮＡ配列を図９に示す。 サブタイプ２ａクローンの完全３°末端の形成は、ＰＣＲ増幅及び５Ｒ１３にユ ニークな配列を含むオリゴヌクレオチド（ＺＣ４５２０，表４）及び５Ｎ３０の ３゛非翻訳領域の３′末端に近い配列に相当するオリゴヌクレオチド（ＺＣ４５ １９、表４）を用いて行った。ＤＮＡは各ライブラリーのオリジナルなプレート のライゼートから調製した。各プレートからクローンのプールを得た。ＰＣＲ反 応のため、各ライブラリーからの１０ナノグラム及び各オリゴヌクレオチド１０ ０１００ｐを反応量５０μｍ中（５０ｍＭ　ＫＣＩ、１０ｍＭ）リス塩酸、ｐＨ ９、０，１，５ｍＭ　ＭｇＣ１，，０，１％トリトンＸ−１００，０，０１％ゼ ラチン、各々０．　２ｍＭのデオキシヌクレオチド三リン酸及び２．５単位のＴ ｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔ　１ｃｕｓ　（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（ウィス コンシン州。 マジソンのＰｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を含む）で混合した。反 応混合物にミネラルオイルを重層した。５サイクル（９４℃３０秒、４５℃３゜ 秒、５０℃１分）及び２５ザイクル（９４℃３０秒、４５℃３０秒、７２℃１分 ）ののち、増幅ＤＮＡを分析のため取り出した。 ■ 椿１しＬυブヌクレオ止上２四−二配夕［Ω区ユニ影−〕−Ｃ４５１９ ＴＴＴ　ＡＴＴ　ＡＧＡ　ＡＡＴ　ＧＴＴ　ＣＴＣＧＧＴＣ４５２０ ＣＣＴ　ＣＴＴ　ＣＣＡ　ＴＡＴ　ＴＴＴ　ＴＣＣＡＴＴＣ４５５９ 、ＡＴＡ　ＡＧＡ　ＡＴＴ　ＣＡＴ　ＮＫＲＹＴＴ　ＮＧＣＹＴＣＲＴＴ　ＲＡ ＡＣ４５６０ ＡＴＡ　ＡＧＡ　ＡＴＴ　ＣＴＴ　ＹＲＡ　ＹＧＡ　ＲＡＡ　ＮＧＧ　ＮＧＡ　 ＹＧＣＣ４５６１ ＡＴＡ　ＡＧＡ　ＡＴＴ　ＣＧＣＮＧＧ　ＮＡＴ　ＨＴＴ　ＹＹＴ　ＮＫＧ　Ｎ ＴＡＣ４５６２ ＡＴＡ　ＡＧＡ　ＡＴＴ　ＣＴＡ　ＮＣＭ　ＮＡＲＲＡＡ　ＤＡＴ　ＮＣＣＮＧ Ｃ各反応からのアリロートをアガロース」ニで電気泳動し、サザン分析のために ニトロセルロースに転写した。このＰＣＲ生産物のザザン分析は、２ｂ配列の３ ゛末端に相当する４６０ｔ）ｐフラグメントが、いくつかのプールに存在するこ とを示した。２ｂサブタイプの３′配列をコー　ドする正しいサイズのＰＣＲ生 産物を生じたプールの一つを希釈して、放射標識したＺＣ４５１９及びＺＣ４５ ２０（表４）でスクリーニングした。放射標識したＺＣ４５１９及びＺＣ４５２ ０の両方にハイブリダイズするファージを拾い上げ、溶出し、希釈し、プレート にまき、オリゴヌクレオチドプローブを用いて再スクリーニングする。スクリー ニングは純粋クローンか得られるまで繰り返す。得られた純粋クローンの配列を 調べ、最も好都合な制限酵素を用いて完全長クローンを構築する。 サブタイプ１ａ及び２ａの推定アミノ酸配列のアラインメントに基づいて、ＰＣ Ｒ増幅を用いたさらなるサブタイプのクローニング方法をデザインした。６番目 の膜貫通ドメイン、保存アミノ酸配列Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓを囲む領 域、３番目のサイトブラズミックループ、及び２番目の膜貫通ドメイン内の保存 アミノ酸配列をコードする縮重オリゴヌクレオチドファミリーを調製した（表４ ）。 グルタメートリセブターｃＤＮＡ配列の増幅は、表４の縮重プライマーの対を用 い、ＰＣＲ法により、全うット脳ライブラリーからのｃＤＮＡ、ラット小脳ライ ブラリーからのＣＤＮＡ、ラット皮質ＤＮＡライブラリーまたはラット海馬ＣＤ ＮＡライブラリー（両者ともに、ＭＤ、ベセスダのＮ、１．　Ｈ，のＭｉ　ａｈ ａｅｌ　Ｂｒｏｗｎｓｔｅｉｎ氏から入手した）上で行った。各プライマーはま た１０ヌクレオチドの５゛テールを有し、これにより好都合な制限酵素部位を与 えられた。各ＰＣＲ反応に対し、ライブラリーから１０ナノグラム、及びオリゴ ヌクレオチドプールＺＣ４５６３及びＺＣ４５６０（表４）の１００１００ｐを 、反応量５０μｍ中（５０ｍＭ　ＫＣＩ、１０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ９，０，１ ，５ｍＭＭｇＣＩ２．０．　１９＋Ｊ’Ｊ　トンＸ−１００，０，０１９６’ｒ ！う５−ン。各々０．２−のデオキシヌクレオチド三リン酸及び２．５単位のＴ ａｑ　ＤＮＡポリメラーゼを含む）で混合した。反応混合物にミネラルオイルを 重層した。５サイクル（９４℃３０秒、４５℃３０秒、５０℃１分）及び２５サ イクル（９４℃３０秒、４５℃３０秒、７２℃１分）ののち、増幅ＤＮＡを分析 のため取り出した。 各反応物からのアリコートをアガロースゲル上で電気泳動した。ゲルのサザン分 析は、実質的にＳａｍｂｒｏｏｋら（上記）の方法および、サブタイプ１ａクロ ーン及び２ａクローン両者からの完全コード領域をカバーするランダムプライム 化フラグメントを用い行った。オートラジオグラフの結果は、ＰＣＲ反応により １ａサブタイプ及び２ａサブタイプのいずれとも異なる新規サイズのフラグメン トが生成したことを示した。二のＰＣＲで生したフラグメントをアガロースゲル 上で電気泳動した。上記独特なサイズのりセプター関連生成物に相当する領域を 切り出し、ＮＡ４５濾紙（ＮＨ，Ｋｅｅｎｅの５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ５ ｅｈｅ　Ｉ　１社）で電気泳動した。精製フラグメントは実質的に製造元の記載 方法に従って回収し、ＥｃｏＲＩで消化し、そして予めＥｃｏＲＩ消化で線状化 しそしてホスファターゼ処理により環状化を防止したプラスミドｐＶＥＧＴ’　 に連結（ライゲート）した。ライゲーション混合物をＥ、ｃｏｌｉのＤＨ１０ｂ ストレーンの細胞に形質転換した。形質転換体を拾いあげ、ニトロセルロース膜 上に複写ブレーティングし、１ａクローン及び２ａクローンからのランダムプラ イム化プローブを用いてスクリーニングした。４８コロニーを拾いあげて制限酵 素分析及び配列分析した。 全うット脳ライブラリーのｃＤＮＡおよび、ラット小脳ライブラリーのｃＤＮＡ からのＤＮＡ配列を各々増幅し、上記の方法を用いそしてオリゴヌクレオチドＺ Ｃ４５５９をＺＣ４５６１またはＺＣ４５５９（表４）と−緒に用いて分析した 。 ラット皮質ｃＤＮＡライブラリー及びラット海馬ｃＤＮＡライブラリー（ともに Ｎ、Ｉ、　Ｈ，のＭｉｃｈａｅｌ　Ｂｒｏｗｎｓｔｅｉｎ氏から入手した）を、 １０．０００コロニーの３０プールに小分けした。各プールからプラスミドＤＮ Ａを調製し、そのＤＮＡをサザン分析した（サザン分析は、プールをＢａｍＨＩ 及びＸｈｏＩで制限消化した後、または各プールを表４の縮重オリゴヌクレオチ ドを用いてＰＣＲ増幅してから行った）。プローブにハイブリダイズしそして完 全長ｃＤＮＡを含むように思われるＤＮＡを含むライブラリーのプールを、さら に分割した。プラスミドＤＮＡを調製し上記のようにしてスクリーニングした。 陽性プールを再度分割し、この操作をプールが純粋クローンになるまで継続した 。クローンを制限酵素分析及び部分配列分析に付した。区別できるグルタメート リセブターホモログのクローンは完全配列決定した。オリジナルのプールをＰＣ Ｒ増幅反応（最長のグルタメートリセプターホモログｃＤＮＡを含むプールを突 き止めるために、ｃＤＮＡインサート片の５゛末端のＳＰ６プロモーターに特異 的なオリゴヌクレオチドプライマー及び最も完全なｃＤＮＡの５°末端に相当す るアンチセンスオリゴヌクレオチドプライマーを用いて行った）に付すことによ り完全長クローンが得られた。 グルタメートリセブターサブタイプの サブタイプ１ｂ及び２ａをコードする相補ＤＮＡ配列を、最初に哺乳類発現ベク ターＺｅｍ２２８Ｒにサブクローニングして、都合よい末端制限酵素部位を作製 した。このｃＤＮＡを次にｐＶＥＧＴ’　にサブクローニングした。サブタイプ １ｂをコードするｃＤＮＡ配列は、実施例Ｉに記載したサブタイプ１ａの３′末 端部分を、５Ｎ２３からのサブタイプ１ｂのアナロガス部分に置換して構築した 。プラスミド５Ｎ２３はＫｐｎＩ及びＸｂａＩで消化して１ｂサブタイプの３′ 末端を含むフラグメントを単離した。Ｚｅｍ２２８Ｒ中にサブタイプ１ａをコー ドする配列（４５−Ａ）を含むプラスミドは、Ｋｐｎｌ及びＸｂａｌで消化して ベクターを含むフラグメントを単離した。このベクターを含むフラグメントを５ Ｎ２３からのＫｐｎｌ−ＸｂａＩフラグメントに連結した。生じたプラスミドは 、ＭＴ−１プロモーター、サブタイプ１ｂのｃＤＮＡ及びｈＧＨターミネータ− を有する。このプラスミドを、実質的に実施例Ｉに記載したようにしてＢＨＫ５ ７０細胞ラインに形質転換し、サブタイプ１ｂリセブターを発現する安定に形質 転換された細胞ラインを得た。このサブタイプ１ｂのｃＤＮＡフラグメントをＢ ａｍＨＩフラグメントとして単離し、ＢａｍＨＩで線状化したｐＶＥＧＴ’　と 連　結した。正しい向きにｃＤＮＡ配列を有するプラスミドを用いてｉＨｖｉｔ ｒＯの系でＲＮＡを合成した。このＲＮＡを卵母細胞に上記のように注入した。 サブタイプ２ａのｃＤＮＡを含むプラスミド５Ｎ３０をＥｃｏＲＩで消化してサ ブタイプ２ａのｃＤＮＡを単離した。このＥｃｏＲＩフラグメントをＥｃｏＲＩ で線状化したＺｅｍ２２８Ｒとライゲーションした。インサート片を正しい向き で有するプラスミドをＢａｍＨＩで消化して、ｃＤＮＡ配列を単離した。サブタ イプ２ａのｃＤＮＡを含むＢａｍＨＩフラグメントをＥｃｏＲＩで線状化したｐ ＶＥＧＴ’　と連結した。ｃＤＮＡを正しい向きで含むプラスミドを用いて１ｎ ｖｉｔｒｏでの翻訳によりＲＮＡを合成した。このＲＮＡを上記のようにして、 カエルの卵母細胞に注入した。 叉鳳刑旦Ｌ ルタメートリセプターサブタイプに・　る　の１゛６リセプターサブタイプー特 異的ポリクローナル抗血清は、ウサギに標準的免疫法を施して作製した。クロー ニングしたりセプター配列から合成ペプチド（表５）を設計した。これらのペプ チドをキーホール・リンベント・ヘモシアニンとコンジュゲートさせ、各抗原を ２匹の動物に免疫した。各ペプチドにつ０て各動物に１００−２００μｇのコン ジュゲートしたペプチドを３箇所の皮下にわけて注射した。動物は３週間間隔で 免疫し、３回目及びそれ以後の免疫投与力１ら各１０日後に耳の静脈から採血し た。 表呈 Ｓｅｑ、ＩＤ　ペプチド　明らかな サブタイプ　Ｎｏ、　配夕ｌ　存在部１１ａ　２１　ＲＤＳＬＩＳＩＲＤＥＫＤ ＧＬＮＲＣ細胞外２２　ＤＲＬＬＲＫＬＲＥＲＬＰＫＡＲＶ　細胞外２３　ＥＥ ＶＷＦＤＥＫＧＤＡＰＧＲＹＤ　ｉ［［ｌ胞外２４　ＥＦＶＹＥＲＥＧＮＴＥＥ ＤＥＬ　細胞質２５　ＰＥＲＫＣＣＥＩＲＥＱＹＧＩＱＲＶ　細胞外２６　ＩＧ ＰＧＳＳＳＶＡＩＱＶＱＮＬＬ　細胞外２７　ＩＡＹＳＡＴＳＩＤＬＳＤＫＴＬ 　細胞外ｌｂ　２８　ＫＫＰＧＡＧＮＡＫＫＲＱＰＥＦＳ　細胞質２９　ＰＥＦ ＳＰＳＳＱＣＰＳＡＨＡＱＬ　細胞質２ａ　３０　ＤＫＩＩＫＲＬＬＥＴＳＮＡ ＲＧ　細胞外３１　ＶＮＦＳＧＩＡＧＮＰＶＴＦＮＥＮ　細胞外３２　ＧＥＡＫ ＳＥＬＣＥＮＬＥＴＰＡＬ　細胞質２ｂ　３３　ＰＡＲＬＡＬＰＡＮＤＴＥＦＳ ＡＷＶ　細胞質抗−ペプチド抗体を、ＰｒｏｔｏｎＴ１′キット（カリホルニア 州、サンジエゴのＭｕｌｔｉｐｌｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用 いてアフィニティー精製で精製した。精製した抗体はカラム溶出ツク・ソファ− 及び中和ノく・ソファ−（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｓｔｅｍｓ 社）中（こ保存した。ウシ血清アルブミンを１ｍｇ／ｍｌの濃度で添加し、アジ 化ナトリウムを０．０５％の濃度に添加した。抗体は、４℃でまたは小分けして 一２０℃で保存した。 表６にリストしたペプチドからの抗体を用いて、サブタイプ１ａまたはサブタイ プ１ｂリセプターを安定に発現する形質転換細胞ラインから調製した膜のウェス タンプロット分析による、Ｇ−タンパク質と結合したグルタメートリセブターの 検出を行った。コントロール細胞ラインはベクターのみで形質転換した。 飢 ＲＤＳＬＩＳＩＲＤＥＫＤＧＬＮＲＣ２１細胞外　＋＋＋　ｂｋｇｄありＤＲＬ ＬＲＫＬＲＥＲＬＰＫＡＲＶ　２２　細胞外　十ＥＥＶＷＦＤＥＫＧＤＡＰＧＲ ＹＤ　２３　細胞外　＋＋＋＋ｂｋｇｄ低いＥＦＶＹＥＲＥＧＮＴＥＥＤＥＬ　 ２４　細胞質　＋＋＋＋ｂｋｇｄ低いＫＫＰＧＡＧＮＡＫＫＲＱＰＥＦＳ　２８ 　細胞質　＋　１ａについて−ｌｂについて ＰＥＦＳＰＳＳＱＣＰＳＡＨＡＱＬ　２９　細胞質　＋＋＋１ｂについてｂｋｇ ｄ低い １ａまたは１ｂサブタイプを安定に発現する各形質転換体を、５ないし１０個の １５０ｍｍプレート内でコンフルエントに達するまで増殖させた。各プレートを 先ず１５ｍ１の冷ＰＢＳで２回洗浄し、次いで氷冷１０ｍＭ　Ｎ　ａ　ＨＣＯｓ 　２０ｍｌを各プレートに添加した。各プレートからゴムのヘラで細胞をかき取 り、氷上のガラス製ホモジナイザーに入れた。細胞をＢ−ベストルを用いて１０ 回のストロークで破壊した。各プレートからのホモジネートを混ぜ、４℃、３０ ００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。ベレットを２２ｇ針とシリンジを用いて１ ０ｍＭ　ＮａＨＣＯｓ４〜８ｍｌ中に再懸濁し、各サンプルに屈折率がＬ　４１ ０になるまで６９％蔗糖を添加した（６〜１２ｍ１）。サンプルを高速遠心分離 チューブに移し、各サンプルに４２％蔗糖を重層した。これらのサンプルを４℃ にて２５．　ＯＯＯｒｐｍで２時間遠心分離した。１０ｄのＮ　ａ　ＨＣＯｓを １ｍｌ添加して膜を４２％蔗糖層から静かに浮き上がらせ、注意深く上層を撹拌 し膜をて再懸濁させることにより、サンプルを回収（７た。上層を氷上の新鮮な チューブに移しかえた。精製した膜を４℃にて１０．００Ｏｒｐｍで遠心分離し 、ベレットを１０ｍＭのＮ　ａ　ＨＣＯｓに再懸濁した。次いで、精製した膜を 最終タンパク質濃度が１〜２μｇ／ｍｌとなるよう調整した。 各精製膜調製物の１０〜２０μｇを２ｘＳＤＳ−メルカプトエタノールバッファ ー（１００ｍＭ　トリス塩酸（ｐＨ６，８）、２００ｍＭジチオスレイトール、 ４％ＳＤＳ、０．２％ブロムフェノールブルー、２０％グリセロール）で希釈し た。サンプルを３７℃で１５分間インキユベートシ、次いで５分間煮沸した。こ のサンプルを４〜１５％グラジェントのゲル上で５ＤＳ−ＰＡＧＥに付した。サ ンプルを、実質的にＴｏｗｂｉｎ　（Ｐｒｏｅ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　 ｉ、ＵＳＡ、７６・４３５０−４３５４．１９７９；その記載は参照により本明 細書に含まれる）に記載された方法を用いて、二ロトセルロース膜に電気転写し た。転写の後、ニトロセルロースを、各ストリップがコントロール及びリセブタ ーサンプルを含むようなストリップに切断した。このニトロセルロースをブロッ キング用バッファー中で予備インキュベート（７、次に免疫前の血清を希釈した ものまたは抗原刺激後に採取した血清を希釈したもの（遅い採血からの血清（即 ち４回抗原刺激以後のもの）を１　：１５００に希釈した））とインキュベート した。洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合したヤギ抗−ウサギ抗体（カ リホルニア州、リッチモンドのＢｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社） を１：２，５００希釈したものを添加し、インキュベート及び洗浄の後、西洋ワ サビペルオキシダーゼの基質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社） を添加して、呈色反応を生じさせた。反応はフィルターを蒸留水中でゆすいで停 止させた。表６はウェスタンプロット分析の結果を示す。 ＧＡＧＡＡＧＣＣＡＧ　ＡＧＡＴＧＣＣＡＡＧ　ＧＡＧＴＧＴＣＡＡＣＣＣＴＴ ＣＣＡＧＡＡ　ＡＴＧＴＧＴＡＧＡＡ　ＡＧＣＡＧＧＧＴＧ`　４０７３ ＧＧＧＡＴＧＧＧＧＡ　ＴＧＧＡＧＧＡＣＣＡ　ＣＧＧＴＣＴＧＣＡＧ　ＧＧＡ ＡＧＡＡＡＡＡ　ＡＡＡＡＡＴＧＣＴＧ　ＣＧＧＣＴＧＣＣsＴ　４１３３ ＡＡＡＧＡＡＧＧＡＧ　ＡＧＧＧＡＣＧＡＴＧ　ＣＣＡＡＣＴＧＡＡＣＡＧＴＧ ＧＴＣＣＴＧ　ＧＣＣＡＧＧＡＴＴＧ　ＴＧＡＣＴＣＴＴＧ`　４１９３ ＡＴＴＡＴＴＣＡＡＡ　ＡＡＣＣＴＴＣＴＣＴ　ＡＧＡＡＡＧＡＡＡＧ　ＧＧＡ ＡＴＴＡＴＧＡ　ＣＡＡＡＧＣＡＣＡＡ　ＴＴＣＣＡＴＡＴfＧ　４２５３ ＴＡＴＧＴＡＡＣＴＴ　ＴＴＡＴＣＧＡＡＡＡ　ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ　ＡＡＡ ＡＡＡＡＡＡＡ　ＡＡＡＡＡＡＡ　４３００Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　 Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｇｉｎ　 Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ６５　ＴＯ７５８０ Ａｌａ　Ｍｅｔ　Ｐｈｅ　Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　ｌｉｅ　 Ａｓｎ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　ＬｅｕＳｅｒ　ｌｉｅ　Ａ ｒｇ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｃ ｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　ＧｌｙＧｉｎ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒ 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Claims (38)

【特許請求の範囲】
1. １．単離された哺乳類Ｇタンパク質一結合グルタメートリセブターまたはそのフ ラグメント。
2. ２．実質的に純粋な、請求項１記載のＧタンパク質一結合グルタメートリセブタ ー。
3. ３．ヒトまたは齧歯類のものである、請求項１記載のＧタンパク質一結合グルタ メートリセブター。
4. ４．請求項１記載のＧタンパク質一結合グルタメートリセブターで免疫した動物 から得られた抗血清。
5. ５．請求項１記載のＧタンパク質一結合グルタメートリセブターに特異的に結合 するモノクローナル抗体。
6. ６．グルタミン酸（ｇＩｕｔａｍａｔｅ）またはキスカル酸（ｑｕｉｓｑｕａｌ ａｔｅ）に結合し、それによりホスホリパーゼＣを活性化しまたは脊椎動物細胞 中でイノシトール・ホスホリビツドの代謝を刺激する、請求項１記載のＧタンパ ク質一結合グルタメートリセプター。
7. ７．哺乳類のＧタンパク質一結合グルタメートリセブターの活性を有する、組換 え技術で製造されたポリペプチド。
8. ８．ヒトまたは齧歯類の哺乳類Ｇタンパク質一結合グルタメートリセブターの活 性を有する、請求項７記載のポリペプチド。
9. ９．哺乳類のＧタンパク質一結合グルタメートリセブターまたはそのフラグメン トをコードする、単離及び精製されたポリヌクレオチド分子。
10. １０．ゲノムＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列またはＲＮＡアンチセンス配列である、 請求項９記載のポリヌクレオチド。
11. １１．ヒトまたは齧歯類のＧタンパク質一結合グルタメートリセブターをコード する、請求項９記載のポリヌクレオチド。
12. １２．哺乳類のＧタンパク質一結合グルタメートリセブター活性を示すポリペプ チドをコードする、請求項９記載のポリヌクレオチド。
13. １３．実質的に図５、図７、図８または図９の配列である、請求項９記載のポリ ヌクレオチド。
14. １４．哺乳類のＧタンパク質一結合グルタメートリセブターまたはそのフラグメ ントをコードする遺伝子と特異的にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドか らなるプローブ。
15. １５．長さが約４０ないし約６０ヌクレオチドである、請求項１４記載のプロー ブ。
16. １６．検出可能な信号を与えるために標識されている、請求項１５記載のプロー ブ。
17. １７．下記の機能的に連結した要素を含むＤＮＡ構築物：転写プロモーター； 晴乳類のＧタンパク質一結合グルタメートリセブターまたはそのフラグメントを コードするＤＮＡ配列；及び 転写ターミネーター。
18. １８．ＤＮＡ配列がヒトまたは齧歯類のＧタンパク質一結合グルタメートリセブ ターのポリペプチドをコードする、請求項１７記載のＤＮＡ構築物。
19. １９．哺乳類のＧタンパク質一結合グルタメートリセブターをコードするＤＮＡ 配列が実質的に図５、図７、図８または図９の配列である、請求項１７記載のＤ ＮＡ構築物。
20. ２０．下記の機能的に連結した要素を有するＤＮＡ構築物で形質転換もしくはト ランスフェクトされた培養真核細胞：転写プロモーター； 哺乳類のＧタンパク質一結合グルタメートリセブターまたはそのフラグメントを コードするＤＮＡ配列；及び 転写ターミネーター。
21. ２１．哺乳類細胞である請求項２０記載の真核細胞。
22. ２２．内因性のＧタンパク質一結合グルタメートリセブターは発現しない、請求 項２０記載の真核細胞。
23. ２３．ＤＮＡ配列がヒトまたは齧歯類のＧタンパク質一結合グルタメートリセブ ターのポリペプチドをコードする、請求項２０記載の真核細胞ライン。
24. ２４．ＤＮＡ配列によりコードされるＧタンパク質一結合グルタメートリセブタ ーのポリペプチドが、哺乳類細胞内のＧタンパク質に結合している、請求項２１ 記載の真核細胞ライン。
25. ２５．哺乳類Ｇタンパク質一結合グルタメートリセブターをコードするＤＮＡ配 列が、実質的に図５、図７、図８または図９の配列である、請求項２０記載のＤ ＮＡ構築物。
26. ２６．Ｇタンパク質一結合グルタメートリセブターの発現をコードするＤＮＡ配 列を含むＤＮＡ構築物で形質転換もしくはトランスフェクトした真核細胞を増殖 させ、そして 該細胞からリセブターを単離する、 ことからなる、哺乳類Ｇタンパク質一結合グルタメートリセブターの製造方法。
27. ２７．細胞が培養哺乳類細胞である、請求項２６記載の方法。
28. ２８．グルタメートリセブターがヒトまたは齧歯類のものである、請求項２６記 載の方法。
29. ２９．グルタメートリセブターをイムノアフィニティー精製法で単離する、請求 項２６記載の方法。
30. ３０．Ｇタンパク質一結合グルタメートリセプターが真核細胞中でタンパク質Ｇ に結合していない、請求項２６記載の方法。
31. ３１．サンプルを、下記リセブターに特異的に結合する単一特異性抗体と共に、 免疫複合体の形成に十分な条件下でインキュベートし、そして免疫複合体の存在 を調べることよりなる、生物学的サンプル中の哺乳類Ｇタンパク質一結合グルタ メートリセブターの存在を調べる方法。
32. ３２．単一特異性抗体がモノクローナル抗体または精製された抗血清である、請 求項３１記載の方法。
33. ３３．単一特異性抗体が標識されている、請求項３２記載の方法。
34. ３４．被検化合物を、組換え哺乳類Ｇタンパク質一結合グルタメートリセブター を発現する真核細胞と共にインキュベートし、該化合物が該細胞のリセブター介 在代謝に及ぼす影響を調べることよりなる、Ｇタンパク質一結合グルタメートリ セブターが介在する代謝を変更させる化合物を調べる方法。
35. ３５．化合物をリセブターおよびリガンドと共にインキュベートする、請求項３ ４記載の方法。
36. ３６．リガンドがグルタメートまたはキスカレート（ｑｕｉｓｑｕａｌａｔｅ） である、請求項３５記載の方法。
37. ３７．真核細胞がヒトまたは齧歯類のＧタンパク質一結合グルタメートリセブタ ーを発現するものである、請求項３４記載の方法。
38. ３８．真核細胞内のイノシトール・ホスホリビツドの代謝の変更を被検化合物に よりモニターする、請求項３７記載の方法。