JPH05508534A - 昆虫ステロイドレセプターｄｎａ配列の同定及び発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ７．２０個のヌクレオチドにわたり同一性を示す配列を有する、ステロイド結合 性ドメイン相同性を有する昆虫ステロイドレセプター題材成分のセグメントをコ ードする単離せしめた組換え核酸。

８、前記核酸が、昆虫ステロイドレセプタ一部材のリガンドに応答性のコントロ ール因子に結合するポリペプチドを特徴とする請求項７に記載の単離せしめた組 換え核酸。

９、請求項７に記載の単離せしめた組換え核酸により形質転換されている細胞。

１０．２Ｏ−ＯＨエクジソンレセプター以外の昆虫ステロイドレセプター題材成 分に結合できるＤＮＡ配列を含んで成る単離せしめた組換え核酸。

１１、前記昆虫ステロイドレセプター題材成分がＤＨＲ３゜Ｅ７５Ａ又はＥ７５ Ｂである、請求項１０に記載の単離せしめた組換え核酸。

１２、前記ＤＮＡ配列が前記昆虫ステロイドレセプター題材成分が結合すること に応答性である作動連結している配列の転写を促進せしめる、請求項１０に記載 の単離せしめた組換え核酸。

１３、前記ＤＮＡ配列がポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に作動連結してい る、請求項１０に記載の単離せしめた組換え核酸。

１４、前記の単離せしめた組換え核酸が発現ベクターである、請求項１０に記載 の単離せしめた組換え核酸。

１５、請求項ＩＯに記載の単離せしめた組換え核酸により形質転換されている細 胞。

１６、前記細胞が昆虫ステロイドレセプター題材成分を更に含んで成る、請求項 １５に記載の細胞。

１７、組換え核酸であって： 昆虫ステロイドレセプタ一部材成分リガンドに応答性のコントロール因子； 非熱ショックプロモーター配列；及び リポータ−遺伝子を含んで成る配列；を含んで成る核酸。

１日、前記非熱ショックプロモーター配列がアルコールデヒドロゲナーゼプロモ ーターである請求項１７に記載の組換え核酸。

１９、請求項１７に記載の岨換え核酸により形質転換されている組換え核酸。

２０．前記細胞が哺乳動物細胞である請求項Ｉ９に記載の細胞。

２１、昆虫ステロイドレセプタ一部材成分のりガントに応答性のコントロール因 子の更なるコピーを含んで成る、請求項１７に記載の組換え核酸。

２２、リポータ−遺伝子の発現をモニターする方法であって、請求項１７に記載 の組換え核酸を発現する段階を含んで成り、ここで前記リポータ−遺伝子の前記 モニターにおいて放射活性因子を用いないことを特徴とする方法。

２３、昆虫ステロイドレセプター部材成分又はそのフラグメントを含んで成るポ リペプチドであって、このポリペプチドが天然に結合している昆虫細胞成分を実 質的に含まず、そしてステロイド結合性ドメインを有する昆虫ステロイドレセプ タ一部材成分の生物学的活性特性を示す、ポリペプチド。

２４、前記昆虫ステロイドレセプタ一部材成分がＥｃＲ，ＤＨＲ３、Ｅ７５Ａ及 びＥ７５Ｂより成る群から選ばれる、請求項２３に記載のポリペプチド。

２５、前記昆虫ステロイドレセプター部材成分又はそのフラグメントがＤＮＡ結 合性ドメインも含んで成る請求項２３に記載のポリペプチド。

２６、前記昆虫がキイロショウジョウバエである請求項２３に記載のポリペプチ ド。

２７、昆虫ホルモン及び昆虫ホルモン作動薬より成る群から選ばれるホルモン類 似体に結合できる請求項２３に記載のポリペプチド。

２８、前記昆虫ホルモンがエフジステロイドである請求項２７に記載のポリペプ チド。

２９、前記昆虫ホルモンが２Ｏ−ＯＨエクジソンである請求項２７に記載のポリ ペプチド。

３０、昆虫ホルモンに応答性のＤＮＡコントロール因子に結合できる、請求項２ ３に記載のポリペプチド。

３１、前記ポリペプチドがジンクフィンガードメインを含んで成る、請求項３０ に記載のポリペプチド。

３２、前記昆虫ホルモン応答性ＤＮＡコントロール因子が前記結合に応答性であ る転写ユニットに作動連結している、請求項３０に記載のポリペプチド。

３３、前記昆虫ホルモン応答性ＤＮＡコントロール因子が前記転写ユニットから 上流にある、請求項３２に記載のポリペプチド。

３４、第２のポリペプチドに融合している請求項２３に記載のポリペプチド。

３５、前記第２ポリペプチドが異種ポリペプチドである、請求項３４に記載のポ リペプチド。

３６、前記異種ポリペプチドが第２ステロイドレセプター超科成分を含んで成る 、請求項３５に記載のポリペプチド。

３７、前記フラグメントが共通Ｅ　１　？ｉｉ域配列配列質的に相同の配列を有 する、請求項２３に記載のポリペプチド。

３８、前記フラグメントが共通Ｅ２領領域列に実質的に相同の配列を有する、請 求項２３に記載のポリペプチド。

３９、前記フラグメントが共通Ｅ　３　ｆｆｉ域配列配列質的に相同の配列を有 する、請求項２３に記載のポリペプチド。

４０、前記フラグメントが： 共通Ｅ　１８ｉ域配列に対して約２５％以上の相同性を有するセグメント； 共通Ｅ２Ｎ域配死に対して約３０％以上の相同性を有するセグメント； 共通Ｅ　３８５域配列に対して約３０％以上の相同性を有するセグメント；を含 んで成る、配列を有する請求項２３に記載のポリペプチド。

４１、請求項２３に記載のポリペプチドを含んで成る組成物。

４２．１を項２３に記載のポリペプチドを含んで成る細胞。

４３、前記細胞がヒト細胞である請求項４２に記載の細胞。

４４、請求項２３に記載のポリペプチドに対して結合特異性を示し、ここでこの 結合特異性が昆虫ステロイドレセプタ一部材成分の特徴的なエピトープに特異的 である抗体又はその結合性フラグメント。

４５、昆虫ステロイドレセプタ一部材成分によって特異的に結合されることがで きるＤＮＡ配列を選別する方法であって、以下の段階： 請求項２３に記載のポリペプチドに対する結合性についてＤＮＡ配列をスクリー ンし；そして 前記結合性を示す前記ＤＮＡ配列を選別せしめることを含んで成る方法。

４６、前記ＤＮＡ配列がＥｃＲ，ＤＨＲ３，Ｅ７４及びＥ７５遺伝子より成る群 から選ばれる遺伝子に作動連結している請求項４５に記載の方法。

４７、昆虫ステロイドレセプタ一部材成分のホルモン結合性ドメインへの結合に 間して特異的なリガンドを選別する方法であって、以下の段階： １もしくは複数種の題材成分への結合性について化合物をスクリーニングし；そ して 該成分に対する特異的な結合性を示す化合物を選別することを含んで成る方法。

４日、前記リガンドがエフジステロイドである請求項４７に記載の方法。

４９、前記リガンドが２０−ＯＨエクジソン拮抗薬である請求項４７に記載の方 法。

５０、昆虫の生理的機能又は成長を調節する方法であって以下の段階： 前記結合性を示す前記化合物を選別し；そして昆虫に前記リガンドを投与するこ とを含んで成る方法。

５１、前記調節が前記昆虫にとって致死的である、請求項５０に記載の方法。

５２、昆虫ステロイドレセプタ一部材成分のホルモン結合性ドメイン及び第２ポ リペプチドを含んで成る融合ポリペプチド。

５３、前記第２ポリペプチドが第２ステロイドレセプター超科レセプター成分由 来のＤＮＡ結合性ドメインを含んで成る請求項５２に記載の融合ポリペプチド。

５４．請求項５２に記載の融合ポリペプチドをコードする核酸。

５５、昆虫ステロイドレセプタ一部材成分のリガンド結合性ドメインへの結合に 関して特異的なリガンドを選別する方法であって、以下の段階： （ｉ）請求項５２に記載の融合ポリペプチド（ここでこの融合ポリペプチドは第 ２ステロイドレセプター超科成分のＤ　Ｎ　Ａ結合性ドメインに機能的に連結し ている前記リガンド結合性ドメインを含んで成る）と； （１１）第２ポリペプチドをコードする第２核酸配列（ここでこの第２核酸配列 の発現は前記ＤＮＡ結合性ドメインによる結合に応答性である）とを組合せ、そ して 前記第２ポリペプチドの発現を誘発する活性について化合物をスクリーニングし ；そして前記化合物を選別することを含んで成る方法。

５６、前記組合せを細胞において行う請求項５５に記載の方法。

５７、前記組合せ段階が、前記融合ポリペプチドをコードする核酸による前記細 胞の形質転換に基づく発現に由来する請求項５６に記載の方法。

５８、昆虫の生理的機能を調節する方法であって、請求項５５に記載の方法によ り選別されたりガントを昆虫に投与せしめる段階を含んで成る方法。

５９、前記結合性ドメインが、ＥｃＲ，ＤＨＲ３，Ｅ７５Ａ及びＥ７５Ｂより成 る群から選ばれる昆虫ステロイドレセプタ一部材成分の結合性ドメインより選別 される、請求項５５に記載の方法。

６０、前記リガンドが前記昆虫に致死的である、請求項５日に記載の方法。

６１．２Ｏ−ＯＨエクジソンに対して応答性でない単離せしめたレセプターコン トロール因子であって、昆虫ステロイドレセプタ一部材成分に結合でき、そして 作動連結されている遺伝子の発現をコントロールできるＤＮＡセグメントを含ん で成る因子。

６２、前記作動連結されている遺伝子が前記コントロール因子の約５０ｋｂ以内 にある、請求項６１に記載の単離せしめたレセプターコントロール因子。

６３、前記昆虫ステロイドレセプタ一部材成分がＤＨＲ３゜Ｅ７５Ａ又はＥ７５ Ｂである、請求項６１に記載の単離せしめたレセプターコントロール因子。

６４、ポリペプチドを製造するための方法であって以下の段階：昆虫ステロイド レセプタ一部材リガンドへの暴露に実質的に感受性でない細胞を選び； 前記細胞に： （ｉ）前記リガンドに対するレセプター；及び（ｉｉ）前記ポリペプチドをコー ドする核酸配列（ここでこの核酸配列は前記選別したりガントの存在に応答性の コントロール因子に作動連結している）を導入せしめ、これによって形質転換細 胞が作られ；そして 前記形質転換細胞を前記リガンドに暴露せしめることを含んで成る方法。

６５、前記細胞が哺乳動物細胞である請求項６４に記載の方法。

６６、前記細胞を完全生物に導入することを更に含んで成る請求項６４に記載の 方法。

６７、前記細胞が植物細胞である請求項６４に記載の方法。

６８、前記リガンドが２Ｏ−ＯＨエクジソンである請求項６４に記載の方法。

明細書 昆虫ステロイドレセプターＤＮＡ配列の同定及び発現本発明は国家科学協会（Ｎ ａｔｉｏｒ＋ａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）がらのグランド（ Ｇｒａｎｔ）ＤＣＢ　８４０５３７０の援助のもので米国政府により成された。

米国政府は本発明における一定の権利を所有する。

発明の分野 本発明は、一般的に昆虫ステロイドレセプタ一部材成分の特徴である核酸配列及 びポリペプチドに適用する組換えＤＮＡ法の利用、そしてより詳しくはこのよう なレセプター及び培養細胞におけるタンパク質の生産性のための発現が調節され る遺伝子に結合しているＤＮＡ＠節因子、更には昆虫の成長をコントロールする 新しいホルモンの同定におけるこのようなホルモンレセプタータンパク質及び遺 伝子の利用に関する。

発明の背景 遺伝子発現の期間的順序（ｔｅｍｐｏｒａｌ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）は受精卵子か ら成人動物への成長における段階の特徴及び順序を決定する。一般的なみばえ（ ｆｒｕｉｔ　ｆｌｙ）　、キイロシヲウジツウバエ（紅匹並旦旦鰯上匹■■肛） はこのような成長の遺伝子的コントロールの研究のための好適なモデル系を提供 する。ショウジヨウバエの成長の種々の様子は一般の昆虫を代表し、更に数多く の観点において、を椎動物を代表する。

β−エクジソンとしても知られるステロイドホルモン２Ｏ−ＯＨエクジソン（ｅ ｃｄｙｓｏｎｅ）はあらゆる昆虫における成長の時期をコントロールする。一般 的にＫｏｏｌｍａｎ（ｌｉＭ）　、Ｅｃｄ　５ａｎｅ　：　Ｐｒｏｖｅ　Ｃｈｅ −ｍｉｓｔｒｔｏ　Ｍｏｄｅ　ｏｆ　Ａｃｔｉｏｎ、　Ｔｈ１ｅ＠ｅ　Ｍｅｄｉ ｃａｌ　Ｐｕｂ、、　Ｎ、Ｙ、　（１９８９）を参照のこと、これは本明細書に 参考として組入れる。一般語「エクジソン」がしばしば２Ｏ−ＯＨエクジソンの 略語として利用される。昆虫成長における短時間にわたる振幅する、上昇する及 び下降するエクジソンの濃度がショウジヨウバエの成長の種々の段階にて観察さ れる。

これらの段階は胚形成、三段階の幼虫期及び二段階のさなぎ期を含む、第三期の 終わりでのエクジソン振幅又は最後の幼虫期振幅は幼虫から成虫バエへの変態の 開始を誘発する。成虫組織と称される一定の組織は成虫の器官、例えば目、羽及 び肢の形成を始めるように誘発される。

成長の幼虫期の際、巨大な多糸染色体が成虫でない幼虫組織において発生する。

このようなケーブル状の染色体は約２，０００本迄０染色体コピーを含んで成る 凝集体より成る。このような染色体凝集物は非常に有用であり、その理由はこれ らは、染色体内における一定の遺伝子の位置が非常に高い程度の分解能で決定で きる手段（これは通常の染色体に関して一般に可能なものよりも数桁高い）を提 供するからである。

多糸染色体における「パフ」はケーブル状条系染色体凝集物の局部膨張又はふく らみであり、これら凝集物はこのパフ遺伝子座での置に局在している遺伝子の転 写の指標である。

遺伝子的調節モデルは幼虫から成虫への変態の引き金となるエクジソン振幅によ って誘発される多糸パフの期間的順序の説明のために研究された。

Ａｓｈｂｕｒｎｅｒら“Ｏｎ　ｔｈｅ　Ｔｅｍｐｏｒａｌ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏ ｆ　Ｐｕｆｆｉｎｇ　ＡｃｔｉｖｉｔｙｉｎＰｏｌｙｔｅｎｓ　Ｃｈｒｏｍｏｓ ｏｍｅｓ　”Ｃｏ１ｄ　Ｓ　ｒｉｎ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓ　ｍ　、Ｑｕａｎｔ＋　 旦１９１工３８　：　６５５−６６２　（１９７４）を参照のこと、このモデル はエクジソンがレセプタータンパク質、即ちエクジソンレセプターに可逆的に相 互作用してエクジソン−レセプター複合体を形成せしめることを示した。

この複合体は、半ダースの瞬時に誘発される「初期型」パフにとって重要なわず かな「初期型」遺伝子の転写を直接的に誘発せしめるのであろう、このような初 期型遺伝子は、「後期型」パフの形成にとって重要な第２組の「後期型」遺伝子 の転写を誘発せしめる調節タンパク質をコードするものと考えられている。従っ てこのモデルは三つのランクの遺伝子的調節段階、即ち、第１のランクにおける エクジソン−レセプター遺伝子、第２のランクにおける初期型遺伝子及び第３の ランクにおける後期型遺伝子を規定する。このモデルは成虫でない組織において 観察されたパフィングパターンに由来するが、類似の遺伝子的調節段階がエクジ ソンの標的でもある成虫組織の成長における変態的変化、及びその他の成長期に て生ずるエクジソンの振幅によって誘発される組織成長における変化からもわか った。

踵々の構造学的データーがを椎動物ステロイドに対するレセプター及びその他の 親油性レセプタータンパク質に由来している。このようなレセプターの「題材Ｊ 　（ｓｕｐｅｒｆａ■１ｌｙ）はそれらの構造的類似性に基づいて規定される。

　Ｅｖａｎｓの“Ｔｈｅ　５ｔｅｒｏｉｄ　ａｎｄ　Ｔｙｒｏｉｄ　Ｆｌ。

ｒｍｏｎｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　５ｕｐｅｒ　ｆａｍｉｌｙ　”　５ｃｔｅｎｃ ｅ　２４０　：　８８９−８９５　（１９８８）；Ｇｒｅｅｎ　ａｎｄ　Ｃｈａ ｓｂｏｎ″Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　Ｅｎｈａｎｃｅ　Ｏｕｒ　Ｉ Ｊｎｄｅｒｓｔａｎｄ−ｉｎｇ　ｏｆ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｒｅｇｕ ｌａｔｉｏｎ　”　丁ｒｅｎｄ　ｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　４　：　３０９−３ １４　（１９８８）を参照のこと０両方とも本明細書に参考として組入れている 。これらの機能を定義すると、対応のホルモンと複合したこのようなレセプター は、上記のモデルにおけるエクジソンレセプターに関して考えられた通り第１の 標的遺伝子の転写を調節する。

栽培農業は世界中において食品生産の効率を大いに高めた。しかしながら種々の 害虫が栽培した食品の起源をそれら自身の都合のために利用している。これら害 虫はその種類の特徴の一連の一過性現象によって成長する。ショウジヨウバエを 含む多くはまずいも虫又はうじ様の幼虫形態にまず成長する。その後、これらは 変態し、こを反映する。特に、前記したショウジヨウバエ成長における昆虫エフ ジステロイド−ホルモンレセプターの機能を支配する原理は、あらゆるタイプの 昆虫の間で分かち合われているようである。

昆虫による栽培作物の災害に対する一つの武器としての殺虫特性を有する有機分 子が、昆虫集団を撲滅するための手法において一般に利用されている。しかしな がら、その広い活性及び特異性の欠如、更にはいくつかのこのような殺虫剤は容 易に生体分解されないことに基づくこれらの殺虫剤の生態学的副作用は明らかに 昆虫及びその他の動物の種の両方の集団に影響を及ぼすであろう、い（つかのこ れらの集団は生態学的又はその他の見地から好都合なものでありうる。更に、昆 虫集団は適用された殺虫剤の作用を小さくするように進化するため、大量の殺虫 剤を散布することが必要とされ、人間を含むその他の動物への大いなる直接的及 び間接的作用が生ずる。従って、特異性が高く、且つ高活性であり、そして生物 分解性である殺虫剤についての重要なるニーズが存在している。エフジステロイ ドのように、ステロイドレセプタ一部材の昆虫成分と複合して昆虫成長をコント ロールする新規なる昆虫ホルモンはこのよウナ所望すれる特性を有する殺虫剤の 候補である。

昆虫ホルモンの利用はその他の重要な用途も有する。あらゆる医療的及び商業的 に重要なタンパク質は遺伝子操作された細菌によって有用な形態において生産さ れうる。しかしながら、多数の発現されるタンパク質は細菌において不適切にプ ロセスされ、従って遺伝子的に操作された真核細胞によって生産されることが好 ましい、一般に酵母細胞又は哺乳動物組織培養細胞が利用される。酵母細胞にお ける異種タンパク質のタンパク質プロセシングもしばしば不適切に観察されるた め、哺乳動物培養細胞が多数のタンパク質の生産のための中心的焦点となってき ている。大量の異種タンパク質の生産はこのような細胞を不健全にし、所望のタ ンパク質の収量を悪くすることが一般に知られている。このような問題はある程 度、誘発性加される迄異種タンパク質を発現できないようにされる。この方法に おいて、大量の健康細胞を作り上げることができ、その後大量の異種タンパク質 を生産するように誘発できる。残念ながら、現状の有用なシステムにおいて、こ のような誘発因子、例えば金属イオン又は高温自体が細胞に悪影響を及ぼし、従 ってまたこの細胞が提供する所望の異種タンパク質の収量を低める。従って組換 えタンパク質の効率的な生産のための温和な誘発因子の開発のニーズが存在する 。このような因子は、特定のタンパク質を生産できないことに苦しむ人間患者の 治療に関するすばらしい価値も示す、これらの因子による治療は病気の個体にお いて生産されるタンパク質の時期及び量をコントロールする。

ステロイドレセプタ一部材の哺乳動物又はその他のを椎動物の成分と複合するホ ルモンは上記の温和な因子の候補とはならない傾向にあり、その理由はこれらは このようなレセプターを有する細胞における多数の標的遺伝子の発現性を変え、 従って宿主細胞に悪影響を及ぼすであろうからである。

このような及びその他の理由により、ステロイドレセプターを得ること及びそれ らについての核酸情報を得ることはここ数年研究者にとっての目標であった。残 念ながら、大いなる手段の研究にもかかわらず、有用な結果は得られていない、 ステロイドレセプターの構造及び分子生物学的な情報の欠如はこのような生成物 の生産の可能性を大いに遅らせている。

従って、ステロイドレセプタ一部材の昆虫成分における詳細な配列情報及びこれ らのレセプターをコードする遺伝子並びに結果としての試薬が要望されている。

ステロイドレセプタ一部材の天然昆虫成分の拮抗薬もしくは作動薬として働きう る、又は哺乳動物細胞における組換えタンパク質の高特異性調節に関するシステ ムの成分として働きうる新しい分子の探索において有用な試薬を提供する。

発明の概要 本発明に従い、単離せしめた組換え核酸を提供し、これは発現に基づき、天然で ないを椎動物ステロイドレセプター又はそのフラグメントをコードすることがで きる。これらの核酸は一般に、ステロイド結合性ドメイン相同性を有する昆虫ス テロイドレセプター題材成分、例えばＥｃＲ，ＤＨＲ３、Ｅ７５Ａ又はＥ７５Ｂ に由来するドメインＡ、　Ｂ、　Ｄ、　Ｅ又はＦの１もしくは複数のコード領域 に実質的相同な配列を有するセグメントを含んで成る。好ましくは、この核酸は 昆虫ステロイドレセプター題材成分に対するリガンドに結合できるポリペプチド をコードし、そして選択的）＼イブリダイゼーション条件、通常は緊張ハイブリ ダイゼーション条件のもとて昆虫ステロイドレセプター題材成分遺伝子とハイブ リダイズすることができる。

他の態様において、ステロイド結合性ドメイン相同性を有する昆虫ステロイドレ セプタ一部材成分のコードセグメントの約２０個以上のヌクレオチドにわたって 同一性を示す配列を有する、単離せしめた組換え核酸が含まれる。この核酸は、 昆虫ステロイドレセプター超科のリガンドに応答するコントロール因子に結合す るポリペプチドを発現せしめるために細胞の中に形質転換させることができる。

他方、２Ｏ−ＯＨエクジソンレセプター以外の昆虫ステロイド題材成分、例えば ＤＨＲ３、Ｅ７５Ａ又は２７５Ｂに結合できるＤＮＡ配列を含んで成る単離した ＤＮＡ配列を提供する。このＤＮＡ配列は一般に発現ベクターに存在し、そして 昆虫ステロイドレセプタ一部材成分が結合することに応答して、作動連結されて いる配列（例えばポリペプチドをコードするもの）の転写を促進せしめる。

該核酸を含んで成る細胞を提供し、これらの細胞は該ポリペプチドを発現する。

一定の１！欅において、哺乳動物細胞を含む昆虫以外の細胞が利用されるであろ う１例えば昆虫ステロイドレセプタ一部材成分すガンド応答性コントロール因子 、非熱的シ５ンクプロモーター配列（例えばアルコールデヒドロヂメーゼプロモ ーター）及びリポータ−遺伝子を含んで成る配列に結合するようなりガントに応 答するコントロール因子を含んで成る組換え核酸も考慮する。通常、コントロー ル因子はりガントの存在に応答してリポータ−遺伝子の転写を行わさせるよう作 動するであろう。

本発明の更なる態様は昆虫ステロイドレセプター部材成分又はそのフラグメント を含んで成るポリペプチドを含み、ここでこのようなポリペプチドは天然的に結 合している昆虫細胞成分を実質的に存さず、そしてホルモン結合性ドメインを有 する昆虫ステロイドレセプタ一部材成分の生物学的活性の特徴を示す、好ましく は、この昆虫ステロイドレセプター部材成分又はそのフラグメントはＤＮＡ結合 性ドメインも含んで成り、そしてこのポリペプチドは、昆虫ホルモン、昆虫ホル モン作動剤及び昆虫ホルモン拮抗剤より成る群から選ばれるホルモン類似体に結 合できる。このポリペプチドはジンク−フィンガードメインを含むことができ、 そして通常は昆虫ホルモンに応答性のＤＮＡコントロール因子に結合できる。任 意的に、このポリペプチドは第２のポリペプチド、典型的には第２ステロイドレ セプター超科成分を含んで成る異種ポリペプチドと融合させてよい。該タンパク 質を含んで成る細胞、通常は哺乳動物細胞を提供する。

このようなポリペプチドのフラグメントは共通Ｅｌ、Ｅ２又はＥ３領領域列と実 質的に相同な配列を有すことができる０例えば、好ましいフラグメントは： 共通Ｅｌｉ域配列配列なくとも約２５％相同なセグメント；共通Ｅ２領領域列と 少なくとも約３０％相同なセグメント：共通Ｅ３６Ｎ域配列と少なくとも約３０ ％相同なセグメント；を含んで成る配列を有する。

本発明のポリペプチドは種々の用途を有する０例えば、昆虫ステロイドレセプタ 一部材成分によって特異的に結合されることができるＤＮＡ配列を選別する方法 は、このようなポリペプチドに結合するためのＤＮＡ配列のスクリーニング及び このような結合性を示すＤＮＡ配列の選別の段階を含んで成ることがある。他方 、昆虫レセプター題材成分のホルモン結合性ドメインへの結合に特異的なりガン ト、例えばエフジステロイドホルモンを選別する方法は、１もしことがある。

更に、昆虫ステロイドレセプタ一部材成分に結合性の化合物をスクリーニングし 、前記結合性を示す化合物も選別し、そして昆虫にこのリガンドを投与すること を含んで成る昆虫の生理機能又は成長を調節する（例えば殺す）ための方法も含 まれる。

更には、昆虫ステロイドレセプタ一部材成分のリガンド結合性ドメインに特異的 に結合するりガントを選別する方法であって、（ｉ）第２ステロイドレセプター 超科成分のＤＮＡ結合性ドメインに機部的に連結しているりガント結合性ドメイ ンも含んで成る融合ポリペプチドと； （ｉｉ）第２ポリペプチドをコードする第２核酸配列（ここでこの第２核酸配列 の発現性は該ＤＮＡ結合性ドメインによる結合に応答性である）；とを組合わせ 、 この第２ポリペプチドの発現を誘発する活性について化合物をスクリーニングし ；そして これを行う化合物を選別することを含んで成る方法を提供する。

これは通常細胞、例えば融合タンパク質をコードするＤＮＡによって形質転換さ れた細胞において実施されるであろう、この方法は昆虫の生理機能又は成長を調 節するのに有用な類似体の選別を可能にする。

更には、ポリペプチドを生産するための方法であって、以下の段階： 細胞、典型的には昆虫ステロイドレセプタ一部材リガンドの暴露に対して実質的 に感受性でない哺乳動物又は植物細胞を選び；前記細胞の中に： （ｉ）該リガンドに対するレセプター；及び（ｔｉ）該ポリペプチドをコードす る核酸配列（ここでこの核酸配列は選別したりガントの存在に応答性であるコン トロール因子と作動連結している）を導入せしめ、これにより形質転換細胞を作 り上げ；そして この形質転換細胞を該リガンドに暴露せしめることを含んで成る方法を提供する 。

通常この細胞は哺乳動物細胞であり、そして時折りまるごとの生物、例えば植物 又は動物に導入せしめることがありうる。

ここで提供される核酸及びタンパク質の発現レベルの測定のためのキットも有用 に作り出せる。一般に、このキットは、所望の標的分子、例えばリガンド類似体 、レセプター又は核酸に特異的に結合する試薬を含む少なくとも１つの区分を有 するであろう。

図面の簡単な説明 図１．Ｃｕ”″−誘発性ＥｃＲ発現プラスミドであるｐＭＴＥｃＲ。

Ｐ、Ｔ、ＥＣＲＯＲＦ　及びＡｃ”５ｃポリＡ因子は実験例ＩＩＩ、Ａ章におい て定義する。ＨＹＧ’　ＯＲＦはヒグロマイシン耐性を授け、そしてこれはショ ウジョウバエトランスポーザブル因子、ユＬ±ｌのＬＴＲにおけるプロモーター のコントロール下にある。

ＳＶ４゜イントロン／ポリＡ因子は可能なスプライシング条件、及びＨＹＧ’　 ＯＲＦｍＲＮＡに関するポリアデニル化／切断配列を提供する。ｐＡＴ１５３Ｄ ＮＡは細菌プラスミドに由来する。

図２．エクジソンー誘発性ＰＥｃＲＥ／Ａｄｈ／βｇａｌリポータ−プラスミド 、このプラスミドの作製及びこの図面に規定されている全ての記号の定ＩＩ（Ｓ Ｖ、。スプライス及びポリＡを除く）については本明細書の実験例ＩＶ、　Ｂ章 を参照のこと。

図３．構成的ＥｃＲ発現プラスミド、ｐＡｃｔＥｃＲ，このプラスミドの作製及 び記号の定義は実験例ＩＩＩ　、　Ｂ章を参照のこと。

好ましい態様の詳細な説明 本発明は、ステロイドレセプター題材の昆虫成分の構造及び／又は活性を示すポ リペプチド生成物をコードする新規なる単離した核酸配列を提供する。このよう な昆虫ステロイドレセプターの構造をこれらの遺伝子から明らかにすることで、 別々のりガント−結合性ドメイン及びＤＮＡ−結合性ドメインは個々にもしくは 組合せて、これらのドメインに結合する新しいりガント又はＤＮＡ配列をスクリ ーンするために用いられる。従って、例えばＤＮＡ結合性部位の一体化したプロ モーター配列に結合することにより、これらのレセプターは通常リポータ−遺伝 子（これに対する高感度なアッセイが存在する）の発現をコントロールする。又 は、このホルモン−結合ばれた既知リガンドの改質体のいづれもがレセプター結 合性に関してスクリーンされる。この方法において得られる新規なるリガンドは 特異性の高い且つ活性の高い天然の殺虫剤として利用される。他方、該リガンド と結合性ドメイン間の相互作用についての構造学的情報は該結合性ドメインにお ける特定の残基の突然変異化又は置換に関する手法を導き、これによって変異し た結合特異性が提供される。従って、とりわけ本発明は新しいりガント分子のた めの、新しいりガント結合性ドメイン相互作用のデザインのための、新しいキメ ラステロイドレセプター題材成分の生産のための、更にはりガントと結合性ドメ インの新しい組合せを作り出すためのスクリーニングを提供する。

本発明は新規なるステロイドホルモン一応答性因子及び対応の遺伝子の単離又は 同定も提供する。ステロイドレセプタ一部材成分のＤＮＡ−結合性ドメインによ る結合に応答性であるＤＮＡコントロール因子への、選ばれた配列の適切な作動 連結により、新しいｙ１節組合せが得られる０本発明は更に、一定のＤＮＡ配列 を認識するであろう昆虫ステロイドレセプタ一部材の成分における結合性ドメイ ン、又は逆に１７セブターＤＮＡ−結合性ドメインに結合するであろう改質した ＤＮＡ配列のいづれをもデザインすることを提供する。

部材−成分ポリペプチドのＤＮＡ−結合性ドメイン及びそのＤＮＡ認識配列の両 者とも完全に新しいレセプターＤＮＡ相互作用を提供するために対等に改質せし めることができる。

他の１！様において、選択したレセプターによって認識されるＤＮＡ−結合性配 列は誘発性発現のための所望の遺伝子配列に作動連結させることがある。従って 、この選ばれたレセプターに特異的なりガントの投与に基づき、この遺伝子配列 は適切に調節される。昆虫ステロイドレセプタ一部材−特異性リガントの投与に 応答性である発現システムを作製した。この昆虫ステロイドレセプタ一部材の新 しい成分を同定且つ単離せしめることにより、ホルモン及びコントロール因子に 関する有用な調節性試薬を得ることができる。

他のＭ様において、遺伝子の発現の高い調節性がこの部材成分に特異的なりガン トに応答性の調節因子の利用によって成される０発現が抑えられる又は誘発され ない条件のもとで形質転換細胞を増殖該！１１１！ｆｆリガンド分子を加えて高 い発現率を生じさせる。この誘発性遺伝子の効率性の高い調節発現及びこのよう な遺伝子を完全生物に導入せしめることのための両方の手段を提供する。

本発明の特定の態様に従い、昆虫ステロイドホルモンレセプター題材の部分をコ ードする核酸配列が明らかとなった。シジウジョウバエステロイドレセプター部 材の４種類の成分をコードするＤＮＡが特徴付けられた＝　（１）全長コード配 列の決定された２Ｏ−ＯＨエクジソンレセプター（エクジソンレセプター（Ｅｃ Ｒ）とも呼ばれる）　ｉ　（２）種々のステロイドレセプタ一部材成分と相同性 の配列を有するタンパク質、ショウジヨウバエホルモンレセプター３（ＤＨＲ３ ）；　（３と４）同一の遺伝子のセグメントによりコードされ、そしてそれぞれ 他のステロイドレセプタ一部材成分に相同性の配列を保有し、近親をタンパク質 であるＥ７５Ａ及びＥ７５Ｂ。

昆虫ステロイドレセプタ一部材のこれらの成分それぞれをコードするＤＮＡ配列 は、シミウジボウバエ及びその他の起源における相同性の核酸配列についてのス クリーニングのためのプローブを提供する。このスクリーニングはを椎動物及び 無を椎動物両方に由来する相同性の遺伝子の単離を可能とする。大量のコード化 タンパク質の生産はこのような配列を発現システムの中に挿入することで行われ る。

ＥｃＲ，ＤＨＲ３、Ｅ７５Ａ及びＥ７５Ｂ遺伝子はそれぞれ、昆虫ステロイドに 応答性であるコントロール又は調節因子として働くようである類似のＤＮＡ配列 に連結している０本発明はこのようなホルモン一応答性コントロール因子の単離 及び遺伝子発現の謂酊におけるそれらの利用を提供する。ＤＮＡ構造体の一つの 態様は：（１）昆虫ステロイドレセプタ一部材コントロール因子の複数のコピー ；これが連結する（２）小さな遺伝子プロモーター（好ましくは熱シラツク遺伝 子プロモーターでない）であって（３）作動連結した遺伝子の高い誘発性発現を 提供するプロモーターを含んで成る。

本発明の他の態様は細胞であって： （１）昆虫ステロイドレセプタ一部材タンパク質の生物学的に活性なフラグメン トをコードする単離せしめた組換え遺伝子セグメント；（２）昆虫ステロイドレ セプターに結合するＤＮＡ配列、例えばホルモン一応答性コントロールに関与す る因子；又は（３）改質したレセプタータンパク質を含んで成る細胞を含む、形 質転換細胞はそれらの子孫を含んでいると理解される。特に、本発明はポリペプ チドの発現がステロイドの導入に応答性であるシステムを提供する。

例えば、エクジソン類似体への暴露に応答して所望のタンパク質を発現するシス テムは、エクジソン一応答性エンハンサ−を有するプロモーターをペプチドコー ド化セグメントに作動連結させることにより作製する。

本発明は更に、天然に連結している昆虫細胞成分を実質的に有さない昆虫ステロ イドレセプタータンパク質を提供する。このようなレセプターは一般に全長タン パク質、ｍ脆性フラグメント、又は融合タンパク質であって異種もしくは通常近 接していないタンパク質ドメインと融合している昆虫ステロイドレセプタータン パク質由来のセグメントを含んで成るもののいづれかであろう。

本発明は更に対象のレセプタータンパク質を利用する多数の方法を提供する。本 発明の一つの態様は新しいホルモン類似体を選別する方法である。単離したホル モン−結合性ドメインはホルモンリガンドと特異的に結合し、これによって該リ ガンド−結合性領域に対して高い親和性を有する結合の性質を保有する新しい分 子のスクリーンのための手段を提供する。従って、昆虫ステロイドレセプター題 材成分の結合性ドメインは結合アッセイを開発するための試薬として利用される であろう、一つのレベルにおいて、この結合性ドメインはバッチ又はカラム選別 プロセスのためのアフィニティー試薬として、即ち、結合するリガンドを選択的 に保持するものとして有用である。他方、リガンド−結合性に対する高い感度の ため、直接的結合アッセイ、又は容易にアッセイされる機能に結合性が関与する 間接的アッセイのいづれの機能的アッセイが好ましい０例えば、容易にアッセイ されるリポータ−遺伝子を、昆虫ステロイドレセプター題材成分による結合に応 答性のコントロール要素に作動連結させることにより（ここでリガンド−結合は タンパク質合成を誘発する）、リガンドヌはレセプターの存在についての非常に 高感度なアッセイが得られる。２Ｏ−ＯＨエクジソンの存在をアッセイするのに 有用なこのような構造体を以下に詳細する。この構造体は２Ｏ−ＯＨエクジソン リガンドの作動薬又は拮抗薬についてのスクリーニングに有用である。

特に、本方法は「オーファンＪ　（ｏｒｐｈａｎ）　レセプター、即ち、そのリ ガンドが未知であるレセプターに結合するりガントを選別することを可能にする 。「未知」のりガントについての結合性ドメインはしばしば新しく同定した昆虫 ステロイドレセプター題材成分、又は突然変異誘発のいづれかを起源とする。バ イブリド１ノセプターは興なる起源由来のりガント結合性ドメインとＤＮＡ−結 合性ドメインにより作り上げられうる。例えば、推測の結合性ドメインと既知の ＤＮＡ−結合性ドメイン間のバイブリドレセプターがリガンド１．二ついてのス クリーニングを可能にする。「オーファンレセプター」結合性ドメインを、発現 が容易に検出されうるであろう既知のリポータ−遺伝子構造体をコントロールす るであろう既知のＤＮＡ−結合性ドメインと機能的に連結されうる。

リガンド−レセプター結合性についてのこのシステムはりガント−レセプター相 互作用に関する非常に高感度なアッセイを提供する。

他方、昆虫ステロイドレセプター題材成分に由来するりガント結合性ドメインと そのリガンドとの間の四次構造及び空間相互作用の重要なる特徴の認識は、リガ ンド−結合性ドメインとりガントとの新しい組合せの選択を可能にするであろう 、いづれの方法も、レセプターの改質されたポリペプチド−結合性ドメインに特 異的に結合する普通ではないリガンドを選別するための方法を提供する。

本発明は更に、新しく且つ有用な、種々の関連成分即ち：該ポリペプチドをコー ドする組換え核酸配列、該ポリペプチド配列及びこのレセプターが結合するＤＮ Ａ部位（即ち、調節又はコントロール因子）の組合せを提供する。例えば、種々 の起源由来のペプチドをコードする核酸配列の部分を融合することは、バイブリ ド特性、例えば通常でないコントロール及び発現特性を示すポリペプチドを提供 するであろう、特に、該題材の他の成分又は他の起源に由来するセグメントを含 んで成るバイブリドレセプターが作られうる。昆虫ステロイドレセプター一応答 性エンハンサ−セグメントを異なるポリペプチドコード化セグメントと組合せる ことは、このポリペプチドのためのステロイド一応答性発現システムを提供する であろう。

昆虫ステロイドレセプターの単離は、レセプター結合のための新しいリガンドの 単離又はスクリーニングを提供する。これらのうちのいくつかは正常な昆虫成長 を妨げる又は崩壊させるであろう、これらの試薬は利用者が昆虫の成長を促進せ しめる又は退行させることを、例えばリリース（ｒｅｌｅａｓｅ）のための不妊 成虫の生産において可能とする。他方、成長の時期を遅らせるもしくは変えるこ とは通常致死的であるか、又は農作物に昆虫が影響を及ぼす能力を劇的に変える であろう、従って昆虫の成長を崩壊することができる天然の生物分解され且つ高 活性子分子が得られるであろう。

更に、これらのポリペプチドは、特定のステロイドレセプタークラスへの結合の 特異性を有する抗体を発生せしめる手段を提供する。

従って、これら又は相同性のポリペプチドの存在を定性的にもしくは定量的に測 定するための試薬が作られうる。他方、これらの抗体はレセプターポリペプチド の選別又は精製のために利用されうる。

ｌ鬼ス元旦イドレセプター　の＝Ｉ【死エクジソンレセプター遺伝子は、リガン ド一応答性転写因子のグループである。ステロイド及び甲状腺ホルモンレセプタ ー遺伝子題材の成分である、Ｅｖａｎｓ（１９８８）　５ｃｉｅｎｃｅ　２４０ 　：　８８９−８９５　；及びＳｅｇｒａ−ｖｅｓ、　Ｍｏ１ｅｃｕ　ａｒ　ａ ｎｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎ　ｌ　ｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｅ７５　Ｅｃｄ　５ ｏｎｅ−Ｒｅｓ−ｏｎｓｉｖｅ　Ｇｅｎｅ　ｏｆ　Ｐｒｏｓｏ　ｈｉｌ　ｍ蛙ｕ 」杉山Ｅ（Ｐｈ、Ｄ、　１ｈｅｓｉｓ、　５ｔａｎ−ｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓ ｉｔｙ　１９８８）を参照のこと。これら両方とも参考の目的で本明細書に組入 れる。これらのレセプターは長い配列類似性（特にそれらの「ジンクフィンガー 、ＤＮＡ−結合性ドメインにおいて）、更にはりガント（又はホルモンもしくは ステロイド）結合性ドメインを示す。遺伝子発現のＴＩ４ｗＢは明らかに、ＤＮ Ａ因子を特異的にコントロール又は調節するレセプターの結合に応答して生ずる 。レセプターｃＤＮＡのクローニングはステロイド作用の分子ベースでの研究の ための第１の機会を提供する。このステロイドレセプター超科は類似の構造的及 び機能的な特徴を示すクラスのレセプターである。本明細書にて昆虫なる語を用 いているが、同一の方法及び分子はその他の動物の種、特に胴、昆虫類に属する もの、又はより広く、ホルモンとしてエフジステロイドを利用する門、節足動物 に属するものに由来することができることが理解されるであろう、昆虫ステロイ ドレセプタ一部材の成分は機能的なりガント−結合性及びＤＮＡ結合性ドメイン によって特徴付けられ、両方とも該レセプターのＤＮＡ結合性部位に作動連結し ている遺伝子の調節状態における変化を及ぼすよう相互作用する。従って、昆虫 ステロイドレセプタ一部材のレセプターはりガント一応答性転写因子のようであ る０本発明のレセプターは、Ｅｌ、Ｅ２及びＥ３として表わす、特定領域に相同 性の配列によって特徴付けられる少なくともホルモン−結合性ドメインを示す。

昆虫ステロイドレセプタ一部材の成分は一般に、初期においてエストロゲンレセ プターとして定義される、特定ドメインの構造的相同性により特徴付けられる。

特に、ＤＮＡ−結合性ドメインＣ及びリガンド−結合性ドメインＥは、Ｋｒｕｓ 　ｔら（１９８６）　ＥＭＢＯＪ、　５　：　８９１−８９７によって同定され た通り、更なるドメインによって分けられて並んでいる。これは本明細書に参考 として組入れる。

Ｃドメイン、又はジンク−フィンガーＤＮＡ−結合性ドメインは通常親水性であ り、高いシスティン、リジン及びアルギニン含有率を有する（所望される強いＤ ＮＡ結合に適した配列である）、Ｅドメインは通常疎水性であり、そして更に領 域Ｅｌ、Ｅ２及びＥ３として特徴付けられる０本発明のりガント−結合性ドメイ ンはこれらの３つの領域に対して、配列及び構造における有意な相同性を有する ことによって一般に′＃徴付けられる。Ｃドメインに対してアミノ近位している のはＡとＢのドメインを分けるものとしての最初に規定される領域である。Ｎ域 りはより保存されているドメインＣとＥを分ける。ｉ域りは一般に疎水性領域を 有し、その予想の二次構造はターンとコイルが豊富である。ＦＢＩ域はＥｌ域に 対してカルボキシ近位している（Ｋｒｕｓ　ｔら、前記を参照のこと）。

昆虫ステロイドレセプタ一部材の成分のりガント−結合性ドメインは典型的に、 以下に詳細のＤＮＡ−結合ドメインと比べてカルボキシル−近位である。　ＩＥ ｖａｎｓ（１９８Ｂ）　５ｃｉｅｎｃｅ　２４０　：　８８９−８９５を参照の こと、ホルモン−結合性ドメイン全体は一般に約２００−２５０個のアミノ酸の 間であるが、潜在的にやや短い、このドメインは高い相同性のＥｌ、Ｅ２及びＥ ３領域と称するサブ領域を有する０例えば表４参照のこと。

Ｅｌｉ域は１９個のアミノ酸の長さであり、共通配列ＡＫＸ（Ｌ／Ｉ）ＰＧＦＸ ＸＬＴ（Ｌ／Ｉ）　（Ｄ／Ｅ）ＤＱＩＴＬＬを有し、ココでＸは任意のアミノ酸 を示し、そしてその他の文字は標準の単独文字コードを意味する。かっこ内にお ける位置は択一的である。一般に、昆虫ステロイドレセプター題材の成分は表示 の１６箇所の位１のうちの少なくとも５箇所のマツチング、好ましくは約９箇所 のマツチング、そしてより好ましいａｍにおいて約ｌＯ箇所のマツチングを有す る。他方、これらの昆虫ステロイドレセプター超群成分は、示した好ましいアミ ノ酸の位置にて、約２５％以上の相同性、通常は約３０％以上の相同性、より通 常には約３５％以上の相同性、一般には約４０％以上の相同性、より一般には約 ４５％以上の相同性、典型的には約５０％以上の相同性、より典型的には約５５ 以上の相同性、通常は約６０％以上の相同性、より通常には約７０％以上の相同 性、好ましくは約８０％以上の相同性、そしてより好ましくは約９０％以上の相 同性を示す相同性配列を有するであろう。

Ｅ　Ｚ　ｍｌ域は１９個のアミノ酸のセグメントであり、共通配列：Ｅ　（Ｆ／ Ｙ）　（Ａ／Ｖ）　（Ｌ／Ｃ）　（Ｌ／Ｍ）　）［Ａ　（１／Ｌ）　（Ｖ／Ｌ） 　Ｌ　（Ｌ／Ｉ）　（Ｎ／Ｓ）　（Ｓ／Ｐ）　Ｄ@（Ｐ／−）　（１１／Ｋ） （Ｐ／Ｄ）　ＧＬを有する。

ここで−は任意的なアミノ酸の欠如を表わす。典型的には、昆虫ステロイドレセ プター題材の成分は少なくとも６箇所のマツチング、好ましくは約８箇所のマツ チング、そしてより好ましい態様において約９箇所のマツチングを有する。他方 、これらの昆虫ステロイドレセプター超群成分は、示した好ましいアミノ酸の位 置にて、約２５％以上の相同性、通常は約３０％以上の相同性、より通常には約 ３５％以上の相同性、一般には約４０％以上の相同性、より一般には約４５％以 上の相同性、典型的には約５０％以上の相同性、より典型的には約５５以上の相 同性、通常は約６０％以上の相同性、より通常には約７０％以上の相同性、好ま しくは約８０％以上の相同性、そしてより好ましくは約９０％以上の相同性を示 す相同性配列を有するであろう。

Ｅ３ｇ！域は１２個のアミノ酸のセグメントであり、共通配列ＬＸＸＬＬＸＸＬ ＰＤＬＲを有する。

この昆虫ステロイドレセプター題材の成分は、ＥＳｆＩＩ域における示した好ま しい９個のうち少なくとも４箇所のマツチング、好ましくは約５箇所のマツチン グ、そしてより好ましい約６箇所のマツチングを有する。他方、これらの昆虫ス テロイドレセプター超群成分は、示した好ましいアミノ酸の位置にて、約２５％ 以上の相同性、通常は約３０％以上の相同性、より通常には約３５％以上の相同 性、一般には約４０％以上の相同性、より一般には約４５％以上の相同性、典型 的には約５０％以上の相同性、より典型的には約５５以上の相同性、通常は約６ ０％以上の相同性、より通常には約７０％以上の相同性、好ましくは約８０％以 上の相同性、そしてより好ましくは約９０％以上の相同性を示す相同性配列を示 した位置にわたり有するであろう。

好ましい態様において、昆虫ステロイドレセプター超群成分はＥｌｌ域において 少なくとも約５箇所のマツチングを、Ｅ３領域において少な（とも約６箇所のマ ツチングを、そしてＥａｉ域において少なくとも約４箇所のマツチング示すであ ろう、Ｅｌ、Ｅ２及びＥ３領域は例えば表４において定義する。

このような昆虫ステロイドレセプター超群成分のＤＮＡ−結合性ドメインは「ジ ンクフィンガー」モチーフによって特徴付される。

Ｅｖａｎｓ（１９８８）　５ｃｉｅｎｃｅ　２４０　：　８８９−８９５を参照 のこと、このドメインは典型的にはりガント又はホルモン結合性部位に対してア ミノ近位している。典型的には、昆虫ステロイドレセプター超群成分のＤＮＡ− 結合性ドメインはふさ状の塩基性残基、システィンに冨む構造及び配列相同性に より特徴付けられる。　Ｅｖａｎｓ、Ｒ，Ｍ、（１９８８）　５ｃｉｅｎｃｅ２ ４０　：　８８９−８９５　；及び以下の実験の章を参照のこと、有意なるポリ ペプチド配列相同性が部材成分の間に存在する。この昆虫ステロイドレセプター 超群成分はこのドメインの６７±１個のアミノ酸領域において少なくとも約３０ ％の相同性、一般には少なくとも約４０％の相同性、通常は少なくとも約４５％ の相同性、そして好ましくは約５５％の相同性を示すであろう。

ステロイドは、飽和テトラサイクリンク炭化水素パーヒドロシクロペンタノフェ ナントレンの誘導体であるグループ「ステロイド」に属する分子、即ち、胆汁酸 、例えばコール酸及びデオキシコール酸；副腎皮質ステロイド、例えばコルチコ ステロン及びアルドステロン：エストロゲン、例えばエストロン及びβ−エスト ラジオール；アンドロゲン、例えばテストステロン及びプロゲストロン；並びに エフジステロイドである。ステロイド又はステロイドホルモンは本明細書では同 じ意味として用いられ、そして全てのステロイド類似体を含むことを意図する。

典型的には、ステロイド類似体は種々の末梢化学基のわずかな修飾を有する分子 である。エフジステロイドの詳細についてはＫｏｏｌ＊ａｎ（編）　（１９８９ ）前記を、参照のこと。

昆虫ステロイドレセプター超群成分に対するリガンドは歴史的にステロイドとし て特徴付けされているが、「昆虫ステロイドレセプター題材」における「ステロ イド」なる語は文字通りの意味のみを有するのではない。「ステロイド」の利用 は、特定の定義された分子構造を有する分子のみを含むと第１に認識されるグル ープのメンバーの歴史的表現に由来する。しかしながら、この限定はもはや通用 せず、なぜならその機能は精密な構造にのみ関連するのではないからである。従 って、リガンド−結合性特異性が歴史的に定義された「ステロイド」に向けられ ていない、本明細書で定義する昆虫ステロイドレセプター題材のメンバーが存在 しているであろう。典型的には、昆虫ステロイドレセプター題材の成分に対する リガンドは、ステロイド分子の構造類似体である親水性分子である。

リガンドなる語は本明細書で「ホルモン−結合性ドメイン」として詳細するドメ インに結合する分子を意味する。更に、昆虫ステロイドレセプター超群成分に対 するリガンドは、この成分が結合する天然りガントとして、又は作動薬もしくは 拮抗薬として働く機能的な類似体のいづれかとして働くリガンドである。「ホル モン」の歴史的な定義は生理学者によって機能的に定義されている０例えばＧｕ ｙｔｏｎ、　Ｔｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｈ　５ｉｏｌｏ　５ ａｕｎｄｅｒｓ、　Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａを参照のこと、Ｉｌ能的な語「ホ ルモン」を歴史的な有用性によって利用するが、しかしこれは細胞の種類間の連 結に利用されるその他の化学メツセンジャーにも適用するように意味する。近年 、ホルモンと神経伝達物質との間の区別はなくなりつつあり、なぜなら種々のペ プチド神経伝達物質は歴史的に定義されているホルモンの特性を示すことが示さ れているからである。これらの分子は一般的に細胞内シグナル変換において利用 されるが、遅いもしくは全身系作用を有する分子又はリモート部位として働くそ のような分子に限定されるわけではない。

核酸内容物における実質的相同性とは、セグメント又はその相補鎖のいづれかを 比較したとき、適切に並べた場合に適当なヌクレオチド挿入もしくは欠失を伴い ながら、少なくとも約４０％の残基、一般には少なくとも約４５％、より一般に は少な（とも約５０％、通常には少なくとも約５５％、より通常には少な（とも 約６０％、典型的には少なくとも約６５％、より典型的には少なくとも約７０％ 、通常には少なくとも約７５％、より通常には少なくとも約８０％、好ましくは 少なくとも約８５％、そしてより好ましくは少なくとも約９５％のヌクレオチド が同一であることを意味する。他方、セグメントは選択的ハイプリダイゼーシッ ン条件のもとで鎖又はその相補鎖と、典型的には表１．２もしくは３に由来する 配列を用いることによってハイブリダイズするとき、実質的な相同性がある。

ハイブリダイゼーシッンの選択性はハイブリダイゼーシ５ンが起こるときには存 在し、これば特異性の全体的な欠如よりもより選択的である０通常選択性ハイブ リダイゼーシッン、少なくとも約１４〜２５個のヌクレオチドの鎖にわたって約 ５５％以上の相同性、一般には約６５％以上、典型的には約７５％以上、通常は 約８５％以」二、好ましくは約９０％以上、そしてより好ましくは約９５％以上 の相同性があるときに起きる。Ｋａｎｅｈｉｓａ、Ｍ、（１９８４）　Ｎｕｃｌ ｅｉｅ　Ａｃ１ｄｓ　Ｆｌｅｓ、１２　：　２０３−２１３を参照のこと。これ は本明細書に参考として組み入れる。緊張ハイブリダイゼーシッン条件は塩濃度 を約２８５Ｍ以下、一般には約１．５Ｍ以下、典型的には約１Ｍ以下、通常は約 ５００１以下、そして好ましくは約２００ａｌｌで含むであろう、温度条件は正 常には約２０℃以上、より正常には約２５°Ｃ以上、一般には約３０″Ｃ以」二 、より一般には約５５℃以上、典型的には約４０℃以上、より典型的には約４５ °Ｃ以上、通常は約５０℃以上、より通常には約５５℃以上、そして特定の１１ 様においては６０℃以上、更には８０℃以上でさえもありうる。その他の要因が ハイブリダイゼーシヨンの緊張性に有意に影響を及ばずことができ、とりわけ塩 基組成及び相補鎖のサイズ、有機溶媒の存在及び塩基誤対合の程度が含まれ、パ ラメーターの組合わせはいづれの絶対尺度よりもより重要である。

昆虫ステロイドレセプター題材成分遺伝子に関する遺伝子は、その上流（例えば プロモータ）及び下流に作動連結したコントロール因子を、相補鎖と同様に含む 。一般的に、’ｅｒａ　ｔｓｏｎら（１９Ｂ？）ハ虹Ｍｏ１ｅｅｕ↓４二ｌゆ↓ ｏ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｇｅｒ＋ｅ　Ｂｅｎｊａｓ＋ｉｎ、　Ｍｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ を参照のこと。これは参考として本明細書に組み入れる。遺伝子は一般的に、イ ントロン及びエキソンの両方を含む転写ユニットをコードするセグメントも含ん で成る。従って、単離せしめた遺伝子は、本発明のレセプター遺伝子のコントロ ール又は転写せしめたセグメントのし１づれかにハイブリダイズする遺伝子配列 をプローブ化することによって、新しいステロイドレセプター遺伝子についての スクリーニングを可能にする。特定の対象の３つのセグメントは、上流及び下流 の両方のコントロール因子、並びにＤＮＡ−結合性セグメント及びホルモン−結 合性セグメントをコードするセグメントである。このようなスクリーニングに利 用できる方法は、ハイブリダイゼーシツン又はアフィニティーラベル化において 一般的に利用されるものと類似である。

核酸プローブは放射性又は非放射性ラベルを用いて通常ラベルされ、この多くを ポリペプチドラベル化における章に記載する。核酸ラベル化に関する標準的方法 は例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）　；及びＡｕ５ｕ−ｂｅｌ　ら（１９ ８７及び付録）に詳細されている。

ｌ東工左工仁しヒ１らヒ」Ｉ擾■ヅユゴブ±エエクジソンレセブターのポリペプ チド配列を表２に示す、その他の昆虫ステロイドレセプタ一部材成分ポリペプチ ド配列を表１及び３に記載する。これら昆虫ステロイドレセプタ一部材成分ポリ ペプチドをコードするｃＤＮＡの好ましい核酸配列も関連の表に提供する。縮重 又は非普遍性（ｎｏｎ−ｕｎｉｖｅｒｓａｌｔｔｙ）の遺伝子コードの利用を可 能にするその他の核酸がタンパク質をコードするのに利用されるであろう。

本明細書で用いる「実質的に純粋」なる語は、タンノイク質又はその他の物質、 例えば核酸がその天然の夾雑物から分けられていることを意味する。典型的には 、七ツマータンパク質は、少なくとも約６０〜７５％のサンプルが単独のポリペ プチド主鎖を示すときに実質的に純粋である。わずかな変異又は化学修飾は同一 のポリペプチド配列を共有する。通常、実質的に純粋なタンパク質は約８５〜９ ０％のタンパク質サンプルを含んで成り１、そして好ましくは約９９％以上純粋 である。普通、純度はポリアクリルアミドゲル上で調べられ、その均一性は染色 によって測定される。他方、一定の目的のために高分解能が必要とされ、従って ＨＰＬＣ又は精製のための類似の手段が利用されるであろう。はとんどの目的の ためには、簡単なりロマトグラフィーカラム又はポリアクリルアミドゲルが純度 の検定のために利用されるであろう。

「天然的に結合した昆虫細胞成分を実質的に含まない」なる語句は、タンパク質 又はその他の物質、例えば核酸が、その天然昆虫細胞状態において一緒である天 然夾雑物から分けられていることを意味する。従って、化学的に合成された１、 又は起源とする昆虫細胞と°　は異なる１ａ胞系において天然的に合成されたタ ンパク質はその天然的に結合した昆虫細胞成分を含まない。この語句は、哺乳動 物細胞又は植物細胞、且、２ｉ恒、匪）及びその他の原核細胞において合成され た昆虫ステロイドレセプター題材成分及び核酸の説明に利用する。

本発明は昆虫ステロイドレセプター題材成分の類似体も提供する。

このような類似体は、ポリペプチド主鎖への修飾、例えば挿入及び欠失、遺伝子 的変異体、並びにポリペプチドの突然変異体を含む。

修飾はポリペプチドの化学誘導、例えばアセチル化、カルボキシル化等を含む、 グリコジル化修飾及び典型的なポリペプチドのプロセシング変異体も含まれる。

このようなプロセシング工程は特に酵素修飾、例えばユビキチン（ｕｂｉｑｕｉ ｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ）が含まれる０例えばＩｅｒｓｈｋｏ　ａｎｄ　Ｃ１ｅｃ ｈａｎｏｖｅｒ（１９８２）　”Ｍｅｃｈａｎｉｓ＋ｍｓ　ｏｆ　Ｉｒ＋ｔｒａ ｃｅｌｌｕｌａｒＰｒｏｔｅｉｎ　Ｒｒｅａｋｄｏｗｎ’　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂ ｉｏｅｈ、　５１　：　３３５−３６４を参照のこと。

その他の類似体には、天然及び誘発された両方の遺伝子的変異体が含まれる。誘 発された突然変異体は種々の技術、例えば照射もしくはＥＭＳへの暴露のような 因子を利用するランダム突然変異誘発、又は位！特異的突然変異誘発技術を用い る操作された変化、又は古典的な分子生物学のその他の技術に由来する。例えば Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：＾Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒ　？Ｉａｎｕａｌ　（第２版）、　Ｃ３ＨＰｒｅｓｓ　；及び Ａｕ５ｕｂｅｌら（１９８７及び付録）　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ 　ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｉｏ　、　Ｇｒｅｅｎ／賀１１ｅｙ、　Ｎｅ ｗ　Ｙｏｒｋを参照のこと、それぞれ本明細書に参考として組み入れる。

前記した通り、レセプターのＤＮＡ−結合ジンクフィンガーセグメントは特定の 標的ＤＮＡ配列の特異性の高い認識性を示す。ＤＮＡ−タンパク質結合相互作用 の理解は、高い活性の調節のための結合性の特異性を及ぼすよう、ＤＮＡもしく はタンパク質の特性又はその両者の連輪状態における改質を提供する。より重要 には、昆虫ステロイドレセプター題材の新しい成分に関する遺伝子の単離は、こ のレセプターポリペプチドを生産するため及び新しいコントロール因子を単離す るためのそれらの利用を可能にする。前記したＤＮＡ−結合性ドメインを利用す ることにより、対応の部材成分が結合することによりリガンドに応答性であるコ ントロール因子が同定且つ単離される。この方法はりガントに応答性の種々のコ ントロール因子をもたらすであろう、上記の方法により、昆虫ステロイドレセプ ター題材のあらゆる特定の成分に対するリガンドが同定されるであろう。

コントロール因子は典型的にエンハンサ−であるが、サイレンサー又は種々のそ の他のタイプのりガント一応答性因子も含まれる。　゛これらは通常遠く離れて 作動するが、しかし典型的にはこれらの因子がｍｔｍする遺伝子の約５０ｋｂ以 内、通常は約３５ｋｂ以内、より通常には約２０ｋｂ以内、そして好ましくは約 ７ｋｂ以内にある。

ポリペプチドフラグメント　び　４ 実質的な全長ポリペプチドとは別に、本発明はこのポリペプチドの生物学的活性 なフラグメントを提供する。有意な生物学的活性はりガント結合性、ＤＮＡ結合 性、免疫学的活性及びステロイドレセプター題材成分のその他の任意の生物学的 特性を含む。免疫学的活性は、標的免疫系における免疫原機能、同様に結合のた めの免疫学的エピトープの共有を含み、ステロイドレセプターエピトープに対す る競合物質又は基質抗原のいづれかとして働（。

例えば、異なるポリペプチドに由来するりガント−結合性又はＤＮＡ−結合性ド メインは、別の、又は新しい融合ポリペプチドもしくはフラグメントへと変換さ れうる。従って、特異性の新しい組合せを示す新しいキメラポリペプチドが、Ｄ ＮＡ−結合性ドメインに対するリガンド結合特異性の機能的な連結より得られる 。これは誘発性発現システムのデザインにおいて非常に有用である。

免疫学的目的のため、免疫原は時折り直列に反復するポリペプチドセグメントよ り作られることがあり、これによって抗原性の高いタンパク質が作られる。他方 、このようなポリペプチドは特異的な結合に対する有効性の高い競合物質として 働きうる。昆虫ステロイドレセプター題材成分に対する抗体の製造は以下に記載 する。

本発明はステロイドレセプター題材成分のフラグメントを含んで成るその他のポ リペプチドも提供する。ステロイドレセプターセグメントとその他の同種又は異 種タンパク質との融合ポリペプチド、例えば異なるタンパク質に由来する近接し たペプチド配列を含んで成るポリペプチドを提供する。相同ポリペプチドは通常 、異なるステロイドレセプター題材成分間の融合体であり、例えば一方の成分の リガンド特異性と他方のＤＮＡ−結合特異性を示す）１イブリドタンパク質とな る。同様に、異なるポリペプチドに由来する異種融合体を作製することができ、 これは先祖タンパク質の特性又は活性の組合せを示すであろう、典型的な配列は 、リポータ−ポリペプチド、例えばルシフェラーゼと、レセプターの他のドメイ ン、例えばＤＮＡ−結合性ドメインの融合体であり、これによって所望のりガン トの存在又は局在が容易に検出される０例えばＤｕｌｌら、米国特許第４　、８ ５９　、６０９号を参照のこと、これは本明細書に参考として組入れる。

その他の典型的な遺伝子融合パートナ−には、ＤＮＡ−結合性タンパク質、ｔａ ｇ性β−ガラクトシダーゼ、ｔｒｐＥタンパク質Ａ１β−ラクタマーゼ、アルフ ァーアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ及び酵母アルファー交配因子と交 換せしめた「ジンクフィンガー」を含む０例えばＧｏｄｏｗｓｋｉら（１９８８ ）、５ｃｉｅｎｃｅ　２４１　＝　８１２−８１６　；及び以下の実験の章を参 照のこと。

ステロイドレセプター 該レセプターポリペプチドの配列及びこれらをコードする組換ＤＮＡ配列により 、大量の昆虫ステロイドレセプター題材成分が調製されうる。細胞におけるベク ターの適切な発現により、効率性の高いタンパク質生産が成し遂げられうる。そ の後、標準的なタンパク質精製方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、カラムクロ マトグラフィー、電気泳動、遠心、結晶化、他が利用できうる。タンパク質精製 に関して典型的に利用される技術については、例えばＤｅｕｔｓｃｈｅｒ（１９ ９０）　＝Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ″　 Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｓｏｌ。

は効率性の高い生産が不必要であるが、しかし慎重に操作せしめた発現システム における既知の誘発性タンパク質の存在はかなり重要である０例えば、（１）こ のタイプのりガント一応答性エンハンサ−が作動連結している（２）所望の遺伝 子配列と、（３）対応の昆虫ステロイドレセプター題材成分の組合せを一緒に発 現システムに！くことは、特異的に誘発される発現システムを提供する。所望の 遺伝子配列は対象のタンパク質をコードし、そして対応のステロイドレセプター 成分はしばしばエクジソンレセプターでありうる。典型的には、この発現システ ムは細胞であるが、しかし試験管内発現システムも組立てられうる。

所望の遺伝子はあらゆる選択できる発現ベクターの中に挿入できる。適切なベク ター及び細胞系の選択は所望の生成物の条件に依存する。典型的な発現ベクター はＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）及びＡｕ５ｕｂｅｌら（１９８７及び付録） に詳細されている。適切な細胞系は寄託機関、例えばＡＴＣＣにより入手できる 。　ＡＴＣＣＣａｔａｌｏｇｕｅ　ｏｆ　Ｃｅ１ｌ　Ｌｉｎｅｓａｎｄ　Ｈｙｂ ｒｉｄｏｓａｓ　（第６版）　（１９８８）を参照のこと、ＡＴＣＣ細胞系、ウ ィルス及び抗血清はそれぞれ本明細書に参考として組入れる。これらのベクター は例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に詳細の通りの標準形質転換又はトラ ンスフェクション工程によフて所望の細胞に導入される。

融合タンパク質は典型的には組換核酸方法又は合成ポリペプチド方法のいづれか によって作られうる。核酸操作に関する技術は一般的に例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ら（１９８９）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｏ　：＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒ Ｍａｎｕａｌ　（第２版）第１〜３＠、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに詳細され、これは本明細書に参考として組入れる。ポ リペプチドの合成に関する技術は例えばＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　Ｊ、Ａ　ｅｒ 、Ｃｅｓ、ｓｏｃ、８５：２１４９−２１５６　（１９６３）に詳細されている 。

本発明の融合タンパク質を作るために利用される岨換え核酸配列は天然又は合成 配列に典型的に由来するあろう。多数の天然遺伝子配列が、適切なプローブを用 いることで種々のｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーから得られる。　Ｇｅｎ　Ｂ ａｎｋ　（商標）＋　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕ−ｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅ ａｌｔｈを参照のこと。ステロイドレセプターのための典型的なプローブは標準 工程に従って表１．２又は３の配列から選べる。

Ｂｅａｕｅａｇｅ　ａｎｄ　Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ、　Ｔｅｔｒａ、Ｌｅｔｔｓ 、　２２　：　１８５９−１８６２（１９８１）に詳細のホスホラミシト方法は 適切な合成りＮＡフラグメントを作り出し得る。次いで二重鎖フラグメント、相 補鎖を合成し、そしてこれらの鎖を適当な条件のもとてアニール化せしめること により、又は適切なプライマー配列を伴ってＤＮＡポリメラーゼを利用する相補 鎖の付加によって得られる。

単離せしめたステロイドレセプター遺伝子により、相同配列を通常は別の起源、 例えば別の動物から単離するためのプローブとして、転写せしめたセグメントの セグメントが有用となる。プローブとして利用するセグメントの選択により、特 に機能的に結合したセグメントが単離されうる。従って例えば、新しいレセプタ ーのりガント−結合性又はＤＮＡ−結合性ドメインのいづれかをコードするその 他の核酸セグメントが単離されうる。他方、プローブとしてステロイド応答性コ ントロール因子を用いることにより、発現が調節される関連のＤＮＡセグメント を伴って新しいステロイド応答性因子が単離されうる。この方法はりガント一応 答性遺伝子の単離を可能にし、その多数はそれ自体、昆虫ステロイドレセプター 題材のメンバーでもある。

所望のステロイドレセプターフラグメントをコードする天然又は合成りＮＡフラ グメントを、試験管内細胞培養に導入できる且つ発現するＤＮＡ構造の中に組込 むことができる０通常、このＤＮＡ構造体は単細胞宿主、例えば酵母又はＩｉＩ 菌における複製に適するべきであるが、しかしながら他方、ゲノムへの組込みを 伴ってもしくは伴わないで、培養哺乳動物もしくは植物又はその他の真核細胞系 への導入に意図されていてもよい、細菌又は酵母への導入のために調製したＤＮ Ａ構造体は典型的には、宿主により認識される複製システム、所望のレセプター ポリペプチドをコードする意図されたＤＮＡフラグメント、ポリペプチドコード 化セグメントに作動連結している転写及び翻訳開始調節配列、並びにポリペブチ トコ−Ｆ化セグメントに作動連結している転写及び翻訳終止調節配列を含む、転 写調節配列は典型的には宿主により認識される異種エンハンザ−又はプロモータ ーを含む、適切なプロモーターの選択は宿主に依存するが、しかしながらプロモ ーター、例えばｔｒｐ、ｌａｃ及びファージプロモーター、ｔＲＮＡプロモータ ー及びグルコース分解酵素プロモーターが知られている。　５ａｓｂｒｏｏｋら （１９８９）を参照のこと。ステロイドレセプターＤＮＡ配列のための挿入部位 を伴う、複製システム並びに転写及び翻訳調節配列を含む常用の入手可能な発現 ベクターが一般的に利用されうる。細胞系及び発現ベクターの有用な例は５ａｓ ｂｒｏｏｋら（１９８９）に記載され；更にＭｅｔｚｇｅｒら（１９８８）　Ｎ ａｔｕｒｅ３３４：３１−３６　も参照のこと。

」議ｊ」創ｉ体 昆虫ステロイドレセプター題材の成分をコードするＤＮＡセグメントは典型的に はプラスミドベクターにおいて利用されうる。第１の１！様において、発現コン トロールＤＮＡ配列は、昆虫ステロイドレセプタ一部材成分単独の発現のために 昆虫ステロイドレセプター題材成分コード化配列に作動連結している。第２の態 様において、昆虫ステロイドレセプター松科成分は、昆虫ステロイドレセプター リガンドの存在に応答するその他のタンパク質の発現の能力を提供する。この後 者のａｍは以下に別に詳細する０発現コントロール配列は一般に、真核宿主細胞 の形質転換又はトランスフエフティングの可能なベクターにおける真核エンハン サ−もしくはプロモーターシステムを含むであろう、該ベクターを適当な宿主に 導入せしめたなら、この宿主をその利用に依存して、高いレベルでのヌクレオチ ド配列発現に適する条件のもとに維持する。

１産ム犬−１猛ｌのステロイド−・ その他の遺伝子のステロイド一応答性発現のため、このステロイドレセプター遺 伝子は一般に、発現のためにこのステロイド一応答性エンハンサ−又はプロモー ター因子に作動連結している所望の遺伝子を含んで成る組換え構造体と一緒に形 質転換されうるゆこの利用において、単一の発現システムは典型的には、（１） 昆虫ステロイドレセプター松科成分のリガンドに応答性のコントロール因子、（ ２）発現のためにコントロール因子に作動連結している所望の遺伝子、及び（３ ）このコントロール因子に結合できる昆虫ステロイドレセプター松科成分の組合 せを含んで成る０通常、このシステムは細胞内で利用されうるが、試験管内シス テムも可能である。この昆虫ステロイドレセプター松科成分は典型的にはこれを コードする核酸の発現によって提供されうる（高いレベルに発現されることが必 要であろうと５ｉ係なく）、従って、ある好ましい態様において、このシステム は調節可能な構造体及び昆虫ステロイドレセプター松科成分をコードする他のセ グメントの両方による細胞の同時形質転換を介して成し遂げられうる９通常、こ のコントロール因子はエンハンサ−因子であるが、いくつかの因子は発現を抑え るように働（。

このＨ様において、昆虫ステロイドレセプター松科成分に対するリガンドが所望 される発現特性のために適切に提供される又は抑えられる。

特に有用な遺伝子構造体は容易にアッセイされうるリポータ−遺伝子、例えばβ −ガラクトシダーゼに作動連結しているアルコールデヒドロゲナーゼを含んで成 る。この構造体の好ましい態様において、この昆虫ステロイドレセプター松科成 分の複数のコピーが利用される０例えば、昆虫ステロイドレセプター松科成分、 例えばＥｃＲ，ＤＨＲ３，Ｅ７５Ａ及びＥ７５Ｂに応答性のコントロール因子の 、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）プロモーター又は前記したその他、並 びに前記した特定のリポータ−タンパク質に関するタンパク質コード化配列への 作動連結は、β−ガラクトシダーゼのステロイド一応答性発現をもたらす。この ようなシステムはりガント結合に応答する感度の高い発現の検出を選択し、生じ るリガンドレセプター相互作用の検出を可能にする。

ＤＮＡ配列は通常、この配列が発現コントロール配列に作動連結された後（１！ ｐち、発現の機能を確実にするために位置した後）、宿主において発現されるで あろう、このような発現ベクターは典型的には、エビソームとして、又は宿主染 色体ＤＮＡに組込まれている部分として宿主生態において複製される。一般に、 発現ベクターは選択マーカー、例えばテトラサイクリン又はネオマイシンを、こ れらの細胞が所望のＤＮＡ配列によって形質転換されていることを検定すること を可能とするために含むであろう（例えば米国特許第４　、７０４　、３６２号 を参照のこと；これは本明細書に参考として組入れる）。

旦１．２ｉは本発明のＤＮＡ配列をクローニングするために有用な１つの原核宿 主である。利用に適する他の微生物宿主にはバチルス［（ｂａｃｉｌｌｉ）　、 例えばバチルススブチ貫ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）、並びにそ の他のエンテロバクテリア（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｅｅａｅ）例えば二 四Ｊじ（ｉ属（Ｓａｌｓｏｎｅｌｌａ）　、土立土工属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）及 び種々の之五二上ｉ去囚属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の糧が含まれる。

酵母細胞、昆虫組織培養ａｒｍ、鳥ａｍ胞等を含むその他の真核細胞がしばしば 利用されうる。好ましくは、本発明の誘発性ポリベブ千ドを作るために哺乳動物 組繊細胞培養物が利用されうる（＄１ｉｎｎａ−ｃｋｅｒ、　Ｆｒｏ＋ｗ　Ｇｅ 　ｅｓ　ｔｏ　Ｃ１ｏｎｅｓ　ＶＣ）ｌ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、　Ｎ、Ｙ、　 （１９８７）　：　（本明細書に参考として組入れる）、を参照のこと）、哺乳 動物細胞は、昆虫ステロイドレセプター題材成分リガンド一応答性遺伝子構造体 の利用において好ましく、その理由はこれらは昆虫ステコイドレセプター松科成 分に対するリガンドへの応答性を授ける分子を天然的に欠いているからでる。

哺乳動物細胞が好ましく、その理由はこれらは昆虫ステロイドレセプター松科成 分に対する多数のりガントに感受性でないからである。従って、このような細胞 の昆虫ステロイドレセプター松科成分への暴露は、一般には細胞又は完全生物に 無視されうるような生理学的又はその他の作用が及ぼされるであろう、従って、 細胞はこのリガンド自体の存在に実質的に影響されずに増殖し、そして所望の生 成物を実現することができうる。このリガンドは陽性又は陰性方向のいづれかの 応答を生じせしめるよう機能する０例えば、通常は発現の前に、細胞を高密度と なるまで増殖させることが所望される。

陽性誘発システムにおいては、この誘発性リガンドは高い細胞密度の到達におい て添加されうるが、このリガンド自体が細胞に対して温和であるため、唯一の生 理学的不均衡は発現、即ち、生成物自体に由来する。他方、陰性抑制システムに おいては、細胞が高密度に到達する迄このリガンドを供給する。これら細胞の完 全生物、例えば植物又は動物への導入は、この生物に発現生成物を提供するであ ろう、このことにおいて、リガンドに対する細胞の天然的な罪悪受性は有利でも ありうる。

これらの細胞のための発現ベクターは発現コントロール配列、例えば複製起点、 プロモーター、エンハンサ−及び必要なプロセシング情報部位、例えばリポソー ム−結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終止配列 を含みうる。好ましくは、エンハンサ−又はプロモーターはステロイドレセプタ ーをコードする遺伝子に天然的に結合しているものであり、しかしながらあらゆ るケースにおいてその他のものも同程度又はより適切でありうることが理解され るであろう。その他の好ましい発現コントロール配列はウィルス、例えばＳＶ４ ０、アデノウィルス、牛パビロマウィルス等に由来するエンハンサ−又はプロモ ーターである。

同様に、好ましいプロモーターはイムノグロブリン−生産細胞において天然に見 い出せるもの（米国特許第４．６６３，２８１号を参照のこと：これは本明細書 に参考として組入れる）であるが、ＳＶ４０、ポリオーマウィルス、サイトメガ ロウィルス（ヒト又はネズミ）及び種々のレトロウィルス由来のＬＴＲ（例えば ネズミ白血病ウィルス、ネズミもしくはラウス肉腫ウィルス及びＨＩＶ）も有用 である。

Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ　ａｎｄ　Ｅｕｋａｒ　ｏｔｔｃ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘ　ｒｅｓ ｓｉｏｎ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ、　Ｌｙ、１１ ９８３を参照のこと、これは本明細書に参考として組入れる。

対象のＤＮＡセグメント（例えばステロイドレセプター遺伝子、組換えステロイ ド一応答性遺伝子又はその両者）を含むベクターを、細胞宿主のタイプに依存し て変わるよく知られた方法によって宿主細胞へと導入せしめることができる９例 えば、塩化カルシウムトランスフェクションは原核細胞に間して一般的に利用さ れ、そしてリン酸カルシウム処理はその他の細胞宿主のためによく利用される。

一般的にはＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）、　Ｍｏ１ｅｃ虹７二Ａ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒＭａｎｕａｌ　（第２版）＋　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ ｒ　Ｐｒｅｓｓ　；　Ａｕ５ｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ。

（１９８７及び付録）　Ｃｅｓ＋ｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｌｓユｎ　Ｍｏ１ｅｃｕ ｌａｒ　８ｉｏ１ｏ　、　Ｇｒｅｅｎｅ／Ｗｆｌｅｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　； 及びＰｏｔｒｙｋｕｓ（１９９０＞”Ｇｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｔｏ　Ｃｅ ｒｅａｌｓ：Ａｎ　Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ、’　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 　８　：　５３５−５４２を参照のこと。これらは本明細書に参考として組入れ る。その他の形質転換技術には、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥ−デキスト ラン、マイクロプロジェクチルホンハードｊ　７　ト（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃ ｔｉｌｅ　ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）　、リボフェクシ！ン、マイクロインジェ クション等が含まれる。「形質転換細胞」なる語は形質転換細胞の子孫も含むこ とを意味する。

精製したポリペプチドと同様に、リガンド−結合性セグメント及びＤＮＡ−結合 性セグメントに連結した核酸配列は特に有用である。

これらの遺伝子セグメントは、類似の生物学的活性を示す新しい遺伝子について スクリーニングするためのプローブとして有用であろうが、しかしこれらの遺伝 子のコントロール因子は以下に詳細の通り同等に重要である。

数多くのタンパク質は真核細胞タイプにおいて生産されることが好ましく、その 理由は他の細胞タイプにおける異常なプロセシング又は修飾にある。従って、哺 乳動物タンパク質は哺乳動物細胞培養物において発現されるのが好ましい。所望 のタンパク質の効率的な発現は以下に詳細の通り：　（１）昆虫ステロイドレセ プター題材成分に対するリガンドに応答性のコントロール因子の隣りへの所望の タンパク質コード化ＤＮＡ配列及び適当なプロモーターを置くことでよく達成さ れる。細胞培養物における周期的パルスは、大量の外因性タンパク質の生産の作 用から細胞が回復する期間を提供する。

回復に基づき、このリガンドは再び誘発せしめる。

他のステロイド応答性遺伝子因子も、本発明の技術を利用することによって単離 、例えば実質的に精製された。ステロイド応答性遺伝子コントロール因子に隣接 する、又は作動連結しているその他の遺伝子は、ステロイドレセプターが特異的 に結合するＤＮＡセグメントを見つけること、又は相同コントロール因子とパイ プリダイゼーシテンさせることによって選別できる０例えば、その他のステロイ ド応答性遺伝子が単離された。リガンド一応答性である数多くの遺伝子は昆虫ス テロイドレセプタ一部材の新しいメンバーでもありうる。

実質的に純粋なポリペプチド、その生物学的活性フラグメント及びその遺伝子を 含んで成る組換核酸が提供されたことで、本発明はそれぞれを含んで成る細胞も 提供する。当業界によく知られる適切な導入技術により、これらを含んで成る細 胞が生産されるであろう。

例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）を参照のこと。

特に、ステロイド応答性コントロール因子を含んで成る細胞が提供され、そして 標準のタンパク質コード化セグメントの前記コントロール因子への作動連結は遺 伝子発現のためのステロイド応答性システムを提供する。このようにして作り出 した細胞はしばしば完全生物、例えば植物、昆虫（いも虫及び幼虫を含む）及び 高等動物、例えば哺乳動物の一部となる、又はその中に導入されうる。このこと は、この調節性リガンドがこれらの細胞に何ら作用をもたないときに所望の遺伝 子の調節可能な発現を提供し、その理由はこれらの細胞はこのレセプター及び応 答性遺伝子を欠いているからである。

例えば、適切なりガントの投与によって植物は所望する時期にて実を結ぶように 誘発され、又は動物は特定の生成物の生産にリガンド一応答性となりうる。更に 、事実として、生化学的欠陥は、完全生物に導入された細胞のリガンド応答性発 現によって解消されうる（この生物自身はこのようなりガンどの存在に応答性の 遺伝子を欠いている）。コントロール因子の数多（の繰り返しはしばしば、最低 限の付加的又は相乗作用コントロールをもらたすであろう、このような発現シス テムを含む細胞は人間を含む遺伝子治療法に利用されうる。

十分な量の所望のステロイドレセプターポリペプチドが得られたら、このタンパ ク質はあらゆる目的に有用となる。典型的な利用はステロイドレセプターへの結 合に特異的な抗体の製造である。これらの抗体（ポリクローナル又はモノクロー ナルのいづれか）は試験管内又は生体内技術によって作られるであろう。

ポリクローナル抗体の製造に間しては、適切な標的免疫システム、典型的にはマ ウス又はウサギが選ばれる。実質的に精製された抗原を、動物及びその他のパラ メータに適する免疫学者によく知られている方法によって決定される手法におい て免疫システムに提供する。

注射のための典型的な部位は脚部（ｆｏｏｄｐａｄ）　、筋肉内、腹膜内又は皮 肉である。むろん、その他の種もよくマウス又はウサギに取って代わることがあ る。

免疫学的応答は通常イムノアッセイによりアッセイされる０通常こようなイムノ アッセイは、例えばこの抗原と同一の細胞により同一の方法において作られた抗 原の起源のある程度の精製を含む、このイムノアッセイは一般的にラジオイムノ アッセイ、酵素−結合化アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光アッセイ、又はその他の 任意に選ばれるものであり、はとんどが機能的には同等であるが特定の条件のも とで有利さを示す。

１０１　・Ｍ−１；好ましくは１０９〜ｉｏ”以上の親和性を有するモノクロー ナル抗体は一般に、例えばＨａｒｌｏｅｍ　ａｎｄ　Ｌａｎｅ　（２９８８）＋ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ＋　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ−ｔｏｒｙ　；又はＧｏｄｉｎ ｇ（１９８６）、　Ｍｏｎｏｅｌｏｎａｌ　ｎｔｉｂｏｄｔｅｓ　：　Ｐｒ１ｎ ｃｉ　Ｉｅ　ａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ　（第２版）　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅ ｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋに詳細の通りの標準的方法によって作られる。これら は本明細書に参考として組入れる。

簡単に述べると、適切な動物を選び、そして所望の免疫プロトコールに従う。適 当な時間の経過後、この動物の肺臓を取り出し、そして個々のＷＩｉＮ細胞を一 般的には不死化ミエローマ細胞と適切な選択条件のもとで融合させる。その後、 細胞をクローン化して分け、そして抗原の所望の領域に特異的な適切な抗体の生 産性について各クローンの丘清液を試験する。

その他の適切な技術には、抗原ポリペプチドに対するリンパ球の試験管内暴露、 又はそれに代わるものとして、ファージもしくは類似のベクターにおける抗体の ライブラリーの選別が含まれる。　Ｈｕｓｅら（１９８９）　”Ｇｅｎｅｒａｔ ｉｏｎ　ｏｒ　Ｌａｒｇｅ　Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ　Ｌｉｂｒａｒｙ　ｏ ｆ　ｔｈｅＩ＋ｓｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ　ｉｎ　Ｐｈ ａｇｅ　Ｌａｍｄａ、’　５ｃｉｅｎｃｅ　２４６　＝　１２７５−１２８１　 （本明細書に参考として組入れる）を参照のこと。

本発明のポリペプチド及び抗体は修飾を伴っていても伴っていなくてもよい。し ばしば１、このポリペプチド及び抗体は、共有結合的もしくは非共有結合的に、 検出可能なシグナルを提供する物質が連結されることによってラベル化されうる 。広範囲にわたる種々のラベル及びコンジェゲーシ３ン技術が知られ、且つ科学 及び特許文献の両方において広く報告されている。適切なラベルには放射性核種 、酵素、基質、補助因子、インヒビター、蛍光物質、ケミルミネッセンス、磁性 粒子等が含まれる。このような利用を教示する特許には米国特許第３．８１７， ８３７号；第３．８５０，７５２号；第３．９３９．３５０号；第３．９９６， ３４５号；第４．２７７．４３７号；第４，２７５．１４９号；及び第４，３６ ６．２４１号が含まれる。更に、組換え、キメラ、又はヒトイムグロブリンが作 られうる０例えばＣａｂｉｌｌｙ、米国特許第４，８１６．５６７号；　Ｊｏｎ ｅｓら１９８６、　Ｎａｔｕｒｅ　３２１．５２２−５２６　；及び公開ＵＫ特 許出願第８７０７２５２号（それぞれ本明細書に参考として組入れる）を参照の こと。

精製せしめたレセプターポリペプチドの他の利用は該ポリペプチドの構造的及び 生合成態様の決定に関する。リガンド結合性ドメインと選ばれたりガントとの相 互作用の構造的研究は種々の方法により行われうる。構造決定に関する好ましい 方法はＸｗＡ結晶学であるが、種々のその他の形態の分光学又はクロマトグラフ ィーも含まれうる０例えば、Ｃｏｎｎｏｌｌｙ＋Ｍ、Ｌ−、Ｊ、１．ｃｒ　ｓｔ 　１１．、１６　：　５４８（１９８３）：Ｃｏｎｎｏｌｌｙ、　Ｍル、、　５ ｃｉｅｎｃｅ　２２！　：　７０９　（１９８３）　ｉ及びＢｌｕｎｄｅｌｌ　 ａｎｄ　Ｊｏｂ−ｎｓｏｎ（１９７６）　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｒ　５ｔａｌｌｏ 　ｒａ　ｈ　、＾ｃａｄｅｓｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ；を参照の こと、これらは本明細書に参考として組入れる０例えば、ホルモンリガンドとホ ルモン−結合性セグメントとの相互作用の構成は高分解能上決定されるやこの情 報から、リガンド及びリガンド−結合性セグメントの一方又は両方のわずかな置 換又は修飾は、例えばこれら２者の接触領域に基づいて行われる。この情報はり ガントとその結合セグメン［・間の改質された相互作用を生じせしめ、結合の親 和力を高めるか又は低める、そしておそらくは結合への応答を高める又は低める ことを可能にする。同様に、ジンクフィンガーＤＮＡ−結合セグメントと特定の 核酸−結合性配列との相互作用も同様に改質されうる。

別の及び付加的な手法として、単離せしめたりガント−結合性ポリペプチドドメ インは新しいりガントをスクリーンするために利用されるであろう、結合アッセ イが例えばイムノアッセイと同様に開発されうる。この方法は特定のステロイド レセプターの新しい作動薬又は拮抗薬についてのスクリーニングを可能とする、 単離したＤＮＡ−結合性セグメントが、特定のレセプター−結合性セグメントに 特異的に結合しうる新しいＤＮＡ配列についてのスクリーンのために利用されう る。典型的には、これらのレセプター特異性結合部位はステロイド応答性遺伝子 のためのコントロール因子でありうる。従って、このようなりＮＡ−結合性配列 を単離し得ることにより、一定のレセプターの結合に応答性である遺伝子が単離 できる。

このことは、一定のホルモンレセプターによる誘発又は阻害に応答性である遺伝 子を単離する方法を提供する。

本発明の他のＢ欅において、昆虫成長を阻害する手段が提供され、ここにおいて 新しいりガント作動薬又は拮抗薬が発現された。これらの化合物は正常な昆虫成 長を妨害する作動薬又は拮抗薬としての主要なる候補である。昆虫ステロイドレ セプター松科成分に対するリガンドの新しいステロイド類似体の適用により、発 育現象の正常なる期間順序を改質せしめることが可能である０例えば昆虫成長の 上げること）において非常に重要でありうる。他方、いくつかの害用である。

他の商業的用途において、本発明によって提供される方法により発見されるリガ ンドは紐製造業において利用される。ここで、蚕は絹生産幼虫期に人工的に維持 され、これによって絹生産が長期化される。幼虫の成長は自然よりも短い時間に おいて紐生産へと加速させるのに対して感受性ともなりうる。

昆虫ステロイドレセプター松科成分に対するその他のりガントの類似体が選ばれ ることができ、適用に基づき、これは正常な成長を完全に阻害する、更には好ま しく死をもたらしめる。わずかに改質せしめた天然物質はしばしば作用のより高 い特異性及びより高い活性を有し、低レベルでの通用な可能にする０例えば、よ り親水性のりガントはより容易に昆虫の表面又はキューティクルに直接的に吸収 される。従って非常に低い濃度の天然りガントが害虫のコントロールに有効であ ろう、更に、数多くのこのようなりガントは酵素的生産方法を取ることで比較的 容易に製造される。昆虫ステロイドレセプター松科成分に対する新しいりガント は時折りより種特異的であるか、又は特に有用な特性、例えば特定の有害な昆虫 に致死的であることを示しうる。ホルモンの高い特異性は、所望されない悪い生 態学的副作用（例えば人間に悪影響をしばしば有する食品における殺虫剤残留堆 積）を有する非特異的な殺虫剤の利用をなくすことを可能にする。更に、天然化 合物に非常に類似する構造を有する化合物は生物学的分解の天然のメカニズムに 対して感受性であろう。

本発明の他の！ｌ様は、昆虫ステロイドレセプター松科成分に対するリガンドに 応答性である新しい遺伝子セグメントの単離又はデザインを提供する０例えば、 標準的な技術による相同配列についてのスクリーンのための核酸の利用は類似の 構造特徴を有する遺伝子を提供するであろう、＊ｍに並んだイントロン構造は一 般に広い題材の分類の特徴でありうる。スクリーニングのための好ましいドメイ ンはりガント−結合性又はＤＮＡ−結合性セグメントでありうるが、しかしなが ら、ＤＮＡ−結合性ドメインにより認識されるＤＮＡセグメント、即ち、コント ロールセグメントも特別なる対象でありうる。新しいコントロール因子について のスクリーニングは通常類似性、例えばその他の知られている因子に対する相同 性、又はその他のレセプターのＤＮＡジンクフィンガー結合性部位に対する相同 性を利用する。一般的な発育上の発現の配列におけるレセプター及び遺伝子の重 要性が発見されうる。この一連の発育上の調節された遺伝子の利用は、発育上の ｔＪＩＷｉされた遺伝子の発現をコントロールするのに重要な特定の分子の選別 を可能にする。

ここで提供する核酸及びタンパク質の発現レベルの測定のためのキットが有用と なる。典型的には、このキットは所望の標的分子、例えばりガント類似体、レセ プター又は核酸に特異的に結合する試薬を含む少な（とも１つの区分を有しうる 。これらの試薬はアッセイに関する技術、例えばスクリーニングプロトコールに おいて典型的に利用される方法において利用されうる０例えば５ａａｂｒｏｏｋ ら（１９８９）及びＡｕ５ｕｂｅｌら（１９８７及び付録）を参照のこと。

以下の実験の章は例示のために提供し、限定を意味するのではない。

ス−」１ スＪＩＬＬ ステロイドレセプター超群の２種類の成分をコードするシタウジゴウバエＥ７５ 遺伝子のクローニング構造及び発現以下の実験はＥ７５遺伝子がステロイドレセ プター超群の２種類の成分をコードすることを実証する。これがコードするタン パク質はこの超群の保存されたＤＮＡ−結合性及びリガンド−結合性ドメインと 相同性のアミノ酸配列を共有する。Ｅ７５遺伝子はエクジソン−誘発性であり、 そしてこれはショウジヨウバエ多糸染色体における７５Ｂ遺伝子座でのエクジソ ン−誘発性初期型パフを支配且つ生じせしめる。

Ａ　エクジソン−７５Ｂパフ゛　−１むゲノムＤＮＡのクローニング ７５Ｂパフ領域を含むゲノムＤＮＡを単離するために我々は染色体歩行の方法を 利用した（Ｂｅｎｄｅｒ、Ｗ、、　Ｐ、５ｐｉｅｒｅｒ　ａｎｄ　Ｄ、Ｓ、ｌＩ ｏｇｎｅｓ。

１９８３、　Ｃｈｒｏｍｏｓａｌ　ｗａｌｋｉＢ　ａｎｄ　ｊｕ＊ｐｉＢ　ｔｏ 　１ｓｏｌａｔｅ　ＤＮＡ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅＡｃｅ　ａｎｄ　ｒｏｒｙ　ｆｏ ｃｉ　ａｎｄ　ｔｈｅ　Ｂｉｔｈｏｒａｘ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｉｎ　７ｍｅｌａ ｎｏ　ａｓｔｅｒ、　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１６８　：　１７−３３Ｌ歩行に 関する出発点はλ８２５３と称するゲノムクローンであり、これは７５Ｂの末端 付近に対するｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼーシヨンにより見つけられた。

単離せしめたλ８２５３の制限フラグメントをキイロショウジゴウバエのカント ン（ｃａｎｔｏｎ）　Ｓ　（Ｃ’　）株からゲノムＤＮＡのライブラリーをスク リーンするために用いた＠　（Ｍａｎ＋ａｔｉｓ＋Ｔ、＋　Ｒ−Ｃ，■ａｒｄｉ ｓｏｎ、Ｅ、Ｌａｃｙ、　Ｊ、Ｌａｕｅｒ、　Ｃ，０’Ｃｏｎｎｅｌｌ、　Ｄ、 Ｑｕｏｎ、　Ｇ、に、Ｓｔｓ、　ａｎｄ　Ａ、Ｅｆｓｔｒａ−ｄｉａｔｘｓ、１ ９７８ｔ　“Ｔｈｅ　１ｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　５ｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｇｅ ｎｅｓ　ｆｒｏｍ　１ｉｂｒａ−ｒｉｅｓ　ｏｆ　ｅｕｃａｒｙｏｔｉｃ　ＤＮ Ａ、”堕旦１５　：　６８７−７０１）を参照のこと、ゲノムクローンλｃ　Ｄ ｍ３５０４及びλｃＤｍ３５０５はλ８２５３に対する相同性によって単離した 。

この歩行を次に両方向において〜１００ｋｂのゲノムＤＮＡが単離できる迄広げ 、そしてこの歩行の向きを多糸染色体への末端セグメントの圏　■包ハイプリダ イゼーシジンによって調べた。その後、この歩行を分子地図の右側方向又は動原 体に対して離れて広げた。

この歩行により囲まれる３５０ｋｂのゲノムＤＮＡはｉｎ　５ｉｔｕハイブリダ イゼーシゴンににより謂べられた通り、７５Ａ６−７と７５８１１−１３の間の 染色体領域に相当する。この領域は７５Ｂパフを含み、これは染色体バンド７５ Ｂ３−５の同時凝集開放（ｄｅｃｏｎｄｅｎ−ｓａｔｉｏｎ）により開始され、 次いで周辺のバンドに広がると考えられる。

方−抜 °ツムＤＮＡライブラリー カントンＳゲノムＤＮＡを、Ｃｈａｒｏｎ　４λフアージベクターの中へとクロ ーンされた、せん断された、ＥｃｏＲＩ・連結されたカントンＳ　ＤＮＡのライ ブラリーから単離した＊　（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、、　Ｒ，Ｃ。

Ｆｌａｒｄｉｓｏｎ、Ｅ、Ｌａｃｙ、Ｊ、Ｌａｕｅｒ、Ｃ，Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ 、ロ、Ｑｕｏｎ、Ｇ、に、Ｓｉｍ、ａｎｄＡ、Ｅｆｓｔｒａｄｉａｔｉｓ、１９ ７８．　Ｔｈｅ　１ｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　５ｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｇｅｎｅ ｓ　ｆｒｏｍｌｉｂｒａｒｉｅｓ　ｏｆ　ｅｕｃａｒｙｏｔｉｃ　ＤＮＡ、　Ｃ ｅ１ｌ　１５　：　６８７−７０１）を参照のこと。

ＯｒゲノムＤＮＡは５ｅｐ５λベクターにＣＣ−テールされた、せん断されたＤ ＮＡのライブラリーから単離した。　（Ｍｅｙｅｒｏｗｉｔｚ＋Ｆ、Ｍ、＋ａｎ ｄ　Ｄ、Ｓ、Ｈｏｇｎｅｓｓ＋　１９８２．”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｏｒｇａｎ ｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　敗並並ｕ圏ｐｕｆｆ　５ｉｔｅ　ｔｈａｔ　ｒｅｓ ｐｏｎｄｓ　ｔｏ　ｅｃｄｙｓｏｎｅ、’　Ｃｅ１ｌ　２８　：　１６５−１７ ６）を参照のこと、染色体歩行における一つの段階は、ｌ５ｈ−Ｈｏｒｏｉ＋ｉ ｃｚ及びＢｕｒｋｅの方法による、ニスミドＰ　１４　Ｂ　！−・とクローン化 された５ａｕｌ［［Ａ部分消化したＯ’　ＤＮＡのニスミドライブラリーを用い て行った。　（Ｉｓｈ−）１ｏｒｏｗｉｃｚ、Ｄ、、　ａｎｄ　Ｊ、Ｆ、Ｂｕｒ ｋｅ＋　１９８２．　ｌ１ａｐｉｄａｎｄｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｃｏｓｍｉｄ　 ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｎｕｃ　ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、９　：　２９８９−２ ９９８）を参照のこと。

ｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼ一シゴン多糸染色体へのｉｎ　５ｉｔｕハイブリ ダイゼーシゴンはＢｏｎｎｅｒ　及びＰａｒｄｕｅに詳細の通りに、　（Ｂｏｎ ｎｅｒ、Ｊ、Ｊ、＋　ａｎｄ　Ｍル、Ｐａｒｄｕｅ、　１９７６゜Ｅｃｄｙｓｏ ｎｅ−ｓｔｉｓｕｌａｔｅｄ　ＲＮＡ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｉｎ　ｉｍａｇｉ ｎａｌ　ｄｉｓｃｓ　ｏｆ　Ｄｒｏ−杢」とρ力ｊ二１ｐ１ｍｅｌａｎｏ　ａｓ ｔｅｒ、Ａｓ５ａｙ　ｂｙ　ｉｎ　５ｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、Ｃ ｈｒｏ−ｍｏｓｏｍａ　５８　：　８７−９９）　’　Ｈ−ラベル化ＴＴＰ　（ ＮＥＮ）の存在下においてニンクー翻訳されたＤＮＡプローブを用いて行い、こ の方法は以下の改良を伴ったニスライドの加熱及びＲＮＡａ　ｓ　ｅ処理は省き 、そしてハイブリダイゼーシヨン及び洗浄は２×の５ＳＰＥ中で６３℃にてそれ ぞれ１８及び２時間にわたって行った。

Ｂｏ、互ｌ四ＬｚｚニーＷ　に・して　の配　８１どとシュン　ゲノムＤＮＡの ５０ｋｂの　の 上記のゲノムクローンの制限フラグメントを、一方がエクジソン−誘発化細胞に おけるＲＮＡに由来し、そして他方が誘発していないＲＮＡに由来する２種類の ｃＤＮＡプローブそれぞれにハイブリダイズするその能力について調べた。二通 りの別々のスクリーンを行った。第１に、３５０ｋｂの歩行全体を覆うゲノムＤ ＮＡを、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡにアニールせしめたオリゴ（ｄＴ）プライマーより 逆転写酵素によって合成したｃＤＮＡプローブを用いて調べた。このポリ（Ａ） ＋ＲＮＡは後期第三齢幼虫からマス（ｍａｓｓ）単離せしめた全内部組織から調 製し、そしてエクジソンとシクロへキシミド、又はシクロへキシミドのみの存在 下においてインキュベートした。

その存在により高いレヘルのエクジソン誘発転写体が堆積するからである。） これらの２種のポリ（Ａ）＋ＲＮＡにより作った５ｚｐ−ラベル化ｃＤＮＡプロ ーブをそれぞれ、歩行由来のゲノムフラグメントの他にリポソームタｄ　土ユ遺 伝子（０’ＣｏｎｎｅｌＩ、Ｐ、、　ａｎｄ　Ｍ、Ｒｏｓ−ｂａｓｈ、　１９８ ４．５ｅｑｕｅｎｃｅ＋　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｃｏｄｏｎ　ｐｒｅｆ ｅｒｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ紅並並肚ｎｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ト鄭長担４９　ｇ ｅｎｅ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１２：５４９５−５５１３ ）由来の配列より成るコントロールＤＮＡを含む２通りのデュブリケートサザン プロットの１つに適用した。コントロールＤＮＡは二重測定プロットのハイブリ ダイゼーシぢン強度を標準化するために用いた。このスクリーンは、分子地図上 の約＋２２０ｋｂにあるλｃＤｍ３５２２ゲノムクローン内においてのみエクジ ソン−誘発ＲＮＡに特異的な配列を示した。

上記のプローブはＲＮＡの３′末端付近の配列を好適に検出するため、特に長い 転写体のケースにおいては、ランダムヘキサマーとプライムしたｃＤＮＡプロー ブにより第２の別のスクリーンを行う（以下の方法を参照のこと）、＋１０５ｋ ｂと＋１７０ｋｂＯ間の１３５ｋｂのゲノムＤＮＡに制限されたこのスクリーン は、＋１７０ｋｂと＋１７０ｋｂＯ間の〜５０ｋｂ０）ｌ域にわたって広がるフ ラグメントにおいてエクジソン−誘発性配列を示した。この領域はＥ７５遺伝子 後期第３齢のＯｒ′幼虫を集め、０．７％のＮａＣ１中で洗い、Ｒｏｂｂのリン ｆＩ緩衝食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ　）　（Ｒｏｂｂ、Ｊ、Ａ、、　１９６８．　Ｍａ ｉｔｅｎａｎｃｅｏｆ　ｉｓａｇｉｎａｌ　ｄｉｓｃｓ　ｏｒ　Ｄｒｏｓｏ　ｈ ｉｌａ　ｍｅｌａｒ＋ｏ　ａｓｔｓｒ　ｉｎ　Ｃｈｅｍｉｅａｌｌｙｄｅｆｉｎ ｅｄ　５ｅｄｉａ、　Ｊ、Ｃｅ１１．　ｉｏｌ、　４１　：　８７６−８８５） に懸濁し、ブレンダーで予備的に空気を吹き込み、そして器官を押し出すために 一連のローラーに通過させた。この「破砕物」を粗いＮ　ｉ　ｔｅｘスクリーン で濾過して残がいを除去し、次いで５分間静！して重力によって浮遊物と微細な 細胞塊を除去した。単離せしめた！ｌ１ｌｌ　ｃ主としてだ液腺、成虫盤（ｄｉ ｓｃ）、腸及びマルビーギ管）をプラスチック製ベト９皿の中の空気を吹き込ま せたＲｏｂｂＯＰＢＳ中で２５℃で培養した。エタノール中のβ−エクジソン（ Ｓｉｇｍａ）　（１０ｍｇ／ｍｌを０　、　２　ｕ　１　／ｍｌ）及び／又は水 の中のシクロへキシミド（３５ｗＭを２μｉ／ｍｌ）を適当な培養物に加えた。

シクロヘキシミドの存在下におけるインキエベーシッンは〜８時間とした。単離 せしめた組織を１０容量の６Ｍのグアニジン−ＭＣＩｌｏ、６Ｍの酢酸ナトリウ ム（ｐＨ５，２）の中でホモナイズし、細胞塊を除くために５０００ｇで１０分 間遠心し、そして５．７ＭのＣａＣ１層に載せた。これは（Ｃｈｉｒｇｗｉｒ＋ 、　Ｊ、Ｍ、　。

＾、Ｅ、Ｐｒｚｂｙｌａ、Ｒ，Ｊ、？１ａｃＤｏｎａｌｄ、ａｎｄ　Ｗ、Ｊ、Ｒ ｕｔｔｅｒ、１９７９．　１ｓｏｌａｔｉｏｎｏｆ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ 　ａｃｔｉｖｅ　ｒｉｂｏｎｕｅｌｅｉｅ　ａｃｉｄ　ｆｒｏｍ　５ｏｕｒｃｅ ｓ　ｅｎｒｉｃｈｅｄｉｎ　ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ、旦１匹触紅１ｕ１８　 ：　５２９４−５２９９）に詳細されている。

ポリ（Ａ）＋ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）クロマトグラフィーにより精製した。

二ゴクフ３ししＦ止梶 ちザンブロントをニトロセルロース上で行った。これは（Ｓｅｇｒａｖｅｓ、１ １．Ａ、、　Ｃ，Ｌｏｕｉｓ、　Ｓ、Ｔｓｕｂｏｔａ、　Ｐ、５ｃｈｅｄｌ、　 Ｊ、Ｍ、Ｒａｗｌｓ、　ａｎｄ　Ｂ、Ｐ。

Ｊａｒｒｙ、１９８４．　Ｔｈｅ　ｒｕｄｉｍｅｎｔａｒｙ　１ｏｃｕｓ　ｏｆ 　、ｐコニ９」す２ｓす□　！１≧１工２−１９盈旦１ｔｅ秩B Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　１７５　：　１−１７）に詳細されている。ｃＤＮＡ プローブを、２ｐｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡと７００ｎｇのオリゴ（ｄＴ）”−” （Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）又は１５μｇのランダムヘ キサマーの、８０ｍＭのトリスＣｌ　（ｐＨ８，３，４２°Ｃ）、１０ｍＭのＭ ｇＣ１ｇ。

１００＋ｍＭのＫＣＩ、０．４ｇＭのＤＴＴ、それぞれ０．２５ｍＭのｄＡＴＰ 、ｄＧＴＰ、及びｄ　ＴＴ　Ｐ、並びに１００μＣｉの（０ｐ）ｄ　ＣＴＰ　（ ８００Ｃｉ１モル；　Ａｍｅｒｓｈａｍ）を含む２０ａ　ｌの反応混合物中での 逆転写（ＡＭＶ逆転写酵素；　Ｓｅｉｋａｇａｋｕ）によって調製した。

３７℃で４５分間インキュベートした後、１０ｍＭのＥＤＴＡ　８０μｍ及び５ ＮのＮａＯＨ２μｍを加え、次いでこの生成物を変性且つＲＮＡを加水分解する ために７０℃で１０分間インキュベートした。ＬＭのトリス−ＣＩ　ＣｐＨ１， ５）１０μｌ及びＩＮのＨＣｌ５μｌを加えた後、取り込まれなかったラベルを Ｂｉｏｇｅｌ　Ｐ　６０でのクロマトグラフィーにより除去した。

Ｃ，２つの重　転　ユニット：Ｅ７５Ａ　びＥ７５Ｂをユ旦ユ五１猛王 上記の通りに調製し、そしてＥ７５遺伝子を含む６０ｋｂの領域（＋　１６６〜 ＋２２６ｋｂ）におけるクローン化制限フラグメントに由来する饋−特異性ＤＮ Ａプローブとハイブリダイズせしめたエクジソン誘発化及び誘発されていないＲ ＮＡのノーザンプロット分析は、この遺伝子が２１ｉ１ｆのクラスのユクジソン ー誘発性ｙｚ＋ＲＮＡを提供することを示し、両方とも右方向転写に由来してい た。このＥ７５ＡクラスのｍＲＮＡは５０ｋｂのＥ７５遺伝子の５′　（左側） 及び３′　（右（！ｌ）末端の両方からプローブとハイブリダイズする。

Ｅ７５Ｂクラスは３′−近位の２０ｋｂの遺伝子からのみプローブとハイブリダ イズした。これらの結果は、Ａ及びＢクラスのエクジソン−誘発性ＲＮＡは、約 ３０ｋｂｊ！Ｉれて位置する異なるプロモーターによって開始され、そしてこれ らのプロモーターにより規定される２つの転写ユニットがＢプロモーターから下 流の領域において重複していることを示唆した。

このような考察はＥ７５Ａ及びＥ７５Ｂ　ｍＲＮＡからのクローン化ｃＤＮＡの 構造の分析によって確認された。初期さなぎｃＤＮＡライブラリーからの約１０ ’個のクローン（Ｐｏｏｌｓ、Ｓ、Ｊ、、　Ｌ、Ｍ、Ｋａｕ−ｖａｒ、　Ｂ、Ｄ ｒｅｅｓ、　ａｎｄ　Ｔ、Ｋｏｒｎｂｓｒｇ＋　１９８５．　Ｔｈｅ　ｅｎｇｒ ａｉｌｅｄ　ｆｏｃｕｓ　ｏｆ９Ｌ隻ジλＲｈ１１且：　５ｔｒｕｃｔｕｒａｌ 　ａｎａｌｙｓｔｓ　ｏｆ　ａｎ　ｅｓｂｒｙｏｎｉｃ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ 。

並置４０　：　３７−４０）を、Ｅ７５遺伝子領域由来のゲノムＤＮＡプローブ により低分解能にてスクリーンした。このスクリーンにより同定された１１６種 のｃＤＮＡクローンを制限消化及び６　ｏｋｂ　ｃ＋１６６〜＋２２６ｋｂ）領 域に由来するプローブのパネルへのハイブリダイゼーシヨンによって分析した。

これらのクローンのうちの一種、λＤｍ４９２５をＥ７５ＡクラスのｍＲＮＡの 代表としてこれによって選び、そして他のλＤｍ４７４５をＥ７５Ｂ　ｎｎＲＮ Ａクラスの代表として選んだ。

これら２種のｃＤＮＡクローンに相同性のゲノム領域がサザンプロット分析によ って更に見つけられ、そしてこの領域及び両ｅＤＮＡクローンのヌクレオチド配 列を調べた。これらの配列を、各転写ユニツＩ・についての５′及び３′末端配 列決定に由来するそれらと一緒に表１に記載した。これらのデーターはこの５０ ｋｂ　Ｅ７５Ａ転写ユニットが５′から３′の順で６つのエキソン、即ち、ＡＯ 。

ＡＩ、２，３．４及び５より成ることを示し、ここでエキソンＡＯ及びＡＩはこ のユニットに特異的であり、そして残り４つは２０ｋｂのＥ７５Ｂ転写ユニット と共有されている。同様に、Ｅ７５Ｂユニットは特異的なエキソン（Ｂｌとラベ ルする）をその５′末端に含み、これは共有されているエキソン２のすぐ上流に 位置する。従って、Ｅ７５遺伝子は２個の転写ユニットより成り、そのうちの短 めのＥ７５Ｂユニットは２０ｋｂの長めのＥ７５Ａユニットの３′近位を占めて いる。

表１゜Ｅ７５エキソン及びフランキングＤＮＡの配列、この配列はＣ３ゲノムＤ ＮＡの配列であり、これはこのｃＤＮＡのそれと同一であるが、Ｔ−Ｇ変化が位 ！＋２６９１にて示されている。この変化はタンパク質配列におけるロイシンを アルギニンに変える。

Ｄｍ４９２５　ｃＤＮＡはＡにおける＋９３９〜＋４２６７でのＥｃｏＲＶ部位 の５′から広がる。Ｄｍ４７４５　ｃＤＮＡはＢにおける＋８０４からＡにおけ る＋４２４６のＨｉｎｄｌ［［部位に近い点迄広がる。（Ａ）Ｅ７５Ａエキソン 及びフランキングＤＮＡ。

ＡＯ，Ａｌ及び共通エキソン２−５の配列はイントロン配列（手交での共通配列 と一致する。各列の右端の負の数字はＥ７５Ａ開始部位の上流の塩基対の数を意 味し、正の数字は３′フランキングＤＮＡへと続＜Ｅ７５Ａ　ｍＲＮＡにおける 位置を示す、各列の左端の数字はＥ７５Ａタンパク質におけるアミノ酸残基に関 する。下線の引かれた−１５９〜−１７２の１４ｂｐの配列は、７４ＥＦでの初 期型パフにとって重要な、エクジソン−誘発性Ｅ７４Ａ転写ユニツトの４７ｂｐ 上流に見い出せる配列（ＣＧＴＡＧＣＧＧＧＴＣＴＣ）に１３／１４ｂｐの対合 を示す、この配列は、キイロシシウジョウバエ　ゼステ遺伝子によりコードされ るタンパク質に結合するＥ７４Ａプロモーターにおける１９ｂｐ配列の近位部分 を示す、−７４〜−８２のＥ７５Ａプロモーターにおける他の下線配列もＥ７５ Ｂプロモーターにおいて見い出され、これはＢにおける−１０６〜−１２１に位 置する直列に反復したオクタヌクレオチド（ＧＡＧＡＧＡＧＣ）の一部である。

この反復は、Ｅ７４Ａプロモーターとも結合するＧＡＧＡ転写因子の結合部位に 関する共通配列と対合する。その他の下線配列は、−２７〜−３３にて適切な位 置で共通のＴＡＴＡボックスとの最良の対合、Ｅ７５ｍＲＮＡの５′−リーダ配 列におけるフレーム内停止コドンが接近して続く３つのＡＵＧコドン、及びＥ７ ５Ａ及びＥ７５ＢｍＲＮＡ両方によって利用される４５９１及び５３６５での択 一的なポリアデニル化切断シグナルを示す、（Ｂ）Ｂｌエキソン及びその５′− フランキングＤＮＡ、列の右及び左端での数字はＡにおけるのと同一の意味を有 する。Ａにおいて示すエキソン２−５はＥ７５Ｂにおいて利用されているが、Ａ において示すアミノ酸残基及び塩基対数をＥＴ５Ｂタンパク質及びｍＲＮＡに適 用するにはそれぞれ１７５個及び３７５対増加させねばならない、Ｂ１エキソン をエキソン２に連結させる１３６−ヌクレオチドＥ７５Ｂ−イントロンの最初の １０個のヌクレオチドはｇｔａｇｇｔｔａｇであり、そして最後の１０個はＡに おけるヌクレオチド１１７８の上流を示す、下線の配列は順に、Ｂ７５Ａの上流 の配列に相同性の領域、前記した通り、−２１〜−２７での共通のＴＡＴＡボッ クスへの最良の対合、及びＢ７５ＢｍＲＮＡの５′−リーダーにおけるフレーム 内停止コドンが続く３つのＡＵＧコドンを示す。

パネルＩ及び２をパネル３−８及び９−１０においてそれぞれ詳しく示す。

カニ」友 工」はＬ配孟イ１謬ＬＬ＝ λＤｍ４９２５及び１０ｍ４７４５　ｃＤＮＡをλｇｔｌｏにおけるＯｒ初期さ なぎｃＤＮＡライブラリー（Ｐｏｏｌｅ、Ｓ、Ｊ、、　Ｌ、Ｍ、Ｋａｕ−ｖａｒ 、　Ｂ、Ｄｒｅｅｓ、　ａｎｄ　ＴＪｏｒｎｂｅｒｇ、　１９８５．　Ｔｈｅ　 ｅｎｇｒａｉｌｅｄ　ｆｏｃｕｓ　ｏｆ旦Ｌ９旦立Ｅｈ１１且：　５ｔｒｕｃｔ ｕｒａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａｎ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｔｒａｎｓｃ ｒｉｐｔ。

Ｃｅ１ｌ　４０　：　３７−４０）から単離した。３′末端地図化のために用い る２種のｃＤＮＡ（λＤｍ４９２７及び１０ｍ４９２８）をＣ，’ｔ４．Ｊｏｎ ｅｓにより調製されたλ６０７におけるエクジソン−誘発化だ液腺ｃＤＮＡライ ブラリーから単離した（これらの試験において用いたｃＤＮＡクローンに関する 我々の株コレクション名はλｆ　０ｍ４９２５゜λｆ　Ｄｍ４７５．　λｅＤｍ ４９２７及びλｅＤｍ４９２８である）。

ノーザンプロット ノーザンプロット分析のために用いたプローブを、ｐＢＲ３２２のＨｉｎｄｌｌ ［とＢａｍＨ１部位の間にクローンせしめたφＸ１７４複製起点を含むベクター ｐφＸにクローンせしめた。このことは−末鎖プローブＤＮＡの合成を可能とし くＡｒａｉＪ、、　Ｎ、Ａｒａｉ、　Ｊ、Ｓｃｈｌｏ−ｍａｉ、　ａｎｄ　Ａ、 ｌ（ｏｒｎｂｅｒｇ＋　１９８０．　Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｕｐｌ ｅｘ　ＤＮＡ　ｏｆ　ＰｈａｇｅφＸ１７４　ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ　ｗ ｉｔｈ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｅｎｚｙｍｅｓ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

をＩニア７　：　３３２２−３３２６）　、これはスーパーコーイルブラスミド ＤＮＡを遺伝子Δ９ｙバＬ！、ｒｅｐ及びｓｓｂタンパク質、並びにＤＮＡポリ ポリーゼ■ホロ酵素と、２０ｍＭのトリスＣ１（ｐＨ７，５）、８０μｇ／ｓｌ のＢＳＡ、４％のグリセロール、２０−ＭのＤＴＴ、１ｗＭ（７）ＡＴＰ、１６ ｗＭ濃度の３種類未標識デオキシヌクレオチド及び１．６ｍＭ１度のラベル化デ オキシヌクレオチドを含む反応液において９０℃で１時間インキュベートするこ とによって行った。次にＥＤＴＡを２０−Ｍとなるように、ＳＤＳを０．１％と なるように、そしてプロテナーゼＫを５０μｇ／鴎Ｉとなるように加えた。この 反応物を３７°Ｃで３０分間消化せしめ、そして取り込まれなかったラベルをゲ ル濾過により除去した。

Ｓ１ヌクレアーゼ　びプライマー φＸ試験管内複製システムによって前記の通りに調製した一本領ブローブをＳ１ プローブとして用いるため、低融点アガロースゲルでの電気泳動によって精製し た。その他のプローブ全ては一本饋Ｍ　１３　ｍ　Ｐ　（Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、 、　１９８３．　Ｎｅｗ　Ｍｌ３　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｆｏｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｂｎｚ　ｍｏｌ、　１０１　：　２Ｏ−７８）又はｐＥＭＢＬ （Ｄｅｎｔｅ、Ｌ、、　Ｇ、Ｃｅ５ａｒｅｎｉ。

ａｎｄ　Ｒ，Ｃｏｒｔｅｓ、１９８３．　ｐＥＭＢＬ　：　Ａ　ｎｅｗ　ｆａｍ ｉｌｙ　ｏｆ　ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄｐｌａｓｍｉｄｓ、　Ｎｕｃｌ ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１１　：　１６４５−１６５４）岨換え鋳型に 基づいて、３ＺＰ−ラベル化ヌクレオチドを用いる−２０．１７−ｍａｒシーケ ンシングブライマー（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）の伸長、その 後の適切な制限酵素による切断、次いで変性ポリアクリルアミドゲルでのこれら のプローブの精製によって調製した。ラベル化プローブ（１００，０００−３０ ０，０００ｃｐｓ）を、５ｌｇの酵母ｔＲＮＡ。

０．４ＭのＮａＣ１，４０ｗＭのＰ　Ｉ　ＦＥＳ　（ｐＨ６，８）及び１ｓ＋Ｍ のＥＤＴＡを含む５μＩの反応混合物中で６０℃にてオイルのもとでポリ（Ａ） ＋ＲＮＡ　１ｌｇとインキュベートした。反応物を冷やし、そしてＳ１消化又は プライマー伸長緩衝液のいづれかに１：１０で希釈した。Ｓ１ヌクレアーゼ消化 は５０１Ｍの酢酸緩衝液（Ｎａ）、４００ｍＭのＮａＣ１及び４１のＺｎＳＯｓ 中で２０℃にて１時間、５０．［／Ｉの反応物当り〜１５　１５０Ｖｏｇｔ単位 のＳ１ヌクレアーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）によって行った。プライマー伸長 は５０＋＊ＭのトリスＣ１（ｐＨ８，３，４２℃）、８０■ＨのＫＣＩ、２ｗＭ のＤＴＴ、１■バのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ中で、５０μｌ の反応物当り２０単位のＡＭＶ逆転写酵素（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ）によって行っ た。反応をＥＤＴＡの添加により停止させ、ｔＲＮＡ担体を５１ヌクレアーゼ消 化物に加え、そしてサンプルをエタノール沈殿させ、そして５％もしくは６％の 変性ポリアクリルアミドゲル上で直接電気泳動させるか、又はグリオキシル化せ しめ（ＭｃＭａｓｔｅｒ、Ｇ、に、。

ａｎｄ　Ｇ、Ｃ，Ｃａｒｖｉｃｈａｅｌ、　１９７７、　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏ ｆ　ｓｉｎｇｌｅ　ａｎｄ　ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎ−ｄｅｄ　ｎｕｃｌｅｉ ｃ　ａｃｉｄｓ　ｏｎ　ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｓｉｄｅ　ａｎｄ　ａｇａｒｏｓ ｅ　ｇｅｌｓ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇｇｌｙｏｘａｌ　ａｎｄ　ａｃｒｉｄｉｎｅ　 ａｒａｎｇｅ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　７４　：　４８３ ５−４８３８）　、そして１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐｌ’！６．　 ８）中で流す１％のアガロースゲルで電気泳動した。

旦凡人ｙ剋分灰 ｃＤＮＡクローンλＤｍ４９２７及び１０ｍ４９２８を化学分解によってシーケ ンス化した（Ｍａｘａｓ＋Ａ、Ｍ、、　ａｎｄ　Ｗ、Ｇ１１ｂｅｒｔ、　１９８ ０゜Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｅｎｄ−１ａｂｅｌｅｄ　ＤＮＡ　ｗｉｔｈ　ｂａ ｓｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｌｅａ−ｖａｇｅ、　Ｍｅｔｈ ｏｄｓ　Ｅｎｚ　＋ｇｏ１．６５　：　４９９−５６０）　＊他の全てのシーケ ンシングはジデオキシヌクレオチド鎖停止法を用いて行った（Ｓａｎｇｅｒ、　 Ｆ、　。

＾、Ｒ，Ｃｏｕｌｓｏｎ、　Ｂ、Ｆ、Ｂａｒｒｅｌｌ、　Ａ、Ｊ、Ｈ，５ｓｉｔ ｂ、　ａｎｄ　Ｂ、Ａ、Ｒｏｅ、　１９８０゜Ｃｌｏｎｆｎｇ　ｉｎ　ｓｉｎｇ ｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ　ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ　ａｓ　ａｎ　ａｔｄ　 ｔｏ　ｒａｐｉｄＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　 １４３　：　１６１−１７８）　ａフラグメントをＭｌ　３ｍｐベクター（Ｍｅ ｓｓｉｎｇ＋Ｊ、＋　１９８３．　Ｎｅｗ　［１３ｖｅｃｔｏｒｓ　ｆｏｒ　ｃ ｌｏ−ｎｉｎｇ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ　ｔｏ２．１０１　：　２Ｏ−７８ ）又はｐＥＭＢＬ　（Ｄｅｎｔｅル７．Ｇ。

Ｃｅ５ａｒｅｎｉ、ａｎｄ　Ｒ，Ｃｏｒｔｅｓｔ　１９８３．　ｐＥＭＢＬ　： 　Ａ　ｎｅｗ　ｆａｍｉｌｙ　ｏｆ　ｓｔｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ　ｐｌａ ｓａｉｄ＋、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１１　：　１６４５− １６５４）の中にクローンし、そして直接又はエキソヌクレアーゼ■を用いる一 連の重複欠失を作り上げた後に（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｓ、、　１９８４．　Ｌｌ ｎｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｅｘｏｏｕｃｌｅ ａｓｅ　ＩＩＩ　ｃｒｅａｔｅｓ　ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔｓ ｆｏｒ　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、　Ｇｅｎｅ　２８　：　３５１−３５ ９）　シーケンス化した。シーケンシングはλＤｍ４９２５　ｅＤＮＡの両方の 饋、λＤｍ４７４５クローン内で示されているゲノム領域は一本鎖に基づいてシ ーケン這汰王 Ｂ７５Ａ及びＢ　ｍＲＮＡをコードする及びコードしない配列、そのスプライス 連結部、並びに５′及び３′フランキング配列を表１に示す、５′フランキング ＤＮＡ及び５′リーダーｍＲＮＡにおける潜在的に注目する一定の配列を表１の 解説において示した。我々はＢ７５Ａ及びＢ　ｍＲＮＡの大きなオーブンリーデ ィングフレームに注目し、これは対応のｍＲＮＡ開始部位から３８０ｂｐ及び２ ８４ｂｐ下流にて始まり、それぞれ共通の最終エキソンへと続く。

エキソン５における終止コドンは両方の択一的なポリアデニル化部位の上流に横 たわる。従ってこのコード化タンパク質の配列は選択する部位によって影響され ない、Ｅ７５Ａ及びＢ　ｍＲＮＡにおけるオーブンリーディングフレームはＡＯ 及びＢ１エキソンから始まり、そしてエキソン２の始まりにて融合するため、こ の２種の転写ユニットによりコードされるタンパク質はそのアミノ−末端領域に おいて異なり、そしてカルボキシ−末端領域において同じである。

特定のアミノ−末端領域はＢ７５Ａ及びＢタンパク質においてそれぞれ２６６及 び４２３個のアミノ酸残基を含み、そしてそれらの共通カルボキシ−末端領域は ９７１個の残基より成る。Ａ及びＢタンパク質の推定分子量は従って１３２，０ ００及び１５１，０００である。オーブンリーディングフレームは特徴的なキイ ロショウジョウバエコドン利用を示し、そしてそれらの範囲はｃＤＮＡ構遺体由 来の試験管内転写したｍＲＮＡの試験管内翻訳及び旦、ユニにおける融合タンパ ク質の発現によって確認された。各タンパク質についての推定タンパク質配列は アミノ酸のホモポリマー区分により区切られ、これは表１及びその解説に示して いる。

Ｅ７５タンパク質の配列の分析及び既知タンパク質配列との比較はＥ７５タンパ ク質とステロイドレセプター題材の成分との間の類似性を示した（Ｅｔａｎｓ、 Ｆｌ、Ｆｌ。＋　１９８８．　Ｔｈｅ　５ｔｅｒｏｉｄ　ａｎｄ　ｔｈｙｒｏｉ ｄ　ｈｏｒ−ｍｏｎｅ　ｒｅｅｅｐｔｏｒ　ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ、５ｃｉｅ ｎｃｅ　２４０　：　８８９−８９５　ｉ　Ｇｒｅｅｎ、Ｓ、＋ａｎｄ　Ｐ、Ｃ ｈａｓ＋ｂｏｎ、１９８８．　Ｎｕｃｌｅａｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ｅｎｈａ ｎｃｅ　ｏｕｒ　ｕｎｄｅｒｓｔａｎ−ｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｉｏｎ　ｒａｇｕｌａｔｉｏｎ、　Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　４ 　：　３０９−３１４）。我々はこのタンパク質を６つの領域、ＡからＦ（アミ ノ−からカルボキシ−末端方向において）に分割することにおいて、Ｋｒｕｓ　 ｔらの論文（Ｋｒｕｓｔ、Ａ６．　Ｓ、Ｇｒｅｅｎ、　Ｐ、Ａｒｇｏｓ＋　ＶＪ ｕｍａｒ、　Ｐ、Ｗａｌｔｅｒ、　Ｊ。

Ｂｏｒｎｅｒｔ、ａｎｄ　Ｐ、Ｃｈａｍｂｏｎ、１９８６．　Ｔｈｅ　ｃｈｉｃ ｋｅｎ　ｏｅｓｔｒｏｇｅｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓｅｑｕｅｎｃｅ　：　Ｈｏｓ ｏｌｏｇｙ　ｗｉｔｈ　ｖ−ｅｒｂＡ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｏｅｓｔ ｒｏｇｅｎ　ａｎｄｇｌｕｅｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、　Ｅ ＭＢＯＪ、　５　：　８９１−８９７）を利用した。

Ｂ７５Ａとこの題材のその他の成分との類似性はＣＷＩ域、即ちこれらのレセプ ターがＤＮＡに結合するために必要且つ十分であるシスティン−リジン−アルギ ニンに冨む領域において最も強かった（参考のためＥｖａｎｓ、Ｒ，Ｍ、＋　１ ９８８．丁ｈｅ　５ｔｅｒｏｉｄ　ａｎｄ　ｔｈｙｒｏｉｄ　ｈｏｒｍｏｎｅｒ ｅｃｅｐｔｏｒ　ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ、　５ｃｔｅｎｃｅ　２４０　：　８ ８９−８９５　；　Ｇｒｅｅ＋＋＋５．、　ａｎｄ　Ｐ。

Ｃｈａｍｂｏｎ＋　１９８８．　Ｎｕｃｌｅａｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ｅｎｈ ａｎｃｅ　ｏｕｒ　ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ　ｏｆｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉ ｏｎ　ｒａｇｕｌａｔｉｏｎ、　Ｔｒｅ　ｄｓ　ｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　４　 ：　３０９−３１４を参照のこと）、この０Ｍ域は６６−６８個のアミノ酸より 成り、そのうちの２０残基はこの科において不変性である。これらの中で９つが 不変性システィン残基であり、８つは２つのジンクフィンガ一様構造の形成にお いてジンクを整理するものと考えられている（Ｍｉ　１−１ｅｒ＋Ｊ、、Ａ、Ｄ 、ＭｃＬａｃｈｌａｎ、ａｎｄ　Ａ、Ｋｌｕｇ、１９８５．　Ｒｅｐｒｅｓｅｒ ｉｔａｔｉｖｅ　ｚｉｎｃ−ｂｆｎｄｉｎｇ　ｄｏｍａｉｎｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　 ｐｒｏｔｅｉｎ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　１１１Ａ　ｆｒ ｏｍ初■１すｏｏｃｙｔｅｓ、　ＥＭＢＯＪ、　４　：　１６０９−１６１４　 ；　Ｆｒｅｅｄｍａｎ、Ｌ、Ｐ、、　Ｂ、Ｆ。

Ｌｕ１ｓｉ、Ｚ、Ｒ，にｏｒｓｚｕｎ、Ｒ，Ｂａ５ａｖａｐｐａ、Ｐ、Ｂ、５１ ｇ１ｅｒ、ａｎｄ　に、Ｒ，Ｙａｍａ−ｍｏｔｏ、１９８８．　Ｔｈｅ　ｆｕｎ ｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｅｔａｌ　ｅｏｏ ｒｄｉ−ｎａｔｉｏｎ　５ｉｔｅｓ　ｗｉｔｈｉｎ　ｔｈｅ　ｇｌｕｅｏｃｏｒ ｔｉｃｏｉｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ＤＮＡ　ｂｉｎｄｉｎｇｄａｓａｉｎ、Ｎａ ｔｕｒｅ　３３４　：　５４３−５４６　；　５ｅｖｅｒｎｅ、Ｙ、、５Ｊｉｅ ｌａｎｄ、Ｗ、５ｃｈａｆ−ｆｎｅｒ、ａｎｄ　Ｓ、Ｒｕ５ｃｏｎｉ＋　１９８ ８．　Ｍｅｔａｌ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｆｉｎｇｅｒ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ ｔｈｅ　ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｄｅｆｉｎｅｄ　 ｂｙ　５ｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅ−ｎｅｓｉｓ、　ＥＭＢＯＪ 、　９　：　２５０３−２５０８）、　Ｃ領域において、Ｅ７５Ａは全ての高く 保存された残基を含み、そしてこれはステロイドレセプター題材のその他の成分 と、それらが互いに密接に近親しているのとほぼ同じように近親している。Ｂ７ ５の最も近い相関物はヒトＬ互工二上遺伝子であると考えられ、これはＤＮＡ− 結合性ドメインにおいてＥ７５Ａに対してほぼ８０％のアミノ酸同一性を存する 。

ステロイドレセプター趨科の成分の中で保存されるその他領域はＥｉ域であり、 これはステロイド結合性及びステロイド−結合性とトランス−活性化機能のため に必要である（参考のため、Ｅｖａｎｓ、Ｒ。

Ｍ、＋　１９８８．　Ｔｈｅ　５ｔｅｒｏｉｄ　ａｎｄ　ｔｈｙｒｏｉｄ　ｈｏ ｒｍｏｎｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　５ｕｐｅｒｆａ−ｓｉｌｙ、　５ｃｉｅｎｃｅ 　２４０　：　８８９−８９５　；　Ｇｒｅｅｎ、Ｓ、、　ａｎｄ　Ｐ、Ｃｈａ ｓ＋ｈ＋ｏｎ、　１，９８８゜Ｎｕｃｌｅａｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ｅｎｈａ ｎｃｅ　ｏｕｒ　ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉ ｏｎｒａｇｕｌａｔｉｏｎ、　Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　４　： 　３０９−３１４を参照のこと）、Ｅ領域全体の類似性が、甲状腺ホルモン、ビ タミンＤ及びレチノイン酸レセプター並びにｅａｒ−１との比較に関して明らか に有意であるが、グルココルチコイド及びエストロゲンレセプターへの類似性は かなり低い、しかしながら、局所類似性のプロットは、Ｅｉ域の３つのサブ領域 、Ｅｌ、Ｂ２及びＢ３内で、これらのタンパク質それぞれに対する明らかなる類 似性を示した。このＥ１サブ領域は最も高く保存され、且つ試験管内突然変異誘 発により示される通りステロイド結合性及びステロイド−依存性トランス−活性 化にとって本質的である領域に相当する（Ｇｉｇｕｅｒｅ、Ｖ、、　Ｓ、Ｍ、Ｈ ｏｌｌｅｎｂｅｒｇ、　Ｍ、Ｇ。

Ｒｏｓｅｎｆｉｅｌｄ、　ａｎｄ　Ｒ，Ｍ、！１ｖａｎｓ、　１９８６．　Ｆｕ ｎｃｔｉｏｎａｌ　ｄｏｍａｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅｈｕｍａｎ　ｇｌｕｃｏｃｏ ｒｔｉｃｏｉｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ、　Ｃｅ１ｌ　４６　：　６４５−６５２　 ；　Ｄａｎｉｅｌｓｏｎ＋Ｍ、、Ｊ、Ｐ、Ｎｏｒｔｈｒｏｐ、Ｊ、Ｊｏｎｋｌａ ａｓ、ａｎｄ　Ｇ、Ｍ、Ｒｉｎｇｏｌｄ＋　１９８７．　Ｄｏｍａｉｎｓｏｆ　 ｔｈｅ　ｇｌｕｃｏｅｏｒｔｉｃｏｉｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　１ｎｖｏｌｖｅｄ 　ｉｎ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　ａｎｄ　ｎｏｎ−ｓｐｅｅｉｆｔｃ　ｄｅｏｘｙｒ ｉｂｏｎｕｅｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｂｉｎｃｌｉｒｉｇ、　ｈｏｒｍｏｎｅ　ａ ｅｔｆｖａｔｉｏｎａｎｄ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｅｎｈａｎｃｅ ｍｅｎｔ、　Ｍｏ１．Ｅｎｄ　ｃｒｉｎｏｌ、　１　：　８１６−８２２Ｌ領域 Ｅ２は一次アミノ酸配列においてあまり保存されないが、しかしこれはある程度 、複数のこれらのタンパク質のヒトロバシー（ｈｙｄｒｏｐａ　ｔｂｙ）プロッ トにおいて保存された疎水性５ｕＩｔ＆として認められている。この領域におけ る１４個のアミノ酸の欠失はステロイド結合性をなくした（Ｒｕ５ｃｏｎｉ＋Ｓ 、、　ａｎｄに、Ｒ，Ｙａｓ＋ａｍｏｔｏ＋　１９８７．　Ｆｕｎｃｔｉ−ｏｎ ａｌ　ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ａｎｄ　ＤＮＡ 　ｂｉｎｄｉｎｇ　ａｃｔｉｖｔｔｉｅｓ　ｏｆｔｈｅ　ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉ ｃｏｉｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ、　ＥＭＢＯＪ、　６　：　１３０９−１３１５） 、　Ｅ　３はステロイド結合性に絶対に必要とされる領域の末端の近くに位置す る。

このステロイドレセプター題材の特徴的な構造特性はＢ７５においてよく保存さ れ、２つ新規なるバリニーシランが認められた。第１のこの考察はＥＴ５Ｂタン パク質の構造であり、これはその予測ＤＮＡ−結合性ドメイン内に主要なる変異 を含む、このステロイドレセプター題材ＤＮＡ−結合性ドメインはあまり保存さ れないリンカ−ＭｆＪＲにより分けられる２つのＤＮＡ−結合性ジンクフィンガ ーより成る。Ｂ７５において、この科のほとんど全てのその他の遺伝子と同様に 、イントロンが２つのフィンガーの間に見い出せた。

通して保有される領域の開始を仕切る。このことは、ＥＶ　５Ａタンパク賀が２ つのフンイガ−を有しながら、Ｅ７５Ｂタンパク質はこの第１のフィンガーの位 １における近親でないＢ−特異的配列をもたらす。Ｂ−特異的アミノ−近位領域 におけるその他の配列はＥ７４Ｂタンパク質のＤＮＡ−結合性ドメインに役立つ であろう。

他方、Ｂタンパク質は１つのフンイガ−とのみでＤＮＡと結合する。酵母のＧＡ Ｌ４転写因子もこのようである。これらの構造上の相違はＥ７５Ａ及びＢタンパ ク質のＤＮＡ−結合特性における機能的な相違を意味し、このことは異なる標的 組織におけるエクジソンに対する第２の応答を特徴づける後期型遺伝子の転写の 別々の調節を可能にする。

この観点において、予測のホルモン−又はリガンド−結合性ドメインはＥ７５Ａ 及びＥ７５Ｂタンパク質に共通するＥ領域によって示されることを強調すべきで ある。従って、これらのタンパク質は異なる遺伝子の組の転写を調節しうる、同 一のホルモンに対するレセプターであると考えられる。これらのタンパク質は「 オーファン」レセプター、即ちそのホルモン又は結合性リガンドが未だ同定され ていないものを示す、エフジステロイドはシラウジタウハエにおける唯一の知ら れたステロイドホルモンであるため、Ｅ７５リガンドに対する最も明確な候補は エクジソンそれ自身であろう。しかしながら、このことはないようであり、その 理由はもしＥ７５タンパク質もエクジソンレセプターである場合に期待される、 Ｅ７５タンパク譬の予測のホルモン結合性ドメインがＥＣＲ遺伝子によりコード される既知のショウジヨウバエエクジソンレセプターのそれと（実験例■及び表 ２参照のこと）高い配列相同性を示すことがないからである。従って、Ｅ７５タ ンパク質はテルペノイド幼若ホルモン又は新規のショウジヨウバエホルモンのい づれかと結合するようである。

Ｅ７５タンパク質の第２の独特の特徴は、このタンパク質の半分を覆う大きなＦ ｖｉ域の存在である。数多くのその他のレセプターは非常に小さいＦ領域を有し 、そしてこの領域において何ら機能は見い出されていない。

方−五 ンバク シーケンスデーターをＢｉｏｎｅｔシステムを用いて集計した。タンパク質配列 の比較はＦ　Ａ　Ｓ　Ｔ　Ｐ　（Ｌｉｐｍａｎ、Ｄ、Ｊ、、　ａｎｄ　Ｗ、Ｒ， Ｐｅａｒｓｏｎ。

１９８５、　Ｒａｐｉｄ　ａｎｄ　５ｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｆ ｓｉｌａｒｉｔｙ　５ｅａｒｃｈｅｓ、　５ｃｆ−Ｅ７５タンパク質を発現させ るため、ｃＤＮＡの一部及びゲノムクローンを融合させてＥ７５Ａ及びＥ７５Ｂ タンパク譬コード領域全体を含むカセットを作り上げた。まずＢａｍＨ１部位を 大きなオープンリーディングフレームの開始ＡＵＧの上流でゲノムクローンに導 入した０次いでＥ７５ＡＯエキソン配列をほぼ全長のＥＶ　５ＡｃＤＮＡの配列 と融合し、そしてＥ７５Ｂ１エキソン配列をほぼ全長のＥ７５Ｂ　ｃＤＮＡの配 列と融合した。これらのカセットをｐ　Ｇ　Ｅ　Ｍ　３　（Ｐｒｏａｅｇａ）に クローンし、そしてこのオーブンリーディングフレームの転写物をＴ７ポリメラ ーゼを用いて調製した。これらを次に３ＳＳ−メチオンの存在下において翻訳し 、そして適切なサイズのタンパク質の発生が示された。

これらのカセットをショウジヨウバエ細胞における発現のためのｐ　Ｕ　ＣＨｓ ｎｅｏ／　Ａ　ｃ　ｔ　、　ｌ’Ｊｌｉ乳動物における発現のためのｐＳＶ２、 及び細菌細胞における発現のためのｐＯＴｓを含む種々の発現ベクターに入れた 。

１−五 ＢａｍＨ１部位をＥＶ　５Ａ及び２７５Ｂコ一ド配列の開始ＡＴＧの上流に直接 導入した（Ｅ７５Ａ開始ＡＴＧの上流の５ｓｐ１部位、及びＥ７５Ｂ開始ＡＴＧ の上流の５ａｃＩ［部位にて）　ｅ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａとゲノム配列をＡＯエキソ ンにおけるＥｃｏＲＶ部位にて連結させて１施■１ ステロイドレセプター松科の他の成分をコードするＥｃＲ及びＤＨＲ３遺伝子の クローニング、構造及び発現。

Ｅ７５遺伝子の一次構造、及びそれがコードする２つのステロイドレセプター松 科の成分を決定（実験、実施例Ｉ）した後に以下の実験を行った。これらの実験 の目的はショウジヨウバエ由来のその他のステロイドレセプター松科遺伝子の一 次構造及びそれらがコードするタンパク質をクローン及び決定することにある。

この目標は、Ｅ７５遺伝子の特徴がエクジソンレセプターをコードしないことが 示されている場合に、ショウジヨウバエエクジソンレセプターをコードする遺伝 子を同定することにある。この実験計画の第１段階は、ステロイドレセプター松 科のその他のショウジヨウバエ成分の予測のＤＮＡ−結合性ドメインをコードす る配列を同定するためにショウジヨウバエゲノムライブラリーをスクリーンする ためのプローブとして、ＥＶ　５Ａレセプタータンパク質の予測のＤＮＡ−結合 性ドメインをコードするＥＶ　５Ａ転写ユニットにおける保存配列を利用する。

第２段階は同定した遺伝子に相当するｃＤＮＡクローン及び他のゲノムＤＮＡク ローンを単離して、完全なコード領域のヌクレオチド配列及びこれらの遺伝子エ キソンーイントロン調和を得ることである。

以下の記載の実験は、ステロイドレセプター松科の真の成分のための評価を満足 せしめる２つの遺伝子（即ち、この松科の成分の間で保存されるＤＮＡ−結合性 及びホルモン−結合性ドメインの両方に相同性のアミノ酸配列を示すタンパク質 をコードする）のクローニング及び構造上の特徴付けをもたらす。この２つの遺 伝子をＥｃＲ及びＤＨ３と称す。ＥｃＲ遺伝子はもとはＤＨＲ２３と呼ばれるが 、これがエクジソンレセプターをコードすることが示された後（実験実施例■を 参照のこと）、ＥｃＲと改名した。ＤＨＲ３はショウジヨウバエホルモンレセプ タ−３に関する鎖を意味する。

Ａ、ＥｃＲびＤＨＲ３ゲノムクローンの−　び　゛ヒ最初に、１もしくは複数種 の制限エンドヌクレアーゼにより消化せしめた全ショウジヨウバエゲノムＤＮＡ のサザンプロットを、Ｅ７５Ａレセプタータンパク質の予想のＤＮＡ−結合性ド メインをコードする配列（実験実施例Ｉを参照のこと）を含むＥＶ　５ＡｃＤＮ Ａの５３０ｂｐのフラグメントにより、低及び高緊張ハイブリダイゼーション条 件にてプローブせしめた。

このような低緊張バンドのための配列を単離するため、ＥＶ　５Ａプローブを同 一の低緊張条件のもとてショウジヨウバエゲノムライブラリーをスクリーンする ために用い、Ｅ７５遺伝子由来のインサートを含むファージをなくすために２７ ５イントロンプローブを有する二重フィルターをカウンタースクリーニングした 。５種のゲノム相当品をスクリーンに、そして３９種のファージを含む非−２７ ５が単された。２５種の最も強くハイブリダイズしたクローンを制限パターン及 び交差ハイブリダイゼーションに基づいて６つのクラスに分け、それぞれのクラ スは１〜６種独立重複ゲノムインサートを含んでいた。

各クラスに関して、ＥＶ　５Ａプローブにハイブリダイズする領域を含む制限フ ラグメントをサザンブロッテイングによって見つけた。

これらのフラグメントに由来するプローブのゲノムサザンブロ、トへのハイブリ ダイゼーションは、Ｅ７５Ａプローブによって検出される低緊張バンドそれぞれ がこの６種の単離したフラグメントの１種に基づきうることを示した。

６種の制限フラグメントのヌクレオチド配列を、候補となるレセプター遺伝子を それらが示すかを調べるために決定した。全てのケースにおいて、Ｅ７５Ａプロ ーブに対するＤＮＡ配列類似性が観察され、これはこれらのフラグメントのこの プローブへのハイブリダイゼーションのために十分である。このＤＮＡ配列を６ 種の全てのリーディングフレームにおいて理論的に翻訳せしめたとき、４種のフ ラグメントはタンパク質レベルにてＥ７５Ａと有意な配列類似性をもたらさなか った。ところが残りの２種のクローンは、Ｅ７５Ａタンパク質及びその他のステ ロイド松科レセプターのＤＮＡ結合性ドメインに対して強い類似性を有する予測 のアミノ酸配列を示した。

これら２種のクローンはＥｃＲ及びＤＨＲ３遺伝子を示すことが明らかとなりう る。これらのクローン由来のプローブをｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼーシヨン により多糸染色体におけるこれらの遺伝子の位置の地図化のために用いた。Ｅｃ Ｒ及びＤＨＲ３染色体遺伝子座はそれぞれ位置４２Ａ及び４６Ｆにて、この第２ 染色体の右腕において地図化された。

Ｂ、ＥｃＲびＤＨＲ３゛　−びそのｃＤＮＡの　゛＆前記したＤＨＲ３及びＥｃ Ｒゲノムクローンを、エクジソン及びシクロへキシミドにより処理せしめた第三 齢組織より調製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーンするために用いた。この 方法は大量のｃＤＮＡクローンの単離を可能とし、その理由は両方の遺伝子はエ クジソン力価における上昇の後に後期第三齢における転写のピーク期を有すから である。各遺伝子に関し、２０種のクローン化ｃＤＮＡが精製され、そしてその 長さが決定された。各遺伝由来の１０種の最も長いｃＤＮＡを調べ、そして共に 直鎖状（ｃａｌ　１ｎｅａｒ）であることが見い出された。

ＥｃＲに関し、５５３４ｂｐのｃＤＮＡ配列が２種の重複しているｃＤＮＡクロ ーンから得られた。これは８７８コドンのオープンリーディングフレーム（ＯＲ Ｆ）を含み、これは以下により詳しく詳細の通り、ステロイドレセプター松科の 成分について期待される予測のアミノ酸配列（表２）をもたらす。単離された最 も大きいＤＨＲ３ｃＤＮＡ（クローンＤＨＲ３−９）の長さは４，２ｋｂであっ た。このｃＤＮＡのヌクレオチド配列を決定し、そして４８７コドンのＡＵＧ− 開始化オーブンリーディングフレーム（表３）を含むことが見い出された。以下 に詳細の通り、この配列より予測されるＤＨＲ３タンパク質のアミノ酸配列は、 このタンパク質もステロイドレセプター松科の真の成分であることを実証した。

表２．ＥｃＲ遺伝子のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列。左側の数字はヌクレオチド配列数に 間する；右側のはＥｃＲタンパク質におけるアミノ配列に関する。ヌクレオチド １−５１９４はＥｃＲ−１７ｃＤＮＡの配列であり、ヌクレオチド５１９５−５ ５３４はＥｃＲ−９ｃＤＮＡに由来する。５′及び３′非翻訳領域における下線 部の配列はそれぞれ、ＡＴＧコドン及びＡＡＴＡＡＡ共通ポリアデニポリシグナ ルを意味する。イントロンの位置並びにドナー及びアクセプタースプライス配列 は小さな字体でｃＤＮＡ配列の上に示した。ステロイドレセプター松科の推定Ｄ ＮＡ−結合性（０Ｍ域）及びホルモン−結合性（Ｅ　ｉＪ域）ドメインに相同性 のアミノ酸配列を下線で示した。

パネルｌはパネル２及び３において詳細に示した。

配列の数字及び下線は表２と同し意味を有し、そしてイントロンの位置並びにド ナー及びアクセプタースプライス配列も同様に示した。

５′近位の２３３８ヌクレオチドのＤＨＲ３−９ｃＤＮＡの配列を示す。この４ ．２ｋｂ　ｃＤＮＡの残りの配列は一本鎖と決定され、そしてここでは示してい ない。ｃＤＮＡとゲノムＤＮＡ配列との間の４つのサイレントな、第３の位Ｉで の相違をｃＤＮＡ配列の上部に示した。

ＥｃＲ及びＤＨＲ３遺伝子のゲノム構造を、それぞれのｃ　ＤＮＡクローンにお いて見い出せる全ての配列を含む重複セ、７トを形成せしめる更なるゲノムＤＮ Ａクローンを単離することにより調べた。

これらのｃＤＮＡに含まれるエキソンを、サザンプロット分析、制限切断部位の 地図化を介するｃＤＮＡとゲノムクローンの比較、更に最終的にエキフン／イン トロン境界を含む領域におけるゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列の決定により、 ゲノム内において地図化せしめた０表２及び３はこのような境界、並びにＥｅＲ 及びＤＨＲ主遺伝子それぞれのスプライスジャンクションの配列を示す。これら 全てのスプライスジャンクションはスプライスドナー及びアクセプター共通配列 に適合する。

ＥｃＲに間して、表２に示すｅＤＮＡ配列は３６ｋｂのゲノムＤＮＡにわたって 広がる６つのエキソンにスプリットし、ここでＯＲＦは第２のエキソンにおいて 始まり、そして第６番目において終わる。

ＤＨＲ３に関しては、ｃＤＮＡ配列は１８ｋｂにわたって広がる９つのエキソン に由来し、ここでＯＲＦは第１のエキソンにおいて始まり、そして第９番目にお いて終わる。それぞれのｍＲＮＡの５′及び３′末端は地図化できないため、こ れらの遺伝子はその５′又は３′末端に更なる非コード化エキソンを含みうるこ とが強調されうる。

ＥｃＲとＤｉ（Ｒ３遺伝子の構造は予め調べられた全てのステロイドレセプター 題材遺伝子のそれと有意に相違する。少なくとも部分的な構造情報が入手されて いるその他の１１種のレセプター同族体に関する遺伝子との比較は、一定のエキ ソン境界の位１が進化において保存されていることを示した。この保存はＤＮＡ −結合性ドメインをコードする遺伝子の位１において最も顕著であった。この領 域の構造が調べられているその他の９種のケースにおいて、２種類の半分のＤＮ Ａ−結合性ドメインは常に別々のエキソンによりコードされていた。もし我々が ショウジヨウバエ遺伝子亘江臼、　ｋｎｉｒｐｓ−関連、及び」匹（これらは真 のレセプター同族体ではなく、その理由はこれらはホルモン−結合性ドメイン配 列類似性を有さないからである）を除外したら、これらは常に小さなエキソンと なり、この２番目のものはＣ３ＪＩ域の末端に保存されているＭｅｔコドンを超 える第４のコドンにおいていつも終結する。従ってこれらのエキソンはそれぞれ ＤＮＡ−結合性ドメインの２つの予測のジンクフィンガーのうちの１つをコード する。一方、ＥｃＲ及びＤＨＲ３レセプターの予測のＤＮＡ−結合性ドメインの 両方のジンクフィンガーは単独のエキソンよりコードされる。我々のスクリーン は上記のイントロンを欠く遺伝子を特異的に選別した可能性がある。このスクリ ーンはむろんこのイントロンを欠＜Ｅ７５Ａ　ｃＤＮＡプローブにハイブリダイ ズするゲノムクローンを選別した。ＤＮＡ−結合性ドメインをコードする隣接配 列を含むゲノム配列は、このイントロンを含む遺伝子に由来するクローンよりも よくこのプローブにハイブリダイズすることが予測される。このことは、ＥｃＲ 及びＤＨＲ３遺伝子の単離の成功及びステロイドレセプター松科のその他のショ ウジヨウバエ成分の遺伝子の単離の失敗を説明するであろう。

方−失 工旦Ｎ人及互進のゲノ友久玉ニＺΩ！崖ちとから単離されているＤＨＲ３及びＥ ｃＲゲノムクローンのサブクローンを、エクジソン及びシクロヘキシミドにより 処理せしめた第三齢組織から調製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーンするた めに用いた。このライブラリーを選んだのは、両遺伝子とも第三齢の終わりにて 比較的高く発現されること、及びこのライブラリーの高い品質による。スクリー ンした２７０，０００個の第１プラークより、ＤＨＲ３に対して２０種及びＥｃ Ｒに対して２２０種の陽性体が検出された。精製した各遺伝子についての２０種 ｃＤＮＡのうち、それぞれについての最も大きい１０種のものを制限地図化し、 そして共直鎖性であることが見い出された。我々のＤＨＲ３ｃＤＮＡよりも更に ５′及び３′の両方向に広がるｃＤＮＡ　ＤＨＲ３−９をシーケンシングのため に選んだ、ＥｃＲに関して、最も長いｃＤＮＡ、ＥｃＲ−１７が最も遠方に５′ に広がり、そしてその全体をシーケンス化した。他のｃＤＮＡクローン、ＥｅＲ −９はＥｃＲ−１７よりも３００ｂｐ遠方に３′に広がることが見い出され、そ して、二の３′伸長体もシーケンス化した。ＥｃＲ及びＤＨＲ３をカバーする他 のゲノムが、前記のＡ章において触れたシラウジヨウｙ＜ｘカントンＳゲノムラ イブラリーを、それぞれのｃＤＮＡクローン由来のプローブ、又は実験実施例■ に詳細の染色体歩行による重複クローンのいづれかを伴うスクリーニングによっ て得られた。

ＤＮＡ１シ１土梶 ｃＤＮＡをブルースクリプト（Ｂｌｕｅ　５ｃｒｉｐｔ）ベクター（Ｓｔ、ｒａ ｔａｇｅｎｅ）にサブクローン化し、そしてシーケンシングのためのクローンを エキソヌクレアーゼ■消化（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＋Ｓ、＋　１９８４．　Ｕｎｉｄ ｉｒｅｃｔｉｏｎａｌｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ 　ＩＩＩ　ｃｒｅａｔｅｓ　ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔｓｆｏｒ 　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、　Ｇｅｎｅ　２８　：　３５１−３５９）に よって作り上げた。

二本鎖プラスミドを変性させ（Ｇａｔｅｒｍａｎｎ、に９ｇ、、　Ｇ、Ｈ，Ｒｏ ｓｅｎｂｅｒｇ。

ａｎｄ　Ｎ、Ｆ、Ｋａｕｆｅｒ、　１９８８．　Ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅ ｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、　ｕｓｉｎｇ　ｍ１ｎｉ−ｐｒｅｐ　ｐｌａｓｍｉ ｄｓ、　ｉｎ　１１　ｈｏｕｒｓ、　ＢｉｏＴｅｃｈｎｉ　ｕｅｓ　６　：　９ ５１−９５２）そして酵素シーケンス化（Ｕ、Ｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を 用いるジデオキシ連鎖停止方法（Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ、、　Ｓ、Ｎ１ｃｋｌｅｎ、 　ａｎｄ　Ａ、Ｒ，Ｃｏｕｌｓｏｎ、　１９７７、　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎ−ｃ ｉｏｇ　ｗｉｔｈ　ｃｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒ ｓ＋　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

１７を両鎖にもとづいて、ＥｃＲ−９の３′伸長と同様に完全にシーケンス化し た。ｃＤＮＡ　ＤＨＲ３−９を、ＯＲＦ全体を含む５′側の２３３８ｂｐに関し て両鎖に基づいてシーケンス化し、そして残りの長い３′非翻訳領域は一本の鎖 に基づいてシーケンス化した。

ゲノムＤＮＡクローンにおけるエキフン／イントロン境界をまずラベル化ｃＤＮ Ａによりプローブされたそれらの制限フラグメントのサザンブロソト分析により 低分解能にて地図化せしめた。各エキフン／イントロン境界を囲むゲノムＤＮ’ Ａをサブクローン化し、そしてこれらのサブクローンのヌクレオチド配列を上記 の通りに決定した。

ゲノム及びｃＤＮＡクローンの共直鎖性を確認するため、ｃＤＮＡクローンと平 行してゲノムエキソンを全体的にシーケンス化するか、又は長めのエキソンを消 化せしめて電気泳動にかけた。短めのエキソンはゲノムクローンから完全にシー ケンス化された。長めのエキソンはそれらの境界をゲノムクローンからシーケン ス化し、そしてｃＤＮＡとゲノムクローンとの平行させた消化及び電気泳動によ り共直線性であることが確認された。

Ｃ，ＥｃＲびＤＨＲ３ンパク　の　、アミノ　びにそ皇又保 予測のＥｃＲ及びＤＨＲ３タンパク質配列の、配列データーベース並びにステロ イドレセプター松科の個々の成分に対する比較は、これらのタンパク質がこの題 材の２種の保存されているドメインの特徴を共有することを示した（Ｅｖａｎｓ 、Ｒ，Ｍ、＋　１９８８．　Ｔｈｅ　５ｔｅｒｏｉｄ　ａｎｄｔｈｙｒｏｉｄ　 ｈｏｒｓ＋ｏｎｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｓｕｐｅｒｆａＩｇｉｌｙ、　５ｃｉｅ ｎｃｅ　２４０　：　８８９−８９５　；Ｇｒｅｅｎ、Ｓ、、　ａｎｄ　Ｐ、Ｃ ｈａｍｂｏｎ＋　１９８８．　Ｎｕｃｌｅａｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ｅｎｈａ ｎｃｅ　ｏｕｒｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏ ｎ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ、　Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ４　：　 ３０９−３１４）　、我々はよりアミノ末端及びよりカルボキシ末端相同性であ るドメインをＫｒｕｓ　ｔらに従って（Ｋｒｕｓｔ、Ａ、、　Ｓ、Ｇｒｅｅｎ、 　Ｐ。

Ａｒｇｏｓ、　Ｖ、Ｘｕ＋ｍａｒ、　ＰＪａｌｔｅｒ、　Ｊ、？１．Ｂｏｒｎｅ ｒｔ、　ａｎｄ　Ｐ、Ｃｈａｓｂｏｎ、　１９８６゜丁ｈｅ　ｃｈｉｅｋｅｎ　 ｏｅｓｔｒｏｇｅｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　；　ｈｏｍｏｌｏ ｇｙ　ｗｉｔｈ　ｖ−ｅｒｂ＾ａｎｄ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｏｅｓｔｒｏｇｅ ｎ　ａｎｄ　ｇｌｕｃｏｃｏｒＨｃｏｉｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、　ＥＭＢＯＪ 。

５　：　８９１−８９７）それぞれＣ及びＥｅｌ域と称した。これらのドメイン を表２及び表３において下線し、そして表４Ａ−ＣはＥｃＲ及びＤＨＲ３に由来 のこれらのドメインとこの題材の代表的な成分に由来するそれとの比較を示す。

表４．ＤＨＲ３，ＥｃＲ及びいくつかの代表的な核レセプター同族体における保 存されているＣ及びＥｉＩ域の配列比較、（Ａ）Ｃ−領域の列、左側の数字は個 々のレセプター内のアミノ酸の位置を示す、ダッシェは最大の長さの列を得るた めに導入したすき間を示す。

ドツトはこのドメインのＤＮＡ結合特異性を決定することにおいて重要な３つの 位置を示す、（Ｂ）Ｅ−領域列、バーはこのドメイン内に最も高く保存されてい る３つの鎖を示す、（Ｃ）Ｃ−９１域配列（下、左側）とＥ−６１域配列（上、 右側）との間の計算されたパーセント同一性、Ｋｎｉ配列はＥ−８１域相同性を 全く示さず、従ってこの比較には含ませなかった。示す配列は：Ｅ７５Ａ、７５ Ｂでのショウジヨウバエエクジソン−誘発性遺伝子；　Ｋｎ　ｉ、　ショウジヨ ウバエ分断遺伝子■江旺；　ｈ　ＲＡ　Ｒα、ヒトレチノイン酸レセプターアル ファー；　ｈｔＲβ、ヒト甲状腺レセプターベーター、ｈＶＤＲ１ヒトビタミン Ｄレセプター；　ｃＯＵＰ−ＴＦ、ニワトリオバルミン上流プロモーター転写因 子、ｈＥＲＲｌ及びｈＥＲＲ２、ヒトエストロゲン−関連レセプター■及び２； ｈＥＲ，ヒトエストロゲンレセプター；　ｈＧＲ、ヒトグルココルチコイドレセ プター、ｈＭＲ、ヒト鉱質グルココルチコイドレセプター；ｈＧＲ，ヒトプロゲ ステロンレセプター；に由来する。

パネル１はパネル２〜６において詳細に示している。

このＣ領域は６６−６８個のアミノ酸のドメインであり、を椎動物レセプターに おいてジンクフィンガーＤＮＡ結合性ドメインとして機能することが示されてい る。このドメインはレセプター〇二量体にも関与することが示されている（Ｋｕ ｍａｒ、Ｖ、＋　ａｎｄ　Ｐ、Ｃｈａｍｂｏｎ。

１９８Ｂ、　Ｔｈｅ　ｅｓｔｒｏｇｅｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｂｉｎｄｓ　ｔｉ ｇｈｔｌｙ　ｔｏ　ｉｔｓ　ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ　ａｓ　ａ　 ｌｉｇａｎｄ−４ｎｄｕｃｅｄ　ｈｏｍｏｄｉｇｅｅｒ、Ｃｅ１ｌ　５５　：　 １４５−１５６）、表４Ａにおいて示す通り、その他のレセプター同族体におい て完全に保存されている全ての１９個Ｃ−４１域残基はＤＨＲ３及びＥｃＲにお いても保存され、これには９個の不変のＣｙｓ残基が含まれ、そのうちの８個は ２つの亜鉛イオンを配位する（Ｆｒｅｅｄｍａｎ、Ｌ、Ｐ、、　Ｂ。

Ｆ、　Ｌｕｆｓｉ、　Ｚ、Ｒ，Ｍｏｒｓｚｕｎ、　Ｒ，Ｂａ５ａｖａｐｐａ＋　 Ｐ、Ｂ、５１ｇ１ｅｒ＊　ａｎｄ　Ｋ、Ｒ，Ｙａｔａａ−１１０ｊＯ＋　１９８ ８．　Ｔｈｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｔｈｅ 　ｍｅｔａｌ　ｃｏｏｒｄｉｎａ−ｔｉｏｎ　５ｉｔｅｓ　ｗｉｔｈｉｎ　ｔｈ ｅ　ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏ３ｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ＤＮＡ　ｂｊｎｄｉｎ ｇ物レセプター同族体はど近密に互いに近親してはいない。ＤＨＲ３のＣｅｌ域 はヒトレチノイン酸レセプターα（ｈＲＡＲα）のそれと最も類似し、そしてＥ ｃＲＯＣｆｉ域はヒト甲状腺レセプターβ（ｈＴＲβ）のそれと量も類似してい た。ヒトグルココルチコイドレセプター（ｈＧＲ）及びヒトエストロゲンレセプ ター（ｈＥＲ）に基づく試験は、これらのレセプターと異なるＤＮＡ結合特異性 を決定するのに重要な３つのＣ−６１域残基（表４Ａにおいてドツトで示す）を 同定した（Ｍａｄｅｒ、Ｓ、、　Ｖ、Ｋｕｓａｒ＋　Ｈ，ｄｅ　Ｖｅｒｒ＋ｅｕ ｉｌ、　ａｎｄ　Ｐ、Ｃｈａ−ｍｂｏｎ、１９８９．　Ｔｈｒｅｅ　ａｍｉｎｏ 　ａｃｉｄｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｓｔｒｏｇｅｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｒｅｅ ｓｓｅｎｔｉａｌ　ｔｏ　ｉｔｓ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｔｏ　ｄｉｓｔｉｎｇｕｉ ｓｈ　ａｎ　ｅｓｔｒｏｇｅｎ　ｆｒｏｍ　ａｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ− ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ、Ｎ旦１隻り旦　３３８　：　２７１− ２７４　；　Ｕｍｅ−ｇｏｎｏ＋に、＋　ａｎｄ　Ｒ，Ｍ、Ｅｖａｎｓ＋　１９ ８９．　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ　ｏｆ　ｔａｒｇｅｔ　ｇｅｎｅｓｐｅｃｉ ｆｉｃｉｔｙ　ｆｏｒ　５ｔｅｒｏｉｄ／１ｈｙｒｏｒｄ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｒ ｅｃｅｐｔｏｒｓ、　Ｃｅ旦５７：１１３９−４６）、　３種のショウジヨウバ エタンパク質、ＤＨＲ３，ＥｃＲ及びＥ７５Ａ並びにを椎動物レセプターｈＲＡ Ｒα、ｈＴＲβ及びヒトビタミンレセプター（ｈＶＤＲ）の全ては、この３つの 位置にて同一のアミノ酸を有し；従ってこれらのタンパク質はｈＲＡＲαとｈＴ Ｒβに関して既に示されている通り（Ｕｍｅｓｏｎｏ、に、、　Ｖ、Ｇｉｇｕｅ ｒｅ。

Ｃ，に、Ｇｌａｓｓ、　Ｍ、Ｇ、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ、　ａｎｄ　Ｒ，Ｍ、Ｅｖ ａｎｓ、　１９８８．　Ｒｅｔｉｎｏｉｃ　ａｃｉｄａｎｄ　ｔｈｙｒｏｉｄ　 ｈｏｒｖｏｎｅ　１ｎｄｕｃｅ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｉｏｎ　ｔｈｒｏｕｇ ｈ　ａ　ｃｏｍｍｏｎｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｅｌｅｇｇｅｎｔ、　Ｎａｔｕｒ ｅ　３３６　：　２６２−２６５）ＩＩ似のＤＮＡ結合特異性を有しうる。

Ｅｆｆ域はを椎動物においてホルモン−結合性ドメインとして働く〜２５個のア ミノ酸のドメインである。このドメインはホルモン依存性レセプターの二量体（ Ｋｕｗａｒ、Ｖ、　ａｎｄ　Ｐ、Ｃｈａ＊ｂｏｎ＋　１９８８．　Ｔｈｅ　ｅｓ ｔ−ｒｏｇｅｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｂｉｎｄｓ　ｔｉｇｈｔｌｙ　ｔｏ　ｉｔ ｓ　ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ　ａｓ　ａｌｉｇａｎｄ−ｉｎｄｕ ｃｅｄ　ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ、Ｃｅ１ｌ　５５　：　１４５４５６　；　Ｇｕｉ ｏｃｈｏｎ、Ｍ、Ａ、。

Ｈ，Ｌｏｏｓｆｅｌｔ、　Ｐ、ＬｅＳｃｏｐ、　Ｓ、Ｓａｒ、　Ｍ、Ａｔｇｅｒ 、　Ａ、Ｍ、Ｐｅｒｒｏｔ、　ａｎｄ　Ｅ、Ｍｉｌ−ｇｒｏｍ、　１９８９．　 Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅａｒ　１ｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏ ｆ　ｔｈｅ　ｐｒｏｇｅｓ−ｔｅｒｏｎｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　：　ｅｖｉｄｅ ｎｃｅ　ｆｏｒ　１ｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｍｏｎｏｍｅｒｓ 。

Ｃｅ１ｌ　５７　：　１１４７−１１５４）　、グルココルチコイドレセプター のホルモン依存性核局在化（Ｐｉｃａｒｄ、　Ｄ。、　ａｎｄ　Ｋ、Ｒ，Ｙａｍ ａａｏｔｏ、　１９８７．　Ｔｗｏ　ｓｉｇｎａｌｓａ＋ｅｄｉａｔｅ　ｈｏｙ ｖｏｎｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｎｕｃｌｅａｒ　１ｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　 ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｌｕｃｏ−ｃｏｒｔｉｃｏｉｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ、　ＥＭＢ ＯＪ、　６　：　３３３３−３３４０）　、及び９０ｋＤａの熱シヨツクタンパ ク質へのグルココルチコイドレセプターの結合性（ＰｒａｔｔＪ、Ｂ、、　Ｄ、 Ｊ、Ｊｏｌｌｙ、　Ｄ、Ｖ、Ｐｒａｔｔ、　Ｗ、Ｍ、Ｈｏｌｌｅｎｇｅｒｇ、　 Ｖ、Ｇｉｇｕｅｒｅ。

Ｆ、Ｍ、Ｃａｄｅｐｏｎｄ、Ｇ、Ｇ、Ｓｅｈｗｅｉｚｅｒ＋　Ｍ、Ｇ、Ｃａｔｅ ｌｌｉ、Ｒ，Ｍ、Ｅｖａｎｓ、ａｎｄ　Ｅ、Ｅ。

Ｂａｕｌｉｅｕ＋　１９８８＋Ａ　ｒｅｇｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　５ｔｅｒｏｉ ｄ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｄｏｍａｉｎ　ｄｅｔｅｒ−ｍｉｎｅｓ　ｆｏｒｍａｔｉ ｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｎｏｎ−ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ＋　９　Ｓ　ｇｌｕｃｏ ｃｏｒｔｉｃｏｉｄｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｃｏｍｐｌｅｘ、　Ｊ、Ｂｉｏ　、Ｃｈ ｅｍ、　２６３　：　２６７−２７３）にも関与する０表４８はＤＨＲ３及びＥ ｃＲタンパク質のＨＣｌ域とその他のレセプター同族体のそれの列を示す、実験 実施例Ｉにおいて注目したこの領域における３つの比較的高く保存されている鎖 に下線を引いた；それぞれは、レセプター配列の全て又はほとんどに保存されて いる残基をふさを含んでいた。ＤＨＲ３及びＥｃＲはこの鎖において互い同志及 びその他のタンパク質に対する強い類似性を示し、そしてそれ以外では少ない類 似性を示した。このＥｌ域相同性の存在は、Ｃ−領域相同性は示すがＥ−領域相 同性を示さないショウジヨウノルエフ　（Ｎａｕｂｅｒ、Ｕ、、　ｎ、Ｊ、Ｐａ ｎｋｒａｔｚ、　Ａ、Ｋｉｅｎｌｉｎ、　Ｅ、５ｅｉｆｅｒｔ、　Ｕ、Ｋｌｅｎ ＋ａ＋。

ａｎｄ　Ｈｊａｃｋｌｅ＋　１９８８．　Ａｂｄｏｍｉｎａｌ　ｓｅｇｍｅｎｔ ａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　旦Ｌ９互立Ｒｈ１１旦ｅｍｂｒｙｏ　ｒｅｑｕｉｒ ｅｓ　ａ　ｈｏｒｖｏｎｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１ｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅ ｎｃｏｄｅｄ　ｂｙｔｈｅ　ｇａｐ　ｇｅｎｅ　■江り、　Ｎａｔｕｒｅ　３３ ６　：　４８９−４９２Ｌ　ｋｎｉｒ　ｓ　−ＷｉＲ（Ｏｒｏ。

＾、Ｅ、、　Ｅ、Ｓ、Ｏｎｇ、　Ｊ、Ｓ、ｌ’ｌａｒｇｏｌｉｓ、　ＪＪ、Ｐｏ ５ａｋｏｎｙ、　Ｍ、ＭｃＫｅｏｗｎ、　ａｎｄ　Ｒ。

Ｍ、Ｅｖａｎｓ＋　１９８８．　Ｔｈｅ　７　ｇｅｎｅ　ｋｎｉｒ　５−ｒｅｌ ａｔｅｄ　ｉｓ　ａ　ｍｅｍｂｅｒｏｆ　ｔｈｅ　５ｔｅｒｏｉｄ−ｒｅｃｅｐ ｔｏｒ　ｇｅｎｅ　ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ、　Ｎａｔｕｒｅ　３３６　：　４ ９３−４９６）、及び弧亜（Ｒｏｔｈｅ、Ｍ、、　Ｕ、Ｍａｕｂｅｒ、　ａｎｄ ■Ｊａｃｋｌｅ、　１９８９．　Ｔｈｒｅｅｈｏｒｖｏｎｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ −１ｉｋｅ　７　ｇｅｎｅｓｅｎＣｏｄｅ　ａｎ　ｉｄｅｎｔｉｃａｌＤＮＡ− ｂｉｎｄｉｎｇ　ｆｉｎｇｅｒ、　ＥＭＢＯＪ、　８：３０８７−３０９４）と は対照的に、核しセプター科の真の成分としてのタンパク質を樹立する。ＤＨＲ ３におけるＨＣｌ域はＥ７５Ａのそれと最もＷ４位し、そしてＥｅＲのＥＳｉ域 はｈＴＲβのそれに最も類似するが、これらの類似性のレベルは多数のその他の レセプターのＥＳＪｊ域（表４Ｃ）の間で見い出せるそれよりは低かった。従っ て、ＤＨＲ３及びＥｃＲは既にクローンされているどのレセプターの同族体とも 特別に近親ではなかった。Ｅ−領域配列の比較は、核レセプターの亜科（ｓｕｂ ｆａ■ｆｌｙ）への分割（Ｐｅｔｋｏｖｉｃｈ、Ｍ、、Ｎｊ、Ｂｒａｎｄ、Ａ、 Ｋｒｕｓｔ、ａｎｄ　Ｐ、Ｃｈａｓｂｏｎ、１９８７．　Ａｈｕｍａｎ　ｒｅｔ ｉｎｏｉｃ　ａｃｉｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｗｈｉｃｈ　ｂｅｌｏｎｇｓ　ｔｏ 　ｔｈｅ　ｆａｍｉｌｙ　ｏｆｎｕｃｌｅａｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、　Ｎａｔ ｕｒｅ　３３０　：　４４４−４５０）を可能とし、いづれの種類の亜科の成分 は他の亜科におけるそれより、互い同志でより近親している。ＤＨＲ３及びＥｃ ＲレセプターはＥ７５Ａ、Ｅ７５Ｂ。

ｈＲＡＲα、ｈＴＲβ及びｈＶＤＲレセプターを有する亜科に属する。

Ｄ、　Ｅ、コリにおいて　されたタンパク　によって悸　）本に９７ｒ：’）　 Ｃ，Ｊ、６ＥｃＲＵＤＨＲ３９”／Ｊ＜９　（７）ｉｎ　５ｉｔｕう＜’Ｊ内及 び組織分布を調べるため、これらのタンパク質に特異的なアフィニティー精製ポ リクローナル抗体を以下の方法により製造した。

これらのタンパク質の保存されているＤＮＡ−結合性とホルモン−結合性ドメイ ンとの間に位置する約１２０個のアミノ酸残基の領域を、各タンパク質に対する 抗体を作るための免疫原として用いた。

従って、アミノ酸３３５−４４７のＥｃＲタンパク質に関するコード配列及びア ミノ酸１６４−２８９のＤＨＲ３タンパク質に関するコード配列（それぞれ表２ 及び３を参照のこと）を適当なｐＡＴＨ（Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ、Ｃ，、ａｎｄ　 Ａ、ｔｚａｇａｌｏｆｆ＋　１９８５．　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６０　： 　１５１３−１５２０）又はｐＵＲ発現ベクターの中にクローン化せしめ、これ らのコード配列をＥ、２１Ｊβ−ガラクトシダーゼ（βｇａ　１）又は旦。

ユニトリプトファンＥタンパク質（ｔｒｐＥ）それぞれをコードする配列と融合 させた。

βｇａｌ融合タンパク質を呈、ユニにおいて、ＩＰＴＧインデューサーを指数的 培養物に加えることにより作り、そしてｔｒｐＥ融合タ融合タンパ対質は無トリ プトファン培地への希釈及びその後のインドール酢酸の添加によって誘発せしめ た。ＥｃＲに関し、ｔ　ｒｐＥ融合タンパク質は免疫原として用い、そしてβｇ ａｌ融合タンパク質はこの融合体のＥｃＲ部分に対する免疫反応性についての血 清を検定するためのイムノプロットにおいて利用した。ＤＨＲ３に関し、βｇａ ｌ融合タンパク質を注射し、そして血清をｔｒｐＥ融合タ融合タンパ対質て調べ た。

免疫化のため、適切な融合タンパク質は５Ｏ３−ＰＡＧＥゲルでの電気泳動及び 水冷０．２５ＭのＫＣｌ中での染色、その後のこの融合タンパク質バンドの切り 出しによって調製した。０．２５ｍ１のゲルスライスにおける約１００μｇの融 合タンパク質を連続的に小さな皮下注射用針を通すことによって破砕せしめ、次 いで０．２５−１の無菌食塩水溶液及び０．５■ｌのフロイント完全アジュバン トとジェバントを省いて２週間間隔にてブーストにかけた。βｇａｌ融合タンパ ク質は精製工程を伴わずに上記のゲル電気泳動にかけたが、ｔｒｐＥ融合タ融合 タンパ対質内におけるその不溶性の利点を利用して、以下の方法によってまず精 製した。

誘発せしめた細胞の２リツターの培養物由来の呈、ユニを洗い、そしてこの細胞 ペレットを複数の凍結／融解サイクルにかけた。この細胞を１８−１の５０■阿 のトリス−ＨＣｌ、ＰＩＩ７．５．０．５ｓＭのＥＤＴＡに再懸濁し、そして１ ．８■ｌの１０−ｇ／ｍｌのリゾチームを加えた。氷上で１５分後、この細胞を フレンチ圧力セルに１０，０００ｐｓｉで３回通すことにより溶解させた。不溶 性画分を２７，０００Ｘｇで１５分間の遠心により集め、そして氷冷５（１＋Ｍ のトリス−ＨＣｌ、０．５ｓＨのＥＤＴＡ、０．３ＭのＮａＣ１中でのＤｏｕｎ ｃｅホモジナイザーを用いる再懸濁により洗い、次いで前記の通り遠心した。こ の洗浄工程を繰り返し、そして最終ベレットを１０ｍ１の、４Ｍの尿素、２％（ Ｗ／Ｖ）のＳＤＳ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５、■＋ｗＭのＥＤＴ Ａ、５％（ｖ　／　ｖ　）の２−メルカプトエタノールに溶かした。不溶性であ り続けている物質を遠心し、そして捨てた。

抗血清を、「非特異的」及び「特異的」アフィニティーカラムに連続に通すこと によるツーステップ工程においてアフィニティー精製した。ｔｒｐＥ融合タ融合 タンパ対質て発生せしめた抗体のケースにおいて、この非特異的カラムは未修飾 ｔ　ｒｐＥタンパク質を発現するＥ、　ＩＩＪに由来する不溶性タンパク質を結 合させた樹脂より成り、そしてこれはｔｒｐエピトープに対して特異的抗体及び 不溶性のＥ、７１Ｊタンパク質不純物に対する抗体を除去するために用いた。特 異的なカラムはＥｃＲ−ｔｒｐＥ融合タ融合タンパ対質の通りに精製）に結合し ている樹脂より成り、そしてこれはＥｃＲエピトープに対して特異的な所望の抗 体を吸着せしめるために用い、この抗体を次にカラムから溶離させた。βｇａｌ 融合タンノ々り質に対して発生せしめた抗体のケースにおいては、同一の一般工 程を用し）たが、但し非特異的カラムにおける樹脂はβ−ガラクトシダーゼと結 合させており、そして特異的なカラムにおけるそれはＤＨＲ３−βｇａｌ融合タ 融合タンパ粘質させていた。適当な旦、ユニ抽出物のウェスタンプロット分析は これらのアフィニティー精製抗体が所望の特異性を示すことを莫証した。

後期第三齢だ液腺におけるＥｃＲタンパク質の細胞内分布を、この抗−ＥｃＲ抗 体によるこのタンパク質のｔｎ　５ｉｔｕラベリングによって調べた。これによ りＥｃＲタンパク質はこの腺の核に高く局在していることが示された。事実、こ れらの核における多糸染色体をＺｉｎｋ及びＰａｒｏの抗体−ラベリング方法（ Ｚｉｎｃ、Ｂ、、　ａｎｄ　Ｐ、Ｐａｒｏ、　１９８９゜に、ＥｃＲタンパク譬 はＥ７５及びＥ７４遺伝子により占められているものを含む初期型パフ遺伝子座 に結合していた。これは、＾５ｈｂｕｒｎｅｒモデルにより期待される通り、Ｅ ｃＲ遺伝子によりコードされるエクジソンレセプターが初期型遺伝子の転写を誘 発せしめるそれである場合に予測される結果である。　Ａｓｈｂｕｒｎｅｒモデ ルの他の予測は、エクジソン−レセプター複合体がまず後期型パフにとって重要 な遺伝子を抑制することであり、これにより、この初期型遺伝子タンパク質によ り誘発される後期遺伝子の転写は、これらのタンパク質が十分に堆積してこの初 期抑制に打ち勝つようになる迄遅らされる。もしＥｃＲレセプターがこの予想さ れる最初の抑制に関与するなら、このＥｃＲタンパク質がだ液腺における後期型 パフ遺伝子座に結合することを予測せしめる。この予測は、ＥｃＲタンパク質が 多糸染色体における後期型パフ遺伝子にも結合することの観察と一致する。

更なるｉｎ　５ｉｔｕ抗体ラベリング実験は、ＥｃＲタンパク譬が後期第三齢幼 虫において調べた全てのエクジソン標的組織の核に存在していることを示した。

これはショウジヨウバエの胚形成及び調べられたその他の段階の際の全てもしく はほとんどの細胞にも存在していた。これに関連して、このＥｃＲタンパク質は 、ＥｃＲ遺伝子が染色体欠失によって削除された胚の抗−ＥｃＲ抗体ラベリング によって検出されず、この抗体の特異性が更に実証された。

広範囲に分布するＥｃＲタンパク質と対照的に、胚の抗−ＤＨＲ３抗体ラベリン グは、ＤＨＲ３タンパク質の分布がこの成長の段階の際に高く抑えられることを 実証した。短い発現の胚誘導期の間、このタンパク質は末梢神経系及び胚の後端 にて気門を囲む細胞に限定されていた。

最後に、Ｅ７５Ａタンパク質に対するアフィニティー精製抗体も、抗−ＥｃＲ及 び抗−ＤＨＲ３抗体に関して上記したものと同一の技術によって調製されること が理解されるべきである。幼虫だ液腺におけるＥ７５Ａタンパク質のｉｎ　５ｉ ｔｕ抗体ラベリングも、このタンパク質が核に局在し、そして多糸染色体におけ る特定の遺伝子座に結合していることを実証した。

２旌握ｌ 以下の実験は、ＥｃＲ遺伝子によりコードされるタンパク質が以下の点によって エクジソンレセプターであることを実証する。（１）ＥｃＲタンパク質はエフジ ステロイドと結合し、そしてショウジヨウバエの胚及び種々の培養ショウジヨウ バエ細胞に存在している全て又は大部分のエフジステロイド−結合活性に原因す る。（２）ＥｃＲタンパク質は高い特異性を伴って、エクジソン応答性因子（Ｅ ｃＲＥ）、即ち、プロモーターエクジソン誘発性を授けるエンハンサ−として機 能するＤＮＡ配列に結合する。　（３）ＩＩ能的なエクジソンレセプターを欠く ためにエクジソンに応答しない細胞は、ＥｃＲ発現性プラスミドによるトランス フエフシランによってエクジソン一応答性状態へと変換される。

Ａ、ＥｃＲンパク　はエフジス−ロイドに　ム　る図１において示すＥｃＲ発現 性プラスミド−ｐＭＴＥｃＲは、之ヨウジョウバエメタロチオニンプロモーター （Ｐｏア）と５′末端にて、そしてシラウジツウバエ　アクチン５Ｃ遺伝子のポ リアデニル化−切断配列と３′末端にて融合している、ＥｃＲタンパク質をコー ドするオーブンリーディングフレーム（ＥｃＲＯＲＦ；実験実施例■を参照のこ と）を含む、ＥｃＲＯＲＦの転写はこのメタロチオニンのコントロール下にある ため、この転写はＣｕ”イオンにより誘発されてｍＲＮＡを生産、言い換えるな らＥｃＲタンパク質を製造する。アフィニティー精製抗−ＥｃＲ抗体を用いるウ ェスタンプロット分析（実験実施例■を参照のこと）によって調べた、Ｃｕ”誘 発に基づいてこのタンパク質を過剰生産する細胞系ＭｔＥｃＲ）ＩＶを、ｐＭＴ ＥｃＲプラスミドＤＮＡをシラウジ３ウハエ５Ｃｈ−２細胞系のゲノムの中に安 定的に組込むことにより作製した。コントロール細胞系ＭｔＨｙを、ＥｃＲＯＲ Ｆを欠く発現ベクターＤＮＡの組込みより同様に作製した。

完全細胞抽出物をＣｕ”誘発の後にＭｔＥｃＲＨｙ及びＭｔ　Ｈｙ細胞系の両方 から調製し、そしてこれらを高アフィニティーエクジソン類似体［＋２５Ｉ）ヨ ードボナステロンＡを用いてエフジステロイド−結合活性についてアッセイした 。このＭｔＥｃＲＨｙ抽出物はＭｔＨｙコントロール抽出物よりも７倍の飽和エ フジステロイド−結合活性を含んでいた。

誘発されたエフジステロイド−結合活性がＥｃＲポリペプチド自体に基づくかを 調べるため、アフィニティー精製抗−ＥｃＲポリクローナル抗体を用いる免疫沈 殿によってＭ　ｔ　Ｅ　ｃ　ＲＨｙ抽出物からＥｃＲ９ンバク質を除去する、又 はコントロールとしてこの抽出物を免疫前血清により擬似除去した。この処理抽 出物を次にエフジステロイド−結合活性についてアッセイした。擬似除去抽出物 と免疫−除去抽出物の比較は、はとんど結合活性が抗−ＥｅＲ抗体処理によって 除去されたことを示し、誘発されたエフジステロイド結合活性がＥｃＲタンパク 質に由来することを示唆した。

コントロール細胞系、ＭｔＨｙにおける内因性エフジステロイド−結合活性はＣ ｕ”暴露によって変化せず、そしてこれが由来する５ｅｈ−２１ｉｌ胞における それとほぼ同じであった。これら及びその他のショウジヨウバエ細胞系、並びに 胚抽出物におけるこの内因性活性が、その対応のゲノムにおけるＥｃＲ遺伝子の 発現に由来するかどうかの問題が生じる。この問題に答えるため、胚及び複数の 細胞系由来の抽出物を前記の通り免疫−除去及び擬似除去し、そしてエフジステ ロイド−結合活性についてアッセイした。ここでも、これらの処理抽出物の比較 は大部分の内因性結合活性が抗−ＥｃＲ抗体による処理によって各ケースにおい て除去されたことを示した。

従って、胚及び細胞系における全てでなければほとんどの内因性結合活性は常在 ＥｃＲ遺伝子に由来するようである。

方−汰 皿■隻 ホルモン及びＤＮＡ結合性実験のための組織培養細胞抽出物を以下の遺りに調製 した０ｗＪ胞を遠心フラスコの中で５〜７Ｘ１０”細胞／　ｍ　１の密度となる まで増殖させ、そしてＥｃＲ緩衝液（２５ｍＭのＨｅ　ｐ　ｅ　ｓ、ｐＨ７，０ ，４０５１ＭのＫＣＩ、１０％（Ｖ／Ｖ）のグリセロール、Ｉｓ＋ＭのＥＤＴＡ 、１１のジチオスレイトール及び以下のプロテアーゼインヒビターのカクテル： １０５ＭのＮａｇ　Ｓｔ　Ｏｓ、１００μＭのＰＭＳＦ、１μＭのロイペプチン 、１μＭのペプスタチン）中で１回洗った。全ての更なる操作は４℃で行った。

もとの培養容量の２％で細胞をＥｃＲ＠衝液に再懸濁し、３−１に小分けし、そ してブローブソニケータ−（Ｂｒｏａｓｏｒ＋　５ｏｎｉｆｉｅｒ　４５０）に よる３０回の１／２秒パルスを利用して音波処理し、〜９５％の細胞の破壊がも たらされた。１００．０００ｇで１時間の遠心後、１００μｌの上清液アリコー トを液体窒素中で凍結させ、そして−８０℃で保存した。標準品として牛血清ア ルブミンを用いてタンパク質濃度を測定し、典型的には６−１ｔ＊ｇ／■ｌであ った。胚抽出物は類似のプロトコールにより１ｉｖＪＩ、た、３〜６Ｒ間のＣａ ｎｔｏｎＳ胚を５５％の市販漂白剤で２分間脱漿膜し、０．７％のＮａＣ１中で 長い間洗い、そしてＥｃＲ１１衝液１ｍｌ当り２ｇの胚を再懸濁せしめた。胚を ＤｏｕｎｃｅホモジナイザーにおいてＢ型乳棒を用いて２０回たたくことにより 砕き、そして１ｉ１１ｉａ培養細胞のために用いたのと同じセツティングを利用 してブローブソニケーターによって溶解を完全にした。コノ抽出物を４００＠Ｍ （７）ＫＣＩニ調整し、１００，０００ｇで１時間遠心し、そして小分けした上 清液を凍結させた。この抽出物は１３．４ａｇ／層１のタンパク質を含んでいた 。ホルモン結合性において用いる前、これをＫＣＩを含まないＥｅＲ１ｌ衝液に おいて１０倍に希釈し、ＫＣＩの最終濃度を４０ｍＭにした。

±−）ｂ％７二殖豆１ヱヱ丸エ ホルモン結合性実験のため、抽出物とまずＥｃＲＭ、衝液で以下の濃度に希釈し た。ＭｔＨｙ及びＭｔＥｃＲＨｙ抽出物に関しては０゜９ｍｇ／■１、Ｓ２及び ５Ｒ３１，５抽出物に関しては３■ｇ　／ｙａ　ｌ、Ｋｃｌｌ胞抽出物に関して は４ｍｇ／ｍｌ、そして胚抽出物に関しては１゜３６７ｍ１．全ての繰作は結果 における定量誤差のため二重サンプルにおいて行った。免疫沈殿実験のため、抽 出物を免疫−除去、擬似−除去又は未処理のままとした。除去のため、３００ｕ ｌの希釈抽出物を２５℃にて３０分間、３．５μｍのアフィニティー精製抗−Ｅ ｃＲ抗体と、又は擬似−除去コントロールのために３．５μｌの免疫前血清とイ ンキュベートせしめた。次いでＥｃＲ＠衝液中の１０％のス！フィａコ−）カス アウレウス（Ｐａｎｓｏｒｂｉｎ、　Ｃａ１ｂｉｏｃｈｅ＋ｓ）　３８ｕ＋を加 え、そしてインキュベーションを２５゛ｃで１５分間続けた。マイクロ遠心機に おいて３分間遠心させた後、この上清液（抽出物の除かれた）を回収した。この 免疫沈殿を繰り返したが、但し胚抽出物のケースにおいては１回の免疫沈殿のみ にかけた。ｒ未処理」抽出アリコートはこの除去処理の間４°Ｃに放置し、そし て除去処理されたアリコートの最終濃度に合わせるためにＥｃＲ緩衝液によって 希釈した。

Ｐ、Ｃｈｅｒｂａｓの改良ホルモン−結合アッセイを用いた（Ｃｈｅｒｂａｓ＋ 　Ｐ。

１９８８、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’１．Ａｃ　ｄ、ｓｃｉ、、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８ ５：２０９６−２１００）、アッセイチューブには１４０μｍの抽出物、１４μ ｌの（＋２５１）ヨードポナステロン、及び１４μｌのＥｃＲ１１衝液又は競合 剤としての１４μｌのＥ　ｃ　Ｒ緩衝液中における未うヘル化２Ｏ−ＯＨエクジ ソンのいづれかを含ませた。（宜ｚｓＩ）ヨードポナステロンは２１７７Ｃ３／ １とし、そしてこのアッセイにおいて５Ｘ１０−’°Ｍの最終１度にて用いた。

２Ｏ−ＯＨエクジソンはこのアッセイにおいて２Ｘ１０”’Ｍの最終濃度とした 。２５℃で１時間のインキュベーションの後、この反応液を乾いたＷｈａｔｍａ ｎ　（ＪＦ／Ｃフィルター（２，４ｃｍ）にスボントとし、そして３０秒後、１ 分間にわた。って１０−１のＥｃＲ緩衝液をこのフィルターを介して吸引するた めに真空を利用してこのフィルターを洗った。フィルターを８００μｍ０４％の ＳＤＳに入れ、そして放射性活性をＴ−カウンターで測定した。示すホルモン結 合活性は、飽和結合活性（何ら競合剤を加えないアッセイにおいて測定される、 全結合活性として計Ｘ）から不飽和競合活性（ｉ！Ｉ剰量の未ラベル化エクジソ ンを加えたアッセイにおいて測定）を差し引いた値である。はとんどの活性抽出 物において、不飽和活性（抽出物における大量の低アフィニティー結合部位を意 味する）は全活性の１０％より低かった。

Ｂ、　におけるＥｃＲタンパク　の゛　−−節　−エクジソン−誘発性リポータ −プラスミド、ＰＥｃＲＥ／Ａｄｈ／βｇａｌ（図２）を生体内におけるＥｃＲ タンパク質の調節機能を調べるために作製した。このプラスミドにおけるリポー タ−遺伝子は、エクジソン−誘発性プロモーターに、ショウジヨウバエ　皇土旦 ｉ　ｅ上土Ｌｚ囚（Ｕ　ｌ　ｔ　ｒ　ａ　ｂ　ｉｔ　ｈ　ｏ　ｒ　ａ　ｘ　）遺 伝子の５′リーダー配列（ＵＢＸリーダー及びＡＵＧ）を介して連結しているる 配列より成る。このプロモーターはショウジヨウバエ　Ａｄｈ遺伝子（Ｐ　ｏａ ｍｈ−ｓａ＊ｓｓ　：示す数字は、これが−３４〜＋５３の位置の塩基対由来の 配列より成ることを示し、これはＴＡＴＡボ、りをまさに含む）に関する近位プ ロモーターの省略された（Ｔｒｕｃａｔｅｄ）型を、エクジソン−誘発性熱ショ ック遺伝子ｌ１Ｌ　２７ＣＲｉｄｄｉｈｏｕｇｈ　ａｎｄ　Ｐｅｌｈａｍ、　１ ９８７．ＥＭＢＯＪ、６：３７２９−３７３４）由来のエクジソン応答性因子（ ＥｃＲＥ）を含む７回反復している３４ｂｐの合成オリゴヌクレオチド（７Ｅｃ ＲＥ　ＯＬ　ＩＧＯ３）に融合すせることにより作り上げた。このリポータ−プ ラスミドのトランスフェクトされた細胞が適当なエクジソンレセプターを含むこ とを条件にこの７つのＥｅＲＥｓは省略プロモーターにエクジソン−誘発性を授 ける。

このエクジソン−誘発性リポータ−プラスミドはプラスミドｐＡｄｈ／βｇａ＋ （これはｐＥｃＲＥ／Ａｄｈ／βｇａｌと同類であるが、但しエクジソン応答性 因子の列を欠く）への７つのＥｅＲＥＯＬＩＧＯ３の挿入により作製される。ｐ Ａｄｈ／βｇａｌプラスミドは従ってエクジソン誘発性ではなく、そしてコント ロールとして働きうる。この推測を調べるため、５ｃｈ−２培養細胞（これらは 内因性エクジソン−結合活性を含むことが上記で示されている）を各プラスミド によりトランスフェクトせしめ、そしてエクジソンの有無においてβ−ガラクト シダーゼ活性について調べた。ｐＥｃＲＥ／Ａｄｈ／βｇａｌ）ランスフェクト された細胞におけるエクジソン中 用をほとんど及ぼさなかった。これらの結果は、ＥｃＲＥが予測通り、Ｐ□、− １４゜５．プロモーター上に基づ（エクジソン−誘発性を授け、そして５ｃｈ− ２細胞は機能的なエクジソンレセプターを含むことを示唆した。

このようなシステムにおけるＥｃＲレセプターの機能を調べるためには、機能的 なエクジソンレセプターを欠く宿主細胞が必要とされる。エクジソン−結合活性 、それ故機能的なレセプターを欠く「エクジソン−耐性」細胞は、数週間にわた ってエクジソン一応答性細胞をエクジソンに連続的に暴露せしめることにより作 られうる。

このエクジソン−耐性条件を次に無エクジソン培地に数ケ月維持する。エクジソ ン−耐性細胞系、５Ｒ５１，５は従って５ｃｈ−２細胞を３ＸｌＯ−’Ｍのエク ジソン中に増殖させることにより作られる。

５Ｒ３１，５細胞は有意なエクジソン−結合活性を欠く。

これらの細胞をｐＥｃＲＥ／Ａｄｈ／βｇａｌプラスミドによりトランスフェク トさせ、そしてその後エクジソンに暴露させると、非常にわずかなエクジソン− 誘発化β−ガラクトシダーゼ活性が観察され、これらの細胞があるとしてもほん のわずかな量の機能的レセプターを有することが示唆された。ＥｃＲ遺伝子の発 現がこの欠陥を「救う」ことができるかを調べるため、５Ｒ３１，５細胞と２種 類のプラスミドにより共トランスフェクトせしめた：エクジソンー誘発性リポー タープラスミド、ｐＥｃＲＥ／Ａｄｈ／βｇａｌ、及びＥｃＲ遺伝子に間する構 成的発現プラスミド（ここでＥｃＲＯＲＦの転写はショウジヨウバエ　アクチン 　５Ｃプロモーター、Ｐ　ａｃｚｓｃ　（図３）によりコントロールされる）。

これら２種のプラスミドによる共トランスフエフシラン、その後のエクジソンへ の暴露は、β−ガラクトシダーゼ活性の劇的な誘発をもたらす、従って、５Ｒ３ １，５細胞へのこのＥｃＲ発現プラスミドの導入は、それらが失っていたエクジ ソン−誘発性を再び発生せしめた。

亙−五 Ａｄｈ　ａｔ　ＥｃＲＥＡｄｈ　ａｌびＡｃｔＥｃＲブースミドの プラスミドｐＡｄｈ／βｇａｌは２つの工程において作製した。

ショウジミウバエ　Ａｄｈ末端プロモーターの−３４〜＋５３のヌクレオチドを 含むＰＤΔ５’−３４のＢｇｌｌ［−３ｃａｌフラグメントを、Ｓｅａ　Ｉ及び ＢａｍＨＩにより切断せしめたｐＵｃ１８にクローンせしめた。得られるプラス ミドをＥｃｏＲＩにより切断し、そしてｃＰ８ｂｘｄ６．２のＥｃ　ｏＲＩフラ グメント（Ｕｂｘ非翻訳化リーダー及びＡＵＧ、βｇａｌオープンリーディング フレーム、並びにＳＶ４０スプライス及びポリＡシグナルを含む）を挿入した。

ｐＡｄｈ／βｇａｌからｐＥｃＲＥ／Ａｄｈ／βｇａｌを作製するため、２種類 の３４残基数のオリゴヌクレオチドを合成した：５’　ＴＣＧＡＧＡＧＡＣＡＡ ＧＧＧＴＴＣＡＡＴＧＣＡＣτＴＧＴＣＣＡＡＴＧ３　’３’　ＣＴＣＴＧＴＴ ＣＣＣＡＡＧＴＴＡＣＧＴＧＡＡＣＡＧＧＴＴＡＣＡＧＣＴ５　’　。

これらはアニールして３０ｂｐの二重鎖を形成し、ここで示した通り、その５′ 末端に５ａｌｌに適合する４個のヌクレオチド突出しが伴う。この５′突出しを 介する更なるアニーリングは縦列の形成をもたらし、そしてこれはその５ａｌｌ 部位にて、省略ＡｄｈプロモーターのＴＡＴＡボックスからすぐ上流にてｐＡｄ 　ｈ／βｇａｌの中に挿入されうる。制限地図化はこれが７組の３４６ｐの繰り 返しの縦列を含むことを示し、そのそれぞれは工１Ｌ　２７遺伝子に存在する２ ３ｂｐのエクジソン応答性因子（ＥｃＲＥ）を含み、その１１ｂｐはフランキン グエ土Ｌ　２１配列及び５′突出しを表わす。

構成的ＥｃＲ発現プラスミドｐ　Ａ　ｃ　ｔ　Ｅ　ｃ　Ｒは、ＥｃＲタンパク質 をコードするＯＲＦ　（表２）を含むｐｂ８５１−４１２３を含むＶ４０ＢＳプ ラスミドのＥｃｏＲＶ部位に挿入せしめることにより形成される。この発現ベク ターは、ＳＶ４　Ｑスプライス及びポリＡシグナルを含むｃｏｓＰｎｅｏβ−ｇ ａｌのＸｂａｌ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、５ａｃＩ［及びＸｂａ　Ｉにより 切断せしめたブルースクリプト士ＫＳ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に挿入し、Ｅ ｃｏＲＩ及び５ａｃｎ末端をプラント化せしめることにょる２工程において作製 される。得られるプラスミドをＢａｍＨＩ及びＡｐａｌにより消化せしめ、そし てｐＰＡｃのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ７ラグメントを挿入し、そしてＡｐａＩ及 びＥｃ　ｏＲＩ末端をプラント化せしめる。

系５ＲＳＩ、５のトランスフェクション　び細胞系５Ｒ３Ｌ、５は、３ｘｌＯ− ’Ｍ（７）２０−ＯＫＸ’）’；Ｖ７（Ｓｉｇｍａ）の存在下において５ｃｈｎ ｅ　１ｄｅｒ系２（Ｓｃｈ−２）細胞を増殖せしめることにより得られた。この 処理は初期に５ｃｈ−２細胞の増殖を停止させるが、しがし調和された細胞は数 週間後によく増殖する。５Ｒ３Ｌ、５細胞をトランスフェクション実験において 用いる前に無ホルモン培地において洗い、そして無ホルモン培地において数回継 代培養した。細胞はリン酸カルシウム技術によってトランスフェクトせしめた。

細胞をｌｏμｇの利用したプラスミドそれぞれでトランスフェクトせしめた；一 種類のプラスミドのみをトランスフェクトせしめるとき、１０％ｇのＰＵＣはＤ ＮＡを担体として加えた。一般に、全てのトランスフェクションは二重で行った 。トランスフェクションの２４時間後、ホルモン処理すべき細胞を二つの皿に分 け、一方を２Ｘ１０−”Ｍの２Ｏ−ＯＨエクジソンで処理した。

一ガラクトシダーゼアッセイ トランスフェクションの４８時間後、２ｍｌの細胞をＰＢｓ（１３７ｍＭのＮａ Ｃｌ、２７ｍＭのＫＣＩ、６５５ＭのＮａｚ　ＨＰＯ４，１５ｍＭ（７）ＫＨｚ 　Ｐ　Ｏｓ　、ｐＨ６，８）中で１回洗い、そし７５０μｍの０．２５Ｍのスク ロース、１０１ＭのトリスｐＨ７，９，１０ｍＭのＥＤＴＡに再！９ｉＩｉシ、 全部で３サイクルの凍結／融解にわたり、液体窒素中での凍結及び３７℃の湯浴 中での融解を繰り返した。ｍ胞塊をマイクロ遠心機において４℃にて１０分間の 遠心により除去した。

上清液（細胞抽出物）中のタンパク質の製炭はＢｒａｄｆｏｒｄ法により、標準 品として生血清アルブミンを用いて測定し、そして典型的には１．　５　２．　 ５ｍｇ／ｍｌであった。抽出物を直ちにアッセイするか、又は凍結させ、そして 最大２週閣迄活性の損失を伴わずにアッセイされた。１０μｌの抽出物、又は適 当な希釈物に、５００μｌのアッセイ緩衝液（０，６ｍＭの４−メチルワンペリ フェリルーβ−Ｄ−ガラクトシド、６０−ｎのＮａｚ　ＨＰＯ４，４０ｍＭのＮ ａｐ２ＰＯ，、Ｌ　ＯＩＩＭ（７）ＫＣＬ　１．Ｏｙｍ！Ｉ（０ＭｇＳＯ４、ｐ Ｈ７，０）を加えた。３７℃で３０分間のインキュベージタン後、反応を３００ ｍ？１のグリシン、１５ｍＥＤＴＡ　ｐＨ１１，２５０（ｌｒｌにより停止させ た。この蛍光反応生成物をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　ＬＳ−５Ｂルミネッセン ス光度計において、λｅｘ＝３６５ｎ■及びλｅｍ−４５０ｒｖにて定量した。

βｇａｌ活性はアッセイしたμｇタンパク質当りの蛍光ユニットとして示した。

上記の章において詳細に結果の最も簡単なる説明は、ＥｃＲ発現性プラスミドに より発生するＥｃＲタンパク譬がリポータ−プラスミドのＥｃＲＥに結合し、そ してエクジソンとの紡合せにおいて、このプラスミドにおける最小Ａｄｈプロモ ーターを活性化せしめることである。以下の実験はＥｅＲタンパク質が試験管内 においてこのＥｃＲＥに対する特異的な結合性を示すがを調べるためにデザイン されている。

２種類のプラスミドを用いた：即ち、コントロールとして働くｐＵＣｌＢ、及び ３４ｂρのＥｃＲＥオリゴヌクレオチド由来の７つの反復を含むｐＥｃＲＥ／Ａ ｄｈ／βｇａｌ由来のＨｉｎｄｌＩ−ＸｈａｌフラグメントをｐＵｃ１８のＨｉ ｎｄｌＩ−ＸｂａＩフラグメントと置換することにより作られるｐＵｃ１８−Ｅ ｃＲＥである。これら２種のフラグメン１間の相違は７つのオリゴヌクレオチド 反復にのみあるため、このことがこの２種のプラスミドの閣の唯一の相違である 。

この２種のプラスミドをＡｐａｌＩ及びＨｉｎｄＩ［により消化し、ｘｔｐによ り末端ラベルし、モしてＣａ”“誘発によりＥｃＲタンパク質が過剰発現される ＭｔＥｃＲＨｙｉｌ胞からの抽出物（前記の章Ａを参照のこと）と混ぜた。Ｅｃ Ｒ−ＤＮＡ結合が生ずるよう２５℃にて１５分間のインキュベーシヨンの後、ア フィニティー精製抗−ＥｃＲ抗体を加えた。この２５℃インキュベーションを更 に４０分間続け、そして抗−ウサギＴｇ−コート化磁性粒子（ＤｕｐｏｎｔＭａ 　ｇｎａ　ｓ　ｏ　ｒ　ｔ−Ｒ）を加え、そしてインキュベーションヲ更に１５ 分間続けた。この溶液からこのビーズを磁気的に除去し、同様に洗い、そして１ ％のＳＤＳ中で６５℃にてこのビーズがらＤＮＡを溶離せしめた。溶離せしめた ＤＮＡをエタノール沈殿させ、そしてアガロースゲルにおける電気泳動により分 画し、これを乾燥させ、そしてオートラジオグラフにかけた。

ＥｃＲＥオリゴヌクレオチドを含むフラグメントのみがオートラジオグラフ上に 特異的且つ有効に示され、そしてこの表示は抗−ＥｃＲ抗体に依存していた。オ ートラジオグラフの定量分析はこのアッセイ条件（以下の方法の章を参照のとと ）のもとて平均ベクター配列より１０’倍優位なＥｃＲＥオリゴヌクレオチドへ の結ｆ１４示した。

本実験実施例の最初に示した点に従い、このＥｃＲタンパク質は明らかにエクジ ソンレセプターの定義を満足せしめる。

方−広 ＤＮＡ　人アッセイのための Ｑ　、２ｆｓｏｌｅの量の消化せしめた、ラベル化プラスミドＤＮＡを、１０μ ｌのＴＥ（１０＠Ｍのトリス−ＨＣＬ　ｐＨ８，０，１ｍＭのＥＤＴＡ）中の２ μｇの（ｄＶｄＣ）と混ぜ、そして１８０１のＫＣＩに調整せしめたＥｃＲ１１ 衝液において０．９Ｂ／ｍｌに迄希釈した９０μｌのＭｔＥｃＲＨｙ抽出物を加 えた。２５°Ｃで１５分間結合した後、ＥｃＲにおいて１．５Ｘに希釈した２ｍ ｌのアフィニティー精製抗−ＥｃＲ抗体を加え、そしてこのインキュベーション を２５°Ｃで４０分間続け、１８０＋＋ＭのＫＣＩのＥｃＲＪｌ衝液で交換せし めた５ｏｕｉの抗−ウサギＩｇ−コート化磁性粒子（Ｄｕｐｏｎｔ　Ｍａｇｎａ 　ｓ　ｏ　ｒ　ｔ−Ｒ）を加え、そしてインキュベーヨンを１５間続けた。

このビーズを４００μ＋の１８０ｍＭのＫＣＩ　ＥｃＲ緩衝液中で２回洗い、そ してＴＥ中の２００μｌの１％ＳＤＳ中で６５℃にて２回すすぐことによりこの ビーズからＤＮＡ溶離させた。溶離せしめたＤＮＡをエタノール沈殿し、そして アガロースゲル上で泳０し、これを乾燥してオートラジオグラフにかけた。コン トロールとして、処理したＤＮＡの半分（０、ｌ　ｆｍｏｌｅ）を比較のために このゲルで泳動させ、そして抗体を省いた結合アッセイを行った。

！施五■ レセプター遺伝子突然変異誘発。

ステロイドレセプター題材遺伝子における突然変異誘発はそれらの機能を２通り に変えることができる。最も明らかには、それらはレセプタータンパク質をコー ドする配列を変え、従ってレセプターの機能を変える。他方、それらはこれらの 遺伝子の発現性を変えることができる。この変更は遺伝子の転写からそのｍＲＮ Ａの翻訳上の発現の任意レベルでありうる。このような突然変異誘発は、この発 現の組織及び細胞分布の発展又は変化させる際の遺伝子発現の時期を変えること ができ、従って成長の行程をかなり変える。更に、突然変異誘発はレセプター遺 伝子発現の調節についての情報を提供する。これはこれらの遺伝子によりコード されるレセプターの構造を変える突然変異誘発が、このようなレセプタータンパ ク質コントロールを発現する遺伝子についての情報を提供するのと同じである。

特に、レセプター遺伝子発現を変える突然変異誘発はタンパク質及びその発現を コントロールするその他の調節分子の同定をもたらしうる。明らかに、昆虫ステ ロイドレセプター題材遺伝子の突然変異誘発は特異性の高い状態で昆虫成長を妨 げる能力をもたらす重要な道筋を提供し、従ってヒトの健康及び農業への昆虫の 来襲の災害をコントロールする。

我々はクローンせしめたステロイドレセプター題材遺伝子の２種類のショウジヨ ウバエ成分、Ｆ７５及びＥｃＲに関して突然変異誘発実験を行い、そしてそれら の発現について特徴付けした。この実験実施例においてＥ７５遺伝子の突然変異 誘発を詳細する。

Ａ、久夫又然変ｌ盈又 ショウジヨウバエにおいて、一定の遺伝子座についての遺伝子分析（この場合、 Ｅ７５遺伝子にとどまる７５Ｂでの初期パフ遺伝子その他の小さな突然変異を大 いに促進せしめる。隣接するドミナントのリンクルド（Ｗｒ　ｉ　ｎ　ｋ　Ｉ　 ｅ　ｄ）　（Ｗ）突然変異誘発に対して復帰変異体である突然変異体を単離する ことにより、我々は、ガンマ−線突然変異誘発（ゲノム構造のこのような大きな 変化を発生せしめるのに好ましい方法）により発生せしめた２種類の欠失体異８ ４及びＷ　ＲＩ　Ｉの染色体歩行（実験実施例■を参照のこと）における境界を 単層及び分子地図化した。これらのうちの一方、−曳１°は旦ユ旦遺伝子全体を カバーするようエエエ土上から遠くに広がり；そして他方、ｗ”は５０ｋｂのＦ ７５Ａ転写ユニットの５′末端のおよそ９０ｋｂ上流の位置迄法がり、そしてＥ ７５遺伝子を含まない。

次に、異８１０欠失体には含まれるがｖＬ口欠失体には含まれない、２００ｋｂ の末端領域に配置するガンマ−線−誘発突然変異体をスクリーンするためにＦ２ スクリーンを利用した。このスクリーンは、分子地図化データー実証がＥ７５遺 伝子を表示した単一の致死的相補性グループの５つの成分の単離をもたらした。

これら５つの突然変異体のうちで最も有用なのはＥ　７５　””突然変異体であ る。この突然変異体の分子地図化はこれがＥＴ５遺伝子全体を含む１０５ｋｂ領 域であることを示した。この方法はその他のＥ７５突然変異体のための非常に有 効なスクリーンを、即ち、この欠失突然変異体と相補でない突然変異体をスクリ ーンすることにより提供する。

Ｂ、エチルメ　ンスルホネートによ　したＥ７５′然・化学突然変異誘発剤、エ チルメタンスルホネート（ＥＭＳ）をこのスクリーンのために用い、これは位置 特異的又は小さな突然変異誘発を作るのに好ましい方法である。１５，０００種 の系のＦ２スクリーンは、Ｅ　７５　”’欠失体の１０５ｋｂｆｉｌ域における ２３種の浸透（ｐｅｎｅｔｒａｎｔ）突然変異体の単離をもたらし、これら全従 ってＦ７５はこの領域における唯一の致死的相補性グループであると考えられる 。上記の５つのＥ７５突然変異体を付加することにより、全部で２８種の浸透Ｅ ７５対立遺伝子が単離され、そのうちのい（つかは温度感受性対立遺伝子であっ た。

これらの対立遺伝子についての相補性研究及びその表現型の調査は複雑な相補グ ループを示した（複雑さはＥ７５遺伝子が２つの重複翻訳ユニット、即ち、５０ ｋｂのＦ７５Ａユニツト及び２０ｋｂのＥ７５ユニット（これはＦ７５Ａ−ユニ ットの３′末端を占める（実験実施例Ｔ及び表１を参照のこと））を含む事実に おそらく由来する）、これらの対立遺伝子は大まかに２つのグループに分けられ うる： （１）胚形成の後期の際又は初期幼虫成長の際の、初期成長において致死を生じ せしめるもの、並びに（２）さなぎ前又はさなぎ期の際の成長における後期に致 死を生じせしめるもの、である。

この分割はＥ７５Ａ及びＥ７５Ｂが発現するときの段階に関与する。従って、旦 工ｌΔ転写は、胚誘導及び初期幼虫段階を標的とするものを含む、エクジソンの ６回のパルスそれぞれに関達す・る、一方、Ｅ７５Ｂ　ｍＲＮＡは最後の幼虫段 階の終わりまで観察されず、さなぎ期中に特異的に豊富である。この関係は、初 期致死性突然変異体はＥ７５Ａユニット及びそのＥ７５Ａタンパク質の発現に影 響を及ぼし、そして後期致死性突然変異体はＥ７５Ｂユニ７）及びそのＥ７５Ｂ タンパク質の発現に特異的に影響を及ぼすことの考察も誘導する。この考察はこ れらの突然変異体の詳細な分子地図化及び致死性の原因を調べるための分子レベ ルでのその表現型の調査によって試験されうる。

ここで詳細の突然変異体はＥ７５遺伝子の更なる遺伝子分析についての原理を提 供し、これは適切なＥ７５発現及び機能のための必要条件の調査、並びに２７５ の構造的及びｍ能的ドメインの同定を可能とするであろう。いくつかの将来的な Ｅ７５研究はその試験管内操作、それに続くショウジヨウバエに戻る構造体の翻 訳によって最も優れて行なわれうる。最後に、相互作用する遺伝子座も同定する ことが所望されるであろう（相互作用はＥ７５発現の１１節のレベル又は他の遺 伝子によりコードされるものとの２７５タンパク譬の相互作用のレベルに起こり うる）、このような相互作用性の遺伝子座は、Ｅ７５突然変異体のサツプレッサ ー又はエンハンサ−として働く突然変異体の単離を介して同定できる。

立−汰 、マーカー　び　色 本発明のこの観点のため、以下の株、マーカー及び染色体を用いた。１且２はＬ ｉｎｄｓｌｅｙ（Ｌｉｎｄｓｌｅｙ、　１９７３　Ｄｉｓ　５０　：　２１）に 詳細されている。その他の全ての株及び突然変異体は（Ｌｉｎｄｓｌｅｙ、　ａ ｎｄ　Ｇｒｅｌｌ。

１９６Ｂ、　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｖａｒｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｄｒｏｓｏ　ｉｌａ 　ｗｂｅ旦鮒■Ｉ肛、　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　６２７．　Ｃａｒｎｅｇｉｅ 　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、 ＤＣ）に詳細されている。Ｌｉ　エ　Ｗ”　ｅ’　ｒｏ　ミニはＬｉ　エ立１５ ｂｄ２　工」２　と１工　ｓｂｄ”　ｅ’　Ｌ土　ユとの間の組換えによって作 製した。１工　土且　エエ　エ’　ｓｂｄ”染色体は、豊翼４及びｖＬｌｏにわ たってこの染色体のマーキング、及び７Ｍ３と交差せしめることによるホモ接合 、７Ｍ３への戻し交差、及び同質遺伝子同胞子系の接合を可能とするために１土 　１且り土　−ｐｐと５ｂｄｚとの組換えにより作製した。１工　旦Ｐ　Ｃ１１ 系を標準のイオン工程によってホモ接合させた。八１」Ｊ！及３Ｂ、８ｍ１２． １Ｘ−１４，２６１２、ｍ４５．３４土、１、ｍｚ４１６．１３ｍ１１５．０５ ２及びＷｓ　４９は５ｈｅａｒｎ　（１９７４）　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　７７　： 　１１５−１２５に詳細されている。上記の株及びその他の株を作製するのに用 いた株はＢｏｗｌｉｎｇ　Ｇｒｅｅｎ及びＣａ　１　ｔｅｃｈストックセンター より入手した。

ＴＭＩ　、７Ｍ３及び７Ｍ６Ｂ（Ｌｉｎｄｓｌｅｙ、　ａｎｄ　Ｇｒｅ１１＋　 １９６８．　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｖａｒｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｄｒｏｓｏ　ｈｉｌ ａ　ｍｅｌａｎｏ　ａｓｔｅｒ、　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　６２７．　Ｃａｒ ｎｅｇｉｅＩｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　Ｗａｓｈｉｎ ｇｔｏｎ、　ＤＣ）は、劣性致死性突然変異体を、組換えを抑えるための複数の 転化を伴って有するバランサー染色体である。このことは、本来の状態において 劣性致死性染色体をヘテロ接合体として保つことを可能とする。このような染色 体は常用の可視マーカーによってマークされてもよい。

″′然−の　のための　・サザンブロ・ト　ＤＮＡは、ハエの成虫（約５０匹） を１＋ｓｌの、１０−Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５，６０−ＭのＮａＣ１− １０＋ＭのＥＤＴＡ、０．１５＋＋＋Ｍのスペルミン、０．２−ｇ／■ｌのプロ テイナーゼＫに浸すことにより調製した。このホモジネート品を等容量の、０． ２Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９，０，３０−ＭのＥＤＴＡ、２％のＳＤＳ、０． ２ａ＋ｇ／購ｌのプロテイナーゼＫに加え、３７℃で１時間インキュベート、次 いで緩衝液−飽和フェノールで２回、そして２４：１のクロロホルム／イソアミ ルアルコールで１回抽出せしめた。ＤＮＡを２回ＥｔＯＨａ′殿し、遠心せずに このペレットを取り出した。サザンブロットハイブリダイゼーシゴンは詳細の通 りである（Ｓｅｇｒａｖｅｓ、　ｈ、ら、。

１９８４、　Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１７５　：　１−１７）　、親染色体 とバランサー染色体とを区別するのにｌｊｌ限フラグメント長さの多形性を用い ないとき、ゲロールされた。野生型ハンＦ′に対する欠失ヘテロ接合体の比較は 、この方法におけるコントロールバンドへと標準化せしめたとき、予測Ｉ：２の 比かられずかな偏差をもたらした。

−Ａ＝−［、、欠を五久ユニ＝ング 適当なサイズの制限フラグメントを調製用低融点アガロース（ＦＭＣ）を気泳動 により、約２０μｇの制限化ゲノムＤＮＡより単離した。６ｋｂのＷ”ｘｈｏＩ フラグメントをＸｈｏｌ−切断化λＳＥ６ＤＢａｍ　（これはベクターを増殖さ せるためにプラスミドとしてＦ３の５ｍ１１部位にクローン化せしめ、これも非 組換えクローンの増殖の阻止のための生化学的選別方法のためにＥｅｏＲＩで切 断せしめた。Ｘ３７ブレークボイントを含む７ｋｂのＥｅｏＲＩフラグメントを ＥｃｏＲＩ−切断化λ６０７にクローンせしめた。ｈｆｌＡ株ＲＹ１０７３に蟇 づく組換え体の平板培養は非組換えクローンによるプラーク形成を阻止した。１ ４ｋｂのＸ４８　ＥｃｏＲＩフラグメン１−をλＥＭＢＬ４のＥｃｏＲＩ部位（ これは組換え体についての「生化学的選別」を利用するためにＢａｍＨＩで切断 されている）にクローンせしめた。Ｘ４４−のブレークポイントフラグメント及 び感受性フラグメントをλＳＥ６ΔＢａｍにクローンせしめた。

Ｈｏｈｎ（ｌｌｏｈｎ、　Ｂ、、　１９７９、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ハ鉦艶シロ８　 ：　２７９−３０３＞に詳細の通り調製し７たλ試験管内パッケージング抽出物 を用いてライブラリーをパッケージ化した。それぞれのライブラリーが、このリ ゲーシジンにおいてインサートが含まれているときにのみ有意な数のプラークを 提供することが実証されたら、ブレークポイントクローンを検出できる制限フラ グメン］・を利用するスクリーンにそれらをかけた。

ガンマ−１然・　逢 雄の成虫の株工且　ｉ　光　ｓｈｄ”　土且２又は１工　１且ｒｉ　Ｐ’　ｓｂ ｄ”をプラスチック容器の中で、（：　ｓ１３？源からの５０００ｒａｄのガン マ−線（投射量は４３００ｒａｄ／分）によって照射せしめた。これらを次に純 潔な適切な株と接合させ、そして５日間にわたり卵を産ませた。

８ＭＳ７然・　憬 細菌及び酵母のＥＭＳ−誘発突然変異体における主な損傷は、グアニンからアデ ニンのアルキル化誘発転移である。ショウジヨウバエにおけるほとんどのＥＭＳ −誘発化位置特異的突然変異はこの原理に基づいて同じように説明されうる。こ の変化は相補鎖に基づいて、−と２」−繰り返し因子におけるＣのＴへの変換を 予測せしめ、フレーム内停止コドン（ＣＡＧＣＡＡからＬＩＡＧＣＡＡ又はＣＡ ＧＵＡ＾）をもたらしうる。（一定の値の不稔（ｓｔ、ｅｒｉｌｉｔｙ）に関す る大量の突然変異をもたらすと報告されているエチルニトロソウレア、ＥＮＵも アルキレータ−である；しかしながら、この突然変異誘導剤を用いるのにかなり の注意を必要とする）。

ＥＭＳを、絶食させていない生後１．５−５日の雄に、１％のスクロース溶液に おいて０．０２５Ｍで投与した（３５０■Ｉの牛乳びん中に２切れのＷｈａｔｍ ａｎ　＃２上で１．５ｍ１）、ＥＭＳ投与の８時間前での雄の絶食は受け入れる ことのできない不稔のレベルをもたらし、そして雄のｓｔ　Ｐ’　ｅ”株は絶食 させないで容易に２ＭＳ／スクロース溶液を摂取した。突然変異誘発は、突然変 異せしめた雄と一緒にいるーＸ　ＦＭＡ３雌とのかみ合わせによりモニターした 。このスクリーンにおいて見られたその他の突然変異には、Ｆ、及びＦ２世代に おける７Ｍ６Ｂに見られた大量の旦！対立遺伝子（多くのモザイク）、優性プ立 ユＺ対立遺伝子、並び２Ｎ［の新しい突然変異体、ウィンク（Ｗｉｎｋ）（Ｂａ ｒに４ＱでいるＰ染色体優性突然変異体）及び第三染色体優性ψ−リ一一様突然 変異体が含まれていた。ウィンクは容易にスコアーされ（ＰＫＩ）、完全な浸透 度を有し、そしてＴＭ６Ｂよりも健康であった．最初のスクリーンにおいて、バ イアルを突然変異体としてスコアーするのは、もしそれらがバランサーへテロ接 合バエの２５％以下を有するときであった．再試験により、これはコントロール 交差において見られるレベルの５０％にまで変化した．バランサーへテロ接合体 は、欠失ヘテロ接合体の約２／３ほと生存した．ｉｎ　Ｓｉｔ工訟Δじリし４随 ズニクＪ−乙及びｆｆｉ主梶多系染色体のｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーショ ンを実験実施例Ｉ（章Ａの方法を参照のこと）に詳細の通りに行った．細胞学分 析はラクト酢酸オルセイン（２％のオルセイン、５０％の酢酸、３０％の乳酸） 中で幼虫だ液腺をつぶすことにより行った。

本発明を例示によって詳細に説明してきたが、本発明の範囲を逸脱することなく 本発明の改良を行うことができる。

Ａ　ｗｍ−ｂｍ　＠１１　ａｍ　一−ａｍ−＋ｗ−一一−ｖｍ　ａｍ　ｗｅ　” ’ｔａｍｍｓπ幇ｆＩＩ１鵠ぽ１ｉリτ１幣Ｉ薦ゲＶ『式ｍｏｔｗｔ　＆ｎｅｍ ｍａｗｍｗ赫ｔａｒｍｅｔａｗｍ＋ｗｅｗｍａ＋＊ｗ　ｍ＋ｕ　ｗｎ　＆”ｌ１ ＋１　＆＋ｌｌｍｏｎ　ｍｔ＋ｔ＋ｍａ一一X．、〜レ，わ、細， ？ｇ帽尋一一−ｌｗ＆Ｍ１■竃電帽−Ｖ一−　−一昭一虐一一渭−−一ぽ撃一− 一繊噂！ｆ＃１１−−ａｌｌ６−！一ｇｗｗｗｗｍｍｗｍｗｍｗｅｓｍｍａｍｓ ｗａｇＭｌｗａｍａｓｗａｍａ’ｅＭ−自−ａｌｌｌ’Ｉｍ！１＋ｌａｌｌ＆Ｐ ｌ鳴Ｍａｍｍｙｍｍ４？喝＆＋壁！曽◆ＩＩｍ＄＋ｓｔａａｍａｔｒｌ＋ｌ＋ｓ ｔ＋ｍａｕｊｍｌｍＭｌｌ＆ｌｉ＋ｍｍｍ撃翌PＭＭｊａｎ＋ＩＩｓＭｌ？Ｉｌ （自）愼−』暢暢−一譜−一輻鳩−一暢一嬬　惰（至）一鱒−−−一−ぽ一虐丘 鳩一−む１釦ｌ＾ＭｅＭ雫一ｌ−＾嚇ｔｍａ一偏Ｖ嚇ｔ―−４噂赫１辞騙１−ｋ ｍ　−ａｌａ　ａｌａ　ａｌ−１−１−●−１ｗｌＪａ一噌一番一−ｋ香|＠ｗ 　赫一一赤 爾〒璽−ｍａｈｓ一轡膳一嶋惰−一嘩論−―　纜一―（自）一−一織Ｃ鈴４岱− 一哄一昭ｇ―ｎＩＩ１＋一樹一管一嗜−ＪＪＩ　ａｍ　ｍ　＆ｍ　ａｕ　ｗｍ　 ｍ　ｍ　ａａａ−　珈一一一−一一噌−ａａｎ　ｔｖ　ｍ　ｍ　ｗ一智X一 喝−ａｍ　ｓａ　ｍ眞情−一一一情樹−　ボ纒嬬礪慝纒纒繍−勘欅−一社一一― −−一一−一畠ｅ　ｋｍ　ｍｅ　Ｍｓ　ａｍ−ｌａｗ一●　一一ｍ　ｍ　ｍｍ　 ｍ　ａａｍ　ｍ　ｍ一階縫綱１１一楓ｎ嚇＾嚇＾ｍｗｓｗ４１１１ａｇｍｍｍｗ ｗＷｍ麺ｌＩｌ一−■ｕ鱈ｍ＃ｌ脚一−１＃一暉一ｌ一豐一緒１−−■＆Ｉｊ鑓 ！餉紗１Ｌ．　ｐ−一番一尋−一一−ＩｓｌＩ…１１１ｔ　＆糞一一酎ａｇ嘴鍍 −慴市嗜−一罐ぽ縛−ポＭ　ＩＩｓｌｍａｍｍａｒＮｅｎ＃ｍｌｍｅｍｍａｍａ ｕｌレ―ｊ　ｋｌ　ａｍ　ｌｌ＋ｌＩＩ′Ｉア．，．。、．１，蕾博、，．鼻ｗ ａｗａａｇｓ。．，自Ｆｌｍ９ロ『１１Ｃ一。。０赫『雫ａｍ　ａｍ　＆＋”　 ａｍ　ｍ−ｍ−縫−ｓｓｌ　ｍ　ｍ　ｍｌ　＆ｌａ　ＩＪＩ　Ｍ＆　：：ｕ＋’ 　ｗａｍａ＋＊ｍｗｍｗａｍａａ＊？１１ａＭ＋−鯖＆　ｆｌｌ＃　Ｗ　ｆｉ　 ｌａ　Ｍ″″“一一帛一＃　ｍ　＋ｘ　＃　ｍ　４１”“０２５〒Ａ　に？？ζ Ｋ一県心一τ鮎τＷ■αフ諷黒嚇−１店ｎｃＡ４蝉ＡｓｃにｊＡｔＪ ８０Ａ、、ｉ７．ＣＩ’りｎ　４．、Ａ７２−−ａ　Ｃ？：；　鮎ｔ＝＋：　ｌ ａ＋＋＋　ロＧ）Ｊ：　Ｃ？；　ＣＡＡ　−；（ＪＩＧ　Ａ；陽−−−−−−ｘ Ｃ：：−、、、−！’ｒｏ　ＬＪＩＪ　ＡＪＩＩ　Ｐｒｏ＾Ｌａ　Ｐ４Ｇｌｕ　 論Ｇｈｎ　Ｓｉｒ　Ｃ；ａｕ　Ｃｉｎ　ＧＡｕ　Ｐｎ＠　鮒Ｃ−＾閃？ｐ、＊） Ｃｏ　ＣＪＩ：　（ｎ　ＣＡＴ　ＣＴＣＡＱ：　ＣＡＧ　ＡＡＩ：　０００　Ｃ ＴＣＡＣＡ　ＡＴＣＡＣＣ：　ＡＴＴ　、、、Ｃｕ　１１I Ｓ＠＋ｅ　Ｈｉｓ　＾１ｍ　＋４Ｌｓ　Ｌｓｕ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　ＧＩ Ｙ　Ｌａｕ　τ？Ｊ　Ｉ五ａ　Ｔ’ｈｒ　Ｆｒｏ　ｉ↓＊Ｖ≠k　Ａｒｑ　Ｋ１ １ｌ Ａｃｒ　（１；ＴＯＧ’ＴＯｒ　Ｇ’：Ｃ，ＴＣＡ　ＣＣＡ　にＴ”　ＣＣＣ？ Ｗ　Ｃ’：　ＣＪＩ４　ｅ　、−、、、ＡＣＣＡｌ−〇　ＡnＣＧＡＡ ｌａｔ　Ｖａｌ　Ｖａｉ　Ｓａｔ　Ｖａｌ　Ｓａｔ　Ｐｒｏ　Ｖａｎ＾ｒｇ　Ｓ ｅｔ　Ｐｒｏ　Ｇｈｎ　Ｐｒｏ　５ｓｒ　Ｔｏｒ　Ｓａｔ　汲秩@ｋｕｓ ＣＴＣ；　ｋｋＧ　ＣＣＡ　ＣＡＧ　ＡＴＴ　！：℃ＧＡＧ　１ｌｌ−ＡＴ　Ａ ＴＣ；　α＝ＧＴＧ　α〕ＡＡＧ　：；ｗ　α℃ＣＮＧ　ＣbＴ −ｒｕ　Ｌｙｓ　＾（Ｍ　Ｃｉｎ　１；ａ　ＶａＩ　Ｇ几　＾ｔｐ　ＭＥ丁　７ ｍ　Ｖａｌ　−ｕ　二１１３　Ａｒｑ　Ｖａｌ　−ｕ　Ｇｉ氏@Ａｌａ 人＾＾　丁″ｒ　Ｃ＄　ＧＣＣｅ：　Ｃ１ｎ　ＣＡＴ　ＣＣＣＣ＆　、、−Ｗ　 ＡＣ：　！　２Ｇ　ｅ　ＣＡＴ　ＣＣ’Ｃ、Ｉ＆ムｙｓ　？ｈｍ　Ａｒｑ　Ａｌ ａ　Ｌｘｖ　Ａｒｑ　ＨＡｓ　Ａｒｑ　Ｇｌｕ　？ｈｒａ　ＧＸＬＩ　Ｔｈｒ　 ＾ａＡＧｌｕ　Ａ１１　＾１吹@＾ｉａｍｒ ＾ｃ’ｒ＝ａ：　ＡＣＴ　ｒ　ＱＧ：　？’Ｏ１；　入＾ＣＡｄ：　ＣＴＣＡＧ Ｔ　ｆｉ　！　ＭＴ　０　Ｃｅ　ＣＡＧ　ＡＧＩ：　ご；＾５ａａｒｓａｔτ１ −；ｓａｔＧ１ｙＳａｇｓｓｎ５ｍｔしｅｕｆｙａｒ＾五ＡＧａｙＳｓｃＰｔＯ ＾ｒｑＧＬｎｋｒ？＝。

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ｂ恢−２ ＥｃＲＯＲＦ ＦＩＧ、Ｊ。

要約書 本発明は昆虫ステロイドレセプターの特徴を有する昆虫ＤＮＡ配列の単離を含む 、更にこのＤＮＡ配列から推定される昆虫ステロイドレセプターに関する予測ア ミノ酸配列も詳細する。

国際調査報告 ｙＩｌ、（ｌａｉ＋ｓ＋ｗ　２コー４３１　ａ　ｐｏ上ｙｐｅｐｔｉｄｅ＋　ｃ ｌａｓｓｉｆｉｅｄ　ｉｎ　５３の／３５のＶＸＸ工、Ｃ１ｍ１ｓ　４４＋　ａ ｎｔｉｋ＋ｏｄｙ＋　ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ　Ｌｎ　３５の７３８７ＸＸ、　Ｃ ｌａｉｍｓ　５２　ａｎｄ　５３＋　ｆｕｓｉｏｎ　ｐａｌｙｐｅｐｔ工ｄｅ＋ 　ｃｌａｓｓ＋１ｆｉｅｄ　工ｎ　５３の／３５■

Claims (68)

【特許請求の範囲】
1. １．発現に基づき、天然以外の脊椎ステロイドレセプター又はそのフラグメント をコードすることが可能であり、ここで前記核酸がステロイド結合性ドメインに 実質的相同性を有する昆虫ステロイドレセプター超科成分遺伝子に由来するドメ インＡ，Ｂ，Ｄ，Ｅ又はＦのコード領域に実質的に相同な配列を有するセグメン トを含んで成る単離せしめた組換え核酸。
2. ２．前記昆虫ステロイドレセプター超科成分がＥｃＲ，ＤＨＲ３，Ｅ７５Ａ又は Ｅ７５Ｂである、請求項１に記載の単離せしめた組換え核酸。
3. ３．前記核酸が昆虫ステロイドレセプター超科成分に対するリガンドに結合でき るポリペプチドをコードする、請求項１に記載の単離せしめた組換え核酸。
4. ４．前記核酸が選択的ハイプリダイゼーション条件のもとで昆虫ステロイドレセ プター超科成分遺伝子にハイプリダイズすることができる、請求項１に記載の単 離せしめた組換え核酸。
5. ５．前記選択的ハイプリダイゼーション条件が緊張ハイプリダイゼーション条件 である請求項４に記載の単離せしめた組換え核酸。
6. ６．請求項１に記載の単離せしめた組換え核酸により形質転換されている細胞。
7. ７．２０個のヌクレオチドにわたり同一性を示す配列を有する、ステロイド結合 性ドメイン相同性を有する昆虫ステロイドレセプター超科成分のセグメントをコ ードする単離せしめた組換え核酸。
8. ８．前記核酸が、昆虫ステロイドレセプター超科のリガンドに応答性のコントロ ール因子に結合するポリペプチドをコードする、請求項７に記載の単離せしめた 組換え核酸。
9. ９．請求項７に記載の単離せしめた組換え核酸により形質転換されている細胞。
10. １０．２０−ＯＨエクジソンレセプター以外の昆虫ステロイドレセプター超科成 分に結合できるＤＮＡ配列を含んで成る単離せしめた組換え核酸。
11. １１．前記昆虫ステロイドレセプター超科成分がＤＨＲ３，Ｅ７５Ａ又はＥ７５ Ｂである、請求項１０に記載の単離せしめた組換え核酸。
12. １２．前記ＤＮＡ配列が前記昆虫ステロイドレセプター超科成分が結合すること に応答性である作動連結している配列の転写を促進せしめる、請求項１０に記載 の単離せしめた組換え核酸。
13. １３．前記ＤＮＡ配列がポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に作動連結してい る、請求項１０に記載の単離せしめた組換え核酸。
14. １４．前記の単離せしめた組換え核酸が発現ベクターである、請求項１０に記載 の単離せしめた組換え核酸。
15. １５．請求項１０に記載の単離せしめた組換え核酸により形質転換されている細 胞。
16. １６．前記細胞が昆虫ステロイドレセプター超科成分を更に含んで成る、請求項 １５に記載の細胞。
17. １７．組換え核酸であって： 昆虫ステロイドレセプター超科成分リガンドに応答性のコントロール因子； 非熱ショックプロモーター配列；及び リポーター遺伝子を含んで成る配列；を含んで成る核酸。
18. １８．前記非熱ショックプロモーター配列がアルコールデヒドロゲナーゼプロモ ーターである請求項１７に記載の組換え核酸。
19. １９．請求項１７に記載の組換え核酸により形質転換されている組換え核酸。
20. ２０．前記細胞が哺乳動物細胞である請求項１９に記載の細胞。
21. ２１．昆虫ステロイドレセプター超科成分のリガンドに応答性のコントロール因 子の更なるコピーを含んで成る、請求項１７に記載の組換え核酸。
22. ２２．リポーター遺伝子の発現をモニターする方法であって、請求項１７に記載 の組換え核酸を発現する段階を含んで成り、ここで前記リポーター遺伝子の前記 モニターにおいて放射活性因子を用いないことを特徴とする方法。
23. ２３．昆虫ステロイドレセプター超科成分又はそのフラグメントを含んで成るポ リペプチドであって、このポリペプチドが天然に結合している昆虫細胞成分を実 質的に含まず、そしてステロイド結合性ドメインを有する昆虫ステロイドレセプ ター超科成分の生物学的活性特性を示す、ポリペプチド。
24. ２４．前記昆虫ステロイドレセプター超科成分がＥｃＲ，ＤＨＲ３，Ｅ７５Ａ及 びＥ７５Ｂより成る群から選ばれる、請求項２３に記載のポリペプチド。
25. ２５．前記昆虫ステロイドレセプター超科成分又はそのフラグメントがＤＮＡ結 合性ドメインも含んで成る請求項２３に記載のポリペプチド。
26. ２６．前記昆虫がキイロショウジョウバエである請求項２３に記載のポリペプチ ド。
27. ２７．昆虫ホルモン及び昆虫ホルモン作動薬より成る群から選ばれるホルモン類 似体に結合できる請求項２３に記載のポリペプチド。
28. ２８．前記昆虫ホルモンがエクジステロイドである請求項２７に記載のポリペプ チド。
29. ２９．前記昆虫ホルモンが２０−ＯＨエクジソンである請求項２７に記載のポリ ペプチド。
30. ３０．昆虫ホルモンに応答性のＤＮＡコントロール因子に結合できる、請求項２ ３に記載のポリペプチド。
31. ３１．前記ポリペプチドがジンクフィンガードメインを含んで成る、請求項３０ に記載のポリペプチド。
32. ３２．前記昆虫ホルモン応答性ＤＮＡコントロール因子が前記結合に応答性であ る転写ユニットに作動連結している、請求項３０に記載のポリペプチド。
33. ３３．前記昆虫ホルモン応答性ＤＮＡコントロール因子が前記転写ユニットから 上流にある、請求項３２に記載のポリペプチド。
34. ３４．第２のポリペプチドに融合している請求項２３に記載のポリペプチド。
35. ３５．前記第２ポリペプチドが異種ポリペプチドである、請求項３４に記載のポ リペプチド。
36. ３６．前記異種ポワベプチドが第２ステロイドレセプター超科成分を含んで成る 、請求項３５に記載のポリペプチド。
37. ３７．前記フラグメントが共通Ｅ１領域配列に実質的に相同の配列を有する、請 求項２３に記載のポリペプチド。
38. ３８．前記フラグメントが共通Ｅ２領域配列に実質的に相同の配列を有する、請 求項２３に記載のポリペプチド。
39. ３９．前記フラグメントが共通Ｅ３領域配列に実質的に相同の配列を有する、請 求項２３に記載のポリペプチド。
40. ４０．前記フラグメントが： 共通Ｅ１領域配列に対して約２５％以上の相同性を有するセグメント； 共通Ｅ２領域配列に対して約３０％以上の相同性を有するセグメント； 共通Ｅ３領域配列に対して約３０％以上の相同性を有するセグメント；を含んで 成る、配列を有する請求項２３に記載のポリペプチド。
41. ４１．請求項２３に記載のポリペプチドを含んで成る組成物。
42. ４２．請求項２３に記載のポリペプチドを含んで成る細胞。
43. ４３．前記細胞がヒト細胞である請求項４２に記載の細胞。
44. ４４．請求項２３に記載のポリペプチドに対して結合特異性を示し、ここでこの 結合特異性が昆虫ステロイドレセプター超科成分の特徴的なエピトープに特異的 である抗体又はその結合性フラグメント。
45. ４５．昆虫ステロイドレセプター超科成分によって特異的に結合されることがで きるＤＮＡ配列を選別する方法であって、以下の段階： 請求項２３に記載のポリペプチドに対する結合性についてＤＮＡ配列をスクリー ンし；そして 前記結合性を示す前記ＤＮＡ配列を選別せしめることを含んで成る方法。
46. ４６．前記ＤＮＡ配列がＥｃＲ，ＤＨＲ３，Ｅ７４及びＥ７５遺伝子より成る群 から選ばれる遺伝子に作動連結している請求項４５に記載の方法。
47. ４７．昆虫ステロイドレセプター超科成分のホルモン結合性ドメインヘの結合に 関して特異的なリガンドを選別する方法であって、以下の段階； １もしくは複数種の超科成分への結合性について化合物をスクリーニングし；そ して 該成分に対する特異的な結合性を示す化合物を選別することを含んで成る方法。
48. ４８．前記リガンドがエクジステロイドである請求項４７に記載の方法。
49. ４９．前記リガンドが２０−ＯＨエクジソン拮抗薬である請求項４７に記載の方 法。
50. ５０．昆虫の生理的機能又は成長を調節する方法であって以下の段階： 昆虫ステロイドレセプター超科成分への結合性について化合物をスクリーニング ド； 前記結合性を示す前記化合物を選別し；そして昆虫に前記リガンドを投与するこ とを含んで成る方法。
51. ５１．前記調節が前記昆虫にとって致死的である、請求項５０に記載の方法。
52. ５２．昆虫ステロイドレセプター超科成分のホルモン結合性ドメイン及び第２ポ リペプチドを含んで成る融合ポリペプチド。
53. ５３．前記第２ポリペプチドが第２ステロイドレセプター超科レセプター成分由 来のＤＮＡ結合性ドメインを含んで成る請求項５２に記載の融合ポリペプチド。
54. ５４．請求項５２に記載の融合ポリペプチドをコードする核酸。
55. ５５．昆虫ステロイドレセプター超科成分のリガンド結合性ドメインヘの結合に 関して特異的なリガンドを選別する方法であって、以下の段階： （ｉ）請求項５２に記載の融合ポリペプチド（ここでこの融合ポリペプチドは第 ２ステロイドレセプター超科成分のＤＮＡ結合性ドメインに機能的に連結してい る前記リガンド結合性ドメインを含んで成る）と； （ｉｉ）第２ポリペプチドをコードする第２核酸配列（ここでこの第２核酸配列 の発現は前記ＤＮＡ結合性ドメインによる結合に応答性である）とを組合せ、そ して 前記第２ポリペプチドの発現を誘発する活性について化合物をスクリーニングし ；そして前記化合物を選別することを含んで成る方法。
56. ５６．前記組合せを細胞において行う請求項５５に記載の方法。
57. ５７．前記和合せ段階が、前記融合ポリペプチドをコードする核酸による前記細 胞の形質転換に基づく発現に由来する請求項５６に記載の方法。
58. ５８．昆虫の生理的機能を調節する方法であって、請求項５５に記載の方法によ り選別されたリガンドを昆虫に投与せしめる段階を含んで成る方法。
59. ５９．前記結合性ドメインが、ＥｃＲ，ＤＨＲ３，Ｅ７５Ａ及びＥ７５Ｂより成 る群から選ばれる昆虫ステロイドレセプター超科成分の結合性ドメインより選別 される、請求項５５に記載の方法。
60. ６０．前記リガンドが前記昆虫に致死的である、請求項５８に記載の方法。
61. ６１．２０−ＯＨエクジソンに対して応答性でない単離せしめたレセプターコン トロール因子であって、昆虫ステロイドレセプター超科成分に結合でき、そして 作動連結されている遺伝子の発現をコントロールできるＤＮＡセグメントを含ん で成る因子。
62. ６２．前記作動連結されている遺伝子が前記コントロール因子の約５０ｋｂ以内 にある、請求項６１に記載の単離せしめたレセプターコントロール因子。
63. ６３．前記昆虫ステロイドレセプター超科成分がＤＨＲ３，Ｅ７５Ａ又はＥ７５ Ｂである、請求項６１に記載の単離せしめたレセプターコントロール因子。
64. ６４．ポリペプチドを製造するための方法であって以下の段階：昆虫ステロイド レセプター超科リガンドヘの暴露に実質的に感受性でない細胞を選び； 前記細胞に： （ｉ）前記リガンドに対するレセプター；及び（ｉｉ）前記ポリペプチドをコー ドする核酸配列（ここでこの核酸配列は前記選別したリガンドの存在に応答性の コントロール因子に作動連結している）を導入せしめ、これによって形質転換細 胞が作られ；そして 前記形資転換細胞を前記リガンドに暴露せしめることを含んで成る方法。
65. ６５．前記細胞が哺乳動物細胞である請求項６４に記載の方法。
66. ６６．前記細胞を完全生物に導入することを更に含んで成る請求項６４に記載の 方法。
67. ６７．前記細胞が植物細胞である請求項６４に記載の方法。
68. ６８．前記リガンドが２０−ＯＨエクジソンである請求項６４に記載の方法。