JPH06505152A - 肝集積性転写因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ７、請求項３に記載の形質転換された宿主を培養する工程を含むＨＮＦ−４の製 造方法。

８、ＩＮＦ−４リガンドをコードするクローン。

９、ＩＮＦ−４タンパク質またはそのフラグメントに対して産生された抗体。

１０、該抗体がモノクローナル抗体である、請求項９に記載の抗体。

１１、ＨＮＦ−４またはその抗原性フラグメントを用いて生物を免疫し、さらに 産生された抗体を分離する工程を含む、ポリペプチドＨＮＦ−４またはそのフラ グメントに反応する抗体調製物の製造方法。

１２、該ＤＮＡ配列がプロモーターおよびレポーター配列に作動的に連結されて いる、請求項２のＤＮＡ分子。

１３、ＩＮＦ−４に反応するが、トランスサイレチンおよびアポＣ１１ｌ遺伝子 の・　転写に必要な部位に対して非反応性である抗体調製物。

１４、ＩＮＦ−４を認識するモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ。

１５、有効量の抑制剤をＩＮＦ−４レセプターに導入する工程を含む、ＩＮＦ− ４レセプター結合の抑制方法であって、該抑制剤が、ＩＮＦ−４に対するリガン ドまたはＨＮＦ−４に結合することができるそのフラグメントおよびＨＮＦ−４ を認識する抗体またはＩＮＦ−４に結合することができるそのフラグメンｌ゛か ら成る群から選ばれる、ＩＮＦ−４レセプター結合抑制方法。

１６、該抑制剤がＩＮＦ−４を認識するモノクローナル抗体の調製物である、請 求項１５の方法。

１７、発現に際してＩＮＦ−４またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列 、および発現に際して免疫グロブリン分子の定常領域をコードするＤＮＡ配列を 含む、発現に際してＩＮＦ−４／免疫グロブリン融合タンパク質をコードする組 換え体ＤＮＡ分子。

１８、ＩＮＦ−４レセプターのｍＲＮＡと雑種形成する核酸配列を含む、ＩＮＦ −４レセプターのｍＲＮＡに対してアンチセンスのオリゴヌクレオチド。

１９、該ｍＲＮＡのいずれの開始コドンとも結合する、請求項１８のアンチセン スオリゴヌクレオチド。

２０、ＤＮＡを含む請求項１９のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

２１、ＲＮＡを含む請求項１８のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

２２、ＩＮＦ−４のｍＲＮＡと雑種形成する核酸配列を含む、ＩＮＦ−４ｍＲＮ Ａに対するアンチセンスリボ核酸を、転写に際して生じる、ＤＮＡ配列を有する 組換え体ＤＮＡ分子でトランスフェクトされた、ＩＮＦ−４酸性細胞株。

２３、ＩＮＦ−４産生細胞株を、ＩＮＦ−４のｍＲＮＡと雑種形成する核酸配列 を含む、ＨＮＦ−４ｍＲＮＡに対するアンチセンスリボ核酸を転写に際して生じ る、ＤＮＡ配列を有する組換え体ＤＮＡ分子でトランスフェクトすることを含む 、ＩＮＦ−４発現減少を示す細胞株の調製方法。

２４、ＩＮＦ−４ｍＲＮＡを切断するりボザイム。

２５、ＩＮＦ−４と反応する抗イデイオタイプ抗体調製物。

２６、ＩＮＦ−４リガンドを同定する方法であって、（ａ）ＨＮＦ−４またはそ のフラグメントを認識する抗体を認識する抗イデイオタイプ抗体と結合するタン パク質について、タンパク質混合物をスクリーニングし、 （ｂ）該抗イデイオタイプ抗体と結合するこれらの分子を分離し、（Ｃ）これら のタンパク質のＨＮＦ−４結合能を調べる工程を含む同定方法。

２７、核種に結合されたＨＮＦ−４を認識する抗体を含む放射性免疫結合物。

２８、該核種が１１６ｉ、ｍＬｙおよび”’Ｒｅから成る群から選ばれる、請求 項２７の放射性免疫結合物。

２９、細胞毒を結合させた、ＩＮＦ−４またはそのフラグメントを認識する抗体 を含むイムノトキシン。

３０、薬剤の薬理活性を評価する方法であって、（ａ）リガンドをＩＮＦ−４レ セプターまたはそのフラグメントと反応させてリガンド／ＩＮＦ−４複合体を形 成し、 （ｂ）該リガンドＨＮＦ−４レセプター複合体を、その中に挿入されたＩＮＦ− ４応答エレメントをもつレポーター遺伝子に連結されたプロモーターを有するプ ラスミドと反応させ、さらに該レポーター遺伝子の転写を開始させ、（Ｃ）レポ ーター遺伝子転写量を調べ、かつ、（ｄ）標準と比較することを含む評価方法。

３１、薬剤の薬理活性を算定する方法であって、（ａ）リガンドをアポＣＩＩＩ レセプターまたはそのフラグメントと反応させてリガンド／アポＣＩＩＩ複合体 を形成し、（ｂ）該リガンドアポＣＩＩＩレセプター複合体を、その中に挿入さ れたアポＣＩＩＩ応答エレメントをもつレポーター遺伝子に連結されたプロモー ターを有するプラスミドと反応させ、さらに該レポーター遺伝子の転写を開始さ せ、 （Ｃ）レポーター遺伝子転写量を定量し、（ｄ）標準と比較することを含む算定 方法。

３２、該レポーター遺伝子がルシフェラーゼまたはＣＡＴを特徴とする請求項３ ０の方法。

３３．ＩＮＦ−４レセプター遺伝子をレポーター遺伝子に挿入するために、ウィ ルス性構築物が用いられる、請求項３０の方法。

３４、該リガンドがＨＮＦ−４レセプター拮抗物質である、請求項３０の方法。

３５、ＨＮＦｉレセプターのリガンド結合ドメインまたはそのフラグメント、お よび既知のりガントを有する別のレセプターのＤＮＡ結合ドメインを有するレセ プターを発現するキメラ構築物。

３６、該ＤＮＡ結合ドメインがグルココーチコイドレセプターに由来する、請求 項３５のキメラ構築物。

３７、請求項３５のキメラ構築物によってコードされるタンパク質質。

３８、ＨＮＦ−４レセプターまたはそのフラグメントに対する結合活性について の競合アッセーであって、 （ａ）既知量の標識された競合リガンドの存在下で、疑われるリガンドをＨＮＦ −４レセプターまたはそのフラグメントと反応させ、さらに（ｂ）結合標識量を 標準と比較することを含む競合アッセー。

３９、トランスサイレチンの遺伝子を認識し、結合するＨＮＦ−４応答エレメン ト。

４０、図３ＢのｃＤＮＡ配列を含むウィルス構築物。

４１、センスまたはアンチセンス方向にＩＮＦ−４をコードするｃＤＮＡを含む 発現ベクター。

４２、レポーター構築物およびプロモーターエレメントを宿主細胞に同時にトラ ンスフェクトした、請求項４１の発現ベクター。

４３、ＩＮＦ−４レセプターのリガンド結合ドメインをコードする遺伝子。

４４、該ＤＮＡ結合ドメインがエストロゲンレセプター由来である、請求項３５ に記載のキメラ構築物。

４５、下記ＤＮＡ配列から成る群から選ばれ、ＩＮＦ−４またはそのフラグメン トをコードする、ＤＮＡ配列またはその縮重変種：（Ａ）図３ＢのＤＮＡ配列： （Ｂ）標準的雑種形成条件下で先行のＤＮＡ配列と雑種形成するＤＮＡ配列；′ 　（Ｃ）先行のＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列を発現に際してコ ードするＤＮＡ配列。

４６、以下から成る群から選ばれ、ＨＮＦ−４またはそのフラグメントをコード するＤＮＡ配列またはその縮重変種を含む組換え体ＤＮＡ分子：（Ａ）図３Ｂの ＤＮＡ配列； （Ｂ）標準的雑種形成条件下で先行のＤＮＡ配列と雑種形成するＤＮＡ配列；（ Ｃ）先行のＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列を発現に際してコード するＤＮＡ配列。

４７、該ＤＮＡ配列が発現制御配列に作動的に連結されている、請求項４５また は４６のいずれかの組換え体ＤＮＡ分子。

４８゜該発現制御配列が、ＳＶ４０またはアデノウィルスの初期もしくは後期プ ロモーター、±１旦系、１工旦系、工Δ皇系、奥系、λファージの主要なオペレ ーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスフ ォグリセレートキナーゼのためのプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモー ター並びに酵母のα−接合因子から成る群から選ばれる、請求項４７の組換え体 ＤＮＡ分子。

４９、請求項４６のＤＮＡ配列から調製された別の種においてＨＮＦ−４につい てスクリーニングすることができるプローブ。

５０、下記ＤＮＡ配列から成る群から選ばれ、当該ＤＮＡ配列が発現制御配列に 作動的に連結されている、ＨＮＦ−４またはそのフラグメントをコードするＤＮ Ａ配列またはその縮重変種を含む組換え体ＤＮＡ分子で形質転換された単細胞宿 主： （Ａ）図３ＢのＤＮＡ配列； （Ｂ）標準的雑種形成条件下で先行のＤＮＡ配列と雑種形成するＤＮＡ配列；（ Ｃ）先行のＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列を発現に際してコード するＤＮＡ配列。

５１、該発現制御配列がＳＶ４０またはアデノウィルスの初期もしくは後期プロ モーター、Ｉ旦Ｓ−系、工工旦系、識系、ＴＲｐ系、λファージの主要なオペレ ーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスフ ォグリセレートキナーゼのためのプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモー ター並びに酵母のα−接合因子から成る群から選ばれる、請求項５０の単細胞宿 主。

５２、該単細胞宿主が、エスケリキア・コリー（大腸菌）、シュードモナス、バ チルス、ストレプトミセス、酵母、ＣＨＯ，Ｒ１，Ｌ　Ｂ−Ｗ、Ｌ−Ｗ、ＣＯ５ １、Ｃ０８７、ＢＳＣＬ　Ｂ５Ｃ４０およびＢＮＴｌ　０細胞、植物細胞、昆虫 細胞、並びに組織培養されたヒトの細胞から成る群から選ばれる、請求項５０の 単細胞宿主。

５３、検出可能な標識で標識された、請求項４６に定義されたＩＮＦ−４゜５４ 、検出可能な標識で標識された、請求項４９のプローブ。

５５、該標識が、酵素、蛍光を発する化学物質および放射活性元素から選ばれる 、請求項５３のＩＮＦ−４゜ ５６、該標識が、酵素、蛍光を発する化学物質および放射活性元素から選ばれる 、請求項５４のプローブ。

５７、実質的に他のポリペプチドを含まない成熟ＨＮＦ−４（ｍＨＮＦ−４）を 含む組成物。

５８、図３Ｂで説明された配列またはそのフラグメントから成る群から選ばれる ＨＮＦ−４のアミノ酸配列と実質的に相同なアミノ酸配列を含むポリペプチド。

５９、レプリコンおよび、ＨＮＦ−４をコードする異種コード配列を含むＤＮＡ 分子。

６０、宿主細胞中のＩＮＦ−４のコート配列の発現を達成させることができる転 写および翻訳制御配列の制御下にある、ＨＮＦ−４のコード配列を含むＤＮＡ分 子であって、該転写および翻訳制御配列が該コード配列に対して異種であるＤＮ Ａ分子。

６１、該コード配列がイントロンによって遮断されていない、請求項６０のＤＮ Ａ分子。

６２、該ＤＮＡ分子によって形質転換されていない細胞を実質的に含まない、請 求項６０のＤＮＡ分子によって形質転換された細胞構成物。

６３、該細胞が原核細胞である、請求項６２の細胞。

６４、該細胞が真核細胞である、請求項６２の細胞。

６５、該細胞が哺乳類細胞である、請求項６２の細胞。

６６、ｍＨＮＦ−４が発現される条件下で、請求項６０に記載のＤＮＡ分子によ って形質転換された細胞構成物を培養し、さらに発現されたｍＨＮＦ−４を回収 することを含むｍＨＮＦ−４の製造方法。

６７、該細胞が原核細胞である、請求項６６の方法。

６８、該細胞が真核細胞である、請求項６６の方法。

６９、該細胞か酵母である、請求項６６の方法。

７０、下記ＤＮＡ配列（Ａ）〜（Ｃ）から成る群から選ばれ、ＩＮＦ−４または そのフラグメントをコードするＤＮＡ配列またはその縮重変種に由来する、以下 の（ｉ）〜（ｉｉ）の工程を含むＩＮＦ−４の調製方法：（Ａ）図３ＢのＤＮＡ 配列； （Ｂ）標準的雑種形成条件下で先行のＤＮＡ配列と雑種形成するＤＮＡ配列；（ Ｃ）先行のＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列を発現に際してコード するＤＮＡ配列： （ｉ）該ＩＮＦ−４を含むことが知られている、組織および体液から選ばれる生 物学的サンプルを集め、 （ｉ）該生物学的サンプルからＨＮＦ−４を抽出し、（ｉｉ）工程ｉｉの抽出物 を精製して該ＩＮＦ−４を得る。

７１、請求項５０の形質転換された宿主を培養することを含む、ＨＮＦ−４の調 製方法。

７２、該ＤＮＡ配列が、下記ＤＮＡ配列から成る群から選ばれ、ＨＮＦ−４また はそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列またはその縮重変種に由来するＩＮ Ｆ−４に対する抗体： （Ａ）図３８のＤＮＡ配列； （Ｂ）標準的雑種形成条件下で先行のＤＮＡ配列と雑種形成するＤＮＡ配列；（ Ｃ）先行のＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列を発現に際してコード するＤＮＡ配列。

７３、多クローン性（ポリクローナル）抗体を含む、請求項７２のいずれかの抗 体。

７４、モノクローナル抗体を含む、請求項７２のいずれかの抗体。

７５、請求項７４に記載のモノクローナル抗体を産生ずる永久細胞株。

７６、検出可能な標識で標識された請求項７４の抗体。

７７、該標識が酵素、蛍光を発する化学物質および放射活性元素から選ばれる、 請求項７６の抗体。

７８、下記ＤＮＡ配列から成る群から選ばれる、ＨＮＦ−４またはそのフラグメ ントをコードするＤＮＡ配列またはその縮重変種に由来するタンパク質を接種さ れた観察可能な細胞性テストコロニーを含む、ＩＮＦ−４の産生および／または 活性を調節する能力について薬剤および他の物質をスクリーニングするためのア ッセー系； （Ａ）図３ＢのＤＮＡ配列； （Ｂ）標準的雑種形成条件下で先行のＤＮＡ配列と雑種形成するＤＮＡ配列；（ Ｃ）先行のＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列を発現に際してコード するＤＮＡ配列。

７９、下記（Ａ）〜（Ｃ）を含む、組織、血清または水性媒体中のＨＮＦ−４結 合活性または拮抗作用の実証用テストキット：（Ａ）該ＩＮＦ−４またはそれに 特異的に結合する相手を検出可能な標識と直接または間接的に結合させることに よって得られる、予め決定された量の免疫化学的に反応性のある少なくとも１種 の成分；ここで、該因子は以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のＤＮＡ配列から成る群か ら選ばれる、ＨＮＦ−４またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列または その縮重変種に由来するタンパク質を含む： （ｉ）図３ＢのＤＮＡ配列： （ｉ）標準的雑種形成条件下で先行のＤＮＡ配列と雑種形成するＤＮＡ配列；（ ｉｉ）先行のＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列を発現に際してコー ドするＤＮＡ配列； （Ｂ）他の試薬、および （Ｃ）該キットの使用説明書。

８０、下記ＡおよびＢを含む、哺乳類の疾患、遺伝的異常または外傷の治療用医 薬組成物： Ａ、ＨＮＦ−４、該因子の産生および／または活性を促進することができる物質 、該因子の活性を模倣することができる物質、該因子に対する抗体、該因子に対 する拮抗物質、該因子の産生および／または活性を抑制することができる物質、 およびその混合物から成る群から選ばれる物質の治療的有効量：ここで、該因子 は、以下の（ｉ）〜（ｉｉ）のＤＮＡ配列がら成る群がら選ばれる、ＩＮＦ−４ またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列またはその縮重変種に由来する 精製形のタンパク質を含む： （ｉ）図３ＢのＤＮＡ配列； （ｉｉ）標準的雑種形成条件下で先行のＤＮＡ配列と雑種形成するＤＮＡ配列； ’　（ｉｉ）先行のＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列を発現に際し てコードするＤＮＡ配列；またはそれと特異的に結合する相手；およびＢ、医薬 的に許容できる担体。

８１、患者にＩＮＦ−４またはアポＣＩＩＩに対するリガンドの有効量を投与す ることを含む、心脈管系疾患を治療する方法。

８２、患者にＨＮＦ−４またはアポＣＩＩＩに対するリガンドの有効量を投与す ることを含む、体重減少誘発治療の必要な患者に、体重減少を誘発する方法。

明細書 本発明は、肝関運転写因子、および特に種々の遺伝子の調節に関与するような因 子、例えば脂肪およびコレステロール輸送に係わる幾っがのアポリポタンパク質 に関する。

本発明はまた、ＨＮＦ−４レセプターを認識する抗体、並びにＩＮＦ−４に対す る抗体およびＨＮＦ−４と結合するりガントの両方を認識する抗イデイオタイプ 抗体に関する。

本発明ハマた、ＩＮＦ−４のｍＲＮＡに相補的なアンチセンスＤＮＡおよびＲＮ Ａ分子、並びにこのｍＲＮＡを認識するりボザイムに関する。

本発明はまた、上記の分子、ＤＮＡ配列、抗体、抗イデイオタイプ抗体、アンチ センス分子およびリボザイムの使用方法、例えば、ＩＮＦ−４との結合を検出し 、抑制し、または強化するための診断薬および治療薬の開発に使用する方法に関 する。

疾病の研究、診断、予防および治療のための新規な手段を提供することが、本発 明の主要な目的である。より具体的には、本発明の目的は、ＨＮＦ−４との結合 に係わる分子を提供し、さらに、そのような結合を抑制するうぇで有用な他の分 子を分離することである。

本発明は、ＩＮＦ−４の発現をコードするＤＮＡ配列、ＩＮＦ−４のゲノムＤＮ Ａ配列、これらのＤＮＡを含む組換え（リコンビナント’）ＤＮＡ分子、これら のＤＮＡで形質転換（トランスフオーム）された単細胞宿主、そのようなレセプ ターを製造する工程、および通常は付随する動物性タンパク質を本質的に含まな いタンパク質を提供する。

本発明はまた、ＨＮＦ−４と反応する抗体調製物を提供する。

ＩＮＦ−４に対するリガンドを認識する単クローン性（モノクローナル）抗体は 、直接、または第三の分子と結合ないしは相互反応することによって、リガンド 結合を抑制することができる。そのような分子は、例えばリガンドの表面構造を 変化させることにより、ＨＮＦ−４に対するリガンド親和性を低下させることが できるかもしれない。

本発明はまた、ＨＮＦ−４のＤＮＡ配列を含む組み換えＤＮＡ分子、およびそれ らで形質転換した単細胞宿主を提供する。本発明はまた、通常付随する動物性タ ンパク質を本質的に含まないＨＮＦ−４タンパク質、およびＩＮＦ−４を認識す るモノクローナル抗体を提供する。

本発明はさらに、ＩＮＦ−４発現を抑制するためにアンチセンス核酸を使用する 方法をも提供する。本発明はまた、そのリガンドとＨＮＦ−４との結合を抑制す る能力について分子をスクリーニングすることによって、結合抑制物質を同定す る方法に関する。本発明はリガンドを同定する方法を提供する。そのような方法 の一つは、ＨＮＦ−４またはＨＮＦ−４のリガンドを認識する抗体に対する抗イ デイオタイプ抗体の使用を伴う。

発明の背景 細胞の型特異性は、特異的遺伝子の発現によるものであり、これは、少なくとも 部分的には、対象となる細胞に、対象となる時期に存在し、活性化している特定 の転写因子群によって順次決定されていく。転写により制御される広範囲の遺伝 子が存在する、特に肝臓において、そのような因子の多くが同定され、その性状 が決定された（　ＭｃＫｎｉｇｈｔ　＆　Ｐａ１ｍ１ｔｅｒ　、１９７９　；Ｄ ｅｒｍａｎら、１９８１）。いくつかの転写因子、例えばＡＰ−ｆｆｌおよび５ ｐ−１は、常にすべての細胞に存在しているようであるが、他の因子はより限定 的に分布する。この多くの因子の分布を説明できる明瞭な理論が存在するか否か は、現在まだ分かつていない。この問題の二つの局面が特に重要である。第一の 局面は、異なる対象における因子の分布は転写の段階で制御されるか否かを決定 することである。もしその通りであるなら、最終的に細胞特異性を生じる転写調 節カスケードが示唆される。第二の問題は、何らかの特定の因子が、特定の代謝 的または生理学的ゴールの達成に対して中核をなしているか否かである。そのよ うなゴールは、相互反応遺伝子群に作用する因子により想定されるかもしれない 。

これらの問題は、本出願者らおよび他の者たち（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９０） により、肝細胞で本来発現される遺伝子のプロモーター／エンハンサー領域を解 体および解析することによって強調され始めた。細胞特異的発現を付与するＤＮ Ａ構成分子は、培養細胞（例えばヘパトーマ対ＨｅＬａ　（ヒーラ）細胞）への 一時的ＤＮＡ感染（トランスフＬクシ９ン）、および／またはインビトロ転写ア ッセーによって明らかにされ、これらの構成分子に結合するタンパク質は、肝臓 の細胞核の粗抽出物を用いたＤＮＡ結合分析によって同定された。この方法では 、これまでのところ、肝臓に豊富な少なくとも４つの異なるタンパク質因子が発 見された（ＨＮＦＩ　（ＬＦ−Ｂｌ）　（Ｃｏｕｒｔｏｉｓら、１９８７；　Ｍ ｏｎａｅｉら、１９８８）　、Ｃ／Ｅ　Ｂ　Ｐ’（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９８７ ）　、ＨＮ　Ｆ　−３およびＨＮ　Ｆ　−４ＣＣｏ５ｔａら、１９８’ｌ）　） 　、　ＨＮＦｌ　（類似ドメインタンパク質）　（Ｆｒａｉｎら、１９８９；　 Ｂａｕｍｈｕｅｔｅｒら、１９９０）　、Ｃ／ＥＢＰ　（本来のロイシンジッパ −タンパク質）　（Ｉ、ａｌｄｓｃｈｕｌｚら、１９８８）　、およびつい最近 にはＩ（ＮＦ−３Ａ（既知の転写因子系とは類似性をもたないＤＮＡ結合タンパ ク質）（Ｌａｉら、１９９０）が、すべて精製され、クローニングされ、それに よって各々の分布および調節を決定することができる。

以下の文献が本出願文書に引用されている。各々の文献は参考文献として本書に 取り込まれている。

ｖｏｎ　ｄｅｒ　Ｄ、＾ｈｅ、　Ｓ、　Ｊａｎｉｅｈ、　Ｃ，５ｃｈｅｉｄｅｒ ｅｉｔ、　Ｒ，Ｒｅｎｋａｗｉｔｚ、　Ｇ、　５ｃｈｕｔｚA　Ｍ。

Ｂｅａｔｏ（１９８５）糖性皮質性ステロイド（グルココーチフィト）およびプ ロゲステロンレセプターは２種のホルモン調節プロモーターの同一部位に結合す る：　Ｎａｔｕｒｅ。

３１３、　７０６−７０９゜ Ｓ、　ｈｕｍｈｕｅｔｅｒ、　Ｄ、　Ｂ、　Ｍｅｎｄｅｌ、　Ｐ、　Ｂ、　Ｃｏ ｎ１ｅｙ、　Ｃ，Ｊ、　ｈａ、　Ｃ，Ｔｕｒｋ、　Ｍ−ｋ。

Ｇｒａｖｅｓ、　Ｃ，Ａ、　Ｅｄｗａｒｄｓ、　Ｇ、　Ｃｏｕｒｔｏｉｓ、　Ｇ 、　Ｒ，Ｃｒａｂｔｒｅｅ　（１９９０）　ＩＮＦ−１はＰＯＵドメインタンパ ク質と３種の配列モチーフを共有し、ＬＦ−Ｂ１およびＥ、　Ｈ，Ｂｉｒｋｅｎ ｍｅｉｅｒ、　Ｂ、　Ｇｗｙｎｎ、　Ｓ、　Ｈｏｗａｒｄ、　Ｊ、　Ｊｅｒｒｙ 、　Ｊ、　１．　Ｇｏｒｄｏｎ、　v、　Ｈ。

Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ、　Ｓ、　Ｌ、　ＭｃＫｎｉｇｈｔ　（１９８９）　ＣＣ ＡＡＴ／−ｕンハーンサー結合タンパクＮ、　Ｂｒａｎｄ、　Ｍ、　Ｐｅｔｋｏ ｖｉｃｈ、　Ａ、　Ｋｒｕｓｔ、　Ｐ、　Ｃｈａｍｂｏｎ、　Ｈ，ｄｅ　Ｔｈｅ 、　Ａ、　Ｍａｒｃ■奄潤A　Ｐ。

Ｔｉｏｌｌａｉｓ、　Ａ、　Ｄｅｊｅａｎ　（１９８８）　第二のレチノイン酸 レセプターの同定：　Ｎａｔｕｒｅ。

３３２、８５０−８５３゜ Ｊ、　Ｂｒｅｓｌｏｗ　（１９８８）アポリポタンパク質の遺伝子変動とヒト疾 患：均■≦神ＬＤ、　Ｊ、　Ｃａｐｏｎら、（１９８９）　エイズ治療のための ＣＦ４免疫吸着物のブザイニング：　Ｎａｔｕｒｅ、　３３７．５２５−５３１ ゜Ｒ，Ｃａｒｌｓｓｏｎ、　Ｃ，Ｇｌａｄ　（１９８９年６月）９０年代に向け てのモノクローナル抗体：　Ｂｔｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　７．５６７−５ ７３゜Ｒ，Ｃａｔｅｒら、（１９８６）　７ラ一氏抑制物質（Ｍｕｌｌｅｒｉａ ｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　５ｕｂｓｔａｎｃｅ）のウシおよびヒト遺伝子の分 離と動物細胞内でのヒト遺伝子の発現：　Ｃｅ１１．４５．６８５−５９８゜ Ｔ、　Ｒ，Ｃｅｃｈ　（１９８８）リボザイムとその医学的意義：　Ｊ、　Ａｍ ｅｒ、　Ｍｅｄ、　Ａｓ５ｎ、、　２６０゜３０３０−３０４４゜ Ｐ、　ＣｈｏＩ［１ｅｚｙｎｓｋｉ、　Ｎ、　５ａｃｃｈｉ　（１９８７）　酸 グアニジニウムチオシアネートーフェノール−クロロホルム抽出によるＲＮＡの 一工程分離法：Ａｎａ１．　Ｂｉｏｃｈｅｕ、　１６２゜１５６−１５９゜ Ｒ，Ｈ，Ｃｏ５ｔａ、　Ｌ　Ｉ、ａｔ、　Ｊ、　Ｂ、　Ｄａｒｎｅｌｌ、　Ｊｒ 、　（１９８６）？ウスプレアルブミン（トランスサイレチン）遺伝子の転写制 御：プロモーター配列および別個のエンハーンサーは細胞特異的である：　Ｍｏ １．　ａｎｄ　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、　６．４６９７−４７０８゜、　Ｒ， Ｌ　Ｃｏ５ｔａ、　Ｄ、　Ｒ，Ｇｒａｙｄｏｎ、　Ｋ、　Ｇ、　Ｘａｎｔｈｏｐ ｏｕｌｏｓ、　Ｊ、　Ｅ、　Ｄａｒｎｅｌｌ、　Ｊ秩B （１９８８）肝特異的ＤＮＡ結合タンパク質はトランスサイレチン、ａｌ−アン チトリプシン、アルブミン、シミアンウィルス４０遺伝子の制御領域の多数のヌ クレオチド部位を認識する：Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、 　８５．３８４０−３８４４゜Ｒ，Ｈ，Ｃｏ５ｔａ、　Ｄ、　Ｒ，Ｇｒａｙｓｏ ｎ、　Ｊ、　Ｅ、　Ｄａｒｎｅｌｌ、　Ｊｒ、　（１９８９）　トランスサイレ チンとａｌ−アンチトリプシン遺伝子の調節における肝細胞集積性核因子の多（ の機能：　Ｍａｔ、　ａｎｄ　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、　９．１４１５−１４ ２５゜Ｒ，Ｈ，Ｃｏ５ｔａ、　Ｔ、んＶａｎ　Ｄｙｋｅ、　Ｃ，Ｙａｎ、　Ｆ、 　Ｋｕｏ、　Ｊ、　ｆＥ、　Ｄａｒｎｅｌｌ、　Ｊｒ、　（１９９O） トランスサイレチン遺伝子発現の類似性と転写因子の差異：絨毛叢と比較した肝 および卵黄嚢：　Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８ ７．６５８９−６５９３゜Ｇ、　Ｃｏｕｒｔｏｉｓ、　Ｊ、　Ｇ、　Ｍｏｒｇａ ｕ、　Ｌ、　Ａ、　Ｃａｍｐｂｅｌｌ、　Ｇ、　Ｆｏｕｒｅｌ、　Ｇ、　Ｒ，Ｃ ｒａｂ狽窒■■ （１９８７）肝特異的核因子とフィブリノーゲンおよびａｌ−アンチトリプシン プロモーターとの相互作用：　５ｃｉｅｎｃｅ　２３８．６８８４９２゜Ｍ、　 Ｄａｎｉｅｌｓｅｎ、　Ｌ、　Ｈｉｎｃｋ、　Ｇ、　Ｍ、　Ｒｉｎｇｏｌｄ　（ １９８９）　最初のジクフィンガーの付は机内の２つのアミノ酸はグルココーチ コイドレセプターによりＤＮＡ応答構成分子（エレメント）の活性化を特異化す る：　Ｃｅ１ｌ、　５７．１１３１−１１３８゜Ｍ、　Ｍ、　Ｄａｖｉｓ　（１ ９８６）　減数性ｃＤＮ’Ａ雑種形成とＴ細胞レセプター遺伝子：Ｈａｎｄｂｏ ｏｋ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ＩＩｕｎｏｌｏｇｙ（全４巻）第４版 、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ社、オ ックスフォード、イギリス、７６、１−７６、１３．　Ｍ、　Ｉｔ　Ｄａｖｉｓ ら、（１９８４）　細胞型特異的ｃＤＮＡプローブとネズミｌ領域：その位置決 定と方向性：　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ、　８ １．２１９４−２　１９８゜Ｅ、Ｄｅｒｍａｎ、Ｋ、Ｋｒａｕｔｅｒ、Ｌ、Ｗａ ｌｌｉｎｇ、Ｃ，Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ、Ｍ、　Ｒａｙ、Ｊ、Ｅ、Ｄａｒｎｅｌ ｌ。

Ｊｒ、　（１９８１）肝特異的ｍＲＮＡの産生における転写制御：　Ｃｅ１ｌ、 　２３．７３１−７３９．　Ｈ。

ｄｅ　Ｔｈｅ、　Ａ、　Ｍａｒｃｈｉｏ、　Ｐ、　Ｔｉｏｌｌａｉｓ、　Ａ、　 Ｄｅｊｅａｎ　（１９９７）　ヒト肝細胞癌で不適切に発現した新規なステロイ ド甲状腺ホルモンレセプター関連遺伝子：　Ｎａｔｕｒｅ３３０゜６６７−６７ ０゜ Ｊ、　Ｒ，Ｄｕｇｕｉｄら、（１９８８）　ｃＤＮＡライブラリーの減数性雑種 形成によるスクレーピー調節ＲＮＭＡｓのｃＤＮＡの分離：Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔ ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８５゜５７３８−５７４２゜ Ｒ，Ｍ、　Ｂｖａｎｓ　（１９８８）　ステロイドおよび甲状腺ホルモンレセプ ター玉料：５ｃｉｅｎｃｅ　、　２４０．８８９−８９５゜Ｓ、　Ｅ、　Ｆａｗ ｅｌｌ、　Ｊ、んＬｅｅｓ、　Ｒ，Ｗｈｉｔｅ、　Ｉｔ　Ｇ、　Ｐａｒｋｅｒ　 （１９９０）　７ウスエストロゲンレセプターのステロイド結合活性および二量 体化活性の性状決定と共通所在部位決定：　Ｃｅ１ｌ、　６０．９５３−９６２ ゜Ａ、　Ｐ、　Ｆｅｉｎｂｅｒｇ、　Ｂ、　Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ　（１９８３ ）　放射能標識ＤＮＡのエンドヌクレアーゼ制限酵素フラグメントの高比活性の ための技術：　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１３２．６−１３゜ Ｒ，Ａ、　Ｆｉｓｈｅｒら、（１９８８）　ＨＩＶ感染はりコンビナンド可溶性 ＣＤ４ｉ、：よってインビトロで阻害される：　Ｎａｔｕｒｅ、　３３１．７６ −７８゜Ｂ、　ＶＬＦｏｒｍａｎ、　Ｃ，Ｒ，Ｙａｎ、　Ｋ　Ａｕ、　Ｊ、　Ｃ ａ５ａｎｏｖａ、　Ｊ、　Ｇｈｙｓｄａｓｌ、　Ｈ，Ｈ，Ｓａｍｕｅ撃■ （＋９８９）　ロイシンジッパ一様モチーフを含むドメインは、甲状腺ホルモン およびレティノイック酸レセプターの間の新規なインビボ相互反応を仲介する： 町ＬＢ、　ｌｉＬ　ＦｏｎＩＩａｎ、　Ｈ，Ｈ，Ｓａｍｕｅｌｓ　（１９９０） 　核ホルモンレセプターの亜科の間の相互反応：調節ジッパ−モデル：　Ｍｏ１ ．　Ｂｎｄ、、　４．１２９３−１３０１゜Ｍ、　Ｆｒａｉｎ、　Ｇ、　Ｓｗａ ｒｔ、　Ｐ、　Ｍｏｎａｃｉ、　Ａ、　Ｎ１ｅｏｓｉａ、　Ｓ、　Ｓｔａｍｐｆ ｌｉ、　Ｒ，ＦｒａｎｋA　Ｒ。

Ｃｏｒｔｅｓｅ　（１９８９）　肝特異的転写因子ＬＦ−Ｂｌは高度に分化した ホメオボックスＤＮＡ結合ドメインを含む二鮭、　５９．１４５−１５７゜Ｉｔ 　Ｆｒ１ｅｄ、　Ｄ、　Ｋ　（１９８１）　ポリアクリルアミドゲル電気泳動に よるｌａｃリプレッサー／オペレーター相互作用の平衡とキネティクス：　Ｎｕ ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、。

９、６５０５−６５２５゜ Ｖ、　Ｇｉｇｕｅｒｅ、　Ｎ、　Ｙａｎｇ、　Ｐ、　Ｓｅｇｕｉ、　Ｒ，Ｉｔ　 Ｅｖａｎｓ　（１９８８）新規な種類のステロイドホルモンレセプターの同定： 　Ｎａｔｕｒｅ、　３３１．９１Ｊ４゜Ｃ，Ｋ、　Ｇｌａｓｓ、　Ｓ、　ＩＬ　 Ｌｉｐｋｉｎ、　０．　Ｖ、　Ｄｅｖａｒｙ、　Ｉｔ　Ｇ、　Ｒｏｓｅｎｆｅｌ ｄ　（＋９８９）　激e ィノイック酸／甲状腺ホルモンレセプター異種二量体による遺伝子転写の陽性お よび陰性調節：智旦、　５９．６９７−７０８゜Ｃ，Ｉｔ　Ｇｏｒｍａｎ、　Ｌ 、　Ｆ、　Ｍｏｆｆａｔ、　Ｂ、　Ｈ，Ｈｏｗａｒｄ　（＋９８２）Ｉｌｌ乳類 細胞でクロラムフＣ，Ｉｔ　Ｇｏｎｏａｎ、　Ｂ、　）Ｌ　Ｈｏｍｒｄ、　Ｒ， Ｒｅｅｖｅｓ　（１９８３）　ＩＩＩ乳類細胞におけるリコンに、　Ｇｏｒｓｋ ｉ、　Ｍ、　Ｃａｒｎｅｉｒｏ、　Ｕ、　５ｃｈｉｂｌｅｒ　（１９８６）　？ ウスアルブミンプロモーターからの組織特異的インビトロ転写：　Ｃｅ１ｌ、　 ４７．７６７−７７６゜Ｎ、　Ｇｒｅｅｎ、　Ｈ，Ａｌｅｘａｎｄｅｒ、　Ａ、 　０１ｓｏｎ、　Ｓ、　Ａｌｅｘａｎｄｅｒ、　Ｔ、　Ｍ、　５ｈｉｎｎｉｃｋ 、　i、　Ｇ。

５ｕｔｃｌｉｆｆｅ、　Ｒ，Ａ、　Ｌｅｒｎｅｒ　（１９８２）　インフルザウ イルスへマグルチニンノ免疫原構造：　ｃｅｌｌ、　２８．４７７−４８７゜Ｓ 、　Ｇｒｅｅｎ、　Ｐ、　Ｗａｉｔｅｒ、　Ｖ、　Ｋｕｍａｒ、　Ａ、　Ｋｒｕ ｓｔ、　Ｊ、　Ｍ、　Ｂｏｒｎｅｒｔ、　Ｐ、　Ａｒｇｏ刀A　Ｐ。

Ｃｈａｍｂｏｎ　（１９８６）ヒトエストロゲンレセプターｃＤＮＡ：塩基配列 、発現およびＣＳ、　Ｇｒｅｅｎ、　Ｐ、　Ｃｈ騙ｂｏｎ　（１９８８）核レセ プターは転写調節についての我々の理解を支援する：　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅ ｔ、、　４．３０９−３１４゜Ｕ、　Ｇｕｂｌｅｒ、　Ｂ、　Ｊ、　Ｈｏｆｆｍ ａｎ　（１９８３）　ｃＤＮＡライブラリー作成のための簡便で非常に効率の良 い方法二超朋、　２５．２６３−２６９゜Ｋ、　Ｈａｍａｄａ、　Ｓ、　Ｌ、　 Ｇｌｅａｓｏｎ、　Ｂ、　Ｚ、　Ｌｅｖｉ、　Ｓ、　Ｈｉｒｓｃｈｆｅｌｄ、　 Ｂ、　ＡｐｐｅｌｌａA　Ｋ。

口ｚａｔｏ　（１９８９）　Ｈ−２ＲＩ　ＩＢＰ、主要な組織適合性クラスｌ遺 伝子の調節エレメントおよびエストロゲン応答エレメントの両方と結合する核ホ ルモンレセプター土耕の仲間：　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ 、　ＵＳＡ、　８６．８２８９−８２９３゜Ｊ、　Ｂ、　Ｈａｍｂｏｒら、（１ ９８８）　ヒトＴ細胞クローンにおけるＣＤ８表面発現のアンチセンスＲＮＡ仲 介性抑制の作用帰結：　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　１６８．１２３７−１２ ４５゜Ｅ、　！ｔ　Ｈａｒｄｏｎ、　ＭＬ　Ｆｒａｉｎ、　Ｇ、　Ｐａｏｎｅｓ ｓａ、　Ｒ，Ｃｏｒｔｅｓｅ　（１９８８）２ツの異なる因子がいくつかの肝特 異的遺伝子のプロモーター領域と相互反応する：　Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪ。

７、１７１１−１７１９゜ Ｅ、　Ｈａｒｌｏｗ、　Ｄ、　Ｌａｎｅ　（１９８８）抗体：実験室マニュアル （コールドスプリングハーバ−、ニューヨーク：コールドスプリングハーハー研 究室刊）Ｊ、　Ｈａｓｓｅｌｈｏｆｆ、　Ｗ、　Ｌ、　Ｇｅｒｌａｃｈ　（１９ ８８）新規で特異性の高いエンドリボヌクレアーゼ活性を有する単純なＲＮＡ酵 素：　Ｎａｔｕｒｅ、　３３４．５８５−５９１゜Ｓ、　Ｍ、　Ｈｅｄｒｉｃｋ ら、（１９８４）Ｔ細胞特異的膜付随タンパク質をコードするｃＤＮＡクローン の分離：　Ｎａｔｕｒｅ、　３０８．１４９−１５３゜Ｙ、Ｉｔｏ、Ｎ、Ａｚｒ ｏｌａｎ、Ａ、　Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ、Ａ、Ｗａｌｓｈ、Ｊ、Ｌ、Ｂｒｅｓｌｏ ｗ　（１９９０）　トランスジェニックマウスにおけるヒトアポＣＩＩＩ遺伝子 発現の結果としての過トリグリセリド血症：　５ｃｉｅｎｃｅ　、　２４９．７ ９０−７９３゜Ｐ、　Ｆ、　Ｊｏｈｎｓｏｎ、　Ｗ、　Ｈ，Ｌａｎｄｓｃｈｕｌ Ｚ、　Ｂ、　Ｊ、　Ｇｒａｖｅｓ、　Ｓ、　Ｌ、　ＭｃＫｎｉｇｈｔ　（１X８ ７）３ 種の動物ウイルスエンハーンサーコアーエレメントに結合するラットの肝核タン Ｊ、　Ｔ、　Ｋａｄｏｎａｇａ、　Ｒ，Ｔｊｉａｎ　（１９８６）塩基配列特異 的ＤＮＡ結合タンパク質のアＲ，Ｃ，Ｋｅｎｎｅｄｙ（１９８６年７月）抗イデ イオタイプと免疫：　Ｓｃｉ、　Ａａ、　２５５゜４８−５６゜ Ｍ、　Ｋｏｚａｋ　（１９８７）　６９９種のを椎動物ｍＲＮＡからの５゛非コ 一ド域配列の分析：　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１５．８１２ ５−８１４３゜Ｅ、　Ｋｒｅｂｓ、　Ｒ，Ｅｉｓｅｎｍａｎ、　Ｂ、　Ｋｕｅｎ ｘｅｌ、　Ｄ、　Ｌｉｔｃｈｆｉｅｌｄ、　Ｆ、　Ｌｏｚｅｍａｎ、　Ｂ、@Ｌ ｉ５ｃｈ ｅｒ、　Ｊ、　５ｏＷ１ｅｒｃｏｒｎ　（１９８８）　シグナル形質導入に関与 する潜在的に重要な酵素としてのカゼインキナーゼＩ　Ｉ　：　Ｍｏ１ｅｃｕｌ ａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｓｉｇｎａｌ　Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ（シグ ナル形質導入の分子生物学）（コールドスプリングハーバ−、ニューヨーク：コ ールドスプリングハーバ−研究室刊）　７７−８４゜Ｖ、　Ｋｕｍａｒ、　Ｐ、 　Ｃｈａｍｂｏｎ　（１９８８）　−Ｌストロケンレセプターはリガンド誘発同 種二量体としてその応答エレメントと強固に結合する：　Ｃｅ１ｌ、　５５：　 １４５−１５６゜Ｃ，Ｆ、　Ｋｕｏ、　Ｋ、　Ｇ、　Ｘａｎｔｈｏｐｏｕｌｏｓ 、　Ｊ、　Ｂ、　Ｄａｒｎｅｌｌ、　Ｊｒ、　（１９９０）Ｃ／ＥＢＰの胎児お よび成人における所在部位決定：細胞特異的遺伝子発現における転写因子の連合 的作用の証拠：　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　、　１０９．４７３−４８１゜Ｂ、 　Ｉ、ａｔ、　Ｖ、　Ｒ，Ｐｒｅｚｉｏｓｏ、　Ｅ、　Ｓｍ１ｔｈ、　０．　Ｌ ｉｔｖｉｎ、　Ｒ，Ｈ，Ｃｏ５ｔａ、　Ｊ、　Ｅ、　Ｄ≠窒獅■撃戟B Ｊｒ、　（１９９０）　ＩＮＦ−３Ａ、新規な構造の肝細胞集積性転写因子は転 写的に調節される。

Ｗ、　Ｈ，Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ、　Ｐ、　Ｆ、　Ｊｏｈｎｓｏｎ、　Ｂ、　Ｙ 、　Ａｄａｓｈｉ、　Ｂ、　Ｊ、　Ｇｒａｖｅｓ、　Ｓ、　k。

ＭｃＫｎｉｇｈｔ（１９８８）　Ｃ／ＥＢＰをコードする遺伝子のりコンビナン ドコピーの分離：　Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　２．７８６ −８００゜Ｅ、　Ｌａｔｈｅ　（１９８５）アミノ酸配列データから推定された 合成オリゴヌクレオチドプローブ：理論的および実験的考察：　Ｊ、　Ｍｏ１． 　Ｂｉｏｌ、、　１８３．１−１２゜Ｔ、　Ｌｅｆｆ、　Ｋ、　Ｒｅｕｅ、　Ａ 、　Ｍｅｌｉａｎ、　Ｈ，Ｃｕ１ｖｅｒ、　Ｊ、　Ｌ、　Ｂｒｅｓｌｏｗ　（１ ９８９）　肝特異I 転写を指令するアポＣＩＩＩプロモーターの調節エレメントは発現型および非発 現型細胞型のタンパク質と結合する：Ｔｈｅ　Ｊ、　ｏｆ　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ ａ、　２６４．１６１３２−１６１３７゜Ｄ、　Ｊ、　Ｌｅｗ、　Ｔ、　Ｄｅｃ ｋｅｒ、　１．　Ｓｔｒｅｈｌｏｗ、　Ｊ、　Ｂ、　Ｄａｒｎｅｌｌ、　Ｊｒ、 　（１９９０）　ＧＢo遺 伝子プロモーターのオーバーラツプするエレメントはアルファおよびガンマイン ターフェロンによる転写誘発を仲介する：　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｊｏｌ、、 　（印刷中）。

Ｘ、　Ｌｉ、　Ｒ，−Ｆ、　５ｈｅｎ、　Ｓ、　Ｙ、　Ｔｓａｉ、　Ｓ、　Ｌ、 　Ｃ，Ｗｏｏ　（１９８８）多数の肝トランス作動性因子がヒトアルファー１− アンチトリプシンのインビトロ転写に必要である：Ｍｏ１．　ａｎｄ　Ｃｅ１１ ．　Ｂｉｏｌ、、　８．４３６２−４３６９゜Ｇ、　Ｒ，ＭａｃＧｒｅｇｏｒ、 　Ｃ，Ｔ、　Ｃａ５ｋｅｙ　（１９８９）　ｌ’ｔｅ乳類細胞で大腸菌ｂ−ガラ クトシダーゼを発現するプラスミドの構築：　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ ｅｓ、、　１７．２３６５゜Ｓ、　Ｍａｄｅｒ、　Ｖ、　Ｋｕｍｒ、　Ｈ，ｄｅ 　Ｖｅｒｎｅｕｉｌ、　Ｐ、　Ｃｈａｍｂｏｎ（１９８９）　ニストロジエンレ セプターの３つのアミノ酸はグルココーチコイド応答性エレメントとエストロゲ ンを識別する当該能力に必須である：　Ｎａｔｕｒｅ、　３３８．２７１−２７ ４゜Ｄ、　Ｊ、　Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ、　Ｅ、　Ｓ、　Ｏｎｇ、　Ｊ、　Ａ 、　Ｄｙｃｋ、　Ｒ，Ｍ、　Ｅｖａｎｓ　（１９９０）　新規な■ ティノイック酸応答経路を識別する核レセプター：　Ｎａｔｕｒｅ、　３４５． ２２４−２２９゜Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｅ、　Ｆ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　 Ｊ、　Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　（１９８２）分子クローニング：実験室マニュアル （コールドスプリングハーバ−、ニューヨーク、コールドスプリングハーバ−研 究室刊）。

Ｃ，Ｊ、　Ｍａｒｃｕｓ−３ｅｋｕｒａ　（１９８８）　遺伝子発現の研究ノタ メノアンチセンスオリコヌクレオチドの使用技術＋　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、、　１７２．２８９−２９５゜Ｐ、　Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ　（１９８７） 　ポリビニリデンジフルオリド膜でエレクトロプロ、ソティングしたピコモル量 のタンパク質の配列：Ｔｈｅ　Ｊ、　ｏｆ　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２６２ ．１００３５−１００３８゜ Ｇ、　Ｓ、　ＭｃＫｎｉｇｈｔ、　Ｒ，Ｄ、　Ｐａ１ｍ１ｔｅｒ　（１９７９） オボアルブミンおよびコンアルブミンのニワトリ卵管ステロイドホルモンによる 転写調節：　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２５４゜９０５０−９０５８゜ Ｎ、　Ｍｅｒｍｏｄ、　Ｅ、＾、　Ｏ’Ｎｅ１ｌｌ、　Ｔ、　Ｊ、　Ｋｅｌｌｙ 、　Ｒ，Ｔｊｉａｎ　（１９８９）　ＣＴＦ／ＮＦ　−１の富プロリン転写アク チベーターは複製およびＤＮＡ結合領域とは別個である：Ｃｅ１ｌ、　５８．７ ４１−７５３゜Ｎ、　Ｍｉｙａｊｉｍａ、　Ｙ、　Ｋａｄｏｗａｋｉ、　Ｆｕｋ ｕｓｈｉｇｅ、　Ｓ、　Ｓｈｉｍｉｚｕ、　Ｋ、　Ｓｅｍｂａ、　Ｙ、　ＨB Ｙａｍｎａｓｈｉ、　Ｋ、　Ｍａｔｓｕｂａｒａ、　Ｋ、　Ｔｏｙｏｓｈｉｍａ 、　Ｔ、　Ｙａｍａｍｏｔｏ　（１９８８）　分子クローニングにるｅｒｂＡ上 科の土耕な２種の同定：当該２種の遺伝子産物は互いに密接に関連する：Ｎｕｃ ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１６：１１０５７−１１０７４゜Ｐ、　Ｍ ｏｎａｃｉ、　Ａ、　Ｎ１ｃｏｓｉａ、　Ｒ，Ｃｏｒｔｅｓｅ　（１９８８）　 ２ツの肝特異的因子はヒトａ１−アンチトリプシンプロモーターからのインビト ロ転写を刺激する：　Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪ。

７、２０７５−２０７８゜ Ｃ，Ｒ，Ｍｕｅｌｌｅｒ、　Ｐ、　Ｍａｉｒｅ、　Ｕ、　５ｃｈｉｂｌｅｒ　（ １９９０）　ＤＢＰ（肝集積性転写活性物質）は個体発生後期に発現し、その組 織特異性は転写後に決定される：　Ｃｅ１１．６１゜２７９−２９１゜ Ｗ、　Ｒ，Ｐｅａｒｓｏｎ、　Ｄ、　Ｊ、　Ｌｉｐｍａｎ　（１９８８）　生物 学的配列の比較のための改良手段：Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、　ＵＳＡ、　８５．２４４４−２４４８゜Ｃ，Ｐｕ１ｓｓａｎｔ、　Ｌ、　 Ｍ−Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ　（１９９０）酸グアニジニウムチオシアネート／フェ ノール／クロロホルム抽出によるＲＮＡの単一工程分離の改良：ＢｉｏＴｅｃｈ ｎｉｑｕｅｓ８、１４８−１４９゜ Ｋ、　Ｒｅｕｅ、　Ｔ、　Ｌｅｆｆ、　Ｊ、　Ｌ、　Ｂｒｅｓｌｏｗ　（１９８ ８）　ヒトアポリポタンパク質ＣＩＩＩ遺伝子発現は、陽性および陰性シス作動 性エレメント並びに組織特異的タンパク゛　質因子により調節される：　Ｔｈｅ 　Ｊ、　ｏｆ　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２６３．６８５７−６８６４゜Ｃ， Ａ、　Ｒｏｓｅｎ、　Ｊ、　Ｇ、　５ｏｄｒｏｓｋｉ、　Ｗ、　Ａ、　Ｈａｓｅ ｌｔｉｎｅ　（１９８５）ヒトＴ細胞リンパ向性ウィルスタイプＩＩＩのシス作 動性調節配列の存在部位：　Ｃｅ１ｌ、　４１．８１３−８２３゜Ｓ、　Ｒｕｐ ｐｅｒｔ、　Ｍ、　Ｂｏｓｈａｒｔ、　Ｆ、　Ｘ、　Ｂｏｓｃｈ、　Ｗ、　５ｃ ｌｕｎｉｄ、　Ｒ，Ｅ、　Ｋ、　Ｆｏｕｒｎｉ■秩A　Ｇ。

５ｃｈｕｔｚ　（１９９０）遺伝学的に定義された２つのトランス作動性遺伝子 座は、肝特異的遺伝子のオーバーラツプ群を統合的に調節する：　Ｃｅ１１．６ １．８９５−９０４゜Ｒ，Ｐ、　Ｒｙｓｅｃｋ、　Ｈ，Ｍａｃｄｏｎａｌｄ−Ｂ ｒａｖｏ、　ＩＪ、　Ｇ、　Ｍａｔｔｅｉ、　Ｓ、　Ｒｕｐｐｅｒｔ、　Ｒ，Ｂ ｒ≠磨B （１９８９）仮定的核ホルモン結合レセプターをコードする成長因子誘発性遺伝 子の構造、マツピングおよび発現＋　Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪ、、　８．３３２７− ３３３５゜Ｒ，Ｋ、　５ａｉｋｉ、　Ｄ、　Ｈ，Ｇｅ１ｆａｎｄ、　Ｓ、　５ｔ ｏｆｆｅ１．　Ｓ、　Ｊ、　５ｃｈａｒｆ、　Ｒ，Ｈｉｇｕｃｈｉ、　f、　Ｔ 。

Ｈｏｒｎ、　Ｋ、　Ｂ、　Ｍｕｌｌｉｓ、　Ｈ，Ａ、　Ｂｒ１ｉｃｈ　（１９８ ８）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いるプライマー誘導性酵素的ＤＮＡ複製：　 ５ｃｉｅｎｃｅ　、　２３９．４８７−４９１゜Ｆ、　Ｓａｎｇｅｒ、　Ｓ、　 Ｎ１ｃｋｌｅｎ、　Ａ、　Ｒ，Ｃｏｕｌｓｏｎ　（１９７７）鎖伸長停止抑制物 質によるＤＮＡ塩基配列決定：　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ 、　ＬＩＳＡ　、　７４．５４６３−５４６７゜Ｊ、　Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｂ 、　Ｆ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ　（１９８９）　分子ク ローニング：実験室マニュアル（コールドスプリングハーバ−、ニューヨーク、 コールドスプリングハーバ−研究室刊）。

Ｔ、　Ｄ、　Ｓａｒｇｅｎｔ　（１９８７）　弁別的に発現される遺伝子の分離 ：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｆ、、１５２．４２３−４４７゜ Ｒ，５ｃｈｕｌｅ、　Ｋ、　ＬＪｍｅｓｏｎｏ、　Ｄ、　、１゜Ｍａｎｇｅｌｓ ｄｏｒｆ、　Ｊ、　Ｂｏｌａｄｏ、　Ｊ、　Ｗ、　ＰｉｋｅA　Ｒ，Ｍ。

Ｅｖａｎｓ（１９９０）　ｊｕｎ−ｆｏｓ並びにビタミンＡおよびＤレセプター はヒトオステオカルシン遺伝子の共通の応答エレメントを認識する：　Ｃｅ１ｌ 　６１．４９７−５０４゜８、５ｅｅｄ　（１９８７）　ＬＦＡ−３ｅＤＮＡは そのレセプターＣＤ２と相同なフォスホリビド結合膜タンパク質をコードする： Ｎａｔｕｒｅ、　３２９．８４０−８４２、Ｂ、　５ｅｅｄ、　Ａ、　Ａｒｕｆ ｆｏ　（１９８７）急速免疫選択法によるｃＤ２抗原（Ｔ細胞赤血球レセプター ）の分子クローニング　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ Ａ、　８４．３３６５−３３６９゜Ｓ、　Ｙ、　Ｔｓａｉ、　Ｊ、　Ｃａｒｌｓ ｔｅｄｔ、　Ｎ、　Ｌ、　Ｗｅｉｇｅｌ、　Ｋ、　Ｄａｈｌｍａｎ、　Ｊ、　Ａ 、　Ｇｕｓｔａ■唐唐盾氏B ｔ　Ｊ、　Ｔｓａｉ、　Ｂ、　ｔ　Ｏ’Ｍａｌｌｅｙ　（１９８８）そのエンバ ー　ンザーエレメントニよルステロイドホルモ゛／レセプタ・−の分子相互反応 ：レセプター二量体形成の証拠：　Ｃｅ１１５５、　３６１−３６９゜ Ｋ、　Ｉｌｍｅｓｏｎｏ、　Ｖ、　ＧｉｇｕＣｒｅ、　Ｃ，Ｋ、　Ｇｌａｓｓ、 　Ｍ、　Ｇ、　Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ、　Ｒ，Ｍ、　Ｅｖａｎ■ （１９８８）　レティノイック酸および甲状腺ホルモンは共通の応答エレメント を介して遺伝子発現を誘導する：　Ｎａｔｕｒｅ、　３３６．２６２−２６５゜ Ｋ、　Ｕｎｉｅｓｏｎｏ、　Ｒ，Ｌ　Ｅｖａｎｓ　（１９８９）　ステロイド／ 甲状腺ホルモンレセプターのための標的遺伝子特異性の決定要素：　Ｃｅ１ｌ、 　５７．１１３９−１１４６゜Ｓ、　Ｖａｕｌｏｎｔ、　Ｎ、　Ｐｕｚｅｎａｔ 、　Ａ、　Ｋａｈｎ、　Ｍ、　Ｒａｙｍｏｎｄｊｅａｎ　（１９８９）　肝特異 的ピルベ、Ｌ、　Ｈ，Ｗａｎｇ、　Ｓ、　Ｙ、　Ｔｓａｉ、　Ｒ，Ｇ、　Ｃｏｏ ｋ、　Ｗ、　Ｇ、　Ｂｅａｔｔｉｅ、　Ｍ、　Ｊ、　Ｔｓａｉ、　ＢA　Ｗ。

０°Ｍａｌｌｅｙ　（１９８９）ＣＯＵＰ転写因転写因子ロイドレセプター上材 の仲間である：Ｎａｔｕｒｅ、　３４０．１６３−１６６゜Ｃ，Ｗｅｉｎｂｅｒ ｇｅｒ、　Ｃ，Ｃ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、　Ｅ、　Ｓ、　Ｏｎｇ、　Ｒ，Ｌｅｂｏ 、　Ｄ、　Ｊ、　Ｇｒｕｏ、　Ｒ，Ｍ。

Ｂｖａｎｓ　（２９８６）　ｃ　／　ｅ　ｐ　ｂ遺伝子は甲状腺ホルモンレセプ ターをコードする：Ｎａｔ１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７５．　２ ８４４−２８４８゜Ｋ、　Ｇ、　Ｘａｎｔｈｏｐｏｕｌｏｓ、　Ｊ、　Ｍｉｒｋ ｏｖｉｔｃｈ、　Ｔ、　Ｄｅｅｋｅｒ、　Ｃ，Ｆ、　Ｋｕｏ、　Ｊ、　Ｂ、　Ｄ ≠窒獅■撃戟B Ｊｒ、　（１９８９）　マウスＤＮＡ結合タンパク質ｍＣ／ＥＢＰの細胞特異的 転写制御：Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８６． ４１１７−４１２１゜Ｋ、　Ｙａｍｓａｋｉら、（１９８９）　ヒトインターロ イキン−６（ＢＳＦ−２／ＩＦＮＢ２）レセプターのクローニングと発現：　５ ｃｉｅｎｃｅ　、　２４１．８２５−８２８゜Ｒ，Ａ、　Ｙｏｕｎｇ、　Ｒ，Ｗ 、　Ｄａｖｉｓ　（１９８３）抗体プローブを用いることによる遺伝子の本発明 はＨＮＦ−４（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｆａｃｔｏｒ　４　（ 肝細胞接置′ｆ−４））のクローニングおよび精製を含む。ＨＮＦ−４は本来、 肝癌細胞内でのトランスフオーム：ｚ（ＴｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎＸＴＴＲ） 遺伝子の転写に必要なりＮＡエレメントに結合するものとして肝の粗抽出物中で 検出された（Ｃｏｓｔａら、１９８９）。アミノ酸配列の比較により、ＩＮＦ− ４は、分化および発育に重要な役割を果たすことが知られているリガンド依存性 転写因子である、ステロイド／甲状腺ホルモンレセプター−Ｌ科の仲間であるこ とが示唆された（Ｅｖａｎｓ、　１９８８；　Ｇｒｅｅｎ　＆　Ｃｈａｎ＋ｂｏ ｎ、　１９８８；Ｂｅａｔｏ、　＋９８９）。これまでのところ、それらの認識 部位のヌクレオチド配列およびジンクフィンガー領域（ｚｉｎｃ　ｆｉｎｇｅｒ 　ｒｅｇｉｏｎ）のアミノ酸配列に基づき、他の仲間はすべていくつかの亜科の 一つに分類される（ｔｈｎｅｓｏｎｏ　＆　Ｅｖａｎｓ、　１９８９；　Ｆｏｒ ｍａｎ＆　Ｓａｍｕｅｌｓ、　１９９０）が、一方、ＩＮＦ−４は新規な亜科を 代表するようである。

より具体的には、本転写因子は、アポＡｔ、アポＢ、ピルベートキナーゼ、αｌ アンチトリプシンおよびグルタミン合成酵素に対する考え得る影響の他に、例え ばアポＣＩＩＩのような脂質含有タンパク質の生成に調節的な役割を果たすと考 えられている。このｃＤＮＡ配列が同定されたが、本発明は、それに基づいたＤ ＮＡ配列、リコンビナント分子、プローブ、センスおよびアンチセンスＲＮＡ、 並びに適切に形質転換（トランスフオーム）された宿主細胞に関する。診断およ び治療上の応用も同様に意図されている。

図面の簡単な説明 図１：ｌ４ＮＦ−４の精製および同定 （Ａ）ラット肝の核から精製されたＨＮＦ−４の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析。５つの 最終クロマトグラフィ一工程の各々、およびモノＱカラムのピーク分画（分画３ ８）について、等量分側の出発物質をクーマシーブルー染色ゲルで示している。

オリゴ＃ｌおよびオリゴ＃２は、それぞれＨＮＦ４ＰおよびＡＰＦ１オリゴヌク レオチドから作成したＤＮＡアフィニティーカラムである。分画３８のバンドは マーカーの相対移動度（Ｊ：、から下に、９７．６６．４３および３１ＫＤ）に 基づいて５４ＫＤと概算された。

（Ｂ）精製ＨＮＦ−４タンパク質の結合活性の性状決定。モビリティシフドア゛ 　ツセーから、７種の３２Ｐ標識オリゴヌクレオチドプローブ（ｌｏｇ）と競合 物なしまたは５０倍過剰の競合物とのタンパク質ＤＮＡ複合体（０，０６２５μ ｌのモノＱ分画３８．３μｇのＢＳＡ、０．５μｇのポリ（ｄｉ−ｄＣ））が示 されている。表１のように、ＡＰＦ＋、−１５１＝−１５１から−１３０；４Ｐ ＝ＨＮＦ４Ｐ　；　４Ｄ＝ＨＮＦ４Ｄである。非特異的プローブはマウスＴＴＲ プロモーターであるニー１７５＝−１７５から−１５１（Ｃｏｓｔａら、１９８ ６）　、ＨＮＦ　３（−１１１から−８５、Ｃｏ５ｔａら、＋９８９）およびｅ ／ＥＢＰ　（−１８６ｋｂ、部位３、Ｃｏ５ｔａら、１９８８）。

（Ｃ）ＨＮＦ−４タンパク質の復元。５０ｎｇのモノＱ精製ＩＮＦ−４を５ＤＳ −ＰＡＧＥで分画し、一連のゲルスライスから溶出させたタンパク質を、モビリ ティシフトアッセーでＡＰＦ１プローブ（０，５ｎｇ）との結合について調べた 。競合物は、５０倍過剰の未標識ＡＰＦｌオリゴヌクレオチドであった。示され たタンパク質ゲルレーンは解体したレーンに対して平行に泳動させ、銀染色した 。

図２：精製ＩＮＦ−４の性状決定 （Ａ）フットプリント：精製ＨＮＦ−４（分画３８）を、マウスＴＴＲプロモー ターの−２０２から−７０の領域の両方の鎖をフットプリントするために、銅フ ェナントロリンとともに使用した。“Ｆ”および“Ｂ”は、未結合および結合プ ローブである。“Ｇ”はＧ残基で切断されたプローブを示す。フットプリントさ れた領域は括弧で示されている。矢印は高感受性部位を示している。

（Ｂ）ホスファターゼおよびプロテアーゼ実験：　精製ＨＮＦ−４（分画３８） をウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）、プロテアーゼＶ８（Ｖ２Ｃまたは エンドプロテイナーゼＬｙｓＣ（ＬｙｓＣ）の存在下で３７℃でインキュベート した。処理物質を４等分し、明示したプローブでモビリティシフトアッセーで（ Ａ）最も大きいＩＮＦ−４クローン、ｐｆ７の模式的表示。精製ペプチドのＣＮ Ｂｒ切断から得られたペプチドの位置（ｐｅｐｌ−５、実線）およびＰＣＲで生 成物を生じる対応するオリゴヌクレオチドプライマー（矢印）（一定の拡大率で 描かれていない）を示す。第二の枠内メチオニンから始まる開放型読み取り枠（ 本文参照）は、四角で表しである。数字はｃＤＮＡの始めからのヌクレオチドの 位置である。斜線部分は、完全な長さのクローンのためにラット肝ｃＤＮＡライ ブラリーをプローブするために用いた領域を示している。ジンクフィンガーはス テロイドホルモンレセプター類似性をもつ部分を示している。

（Ｂ）ＨＮＦ−４ｃＤＮＡの部分的核酸配列およびアミノ酸配列。配列は、ジデ オキシ法（Ｓａｎｇｅｒら、１９７７）によって、ＰＣＲ産物、ｐｆ７および他 のｃＤＮＡ分離体から得られた。すべての領域は、少な（とも２つのソースから 配列決定され、ｐｆ７クローンで確認された。下線を付したアミノ酸配列はペプ チドｌ。

５、に対応する。＋１の印は最も可能性の高い開始点メチオニンである。括弧は 最初のジンクフィンガーの付は根を示し、＊は新規なアスパラギン酸残基を示す （本文参照）。この配列は、遺伝子配列データバンクに付託された。

図４：ＨＮＦ−４タンパク質およびステロイドホルモンレセプターとの間の構造 的および配列類似性 ラットＩＮＦ−４のアミノ酸−次配列を、該レセプター１科の仲間と、ＦＡＳＴ Ａプログラム（Ｐｅａｒｓｏｎ　＆　Ｌｉｐｍｎ、　１９８８）を用いて比較し た。百分率はジンクフィンガー（Ｚ　ｎ　＋＋）およびリガンド結合ドメイン内 のアミノ酸同一性を示している。”　Ｐｒｏ″は富プロリンドメインを指す。ｍ Ｈ２−ＲＩＩＢＰはマウスの主要組織適合性クラスＩ調節タンパク質（ＪＨａｍ ａｄａら、１９８９）を表す；ｈｃ−ｅｒｂＡはヒト甲状腺ホルモンレセプター ＴｓＲβである（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒら、１９８６）；ｈＢＲはヒトエストロ ゲンレセプターである（Ｇｒｅｅｎら、１９８６）；Ｃ０ＵＰ−ＴＴ（ｅ　ａ　 ｒ　３）はニワトリオボアルブミン上流プロモーター転写因子で（Ｗａｎｇら、 １９８９Ｌｈｅａｒ２はヒトｖ−ｅｒｂＡ関連遺伝子である（Ｍｉｙａｊ　ｉｍ ａら、１９８ｇ）。

（Ａ）インビトロ合成したＩＮＦ−４タンパク質の切断形の模式的表示。ｐｆ７ ＤＮＡ（ブルースクリプトでＳＫ　（−））を提示した制限酵素で切断し、イン ビトロでＴ３ＲＮＡポリメラーゼで転写した。生じたｍＲＮＡをウサギレティキ ュレートライセート（プロメガ社製）で３Ｈ−ロイシン存在下で翻訳した。白抜 き枠はｐｆ７の３ｋｂのｃＤＮＡ挿入物を表している。数字は開始（ＡＴＧ）お よび終止（ＴＡＧ）のヌクレオチドの位置である。制限酵素の切断部位の位置、 およびヌクレオチド５９で始まる翻訳の結果生じるアミノ酸（ａ　ａ）によるペ プチドの長さが与えられる。

（Ｂ）インビトロ合成ＨＮＦ−４産物のモビリティシフトアッセー。反応物は、 ０、５　ｎ　ｇの８′Ｐ標識ＡＰＦｌプローブおよび２８Ｈのポリ（ｄｉ−ｄＣ ）を、競合物質として２５μｇの未標識非特異的Ｃ−）（−１７５から−１５１ ＴＴＲ）または特異的（＋）オリゴヌクレオチド（ＡＰＦＩ）の存在下で含んで いた。レーンｌ−２：精製ＨＮＦ−４（分画３８）、レーン３−１２：（Ａ）で 述べたようにインビトロ翻訳反応物（２μＩＬレーン１３−１４．陰性コントロ ールとしてインビトロ翻訳系に加えられたウシモザイクウィルス（ＢＭＶ）ＲＮ Ａ。

（Ｃ）インビトロ合成ＩＮＦ−４産物の５ＤＳ−ＰＡＧＥ、（Ａ）に記載した翻 訳反応物の１μｌを含む１０％ゲル（エンハーンス、ＮＥＮで処理）のオートラ ジオグラム。クーマシー染色マーカーの位置は左に示されている。

（Ｄ）二量体形成を示すモビリティシフトアッセー。明示された制限酵素で切断 されたｐｆ７ＤＮＡは（Ａ）のように転写された。生じたＲＮＡを記載のとおり 混合し、インビトロで翻訳した。翻訳反応物は、非特異的競合物の存在下で（Ｂ ）のようにアッセーした。矢印は異種二量体タンパク質によって形成された複合 体を示している。矢印の頭は通常認められるシフト複合体（おそらく同種二量体 ）のいちを示す。

図６　：ＨＮＦ−４ｃＤＮＡによる転写活性化上：ＣＡＴアッセーのオートラジ オグラム。下ニレポーター構築物の模式的表示。センスまたはアンチセンス方向 にＩＮＦ−４ｃＤＮＡ　（ｐｆ７の３ｋｂ挿入物）を含む発現ベクターＤＮＡ　 （０−５，Ｏｕ　ｇ）をＨｅＬａ細胞にＣＡＴレポーター構築物（２μｇ）（Ｉ ＮＦ−４認識部位を欠＜　（ＨＩＶ−ＣＡＴ）　が＊ｆ、：、＋１欠かない（Ａ ＰＦＩ−ＨＩＶ−ＣＡ））とともにトランスフェクトした。ヒト免疫不全ウィル ス（ＨＩＶ）の長い末端の繰り返し部分（ＬＴＲ）が基本的プロモーターエレメ ントとして使用された。オートラジオグラムのデンシトメトリーは、ＩＮＦ−４ ｃＤＮＡの１０−１５倍の誘発を示した（レーン２−４をレーン９−１１と比較 ）。

図７　：ＨＮＦ−４ｍＲＮＡの分布の組織限定プローブとしてＨＮＦ−４ｃＤＮ Ａフラグメントを用いた、種々のラットおよびマウス組織からのポリ（Ａ）＋Ｒ ＮＡのノザーンプロット分析（上）。コントロールとしてグリセルアルデヒド３ −ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プローブが使用された（下）。

図８８ＮＦ−４はＬＦ−Ａ１部位に結合する（Ａ）精製（モノＱ、分画３８．０ ，０３μ）またはインビトロ翻訳ＨＮＦ−４（Ｓｐｈｌ、図５）のモビリティシ フトアッセー（２μｇ＋７）ポリ（ｄｉ−ｄＣ）および競合物として２５μｇの 未標識オリゴヌクレオチド、非特異的（−）（−１７５から−１５１ＴＴＲ）ま たは特異的（＋）オリゴヌクレオチドＡＰＦＩ、ＬＦ−ＡＩ、またはＨＮＦ　４ 　Ｐ）。

図９ＨＮＦ−４はＥＲＥ、ＴＲＥまたはＧＲＥに顕著には結合しない精製ＨＮＦ −４（−１１−／Ｑ、分画３８．０．０３μ）を用いて、３μｇ（７）ＢＳＡ、 ５０μｇのポリｄｌ−ｄＣ，”Ｐ標識した−１５１から一１３０ＴＴＲ（プロー ブ（０，５μｇ））および明示されたように競合物として未標識オリゴヌクレオ チドの存在下でモビリティシフトアッセーを実施した。−１５１＝−１５１−１ ３０ＴＴＲ１４Ｄ＝ＮＨＦ４ＤさらにＥＲＥ、ＴＲＥおよびＧＲＥはエストロゲ ン、甲状腺ホルモンおよびグルココーチコイド応答エレメント（表１参照）。０ １５は未標識オリゴヌクレオチド、５°　−ＧＡＴＣＣＴＣＧＣＣＡＡＡＧＧＧ ＡＡＡＣＣＧＡＡＡＣＴＧＡＡＧＧＣＣ−３’　、ｌ、２および３は、それぞれ ５０゜２５０、および５００倍過剰モル濃度。

詳細な説明 この詳細な説明にしたがい、以下の定義が用いられる：発現制御配列：　別のＤ ＮＡ配列の転写および翻訳を制御し、調節するＤＮＡ配列。

作動的に連結される二　発現制御配列がＤＮＡ配列の転写および翻訳を制御し、 調節するとき、当該ＤＮＡ配列は当該発現制御配列に作動的に連結されている。

“作動的に連結される”という用語は、適切な開始シグナル（例えばＡＴＧ）を 発現されるべきＤＮＡ配列の前に有し、さらに発現制御配列の制御下のＤＮＡ配 列の発現および該ＤＮＡ配列によってコードされる所望の産物の産生を許容する ために、正確な読み取り枠を維持することを含む。リコンビナントＤＮＡ分子に 挿入することを所望する遺伝子が適切な開始シグナルを含まない場合は、そのよ うな開始シグナルは該遺伝子の前に挿入することができる。

抗体：　免疫グロブリンまたはその機能的フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆ　（ ａｂ’　）　ｔまたはｄＡＢ、抗体調製物は、該調製物中の個々の免疫グロブリ ンの少な（とも一部が抗原を認識（すなわち結合）するとき、特定の抗原に対し て反応性である。調製物中の個々の免疫グロブリン分子と抗原との結合が普通に 用いられる方法によって検出されないとき、抗体調製物は抗原に対して非反応性 である。

標準雑種形成条件：　雑種形成および洗浄の両方について、５×ＳＳＣおよび６ ５℃に実質的に匹敵する塩および温度条件。

ＤＮＡ配列：　本発明のＤＮＡ配列は、リコンビナントＤＮＡ技術を用いて調製 または分離されたＤＮＡ配列を指す。これらは、ｃＤＮＡ配列、それらの天然の ゲノムから分離されたＤＮＡ配列、および合成りＮＡ配列を含む。請求の範囲で 用いられているような用語は、それらが自然界で存在するように天然に生じるＤ ＮＡ配列を含むことを意図しない。

ＩＮＦ−４（肝細胞核因子４）は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）およびアポリ ポタンパク質Ｃ１１ｌ　（アポＣＩＩＩ）遺伝子の転写に必要な部位に結合する 、肝油出物中に豊富なタンパク質である（Ｃｏｓｔａら、１９８９；　Ｃｏ５ｔ ａら、１９９０．　Ｌｅｆｆら、１９８９）　、　ＨＮＦ−４タンパク質（５４ ＫＤ）は精製され、分離されたｃＤＮＡは該タンパク質をコードした。ＩＮＦ− ４は、最初のジンクフィンガー（ＤＧＣＫＧ）の保存された”付は根”の通常で ないアミノ酸を有するステロイドホルモンレセプター亜科の仲間である。このこ と、およびＨＮＦ−４はエストロゲン、甲状腺ホルモンまたはグルココーチコイ ド応答エレメントとは顕著には結合しないという事実は、ＩＮＦ−４は新規な亜 科を代表するかもしれないことを示唆している。ＩＮＦ−４は、その結合部位に 二量体として結合し、非肝性細胞（ＨｅＬａ）において配列特異的態様で転写を 活性化する。ＩＮＦ−４ｍＲＮＡは、肝臓の他に腎および腸に存在するが、他の 組織には存在しない。ＤＮＡ結合データは、肝因子ＡＩ　（ＬＦ−ＡＩ）と同一 であり得ることを示唆する。この因子は、以前にα−１アンチトリプシン、アポ リボクンバク質ＡＩおよびピルベートキナーゼ遺伝子の転写を調節することが示 された。

本明細書で用いられているように、”リガンド”という語は、レセプター、例え ばホルモンまたは成長物質に結合する物質を指す。細胞内では、リガンドはレセ プタータンパク質に結合し、それによってリガンド／レセプター複合体を生じ、 これは続いて適切なホルモン応答エレメントに結合することができる。単一のリ ガンドが多数のレセプターを有するかもしれない。例えば、ＴＡＲαおよびＴ。

Ｒβは両方とも甲状腺ホルモン、例えばＴ、と結合する。リガンドは拮抗物質で あることもできる。

ここで用いられているように、“リガンド応答性プロモーターに機能的に結合し た作動性ホルモン応答エレメントおよび作動性レポーター遺伝子”というフレー ズにおける「作動性Ｊという語は、対応するＤＮＡ配列（“ホルモン応答エレメ ント”、“リガンド応答性プロモーター”および“レポーター遺伝子”という用 語によって表される）が作動させることができることを意味する。すなわち、ホ ルモン応答エレメントがレセプタータンパク質（野性型またはキメラ）のＤＮＡ 結合ドメインで結合することができ、リガンド応答性プロモーターがレポーター 遺伝子の転写を制御でき（ＨＲＥ／レセプタータンパク質／リガンド複合体によ り適切に活性化されて）、該レポーター遺伝子が宿主細胞中で発現され得る。

゛擾、能的（、−結・ｒ目ハ□゛といっ一７ｉ／・−へ′は、Ｆア姐）ｊな活性 化に［；にしτＤＮ）＼レグメ゛。

１・が加わる〆一きに（床、該レボ−・や°−スー伝ｊ′・（例えばＣＡ　ｉ’ またはルシ５〕′ニラ−じ）は発現されるであろうとい−，１，−と？ご息味づ “る。、−の発現は、１ル、ノンＦＬ１１；’Ｉ’１ｌｌＪニー、ＩＹｌモ〜・ り〜”が“作動開始され、”−た１人、別にホルモン応答エレメントとリガ゛／ ド／１ノ（！゛ゾタークンバク質複合体との結合の結果ノニしマー活性化され、 たとい、３事実（？）結果として生じる。“リガント応答性グロモ・〜・；′・ ・−゛は、ホルモン応答ｒ−レメ−・ｌ・から下流にあり、ＨＲＥが適切なリカ ゛／ド／＋セグタータンパク質複合体と結合６゛乙とき“活性化され”１、す° ２に１、−れはその後続い（１ノポータ゛−遺伝ｊ：の″転写”イ！制御する。

：１．　ｒ二゛ｅ用いらＡ１１″′、イる。！、うｊＪ６．１７　ｆ　’、’ｆ ターの”ＤＮＡ結合ドメイン′”と（リフＩ・−ズ（、（、り１−１−１ｌ′グ ンＤＮＡ、１ｔ（７）ＬＩＲＥ部位に結合するしくｒブクータニバク質（伊ｊえ ば、グル″−ノー１−チ：」イｌぐ１）士・ズづ゛・、甲状腺１ノ（τブタ・− 、ミネラ〔］コー壬、ｉイド！、、ｌ　”ｅ　’７−り・・、ニスｌ−ｙ、ｉゲ ′・・１１１迫１、・せヅクー・＄”ｒ　Ｊ：び１．・ヂイノイック酸しヒブタ 〜・）の部分・菖１づ−１、これらのＩ井ｊへ結合ドメインθ）ための境界は、 ス角１イドホル（τ′・亜利について同定さオｖ２、外状が決定されん・。図８ および文献参照（ＧｉｒＵｎｅｔ−ｅら、１ｔ）８６；　Ｉｂ市ｅｎｂｌ！ｒｇ ら、、　Ｅ８７　；　Ｇ「ｅｅｎ　Ｐａ　Ｃｌｘａｍｂｎｎ　！！１８７；@） 、（ｉｅｓｆｉｐＭ ら、１９８７；　Ｅｖａｉｌｓ　１９８ｇ）。

本転写因了１．ｉ、、アポＡｌ、アポ■３、ピノ１．ベー　ト４−・ノーへ（ね σ１）゛ング・トリフ′シ゛／お快びグルクミ゛／合成酵素１ｍ、Ｈ１，Ｎ’ｒ 考え得る効果の他に、脂質含有タンバケ質（例２．ばア、“１ｅｃｌＩＩ）の生 成１．′、調節的役割を墨たグと考えられている。ｅＤＮＡ配列ノ゛パ同定され た。本発明（未ＤＮＡ配列、七れ（こ基づくリコンビｈント分子、グローブ、セ ンスおよびアンチセンスＲＮＡ、および適切に形質転換された宿主Ｍ：Ｉ胞に関 する。診断的および治療的応用も同様に意図されている。

この中で特に興味深いものは、ＡＰＦＩＩ、□セブ；−１３よびその遺伝子であ る。

なぜならば、こＡ］、らの構造は務剤の活性評価に有用だからである。

多くの疫学的研究によって、血漿の変動脂質タンパク質瓜は、冠状動脈心疾患の リスクと関連があるごとノ）＜示された９、低密度脂質クツバク質（Ｌ　Ｄ　Ｉ −）　量の上昇お、丸び高密度脂質タンパク質（ＨＤＬ）量の減少は、冠状動脈 心疾患の増加＜１−関連がある。過去３０年間に多くの研究室で行ノつオｌ、た 研究は、血漿脂質タンパク′べ量を決定するむしろ複雑な事象の組み合わせを明 らかにした。

ノーポリボタンバク質Ｃｌ１ｌはＶ　Ｌ　Ｄ　Ｌおよびｌ（Ｄ　Ｌの成分であり 、〜５０％ｆ’０　Ｖ　Ｌ、１）工５タンパク質および２％のＨＤ　Ｘ、タンパ ク質を含む。ヒト血漿アポＣｌＩ濃度は、０．１１−０．１４■／ｍｌの範囲に ある。アポＣＩ目は、各’ｚｉｌＴｈ＋１１のガラクトース、力゛ラクトザニニ ノおよび０、ｌ、または２ｍｌのシアリ、′酸を含む糖タンパク質である。・１ ゛ソコ＋りトす・ツクフォーカシングにより認め）・れる３１１ｉの生成される 異性体タンパク質は、ＣｌｌＮ−０，ＣＩＩ　Ｉ−１おＪ：びＣ１１ト２と名付 けられ、血漿アポＣ１１１０′）４れぞれ１４．５９、および２　’７％を構成 する。インビトロのアポＣｌ１ｌは、リポタンパク質リパーゼおよび肝リパーゼ の両方の活性を抑制することが示された。アポＣＩＩＮは、潅流う・・、・ト肝 俗１．よるリンパ乳腹脂粒の取り込みを減少させることが示された５、これらの インビト１Ｊ実験は、アポＣ１ＩＩは富トリグリセリドリポタンパク質の異化作 用を遅らせるかもしれないこ志を示唆している。最近、過トリグリセリド血症患 者は循環リポタンパク質およびリポタ゛６ノバク質リバー、（２の非すポタンパ ク質抑制物−”１を有することが示された。リポタンパク質連動抑制は、アポＣ ｌ１Ｉ濃度と最も良く相関する。同じ研究で、１゛ポＣ１１ｌは、部分精製リポ タンパク質リパーゼの活性の非競合的抑制物質であることが示された。さらに、 アポＡ−Ｉおよび）°ボＣＩ　Ｉ　Ｎの両方が欠乏している患者は低血漿トリグ リセリド水準を有することが示され、２８らに、イ〉・ビボ実験では、彼らは急 速にＶＬＤＬをＬＤＬに変換・？ることか示された。彼らのＶＬＤＬのインビト ロ脂質分解は、添加アポ（ＩＴ：　Ｘ　ｉ　Ｉによって抑制された。したがって 、アポＣＩＩＮの質または量における五十初の以上は血漿トリグリセリド量に影 響を及ぼし、ざらに、アポＣＩＩＩの生理学的役割は、トリグリセリドに富むリ ポタンパク質の異化作用の調節にあるのかもしれない。アポＣＩＩＮの機能的ド メインが明らかにされた。Ｃ０ＯＨ末端の３９ア゛ミノ酸はフォスホリピドに結 合し、一方ＮＨ７末端の４０個のアミノ酸は結合しない。アポＣＡＸＮの合成は 主に肝であり、それより少ない量が腸で合成される。１ＩＮＦ−４おＪ：びアポ ＣＩＩＮの拮抗物質のについて非常に様々な医ザー的利用が存在するようである 。例えば、心脈管に係わる疾患、例えばアテーロー人硬化性心疾患、高脂血症お よび動脈硬化は、血管内のＶＬＤＩ、お、よびコレステロ・ルの堆積を干渉ｒる ことによ一２Ｔ治療できる。

同様に過剰な脂質水準の存在を伴う肝疾患の治療もｉｊ７能である。

医療技術分野の当業者にとり、１ｉＮＦ−４に対するリガンドおよびアポＣＩＩ Ｎに対する拮抗物質が明らかである他の疾患も、技術が認識できる用量でそのよ うな化合物を用いて調節できる。

同様６ご肥満症のような状態もこの方法で治療できるかもしれない。医薬的特性 を有するｌ１ＮＦ−４に対するリガンドは有効かも（７れない。用いることがで きるアッセ・−７Ａ−マットは、２種の遺伝的抗生物質を利用する。１つは、適 切な細胞株にＤＮＡ感染（トランスフェクト）させたとき、関心があるレセプタ ーを持続的に発現する典型的なプラスミドである。ｃｖ−ｉ細胞が最もしばしば 用いられる。第二は、レポーター（例えばレセプター／リガンド複合体の制御下 にあるルシフェラーゼ）を発現するプラスミドである。例えば、ＩＮＦ−４のリ ガンドとして作用する化合物が評価される場合は、該プラスミドの一つは、適切 な細胞株（例えばＣＶ−１細胞）において、）（ＮＦ−４レセプターの発現を生 じる構築物であるだろう。第二のものは、ルシフェラーゼ遺伝子に結合させたブ ロモーク・−を有するであろう。これにはＨＮＦ　４応答エレメントが挿入され ている。テストずべき化合物がＨＮＦ−４レセプターの拮抗物質である場合は、 該リガンドはレセプターと複合体を作り、生じた接合体は応答エレメントに結合 し、ルシフエラー・ゼ遺伝子の転写を開始する。そのうち細胞を溶解させ、ルシ フェラーゼの基質が添加される。生じた化学蛍光を光学的に測定する。ドースレ スポンス曲線を得て、既知のリガンドの活性と比較することができる。ルシフェ ラーゼ以外の他のレポーターも用いることができ、ＣＡＴおよび他の酵素が含ま れる。

ウィルス構築物もレセプターおよびレポーター遺伝子を導入するために用いるこ とができる。通常のウィルスベクターはアデノウィルスである。この好ましいア ッセーに関するさらに詳しい記述については、米国特許第４９８１７８４号（１ ９９１年１月１日発行）およびＥｖａｎｓらのＷＯ３８１０３１６８号（１９８ ８年５月５日公告）を参照のこと。両文献は参考文献として本明細書に引用され ている。ＨＮＦ−４拮抗物質はこれと同じ基本的な拮抗物質アッセーを用いて同 定できる。固定量の拮抗物質を細胞に加え、被験化合物の量を変化させ１・−ス １／スポンス曲線を作成号′る。化合物が拮抗物質である場合には、ルシフェラ ーゼの発現は抑制される。ＡＰＦｌ遺伝子もまた上記のアッセーに取り込むこと ができる。拮抗物質リガンドをレセプターの持続的発現により、さらにレセプタ ーミニ結合するりガントを調べ、その後レポーターの産生量を測定することによ ってスクリーニングすることができる。

キメラレセプターの遺伝子を、アッセー系に用いることができる。こわらのキメ ラレセプターは、キメラ内に導入された”親”のＤＮＡ結合およびリガンド結合 ドメインの”起源”に基づきハイブリッドの機能的特性を有する。例えば、キメ ラレセプターのＤＮＡ結合ドメインがレティノイック酸レセプターＤＮＡ結合ド メインである場合（すなわち、野性型レティノイック酸レセプターから得られる か、または、レティノイック酸ＤＮＡ結合ドメインの機能的エレメントを含む突 然変異体（ミュータント）である）、このキメラは、レティノイック酸レセプタ ーに特徴的なりＮＡ結合特性を有する。同じことがリガンド結合ドメインにって も言える。キメラレセプターのリガンド結合ドメインが甲状腺ホルモンに結合す る場合、このキメラは甲状腺ホルモンレセプターに特徴的なリガンド結合特性を 有するであろう。これは、最もしばしばいわゆる”みなしごレセプター（すなわ ち天然のりガントが知られていない場合）に用いられる。通常構築されるキメラ は、既知のレセプター（例えばグルココーチコイドレセプター）の遺伝子のりガ ント結合ドメインが該ろなしごのリガンド結合ドメインによって置き換えられて いる。生じた構築物は、みなしごのリガンド結合ドメインおよびグルココーチコ イドレセプターのＤＮＡ結合ドメインをもつレセプターを生じる。したがって、 このレセプターは、グルココーチコイド制御遺伝子を制御するために用いること ができる。みなしごのリガンドは、別に良く知られたシステムでスクリーニング することができる。この方法でＩＮＦ−４遺伝子を用いることができる。

大量のレセプターを産生ずることができ、これを精製し結合アッセーに用いるこ とができる、レセプターの遺伝子もまた発現系で用いることができる。これらの アッセーは競合形式で行うことができる。ここでは、疑わしいリガンドが、一定 量の既知の標識リガンドをもつレセプターと競合する。これらのアッセーは、リ ガンドがレセプターと結合することを確認するために用いることができ、さらに 、シス／トランスアッセーは人工的所産でないことをさらに確認するために用い ることができる。大量のレセプターを発現させるために用いられるシステムには ウィルス感染細胞が含まれる。この場合には、レセプターの遺伝子は、プラスミ ドトランスフェクションによるよりはむしろ、ウィルス構築物の感染により導入 される。アデノウィルスが好ましい。また、酵母系も使用でき、この場合、レセ プター遺伝子は酵母の発現に適したプラスミドに挿入される。

ＩＮＦ−４の遺伝子は、例えばウィルス構築物に挿入され、ＩＮＦ−４レセプタ ー遺伝子をもつウィルスベクターは、上記のアッセーの伝達形におけるものと同 様、ＨＮＦ−４のレセプターを過剰発現させるために用いることができる。

に、シス／トランスアッセーは人工的所産でないことをさらに確認するために用 いることができる。大量のレセプターを発現させるために用いられるシステムに はウィルス感染細胞が含まれる。この場合には、レセプターの遺伝子は、プラス ミドトランスフェクションによるよりはむしろ、ウィルス構築物の感染により導 入される。アデノウィルスが好ましい。また、酵母系も使用でき、この場合、レ セプター遺伝子は酵母の発現に適したプラスミドに挿入される。

ＩＮＦ−４の遺伝子は、例えばウィルス構築物に挿入され、ＨＮＦ−４レセプタ ー遺伝子をもつウィルスベクターは、上記のアッセーの伝達形におけるものと同 様、ＨＮＦ−４のレセプターを過剰発現させるために用いることができる。

本発明のりコンビナンドＤＮＡ分子の発現は、生じたポリペプチドの宿主細胞に よる転写後修飾を伴うことができる。例えば、哺乳類細胞ではとりわけ、発現ポ リペプチドの糖付加、脂質付加もしくはリン酸化、または成熟タンパク質を生成 するためのシグナル配列の切離しを含む。したがって、ここで用いられているよ うに、ＨＮＦ−４という用語は、完全な長さのポリペプチドおよびその修飾体ま たは誘導体、例えばそのようなポリペプチドの糖付加型、成熟タンパク質、シグ ナルペプチド保持ボリプチド、匹敵する生物活性を有する切りつめたポリペプチ ド等を包含する。

ｍＲＮＡはＩＮＦ−４を発現している細胞から分離でき、ｃＤＮＡライブラリー 作成に用いられる。ｍＲＮＡの分離およびそれからｃＤＮＡをつくることについ て、多（の方法が知られている（例えば、Ｇｕｂｌｅｒ　＆　Ｈｏｆｆｍａｎ、 　１９８３；　Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２を参照のこと）。

ｃＤＮＡはその後適切なベクターに挿入される。ベクターｐｃＤＭ８　（Ｂｒｉ ａｎＳｅｅｄにより記載（Ｓｅｅｄ、　１９８７））が代表的である。このプラ スミドは、エスケリキア・コリー（大腸菌）中のコピー数が多いこと、真核性プ ロモーターであること、Ｃ０８７細胞のような一時的発現系における発現が高レ ベルであることを含む、い（つかの利点を有する。しかしいくつかの他のベクタ ーも利用可能である（例えば、Ｃａｔｅら（１９８６）参照）。

ｃＤＮＡライブラリー構築後、次の工程はＨＮＦ−４ｃＤＮＡ配列を含むクロー ンをそれから分離することである。様々に発現されたｍＲＮＡのためのｃＤＮＡ を分離する多くの方法が現在存在する。これらには、例えば、（１）標識ｃＤＮ Ａでのプラス／マイナススクリーニング；　（２）減数ｃＤＮＡライブラリーの 調製；（３）減数ｃＤＮＡプローブでのスクリーニングが含まれる（Ｄａｖｉｓ 。

１９８６；Ｓａｒｇｅｎｔ、　１９８７；　Ｄａｖｉｓら、１９８５　；　Ｈｅ ｄｒｉｃｋら、１９８４；　Ｄｕｇｕｉｄら、１９８８）。

ＩＮＦ−４配列のｃＤＮＡを含むクローンを同定するために、種々の技術を用い ることができる。第一の方法では、クローンを適切な真核発現系でＩＮＦ−４活 性の発現についてテストできる。様々な直接的発現技術を用いることができ、こ れは、λＧＴ　Ｉ　Ｉ　（Ｙｏｕｎｇ　＆　Ｄａｖｉｓ、　１９８３；　Ｙｏｕ ｎｇ　＆　Ｄａｖｉｓ、　１９８４）でクローニングされたｃＤＮＡによりコー ドされた融合タンパク質の抗体スクリーニング；またはクローニングしたｃＤＮ ＡまたはＳＰ６／Ｔ７プロモーターを含むプラスミドもしくはファージＤＮＡか らのｍＲＮＡの注入後、卵母細胞条件化培養液の活性の分析を含む。また別に、 種々のプロモーター、選別および複製エレメントを含むプラスミド、ファージお よびコスミドでライブラリーを作ることもできる。

動物細胞を、一時的または安定発現のために、このライブラリーでトランスフエ □　クトしてもよい。トランスフェクションは種々の方法で実施できる。一時的 発現には、スフェロプラスト融合、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーシ ョンが用いられた。安定発現には、リン酸カルシウム、スフェロプラスト融合お よびエレクトロポレーションが用いられた。

最近までは、直接的発現によ７てクローニングされた分子の同定は鋭敏なアッセ ーを必要とし、リンホカインに限定されていた。しかしながら、抗体“選別”技 術（Ｗｙｓｏｃｋ　＆　５ａｔｏ、　１９７８）またはＦａｃｓによる機能分子 の同定（Ｙａｍａｓａｋｉら、１９８８）のいずれかによって、有効な一時的発 現ベクターでの一本鎖細胞表面分子のｃＤＮＡクローニングは、直接発現によっ て同定できるクローニング分子の範囲を拡大した。

遺伝子をスクリーニングすることによって、転写プロモーターを含むＨＮＦ−４ のゲノムＤＮＡを分離できる。ｓｔｐ標識プローブを有するヒトの染色体ライブ ラリーをＩＮＦ−４ＤＮＡ配列のコード領域から得た。これによりＩＮＦ−４遺 伝子の非転写、および非翻訳領域部分を含むクローンを得ることができるかもし れない。

転写プロモーターは多くのものに利用できる。第一に、それらは、ＩＮＦ−４の 発現誘発に使用できるベクターを構築するために有用である。そのようなベクタ ーは、例えば、遺伝子トランスファーアッセーにおいて有用であるかもしれない 。ここでは、誘発できるプロモーターは、レポーター遺伝子（例えば、クロラム フェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）　、β−ガラクトシダーゼ 、ルシフェラーゼなど）の転写を作動させるように配置される。その後この構築 物は、一時的にまたは安定な形で、適切な哺乳動物細胞株に導入できる。続いて 誘発の潜在的抑制物質または刺激物質は、上記の誘発物質のいずれか、またはす べてによりそれらの誘導についての影響を測定することによってアッセーできる 。

ＩＮＦ−４を認識するモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマもまた作成 できる。

研究者らは、また放射性免疫療法およびイムノトキシン療法を開発している。

放射性免疫療法は放射性免疫結合物の使用を伴い、この場合、１１５　Ｉ、　ｓ ｏ’ｙ、”’Ｒｅなどのような核種が、特定の表面抗原を認識する抗体に結合さ れる。イムノトキシンは、例えばシュードモナスの外毒素などの細胞毒を結合さ せた抗体である。注射に際して、これらの結合抗体は、該抗原を発現している細 胞に毒性物質の照準を合わせる。本発明に従い、放射活性マーカー、核種および 細胞毒は、ＩＮＦ−４、ＨＮＦ−４を認識する抗体、ＨＮＦ−４を発現している 標的細胞、またはそのリガンドと結合させてもよい。

ＨＮＦ−４を分離するまた別の方法は、蛍光抗体標識を用いるであろう。この方 法では、ＩＮＦ−４発現細胞は、Ｍｏａｂｓ（モノクローナル抗体）とインキュ ベートされ、続いてＭｏ　ａ　ｂ　ｓを、例えば蛍光的に標識した抗マウス抗体 で標識する。蛍光抗体結合細胞は、続いて蛍光活性細胞選別機（ＦＡＣ３）で選 別することができる。選別細胞のＤＮＡを細菌宿主（例えば大腸菌）を形質転換 するために用いてもよい。生じたコロニーのＤＮＡをその後細菌宿主（例えば大 腸菌）を形質転換するために用いてもよい。生じたコロニーのＤＮＡを、さらに 、適切な細胞株にトランスフェクトするために用いてもよく、この操作は、単一 の発現クローンが同定されるまで繰り返すことができる。

発現ライブラリーは大腸菌でも作成することができる。例えば、λＺＡＰ＠（Ｓ ｔｒａｔａｇｅｎｅ）　／　ＨＬ　−６０ライブラリーを構築してもよく、大腸 菌で挿入ＤＮＡを発現するために使用できる。平板に蒔いたあと、例えば放射能 標識モノクローナル抗体でプラークを直接スクリーニングできる（Ｙｏｕｎｇ　 ＆　Ｄａｖｉｓ、　１９８３；Ｙｏｕｎｇ　＆　Ｄａｖｉｓ、　１９８４）。モ ノクローナル抗体が結合したプラークを釣り上げ、それらから挿入ＤＮＡを分離 する。　・抗体認識によらないＨＮＦ−４リガンドを同定する別の方法は、適切 なライブラリー（これは一部が除去されるかもしれない）でＣ０８７細胞をトラ ンスフェクトし、さらにそれらをＩＮＦ−４発現細胞に直接選別することである 。また、適切なりローンを分離するために、ライブラリーを十分に集積させるた め、多数回の選別が必要かもしれない。

ＤＮＡ配列を分離するまた別の技術は、オリゴヌクレオチドプローブでｃＤＮＡ ライブラリーをスクリーニングすることを伴う。十分なＨＮＦ−４タンパク質が 、例えば固定抗体を用いてアフィニティクロマトグラフィーによって精製されて いる場合は、アミノ酸の部分的配列を決定し、遺伝子の少なくとも一部分と一致 するオリゴヌクレオチドを合成してもよい。これらのプローブは、続いｃＤＮＡ ライブラリーをスクリーニングするために用いることができる。また別には、こ のオリゴヌクレオチドは、遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために用い る長いプローブを作成するためにプライマーとして使用してもよい。

ＨＮＦ−４ＤＮＡ配列および分子の幾つかの利用は、本発明の部分として意図さ れている。第一に、ＨＮＦ−４をこれらの分子と反応するモノクローナル抗体調 製のために利用−ｄ−’にとが“ｅきる５、Ｍ　Ｏ２１ｂ　ｓは診断に、ま六、 それに続い２、ＨＮＦ−、−４結合を抑制御る治療薬剤と（、て使用することか できる。

第二に、ＨＮＩ”−４またはイーのフラグメントの可溶形を結合抑制物質として 用いるこｃｌができる。ＩＮＦ−４ペプダドはＩＮＦ−４リガンドに結合し、。

ＨＮＦ−４リガンドはＨＮＦｉ！ノセグターに結合する”ｒあろう。両方法きも （れによってＩＮＦ−４結合を抑制４る２、 可溶ｆ１．すｊ゛／／ビーノ゛／目Ｆ−４リガンドを生成するために、例えば、 　トランスメンブレン領域を除外するために、それらの分子をコー・ドするＤＮ Ａを改変することができるであろう。したかつへり溶性分子のＤＮＡは、おそら くは細胞質ドメインに結合した細胞外ドメインの全てまたは一部分を含むであろ う。このアプローチは、すでに、可溶性ＣＤ４（、Ｔイズウイルスに結合するＴ 細胞の表面タンパク質）を用いて実証された（Ｆｉｓｈｅｒら、１９８８）。こ のアプローチはまた抗体療法の問題を回避する。なぜならば、使用されるポリベ ブザドは免疫応答を誘発することが少ないからである。

可溶性リコンビナント分子について研究者らが遭遇した問題は、血漿半減期が短 いということである（Ｃａｐｏｎら、１９８９）。なぜならば、そのような分子 はシステムから迅速に除去さね、治療効果を得るために、大量まＩ、−は瀕回注 射が必要となるからである。したがって、研究者らは可溶性分子の半減期を増加 させる方法を探した。可能性のある解決法は、可溶性分子を血流中でより長い半 減期を有することが知られている別の分子に連結することである。免疫グロブリ ン分子はその長い半減期により有望な候補となるであろう。Ｃａｐｏｎら（１９ ８９）は、リコンビナントＤＮＡ技術を用い゛Ｃ可溶性ＣＤ４を免疫グロブリン 分子に連結さぜることを報告している。このアプローチでは、免疫グロブリン分 子の可変領域を可溶性タンパク質で置き換え、タンパク質／免疫グロブリン融合 タンパク質が形成される。

可溶性リコンビナント免疫グロブリ゛ノ融合タンパク質は、可溶性タンパク質だ けよりもはるかに長い血漿半減期を有するであろう。そのような融合タンパク質 は、可溶性分子をコードするＤＮＡ配列を免疫グロブリンの定常ドメインをコー ドするＤＮＡ配列に融合させて、好ましくはりコンビナンド構築物で調製される ５３、′二のりコンヒナン１−ＤＮＡは、その後適切な宿を細胞（好ま（パは動 物細胞）Ｃ発現さｔｌ、融合タンパク質を産生ずる。

免疫融合タンパク質は、また別の利点を有゛４ろ１、なぜならば、免疫グ０／リ ン分子は普通には２価（すなわち、それらは２つの結合部位を有する）で・あり 、免疫グロブリン融合タンパク質は２個のＨＮＦ−４を有し、したがって、２個 のりガント結合部位を有するからである３、したがって、それらはＩＮＦ−４リ ガンドを表す細胞に対してより強い親和性または有効性を期待することができる 。

第三に、疾患の存在を検出するために、ＨＮＩ−４レセプター　（例えば抗ＨＮ Ｆ−４抗体、またはリガンドもしくはそのフラグメントのようなマーカー）と結 合している分子を用いてもよい。これは、例えば、蛍光または放射能活性によっ て検出できる分子を作成し、それを患者に投すし、さらに生体内でそれが蓄積す る場所を決定することを伴う。この方法では疾患のタイプを同定することもでき るであろう。

第四に、ＨＮＦ−４が炭水化物部分またはその他の転写後修飾を介してそのリガ ンドに結合する場合、それが結合しているＩＮＦ−４Ｌの炭水化物を同定するた めにＨＮＦ−４を用いることも可能であろう。

第五に、抑制物質のために小さな分子をスクリーニングするための系の部分とし てＩＮＦ−４を用いることもできるであろう。例えば、ＨＮＩ−４とそれに対す るリガンドとの相互反応を抑制する能力について低分子をテストするアッセー系 を作ることができるであろう。この方法で同定される低分子抑制物質は薬剤候補 を提供するであろう。

第六に、ＨＮＦ−４を抑制する内在性タンパク質を同定するためにこれらの分子 を用いることが可能であろう。

第七に、融合タンパク質を作ることができるであろう。タンパク質はいくつかの 構造的ドメインからできていること力蜘られている（Ｓｉｎｍｏｎｓら、１９８ ８）。各タンパク質の種々のドメインをコードするＤＮＡ配列は、例えば、免疫 グロブリン融合タンパク質を作成するために記載した遺伝子融合技術を用いて融 合される。

選択されるドメインはリガンドおよびＨＮＩ−４と結合する能力を有するもので ある。既知のリガンドに結合するドメインが好ましいであろう。これらのＤＮＡ 配列の発現に基づき産生されるポリペプチドは、１（ＮＦ−４、リガンドまたは その両方に対するリガンドを有するすべての細胞の付着を阻害するので有用であ る。

最後に、ＩＮＦ−４またはＨＮＩ−４リガンドの発現に翻訳段階で介入する核酸 分子を調製するために、ＩＮＦ−４およびＨＮＦ−４リガンドのＤＮＡ配列を用 いることができるであろう。このアプローチは、アンチセンス核酸でｍＲＮＡを マスクするか、またはりボザイムでそれを切断することにより特異的ｍＲＮＡの 翻訳を阻害するために、アンチセンス核酸およびリボザイムを利用する。これら の方法はまた疾患を治療するために有用であろう。

アンチセンス核酸は、特異的ｍＲＮＡ分子の少なくとも一部と相補的なりＮＡま たはＲＮＡである（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ、　１９９０：　Ｍａｒｃｕｓ−３ｅｋ ｕｒａ、　１９８８参照）。細胞内では、それらは、該ｍＲＮＡと雑種形成し、 二本鎖分子を形成する。細胞はこの二本鎮形のｍＲＮＡを翻訳しない。したがっ て、アンチセンス核酸はｍＲＮＡのタンパク質への発現を干渉する。およＪｃ１ ５ヌクレオチドのオリゴマーおよびＡＵＧ開始コドンと雑種形成する分子は特に 効果的である。なぜならば、それらは合成しやすく、さらにＨＮＦ−４産生細胞 にそれらを導入したとき、より大きな分子より問題が少ないからである。アンチ センス法は、多くの遺伝子のインビトロ発現を抑制するために用いられてきた（ Ｍａｒｃｕｓ−３ｅｋｕｒａ、　１９８８；　Ｈａｎ＋ｂｏｒら、！９８８）。

リボザイムは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ制限酵素といくぶん類似した態様で他 の一本鎖ＲＮＡ分子を特異的に切断する能力を有するＲＮＡ分子である。リボザ イムは、特定のｍＲＮＡが自身のイントロンを切り出す能力を有するという観察 を基に発見された。これらのＲＮＡのヌクレオチド配列を修飾することによって 、研究者らはＲＮＡ分子の特異的ヌクレオチド配列を認識し、それを切断する分 子を創りだすことができた（　Ｃｅｃｈ、　１９８８）。それらは配列特異的で あるので、特定の配列を有するｍＲＮＡだけ力坏活性化される。

研究者らは２つのタイプのりポザイムを同定した：テトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈ ｙｍｅｎａ）型およびハンマーヘッド型である（Ｈａｓｓｅｌｈｏｆｆ　＆　Ｇ ｅｒｌａｃｈ、　１９８８）　ｏテトラヒメナ型すボザイムは４塩基間列を認識 し、一方、ハンマーヘッド型は１１から１８塩基配列を認識する。認識配列が長 いほど、標的ｍＲＮＡ種により独占的に反応する。したがって、特異的ｍＲＮＡ 種を不活性化するためには、テトラヒメナ型すポザイムよりハンマーヘッド型す ボザイムが好ましく、さらに、１８塩基認識配列の方がより短い認識配列より好 ましい。

ここに記載するＤＮＡ配列は、したがって、ＨＮＩ−４およびＩＮＦ−４リガン ドのｍＲＮＡに対するアンチセンス分子および切断するリボザイｌ（を調製する ために用いることができる。

アンチセンス分子およびリポザイムは、ＨＮＦ−４の発現を干渉する分子を細胞 に導入することによって、疾患を治療する方法に用いることができる。治療薬剤 は静脈注射により容易に送達させることができるので、アンチセンス分子または りボザイムが効果的に送達されることを条件として、肝細胞はそのような治療に ついて魅力的なターゲットである。

これらの分子を標的細胞に送達させるために用いることができる２つのアプロー チが提示された。第一は、アンチ−ＨＮＦ−４アンチセンス核酸、またはｍＲＮ Ａ分子としてＨＮＦｉ特異的リボザすムを発現しているベクターで標的細胞をト ランスフ１クトすることを伴う（Ｈａａ＋ｂｏｒら、上掲書）。このアプローチ はインビトロで細胞株を扱っている場合には非常に有用であるけれども、インビ ボではそのように効果的ではない。インビボ送達についてより有望な第二のアプ ローチは、アンチ−〇ＮＦ−４Ｎシーセンス分子、ＩＮＦ−４特異的リボザイム またはそれらを発現しているベクターをリポゾームに積載することを必要とする 。

これらのりポゾームは、また、疾患部位にリボゾームを導くためにモノクローナ ル抗体を含むことができる。

本発明の別の特徴は、本明細書に開示されたＤＮＡ配列の発現である。当該技術 分野でよく知られているように、ＤＮＡ配列は、適切な発現ベクターにおいて、 それらを発現制御配列に作動的に連結し、その発現ベクターを適切な単細胞宿主 を形質転換するために用いることによって発現できる。

本発明のＤＮＡ配列の発現制御配列へのそのような作動的連結は、（まだ該ＤＮ Ａ配列の一部分となっていない場合は）、もちろん当該ＤＮＡ配列の上流の正確 な読み取り枠内に開始コドンＡＴＧを供給することを含む。

本発明のＤＮＡ配列を発現するには広範囲の宿主／発現ベクターの組み合わせを 用いることができる。例えば有用な発現ベクターは、染色体性、非染色体性およ び合成りＮＡ配列のセグメントから成る。適切なベクターは、ＳＶ４０の誘導体 および既知の細菌プラスミド（例えば大腸菌プラスミドのｃｏｌＥｌ、ｐｃＲｌ 、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９およびそれらの誘導体）、ＲＰ４のようなプラスミド ；ファージＤＮＡ　（例えばファージλの多数の誘導体（例えばＮＭ９８９）、 他のファージＤＮＡ　（例えばＭ１３）およびフィラメント状−末鎖ファージＤ ＮＡ；酵母プラスミド（例えば２μプラスミドまたはその誘導体；真核細胞で有 用なベクター（例えば昆虫または哺乳類細胞で有用なベクター）；プラスミドお よびファージＤＮＡの組み合せから得られたベクター（例えばファージＤＮＡま たは他の発現制御配列を用いるために修飾されたプラスミド）などである。

広範囲の発現制御配列（作動的に連結されたＤＮＡ配列の発現を制御する配列） のいずれも、本発明のＤＮＡ配列を発現するためにこれらのベクターに用いるこ とができる。そのような有用な発現制御配列には、例えば、ＳＶ４０またはアデ ノウィルスの初期および後期プロモーター、里系、ｔｒｐ系、工ＡＳ演たはＴＲ Ｃ系、λファージの主要なオペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタ ンパク質の制御領域、３−ホスフォグリセレートキナーゼまたは他の糖分解酵素 のためのプロモーター、酸ホスファターゼのプロモーター（例えばＰｂｏ２）、 酵母α−接合因子のプロモーター、さらに、原核もしくは真核細胞またはそれら のウィルスの遺伝子の発現を制御することが知られている他の配列、およびそれ らの種々の組み合わせが含まれる。

広範囲の単細胞宿主が、また、本発明のＤＮＡ配列の発現に有用である。これら の宿主は、よく知られた真核細胞および原核細胞宿主：例えば大腸菌、シュード モナス、バチルス、ストレプトミセス株、酵母のようなカビ、動物細胞（例えば ＣＨＯ，Ｒ１，Ｌ　Ｂ−Ｗ、およびＬ−Ｍ細胞、アフリカミドリザル腎細胞（例 えばＣＯ８ｌ　、　ＣＯ３７、Ｂ５Ｃｌ、Ｂ５Ｃ４０およびＢＭＴＩＯ）、昆虫 細胞（例えば５ｆ９）、ヒトの細胞および組織培養植物細胞を含む。

本発明のＤＮＡ配列を発現するために、ベクター、制御配列および宿主がすべて 等しく有効に機能するわけではないことは理解されるところである。さらにまた 、同じ発現系で全ての宿主が等しく有効に機能するわけでもない。しかし、当業 者は、本発明の範囲内で、所望の発現を得るために過度の実験を行うことなく、 適切なベクター、発現制御配列および宿主を選択し得るであろう。例えば、ベク ターを選択する場合は、ベクターは宿主の中で機能しなければならないので宿主 が熟慮されなければならない。ベクターのコピー数、コピー数を制御する能力、 ベクターによりコードされる他の一切のタンパク質の発現（例えば抗生物質マー カー）もまた考慮されるであろう。

発現制御配列を選択する場合、種々の因子が通常考慮される。これらには、例え ば、その系の相対的な強さ、その制御能、および発現されるべき特定のＤＮＡ配 列または遺伝子との適合性（特に潜在的な二次構造に関して）が含まれる。適切 な単細胞宿主は、例えば選択ベクターとの適合性、それらの分泌特性、タンパク 質を正確に折り曲げる能力、それらの培養要求性を、発現されるべきＤＮＡ配列 によってコードされる産物の宿主に対する毒性、および発現産物の生成の容易さ とともに考慮することによって選択されるであろう。これら、および他の因子を 考慮しながら、当業者は、醗酵または大規模動物細胞培養で本発明のＤＮＡ配列 を発現する、ベクター／発現制御配列／宿主の様々な組み合わせを構築すること ができるであろう。

ＨＮＦ−４およびそのリガンドに対する抗体は、他のリガンドを分離する別の可 能な方法となるであろう。この方法は、イディオタイプとして知られている抗体 の特性を利用するものである。各抗体は抗原に特異的な固有の領域を含んでいる 。この領域はイディオタイプと呼ばれる。抗体は、それ自身抗原決定基を含んで おり、抗体のイディオタイプはその分子に固有の抗原決定基である。生物を抗体 で免疫することによって、それらを認識する“抗抗体”を生じることができる。

抗抗体はイディオタイプを認識する抗体を含む。別の抗体のイディオタイプを認 識する抗体は、抗イデイオタイプ抗体と呼ばれる。いくつかの抗イデイオタイプ 抗体は、当該抗体が認識する最初の抗原の形に似ており、抗原の“内部イメージ ”を担うと言われている（Ｋｅｎｎｅｄｙ、　１９８６）。抗原がリガンドであ るとき、ある種の抗イデイオタイプは、インシュリン、アンギオテンシンＩＩ、 アデノシンＩ、β−アドレナリンに対するレセプター並びにラット脳ニコチンお よび阿片剤レセプターに結合する（　Ｃａｒｌｓｓｏｎ　＆　Ｇｌａｄ、　１． ９８９）。

この現象を利用して、抗イデイオタイプ抗体を用いて他のＩＮＦ−４リガンドを 分離できるかもしれない。抗イデイオタイプは、最初の抗原と結合する分子をス クリーニングするために利用できるかもしれない。

実験手順 抽出物の調製およびクロマトグラフィーは４℃で実施した。

ラット肝の核抽出物の調製 ラット肝の核粗抽出物を、以下のように修飾したゴルスキーらの方法（Ｇｏｒｓ ｋｉら、１９８６）を用いて調製した： 新たに殺処分した３から４匹の雄のう・ソト（スプラーグードーレー、およそ２ ０週令）からおよそ５０ｇの組織を取り出し、３０ｍ１の緩衝液Ａ（１０ｍＭの ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７，９；　２５ｍＭのＫＣＩ；０．１５ｍＭのスノ々−ミン； ０．５ｍＭのスパーミジン；１．ＯｍＭのＥＧＴＡ；　１．ＯｍＭのＥＤＴＡ； 　１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）；　０．３２Ｍの蔗糖）で均質化し、 ダウンスホモジナイザーで５から７回処理しく乳棒Ａ）、２容の緩衝液ｂ　（２ Ｍの蔗糖を除きＡと同じ）で希釈した。２７ｍ１の均質化物を１０ｍ１の緩衝液 Ｂのり・ソションに重ね、ベックマン５Ｗ２７０−ターで１５００Ｏｒｐｍ、４ ５分遠ＩｃＪ１シた。沈澱した核を緩衝液Ｃ（蔗糖の代わりに２０％グリセロー ルを用いることを除き緩衝液Ａと同じ）で１度洗浄し、５度ダウンスホモジナイ ザーで処理しく乳棒Ｂ）、緩衝液Ｄ　（ＩＭのＫＣＩを除いて緩衝液Ｃと同じ） で０．４１ＭのＫＣｌとした。

４℃で４５分穏やかに揺り動かしてタンパク質を抽出した。１８００００Ｘｇで ４５分遠心してクロマチンを沈澱させた。さらに上清（核粗抽出物、タンノくり 質３．５−５．０ｍｇ／ｍｌ）を直ちに液体窒素中で凍結し、−８０℃で保存し た。

ＤＴＴおよびプロテアーゼ抑制物質（フェニルメチル−スルファニルフルレオリ ド、０．５ｍＭ；ベンザミジンＨＣＬ　１ｍＭ；ロイペプチン、０．５μｇ／ｍ ｌ；ペプスタチン、１Ｍｇ／ｍｌ）を使用直前にすべての緩衝液に加えた。

モビリティシフトアッセーおよびＨＮＦ−４の精製ゲルモビリティシフト（ＤＮ Ａ結合）ア・ソセー（Ｆｒ１ｅｄ　＆　Ｃｒｏｔｈｅｒｓ、　１９８１）を、シ フト緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７，９；　４０ｍＭのＫＣＩ；２ｍＭ のＭｇＣｌ　ｖ　；　１　ｍＭのＤＴＴ；　０．５ｍＭのＥＧＴＡ；　４％フィ コール）中で１５μｍの反応物（ｌ−２μＩのタンパク質抽出物およびＫｅｎｏ ｗにより３！Ｐで標識した０、５ｎｇの二重鎖オリゴヌクレオチドプローブを含 む）で実施した。反応物を室温で２０分インキュベートした。ポリ（ｄｌ−ｄＣ ）（オリゴヌクレオチド抑制物質）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を表示 したように加えた。タンパク質結合ＤＮＡ複合体（５μｌのシフト反応物）を、 ８％ポリアクリルアミドゲルで２５ｍＭのトリス−ボレートおよび０．２５ｍＭ のＥＤＴＡ中で、４℃で電気泳動して、未結合プローブを分離した。

プローブとしてＡＰＦ−１またはＨＮＦ４Ｐオリゴヌクレオチドのいずれかを用 いて、クロマトグラフィー分画をモビリティシフトアッセーによって分析した。

核粗抽出物（３００ｍｇまで）を、１５０ｍＭのＫＣＩを含む緩衝液Ｅ（２０ｍ ＭのＨＥＰＥＳ、　ｐＨ７，９，１０％グリセロール；１ｍＭのＤＴＴ；０．１ ｍＭのＥＤＴＡ；０．１ｍＭのＥＧＴＡ）で平衡化させた６０ｍ１のヘパリンア ガロースカラムにかけた。このカラムを０．２から０．８ＭのＫＣＩの直線濃度 勾配４００ｍ１で展開した。ＨＮＦ−４活性（０，５０−０，５５ＭのＫＣＩ） をもつ分画を纏め、硫酸アンモニウム（最終濃度３００ｍｇ／ｍｌ）で沈澱させ 、１００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液Ｆ（０，０５％ノニデットＰ−４０（ＮＰ −４０）以外は緩衝液Ｅと同じ）に溶解し、透析して２４０ｍ１のセファクリル ５３００　（ファルマシア）カラムに載せた。ボイドボリューム直後に溶出する 活性分画を、緩衝液Ｆ／１００ｍＭのＮａＣｌで平衡化した二重鎖ＤＮＡセルロ ース（シグマ）カラム５ｍｌに載せた。カラムを３段階勾配（１５０ｍＭ、３０ ０ｍＭおよびＩＭのＮａＣ１）で展開した。活性分画（３００ｍＭのＮａＣ１で 溶出）を１００ｍＭのＮａＣ１に希釈し、さらにポリ（ｄｉ−ｄＣ）および超音 波処理した変成サケ精子ＤＮＡを各々ｌＯμｇ／ｍｌとなるよう添加した。氷上 で１０分してから、ＫａｄｏｎａｇａとＴ　ｊ　ｉ　ａ　ｎ　（１９８６）のよ うに調製したＩＮＦ４Ｐオリゴヌクレオチドアフィニティーカラム２ｍｌに載せ 、緩衝液Ｆ／１００ｍＭのＮａＣ１で平衡化させた。カラムを０．１から１．０ ＭのＮａＣｌの直線濃度勾配２０ｍ１で展開した。０．１８−０．３ＭのＮａＣ ｌで溶出する活性分画を０．１ＭのＮａＣ１濃度に希釈し、ポリ（ｄｌ−ｄＣ） およびサケ精子ＤＮＡを各々３μｇ／ｍｌの濃度で補充し、上記のように２ｍｌ のＡＰＦｌオリゴヌクｌ／オチドアフイニテイーカラム２ｍｌに通した。０．２ ５から０．５ＭのＮａＣｌで溶出するＨＮＦ−４結合活性を、１００ｍＭのＮａ Ｃｌを含む緩衝液Ｔ（２０ｍＭのＴｒｉｓ塩酸、ｐＨ８，０および２０％グリセ ロール以外は緩衝液Ｆと同じ）に対して透析し、ＦＰＬＣモノＱＨＲ５１５（、 ファルマシア）カラムに載せた。カラムを０．１から１．ＯＭのＮａＣ１の直線 濃度勾配で展開した。■調製物のピーク分画（分画３８）は、およそ０．４２Ｍ のＮａＣ１で溶出した。精製ＩＮＦ−４とは５カラムすべてを通した物質をいう 。

ＩＮＦ−４の復元 およそ５０ｎｇの精製ＨＮＦ−４（ＡＰＦ１オリゴヌクレオチドに対する活性に 基づく）をＳＤＳサンプル緩衝液と混合し、７２℃１５分加熱し、０．１ｍＭの チオグリコレートナトリウムで予備洗浄した１２．５ｃｍの１０％５ＤＳ−ポリ アクリルアミドゲルで分画した（Ｌａｅｍｌｉ、　１９７０）。ゲルスライスを 切り出し、タンパク質を溶出させ、溶出緩衝液に０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを加 えること、復元には１００ｍＭのＮａＣ１，３，５ｍＭのＭ　ｇ　Ｃ１！および ６Ｍの塩酸グアニジン含有緩衝液ｃ；ｃｏ、ｔ％ＮＰ−４０以外は緩衝液Ｅと同 じ）を用いたこと以外は、Ｂｒ１ｇｇ５ら（＋９８６）の記載と本質的に同じよ うに復元させた。３５　ｆｔ　１の回収物質の５μｌをモビリテイシフトアツセ ー（０，０５μｇポリ（ｄｉ−ｄＣ）’）−２０２から−７０のマウスＴＴＲプ ロモーター（Ｃｏｓｔａら、１９８６参照）を含む１３７塩基対ＤＮＡフラグメ ントを、ＢａｍＨ１部位（＝−２０２から７塩基対）またはＸｂａ１部位（−Ｔ Ｏ）のいずれかをクレノーで充填することによって、■Ｐで標識した。精製ＨＮ Ｆ　−４（２μｇのＡＰＦｌオリゴヌクレオチドをシフトさせるのに七分量）を 、ポリ（ｄｉ−ｄＣ）の非存在下において一２０２／−７０ＴＴＲプロ一ブｌｕ ｎｇを含む、３０μｌのシフト反応物中でイ：／キ、べ−Ｉ□Ｌ、、５％ポｌＪ ７クリルｒミドゲルで電気泳動ｌまたｏ　Ｋｖｉｙａ　ｂ　ａ　ｒ　ａとＳｉｇ ｍａ　（１９８７）が記載し、たように、１，１０イ八−ナントロリン銅・ｆオ ンでゲノｌノを処理した後、結合おにび未結合ブｌ１ｉ−ブ（湿潤ゲルのオート ラジオグラフィー、て識別）を切り出し、アガロースに埋め込み、電気的溶出に よってＤＥＡＥｗＡ（ＮＡ　−４５（Ｓｃｈｌｅｉｅｈｅｒ　５ｃｈｕｅｌｌ） ）上にＤＮＡを回収した。切断プローブを８Ｍウレア／１０％ポリアクリルアミ ドゲルで分析した。

ホスファターゼ反応については、精製ＩＮＦ−４（モノＱ、分画３８．４μｇ） を２０μｍの反応物中で３７℃２０分インキュベートした。反応物は、ＫＣＩお よびＥＧＴＡを含まないか、０．００５％ＮＰ−４，０および０．２５μｇ／ｕ ｌのＢＳＡを含む０．２５Ｘシフト緩衝液中にウシ腸アルカリホスファターゼ（ ＣＩ　Ｐ。

２．５μ＋、ＩＵ／μｌ：ベーリンガーマンハイム）を含み、または含まない。

酵素を含まない反応物は２．５μｌのＣＩＰ保存用緩衝液（３０ｍＭ、トリエタ ノ−□　ルアミン、ｐＨ７，６；３ＭのＮａＣｌ；１ｍＭのＭｇＣＩｔ　；　０ ．１ｍＭのＺｎＣ１ｔ）を含んでいた。プロテアーゼ反応については、精製ＩＮ Ｆ−４（分画３８、ｅｚ、ｓｎｇ）をプロテアーゼＶ８　（５μｇ）またはエン ドプロテイナーゼ■、ｙｓｅ　（５μｇ）（ともにベーリンガーマンハイム社製 ）を含む１０μｍの反応物中で、３７℃で１．５時間イ：／キュベ２−トした。

各反応物の１　／　５をモビリティシフトアッセー（３μｇのＢＳＡ／　１５　 ｔｔ、　１反応物、ポリ（ｄｌ−ｄＣ）は含まず、４種の！ｔｐ標識標識オリゴ ヌクｌ／オツドプローブＰＦ　１．　−１５１から−１３０，ＨＮＦ４Ｐ、ＨＮ Ｆ４Ｄ）を含む）で調べた。

臭化シアン切断とタンパク質のアミノ酸配列決定およそｉｏμｇ（２００ピコモ ル）の精製Ｉ　Ｎ　Ｆ　−４（分画３８）を１．３Ｍ塩酸グアニジン（ウルトラ ピュアー、ＩＣＮ）および０．０３％β−メルカプトエタノール（シグマ）に入 れ、緩衝液Ｈ（１０ｍＭのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中の５％ｌ−プロパツー ル）で平衡化した逆相ＨＰ　Ｌ　（：カラム（アクアポアブチル３０Ｘ２．１ｍ ｍ、７μｍ、ブラウンリーラブ）に載せｉｏ　１０ｍＭのＴＦＡ中の５％から５ ９％ｌ−プロパツールの濃度勾配９ｍｌで、０．１５ｍ１／分の流加でカラムを 展開した。ＨＮＩ−４を含む分画（４７％から５０％ブＹ１パノール）を纏めて 乾燥し、５０％蟻酸中の５７７　Ｅン′ロｌＩのＣＮＢｃ’Ｔ’２４時間処理し た。

ＣＮＢｒ生成ペブ１−ドを−［−記の条件を用いｒｔＨ’Ｔ−ｃ−ｒ分離した１ 、ベプヂ匿口ｆ分画を、アプライドバイ号“ンス戸ム社のガ入相（モデル４７０ ）で直接配列決定す”るか、またはさらに１６．５％Ｓ　ｌ１ｌ）　Ｓポリアク リ刀ｊア゛ミドゲルｒｔＮ製し、さらＩＪ二゛ｌツダイラ（１９８７）の記載の ように５１３列決定を行った（ｐｅｐ３：Ｌ；よびｐ　（！Ｉ）　４　）Ｉ−Ｉ ＮＦ−４ｅＤＮＡクローンの分離ｐｅｐＬｐ叫）２、ｐｅｐ３の最も縮重の少な い領域に対応する′：Ａ１月二ｆヌク１ノオチトプライマーを合成した：ブタ２ イマーＩｓ（ｐｅｐｌのセンス方向から）は５’　−ＣＣ（Ｃ／Ａ）ｔｃｃ　（ Ｃ／Ｇ）ＡＸＧＧＮＧＣＮＡＡＹＹＴＮＡＡ−３°で、ここでＮ＝Ａ　十Ｇ　十 Ｔ　＋Ｃ，Ｘ＝Ａ＋Ｇ、Ｙ＝Ｃ＋Ｔである。、プライマーＩＡ（ｐｅｐｌのアン チセンス方向）は５’−Ｔ”ｌ”ＡｇｇＴＴＴＴＮＧＣＮＣＣＹＴ　（Ｇ／Ｃ） Ｎ　（Ｇ／Ｃ）ＸＮＧＧ−３’　であった。プライマー２Ｓ（ｐｅ１］２のセン ス方向）は５°　−ＣＡ工Ｃ”ｌ”ＡＧＡＡＴｔＧＡｇＣＡｇΔＴ　（Ｙ／Ａ） ＣＡ　（Ｇ／Ａ）ＴＴＹＡＴ　（Ｙ／Ａ）ＡＡ−３’　であった。プライマー２ Ａ（ｐｅｐ２のアンチセンス）は５’　Ａ−ＡＣＧ工ｐへＧＡｇｃＴＴ　（Ｘ／ Ｔ）ＡＴ（Ｇ／Ａ）ＡＡＹＴＧ　（Ｘ／Ｔ）ＡＴＹＴＧＹＴＯ−３°であった。

プライマー３Ｓ（ｐｅｐ３のセンス）は５°−ＧＡｇＧＣｔＧＴＮＣＡＸＡＡＹ ＧＡＸ　（Ｃ／Ａ）ＧＮＧＡ−３’　であった。プラ、イマ−３Ａ（ｐｅｐ３の アンチセンス）は５°　−ＴＣ（Ｙ／Ｇ）Ｃ（Ｇ／Ｔ）ｅＴＣＸＴＴＹＴＧＮＡ ＣＮＧＣＹＴＣ−であった。小文字活字はＬ　ａ、　ｔ　ｈ　ｅ　（１，９８５ ）によるコドン使用を示１．、下線部分はザブクローニングのために用いられる Ｘｈｏｌ制限部位を示し７でいる。プライマー−は、バーキンーエルマーシーク ス（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）のプロトコールに従い、対の状態 （プライマー・ＩＳ＋２Ａ、ｌｓ＋３Ａなど）でポリメラーゼチェーン反応（Ｐ 　ＣＲ，）　（Ｓａｉｋｉら、１９８８）に用いた。０．５から４μｇの各プラ イマー（ＩｓとｌＡ、４μｇ；２Ｓと２Ａ、０．５μｇ；３Ｓ、Ｉμｇ、３Ａ、 １．５μｇ）およびλＺａｐＩＩ中のｌＯμｌのラット肝ｅＤＮΔライブラリー （Ｓｔ＋須ｅｇｅｎｅ社製、１．．５Ｘ１０’インディペンデントリコンビナン ト、アンプリファイ（増強）させ４Ｘ１０Ｉａｐｆｕ／ｍｌで使用）を含む、５ ０μｍの反応物をＤＮＡ熱サイクラ−（パーキンエルマーシータス社製）で３０ サイクル反応させた。各サイクルは９４℃で１分、５７℃で１分、７２℃で２． ５分（プラス５秒／サイクル）から成っていプこ。ＰＣＲ産物は、ブルースクリ プトＩ（Ｓ　（＋）　（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）のポリリンカー領域でクローニ ングし、Ｕ、　Ｓ、バイオケミカル社のシークＬす・−セキットを用いて配列決 定した。ｄｌＴＰ反応は、配列が不明瞭な領域に実施１，７た。っ以下の点を除 き一ノで、ア　ディスら（１９８２）の記載に従い、非増強うント肝ｃｌＪ”、 ＴＡライグラリー　（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）を完全な長、へのりＵｉ　−ンに つい゛Ｃスクリー：＝＞グしｊ−・ＤＮＡを結合３させるためｌご斗［１セルロ ースソイルクー・はオー斗り１７．・〜ブした；予備雑種形成用緩衝液ｒはホル ムアミドは使用しなかっｔ、−；雑種形成、ｌ、、；　、ｌ、び洗浄は５０℃で 行った。ゾロ〜ブは、ランダムプライミソグにより１ｐ−ｐ標識した３Ｓおよび ２Ａプライ７−・を用いて得られたリーブク「１−ニングしｔ、＝　Ｐ　ＣＲａ 物であった（Ｆｃｉｎｂｅｒｇ＆　Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉ＋＋、１９Ｆ１３）　、 、トランスアクティヘーンー３：／アッセーＨＩＶ　ＣＡＴ１ノボ・−クー構築 物り一５ｋｂ）は、ｐ　Ｇ　Ｅ　Ｍ　−１（Ｐｒｎｍｅｇａ　）中のＳＶ４０ス プライスおよびポリ（ａ）部位（＋）ＳＶ２ＣＡＴから、Ｇｏｒｍａｎｉ−＋、 ＋９８２）に連結された細菌クロラノ−、フ、二二］−ルアセチルト一＝ノンス ノＳラーじ（ＣＡＴ）遺伝子の５゛１−すぐ続く、ヒト免疫不全Ｃフィルス（Ｈ ＩＶ）のロングターミナルリピート た（構築は［、ｅｗ，　Ｄｅｃｋｃｒ．　Ｓｔｅｈｌｏｗ．　Ｄａｒｎｅｌｌ　 （準備中）に記載）。ＡＰＦｌ−ＨＩＶ−ＣＡＴｌ，ポークー構築物は、ＦｉＩ Ｖ’−ＣＡＴＯ）ｐＧＥＭボリリ〕／カーのＳｍａ　１部位（ＨＩＶＩ，ＴＲか ら１７１−）り）′Ｔ′クローニングされた、ダ・イＬ／りトリピー　ト中の２ つのＡＰＦＩオリイヌク１７オチドか１）成る。）ｉＮＦ−　４発現へ／）り（ セ’．．ｉ７．方向、Ｌ）ＬＥＮ４　Ｓ　：　Ｔン４−センス方向、Ｌ＞　１． 　Ｅ　Ｎ　４　Ａ）　ｉｔ、ｐ　ｆ７の３ｋｂのＨＮＦ−４の完全なＣＤＮＡを ｐＬＥＮ　（Ｃａｉ−Ｂｉｎ　Ｉｎｃ社提供）のＢａｍＬ（１部位でりＯ−一一 ーーングすることによって構築した．ｐＬＥＮは、ＳＶ４０エンハーンサ−（１ 　１２０ｈ＋ｐ，Ｉ（ｉｎａＴ　Ｘ　Ｉフラグメント）、ヒトのメタロチオネイ ンプロモータ　（８３６ｂｐ．ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨｌフラグメント）およ びヒト成長ホルモン３゛非翻訳領域（〜５５０ｂｐ，ｐＵＣ８内のＢａｍＩ（１ −−ＥｃｏＲＩフラグメント）を含む、−５ｋｂの発現４ベクタ・−である。

ＤＮＡ）ランスフ】クションおよびβ−ガラクトシダーゼおよびＣＡＴアッセー は、本質的にサンプルツクら（１９８９）にしたがって実施した。ＤＮＡは、ｌ Ｏ％子ウシ血清（ＢＳＣ。ハイクローく／社製）添加ダルベラツー修飾イーグル 培養液（ＤＭＥＭ．ギブコ社Ｆりで増殖させ−たＨ　ｅ　Ｔ．ａ細胞に、カルシ ウム燐酸法でトランスフェクトシた．、ＩＮＦ−４発現ベクター　（１）Ｉ−Ｅ Ｎ４ＳまたはｐＬＥＮ４Ａ、０から５μｇ）、ｌμｇのｐＣＭＶ−β（ｇａｌ） （内部制御、ＭａｃＧｒｅｇｏｒ！　Ｃａ５ｋｅｙ、　１９８９）　、２　ｔｔ 　ｇのレポーター構築物（ＨＩＶ−ＣＡＴまたはＡＰＦ　１−ＨＩＶ−ＣＡＴ） および５０Ｐｇの超音波処理変成サケ精子ＤＮＡの沈殿物を、１００ｍｍの培養 皿に６０から８０％まで増殖した細胞に加えた。３７℃で１５時間後、細胞にグ リセロールショク（１５％）を施し、１０ｍＭ酪酸ナトリウム（ＳＶ４０エンハ ーンサーからの発現を強化するため、Ｇｏｒｍａｎら、１９８３）およびｌＯ％ ＢＣ３添加ＤＭＥＭでさらに３７℃４８時間培養した。抽出物を調製し、β−ガ ラクトシダーゼ活性に対して標準化して、ＣＡＴ活性についてアッセーした（２ ０時間、３７℃でインキュベーション）。

ノーリンプロット分析 Ｐｕ１ｓｓａｎｔ　＆　Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ（１９９０）により修飾されたＣｈ ｏｍｅｘｙｎｓｋｉ　＆　５ａｃｃｈｉ（１９８７）の酸フェノール法を用いて 、雄のラット（スプラーグードーレ一種）組織から全ＲＮＡを抽出した。サンプ ルツクらの記載（１９８９）に従い、ポリＡ＋のＲＮＡをオリゴｄＴセルロース カラムで選別し、１％アガロースホルムアルデヒドゲルで電気泳動した（５μｇ ／レーン）。このＲＮＡをイモピロン−Ｎ（ミリポアー）に移し、メーカーの提 供するプロトコールに従って精査した。ＨＮＦ−４ｍＲＮＡは、６１６から１１ １４ヌクレオチド（図３の最初の影付き部分）を含むランダムプライムによるｃ ＤＮＡを用いて検出した。厳格な相同性のための洗浄は、６００℃１５分、０． ２　ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ１０，１％ＳＤＳで行われた。ＩＮＦ−４プローブのオート ラジオグラフは２枚の増感スクリーンを用いて３日間露光させた。リポゾームＲ ＮＡ（２８Ｓおよび１８ｓ、それぞれ４．９および１．９ｋｂ）をサイズマーカ ーとして使用した。

表１ 使用オリゴヌクレオチドの上の鎖の配列および起源を示す。下線を付したヌクレ オチドは便宜のために付は加えたものである。下側の相補鎖はそれらの５′末端 側に４塩基のオーバーハンドを有する。ボールド体活字はコンセンサス領域を強 調し、ホルモン応答エレメント内のマツチ部分を示している。ＥＲＥはアフリカ ッメガエルのビテロゲニン、Ａ、（Ｋｌｅｉｎ−ＨｉｔｐａＳら、１９８６）に 由来し、ＴＲＥおよびＧＲＥは、それぞれラット成長ホルモン（Ｇｌａｓｓら、 １９８８）およびチロシンアミノトランスフェラーゼ（Ｓｔｒａｈｌｅら、１９ ８７）遺伝子における応答エレメントの回文変種である。矢印は保存回文領域を 示している。

表１．実験に使用したオリゴヌクレオチド遺伝子　塩基翫ヲリ　部位 ＝１５１かう１３０　ＴＴＦＩ　５’−２ｃｃｃｗａｃ’ｒｔｃｘＴＡＴＴＴＧ ＴＧＴＡＣ−３’　−＋ｓ＋から−１３０（７ウス）ＨＮＦａＰ　Ｔｒ日　ｓ・ −コｃｃｃｒＡω刃弱買ｃｘｎｒｃｃｃｃ−３・−１５６から−１３８（マウス ）ＨＮＦ４Ｄ　ｎ日　ｓ′−Ｈ５）、ｃｒｃＴｃｒニ緑ノａｃｙｃＡｃｒ＾ｃ− ３９−１，８５キロベース（マウス）＾ＰＦ１ａｐｏｃＩｌ＋　５’−ｘｒｘａ ＧｃＧＣＴｃＴＧＣ−３”　−５５から−８７（ヒト）「−＾１　ａ＋−ＡＴ　 ５’−ＡＧＣ）ＭＣＡＧｒ２ｒＧＧＣＴＧ−３’　−ＩＱｌカら−１２８（ヒト ）ホルモン応答エレメント ＥＲＥ（ニストロケン）５・−１ｃＴい工、６アい。。、６い−１・−）−−Ｅ −ｍ− ｍ−←＞Ａ（−ｍ− ＴＲＥ（甲状腺）　ｓ　′−トロｃｒｃｘｙｒｃｈｒｃＡｃｃｒｃｘ−３′墾 表１は、ＩＮＦ−４結合タンパク質の精製および性状決定に用いられた種々のオ リゴヌクレオチドの一覧である。オリゴヌクレオチド−１５１から−１３０は、 弱いＩＮＦ−３部位（−１３０から−１４０）とともに、トランスフエクション アッセーでＴＴＲ発現に必要なＩＮＦ−４部位（−１５１から−１４０）を含ん でいる（Ｃｏｓ　ｔａら、１９８９）；ＨＮＦ４Ｐは−１５１から−１３０と同 じであるが、ＨＮＦ−３部位を含まない、ＨＮＦ４ＤはＴＴＲプロモーター内の 末端部位（およそ−１，９ｋｂ）に由来し、これはＴＴＲの転写をかろうじて強 めることが示されたが（Ｃｏｓｔａら、１９８８．１９８９）　、さらにこれに 肝粗抽出物中のタンパク質がＩＮＦ−４Ｐより弱く結合する。ＡＰＦｌおよびＬ Ｆ−ＡＩは、それぞれ、ヒトのアポリポタンパク質ＣＩＩＩ　（アポＣ１１ｌ） およびαｌ−アンチトリプシン（α１−ＡＴ）遺伝子のプロモーター領域に由来 する。以前に実施された交叉競合実験（Ｃｏｓｔａら、１９９０）は、ＴＴＲプ ロモーター内のＨＮＦ−４部位に結合する因子は、またＡＰＦｌにも結合するこ とを示した。

ＨＮＦ−４結合タンパク質は、重合ＨＮＦ４ＰまたはＡＰＦ１オリゴヌクレオチ ドのいずれかで作成した配列特異的ＤＮＡアフィニティーカラムを含む、６度の クロマトグラフィ一工程によって、ラット肝の核抽出物から精製された。各工程 は、二重鎖プローブ（ＨＮＦ４ＰまたはＡＰＦｌ）を用いたモビリテイーシフト アッセーによりアッセーされた。最後の５力ラム＋最終精製分画（分画３８、図 ＩＡ）の出発物質は、モビリティシフト活性とともに精製される、名目分子量５ ４ＫＤの単一のクーマシー染色バンドを示した。ｌ調製物例では、４１匹のラッ トからのおよそ７００ｍｇの核タンパク質から、３０−４０Ｐｇの５４ＷＤタン パク質が、モビリティシフト活性に基づき１０−１５％の全体的回収率で得られ た。精製の各工程についてのタンパク質濃度およびＤＮＡ結合活性（ＡＰＦＩプ ローブ）を比較することによって、比活性における累積増加は、５０００から１ ００００倍であると概算された。

５４ＫＤ種はＩＮＦ−４結合タンパク質であることを示すために、精製物質を調 製用５ＤＳ−ＰＡＧＥに付し、ゲルをスライスし、各スライスからタンパク質を 溶出させて復元し、ＨＮＦ−４結合活性について分析した。４５から６５ＫＤ領 域のみを調べたそのような復元実験は、５４ＫＤで移動する主要バンド（主とし てスライス３）はＨＮＦ−４結合活性を含むことを示した。他の実験（結果は示 されていない）は４５ＫＤ以下および６５ＫＤ以上の領域は結合活性を含まない ことを明らかにした。

ＴＴＲ部位、ＨＮＦ４Ｆ（オリゴ＃ｌ、図ＩＡ）を用いたカラムの後の精製スキ ームにアポＣＩＩＩ部位、ＡＰＦＩ、（オリゴ＃２、図ＩＡ）を含むアフィニテ ィカラムを用いた。最終精製物質がなおＴＴＲ部位に結合するということを確認 するために、したがって、わずかに異なるＩＮＦ−４部位を含む４つの異なるプ ローブ（ＡＰＦＩ、−１５１から−１３０、ＨＮＦ４Ｐ、ＨＮＦ４Ｄ）およびＨ ＮＦ−４認識部位と配列類似性を欠く３つのプローブ（−１７５から−１５１、 ＨＮＦ３およびＣ／Ｅ　Ｂ　Ｐ）を同じ比活性で標識し、精製タンパク質を用い てモビリティシフトアッセーで調べた。精製物質は４つのＨＮＦ−４部位すべて と結合し、同一のシフトバンドを生じた（図ＩＢ）。種々のプローブについての 精製物質の相対的親和性の相違は、肝の核粗抽出物で認められたものと同じであ った（結果は示さず）。期待したように、精製物質は関連のないオリゴヌクレオ チドのにずれとも結合しなかった（図ＩＢ、レーン９−１４）。

精製したタンパク質がＣｏ５ｔａら（１９８９）が最初に記載したものであるこ とを立証するために、この精製タンパク質が、ＴＴＲプロモーターのコード鎖の −１４０から−１５０までの領域を、銅フェナントロリンによる切断から保護す ることを示した（図２Ａ）。これは、欠損変異体を用いた一時的トランスフエク ションアッセー、および肝粗抽出物を用いたメチル化干渉実験により、ＩＮＦ− ４部位として最初に明らかにされたのと同じ領域である（Ｃｏｓ　ｔａら、１９ ８９）。

い（つかの銀染色ＳＤＳゲルの５４ＫＤの主要バンド（図１Ｃに太いバンドとし て明瞭）よりわずかに速（移動するマイナーなバンドの出現、および精製物質は 幾つかの幾分異なるプローブに結合するという事実は、精製物質中に２種類以上 のＤＮＡ結合タンパク質が存在するかもしれないという懸念を生じた。この可能 性を調べるために、モノＱ分画３８を修飾試薬（ホスファターゼまたはいくつか のプロテアーゼの１つ）で処理し、数等分して、上記の４種の）ＵＮＦ−４プロ ーブを用いてモビリティシフトアッセーに付した。図２Ｂに示した結果は、与え られた処理（ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＵＰ）、プロテアーゼＶ８（Ｖ ８）、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ（ｌｙｓｃ））は、使用プローブに関係 なく、本質的に同じパターンのシフトバンドを生じることを示している。精製物 質が異なるポリペプチドの混合物を含んでいたなら、異なるペプチドフラグメン ト、したがって異なるシフトバンドが生じたであろう。したがって、精製物質中 には種々のプローブと結合する単一のポリペプチドが存在すると我々は結論した 。

ＩＮＦ−４ｅＤＮＡクローンの分離 ＨＮＦ−４タンパク質をコードするｃＤＮＡを分離するために、ラット肝から精 製したタンパク質のアミノ酸の部分配列を得た。無傷のタンパク質はＮ末端がブ ロックされていることが分かっていたので、精製物質（モノ、分画３８．１０μ ｇ）を逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に付し、５４ＫＤタンパク 質を含む主要ピークを臭化シアンで切断した、生じたペプチドをＨＰＬＣで分離 し、配列決定した。

５種のペプチド配列を得た（ｐｅｐｌ−５）。これらのペプチド３種（ｐｅｐｌ 、ｐｅｐ２、ｐｅｐ３）に対して、３６から４０９６の範囲の縮重を有し、長さ が２３ヌクレオチドであるセンス（Ｓ）およびアンチセンス（Ａ）プライマーを 作成した。これらのプライマーを、鋳型として増強ラット肝ｅＤＮＡライブラリ ーを用いたポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）において、対として組み合わせ て（プライマーＩＳおよび２Ａ、ｌＡおよび２Ｓなど）使用した。プライマーＩ ｓおよび２Ａ並びにプライマー２Ａおよび３Ｓの組み合わせだけが、アガロース ゲルの臭化エチジウム染色で用意に認識できる生成物を生じた（それぞれ１．０ および０．５キロベース（ｋｂ））。サブクローニングおよび配列決定後、大き い方の生成物（ｌｓ＋２Ａ）は、小さい生成物（３Ｓ＋２Ａ）を含んでいること が分かった（図３、ｈ）。大型生成物から推定されるアミノ酸配列は、また、ス テロイドホルモンレセプターに認められた２つのジンクフィンガーと非常に類似 する領域を含んでいた。ジンクフィンガーを含まない短いＰＣＲ生成物は、ラッ ト肝ライブラリーの３．６ＸｌＯ’の主要なりコンビナンドをスクリーニングす るために用いた。二回目のスクリーニングで２２個の陽性クローンのうち、９個 が完全に性状が調べられ、オーバーラツプしていることが分がった。

最も大きいｃＤＮＡ挿入物の部分的ヌクレオチド配列（ｐ　ｆ　？、図３最下部 ）は、ヌクレオチド５９の開始点メチオニンで始まる長い開放型読み取り枠を含 んでいる。ヌクレオチド３２で始まる別の枠内ＡＴＧコドンが存在するが、翻訳 開始のためのコンセンサス配列（ＧＣＣＡ／Ｇ　ＣＣＡＴＧＧ、　Ｋｏｘａｋ、 　１９８７）との比較およびインビトロ翻訳産物（結果は示さす）の５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥ分析により、ヌクレオチド５９のＡＴＧコドンが主要な翻訳開始点である ことが提案される。精製ＩＮＦ−４タンパク質に由来する５つのすべてのペプチ ド配列が、予想されたアミノ酸配列で出現しく図３−１’）、精製ＨＮＦ−４調 製物は、実際唯一・っの主要ペプチド含んでいることが確認された。＋３６５ｂ ｐの開放型読み取り枠は、分子量５０．６ＫＤの４５５アミノ酸の長さのタンパ ク質をコードする。ポリアデニル化シグナルは認められなかった。

遺伝子配列データバンクの調査により、ＨＮＦ−４は新規なタンパク質であるが 、ステロイド／甲状腺ホルモンレセプターのそれと類似の構造をもつことが明ら かとなった（図４参照）。ＨＮＦ−４は、アミノ酸５０および１１６の間に可能 な２つのジンクフィンガーを有する領域を含み、これは、ステロイドレセプター 上材の他の仲間のジンクフィンガー（ＤＮＡ結合）ドメインと４０から６３％の 同一性を有する。この領域において、マウスの主要組織適合性クラス夏タンパク 質（Ｈ−２ＲＩ　Ｉ　Ｂ　Ｐ　（Ｈａｍａｄａら、１９８９））のための提案さ れている調節タンパク質は最も高い相似性（６２，７％同一性）を有し、さらに ヒト甲状腺ホルモンレセプター（ｃ−ｅｒｂＡ；Ｔｓ　Ｔβ）　（Ｗｅｉｎｂｅ ｒｇｅｒら、１９８６）は、その次に高い相似性（３９，７％同一性）を有して いた。ＩＮＦ−４のジンクフィンガードメインは既知のいずれのタンパク質とも 類似性をもたない領域と接している一方、このタンパク質のＣ末端側の半分に（ アミノ酸１３３から３７３）大きな疎水性領域が存在し、これは、いくつかの他 のレセプターのリガンド結合ドメインと明確な相似性（２０−３７％同一性）を 有する。さらにまた、ＩＮＦ−４はＨ−２Ｒ１１８Ｐと最も類似するが（３７， ３％同一性）、ＨＮＩ４が、Ｈ−２ＲＩＩＢＰの場合のように、リガンドに干渉 を許容させないかどうかは分からない。

ＨＮＦ−４タンパク質は他の２つの独特な特徴を有する・アクティヘータートメ インとなり得る、Ｃ末端（アミノ酸４００−４７７）の富プロリン領域（２３％ ）　（Ｍｅｎｎｏｄら、１９８９）および燐酸化のための部位となり得る、分子 内に散らばった（アミノ酸１５から４４．１２９から１６１、さらに３９８から ４２６）３つの富セリン／ス１ノオニン領域（３０−３８％）　（Ｋｒｅｂｓら 、１９８８）　、　ＨＮＩ−４が修飾されるか否かは未だ確立さねていないが、 いくつかの翻訳後修飾のＩ１１能性は、ＳＤＳゲルの主要バンドよりわずかに速 く移動するマイナーなバンドの出現とともに、ラッ］・肝から分離されたタンパ ク質のＳ　Ｉ）　Ｓゲルにおける幾分異常な移動性（アミノ酸配列から予想され る５０．６ＫＤに対して５４ＫＤ）により提案される。

ＨＮＦ−４ｅＤＮＡのインビトロ発現 ｅＤＮＡクローンｐｆ７は、ＨＮＩ”−４結合タンパク質をコードすることを立 証するために、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ転写物を生成し、インビトロで翻訳して 生じたタンパク質をモビリティシフ）・アッセーでテストンた。インビトロで合 成したタンパク質は、ＡＰＦ１オリゴヌクレオチドに配列に特異的な態様で結合 し７（図５Ｂ、レーン３および４）、シフト複合体はラット肝から精製１ノだ物 質で形成された複合体のそれと同一の位置に移動した（図５Ｂレーン３とｌを比 較）。

終止コドンの位置は、ｐｆ　７ｃＤＮＡを、提案された終止コドン（ヌクレオチ ド１５８４）の前（ｐｆｌＭｌ、ヌクレオチド１３０９）または後（ＳｐｈＩ、 ヌクレオチド１５８４）のいずれかの固有の制限部位で切断し、続いてインビト ロでタンパク質を合成し、モビリティシフトアッセーを実施することによって確 認された。５ｐｈＩで切断した鋳型の産物は、完全な長さのｅＤＮＡ　（Ｘｈｏ Ｉ）によって生成されるそれと同様な複合体を生じたが、ｐｆ１ＭＩ切断鋳型は より速く移動する複合体を生じた（図５Ｂ：レーン３．５．７）。ＳＤＳゲルで のタンパク質生成物の分析は、５ｐｈｉ切断鋳型からの生成物は、完全な長さの 鋳型からのそれと同じサイズであり（図５０レーン２と１を比較）、両方とも精 製ラット核タンパク質のそれ（５４ＫＤ）と大雑把に同じ位置に移動することを 示し７た。ｐｆ１ＭＩ切断鋳型の生成物はより速く移動し、それはアミノ酸が３ ６個少ない（４０００ダルトン）筈であるという予想を確認させた（図５ＣＩノ ーン３）。

Ｈｇａｌで切断（ヌクレオチド１１７１において）されたプラスミド鋳型は、さ らに短いタンパク質（４５アミノ酸分、５１７５ダルトン）（図５Ｃ、レーン４ ）を生じ、これはより速く移動するシフト複合体を生じた（図５Ｂ、レーン９） 。

一部を切りつめたインビトロ翻訳産物を、別のＩＮＦ−４部位、ＩＮＦ４Ｐを含 むオリゴヌクレオチドに対するＤＮＡ結合について調べたとき、同一の結果が得 られた（結果は示さず）。このインビトロ翻訳実験の結果は、ｐｆ７ｃＤＮＡは 、精製タンパク質のそれと類似の態様でＩＮＦ−４認識部位に結合するタンパク 質をコードすることを裏付ける。

ＨＮＦ−４は二量体としてその認識部位に結合する一部切断ｃＤＮＡ鋳型から生 じる翻訳生成物をさらに調べたところ、アミノ酸１から２１９（Ｈｐｈｌ切断、 図５Ｃレーン５）を含むポリペプチドは、たとえ完全なジンクフィンガー（レセ プターのＤＮＡ結合ドメイン）（図５ＢレーンＩＩ）が存在していたとしてもＤ ＮＡに結合しないということが示された。したがって、アミノ酸２１９および３ ７４の間の領域（おそらくリガンド結合ドメイン）は、ＨＮＦ−４タンパク質が その認識部位に結合するために必要とされるかもしれない。エストロゲンレセプ ターのリガンド結合ドメインのアミノ酸は、レセプターの二量体化およびその後 のＤＮＡ結合のために必要であることが知られているので（Ｋｕｍａｒ　＆　Ｃ ｈａｍｂｏｎ、　１９８８；　Ｆａｗｅｌｌら、１９９０）　、我々は、ＩＮＦ −４がその認識部位に単量体としてまたは二量体として結合するのかを調べた。

完全な長さのｃＤＮＡ　（ＸｈｏＩ）を、ＤＮＡと結合する２種の一部切断物（ ＰｆｌＭＩおよびＨｇａｌ）のいずれかとインビトロで同時翻訳した。さらに、 その生成物をモビリティシフトアッセーで調べた。完全な長さおよび一部切断転 写物をともに翻訳したとき、中間の移動度の複合体が、ＡＰＦｌプローブ（図５ Ｄレーン３および５）および−１５１から一１３０ＴＴＲプローブ（結果は示さ ず）の両方で生成された。これら中間体のバンドは、完全体および一部切断タン パク質との間の異種二量体によりおそらく生成され、これは、モニターされたシ フト複合体は、プローブに結合した同種二量体から成るということを提案してい る。単量体に対応するシフト複合体は、インビトロ翻訳または精製タンパク質の いずれを用いても検出されなかったので、さらに想定されるドメイン（Ｈｐｈｌ ）を欠く転写物はプローブと全く結合しなかったので、我々は、タンパク質二量 体化は、ＩＮＦ−４がその認識部位に結合するために必要であると結論する。

クローニングしたＨＮＦ−４による転写活性化ＴＴＲプロモーターのＨＮＦ−４ 結合部位の欠損は、トランスフェクトされた鋳型の転写を顕著に減少させたので （Ｃｏｓｔａら、１９８９）　、我々は、クローニングされたｃＤＮＡから生成 されたＨＮＦ−４が標的遺伝子の転写を活性化するかどうかを調べた。ＨＮＦ− ４ｃＤＮＡを含む発現ベクターを、レポーター遺伝子、クロラムフェニコールア セチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）を含む構築物（これはＨＮＦ−４認識部位 を含むかまたは含まない（それぞれＡＰＦＩ−ＨＩＶ−ＣＡＴおよびＨＩＶ−Ｃ ＡＴ）’）とともにＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。

結果は図６に示されている。センス方向にｃＤＮＡを含むＨＮＦ−４発現ベクタ ーは、ＩＮＦ−４部位が存在するときだけレポーター構築物からのＣＡＴ産生を 刺激した（図６のレーン２−４とレーン６−８を比較）。他方、アンチセンス方 向にｃＤＮＡを含むベクターは、バックグラウンド以上にはＣＡＴ発現を活性化 しなかった。（図６のレーン９−１１とレーン１を比較）。したがって、我々は 、これらの実験条件下では、ＩＮＦ−４タンパク質は標的遺伝子の転写を活性化 できるということを結論した。さらに、活性化が生じる細胞の起源は非肝性であ るので、肝特異的転写後修飾は、ＨＮＦ−４機能のためには必要でないようであ る。

ＨＮＦ−４ｍＲＮＡの組織分布は限られているＩＮＦ−４結合活性は最初肝で認 められた。その後、それはまた腎および腸で発見されたが、膵臓または脳では認 められなかった（Ｃｏｓ　ｔａら、１９９０）。ＨＮＦ−４結合活性の組織分布 が、ＨＮＦ−４ｍＲＮＡのそれを反映しているのかどうかを知るため、さらにＩ ＮＦ−４ｍＲＮＡのサイズをめるため、ノーリンプロット分析を実施した。図７ に示すように、ＨＮＦ−４ｍＲＮＡは、単一種としてラット肝、腎および腸に存 在するが、膵臓、脳、白色脂肪、肺および心臓には存在しない。この結果は、Ｈ ＮＦ−４は肝臓にのみ存在するわけではなく、また、すべての組織に存在するわ けでもない。

ｍＲＮＡのサイズは、すべてのラット組織において同じ（−４，５ｋＢ）であり 、マウスの肝でも同様であった（図７レーンｌ）。これは、ラット肝ｃＤＮＡラ イブラリーから分離されたｐｆ？クローンは、およそ３ｋｂの長さのｃＤＮＡ挿 入物を含むが、ポリアデニル化部位は含まないという事実と一致する。およそ２ ．３ｋｂの弱いシグナルもまた認められた（図７レーン２．３）。プロット間で その量は変動し；主要シグナルに対するその関係は、もしあるとしても不明であ る。

ＩＮＦ−４はＬＦ−Ａ１部位に結合するＬＦ−ＡＩは、肝で発現されるヒトαｌ −アンチトリプシン（Ｍｏｎａｃｉら、１９８８；Ｌｉら、１９８８（ＩＮＦ− ４について））、ある種のアポリポタンパク質および他の遺伝子（Ｈａｒｄｏｎ ら、１９８８；　ｖａｕｌｏｎｔら、１９８９）の転写のために必要な部位に結 合する肝集積性因子である。ＬＦ−Ａ１部位はＨＮＦ−４結合部位のための配列 と類似しているので（表１参照）、ＬＦ−Ａ１部位の１つに対するＩＮＦ−４タ ンパク質の親和性を調べるために、モビリティシフトアッセーを用いた（図８） 。

ＩＮＦ−４タンパク質（ラット肝から精製されたもの、またはＨＮＦ−４ｃＤＮ Ａからインビトロで翻訳されたもののいずれも）は、ＬＦ−ＡＩプローブに非常 によ（結合し、ＡＰＦｌおよびＨＮＦ４Ｐプローブで形成されたものと区別でき ないシフト複合体を生じた（図８のそれぞれレーン３および９を１および５並び に７および１１と比較のこと）。実際、ＬＦ−ＡＩプローブは、ＩＮＦ−４プロ ーブより強力なシグナルを与えた（すべてのプローブは同じ比活性で標識した） 。

粗抽出物においてＬＦ−Ａｔ部位に結合する主要タンパク質種は、ＨＮＦ−４タ ンパク質を精製するためのプローブと結合するそれと同じであるか否かを調べる ために、モビリテイシフトアツセーをラット肝核粗抽出物を用いて実施した。結 果は、ＬＦ−ＡＩプローブで形成される主要なシフト複合体は、ＡＰＦｌプロー ブで形成されるそれと同一の位置に移動するということを示している（図８のレ ーン１６と１３を比較のこと）。さらに、ＬＦ−ＡＩおよびＡＰＦ！複合体はお 互によって特異的に完成され（図８レーン１５および１８）、精製およびインビ トロ産生ＩＮＦ−４タンパク質については、ＬＦ−Ａ１部位は、ＡＰＦ１部位よ りも該因子に対して幾分弱い親和性をもつようである。したがって、ＨＮＦ−４ はＬＦ−ＡＩと同一であるらしい。

ＩＮＦ−４はＥＲＥ、ＴＲＥまたはＧＲＥと顕著には結合しないＩＮＦ−４のジ ンクフィンガー領域は甲状腺ホルモンのそれと非常に似ているので、さらにＡＰ Ｆ１部位はそれらの応答エレメントにおいて認められる回文の半分を含んでいる ので（ＡＧＧＴＣＡ）、エストロゲン、グルココーチコイドおよび甲状腺ホルモ ン応答エレメント（それぞれＥＲＥ、ＧＲＥ、ＴＲＥ　：表１参照）に結合する ためのＩＮＦ−４タンパク質を、標識ＡＰＦｌプローブに対するこれらの部位の 競合によって調べた。３種のホルモン応答エレメントのいずれも、ＡＰＦｌプロ ーブとの複合体形成を顕著には阻害しなかった（ゲルは示さず）ＯＨＮＦ−４タ ンパク質はＡＰＦ１部位に対して非常に高い親和性を有するので、ＩＮＦ−４が より低い結合親和性を有するオリゴヌクレオチド、−１５０から一１３０ＴＴＲ をプローブとして使用することによってアッセーの感度を高めた（図ＩＢ参照） 。図９に示した結果は、ＧＲＥおよびＴＲＥは、−１５１から一１３０ＴＴＲに よる複合体形成を、完全に無関係のオリゴヌクレオチドよりも明らかな程度に強 （は競合しないことを示している（０１５　；レーン１ｌ−１８）。

他方、ＥＲＥは無関係のオリゴヌクレオチドより微かにより強く競合したが（レ ーン８および１９を１７および１８と比較のこと）、今日まで知られている最も 弱いＨＮＦ−４部位を含むオリゴヌクレオチドとはとても同じではない（レーン ８−ＩＯを５−７と比較）。これらのすべての競合は、高い過剰モルで実施され たので（５０，２５０，５００倍）、我々は、ＨＮＦ−４はＧＲＥ、ＴＲＥまた はＥＲＥのいずれともインビボで問題となるほどには結合しないと結論する０煮 爽 その主要な局面において本発明は、肝細胞核因子（ＨＮＦ−４）と名付けられる 新規な組織限定性哺乳類転写因子のためのタンパク質精製、並びにｃＤＮＡのク ローニングおよび配列決定を含む。ＩＮＦ−４は、その存在が第一に肝油出物で 検出されたが他のいくつかの組織からの抽出物においては検出されず、さらにそ の認識部位が、主に肝で発見され、以前に記載された３種のタンパク質のそれと 区別し得るので、そのように名付けられた（Ｃｏｓｔａら、１９８９）。

ＩＮＦ−４ニステロイドホルモンレセプター玉料の新規な仲間ＨＮＦ−４タンパ ク質の推定されたアミノ酸配列は、それがステロイド／甲状腺ホルモンレセプタ ー工科（そのＤＮＡ結合（ジンクフィンガー）ドメインに高い相似性を有するリ ガンド依存性転写因子のますます増大する群である）の仲間であることを示唆し ている。ＨＮＦ−４がジンクフィンガードメインにおいて、他の因子の配列に対 して類似性を有する一方、それは新規な上材の一員であり得る。当該工科の仲間 は、ホルモンレセプターエレメントの回文部位の半分の配列を認識するために重 要な領域である、最初のジンクフィンガーの付は根（Ｃ３およびＣ４の間）（Ｐ ボックスと呼ばれる）のアミノ酸配列に従って分類された（Ｄａｎｉｅｌｓｏｎ ら、１９８９；　Ｍａｄｅｒら、１９８９；　Ｕｍｅｓｏｎｏ　＆　Ｂｖａｎｓ 、１９８９；　Ｆｏｒｍａｎ　＆Ｓａｍｕｅｌｓ、　１９９０）。例えば、甲状 腺ホルモンレセプター（ＴＲ）亜科の仲間はアミノ酸、ＥＧＣＫＧを含み、ＴＲ Ｅに結合し、一方、エストロゲンレセプター（ＥＲ）亜科の仲間は、アミノ酸、 ＥＧＣＫＡを含み、ＥＲＥに結合する。この領域におけるＩＮＦ−４の配列（Ｄ ＧＣＫＧ）は、Ｃ１に続くグルタミン酸（Ｅ）の位置にアスパラギン酸（Ｄ）を 含むという点を除き、ＴＲ亜科のそれと最も類似する。　このことは、ＨＮＦ− ４コンセンサス部位と殆ど同一（９／ｌ　２残基）であるにもかかわらず、なぜ ＩＮＦ−４がＴＲＥに結合しない（図９）かを説明できるであろう。ＥＲＥへの 極めてぎりぎりの結合（図９）の意義（もしあるとすれば）は不明である。ＨＮ Ｆ−４は今日まで発表されたＤＧＣＫＧ配列をもつ唯一の因子であるけれども、 他の亜科のサイズを考慮して、我々は将来より多くのものが発見されるであろう と予測する（Ｕｍｅｓｏｎｏ　＆　Ｅｖａｎｓ（１９８９）により編纂されたレ セプター参照；Ｆｏｒｍａｎ　＆　Ｓａｍｕｅｌｓ、　１９９０；　ｈａｐにつ いて、　ｄｅ　Ｔｈｅら、１９８７゜Ｈ−２ＲＩＩＢＰについて、　Ｈａｍａｄ ａら、１９８９；　ＮＩＯについて、　Ｒｙｓｅｃｋら、１９８９）。

よく性状が調べられたレセプタータンパク質（エストロゲン（Ｋｕｍａｒ　＆　 Ｃｈａｍｂｏｎ。

１９８８；　Ｆａｗｅｌｌ　ら、１９９０）　：甲状腺ホルモンおよびレティノ イック酸（Ｆｏｒｍａｎら、１９８９）：グルココーチコイド（Ｔｓａｉら、１ ９８８）　）のように、ＨＮＦ−４タンパク質は、その部位に明瞭な対となる対 称性を欠いていたとしても、その認識部位に同種二量体として結合する（図５Ｄ ）。他のレセプターにおけるレセプター二量体化は、リガンド結合ドメイン内の 一連の疎水性残基の７個の繰り返しに局在されてきた（Ｆｏｒｍａｎら、１９８ ９；　Ｆａｔｗｅｌｌら、１９９０；　Ｆｏｒｍａｎ　＆　Ｓａｍｕｅｌｓ、　 １９９０）　ｏ　ＨＮＦ−４の対応する領域は、また、ＤＮＡ結合にも必要（図 ５Ｂ）で、７個の繰り返しを少なくとも１２含んでいる。同種二量体形成は、甲 状腺ホルモンと１７テイソニツク酸レセプターとの間で認められたように、ＩＮ Ｆ−４および他の転写因子との間の異種二量体形成の可能性を生じた（Ｆｏｒｍ ａｎら、１９８９；　Ｇｌａｓｓら、１９８９）。

ＴＴＲ発現はホルモン調節に依存しないので、我々は、ＩＮＦ−４がこのリガン ド依存玉料に入ると予想しなかった。しかし、この科の性質および既知のリガン ドを有するだのレセプターのりガント結合ドメインとの限局されるホモロジー・ により、ＨＮＦ−４は未だ同定されていないリガンドをもつ可能性が生じる、。

ＩＮＦ−４が制御する遺伝子の数および多様性（以下で考察される）を考えると 、ＩＮＦＩのためのリガンド可能性は非常に興味深い。それにもかかわらず、当 該工科の非常に多くの他の仲間はみなしごレセプター（そのタンパク質のための リガンドが同定されていないタンパク質、例えばＣＯＵＰ−ＴＦ（Ｗａｎｇら、 １９８９）、ｅ　ａ　ｒ　２　（Ｍｉｙａｊｉａら、１９８８）、ＥＲＲ（Ｇｉ ｇｕｅｒｅら、１９８８）、Ｈ−２ＲＩＩＢＰ（ＨｕＩａｄａら、１９８９）　 、Ｎ　ｌ　Ｏ（Ｒｙｓｅｃｋら、１９８９））に入るので、これらのレセプター はリガンドをもたない可能性もまた壽えなければならない。リガンド結合ドメイ ンは二量体化ドメインとオーバーラツプするので、この領域の類似性は二量体化 の目的のためにのみ維持され、リガンドを結合させるためには維持されてこなか ったかもしれない。

ＩＮＦ−４、ＬＩ−ＡＩおよびＡＦ−１ＬＦ−ＡＩは、本来はαｌ−アンチトリ プシン遺伝子プロモーターにおいて、インビボおよびインビトロで陽性の転写調 節を付与する部位として確認された肝集積性因子である（Ｌｉら、１９８８；　 Ｍｏｎａｃｉら、１９８８）　。ＬＦ−Ａ　１部位は、また、アポリポタンパク 質Ａ１遺伝子、ハプトグロビン−関連遺伝子（Ｈａｒｄｏｎら、１９８８）およ びピルベートキナーゼＬ型遺伝子（Ｖａｕｌｏｎｔら、１９８９）の調節領域に おいて発見された。本明細書において、我々は、ＨＮＩ−４はＬＦ−Ａｌと同一 でありえるということを示すＤＮＡ結合データを提供する。しかし、特にホルモ ン１ノセプグーには、与えられた工、ンハーンサーエレメントに結合する２つ以 上の因子の例が幾つかあるので（ＩＶｉｎｇｅｎｄｅｒの評論、　１９９０；　 Ａｈｅら、１９８５；　Ｍｕｅｌｌｅｒら、１９９０；　５ｃｈｕｌｅら、１９ ９０；　Ｌｈｎｅｓｏｎｏら、１９８８）　、ＨＮＦ−４をＬｌ−Ａｌとして前 向きに認定するためには、ＬＦ−ＡＩがさらに精製されるのを待たねばならない 、７ＨＮＦ−４と異なるようにろえるが、ｌ−１ＮＦ−４と同じ結合特異性を有 する因子の例はＡＦ−１（アポリポタンパク質因子１）であるが、これは、ヒト アポＣＩＩＩおよびアポＢ１００遺伝子を調節する（Ｒｅｕｃら、１９８８；　 Ｌｅｆｆら、１９８９）。

マウス肝から精製されたＡＦ−１は−１５１から一１３０ＴＴＲオリゴヌクレオ チドおよびフットプリント（精製ＩＮＦ−４タンパク質が結合するのと同じアポ ＣＩＩＩプロモーターの領域）に結合するけれども、２種の因子の組織特異性お よびクロマトグラフィーの特性は、本質的に異なるようにみえる（Ｔ、　Ｌｅｆ ｆ、　Ｆ。

Ｍ、　５ｌａｄｅｋ（未発表データ））。ＨＮＦ−４がＬＦ−ＡＩおよびＡＦ− １と同一であるか、異なるかにかかわらず、ＩＮＦ−４は、それらの認識部位に 比較的高い親和性で結合するので、ＨＮＦｉは、これらの部位にインビボでも作 用するかもしれないという可能性を考えなければならない。ＨＮＦ−４は、肝で 転写される種々の遺伝子における一連の関連部位と相互反応する、いくつかの潜 在的に競合するＤＮＡ結合タンパク質の１つであるかもしれない。

ＩＮＦ−４および肝性異的遺伝子発現 本発明の主要な目的は、それ自体肝で転写的に制御される転写図−ｒ−を同定す ることである。ＩＮＦ−４はそのような因子であるようである：ＨＮＦ−４は、 肝起源でない細胞において転写を活性化でき（図６）、これは肝性異的修飾は、 ＨＮＩ−４機能に必要でないことを示している。さらにＩＮＦ−４ｍＲＮＡは多 くの組織に存在しない（図７）。これらの結果は、ＨＮＦｉ遺伝子転写の速度は 肝で高いか他の組織では無視できる（Ｘａｎｔｈｏｐｏｕｌｏｓ、　Ｐｒｅｚｉ ｏｓｏ、　Ｃｈｅｎ、　５ｌａｄｅｋ。

ｄａｒｎｅｌｌ、論文準備中）という立証と合わせて、ＩＮＦ−３（［、ａｍら 、１９９０）およびＣ／ＥＢＰ（Ｘａｎｔｈｏｐｏｕｌｏｓら、１９８９）のよ うにＨＮＦ−４は、転写的に制御される転写因子であることが示唆される。これ らの調節タンパク質をコードする遺伝子を調節する因子を研究することによって 、調節カスケードにおいて先行する調節遺伝子を、今や、確信をもって探索する ことができる。

組織特異的発現研究により、これまで考えられてきた２つの簡単な仮説が程度の 差はあるが排除された。第一は、普遍的な肝性異的転写因子または転写因子群は 存在しない：ＨＮＦ−Ｉ　Ｃ／ＥＢＰ、ＩＮＦ−３、ＩＮＦ−４はすべていくつ かの遺伝子に結合部位を有するが、いずれも”支配的”な作用因子ではない。

実際、これらの因子のすべては肝以外の組織に存在し、いくつかは肝と同じ胚細 胞系でない組織にすら存在する（ＩＮＦ−１＋腎および膵臓にも存在（Ｂａｕｍ ｅｕｅｔｅｒら、！９９０）　、Ｃ／ＥＢ　：脳。脂肪、腸、肺および皮膚（Ｂ ｉｒｋｅｎｍｅｉｅｒら、１９８９；　Ｘａｒ＋ｔｈＯｐＯＬＩＩＯ３ら、１９ ８９；　Ｋｕｏら、１９９０；　Ｒｕｐｐｅｒｔ　ら、１９９０）　、ＨＮＦ− ３Ａ　：小量が腸に存在、ＨＮＦ−４：腎および腸、図７）。午れらの組織分布 における変動に加え、これらの因子は、それらを４つの異なる調節因子群の仲間 として分類するタンパク質構造を有するが、いずれも肝にのみ見出されるわけで はない（ＨＮＦ−川、類似ドメイン；Ｃ／ＥＢＰ、ロイシンジッパ−、ＨＮＩ− ３、未分類、ＨＮｌ”−４、ステロイドホルモン１ノセプタ・−）。第二に、我 々は、特定の因Ｔが調節を助ける遺伝１群を纏める理論を、直ちに理解すること はできない、、例えば、ＨＮＦ−４は、アポリポタンパク質（これはコレステロ ールの恒常性番ご関わる）、さらに、トランスサイレチン（これは血中の甲状腺 ホルモンおよびビタミンＡを運ぶ）の他に、αｌ−アンチトリプシン（プロテア ーゼ抑制物質）、ピルベートキナーゼ（これは解糖において役割を果たす）、さ らにグルタミン合成酵素（アミノ酸の生合成において役割を果たす）を：１−ド する遺伝子に明らかに積極的に作用する（Ｃ，Ｆ、　Ｃｕｏ、　Ｆ、　Ｍ−５ｌ ａｄｅｋ、未発表データ）。この因子がこのように様々な組み合わせの遺伝子の 調節に係わる理由は、全く明らかではない。

好ましい具体例を述べながら、本発明を詳細に記載した。しかしながら、また別 の具体例も本発明の範囲内に入るとものとして意図されている。したがって、請 求の範囲は、本明細書に含まれる教示によって制限されるものではない。

浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） ゲルスライス　Ｓｌ　２　３　４５６　７８浄書（内容に変更なし） コード鎖　非コード鎖 ＦＩＧ　２Ａ 浄書（内容に変更なし） Ｂ ブ０−ブ　ＡＰＦｌ　−１５１ｔｏ　−１３０ＨＮＦ４Ｐ　ＨＮＦ４ＤＣＧＡＣ ＡＧＧｃｃＧＣＴＧＡＧＧＧＧＴＧＧＧＴＡＧＡＧＧＡＧＡＡＴＧＣＧＡＣＴＣ ＴＣＴＡＡＡＡＣＣＣＴＣｃｃｃ　５５浄書（内容に変更なし） Ｆ　ＩＧ、　３Ｂ（３） ば） ｋＤ 浄書（内容に変更なし） Ｆ　Ｉ　Ｇ、　５Ｄ ３巳　膠　ト　Ｌ ゛ｃＬＨ 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示　平成４年特許願第５０４３９５号（ＰＣＴ／ＵＳ　９１１０９ ７３３） ２発明の名称　肝集積性転写因子 ３、補正をする者 事件との関係　出　願　人 名　称　ザ　ロックフェラー　ユニヴアーシティ４、代理人 ７、補正の内容　別紙のとおり 図面の翻訳文の浄書　（内容に変更なし）国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，Ｓ　識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３９／３９ ５　Ｄ　９２８４−４ＣＮ　９２８４−４Ｃ ＣＯ７Ｋ　１３１００　８３１８−４Ｈ１５１０６８３１８−４Ｈ Ｃ１２Ｎ　１／１９　７２３６−４８ １／２１　７２３６−４Ｂ Ｃ１２Ｐ　２１１０８　８２１４−４ＢＣ１２Ｑ　１／６８　Ａ　７８２３−４ ＢＧＯＩＮ　３３１５３　Ｗ　８３１０−２Ｊ３３１５７７　Ｂ、　９０１５− ２Ｊ （７２）発明者　ツォン　ウニイミン アメリカ合衆国　ニューヨーク州　１００２１ニユーヨーク　ヨーク　アベニュ ー Ｉ （７２）発明者　ダーネル　ジェームズ　イー　ジュニアアメリカ合衆国　ニュ ーヨーク州　１０５３８ラーチモント　エツジウッド　アベニュ

Claims (82)

【特許請求の範囲】
1. １．図３ＢのｃＤＮＡ配列を含む、肝細胞核因子をコードするＤＮＡ配列または そのフラグメント。
2. ２．請求項１のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子。
3. ３．請求項１のｃＤＮＡを含むＤＮＡ分子で形質転換された単細胞宿主。
4. ４．該ＤＮＡ配列が遺伝子組換え手段により製造され、さらに作動的に発現制御 配列に連結されている、請求項２に記載のＤＮＡ分子。
5. ５．該発現制御配列が、ＳＶ４０またはアデノウイルスの初期もしくは後期プロ モーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、λファージの主要なオペ レーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホス フォグリセレートキナーゼのためのプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモ ーター並びに酵母のα−接合因子から成る群から選ばれる、請求項４の組換え体 ＤＮＡ分子。
6. ６．該発現制御配列が、ＳＶ４０またはアデノウイルスの初期もしくは後期プロ モーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、λファージの主要なオペ レーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホス フォグリセレートキナーゼのためのプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモ ーター並びに酵母のα−接合因子から成る群から選ばれる、請求項３の単細胞宿 主。
7. ７．請求項３に記載の形質転換された宿主を培養する工程を含むＨＮＦ−４の製 造方法。
8. ８．ＨＮＦ−４リガンドをコードするクローン。
9. ９．ＨＮＦ−４タンパク質またはそのフラグメントに対して産生された抗体。
10. １０．該抗体がモノクローナル抗体である、請求項９に記載の抗体。
11. １１．ＨＮＦ−４またはその抗原性フラグメントを用いて生物を免疫し、さらに 産生された抗体を分離する工程を含む、ポリペプチドＨＮＦ−４またはそのフラ グメントに反応する抗体調製物の製造方法。
12. １２．該ＤＮＡ配列がプロモーターおよびレポーター配列に作動的に連結されて いる、請求項２のＤＮＡ分子。
13. １３．ＨＮＦ−４に反応するが、トランスサイレチンおよびアポＣＩＩＩ遺伝子 の転写に必要な部位に対して非反応性である抗体調製物。
14. １４．ＨＮＦ−４を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
15. １５．有効量の抑制剤をＨＮＦ−４レセプターに導入する工程を含む、ＨＮＦ− ４レセプター結合の抑制方法であって、該抑制剤が、ＨＮＦ−４に対するリガン ドまたはＨＮＦ−４に結合することができるそのフラグメントおよびＨＮＦ−４ を認識する抗体またはＨＮＦ−４に結合することができるそのフラグメントから 成る群から選ばれる、ＨＮＦ−４レセプター結合抑制方法。
16. １６．該抑制剤がＨＮＦ−４を認識するモノクローナル抗体の調製物である、請 求項１５の方法。
17. １７．発現に際してＨＮＦ−４またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列 、および発現に際して免疫グロブリン分子の定常領域をコードするＤＮＡ配列を 含む、発現に際してＨＮＦ−４／免疫グロブリン融合タンパク質をコードする組 換え体ＤＮＡ分子。
18. １８．ＨＮＦ−４レセプターのｍＲＮＡと雑種形成する核酸配列を含む、ＨＮＦ −４レセプターのｍＲＮＡに対してアンチセンスのオリゴヌクレオチド。
19. １９．該ｍＲＮＡのいずれの開始コドンとも結合する、請求項１８のアンチセン スオリゴヌクレオチド。
20. ２０．ＤＮＡを含む請求項１９のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
21. ２１．ＲＮＡを含む請求項１８のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
22. ２２．ＨＮＦ−４のｍＲＮＡと雑種形成する核酸配列を含む、ＨＮＦ−４ｍＲＮ Ａに対するアンチセンスリボ核酸を、転写に際して生じる、ＤＮＡ配列を有する 組換え体ＤＮＡ分子でトランスフェクトされた、ＨＮＦ−４酸性細胞株。
23. ２３．ＨＮＦ−４産生細胞株を、ＨＮＦ−４のｍＲＮＡと雑種形成する核酸配列 を含む、ＨＮＦ−４ｍＲＮＡに対するアンチセンスリボ核酸を転写に際して生じ る、ＤＮＡ配列を有する組換え体ＤＮＡ分子でトランスフェクトすることを含む 、ＨＮＦ−４発現減少を示す細胞株の調製方法。
24. ２４．ＨＮＦ−４ｍＲＮＡを切断するリボザイム。
25. ２５．ＨＮＦ−４と反応する抗イディオタイプ抗体調製物。
26. ２６．ＨＮＦ−４リガンドを同定する方法であって、（ａ）ＨＮＦ−４またはそ のフラグメントを認識する抗体を詔識する抗イディオタイプ抗体と結合するタン パク質について、タンパク質混合物をスクリーニングし、 （ｂ）該抗イディオタイプ抗体と結合するこれらの分子を分離し、（ｃ）これら のタンパク質のＨＮＦ−４結合能を調べる工程を含む同定方法。
27. ２７．核種に結合されたＨＮＦ−４を認識する抗体を含む放射性免疫結合物。
28. ２８．該核種が１２５Ｉ、９０Ｙおよび１８６Ｒｅから成る群から選ばれる、請 求項２７の放射性免疫結合物。
29. ２９．細胞毒を結合させた、ＨＮＦ−４またはそのフラグメントを認識する抗体 を含むイムノトキシン。
30. ３０．薬剤の薬理活性を評価する方法であって、（ａ）リガンドをＨＮＦ−４レ セプターまたはそのフラグメントと反応させてリガンド／ＨＮＦ−４複合体を形 成し、 （ｂ）該リガンドＨＮＦ−４レセプター複合体を、その中に挿入されたＨＮＦ− ４応答エレメントをもつレポーター遺伝子に連結されたプロモーターを有するプ ラスミドと反応させ、さらに該レポーター遺伝子の転写を開始させ、（ｃ）レポ ーター遺伝子転写量を調べ、かつ、（ｄ）標準と比較することを含む評価方法。
31. ３１．薬剤の薬理活性を算定する方法であって、（ａ）リガンドをアポＣＩＩＩ レセプターまたはそのフラグメントと反応させてリガンド／アポＣＩＩＩ複合体 を形成し、（ｂ）該リガンドアポＣＩＩＩレセプター複合体を、その中に挿入さ れたアポＣＩＩＩ応答エレメントをもつレポーター遺伝子に連結されたプロモー ターを有するプラスミドと反応させ、さらに該レポーター遺伝子の転写を開始さ せ、 （ｃ）レポーター遺伝子転写量を定量し、（ｄ）標準と比較することを含む算定 方法。
32. ３２．該レポーター遺伝子がルシフェラーゼまたはＣＡＴをコードする、請求項 ３０の方法。
33. ３３．ＨＮＦ−４レセプター遺伝子をレポーター遺伝子に挿入するために、ウイ ルス性構築物が用いられる、請求項３０の方法。
34. ３４．該リガンドがＨＮＦ−４レセプター拮抗物質である、請求項３０の方法。
35. ３５．ＨＮＦ−４レセプターのリガンド結合ドメインまたはそのフラグメント、 および既知のリガンドを有する別のレセプターのＤＮＡ結合ドメインを有するレ セプターを発現するキメラ構築物。
36. ３６．該ＤＮＡ結合ドメインがグルコーチコイドレセプクーに由来する、請求項 ３５のキメラ構築物。
37. ３７．請求項３５のキメラ構築物によってコードされるタンパク質質。
38. ３８．ＨＮＦ−４レセプターまたはそのフラグメントに対する結合活性について の競合アッセーであって、 （ａ）既知量の標識された競合リガンドの存在下で、疑われるリガンドをＨＮＦ −４レセプターまたはそのフラグメントと反応させ、さらに（ｂ）結合標識量を 標準と比較することを含む競合アッセー。
39. ３９．トランスサイレチンの遺伝子を認識し、結合するＨＮＦ−４応答エレメン ト。
40. ４０．図３ＢのｃＤＮＡ配列を含むウイルス構築物。
41. ４１．センスまたはアンチセンス方向にＨＮＦ−４をコードするｃＤＮＡを含む 発現ベクター。
42. ４２．レポーター構築物およびプロモーターエレメントを宿主細胞に同時にトラ ンスフェクトした、請求項４１の発現ベクター。
43. ４３．ＨＮＦ−４レセプターのリガンド結合ドメインをコードする遺伝子。
44. ４４．該ＤＮＡ結合ドメインがエストロゲンレセプター由来である、請求項３５ に記載のキメラ構築物。
45. ４５．下記ＤＮＡ配列から成る群から選ばれ、ＨＮＦ−４またはそのフラグメン トをコードする、ＤＮＡ配列またはその縮重変種：（Ａ）図３ＢのＤＮＡ配列； （Ｂ）標準的雑種形成条件下で先行のＤＮＡ配列と雑種形成するＤＮＡ配列；（ Ｃ）先行のＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列を発現に際してコード するＤＮＡ配列。
46. ４６．以下から成る群から選ぼれ、ＨＮＦ−４またはそのフラグメントをコード するＤＮＡ配列またはその縮重変種を含む組換え体ＤＮＡ分子：（Ａ）図３Ｂの ＤＮＡ配列； （Ｂ）標準的雑種形成条件下で先行のＤＮＡ配列と雑種形成するＤＮＡ配列；（ Ｃ）先行のＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列を発現に際してコード するＤＮＡ配列。
47. ４７．該ＤＮＡ配列が発現制御配列に作動的に連結されている、請求項４５また は４６のいずれかの組換え体ＤＮＡ分子。
48. ４８．該発現制御配列が、ＳＶ４０またはアデノウイルスの初期もしくは後期プ ロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、λファージの主要なオ ペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホ スフォグリセレートキナーゼのためのプロモーター、酸性ホスファターゼのプロ モーター並びに酵母のα−接合因子から成る群から選ぼれる、請求項４７の組換 え体ＤＮＡ分子。
49. ４９．請求項４６のＤＮＡ配列から調製された別の種においてＨＮＦ−４につい てスクリーニングすることができるプローブ。
50. ５０．下記ＤＮＡ配列から成る群から選ばれ、当該ＤＮＡ配列が発現制御配列に 作動的に連結されている、ＨＮＦ−４またはそのフラグメントをコードするＤＮ Ａ配列またはその縮重変種を含む組換え体ＤＮＡ分子で形質転換された単細胞宿 主： （Ａ）図３ＢのＤＮＡ配列； （Ｂ）標準的雑種形成条件下で先行のＤＮＡ配列と雑種形成するＤＮＡ配列；（ Ｃ）先行のＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列を発現に際してコード するＤＮＡ配列。
51. ５１．該発現制御配列がＳＶ４０またはアデノウイルスの初期もしくは後期プロ モーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、λファージの主要なオペ レーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホス フォグリセレートキナーゼのためのプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモ ーター並びに酵母のα−接合因子から成る群から選ばれる、請求項５０の単細胞 宿主。
52. ５２．該単細胞宿主が、エスケリキア・コリー（大腸菌）、シュードモナス、バ チルス、ストレプトミセス、酵母、ＣＨＯ、Ｒ１．１、Ｂ−Ｗ、Ｌ−Ｗ、ＣＯＳ １、ＣＯＳ７、ＢＳＣｌ、ＢＳＣ４０およびＢＮＴ１０細胞、植物細胞、昆虫細 胞、並びに組織培養されたヒトの細胞から成る群から選ばれる、請求項５０の単 細胞宿主。
53. ５３．検出可能な標識で標識された、請求項４６に定義されたＨＮＦ−４。
54. ５４．検出可能な標識で標識された、請求項４９のプローブ。
55. ５５．該標識が、酵素、蛍光を発する化学物質および放射活性元素から選ばれる 、請求項５３のＨＮＦ−４。
56. ５６．該標識が、酵素、蛍光を発する化学物質および放射活性元素から選ばれる 、請求項５４のプローブ。
57. ５７．実質的に他のポリペプチドを含まない成熟ＨＮＦ−４（ｍＨＮＦ−４）を 含む組成物。
58. ５８．図３Ｂで説明された配列またはそのフラグメントから成る群から選ばれる ＨＮＦ−４のアミノ酸配列と実質的に相同なアミノ酸配列を含むポリペプチド。
59. ５９．レプリコンおよび、ＨＮＦ−４をコードする異種コード配列を含むＤＮＡ 分子。
60. ６０．宿主細胞中のＨＮＦ−４のコード配列の発現を達成させることができる転 写および翻訳制御配列の制御下にある、ＨＮＦ−４のコード配列を含むＤＮＡ分 子であって、該転写および翻訳制御配列が該コード配列に対して異種であるＤＮ Ａ分子。
61. ６１．該コード配列がイントロンによって遮断されていない、請求項６０のＤＮ Ａ分子。
62. ６２．該ＤＮＡ分子によって形質転換されていない細胞を実質的に含まない、請 求項６０のＤＮＡ分子によって形質転換された細胞構成物。
63. ６３．該細胞か原核細胞である、請求項６２の細胞。
64. ６４．該細胞か真核細胞である、請求項６２の細胞。
65. ６５．該細胞が哺乳類細胞である、請求項６２の細胞。
66. ６６．ｍＨＮＦ−４が発現される条件下で、請求項６０に記載のＤＮＡ分子によ って形質転換された細胞構成物を培養し、さらに発現されたｍＨＮＦ−４を回収 することを含むｍＨＮＦ−４の製造方法。
67. ６７．該細胞が原核細胞である、請求項６６の方法。
68. ６８．該細胞が真核細胞である、請求項６６の方法。
69. ６９．該細胞が酵母である、請求項６６の方法。
70. ７０．下記ＤＮＡ配列（Ａ）〜（Ｃ）から成る群から選ぼれ、ＨＮＦ−４または そのフラグメントをコードするＤＮＡ配列またはその縮重変種に由来する、以下 の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の工程を含むＨＮＦ−４の調製方法：（Ａ）図３ＢのＤＮ Ａ配列； （Ｂ）標準的雑種形成条件下で先行のＤＮＡ配列と雑種形成するＤＮＡ配列；（ Ｃ）先行のＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列を発現に際してコード するＤＮＡ配列： （ｉ）該ＨＮＦ−４を含むことが知られている、組織および体液から選ばれる生 物学的サンプルを集め、 （ｉｉ）該生物学的サンプルからＨＮＦ−４を抽出し、（ｉｉｉ）工程ｉｉの抽 出物を精製して該ＨＮＦ−４を得る。
71. ７１．請求項５０の形質転換された宿主を培養することを含む、ＨＮＦ−４の調 製方法。
72. ７２．該ＤＮＡ配列が、下記ＤＮＡ配列から成る群から選ぼれ、ＨＮＦ−４また はそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列またはその縮重変種に由来するＨＮ Ｆ−４に対する抗体： （Ａ）図３ＢのＤＮＡ配列； （Ｂ）標準的雑種形成条件下で先行のＤＮＡ配列と雑種形成するＤＮＡ配列；（ Ｃ）先行のＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列を発現に際してコード するＤＮＡ配列。
73. ７３．多クローン性（ポリクローナル）抗体を含む、請求項７２のいずれかの抗 体。
74. ７４．モノクローナル抗体を含む、請求項７２のいずれかの抗体。
75. ７５．請求項７４に記載のモノクローナル抗体を産生する永久細胞株。
76. ７６．検出可能な標識で標識された請求項７４の抗体。
77. ７７．該標識が酵素、蛍光を発する化学物質および放射活性元素から選ばれる、 請求項７６の抗体。
78. ７８．下記ＤＮＡ配列から成る群から選ぼれる、ＨＮＦ−４またはそのフラグメ ントをコードするＤＮＡ配列またはその縮重変種に由来するタンパク質を接種さ れた観察可能な細胞性テストコロニーを含む、ＨＮＦ−４の産生および／または 活性を調節する能力について薬剤および他の物質をスクリーニングするためのア ッセー系： （Ａ）図３ＢのＤＮＡ配列； （Ｂ）標準的雑種形成条件下で先行のＤＮＡ配列と雑種形成するＤＮＡ配列；（ Ｃ）先行のＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列を発現に際してコード するＤＮＡ配列。
79. ７９．下記（Ａ）〜（Ｃ）を含む、組織、血清または水性媒体中のＨＮＦ−４結 合活性または拮抗作用の実証用テストキット：（Ａ）該ＨＮＦ−４またはそれに 特異的に結合する相手を検出可能な標識と直接または間接的に結合させることに よって得られる、予め決定された量の免疫化学的に反応性のある少なくとも１種 の成分；ここで、該因子は以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のＤＮＡ配列から成る群か ら選ぼれる、ＨＮＦ−４またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列または その縮重変種に由来するタンパク質を含む： （ｉ）図３ＢのＤＮＡ配列； （ｉｉ）標準的雑種形成条件下で先行のＤＮＡ配列と雑種形成するＤＮＡ配列； （ｉｉｉ）先行のＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列を発現に際して コードするＤＮＡ配列； （Ｂ）他の試薬、および （Ｃ）該キットの使用説明書。
80. ８０．下記ＡおよびＢを含む、哺乳類の疾患、遺伝的異常または外傷の治療用医 薬組成物： Ａ．ＨＮＦ−４、該因子の産生および／または活性を促進することができる物質 、該因子の活性を模倣することができる物質、該因子に対する抗体、該因子に対 する拮抗物質、該因子の産生および／または活性を抑制することができる物質、 およびその混合物から成る群から選ばれる物質の治療的有効量：ここで、該因子 は、以下の（ｉ）〜（ｉｉ）のＤＮＡ配列から成る群から選ばれる、ＨＮＦ−４ またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列またはその縮重変種に由来する 精製形のタンパク質を含む： （ｉ）図３ＢのＤＮＡ配列； （ｉｉ）標準的雑種形成条件下で先行のＤＮＡ配列と雑種形成するＤＮＡ配列； （ｉｉｉ）先行のＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列を発現に際して コードするＤＮＡ配列；またはそれと特異的に結合する相手；およびＢ．医薬的 に許容できる担体。
81. ８１．患者にＨＮＦ−４またはアポＣＩＩＩに対するリガンドの有効量を投与す ることを含む、心脈管系疾患を治療する方法。
82. ８２．患者にＨＮＦ−４またはアポＣＩＩＩに対するリガンドの有効量を投与す ることを含む、体重減少誘発治療の必要な患者に、体重減少を誘発する方法。