PT99770B - Processo para a preparacao de receptores de glutamato acoplados com proteina g de mamiferos - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

DA

PATENTE DE INVENÇÃO,,

N.° 99 770

REQUERENTE'. ZIMOGENETICS, INC., americana, industrial e comercial, com sede em 4225 Roosevelt Way N.E., Seattle, Wãshington 98105, Estados Unidos da América e THE BOARD OF REGENTS OF THE UNIVERSITY OF

WASHINGTON, estabelecimento público com carácter científico e cultural, domiciliadã. em Seattle, Washington 98195, Estados Unidos da América

EPÍORAEE: PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE RECEPTORES DE GLUTAMATO ACOPLADOS COM PROTEÍNA G DE MAMÍFEROS

INVENTORES: EILEEN RANAE mulvihill, frederick STAMMER HAGEN, KHALED M. HOUAMED e WOLFHARD ALMERS

Rcivhullcnçilo do direito dc prioridade ao abrigo do artigo Ί.° da Convcnçfto dc 1’nrls do 20 do Março dc 1883.

nos Estados Unidos da América em 12 de Dezembro de 1990, em 30 de Janeiro de 1991 e em 18 de Março de 1991 respectivamente sob os N²s 07/626,806, 07/648,481 e 07/672,007.

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RESUMO

Α invenção refere-se a um processo para a preparação de receptores de glutamato acoplado com proteína G de mamíferos que compreende a identificação, isolamento e purificação depois de terem sido clonados sequênciados e expressos por meios recombinantes. Podem-se utilizar os receptores e os respectivos anticorpos para identificar agonistas e antagonistas de excitação de neurónios mediada por receptores de glutamato acoplados com proteína G e em processos de diagnóstico.

Pedidos Relacionados presente pedido é uma continuação-em-parte do pedido

U.S.S.N. 07/648.481, apresentado em 30 de Janeiro de 1991;

que é uma continuação em parte da U.S.S.N. 07/626,806, apresentado em 12 de Dezembro de 1990, que são aqui incorporados por referência.

Enquadramento da Invenção

A maior parte das ligações de células nervosas são sinapses químicas. Um neurotransmissor é libertado do terminal pre-sináptico, tipicamente em resposta à chegada de uma acção potencial no neurónio e difunde-se pelo espaço sináptico para se ligar às proteínas do receptor da membrana do terminal pós-sináptico. A ligação dos neurotransmissores aos receptores das membranas é acoplada quer à geração de uma mudança da permeabilidade na célula pós-sináptica, quer a mudanças metabólicas.

Os neurotransmissores produzem efeitos diferentes, de acordo com o tipo de receptor ao qual eles se ligam. Em geral, aqueles que produzem efeitos que são rápidos à partida e de curta duração, ligam receptores que actuam como canais iónicos de passagem do ligando, em que a ligação causa quase £,/ h U instantaneamente um fluxo iónico ao longo da membrana da célula pós-sináptica. Esses neurotransmissores, que actuam mais como mediadores químicos locais, ligam-se a receptores que estão acoplados a enzimas intracelulares produzindo, deste modo, efeitos que são lentos à partida e mais prolongados. Estes neurotransmissores alteram a concentração dos segundos mensageiros intracelulares na célula pós-sináptica.

Foram ligados quatro segundos sistemas mensageiros a receptores de neurotransmissores ou a receptores de hormonas, tendo sido estudados relativamente aos seus papéis no controlo da excitabilidade dos nuerónios. São eles o sistema adenilato ciclase/proteína quinase dependente do AMP cíclico, o guanilato ciclase e proteína quinase dependente do cGMP, o sistema trifosfato de inositol/diacil-glicerol-proteína quinase e os sistemas que são activados por iões de cálcio, tais como o sistema cálcio/proteína quinase dependente de calmodulina. Deste modo, a ligação de um transmissor a um receptor pode activar, por exemplo, o adenilato ciclase,

I aumentando deste modo, a concentração intracelular de cAMP, que por sua vez activa as proteína-quinases que fosforilatam as proteínas específicas nas células, tais como aquelas que formam canais iónicos e, deste modo, alteram o comportamento eléctrico das células. Tal como com os transmissores dos canais iónicos de passagem do ligando, os efeitos podem ser ou de excitação ou de inibição e podem afectar as células a muitos níveis, incluindo o modelo de expressão dos genes.

Crê-se também que estas sinapses químicas, associadas com os segundos sistemas mensageiros, podem estar envolvidas em mudanças a .longo prazo, que compreendem a base celular da aprendizagem e da memória.

Contudo, os receptores da membrana activados pelo ligando não activam os segundos sistemas mensageiros directamente, mas sim, através de uma proteína que liga a membrana, a proteína de ligação GTP (proteína G), que liga a GTP na superfície citoplasmica da membrana da célula e, deste modo, actua para acoplar o adenilato ciclase ao receptor da membrana. Crê-se que a ligação do neurotransmissor ao receptor da membrana altera a configuração da proteína do receptor para lhe permitir activar a proteína G na bicamada lípida, que depois liga a GTP na superfície citoplásmica e produz uma outra alteração na proteína G, para permitir que ela active,

e.g., uma molécula de adenilato ciclase para sintetizar o cAMP. Quando um ligando liga um receptor, resulta uma cascata enzimática, como se cada receptor activasse várias moléculas

...

de proteína G, que por sua vez activam mais moléculas de adenilato ciclase que convertem um número ainda maior de

ATP's em moléculas cAMP, produzindo uma amplificação substancial desde o acontecimento inicial.

Crê-se que o glutamato, o aspartato e os seus derivados endógenos são os neurotransmissores predominantes de excitação no sistema nervoso vertebrado central. (Krinjrvic,

Phys, Rev. 54:418-540, 1974). Recentemente, o glutamato foi descrito como desempenhando um papel comum muito importante no controle dos neurões neuro-endócrinos, possivelmente controlando não apenas o sistema neuro-endócrino, como também outras regiões hipotalâmicas. Foram descritas quatro importantes sub-classes de receptores de glutamato, porém a sua caracterização foi, até há pouco tempo, limitada a análises funcionais farmacológicas e electrofisiológicas. Veja-se em geral, Hollman et al., Nature 342: 643-548 (1989) e Sommer et al. , Science 249: 1580-1595 ( 1990 ). Crê-se que três dos receptores, o receptor de quisqualato (QA/AMPA), cainato (KA) e N-metil-D-aspartato (NMDA), estão directamente acoplados aos canais iónicos específicos de catiões, sendo por isso classificados como receptores ionotrópicos de passagem do ligando. 0 quarto receptor de glutamato liga alguns dos agonistas dos receptores ionotrópicos (o quisqualato glutamato, mas não o AMPA), mas não possui quaisquer antagonistas e está acoplado à proteína G. Deste modo, este receptor, referido como o receptor de glutamato acoplado com proteína G, ou GlugR, é farmacológica e funcionalmente distinto dos outros principais receptores de glutamato. Este receptor foi também denominado como receptor metabotrópico,

Mostrou-se que a ligação dos agonistas ao GlugR resulta na activação de vários segundos sistemas mensageiros, dependendo do sistema estudado. Um dos melhor caracterizados é o sistema de activação do quisqualato da fosfolipase C através de uma interacção acoplada com a proteína G, que leva à estimulação do metabolismo de inositol fosfolípido. Esta actividade foi estudada em sistemas que medem a acumulação de monofosfato de inositol rádio-marcado em resposta à estimulação pelo glutamato. Os sistemas usam tipicamente porções de cérebro de regiões tais como o hipocampo, o estriato, o córtex cerebral e o hipotálamo (Nicoletti, et al.,

Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83: 1931-1935 (1986), e Nicoletti, et al., J. Neurochem. 46: 40-46 ( 1986 )) e culturas de neurónios provenientes de embriões de ratinhos, do cerebelo do rato, estriato do corpo e do córtex cerebral (Nicoletti et

al. , J. Neuroaci. 6 : 1905-1911 ( 1986 ), Sladeczek et al.,

Nature 317: 717-719 (1985), Dumuis, et al., Nature 347: 182-184 (1990), e Drejer et al., J. Neuroaci. 7: 2910-2916 (1987)) e sinaptossomas do cérebro de rato (Recasena et al.,

Eur. J. Pharm. 141: 87-93 (1987), e Recaaena et al., Neurochem. Int. 13: 463-467 (1988)). Uma grande desvantagem de cada um destes sistemas modelo é a dificuldade em analisar as actividades farmacológica e funcional do GlugR num ambiente em que se encontram também presentes outros receptores de glutamato e receptores acoplados com proteína G, tais como os receptores muscarínico e de serotonina.

Tem sido usado o sistema do oócito Xenopus para identificar o G1u_gR como um membro da família dos receptores acoplados com a proteína G. Um caminho mediado pelo segundo mensageiro de trifosfato de inositol endógeno no oócito, permite a detecção do Glu_GR depois da injecção de mARN total de cérebro total do rato, no sentido de que o oócito responde ao ligando através de activação, mediada por PLC, de um canal de cloreto, acoplado com a proteína G do oócito, que pode ser detectada como uma corrente de oscilação retardada por registo de voltagem aos bornes (Houamed et al., Nature

310: 318-321 (1984); Gunderson et al., Proc, Roval Soc. B221:

127-143 (1984); Dascal et al., Mol. Brain Rea. 1: 301-309 (1986); Verdoorn et al., Science 238: 1114-1116 (1987);

Sugiyama et al., Nature 325; 531-533 (1987); Hirono et al.,

Neuro8. Res. 6: 106-114 (1988); Verdoorn and Dingledine, Mol.

Pharmacol. 34: 298-307 (1988); e Sugiyama et al., Neuron 3;

129-132 (1989)). A injecção de mARN de uma região especifica do cérebro e de uma mARN de tamanho fraccionado sugeriram que o Glu_GR pode ser um mARN grande (6-7 kb) e que é enriquecido no cerebelo (Fong et al., Synapse 2: 657-665 (1988) e Horikoshi et al., Neurosci, Lett. 105: 340-343 (1989)).

Permanece ainda uma necessidade considerável na técnica relativamente a Glu^R isolado e purificado, bem como de sistemas capazes de expressarem o G1u_gR separado de outros receptores neurotransmissores. Além disso, seria desejável identificar especificamente a presença de GlUgR nas células e tecidos evitando, deste modo, perdas de tempo, ensaios electrofisiológicos e farmacológicos funcionais complexos e não-específicos. Seria também desejável seleccionar e desenvolver novos agonistas e/ou antagonistas específicos para o

GIuqR mas, até agora, isto não tem sido praticável. De forma bastante surpreendente, a presente invenção preenche estas e outras necessidades relacionadas.

Sumário da Invenção

A presente invenção proporciona preparações isoladas e substancialmente puras de receptores de glutamato acoplados com proteína G de mamíferos e de fragmemtos dos mesmos. De acordo com formas de realização preferidas, os receptores são acoplados com uma proteína G em células de vertebrados, ligam o glutamato,e o quisqualato e, deste modo, activam a fosfolipase C, sendo capazes de estimular o metabolismo de inositol fosfolipídico. Tendo proporcionado esses receptores na forma isolada e purificada, a invenção proporciona ainda anticorpos para os receptores, na forma de anti-soros e/ou anticorpos monoclonais.

De acordo com um outro aspecto, a invenção proporciona a capacidade de produzir receptores de glutamato acoplados com proteína G de mamíferos e polipéptidos ou fragmentos dos mesmos, por meios recombinantes, de preferencia em células eucarióticas cultivadas. Os receptores ou fragmentos expressos podem ter, ou podem não ter, actividade biológica de receptores naturais correspondentes e podem estar, ou podem não estar acoplados com uma proteína G na célula usada para expressão. Deste modo, são descritos polinucleótidos isolados e purificados que codificam os receptores e fragmentos dos /4 ff mesmos, em que os polinucleótidos podem ser na forma de ADN, tal com cADN, ou de ARN. Com base nestas sequências, podem ser usadas amostras de ensaio para hibridizar e identificar estes genes e genes relacionados, os quais codificam receptores de glutamato acoplados com proteína 6 de mamíferos. As amostras podem ser cADN de comprimento total ou terem um comprimento correspondente de 14 a 25 nucleótidos, mais regularmente de cerca de 40 a cerca de 50 nucleótidos ou mais.

Em formas de realização relacionadas, a invenção refere-se a construções de ADN que compreende um promotor de transcrição, uma sequência de ADN que codifica o receptor ou fragmento, e um terminador de transcrição, cada um deles operacionalmente ligado para expressão do receptor. Para a expressão, a construção pode também conter, pelo menos, uma sequência de sinal. As contruções são, de preferência, usadas para transformar ou transfectar células eucarióticas, de preferência, células de mamíferos que não expressam receptores de glutamato acoplados com proteína G, endógenos.

Quando ligados por um ligando apropriado, tal como glutamato ou quisqualato, o receptor pode activar a fosfolipase C na célula hospedeira, através do acoplamento com a proteína G.

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Além disso, para uma produção em larga escala, o receptor expresso pode também ser isolado das células por, por exemplo, purificação por afinidade imunológica.

Podem também ser usadas células que expressam os receptores de glutamato acoplados com proteína G para identificar compostos que podem alterar o metabolismo mediado por receptor de uma célula eucariótica. Os compostos podem ser seleccionados por se ligarem ao receptor e/ou por efectuarem uma mudança no metabolismo mediado pelo receptor na célula hospedeira. Podem também ser seleccionados em sistemas livres de células, agonistas e/ou antagonistas dos receptores de glutamato acoplados com proteína G, usando receptores purificados ou fragmentos de ligação dos mesmos, para o efeito na interacção de receptor-ligando, ou usando sistemas reconstituídos, tais como micelas, que também dão a possibilidade de determinar mudanças metabólicas.

Ainda de acordo com outras formas de realização, a invenção refere-se a métodos para diagnóstico, em que pode ser determinada a presença de um receptor de glutamato acoplado com proteína G de mamífero, numa amostra biológica.

Por exemplo, incuba-se um anticorpo mono-específico que liga especificamente um receptor de glutamato acoplado com

proteína G, com a amostra, em condições que levam à formação de um complexo imunológico, complexos esses que são depois detectados, tipicamente por meio de uma marca tal como uma enzima, fluorescência, radionuclido, quimiluminescência, partícula, ou um segundo anticorpo marcado. Deste modo, são proporcionados meios para o manchamento histoquímico imunológico,de tecidos, incluindo tecidos do cérebro, para os receptores em apreço.

Breve Descrição das Figuras

A Figura 1 ilustra a construção do pVEGT de plasmídio, em que a Fig. IA mostra a construção de pVEG, a Fig. 1B mostra a construção de pVEG' e a Fig. 1C mostra o pVEGT'. Os símbolos usados são ο T7 pro, o promotor T7; os terminadores

T7 sintéticos e naturais TI e T2, respectivamente; M13, a região intergénica M13; o parêntesis indica um lugar de restrição destruído na construção de vector; e pA é a sequência de poliadenilato Aspergillus niger.

A Figura 2 ilustra as respostas representativas dos ensaios de voltagem aos bornes de oócitos injectados com ARN de piscinas positivas.

A Figura 3 ilustra um mapa de restrição parcial do clone

A Figura 4 ilustra a clonação do receptor de cADN presente no clone 45-A para o Zem228R.

A Figura 5 ilustra a sequência de ADN e a sequência de aminoácido deduzida do clone 45-A. Os números abaixo da linha referem-se à sequência de aminoácido , os números à direita da linha referem-se ao número de nucleótidos. Foram delineados os domínios hipotéticos de transmembranas, sendo indicados por círculos fechados locais hipotéticos de glicosilação

N-ligados.

A Figura 6 ilustra uma curva de resposta de uma dose representativa para concentrações variadas de ácido L-glutâmico. Barras de erros, quando maiores que os símbolos, representam SEM.

A Figura 7 ilustra a sequência de ADN e a sequência de aminoácido deduzida de um de clone de receptor de glutamato subtipo lb. Os números abaixo da linha referem-se à sequência de aminoácido. Os números à direita da linha referem-se à sequência de nucleótido.

A Figura 8 ilustra a sequência de ADN e a sequência de aminoácido deduzida de um de clone receptor de glutamato subtipo 2a. Os números abaixo da linha referem-se à sequência

J ϊί

Íj' ( de aminoácido. Os números à direita da linha referem-se à sequência de nucleótido.

A Figura 9 ilustra a sequência de ADN de um clone de receptor de glutamato subtipo 2b parcial. Os números referem-se à sequência de nucleótido.

Descrição das Formas de Realização Especificas

G1u_gR é uma família de receptores de membranas acopladas com proteína G para o glutamato neurotransmissor. Uma vez que o glutamato tem sido descrito como tendo um papel importante no controlo dos neurónios, em particular dos neurónios neuroendócrinos, o Glu^R pode desempenhar um papel crítico na realização desse controlo. Consequentemente, o desenvolvimento de agonistas e antagonistas da interacção do ligando de GlugR e o metabolismo mediado pelo Glu^R é de grande interesse. A presente invenção apresenta os meios para identificar agonistas e antagonistas da interacção do ligando de GlugR proporcionando GlugR isolado. 0 termo GlugR refere-se a qualquer proteína, quer seja derivada de um Glu_G R que ocorre naturalmente, ou que partilhe características estruturais e funcionais significativas peculiares a um GIuqR que ocorre naturalmente. Um receptor desses pode resultar quando _ζη A/·

são retiradas ou substituídas regiões de um receptor que ocorre naturalmente, de forma a originar uma proteína com uma função semelhante. Estão também incluídas sequências homólogas, variações alélicas e mutantes naturais; mutantes de ponto induzido e de inserção; variantes alternativamente expressas; proteínas codificadas pelo ADN que hibridiza sob condições de, elevado ou baixo rigor para ácidos nucleicos que codificam ácidos nucleicos que codificam GlugR que ocorre naturalmente; proteínas recuperadas de materiais que ocorrem naturalmente, e proteínas intimamente ligadas recuperadas por antíssoros dirigidos contra proteínas de GlugR.

Por ligando de GlugR, entende-se uma molécula capaz de estar ligada pelo domínio de ligação do .ligando de GlugR, um análogo de GlugR, ou GlugR quimérico, tal como é descrito em geral na Patente Americana N^s 4.859.609, aqui incorporada por referência. A molécula pode ser quimicamente sintetizada ou pode ocorrer na natureza. Os ligandos podem ser agrupados em agonistas e antagonistas. Os agonistas são as moléculas cuja ligação a um receptor provoca o caminho de resposta dentro da célula. Os antagonistas são as moléculas cuja ligação a um receptor bloqueia o caminho da resposta dentro da célula.

Por GlugR isolado entende-se que se refere a um GlugR /T fi A ti)· £ · -·> ·*.

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-i i:/r ^z y que está noutro meio que não o seu meio natural, tal com um neurónio, incluindo, por exemplo, GlUgR substancialmente puro, tal como se define abaixo. Mais geralmente, isolado significa que inclui um GlUgR como um componente heterólogo de uma célula ou de outro sistema. Por exemplo, um GlugR pode ser expresso por uma célula transfectada com uma construção de ADN que codifica o GlugR, separado da célula e adicionado a micelas que contêm outros receptores seleccionados. Num outro exemplo descrito abaixo, um GlugR é expresso por uma célula que foi co-trans£ectada com um gene que codifica o receptor muscarínico. Assim, neste contexto, o meio do GlugR isolado não é tal como ocorre no seu estado natural, em particular quando está presente num sistema sob a forma de um componente exógeno.

A invenção proporciona GlugR clonado que codifica sequências que são capazes de expressar proteínas de GlugR. Pode ser obtido ADN complementar que codifica GlUgR, construindo uma biblioteca de cADN a partir de mARN de, por exemplo, tecido do cérebro. A biblioteca pode ser seleccionada transcrevendo a biblioteca e injectando o mARN resultante em oócitos e detectando, por meio de ensaios funcionais, os oócitos que expressam o GlUgR. Alternativamente, os clones podem ser seleccionados com uma amostra de ensaio complementar de oligonucleótido marcada.

A presente invenção refere-se a um processo para isolar com sucesso um cADN que codifica o GlUgR. A clonação funcional do G1u_gR foi conseguida por modificações substanciais e melhoramentos de várias técnicas de clonação do cADN e de biologia molécular. Inicialmente, foi usada como modelo para a síntese de cADN, uma fonte enriquecida de mARN de Glu_GR preparada por centrifugação do gradiente de sacarose de cerebelo do rato poli (A)+ mARN de comprimento >4 kb. Além disso, um vector de clonação de cADN que foi empregue, incluía uma cauda poli (A), aumentando, deste modo, em 40 vezes a eficácia de translacção do produto de transcrição da inserção de cADN e uma parte poli-ligante para permitir a clonação direccional do cADN para o vector entre o promotor e a cauda poli (A) . A construção de vector para a clonação direccional é descrita na co-patente pendente U.S.S.N.

07/320.191, aqui incorporada por referência. 0 vector de clonação de cADN foi também usado com dois terminadores de transcrição, em tandem, seguindo as sequências poli (A), gerando de forma eficaz um produto de transcrição com uma unidade de comprimento sem a não-codificação de sequências de plasmídio ou virais, e sem requerer uma endonuclease de restrição para linearizar o padrão de ADN (uma prática padrão que muitas vezes impede que as estratégias de clonação funcionais trabalhem, devido à presença da parte de endonuclease dentro da região de codificação do cADN). A estratégia de síntese do cADN maximizava o tamanho da inserção e a recriação das extremidades 5' dos cADN's, sem a introdução de caudas de homopolímero. As inserções de cADN foram seleccionadas em relação ao tamanho, para terem um comprimento superior a 4 kb, antes da inserção no vector. Uma biblioteca de inserções de cADN 10θ em piscinas de 100.000, foi placada em réplica para reduzir o número de fases de amplificação no fraccionamento de piscinas sequencialmente mais pequenas.

Além disso, inclui-se um modelo de cADN muscarínico ml (um outro receptor acoplado com proteína G, acoplado ao metabolismo de fosfoinositol), nas reacções de transcrição das piscinas sub-fraccionadas, de forma a que, antes da injecção as transcrições in vitro de cada piscina pudessem ser ensaiadas por análise de Northern, para determinar a quantidade relativa e a qualidade do mARN, e por voltagem aos bornes de oócitos como um controlo positivo interno para cada oôcito que não respondesse ao quisqualato ou glutamato. Foi também empregue inclusão de uma diluição do modelo SEAP-VEGT' (uma forma secreta de fosfatase alcalina) em transcrições, de forma a que os oócitos seleccionados para análise de voltagem aos bornes fossem os que sintetizavam níveis mais elevados do mARN de GlugR co-injectado. E além disso, foram usadas técnicas de registo eléctrico de baixo ruído, para controlar os pequenos sinais inicialmente gerados de transcrições invulgares.

Os métodos acima descritos foram usados para isolar um clone de cADN que codifica um Glu_GR designado por subtipo la. Foram usadas amostras para ensaio de oligonucleótidos com base na sequência do clone subtipo la, para ensaiar bibliotecas adicionais de cérebro e cerebelo. Estas bibliotecas originaram clones que codificavam subtipos adicionais, que foram designados por lb, 2a e 2b.

Com o Glu_GR e os seus clones de cADN aqui proporcionados, podem ser determinadas sequências de nucleótidos e aminoácidos por meios convencionais, tais como por sequenciamento de dideoxi. Veja-se em geral, Sambrook et al., Molecular Cloninq, A Laboratory Manual, 2⁸ ed., Cold Spring Harbor

Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, aqui incorporada por referência. Podem ser obtidas sequências genómicas π

ί^!· ~2 ou de cADN que codificam receptores de Glu_GR e receptores homólogos desta família, a partir de bibliotecas preparadas de outras espécies de mamíferos, de acordo com processos bem conhecidos. Por exemplo, usando amostras de oligonucleótidos de G1u_gR de roedores, tais como amostras de cADN de comprimento completo ou amostras mais pequenas de, pelo menos, cerca de catorze nucleótidos a vinte e cinco ou mais nucleótidos de comprimento; podem ser obtidas muitas vezes, sequências de ADN com 40 a 50 nucleótidos, que codificam o

G1u_gR de outras espécies de mamíferos, tais como lagomorfo, aves, bovino, porco, murídeo, etc.. Se se obtiverem clones parciais, é necessário juntá-los no quadro de leitura apropriada para produzir um clone de comprimento total, usando técnicas tais como clivagem de endonuclease, e mutagenese de ligação e de volta.

É inserida uma sequência de ADN codificando o Glu_GR num vector de expressão apropriado que, por sua vez, é usado para transfectar células eucarióticas. Os vectores de expressão para serem utilizados na realização da presente invenção compreenderão um promotor capaz de dirigir a transcrição de um ADN clonado e um terminador de transcrição.

A fim de dirigir as proteínas da presente invenção para

Z G_ ' _r- -T o transporte para a membrana do plasma, é operacionalmente ligado, pelo menos, uma sequência de sinal, à sequência de

ADN de interesse. A sequência de sinal pode ser derivada da sequência que codifica o GlugR, de outras sequências de sinal descritas na técnica, ou sintetizada de novo.

As células hospedeiras para utilização na prática da presente invenção incluem células de mamíferos, aves, plantas, insectos e fungos, sendo, de preferência, células de mamíferos. As células de fungos, incluindo as espécies de fermentos (e.g., Saccharomyces spp., em particular S. cerevisiae. Schizosaccharomyces spp.) ou os fungos filamentosos (e.g., Arpergillus spp., Neurospora spp.), podem ser usados como células hospedeiras na presente invenção. Os vectores de fermentos apropriados para uso na presente invenção incluem o

YRp7 (Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76: 1035-1039, 1978), YEpl3 (Broach et al. , Gene 8: 121-133, 1979), os vectores POT (Kawasaki et al., Patente Americana n^s

4.931.373, que aqui é incorporada por referência), o pJDB249 e o pJDB219 (Beggs, Nature 275: 104-108, 1978) e seus derivados. Esses vectores incluem em geral, um marcador seleccionável que pode ser um vector de qualquer número de genes

2.2 que exiba um fenotipo dominante, para o qual existe um ensaio li fenotópico, para permitir seleccionar os transformadores. Os marcadores seleccionáveis preferidos são os que complementam a auxotrofia da célula hospedeira, que proporcionam uma resistência ao antibiótico, ou que permitem que uma célula utilize fontes de carbono específicas, e incluem o LEU2 (Broach et al., ibid.), URA3 (Botstein et al. , Gene 8: 17,

1979), HIS3 (Struhl et al., ibid.) ou POT1 (Kawasaki et al., ibid.). Um outro marcador seleccionável apropriado é o gene

CAT, que confere uma resistência ao cloranfenicol nas células de fermento.

São bem conhecidos na técnica outros vectores, promotores e terminadores adicionais para serem utilizados na expressão do receptor da invenção, em fermento e são revistos, por exemplo, por Emr, Meth. Enzymol. 185: 231-279, (1990), aqui incorporado por referência. Os receptores da invenção podem ser expressos em Asperqillus spp. (McKnight e

Upshall, descritos na Patente Americana 4.935.349, que é aqui incorporada por referência). Os promotores úteis incluem os derivados dos genes glicolíticos de Asperqillus nidulans.

tais como o promotor ADH3 (McKnight et al., EMBO J. 4: 2093-2099, 1985) e o promotor tpiA. Um exemplo de terminador apropriado é o terminador ADH3 (McKnight et al., ibid.). As

técnicas para a transformação dos fungos são bem conhecidas na literatura e foram descritas, por exemplo, por Beggs (ibid.), Hinnen et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75: 1929-1933, 1978), Yelton et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:

1740-1747, 1984) e Russell (Nature 301: 167-169, 1983), cada um dos quais é aqui incorporado por referência.

Várias outras células eucarióticas maiores podem servir como células hospedeiras para a expressão do Glu^R, embora nem todas as linhas de células sejam capazes de um acoplamento funcional do receptor aos, segundos sistemas mensageiros de células. São preferidas células de mamíferos cultivadas, tais como BHK, CHO, Y1 (Shapiro et al., TIPS Suppl. 43-46 (1989)),

NG108-15 (Dawson et al., Neuroscience Approached Throuqh Cell

Culture, Vol, 2, páginas 89-114 (1989)), N1E-115 (Liles et al., J. Biol. Chem. 261: 5307-5313 (1986)), PC 12 e COS-1 (ATCC CRL 1650). As linhas de células BHK preferidas são a linha de células BHK tk“tsl3 (Waechter e Baserga, Proc. Natl.

Acad. Sei. USA 79: 1106-1110 (1982)) e a linha de células BHK

570 (depositada na American Type Culture Collection, 12301

Parklawn Dr., Rockville, MD. sob o número de acesso CRL

10314). Encontra-se à disposição uma linha de células BHK tk“ na ATCC, sob o número de acesso CRL 1632.

Os vectores de expressão de mamíferos para uso na realização da presente invenção incluem um promotor capaz de dirigir a transcrição de um gene clonado ou cADN. Os promotores preferidos incluem promotores virais e promotores celulares. Os promotores virais incluem o promotor de citomegalovirus imediatamente anterior (Boshart et al., Cell 41: 521-530, 1985) e o promotor SV40 (Subramani et al., Mol. Cell.

Biol. 1: 854-864, 1981). Os promotores celulares incluem o promotor de metalotioneína-1 do ratinho (Palmiter et al. , Patente Americana N^s 4.579.821), um promotor V_k do ratinho (Bergman et al., Proc. Natl. Acad, Sei. USA 81: 7041-7045,

1983; Grant et al., Nuc. Acida Res. 15: 5496, 1987) e um promotor Vg do ratinho (Loh et al., Cell 33: 85-93, 1983). Um promotor particularmente preferido é o último promotor principal de Adenovirus 2 (Kaufman e Sharp, Mol. Cell, Biol. 2:

1304-13199, 1982). Esses vectores de expressão podem também conter um conjunto de locais de união de ARN localizados para baixo, a partir do promotor, e para cima, a partir da sequência de ADN que codifica o péptido ou proteína de interesse.

Os sítios de união de ARN preferidos podem ser obtidos de genes de adenovirus e/ou genes de imunoglobulina.

Também contido nos vectores de expressão se encontra um

sinal de poliadenilatação localizado para baixo da sequência de codificação de interesse. Os sinais de poliadenilatação incluem os primeiros ou os últimos sinais de poliadenilatação de SV40 (Kaufman e Sharp, ibid.), o sinal de poliadenilatação do Adenovirus 5 região E1B e o terminador do gene da hormona do crescimento humana (DeNoto et al. , Nuc, Acids Res. 9:

3719-3730, 1981). Os vectores de expressão podem incluir uma sequência condutora virai de não-codificação, tal como o condutor tripartito do Adenovirus 2, localizado entre o promotor e os sítios de união do ARN. Os vectores preferidos podem também incluir sequências aumentadoras, tais como o aumentador SV40 e o aumentador u do ratinho (Gillies, Cell

33: 717-728, 1983). Os vectores de expressão podem também incluir sequências que codificam os ARNs do adenovirus VA.

As sequências de ADN clonadas podem ser introduzidas nas células cultivadas de mamíferos por, por exemplo, transfecção mediada por fosfato de cálcio (Wigler et al., Cell 14: 725,

1978; Corsaro e Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981;

Graham e Van der Eb, Virology 52: 456, 1973). Podem também ser usadas outras técnicas para a introdução de sequências de

ADN clonadas em células de mamíferos, tais como a electroporação {Neumann et al., Embo J. 1: 841-845, 1982). A fim de identificar as células que têm integrado o ADN clonado, é geralmente introduzido nas células um marcador seleccionável, juntamente com o gene ou o cADN de interesse.

Os marcadores seleccionáveis preferidos para uso nas células cultivadas de mamíferos incluem os genes que conferem uma resistência aos fármacos, tais como a neomicina, higromicina e metotrexato. 0 marcador seleccionável pode ser um marcador seleccionável amplificável. Os marcadores seleccionáveis amplificáveis preferidos são o gene DHFR e o gene de resistência à neomicina. Os marcadores seleccionáveis são revistos por Thilly (Mammalian Cell Technology, Butterworth

Publishers, Stoneham, MA, que aqui é incorporado por referência). A escolha de marcadores, seleccionáveis está perfeitamente dentro do nível de qualquer perito comum na matéria.

Os marcadores seleccionáveis podem ser introduzidos na célula, num plasmídio separado, ao mesmo tempo que o gene de interesse, ou podem ser introduzidos no mesmo plasmídio. Se estiverem no mesmo plasmídio, o marcador seleccionável e o gene de interesse podem estar sob controlo de promotores diferentes ou do mesmo promotor, produzindo o último arranjo uma mensagem dicistrónica. As construções deste tipo são

conhecidas na técnica (por exemplo, Levinson e Simonsen,

Patente U.S. N^s 4.713.339). Pode também ser vantajoso adicionar ADN adicional, conhecido como ADN veicular, à mistura que ê introduzida nas células.

Deixam-se desenvolver durante um período de tempo, tipicamente 1-2 dias, células transfectadas dos mamíferos, para começarem a expressar a(s) sequência(s) de ADN de interesse.

A selecção de fármaco é depois aplicada para seleccionar o crescimento das células que estão a expressar o marcador seleccionável numa forma estável. As células transfectadas podem também ser seleccionadas na presença de um antagonista para inibir a actividade do receptor. Os antagonistas apropriados neste contexto incluem o D, L, 2-amino-3-fosfonopropionato. Para as células que foram transfectadas com um marcador seleccionável amplificável, a concentração de fármaco pode ser aumentada de uma forma passo-a-passo, para seleccionar um número aumentado de cópias das sequências clonadas, aumentando deste modo os níveis de expressão.

Os promotores, terminadores e métodos apropriados para a introdução de vectores de expressão que codificam o Glu^R recombinante em células de plantas, aves e insectos, são conhecidos na técnica. 0 uso de baculoviros, por exemplo, como vectores para a expressão de sequências de ADN heterólogas em células de insectos £oi revisto por Atkinson et al., (Peatic. Sei. 28: 215-224, 1990). O uso de Agrobacterium rhizogenes como vectores para a expressão de genes em células de plantas foi revisto por Sinkar et al., (J, Biosci.

(Banglaore) 11: 47-58, 1987).

As células hospedeiras que contêm as construções de ADN da presente invenção são depois cultivadas para produzirem GIuqR recombinante. As células são cultivadas de acordo com métodos aceites, num meio de cultura contendo nutrientes requeridos para o crescimento de células de mamíferos e de outras células hospedeiras. São conhecidos na técnica vários meios apropriados, incluindo em geral uma fonte de carbono, uma fonte de azoto, aminoácidos essenciais, vitaminas, minerais e factores de crescimento. 0 meio de crescimento é em geral seleccionado relativamente às células que contêm a construção de ADN por, por exemplo, selecção ou deficiência de fármaco num nutriente essencial, que seja complementado pelo marcador seleccionável na construção de ADN ou co-transfectada com a construção de ADN.

As células transfectadas que expressam um GlUgR clonado podem ser detectadas por vários métodos. Transfectando célu-

las com um vector de expressão que contenha unidades de expressão para o Glu_GR e um gene informador (e.g. luciferase), a actividade do gene informador proporciona um indicador de expressão do clone Glu_GR co-transfectado. Incluindo um ou mais elementos de resposta AMP cíclicos (CRE) na unidade de expressão do gene informador, os clones que codificam os receptores acoplados quer à estimulação quer à inibição do segundo mensageiro de adenilato ciclaBe podem ser identificados por uma mudança na expressão do gene informador em resposta ao ligando adicionado. As construções de ADN que compreendem um CRE ligado e um gene informador são conhecidas na técnica. Veja-se, por exemplo, Mellon at al., Proc, Natl.

Acad. Sei. USA 86: 4887-4891 (1989), aqui incorporada por referência. As linhas de células que expressam receptores funcionais podem também ser detectadas por medições electrofisiológicas da actividade de canal induzida pelos agonistas. A actividade receptora pode também ser ensaiada medindo-se as concentrações citosólicas livres de cálcio em células transfectadas. Veja-se, por exemplo, Thastrup et al.,

Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 2466-2470 (1990) e Picard et al. , Science 247: 327-329 (1990), que aqui são incorporadas por referência. Um método preferido para a medição da

..Ί

''' * ‘ concentração citosólica livre de cálcio é por varrimento das células com um microscópio fluorescente acoplado a uma câmara de vídeo. As células são ínjectadas com um indicador fluoresΠ J.

cente Ca (e.g. Fluo-3 ou Fura-2, Molecular Probes, Inc.,

Eugene, OR) e expostas ao ligando.

GlugR produzido de acordo com a presente invenção pode ser purificado dos sistemas de expressão recombinantes ou outras fontes, usando protocolos de purificação que empregam técnicas em geral à disposição dos peritos na matéria. As fontes mais convenientes para a obtenção de grandes quantidades de GlugR são as células que expressam o receptor recombinante. Contudo, podem também ser empregues outras fontes, tais como tecidos, em particular tecidos de cérebro do cerebelo que contêm GlugR.

A purificação pode ser realizada por meios de purificação química convencionais, tais como cromatografia líquida, cromatografia de afinidade de lectina, centrifugação do gradiente e electroforese de gel, entre outros. Os métodos de purificação de proteínas são conhecidos na técnica (veja-se em geral, Scopes, R., Protein Purification. Springer-Verlag, NY (1982), que aqui ê incorporada por referência) e podem ser aplicados à purificação do GlugR e, em particular, ' j,^:

Λ ^Λ' ^Η , >

do GlugR recombinantemente produzido, aqui descrito. Numa forma de realização preferida é empregue cromatografia de afinidade imunológica usando anticorpos dirigidos contra o G1u_gR, tal como se descreveu acima. De acordo com um outro método de purificação, um gene recombinante que codifica o Glu_GR ou porções do mesmo, pode ser modificado na extremidade amino, imediatamente atrás de um péptido de sinal, com uma sequência que codifica um pequeno péptido hidrofílico, tal como se descreve nas Patentes Americanas N^as. 4.703.004 e

4.782.137, aqui incorporadas por referência. Os anticorpos específicos para o péptido facilitam a rápida purificação do Glu_GR, e o pequeno péptido pode depois ser removido com enteroquinase.

Deste modo, tal como se descreveu acima, a presente invenção proporciona GlugR isolado do seu meio celular natural, substancialmente livre de outros receptores de glutamato acoplados com proteína G. Proporciona-se também GlugR purificado. É preferido o GlugR substancialmente puro em, pelo menos, cerca de 50%, sendo mais preferido pelo menos cerca de

70-80%, e o mais preferido ainda é 95-99% ou mais de homogeneidade, em particular para usos farmacêuticos. Uma vez purificado, parcialmente ou até à homogeneidade, conforme

desejado, o GlugR recombinante ou GlugR natural pode depois ser usado para gerar anticorpos, em processos de ensaio, etc. .

De acordo com outro aspecto, a invenção refere-se a polipéptidos e fragmentos de GlugR. Os polipéptidos e os fragmentos de GlUgR podem ser,isolados dos sistemas de expressão recombinantes ou podem ser sintetizados pelo método de fase sólida de Merrifield, Fed. Proc. 21: 412 (1962),

Merrífield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 (1963), ou Barany e

Merrifield, em The Peptides. Vol. 2, pp. 1-284 (1979) Academic Press, NY, cada um dos quais é aqui incorporado por referência, ou pelo uso de um sintetizador de péptidos automático. Por polipéptidos entende-se uma sequência de, pelo menos, 3 aminoácidos, tipicamente 6 ou mais, até 100-200 aminoácidos ou mais, incluindo proteínas completas. Por exemplo, a ou as porções de proteínas de GlUgR que ligam o ligando podem ser identificadas por vários métodos, tais com por tratamento do receptor purificado com uma protease ou um agente químico para o fragmentar e determinar que fragmento é que é capaz de se ligar ao glutamato marcado numa mancha de ligando. Os polipéptidos podem depois ser sintetizados e usados como anti-géne, para inibir a interacção ligando-

-Glu_gR, etc.. Dever-se-á entender que, tal como aqui é usado, a referência ao GlugR entende-se que inclui as proteínas, polipéptidos e seus fragmentos, a não ser que o contexto indique de outra forma.

De acordo com outro aspecto, a invenção proporciona meios para regular a interacção GlugR-ligando e, deste modo, tratar, terapêutica e/ou profilacticamente, uma perturbação que pode estar ligada directa ou indirectamente a um GlugR ou aos seus ligandos, tais como glutamato e outros aminoácidos de excitação endógenos. Devido ao facto de terem os receptores da invenção, podem ser identificados agonistas ou antagonistas que estimulam ou inibem a interacção do ligando com um GlugR. Quer com agonistas ou antagonistas, são controlados o metabolismo e a reactividade das células que expressam o receptor, proporcionando-se deste modo um meio para destruir ou, nalguns casos impedir, a doença de interesse.

Deste modo, a invenção proporciona processos de selecção para identificar agonistas ou antagonistas de situações mediadas pela interacção do ligando-GlugR. Esses ensaios de varrimento podem empregar uma larga variedade de formatos, dependendo, até certo ponto, de que aspecto da interacção ligando/receptor/proteína G se pretende focar. Por exemplo,

esses ensaios podem ser designados para identificar compostos que se ligam ao receptor e, desta forma, bloqueiam ou inibem a interacção do receptor com o ligando. Outros ensaios podem ser designados para identificar compostos que podem substituir o ligando e, por isso, estimular as passagens intracelulares mediadas pelo GlugR. Contudo, outros ensaios podem ser usados para identificar compostos que inibem ou facilitam a associação do GlugR à proteína G e, deste modo, mediam a resposta celular ao ligando de GlugR.

De acordo com um ensaio de varrimento funcional, a iniciação das situações de activação da fertilização são controladas em ovos que foram injectados com, e. g., mARN que codifica o GlugR e subsequentemente expostos a compostos seleccionados que estão a ser seleccionados, conjuntamente com ou separados de um ligando apropriado. Veja-se, em geral,

Kline et al., Science 241: 464-467 (1988), aqui incorporado por referência. Os oócitos injectados com mARN que codificam +

o G1u_gR podem também ser testados pela medição de Ca citosólico livre, tal como se descreveu acima.

Um outro ensaio de varrimento baseia-se no uso de linhas de células de mamíferos que expressam Glu^R funcionalmente acoplado com uma proteína G de mamíferos. Neste ensaio, os compostos são seleccionados relativamente à sua actividade relativa como agonistas ou antagonistas receptores comparando a ocupação relativa do receptor com a extensão da eBtimulação ou inibição provocada pelo ligando do segundo metabilismo mensageiro. Por exemplo, a activação da fosfolipase C conduz ao aumento do metabolismo de monofosfato de inositol. São em geral descritos meios para medir o metabolismo do monofosfato de inositol, em Subers e Nathanson, J. Mol. Cell, Cardiol.

20: 131-140 (1988), aqui incorporado por referência. Tal como se referiu anteriormente, os subtipos de receptores que estão acoplados à estimulação ou inibição do segundo mensageiro de adenilato ciclase podem ser usados em sistemas de ensaio em que a actividade do gene informador (e. g. luciferase) está ligada às interacções ligando-receptor.

O processo de varrimento pode ser usado para identificar reagentes, tais como anticorpos, que se ligam especificamente aos receptores e afectam de forma substancial a sua interacção com o ligando, por exemplo. Os anticorpos podem ser monoclonais ou policlonais, na forma de anticorpos de antissoro ou anticorpos mono-específicos, tais como anticorpos de antissoro purificado ou anticorpos monoclonais ou suas misturas. Para a administração às pessoas, e. g., como um ,/

Ο //.

componente de uma composição para o diagnóstico ou a visualização in vivo, os anticorpos são, de preferência, substancialmente humanos para minimizar a imunogenicidade e estão na forma substancialmente pura. Por substancialmente humano entende-se, em geral, que contem, pelo menos, cerca de

70% de sequência de anticorpo humano, de preferência pelo menos cerca de 80% humano, e de preferência ainda pelo menos cerca de 90-95% ou mais de uma sequência de anticorpo humano

I para minimizar a imunogenicidade nas pessoas.

Os anticorpos que ligam o Glu^R podem ser produzidos por várias meios. A produção de anticorpos de antissoros não-humanos ou anticorpos monoclonais, e, g., muridios, lagomorfa, equinos, etc. é bem conhecida e pode ser realizada, por exemplo, imunizando o animal com a molécula receptora ou uma preparação contendo uma porção desejada da molécula receptora, tal como o domínio ou domínios que contribuem para a ligação do ligando. Os anticorpos receptores de subtipos específicos podem ser gerados imunizando com péptidos específicos. Pequenos péptidos (e. g., cerca de 14-20 aminoácidos) podem ser acoplados em hemocianina limpeto básico, por exemplo, para aumentar a imunogenicidade. Para a produção de anticorpos monoclonais, são imortalizadas e ô

seleccionadas células que produzem anticorpos, obtidas a partir de animais imunizados, ou são seleccionadas primeiro para a produção do anticorpo que se liga à proteína receptora e depois imortalizadas. Como a geração de anticorpos monoclonais humanos em antigene de Glu_GR humano pode ser difícil com técnicas convencionais, pode ser desejável transferir as regiões de ligação do antigene dos anticorpos não-humanos, e. g. , as regiões FCab'^ ou regiões hipervariáveis, para regiões constantes humanas (Fc) ou regiões de estrutura, por técnicas de ADN recombinantes para produzir moléculas substancialmente humanas. Esses métodos são geralmente conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, na Patente Americana

N⁵ 4.816.397 e nas publicações EP 173.494 e 239.400, que aqui são incorporadas por referência. Em alternativa, podem-se isolar sequências de ADN que codificam um anticorpo monoclonal humano ou porções do mesmo, que se ligam especificamente à proteína do receptor humana, seleccionando uma biblioteca de ADN a partir de células B humanas, de acordo com o protocolo geral delineado por Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1989), aqui incorporado por referência, e depois clonando e amplificando as sequências que codificam o anticorpo (ou fragmento de ligação) com a especificidade desejada.

De acordo com outras formas de realização, a invenção proporciona ensaios de varrimento levados a cabo in vitro com células que expressam o receptor. Por exemplo, o ADN que codifica o receptor ou porções seleccionadas do mesmo, pode ser transfectado numa linha de células estabelecida, e. g., uma linha de células de mamíferos, tais como BHK ou CHO, usando processos conhecidos na técnica (veja-se, e. g.,

Sambrook et al., Molecular Cloninq, A Laboratory Manual. 2⁸ ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,

N.Y., 1989, que aqui é incorporado por referência). 0 receptor é depois expresso pelas células cultivadas, sendo seleccionados agentes seleccionados para o efeito desejado nas células, separadamente ou em conjunto com um ligando apropriado, tal como glutamato ou quisqualato. São descritos meios para amplificar as sequências de ácido nucleico que podem ser empregues para amplificar sequências que codificam o receptor ou porções do mesmo, nas Patentes Americanas N⁸s.

4.683.195 e 4.683.202, aqui incorporadas por referência.

De acordo com um outro aspecto, os ensaios de varrimento, proporcionados pela invenção referem-se a mamíferos transgénicos, cujas células germinativas e Bomáticas contêm uma sequência de nucleótido que codifica a proteína de GlUgR ou uma porção seleccionada do receptor que, e. g. , liga o ligando, a proteína de ligação ao GTP, ou semelhante. Existem vários meios pelos quais uma sequência que codifica, por exemplo, o Glu^R humano, pode ser introduzida num embrião de mamífero não-humano, alguns dos quais são descritos, e. g., na Patente Americana N^s 4.736.866, Jaenisch, Science

240-1468-1474 (1988) e Westphal et al., Annu. Rev. Cell Biol.

5: 181-196 (1989), que aqui são incorporados por referência.

As células dos animais expressam então o receptor, podendo assim ser usadas como um modelo conveniente para testar ou seleccionar agonistas ou antagonistas seleccionados.

De acordo com um outro aspecto, a invenção diz respeito a métodos de diagnóstico e composições. Devido a ter a molécula Glu_GR e os anticorpos para a mesma, proporcionam-se vários ensaios de diagnóstico. Por exemplo, com anticorpos, incluindo os anticorpos monoclonais, para o GlUçR, pode ser determinada a presença e/ou concentração de receptor em células ou tecidos seleccionados numa situação individual ou cultura de interesse.Estes ensaios podem ser usados no diagnóstico e/ou no tratamento de doenças tais como, por exemplo, a isquémia cerebral, a doença de Parkinson, a demência senil e outras perturbações cognitivas, a coreia de

Huntington, a esclerose lateral amiotrófica, a enteses, a enxaqueca e outras.

Encontram-se à disposição numerosos tipos de ensaios imunológicos, sendo conhecidos pelos peritos na matéria, e.

g. , os ensaios competitivos, os ensaios de sandwich e semelhantes, tal como se descreve em geral, e. g., nas Patentes

Americanas ,N⁹s 4.642.285; 4.376.110; 4.016.043; 3.879.262;

3.852.157; 3.850.752; 3.839.153; 3.791.932; e o Antibodies, A

Laboratory Manual. de Harlow e Lane, Cold Spring Harbor

Publications, N.Y. (1988), cada uma das quais aqui incorporada por referência. De acordo com um formato de ensaio, identifica-se e/ou quantifica-se Glu^R usando anticorpos marcados, de preferência anticorpos monoclonais que se fazem reagir com tecidos do cérebro, e. g., córtex, estriato, hipocampos, cerebelo, e determinando-lhe a ligação específica, em que o ensaio é tipicamente levado a cabo em condições que conduzem à formação do complexo imunológico.

Pode ser usado um anticorpo primário não marcado em combinação com marcas que são reactivas com o anticorpo primário para detectar o receptor. Por exemplo, o anticorpo primário pode ser detectado indirectamente por um anticorpo marcado secundário, feito para detectar especificamente o anticorpo primário. Em alternativa, o anticorpo de anti-GlUgR pode ser directamente marcado. Podem ser empregues uma larga variedade de marcas, tais como os radionuclidos, partículas (e. g., ouro, ferritina, partículas magnéticas, glóbulos vermelhos), fluorescentes, quimiluminescentes, enzimas, substractos de enzimas, cofactores de enzimas, inibidores de enzimas, ligandos (particularmente haptenos), etc..

ADN de Glu_GR pode ser directamente detectado em células com um ADN de GlugR marcado ou uma amostra sintéctica de oligonucleótido num processo de hibridização semelhante ao de Southern ou de uma pequena mancha. Também pode ser usada a reacção em cadeia de polimerase (Saiki et al . , Science 239:

487 (1988), e a Patente U.S. N⁵ 4.683.195) para amplificar sequências de ADN, que são subsequentemente detectadas pelo seu tamanho característico em geles de agarose, manchas de Southern destes geles usando ADN de GlugR ou uma amostra de oligonucleótido, ou uma pequena mancha usando amostras semelhantes. As amostras podem compreender de cerca de 14 nucleótidos a cerca de 25 ou mais nucleótidos, de preferência, 40 a 60 nucleótidos e, nalguns casos, pode ser usada uma porção substancial ou mesmo todo o cADN de GlugR. As amostras são marcadas com um sinal detectável, tal como

ί) f/)í // rfí /'//3 λ' ί; / uma enzima, biotina, um radionuclido, fluorescente, quimiluminescente, partícula paramagnética, etc..

Podem também ser fornecidos estojos para serem usados com o receptor da presente invenção para detectar a presença do receptor ou anticorpos para o mesmo, tal como seria desejável no caso de uma doença auto-imunológica. Deste modo, podem ser fornecidos anticorpos para o GlUgR, de preferência anticorpos mono-específicos tais como anticorpos monoclonais, ou composições do receptor, usualmente na forma liofilizada, num recipiente, ou segregados ou em conjunto com reagentes adicionais, tais como anti-anticorpos, marcas, amostras para ensaio de geles, primários de reacção em cadeia de polimerase e polimerase, e semelhantes.

Os exemplos seguintes são dados como forma de ilustração, não como forma de limitação.

EXEMPLO I

Preparação de mARN enriquecido com GlUgR

Preparou-se ARN total a partir do cerebelo de ratazanas usando isotiocianato de guanidina (Chirgwin et al., Biochemistry 18: 52-94 (1979) e centrifugação com CsCl. Isolou-se poly (A)+ ARN usando cromatografia de oligo d(T) celulose.

:/

Depois de duas voltas de cromatografia em oligo d(T) celulose, dividiu-se o ARN (800 ug) em duas aliquotas e colocou-se em camadas sobre gradientes de sacarose linear 10-40% em tubos para um rotor SW 28. Os gradientes foram centrifugados durante 28 horas a 25.000 rpm para formar grânulos do ARN superiores a 4 kb de tamanho. Injectou-se o ARN enriquecido em oócitos de rãs e ensaiou-se relativamente à presença do GlUçR.

x_Iniecção de oócitos e ensaio de voltagem aos bornes da actividade do Glu_cR

Prepararam-se oócitos a partir de lóbulos de ovários que foram cirurgicamente removidos de Xenopus fêmeas anestesiadas. Lavaram-se os lóbulos dos ovários, puxaram-se para o lado em pequenos grupos e dissociaram-se por tratamento com colagenase durante 2-3 horas, a 20* C, com uma agitação suave e constante. A dissociação e a desfolicularização dos oócitos é completada manualmente depois da remoção da colagenase. Os oócitos que foram considerados saudáveis e superiores a 1 mm de diâmetro, foram transferidos para um prato de cultura de tecido estéril de 50 mm e incubaram-se em meio de Barth estéril suplementado com antibiótico (NaCl 88 mM, KC1 1 mM,

MgSO₄ 0,82 mM, Ca(NO₃)₂ 0,33 mM, CaCl₂ 0,41 mM, NaHCO₃ 2,4 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4, 0,1 mg/ml de gentamicina, 0,01 mg/ml de penicilina, 0,01 mg/ml de streptomicina, teofilina 0,5 mM e piruvato de Na 2,5 mM) a 19'C.

Puxaram-se as pipetas de injecção de tubos de vidro grosso (Drummond) num puxador vertical de Kopf modificado de

700C. Partiu-se a ponta e enviesou-se usando uma microforja

Médica de List. Os diâmetros da ponta das pipetas variavam entre 20-30 mM. As pipetas de injecção foram libertadas de

RNase, aquecendo-se a 285’C, durante a noite.

A seguir à incubação durante a noite, seleccionaram-se os oócitos saudáveis para a injecção. O ARN que foi a armazenado a -70’C em água tratada com DEPÇ, foi descongelado e centrifugado a 15.000 g, durante cinco minutos. Realizou-se a injecção usando um dispositivo de pipetamento modificado (Drummond). Depois da injecção, os oócitos foram incubados em meio de Barth fresco, estéril, que foi mudado diariamente e removidos os oócitos não saudáveis.

Os ensaios de voltagem aos bornes foram levados a cabo em oócitos injectados que foram, cada um deles, colocado num pequeno compartimento de aproximadamente 500 ul de volume e que foi continuamente aspergido com solução de Ringer de rã,

padrão (NaCl 115 mM, KC1 2,5 mM, C_aCl₂ 1,8 mM, HEPES 10 mM, pH 7,2) a 1-6 ml/min.. 0 oócito foi empalado com dois micro-eléctrodos de vidro para o registo que, depois de preenchidos com KC1 3 M, tinha uma resistência de ponta de 0,5 a 7,0 megaohms. Um dos dois electrodos foi ligado a um amplificador diferencial através de uma meia célula de prata/cloreto de prata. 0 banho potencial foi medido ligando o outro lado do amplificador diferencial ao banho, através de um grânulo de prata/ cloreto de prata e uma ponte Ringer/Agar. Foi usado um sistema de voltagem aos bornes de baixo ruído e elevada tolerância (NPI), para controlar o potencial da membrana e medir a corrente da membrana. 0 potencial da membrana do oócito foi mantido a -60 mV (interior da célula negativo).

Foram aplicados um glutamato milimolar (Sigma), 100 nM de quisqualato (Sigma), 1 mM de carbamilcolina (Sigma) e as outras drogas usadas neste ensaio, ligando o meio aspergido a um meio contendo um fármaco durante aproximadamente três minutos, e registou-se a corrente da membrana num registador de gráfico (Linear Instruments),

Depois de empalar o oócito com os dois microelêctrodos, e impor a voltagem aos bornes, a corrente da membrana (a corrente de manutenção) decresce gradualmente para um estado

estável durante um período de vários minutos. Quando a corrente de manutenção estabiliza, de forma a que o gráfico fique horizontal, a droga é aplicada durante um a três minutos. Considera-se que um oócito tem uma resposta positiva se se observar uma rápida ponta de corrente centrípeta (deflecção descendente no gráfico), seguido por oscilações lentas da corrente de magnitude decrescente. 0 nosso limite inferior de detecção dependeu da estabilidade da corrente de manutenção antes da aplicação da droga, mas situou-se na gama de 5-10 nA.

Construção de pVEGT'

Para permitir a transcrição de cADN clonado sem a anterior digestão de endonuclease, adicionaram-se terminadores de transcrição de bacteriofage T7 a um vector de clonação. O pVGET' de plasmídio é descrito no pedido de Patente Americana pendente 07/581.342, que é aqui incorporada por referência. A sequência do terminador de transcrição de ARN T7 hipotético, que se situa entre o gene 10 e o gene 11 da bacteriofage T7, é descrito por Dunn and Studier (J. Mol. Biol. 166: 477-536 (1983)). Tal como se mostra na Figura 5, desenharam-se quatro oligonucleótidos sintécticos a partir desta sequência e ligaram-se ao vector pGEM-1 (obtido da Promega Biotec, Madison, WI), um plasmídio contendo uma origem bacteriana da réplicação, gene de resistência à ampicilina, e o promotor T7 adjacente a um local de clonação múltiplo. Adicionaram-se fosfatos terminais às extremidades 5' de oligonucleótidos

ZC776 e ZC777 com polinucleôtido quinase T4 e ATP, em condições padrão (Maniatis et al. ibid.). (As sequências destes e outros oligonucleótidos aqui referidos são mostradas na Tabela 1.) Depois da incubação, destruiu-se a quinase por

J aquecimento a 65'C, durante 10 min. Recozeram-se 25 nanogramas de oligonucleótido ZC775 e 25 ng de oligonucleótido

ZC776, por incubação, a 65'C, durante 15 minutos, e depois deixaram-se arrefecer para a temperatura ambiente em 500 ml de água. Os oligonucleótidos 7&ΤΊΊ e ZC778 foram recozidos de forma semelhante. Os oligonucleótidos recozidos foram armazenados a -20'C, até serem usados. Digeriu-se o pGEM-1 do vector, com Pst I e Hind III, e purificou-se o ADN de vector linearizado por meio de electroforese de gel de agarose. O terminador T7 sintéctico (oligonucleótidos recozidos ZC775,

ZC776, ZC777 e ZC778) foi então clonado com pGEM-1.

Vinte e cinco nanogramas de vector, mais uma quantidade equimolar de cada um dos oligonucleótidos recozidos

Λ

Λ,

4V ii mistura η - ι ' li l

ι

ZC775/ZC776 e ZC777/ZC778 foram combinados numa reaccional de 10 ul. Depois de uma ligação durante a noite a

14'C, o ADN foi transformado em células JM83 E, coli competentes, e as células transformadas foram seleccionadas relativamente à resistência à ampicilina. O ADN de plasmídio foi preparado a partir de transformantes seleccionados pelo processo da lise alcalina (Birnboim e Doly, Nuc. Acida Res.

7: 1513-1523 (1979)). Uma porção do ADN destas amostras foi cortada com Pst I e Hind III e analisada num gel de poliacrilamida a 4% para identificar os clones que libertaram um fragmento de Pst Ι-Hind III 80 bp. Foram também feitos outros cortes de diagnóstico, tais como o Eco RI e o Not I. Um dos isolados, designado pGEMT, foi mostrado por análise de restrição por conter o fragmento do terminador T7.

Tabela 1.

Sequências de oligonucleótidos (5 * -3 ' )

ZC775:

GCT AGC ATA ACC CCT TGG GGC CTC TAA ACG GGT CT

ZC776:

CTC AAG ACC CGT TTA GAG GCC CCA AGG GGT TAT GCT AGC TGC A

ZC777:

TGA GGG GTT TTT TGC TGA AAG GAG GAA CTA TGC GGC CGC A

ZC778:

AGC TTG CGG CCG CAT AGT TCC TCC TTT CAG CAA AAA ACC C

ZC1751:

AAT TCT GTG CTC TGT CAA G

ZC 1752:

GAT CCT TGA CAG AGC ACA G

ZC2063;

GAT CCA AAC TAG TAA AAG AGC T

ZC2064:

CTT TTA CTA GTT TG

ZC2938:

GAC AGA GCA CAG ATT CAC TAG TGA GCT CTT TTT TTT TTT TTT T

ZC3015:

TTC CAT GGC ACC GTC AAG GCT

ZC3016:

AGT GAT GGC ATG GAC TGT GGT

ZC3652:

ACA TGC ACC ATG CTC TGT GT

ZC3654:

AGT GAT GGC ATG GAC TGT GGT

Adicionou-se ao pGEMT de plasmídio o terminador T7 natural do plasmídio pAR2529 (Rosenberg et al,, Gene 56: 125135 (1987)). Digeriu-se o pGEMT de plasmídio com Bam HI e digeriu-se o plasmídio pAR2529 com Bam HI e Bgl II (Figura

1). 0 fragmento do terminador Bam HI-Bgl II do pAR2529 foi purificado por electroforese de gel de agarose. 0 fragmento terminador foi ligado ao pGEMT digerido com Bam HI e o ADN foi transformado em células LM1035 E. coli competentes. As colónias que foram resistentes à ampicilina foram inoculadas em culturas de 5 ml para se desenvolverem durante a noite.

Seleccionou-se ADN de plasmídio preparado pelo processo da lise alcalina, relativamenta à adequada orientação do terminador, por digestão de Bam ΗΙ-Sal I e electroforese num gel de poliacrilamida a 8%. Escolheu-se um clone que continha o terminador na orientação correcta, conforme evidenciado pela presença de um fragmento Bam ΗΙ-Sal I 130 bp, e denominou-se pGEMTT (Figura 1).

Para permitir que o pGEMTT seja embalado como ADN de fita única na presença de proteínas de fage M13, adicionou-se ao pGEMTT a região intergénica M13 da pUC382 (semelhante às pUC118 e 119 tal como descrito por Vieira e Messing, Methods

Enzymol. 153: 3-11 (1987), (Figura 1). O pGEMTT de plasmídio foi digerido com Fsp I e Nar I, e purificado o fragmento contendo o promotor T7 e terminador de transcrição. O pUC382 de plasmídio foi digerido com Fsp I e Nar I, e purificado com gel, o fragmento que codifica o gene de resistência à ampicilina e a região intergénica M13. Estes fragmentos foram depois ligados conjuntamente, na presença de ADN ligase T4. 0

ADN ligado foi transformado em células LM1035 E, coli competentes. Preparou-se ADN de plasmídio de doze colónias resistentes à ampicilina, pelo método da lise alcalina e o ADN foi seleccionado por digestão com Ava I. A construção apropriada deu duas bandas, uma de 2430 bp e a outra de 709 bp. Escolheu-se um desses isolados e denominou-se pVEG. Adicionaram-se ao pVEG oligonucleótidos sintécticos que codificam a sequência primária, entre os locais Bam HI e Eco RI (Figura

1). O pVEG do plasmídio foi digerido com Bam HI e Eco RI e foi purificado com gel o fragmento do vector. Recozeram-se noventa e seis nanogramas de cada um dos oligonucleótidos

ZC1751 e ZC1752, em 4,5 yl de Tris 10 mM, pH 7,5, MgCl₂ 20 mM e NaCl 10 mM, a 65’C, durante 20 minutos, e depois arrefeceu-se a mistura para a temperatura ambiente durante um período de 30 minutos. Os oligonucleótidos recozidos foram ligados ao fragmento do vector pVEG com ADN ligase T4 e depois transformados em células LM1035 E. coli competentes. Depois de se cultivar durante a noite para desenvolver as colónias, retirou-se uma suspensão de filtro das colónias na placa de ágar.

filtro foi ensaiado com oligonucleótido ZC1751 marcado com

p. Todas as colónias eram positivas. Preparou-se ADN de plasmídio das culturas cultivadas de 12 das colónias. O ADN

Ν

de plasmidio foi seleccionado por digestão com Sst I para verificar a ausência do local Sst I entre os locais Eco RI e

Bam HI de pVEG. Todos os 12 dos ADNs de plasmidio foram negativos relativamente à digestão de Sst I. Um destes 12 isolados, foi escolhido e denominado pVEG'.

Adicionou-se ao pVEG uma sequência de poliadenilato derivada de uma cADN de dehidrogenase de álcool Asperqillus.

Tal como se mostra na Figura 1, o plasmidio pM098 (descrito no pedido de Patente Europeia publicado EP 272.277 e depositado na American Type Culture Collection sob o número de acesso 53428) foi digerido com Dra I e Bam HI, e o fragmento poli(A) com aproximadamente 150 bp foi purificado por electroforese de gel de agarose. Este fragmento continha principalmente sequência poli(A) com muito pouco cADN de franqueamento. Para clonar o fragmento poli (A) de cADN em pVEG, digeriu-se o pVEG com Bam HI e Sma I, e purificou-se com gel o fragmento do vector 3,4 kb. Os fragmentos de vector e poli(A) foram ligados conjuntamente com ADN ligase T4, para produzirem pVEGT de vector (Figura 1).

Adicionaram-se ao pVEGT oligonucleótidos sintécticos que codificam a sequência primária. Para cumprir isto, digeriu-se pVEGT com Not I e Sst I, e purificaram-se o fragmento 370 bp contendo a sequência poli(A) e os dois terminadores de transcrição T7 por electroforese de gel de agarose. Digeriu-se o pVEG' de plasmidio com Not I e Bam HI, e purificou-se com gel o fragmento do veetor 3,2 kb. Dois oligonucleótidos (ZC2063 e

ZC2064) que se formaram, quando recozidos, foram sintetizados com um adaptador Bam ΗΙ-Sst I. Os dois oligonucleótidos foram individualmente quinasados e recozidos, e ligados com o veetor linearizado e o fragmento poli(A) terminador. 0 veetor resultante, designado pVEGT' (Figura 1), continha um promotor de transcrição de ARN T7, um local de clonação Eco RI flanqueado pela sequência primária, um trato poli(A) e dois terminadores de ARN polimerase T7.

Construção da biblioteca de cADN a partir de polHAH ARN do cerebelo do rato

Uma vez que houve a evidência sugerindo que o Glu^R codificava um mARN muito grande de 7 kb (Fong, Davidson, and

Lester, Synapse 2:657 (1988)) e devido ao facto de ser necessário cADN de comprimento total circundando a sequência de codificação para a clonação funcional de cADN, foram tomadas medidas para optimizar a síntese de cADN grande. Foi desenvolvido um novo método de síntese de cADN que originou cADN grande de comprimento completo. Isto tornou-se evidente demonstrando-se que se podia sintetizar cADN 7,5 kb de comprimento total a partir de um modelo mARN de 7,5 kb e que se encontrava presente cADN grande de comprimento total numa biblioteca construída a partir de poli(A)+ ARN, conforme demonstrado pela análise de manchas de Southern. Adicionalmente, todas as enzimas que eram importantes neste método, foram testadas previamente e seleccionadas a partir de um grande número de lotes de enzimas que podiam ser obtidas de fornecedores comerciais. Uma vez identificado um lote satisfatório, foi adquirida uma grande quantidade da enzimas e a enzima foi armazenada a -70‘C, até ser usada. Uma vez usada, a enzima foi armazenada a -20'C, durante alguns meses e depois descartada. Foram seleccionadas relativamente à qualidade dos ensaios da síntese dó teste, diferentes lotes de enzimas de fornecedores comerciais, incluindo lotes de transcriptase inversa de Superscript (BRL), polimerase I E.

coli de ADN (Amersham) e nuclease de feijão Mung (NEB), que foram usadas na síntese de cADN. Foram ensaiados lotes de transcriptase inversa de Superscript relativamente à capacidade de sintetizar a unidade de comprimento da primeira fita de cADN (7,5 kb) a partir do controlo ARN (BRL) 7,5 kb. As ,¾.

li f UZ;

condições para a síntese da primeira fita com os lotes de transcriptase inversa de Superscript foram preparadas tal como se descreve abaixo. Analisou-se o cADN da primeira fita rádiomarcada por electroforese de gel de agarose alcalina.

Foram seleccionados para uso lotes de Superscript capazes de produzirem numa unidade de comprimento, cADN 7,5 kb.

Testaram-se os lotes de polimerase I de ADN E. coli relativamente à capacidade de produzirem, por formação de ADN fechada, cADN de segunda fita de comprimento total, a partir do cADN da primeira fita de unidade de comprimento 7,5 kb. As sínteses do cADN da segunda fita foram levadas a cabo tal como se descreve abaixo. A qualidade das sínteses de segunda fita foi avaliada por electroforese de agarose alcalina do produto rádiomarcado. Foram seleccionados para uso, lotes de

ADN de polimerase I capazes de produzirem 15 kb de segunda fita, a partir do cADN da primeira fita de unidade de comprimento 7,5 kb.

Foram testados lotes de nuclease de feijão de Mung, relativamente à capacidade de cortar o ADN fechado, formado durante a síntese da segunda fita, sem degradarem o cADN.

Adicionalmente, foram adicionadas concentrações variadas de enzima para determinar a concentração óptima de enzima para

as condições abaixo estabelecidas. As reacções foram avaliadas por electroforese de agarose alcalina. Foram seleccionados para uso lotes e concentrações que resultassem na produção de cADN de unidade de comprimento 7,5 kb.

Preparou-se ARN total a partir dos cerebelos de rato usando isotiocianato de guanidina (Chirgwin et al., Biochemistry 18: 52-94, 1979) e centrifugação de CsCl (Gilsin et al., Biochemistry 13: 2633-2637, 1974). Foi seleccionado poli(A)+ ARN a partir do ARN total, usando cromatografia de oligo d(T) celulose (Aviv and Leder, Proc. Natl. Acad. Sei.

USA 69: 1408 (1972)) .

O cADN da primeira fita foi sintetizado a partir de cerebelo poli (A) + ARN seleccionado uma vez de poli d(T) em duas reacções separadas. Uma reacção, contendo dATP rádiomarcado, foi usada para determinar a qualidade de síntese da primeira fita. A segunda reacção foi levada a cabo na ausência de dATP rádiomarcada e foi usada, em parte, para determinar a qualidade de síntese da segunda fita. Foi usada a transcriptase inversa de Superscript (BRL) especificamente tal como se descreve abaixo. Preparou-se uma mistura reaccional 2,5x, à temperatura ambiente, misturando, por ordem, μ1 de tampão de transcriptase inversa 5x (BRL: Tris-HCl

250 mM, pH 8,3, KC1 375 mM e MgCl₂ 15 mM), 2,5 ul de ditiotreitol 200 mM (feito de fresco ou armazenado em aliquotas a

-70*C) e 2,5 ui de uma solução de trifosfato de deoxinucleótido contendo 10 mM de cada um de dATP, dGTP, dTTP e 5-metil dCTP (Pharmacia). A mistura reaccional foi aliquotada em dois tubos de 7,5 yl cada um. Ao primeiro tubo, foram adicionados 1,3 yl de 10 yCi/yl de P-dATP (Amersham) e adicionou-se 1,3 yl de água ao segundo tubo reaccional.

Transferiram-se sete microlitros de cada tubo para tubos reaccionais. Misturaram-se catorze microlitros de uma solução contendo 10 yg de poli (A) + ARN de cerebelo diluído em 14 yl de Tris-HCl 5 mM, com um pH de 7,4, EDTA 50 yM, com 2 yl de yg/yl do primário de primeira fita, ZC2938 (Tabela 1), e recozeu-se o primário para o ARN, por aquecimento da mistura a 65C, durante 4 minutos, seguido pelo arrefecimento em água gelada. Adicionaram-se a cada um dos dois tubos reaccionais oito microlitros da mistura ARN-primário, seguidos de 5 yl de

200 U/yl de transcriptase inversa de Superscript (BRL).

Misturaram-se suavemente as reacções e os tubos foram incubados a 45'C durante 30 minutos. Depois da incubação, adicionaram-se 80 yl de Tris-HCl 10 mM, com um pH de 7,4, EDTA 1 mM a cada tubo, agitaram-se as amostras em turbilhão e centrífugaram-se rapidamente. Removeram-se três microlitros de cada reacção para determinar as contagens totais e as contagens precipitáveis de TCA (contagens incorporadas). Analisaram-se dois microlitros de cada amostra por electroforese de gel alcalino para determinar a qualidade de síntese da primeira fita. 0 restante de cada amostrg foi precipitado com etanol.

Peletizaram-se os ácidos nucleicos por meio de centrifugação, lavaram-se com etanol a 80% e secaram-se ao ar durante 10 minutos. A síntese da primeira fita originou 1,4 ug de cADN de cerebelo ou uma conversão de 28% de ARN em ADN.

A síntese de cADN da segunda fita foi levada a cabo no híbrido ARN-ADN a partir das reacções da primeira fita em condições que encorajavam o primeiro escorvamento condutor da segunda síntese condutora resultante na formação da curva

ADN. Os grânulos de ácido nucleico contendo o primeiro cADN condutor foram novamente suspensos em 71 ul de água. Para determinar a qualidade da segunda síntese condutora adicionou-se α P-dATP ao primeiro cADN condutor não marcado. Para encorajar a formação da estrutura em curva, todos os reagentes, excepto as enzimas, foram levados para a temperatura ambiente e as misturas reaccionais foram fixadas à temperatura ambiente. (Alternativamente, os reagentes podem estar em

gelo e a mistura reaccional mantida à temperatura ambiente e deixada equilibrada à temperatura ambiente durante um pequeno período de tempo antes da incubação a 16’C.) Fixaram-se dois tubos reaccionais para cada síntese. Um tubo reaccional continha o cADN da primeira fita não marcado e o outro tubo reaccional continha o cADN da primeira fita rádiomarcado. A cada tubo reaccional, foram adicionados 20 ul de 5x tampão da segunda fita (Tris 100 mM, pH 7,4, KC1 450 mM, MgCl₂ 23 mM, (NH4 )2^4) ⁵θ mM), 3 ul de beta-NAD e 1 ul de uma solução de dioxinucleótido de trifosfato contendo 10 mM de cada um de dATP, dGTP, dTTP e dCTP (Pharmacia), 1 ul de a³²p-dATP ou 1 ul de ãgua (0 dATP rádiomarcado foi adicionado ao tubo contendo o cADN da primeira fita não-marcado), 0,6 ul de 7 U/ul de ligase de ADN de E. coli (Boehringer-Mannheim), 3,1 ul de

U/ul ADN de polimerase I de ADN de E, coli (Amersham) e 1 ul de 2 U/ul de RNase H (BRL). As reacções foram incubadas a

16'C durante 2 horas. Depois da incubação, retiraram-se 3 ul de cada tubo reaccional para determinar as quantidades precipitáveis totais e de TCA. Analisaram-se dois microlitros de cada amostra por electroforese de gel alcalino para determinar a qualidade da síntese da segunda fita pela presença de uma fita com um comprimento de aproximadamente duas vezea a

fi:;

ι fi / fi

6:.l unidade de comprimento. Ao restante de cada amostra, adicionaram-se 2 ul de 2,5 ug/ul de glicogene de ostra, 5 ul de

EDTA 0,5 M e 200 ul de Tris-HCl 10 mM com um pH de 7,4, EDTA mM, as amostras foram extraídas com fenol-clorofórmio e precipitadas com isopropanol. Os ácidos nucleicos foram peletizados por centrifugação, lavados com etanol a 80% e secos ao ar, O rendimento do cADN de fita dupla, em cada uma das reacções, foi de aproximadamente 2 ug.

O ADN de fita única na estrutura fina foi cortado usando nuclease de feijão mung. Cada amostra de ADN da segunda fita foi novamente suspensa em 12 ul de ãgua. Foram adicionados a cada tubo dois microlitros de lOx de tampão de feijão mung (NaOAC 0,3 M, pH 4,6, NaCl 3 M, ZnSO₄.10 mM), 2 ul de ditiotreitol 10 mM, 2 ul de glicerol a 50% e 2 ul de 10 U/ul de nuclease de feijão mung (NEB, lote 7), e as reacções foram incubadas a 30‘C durante 30 minutos. Depois da incubação, adicionaram-se a cada tubo, 80 ul de Tris-HCl 10 mM, com um pH de 7,4, EDTA lmM e submeteram-se 2 ul de cada amostra a electroforese de gel alcalina, para determinar a clivagem do produto da segunda fita em cADN de unidade de comprimento.

Adicionaram-se cem microlitros de Tris-HCl 1 M, com um pH de

7,4, a cada amostra e as amostras foram extraídas duas vezes

com fenol-clorofórmio. A seguir à extraeção final do fenolclorofórmio, precipitou-se o ADN com isopropanol. Peletizou-se o ADN por centrifugação, lavou-se com etanol a 80% e secou-se ao ar. Obtiveram-se aproximadamente 2 ug de ADN, de cada reacção.

Cortou-se com o cADN com polimerase de ADN de T4, depois de os grânulos de cADN terem sido suspensos novamente em 12 jlí 1 de água. Adicionaram-se a cada tubo, dois microlitros de lOx tampão de polimerase da ADN de T4 (Tris-acetato 330 mM, pH 7,9, KAc 670 mM, MgAc 100 mM, 1 mg/ml de gelatina), 2 μΐ de dNTP 1 mM, 2 ul de ditiotreitol 50 mM e 2 ul de 1 U/ul de polimerase de ADN de T4 (Boehringer-Mannheim). Depois de uma incubação a 15’C durante 1 hora, adicionaram-se a cada amostra 180 yl de Tris-HCl 10 mM, com um pH 7,4 e EDTA 1 mM e extraíram-se as amostras com fenol-clorofórmio seguidas de precipitação com isopropanol. 0 cADN foi peletizado por centrifugação, lavado com etanol a 80% e seco ao ar. Ligaram-se os adaptadores Eco RI (Invitrogen, Cat. # N409-20) ao cADN enfraquecido depois de o ADN de cada reacção ter sido ressuspenso em 6,5 μΐ de água.

O primário da primeira fita codificava um local de clonação Sst I, para permitir que o cADN fosse direccionalmente clonado num vector de expressão. 0 cADN foi digerido com Sst I, seguido de extracção com fenol-clorofórmio e precipitação com isopropanol. Depois da cozedura, o cADN foi electroforesado num gel de agarose a 0,8% de baixa fusão, e o cADN acima de 4,2 kb foi electroeluído usando um Elutrap (Schleicher and Schuell, Keene, NH). O cADN electroeluído em

500 ul de tampão foi precipitado com isopropanol e o cADN foi peletizado por centrifugação. O grânulo de cADN foi lavado com etanol a 80%.

Estabeleceu-se uma biblioteca de cADN de cerebelo ligando o cADN ao pVGET' purificado com gel de agarose, digerido com Eco Rl-Sst I.

Construíram-se dez sub-bibliotecas de um milhão de clones, cada uma, representando uma biblioteca de dez milhões de clones independentes. Para preparar cada sub-biblioteca, ligaram-se 80 ng do vector linearizado a 40 ng de cADN.

Depois da incubação à temperatura ambiente durante 11 horas, adícionaram-se 2,5 yg de glicogene de ostra e 80 ul de Tris-HC1 10 mM, e EDTA lmM e extraiu-se a amostra com fenol-clorofórmio seguido de precipitação com etanol. Peletizou-se o ADN por centrifugação e lavou-se o grânulo de ADN com etanol a 80%. Depois de se secar ao ar, suspendeu-se nova-

mente o ADN em 3 ul de água. Adicionaram-se ao ADN trinta e sete microlitros de células DH10B de electroporação competentes (BRL) e completou-se a electroporação usando uma unidade de electroporação BioRad. Depois da electroporação, adicionaram-se às células 4 ml de SOC (Maníatis et al.) e espalharam-se 400 ul em cada uma das placas de ampicilina LB de 10-150 mm. Cada placa representava uma sub-biblioteca de

100.000 clones. Depois de uma incubação durante a noite, colheram-se as células adicionando 10 ml de meio de ampicilina LB a cada placa e rasparam-se as células para dentro do meio. Prepararam-se stocks de glicerol e de ADN de plasmídio, a partir de cada placa. Estabeleceu-se a finalidade da biblioteca (inserção sem vector) a cerca de 15%.

Detecção da actividade de GlugR a partir da biblioteca de cADN

O oócito Xenopus traduz de forma eficiente o mARN adicionado exogenamente. Foram efectuadas experiências preliminares usando o cADN do receptor muscarínico ml do ratinho (um receptor acoplado com proteína G que pode ser detectado por voltagem aos bornes) clonado com pVEGT'. A injecção de ARN transcrito in vitro a partir de diluições crescentes de ADN (í /!

• /·'<modelo ml, indicavam que a actividade induzida pelo agonista ml pode ser detectada para um clone numa piscina de tamanho

100.000. Placou-se uma sub-biblioteca de cerebelo em dez piscinas de 100.000 clones únicos.

As piscinas podiam também ser placadas em réplicas num filtro de nitrocelulose e deixaram-se desenvolver o original t

e a replica durante algumas horas. A placa original é raspada para colher todas as colónias. 0 ADN de plasmídio é preparado e purificado por ultracentrifugação do gradiente de cloreto de césio. 0 ADN de cada piscina é transcrito in vitro com polimerase de ARN T7, na presença de 7-metil-G, o nucleótido acabado, para aumentar a eficácia de translacção. As reacções da transcrição do ADN modelo são cravadas com a diluição de dois genes de controlo clonados em pVGET' : o gene ml do ratinho e uma versão segregada do gene da fosfatase alcalina da placenta humana (SEAP; Tate et al., Fed. Am. Soc. Exp.

Biol. 8: 227-231 (1990), que são aqui incorporadas por referência). A transcrição dos genes de controlo permitirá a selecção de oócitos que traduzam de forma mais eficaz o ARN injectado, e uma determinação de se os oócitos que são negativos para o Glu_GR são negativos verdadeiros, quer dizer, se ainda têm uma resposta provocada pelo agonista ml detectável.

ό

Purificou-se ο ADN de plasmídio a partir de cada uma das piscinas de 100.000 clones, que, no total, representavam uma sub-biblioteca de um milhão de clones da biblioteca de cADN do cerebelo, por ultracentrifugação do gradiente de cloreto de césio. 0 ADN foi transcrito in vitro com polimerase de ARN T7 (Pharmacia) na presença de nucleótido acabado * (GpppG, Pharmacia). A presença de uma sequência poli (A) e dois terminadores de polimerase T7 no pVEGT' resultou em ARN, com uma extremidade 5' acabada, a sequência da inserção cADN e caudas poli (A) 3'. Crê-se que o ARN acabado é necessário para a tradução eficaz em oócitos (Noma et al., Nature

319:640 ( 1986) e a sequência poli (A) foi mostrada para aumentar a síntese de uma proteína em oócitos, em mais de 40 vezes. Os tubos da reaccão de transcrição foram fixados adicionando 12 ul de 5x tampão de transcrição (Sratagene

Cloning Systems, La Jolla, CA), 3 ul de cada um de ATP 10 mM,

CTP, GTP e UTP, 6 ul de GpppG 10 mM (Pharmacia), 6 ul de 1 mg/ml de BSA, 3 ul de DTT 200 mM, 1.5 ul de 40 U/ul de RNasin (ProMega Biotech, Madison, WI), 8,5 ul de água, 10 ul de cADN contendo 5 a 10 ug de ADN, e 1 ul de 70 U/ul de polimerase de

ARN T7. Depois de se misturar, transferiram-se 10 ul da reacção para um tubo contenda 0,5 uCi de a P-UTP para determinar as contagens totais e as contagens incorporadas no ARN.

As amostras são incubadas a 37'C durante uma hora. 0 cADN nas amostras não marcadas foi degradado com a adição de 1 yl de

DTT 200 mM, 2 yl de 30 U/μΙ de RNase I e 0,5 yl de 40 U/yl

RNasin e continuou-se a incubação a 37*C, durante 15 minutos.

Adicionaram-se quarenta microlitros de água às reacções rádiomarcadas e removeu-se 1 yl de cada amostra e contou-se para determinar as contagens totais. 0 restante das amostras marcadas foi precipitado com etanol. Centrifugaram-se as amostras para recolher o ARN e contaram-se os grânulos de ARN para determinar as contagens incorporadas no ARN. Depois da reacção de degradação do ADN nas amostras não marcadas, adicionaram-se a cada amostra 70 yl de Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM e extrairam-se duas vezes as amostras com fenol-clorofórmio seguido de uma extracção com clorofórmio. Precipitou-se o ARN com etanol. Depois da centrifugação para recolher o ARN, lavaram-se os grânulos com etanol a 80%, seguidos pela secagem ao ar durante 10 minutos. Um rendimento típico do ARN não marcado foi de 20 a 30 yg. Suspendeu-se novamente o ARN não marcado a 2 yg/yl em pirocarbonato de dietilo (DEPC, Sigma), água tratada e armazenou-se a -70’C.

Antes da microinjecção em oócitos, descongelaram-se as amostras de ARN e centrifugaram-se num aparelho de microcentrifugação, durante 5 minutos, para remover quaisquer partículas que pudessem obstruir uma pipeta de microinjecção. Depois da centrifugação, removeu-se 80% de cada amostra e dividiu-se em dois tubos.

ARN de cada uma das 10 sub-bibliotecas foi injectado em oócitos, tal como acima descrito, e deixou-se processar a translacção durante quatro dias. A expressão da actividade do GlugR foi determinada por um ensaio de voltagem aos bornes, tal como acima descrito. Uma das dez sub-bibliotecas, a Z931,9, produziu um sinal com a administração de quisqualato ao oócito.

Subdivisão da piscina da biblioteca de cADN para se obter o clone de GlugR puro

Subdividiu-se a piscina de ADN (Z93-l,9) placando-se clones do stock de glicerol em placas de ampicilina LB. Para determinar o número de clones que deviam ser placados para a subdivisão da piscina de 100.000 clones, para identificar um clone positivo, foi usada a equação das probabilidades N = ln (1 - P)/ ln (1 - f) (Maniatis et al. , ibid.), em que P é a probabilidade desejada de, incluindo o clone de interesse, f .Λ ' //

I ' .¾ /0 ¢-, // £ , fafafa fa— ⁷ ίί é a fracção de clones positivos na piscina e N é o número de clones a serem placados para proporcionarem a probabilidade dada. Para uma probabilidade de 99,8%, de que uma piscina do tamanho de 100.000 contenha um clone positivo, deveriam ser placados 621.461 clones.

Placaram-se quarenta e oito placas de ampicilina LB de

150 mm com o stock de glicerol representando a piscina positiva de 100.000, 293-1,9, numa densidade de aproximadamente

14.000 clones por placa, para dar um total de 670.000 clones.

Depois de uma incubação durante a noite a 37'C, recolheram-se as bactérias em cada placa em 10 ml de Solution I (tal como descrita por Birnboim and Doly, Nuc ♦ Acids Res. 7:1513 (1979)), aqui incorporada por referência). Preparou-se um stock de glicerol a partir de uma porção das células, e preparou-se ADN de plasmidio a partir do resto das células.

Prepararam-se seis piscinas de ADN, cada uma representando oito das placas de ampicilina LB, combinando um décimo do ADN de plasmidio a partir de grupos de oito placas em cada uma das piscinas. O ADN de plasmidio destas seis piscinas foi purificado por centrifugação de gradiente de cloreto de césio. Transcreveu-se o ADN em ARN tal como se refere acima.

A transcrição do piscina original Z95-l,9 foi incluída como o

Μ

I-J '•'Λ controle positivo. Injectaram-se oócitos com o ARN e os ensaios de voltagem aos bornes nos oócitos identificaram a piscina Z99-25-32 como positiva para o GlUgR. A piscina Z99-25-32 continha ADN preparado das placas 25 a 32.

ADN de plasmidio das placas 25 a 32 foi ligado em bandas com cloreto de césio e transcritos em ARN, tal como se descreveu acima, juntamente com a piscina original positiva

Z99-25-32, Injectaram-se oócitos com ARN e os ensaios de voltagem aos bornes, levados a cabo tal como se descreveu acima, identificaram as piscinas Z104-25 e Zlll-32 como sendo fracamente positivas, a Z106-27 e a Z109-30 como medianamente positivas e a Z108-29 e a Z110-31 como as mais positivas. A piscina que resultou na Z110-31 foi escolhida para outra subdivisão.

A identificação das piscinas positivas a partir da subdivisão da piscina positiva de 14.000 (Z110-31) a partir do stock de glicerol não foi bem sucedida. Assim, o ADN de plasmidio preparado a partir da piscina resultante em Z110-31, foi electroporado em bactérias e placado em 60 placas numa densidade de 1.000 clones/placa. O ADN de plasmidio foi preparado a partir das bactérias colhidas de cada placa.

Misturaram-se aliquotas do ADN de plasmidio de cada placa, ii ^Γ para formar seis piscinas representando dez placas cada uma.

ADN de plasmídio foi ligado em bandas com cloreto de césio e o ARN foi transcrito tal como se descreveu acima. 0 ARN foi transcrito das piscinas Z108-29, Z110-31, e um cADN de receptor muscarínico, ml, para serem usados como controlos positivos. Injectou-se o ARN em oócitos,e levaram-se a cabo ensaios de voltagem, aos bornes tal como se descreveu acima. Os ensaios identificaram a piscina Z133-21 a 30 como positiva.

O ADN de plasmídio das placas 21 a 30 foi ligado em bandas com cloreto de césio e transcrito tal como se descreveu acima. O ARN transcrito e o ARN da piscina original Z133-21 a 30 foram injectados em oócitos e ensaiados tal como se descreveu acima. 0 ensaio voltagem aos bornes identificou a piscina Z142-22 como positiva.

A identificação de piscinas positivas pela subdivisão da piscina positiva Z142-22 a partir de um stock de glicerol provou não ser bem sucedida. A análise de restrição do ADN de plasmídio preparado a partir de clones seleccionados ao acaso das piscinas Z110-31 (a piscina de 14.000) e Z142-22 (a piscina de 1.000) indicou que 50% da piscina Z110 - 31 e 68% da piscina Z142 - 22 eram clones sem inserções.

Para determinar os métodos físicos de enriquecimento do

clone de GlugR e para estabelecer quantos clones da piscina Z142-22 necessitavam de ser ensaiados para incluir um clone de Glu_gR, electroforesou-se, num gel de agarose, ADN de plasmídio não-digerido da piscina Z142-22. Cortou-se a banda de super-élice representando o vector sem inserção e eluiu-se o restante ADN do gel. Electroporou-se depois o ADN em células de bactérias e placou-se em clones de densidades

3.400, 6.900 e 13.800 por placa. Placaram-se réplicas das placas e cultivaram-se durante a noite. Preparou-se ADN de plasmídio a partir das células colhidas das réplicas de cada placa. Transcreveu-se o ADN de plasmídio e ensaiou-se o ARN em oócitos, tal como se descreveu acima. Como controlo, cada piscina continha o equivalente a uma .colónia de ml, como controlo positivo interno. Adicionalmente, usou-se ml como um controlo positivo externo. Os ensaios de voltagem aos bornes identificeram o ADN da piscina de 6.900 clones (Z167-7) como (

positivo.

Os clones representados na placa de 6.900 clones, que resultaram na piscina positiva Z167-7, foram subdivididos por meio de placamento em réplicas da placa principal numa membrana de nylon Biodyne-A, numa placa de ampicilina LB. Incubou-se a placa de réplica durante quatro horas, a 37’C.

X---

Depois da incubação, prepararam-se sub-piscinas removendo a membrana da placa, tapando a membrana numa placa de vidro estéril, numa caixa clara e sobrepondo por cima da membrana uma grelha que dividia a membrana em 100 secções. As secções da grelha e a membrana que ficava por baixo foram depois cortadas com uma lâmina de barbear que tinha sido mergulhada em álcool e. queimada entre cada corte. Foram usados fórceps queimados, tratados com álcool, para transferir cada secção de membrana para um tubo de ensaio contendo 12,5 ml de meios de ampicilina LB. As culturas contendo a secção da membrana foram incubadas durante a noite a 37'C. Depois da incubação, misturou-se 0,5 ml de cada cultura com 0,5 ml de glicerol a

50% e armazenou-se a -70’C para estabelecer stocks de glicerol de cada sub-piscina. Foram colocados em piscina aliquotas de 100 culturas numa matriz 10 x 10 com amostras (1) a (10) na abcissa e amostras (a) a (j) na ordenada. Por exemplo, adicionou-se 1 ml de culturas (1) a (10) ao tubo 1 e adicionou-se 1 ml de culturas (1), (11), (21), (31), (41), (51), (61), (71), (81) e (91) ao tubo (a) e assim sucessivamente, até estarem completas 10 filas de 10 em 10 colunas contendo piscinas de dez culturas cada uma. Adicionaram-se a cada piscina, como controlo interno, dez microlitros de uma cultu-

/ ra nocturna contendo bactérias transformadas com ml. Preparou-se ADN de plasmídio a partir de 20 sub-piscinas e purificou-se o ADN por meio de centrifugação do gradiente de cloreto de césio. Transcreveu-se o ARN do ADN de plasmídio e ensaiou-se em oócitos, tal como se dsecreveu acima. Os controlos positivos foram o piscina^ original Z167-7 e o ARN ml puro. Os ensaios de voltagem aos bornes indicaram que apenas as piscinas Z175-1 e Z191-g eram positivas. Consultando a matriz, esta indicou que a secção da membrana número (7) continha o clone de G1u_gR.

Para subdividir os clones contidos na secção (7), aplicou-se um pedaço da membrana Biodyne A à placa principal contendo a secção (7), estendendo-se a membrana para lá da secção (7) cada lado, em metade da largura da secção (7).

Removeu-se a membrana da placa, aplicou-se a uma parte da colónia da placa de ampicilina LB fresca e incubou-se durante a noite a 37'C. Subdividiu-se a membrana tal como se descreveu acima com a região central da membrana, a área real da secção (7), dividiu-se em nove pequenos quadrados de tamanhos equivalentes e retirou-se a membrana em cada lado da secção (7) como quatro áreas adicionais. Foi usada cada secção da membrana para inocular uma cultura de líquidos de 10 ml.

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75.

Usaram-se bactérias transformadas com o clone ml como controlo interno em cada cultura, tal como se descreveu acima.

Depois de uma incubação durante a noite a 37’C, preparou-se

ADN de plasmídio e purif icou-swe o ADN por meio de centrifugação de gradiente de cloreto de césio. Transcreveu-se o ARN e ensaiou-se em oócitos tal como se descreveu acima, usando ARN de ml e a piscina original número (7) como controlos positivos. Descobriu-se actividade de GlugR apenas na piscina Z203-7 correspondente à secção da membrana número (7).

Subdividiu-se a piscina Z203-7 electroporando-se o ADN de plasmídio preparado da secção da membrana número (7) em células DH10B de electroporação competentes. Placaram-se os transformadores a uma densidade que permitia retirar colónias individuais. Retiraram-se clones individuais para uma placa principal e para dentro de 2ml de meio de ampicilina LB.

Incubaram-se as culturas durante a noite e preparou-se ADN de plasmídio pelo método essencialmente descrito por Holms e

Quigley (Anal. Bioc. 114: 193 (1981)). A análise de restrição sugeriu que os clones estavam agrupados em 7 classes de clones diferentes. ADN de plasmídio, preparado a partir de cada classe, representando um total de cinquenta clones, foi

preparado,transcreveu-se e ensaiou-se em oócitos tal como se descreveu acima. Contudo, nenhum dos clones foi positivo.

Para seleccionar clones positivos, electroporaram-se células DH10B E. coli de electroporação competentes, com o

ADN preparado da secção da membrana número (7) (Z203-7) e placaram-se em 180, 360 , 900 e 1800 colónias por placa.

Incubaram-se. as placas durante a noite e prepararam-se placas de réplica tal como se descreveu acima. Combinou-se o ADN de plasmídio preparado a partir de cada placa de réplica com 1 a

1000 partes de ml como controlo interno. Transcreveram-se as piscinas de ADN, o clone ml e a piscina original Z203-7, e ensaiou-se o ARN por meio de injecção de oócitos. A primeira transcrição e injecção não revelaram positivos, no entanto, depois da retranscrição e a reanálise, a piscina de clones

1800 (Z264-1800) foi positiva relativamente à actividade do G1u_gR.

Para subdividir a piscina positiva de 1800 (Z264-1800), todas as colónias da placa de 1800, 1528 no total, foram cada um retirados para duas placas de ágar de ampicilina LB de

100 mm, numa grelha de 100 colónias. Depois de uma cultura durante a noite, designou-se um conjunto de placas em duplicados como conjunto principal e colocou-se a 4‘C. O outro conjunto foi placado em réplica para um terceiro conjunto de placas. Depois da incubação durante a noite destas placas, as células nas placas de réplica foram colhidas para um meio e preparou-se ADN de plasmídio das células da piscina. Tal como se descreveu acima, incluiu-se um controlo de ml interno, em cada preparação de ADN. 0 ADN de, ml e o ADN original Z264-1800 foram usados como controlos positivos externos. Transcreveu-se o ADN de plasmídio preparado a partir das 16 placas e ensaiou-se o ARN em oócitos, tal como se descreveu acima.

Uma das piscinas de 100 clones, a Z256-I, produziu actividade de GlugR.

Para identificar qual dos clones dos 100 clones da Z256-I, produziu a actividade GlugR, construiu-se uma matriz 10 x 10 dos clones. Cultivou-se uma cultura líquida de cada clone.

Adicionou-se um mililitro de cada cultura a cada um dos dois tubos representando a fila apropriada e a coluna da matriz 10 x 10. Tal como se descreveu anteriormente, usou-se, como controlo interna positivo, ADN de plasmídio codificando o ml.

Transcreveram-se o ADN de plasmídio preparado a partir de cada tubo, ADN de ml e ADN da piscina original Z264-1800 e ensaiaram-se em oócitos, tal como se descreveu acima. A actividade de GlugR foi identificada apenas na fila (5) e na

/'', Ί Λ ' 78 J coluna (e). Deste modo, o clone positivo número 45 foi identificado como contendo a actividade de Glu_GR.

Para confirmar o resultado, preparou-se ADN de plasmídio a partir do clone #45, transcreveu-se e ensaiou-se em oócitos, tal como se descreveu acima. Os resultados do ensaio indicaram que o clone #45 era capaz de produzir actividade de GlUgR. A Figura 2 ilustra os dados retirados dos registos de voltagem aos bornes em vários estádios, no sub-fraccionamento da biblioteca do cerebelo. 0 painel (a) é uma resposta registada ao quisqualato de um oócito previamente injectado com

ARN transcrito in vitro a partir de uma sub-biblioteca do cerebelo do rato, de 100.000 colónias independentes; o painel (b) mostra a resposta ao quisqualato numa célula previamente injectada com ARN transcrito a partir de uma piscina sub-fraccionada de 14.000 colónias. A corrente de pico foi truncada pelo registador do gráfico, mas a corrente de pico real (avaliada a partir de um metro do painel digital) era de aproximadamente 1300 nA. 0 painel (c) mostra a resposta ao quisqualato numa célula injectada com ARN de GlUgR puro, do clone 45-A. A quantidade de ARN injectado por oócito foi de aproximadamente 100 ng, excepto no painel (c) em que a quantidade de ARN foi de 50 pg.

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Ο seguinte descreve um meio alternativo para a subdivisão e selecção de uma piscina positiva. Trabalhar com inserções de cADN num vector à base de plasmídio, e não num vector à base de lambda, influencia o protocolo de sub-fraccionamento. Uma vez identificada uma piscina positiva, é sobreposto o filtro de réplica com outro filtro de nitrocelulose estéril. 0 filtro é cortado em 88 pedaços, usando cortes com espaços iguais de 10 filas e 10 colunas, para formar uma grelha. Cada um dos 88 pedaços é transferido para 10 ml de LB +Amp estéril e cultivado durante várias horas. Formam-se 20 piscinas; C 1-10 {correspondente ao número da coluna) e R 1-10 (correspondente ao número da fila). Pipeta-se em dois tubos, uma aliquota de cada uma das 88 sub-fracções, correspondendo à sua posição numa fila e numa coluna. Isola-se o

ADN das 20 piscinas, purifica-se em gradientes de CsCl e transcreve-se numa reacção in vitro que inclui o ml de controlo e os plasmidos SEAP. Depois da injecção nos oócitos e do registo de voltagem aos bornes, ficam 2 piscinas positivas, apontando a localização de 1 das 88 sub-fracções originais.

Uma vez que o clone positivo faz ainda parte de uma piscina, tem de ser ainda subdividido. É usada a equação das probabilidades, descrita acima, para determinar o número de clones a serem placados para a próxima subdivisão da piscina.

stock de glicerol da piscina positiva é placado em, e.g.,

3.000, 6.000 e 18.000 clones por placa. Depois do placamento da réplica, colhe-se o ADN, transcreve-se, injecta-se e ensaia-se. A piscina que é positiva é subdividida numa grelha de 88, tal çomo se descreveu acima. Repete-se o ensaio, sendo positivo apenas um único quadrado da grelha. Na fase seguinte da subdivisão da piscina, retiram-se 100 colónias individuais para uma placa, placam-se em réplicas, e fazem-se 20 piscinas para transcrição e ensaio. Os clones positivos são retirados, são retiradas várias colónias e a restrição é anotada em mapa e preparados o modelo e o transcrito para injecção e ensaio.

Caracterização de Glu^R

Para estabelecer que o Glu^R codificado pelo clone 45-A se acopla com proteína G, transcreveu-se o ARN de GlUgR do clone 45-A e injectou-se em oócitos, tal como se descreveu acima. Dois dias depois da injecção, dividiram-se os oócitos em grupos de controlo e grupos tratados com toxinas. Os oócitos nos grupos tratados com toxinas foram tratados com uma concentração final de 4 ug/ml de toxina da tosse convulsa

B. (List Biological Laboratories Inc., Campbell, CA) e incubaram-se ambos os grupos durante 24 horas, a 19'C, tal como descrito por Sugiyama et al., Nature 325:531 (1987) e Moriarity et al., J. Biol. Chem. 264:13521 (1989), ambos os quais são aqui incorporados por referência. Os oócitos de ambos os grupos de controlo e tratados com,toxinas foram submetidos a ensaios de voltagem aos bornes tal como se descreveu anteriormente. Num exemplo, os oócitos aspergidos tal como se descreveu anteriormente com 100 μΜ de ácido L-glutâmico mostraram uma corrente média induzida pelo ácido L-glutâmico de 264,2 nA + /- 73 nA nos oócitos de controlo (SEM, n=6) e

57,7 nA +/- 19 nA (n=9) nos oócitos tratados com toxinas. A corrente média da membrana no grupo tratado com toxinas foi significativamente mais pequena (p<0,01) do que no grupo de controlo sugerindo que os oócitos injectados com ARN 45-A se acoplaram com uma proteína G sensível à toxina de tosse convulsa.

Foram aplicados aos oócitos que tinham sido injectados com ARN transcrito do clone 45-A, ácido L-glutâmico e alguns dos seus derivados estruturais que são conhecidos por activarem as correntes de GlugR de uma forma dependente da dose.

Transcreveu-se ARN e prepararam-se oócitos e injectaram-se, tal como se descreveu anteriormente. Mediram-se as respostas dependentes da dose usando ensaios de voltagem aos bornes, que foram levados a cabo na presença de concentrações crescentes de ácido L-glutâmico (Sigma), ácido quisquálico (Sigma), ácido iboténico (Sigma), ou ácido trans-l-amino-ciclopentil-1,3-dicarboxílico (tACPD; Tocris Neuramin,

Essex, Inglaterra). Aspergiram-se quatro ou cinco oócitos separados com concentrações crescentes de um fármaco particular, com espaços de 30 minutos entre aplicações consecutivas do fármaco, para minimizar qualquer interferência de dessensibilização. As respostas foram normalizadas para uma resposta subsequente a 100 yM de ácido L-glutâmico. Os dados foram analisados usando a equação seguinte:

(Corrente fraccionada) = (Dose¹¹)/(Dose¹¹) + (ΟΕ^θ)¹¹, em que:

Dose = uma dose de fármaco normalizada para a requerida por uma aplicação subsequente de 100 nM de ácido L-glutâmico;

Corrente fraccionada = a corrente de pico definida por uma dose, tal como se definiu acima;

CEgg = concentração efectiva que requere uma resposta de

50¾ (uma medida da potência de um agonista); e n = coeficiente de Hill, uma medida da capacidade de

/.

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cooperação da reacção.

Usando esta equação, determinou-se a concentração efectiva a uma estimulação de 50% em relação a 100 mM de ácido L-glutâmico, para cada experiência de resposta em relação à dose. A Figura 6 mostra uma curva de resposta à dose representativa, para concentrações variadas de ácido L-glutâmico.

As séries de, potência dos análogos de glutamato e das suas CEgθ^fs associadas, estão referidas na Tabela 2.

Tabela 2

Potências Análogas ao Glutamato (CE_5Q)

Ácido	quisquálico	0,681	UM
Acido	L-glutâmico	12,32	iíM
Acido	iboténico	32,37	uM
tACPD		376 uM

Adicionalmente, expuseram-se oócitos aos seguintes análogos de ácido L-glutâmico: ácido aspártico (Tocris Neuramin), ácido caínico, ácido N-metil-D-aspártico (NMDA; Sigma), ácido 2-amino-4-fosfonobutírico (APB; Sigma), ácido a-amino-3-hidróxi-5-metil-isoxazol-4-propiónico (AMPA; Research Biochemicals Inc., Wayland, MA) em concentrações de r\ h' i; r í _ i - / i:

U saturação e as respostas foram, cada uma, normalizada para uma resposta subsequente para 100 uM de L-glutamato. Os análogos do ácido L-glutâmico que se descobriu não serem eficazes, foram o ácido aspártico 1 mM, ácido caínico 1 mM, NMDA

100 yM + glicina 10 μΜ, APB 100 uM e AMPA 100 yM.

Foram também levados a cabo ensaios de voltagem aos bornes em oócitos injectados para medir a inibição pelo antagonista do receptor do glutamato acoplado com proteína G hipotético, do ácido 2-amino-3-fosfonopropiónico (AP3). Os ensaios de voltagem aos bornes mostraram que a 1 mM, o DL-AP3 (Sigma) reduziu a corrente requerida por 10 uM de ácido glutâmico para 59,3 +/- 7,3% do controlo.

Listaram-se células do clone 45, em placas Amp LB e retiraram-se várias colónias, cultivaram-se e isolou-se o

ADN. Preparou-se ADN 45-A puro e delineou-se num mapa a restrição por processos conhecidos. 0 clone 45-A foi depositado na American Type Culture Collection, 12301 Parklawn

Drive, Rockville, MD, 20852, sob a referência de Acesso ATCC

N^s 68497. Digeriu-se o ADN com uma ou múltiplas enzimas.

Separaram-se os fragmentos em geles de agarose a 1% e geles de Nusieve a 4%, por meio de electroforese. Depois da electroforese, o ADN foi transferido para filtros de nitrocelu-

lose usando protocolos conhecidos para a transferência de

Southern. Delinearam-se num mapa os locais de restrição com base no tamanho e com base na hibridização para sub-clones

Pst I de ADN 45-A. Adicionalmente, toda a inserção de cADN

45-A pode ser isolada por digestão com endonuclease de restrição Not I. A inserção Not I foi quinasada com τ- P

ATP, e depois da digestão de metade da amostra com Bam HI para remover a marca 3', ambas as amostras foram submetidas a digestão com um número de enzimas que se conhecia estar presente uma vez na inserção. Desta maneira podiam ser localizados os sítios únicos. Mostra-se na Figura 3 um mapa de restrição do clone 45-A de GlugR.

Todo o clone 45-A foi sequênciado em ambas as direcções usando o método de terminação em cadeia de dideoxinucleótido (Sanger and Coulson, J. Mol. Biol. 94:441 (1975), aqui incorporado por referência). A figura 5 mostra a sequência de ADN e a sequência de aminoácido deduzida do clone 45-A. A Figura mostra também a localização dos locais de glicosilação ligados ao N hipotéticos, que se previu ocorrerem na sequência de aminoácido Asn-X-Thr.

Tal como se mostra na Figura 5, previram-se sete domínios hipotéticos de transmembrana da sequência de

aminoácido deduzida do clone 45-A, usando o método descrito por Eisenberg et al. J. Mol. Biol. 179:125-142, (1984), aqui incorporado por referência. Foram apenas incluídos aqueles domínios que se previram como sendo domínios multiméricos de transmembranas. Foi previsto um domínio de transmembrana adicional (o terceiro) usando o método de Hopp e Woods, Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 78:3824-3838 (1981). Com base nestas previsões, a proteína codificada pelo clone 45-A parece ter dois domínios não usualmente de grandes dimensões nos términos amino e carbóxi, que não se encontram em qualquer dos outros receptores acoplados com proteína G referidos, que têm a característica estrutural comum de sete regiões distanciadas da membrana prevista. A análise da sequência de aminoácido deduzida do clone 45-A prognostica três outras extensões hidrofóbicas, incluindo uma no terminal amino da sequência. Esta dilatação hidrofóbica do terminal amino pode ser uma sequência de sinal, embora não seja previsto qualquer lugar de clivagem de sinal para baixo da sequência.

Isolou-se poli (A)+ ARN do cérebro total de rato e do cerebelo de rato usando cromatografia de oligo d(T) celulose, tal como descrito por Aviv e Leder (ibid.). Adquiriram-se da

Clonetech poli (A)+ ARN da retina de rato, do coração do rato, do pulmão do rato, de fígado do rato, do rim do rato, do baço do rato, dos testículos do rato, do ovário do rato e do pâncreas do rato. Analisaram-se as amostras de poli (A)+

ARN por análise de northern (Thomas, Proc. Natl. Acad. Scí.

USA 77:5201-5205 (1980), que aqui é incorporada por referência). Desnaturou-se o ARN em glioxal, electroforesou-se em agarose e transferiu-se para uma membrana de nitrocelulose essencialmente tal como descrita por Thomas (ibid.). Hibridizou-se a mancha de northern com um fragmento 3473 bp Eco RI-Xba I rádiomarcado do clone 45-A. A autoradiografia da mancha mostrou a hibridização numa banda maior, de aproximadamente 7 kb, e uma banda mais pequena, de aproximadamente

3.8 kb, no cérebro total do rato e no ARN do cerebelo do rato.

Sintetisou-se cADN de fita única usando 1 ug do poli (A) + ARN usando transcriptase inversa de Superscript (BRL) nas condições descritas pelo fabricante. Foi usado um quarto do cADN como modelo para a amplificação do PCR usando 40 pmoles de cada um dos primários específicos de Glu_GR ZC3652 (Tabela 1) e ZC3654 (Tabela 1) e 2,5 U de polimerase Taq I (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, VA) e as condições especificadas pelo fabricante. Como controlo interno, a reaeção de PCR

continha também 2 pmoles de cada um dos primários de glucose-6-fosfato específicos de dehidrogenase ZC3015 (Tabela 1) e

ZC3016 (Tabela 1). Depois de trinta ciclos (um minuto a 94'C, um minuto a 60‘C, noventa segundos a 72’C), extrairam-se as amostras com fenol-clorofórmio e electroforesou-se 20% de cada reacção em agarose. O ADN foi direccionalmente transferido duas vezes para membranas de nitrocelulose e os filtros foram hibridizados com qualquer dos ZC3652, ZC 3654, ZC3015 e

ZC3016 radiomarcados ou com o fragmento Eco Rl-Xba I radiomarcado do clone 45-A, acima descrito. A autorádiografia da mancha hibrídizada mostrou que a transcrição de Glu^R se confinava principalmente ao cérebro total do rato e ao cerebelo do rato; contudo, exposições mais longas mostraram uma transcrição específica de Glu^R na retina e nos testículos.

Preparou-se ARN total, tal como se descreveu acima, a partir de regiões específicas do cérebro do rato, incluindo o córtex frontal, o cerebelo, o hipocampos, o córtex, o estriato, medula pons e o restante do cérebro. Sintetizou-se cADN de fita-única, tal como se descreveu anteriormente, usando 20 ug de ARN total em 50 ul usando transcriptase inversa de

Superscript (BRL), em condições descritas pelo fabricante.

Depois de uma hora de incubação a 42‘C, tratarm-se as amostras com ARNse (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN), extraíram-se com fenol-clorofórmio e precipitaram-se com etanol, Suspenderam-se novamente as amostras em água e submeteu-se metade de cada uma das amostras a amplificação com PCR. Cada amplificação de PCR continha 40 pmoles de cada um dos primários específicos de Glu_GR, ZC3652 e ZC 3654, acima descritos, 2 pmoles de cada um dos primários ZC3015 e

ZC3016 de glucose-6-fosfato específico de dehidrogenase, e

2,5 U de polimerase Taq I (Perkin Elmer Cetus) e as condições descritas pelo fabricante. Depois de 35 ciclos (um minuto a

94*C, um minuto a 60’C, noventa segundos a 72'C), as amostras foram extraídas com fenol-clorofórmio, e electroforesou-se

20% de cada reacção em agarose. Transferiu-se o ADN para uma membrana de nitrocelulose e hibridizou-se o filtro com o fragmento Eco Rl-Xba I rádio-marcado do clone 45-A acima descrito. A auto-radiografia das manchas hibridizadas mostraram uma distribuição larga da transcrição de GlugR ao longo do cérebro, embora o córtex frontal e o cerebelo apareçam algo enriquecidos.

A análise de Southern do ADN genómico humano e do rato foi levada a cabo usando o método essencialmente descrito por

Blin et al. (Nuc♦ Acids Res. 3:2303 (1976), que aqui é incorporado por referência). Resumindo, preparou-se ADN genómico do rato e humano a partir da linha de células do rato UMR 106 (ATCC CRL 1661) e de uma linha de células do hepatoma humano (ATCC HTB 52), respectivamente. Digeriu-se o ADN genómico com

Eco RI ou com Pst I e electroforesou-se por meio de agarose.

Transferiu-se o ADN para uma membrana de nitrocelulose e hibridizou-se a membrana com um fragmento de Pst I, 1,6 kb rádio-marcado do clone 45-A. A auto-radiografia da mancha hibridizada sugere que o gene humano tem uma sequência semelhante à sequência de Glu_GR do rato, o gene de G1u_gR contem pelo menos um intron, e que existe um pequeno número de genes intimamente relacionados.

Expressão em Células de Mamíferos

Removeu-se toda a inserção de cADN de Glu^R do vector de clonação pVEGT' pela digestão com Not I e Xba I. Cortaram-se as extremidades com ADN polimerase I (fragmento de Klenow) e dNTP's, e depois ligaram-se com ligantes Eco RI (Smart).

Depois da ligação do ligante, quinasou-se a inserção com extremidades Eco RI e ligou-se ao corte Eco RI e tampou-se o vector de expressão Zem 228. Transformaram-se as bactérias com a reacção de ligação e caracterizaram-se os clones por í Ζ>

-è::

análise de restrição e sequenciamento parcial (veja-se Fig.

4).

Serviram como células hospedeiras para a expressão, células de mamíferos cultivadas, tais como BHK 570 e BHK tsl3. Precipitaram-se vinte e cinco ug de ADN purificado com

CsCl com fosfato de cálcio e adicionou-se às células do tecido de cultura numa placa de 150 mm. Depois de 4 horas, submeteram-se as células a um choque com glicerol e depois colocaram-se num meio não-selectivo. Nalguns casos pode ser necessário incluir um antagonista ao GlugR no meio, para impedir a expressão de uma resposta citotóxica nas células em que o GlugR é expresso em níveis suficientemente elevados para causar uma certa quantidade de auto-activação. Transitoriamente expressa a actividade de ligação do ligando de GlugR ou a activação de PLC, as células são colhidas 48 horas depois. Detectou-se uma expressão estável depois de duas semanas de selecção. 0 vector de expressão Zem228 inclui um promotor capaz de dirigir a transcrição do gene GlugR e um marcador seleccionável para o gene bacteriano de resistência à neomicina. Usou-se resistência ã droga G-418, um inibidor da síntese de proteína para identificar os clones estavelmente transfectados. A presença da região SV40 ori no vector permite que a construção da expressão seja também usada para a expressão transitória. Nalguns casos, foi preferível incluir ADN para outro marcador seleccionável, o gene DHFR, no protocolo de transfecção. A selecção com o G-418 e o metotrexato permitiu o isolamento dos clones cuja expressão de GlUgR pode ser subsequentemente ^amplificada pela adição de concentrações cada vez maiores de metotrexato ao meio de cultura.

Identificaram-se as linhas de células transfectadas expressando o GlugR através da ligação de H-glutamato a preparações de membranas das células transfectadas. São usadas linhas de células que expressem níveis baixos a moderadas de GlugR para estabelecer os ensaios de varrimento funcionais.

Placaram-se clones de células BHK 570 e BHK TK tsl3 expressando o cADN do receptor de glutamato acoplado com proteína G do rato, em dois ou três pratos de cultura de placas máximas de 150 mm e cultivaram-se até à confluência.

Rasparam-se as células de cada placa para dentro de 5 ml de

PBS (solução salina tamponada de fosfato, Sigma Chemical Co.,

St. Louis, MO), que foi arrefecida previamente para 4’C.

Removeram-se as células para um tubo centrifugado arrefecido e as placas foram, cada uma delas, enxaguadas com 5 ml de PBS arrefecido e colocadas numa piscina com as células. Fizeram-se rodar os tubos arrefecidos a 1.000 rpm, durante dois minutos, e descartou-se o sobrenadante. Congelaram-se as células ou a -70‘C ou em gelo seco. Nalguns casos, deixaram-se as células durante a noite a -70’C. Congelaram-se as células em gelo e suspenderam-se novamente em 10 ml de um tampão contendo Tris 30 mM, pH 7,0, CaC^ 2,5 mM, PMSF 1 mM, que foi arrefecido previamente para 4’C, homogenizando as células durante cerca de 15 segundos. Vazou-se a suspensão para dentro de tubos de centrifugação arrefecidos. Enxaguou-se o homogenizador com 10 ml da mesma solução arrefecida e combinou-se o produto do enxaguamento com a suspensão. Fizeram-se rodar os tubos de centrifugação durante quinze minutos, a 40.000 x g a 4'C, e descartou-se o sobrenadante.

Homogeneizou-se o grânulo com um tampão contendo Tris 30 mM, pH 7,0, CaCl₂ 2,5 mM, que foi previamente arrefecido a 4’C. Enxaguou-se o homogenizador com o tampão arrefecido e combinou-se o produto do enxaguamento com o homogenado. Fez-se rodar o homogenado tal como se descreveu acima. Repetiu-se a segunda homogenização no grânulo resultante. Suspendeu-se novamente o grânulo final entre dois e cinco mililitros de ο

J‘ζ

/'ι

Tris 30 mM, pH 7,0, CaCl^ 2,5 mM, que foi arrefecido previamente para 4’C. Prepararam-se amostras em triplicado para cada maior e menor ponto de ensaio de quisqualato, de tal forma que fossem adicionados 250 ul de aliquotas de cada uma das amostras de homogenado aos reservatórios de uma placa de micro-titração de 96 reservatórios. A um tampão contendo Tris 30 mM, pH 7,0, CaC^ 2,5 mM, que foi arrefecido previamente para 4’C, adicionou-se uma concentração final de ácido glutãmico tritiado 10 nM e dividiu-se a solução em dois. A uma metade, adicionou-se quisqualato ate uma concentração final de 1 mM. Às amostras em triplicado adicionaram-se duzentas e cinquenta microlitros de aliquotas ou de Tris 30 mM, pH 7,0, CaCl.2 2,5 mM, ãcido glutãmico tritiado 5 nM e quisqualato 500 mM, ou de Tris 30 mM, pH 7,0, CaC^ 2,5 mM e ácido glutãmico triatiado 5 nM. Incubaram-se as amostras durante trinta minutos, à temperatura ambiente. Colheram-se as amostras para filtros de vidro e lavaram-se imediatamente com Tris 30 mM gelado, pH 7,0, CaC^ 2,5 mM, sob vácuo, usando uma colhedeira de células automatizada LKB 1295-001 (Pharmacia LKB, Piscataway, NJ) . Secaram-se os filtros num forno micro-ondas e contaram-se num contador gama.

Levaram-se a cabo as determinações das proteínas usando ο

um ensaio à base de Coomassie Blue, da Pierce Chemical Company (Rockford, IL), em condições estabelecidas pelo fabricante. Adicionaram-se 100 microlitros de homogenado de células não diluído ou BSA padrão, a 2 ml do reagente e mediu-se a densidade óptica a 595 nm. Retiraram-se as concentrações de proteínas das amostras a partir de uma curva padrão gerada usando os padrões BSA diluídos em Tris 30 mM, pH 7,0, CaCl₂ 2,5 mM.

Os resultados destes ensaios mostraram que o quisqualato foi capaz de ligar competitivamente o receptor de glutamato expresso pelas células BHK transfectadas.

Varrimento funcional de agonistas e antagonistas

Placam-se células BHK 570 que expressam Glu_GR ou células BHK 570 simuladamente transfectadas em pratos de cultura de tecido de 24 reservatórios com cerca de 100.000 células por reservatório. Depois de 24 horas, marcam-se as células com 0,2 yCi de inositol mio-(2-³H) (actividade especifica - 20 Ci/mmol; New England Nuclear,) por reservatório. Ao fim de 24 a 48 horas de incubação, lavam-se as células com DMEM previamente aquecido (Dulbecco's Modified Eagles Médium; Produto N^s

51-432, JRH Biosciences, Lenexa, KS) que foi tamponado para

T3EÍ .3 um pH de 7,4, com tampão de Hepea (Sigma Chemical Co.) contendo LiCl 10 mM e incubam-se durante cinco minutos a 37’.

Adicionam-se então as drogas seleccionadas e incubam-se as células durante mais trinta minutos a 37‘C. Pára-se a reacção colocando as células em gelo e as células são lasadas por aspiração do meio e adicionando 0,5 ml de DMEM frio e 0,5 ml de ãcido perclórico a 10% gelado. Dez minutos depois, o lisato de células é transferido para um tubo em gelo contendo

250 ul de EDTA 10 mM, pH 7,0. As amostras são neutralizadas com 325 ul de KOH 1,5 M em Tampão de Hepes 60 mM. Depois de os precipitados repousarem, aplica-se 1,0 ml do sobrenadante a uma mini-coluna de Amprep (Amersham, Arlington Heights, IL,

RPN1908). Eluem-se os fosfatos de inositol de coluna e contam-se as amostras num contador de cintilação. Uma resposta positiva é indicada por um aumento dos níveis marcados de fosfato de inositol.

EXEMPLO II

Selecção de sub-tipos adicionais de receptores de crlutamato

Isolaram-se sub-tipos adicionais de receptores de glutamato usando amostras derivadas do clone 45-A. Isolaram-se sub-tipos de receptores de glutamato a partir de uma biblioteca de cADN total do cérebro do rato em Lambda Zap II, que foi seleccionada pelo tamanho relativamente a inserções de 3 kb antes da ligação (preparada para Terry Snutch, Ph.D.,

University of British Columbia, Vancouver, British Columbia,

Canada por Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) e uma biblioteca de cADN do cerebelo do rato em Lambda Zap II, que foi seleccionada pelo tamanho para inserções 3 kb antes da ligação (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA).

A biblioteca total do cérebro do rato e a biblioteca do cerebelo do rato foram placadas com células E. coli XL-1 em placas de ágar NZY (Tabela 3) para se obterem aproximadamente placas 2,1 x 10⁶. Digeriu-se o clone 45-A que codifica o sub-tipo la, com Pst I para isolar os fragmentos 1,3 e 1,6 kb.

Os fragmentos 45-A Pst I foram marcados por impressão ao acaso usando o conjunto de impressão ao acaso de Amersham (Amersham, Arlington Hts, II). Prepararam-se suspensões em duplicado a partir das placas e hibridizaram-se os filtros com as amostras em formamida a 50% a 37’C. Depois de uma hibridização durante a noite, lavaram-se os filtros em 2x SSC + SDS a 0,1% a 50’C. Isolaram-se placas positivas através de várias séries de plaqueamento de diluição e repetiu-se a selecção com as amostras impressas ao acaso.

Tabela 3

Agar NZY

A 950 ml de água desionizada, adicionam-se:

g NZ amina: Solução enzimática de hidrolisado de caseína (ICN Biochemicals) g NaCl g extracto bacteriológico de fermento g casamino ácidos g MgSO₄ * 7H₂O

Agita-se até se terem dissolvido os solutos, ajusta-se para um pH de 7,0 com NaOH 5 N (aproximadamente 0,2 ml). Ajusta-se o volume da solução para 1 litro com H₂0 desionizado. Esteriliza-se aquecendo em autoclave durante 20 minutos.

20x SSC

Dissolvem-se 175,3 g de NaCl e 88,2 g de citrato de sódio em 800 ml de H₂0. Ajusta-se o pH para 7,0 com algumas gotas de NaOH 10 N. Ajusta-se o volume para 1 litro com H₂0. Esteriliza-se por meio de autoclave.

ο

F' h/f í lí

Preparou-se ADN de plasmídio a partir de placas positivas usando o sistema de Bluescript (Stratagene Cloning Systems). Submeteu-se o ADN de plasmídio a análise de restrição e análise da mancha de Southern (Sambrook et al., ibid., que aqui é incorporado por referência) . Foram identificados dois clones, SN23, derivado da biblioteca total do cérebro do rato, e o SR2, derivado da biblioteca do cerebelo do rato, como sendo diferentes do clone 45-A e sequenciaram-se. A análise de sequência revelou que aqueles representavam dois sub-tipos adicionais. 0 SN23 codifica o sub-tipo lb, que contem um exon adicional de 85 bp que codifica uma nova extensão de aminoácidos e um codon de paragem no domínio intracelular, e é mais pequeno em 292 aminoácidos do, que o clone 45-A. A sequência de nucleótido e a sequência deduzida de aminoácidos do clone SN23 são mostradas na Fig. 7. Descobriu-se que o SR2 contem uma sequência de cADN parcial que codifica o sub-tipo

2a, que é uma nova sequência que partilha uma homologia de

42% com os domínios da transmembrana e o domínio extracelular do clone 45-A.

Obteve-se um clone completo do sub-tipo 2a por nova selecção de ambas as bibliotecas, tal como se descreveu acima, com o fragmento Pst I 1,3 kb radiomarcado do clone 45ο

Ί//

'100

-Α e um fragmento Eco RI-Pvu II 1,4 kb radiomarcado do SR2.

Obtiveram-se dois clones adicionais. 0 SN30, derivado da biblioteca total do cérebro do rato, continha toda a sequência de codificação do sub-tipo 2a. A sequência do nucleótido e a sequência deduzida de aminoácidos do clone

SN30 são mostradas na Fig. 8. 0 SR13, derivado da biblioteca do cerebelo do rato, continha uma sequência imcompleta de um novo sub-tipo de receptor, 2b. A análise de sequência do SR13 mostrou que a sequência de codificação era incompleta na extremidade 3' e que era virtualmente idêntica à sequência

SN30, com excepção de conter um par de anulação base 610, dentro da extremidade 3' do SN30. A sequência ADN da inserção cADN no clone SR13 é mostrada na Figura 9.

A extremidade 3' completa do clone sub-tipo 2a foi gerada usando a amplificação PCR e um oligonucleótido contendo uma sequência única para o SR13 {ZC4520, Tabela 4) e um oligonucleótido correspondente à sequência próxima da extremidade 3' e da região 3' não traduzida do SN30 (ZC4519, Tabela 4).

Preparou-se ADN de lisatos da placa do placamento original de cada biblioteca. Cada placa produziu uma piscina de clones.

Para as reacções PCR, combinaram-se dois nanogramas de cada biblioteca e 100 pmol de cada oligonucleótido num volume reaccional de 50 ul contendo KCl 50 mM, Tris-HCL 10 mM pH

9,0, MgCl₂ 1,5 mM, Triton X-100 a 0,1%, gelatina a 0,01%, 0,2 mM de cada um de trifosfato de deoxinucleótido e 2,5 unidades de Thermua aquaticua (Tag) ADN polimerase (Promega Corporation, Madison, WI). Revestiu-se a mistura reaccional com óleo mineral. Depois de cinco ciclos (30 segundos a 94'C, 30 segundos a 4.5*C, 1 minuto a 50'C) e vinte e cinco ciclos (30 segundos a 94’C, 30 segundos a 45’C, 1 minuto a 72’C) removeu-se o ADN amplificado para análise.

Tabela 4

Sequências Primárias de Oligonucleótido Degenerado (5' - 3')

ZC4519

TTT ATT AGA AAT GTT CTC GGT

ZC4520

CCT CTT CCA TAT TTT TCC ATT

ZC4559

ATA AGA ATT CAT NKR YTT NGC YTC RTT RAA

ZC4560

ATA AGA ATT CTT YRA YGA RAA NGG NGA YGC

ZC4561

ATA AGA ATT CGC NGG NAT HTT YYT NKG NTA

ZC4562

ATA AGA ATT CTA NCM NAR RAA DAT NCC NGC

ZC4563

ATA AGA AAT CAN GTN GTR TAC ATN GTR AA

102

Electroforesou-se uma alíquota de cada reacção em agarose e transferiu-se para nitrocelulose por análise de Southern. A análise de Southern dos produtos PCR mostraram que se encontrava presente em várias piscinas um fragmento 460 bp correspondente à extremidade 3' da sequência 2b. Uma das piscinas que produziu o produto,PCR com o tamanho correcto codificando, a sequência 3' do sub-tipo 2b foi diluída e varrida com ZC4519 e ZC4520 rádio-marcados (Tabela 4). Retira-se a fage que hibridiza as ZC4519 e ZC4520 radiomarcadas, elui-se, dilui-se, plaqueia-se e varre-se novamente com as amostras de oligonucleótido. A selecção é repetida até se obter um clone puro. 0 clone puro e sequenciado e construído um clone de comprimento completo, usando a(s) enzima(s) de restrição mais convenientes.

Com base num alinhamento das sequências de amino-ácido deduzidas dos sub-tipos la e 2a, elaboraram-se estratégias para a clonação de sub-tipos adicionais, usando amplificação

PCR. Preparam-se famílias de oligonucleótido degenaradas para codificar as sequências de amino-ácido conservadas no sexto domínio da transmembrana, uma região que circunda a sequência de amino-ácido conservada Phe-Asp-Glu-Lys, o terceiro elo citoplásmico e o segundo domínio da transmembrana (Tabela 4).

. 103 ίΖ

Amplificaram-se as sequências de cADN do receptor de glutamato com pares de primários degenerados da Tabela 4 usando o método PCR em cADN a partir da biblioteca total do cérebro do rato, de cADN da biblioteca do cerebelo de rato, uma biblioteca de cADN do córtex do rato ou uma biblioteca de cADN do hipocampus do rato (ambas obtidas da Michael Brownstein, National Institutes of Health, Bethesda, MD). Os primários continham também cada um, uma cauda 5' de 10 nucleótidos, que proporcionavam locais de enzimas de restrição convenientes. Para cada reacção de PCR, combinaram-se 10 nanogramas da biblioteca e 100 pmol das piscinas de oligonucleótidos ZC4563 e ZC4560 (Tabela 4) num volume reaccional de 50 yl contendo KC1 50 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 9,0, MgC^ 1,5 mM, Triton X-100 a 0,1%, gelatina a 0,01%, 0,2 mM de cada um do trifosfato de deoxinucleótido e 2,5 unidades de Taq ADN polimerase. Revestiu-se a mistura reccional com óleo mineral.

Depois de cinco ciclos (30 segundos a 94’C, 30 segundos a

45’C, 1 minuto a 50’C) e vinte e cinco ciclos (30 segundos a

94’C, 30 segundos a 45 C, 1 minuto a 72’C) removeu-se o ADN amplificado para análise.

Electroforesou-se num gel de agarose uma aliquota de cada reacção. Efectuou-se a análise de Southern do gel usando essencialmente o método descrito por Sambrook et al. (ibid.) e fragmentos preparados ao acaso cobrindo todas as regiões de codificação de ambos os clones sub-tipos la e 2a. As autoradiografias revelaram que a reaeção de PCR gerou fragmentos com um novo tamanho, que eram diferentes quer do sub-tipo la quer do sub-tipo 2a. Os fragmentos gerados de PCR foram electrofores.ados num gel de agarose. As regiões correspondentes aos produtos relacionados com o receptor de tamanho único foram excitadas e electroforesadas num papel NA45 (Schleicher e Schuell, Keene, NH). Recuperaram-se os fragmentos purificados usando essencialmente o método descrito pelo fabricante, digeridos com Eco RI e ligados ao pVEGT' de plasmídio que tinha sido linearizado por digestão com Eco RI e tratado com fosfatase para impedir a recircularização.

Transformaram-se as misturas de ligação em células DHIOb de estirpe E. coli. Retiraram-se os transformantes e placaram-se réplicas em filtros de nitrocelulose e varreram-se usando amostras preparadas ao acaso dos clones la e 2a. Colheram-se quarenta e oito colónias para análise de restrição e sequenciamento.

As sequências ADN do cADN da biblioteca total do cérebro do rato e o cADN da biblioteca do cerebelo do rato foram cada uma, amplificadas e analisadas usando os métodos descritos acima e oligonucleótido ZC4559 em combinação com qualquer dos

ZC4561 ou ZC4559 (Tabela 4).

Subdividem-se em 30 piscinas de 10.000 colónias, uma biblioteca de cADN do córtex do rato e uma biblioteca de cADN do hipocampos do rato (ambas obtidas de Michael Brownstein,

NIH) . Prepara-se o ADN de plasmídio de cada piscina e submete-se o ADN a análise de Southern depois da digestão com restrição das piscinas com Bam HI a Xho I ou pela amplificação de PCR de cada piscina usando os oligonucleótidos degenerados da Tabela 4. Subdividem-se as piscinas das bibliotecas contendo o ADN que hibridiza as amostras e parece conter um cADN de comprimento total. Prepara-se o ADN de plasmídio e varre-se tal como se descreveu acima. As piscinas positivas são novamente divididas e continua-se o processo até a piscina estar reduzida a clones puros. Os clones são submetidos a análise de restrição e análise em sequências parciais. Os clones que representam homólogos de receptor de glutamato distintos são completamente sequenciados. São gerados clones de comprimento completo, submetendo-se as piscinas originais a amplificação de PCR usando um primário de oligonucleótido específico para o ο

Ζ-⁷

7.7

..7.) promotor SP6 na extremidade 5' da inserção cADN e um primário de oligonucleótido de sentido contrário correspondente à extremidade 5' do cADN mais completo, para identificar as piscinas que contenham o cADN homólogo do receptor de glutamato mais longo. A piscina é depois diluída e novamente hibridizada com as amostras, tal como se descreveu acima, a fim de isolar um clone de cADN de comprimento total.

Expressão de Subtipos de Receptores de Glutamato

Subclonaram-se sequências de ADN complementares que codificam os sub-tipos lb e 2a, primeiro no vector de expressão de mamíferos Zem228R, para obter locais de terminais de restrição convenientes. Os cADN's são depois subclonados em pVEGT'. A sequência de cADN que codifica o sub-tipo lb é construída substituindo-se a porção terminal 3' do sub-tipo la descrito no Exemplo I com a porção análoga do sub-tipo lb da SN23. Digeriu-se o SN 23 de plasmídio com Kpnl e

Xbal para isolar o fragmento que contem a parte terminal 3' do sub-tipo lb. 0 plasmídio que contem o sub-tipo la que codifica a sequência (45-A) em Zem228R, foi digerido com Kpnl e Xbal para isolar o vector que contem o fragmento. 0 vector que contem o fragmento é ligado ao fragmento Kpnl-Xbal do /·>.

/ / //7 , λ'f fi Λ ι -, ! í S'·' ϊ /; AV*!/ . . <

,- - ν - SN23. 0 plasmídio resultante compreende o promotor MT-1, o cADN sub-tipo lb e o terminador hGH. 0 fragmento de cADN de sub-tipo lb foi isolado como um fragmento Bam HI, que foi ligado com pVEGT', que tinha sido linearizado com Bam HI. Foi usado para sintetizar ARN, num sistema in vitro, um plasmídio contendo a sequência cADN na orientação correcta, 0 ARN foi injectado em oócitos, tal como se descreveu acima.

SN 30 de plasmídio, que compreende o cADN de sub-tipo

2a, é digerido com Eco RI para isolar o cADN de sub-tipo 2a. 0 fragmento Eco RI é ligado com Zem228R linearizado com Eco RI.

Digeriu-se com Bam HI, um plasmídio contendo a inserção na orientação correcta, para isolar a sequência cADN. 0 fragmento Bam HI que compreende o cADN sub-tipo 2a, foi ligado com pVEGT' linearizado com Eco RI. Foi usado um plasmídio contendo o cADN na orientação correcta para sintetizar o ARN numa translacção in vitro. Injectou-se o ARN em oócitos de rã, tal como se descreveu acima.

EXEMPLO III

Geração de anticorpos em sub-tipos de receptores de glutamato

Geraram-se anti-soros policlonais de receptores de sub-tipos específicos em coelhos usando técnicas de imunização ο

ί ; !' padrão. Desenharam-se péptidos sintécticos (Tabela 5) a partir de sequências de receptores clonados. Conjugaram-se os péptidos com hemocianina de limpeto básico, sendo usado cada antigene para imunizar dois animais. Os animais foram imunizados com intervalos de três semanas e sangrados numa veia da orelha, dez dias depois da terceira e subsequentes imunizações.

Tabela 5

Subtipo	Sequência de Péptido	Localização Aparente
la	RDSLISIRDEKDGLNRC	Extracelular
	DRLLRKLRERLPKARV	Extracelular
	EEVWFDEKGDAPGRYD	Extracelular
	EFVYEREGNTEEDEL *	Citoplásmico
	PERRCCEIREQYG1QRV	Extracelular
	IGPGSSSVAIQVQNLL	Extracelular
	IAYSATSIDLSDKTL	Extracelular
lb	KKPGAGNAKKRQPEFS	Citoplásmico
	PEFSPSSQCPSAHAQL	Citoplásmico
2a	DKIIKRLLETSNARG	Extracelular
	VNFSGIAGNPVTFNEN	Extracelular
	GEAKSELCENLETPAL	Citoplásmico
2b	PARLALPANDTEFSAWV	Citoplásmico

Foram ensaiados antisoros individuais relativamente à actividade e especificidade num ensaio de mancha de western usando membranas preparadas das linhas de células transfectadas com e expressando de forma estável os sub-tipos de receptores individuais.

Claims (24)

1. REIVINDICAÇÕES:

   la. Processo para a preparação de receptores de glutamato acoplados com proteína G de mamíferos, caracterizado pelo facto de compreender as operações que consistem em cultivar células eucarióticas transformadas ou transfectadas com uma construção de ADN que compreende uma sequência de ADN que codifica a expressão do receptor de glutamato acoplado com proteína G? e isolar os receptores das células.
2. 2a Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de as mencionadas células serem células de mamíferos cultivadas.
3. 3a. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o receptor de glutamato ser receptor humano ou de animais roedores.
4. 4a. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se isolar o receptor de glutamato por purificação por afinidade imunológia.
5. 5a. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o receptor de glutamato acoplado com a proteína G não estar acoplado com a proteína G nas células eucarióticas.
6. 6a. Processo para determinar a presença dum receptor de glutamato acoplado com proteina G de mamífero numa amostra biológica, caracterizado pelo facto de se incubar a amostra com um anticorpo monoespecíf ico, o qual se liga especificamente com o receptor em condições suficientes para a formação do complexo imunológico e, a partir do citado complexo, se determinar a presença de complexos imunológicos.
7. 7a. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de o anticorpo monoespecífico ser um anticorpo monoclonal ou um antissoro purificado.
8. 8a.' Processo de acordo com a reivindicação Ί, caracterizado pelo facto de o anticorpo monoespecífico ser marcado.
9. 9a. Processo para identificar um composto que altera o metabolismo mediado pelo receptor de glutamato acoplado com G, caracterizado pelo facto de compreender as operações que consistem em incubar o composto com células eucarióticas, as quais expressam o receptor de glutamato acoplado com a proteína G, recombinante de mamífero e, a partir do referido receptor, se determinar o efeito do mencionado composto sobre o metabolismo nas células mediado pelo receptor.
10. 10a. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de se incubar o composto com o receptor e o ligando.
11. 11a. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de o citado ligando ser glutamato ou quisqualato.
12. 12a. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de as células eucarióticas

    1ΐ2.

    . Λ expressarem um receptor de glutamato acoplado com proteína G humana ou de roedores.
13. 13a. Processo de acordo com a reivindicação 12, caraeterizado pelo facto de se controlar o metabolismo de inositol-fosfolípido nas células eucarióticas relativamente à alteração provocado pelo composto.
14. 14a. Processo de acordo com a reivindicação 1, caraeterizado pelo facto de se isolar o citado receptor de glutamato acoplado com proteína G de mamífero ou um seu fragmento sob uma forma substancialmente pura e ser proveniente dum ser humano ou dum animal roedor.
15. 15a. Processo para a preparação dum antissoro, caraeterizado pelo facto de o mesmo ser recuperado a partir dum animal imunizado com o mencionado receptor de glutamato acoplado com a proteína G de acordo com a reivindicação 14.
16. 16a. Processo para a preparação de anticorpos monoclonais, caraeterizado pelo facto de se obter um anticorpo monoclonal que se liga especificamente com o receptor de glutamato acoplado com a proteína G, de acordo com a reivindicação 14.
17. 17a. Processo para a preparação de receptor de glutamato ou de quisqualato de acordo com a reivindicação 14, caraeterizado pelo facto de se obter um receptor que se liga com glutamato ou quisqualato e, dessa forma, activa a fosfolipase C ou estimula o- metabolismo de inositalfosfolípidos nas células dum vertebrado.
18. 18a. Processo para a preparação de polipéptidos produzidos por métodos recombinantes, caracterizado pelo facto de se obter um polipéptido que tem a actividade de receptor de glutamato acoplado com proteina G de mamífero.
19. 19a. Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo facto de se obter um polipéptido com a actividade de receptor de glutamato acoplado com proteina G humana ou dum mamífero roedor.
20. 20a. Processo para a preparação duma molécula de polinucleótido isolada e purificada, caracterizado pelo facto de se obter um polinucleótido que codifica um receptor de glutamato acoplado com proteina G de mamífero ou um seu fragmento.
21. 21a. Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo facto de o citado polinucleótido ser uma sequência de ADN genómico ou uma sequência de cADN ou uma sequência de ARN de sentido contrário.
22. 22a. Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo facto de o mencionado polinucleótido codificar um receptor de glutamato acoplado com proteína G humana ou de roedor.
23. 23a. Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo facto de o referido polinucleótido codificar um polipétido que possui a actividade de receptor de glutamato acoplado com proteína G de mamífero.
24. 24a. Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo facto de a sequência dos aminoácidos do polinucleótico ser uma das seguintes sequências: