DE69735421T2

DE69735421T2 - Gegen inaktivierung resistenter faktor viii

Info

Publication number: DE69735421T2
Application number: DE69735421T
Authority: DE
Inventors: J. Randal Ann Arbor KAUFMAN; W. Steven Ypsilanti PIPE; Kagehiro Ann Arbor AMANO
Original assignee: University of Michigan
Current assignee: University of Michigan
Priority date: 1996-04-24
Filing date: 1997-04-24
Publication date: 2006-10-19
Anticipated expiration: 2017-04-25
Also published as: US7459534B2; ATE319817T1; EP0910628B1; AU3202797A; EP0910628A1; PT1754718E; DK1754718T3; DE69740154D1; JP2007228973A; EP1754718A3; US6838437B2; CA2252896C; ATE502958T1; EP0910628A4; CA2252896A1; JP2000511407A; US20060014683A1; EP1754718B1; US20020132306A1; EP2202242A1

Description

Diese Anmeldung ist eine Fortsetzungsanmeldung von U.S.-Seriennummer 60/016.117, eingereicht am 24. April 1996 und U.S.-Seriennummer 60/017.785, eingereicht am 15. Mai 1996, welche hiermit ausdrücklich durch Bezugnahme einbezogen werden.
Die Arbeit an dieser Erfindung wurde durch die Regierung der Vereinigten Staaten gemäß der Stipendien HL53777 und HL52173 unterstützt, welche durch das National Institute of Health verliehen wurden. Die Regierung kann bestimmte Rechte auf diese Erfindung haben.
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen prokoagulatorisch aktive Proteine und genauer gesagt Nucleotidsequenzen, die ein Faktor VIII-Protein codieren, welches zur Sekretion von höheren Mengen im Stande ist, als sie üblicherweise mit dem Wildtyp-Faktor VIII, APC-resistentem Faktor VIII-Protein und Inaktivierungs- resistentem Faktor VIII-Protein erhalten werden.
Menschlicher Faktor VIII:C (FVIII) ist der Koagulationsfaktor, welcher in der mit dem X-Chromosom verbundenen Bluterkrankheit Hämophilie A, einer Hauptquelle der hämorrhagischen Morbidität und Mortalität in betroffenen Männern, fehlerhaft ist. Traditionell werden Bluter mit Transfusionen von Vollblut behandelt. In letzter Zeit ist die Behandlung mit Präparationen von FVIII-Konzentraten durchgeführt worden, die aus menschlichem Plasma stammen. Die Verwendung von aus dem Plasma stammenden Produkten setzt den Bluterpatienten allerdings dem möglichen Risiko von durch Viren übertragbaren Krankheiten aus, wie zum Beispiel Hepatitis und AIDS. Teure Reinigungsmaßnahmen zur Verminderung dieses Risikos erhöhen die Behandlungskosten. Mit der Steigerung der Kosten und begrenzter Verfügbarkeit an aus dem Plasma stammendem FVIII, werden Patienten eher episodisch, auf Bedarfbasis, als prophylaktisch behandelt. Rekombinant erzeugter FVIII hat im Hinblick auf Reinheit und Sicherheit wesentliche Vorteile gegenüber dem aus Plasma stammendem FVIII, sowie auch erhöhte Verfügbarkeit und es ist demgemäß viel Forschungsaufwand auf die Entwicklung von rekombinant erzeugtem FVIII gerichtet worden. Aufgrund der labilen Natur von FVIII, besonders nach seiner Aktivierung, müssen, ob aus Plasma oder rekombinant-erlangt, große und wiederholte Dosen an Protein verabreicht werden, um einen therapeutischen Vorteil zu erzielen. Die Menge an FVIII-Protein, welcher der Patient ausgesetzt ist, ist jedoch mit der Entwicklung von Antikörpern in Zusammenhang gebracht worden, die seine Aktivität hemmen. Im Lichte seiner bekannten Immunogenität ist eines der Ziele bei der Entwicklung von neuen rekombinanten Formen von FVIII zur Verwendung als ein therapeutisches Agens die Entwicklung von Produkten, die eine solche Immunantwort vermindern oder eliminieren.
FVIII wirkt in der intrinsischen Blutgerinnungskaskade als ein Co-Faktor, um die Aktivierung von Faktor X durch Faktor IXa zu beschleunigen, eine Reaktion, die auf einer negativ geladenen Phospholipidoberfläche in der Gegenwart von Calciumionen stattfindet. FVIII wird als ein einkettiges, 2351 Aminosäuren langes Polypeptid synthetisiert, das eine Domänenstruktur von A1-A2-B-A3-C1-C2 aufweist. Wehar, G.A. et al., Nature 312:337–342 (1984) und Toole, J.J. et al., Nature 312:342–347 (1984). Die Domänenstruktur von FVIII ist identisch zu jener des homologen Gerinnungsfaktors Faktor V (FV). Kane, W.H. et al., PNAS (USA) 83:6800–6804 (1986) und Jenny, R.J. et al., PNAS (USA) 84:4846–4850 (1987). Die FVIII A-Domänen sind 330 Aminosäuren lang und haben 40% Aminosäureidentität miteinander und zu der A-Domäne von FV und dem Plasma-Kupfer-bindenden Protein Ceruloplasmin. Takahashi, N. et al., PNAS (USA) 81:390–394 (1984). Jede C-Domäne ist 150 Aminosäuren lang und weist 40% Identität mit der C-Domäne von FV auf, und mit Proteinen, die Glykokonjugate und negativ geladene Phospholipide binden. Stubbs, J.D. et al., PNAS (USA) 87:8417–8421 (1990). Die B-Domäne von FVIII wird durch ein einzelnes Exon codiert und weist geringe Homologie zu jedem bekannten Protein, einschließlich der B-Domäne von FV, auf. Gitschier, J. et al., Nature 312:326–330 (1984) und Cripe, L.D. et al., Biochemistry 31:3777–3785 (1992).
FVIII wird als ein Heterodimer einer schweren Kette (Domänen A1-A2-B) und einer leichten Kette (Domänen A3-C1-C2) ins Plasma sezerniert, die durch eine nicht-kovalente Verknüpfung über ein divalentes Metallion zwischen den A1- und A3 Domänen verbunden sind. Im Plasma wird FVIII durch Bindung an von Willebrand-Faktor stabilisiert. Genauer gesagt wird die leicht Kette von FVIII durch nicht- kovalente Interaktionen an die primäre Bindungsstelle im Aminoterminus des von Willebrand-Faktors gebunden. Bei der proteolytischen Aktivierung durch Thrombin wird FVIII zu einem Heterodimer von 2 schweren Ketten-Fragmenten (A1, ein 50 kDa-Fragment, und A2, ein 43 kDa-Fragment) und der leichten Kette (A3-C1-C2, einer 73 kDa Kette) aktiviert. Die aktive Form von FVIII (FVIIIa) besteht daher aus einer A1-Untereinheit, die durch die Verknüpfung über ein divalentes Metallion mit einer Thrombin-gespaltenen leichten Kette A3-C1-C2 verbunden ist, sowie einer freien A2-Untereinheit, die mit der A1-Domäne durch eine Ionenverbindung verbunden ist (siehe 1A). Eaton, D. et al., Biochemistry 25:505 (1986); Lollar, P. et al., J. Biol. Chem. 266: 12481 (1991); und Fay, P.J. et al., J. Biol. Chem. 266:8957 (1991). Dieses FVIIIa-Heterodimer ist instabil und unterliegt unter physiologischen Bedingungen einer schnellen Inaktivierung durch Dissoziation der A2-Untereinheit.
Frühere Transfektionsstudien zeigten, dass FVIII 10-fach weniger effizient sezerniert wurde als FV. Die ineffiziente Sekretion von FVIII korreliert mit der Bindung and das Protein Chaperonin, welches als das Immunglobulin-Bindeprotein (BiP) identifiziert wurde, auch bekannt als das durch Glucose regulierte Protein mit 78 kDa (GRP78) (Murno, S. et al., Cell 46:291–300 (1986)) innerhalb des Lumens des ER (Dorner, A.J. et al., EMBO J. 4:1563–1571 (1992)). BiP ist ein Mitglied der Hitzeschock-Proteinfamilie, welches eine Peptid-abhängige ATPase-Aktivität aufweist. Flynn, G.C. et al., Science 245:385–390 (1989). BiP-Expression wird durch die Anwesenheit von aufgefaltetem Protein oder nicht zusammengesetzten Proteinuntereinheiten innerhalb des ERs induziert. Lee, A.S., Curr. Opin. Cell Biol. 4:267–273 (1992) und Kozutsumi, Y. et al., Nature 332:462–464 (1988). Es ist gezeigt worden, dass hohe FVIII-Expressionsmengen die BiP-Transkription induzieren. Dorner, A.J. et al., J. Biol. Chem. 264:20602–20607 (1989). Zusätzlich benötigt die FVIII-Freisetzung von BiP und der Transport aus dem ER große Mengen an intrazellulärem ATP. Dorner, A.J. et al., PNAS (USA) 87:7429–7432 (1990). Im Gegensatz dazu ist festgestellt worden, das FV nicht mit BiP assoziiert und keine großen ATP-Mengen zur Sekretion benötigt. Pittman, D.D. et al., J. Biol Chem. 269:17329–17337 (1994). Die Deletion der FVIII-B-Domäne ergab ein Protein, welches BiP in einem geringeren Maße band und effizienter ausgeschieden wurde. Dornen, A.J. et al., J. Cell Biol. 105:2665–2674 (1987). Um zu bewerten, ob die FVIII-B-Domäne für die Interaktion mit BiP verantwortlich war, wurden FV- und FVIII-chimäre cDNA-Moleküle konstruiert, in welchen die B-Domänensequenzen ausgetauscht wurden. Pittman, D.D. et al., Blood 84:4214–4225 (1994). Ein FVIII-Hybrid, das die B-Domäne von FV beherbergt, wurde als ein funktionelles Molekül exprimiert und sezerniert, obwohl die Sekretionseffizienz des Hybrids schwach war, ähnlich dem Wildtyp FVIII. Pittman, D.D. et al., Blood 84:4225 (1994). Das deutete darauf hin, dass der Unterschied an Sekretionseffizienz zwischen FV und FVIII nicht direkt auf spezifische Sequenzen innerhalb der FVIII-B-Domäne, die divergentesten Bereiche zwischen diesen homologen Koagulationsfaktoren, zurückgeführt werden konnte.
Um zu bestimmen, ob spezifische Aminosäuresequenzen innerhalb der FVIII-A-Domäne die Sekretion hemmen, wurden chimäre Proteine untersucht, welche die A1- und A2-Domänen von FVIII oder FV enthielten. Das chimäre Protein, welches die A1- und A2-Domänen von FV enthielt, wurde mit einer ähnlichen Effizienz wie der Wildtyp FV sezerniert. Die komplementären Chimären, welche die A1- und A2-Domänen von FVIII aufwiesen, wurden mit niedriger Effizienz, ähnlich dem Wildtyp FVIII, sezerniert. Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass Sequenzen innerhalb der A1- und A2-Domänen für die niedrige Sekretionseffizienz von FVIII verantwortlich waren. Ein FVIII-Molekül mit deletierter A1-Domäne wurde konstruiert und die Sekretion war, verglichen mit dem Wildtyp mit deletierter A2-Domäne, ungefähr 10-fach erhöht. Die Expression der FVIII-A1-Domäne alleine ergab kein sezerniertes Protein, wobei die Expression der FVIII-A2-Domäne alleine, oder der FV-A1-Domäne oder A2-Domäne alleine, die Synthese des sezernierten Proteins steuerte. Die Sekretion eines Hybrids, in welchem die carboxyterminalen 110 Aminosäuren der A1-Domäne durch homologe Sequenzen der FV-A1 Domäne (226–336 Hybrid FVIII) ersetzt waren, war verglichen mit dem Wildtyp FVIII auch 10-fach erhöht, das abgesonderte Protein war jedoch nicht funktionsfähig, d.h. zeigte keine prokoagulatorische Aktivität und die schweren und leichten Ketten waren nicht verbunden. Marquette, K.A. et al., J. Biol. Chem. 270:10297–10303 (1995). Es wäre daher wünschenswert, ein funktionsfähiges rekombinantes FVIII-Protein bereitzustellen, welches verglichen mit dem Wildtyp eine erhöhte Sekretion aufweist. Es wäre auch wünschenswert, ein funktionsfähiges rekombinantes FVIII-Protein mit erhöhter Sekretion, sowie mit erhöhter spezifischer Aktivität bereitzustellen.
FVa und FVIII werden durch Aktiviertes Protein C (APC) in der Anwesenheit von Phospholipid und CaCl₂ inaktiviert und APC-Resistenz wird als eine der Hauptursachen für vererbliche Thrombophilie angesehen. Dahlbäck, B. et al., PNAS (USA) 90: 1004 (1993). Die molekulare Basis für die APC-Resistenz wurde der Resistenz gegen APC-Spaltung und Inaktivierung zugeschrieben. Dahlbäck, B. et al., PNAS (USA) 91: 1396 (1994). Frühere Studien über die APC-Inaktivierung von FVIII haben die Erzeugung eines 45 kDa-Fragments festgestellt (Fulcher, C.A. et al., Blood 63: 486 (1994)), abgeleitet vom Aminoterminus der schweren Kette, und es wurde vorgeschlagen, dass es aus der Spaltung am Arg336 resultierte. Eaton, D. et al., Biochemistry 25: 505 (1986). Während die leichte Kette von FVIII nicht durch APC gespalten wird, sind mehrere Polypeptide beobachtet worden, welche von der schweren Kette abstammende Zwischen- und Endspaltungsfragmente darstellen. Walker, F.J. et al., Arch. Bioch. Biophys. 252:322 (1987). Diese Fragmente resultieren aus den Spaltungstellen-Standorten bei Arg336, dem Übergang der A1- und A2-Domäne, bei Arg562, welches die A2-Domäne halbiert und der Stelle am A2-B-Übergang, wahrscheinlich bei Arg740. Fay, P.J. et al., J. Biol. Chem. 266:20139 (1991). APC-Spaltung von FVIII bei Rest 336 erzeugt ein 45 kDa-Fragment vom Aminoterminus der A1-Domäne und Spaltung bei den Resten 562 und 740 erzeugt ein 25 kDa-Fragment vom Carboxyterminus der A2-Domäne (siehe 1A).
Frühere Studien haben gezeigt, dass die B-Domäne von FVIII für FVIII-Co-Faktoraktivität unwesentlich ist. Gentechnologisch erzeugte FVIII-Moleküle, die unterschiedliche Ausmaße an B-Domänendeletionen (BDD) aufweisen, ergeben sezernierte Einzelketten-FVIII-Arten, in welchen keine intrazelluläre Proteolyse des primären Translationsproduktes beobachtet wird. Diese BDD-FVIII-Mutanten sind vorteilhaft, da sie in Säugerzellen effizienter produziert werden. Funktionelle Charakterisierung dieser BDD-FVIII-Moleküle zeigte, dass FVIII-Cofaktoraktivität erhalten bleibt, wenn die Thrombinspaltung nach Arg372, Arg740 und Arg1689 stattfindet. Daher erzeugt jede gentechnisch erzeugte, funktionsfähige Konstruktion von FVIII ein FVIIIa-Heterotrimer nach der Thrombinaktivierung. Die funktionellen Vorteile von früheren BDD-FVIII-Konstrukten waren daher durch schnelle Dissoziation der nicht kovalent gebundenen A2-Untereinheit von FVIIIa eingeschränkt gewesen.
Es wäre daher erstrebenswert, ein verbessertes rekombinantes FVIII-Protein bereitzustellen. Es wäre auch wünschenswert, FVIIIa-Protein bereitzustellen, welches gegen Inaktivierung resistent ist. Es wäre ferner erstrebenswert, FVIIIa-Protein bereitzustellen, das APC-resistent ist. Es wäre außerdem erstrebenswert, FVIII-Protein bereitzustellen, welches, verglichen mit dem Wildtyp FVIII, erhöhte Sekretion aufweist. Es wäre ferner erstrebenswert, FVIII-Protein bereitzustellen, welches erhöhte Sekretion und APC-Resistenz aufweist. Es wäre auch wünschenswert, FVIII-Protein bereitzustellen, welches erhöhte Sekretion und Inaktivierungsresistenz aufweist. Es wäre außerdem erstrebenswert, ein Verfahren zur Behandlung von Bluterpatienten mit verbessertem rekombinantem FVIII bereitzustellen. Es wäre ferner erstrebenswert, ein Verfahren zur Behandlung von Bluterpatienten über Austauschtherapie bereitzustellen, wobei die zur Behandlung des Patienten benötigte Menge an FVIII-Protein verringert ist.
Die vorliegende Erfindung stellt neue gereinigte und isolierte Nucleinsäuresequenzen bereit, die prokoagulatorisch aktives FVIII-Protein codieren. In einer Ausführungsform codieren die Nucleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung Aminosäuresequenzen, die bekannten menschlichen FVIII-Sequenzen entsprechen, wobei die A1-Domäne, im Speziellen der Aminosäurerest 309, Phenylalanin, durch Serin ersetzt ist. Das daraus resultierende FVIII-Protein ist zur Sekretion in größeren als üblicherweise mit dem Wildtyp FVIII erhaltenen Mengen im Stande und behält die prokoagulatorische Aktivität bei.
Weiter werden Nucleinsäuresequenzen beschrieben, welche Aminosäuresequenzen codieren, die bekannten menschlichen FVIII-Sequenzen entsprechen, wobei APC-Spaltungsstellen mutiert worden sind. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Aminosäurereste 336 und 562 von Arginin zu Isoleucin bzw. Arginin zu Lysin mutiert und der Aminosäurerest 309Phe ist durch Serin ersetzt. Das resultierende FVIII-Protein ist APC-resistent und wird daher der Einfachheit halber im Allgemeinen hierin als „APC-resistentes FVIII" bezeichnet.
Ferner werden Nucleinsäuresequenzen beschrieben, die Aminosäuresequenzen entsprechend bekannten menschlichen FVIII-Sequenzen codieren, wobei die B-Domäne deletiert ist, die von Willebrand-Faktor-Bindungsstelle deletiert ist, eine Thrombinspaltungsstelle mutiert ist und ein Aminosäuresequenzspacer zwischen die A2- und A3-Domänen inseriert ist. Weiter beschreibt die Beschreibung, dass die Thrombinspaltungsstelle Arg740 mutiert sein kann, z.B. durch Substitution mit Alanin. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform stellt der Aminosäurespacer den Aminobereich der B-Domäne dar, vorzugsweise die 54 Reste des Aminobereichs der B-Domäne. In noch einem weiteren Aspekt der Beschreibung können eine oder beide APC-Spaltungsstellen mutiert sein. Es ist überraschenderweise festgestellt worden, dass nach Aktivierung durch Thrombin dieses Protein ein Heterodimer ist, wobei die A2-Domäne kovalent mit der leichten Kette verbunden bleibt (siehe 1B). Diese Heterodimer-Konfiguration ist stabiler als die Wildtyp-Heterotrimerkonfiguration und weist, verglichen mit dem gereinigten Wildtyp-FVIII, einen ungefähr fünffachen Anstieg in der spezifischen Aktivität auf. Der FVIII der vorliegenden Erfindung kann daher als ein einkettiges Polypeptid sezerniert werden, welches nach Aktivierung durch Thrombin ein inaktivierungsresistentes FVIII-Heterodimer erreicht. Der Einfachheit halber wird dieser neue FVIII der vorliegenden Erfindung hierin im Allgemeinen als „inaktivierungsresistenter FVIII" bezeichnet.
Der inaktivierungsresistente FVIII kann durch Bindung an von Willebrand-Faktor (vWF) induziert werden. Es ist festgestellt worden, dass in der Anwesenheit eines Antikörpers gegen die leichte Kette, ESH8, der inaktivierungs-resistente FVIII, dem die vWF-Bindungstelle fehlt, eine erhöhte Bindungsaktivität an vWF aufweist. Ein solcher Antikörper oder anderes vernetzendes Agens, das die Bindung an vWF induziert, kann daher verwendet werden, um den inaktivierungsresistenten FVIII noch weiter zu stabilisieren.
In noch einer weiteren Ausführungsform codieren die Nucleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung APC-resistente FVIII-Aminosäuresequenzen, die eine Mutation am Rest 309, Phenylalanin, aufweisen, wobei Phe390 durch Serin ersetzt wird. Die in der Beschreibung beschriebenen Nucleinsäuresequenzen codieren auch inaktivierungsresistente FVIII-Aminosäuresequenzen, die eine Mutation bei Phe309 aufweisen. Nochmals gesagt, wird Phe309 vorzugsweise deletiert oder durch eine andere Aminosäure, z.B. Serin, ersetzt. Die hierin beschriebenen Nucleinsäuresequenzen können daher FVIII-Proteine codieren, welche Inaktivierungsresistenz und/oder erhöhte Sekretion zeigen.
Ein Fachmann wird sich darüber im Klaren sein, dass aufgrund der hierin beschriebenen Inaktivierungsresistenz der Proteine und der damit in Zusammenhang stehenden erhöhten spezifischen Aktivität, eine niedrigere Dosierung an Protein, während der Ersatz-Therapie an Bluterpatienten verabreicht werden kann. Durch Nutzung der Proteine der vorliegenden Erfindung wird daher die gesamte Proteinbelastung des Patienten vermindert, wodurch die Wahrscheinlichkeit einer Inhibitorbildung gesenkt wird. Es wird ferner eingesehen werden, dass der neue FVIII der vorliegenden Erfindung auch in Gentherapie-Anwendungen nützlich sein wird.
Zusätzliche Gegenstände, Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden von der folgenden Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen deutlich werden, in Verbindung mit den begleitenden graphischen Darstellungen.
Die verschiedenen Vorteile der vorliegenden Erfindung werden durch Lesen der folgenden Beschreibung und der hinzugefügten Ansprüche unter Bezugnahme auf die folgenden graphischen Darstellungen offensichtlich werden, in welchen:
1A ein Diagramm der Wildtyp-FVIII- und -FV-Domänenstrukturen ist;
1B ein Diagramm des Inaktivierungs-resistenten FVIII der vorliegenden Erfindung ist;
2 eine Tabelle ist, welche die Sekretionsaktivität der A1-mutierten FVIII-Proteine der vorliegenden Erfindung verglichen mit dem Wildtyp FVIII zeigt.
3 ein Diagramm ist, das die Thrombinaktivierung des APC-resistenten FVIII der vorliegenden Erfindung und vom Wildtyp FVIII zeigt;
4A und 4B Photographien von Gelen sind, welche die Expression und Thrombinspaltung des APC-resistenten FVIII der vorliegenden Erfindung zeigen;
5A und 5B Photographien von Gelen sind, welche die APC-Spaltung des APC-resistenten FVIII der vorliegenden Erfindung zeigen;
6 eine Photographie eines Gels ist, welches den gereinigten Wildtyp und den APC-resistenten FVIII der vorliegenden Erfindung zeigt;
7A und 7B Diagramme sind, welche APC-vermittelte funktionelle Inaktivierung von Wildtyp- und von APC-resistentem FVIII der vorliegenden Erfindung zeigen;
8 ein Diagramm der Domänenstruktur des einkettigen inaktivierungsresistenten FVIII der vorliegenden Erfindung ist;
9 ein Diagramm der Domänenstruktur des inaktivierungsresistenten, heterodimeren FVIII-Proteins der vorliegenden Erfindung ist;
10 eine Photographie eines Gels ist, welches relative Synthese- und Sekretionsmengen des inaktivierungsresistenten FVIII der vorliegenden Erfindung zeigt;
11 eine Photographie eines Gels ist, welches die Spaltungsmuster des inaktivierungsresistenten FVIII der vorliegenden Erfindung zeigt;
12 ein Diagramm ist, welches die funktionelle Aktivierung und Inaktivierung des inaktivierungsresistenten FVIII der vorliegenden Erfindung verglichen mit dem Wildtyp FVIII zeigt;
13 ein Diagramm ist, welches die Aktivierung und reduzierte Rate der Inaktivierung des durch Immunaffinität gereinigten inaktivierungsresistenten FVIII der vorliegenden Erfindung verglichen mit dem Wildtyp FVIII zeigt;
14 ein Diagramm ist, welches die Ergebnisse eines ELISA-Tests illustriert, der die Antikörper-induzierbare vWF-Bindung des inaktivierungsresistenten FVIII der vorliegenden Erfindung beweist;
15 ein Diagramm ist, welches die Ergebnisse eines ELISA-Tests illustriert, der die Antikörper-induzierbare vWF-Bindung des inaktivierungsresistenten FVIII der vorliegenden Erfindung nach Aktivierung mit Thrombin zeigt; und
16 ein Diagramm ist, welches die Ergebnisse eines ELISA-Tests illustriert, der die Antikörper-induzierbare vWF-Bindung des inaktivierungsresistenten FVIII der vorliegenden Erfindung nach Aktivierung mit Thrombin sowie bewahrte FVIII-Aktivität zeigt.
Neue gereinigte und isolierte Nucleinsäuresequenzen werden bereitgestellt, die prokoagulatorisch aktiven FVIII codieren. Nucleinsäuresequenzen, die Aminosäuresequenz codieren, welche mit bekannten menschlichen FVIII-Sequenzen übereinstimmen, die eine A1-Domänenmutation aufweisen, werden bereitgestellt. Genauer gesagt werden Nucleinsäuresequenzen bereitgestellt, welche Aminosäuresequenzen codieren, die mit bekannten menschlichen FVIII-Sequenzen übereinstimmen, wobei der Aminosäurerest 309, Phenylalanin, durch ein Serin ersetzt ist. Das resultierende FVIII-Protein ist zur Sekretion von höheren Mengen im Stande als sie üblicherweise mit dem Wildtyp FVIII erhalten werden und behält die prokoagulatorische Aktivität bei.
Nucleinsäuresequenzen, die Aminosäuresequenzen codieren, welche bekannten menschlichen FVIII-Sequenzen entsprechen, die mutierte APC-Spaltungsstellen enthalten, werden auch bereitgestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die APC-Spaltungsstellen Arg336 und Arg562 zu Isoleucin bzw. Lysin (R336I und R562K) mutiert und der Aminosäurerest Phe309 wird durch Serin ersetzt. Das resultierende FVIII-Protein ist APC-resistent.
Weiter können die hierin beschriebenen Nucleinsäuresequenzen Aminosäuresequenzen codieren, die bekannten menschlichen FVIII-Sequenzen entsprechen, wobei die B-Domäne deletiert ist, die von Willebrand-Faktor-Bindungsstelle (d.h. der saure Bereich des Aminoterminus der leichten Kette) deletiert ist, eine Thrombinspaltungsstelle mutiert ist und ein Aminosäuresequenzspacer zwischen den A2- und A3-Domänen inseriert ist. Das kann ferner eine APC-Spaltungsstellen-Mutation einschließen, zum Beispiel eine oder beide hierin beschriebenen APC-Spaltungsstellen-Mutationen. Die Beschreibung beschreibt weiter, dass die Arg740-Thrombinspaltungsstelle mutiert ist, vorzugsweise durch eine Substitution mit Alanin (R740A) oder Lysin (R740K). Der Aminosäuresequenzspacer besitzt eine ausreichende Länge, um dem Protein zu ermöglichen, durch Thrombin aktiviert zu werden, um ein Heterodimer zu erhalten, wobei die A2-Domäne kovalent mit der leichten Kette verbunden bleibt. Der Spacer ist ungefähr 54 Reste lang. Der Spacer umfasst 54 Reste des Aminoanteils der Wildtyp-FVIII-B-Domäne, d.h. Reste 741 bis 794, wobei Rest 794 Threonin oder Leucin ist. Das einkettige Polypeptid (neuer FVIII, hierin auch als IR8 bezeichnet) wird nach Aktivierung mit Thrombin ein Heterodimer (neuer FVIIIa, hierin auch als IR8a bezeichnet), welches eine ungefähr fünffache Steigerung in der spezifischen Aktivität verglichen mit gereinigtem Wildtyp-FVIII aufweist.
Ferner kann der inaktivierungsresistente FVIII in Kombination mit einem Antikörper oder einem vernetzendem Agens eingesetzt werden, welches die Bindungsaffinität des Proteins an vWF erhöht. Zum Beispiel wenn sich der Inaktivierungs-resistente FVIII, dessen vWF-Bindungsstelle entfernt wurde, in der Anwesenheit von ESH8, eines im Handel erhältlichen monoclonalen Antikörpers von der Maus (American Diagnostics, Inc. Greenwich, CT) befindet, welcher ein Epitop bei Aminosäuren 2248 bis 2285 innerhalb der C2-Domäne erkennt, bindet der inaktivierungsresistente FVIII an vWF. Wie in Beispiel 4 in mehr Einzelheiten dargelegt wird, weist der inaktivierungsresistente FVIII, verglichen mit dem Wildtyp FVIII, eine mindestens 10-fach reduzierte Affinität für vWF auf, in der Anwesenheit von ESH8 weist er allerdings eine nur 2-fach reduzierte Affinität zu vWF auf. Es ist vor kurzem berichtet worden, dass ESH8 durch Erhöhung der Affinität des mit Thrombin gespaltenen FVIII (FVIIIa) für vWF, als Inhibitor der Wildtyp-FVIII-Aktivierung agieren kann. Saenko, E.L. et al., Blood 86, AbstraktNr. 749 (1995). Durch Verzögerung der Freisetzung von FVIIIa von vWF inaktivieren die A2-Dissoziation und die weitere proteolytische Spaltung wahrscheinlich den FVIII bevor er vollständig von vWF freigesetzt werden kann und seine Cofaktorfunktion ausüben kann. Von einem menschlichen inhibitorischen Antikörper, der ein Epitop bei den Aminosäuren 2218 bis 2307 innerhalb der C2-Domäne erkennen kann, ist auch berichtet worden, welcher die Wildtyp-FVIII-Aktivierung durch einen ähnlichen Mechanismus zu inhibieren scheint und der auf ähnliche Weise verwendet werden kann, um vWF-Bindung zu induzieren. Shima, M. et al., Blood 86, Abstraktnummer 748 (1995) und Shima, M. et al., Britisch J. Hematol. 91: 714–721 (1995).
In noch einer weiteren Ausführungsform codieren die Nucleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung hierin beschriebenen APC-resistenten FVIII, welcher eine Mutation bei Phe309 aufweist, wobei Phe309 durch Serin ersetzt ist. Die in dieser Beschreibung beschriebenen Nucleinsäuresequenzen können auch den hierin beschriebenen inaktivierungsresistenten FVIII codieren, der auch eine zusätzliche Mutation an Phe309 aufweist. Nochmals gesagt, ist Phe309 durch Serin ersetzt. Die Nucleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung codieren FVIII-Proteine, welche Inaktivierungsresistenz und/oder erhöhte Sekretion aufweisen.
Man wird sich darüber im Klaren sein, dass aufgrund der erhöhten spezifischen Aktivität der Proteine der vorliegenden Erfindung den Bluterpatienten eine niedrigere Proteindosierung verabreicht werden kann, während therapeutisch effektive FVIII-Aktivitätswerte beibehalten werden. Zusätzlich zur Kosteneinsparung kann durch die Nutzung der Proteine der vorliegenden Erfindung in der FVIII-Austauschtherapie die gesamte Proteinbelastung des Patienten gesenkt werden, wodurch die Wahrscheinlichkeit von Inhibitorbildung gesenkt wird. Es wird ferner verständlich sein, dass die Proteine der vorliegenden Erfindung auch in der Gentherapie-verwandten Behandlung nützlich sind.
DNA-Sequenzen für menschlichen FVIII sind bekannt, wie auch die Expressionsverfahren (siehe z.B. Toole et al., Nature 312:312–317 (1984); Wood et al., Nature 312:330–337, Vehar et al., Nature 312:337-342, U.S. Patentnummer 4.757.006, W0 87/04187, WO 88/08035 und W0 88/03558). Die neuen gereinigten und isolierten Nucleinsäuresequenzen, welche das FVIII-Protein der vorliegenden Erfindung codieren, können durch herkömmliche Techniken erzeugt werden, d.h. eine Nucleinsäuresequenz, welche eine Polypeptidsequenz codiert, die im Wesentlichen die Gleiche ist wie menschlicher FVIII oder Varianten davon, modifiziert wie es im Fachgebiet bekannt und hierin beschrieben ist. Zum Beispiel können die Mutationen bei Phe309 und die APC- und Thrombin-Spaltungsstellen auf diese Weise durch ortsspezifische Mutagenese der cDNA erzeugt werden. Ein Fachmann wird erkennen, dass sich „Mutation" auf jede Änderung bezieht, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Substitutionen, Insertionen und Deletionen. Es wird ferner verstanden werden, dass sich der Rest der FVIII-Nucleinsäuresequenz vom Wildtyp-FVIII unterscheiden kann, indem er zusätzliche Modifikationen enthält, wie jene die in U.S. Patentnummer 5.004.803, WO 86/06101, und WO 87/071444 offenbart sind. FVIII-Analoge sind entwickelt worden, um die spezifischen strukturellen Anforderungen für die FVIII-Aktivierbarkeit oder -Nicht-Aktivierbarkeit und in vivo Wirksamkeit besser zu verstehen und sie liegen auch im Schutzbereich der Erfindung. Unter den zu optimierenden Merkmalen sind auch vereinfachte Herstellung, Erleichterung der Verabreichung, Stabilität, verbesserte Clearance/Verteilungseigenschaften, verminderte Immunogenität und verlängerte Halbwertszeit eingeschlossen. Darüber hinaus wird eingesehen werden, dass Varianten der FVIII-Nucleinsäuresequenzen in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung auch Allel-Variationen einschließen, d.h. Variationen in der Sequenz aufgrund natürlicher Variabilität von Individuum zu Individuum, oder mit anderen Codonsubstitutionen oder -deletionen, die prokoagulatorische Aktivität vom FVIII-Typ noch immer bewahren.
Alternierende Nucleinsäureformen, wie zum Beispiel genomische DNA, cDNA und DNA, erzeugt durch teilweise oder gesamte chemische Synthese von Nucleotiden, sowie DNA mit Mutationen liegen auch innerhalb der Erwägungen der Erfindung.
Die Assoziation der durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten Nucleinsäuresequenzen mit Expressionskontrollsequenzen homologer oder heterologer Arten, wie zum Beispiel Promotoren, Operatoren, Regulatoren und ähnlichem, ermöglicht eine in vivo- und in vitro-Transkription zur Bildung von mRNA, die dann wiederum für Translation empfänglich ist, um neue FVIII-Proteine und verwandte Poly- und Oligopeptide in großen Mengen bereitzustellen. Die vorliegende Erfindung umfasst demnach die Expressionsprodukte der Nucleinsäuresequenzen der Erfindung, sowie auch aktivierte Formen dieser Expressionsprodukte. In einem zurzeit bevorzugten Expressionssystem der Erfindung werden FVIII-codierende Sequenzen funktionsfähig mit einer regulatorischen Promotorsequenz verbunden und dadurch die Transkription und Translation in einer Säugerzelle ermöglicht, um zum Beispiel FVIII bereitzustellen, der Gerinnungsaktivität aufweist.
Wie hierin verwendet, kann der Begriff „prokoagulatorisch aktiver" und „aktiver" FVIII austauschbar verwendet werden, um sich auf einen oder mehrere Polypeptide) oder Proteine zu beziehen, die in einem Gerinnungstest prokoagulatorische Aktivität demonstrieren. Der Begriff FVIII kann hierin verwendet werden, um FVIIIa einzuschließen und ein Fachmann wird aus dem Zusammenhang, in welchem die Begriffe verwendet werden, verstehen, welcher Begriff (Prä-Thrombin-aktivierter FVIII oder Thrombin-aktivierter FVIII (FVIIIa)) beabsichtigt ist. Wie hierin verwendet, schließt der Begriff „Polypeptide" nicht nur Vollängen-Proteinmoleküle ein, sondern auch Fragmente davon, welche alleine oder mit anderen Fragmenten gemeinsam FVIII-prokoagulatorische Aktivität in einem Gerinnungstest erzeugen. Man wird sich darüber im Klaren sein, dass synthetische Polypeptide der neuen Proteinprodukte der vorliegenden Erfindung auch im Schutzbereich der Erfindung liegen und gemäß Standard-Syntheseverfahren erzeugt werden können. Es wird auch eingesehen werden, dass im hierin verwendeten Aminosäure-Nummerierungssystem, der Aminosäurerest 1 der erste Rest des nativen, reifen FVIII-Proteins ist. Man wird sich ferner darüber im Klaren sein, dass sich der Begriff „Domäne" auf die groben Bereiche von FVIII bezieht, die den Fachleuten bekannt sind.
Wie hierin verwendet, soll der Ausdruck „eine Sequenz, die im Wesentlichen der Sequenz entspricht" Sequenzen einschließen, die unter stringenten Bedingungen an eine bestimmte Sequenz hybridisieren, sowie auch jene, die trotz der Redundanz des genetischen Codes hybridisieren würden und die in Expressionsprodukten resultieren, die vorgegebene Aktivität aufweisen. Stringente Bedingungen sind im Allgemeinen 0,2 x SSC bei 65°C. Der Ausdruck „im Wesentlichen duplikativ" soll jene Sequenzen einschließen, die obwohl sie nicht identisch zu einer bestimmten Sequenz sein müssen, dennoch in einem Expressionsprodukt resultieren, Proteine und/oder synthetische Polypeptide, die FVIII-Aktivität in einem Standard-Gerinnungstest aufweisen.
Die Aufnahme der Sequenzen der vorliegenden Erfindung durch Standard-Transformation und Transfektionsprozesse in prokaryontische oder eukaryontische Wirtszellen, die eventuell geeignete virale oder zirkuläre DNA-Plasmidvektoren einschließen, liegt auch innerhalb der Erwägung der Erfindung. Prokaryontische und eukaryontische Zellexpressionsvektoren, welche die Nucleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung enthalten und im Stande sind, sie zu exprimieren, können durch Techniken synthetisiert werden, die Fachleuten gut bekannt sind. Die Komponenten der Vektoren, wie zum Beispiel die bakteriellen Replikons, Selektionsgene, Enhancer, Promotoren und ähnliches, können von natürlichen Quellen erhalten oder durch bekannte Verfahren synthetisiert werden (siehe z.B. Kaufman et al., J. Mol. Biol. 159:601–621 (1982) und Kaufman, PNAS 82:689–693 (1995)). Expressionsvektoren, die für die Herstellung von Proteinen dieser Erfindung nützlich sind, können auch induzierbare Promotoren enthalten oder induzierbare Expressionssysteme umfassen, die im Fachgebiet bekannt sind.
Etablierte Zelllinien einschließlich transformierter Zelllinien sind als Wirte geeignet. Normale diploide Zellen, Zellstämme, abgeleitet von in vitro-Kulturen aus primären Geweben, sowie primäre Explantate (einschließlich relativ undifferenzierter Zellen, wie zum Beispiel hämatopoietischen Stammzellen) sind auch geeignet. Zellkandidaten müssen im Selektionsgen nicht genotypisch defizient sein, solange das Selektionsgen dominant agiert.
Die Verwendung von Säuger-Wirtszellen stellt solche Post-Translationsmodifikationen bereit, z.B. proteolytische Prozessierung, Glykosylierung, Tyrosin-, Serin- oder Threonin-Phosphorylierung, wie sie durchgeführt werden können, um dem Expressionsprodukt der Erfindung optimale biologische Aktivität zu verleihen. Etablierte Säugerzelllinien werden daher bevorzugt, z.B. CHO (Chinese Hamster Ovary)-Zellen. Alternativ kann der Vektor das gesamte oder einen Teil des Genoms des Rinderpapillomavirus umfassen (Lusky et al., Cell 36:391–401 (1984)) und in Zelllinien wie zum Beispiel C127 Mauszellen als stabiles episomales Element aufgenommen werden. Andere nützliche Säugerzelllinien schließen HeLa, COS-1-Affenzellen, Melanomzelllinien wie zum Beispiel Bowes-Zellen, Maus L929-Zellen, 3T3-Linien abgeleitet von Schweizer, Balb-c- oder NIH-Mäusen, BHK- oder HaK-Hamsterzelllinien und ähnliches ein.
Welcher Expressionsvektortyp auch immer verwendet wird, es mag wünschenswert sein die FVIII-Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung mit einer Nucleinsäuresequenz zu coexprimieren, die den von Willebrand-Faktor (vWF) oder ein Analog davon codiert, z.B. wie beschrieben in WO 87/06101, WO 88/08035 und U.S. Patentnummer 5.250.421. Es kann auch bevorzugt werden, das Protein in einem Medium zu exprimieren, welches einen Proteaseinhibitor wie zum Beispiel Aprotinin enthält, z.B. in einer Menge von etwa 0,01 bis etwa 5%, vorzugsweise von etwa 0,5 bis etwa 1,0%, (Vol/Vol) (Aprotinin, 15–30 Trypsin-Inhibitoreinheiten ((TIE/ml, Sigma) oder entsprechende Mengen an Aktivitätseinheiten anderer Proteaseinhibitoren.
Stabile Transformanten werden durch standardmäßige immunologische- oder Aktivitätstests auf die Expression des prokoagulatorischen Produktes hin durchmustert. Die Anwesenheit der die prokoagulatorischen Proteine codierenden DNA kann durch Standardverfahren wie zum Beispiel Southern-Blots nachgewiesen werden. Transiente Expression der prokoagulatorischen Gene während mehrerer Tage nach Einführung des Expressionsvektors in geeignete Wirtszellen, wie zum Beispiel COS-1-Affenzellen, wird ohne Selektion durch Aktivitäts- oder immunologische Tests der Proteine im Kulturmedium gemessen. Nach der Expression der DNA durch herkömmliche Mittel, kann das so erzeugte Protein gewonnen, gereinigt und/oder im Hinblick auf physikochemische, biochemische und/oder klinische Parameter charakterisiert werden, alles mittels bekannter Verfahren.
In einer weiteren Ausführungsform können die Nucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung in Gentherapie-Anwendungen verwendet werden, z.B. zur Behandlung von durch Mangel an FVIII verursachter Hämophilie. Aufgrund der erhöhten spezifischen Aktivität der FVIII-Proteine der vorliegenden Erfindung, kann therapeutisch effektive FVIII-Aktivität mit niedrigeren Proteinexpressionsmengen, als verglichen mit anderen Formen von FVIII, einschließlich Wildtyp-FVIII, erreicht werden. Die Verfahren dieser Erfindung umfassen daher den Schritt des Einführens der Nucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung in eine Zielzelle. Um den Transfer herbeizuführen, müssen die zu transferierenden Nucleotidsequenzen mit einem Vehikel assoziiert sein, das in der Lage ist, die Zielzelle zu transduzieren. Fachleuten wird bewusst sein, dass solche Vehikel in der Gentherapie bekannte Transfersysteme einschließen, die adenovirale, retrovirale und adeno-assoziierte virale Vektoren umfassen, aber nicht auf sie beschränkt sind, sowie auch Liposomen und DNA-Protein-Komplexe.
Die Erfindung wird ferner mit Bezug auf die folgenden darstellenden Beispiele und Verfahren verstanden werden, welche rein beispielhaft sind und nicht als limitierend für den wahren Schutzbereich der vorliegenden Erfindung betrachtet werden sollten. Beispiel 1 beschreibt die Herstellung und Analyse des FVIII der vorliegenden Erfindung mit mutierten A1-Domäne. Beispiel 2 beschreibt die Herstellung und Analyse des APC-resistenten FVIII. Beispiel 3 beschreibt die Herstellung und Analyse des inaktivierungsresistenten FVIII. Beispiel 4 beschreibt die induzierbare vWF-Bindung des inaktivierungsresistenten FVIII. Beispiel 5 beschreibt die Arzneimittel und Verfahren zur Verwendung der FVIII-Proteine und Nucleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung.
BEISPIEL 1
HERSTELLUNG UND ANALYSE DES FVIII MIT MUTIERTER A1-DOMÄNE
Ein statistischer Algorithmus (Blond-Elguindi, S. et al., Cell 75:717–728 (1993)) wurde angewandt, um das BiP-Bindungspotential von 7-mer-Peptiden an die Region 226–336 von FVIII vorherzusagen (Rest 1 ist der erste Aminosäurerest des nativen reifen FVIII-Proteins). Von den Resten Leu303 bis Phe309 wurde festgestellt, dass sie einen BiP-Bindungswert von +14 aufwiesen, wobei jeder Wert über +10 eine extrem hohe Wahrscheinlichkeit der BiP-Bindung aufweist. Fay, P.J. et al., J. Biol. Chem. 266:8957–8962 (1991). Dieser Bereich enthält einen hydrophoben Cluster, wobei 7 bis 11 Aminosäurereste Leu oder Phe darstellen.
Zunächst wurden alle 7 Leu- und Phe-Reste in der möglichen BiP-Bindungstasche zu Ala mutiert. Ortsspezifische Mutagenese durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Mutagenese mit Verlängerung durch überlappende Oligonucleotide wurde genützt. Eine FVIII/FV-Chimäre wurde produziert, wobei die Reste 226–336 von FVIII durch die homologen Reste von FV (Reste 198–313) ersetzt wurden. Marquette, K.A., et al., J. Biol. Chem. 270:10297–10303 (1995). Teilweise komplementäre Primer, welche die Mutation enthielten, wurden mit zwei Primern genutzt, die gegen die Mlul-Stellen bei 226 und 336 in der chimären cDNA von FVIII/FV gerichtet waren, um zwei überlappende Produkte zu amplifizieren, welche die spezifischen Mutationen enthielten. Diese beiden Fragmente wurden isoliert und durch PCR unter Verwendung der beiden die Mlul-Stelle enthaltenden Primer miteinander fusioniert. Das daraus resultierende Mlul-Fragment wurde dann in die mit Mlul gespaltene FVIII/FV 226–336-Chimäre innerhalb des Expressionsvektors pMT2 subcloniert. Alle Mutationen wurden durch DNA-Sequenzierung über die mit PCR amplifizierte Region bestätigt. Expressionsvektoren, die diese Mutanten codierten, wurden in COS-1-Zellen transfiziert und das konditionierte Medium bei 60 Stunden zur Analyse der FVIII-Aktivität durch den Coatest-Aktivitätstest entnommen. Wenn alle 7 Leu- und Phe-Reste in der potentiellen BiP-Bindungstasche zu Ala mutiert waren, wurde das Molekül nicht sezerniert. Anschließend wurden die Phe-Reste einzeln in die entsprechenden Aminosäurereste im FV mutiert. Die Sekretion der F309S-Mutanten (entweder alleine oder in Kombination mit anderen Mutanten) wurde in mehreren Transfektionsexperimenten reproduzierbar 2-fach erhöht. Wie in 2 gezeigt, haben Mutationen an anderen benachbarten Resten (F293S, F306W) die Sekretion nicht verbessert. Die vermehrte Sekretion der F309S-Mutanten korrelierte mit einer 2-fachen Erhöhung an FVIII-Antigen, was auf eine spezifische Aktivität ähnlich zu Wildtyp-FVIII hindeutet. Metabolische Markierung mit [³⁵S]-Methionin für 20 Minuten und nachfolgendem 4-stündigem Chase in Medium, das einen Überschuss an unmarkiertem Methionin enthielt, deutete darauf hin, dass die erhöhte Sekretion der F309- und Q,F305/309K,S-Mutanten im Vergleich mit dem Wildtyp mit einer erhöhten Sekretion korrelierte.
Stabil transfizierte CHO-Zelllinien wurden gestaltet, welche die F309S-Mutante exprimierten. Von den 35 ursprünglich transfizierten CHO-Zellclonen, die für Dihydrofolat-Reduktaseexpression ausgewählt wurden, wurden 5 Clone erhalten, die erhebliche Mengen an FVIII (ungefähr 1 E/ml/10⁶ Zellen/Tag) exprimierten. Zwei dieser Clone exprimierten die gleiche Menge an FVIII wie die ursprüngliche 10A1-Zelllinie, die durch Durchmusterung von über 1000 ursprünglich transfizierten Zellclonen erhalten wurde. Kaufman, R.J. et al., J. Biol. Chem. 263:6352–6362 (1988). In niedrigen Methotrexat-Konzentrationen erlaubt die Mutation daher die einfachere Erlangung von hohen FVIII-Expressionsmengen.
Weitere Selektion in Methotrexat wird durchgeführt, um zu bestimmen, ob die maximale Produktivität von FVIII/Zelle verbessert ist. Experimente werden durchgeführt, um die BiP-Interaktion und ATP-Abhängigkeit für die Sekretion der funktionsfähigen FVIII-Mutante, F309W/S, in stabil transfizierten CHO-Zellen zu messen.
BEISPIEL 2
HERSTELLUNG UND ANALYSE VON APC-RESISTENTEM FAKTOR VIII
Experimentelle Verfahren
Materialien. Plasma mit FVIII-Mangel und normales vereinigtes menschliches Plasma wurden von der George King Biomedical Inc., (Overland Park, KS) erhalten. Monoclonale Antikörper gegen die schwere Kette von FVIII (F8) gekoppelt an CL4B-Sepharose wurde verwendet und können durch bekannte Verfahren erzeugt werden. Aktiviertes partielles Thromboplastin (automatisiertes APTT-Reagens) wurde von der General Diagnostic Organon Teknika Corporation (Durham, NC) erworben. Sojabohnen-Trypsininhibitor, Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und Aprotinin wurden von Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Germany) erworben. Menschliches α-Thrombin wurde von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erhalten. Menschliches APC wurde von Enzyme Research Laboratories Inc., (South Bend, IN) erworben. Dulbecco-modifiziertes-Eagle-Medium (DMEM), α-Modifizierung von Eagle-Medium (α-MEM) und Methionin-freies DMEM wurden von Gibco BRL (Gaithersburg, MD) erhalten. Fötales Rinderserum wurde von PAA-Laboratories Inc., (Newport Beach, CA) erworben.
Plasmidkonstruktion. Ortsspezifische Oligonucleotid-vermittelte Mutagenese wurde durch das „Gapped"-Heteroduplex-Verfahren durchgeführt, um wie vorher beschrieben Arg336IIe (R336I)- und/oder Arg562Lys (R562K)-Mutationen in die in den Expressionsvektor pED6 clonierte FVIII-cDNA einzuführen. Pittman, D.D. et al., Methods in Enzymology Bd. 222, (San Diego, CA; Academic Press, Inc.,) S. 236 (1993) und Toole, J.J. et al., PNAS (USA) 83:5939 (1986). Die Mutationen wurden durch umfassende Restriktionsendonuclease-Spaltung und DNA-Sequenzanlayse bestätigt. Die sich ergebenden Moleküle wurden als R336I oder R562K bezeichnet und die Doppelmutante, die hierin APC-resistenter FVIII genannt wurde, wurde als R336I/R562K bezeichnet. Zusätzlich wurde auch eine R336I/K338I-Doppelmutante konstruiert.
Analyse von Synthese und Sekretion. Plasmid-DNA wurde wie beschrieben durch das Diethylaminoethyl (DEAE)-Dextran-Verfahren in COS-1-Zellen transfiziert. Pittman, D.D. et al., Methods in Enzymology Bd. 222 (San Diego, CA; Academic Press, Inc.,) S. 236 (1993). Konditioniertes Medium wurde 60 Stunden nach der Transfektion in der Anwesenheit von 10% Hitze-inaktiviertem fötalem Rinderserum für den FVIII-Test geerntet. Anschließend wurden die Zellen wie vorher beschrieben mit [³⁵S]-Methionin metabolisch markiert. Pittman, D.D. et al., Methods in Enzymology Bd. 222 (San Diego, CA; Academic Press, Inc.,) S. 236 (1993). Markiertes konditioniertes Medium wurde geerntet und mit F8-Antikörper, gekoppelt an CL-4B-Sepharose, immunpräzipitiert. Immunpräzipitierte Proteine vom konditionierten Medium wurden mit PBS gewaschen, das Triton X-100 enthielt, in 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 2,5 mM CaCl₂ und 5% Glycerin (Puffer A) resuspendiert und mit oder ohne 8,5 E/ml Thrombin bei 37°C für 1 Stunde behandelt. Proben wurden durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) unter reduzierenden Bedingungen analysiert und nach Fluorographie durch Behandlung mit En3hance (Dupont; Boston, MA) durch Autroradiographie sichtbar gemacht.
Analyse der APC-Spaltung von FVIII. Radioaktiv markierter und immunpräzipitierter FVIII wurde mit Puffer A resuspendiert und mit 30 μg/ml Rinder-APC in der Anwesenheit von 100 μg/ml Inosithin und 10 mM CaCl₂ bei 37°C für 1,5 Stunden behandelt. Die daraus resultierenden Polypeptide wurden auf SDS-PAGE aufgetrennt und wie vorstehend beschrieben durch Autoradiographie sichtbar gemacht.
Erzeugung von CHO-Zelllinien und Reinigung von FVIII. Um große Mengen an FVIII zu erhalten, wurden stabil transfizierte CHO-Zelllinien gestaltet, die DNA enthielten, welche den Wildtyp und APC-resistenten FVIII codiert. Die Expressionsplasmide wurden mit Cla1 gespalten und unter Verwendung des Lipofektionsverfahren in CHO-Zellen transfiziert. Pittman, D.D. et al., Methods in Enzymology Bd. 222 (San Diego, CA; Academic Press, Inc.,) S. 236 (1993). Konditioniertes Medium wurde auf eine Säule von F8-Antikörper, gekoppelt an CL-4B-Sepharose, aufgetragen. Der gebundene FVIII wurde in Puffer eluiert, der 60% Ethylenglykol enthielt und durch Dialyse gegen einen 10% Polyethylenglykol (MW 15K–20K)-enthaltenden Puffer konzentriert. Fay, P.J. et al., J. Biol Chem. (im Druck) (1996). Konzentrierte Proben wurden gegen modifizierten Puffer A, der 5 mM CaCl₂ enthielt (Puffer B), dialysiert. Die FVIII-Gerinnungsaktivität der gereinigten Präparate waren etwa 20 E/ml. Die Struktur der gereinigten Proteine wurde durch SDS-PAGE und Silberfärbung (Bio-Rad Laboratories; Hercules, CA) evaluiert.
FVIII-Test. FVIII-Aktivitäten wurden in einem Ein-Schritt-Gerinnungstest unter Verwendung von FVIII-defizientem Plasma als Substrat gemessen. Eine Einheit der FVIII-Aktivität ist die Menge, die in 1 ml eines normalen menschlichen vereinigten Plasmas gemessen wird. Zur Thrombinaktivierung wurde konditioniertes Medium in Puffer A verdünnt und bei Raumtemperatur mit 1 E/ml Thrombin inkubiert. Nach Inkubation für zunehmende Zeitspannen wurden Aliquots verdünnt und auf FVIII-Aktivität überprüft.
APC-Inaktivierung von FVIII. Gereinigte FVIII-Proben, verdünnt auf 3 E/ml in Puffer B, wurden mit 100 μg/ml Inosithin und menschlichem APC mit 100 ng/ml gemischt, oder Puffer alleine als eine Kontrolle. Nach zunehmenden Zeitspannen bei 37°C wurden Aliquots verdünnt und der verbleibende FVIII wurde bestimmt.
Effekt von APC-resistentem FVIII im APC-Resistenztest. 20 E/ml an gereinigtem FVIII wurden mit Plasma mit FVIII-Mangel auf 1 E/ml verdünnt. Diese Proben wurden durch den im Handel erhältlichen APC-Resistenztest-Kit (Coatest APC Resistance; Chromogenix, Molndal, Schweden) laut Hersteller überprüft.
Ergebnisse
Mutierte FVIII-Moleküle R336I, R562K und R336I/R562K werden mit FVIII-Aktivität ähnlich zu Wildtyp FVIII, effizient sezerniert. Die Aktivität und Sekretion der FVIII-Mutanten wurde durch transiente DNA-Transfektion von COS-1-Affenzellen gemessen. Die FVIII-Gerinnungsaktivität im konditionierten Medium zeigte, dass alle Mutanten FVIII-Aktivität ähnlich zum Wildtyp FVIII aufwiesen, ungefähr 300 mE/ml (siehe Tabelle 1). Eine Thrombinaktivierung der konditionierten Mediumproben deutete darauf hin, dass es keinen Unterschied in der Rate der Thrombinaktivierung und dem Verfall der prokoagulatorischen Aktivität gab. Wie in 3 gezeigt, wurden alle Proben 10 Sekunden nach der Thrombinzugabe sofort aktiviert (3–5-fach) und wurden sofort inaktiviert. In 3 stellen die Symbole Wildtyp FVIII (X), R366I (•), R562K
und R336I/R562K
dar. Um FVIII-Sekretion zu messen, wurden transfizierte Zellen für 2 Stunden mit [³⁵S]-Methionin metabolisch markiert und dann mit einem Überschuss an unmarkiertem Methionin im Medium für 4 Stunden behandelt. Die sezernierten Proteine wurden durch Immunpräzipitation des markierten konditionierten Mediums analysiert. Wie in 4A gezeigt, wurden Wildtyp-FVIII und alle Mutanten bei ähnlichen Mengen sezerniert, wie eine 300 kDa-Einzelkette und eine 200 kDa-schwere Kette und eine 80 kDa-leicht Kette. Wie in 4B gezeigt, erzeugte die Thrombinspaltung für alle Moleküle die leichte Kette, die bei 73 kDa wanderte, sowie Fragmente, die von der schweren Kette stammen, die, wie erwartet, der 50 kDa-A1-Domäne und der 43 kDa-A2-Domäne entsprachen (4B). Außerdem gab es beim Wildtyp-FVIII und R562K (4B, Spuren 7 und 9) etwas Spaltung bei Rest 336, was eine 45 kDa-Spezies ergab. Im Gegensatz dazu erzeugten die R336I und R336I/562K (4B, Spuren 8 und 10)-Mutanten keine 45 kDa-Spezies, was darauf hindeutet, dass eine Isoleucinmutation bei Rest 336 gegen die Spaltung durch einen Überschuss an Thrombin resistent ist. Für 4A und 4B werden links molekulare Größenmarker gezeigt, „Kontrolle" stellt Zellen dar, die keine DNA erhalten haben, und eK, sK und IK stellt die Einzelkette, schwere Kette bzw. leichte Kette dar. TABELLE 1 FVIIII-Gerinnungsaktivität in konditioniertem Medium von transfizierten COS-1- Zellen

Daten stellen Mittel ± Standardabweichung dar

R562K ist gegen APC-Spaltung an der mutierten Stelle völlig resistent und R336I ist größtenteils resistent. APC-Spaltung von FVIIIa wurde durch Behandlung von [³⁵S]-Methionin markiertem, immunpräzipitiertem FVIII mit APC ausgewertet. Die Analyse der APC-Spaltungsprodukte des Wildtyp-FVIII, untersucht durch SDS-PAGE auf einem 5–15% Gradientengel, wies die schweren Kettenfragmente von 50 kDa und 45 kDa nach, welche die A1-Domäne repräsentieren, und von 43 kDa, welche die A2-Domäne repräsentiert, die nicht im konditionierten Zellmedium vorhanden waren, das keine DNA erhielt. Wie in 5A Spalte 2 gezeigt, war ein Produkt mit niedrigerem Molekulargewicht bei 25 kDa nachweisbar, welches den Carboxyterminus der A2-Domäne darstellt. Wie in 5A, Spalte 3 gezeigt, war R336I-FVIII teilweise gegen Spaltung bei Rest 336 resistent, wie durch eine Zunahme der 50 kDa- und eine Verminderung der 43 kDa-Spaltprodukte, verglichen mit dem Wildtyp, ersichtlich ist. Die R336I zeigte keine Änderung in der Menge der 25 kDa-Spezies, was darauf hindeutet, dass bei Rest 562 eine effiziente Spaltung stattfindet. Wie in 5A, Spalte 4, gezeigt war die R562K-FVIII-Mutante gegen die Spaltung bei Rest 562 resistent, wie durch die Zunahme des 43 kDa-Fragments und durch den Verlust des 25 kDa-Fragments gezeigt wird. Die R562K-Mutante wurde jedoch bei 336 effizient gespalten, wie durch ein 45 kDa-Fragment gezeigt wird. APC-Behandlung der R336I/R562K-Doppelmutante ergab eine Zunahme in den 50 kDa und 43 kDa-Spezies und die Verminderung der 45 kDa- und Verlust der 25 kDa-Spezies, verglichen mit dem Wildtyp FVIII (siehe 5A, Spalte 5). Die Migration des 45 kDa Fragments, das von der APC-Spaltung der R336I-Mutante stammt, war gemäß der Analyse durch SDS-PAGE auf einem 8% Polyacrylamidgel etwas vermindert (siehe 5B, vergleiche Spuren 7 und 8). Um zu bestimmen, ob diese Mutante an dem benachbarten Lysin bei Rest 338 gespalten werden kann, wurde eine R336I und K338I-Doppelmutante durch ortsspezifische Mutagenese erzeugt. Die R336I/K338I-Mutante hat nach der APC-Spaltung kein 45 kDa-Fragment erzeugt (siehe 5B, Spur 9). In 5A und 5B werden auf der linken Seite Molekulargewichtsmarker gezeigt, und „Kontrolle" stellt Zellen dar, die keine DNA erhalten haben.
In FVIII wird Mutagenese sowohl an Arg336 als auch Arg562 benötigt, um Resistenz gegen APC-Aktivierung zu vermitteln. Von Willebrand-Faktor (vWF) hemmt die APC-Inaktivierung von FVIII. Koedam, J.A. et al., J. Clin. Invest. 82:1236 (1988) und Fay, P.J. et al., J. Biol. Chem. 266:2172 (1991). Um APC-Inaktivierung zu untersuchen, wurden daher stabil transfizierte CHO-Zellen gestaltet, die Wildtyp- und APC-Spaltungsstellen-Mutanten-FVIII-Moleküle exprimieren. Konditioniertes Medium wurde zur FVIII-Reinigung gesammelt. Wie in 6 gezeigt, bewies die Analyse der gereinigten Proteine durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen sowie Silberfärbung, dass alle Moleküle ähnliche Polypeptidzusammensetzungen der schweren Kette (sK) und leichten Kette (IK), mit minimalem Abbau und Abwesenheit von vWF aufwiesen. Diese gereinigten Proteine wurden dann auf funktionelle Inaktivierung durch APC analysiert. Wie in 7A gezeigt, war die Aktivität aller Proben, außer der R336I/562K
-Doppelmutante nach 10 Minuten Inkubation bei 37°C, in der Abwesenheit von APC, auf 80% reduziert und anschließend für 60 Minuten danach stabil. In der Anwesenheit von APC hatte der Wildtyp-FVIII (X) eine Restaktivität von 38% bei 10 Minuten und 8% bei 60 Minuten. In der Anwesenheit von APC war die Inaktivierung der R336I (•)- und R562K
-Einzelmutanten ähnlich und beide langsamer als Wildtyp-FVIII. Nach 60 Minuten verblieben 41% und 30% der ursprünglichen Aktivität für die R336I-bzw. R562K-Mutanten. Im Gegensatz dazu war die R336I/562K
-Doppelmutante gegen Inaktivierung resistent und behielt 76% der Aktivität nach 60 Minuten bei. Die Ergebnisse zeigten daher, dass die R336I/562K-Doppelmutante größtenteils resistent war und beide Einzelmutanten nur teilweise resistent gegen die APC-Inaktivierung waren.
Fähigkeit des APC-Resistenztest-Kits APC-resistenten FVIII nachzuweisen. Zurzeit wird ein im Handel erhältlicher APC-Resistenztest-Kit (Coatest APC Resistance; Chromogenix, Molndal, Sweden) verwendet, um das Plasma von Patienten mit thrombotischer Erkrankung zu durchmustern, die mit der FV R506Q-Mutation in Zusammenhang steht. Die Fähigkeit dieses Kits APC-resistenten FVIII nachzuweisen wurde durch Rekonstruktion von Plasma mit FVIII-Mangel, entweder mit gereinigtem Wildtyp oder gereinigtem, mutiertem FVIII, überprüft. Die APC-Resistenzrate wurde durch Messung der Gerinnungszeit in der Anwesenheit von APC geteilt durch die Gerinnungszeit in der Abwesenheit von APC (siehe Tabelle 2) berechnet. Nur die R336I/R562K- Doppelmutante zeigte eine niedrigere APC-Resistenzrate als 2, ein Wert, der auf einen APC-resistenten Phänotyp schließen lässt. Svensson, P.J. et al., N. Engl. J. Med. 336:517 (1994). TABELLE 2 APC-Resistenzrate von Wildtyp-FVIII und Mutanten im kommerziell erhältlichen Testkits

Daten stellen Mittel ± Standardabweichung dar

Diskussion
Alle Mutanten wurden mit einer FVIII-Aktivität ähnlich der des Wildtyps effizient von COS-1 Zellen sezerniert. Die Analyse der APC-Spaltung wurde durch [³⁵S]-Methioninmarkierung des Proteins und Analyse von FVIII im konditionierten Medium nach Immunpräzipitation durchgeführt. Die R336I-Mutante war teilweise gegen die Spaltung bei Rest 336 resistent, war aber anfällig für die Spaltung bei Arg562. Andererseits war die R562K-Mutante völlig resistent gegen eine Spaltung bei Rest 562, war aber anfällig für die Spaltung bei Arg336. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass jede Einzelmutation bei Arg336 oder Arg562 die Spaltung an der mutierten Stelle beeinflusst und dass es für diese beiden Stellen in FVIII für die APC-Spaltung keine vorgeschriebene Reihenfolge gibt. Die Doppelmutante R336I/R562K war teilweise resistent gegen Spaltung bei Rest 336 und völlig resistent bei Rest 562. Die Spaltung von R336I trat wahrscheinlich an einem benachbarten Rest, Lys 338, auf, da eine Doppelmutante von R336I/R338I völlig resistent gegen die Spaltung an dieser Stelle war. Diese Ergebnisse zeigen, dass die APC-Spaltung von FVIII zerstückelt sein kann, d.h. sie weist keine stringenten Abstandserfordernisse für die Spaltung auf.
Die Kinetikanalyse der APC-Spaltung in FVIII deutet darauf hin, dass Arg562 verglichen mit Arg336 vorzugsweise gespalten wurde, und diese anfängliche Spaltung korrelierte am ehesten mit dem Verlust der Cofaktoraktivität. Fay, P.J. et al., J. Biol. Chem. 266:20139 (1991). Die langsamere Inaktivierung der R562K-Einzelmutante, als eine Konsequenz der Spaltungsresistenz bei Rest 562, ist konsistent mit der Hypothese und dass die resultierende Inaktivierung eine Folge der Spaltung bei Arg336 war. Die R336I-Einzelmutante wurde jedoch durch Spaltung bei Arg562 nur teilweise inaktiviert. Es ist gezeigt worden, dass beide einzelnen Spaltungsstellen-Mutanten unter den hierin beschriebenen Bedingungen mit ähnlicher Geschwindigkeit inaktiviert wurden. In der Annahme, dass die Spaltung bei Arg336 und Arg562 zur gleichen Zeit stattfindet, scheinen die Auswirkungen der Spaltung, entweder bei Arg336 oder Arg562, auf die Inaktivierung von FVIII ähnlich zu sein. Die schnelle Inaktivierung von Wildtyp FVIII kann die Folge von synergistischen Rollen der Spaltung bei Arg336 und Arg562 für die Inaktivierung von FVIII sein.
Gegenwärtig gibt es keine Berichte, welche Patienten mit Mutationen in den APC-Spaltungsstellen von FVIII beschreiben. Um zu beurteilen, ob diese Mutationen einen APC-resistenten Phänotyp aufweisen würden, wurden die FVIII-Moleküle mit dem im Handel erhältlichen APC-Resistenztest-Kit (Coatest APC Resistance; Chromogenix, Molndal, Sweden) untersucht. Nur die R336I/R562K-Doppelmutante zeigte eine niedrigere APC-Resistenzrate. Dieser Testkit kann daher keine der einzelnen APC-Spaltungsstellenmutanten von FVIII nachweisen. Im Gegensatz zu FVIII zeigten beide FV-APC-Einzelspaltungsstellen-Mutanten Arg306Gln und Arg506Gln, verminderte APC-Resistenzanteile in diesem Test. Die Ergebnisse zeigen daher, dass der im Handel erhältliche APC-Resistenzkit FVIII-APC-resistente Mutanten nicht nachweisen wird, außer wenn beide APC-Spaltungsstellen gehemmt sind.
BEISPIEL 3
HERSTELLUNG UND ANALYSE DES INAKTIVIERUNGSRESISTENTEN FAKTORS VIII
Experimentelle Verfahren
Materialien. Ein monoclonaler Antikörper gegen die schwere Kette von Faktor VIII (F-8), F-8 konjugiert an CL-4B-Sepharose und gereinigtes, rekombinantes Faktor VIII-Protein wurden von Genetics Institute Inc. (Cambridge, MA) erhalten. Mit Meerrettich-Peroxidase konjugierter Anti-menschlicher vWF-Kaninchen-Antikörper wurde von Dako Corp. (Carpinteria, CA) erhalten. Monoclonale Antikörper gegen die leichte Kette von Faktor VIII, ESH-4 und ESH-8, wurden von American Diagnostica, Inc., (Greenwich, CT) erworben. Plasma mit Faktor VIII-Mangel und normales, vereinigtes menschliches Plasma wurde von der George King Biomedical, Inc. (Overland Park, KS) erworben. Aktiviertes partielles Thromboplastin (automatisiertes APTT-Reagens) und CaCl₂ wurden von der General Diagnostic Organon Teknika Corporation (Durham, NC) erhalten. Menschliches Thrombin, Sojabohnen-Trypsininhibitor, Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und Aprotinin wurden von Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Germany) erhalten. O-Phenylendiamindihydrochlorid (OPD) wurde von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erhalten. [³⁵S]-Methionin (>1000Ci/mmol) wurde von Amersham Corp. (Arlington Heights, IL) erhalten. En³Hance wurde von Dupont (Boston, MA) erhalten. Fötales Rinderserum wurde von PAA-Laboratories Inc. (Newport Beach, CA) erhalten. Dulbecco-modifiziertes-Eagle-Medium (DMEM), Methionin-freies DMEM, OptiMEM, Biotin N-Hydroxysuccinimidester und Streptavidin-Meerrettichperoxidase-Konjugat wurden von Gibco BRL (Gaithersburg, MD) erhalten.
Plasmidmutagenese. Mutagenese wurde innerhalb des Säuger-Expressionsvektors pMT₂(37) durchgeführt, der FVIII-cDNA(pMT₂VIII) enthielt. Mutierte Plasmide wurden durch ortspezifische Mutagenese mit Oligonucleotiden unter Nutzung der Polymerasekettenreaktion (PCR) erzeugt. Für eine ausführliche Beschreibung der ortspezifischen Mutagenese siehe Smith, M., Annu. Rev. Genet. 19:423 (1985).
Konstruktion 1–90/73 R740K. Vektor pMT₂90/73 wurde als die DNA-Matrize verwendet. Das 90/73-Konstrukt wird in Nesheim, M. et al., J. Biol. Chem. 266: 17815–17820 (1991) und Pittman, D. et al., Blood 70, Abstraktnummer 392 (1987) beschrieben. Im Allgemeinen ist das 90/73-Konstrukt eine Wildtyp-FVIII-cDNA-Sequenz, in welcher die B-Domäne und die vWF-Bindungstelle (saurer Bereich der leichten Kette) deletiert worden sind (del 741–1689). Oligonucleotid-spezifische Mutagenese wurde verwendet, um ein PCR-Fragment, Kpnl/R740K/Apal, zu erzeugen, und wurde in mit Kpnl/Apal gespaltenen pMT₂90/73 ligiert.
Konstruktion 2–90/b/73 R740K. Vektor pMT₂VIII wurde als die DNA-Matrize verwendet. Oligonucleotid-spezifische Mutagenese wurde verwendet, um ein PCR-Fragment, Kpnl/b/1689 Mlul (wobei b eine DNA-Sequenz darstellt, welche die Aminosäurereste 741 bis 793 des Wildtypsequenz codiert, gefolgt von einer Mlul-Stelle, welche die Aminosäuren Threonin und Arginin bei den Resten 794 und 795/1689 voraussagt) zu erzeugen, das in den mit Kpnl/Mlul-gespaltenen Vektor pMT₂VIII/1689/Mlul ligiert wurde. Die folgende Aminosäuresequenz (und die das Gleiche codierende Nucleotidsequenz) ist der bevorzugte Aminosäurenspacer, wobei Rest 794 Threonin oder Leucin sein kann und vorzugsweise Threonin ist:
Konstruktion 3 – 90/b/73 R740A. Vektor 90/b/73 wurde als die DNA-Matrize verwendet (wobei b vorstehend beschrieben wird und Threonin am Rest 794 codiert). Oligonucleotid-spezifische Mutagenese wurde verwendet, um ein PCR-Fragment, Kpnl/R740A/b/Apal, zu erzeugen, das in den mit Kpnl/Apal-gespaltenen pMT₂90/73 ligiert wurde.
Konstruktion 4 – 90/b/73 R740A/R1689A (DM1). Vektor 90/b/73 R740A wurde als die DNA-Matrize verwendet (wobei b vorstehend beschrieben wird und Leucin am Rest 794 codiert). Oligonucleotid-spezifische Mutagenese wurde verwendet, um ein PCR-Fragment, Kpnl/R740A/b/R1689A/Apal, zu erzeugen, das in den mit Kpnl/Apal-gespaltenen pMT₂90/73 ligiert wurde.
Konstruktion 5 – 90/b/73 R336I/R740A (DM2). Vektor pMT₂VIII/R336I wurde mit Spel und Kpnl gespalten. Das Fragment wurde in mit Spel/Kpnl gespaltenen 90/b/73 R740A ligiert (wobei b vorstehend beschrieben wird und Threonin am Rest 794 codiert).
Konstruktion 6 – 90/b/73 R336I/R562K/R740A (IR8). Vektor pMT₂VIII/R562K wurde mit Bglll und Kpnl gespalten. Das Bglll/R562K/Kpnl-Fragment wurde in den mit Bglll/Kpnl gespaltenen 90/b/73 R336I/R740A ligiert (wobei b vorstehend beschrieben wird und Threonin bei Rest 794 codiert).
Das Plasmid, welches die Wildtyp-FVIII cDNA-Sequenz enthält, wurde als FVIII WT bezeichnet. Alle Plasmide wurden mit Zentrifugation durch Cäsiumchlorid gereinigt und durch Restriktionsendonuclease-Spaltung und DNA-Sequenzanalyse charakterisiert.
DNA-Transfektion und Analyse. Plasmid-DNA wurde durch das DEAE-Dextran-Verfahren in COS-1-Zellen transfiziert. Konditioniertes Medium wurde 64 Stunden nach der Transfektion in Anwesenheit von 10% fötalem Rinderserum geerntet. FVIII-Aktivität wurde durch einen Ein-Schritt-APTT-Gerinnungstest in einem MLA Electra 750-Gerät gemessen. Proteinsynthese und Sekretion wurden durch metabolische Markierung der Zellen 64 Stunden nach der Transfektion für 30 Minuten mit [35S]-Methionin (300 mCi/ml in Methionin-freiem Medium), gefolgt von einem Chase für 4 Stunden in einem Medium mit 100-fachem Überschuss an unmarkiertem Methionin und 0,02% Aprotinin. Zellextrakte und konditioniertes Medium, das markiertes Protein enthielt, wurden geerntet. WT und mutierte FVIII-Proteine wurden aus gleichen Anteilen an Zellextrakt und konditioniertem Medium mit F-8, gekoppelt an CL-4B-Sepharose, immunpräzipitiert. Die Immunpräzipitate wurden gewaschen und in Laemmli-Probenpuffer resuspendiert. Die Proben wurden durch Elektrophorese auf einem reduzierenden SDS-niedrig bis-8% Polyacrylamidgel analysiert. Die Gele wurden mit En³Hance behandelt und die Proteine durch Autoradiographie sichtbar gemacht.
Proteinreinigung. Teilweise gereinigtes IR8-Protein wurde aus 200 ml konditioniertem Medium von transient transfizierten COS-1-Zellen durch Immunaffinitätschromatographie erhalten. Teilweise gereinigtes FVIII-WT-Protein wurde aus 200 ml konditioniertem Medium von stabil transformierten CHO-Zellen erhalten und in der gleichen Weise Immunaffinitäts-gereinigt. Die in den Ethylenglycol enthaltenden Puffer eluierten Proteine wurden dialysiert und gegen einen Polyethylenglycol (MW ~15-20.000) enthaltenden Puffer konzentriert und bei –70°C gelagert.
FVIII-Aktivitätstest. FVIII-Aktivität wurde in einem Ein-Schritt-APTT-Gerinnungstest durch Rekonstitution von menschlichem Plasma mit FVIII-Mangel gemessen. Für Thrombinaktivierung wurden Proteinproben in 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 2,5 mM CaCl₂ und 5% Glycerin verdünnt und bei Raumtemperatur mit 1 E/ml Thrombin inkubiert. Nach Inkubation für zunehmende Zeitspannen wurden Aliquots verdünnt und auf FVIII-Aktivität getestet. Eine Einheit an FVIII-Aktivität ist die Menge gemessen in 1 ml an normalem menschlichem, vereinigtem Plasma.
FVIII-Antigenbestimmung. FVIII-Antigen wurde unter Verwendung eines Sandwich-ELISA-Verfahrens unter Nutzung der Antikörper gegen die leichte Kette, ESH-4 und ESH-8, quantifiziert. Gereinigtes rekombinantes FVIII-Protein wurde als ein Standard verwendet.
Ergebnisse
Erzeugung von FVIII-Inaktivierungsresistenz. Alle der vorstehend erwähnten Konstrukte basieren auf 90/73, wobei die B-Domäne (Reste 795 bis 1647) und die vWF-Bindungsstelle (Reste 1648 bis 1688, die auch als der saure Bereich des Aminoterminus der leichten Kette bezeichnet werden) deletiert worden sind. Nesheim, M. et al., J. Biol. Chem. 266: 17815–17820 (1991) und Pittman, D. et al., Blood 70, Abstrakt Nr. 392 (1987). 8 legt die Domänenstrukturen des Wildtyp-FVIII und der vorstehenden Konstrukte sowie der Mutationen an den APC- und Thrombin-Spaltungsstellen dar. Wie hierin und in 8 beschrieben, stellt „b" den Aminosäuresequenzspacer dar, der ausreichend lang ist, um dem Protein eine Aktivierung durch Thrombin zu ermöglichen, um ein Heterodimer zu erhalten, wobei die A2-Domäne kovalent mit der leichten Kette verbunden bleibt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Aminosäuresequenzspacer vorzugsweise der Aminoanteil der Wildtyp-B-Domäne, d.h. Aminosäurereste 741 bis 793 gefolgt von einer Mlul-Stelle (zu Clonierungszwecken), welche die Aminosäuren Threonin oder Leucin, vorzugsweise Threonin am Rest 794 und Arginin bei 795/1689 voraussagt.
8 legt ein Aktivierungsmodell der Konstrukte der vorliegenden Erfindung dar. Wildtyp-FVIII und die Mutante 90/73 erzielen beide ein Heterotrimer nach Aktivierung durch Thrombin. Wenn ein Aminosäuresequenzspacer zwischen die A2- und A3-Domänen von 90/73 eingeführt wird, der eine Mutation an der Thrombin-Spaltungsstelle enthält (del795-1688/Arg336Iso/Arg562Lys/Arg740Ala) tritt nach Aktivierung mit Thrombin nur nach Arg372 eine Spaltung auf, die ein FVIIIa-Heterodimer erzeugt. Dieses neue FVIII-Protein, das als IR8 bezeichnet wird, behält eine stabile Aktivität nach der Thrombinaktivierung bei.
Synthese und Sekretion von IR8. FVIII-WT und die verschiedenen inaktivierungsresistenten Mutanten wurden durch transiente DNA-Transfektion der cDNA-Expressionsvektoren in COS-1-Affenzellen verglichen. 60 Stunden nach der Transfektion wurden die Syntheseraten durch Immunpräzipitation von Zellextrakten aus mit [³⁵S]-Methionin pulsmarkierten Zellen analysiert. Intrazellularer FVIII-WT wurde in seiner einkettigen Form nachgewiesen und wanderte bei ungefähr 250 kDa (10, Spur 1). Das mutierte 90/80 ist eine früher charakterisierte BDD-FVIII-Mutante (del741-1648), die bei 170 kDa wandert und in Übereinstimmung mit erhöhter Syntheseeffizienz (10, Spur 3) eine erhöhte Intensität aus pulsmarkierten Zellextrakten zeigt. 90/73 wandert aufgrund der zusätzlichen Deletion der Reste des sauren Bereiches ein wenig rascher (10, Spur 5). Alle auf 90/b/73 basierende Konstrukte, einschließlich IR8, zeigten ähnliche Bandenintensität wie die 90/80- und 90/73-Konstrukte, was darauf hindeutet, dass die mehrfachen Missense-Mutationen nicht mit der effizienten Proteinsynthese interferieren. Zusätzliche Banden innerhalb des Zellextraktes wurden im Kontroll-Zellextrakt nicht beobachtet, der mit einem Anti-FVIII-spezifischen Antikörper immunpräzipitiert wurde, und stellen sowohl FVIII-spezifische Proteine als auch gleichzeitig immunpräzipitierte intrazelluläre Proteine dar. Nach einer 4-stündigen Chaseperiode ist der größte Teil des FVIII-WT aus dem Zellextrakt verschwunden (10, Spur 2) und kann von dem durch den Chase konditionierten Medium in seinen 280 kDa Einzelketten-, 200 kDa schweren Ketten- und 80 kDa leichten Kettenformen gewonnen werden ( 10, Spur 3). Obwohl alle der BDD und inaktivierungsresistenten Mutanten zeigten, dass erhebliche Mengen ihrer primären Translationsprodukte nach dem 4-stündigen Chase mit einem Überschuss an unmarkiertem Methionin innerhalb des Zellextraktes verbleiben (10, Spuren 4, 6, 8, 10, 12), wurden sie alle von dem durch den Chase konditionierten Medium als eine einkettige Spezies gewonnen (11, Spuren 5, 7, 9, 11, 13). Die verschiedenen Änderungen des FVIII-Konstrukts haben daher keine wesentliche Auswirkung auf die Sekretion gehabt.
Strukturelle Stabilität von IR8 nach Thrombinspaltung. Die markierten FVIII-Proteine, die von dem durch den Chase konditionierten Medium immunpräzipitierten, wurden vor der SDS-PAGE-Analyse mit Thrombin (1 E/ml) für 30 Minuten inkubiert. FVIII-WT wurde effizient in ein Heterotrimer an Fragmenten gespalten, die aus einer 50 kDa A1-Unterinheit, 43 kDa A2-Untereinheit und 73 kDa Thrombin-gespaltenen leichten Kette, A3-C1-C2 (11, Spur 4), bestanden. 90/73- WT wurde auch in ein Heterotrimer aus Untereinheiten ähnlich dem FVIII-WT gespalten (11, Spur 6), übereinstimmend mit früheren und in 1A dargestellten Beobachtungen. 90/73 Arg740Lys erzeugte ein Heterodimer aus Thrombin-gespaltenen Untereinheiten, übereinstimmend mit einer 50 kDa-A1 Untereinheit und einer A2-A3-C1-C2-fusionierten leichten Kette (11, Spur 8). 90/b/73 Arg740Lys zeigte Thrombin-Spaltungsfragmente, übereinstimmend mit 2 heteromeren Spezies, einem 50 kDa- A1/120 kDa A2-b-A3-C1-C2-Heterodimer, sowie einer 43 kDa-A2-Untereinheit und einem ~85 kDa-Fragment, übereinstimmend mit einer b-A3-C1-C2-fusionierten leichten Kette (11, Spur 10). Das Auftauchen der A2-Untereinheit nach Inkubation mit Thrombin wies darauf hin, dass Lys740 die Thrombinspaltung in der Anwesenheit von Spacer b nicht vollständig aufhob. Mit der radikaleren Missense-Mutation an Ala740 wurde eine stabile heterodimere Spezies gezeigt (11, Spur 12). Diese nach Thrombinspaltung stabile heterodimere Struktur wurde für IR8 mit Additionen der Missense-Mutationen Arg336Iso und Arg562Lys beibehalten (11, Spur 14).
Funktionelle Stabilität von IR8 nach Thrombinaktivierung. Nachdem die strukturelle Integrität des IR8-Heterodimers nach der Thrombinspaltung bewiesen war, wurde die funktionelle Konsequenz dieser Modifikation bei Aktivierung und Inaktivierung in einem funktionellen in vitro-Test untersucht. Immunaffinitätsgereinigter FVIII-WT und IR8 wurden mit Thrombin inkubiert und durch einen Ein-Schritt-APTT-Gerinnungstest auf FVIII-Aktivität untersucht. Ein Beispiel der funktionellen Aktivierung und Inaktivierung wird in 12 dargestellt und ist für mehrfache Wiederholungsexperimente typisch. Unter diesen Bedingungen wurde FVIII-WT innerhalb der ersten 10 Sekunden der Inkubation mit Thrombin maximal aktiviert, dann über die nächsten 5 Minuten rasch inaktiviert. IR8 hat am Ende einer 30 Sekunden-Inkubation mit Thrombin die Peak-Aktivität nicht erreicht, was verglichen mit FVIII-WT auf eine leicht verminderte Sensitivität gegen Thrombinaktivierung hinweist. Außerdem war die Peak-Aktivität für Thrombinaktiviertes IR8 niedriger (74,7 + 6,7% an Peak-Thrombin-aktivierter FVIII-WT-Aktivität, n=3), was auf etwas reduzierte Effizienz als ein Cofaktor hinweist. IR8 zeigte jedoch eine wesentliche Beibehaltung der Peak-Aktivität über die ersten 10 Minuten der Inkubation mit Thrombin (66,9 + 5,3% der Peak-IR8-Aktivität, n=3), eine Zeitspanne, in welcher FVIII-WT fast vollständig inaktiviert wurde. Obwohl es bei verlängerter Inkubation mit Thrombin zu einem allmählichen Verlust der Peak-IR8- Aktivität kommt, behält IR8 trotzdem ~38% der Peakaktivität nach 4-stündiger Inkubation mit Thrombin bei.
IR8 zeigt in vitro erhöhte FVIII-spezifische Aktivität. Immunaffinitätsgereinigter FVIII-WT und IR8 werden unter Nutzung eines Standard-Ein-Schritt APTT-Gerinnungstests auf FVIII-Aktivität hin untersucht, wobei der erste Zeitpunkt 10 Sekunden war. Antigenbestimmungen wurden unter Nutzung eines auf der leichten Kette von FVIII basierenden ELISAs durchgeführt. 13 zeigt die Aktivierung und die verminderte Inaktivierungsrate, ausgedrückt als spezifische Aktivität. Die spezifischen Aktivitätswerte für IR8 wurden basierend auf einer Korrektur für sein Molekulargewicht berechnet. Von IR8 wurde beobachtet, dass er verglichen mit FVIII-WT eine 5-fache Erhöhung an spezifischer Aktivität aufweist (102 ± 43 verglichen mit 18,6 ± 7,4 E/ml Protein).
BEISPIEL 4
INDUZIERBARE vWF-BINDUNG VON INAKTIVIERUNGS-RESISTENTEM FAKTOR VIII
Experimentelle Verfahren
Immulon 2-Mikrotiter-Vertiefungen (Dynatech Laboratories, Inc., Chantilly, VA) wurden bei einer Konzentration von 2 μg/ml über Nacht bei 4°C in einem Puffer von 0,05 M Natriumcarbonat/Bicarbonat pH 9,6 mit FVIII-Antikörper beschichtet. Die Vertiefungen wurden mit TBST (50 mM Tris-HCl/pH 7,6, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20) gewaschen und dann mit 3% Rinderserumalbumin (BSA) in TBST blockiert. Proteinproben wurden in TBST, 3% BSA, 1% menschlichem Plasma mit Faktor VIII-Mangel +/- ESH8 (molekulares Verhältnis von ESH8:FVIII-Protein = 2:1) verdünnt. Die Proben wurden für 2 Stunden bei 37°C in 1,7 ml-Mikrozentrifugenröhrchen inkubiert. Die Proben wurden dann für weitere 2 Stunden in den blockierten und gewaschenen Mikrotitervertiefungen inkubiert. Die Vertiefungen wurden dann in TBST gewaschen, das 10 mM CaCl₂ enthielt. Anti-vWF-Meerrettichperoxidase-Antikörper wurden in TBST, 3% BSA, 10 mM CaCl₂ verdünnt und in den Vertiefungen für 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach zusätzlichem Waschen mit TBST, das 10 mM CaCl₂ enthielt, wurde das OPD-Substrat zu den Vertiefungen hinzugefügt und für 3 Minuten inkubiert. Die Farbereaktion wurde mit 2 M H₂SO₄ beendet und die optische Dichte (O.D.) bei 490 nm unter Verwendung eines automatisierten EL 340 Mikroplattenlesegeräts (Biotek Instruments Inc., Winooski, VT) abgelesen.
Ergebnisse
14 zeigt die Ergebnisse des FVIII-vWF-Bindungs-ELISAs. Eine Anti-A2-Domänenfalle wurde verwendet. Nach einer 4-stündigen Inkubation mit Plasma mit FVIII-Mangel (1:100 Verdünnung) wurde Bindung durch mit Peroxidase konjugiertem Anti-vWFAk nachgewiesen. Wie in 14 gezeigt, wird im Vergleich mit Wildtyp-FVIII eine 10-fach niedrigere Bindungsaffinität von IR8 zu vWF in der Abwesenheit von ESH8 beobachtet und in der Anwesenheit von ESH8 wird eine 2-fach niedrigere Bindungsaktivität beobachtet.
15 zeigt die Ergebnisse des FVIII-vWF-Bindungs-ELISAs mit Thrombin (IIa) und/oder ESH8. In einer 4-stündigen Inkubation mit IIa (1 E/ml) in der Anwesenheit von FVIII-defizientem Plasma wurde das gleiche ELISA-Verfahren angewandt, jedoch mit einem 2-fachen molaren Überschuss an ESH8. Wie in 15 gezeigt, behält IR8 nach Thrombinaktivierung die Aktivität für vWF bei, was darauf hindeutet, dass das Heterodimer nach der Thrombinspaltung intakt ist und ESH8 die Konformation der leichten Kette so stabilisiert, dass sie etwas Aktivität für vWF beibehält.
Nachdem der vorstehend beschriebene Bindungstest einen „Fallen"-Antikörper benützt, der nur die A2-Domäne von FVIII erkennt, wird er nur FVIII-vWF-Komplexe erkennen, welche die A2-Domäne in Verbindung mit dem Rest des Proteins erkennen. Nach einer 4-stündigen Inkubation des Proteins in der Anwesenheit von überschüssigem Thrombin, wird der FVIII-Wildtyp daher nicht nur vollständig aktiviert worden sein, sondern wird auch durch A2-Dissoziation und/oder weitere proteolytische Spaltungen völlig inaktiviert worden sein und wird sich nicht länger mit vWF in einem Komplex verbinden, der durch diesen Test erkannt wird. Der inaktivierungsresistente FVIII behält dadurch die induzierbare Bindung sogar nach vollständiger Aktivierung durch Thrombin bei.
Es ist auch gezeigt worden, dass die induzierbare vWF-Bindungsform des inaktivierungsresistenten FVIII die Aktivität beibehielt. In diesem Test wurde ein Anti-vWF-Antikörper als die „Falle" für den ELISA verwendet. Die gleiche Inkubation wurde in der Anwesenheit und Abwesenheit von Thrombin und ESH8 durchgeführt.
Nach Immobilisierung des FVIII-vWF-Komplexes auf der Platte wurde die FVIII-Aktivität unter Verwendung eines chromogenen FVIII-Testkits (Coamatic, Pharmacia Hepar, Franklin, OH) innerhalb der ELISA-Vertiefungen gemessen. Wie in 16 gezeigt, wurden nach der Aktivierung durch Thrombin keine nachweisbar aktiven FVIII-vWF-Komplexe für FVIII-Wildtyp beobachtet. Der Inaktivierungsresistente FVIII wies unter den gleichen Bedingungen jedoch noch immer nachweisbare Aktivität auf. Das deutet darauf hin, dass der inaktivierungsresistente FVIII nach der Thrombinaktivierung in ein Heterodimer von A1 gespalten wird, in Verbindung mit einer modifizierten leichten Kette von A2-b-A3-C1-C2, welche ESH8-induzierbare Bindung an vWF aufweist und FVIII-Aktivität beibehält.
Die funktionelle Auswirkung dieses ESH8-induzierten IR8-vWF-Kompleses wurde auch durch Testen auf FVIII-Aktivität über APTT (Tabelle 3) ausgewertet. In der Abwesenheit von ESH8 zeigten Immunaffinitäts-gereinigter FVIII-WT und IR8 minimalen Aktivitätsverlust über eine 4-stündige Inkubation bei 37°C mit Plasma mit FVIII-Mangel. In der Anwesenheit von ESH8 war die FVIII-WT-Aktivität zu ungefähr 70% gehemmt, wohingegen IR8 100% seiner ursprünglichen Aktivität beibehielt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Inaktivierung des FVIII-WT in der Anwesenheit von ESH8 an der A2-Untereinheitdissoziation liegen könnte und IR8 gegen die Inaktivierung durch ESH8 resistent ist, da es für die A2-Untereinheitdissoziation nicht anfällig ist.
TABELLE 3 ESH8 inhibiert IR8-Aktivität in der Anwesenheit von vWF nicht
BEISPIEL 5
ARZNEIMITTEL UND VERWENDUNG
Arzneimittel
Die FVIII-Proteine der vorliegenden Erfindung können mit parenteral verträglichen Vehikeln und Hilfsmitteln gemäß im Fachgebiet bekannten Verfahren zu pharmazeutisch verträglichen Zusammensetzungen gestaltet werden. Die für parenterale Verabreichung geeigneten Arzneimittel dieser Erfindung können geeigneterweise ein steriles lyophilisiertes Präparat des Proteins umfassen, welches durch Hinzufügen einer sterilen Lösung rekonstituiert werden kann, um vorzugsweise mit dem Blut des Empfängers isotonische Lösungen zu ergeben. Das Präparat kann in Behältern als Einzel- oder Mehrfachdosis dargeboten werden, z.B. in abgedichteten Ampullen oder Röhrchen.
Solche Arzneimittel können pharmazeutisch verträgliche Träger, Verdünnungsmittel, Füllstoffe, Salze, Puffer, Stabilisatoren und/oder andere im Fachgebiet gut bekannte Materialien enthalten. Der Begriff „pharmazeutisch verträglich" bedeutet ein nicht-toxisches Material, welches die Effektivität der biologischen Aktivität des (der) aktiven Bestandteil(e)s nicht störend beeinflusst. Die Eigenschaften des Trägers, oder eines anderen Materials wird vom Verabreichungsweg abhängen.
Die Menge an FVIII-Protein im Arzneimittel der vorliegenden Erfindung wird von der Art und Schwere des zu behandelnden Leidens abhängen und der Art der vorherigen Behandlungen, die der Patient durchgemacht hat. Schlussendlich wird der behandelnde Arzt entscheiden, mit welcher Menge an Protein jeder einzelne Patient behandelt werden soll. Ebenso wird die Dauer der intravenösen Therapie variieren, abhängig von der Schwere der zu behandelnden Krankheit und dem Zustand und der möglichen idiosynkratische Reaktion jedes einzelnen Patienten.
Zusätzlich können die die FVIII-Proteine der vorliegenden Erfindung codierenden Nucleinsäuresequenzen mit einem Gentherapie-Transfersystem gemäß auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren verbunden sein. Solche Transfersysteme schließen ohne Limitierung adenovirale, retrovirale und adeno-assoziierte virale Vektoren ein, sowie Liposomen und DNA-Protein-Komplexe. Die Sequenzen der vorliegenden Erfindung sind in solchen Transfersystemen enthalten oder in einer solchen Weise damit funktionsfähig verbunden, dass die Transkription, z.B. durch die Verwendung von ausreichenden regulatorischen Elementen, ermöglicht wird. Man wird sich darüber im Klaren sein, dass Fachleuten eine Vielzahl an Strategien und Methodik für die Erzeugung solcher Gentherapie-Transfersysteme gut bekannt ist.
Verwendungsverfahren
Arzneimittel, die Proteine der vorliegenden Erfindung enthalten, können verwendet werden, um Patienten zu behandeln, die an Hämophilie leiden, verursacht durch einen Mangel an FVIII.
Eine therapeutisch effektive Menge an FVIII-Protein kann daher einem Säuger verabreicht werden, der eine Bluterkrankheit verursacht durch Mangel an FVIII aufweist. Der Begriff „therapeutisch wirksame Menge" bedeutet die Gesamtmenge jeder aktiven Komponente des Verfahrens oder der Zusammensetzung, die ausreicht, um einen aussagekräftigen Vorteil für den Patienten zu zeigen, d.h. Stillstand der Blutung.
Die Verabreichung der Proteine der vorliegenden Erfindung kann in einer Vielzahl von herkömmlichen Wegen durchgeführt werden. Intravenöse Verabreichung an den Patienten wird bevorzugt. Die Proteine der Erfindung werden in Form Pyrogen-freier, parenteral verträglicher, wässriger Lösungen vorliegen, wenn sie durch intravenöse Injektion verabreicht werden. Ein bevorzugtes Arzneimittel für intravenöse Injektion sollte zusätzlich zu den Proteinen einen isotonischen Träger wie zum Beispiel eine Natrimchloridinjektion, Ringer-Injektion, Dextroseinjektion, Dextrose und Natriumchlorid-Injektion, mit Milchzucker versetzte Ringer-Injektion oder andere im Fachgebiet bekannte Träger enthalten. Das Arzneimittel gemäß der vorliegenden Erfindung kann auch Stabilisatoren, Konservierungsmittel, Puffer, Antioxidantien oder andere Zusatzstoffe enthalten, die Fachleuten bekannt sind.
Für cutane oder subcutane Injektion werden die Proteine der vorliegenden Erfindung in Form von Pyrogen-freien, parenteral-verträglichen, wässrigen Lösungen vorliegen, wobei die Erzeugung solcher parenteral verträglicher Proteinlösungen im Hinblick auf pH-Wert, Isotonität, Stabilität, und ähnliches innerhalb des Fachwissens liegt.
Wie auch die Arzneimittel, welche die Proteine der vorliegenden Erfindung enthalten, können Gentherapie-Transfersysteme oder -Vehikel, welche die Nucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung enthalten, auch verwendet werden, um Patienten zu behandeln die an durch Mangel an FVIII verursachter Hämophilie leiden. Eine therapeutisch wirksame Menge solcher Gentherapie-Transfervehikel, wird einem Säuger verabreicht, der eine Bluterkrankheit hat, die durch FVIII-Mangel verursacht ist. Man wird sich darüber im Klaren sein, dass die Verabreichung der Vehikel der vorliegenden Erfindung durch im pharmazeutischen Fachgebiet gut etablierte Verfahren stattfindet, z.B. durch direkte Verabreichung an Zielgewebe oder -stelle, intranasal, intravenös, intramuskulär, subcutan, intradermal und durch orale Verabreichung, entweder alleine oder in Kombination. Es wird auch eingesehen werden, dass im Fachgebiet für die Verabreichung der Gentherapie-Transfervehikel geeignete Rezepturen bekannt sind und wässrige und nicht-wässrige isotonische sterile Injektionslösungen und wässrige und nicht-wässrige sterile Suspensionen umfassen.

Claims

Prokoagulatorisch aktives FVIII-Protein, umfassend ein menschliches FVIII-Polypeptid, welches modifiziert ist, wobei die Modifikation einen Austausch des Phe309 mit Ser umfasst.
Prokoagulatorisch aktives FVIII-Protein, umfassend ein menschliches FVIII-Polypeptid, welches modifiziert ist, wobei die Modifikation einen Austausch des Arg-Rests an Positionen 336 mit Ile, einen Austausch des Arg-Rests an Position 562 mit Lys und einen Austausch des Phe-Rests an Position 309 mit Ser umfasst.
Nucleinsäuremolekül, umfassend eine Nucleotidsequenz, welche das Protein gemäß Anspruch 1 oder 2 codiert.
Expressionsvektor, umfassend das Nucleinsäuremolekül gemäß Anspruch 3.
Wirtszelle, welche mit dem Nucleinsäuremolekül gemäß Anspruch 3 oder dem Expressionsvektor gemäß Anspruch 4 transformiert oder transfiziert wurde.
Verfahren zur Herstellung eines prokoagulatorisch aktiven Proteins, umfassend die Schritte: (a) das Züchten der Wirtszelle gemäß Anspruch 5 in Kultur; und (b) das Isolieren des Polypeptid-Produkts der Expression des Nucleinsäuremoleküls aus der Wirtszelle und Kultur.
Arzneimittel, umfassend ein Protein gemäß Anspruch 1 oder 2, das Nucleinsäuremolekül gemäß Anspruch 3 oder den Expressionsvektor gemäß Anspruch 4 im Gemisch mit einem parenteral verträglichen Träger oder Excipienten.
Verwendung eines Nucleinsäuremoleküls gemäß Anspruch 3 oder eines Expressionsvektors gemäß Anspruch 4 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung in der Gentherapie.