CN105400819A - 一种细胞可回复性永生化的多顺反子载体及其构建方法 - Google Patents

一种细胞可回复性永生化的多顺反子载体及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种多顺反子质粒型逆转录病毒载体及其构建方法，属于基因工程领域。通过基因重组方法获得：将融合雌激素受体的重组酶基因、猿猴病毒大T抗原基因、人端粒酶基因和融合胸苷激酶的增强绿色荧光蛋白基因五个顺反子插入到逆转录病毒载体中得到重组质粒。与现有技术相比，使用本发明质粒型逆转录病毒载体建立的永生化细胞系可在他莫昔芬药物处理之后获得非转化正常细胞，同时利用胸苷激酶自杀基因机理在更昔洛韦药物处理后可使未回复的细胞自杀，从而获得完全非转化正常细胞。本发明保证了重组逆转录病毒载体的生物安全性，具有促进该多顺反子选择性的高表达和利于后续筛选阳性细胞群以及检测多顺反子的表达的优点。

Description

一种细胞可回复性永生化的多顺反子载体及其构建方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种细胞可回复性永生化的多顺反子载体及其构建方法。本发明涉及基因间共表达调控序列、DNA重组和质粒转化等基因工程学，以及通过基因工程学方法重组多基因共表达质粒及其用途，包括一种含有Cre-er融合基因序列、SV40LT基因序列、hTERT基因序列、NeoR基因序列、EGFP-TK融合基因序列以及人工设计并合成含有四个FMDV-2A自剪肽的多克隆位点序列的质粒型逆转录病毒载体和该质粒型逆转录病毒载体的构建方法。
背景技术
研究一种物质或某个基因是否参与了脂肪组织的成脂定型、成脂分化或脂质代谢的调节作用，至少要观察前脂肪细胞或脂肪细胞是否对该处理因素有响应。关于猪脂肪发育、脂肪沉积，尤其是肌内脂肪的沉积，到目前为止还没有系统的研究，这主要是由于缺少来源于猪脂肪组织合适的脂肪细胞系，它们需具有来源于健康活体的正常脂肪细胞且能够在体外长期培养以便于进行实验。然而，利用现有方法分离的原代细胞寿命有限，往往仅能有限的传代几次便进入衰老状态，此外，每次获取原代细胞用于实验的过程不仅费时费力，还受到科研资金和动物福利的限制。同时，由于猪的个体差异、取样分离细胞技术的差异和细胞衰老状态的差异等等诸如此类的差异使得这方面的研究不能广泛的推广。上述的限制因素均使得大规模的研究猪脂肪沉积机理的进程受到了阻碍。本发明，一种细胞可回复性永生化的多顺反子载体及其构建方法为上述问题带来了转机。
国外文献报道，猿猴病毒大T抗原基因(SV40LT)和人端粒酶基因(hTERT)不仅可以加快细胞的生长速率，增加细胞的传代次数，也可以使细胞转化为永生化细胞系。然而，SV40LT处理的细胞虽然度过了衰老期(MⅠ期)，但多数细胞最终会进入危机期(MⅡ期)而死亡。此时，细胞染色体异常，细胞的分裂逐渐减少，细胞死亡率增加。同时，SV40病毒也具有致瘤性，而hTERT处理的细胞基本能保持染色体稳定、分化正常和无致瘤性等特点，hTERT可以维持细胞染色体端粒的稳定，使细胞度过MⅡ期，从而继续存活。因此，本发明，一种细胞可回复性永生化的多顺反子载体将SV40LT和hTERT用FMDV-2a自剪肽串联表达，不仅避免了共转两个质粒时表达效率的偏差，也使得最终获得的细胞既能够度过MⅠ期，又能够度过MⅡ期，为真正获得寿命更长、更稳定的细胞系提供了一个可实现的基础、路径和技术支持。
通常情况下，永生化细胞系是利用重组病毒或逆转录病毒进行制备，用此类方法产生的永生化细胞系虽说可增加原代细胞体外扩增的能力，但转化的细胞有时会在细胞的表型及功能上可能和所来源的原代细胞有所差别，甚至表现出不同的代谢方式，原有的分化特性退化等问题。因此，将病毒转化的细胞系替代原代细胞的作为模式模型细胞进行研究存在潜在的风险性。为了解决这一问题，同时为了生物安全性的考量，我们在所构建的质粒型逆转录病毒载体中引入了Cre-LoxP重组酶系统，构建了一种用于细胞可回复性永生化的多顺反子载体。
Cre重组酶在1981年从P1噬菌体中发现，它具有能识别特异的DNA序列的特性，即识别LoxP位点，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。借助Cre-LoxP重组酶技术我们构建了含永生化基因SV40LT和hTERT的可回复性永生化的多顺反子载体，该多顺反子载体可以用于原代细胞的转染，使原代细胞发生永生化，便于细胞的大量增殖、传代及保存，并且在实验过程中，当需要将细胞用于正常生理或遗传实验时，可以利用位点特异性重组酶Cre识别特异性位点LoxP，切除位于两个同向LoxP序列之间的外源基因，使细胞回复到永生化之前的状态。在解决了原代细胞体外增殖传代问题的同时，又克服了永生化细胞恶性转变，细胞安全性差和表型功能偏差的难题。
鉴于Cre-LoxP重组酶系统重组效率的问题，为最终获得纯粹的回复细胞，我们引入了自杀基因清除未发生重组的细胞。胸苷激酶(TK)对更昔洛韦敏感，当在培养基中添加更昔洛韦时可清除少数未发生Cre-LoxP重组的未回复细胞，而回复的细胞由于TK基因被切除使得其对更昔洛韦耐药而不受影响，从而获得完全的回复细胞。
在本发明的载体中，需要实现Cre-er、SV40LT、hTERT、NeoR和EGFP-TK五个基因共表达，如果利用传统方法，在五个基因之间同时引入四个“内部核糖体引入位点”(IRES)，不仅大大增加了载体序列的长度，而且由于IRES自身的特性，极有可能导致后三个基因的表达量偏低，进而影响永生化细胞的建立。因此，本发明一种细胞可回复性永生化的多顺反子载体在各个基因间引入了口蹄疫病毒自剪肽(FMDV-2A)，设计并人工合成了一个包含四个口蹄疫病毒自剪肽的多克隆位点(MCS)——4×FMDV-2A-MCS。考虑到在同一载体中引入多个相同的序列，存在发生同源重组的可能性，因此在设计4个FMDV-2A自剪肽序列时，我们利用同义突变原理使得4个FMDV-2A自剪肽的核苷酸序列不一样，但均能编码相同的功能蛋白。该自剪肽在翻译水平2A的C端甘氨酸与2B的N端的脯氨酸自我剪切，自剪切后上游的氨基酸残基和上游蛋白融合，下游的脯氨酸残基和下游蛋白融合。目前，该自剪肽已被广泛的应用于构建多基因共表达的载体。除了序列短的优点外，其介导的多基因的表达效率也比IRES序列高，本发明引入自剪肽序列可以尽可能确保质粒中五个基因的表达，与此同时，在Cre发挥重组酶活性时，编码自剪肽的序列也会随多顺反子一并切除，因此不必担心该序列残留带来未知的作用。
猪前体脂肪细胞和肌内脂肪细胞已成为限制研究猪脂肪沉积和肌内脂肪发育机制的瓶颈问题，解决这一问题将大大提升该领域的研究空间并节省该领域的研究时间。目前市场上尚无猪源脂肪细胞系的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种细胞可回复性永生化的多顺反子载体及其构建方法，即利用基于Cre-LoxP系统介导的能够同时表达永生化基因及筛选标记基因的重组逆转录病毒载体，为改造细胞的传代能力以及为原代细胞系材料的扩大化奠定了基础。以期为猪永生化细胞系的构建提供一种新方法和路径。
具体地，本发明的目的之一是提供一种同时含有融合雌激素受体的重组酶基因(Cre-er)、猿猴病毒大T抗原基因(SV40LT)、人端粒酶基因(hTERT)、新霉素耐药基因(NeoR)和融合胸苷激酶的增强绿色荧光蛋白基因(EGFP-TK)的多顺反子共表达质粒。
本发明的目的之二是提供上述表达质粒的构建方法。
本发明的目的之三是提供上述共表达质粒的用途。
本发明的多顺反子共表达质粒是一种包含融合雌激素受体的重组酶基因(Cre-er)、猿猴病毒大T抗原基因(SV40LT)、人端粒酶基因(hTERT)、新霉素耐药基因(NeoR)和融合胸苷激酶的增强绿色荧光蛋白基因(EGFP-TK)的质粒，其结构如图13所示。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种质粒型逆转录病毒载体pCSHNET，该载体包含有以下五个如序列表SEQIDNO：1-5所示核苷酸序列的多顺反子基因以及一个逆转录病毒系统；
SEQIDNO：1所示核苷酸序列的融合雌激素受体的重组酶Cre-er基因；
SEQIDNO：2所示核苷酸序列的猿猴病毒大T抗原SV40LT基因；
SEQIDNO：3所示核苷酸序列的人端粒酶hTERT基因；
SEQIDNO：4所示核苷酸序列的新霉素耐药NeoR基因；和
SEQIDNO：5所示核苷酸序列的融合胸苷激酶的增强绿色荧光蛋白EGFP-TK基因；
其中：所述的逆转录病毒系统为一种口蹄疫病毒自剪肽FMDV-2A的短肽，其核苷酸序列如SEQIDNO：6-9所示。
所述的质粒型逆转录病毒载体pCSHNET的五个插入基因由四个自剪肽连接而成，这四个自剪肽的核苷酸序列不同，但编码蛋白的氨基酸序列是相同的。
连接4个自剪肽的多克隆酶切位点如图16所示，依次为：NheI、MssI、AscI、SmiI、MreI、Eco72I、MauBI、SalI和Bst1107I，所述的酶切位点的顺序按平末端与粘性末端酶切位点交替排列，保证插入基因的方向与基因表达的方向相一致。
如图13所示的质粒型逆转录病毒载体pCSHNET的第二个Moloney鼠白血病病毒长末端重复序列MoMuLV_LTR内包含一个噬菌体P1重组位点LoxP，所述LoxP的核苷酸序列如SEQIDNO：10所示。
申请人提供了一种质粒型逆转录病毒载体pCSHNET的构建方法，包括下列步骤：
(1)将如图2所示的起始质粒pCTGTKlox的第二个ClaⅠ酶切位点利用定点突变方法突变成Bst1107Ⅰ酶切位点获得中间质粒pCB；
(2)人工合成含有四个口蹄疫病毒自剪肽的多克隆位点序列，每个自剪肽的核苷酸序列如SEQIDNO：6-9所示；
(3)用含酶切位点的引物分别扩增Cre-er基因和hTERT基因片段，使Cre-er基因序列的5’端含有EcoRⅠ酶切位点，3’端依次含有NheⅠ和Bst1107Ⅰ酶切位点，使hTERT基因的5’端含有SmiⅠ酶切位点，3’端含有MreⅠ酶切位点；
(4)将步骤(1)中获得的中间质粒pCB和步骤(3)中Cre-er扩增片段分别用限制性内切酶EcoRⅠ和Bst1107Ⅰ双酶切，将酶切后的骨架质粒片段和Cre-er融合基因片段用T4DNALigase进行连接反应，将所得的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细菌，得到中间质粒pCB-Cre-er；
(5)将步骤(4)中获得的中间质粒pCB-Cre-er和步骤(2)中获得的自剪肽的多克隆位点序列分别用限制性内切酶NheⅠ和Bst1107Ⅰ双酶切，将酶切后的骨架质粒片段和自剪肽片段利用T4DNALigase进行连接反应，将所得的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细菌，得到中间质粒pCre-er-MCS；
(6)利用PCR扩增SV40LT基因序列，使其5’端上含有MssⅠ酶切位点，3’端上含有AscⅠ酶切位点；扩增NeoR基因序列，使其5’端含有Eco72Ⅰ酶切位点，3’端含有MauBⅠ酶切位点；扩增EGFP-TK融合基因序列，使其5’端含有SalⅠ酶切位点，3’端含有Bst1107Ⅰ酶切位点，将扩增的三个基因片段分别连接如图14所示的载体pMD-18T，将所得的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细菌，分别得到中间质粒pMD-18T-SV40LT、pMD-18T-NeoR和pMD-18T-EGFP-TK；
(7)将步骤(5)中获得的中间质粒pCre-er-MCS和步骤(6)中获得的中间质粒pMD-18T-NeoR分别用限制性内切酶Eco72Ⅰ和MauBⅠ双酶切，将酶切后的骨架质粒片段和NeoR片段利用T4DNALigase进行连接反应，将所得的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细菌，得到中间质粒pCre-er-NeoR；
(8)将步骤(7)中获得的中间质粒pCre-er-NeoR和步骤(6)中获得的中间质粒pMD-18T-EGFP-TK分别用限制性内切酶SalⅠ和Bst1107Ⅰ双酶切，将酶切后的骨架质粒片段和EGFP-TK融合基因片段利用T4DNALigase进行连接反应，将所得的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细菌，得到中间质粒pCre-er-NeoR-EGFP-TK；
(9)将步骤(8)中获得的中间质粒pCre-er-NeoR-EGFP-TK和步骤(6)中获得的中间质粒pMD-18T-SV40LT分别用限制性内切酶MssⅠ和AscⅠ双酶切，将酶切后的骨架质粒片段和SV40LT片段利用T4DNALigase进行连接反应，将所得的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细菌，得到重组质粒pCre-er-SV40LT-NeoR-EGFP-TK；
(10)将步骤(9)中获得的中间质粒pCre-er-SV40LT-NeoR-EGFP-TK和步骤(3)所得的hTERT基因片段分别用限制性内切酶SmilⅠ和MreⅠ进行双酶切，将酶切后的骨架质粒片段和hTERT基因片段用T4DNALigase进行连接反应，将所得的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细菌，得到最终的重组质粒型逆转录病毒载体pCre-er-SV40LT-hTERT-NeoR-EGFP-TK-Lox，即为一种细胞回复性永生化的多顺反子载体pCSHNET。
本发明与现有技术相比较具有的显著特点：
(1)本发明引入Cre-LoxP重组酶系统，将五个外源多顺反子置于该系统中，当需要将细胞用于正常生理或遗传实验时，利用位点特异性重组酶Cre识别特异性位点LoxP，切除位于两个同向LoxP序列之间的外源基因，使细胞回复到永生化之前的状态。该策略在解决了原代细胞体外增殖传代问题的同时，又克服了永生化细胞恶性转变，细胞安全性差和表型功能偏差的难题。
(2)本发明引入TK自杀基因，未发生重组的细胞由于含有TK自杀基因在更昔洛韦药物处理作用下发生自杀，从而自动清除了少数未发生Cre-LoxP重组的未回复细胞，该策略解决了回复细胞纯度差的问题，能完全的获得纯粹的回复细胞。
(3)本发明在各个基因序列间引入了口蹄疫病毒自剪肽，该自剪肽不仅具有比现有的IRES序列短的优点外，还能高效剪切，使三个或更多的顺反子高效表达，从而尽可能确保本发明质粒中五个基因的表达，考虑到在同一载体中引入多个相同的序列，存在发生同源重组的可能性，因此在设计4个自剪肽序列时，我们利用同义突变原理使得4个自剪肽的核苷酸序列不一样，但均能编码相同的功能蛋白。
(4)本发明将永生化基因SV40LT和hTERT用自剪肽串联表达，不仅避免了共转两个质粒时表达效率的偏差，也使得最终获得的细胞既能够度过MⅠ期，又能够度过MⅡ期，为真正获得寿命更长、更稳定的细胞系提供了一个可实现的基础、路径和技术支持。
更详细的技术方案参见《具体实施方案》。
附图说明
图1：是本发明总体技术流程图。
图2：是本发明的起始载体图谱。
图3-12：是本发明构建的中间载体图谱。
图13：是本发明构建的最终的重组质粒型逆转录病毒载体pCSHNET图谱。
图14：是本发明所用的商业质粒pMD-18T图谱。
图15：是将起始质粒pCTGTKlox的第二个ClaⅠ酶切位点利用定点突变方法突变成Bst1107Ⅰ酶切位点的突变位点测序结果。
图16：是人工设计的含有4个口蹄疫病毒自剪肽的多克隆位点图谱。
图17：是pCB用限制性内切酶EcoRⅠ和Bst1107Ⅰ双酶切的骨架质粒片段图谱。
图18：是跑胶图。附图标记说明：泳道M代表DL10000Marker(Takara，3584Q)，泳道1-4代表用限制性内切酶EcoRⅠ和Bst1107Ⅰ双酶切的Cre-er融合基因片段。
图19：是pCB-Cre-er用限制性内切酶NheⅠ和Bst1107Ⅰ双酶切的骨架质粒片段图谱。
图20：是pCre-er-MCS用限制性内切酶Eco72Ⅰ和MauBⅠ双酶切的骨架质粒片段图谱。
图21：是跑胶图，附图标记说明：泳道M代表DL10000Marker(Takara，3584Q)，泳道1-3代表用限制性内切酶Eco72Ⅰ和MauBⅠ双酶切的NeoR基因片段。
图22：是pCre-er-NeoR用限制性内切酶SalⅠ和Bst1107Ⅰ双酶切的骨架质粒片段图谱。
图23：是跑胶图，附图标记说明：泳道M代表DL10000Marker(Takara，3584Q)，泳道1-3代表用限制性内切酶SalⅠ和Bst1107Ⅰ双酶切的EGFP-TK融合基因片段。
图24：是pCre-er-NeoR-EGFP-TK用限制性内切酶MssⅠ和AscⅠ双酶切的骨架质粒片段图谱。
图25：是跑胶图，附图标记说明：泳道M代表DL10000Marker(Takara，3584Q)，泳道1-3代表用限制性内切酶MssⅠ和AscⅠ双酶切的SV40LT基因片段。
图26：是pCre-er-SV40LT-NeoR-EGFP-TK用限制性内切酶SmilⅠ和MreⅠ进行双酶切的骨架质粒片段图谱。
图27：是跑胶图，泳道M代表DL10000Marker(Takara，3584Q)，泳道1-3代表用限制性内切酶SmilⅠ和MreⅠ进行双酶切的hTERT基因片段。
图28：是分离后纯化两代的猪原代前脂肪细胞。
图29：是在倒置荧光显微镜下，检测出转染的猪原代前脂肪细胞的阳性细胞团被激发所发出的绿色荧光。
图30：是在倒置荧光显微镜下，检测出转染的乳仓鼠肾细胞BHK-21的阳性细胞团被激发所发出的绿色荧光。
图31：是在倒置荧光显微镜下，转染的小鼠间充质干细胞C3H10T1/2的阳性细胞团被激发所发出的绿色荧光。
图32：是在倒置荧光显微镜下，转染的小鼠前脂肪细胞3T3-L1的阳性细胞团被激发所发出的绿色荧光。
具体实施方案
实施例1
申请人提供了构建用于细胞可回复性永生化的多顺反子载体即质粒型逆转录病毒载体pCSHNET的方法，该方法包括如下步骤：
本发明所用PCR反应酶均为TOYOBOKOD-201高保真酶，所用限制性内切酶均为ThermoFisherScientificFastDigest系列限制性内切酶，所用引物序列见表1。
表1本发明设计的引物
引物名称 引物序列
Cla1-Bst1107I F CCCCCAACGGCGACCTGTATAACGTATACAAAATAAAAGATTTT
Cla1-Bst1107I R AAAATCTTTTATTTTGTATACGTTATACAGGTCGCCGTTGGGGG
Creer F CCGGAATTCCACCATGTCCAATTTACTGACCGT
Creer R GGTGTATACGGTGCTAGCGACTGTGGCAGGGAAACCCT
hTERT F GCCATTTAAATCACCATGCCGCGCGCTCCCCGCTGCCGAG
hTERT R GGTGCGCCGGCGGTCCAGGATGGTCTTGAAGTCTGAGGGC
Neo F CCGCACGTGACCATGATTGAACAAGATG
Neo R GGTGCGCGCGCGGAAGAACTCGTCAAGA
EGFP-TK F ACGCGTCGACACCATGGTGAGCAAG
EGFP-TK R CCGGTATACTCAGTTAGCCTCCCCC
SV40LT F GCCGTTTAAACCACCATGGATAAAGTTTTAAACA
SV40LT R GGTGGGCGCGCCTGTTTCAGGTTCAGGG
具体步骤如下：
(1)突变起始质粒pCTGTKlox第二个ClaⅠ限制性酶切位点为Bst1107Ⅰ
用引物ClaⅠ-Bst1107ⅠF/R扩增质粒pCTGTKlox，PCR反应体系和反应条件见表2-3。
表2PCR反应体系
表3PCR反应条件
PCR扩增反应完成后冰浴5分钟，然后置于室温，将PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增的突变型质粒，将鉴定成功的突变型质粒加入1μlFastDigestDpnI酶(ThermoFisherScientificFD1703)37℃温育30分钟，酶切产物转化大肠杆菌DH5α感受态细菌，挑选阳性菌落扩增，将挑选的菌液送交北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序，测序结果显示该突变位点与Bst1107Ⅰ限制性酶切位点相吻合(测序结果见图15)，将测序正确的菌液扩大培养提取质粒。
(2)包含四个口蹄疫病毒自剪肽多克隆位点的设计及人工合成
利用Primer5和密码子表对有效的口蹄疫病毒自剪肽蛋白序列输出4个不同的核苷酸序列，同时在输出的四个自剪肽两端设计酶切位点，以便多顺反子嵌入逆转录病毒载体中。为了保证插入基因的方向与基因表达的方向一致，将设计的酶切位点的顺序按平末端与粘性末端酶交替排列。如图16所示设计的多克隆酶切位点依次为：NheⅠ、MssⅠ、AscⅠ、SmiⅠ、MreⅠ、Eco72Ⅰ、MauBⅠ、SalⅠ和Bst1107Ⅰ。每个基因两端的酶切位点及切口类型如表4所示。将设计的序列交由生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列的人工合成。最终得到了含有该自剪肽多克隆位点的克隆质粒p4×2A-MCS(如图4所示)。
表4基因两端的酶切位点及切口类型：
基因 基因5’的酶切位点及切口类型 基因3’的酶切位点及切口类型
Cre-er EcoRⅠ，5’突出的粘性末端 NheⅠ，5’突出的粘性末端
SV40LT MssⅠ，平末端 AscⅠ，5’突出的粘性末端
hTERT SmiⅠ，平末端 MreⅠ，3’突出的粘性末端
NeoR Eco72Ⅰ，平末端 MauBⅠ，3’突出的粘性末端
EGFP-TK SalⅠ，5’突出的粘性末端 Bst1107Ⅰ，平末端
(3)设计含酶切位点的引物分别PCR扩增Cre-er基因和hTERT基因序列使扩增的Cre-er基因序列的5’端含有EcoRⅠ酶切位点，3’端依次含有NheⅠ和Bst1107Ⅰ酶切位点，使扩增的hTERT基因序列5’端含有SmiⅠ酶切位点，3’端含有MreⅠ酶切位点。反应体系见表5。
表5PCR反应体系
反应组分 体积
10x Buffer for KOD-Plus-(来自高保真酶试剂) 5μl
2mM dNTPs(来自高保真酶试剂) 5μl
25mM MgSO4(来自高保真酶试剂) 2μl
10pmol/μl Creer F/hTERT F(引物) 1.5μl
10pmol/μl Creer R/hTERT R(引物) 1.5μl
模板 1-50ng
KOD-Plus-(1.0U/μl)(来自高保真酶试剂) 1μl
去离子水 补到50μl
表6PCR反应条件
将所得的PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，将鉴定成功的PCR产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒(Omega，D2500-01)回收目的片段，将回收基因的目的片段存于-20低温冰箱中备用。
(4)将步骤(1)中突变了酶切位点的中间质粒pCB和步骤(3)中扩增的Cre-er基因片段分别用限制性内切酶EcoRⅠ和Bst1107Ⅰ双酶切，将酶切后的骨架质粒片段和Cre-er融合基因片段利用T4DNALigase(NEB，M0202S)进行连接反应，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细菌，挑取克隆扩大培养，菌液PCR筛选阳性克隆并经测序鉴定得到中间质粒pCB-Cre-er；
(5)将步骤(4)中获得的中间质粒pCB-Cre-er和步骤(2)中获得克隆质粒p4×2A-MCS分别用限制性内切酶NheⅠ和Bst1107Ⅰ双酶切，将酶切后的pCB-Cre-er骨架质粒片段和含自剪肽多克隆位点的片段利用T4DNALigase(NEB，M0202S)进行连接反应，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细菌，挑取克隆扩大培养，菌液PCR筛选阳性克隆并经测序鉴定得到中间质粒pCre-er-MCS；
(6)利用PCR扩增SV40LT基因序列，使其5’端上含有MssⅠ酶切位点，3’端上含有AscⅠ酶切位点；扩增NeoR基因序列，使其5’端含有Eco72Ⅰ酶切位点，3’端含有MauBⅠ酶切位点；扩增EGFP-TK融合基因序列，使其5’端含有SalⅠ酶切位点，3’端含有Bst1107Ⅰ酶切位点，PCR扩增的反应体系和反应条件同步骤(3)。将扩增的三个基因片段分别连接如图14所示的载体pMD-18T(TaKaRa，D101A)，将所得的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细菌，挑取克隆扩大培养，菌液PCR筛选阳性克隆并经测序鉴定得到中间质粒pMD-18T-SV40LT、pMD-18T-NeoR和pMD-18T-EGFP-TK；
(7)将步骤(5)中获得的中间质粒pCre-er-MCS和步骤(6)中获得的中间质粒pMD-18T-NeoR分别用限制性内切酶Eco72Ⅰ和MauBⅠ双酶切，将酶切后的骨架质粒片段和NeoR片段利用T4DNALigase(NEB，M0202S)进行连接反应，将所得的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细菌，挑取克隆扩大培养，菌液PCR筛选阳性克隆并经测序鉴定得到中间质粒pCre-er-NeoR；
(8)将步骤(7)中获得的中间质粒pCre-er-NeoR和步骤(6)中获得的中间质粒pMD-18T-EGFP-TK分别用限制性内切酶SalⅠ和Bst1107Ⅰ双酶切，将酶切后的骨架质粒片段和EGFP-TK融合基因片段利用T4DNALigase(NEB，M0202S)进行连接反应，将所得的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细菌，挑取克隆扩大培养，菌液PCR筛选阳性克隆并经测序鉴定得到中间质粒pCre-er-NeoR-EGFP-TK；
(9)将步骤(8)中获得的中间质粒pCre-er-NeoR-EGFP-TK和步骤(6)中获得的中间质粒pMD-18T-SV40LT分别用限制性内切酶MssⅠ和AscⅠ双酶切，将酶切后的骨架质粒片段和SV40LT片段利用T4DNALigase(NEB，M0202S)进行连接反应，将所得的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细菌，挑取克隆扩大培养，菌液PCR筛选阳性克隆并经测序鉴定得到中间质粒pCre-er-SV40LT-NeoR-EGFP-TK；
(10)将步骤(9)中获得的中间质粒pCre-er-SV40LT-NeoR-EGFP-TK和步骤(3)所得的hTERT基因片段分别用限制性内切酶SmilⅠ和MreⅠ进行双酶切，将酶切后的骨架质粒片段和hTERT基因片段用T4DNALigase(NEB，M0202S)进行连接反应，将所得的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细菌，得到最终的重组质粒型逆转录病毒载体pCre-er-SV40LT-hTERT-NeoR-EGFP-TK-Lox，即为一种用于细胞回复性永生化的多顺反子载体pCSHNET。
实施例2
申请人提供了将该可回复性永生化的多顺反子载体pCSHNET转染猪原代前脂肪细胞的方法，该方法包括如下步骤：
(1)猪原代前脂肪细胞的分离
猪原代前脂肪细胞的分离方法参照本实验室前期建立的方法(杨红文，2011)。具体步骤如下：
从7-21日龄猪颈、肩、背部无菌采取皮下脂肪组织，放入装有含双抗PBS的培养皿中，反复漂洗并去除非目标组织，用眼科剪剪碎组织,随即转入含有胶原酶消化液15ml无菌的离心管中于37℃的恒温振荡水浴锅中振荡消化60分钟，消化完毕，加入增殖培养基终止消化，用无菌吸管反复吹打，避免产生气泡，吹打完全后分装入离心管并于1200转/分钟离心6分钟，除去上清，用PBS重悬离心管底的沉淀,加入红细胞裂解液再次配成细胞悬液，室温孵育10分钟，离心弃上清，用增殖培养基重悬，经孔径为75μm的尼龙筛过滤，滤液中的细胞即为猪原代前脂肪细胞。分装到培养瓶中培养即可。
(2)pCSHNET质粒转染猪原代前脂肪细胞
将分离后纯化两代的猪原代前脂肪细胞接种于六孔板中(图28)，每孔接种约1×105个细胞，在37℃，5％CO2浓度和饱和湿度条件下培养，待细胞生长至80％汇合度时换用无血清的Opti-MEM(Gibco31985070IReducedSerumMedium)培养基。同时用Opti-MEM培养基分别稀释2.5μgpCSHNET质粒至100μl，稀释10μl脂质体LipofectamineTM2000至100μl，轻柔混匀，室温孵育5分钟。将稀释的质粒溶液加入稀释的脂质体溶液中，轻柔混匀，室温孵育5分钟以形成DNA_脂质体复合物。将DNA_脂质体复合物溶液逐滴加入含有猪原代前脂肪细胞的六孔板中。轻轻摇动六孔板，使DNA_脂质体复合物溶液与培养基混匀。然后置于37℃，5％CO2浓度和饱和湿度条件下培养6小时后，弃去培养基更换增殖培养基，继续培养48小时。在倒置荧光显微镜下观察，可见阳性细胞团发出绿色荧光(图29)，由于产生绿色荧光蛋白的EGFP-TK基因位于该多顺反子的最后一位，说明该质粒已在猪原代前脂肪细胞中表达并得到了有效的剪切。
实施例3
申请人提供了将该可回复性永生化的多顺反子载体pCSHNET转染乳仓鼠肾细胞BHK-21的方法，该方法包括如下步骤：
(1)乳仓鼠肾细胞BHK-21的复苏培养
取液氮罐中冻存的BHK-21细胞，立即放入37℃-42℃的水浴锅中迅速解冻，1000转/分钟室温离心5分钟，加入增殖培养基，然后置于37℃，5％CO2浓度和饱和湿度条件下培养。1-2天后，当细胞贴壁生长后形态良好时，准备接种到六孔板中开始试验。
(2)pCSHNET质粒转染乳仓鼠肾细胞BHK-21
将复苏后细胞贴壁生长后形态良好的乳仓鼠肾细胞BHK-21接种于六孔板中，每孔接种约1×105个细胞，在37℃，5％CO2浓度和饱和湿度条件下培养，待细胞生长至80％汇合度时换用无血清的Opti-MEM(Gibco31985070IReducedSerumMedium)培养基。同时用Opti-MEM培养基分别稀释2.5μgpCSHNET质粒至100μl，稀释10μl脂质体LipofectamineTM2000至100μl，轻柔混匀，室温孵育5分钟。将稀释的质粒溶液加入稀释的脂质体溶液中，轻柔混匀，室温孵育5分钟以形成DNA_脂质体复合物。将DNA_脂质体复合物溶液逐滴加入含有乳仓鼠肾细胞BHK-21的六孔板中。轻轻摇动六孔板，使DNA_脂质体复合物溶液与培养基混匀。然后置于37℃，5％CO2浓度和饱和湿度条件下培养6小时后，弃去培养基更换增殖培养基，继续培养48小时。在倒置荧光显微镜下观察，可见阳性细胞团发出绿色荧光(图30)，由于产生绿色荧光蛋白的EGFP-TK基因位于该多顺反子的最后一位，说明该质粒已在乳仓鼠肾细胞BHK-21中表达并得到了有效的剪切。
实施例4
申请人提供了将该可回复性永生化的多顺反子载体pCSHNET转染小鼠间充质干细胞C3H10T1/2的方法，该方法包括如下步骤：
(1)小鼠间充质干细胞C3H10T1/2的复苏培养
取液氮罐中冻存的小鼠间充质干细胞C3H10T1/2，立即放入37℃-42℃的水浴锅中迅速解冻，1000转/分钟室温离心5分钟，加入增殖培养基，然后置于37℃，5％CO2浓度和饱和湿度条件下培养。1-2天后，当细胞贴壁生长后形态良好时，准备接种到六孔板中开始试验。
(2)pCSHNET质粒转染小鼠间充质干细胞C3H10T1/2
将复苏后细胞贴壁生长后形态良好的小鼠间充质干细胞C3H10T1/2接种于六孔板中，每孔接种约1×105个细胞，在37℃，5％CO2浓度和饱和湿度条件下培养，待细胞生长至80％汇合度时换用无血清的Opti-MEM(Gibco31985070IReducedSerumMedium)培养基。同时用Opti-MEM培养基分别稀释2.5μgpCSHNET质粒至100μl，稀释10μl脂质体LipofectamineTM2000至100μl，轻柔混匀，室温孵育5分钟。将稀释的质粒溶液加入稀释的脂质体溶液中，轻柔混匀，室温孵育5分钟以形成DNA_脂质体复合物。将DNA_脂质体复合物溶液逐滴加入含有小鼠间充质干细胞C3H10T1/2的六孔板中。轻轻摇动六孔板，使DNA_脂质体复合物溶液与培养基混匀。然后置于37℃，5％CO2浓度和饱和湿度条件下培养6小时后，弃去培养基更换增殖培养基，继续培养48小时。在倒置荧光显微镜下观察，可见阳性细胞团发出绿色荧光(图31)，由于产生绿色荧光蛋白的EGFP-TK基因位于该多顺反子的最后一位，说明该质粒已在小鼠间充质干细胞C3H10T1/2中表达并得到了有效的剪切。
实施例5
申请人提供了将该可回复性永生化的多顺反子载体pCSHNET转染小鼠前脂肪细胞3T3-L1的方法，该方法包括如下步骤：
(1)小鼠前脂肪细胞3T3-L1的复苏培养
取液氮罐中冻存的小鼠前脂肪细胞3T3-L1，立即放入37℃-42℃的水浴锅中迅速解冻，1000转/分钟室温离心5分钟，加入增殖培养基，然后置于37℃，5％CO2浓度和饱和湿度条件下培养。1-2天后，当细胞贴壁生长后形态良好时，准备接种到六孔板中开始试验。
(2)pCSHNET质粒转染小鼠前脂肪细胞3T3-L1
将复苏后细胞贴壁生长后形态良好的小鼠前脂肪细胞3T3-L1接种于六孔板中，每孔接种约1×105个细胞，在37℃，5％CO2浓度和饱和湿度条件下培养，待细胞生长至80％汇合度时换用无血清的Opti-MEM(Gibco31985070IReducedSerumMedium)培养基。同时用Opti-MEM培养基分别稀释2.5μgpCSHNET质粒至100μl，稀释10μl脂质体LipofectamineTM2000至100μl，轻柔混匀，室温孵育5分钟。将稀释的质粒溶液加入稀释的脂质体溶液中，轻柔混匀，室温孵育5分钟以形成DNA_脂质体复合物。将DNA_脂质体复合物溶液逐滴加入含有小鼠前脂肪细胞3T3-L1的六孔板中。轻轻摇动六孔板，使DNA_脂质体复合物溶液与培养基混匀。然后置于37℃，5％CO2浓度和饱和湿度条件下培养6小时后，弃去培养基更换增殖培养基，继续培养48小时。在倒置荧光显微镜下观察，可见阳性细胞团发出绿色荧光(图32)，由于产生绿色荧光蛋白的EGFP-TK基因位于该多顺反子的最后一位，说明该质粒已在小鼠前脂肪细胞3T3-L1中表达并得到了有效的剪切。

Claims (6)

1.一种质粒型逆转录病毒载体pCSHNET，其特征在于：该载体包含有五个如SEQIDNO：1-5所示核苷酸序列的多顺反子基因以及一个逆转录病毒系统；
SEQIDNO：1所示核苷酸序列的融合雌激素受体的重组酶Cre-er基因；
SEQIDNO：2所示核苷酸序列的猿猴病毒大T抗原SV40LT基因；
SEQIDNO：3所示核苷酸序列的人端粒酶hTERT基因；
SEQIDNO：4所示核苷酸序列的新霉素耐药NeoR基因；和
SEQIDNO：5所示核苷酸序列的融合胸苷激酶的增强绿色荧光蛋白EGFP-TK基因；
其中：所述的逆转录病毒系统为一种口蹄疫病毒自剪肽FMDV-2A的短肽，其核苷酸序列如SEQIDNO：6-9所示。
2.如权利要求1所述的质粒型逆转录病毒载体pCSHNET，其特征在于：所述的质粒型逆转录病毒载体pCSHNET的五个插入基因由四个自剪肽连接而成，这四个自剪肽的核苷酸序列不同，但编码蛋白的氨基酸序列是相同的。
3.如权利要求1或2或3所述的质粒型逆转录病毒载体pCSHNET，其特征在于：连接4个自剪肽的多克隆酶切位点如图16所示，依次为：NheI、MssI、AscI、SmiI、MreI、Eco72I、MauBI、SalI和Bst1107I，所述的酶切位点的顺序按平末端与粘性末端酶切位点交替排列，保证插入基因的方向与基因表达的方向相一致。
4.如权利要求1-4任一项权利要求所述的质粒型逆转录病毒载体pCSHNET，其特征在于：如图13所示的质粒型逆转录病毒载体pCSHNET的第二个Moloney鼠白血病病毒长末端重复序列MoMuLV_LTR内包含一个噬菌体P1重组位点LoxP，所述LoxP的核苷酸序列如SEQIDNO：10所示。
5.一种质粒型逆转录病毒载体pCSHNET的构建方法，其特征在于，包括下列步骤：
(1)将如图2所示的起始质粒pCTGTKlox的第二个ClaⅠ酶切位点利用定点突变方法突变成Bst1107Ⅰ酶切位点获得中间质粒pCB；
(2)人工合成含有四个口蹄疫病毒自剪肽的多克隆位点序列，每个自剪肽的核苷酸序列如SEQIDNO：6-9所示；
(3)用含酶切位点的引物分别扩增Cre-er基因和hTERT基因片段，使Cre-er基因序列的5’端含有EcoRⅠ酶切位点，3’端依次含有NheⅠ和Bst1107Ⅰ酶切位点，使hTERT基因的5’端含有SmiⅠ酶切位点，3’端含有MreⅠ酶切位点；
(4)将步骤(1)中获得的中间质粒pCB和步骤(3)中Cre-er扩增片段分别用限制性内切酶EcoRⅠ和Bst1107Ⅰ双酶切，将酶切后的骨架质粒片段和Cre-er融合基因片段用T4DNALigase进行连接反应，将所得的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细菌，得到中间质粒pCB-Cre-er；
(5)将步骤(4)中获得的中间质粒pCB-Cre-er和步骤(2)中获得的自剪肽的多克隆位点序列分别用限制性内切酶NheⅠ和Bst1107Ⅰ双酶切，将酶切后的骨架质粒片段和自剪肽片段利用T4DNALigase进行连接反应，将所得的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细菌，得到中间质粒pCre-er-MCS；
(6)利用PCR扩增SV40LT基因序列，使其5’端上含有MssⅠ酶切位点，3’端上含有AscⅠ酶切位点；扩增NeoR基因序列，使其5’端含有Eco72Ⅰ酶切位点，3’端含有MauBⅠ酶切位点；扩增EGFP-TK融合基因序列，使其5’端含有SalⅠ酶切位点，3’端含有Bst1107Ⅰ酶切位点，将扩增的三个基因片段分别连接如图14所示的载体pMD-18T，将所得的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细菌，分别得到中间质粒pMD-18T-SV40LT、pMD-18T-NeoR和pMD-18T-EGFP-TK；
(7)将步骤(5)中获得的中间质粒pCre-er-MCS和步骤(6)中获得的中间质粒pMD-18T-NeoR分别用限制性内切酶Eco72Ⅰ和MauBⅠ双酶切，将酶切后的骨架质粒片段和NeoR片段利用T4DNALigase进行连接反应，将所得的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细菌，得到中间质粒pCre-er-NeoR；
(8)将步骤(7)中获得的中间质粒pCre-er-NeoR和步骤(6)中获得的中间质粒pMD-18T-EGFP-TK分别用限制性内切酶SalⅠ和Bst1107Ⅰ双酶切，将酶切后的骨架质粒片段和EGFP-TK融合基因片段利用T4DNALigase进行连接反应，将所得的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细菌，得到中间质粒pCre-er-NeoR-EGFP-TK；
(9)将步骤(8)中获得的中间质粒pCre-er-NeoR-EGFP-TK和步骤(6)中获得的中间质粒pMD-18T-SV40LT分别用限制性内切酶MssⅠ和AscⅠ双酶切，将酶切后的骨架质粒片段和SV40LT片段利用T4DNALigase进行连接反应，将所得的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细菌，得到重组质粒pCre-er-SV40LT-NeoR-EGFP-TK；
(10)将步骤(9)中获得的中间质粒pCre-er-SV40LT-NeoR-EGFP-TK和步骤(3)所得的hTERT基因片段分别用限制性内切酶SmilⅠ和MreⅠ进行双酶切，将酶切后的骨架质粒片段和hTERT基因片段用T4DNALigase进行连接反应，将所得的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细菌，得到最终的重组质粒型逆转录病毒载体pCre-er-SV40LT-hTERT-NeoR-EGFP-TK-Lox，即为一种细胞回复性永生化的多顺反子载体pCSHNET。
6.权利要求1所述的质粒型逆转录病毒载体pCSHNET在制备猪源脂肪细胞系中的应用。
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