CN105695494A - 一种三顺反子表达载体、制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种三顺反子表达载体、制备方法及应用，属于基因工程技术领域。三顺反子表达载体包括核基质结合区序列以及由两个内核糖体进入位点序列连接而成的三顺反子序列，三顺反子序列的结构为：启动子-轻链信号肽SPL-IRESwt-重链信号肽SPH-IRESatt-筛选标记-Poly A。该载体能同时表达抗体的轻链、重链以及筛选标记基因，克服传统载体重链、轻链及筛选标记基因表达不均衡的问题，提高抗体质量及阳性细胞克隆筛选率，同时载体上含有的核基质结合区序列还能克服转基因沉默，实现转基因在宿主细胞中的高效、长期表达，一方面提高抗体蛋白表达水平，另一方面提高后续单克隆抗体细胞株筛选的有效性。

Description

一种三顺反子表达载体、制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种三顺反子表达载体，同时还涉及该表达载体的制备方法和应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
抗体是一种由抗原诱导、淋巴细胞(浆细胞)合成与分泌的具有特殊氨基酸序列的免疫球蛋白。单克隆抗体(Monoclonalantibodies，mAbs)具有高度的特异性，因而被大量用于各种疾病尤其是癌症和自身免疫性疾病的治疗。自1986年第一个单克隆抗体药物OrthocloneOkt3上市以来，已经有35种单克隆抗体药物相继批准上市。目前，单克隆抗体是增长最快的一类生物医药分子，越来越受到学者及制药企业的关注。大多数单克隆抗体(免疫球蛋白G)由两个相同的重链(HC)和两个相同的轻链(LC)多肽通过二硫桥组装产生。
随着分子生物学的飞速发展，抗体的精细结构和功能逐步得到阐明，结合重组DNA技术，近年来基因工程重组抗体产品应运而生。单克隆抗体真核表达载体构建主要是将轻链和重链分别克隆到2个独立的表达载体上，从而表达出完整的抗体(Guidelinestocellengineeringformonoclonalantibodyproduction.EurJPharmBiopharm.2010)。每个基因在各自的启动子驱动下独立进行转录。但是，这类载体的缺陷在于重链与轻链表达的比例不均衡，而二者的比例影响单克隆抗体的质量，如聚合和糖基化(IRES-mediatedTricistronicvectorsforenhancinggenerationofhighmonoclonalantibodyexpressingCHOcelllines.JBiotechnol.2012)。虽然有些载体能同时表达抗体重链与轻链(专利申请号：201110380100.8，一种抗体的高效表达载体及其制备方法)，但是由于其筛选标记基因与重链、轻链基因不在同一编码框，会导致筛选的某些阳性克隆不表达目的蛋白，出现假阳性细胞克隆(Vectorfragmentation:characterizingvectorintegrityintransfectedclonesbySouthernblotting.BiotechnolProg.2010)。
此外，在CHO细胞表达系统中，高水平持续稳定表达的细胞株往往难以得到，这是因为转基因转染细胞后的随机整合，使有些转基因发生沉默或者表达水平降低，因此需要从大量细胞克隆株中分离出稳定高效表达的克隆细胞株，这也给基因工程产业化生产带来了很大困扰(Astudyofmonoclonalantibody-producingCHOcelllines:whatmakesastablehighproducer？Biotechnol.Bioeng.2009)。核基质结合区序列(matrixattachmentregion，MAR)是限制酶消化后仍附着在核基质上的DNA序列，长度为300～3000bp，富含AT碱基对(＞60％)，以及几个短的“共有序列”，如A-box(AATAAAYAAA)、T-box(TTWTWTTWTT)、DNA链解旋序列(AATATATTT或AATATT)、拓扑异构酶II结合位点(GTNWAYATTNATNNR)等。研究表明，MAR序列能提高CHO表达系统转基因表达水平，同时降低转化株转基因表达水平差异(Genome-widepredictionofmatrixattachmentregionsthatincreasegeneexpressioninmammaliancells.Nat.Methods.2007；PositionaleffectsofthematrixattachmentregionontransgeneexpressioninstablytransfectedCHOcells.CellBiol.Int.2010)。
发明内容
本发明的目的是提供一种三顺反子表达载体，该载体能同时表达抗体的重链、轻链以及筛选标记基因，提高阳性细胞克隆筛选率，载体上含有的MAR序列还能克服转基因沉默，提高抗体蛋白表达水平，并提高后续单克隆抗体细胞株筛选的有效性。
同时，本发明还提供一种三顺反子表达载体的制备方法。
最后，本发明再提供一种三顺反子表达载体的应用。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
一种三顺反子表达载体，包括在启动子上游和PolyA下游引入的核基质结合区序列，以及由IRESwt、IRESatt序列连接而成的三顺反子序列，三顺反子序列的结构为：启动子-轻链信号肽SPL-IRESwt-重链信号肽SPH-IRESatt-筛选标记-PolyA。
所述核基质结合区序列优选为β-珠蛋白MAR序列(GenBank登录号：L22754.1，第840～2998位碱基)。
所述启动子选自SV40、CMV、EF-1α、CAG等中的任一种。优选为SV40启动子，核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。
所述轻链信号肽SPL的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。
所述IRESwt为脑心肌炎病毒(Encephalomyocaralitisvirus，EMCV)的内部核糖体进入位点(internalribosomalentrysite，IREs)，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。
所述重链信号肽SPH的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示。
所述IRESatt为突变的脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。
所述筛选标记选自新霉素磷酸转移酶(neomycinphosphotransferase，NPT)、博来霉素(zeocin/zeomycin)抗性基因等中的任一种。优选为NPT抗性弱化基因，核苷酸序列如SEQIDNO:6所示。
上述三顺反子表达载体可采用常规方法构建。具体的，包括以下步骤：
1)分别采用MluI和EcoRI酶双酶切SEQIDNO:9所示序列和pIRES-Neo载体，回收酶切片段，连接、转化后鉴定，得到pIRES-101载体；
2)分别采用SmaI和NarI酶双酶切SEQIDNO:10所示序列和pIRES-101载体，回收酶切片段，连接、转化后鉴定，得到pIRES-102载体；
3)分别采用PacI和NarI酶双酶切SEQIDNO:11所示序列和pIRES-102载体，回收酶切片段，连接、转化后鉴定，得到pIRES-103载体；
4)分别采用SwaI和XbaI酶双酶切SEQIDNO:12所示序列和pIRES-103载体，回收酶切片段，连接、转化后鉴定，得到pIRES-104载体；
5)分别在pIRES-104载体的SV40启动子的NruI、MluI酶切位点之间以及polyA下游的XhoI、BstZ17I酶切位点之间插入β-珠蛋白MAR序列，即得。
上述三顺反子表达载体的应用，具体为将单克隆抗体的重链可变区基因序列插入轻链信号肽SPL与IRESwt之间，轻链可变区基因序列插入重链信号肽SPH与IRESatt之间，构建重组载体；将重组载体转入宿主细胞中，随宿主细胞复制表达目的蛋白。
所述单克隆抗体如为抗CD20单克隆抗体，其重链可变区基因序列如SEQIDNO:7所示，轻链可变区基因序列如SEQIDNO:8所示。
本发明的有益效果：
本发明中三顺反子表达载体包括核基质结合区序列以及由两个内核糖体进入位点序列连接而成的三顺反子序列，三顺反子序列的结构为：启动子-轻链信号肽SPL-IRESwt-重链信号肽SPH-IRESatt-筛选标记-PolyA。该载体能同时表达抗体的轻链、重链以及筛选标记基因，克服传统载体重链、轻链及筛选标记基因表达不均衡的问题，提高抗体质量及阳性细胞克隆筛选率，同时载体上含有的核基质结合区序列还能克服转基因沉默，实现转基因在宿主细胞中的高效、长期表达，一方面提高抗体蛋白表达水平，另一方面提高后续单克隆抗体细胞株筛选的有效性。
附图说明
图1为pIRES-Neo载体的结构示意图；
图2为pIRES-101载体的结构示意图；
图3为pIRES-102载体的结构示意图；
图4为pIRES-103载体的结构示意图；
图5为pIRES-104载体的结构示意图；
图6为pIRES-105载体的结构示意图；
图7为pIRES-106载体的结构示意图；
图8为抗CD20抗体在CHO-K1细胞中的表达；
图9为抗CD20抗体在不同载体下的表达水平及阳性克隆率对比。
具体实施方式
下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成本发明的任何限制。除所列举实施例外，还可以有其他实施方式。但是，凡采用等同替换或等效变换获得的任何技术方案，均落在本发明要求的保护范围之内。
实施例1
三顺反子表达载体的构建，包括以下步骤：
1、pIRES-101载体的构建(即在pIRES-Neo载体基础上，用SV40启动子替换CMV启动子，同时在MCS插入轻链信号肽序列，以及NdeI、HpaI酶切位点)
1)合成SV40启动子及轻链信号肽的融合序列
根据报道的SV40启动子序列(GenBank登录号：KM359772.1，第2794～3247位碱基，如SEQIDNO:3所示)及轻链信号肽序列(GenBank登录号：Z69026.1，第1～66位碱基，如SEQIDNO:4所示)人工合成SV40启动子及轻链信号肽的融合序列(如SEQIDNO:9所示)，具体交由通用生物基因(安徽)有限公司合成。为便于克隆，在合成融合序列时，5′端引入AGCACGCGT序列，其中AGC为保护碱基，ACGCGT为MluI酶切位点；3′端引入pIRES-Neo载体的部分序列(GenBank登录号：U89673.1，第821～926位碱基)、轻链信号肽序列(GenBank登录号Z69026.1，第1～66位碱基)、NdeI、HpaI酶切位点及3个保护碱基，具体序列如下：
CTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTTGGT ACCGAGCTCGGATCGATATCTGCGGCCGCATGGACATGAGGGTTCCTGCTCAGCTCCTGGGACTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTCATATGGTTAACGAATTCCGA，其中下划线部分为pIRES-Neo载体的部分序列，斜体部分为轻链信号肽序列，CATATG为NdeI酶切位点，GTTAAC为HpaI酶切位点，GAATTC为EcoRI酶切位点，CGA为保护碱基。
2)构建pIRES-101载体
用MluI/EcoRI双酶切合成的融合序列片段，同时用MluI/EcoRI双酶切pIRES-Neo质粒DNA(pIRES-Neo载体结构示意图见图1)。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的融合序列片段、pIRES-Neo线形质粒DNA。
融合序列的双酶切体系为：融合序列10μL(1μg/μL)，10×Hbuffer3μL(TakaRa公司)，MluI/EcoRI酶各1.0μL(10U/μL)，补足水至30μL；酶切条件为：37℃，酶切3min。
pIRES-Neo质粒的双酶切体系为：pIRES-Neo质粒5μL(1μg/μL)，10×Hbuffer2μL(TakaRa公司)，MluI/EcoRI酶各0.5μL(10U/μL)，补足水至20μL；酶切条件为：37℃，酶切3min。
取酶切后的融合序列和pIRES-Neo线形质粒DNA(摩尔比5:1)，使用NEB公司TM的连接试剂盒，25℃连接5min。将连接产物加入到E.coliJM109菌株感受态细胞悬液中进行转化，取150μL转化菌液接种在含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜，挑取单菌落继代培养，并进行重组质粒的双酶切(MluI/EcoRI)验证，选取酶切验证正确的质粒进行测序验证，构建正确的质粒命名为pIRES-101，结构示意图见图2。
2、pIRES-102载体的构建(即在pIRES-101载体基础上，插入重链信号肽序列、NheI及PacI酶切位点)
1)合成重链信号肽
根据报道的重链信号肽序列(参见专利文献：pHAb-FAST人源抗体表达载体系统及其使用方法，申请号：201510053657.9，如SEQIDNO:5所示)人工合成重链信号肽序列(如SEQIDNO:10所示)，具体交由通用生物基因(安徽)有限公司合成。为便于克隆以及保证序列的完整性，在合成重链信号肽序列时，5′端引入AGCCCCGGG序列，其中AGC为保护碱基，CCCGGG为SmaI酶切位点；3′端引入NheI、PacI酶切位点、pIRES-Neo载体的部分序列(GenBank登录号：U89673.1，第1892～2051位碱基)以及3个保护碱基，具体序列如下：
GCTAGCTTAATTAAATAATTCCTGCAGCCAATATGGGATCGGCCATTGAACAAGATGGATTGCACGC AGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCG CCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGA，其中GCTAGC为NheI酶切位点，TTAATTAA为PacI酶切位点，下划线部分为pIRES-Neo载体的部分序列，CGA为保护碱基。
2)构建pIRES-102载体
用SmaI/NarI双酶切合成的重链信号肽序列，同时用SmaI/NarI双酶切pIRES-101质粒DNA，酶切体系及连接体系基本同步骤1，所用buffer为CutSmartBuffer(购自美国NewEnglandBiolabsLTD，即NEB公司)。
重链信号肽序列的双酶切体系为：合成重链信号肽序列片段10μL(1μg/μL)，10×CutSmartBuffer3μL，SmaI/NarI酶(10U/μL)各1.0μL，补足水至30μL，酶切条件为：37℃，酶切3min。
pIRES-101质粒的双酶切体系为：pIRES-101质粒5μL(1μg/μL)，10×CutSmartBuffer2μL，SmaI/NarI(10U/μL)各0.5μL，补足水至20μL，酶切条件为：37℃，酶切3min。
取酶切后的重链信号肽序列片段和pIRES-101线形质粒DNA(摩尔比5:1)，使用NEB公司TM的连接试剂盒，25℃连接5min。将连接产物加入到E.coliJM109菌株感受态细胞悬液中进行转化，取150μL转化菌液接种在含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜，挑取单菌落继代培养，并进行重组质粒的双酶切(SmaI/NarI)验证，选取酶切验证正确的质粒进行测序验证，构建正确的质粒命名为pIRES-102，结构示意图见图3。
3、pIRES-103载体的构建(即在pIRES-102载体基础上，插入IRESatt序列及SwaI酶切位点)
1)合成IRESatt序列
根据报道的IRESatt序列(GenBank登录号：JQ692169.1，第610～1197位碱基)及文献(HoSC,BardorM,LiB,LeeJJ,SongZ,TongYW,GohLT,YangY.Comparisonofinternalribosomeentrysite(IRES)andFurin-2A(F2A)formonoclonalantibodyexpressionlevelandqualityinCHOcells,PLoSOne.2013May21；8(5):e63247.)设计IRESatt序列(如SEQIDNO:2所示)，并人工合成IRESatt序列(如SEQIDNO:11所示)，具体交由通用生物基因(安徽)有限公司合成。为便于克隆以及保证序列的完整性，在合成IRESatt序列时，5′端引入AGCTTAATTAA序列，其中AGC为保护碱基，TTAATTAA为PacI酶切位点；3′端引入SwaI酶切位点、pIRES-Neo载体的部分序列(GenBank登录号：U89673.1，第1892～2051位碱基)，具体序列如下：
ATTTAAATATAATTCCTGCAGCCAATATGGGATCGGCCATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCT CCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTT CCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCC，其中ATTTAAAT为SwaI酶切位点，下划线部分为pIRES-Neo载体的部分序列。
2)构建pIRES-103载体
用PacI/NarI双酶切合成的IRESatt序列，同时用PacI/NarI双酶切pIRES-102质粒DNA，酶切体系及连接体系基本同步骤1，所用buffer为CutSmartBuffer(购自美国NEB公司)。
IRESatt序列的双酶切体系为：合成IRESatt序列片段10μL(1μg/μL)，10×CutSmartBuffer3μL，PacI/NarI(10U/μL)各1.0μL，补足水至30μL，酶切条件为：37℃，酶切3min。
pIRES-102质粒的双酶切体系为：pIRES-102质粒5μL(1μg/μL)，10×CutSmartBuffer2μL，PacI/NarI(10U/μL)各0.5μL，补足水至20μL，酶切条件为：37℃，酶切3min。
取酶切后的IRESatt序列片段和pIRES-102线形质粒DNA(摩尔比6:1)，使用NEB公司TM的连接试剂盒，25℃连接5min。将连接产物加入到E.coliJM109菌株感受态细胞悬液中进行转化，取150μL转化菌液接种在含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜，挑取单菌落继代培养，并进行重组质粒的双酶切(PacI/NarI)验证，选取酶切验证正确的质粒进行测序验证，构建正确的质粒命名为pIRES-103，结构示意图见图4。
4、pIRES-104载体的构建(即在pIRES-103载体基础上，将筛选标记替换为NPT抗性弱化基因)
1)合成NPT抗性弱化基因
根据报道的NPT抗性弱化基因序列(GenBank登录号：KP844566，第778～1572位碱基)及文献(Sautter,K.,Enenkel,B.(2005).Selectionofhigh-producingCHOcellsusingNPTselectionmarkerwithreducedenzymeactivity.BiotechnologyandBioengineering,89,530-538)设计NPT抗性弱化基因，为弱化筛选标记，将261位天冬氨酸突变为甘氨酸(密码子由GAC突变为GGC，如SEQIDNO:6所示)，人工合成NPT抗性弱化基因序列(如SEQIDNO:12所示)，具体交由通用生物基因(安徽)有限公司合成。为便于克隆，在合成NPT抗性弱化基因时，5′端引入3个保护碱基、pIRES-Neo载体的部分序列(GenBank登录号：U89673.1，第1892～1931位碱基)以及SwaI酶切位点，具体序列如下：
CGAATTTAAATATAATTCCTGCAGCCAATATGGGATCGGCCATTGAACAAG，其中CGA为保护碱基，ATTTAAAT为SwaI酶切位点，下划线部分为pIRES-Neo载体的部分序列；3′端引入如下序列：GGGGATCAATTCTCTAGACGA，其中TCTAGA为XbaI酶切位点，CGA为保护碱基。
2)构建pIRES-104载体
用SwaI/XbaI双酶切合成的NPT抗性弱化基因，同时用SwaI/XbaI双酶切pIRES-103质粒DNA，酶切体系及连接体系基本同步骤1，所用buffer为NEBuffer3.1(购自美国NEB公司)。将连接产物加入到E.coliJM109菌株感受态细胞悬液中进行转化，取150μL转化菌液接种在含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜，挑取单菌落继代培养，并进行重组质粒的双酶切(SwaI/XbaI)验证，选取酶切验证正确的质粒进行测序验证，构建正确的质粒命名为pIRES-104，结构示意图见图5。
5、pIRES-105载体的构建(即在pIRES-104载体基础上，在启动子SV40的上游及polyA的下游插入β-珠蛋白MAR序列)
1)合成β-珠蛋白MAR序列
根据β-珠蛋白MAR序列(GenBank登录号：L22754.1，第840～2998位)设计引物P1、P2、P3和P4。在引物P1、P2的5′端分别引入NruI、MluI酶切位点，P3、P4的5′端分别引入XhoI、BstZ17I酶切位点，引物序列如下(下划线为酶切位点)：
P1：5′-GTCTCGCGAAATATATCTCCTGATAAAATGTCTA-3′；
P2：5′-AGCACGCGTGGATCCTCCCATTTCGGCCTCCTG-3′；
P3：5′-GTCCTCGAGAATATATCTCCTGATAAAATGTCTA-3′；
P4：5′-GTCGTATACGGATCCTCCCATTTCGGCCTCCTG-3′。
提取人外周血基因组DNA作为模板，分别用引物P1/P2、P3/P4进行PCR扩增，扩增反应体系见下表1。
表1PCR扩增反应体系
PCR扩增程序为：95℃3min，94℃40s，58℃30s，72℃40s，每个退火温度4个循环，最后55℃，30个循环，72℃3min。
琼脂糖凝胶电泳回收扩增产物，送生物公司测序验证。结果表明，扩增出的DNA片段与GenBank登录的β-珠蛋白MAR序列完全一致。
2)构建表达盒5′端含β-珠蛋白MAR序列的表达载体
用NruI/MluI双酶切β-珠蛋白MAR序列的扩增产物(经测序验证正确)，同时用NruI/MluI双酶切pIRES-104质粒DNA。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的β-珠蛋白MAR序列片段和pIRES-104线形质粒DNA。
β-珠蛋白MAR序列的双酶切体系为：β-珠蛋白MAR序列片段10μL(1μg/μL)，10×NEBuffer3.13μL(美国NEB公司)，NruI/MluI酶(10U/μL)各1.0μL，补足水至30μL，酶切条件为：37℃，酶切3min。
pIRES-104质粒的双酶切体系为：pIRES-104质粒5μL(1μg/μL)，10×NEBuffer3.1(美国NEB公司)2μL，NruI/MluI酶(10U/μL)各0.5μL，补足水至20μL，酶切条件为：37℃，酶切3min。
取酶切后的β-珠蛋白MAR序列片段和pIRES-104线形质粒DNA(摩尔比5:1)，使用NEB公司TM的连接试剂盒，25℃连接5min。将连接产物加入到E.coliJM109菌株感受态细胞悬液中进行转化，取150μL转化菌液接种在含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜，挑取单菌落继代培养，并进行重组质粒的双酶切(NruI/MluI)验证，选取酶切验证正确的质粒进行测序验证，构建正确的质粒命名为pIRES-104M。
3)构建达盒5′端及polyA下游均含β-珠蛋白MAR序列的表达载体
用XhoI/BstZ17I双酶切β-珠蛋白MAR序列的扩增产物，同时用XhoI/BstZ17I双酶切pIRES-104M质粒DNA，酶切体系及连接体系同上。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的β-珠蛋白MAR序列片段和pIRES-105M线形质粒DNA，连接、转化操作同上。XhoI/BstZ17I双酶切重组质粒载体，选取酶切验证正确的质粒进行测序验证，构建正确的质粒命名为pIRES-105，结构示意图见图6。
实施例2
pIRES-106载体的构建，包括以下步骤：
1)人工合成抗CD20抗体kappa链cDNA序列并构建pIRES-105C表达载体
根据SEQIDNO:8所示序列人工合成抗CD20抗体kappa链cDNA序列(如SEQIDNO:14所示)，具体交由通用生物基因(安徽)有限公司合成。为方便克隆，在合成序列的5′端引入ATACATATG，其中ATA为保护碱基，CATATG为NdeI酶切位点；3′端引入GTTAACAGC，其中GTTAAC为HpaI酶切位点，AGC为保护碱基。再将合成的抗CD20抗体kappa链cDNA序列插入到pIRES-105的轻链表达盒中。
分别用NdeI/HpaI双酶切合成的抗CD20抗体kappa链cDNA序列和pIRES-105质粒DNA酶切体系及连接体系基本同步骤1。
抗CD20抗体kappa链cDNA序列的双酶切体系为：抗CD20抗体kappa链cDNA序列片段10μL(1μg/μL)，10×CutSmartBuffer3μL(美国NEB公司)，NdeI/HpaI酶(10U/μL)各1.0μL，补足水至30μL，酶切条件为：37℃，酶切3min。
pIRES-105质粒的双酶切体系为：pIRES-105质粒5μL(1μg/μL)，10×CutSmartBuffer2μL(美国NEB公司)，NdeI/HpaI酶(10U/μL)各0.5μL，补足水至20μL，酶切条件为：37℃，酶切3min。
取酶切后的抗CD20抗体kappa链cDNA序列片段和pIRES-105线形质粒DNA(摩尔比5:1)，使用NEB公司TM的连接试剂盒，25℃连接5min。将连接产物加入到E.coliJM109菌株感受态细胞悬液中进行转化，取150μL转化菌液接种在含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜，挑取单菌落继代培养，并进行重组质粒的双酶切(NdeI/HpaI)验证，选取酶切验证正确的质粒进行测序验证，构建正确的质粒命名为pIRES-105C。
2)人工合成抗CD20抗体gamma链cDNA序列并构建pIRES-106表达载体
根据SEQIDNO:7所示序列人工合成抗CD20抗体gamma链cDNA序列(如SEQIDNO:13所示)，为方便克隆，合成序列的两端分别插入有NheI、PacI酶切位点。
抗CD20抗体gamma链cDNA序列的双酶切体系为：抗CD20抗体gamma链cDNA序列片段10μL(1μg/μL)，10×CutSmartBuffer3μL(美国NEB公司)，NheI/PacI酶(10U/μL)各1.0μL，补足水至30μL，酶切条件为：37℃，酶切3min。
pIRES-105C质粒的双酶切体系为：pIRES-105C质粒5μL(1μg/μL)，10×CutSmartBuffer2μL(美国NEB公司)，NheI/PacI酶(10U/μL)各0.5μL，补足水至20μL，酶切条件为：37℃，酶切3min。
取酶切后的抗CD20抗体gamma链cDNA序列片段和pIRES-105C线形质粒DNA(摩尔比5:1)，使用NEB公司TM的连接试剂盒，25℃连接5min。将连接产物加入到E.coliJM109菌株感受态细胞悬液中进行转化，取150μL转化菌液接种在含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜，挑取单菌落继代培养，并进行重组质粒的双酶切(NheI/PacI酶)验证，选取酶切验证正确的质粒进行测序验证，构建正确的质粒命名为pIRES-106。结构示意图见图7。
试验例
1、抗CD20抗体在CHO-K1细胞中的表达
选择生长状态良好的CHO-K1细胞接种到6孔培养板上，待铺板密度达到约80％进行转染。操作步骤如下：10μLlipofectamine2000+240μL无血清Opti-MEM培养基，在37℃孵箱中静置5min，将无血清Opti-MEM培养基与250μL(5μg)表达载体pIRES-107混合，37℃孵箱中静置20min；同时用PBS将6孔培养板上的细胞清洗三遍，加入2mL无血清的DMEM细胞培养基；然后将脂质体与pIRES-107质粒DNA的混合液逐滴轻滴入孔中，尽快轻轻摇晃培养平板使其混匀；放入5％CO2细胞培养箱中，37℃培养6h后，将无血清DMEM培养基更换成DMEM完全培养基，放入细胞培养箱内继续培养。48h后在转染孔中加入600μg/mL的G418药物，每48h换成新鲜D/F完整培养基，从第五天开始细胞大量死亡。筛选两周后将G418浓度调整到维持浓度300μg/mL继续培养。药物筛选完成后，对细胞进行有限稀释法单克隆化操作。约两个星期单克隆细胞在孔中长至80％，一天后取细胞上清做ELISA检测，检测结果见图8。图8挑选的10个克隆中，4#和7#克隆的产率最佳，分别为98.2μg/mL和96.3μg/mL。
2、对比试验
为了验证利用三顺反子控制轻重链比例能够提高抗CD20抗体在CHO细胞中的表达能力，特构建3组真核细胞载体，其中组A为抗CD20抗体的重链和轻链基因分别插入到pIRES-Neo表达载体，组B为抗CD20抗体的重链和轻链基因分别插入到pIRES-105表达载体，组C为上述pIRES-107表达载体。经同一操作后获得数量近似的单克隆株，对阳性单克隆群进行ELISA检测，并比较克隆株的表达量，结果见图9。从图中可以看出，采用pIRES-107表达载体的抗体产量及阳性克隆率均为最高。
实施例中所用大肠杆菌(Escherichiacoli)JM109、pIRES-Neo质粒载体、细胞系试剂、工具酶等均为市售商品。pIRES-Neo质粒载体购自Clontech生物公司。

Claims (10)

1.一种三顺反子表达载体，其特征在于：包括在启动子上游和PolyA下游引入的核基质结合区序列，以及由IRESwt、IRESatt序列连接而成的三顺反子序列，三顺反子序列的结构为：启动子-轻链信号肽SPL-IRESwt-重链信号肽SPH-IRESatt-筛选标记-PolyA。
2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于：所述核基质结合区序列为β-珠蛋白MAR序列，GenBank登录号：L22754.1第840～2998位碱基。
3.根据权利要求1或2所述的表达载体，其特征在于：所述启动子为SV40启动子，核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于：所述轻链信号肽SPL的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于：所述IRESwt的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。
6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于：所述重链信号肽SPH的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示。
7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于：所述IRESatt的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。
8.根据权利要求7所述的表达载体，其特征在于：所述筛选标记为NPT抗性弱化基因，核苷酸序列如SEQIDNO:6所示。
9.如权利要求8所述表达载体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)分别采用MluI和EcoRI酶双酶切SEQIDNO:9所示序列和pIRES-Neo载体，回收酶切片段，连接、转化后鉴定，得到pIRES-101载体；
2)分别采用SmaI和NarI酶双酶切SEQIDNO:10所示序列和pIRES-101载体，回收酶切片段，连接、转化后鉴定，得到pIRES-102载体；
3)分别采用PacI和NarI酶双酶切SEQIDNO:11所示序列和pIRES-102载体，回收酶切片段，连接、转化后鉴定，得到pIRES-103载体；
4)分别采用SwaI和XbaI酶双酶切SEQIDNO:12所示序列和pIRES-103载体，回收酶切片段，连接、转化后鉴定，得到pIRES-104载体；
5)分别在pIRES-104载体的SV40启动子的NruI、MluI酶切位点之间以及polyA下游的XhoI、BstZ17I酶切位点之间插入β-珠蛋白MAR序列，即得。
10.如权利要求8所述表达载体的应用，其特征在于：将单克隆抗体的重链可变区基因序列插入轻链信号肽SPL与IRESwt之间，轻链可变区基因序列插入重链信号肽SPH与IRESatt之间，构建重组载体；将重组载体转入宿主细胞中，随宿主细胞复制表达目的蛋白。
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