CN114561430A - 人源化细胞瞬时表达用表达载体、表达系统、构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于重组蛋白表达技术领域，具体涉及人源化细胞瞬时表达载体、表达系统及其应用。本发明构建的表达载体，引入TRE/TAP组成的反式激活蛋白元件，并且TAP作为独立表达框，相比未引入该元件的表达载体，能够成倍提高目的蛋白瞬时表达量；更进一步的，本发明将TRE/TAP组成的反式激活蛋白元件与核基质结合区元件MAR和IRES复配使用，相互之间协同增效，进一步提高目的蛋白的瞬时表达量。由此，本发明提供的表达载体和表达系统能够应用于制备蛋白类药物。
Description
技术领域
本发明属于重组蛋白表达技术领域，具体涉及人源化细胞瞬时表达载体、表达系统及其应用。
背景技术
随着基因工程技术的发展，利用基因工程生产的重组蛋白质类的数量和种类正在不断的增加，并且已经成为医药工业的重要部分。重组药物蛋白的表达系统主要包括E.coli、酵母以及非人源化哺乳动物细胞系。E.coli适合表达分子量较小、结构相对简单的蛋白质，酵母表达系统适合表达分子量较大、结构较复杂、较少糖基化的蛋白质。结构复杂或糖基化对于蛋白质的活性非常重要，非人源化哺乳动物细胞系如中国仓鼠卵巢细胞虽然具有类似人源化的翻译后加工修饰(post-translational modifications，PTMs)，但其PTMs与人源化细胞还存在差异。因此，人源化细胞目前成为生产人源性治疗性蛋白的首选表达系统，特别是需要较复杂翻译后修饰的蛋白质生产的首选系统。
重组蛋白的表达有瞬时表达和稳定表达两种，瞬时表达状态下导入细胞的外源基因和宿主细胞染色体DNA不发生整合，能够短时间获得目的蛋白，且其通用性强等优点。但由于细胞中的外源基因会随着细胞分裂而丢失，因此目的蛋白表达只能维持几天到十几天时间，因此存在表达量低的缺点，使其方法的应用受到较大的限制，如何提高人源化细胞重组瞬时表达的目的基因的表达量成为亟待解决的问题。
目前针对提高人源化细胞重组瞬时表达的方法包括细胞培养过程中添加功能性助剂，比如添加一些生长因子、程序性死亡抑制剂或者共转一些生长因子基因、miRNA分子等，但是该方法存在工艺复杂，所用试剂昂贵，不适合大规模生产的缺陷。同时也包括通过改进和优化表达系统的方式提高目的蛋白表达，比如在表达系统中设置附加体维持系统、强启动子/增强子、蛋白质反式激活系统，但是这些所有元素应当如何组合使用整合至表达载体中形成稳定的表达系统仍然是目前尚需解决的技术问题。
反式激活蛋白(transactivator protein，TAP)是一种来自HIV病毒RNA结合蛋白，具有转录激活的作用，能够通过结合在HIV RNA的5'端形成的反式激活反应元件(transactivation response element，TRE)茎环结构，激活HIV-1中的转录。TAP与TRE的结合能够促进转录延长，进而提高下游基因表达。如何使用TAP/TRE，以及与其他元件配合，构建人源化细胞重组表达系统，进一步提高目的蛋白表达量是本发明需要解决的技术问题。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的之一在于提供人源化细胞瞬时表达用表达载体，通过在表达系统中引入反式激活蛋白元件，提高目的蛋白表达量。
本发明的目的之二在于提供人源化细胞瞬时表达系统。
本发明的目的之三在于提供人源化细瞬时表达系统构建方法。
本发明的目的之四在于提供本发明人源化细胞瞬时表达系统应用于重组表达目的蛋白。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
人源化细胞瞬时表达用表达载体，该载体包含在启动子和目的基因之间插入的TRE编码序列；和插入目的基因下游的TAP表达框。
进一步优选的，所述启动子上游和TAP表达框下游还插入有核基质结合区序列。
进一步优选的，所述TAP表达框的结构为IRES-TAP-PolyA；该载体的结构为核基质结合区序列-启动子-TRE-目的基因-IRES-TAP-PolyA-核基质结合区序列。
可选的，所述TRE编码序列如SEQ ID NO:1所示；所述TAP编码序列如SEQ ID NO:2所示。
可选的，所述核基质结合区序列为β-珠蛋白MAR序列；IRES序列为HRV IRES序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述启动子为CMV。
可选的，所述人源化细胞选自HEK293；更优选的，选自HEK293T细胞、HEK293H细胞、HEK293E细胞、HEK293F细胞或者HEK293S细胞。
人源化细胞瞬时表达系统，包含上述表达载体。
上述人源化细胞瞬时表达系统的构建方法，包括以下操作步骤：
1)构建表达载体：在pIRES-Neo载体中构建形成核基质结合区序列-启动子-TRE-目的基因-IRES-TAP-PolyA-核基质结合区序列表达盒，构建形成表达载体；
2)插入目的基因：将目的基因插入表达载体的启动子与IRES序列之间，构建形成重组表达载体；
3)构建表达系统：将重组表达载体转染进入宿主细胞，构建获得瞬时表达系统。
本发明构建的表达载体以及插入目的基因转染进入人源化来源的宿主细胞构建的表达系统，引入TRE/TAP组成的反式激活蛋白元件，并且TAP作为独立表达框，相比未引入该元件的表达载体，能够成倍提高目的蛋白瞬时表达量；更进一步的，本发明将TRE/TAP组成的反式激活蛋白元件与核基质结合区元件和IRES复配使用，相互之间协同增效，进一步提高目的蛋白的瞬时表达量。由此，本发明提供的表达载体和表达系统能够应用于制备蛋白类药物。
附图说明
图1为试验例1构建的pIRES-EPO-2序列结构示意图；
图2为试验例1构建的不同表达系统EPO表达量对比图；
图3为试验例2构建的不同表达系统HBsAg表达量对比图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此；实施例及试验例中所用的培养基、试剂、、细胞系试剂等均为市售商品。
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。实施例及试验例中所用大肠杆菌(Escherichia coli)JM109、pIRES-Neo质粒载体、细胞系试剂、工具酶等均为市售商品。内切酶及NE Buffer均购自美国New England Biolabs(NEB)公司，pIRES-Neo质粒载体购自Clontech生物公司。
实施例1
本实施例提供包含TRE/TAP组成的反式激活蛋白元件的表达载体，构建方法的具体步骤包括：
1)人工合成TAP序列、TRE序列：
人工合成如SEQ ID NO：2所示的TAP-1核苷酸序列，并且5′及3′-端分别插入SmaI(CCCGGG)、XbaI(TCTAGA)酶切位点；
人工合成如SEQ ID NO：1所示的TRE-1核苷酸序列，并且5′及3′-端分别插入EcoRV(GATATC)、NotI(GCGGCCGC)酶切位点；
2)构建pIRES-TAP1载体：
用SmaI/XbaI双酶切合成的TAP-1序列，同时用SmaI/XbaI双酶切pIRES-Neo质粒载体，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的TAP-1序列片段和pIRES-Neo线形质粒DNA：
TAP-1序列的双酶切体系为：TAP-1序列10μL(1μg/μL)，10×NE Buffer 3.1 3μL，SmaI/XbaI(10U/μL)各1.0μL，补足水至30μL；酶切条件为：37℃，酶切3min。
pIRES-Neo质粒的双酶切体系为：pIRES-Neo质粒5μL(1μg/μL)，10×NE Buffer3.12μL，SmaI/XbaI(10U/μL)各0.5μL，补足水至20μL；酶切条件为：37℃，酶切3min。
取酶切后的TAP-1序列片段和pIRES-Neo线形质粒DNA(摩尔比5:1)，使用NEB公司TM的连接试剂盒，25℃连接5min。提取重组质粒并进行双酶切(SmaI/XbaI)验证，取酶切验证正确的质粒进行测序验证，构建正确的质粒命名为pIRES-TAP1；
3)构建pIRES-TAP1-TRE1载体：
用EcoRV/NotI双酶切合成的TRE-1序列，同时用EcoRV/NotI双酶切pIRES-TAP质粒DNA。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的TRE序列片段和pIRES-TAP线形质粒DNA：
TRE序列的双酶切体系为：TRE-1序列10μL(1μg/μL)，10×NE Buffer 3μL，EcoRV/NotI(10U/μL)各1.0μL，补足水至30μL；酶切条件为：37，℃酶切3min。
pIRES-TAP质粒的双酶切体系为：pIRES-Neo质粒5μL(1μg/μL)，10×NE Buffer2μL，EcoRV/NotI(10U/μL)各0.5μL，补足水至20μL；酶切条件为：37，℃酶切3min。
琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的TRE序列片段和pIRES-TAP线形质粒DNA,使用NEB公司TM的连接试剂盒，25℃连接5min。提取重组质粒并进行双酶切(EcoRV/NotI)验证，取酶切验证正确的质粒进行测序验证，构建正确的质粒命名为pIRES-TAP1-TRE1。
实施例2
本实施例提供包含TRE/TAP组成的反式激活蛋白元件、MAR元件、HRV IRES元件的表达载体，构建方法的具体步骤包括：
1)构建包含MAR元件、HRV IRES元件的表达载体：
以pIRES-Neo质粒为出发载体，按照专利发明专利CN106520832A记载的构建方法构建pIRES-C3载体；
2)按照实施例1所述的方法以pIRES-C3为出发载体，在出发载体中插入TAP-1序列，构建中间载体pIRES-TAP1-MAR-IRES；
再在中间载体pIRES-TAP1-MAR-IRES中插入TRE-1序列，构建获得质粒命名为pIRES-TAP1-TRE1-MAR-IRES。
实施例3
本实施提供包含目的蛋白EPO的表达载体的构建方法，具体步骤包括：
1)合成EPO序列：
根据NCBI公布的EPO序列(GenBank：JN849371.1，第1～582位碱基)，人工合成EPO序列(5′端和3′端分别引入EcoRI、BamHI酶切位点)，具体交由通用生物基因(安徽)有限公司完成：
2)将EPO序列插入试验质粒载体：
用EcoRI/BamHI双酶切引物人工合成的EOP序列，同时用EcoRI/BamHI双酶切试验质粒载体DNA，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的EPO序列片段和试验质粒的线性质粒DNA：
EPO序列的双酶切体系为：EPO序列片段10μL(1μg/μL)，10×NEBuffer 3μL，EcoRI/BamHI酶(10U/μL)各1.0μL，补足水至30μL；酶切条件为：37，℃酶切3min；
试验质粒的双酶切体系为：质粒5μL(1μg/μL)，10×NEBuffer 2μL，EcoRI/BamHI(10U/μL)各0.5μL，补足水至20μL；酶切条件为：37，℃酶切3min。
取酶切后的EPO序列片段和试验质粒的线性质粒DNA(摩尔比5:1)，使用NEB公司TM的连接试剂盒，25℃连接5min。提取重组质粒并进行双酶切(EcoRI/BamHI)验证，取酶切验证正确的质粒进行测序验证。
对比例1
本对比例提供一种包含TAP元件的表达载体，与实施例2的不同之处在于替换TAP-1序列为如SEQ ID NO：4所示TAP-2序列，在pIRES-C3中插入TAP-2序列，不插入TRE序列，构建载体命名为pIRES-TAP2-MAR-IRES。
对比例2
本对比例提供一种表达载体，与实施例2的不同之处在于替换TRE-1序列为如SEQID NO：5所示TRE-2序列，其他同实施例2，构建载体命名为pIRES-TAP1-TRE2-MAR-IRES。
对比例3
本对比例提供一种表达载体，与实施例2的不同之处在于替换TRE-1序列为如SEQID NO：6所示TRE-3序列，其他同实施例2，构建载体命名为pIRES-TAP1-TRE3-MAR-IRES。
对比例4
本对比例提供一种表达载体，与实施例2的不同之处在于替换TAP-1序列为如SEQID NO：4所示TAP-2序列，其他同实施例2，构建载体命名为pIRES-TAP2-TRE1-MAR-IRES。
对比例5
本对比例提供一种表达载体，与对比例4的不同之处在于替换TRE-1序列为如SEQID NO：5所示TRE-2序列，其他同对比例4，构建载体命名为pIRES-TAP2-TRE2-MAR-IRES。
对比例6
本对比例提供一种表达载体，与对比例4的不同之处在于替换TRE-1序列为如SEQID NO：6所示TRE-3序列，其他同对比例4，构建载体命名为pIRES-TAP2-TRE3-MAR-IRES。
试验例1比较不同载体构建的表达系统对EPO瞬时表达的影响
试验方法：按照实施例3所述的方法分别以pIRES-Neo、实施例1、实施例2、对比例1～6、pIRES-C3提供的表达载体构建包含目的蛋白EPO的表达载体，分别命名为pIRES-EPO、pIRES-EPO-1、pIRES-EPO-2(如图1所示)、pIRES-EPO-3、pIRES-EPO-4、pIRES-EPO-5、pIRES-EPO-6、pIRES-EPO-7、pIRES-EPO-8、pIRES-EPO-9；
选择生长状态良好的HEK293细胞接种到孔板培养板上，待铺板密度达到约80％进行转染。具体操作步骤如下：10μL lipofectamine 2000+240μL无血清FreeStyleTM293expression medium，在37℃孵箱中静置5min，将无血清培养基与250μL(5μg)表达载体混合，37℃孵箱中静置20min；同时用PBS将培养板上的细胞清洗三遍，加入2mL无血清细胞培养基；然后将脂质体与含质粒DNA的混合液逐滴轻滴入孔中，尽快轻轻摇晃培养平板使其混匀；放入5％CO2细胞培养箱中；转染HEK293细胞48h后将细胞转入加有3 0mL HEK293悬浮培养基的125mL康宁摇瓶中，使细胞接种浓度为70万/mL；将培养物放置在设置转速为100rpm/min的摇床上摇床，37℃温育7天，每天按时观察细胞生长状况，并用0.8％台盼蓝染色计数。当细胞培养到7天时，收集培养液，离心获取上清液ELISA检测EPO的表达水平。
结果如图2所示，实施例1提供的表达载体相比出发载体能够提高EPO的表达量，实施例2相比实施例1能够更进一步成倍提高EPO表达量，并且实施例2相比对比例1～6以及pIRES-C3成倍提高EPO表达量。。
试验例2比较不同载体构建的表达系统对HBsAg瞬时表达的影响
试验方法：按照实施例3所述的方法分别以pIRES-Neo、实施例1、实施例2、对比例1～6、pIRES-C3提供的表达载体构建包含目的蛋白HBsAg的表达载体，分别命名为pIRES-HBsAg、pIRES-HBsAg-1、pIRES-HBsAg-2、pIRES-HBsAg-3、pIRES-HBsAg-4、pIRES-HBsAg-5、pIRES-HBsAg-6、pIRES-HBsAg-7、pIRES-HBsAg-8、pIRES-HBsAg-9；
按照试验例1同样的方法检测不同表达载体构建的表达系统的HBsAg表达水平，结果如图3所示，实施例1提供的表达载体相比出发载体能够提高HBsAg的表达量，实施例2相比实施例1能够更进一步成倍提高HBsAg表达量，并且实施例2相比对比例1～6以及pIRES-C3成倍提高HBsAg表达量。。
由上述试验结果可知，在传统载体中加入引入TRE/TAP组成的反式激活蛋白元件，并且TAP作为独立表达框，相比未引入该元件的表达载体，能够成倍提高目的蛋白瞬时表达量；更进一步的，将TRE/TAP组成的反式激活蛋白元件与核基质结合区元件和IRES复配使用，相互之间协同增效，进一步提高目的蛋白的瞬时表达量。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 新乡医学院
<120> 哺乳动物细胞瞬时表达用表达载体、表达系统、构建方法及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
acgtgaattc gggtctctct ggttagacct ctggctaact agggaacccg aattcacgt 59
<210> 2
<211> 303
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
atggagcccg tggatcctag gctggagcct tggaagcacc ctggctccca gcctaagaca 60
gcctgtacaa actgctactg taagaagtgt tgcttccact gccaggtgtg cttcatcaca 120
aaggccctgg gcatcagcta cggcaggaag aagaggaggc agaggaggag agcccaccag 180
aacagccaga cccaccaggc ctccctgtcc aagcagcccg ccagccagcc caggggagat 240
cctaccggcc ctaaggagtc caagaagaag gtggagaggg agaccgagac cgaccctgtg 300
gat 303
<210> 3
<211> 652
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
agcatgcatc tagggcggcc attaaaactg ggagtgggtt gttcccactc actccaccca 60
tgcggtgttg tactctgtta ttacggtaac tttgtacgcc agtttttccc acccttcccc 120
ataatgtaac ttagaagttt gtacaatatg accaataggt gacaatcatc cagactgtca 180
aaggtcaagc acttctgttt ccccggtcaa tgaggatatg ctttacccaa ggcaaaaacc 240
ttagagatcg ttatccccac actgcctaca cagagcccag taccattttt gatataattg 300
ggttggtcgc tccctgcaaa cccagcagta gacctggcag atgaggctgg acattcccca 360
ctggcgacag tggtccagcc tgcgtggctg cctgctcacc cttcttgggt gagaagccta 420
attattgaca aggtgtgaag agccgcgtgt gctcagtgtg cttcctccgg cccctgaatg 480
tggctaacct taaccctgca gccgttgccc ataatccaat gggtttgcgg tcgtaatgcg 540
taagtgcggg atgggaccaa ctactttggg tgtccgtgtt tcctgttttt cttttgattg 600
cattttatgg tgacaattta tagtgtatag attgtcatca tgccccggga ta 652
<210> 4
<211> 258
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
atggagcccg tggatcctag actggagcct tggaagcacc ctggctccca gcccaagacc 60
gcctgcacca attgctactg taagaagtgt tgcttccact gccaggtgtg ttttatcacc 120
aaggccctgg gcatcagcta cggcagaaag aagaggaggc agagaagaag acctccccag 180
ggcagccaga cacaccaggt gagcctgagc aagcagccta ccagccagtc caggggcgac 240
cctaccggcc caaaggag 258
<210> 5
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
ggtggtgggg ttagccagat ctgagcctgg gagctctctg gctaaggtgg tggg 54
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
ggccagagag ctcccaggct cagatctggc c 31
Claims (10)
1.人源化细胞瞬时表达用表达载体，其特征在于，该载体包含在启动子和目的基因之间插入的TRE编码序列；和插入目的基因下游的TAP表达框。
2.如权利要求1所述的人源化细胞瞬时表达用表达载体，其特征在于，所述启动子上游和TAP表达框下游还插入有核基质结合区序列。
3.如权利要求2所述的人源化细胞瞬时表达用表达载体，其特征在于，所述TAP表达框的结构为IRES-TAP-PolyA；该载体的结构为核基质结合区序列-启动子-TRE-目的基因-IRES-TAP- PolyA-核基质结合区序列。
4.如权利要求3所述的人源化细胞瞬时表达用表达载体，其特征在于，所述TRE编码序列如SEQ ID NO:1所示；所述TAP编码序列如SEQ ID NO:2所示。
5.如权利要求4所述的人源化细胞瞬时表达用表达载体，其特征在于，所述核基质结合区序列为β-珠蛋白MAR序列；IRES序列为HRV IRES序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述启动子为CMV。
6.如权利要求5所述的人源化细胞瞬时表达用表达载体，其特征在于，所述人源化细胞选自HEK293。
7.人源化细胞瞬时表达系统，其特征在于，包含如权利要求1~6任一项所述的表达载体。
8.如权利要求7所述的人源化细胞瞬时表达系统的构建方法，其特征在于，包括以下操作步骤：
1）构建表达载体：在pIRES-Neo载体中构建形成核基质结合区序列-启动子-TRE-目的基因-IRES-TAP- PolyA-核基质结合区序列表达盒，构建形成表达载体；
2）插入目的基因：将目的基因插入表达载体的启动子与IRES序列之间，构建形成重组表达载体；
3）构建表达系统：将重组表达载体转染进入宿主细胞，构建获得瞬时表达系统。
9.如权利要求1~6任一项所述表达载体在制备包含目的蛋白的药物中的应用。
10.如权利要求7所述的表达系统在制备包含目的蛋白的药物中的应用。
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