CN116855500A - 翻译调控元件在促进重组蛋白表达方面的应用、表达盒、载体、表达系统、试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域,具体涉及翻译增强元件在促进重组蛋白表达方面的应用、表达盒、载体、表达系统、试剂盒。本发明通过对人基因组翻译调控元件5'‑UTR插入序列进行构效关系分析,筛选设计出如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列作为翻译调控元件,紧邻连接在目的蛋白编码基因上游,构建重组蛋白表达载体,转染至哺乳动物细胞,进行重组蛋白表达,提高重组表达量,尤其是瞬时表达量。本发明通过试验验证,相比缺少翻译调控元件的表达系统,插入本发明提供的调控元件的表达系统,目的蛋白的瞬时表达量提高约1.5~2.0倍。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域,具体涉及翻译增强元件在促进重组蛋白表达方面的应用、表达盒、载体、表达系统、试剂盒。
背景技术
重组蛋白药物的细胞平台主要是哺乳动物细胞。尤其是中国仓鼠卵巢(Chinesehamster ovary,CHO)细胞在2015年至2018年期间获批的重组蛋白药物中占80%以上。CHO细胞的优势包括容易扩大培养规模,人类病毒感染风险低,可以进行类似人类细胞的翻译后修饰。这些优势,加上过去几十年来细胞系的发展、培养基的优化和培养技术的进步,使得CHO细胞广泛用于稳定细胞系的产生和生物蛋白药物的生产。对于蛋白质的大规模生产,稳定的表达方法可以提供更高的产量和稳定的质量。但在项目初期,需要在较短的开发周期内表达许多蛋白质,而瞬时表达系统可以为筛选许多单克隆细胞系节省大量的时间和成本,使研究人员能够专注于重组蛋白的研究和开发。
蛋白质的合成可以在转录、mRNA加工、翻译、翻译后修饰和分泌的任何一个阶段进行调节。作为生物遗传信息传递的重要步骤,翻译是连接基因转录和蛋白质分泌的桥梁。翻译并不是简单地将mRNA的遗传信息传递,而是有一个广泛而准确的调控过程,它能较快地改变细胞的蛋白质浓度,在适当的时间为细胞提供所需的蛋白质浓度。翻译调节对细胞的影响占54%,大于转录、转录后和翻译后等其他阶段调节的总和,是生命活动调控的主要环节。翻译是决定重组蛋白产量的关键,核糖体的生物合成也会影响重组蛋白的产量。近年来,围绕哺乳动物细胞,尤其是CHO细胞,瞬时表达主要集中在培养基及工艺的优化,关于表达载体方面的优化,主要见于稳定表达载体,瞬时表达载体如申请公布号为202111361923.6的中国专利申请文件中公开了一种提高CHO细胞重组蛋白表达水平的方法;申请公布号为201410853298.0的中国专利申请文件中公开了一种利用CHO细胞生产重组蛋白的基因表达系统及真核表达载体。但这些优化主要集中是通过提高CHO转录水平而进行的表达载体优化。因此,如何在翻译调控方面提高哺乳动物细胞重组蛋白瞬时表达水平具有很大的研究价值和应用前景。
在真核生物中,翻译调控主要集中在翻译起始的过程中。根据是否依赖于m7G帽结构,翻译起始机制可分为帽依赖性(cap-dependent,CD)机制和帽非依赖性(cap-independent,CI)机制。对于重组蛋白的生产,帽结构所在的5'-非翻译区(untranslatedregion,UTR)成为帽依赖性机制研究的重点,并最终体现在蛋白质表达载体中转录起始位点和起始密码子之间序列的修饰上。翻译调控主要发生在5'-UTR上的翻译起始核糖体组装和起始密码子的扫描,5'-UTR是促进翻译的关键。因此,如何通过优化5'-UTR实现对目的蛋白瞬时表达的调控,是本发明需要解决的核心技术问题。
发明内容
本发明的目的之一在于提供翻译调控元件在促进重组蛋白表达方面的应用。本发明将特定序列结构的翻译调控元件应用于重组蛋白表达,提高重蛋白表达量,尤其是瞬时表达量。
本发明的目的之二在于提供一种构建重组蛋白表达系统用表达盒,包括本发明选定的翻译调控元件。
本发明的目的之三在于提供一种构建重组蛋白表达系统用表达载体,包括本发明选定的翻译调控元件。
本发明的目的之四在于提供一种试剂盒,包括出发载体、本发明选定的翻译调控元件,或者包括本发明提供的表达盒或表达载体。
本发明的目的之五在于提供一种重组蛋白表达系统,由本发明提供的表达载体插入目的蛋白构建而成。
为了实现上述发明目的,本发明采用的技术方案如下:
翻译调控元件在促进重组蛋白表达方面的应用,所述翻译调控元件的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在本发明的具体实施例中,将翻译调控元件紧邻连接在重组蛋白编码序列上游构建重组蛋白表达载体,用于翻译调控元件在促进重组蛋白表达。
具体的,还包括将重组蛋白表达载体转染至哺乳动物细胞构建形成重组蛋白表达系统。
可选的,所述哺乳动物细胞选自CHO、HEK293、BHK21、COS-7中的任意一种;优选为CHO细胞。
一种表达盒,包括翻译调控元件和重组蛋白编码序列;其中翻译调控元件紧邻重组蛋白编码序列上游,所述翻译调控元件的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
一种载体,包括如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列作为翻译调控元件。
上述载体作为目的蛋白表达用出发载体,还包括目的蛋白编码序列元件,所述调控元件紧邻目的蛋白编码序列元件上游连接。
一种重组蛋白表达系统,通过将上述包含目的蛋白编码序列元件的载体转染至哺乳动物细胞构建而成。
一种重组蛋白表达用试剂盒,包括哺乳动物细胞、载体、转染试剂和/或作为翻译调控元件核酸分子;所述载体为不包括翻译调控元件的出发载体,或上述载体;作为翻译调控元件核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
上述重组蛋白表达系统或试剂盒能够应用于制备包含目的蛋白的制剂;所述制剂选自蛋白检测试剂、治疗或预防疾病的目的蛋白药物、带有目的蛋白的基因药物。
本发明的有益效果:
本发明通过对人基因组翻译调控元件5'-UTR插入序列进行构效关系分析,筛选设计出如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列作为翻译调控元件,紧邻连接在目的蛋白编码基因上游,构建重组蛋白表达载体,转染至哺乳动物细胞,进行重组蛋白表达,提高重组表达量,尤其是瞬时表达量。本发明通过试验验证,相比缺少翻译调控元件的表达系统,插入本发明提供的调控元件的表达系统,目的蛋白的瞬时表达量提高约1.5~2.0倍。
附图说明
图1为本发明实施例3构建的载体结构示意图;
图2为本发明应用效果验证试验中翻译调控元件与不含翻译调控元件的eGFP瞬时表达水平对比结果示意图;
图3为本发明应用效果验证试验中翻译调控元件与不含翻译调控元件的HSA瞬时表达水平对比结果示意图。
具体实施方式
未特别指明的,实施例及试验例中相关操作均为领域内常规技术手段,比如参照Sambrook等编著的分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW.Molecular cloning:alaboratory manual.2001),或者产品制造厂商提供的说明书等。
实施例及试验例中所用各类培养基、试剂、大肠杆菌(E.coli JM109)、pcDNA3-EGFP质粒、细胞系、工具酶等均为市售商品
下述实施例仅对本发明作进一步详细说明,但不构成对本发明的任何限制。
实施例1翻译调控元件序列设计和筛选
通过对含人基因组翻译调控元件的5'-UTR插入序列的构效关系进行筛选分析,根据插入序列上游存在或不存在足以阻止翻译起始的发卡结构(ΔG=-58kcal/mol)时下游荧光素酶的表达水平,翻译起始机制可以被定义为CI或CD偏好。当发卡结构存在时,较高的表达序列占CI翻译起始的比例较大,而在没有发卡结构时,CD翻译起始对荧光素酶表达的贡献较大。以两种机制下的荧光素酶表达比例(CD/CI)作为筛选标准,筛选高比例的序列特征进行对比研究,如表1所示,通过对各个序列结构,尤其是序列结构中上游AUG(upstreamAUG,uAUG)结构进行分析,从重组蛋白保证度、是否会影响重组蛋白完整表达等方面筛选确定序列2和序列3作为可以用于翻译调控元件的目标序列,为了验证序列2和序列3的应用效果,以序列10作为对照,设计后续实施例验证试验。
其中用于后续试验的序列2的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,命名为TEE-1;序列3如SEQ ID NO:2所示,命名为TEE-2;序列4如SEQ ID NO:3所示,命名为TEE-3。
表1
实施例2翻译调控元件的合成
根据TEE-1(SEQ ID NO.1)、TEE-2(SEQ ID NO.2)、TEE-3(SEQ ID NO.3)所示DNA序列,交由通用生物基因(安徽)有限公司合成,为方便克隆,合成序列5′及3′-端分别插入HindIII(AAGCTT)、BamHI(GGATCC)酶切位点。
实施例3构建含有翻译调控元件的表达载体
构建如图1所示结构的表达载体,具体步骤为:
1)用HindIII/BamHI分别双酶切合成的TEE序列,同时用HindIII/BamHI双酶切pcDNA3-EGFP质粒DNA载体,琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果,凝胶回收酶切后的翻译调控元件序列片段和pcDNA3-EGFP线形质粒DNA;
其中翻译调控元件序列(实施例2合成的TEE-1、TEE-2、TEE-3)的双酶切体系为:翻译他调控元件序列10μL(1μg/μL),10×NE Buffer 3.1 3μL,HindIII/BamHI(10U/μL)各1.0μL,补足水至30μL;酶切条件为:37℃,酶切3min;
pcDNA3-EGFP质粒的双酶切体系为:pcDNA3-EGFP质粒5μL(1μg/μL),10×NEBuffer 3.1 2μL,HindIII/BamHI(10U/μL)各0.5μL,补足水至20μL;酶切条件为:37℃,酶切3min;
2)取酶切后的翻译调控元件序列片段和HindIII/BamHI线形质粒DNA(摩尔比5:1),使用NEB公司TM的连接试剂盒,25℃连接5min;将连接产物加入到大肠杆菌(E.coli)JM109菌株感受态细胞悬液中转化,取150μL转化菌液接种到含有氨苄青霉素的LB平板上,37℃培养过夜,挑取单菌落继代培养。提取重组质粒并进行双酶切(HindIII/BamHI)验证,取酶切验证正确的质粒进行测序验证,构建正确的质粒分别命名为pcDNA3-EGFP-T1、pcDNA3-EGFP-T2、pcDNA3-EGFP-T3,用于后续试验质粒载体。
实施例4构建含有翻译调控元件的表达载体
以实施例3提供的表达载体为出发载体,构建人血清白蛋白表达载体,具体步骤为:
1)人工合成HSA基因序列
根据文献报道的人血清白蛋白(Human Serum Albumin,HSA)氨基酸序列(Genbankno:CAA01491);人工合成HSA序列(5′端和3′端分别引入BamHI、EcoRI酶切位点),具体交由通用生物基因(安徽)有限公司完成:
2)将HSA序列插入试验质粒载体:
用BamHI/EcoRI双酶切引物人工合成的HSA序列,同时用BamHI/EcoRI双酶切试验质粒载体DNA,琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果,凝胶回收酶切后的HSA序列片段和试验质粒的线性质粒DNA(实施例3提供的pcDNA3-EGFP-T1、pcDNA3-EGFP-T2、pcDNA3-EGFP-T3):
HSA序列的双酶切体系为:HSA序列片段10μL(1μg/μL),10×NEBuffer 3μL,BamHI/EcoRI酶(10U/μL)各1.0μL,补足水至30μL;酶切条件为:37,℃酶切3min;
试验质粒的双酶切体系为:质粒5μL(1μg/μL),10×NEBuffer 2μL,BamHI/EcoRI(10U/μL)各0.5μL,补足水至20μL;酶切条件为:37,℃酶切3min。
取酶切后的HSA序列片段和试验质粒的线性质粒DNA(摩尔比5:1),使用NEB公司TM的连接试剂盒,25℃连接5min。提取重组质粒并进行双酶切(BamHI/EcoRI)验证,取酶切验证正确的质粒进行测序验证。将目的基因序列完全正确的载体命名为pcDNA3-HSA-T1、pcDNA3-HSA-T2、pcDNA3-HSA-T3。
应用效果验证试验:
试验方法:
1)试验分组:
eGFP组:以pcDNA3-EGFP为对照组,记为TEE-0;以pcDNA3-EGFP-T1、pcDNA3-EGFP-T2、pcDNA3-EGFP-T3设置三个试验组,分别记为TEE-1、TEE-2、TEE-3;
HSA组:以pcDNA3-EGFP为出发载体,按照实施例4所述方法用HSA的CDS替换了载体中的eGFP序列构建HAS表达载体作为对照组,记为TEE-0;以pcDNA3-HSA-T1、pcDNA3-HSA-T2、pcDNA3-HSA-T3设置三个试验组,分别记为TEE-1、TEE-2、TEE-3;
2)构建重组蛋白表达系统:
CHO细胞于37℃、5%CO2条件下,在含10%灭活胎牛血清的DMEM培养基中培养。在6孔板内接种CHO细胞(3×106/孔),铺板培养24h后细胞达到约90%融合度。以Lip3000(3000)为转染试剂,将按照试验分组对应的表达载体分别转染进入CHO细胞中,将培养基换成无血清培养基进行培养。
3)结果检测:
eGFP:eGFP组的对照组和试验组每天细胞计数,第5-6天细胞凋亡数高于50%收集细胞进行流式细胞检测,结果如图2所示,荧光图像结果显示三种载体的eGFP表达水平不同(图2A),pcDNA3-EGFP-T1载体的CHO-S细胞的eGFP表达水平最高,平均荧光强度比对照组高2.0倍。然而,pcDNA3-EGFP-T2和pcDNA3-EGFP-T3载体的细胞的eGFP基因表达水平低于对照,而pcDNA3-EGFP-T3的表达量最低。此外,流式细胞仪结果显示,pcDNA3-EGFP-T2和pcDNA3-EGFP-T3的平均荧光强度比对照低4.95%和19.69%(图2B),Western blot检测也得到了进一步证实(图2C)。
根据上述结果,可以得出:当在eGFP上游插入翻译调控元件序列时,TEE-1序列可以提高eGFP的瞬时表达水平,高达2.0倍(P<0.05),而TEE-2和TEE-3不能提高eGFP的瞬时表达水平。
HSA:HAS组每天细胞计数,培养至第七天收集细胞上清,用ELISA检测试剂盒测定各组目的蛋白HSA的表达量,如图3所示,TEE-1使HSA的表达量增加1.55倍(图3A),Westernblot检测进一步进行了蛋白的表达验证(图3B),结果与ELISA分析的结果一致。
最后应说明的是:以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.翻译调控元件在促进重组蛋白表达方面的应用,其特征在于,所述翻译调控元件的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.如权利要求1所述应用,其特征在于,包括将翻译调控元件紧邻连接在重组蛋白编码序列上游构建重组蛋白表达载体。
3.如权利要求2所述应用,其特征在于,还包括将重组蛋白表达载体转染至哺乳动物细胞构建形成重组蛋白表达系统。
4.如权利要求3所述应用,其特征在于,所述哺乳动物细胞选自CHO、HEK293、BHK21、COS-7中的任意一种;优选为CHO细胞。
5.一种表达盒,其特征在于,包括翻译调控元件和重组蛋白编码序列;其中翻译调控元件紧邻重组蛋白编码序列上游,所述翻译调控元件的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
6.一种载体,其特征在于,包括如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列作为翻译调控元件。
7.如权利要求6所述的载体,其特征在于,还包括目的蛋白编码序列元件,所述调控元件紧邻目的蛋白编码序列元件上游连接。
8.一种重组蛋白表达系统,其特征在于,通过将权利要求7所述的载体转染至哺乳动物细胞构建而成。
9.一种重组蛋白表达用试剂盒,其特征在于,包括哺乳动物细胞、载体、转染试剂和/或作为翻译调控元件核酸分子;所述载体为不包括翻译调控元件的出发载体,或权利要求6或7所述的载体;
作为翻译调控元件核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
10.如权利要求8所述表达系统或权利要求9所述试剂盒的应用,其特征在于,用于制备包含目的蛋白的制剂;
所述制剂选自蛋白检测试剂、治疗或预防疾病的目的蛋白药物、带有目的蛋白的基因药物。
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