CN114807145A - 一种提高非帽子依赖翻译效率的前导序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种提高非帽子依赖翻译效率的前导序列及其应用，属于基因工程技术领域。所述前导序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的前导序列能有效提高瞬时哺乳细胞表达系统中非帽子依赖内部核糖体进入位点(internalribozymeentrysite，IRES)元件介导的目的基因的表达量。

Description

一种提高非帽子依赖翻译效率的前导序列及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种提高非帽子依赖翻译效率的前导序列及其应用。

背景技术

在真核生物中，翻译可以由不同的机制启动。大多数真核细胞的mRNAs都是通过一种被称为依赖帽子翻译的机制进行翻译的。一些细胞和病毒mRNA通过一种不同的机制进行翻译，其中核糖体被内部核糖进入位点(internal ribozyme entry site，IRES)的RNA结构招募。由于IRES元件能够在没有帽子结构的情况下启动基因的翻译，它们已被用于双顺反子和多顺反子载体中，用于共同表达目的蛋白质。在这些载体中，病毒启动子指导含有IRES元件的单个mRNA链的合成阅读框。第一个基因通过帽子依赖的核糖体扫描机制进行翻译，而后续基因的翻译是通过以非帽子依赖的方式将核糖体直接招募到IRES来完成的。通过在单个载体中结合使用IRES元件或者在基因之间插入病毒自裂解2A肽，成功构建了多种不同类型的多顺反子载体。由于双顺反子和多顺反子载体能够在单个细胞中产生多种蛋白质，因此它们已广泛应用于基因治疗和生物医学研究领域。

但目前由IRES构建的双顺反子和多顺反子载体，2A肽载体表达抗体时存在不完全切割的特性，会造成蛋白的异质性，而IRES载体介导的下游基因表达效率较低。因此，如何保证上游高效表达的同时大幅提高下游表达能力是双顺反子和多顺反子载体急需解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高非帽子依赖翻译效率的前导序列，该前导序列能有效促进瞬时哺乳细胞表达系统中目的基因的高效表达。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种提高非帽子依赖翻译效率的前导序列，所述前导序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明还提供了一种包含所述前导序列的表达载体。

优选的，所述表达载体还含有内部核糖体进入位点元件。

本发明还提供了一种所述的前导序列或所述的表达载体在提高瞬时哺乳细胞表达系统中目的基因表达量中的应用。

优选的，所述前导序列克隆在内部核糖体进入位点的上游或下游。

优选的，所述前导序列克隆在内部核糖体进入位点的下游。

优选的，所述前导序列克隆在目的基因的上游。

优选的，所述瞬时哺乳细胞包括CHO细胞或HEK293细胞。

本发明提供的前导序列能有效提高瞬时哺乳细胞表达系统中非帽子依赖内部核糖体进入位点(internal ribozyme entry site，IRES)元件介导的目的基因的表达量。

附图说明

图1为实施例1～5中构建的不同载体的结构示意图；

图2为实施例1中不同载体细胞转染48h时的荧光图；

图3为实施例1中不同载体细胞转染48h时的EGFP表达量；

图4为实施例1中不同载体细胞转染7d时的EGFP蛋白表达情况；

图5为实施例2中不同载体转染细胞48h的荧光图；

图6为实施例2中不同载体转染细胞48h和7d的EGFP表达量；

图7为实施例3中前导序列对EGFP-Fluc双顺反子载体中萤火虫荧光素酶(Fireflyluciferase，Fluc)表达水平的影响；

图8为实施例4中前导序列在不同位置对IRES下游Fluc表达的影响；

图9为实施例5中阿达木单抗的WesternBlot检测结果；

图10为实施例5中阿达木单抗的表达量。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1、含TurboRFP基因单顺反子载体的构建

(1)合成TurboRFP基因

参照TurboRFP基因序列(GenBank：MW560964，第5851～6546位碱基)，合成TurboRFP基因，具体交由通用生物基因(安徽)有限公司合成。合成的TurboRFP基因与GenBank公开的TurboRFP序列(GenBank：MW560964，第5851～6546位碱基)完全一致。为便于克隆，在合成TurboRFP基因序列时，5′端引入5′-AGCAAGCTT-3′序列，其中AGC为保护碱基，AAGCTT为HindIII酶切位点，3′端引入5′-ATAGCGGCCGC-3′、其中ATA为保护碱基，GCGGCCGC为Not I酶切位点。

(2)构建含TurboRFP序列的表达载体

用HindIII、Not I双酶切的TurboRFP的PCR扩增产物，同时用HindIII、Not I双酶切pIRES-C3载体质粒DNA，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的TurboRFP序列片段和pIRES-C3线性质粒DNA。

TurboRFP序列的酶切体系为：10×Kbuffer 1μL+BSA，10U/μL HindIII、Not I酶各0.5μL，1.289μg/μLTurboRFP扩增产物0.78μL，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育6h。

质粒的酶切体系为：10×Kbuffer 1μL+BSA，10U/μL HindIII、Not I酶各0.5μL，0.81μg/μL质粒pIRES-C31.23μL，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育3h。

取酶切后的TurboRFP序列片段和pIRES-C3线性质粒DNA，用T4连接酶进行连接。连接体系为：2×Quick Ligation Buffer 10μL，pIRES-C3线性质粒DNA200 ng，酶切后的TurboRFP序列片段87.2ng，350U/μL T4连接酶1μL，补足水至20μL。16℃连接过夜。将连接产物加入E.coli JM109感受态细菌悬液中转化，取100μL转化菌液接种在含有氨苄青霉素的LB固体培养板上，37℃培养过夜，挑取单菌落摇菌继代培养。提取细菌质粒并进行重组质粒的酶切验证，选取酶切鉴定正确的质粒，进行测序验证，将序列完全正确的载体命名为pIRES-C3-TurboRFP，其载体结构示意图如图1A所示。

2、构建pIRES-TurboRFP-EGFP基因双顺反子载体

(1)PCR扩增EGFP基因

参照pEGFP-C1载体的Enhanced green fluorescent protein(EGFP)基因序列(GenBank：U55763.1，第613～1332位碱基)设计引物P1和P2(用于扩增720bp的EGFP基因DNA)，引物的5′端分别引入HindIII、Not I酶切位点，引物序列如下所示(下划线处为酶切位点)：

P1：5′-CCGAAGCTTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3′(如SEQ ID NO.4所示)；

P2：5′-CTAGCGGCCGCGGACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3′(如SEQ ID NO.5所示)。

以pEGFP-C1质粒(购自美国Clontech公司)为模板，使用引物P1、P2扩增EGFP基因，反应体系见下表1。

表1EGFP基因的PCR扩增体系

PCR反应体系	试剂浓度	终浓度	体积(μL)
				10×PCRbuffer	10×	1×	2.5
引物P1	10μmol/L	0.4μmol/L	1.0
				引物P2	10μmol/L	0.4μmol/L	1.0
dNTP	25μmol/L	200μmol/L	2.0
				模板DNA	100ng/μL	4.0ng/μL	1.0
Taq酶	5U/μL	0.1U/μL	0.5
				ddH<sub>2</sub>O	/	/	17

反应程序：95℃3min，94℃40s，56～60℃30s，72℃40s，每个退火温度4个循环，最后55℃1min，30个循环，72℃3min。

琼脂糖凝胶电泳回收PCR扩增产物，纯化后送生物公司测序验证。结果表明，扩增出的DNA片段与GenBank公开的EGFP序列(GenBank：U55763.1，第613～1332位碱基)完全一致。

(2)构建pIRES-TurboRFP-EGFP基因双顺反子载体

用SmaI、XbaI双酶切EGFP的PCR扩增产物，同时用SmaI、XbaI双酶切上述构建的pIRES-C3-TurboRFP载体质粒DNA。

EGFP序列的酶切体系为：10×CutSmartBuffer 2μL(美国NEB公司)，XmaI/XbaI酶(10U/μL)各0.5μL，补足水至20μL，酶切条件为：37℃，酶切3h。酶切条件为：37℃，酶切3h。酶切结束后，于1.5％琼脂糖凝胶进行电泳，凝胶回收酶切后的EGFP序列片段。

质粒的酶切体系为：pIRES-C3-TurboRFP质粒(1μg/μL)10μL，10×CutSmartBuffer 3μL(美国NEB公司)，XmaI/XbaI酶(10U/μL)各1.0μL，补足水至30μL，酶切条件为：37℃，酶切3h。酶切结束后，于1.5％琼脂糖凝胶进行电泳，凝胶回收酶切后的pIRES-C3-TurboRFP载体片段。

取酶切后的EGFP序列片段和pIRES-C3-TurboRFP线性质粒DNA，用T4连接酶进行连接。连接体系为：2×Quick Ligation Buffer 10μL，pIRES-C3-TurboRFP线性质粒DNA200ng，酶切后的EGFP序列片段87.2ng，350U/μLT4连接酶1μL，补足水至20μL。16℃连接过夜。将连接产物加入E.coli JM109感受态细菌悬液中转化，取100μL转化菌液接种在含有氨苄青霉素的LB固体培养板上，37℃培养过夜，挑取单菌落摇菌继代培养。提取细菌质粒并进行重组质粒的酶切验证，选取酶切鉴定正确的质粒，进行测序验证，将序列完全正确的载体命名为pIRES-TurboRFP-EGFP，其载体结构示意图如图1B所示。

3、构建含前导序列的双顺反子载体

(1)合成前导序列

设计并人工合成如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示前导序列，具体交由通用生物基因(安徽)有限公司合成。

(2)构建含前导序列的双顺反子载体

利用无缝克隆技术分别将上述前导序列(如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3所示)序列插入pIRES-TurboRFP-EGFP载体IRES元件2的下游，并依次命名为pIRES-TE-L13、pIRES-TE-L23、pIRES-TE-L33，其载体结构示意图依次如图1C、D、E所示。

将上述构建的载体pIRES-C3-TurboRFP、pIRES-TurboRFP-EGFP、pIRES-TE-L13、pIRES-TE-L23、pIRES-TE-L33转染细胞。倒置荧光显微镜观察48h和7d EGFP瞬时表达情况。

转染方法为：

(1)细胞培养

CHO细胞在10％胎牛血清、DMEM-F12培养基，37℃，5％CO₂条件下贴壁培养。待细胞汇合度为80～90％时，使用胰酶消化细胞，对细胞进行传代处理。新复苏的细胞至少传代3次后再进行铺板。

(2)细胞转染

选择贴壁培养生长状态良好的CHO细胞接种到6孔培养板上，每孔5×10⁵细胞，培养一天后，待铺板密度达到80％用于转染。取pIRES-C3-TurboRFP载体4μg加到250μL不含血清和抗生素的DMEM-F12培养基中，轻轻混匀，备用。将10μL脂质体2000试剂稀释于250μL不含血清和抗生素的DMEM-F2培养基中，轻轻混匀，室温放置5min后，得到脂质体2000稀释液。将脂质体2000稀释液滴加到质粒DNA稀释液中，一边滴加一边混匀，室温孵育20min，得到脂质体2000/DNA复合物。然后将脂质体2000/DNA复合物加到待转染的细胞中，并轻轻摇动使其混合，每孔500μL。其他四种载体(pIRES-TurboRFP-EGFP、pIRES-TE-L13、pIRES-TE-L23、pIRES-TE-L33)同样按照上述方法转染。然后放入5％CO₂细胞培养箱中，37℃培养6h后将无血清培养基换为完全的DMEM培养基进行常规培养。

在常规培养过程中，用流式细胞仪检测各组细胞EGFP的平均荧光强度(Meanflorescence intensity，MFI)，方法如下：在常规培养的第48h和第7d收集细胞，每个样品收集50万细胞。使用移液枪吸取1mL PBS轻柔冲洗细胞，1000r/min，离心5min，弃上清，重复一次。然后用1mL PBS重悬细胞制备细胞悬液。将细胞悬液通过孔径为40μm的尼龙网进行过滤，取滤下物进行流式检测。48h的转染细胞用于流式检测，7d的转染细胞用于WesternBlot分析。

转染48h的EGFP检测结果：如图2所示，与其他载体相比pIRES-TE-L13载体的荧光强度显著提高，表明pIRES-TE-L13载体显著提高了前导序列下游EGFP蛋白的表达量。以pIRES-TurboRFP-EGFP载体的平均荧光强度标准化为1，对含不同前导序列载体的EGFP荧光强度进行相对分析，结果如图3所示，pIRES-TE-L13载体表达水平最高，可提高10倍以上。

转染7d的EGFP检测结果：Western Blot结果表明(图4)，不含EGFP基因的pIRES-C3-TurboRFP载体EGFP蛋白不表达，含有EGFP基因的pIRES-TurboRFP-EGFP载体EGFP低表达，改造后的pIRES-TE-L13载体EGFP高表达。为了提高对照组和优化后蛋白在同一张PVDF膜上的成像效果，pIRES-TE-L13优化载体组的β-actin和EGFP上样量被控制在对照组的1/5。

实施例2

1、构建含EGFP单顺反子载体

按照实施例1的方法扩增EGFP，构建EGFP单顺反子载体方法与构建TurboRFP基因单顺反子载体方法相同，不同点在与用EGFP基因替代TurboRFP基因，得到载体pIRES-C3-EGFP，其结构示意图如图1F所示。

2、构建pIRES-EGFP-TurboRFP基因双顺反子载体

(1)PCR扩增TurboRFP基因

参照实施例1构建的pIRES-C3-TurboRFP序列设计引物P3和P4，引物的5′端分别引入SmaI、XbaI酶切位点，引物序列如下所示(下划线处为酶切位点)：

P3：5′-CCGCCCGGGATGAGCGAGCTGATCAAGGAGAAC-3′(如SEQ ID NO.6所示)；

P4：5′-CTATCTAGATCATCTGTGCCCCAGTTTGCTA-3′(如SEQ ID NO.7所示)。

以pIRES-C3-TurboRFP质粒为模板，使用引物P3、P4扩增TurboRFP基因，反应体系见下表2。

表2TurboRFP基因的PCR扩增体系

PCR反应体系	试剂浓度	终浓度	体积(μL)
				10×PCRbuffer	10×	1×	2.5
引物P1	10μmol/L	0.4μmol/L	1.0
				引物P2	10μmol/L	0.4μmol/L	1.0
dNTP	25μmol/L	200μmol/L	2.0
				模板DNA	100ng/μL	4.0ng/μL	1.0
Taq酶	5U/μL	0.1U/μL	0.5
				ddH<sub>2</sub>O	/	/	17

反应程序：95℃3min，94℃40s，50～56℃30s，72℃40s，每个退火温度4个循环，最后55℃1min，30个循环，72℃3min。

琼脂糖凝胶电泳回收PCR扩增产物，纯化后送生物公司测序验证。结果表明，扩增出的DNA片段与GenBank(GenBank：MW560964，第5851～6546位碱基)公开的TurboRFP序列完全一致。

(2)构建pIRES-EGFP-TurboRFP基因双顺反子载体

用SmaI、XbaI双酶切TurboRFP的PCR扩增产物，同时用SmaI、XbaI双酶切pIRES-C3-EGFP载体质粒DNA。

TurboRFP序列的酶切体系为：10×CutSmart Buffer 2μL(美国NEB公司)，XmaI/XbaI酶(10U/μL)各0.5μL，补足水至20μL，酶切条件为：37℃，酶切3h。酶切结束后，于1.5％琼脂糖凝胶进行电泳，凝胶回收酶切后的TurboRFP序列片段。

质粒的酶切体系为：pIRES-C3-EGFP质粒(1μg/μL)10μL，10×CutSmart Buffer 3μL(美国NEB公司)，XmaI/XbaI酶(10U/μL)各1.0μL，补足水至30μL，酶切条件为：37℃，酶切3h。酶切结束后，于1.5％琼脂糖凝胶进行电泳，凝胶回收酶切后的pIRES-C3-EGFP载体片段。

取酶切后的TurboRFP序列片段和pIRES-C3-EGFP线性质粒DNA，用T4连接酶进行连接。连接体系为：2×Quick Ligation Buffer 10μL，pIRES-C3-EGFP线性质粒DNA 200ng，酶切后的TurboRFP序列片段87.2ng，350U/μLT4连接酶1μL，补足水至20μL。16℃连接过夜。将连接产物加入E.coli JM109感受态细菌悬液中转化，取100μL转化菌液接种在含有氨苄青霉素的LB固体培养板上，37℃培养过夜，挑取单菌落摇菌继代培养。提取细菌质粒并进行重组质粒的酶切验证，选取酶切鉴定正确的质粒，进行测序验证，将序列完全正确的载体命名为pIRES-EGFP-TurboRFP，其结构示意图如图1G所示。

3、构建含有前导序列(SEQ ID NO.1)的表达载体

利用无缝克隆技术将如SEQ ID NO.1所示的前导序列插入载体pIRES-EGFP-TurboRFP中，插入位置为IRES的下游，载体命名为pIRES-ET-L13，其结构示意图如图1H所示。

然后将构建的载体pIRES-C3-EGFP、pIRES-EGFP-TurboRFP和pIRES-ET-L13按照实施例1的方法转染CHO细胞，倒置荧光显微镜观察48h后EGFP、TurboRFP基因表达情况。结果如图5所示，3个载体EGFP表达水平接近，提示3个载体转染效率基本一致。pIRES-EGFP-TurboRFP载体使用IRES介导了TurboRFP基因的表达，视野下可以观察到较低比例发红光的细胞。而含有前导序列(SEQ ID NO.1)的载体pIRES-ET-L13可以观测到高比例发红色荧光的细胞，且荧光亮度更高。这表明本发明提供的前导序列(SEQ ID NO.1)显著提高了EGFP-IRES-TurboRFP双顺反子表达载体IRES下游TurboRFP表达。流式细胞术同样证明了三个载体上游EGFP的表达没有显著影响(如图6所示)，这与荧光显微镜的观测结果一致。

实施例3

为了验证前导序列能否提高Fluc的表达以及为了准确准确的提高倍数，本实施例构建了pIRES-EGFP-Fluc双顺反子载体和含有前导序列(SEQ ID NO.1)的pIRES-EF-L13载体。

1、构建pIRES-EGFP-Fluc双顺反子载体

参照Firefly luciferase(Fluc)基因序列(GenBank：MK484108.1，第648～2300位碱基)进行人工合成Fluc基因，具体交由通用生物基因(安徽)有限公司合成。合成的Fluc基因与GenBank：MK484108.1，第648～2300位碱基序列一致。

参照实施例2中构建pIRES-EGFP-TurboRFP载体的方法构建pIRES-EGFP-Fluc双顺反子载体，与实施例2的区别在于将实施例2中的TurboRFP基因替换成Fluc基因。pIRES-EGFP-Fluc双顺反子载体的结构示意图如图1I所示。

2、构建含有前导序列(SEQ ID NO.1)的表达载体

利用无缝克隆技术将如SEQ ID NO.1所示的前导序列插入载体pIRES-EGFP-Fluc中插入位置为IRES的下游，载体命名为pIRES-EF-L13，其结构示意图如图1J所示。

然后将构建的载体pIRES-EGFP-Fluc、pIRES-EF-L13按照实施例1的方法转染HEK293F细胞(培养方法同实施例1中CHO细胞的培养方法，HEK293F细胞的细胞汇合度为60～90％)，分别检测24h和48h的瞬时表达水平。结果如图7所示，与pIRES-EGFP-Fluc载体相比，pIRES-EF-L13载体在转染后24h Fluc表达量提高6.74倍，48h Fluc表达量提高9.59倍(P<0.05)。表明本发明提供的前导序列能够提高Fluc蛋白的表达水平。

实施例4

为了探究前导序列(SEQ ID NO.1)在IRES元件上下游的位置效应，以及在CHO细胞中的影响，分别将前导序列构建到IRES元件的上游或下游。其中下游载体为实施例3构建得到的载体pIRES-EF-L13，上游载体pIRES-EF-L15的结构示意图如图1K所示。

将载体pIRES-EF-L15、pIRES-EF-L13与不含前导序列的载体pIRES-EGFP-Fluc按照实施例1的方法分别转染CHO细胞，化学发光仪检测Fluc的表达水平。结果如图8所示，与前导序列在IRES上游的载体pIRES-EF-L15相比，前导序列在IRES下游的载体pIRES-EF-L13的Fluc蛋白有更高的表达水平。前导序列位于IRES下游Fluc表达被提高8.43倍，位于上游Fluc表达被提高3.8倍。

实施例5

含前导序列(SEQ ID NO.1)的阿达木抗体表达载体构建

参照Adalimumab(mAb)基因序列(GenBank：MP054496，GenBank：MP723941)进行人工合成阿达木抗体基因LC和HC，具体交由通用生物基因(安徽)有限公司合成。

参照实施例2构建pIRES-EGFP-TurboRFP载体的方法构建pIRES-LC-HC双顺反子载体，与实施例2的区别在于将实施例2中的EGFP基因替换成LC基因，将TurboRFP基因替换成HC基因。pIRES-LC-HC双顺反子载体的结构示意图如图1L所示。

利用无缝克隆技术将前导序列(SEQ ID NO:1)构建到pIRES-LC-HC载体IRES的下游，载体命名为：pIRES-LH-L13(图1M)。

将双顺反子抗体对照载体pIRES-LC-HC和前导序列优化后的双顺反子抗体载体pIRES-LH-L13按照实施例1的方法同时转入CHO细胞中，表达7天后，WesternBlot检测抗体表达水平。结果表明，pIRES-LH-L13载体抗体表达量高于对照载体(图9)，统计分析表明pIRES-LH-L13载体的相对表达量比对照载体提高了数倍(图10)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 新乡医学院 河南普诺易生物制品研究院有限公司

<120> 一种提高非帽子依赖翻译效率的前导序列及其应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 91

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gacaagagtt cagaaaggaa gactacacag aaatacgcat tttaaagtca ctgacatgga 60

gatgacactt aaaaccatga acatggatgg g 91

<210> 2

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aacatacgca aatcaataaa tgtaatccag catataaaca gaaccaaaga caaaaaccac 60

atgattatct caatagatgc agaaaaggcc 90

<210> 3

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acagcagaaa acgaacatca gaaaatcact ctacatgatg cttaaataca gagggcaagc 60

aacccaagag aaaacaccac ttcctaat 88

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccgaagctta tggtgagcaa gggcgaggag 30

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctagcggccg cggacttgta cagctcgtcc atgc 34

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccgcccggga tgagcgagct gatcaaggag aac 33

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctatctagat catctgtgcc ccagtttgct a 31

Claims (8)

1.一种提高非帽子依赖翻译效率的前导序列，其特征在于，所述前导序列如SEQ IDNO.1所示。

2.一种包含权利要求1所述前导序列的表达载体。

3.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体还含有内部核糖体进入位点元件。

4.一种权利要求1所述的前导序列或权利要求2或3所述的表达载体在提高瞬时哺乳细胞表达系统中目的基因表达量中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述前导序列克隆在内部核糖体进入位点的上游或下游。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述前导序列克隆在内部核糖体进入位点的下游。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述前导序列克隆在目的基因的上游。

8.如权利要求4～7任一项所述的应用，其特征在于，所述瞬时哺乳细胞包括CHO细胞或HEK293细胞。

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