CN113025578A - 一种抗凋亡单克隆细胞株及其制备方法 - Google Patents

一种抗凋亡单克隆细胞株及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种抗凋亡单克隆细胞株及其制备方法，所述细胞株过表达生存素Survivin蛋白，同时不表达谷氨酰胺合成酶，所述细胞株基于CRISPR/cas9基因编辑技术将外源表达盒整合到宿主细胞的谷氨酰胺合成酶位点得到。本发明通过敲除谷氨酰胺合成酶(GS)并高表达生存素Survivin基因，建立了抗凋亡能力强的单克隆细胞株，该单克隆细胞株能够显著提高最终产物的效价，适用于抗体、疫苗和重组蛋白等生物制药工业中蛋白质的高效和高活性规模化生产，具有广阔的市场前景。

Description

一种抗凋亡单克隆细胞株及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种抗凋亡单克隆细胞株及其制备方法。
背景技术
随着生物科学的高速发展，生物治疗药物占整个医药市场的比例越来越大。哺乳动物细胞作为表达系统能够指导蛋白进行正确折叠、组装以及提供复杂的N型和O型糖基化等翻译后修饰，不需要对蛋白进行复性，使表达蛋白的结构、特性和功能最接近天然的蛋白质分子，因此已经成为生产生物药物的一种重要工具。
然而，在细胞培养过程中，由压力引起的细胞死亡是制约着工业生物制药生产的主要问题之一。细胞死亡不仅会降低细胞培养物中的产品产量，而且还可能对产品质量产生负面影响。尤其在细胞培养的后期，细胞死亡加剧，导致蛋白酶，糖基化酶和唾液酸酶释放的增加，可能造成目的蛋白质的降解或者改变蛋白质聚糖结构。此外，细胞死亡产生的碎片会使下游处理复杂化。上述这些问题会导致最终产物的效价大幅度降低，降幅甚至高达30％。
哺乳动物细胞死亡的主要方式有两种：凋亡和坏死，其中凋亡已被证明是哺乳动物细胞培养中的主要细胞死亡机制。凋亡是指基于细胞外和细胞内信号作出反应的程序性细胞死亡，细胞凋亡的生理学特征是细胞体积的有序损失，膜起泡，核浓缩和DNA片段化。在生物制药生产的细胞培养的背景下，这些细胞机制是不良事件，与工业生产获高效价的最终产物的目标相冲突。
因此，如何有效抑制细胞培养过程中的细胞凋亡，提高最终产物的效价已成为目前生物制药生产行业亟需解决的问题。
发明内容
本发明的第一个目的在于，提供一种抗凋亡单克隆细胞株，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术定点改造宿主细胞使之提高抗凋亡能力，提高最终产物的效价。
本发明的第二个目的在于，提供上述抗凋亡单克隆细胞株的制备方法。
本发明的第三个目的在于，提供上述抗凋亡单克隆细胞株在重组蛋白表达中的应用。
为了实现上述目的，本发明提供了一种抗凋亡哺乳动物细胞株，所述细胞株过表达生存素Survivin蛋白，同时不表达谷氨酰胺合成酶，所述细胞株基于CRISPR/cas9基因编辑技术将外源表达盒整合到宿主细胞的谷氨酰胺合成酶位点得到；
所述外源表达盒由启动子、筛选基因、survivin基因和终止子以串联方式得到，所述survivin基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。
作为一个优选方案，所述启动子为CMV启动子、EF1a启动子、SV40启动子、RSV启动子或PGK启动子中的一种。
作为一个优选方案，所述筛选基因为EGFP基因、Cherry基因、嘌呤霉素抗性基因、新霉素抗性基因、氯霉素抗性基因或潮霉素抗性基因中的一种。
作为一个优选方案，所述终止子为BGH PloyA或SV40 PolyA。
作为一个优选方案，所述外源表达盒由CMV强启动子、EGFP荧光筛选基因survivin基因和BGH polyA尾巴以串联方式得到。
作为一个优选方案，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞、非洲猴肾细胞、幼仓鼠肾细胞、小鼠骨髓瘤细胞或人胚胎肾细胞。
作为一个优选方案，所述外源表达盒的制备方法包括如下步骤：
获取启动子、筛选基因、生存素基因、终止子以及线性化载体；
将所述启动子、筛选基因、生存素基因、终止子以及线性化载体加入PCR管中混合均匀，并加入同源重组酶，于50℃的水浴锅中进行连接反应，待反应完成后挑选阳性单克隆细胞于含有Amp的LB培养基中培养12h，即得；
其中，在上述连接反应中所用到的引物包括：
正向引物序列如SEQ ID NO:5所示，反向引物序列如SEQ ID NO:6所示的启动子和筛选基因的连接引物组；
正向引物序列如SEQ ID NO:7所示，反向引物序列如SEQ ID NO:8所示的生存素基因连接引物组；以及
正向引物序列如SEQ ID NO:9所示，反向引物序列如SEQ ID NO:10所示的终止子连接引物组。
为了实现上述第二个目的，本发明提供了抗凋亡单克隆细胞株的制备方法，包括：
构建sgRNA-Cas9基因编辑载体，所述基因编辑载体包括pX458-GS-sgRNA与pX459-GS-sgRNA；
对冻存的宿主细胞进行复苏、传代培养处理，得到待转染的宿主细胞；
采用pX458-GS-sgRNA单转染待转染的宿主细胞，并采用pX459-GS-sgRNA与外源表达盒共转染待转染的宿主细胞，并进行单克隆挑选，得到抗凋亡单克隆细胞株。
作为一个优选方案，所述对冻存的宿主细胞进行复苏、传代培养处理，得到待转染的宿主细胞的步骤，具体包括：
对冻存的宿主细胞进行解冻处理，得到宿主细胞悬液；
对宿主细胞悬液移进行离心处理去除冻存液后，用37℃预温的F-12K培养基上下缓慢吹打宿主细胞沉淀，并将宿主细胞转移至T-25的培养瓶中，再补充F-12K培养基，并于37℃、5％CO2的培养箱中进行细胞培养；
当培养至宿主细胞密度达到80-90％时，进行传代培养，获得待转染的宿主细胞。
在本发明实施例中，生存素(Survivin)是凋亡蛋白抑制因子家族(Inhibitor ofapoptosis proteins,IAPs)的最小成员，它可以抑制Caspase-3或Caspase-9活性来抑制细胞凋亡，也可以抑制由Fas(CD95)(是一种319个氨基酸的I型跨膜糖蛋白，是死亡受体(DR)家族中的一员)、Bax(兔抗人单克隆抗体)和抗癌药物引起的细胞凋亡过程，其抗凋亡作用也是目前发现最强的。本发明以生存素基因为目的基因，应用CRISPR/Cas9基因编辑技术对宿主细胞进行编辑，使宿主细胞过表达外源生存素蛋白，最终使得细胞的抗凋亡能力得到提高，进而提高细胞的生产力。
基因编辑技术是一种用定点修饰的方法改变生物体的基因组及其转录产物的技术，目前为止，基因编辑技术主要分为三代，前两代是依赖Fok I限制性内切酶的锌指核酸酶(Zinc finger nucleases,ZFNs)和转录激活因子样效应物核酸酶(Transcriptionactivator-like effectors,TALENs)基因编辑技术，第三代则是近年来发展速度十分迅猛的以CRISPR/Cas9系统为代表的基因编辑技术与ZFN/TALEN相比，CRISPR/Cas9系统因其sgRNA设计简单，实验操作简单，切割效率更高，且可以在多个不同的位点引入突变等优点被广泛的应用于各种生物，已经成功在人、小鼠、斑马鱼、山羊、果蝇和水稻等多种生物中实现了多种基因组的精确修饰，成为目前应用最广泛的基因编辑技术。本发明通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对宿主细胞进行精准编辑，产生过表达生存素的稳转细胞株，该细胞株具有良好的抗凋亡能力。
构建稳定表达外源基因的细胞株的过程中，在构建的载体上除了具有外源蛋白的序列也会加入一个筛选标记，细胞株通过高效表达外源的抗性基因获得抗性，并能成功抵御选择性培养基中的筛选剂压力而生长。目前的筛选标记分为两类：一是抗生素筛选(非扩展筛选标记)，如嘌呤霉素，新霉素等：二是基因扩展筛选，通过影响细胞代谢的加压方式，例如甲氨蝶呤(methothrexate，MTX)和蛋氨酸亚氨基代砜(methionine sulfoximine，MSX)。抗生素筛选方式虽然便捷，但是抗生素不能使外源基因扩增，并且部分抗生素存在细胞毒性会影响重组蛋白产物的质量，相比之下，采用影响细胞代谢的加压方式处理细胞不仅能够获得我们期望的目的细胞，而且还能刺激细胞增加外源治理的复制以及外源蛋白的表达。目前常用的基因扩增筛选系统标记为二氢叶酸还原酶(Dihydrofolate reductase，DHFR)和谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase，GS)筛选标记。
与DHFR筛选系统相比，GS筛选系统只需要一轮筛选，使得细胞系生成的时间更短而增加的，同时谷氨酰胺合成酶可以减少细胞内氨的浓度，同时利用代谢废物合成自身所需营养物质，是细胞生长的必需成分，谷氨酰胺合成酶(GS)缺陷型细胞株已成功运用于多种抗体及重组蛋白药物的商业化生产。
本发明利用CRISPR/cas9基因编辑技术将含有高表达生存素基因的外源表达盒整合到宿主细胞的谷氨酰胺合成酶基因位点，破坏谷氨酰胺合成酶基因并产生过表达Survivin的稳转细胞株，该细胞株不产生功能性的谷氨酰胺合成酶，同时具有更强的抗凋亡能力，能够显著提高最终产物的效价，适用于抗体、疫苗和重组蛋白等生物制药工业中蛋白质的高效和高活性规模化生产，具有广阔的市场前景。
附图说明
图1为是本发明实施例提供的外源表达盒EC#3的结构设计示意图。
图2为外源表达盒各基因片段的琼脂糖凝胶图。
图3为pX458-GS-sgRNA切割靶基因效率检测。
图4为本发明实施例提供的单克隆细胞株的筛选流程图。
图5为荧光实时PCR检测阳性单克隆细胞株的Survivin基因的表达相对量。
图6为Western Blot检测阳性单克隆细胞Survivin蛋白的表达水平。
图7为流式检测仪检测不同细胞加药后凋亡结果。
图8为细胞生长曲线及细胞活力比较图。
图9为重组质粒pcDNA3.1/V5-HisB-hBMP-2构建示意图。
图10为流式细胞仪检测不同质量比DNA(pcDNA3.1/V5-HisB-hBMP-2):PEI转染效率。
图11为MTT法绘制的CHO-K1标准曲线测定。
图12为hBMP-2标准曲线。
图13为各细胞hBMP-2蛋白表达水平比较图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
除特殊说明的之外，各实施例及试验例中所用的设备和试剂均可从商业途径得到。
实施例1：构建基于中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1的sgRNA-Cas9基因编辑载体
构建的载体包括pX458-GS-sgRNA与pX459-GS-sgRNA，两个载体的构建方法相同，以下都以pX458-GS-sgRNA载体的构建为例。
sgRNA的设计与选择：根据物种和基因名称在NCBI上找到中国仓鼠源的编码谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase，GS)蛋白的GS基因(gene ID:100764163)，该基因含有6个外显子。运用sgRNA设计网页Optimized CRISPR Design(http://crispr.mit.edu/)筛选能够靶向GS位点的sgRNA。
根据不同分数的筛选结果后，选择切割效率较高、脱靶率较低的两条sgRNA进行合成，用来开展后续实验。下表1为合成的两对sgRNA。
表1靶向GS-Exon4和GS-Exon5合成的sgRNA寡核苷酸序列(SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.4)
Figure BDA0002994416980000061
pX458质粒线性化：PX458质粒用限制性内切酶BbsI切割，体系为PX458载体2μg，10×缓冲液5μL，Bbs I 1uL，用ddH2O补足至50μL，在37℃恒温水浴条件下进行切割，酶切时间为3h。
pX458-GS-sgRNA载体的构建：合成的sgRNA oligos退火形成双链DNA，与线性化的pX458质粒酶T4连接酶16℃过夜连接，体系为线性化PX458100ng，sgRNA退火产物2μL，T4连接酶缓冲体系1μL，T4连接酶0.5μL，ddH2O补足至10μL。次日进行DH5α感受态细胞的转化反应。培养14小时后，挑取单克隆菌于含有Amp(氨苄青霉素)的LB液体培养基中培养12h，并送上海生工生物有限公司进行测序。
实施例2:设计并制备外源表达盒
如图1所示，提供了一种外源表达盒的结构示意图，该外源表达盒的结构具体为CMV(E+P)+EGFP+T2A+Survivin+BGH(polyA)，其中，CMV(E+P)为启动子，EGFP为筛选基因，Survivin为生存素基因，T2A为连接EGFP与目的基因的短肽，BGH(polyA)为终止子。
其中，上述表达盒(Expression Cassette,EC)的构建过程如下：
获取目的基因以及其他所需DNA片段和载体，其中，目的基因为生存素(Survivin)基因，其他所需DNA片段包括如图1所示的启动子、筛选基因、终止子。载体为通过PCR得到的线性化pcDNA3.1(+)。
采用同源重组试剂盒将上述各片段及载体进行连接，制得外源表达盒。同源重组酶是基因片段的反向引物和相邻基因片段的正向引物有15-25bp的重叠序列。外源表达盒各部分DNA片段之间含有25-30bp的同源序列。在本实施例中设计构建该外源表达盒做需的引物如下表2所示。各DNA片段的凝胶电泳图如图2所示。其中，图2中的A图：泳道1-2为:Survivin基因片段，泳道3为BGH polyA基因片段，泳道3为CMV(E+P)+EGFP基因片段；B图：DH5α/pCDNA3.1(+)-EC#3菌液PCR电泳图，泳道1-4：单克隆扩增的外源表达盒的基因片段；C图：外源表达盒线性全长PCR电泳图。
表2表达盒构建所需的引物(SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.10)
Figure BDA0002994416980000071
按表3的克隆反应体系将获取的各部分DNA片段及线性化载体加入到PCR管中混匀进行连接反应。反应条件为：50℃的水浴锅，15min。转化后挑选阳性克隆于含有Amp的LB培养基中培养12h并送生工生物有限公司测序。
表3各DNA片段重组克隆反应体系
Figure BDA0002994416980000072
(2)添加表达盒对应位点的微同源末端
依据最新研究报道的方法利用CRISPR/Cas9和优化载体微同源介导的末端连接依赖整合方法(MMEJ)将靶基因片段进行定点整合，这种方法对敲入片段的方向和缺口都是可以控制的，比HDR整合方式更有优势。研究表明在靶位点DNA双链断裂发生时，9bp微同源最能利于微同源介导的末端连接整合。所以，利用PITCh系统我们只需设计引物就可以PCR出整合片段，在上游引物前部分5’端加上9bp与GS基因组同源序列，后部分的引物序列与表达盒CMV(E+P)+EGFP+T2A+Survivin+BGH(polyA)5’端同源，下游引物设计同理。
实施例3：CHO-K1细胞的培养、转染以及pX458-GS-sgRNA载体效率验证
(1)细胞培养及转染
CHO-K1细胞复苏
细胞的复苏原则为快速融化。用镊子从液氮中迅速取出CHO-K1细胞的冻存管置于37℃的温水中，快速来回摇冻存管使细胞完全融解。在超净台中将冻存管口的水渍擦拭干净，打开冻存管，将细胞悬液移取至1.5mL离心管中800rpm离心5min，最后弃去冻存液。用1mL 37℃预温的F-12K新鲜培养基上下缓慢吹打细胞沉淀，将细胞转移至T-25的培养瓶中，再补充3mL培养基将细胞轻轻摇匀后放在37℃、5％CO2的培养箱中，6h后观察到细胞贴壁生长，更换新F-12K培养液继续培养。
CHO-K1细胞换液及传代
细胞的换液:先将T-25培养瓶内的旧培养液慢慢倒入废液缸，再用2-3mL PBS润洗去除残留的旧培养基，润洗2-3次。最后，添加4-6mL预温的F-12K培养基，将细胞重放回培养箱中培养。
细胞的传代:当细胞密度达到80-90％时，需要对细胞进行传代。即倒掉培养瓶中旧培养基，用PBS洗涤细胞2-3次，再加500-1000μL胰酶消化细胞，轻轻地左右晃动培养瓶，使细胞表面被胰酶均匀覆盖，同时用倒置显微镜观察细胞。一旦大部分细胞变圆，立即用枪头将胰蛋白酶吸掉并加2mL培养基终止消化。随后将细胞吹打均匀，按照1:2或1:3的比例进行传代。
细胞的冻存
细胞铺满整个培养瓶底时，吸除培养基，PBS清洗3次，加入500μL胰酶，37℃消化2min后加入1mL培养基，轻轻吹打细胞培养瓶壁上的细胞并且分散均匀，将吹悬的细胞液收集至新的1.5mL的EP管中，在800rpm的转速下离心5min，弃去上清培养基，用1mL细胞冻存液重悬细胞沉淀转移至冻存管，并标记好冻存时间与细胞名称，将其放置4℃冰箱30min，-20℃冰箱2h，-80℃冰箱过夜，液氮中长期保存备用。
细胞转染
细胞转染主要分为pX458-GS-sgRNA单转染CHO-K1细胞，研究设计的两条sgRNA引导的靶向切割效率；pX459-GS-sgRNA与EC#3表达盒共转染CHO-K1细胞，筛选所需单克隆细胞。
以下为单转染的步骤，DNA为pX458-GS-sgRNA质粒，共转染中DNA为pX459-GS-sgRNA载体与线性表达盒EC#3按照1:1配置而成，其他步骤相同，因此不作赘述。
在转染的前一天，胰酶消化细胞并制成细胞悬液，血球计数板计数，以24孔板为例，细胞浓度为4×105个/mL，每孔接种500μL细胞悬液；待细胞生长至70-80％的汇合度后，提前1h左右更换培养基为无血清无抗生素F-12k培养基；准备A和B两个1.5mL的EP管，A管:25μL无血清无抗生素培养基+0.75μL Lipofectamine 3000；B管:25μL无血清无抗生素培养基+500ng DNA+1μL入核试剂P3000，A管和B管分别混合均匀，室温静置5min后，将A管混合液加入B管并混合均匀后，再室温静置10-15min；向24孔细胞板中每孔逐滴加入DNA-脂质体转染复合物，轻晃使其均匀混合后继续培养。6h后更换细胞培养基为含10％血清和1％三抗的F-12k培养基。
(2)pX458-GS-sgRNA载体在CHO-K1细胞的切割效率
pX458-GS-sgRNA的Cas9酶有核定位序列，质粒中的sgRNA能否引导Cas9酶将CHO-K1细胞中的SGS位点切割需要进行验证。
T7E1酶为T7核酸内切酶Ⅰ的简称，它能够识别错配的双链DNA、Holliday结构或其他异源双链DNA及十字型DNA等，并能切割错配碱基5’端三个磷酸二酯键中的任意一个。根据T7E1酶的功能，我们可以检测pX458-GS-sgRNA1与pX458-GS-sgRNA2两个质粒的切割效率，检测原理为：质粒转染细胞后，sgRNA可以引导Cas9酶在细胞基因组的特定位点进行切割形成DSBs，真核细胞会启动自我修复系统将缺口连接起来，此过程引入了碱基的增加或缺失，形成了能被T7E1酶识别的双链。
本实施例的操作步骤如下所述：质粒转染CHO-K1细胞48-72h后，消化细胞，用天根血液/细胞、组织基因组DNA提取试剂盒，根据使用说明书提取细胞基因组，最后用微型核酸分析仪定量；按照下表4设计的靶位点引物用KOD-FX高效率高保真酶对目的片段进行PCR扩增，扩增按照表5的Touchdown程序进行，PCR结束后进行电泳并纯化回收目的片段，再用微量核酸分析仪进行定量；变复性：取纯化片段400ng，加入2uL 10×PCR buffer，用ddH2O补足至20uL，变复性程序：95℃5min，以2℃/s的速度降至25℃，4℃保存；目的片段中包含被Cas9酶切割及未切割的片段，经过变复性处理，片段会形成杂合型双链，取200ng该变复性片段，加入T7E1酶1uL，ddH2O补足至10uL，反应条件37℃，反应25-30min，再置于65℃反应10min，最后进行凝胶电泳验证；根据跑胶结果用ImageJ分析计算Indel(deletion/insertion)突变率，按照Indel(％)＝(1-(1-(b+c/a+b+c))1/2)×100％计算公式进行评估，其中a代表未切割DNA条带，b和c代表经T7E1酶切割后形成两条带，结果如图3所示。图3中的A图为靶基因位点目的片段PCR电泳图；B图为T7E1酶切试验凝胶电泳结果。
表4 T7E1酶切实验所需引物(SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.14)
Figure BDA0002994416980000101
表5降落PCR扩增sgRNA靶位点目的片段的反应程序
Figure BDA0002994416980000102
实施例4.筛选阳性单克隆细胞株
pX459-GS-sgRNA与EC#3表达盒共转染CHO-K1细胞，由于表达盒EC#3上带有绿色荧光，本实施例选用96孔板稀释方法进行筛选，如图4所示，筛选步骤如下：CHO-K1细胞进行共转染后稳定传3代，用PBS清洗细胞两次，加500-1000μL的胰酶消化细胞，等细胞变圆后立即加入预温的F-12K培养基终止消化，轻柔吹打CHO-K1细胞为单细胞悬液，取少量的CHO-K1细胞悬液稀释，用血球计数板计数，最终将细胞稀释为0.5个/100μL，将96孔板每个孔加100μL的最终稀释液，铺两块96孔板。24h后，用荧光显微镜观察有荧光的单个细胞，并作好标记。每隔2-3天给细胞换液，持续培养两周，观察孔中的单细胞株。当细胞长到适当数量，消化细胞，将细胞移入24或6孔板中，再继续培养到一定的数量，消化筛选单克隆细胞。将筛选得到的阳性单克隆细胞提取基因组，进行PCR扩增，纯化回收后测序鉴定，筛到的细胞株命名为S-Knockin。根据此方法用pX458-GS-sgRNA单转染CHO-K1细胞，筛选得到GS酶基因被破坏的细胞株，命名为GS-Knockout。
实施例5.建立过表达生存素Survivin单克隆稳定细胞株
(1)实时荧光定量PCR检测阳性单克隆细胞株中Survivin基因表达情况
阳性克隆细胞的总RNA提取并逆转录为cDNA：消化并收集阳性克隆细胞，用RNA提取试剂盒(RNA Prep pure cell/bacteria Kit)提取总RNA，取500ng的总RNA作为模板，再加上2μL的5×PrimeScript RT Master Mix，RNase Free ddH2O补齐到10μL，加样过程在冰上操作，按照以下程序进行逆转录反应：37℃反应15min，85℃反应5s，完成后-80℃保存。
荧光定量PCR(qPCR)：用SYBR Green qPCR Master Mix I试剂盒进行qPCR反应，反应引物为表6所示，按照表7进行荧光定量PCR，本实施例在Bio-Rad CFX 96qPCR仪器上进行，程序简述为：95℃预变性,30s；95℃,5s；60℃，45s；40个循环；获得溶解曲线。
PCR结束后，分析各数据，得到各组目的基因以及内参基因基Ct值，然后计算各组基因的表达水平，用2-ΔΔCt计算。最终能够得到每组细胞Survivin mRNA相对表达水平。表达水平为2-ΔΔCt,2^-ΔΔCt＝[(Ct gene in test cell lines-Ct in control cellline)KO-(Ct gene in test cell lines-Ct in control cell line)WT]。本实施例结果如图5所示。其中CHO-K1为野生型细胞株；S-Knockin为筛选的Survivin过表达的细胞株。
表6 qPCR引物列表(SEQ ID NO.15-SEQ ID NO.18)
Figure BDA0002994416980000121
表7 qPCR反应体系
Figure BDA0002994416980000122
(2)Western Blot检测阳性单克隆细胞Survivin蛋白的表达水平
对阳性单克隆细胞(S-Knockin)进行如下处理：胰酶消化细胞，将细胞收集至1.5mL的EP管中，3000rpm，离心5min，收集细胞；加入100μL细胞裂解液NP-40(含1mM的蛋白酶抑制剂PMSF)，用旋涡混合器振荡使其充分混合均匀，置于冰上裂解20-30min(裂解过程中拨打几次离心管，使细胞充分裂解)；将上一步骤得到的细胞裂解液以10000-12000g转速离心5min，上清即为所需的细胞样品并用BCA法测定总蛋白浓度；进行SDS-PAGE电泳；转膜：将SDS-PAGE凝胶于玻璃板中剥离，以marker条带为判断依据，切下目的蛋白区域凝胶，并测量裁剪出相应的PVDF膜，将PVDF膜用甲醇浸泡活化3-5min，然后将胶和PVDF膜平铺在转膜装置上(海绵、三层滤纸、凝胶依次放入黑色阴极板内，PVDF膜平铺胶上，其上继续放置三层滤纸、海绵，每层之间都要小心赶走气泡)，将转膜装置正负极对应好，倒入转膜缓冲液，盖上电极盖，置于冰上，以80V恒压转膜2h，转膜过程在冰上进行；转膜结束后，取出PVDF膜，用TBST清洗2-3次，每次5min，再将PVDF膜在封闭液中室温封闭2h，60rpm震荡；封闭结束后，将一抗用封闭液按照说明书推荐的比例稀释，4℃过夜孵，60rpm晃荡，次日早上，倒掉一抗，用TBST晃荡清洗PVDF膜2-3次，每次5min；孵二抗：将PVDF膜洗净一抗后，将二抗用封闭液按照说明书推荐的比例稀释，室温孵育1h，60rpm晃荡；显色拍照：弃除二抗，用TBST晃荡清洗2-3次，洗净残余的二抗后用ECL化学发光显色试剂盒现配置发光液进行ECL化学发光成像，Western Blot拍照结果用Image J软件分析，本实施例结果如图6所示。图6中的A图为Western blot检测出的各细胞Survivin蛋白的表达量；B图为Survivin蛋白在不同细胞中的表达量比较。
实施例6.过表达Survivin的单克隆株的抗凋亡能力性能鉴定
(1)流式细胞仪检测细胞抗凋亡能力：
本实施例中，选用10μg/mL的鬼臼毒素促进CHO-K1、S-Knockin细胞凋亡，用含谷氨酰胺合成酶的培养基继续培养细胞18h，再用凋亡试剂盒Annexin V-PE检测细胞凋亡率。具体操作流程简述如下：前一天消化稀释细胞，然后制备密度为2×105个/mL的细胞悬液铺6孔板，每个孔内添加2mL细胞悬液，放入培养箱中继续培养20-24h；将铺板的相应细胞进行换液，每孔加入终浓度为10μg/mL的鬼臼毒素2mL；将加药后的细胞继续放于培养箱内培养18h，胰酶消化并收集细胞，并用预冷的PBS润洗细胞两次，4℃1000rpm离心5min；弃去上清，加入195μL 1×binding buffer轻轻重悬细胞，再加入5μL Annexin V-PE，慢慢混匀，用锡箔纸包裹好EP管放在室温下避光孵育15min(孵育过程中需轻轻弹动EP管2-3次避免细胞结团)。孵育完成立即将EP管放冰盒内，送去流式细胞仪检测。本实施例结果如图7所示。正常培养各细胞24h后，加入终浓度为10μg/mL的鬼臼毒素促进各细胞凋亡，18h后流式检测细胞凋亡。其中，图7中A图为流式检测不同细胞加药后的凋亡情况；B图为各细胞凋亡率的统计。
(2)过表达生存素Survivin对细胞生长的影响
本实施例中选用未经过改造的CHO-K1为对照组，以在GS基因位点过表达生存素Survivin的S-Knockin和GS敲除的CHO-K1细胞GS-Knockout作为实验组，培养基中含有谷氨酰胺合成酶，通过细胞计数及活力分析实验试验生存素Survivin对细胞生长的影响，具体实验过程为：将3种细胞浓度稀释到2×105个/mL，接种于96孔板中，每孔100μL，连续培养7天，每天用血球计数板台盼蓝染色法对细胞进行计数及活力分析，最后绘制各组细胞的生长曲线和生存率曲线，每个实验组设置三个平行。本实施例结果如图8所示。CHO-K1、GS-Knock以及S-Knockin细胞连续培养各细胞7天，对它们计数并检测细胞活力。其中，图8中A图为CHO-K1、GS-Knockout和S-Knockin细胞增殖曲线；B图为CHO-K1、GS-Knockout和S-Knockin细胞活力曲线。
实施例7.过表达生存素Survivin细胞表达外源蛋白的性能比较
本实施例采用瞬时转染表达人源骨形态发生蛋白2(Human Bone morphogcnticprotein 2,hBMP-2)作为模式蛋白验证过表达生存素Survivin细胞的外源蛋白生产性能。
(1)pcDNA3.1/V5-HisB-hBMP-2质粒的构建
根据图9所示的pcDNA3.1/V5-HisB-hBMP-2构建示意图，先以pGEM-BMP2为模板PCR扩增目的片段，引物如表8所示。用BamH I和Xho I双酶切回收得到的hBMP-2单一产物和pcDNA3.1/V5-HisB质粒。pcDNA3.1/V5-HisB质粒双酶切后的片段与载体进行连接转化后进行菌液PCR，泳道中出现大小与理论大小相符的单一明亮的电泳条带，可以初步判定为阳性克隆，挑选3-5个阳性克隆送公司测序后，通过CmSuite8软件对测序结果进行序列比对分析，最终成功构建了pcDNA3.1/V5-HisB-hBMP-2重组质粒。
表8 pcDNA3.1/V5-HisB-hBMP-2引物列表(SEQ ID NO.19-SEQ ID NO.20)
Figure BDA0002994416980000141
(2)细胞密度及细胞活力分析
重组质粒瞬时转染CHO-K1细胞表达条件的优化
蛋白生产时，瞬时转染的DNA与PEI质量比过高或过低都会影响细胞。本实施例先优化转染条件，以便于后续蛋白表达的测定。瞬时转染选用6孔板进行，DNA与PEI的质量比设为1：1、1：2、1：3、1：4以及一个空白组，转染过程中细胞处理同上述转染步骤，将1mg/mL的PEI提前加热融解均匀，用pcDNA3.1/V5-HisB作为对照组。先在一个EP管中加入250μL的培养基，再加入4μg质粒DNA，室温孵育5min，再将其他几个EP管中加入250μL培养基，然后分别加入4μL、8μL、12μL和16μL的PEI(DNA：PEI分别为1：1、1：2、1：3和1：4)，室温孵育5min；轻轻将含有DNA的EP管与含有PEI的EP管内孵育完成的培养基混匀，在室温(15℃-25℃)中孵育20min，形成DNA-PEI复合物；孵育完成后，将500μL DNA-PEI复合物逐滴加到6孔板中，边加入边十字混匀；将6孔板继续放回培养箱中培养；培养6h后，将含有转染复合物的培养基弃去，换成含有血清与抗生素的培养基继续培养。24h后，流式细胞仪检测转染效率。本实施例结果如图10所示。
细胞数标准曲线的绘制
先用胰酶消化CHO-K1细胞，将细胞计数然后配制成6种不同浓度的细胞悬液，将细胞悬液分别接种到96孔板，每个重复3组，6个浓度细胞分别为0.2975×104、0.595×104、1.19×104、1.785×104、2.975×104和3.57×104个/mL，并设置一个空白孔只加新鲜培养基。将96孔板放置于37℃，5％CO2烘箱培养20-24h，细胞贴壁后去掉旧培养基，每孔加入180μL新鲜培养基，再加入浓度为5mg/mL的MTT母液，每孔20μL，放回细胞培养箱继续培养4h取出。轻轻吸掉含有MTT的旧培养基，然后每孔加入150μL的二甲亚砜，室温孵育30min。最后，在波长为490nm处测定吸光度。以细胞数作横坐标，各孔的平均吸光度值作纵坐标，绘制CHO-K1细胞数标准曲线。本实施例如图11所示。
ELISA法检测各细胞培养液上清hBMP-2的浓度
本实施例用Human BMP-2ELISA Kit(北京义翘公司购买)，参照试剂盒的操作手册检测CHO-K1、S-Knockin和GS-Knockout细胞培养液上清中hBMP-2的浓度，具体操作步骤如下：
将各细胞铺96孔板，DNA与PEI比例1：3瞬时转染各细胞，72h后分别取各孔细胞上清培养基，8000rpm离心5min，吸取上清；清液以1：100的比例用样品稀释液稀释；预先用稀释液将标准品逐级稀释成1500pg/mL、750pg/mL、375pg/mL、187.5pg/mL、93.75pg/mL、46.88pg/mL和23.44pg/mL备用；取出所需的酶标板，每孔加入300μL 1×洗涤缓冲液清洗三次后拍干；将标准品与稀释样品依次加入孔板中，每孔100μL，其中1孔只加样品稀释液作为零孔，待测样品重复三组，室温孵育2h小时(加样在15min内完成)；弃去孔中液体，再向孔内加入300μL 1×洗涤缓冲液清洗三次后拍干；加入100μL预先配制好的浓度为1μg/mL的检测抗体到酶标板中，混匀后室温孵育1h；弃去孔中液体，再向孔内加入300μL 1×洗涤缓冲液清洗三次后拍干；使用前15min先将显色液A与显色液B等体积混匀，避光，加入上一步拍干的酶标孔中，每孔200μL，混匀，室温避光孵育20min；孵育完成后，在每个酶标孔中加入50μL终止液，轻轻地左右震动酶标板，使显色均匀；20min内读取450nm的吸光度，并根据曲线计算样品浓度。本实施例结果如图12，图13所示。图13中将pcDNA3.1/V5-HisB-hBMP-2质粒与PEI质量比以1：3瞬转至CHO-K1相关细胞中，72h后检测细胞上清中蛋白含量。
需要说明的是，按照本发明上述实施例，本领域技术人员是完全可以实现本发明权利要求1及从属权利的全部范围，实现过程及方法同上述各实施例。
本发明通过上述实施例来说明本发明的详细流程，但本发明并不局限于上述详细流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 江苏中慧元通生物科技有限公司
<120> 一种抗凋亡单克隆细胞株及其制备方法
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caccgaccgc gcctgcttgt atgct 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaacagcata caagcaggcg cggtc 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caccgccctg tgaaggaatc cgcat 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaacatgcgg attccttcac agggc 25
<210> 5
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
attggtaccg agctcggatc cgacattgat tattgactag tta 43
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gggcacccat tcctggcttg tacagctcgt 30
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caagccagga atgggtgccc cgacgttg 28
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gaaggcacag tcaatccatg gcagccagct g 31
<210> 9
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
catggattga ctgtgccttc tagttgccag c 31
<210> 10
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgcgggccct ctagactcga gccatagagc ccaccgca 38
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggggttatgg actctgattc ttcact 26
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tcacccttgt taaccaaagt cccca 25
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gtagaacaag ctaggagctt gagtt 25
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ttcagaccat tctcctcccg catgg 25
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ccgcatctct acattcaaga actgg 25
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aagcgcaacc ggacgaatgc t 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
agctgagagg gaaattgtgc g 21
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gcaacggaac cgctcatt 18
<210> 19
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ggaattcgcc accatggtgg ccgggacccg ctgt 34
<210> 20
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ccctcgagct aatggtgatg gtgatgatgg cgacacccac aaccctccac aa 52
<210> 21
<211> 142
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Thr Gly Pro Pro Leu Leu Ala
1 5 10 15
His Ala Ile Ser Thr Pro Leu Ala Thr Pro Pro Leu Gly Gly Cys Ala
20 25 30
Cys Thr Pro Gly Ala Met Ala Gly Ala Gly Pro Ile His Cys Pro Thr
35 40 45
Gly Ala Gly Pro Ala Leu Ala Gly Cys Pro Pro Cys Pro Leu Gly Leu
50 55 60
Gly Gly Thr Gly Pro Ala Ala Ala Pro Ile Gly Gly His Leu Leu His
65 70 75 80
Ser Ser Gly Cys Ala Pro Leu Ser Val Leu Leu Gly Pro Gly Gly Leu
85 90 95
Thr Leu Gly Gly Pro Leu Leu Leu Ala Ala Gly Ala Ala Leu Ala Leu
100 105 110
Ile Ala Leu Gly Thr Ala Ala Leu Leu Leu Gly Pro Gly Gly Thr Ala
115 120 125
Leu Leu Val Ala Ala Ala Ile Gly Gly Leu Ala Ala Met Ala
130 135 140

Claims (10)

1.一种抗凋亡单克隆细胞株，其特征在于，所述细胞株过表达生存素Survivin蛋白，同时不表达谷氨酰胺合成酶，所述细胞株基于CRISPR/cas9基因编辑技术将外源表达盒整合到宿主细胞的谷氨酰胺合成酶位点得到；
所述外源表达盒由启动子、筛选基因、survivin基因和终止子以串联方式得到，所述survivin基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。
2.根据权利要求1所述的一种抗凋亡单克隆细胞株，其特征在于，所述启动子为CMV启动子、EF1a启动子、SV40启动子、RSV启动子或PGK启动子中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种抗凋亡单克隆细胞株，其特征在于，所述筛选基因为EGFP基因、Cherry基因、嘌呤霉素抗性基因、新霉素抗性基因、氯霉素抗性基因或潮霉素抗性基因中的一种。
4.根据权利要求1所述的一种抗凋亡单克隆细胞株，其特征在于，所述终止子为BGHPloyA或SV40 PolyA。
5.根据权利要求1所述的一种抗凋亡单克隆细胞株，其特征在于，所述外源表达盒由CMV强启动子、EGFP荧光筛选基因survivin基因和BGH polyA尾巴以串联方式得到。
6.根据权利要求1所述的一种抗凋亡单克隆细胞株，其特征在于，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞、非洲猴肾细胞、幼仓鼠肾细胞、小鼠骨髓瘤细胞或人胚胎肾细胞。
7.如权利要求1所述的抗凋亡单克隆细胞株，其特征在于，所述外源表达盒的制备方法包括如下步骤：
获取启动子、筛选基因、生存素基因、终止子以及线性化载体；
将所述启动子、筛选基因、生存素基因、终止子以及线性化载体加入PCR管中混合均匀，并加入同源重组酶，于50℃的水浴锅中进行连接反应，待反应完成后挑选阳性单克隆细胞于含有Amp的LB培养基中培养12h，即得；
其中，在上述连接反应中所用到的引物包括：
正向引物序列如SEQ ID NO:5所示，反向引物序列如SEQ ID NO:6所示的启动子和筛选基因的连接引物组；
正向引物序列如SEQ ID NO:7所示，反向引物序列如SEQ ID NO:8所示的生存素基因连接引物组；以及
正向引物序列如SEQ ID NO:9所示，反向引物序列如SEQ ID NO:10所示的终止子连接引物组。
8.如权利要求1～7任意一项所述的抗凋亡单克隆细胞株的制备方法，其特征在于，包括：
构建sgRNA-Cas9基因编辑载体，所述基因编辑载体包括pX458-GS-sgRNA与pX459-GS-sgRNA；
对冻存的宿主细胞进行复苏、传代培养处理，得到待转染的宿主细胞；
采用pX458-GS-sgRNA单转染待转染的宿主细胞，并采用pX459-GS-sgRNA与外源表达盒共转染待转染的宿主细胞，并进行单克隆挑选，得到抗凋亡单克隆细胞株。
9.如权利要求8所述的抗凋亡单克隆细胞株的制备方法，其特征在于，所述对冻存的宿主细胞进行复苏、传代培养处理，得到待转染的宿主细胞的步骤，具体包括：
对冻存的宿主细胞进行解冻处理，得到宿主细胞悬液；
对宿主细胞悬液移进行离心处理去除冻存液后，用37℃预温的F-12K培养基上下缓慢吹打宿主细胞沉淀，并将宿主细胞转移至T-25的培养瓶中，再补充F-12K培养基，并于37℃、5％CO2的培养箱中进行细胞培养；
当培养至宿主细胞密度达到80-90％时，进行传代培养，获得待转染的宿主细胞。
10.权利要求1～7任一所述抗凋亡单克隆细胞株在重组蛋白表达中的应用。
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