一种CHO细胞分泌能力评价系统
技术领域
本发明涉及一种真核表达载体及其应用领域,具体地说是一种能够评估外源DNA片段是否会对CHO细胞的分泌能力产生影响的表达载体及系统,涉及基因工程制药领域。
背景技术
CHO表达系统是目前蛋白或抗体药物最主要的表达系统之一,在生物制药中得到了广泛应用。除了具备其他哺乳动物细胞所具有的指导蛋白质的正确折叠,提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种蛋白翻译后加工,以及生产出最接近于天然活性的蛋白药物等优势外,与其他细胞相比,CHO细胞能够获得较高的产物产量以及抵抗相对强的代谢压力,此外,CHO细胞属成纤维细胞,为非分泌型细胞,很少分泌内源蛋白,有利于目标蛋白的分离纯化。然而,目前CHO细胞的蛋白表达水平仍然不能满足市场的需要,因此改进国内CHO工程细胞株,提高其表达分泌的水平,成为提高我国的蛋白药物生产水平关键的关键。
经过多年来CHO细胞株优化,特别是通过GS/MSX或者DHFR/Mix扩增筛选系统,增加外源基因的拷贝数,已经极大地提高了蛋白的表达量。有研究表明,蛋白表达的限速步骤主要在转录和转录后的过程。一些与蛋白分泌相关的内质网蛋白与高水平的蛋白的生产紧密相关。然而由于细胞内ER stress的存在,使得拷贝数提高到一定数量,细胞分泌水平达到一个极限,表达量不但无法再提高,反而会下降。此外,过多的拷贝数也将是细胞内DNA和RNA代谢的浪费和细胞负担。仅靠提高外源基因的拷贝数很难进一步提高蛋白的表达,需要从其他方面对CHO细胞株进行生理活动的改造。
蛋白质的表达和分泌,从基因的转录开始,到最后输送到细胞外,涉及到细胞体内生命活动的各个方面,包括基因转录的水平,RNA稳定性调控,蛋白质的翻译水平,蛋白质的稳定性调控,蛋白质的分流和转运即分泌途径的调控。其中蛋白质的分流和转运是分泌蛋白水平的限制管道。蛋白质合成好之后,如何进入内质网,如何通过转运泡转运到高尔基体,再从高尔基体形成分泌泡,分泌泡如何转运到细胞膜,然后与细胞膜融合,将蛋白质分泌出去。每一次的蛋白转运、膜与膜融合、生物膜回流的效率直接影响了分泌蛋白的量,其中哪里效率低下,蛋白将滞留在哪里。此外还涉及细胞整体生理状况,如细胞的分裂速度,细胞的凋亡,细胞的密度,细胞代谢活动的平衡和耐受,细胞的能量应用和流向。因此有必要对CHO这些细胞活动各层面进行全面的、系统的基因改造,才能有可能进一步提高CHO药物蛋白分泌表达水平。
目前检测细胞分泌出的蛋白含量多是通过western blot,程序复杂且费时费力。如何更直接快速的寻找影响CHO细胞蛋白分泌过程的基因,是加快CHO细胞改造的一个关键步骤。
发明内容
本发明公开了一种能够直接衡量外源DNA片段能否对CHO细胞的分泌能力产生影响的评价系统。本发明利用谷氨酰胺合成酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞(CHO-GS-/-)为宿主细胞,利用TALEN技术向基因组中定点插入重组片段。该评估系统以lucGFP为报道基因,能够通过检测luciferase在细胞培养上清中的含量评估外源蛋白对细胞分泌能力的增强或抑制作用。应用了谷氨酰胺合成酶筛选系统的优势,经过压力筛选后得到定点插入的稳定细胞株。该系统将piggy位点整合到细胞基因组中,可通过piggyBAC转座子直接将报道基因从基因组中去除。从而获得稳定插入外源DNA片段的重组CHO细胞。本发明所提供的真核表达载体能够与外源基因连接,构建成融合表达载体,可简单快速地评估外源蛋白对细胞分泌能力的影响,并获得遗传改造的重组CHO细胞株。
本发明中所应用的载体,包含:a)一个GS筛选单元,该单元表达构件包括5’至3’方向依次排列的PGK启动子基因序列、谷氨酰胺合成酶基因序列、EEF1a内含子序列以及SV40polyA基因序列,谷氨酰胺合成酶(GS)基因作为CHO稳定细胞株的筛选标记;b)一个抗体-lucGFP表达单元,一个完整的抗体-lucGFP表达单元共有四个表达框架,分别含有两个重链(VH)和两条轻链(VL),重链基因与LucGFP报道基因融合。为了使重链和轻链的表达量基本相近,引入了两种不同的强启动子,hCMV启动子和hEEF1a启动子,每个启动子分别控制一条重链-LucGFP融合基因和一条轻链。c)在GS筛选单元和报道基因表达单元两侧引入了PiggyBAC序列,这样GS筛选单元和报道基因单元插入到细胞基因组后,PiggyBac转座酶的作用下在Piggy位点将基因组染色体切开,GS筛选单元和报道基因单元将从基因组中被切除。
本发明中所应用的载体pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)构建步骤如下:
1.构建含有PGK启动子序列、EEF1a内含子序列、SV40polyA、以及mGS CDS序列的GS基因表达单元质粒:pPGK-mGS。
2.将抗体重链VH与lucGFP报道基因进行融合。分别把VH-lucGFP基因和抗体轻链VL基因构建到带有hCMV或者hEEF1a启动子的表达质粒中。将VH-lucGFP和轻链基因表达基因两两串联起来,形成一个带有四个表达框架的质粒p2x(HG-VL),构建抗体-lucGFP报道基因表达单元。
3.构建带有Floxp和piggy序列的骨架载体pACYC-piggy-mK16K
4.将GS表达单元、抗体-lucGFP报道基因表达单元构建到pACYC-piggy-mK16K骨架载体中,形成一个完整的筛选质粒pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)(图1)。可以继续添加抗体-lucGFP报道基因表达单元,产生带有两个完整表达单元的质粒pACYC-mK16K-mGS-4x(HG-VL),以及带有三个完整表达单元的质粒pACYC-mK16K-mGS-8x(HG-VL),提高抗体-lucGFP报道基因表达单元拷贝数。
5.筛选质粒pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)中插入影响CHO分泌能力的DNA调控片段,如分泌通路上的基因,或者影响分泌通路基因表达的元件如shRNA,microRNA,CRISPR、TALEN、ZFN等等,形成重组质粒。
本发明还公开了pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)载体在评估外源蛋白对CHO细胞分泌能力的影响中的应用(图2)。具体操作如下:
(1)质粒准备:EcoRI酶对带有外源目的蛋白的重组质粒和对照质粒pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)进行线性化处理。选择具有较高活性的经修饰的TALEN质粒对3xGCN4-CHOActb-6K-L和CHOActb-6k-R与实验载体共转染,以达到定点插入的目的。
(2)细胞的转染与筛选:将3xGCN4-CHOActb-6K-L和CHOActb-6k-R与线性化的重组质粒或空白对照质粒pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)通过电转法共转染到谷氨酰胺缺陷的CHO细胞系CHO-GS-/-中(图3)。转染后的混合细胞在不含L-谷氨酰胺的压力培养基中进行筛选。经过十天的筛选,未转入pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)片段的细胞将因为自身无法合成谷氨酰胺合成酶而逐渐死去,而转入pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)质粒的CHO细胞重新获得了合成谷氨酰胺合成酶的能力,其自身可利用谷氨酸盐合成谷氨酰胺,因此在不含谷氨酰胺的培养基的筛选压力下能够继续存活下来。
(3)阳性克隆的筛选:经不含L-谷氨酰胺的培养基筛选后的细胞库,通过有限稀释法获得细胞单克隆,PCR检测获得片段插入正确的单克隆细胞。
(4)外源蛋白对细胞分泌影响分析:使用酶标仪检测细胞培养上清以及细胞内luciferase的含量。通过比较重组细胞与对照细胞上清中luciferase的含量,判断目的蛋白是否会在细胞分泌过程中发挥作用。
(5)筛选标记的去除:通过电转法向插入含有目的蛋白的重组细胞中转入Piggy-BAC质粒,将插入的筛选标记去除,最后获得稳定插入影响CHO分泌的外源DNA片段的重组细胞株。
本发明克服了以往验证某个蛋白是否会在细胞分泌过程中发挥作用费时费力的缺点,可以简单快速的判断重组蛋白对细胞分泌的影响,大大节省了时间,人力,物力和财力。将本发明的重组载体转染CHO细胞,利用Piggy-BAC转座子可以直接将报道基因和筛选标记去除,获得已经提高CHO细胞分泌能力的CHO细胞株,快速地改造并提高CHO细胞分泌能力。
附图说明
图1为pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)质粒图谱;
图2为评价系统稳定细胞株构建示意图;
图3为质粒瞬时转染结果;
图4为瞬时转染报道基因检测结果;
图5为定点插入PCR检测结果;
图6为稳定细胞株CHO-2x(HG-VL)荧光显微镜照片;
图7为稳定细胞株CHO-2x(HG-VL)及通过piggyBAC删除筛选基因与报道基因后的细胞株的报道基因检测结果。
具体实施方式
以下将通过具体的实施例说明本发明,但是这些具体的实施例不应当理解为对本发明的限制,对某些细节进行修改将仍然落入本发明的保护范围之内。
一.重组质粒的构建
1.GS表达单元的构建:
1)首先通过PCR分别获得pMV片段、启动子PGK片段、内含子序列EEF1a intron、以及SV40polyA片段,将以上四个片段连接起来获得pMV-PGK-EEF1a intron-SV40polyA载体。
2)全基因合成带有谷氨酰胺合成酶基因的质粒pUC57-mGS质粒,酶切获得mGS片段,将其插入到酶切的载体pMV-PGK-EEF1aintron-SV40polyA中,获得GS基因的完整表达单元pPGK-mGS质粒。
2.荧光素酶报道基因表达单元的构建
1)利用PCR等常规分子生物学方法扩增出pMV片段,启动子CMV,内含子ACTBintron,以及BGHpolyA序列,将其连接起来构建成新型质粒pMV-hCMV-ACTBintron-BGHpolyA;PCR扩增pMV片段,启动子hEEF1a,内含子EEF1aintron,以及SV40polyA序列连接起来,构建成新型质粒pMV-hEEF1a-EEF1aintron-SV40polyA。
2)PCR获得RPL15At和RPL41Bt片段,分别连接到上述两个载体中,获得pMV-hCMV-ACTBintron-BGHpolyA-H,pMV-hCMV-ACTBintron-BGHpolyA-L以及pMV-hEEF1a-EEF1aintron-SV40polyA-H,pMV-hEEF1a-EEF1aintron-SV40polyA-L四个载体。
3)将片段VH和nanGFP分别与载体pMV-hCMV-ACTBintron-BGHpolyA-H和pMV-hEF1a-EEF1aintron-SV40polyA-H连接,获得被不同启动子启动的VH-nanGFP载体phCMV-VH-nanGFP和phEF1a-VH-nanGFP
4)将片段VL分别与载体pMV-hCMV-ACTBintron-BGHpolyA-L和pMV-hEF1a-EEF1aintron-SV40polyA-L连接,获得被不同启动子启动的VL载体phCMV-VL和phEF1a-VL。
将上述带有不同启动子的VH-nanGFP和VL片段串联起来,分别形成phCMV-VH-nanGFP-hEF1a-VL和phCMV-VL-hEF1a-VH-nanGFP,最后将上述两个具有两个表达框架的质粒串联,形成一个带有四个表达框架的质粒p2x(HG-VL)。
3.Piggy位点的构建
1)构建带有Floxp和piggy序列的骨架载体pACYC-piggy-mK16K
PCR从全基因合成的pUC-piggyl-LIC质粒中扩增piggyl序列,从带有piggy序列的质粒中扩增piggyR序列,将piggyl和piggyR序列串联到PACYC骨架中,获得质粒pACYC-piggy-lic
4.完整真核表达质粒的构建
1)合成mK16K序列,将其插入到pACYC-piggy-lic载体中构建包含mK16K序列的质粒pACYC-piggy-mK16K。
2)从pPGK-mGS质粒中酶切获得GS表达单元,插入到上述质粒中,构建pACYC-mK16K-PGK-mGS载体。
1)从p2x(HG-VL)载体中酶切获得荧光素酶报道基因表达单元,插入到pACYC-mK16K-PGK-mGS中,形成一个完整的筛选质粒pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)。继续添加荧光素酶报道基因表达单元,形成带有两个完整表达单元的质粒pACYC-mK16K-mGS-4x(HG-VL),以及带有三个完整表达单元的质粒pACYC-mK16K-mGS-8x(HG-VL)。
5.重组质粒的构建
PCR扩增目的蛋白基因片段,将其插入到质粒pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)中获得重组质粒。
二.pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)载体在对细胞分泌能力评估中的作用
1.pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)载体在CHO细胞中的瞬时表达
1)细胞的培养,转染和筛选
野生型CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)在含10%胎牛血清(16000-044
bylife technologies)和1%双抗的F12(11765-054
by life technologies)培养基中培养。获得的谷氨酰胺缺陷型CHO细胞(CHO-GS-/-)在含10%胎牛血清,1%双抗以及20mML-谷氨酰胺(0374Amresco)的F12培养基中培养。
pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)质粒用EcoRI酶进行线性化处理。3xGCN4-CHOActb-6K-L,CHOActb-6k-R和线性化的pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)按照1∶1∶5的比例混合,电转法共转染到CHO-GS-/-细胞中。在37度5%CO2的细胞培养箱中培养24h后,荧光显微镜下检测其GFP表达情况。
2)nanGFP分泌量检测
收集细胞培养上清以及细胞样品,向细胞样品中加入裂解液裂解细胞。12000rpm离心5min除去样品中的细胞碎片,分别取上清液检测细胞培养上清和细胞内luciferase含量。结果表明pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)质粒转染的CHO细胞GFP主要分泌到细胞上清中(图4)。
3.pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)载体在CHO细胞中的稳定表达
1)含有pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)载体的CHO稳定细胞株的获得
将第一步转染了pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)片段的CHO-GS-/-细胞用胰蛋白酶消化下来,接种到细胞培养皿中混合培养。选用不含L-谷氨酰胺的DMEM/F12培养基进行加压培养,待细胞长至90%时,将细胞消化下来,按照1∶3接种到新的培养皿中,继续在不含L-谷氨酰胺的培养基中培养。约两周后,待细胞生长稳定,取部分混合细胞检测pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)片段在基因组中的插入是否正确。
检测方法:分别在插入位点的基因组上和插入序列上设计引物进行PCR,PCR产物测序确认片段插入正确。PCR引物设计如下:
Actb-6K-F1:GAGACAGACTTTCTATGCACC
Actb-6K-R1:GAGTGAGCCACACATAACAAC
GS-Test:GATCCACGGTGCGCCTTCTAG
野生型CHO细胞PCR条带为500bp,定点插入片段的CHO细胞将产生650bp或750bp的条带(图5)。
采用梯度稀释法对混合细胞铺单克隆,待单克隆细胞在96孔板中长至50%左右,取部分单克隆细胞按照上述方法进行PCR检测,直至挑选到在CHO-GS-/-细胞中定点插入了pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)片段的单克隆细胞。所获得的单克隆细胞进行扩大培养,形成稳定细胞株CHO-2x(HG-VL)(图6)。
2)luciferase在稳定细胞中的分泌检测
接种一定数目的细胞CHO-2x(HG-VL)至24孔细胞培养版中,同时接种等量的野生型细胞CHO细胞作为对照。培养24小时后,分别收集样品上清液,加入细胞裂解液完全裂解细胞。分别取上清液检测细胞培养上清和细胞内luciferase含量。结果表明,稳定表达细胞其luciferase蛋白主要分泌在细胞培养液中(图7),且细胞生长状态良好。
4.应用pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)载体对细胞分泌能力评估
将影响CHO分别能力的DNA片段,如编码蛋白的基因表达元件、shRNA或者microRNA表达元件,构建到pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)载体中。按照上述方法将带有调控DNA片段的载体pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)通过电转法转染进CHO-GS-/-细胞中,同样方法获得稳定细胞株。
以转染pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)的CHO细胞株作为对照,分别检测带有调控DNA片段的CHO细胞株和对照细胞株向外分泌GFP的含量。
三.报道基因的去除
电转法将pCS7-piggyBAC质粒转染到插入了pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)片段的CHO-GS-/-稳定重组细胞株。转染后的细胞接种到含有L-谷氨酰胺的细胞培养皿中混合培养。有限稀释法对混合细胞铺单克隆,待单克隆细胞长至50%左右,荧光显微镜下观察,选取不带有荧光的单克隆细胞,PCR检测报道基因已被去除。筛选标记基因和报道基因都去除后的CHO细胞经检测不再表达报道基因(图7)
综上所述,本发明提供的pACYC-mK16K-mGS-2x(HG-VL)载体构建的CHO稳定细胞株能够有效评估调控DNA片段对CHO细胞分泌作用的影响。