CN110982790B - 一种用于蛋白展示和表达的细胞株及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种可用于蛋白展示和表达的CHO细胞，所述CHO细胞的基因组中整合有表达框，所述表达框整合于CHO细胞基因组的YWHAE基因的终止密码子之后；所述表达框包括启动子、第一重组酶识别序列、目的基因、第二重组酶识别序列、终止子。在该细胞中，荧光蛋白基因和抗体基因可以高转录并且在无抗生素维持的情况下持续稳定高表达，抗体转录水平相对于之前建立的CHO‑puro细胞株有了显著的提高。并通过实验验证该位点的AID突变效率显著高于CHO‑puro的随机插入位点。
Description
技术领域
本发明属于生物医药及抗体工程领域，具体而言，涉及一种用于蛋白展示的细胞株及其制备方法和应用。
背景技术
目前，抗体已经被广泛应用于科学研究、诊断和治疗领域。而抗体被发现以后，抗体的亲和力往往不高，这时就需要体外抗体展示技术来提高抗体的亲和力从而使抗体得到应用。最近几年，哺乳动物细胞抗体展示和体外高频突变进化平台已经得到快速发展。
在前期的工作中，申请人已经建立了一个哺乳动物细胞抗体进化平台，将一个可替换的框式表达框随机整合到CHO基因组中，通过多轮替换筛选鉴定获得了一株单拷贝的细胞株CHO-puro(中国专利申请号：201410803422.2)。可以将抗体基因通过RMCE技术替换到基因组的预设位点，实现抗体的表达和展示。然后通过AID酶对抗体基因进行突变而获得抗体突变库，进而通过流式细胞仪进行分选获得高亲和力的抗体。但CHO-puro细胞株是通过随机插入的方式获得的，由于染色体的复杂性而不能保证该插入位点具有最好的转录水平和展示水平。
AID可以通过将胞嘧啶脱氨基转换成尿嘧啶进而诱导成其他碱基突变。有研究报道在细菌及非B细胞内，AID也可以对高表达的基因进行高频突变。AID的这种特质是哺乳动物细胞蛋白进化平台的关键和基础。目前有研究发现基因的转录水平和AID诱导的突变频率成正比。因此如果能够在基因组中找到一个高转录活性的位点，那么就能提高AID进化的效率，而且能够提高抗体的展示水平，从而提高抗体进化平台的整体效率。目前为止，这样的高转录活性位点并不多，急需这方面的研究。因为之前基因定点插入的技术比较繁琐复杂，研究这些位点比较困难。
染色体基因组中的基因整合位点对外源基因的转录水平，表达水平和稳定性起着至关重要的作用，这种现象被称为位置效应。染色体结构比较复杂，能够影响RNA聚合酶II的转录活性，并且染色体的动态结构受到多方面机制的调控，因此如何选择这个基因高转录活性位点是比较困难的。
发明内容
一方面，本发明提供了一种可用于蛋白展示和表达的CHO细胞，所述CHO细胞的基因组中整合有表达框，所述表达框整合于CHO细胞基因组的YWHAE基因的终止密码子之后的第1位至第2000位碱基区域的内部。
上述终止密码子之后的碱基，应当理解为终止密码子最后一位碱基之后的碱基，比如，终止密码子为TGA，那么终止密码子之后的第1位碱基应当为“TGA”中的碱基“A”之后的第1位碱基。假设TGA之后紧接的碱基序列为CTAAG……，那么上述碱基“C”即为终止密码子之后的第1位碱基。
优选的，所述表达框整合于CHO细胞基因组的YWHAE基因的终止密码子之后的第100位至第1900位碱基区域的内部，更优选，第500位至第1800位碱基区域的内部，更优选，第1000位至第1700位碱基区域的内部，更优选，第1200位至第1600位碱基区域的内部。
所述表达框包括启动子、第一重组酶识别序列、目的基因、第二重组酶识别序列、终止子；优选的，所述表达框包括从5’到3’端依次连接的启动子、第一重组酶识别序列、目的基因、第二重组酶识别序列和终止子。
进一步的，所述第一重组酶和第二重组酶选自重组酶Flpo或iCre。
在优选的实施方式中，所述表达框替换CHO细胞基因组的YWHAE基因的终止密码子之后的第1位至第2000位的碱基区域中的任意一段连续的碱基区域；优选的，所述表达框替换CHO细胞基因组的YWHAE基因的终止密码子之后的第100位至第1900位的碱基区域的任意一段连续的碱基区域，更优选，替换第500位至第1800位的碱基区域的任意一段连续的碱基区域，更优选，替换第1000位至第1700位的碱基区域的任意一段连续的碱基区域，更优选，第1200位至第1600位的碱基区域的任意一段连续的碱基区域；优选的，上述任意一段连续的碱基区域包含连续的至少20个碱基，更优选，至少30个、至少40个、至少50个、至少100个、至少150个或至少200个碱基。在优选的实施方式中，所述表达框替换CHO细胞基因组的YWHAE基因的终止密码子之后第1320位至第1525位的碱基区域。
上述替换应当理解为，CHO细胞基因组的YWHAE基因的终止密码子之后的某段碱基区域被表达框完全的替换；例如，替换第1320位至第1525位的碱基区域，应当理解为，CHO细胞基因组的YWHAE基因的终止密码子之后的第1320位至第1525位的碱基被表达框替换。
进一步的，所述第一重组酶识别序列和第二重组酶识别序列选自FRT或Loxp。
进一步的，所述启动子选自CMV启动子，所述终止子选自BGH pA终止子。
进一步的，所述目的基因选自荧光标记基因，例如，GFP、RFP，抗体基因，优选的，所述抗体选自单链抗体(scFv)，Fab抗体，螺旋-卷曲异源二聚体Fv抗体片段(ccFv)或全长抗体，或者其他非抗体的蛋白质，例如，细胞因子。
在优选的实施方式中，所述CHO细胞为CHO-K1细胞。
本发明的CHO细胞，可以通过常规的基因插入的方式将表达框整合到基因组中，也可以采用CRISPR基因编辑的方式将表达框整合到基因组中。
另一方面，本发明还提供了上述CHO细胞在蛋白展示和蛋白表达中的应用。
另一方面，本发明还提供了上述CHO细胞在蛋白进化，如，抗体进化；抗体成熟；或者蛋白分泌，如，分泌抗体中的应用；此时，所述表达框中的目的基因选自抗体基因，优选的，所述抗体选自单链抗体(scFv)，Fab抗体，螺旋-卷曲异源二聚体Fv抗体片段(ccFv)或全长抗体。
本发明中，我们通过CRISPR/Cas9技术将一个可替换表达框定点插入到CHO细胞基因组ywhae基因的3’末端，获得了蛋白高表达的细胞株，并成功将抗体展示到细胞膜表面。在该细胞株中，荧光蛋白基因和抗体基因可以高转录并且在无抗生素维持的情况下持续稳定高表达，抗体转录水平相对于之前建立的CHO-puro细胞株有了显著的提高。并通过实验验证该位点的AID突变效率显著高于CHO-puro的随机插入位点。
附图说明
图1.可替换表达框插入CHO细胞的策略；(A)定点插入CHO-K1细胞基因组ywhae基因的位点图。一共选择了3个插入位点，分别是：E位点在外显子1中；I位点位于内含子内部，在外显子3和外显子4之间；T位点位于终止密码子后面。crRNA对应于基因组中的20bp靶向序列用下划线标出，PAM序列也用下划线标出，Cas9酶在基因组中的切割位点用三角号标出。Ywhae基因的起始密码子用方框标记。(B)GFP可替换表达框定点整合策略。供体质粒主要包含3个主体：两个同源臂(HR1和HR2)，GFP可替换表达框和潮霉素抗性基因表达框，RFP表达框。MCS1和MCS2是限制性核酸内切酶多克隆位点，可以使两条同源臂方便快捷的插入供体质粒。FRT和Loxp是Flpo和iCre重组酶识别的序列。通过双重组酶介导的框式替换，可以将FRT和Loxp之间的GFP基因替换成目的基因。CRISPR/Cas9-RNA复合物可以识别靶向序列并在特定位点切割，使基因组DNA双链断裂，进而激活同源介导的DNA修复，在供体质粒存在的情况下将供体质粒同源臂之间的序列(3561bp)整合到基因组DNA断裂处。
图2.CHO-K1-T细胞株的RMCE流式图；anti-TNF-αScFv抗体基因替换CHO-K1-T细胞株中的GFP基因实验过程中的流式图结果。(-)，CHO-K1细胞作为阴性对照；T31 RMCE，为CHO-K1-T细胞株转染质粒后进行的流式检测，gate P3中的细胞团是替换成功的细胞(展示抗体而不表达GFP蛋白)，将该细胞团分选下来，培养；T31-Ab，是细胞培养后的流式图，相对于阴性对照，几乎全部的细胞都展示anti-TNF-α抗体。
图3.CHO-K1-T细胞株蛋白稳定表达情况；(A)流式分析T31-GFP(插入GFP的CHO-K1-T细胞株)细胞的GFP表达情况和T31-TNF细胞(插入anti-TNF-αScFv抗体基因的CHO-K1-T细胞株)的抗体展示情况；列出了在0天和42天对细胞检测的流式图。CHO-CTL为CHO-K1阴性对照。(B)GFP表达或抗体展示的阳性细胞百分比。每7天流式检测一次，共检测7次。
图4.CHO-K1-T细胞株(T31)和CHO-puro克隆的RMCE流式图；RFP基因替换CHO-K1-T细胞株(T31)中的GFP基因和CHO-puro克隆中的puromycin抗性基因的流式图结果。CHO-K1细胞作为阴性对照(CHO-CTL)；T31 RMCE，为CHO-K1-T细胞株克隆转染质粒后进行的流式检测，gate中的细胞团是替换成功的细胞(表达RFP而不表达GFP蛋白)，将该细胞团分选下来，培养；CHO-puro RMCE，为CHO-puro克隆转染质粒后进行的流式检测，gate中的细胞团是替换成功的细胞(表达RFP)，将该细胞团分选下来，培养。
图5.CHO-K1-T与CHO-puro克隆基因转录和蛋白表达水平比较；通过双重组酶介导的框式替换，CHO-K1-T细胞株(T31)中的GFP基因和CHO-puro克隆中的puroR基因分别被anti-TNFα-Ab基因，RFP基因和anti-HMGB1-Ab基因替换。(A)流式分析抗体的展示水平和RFP蛋白的表达水平。代表性的anti-TNFα-Ab(左)，RFP(中)和anti-HMGB1-Ab(右)表达情况流式图显示在上边。三次独立实验的几何荧光强度均值(代表蛋白表达水平或者展示水平)和CV(coefficient of variance)显示在下边的柱形图中。CHO-K1作为阴性对照(CHO-CTL)。(B)qPCR鉴定目的基因的转录水平。CHO-K1-T替换后的目的基因转录水平显著高于CHO-puro替换后的目的基因。
图6.CHO-K1-T与CHO-puro细胞AID诱导的突变效率的比较；(A)建立用于检测AID诱导的突变效率的细胞模型(T31-mGFP和Puro-mGFP)。通过双重组酶介导的框式替换将突变的GFP基因(mGFP)替换到T31-GFP细胞(T31克隆株，表达GFP)和Puro-RFP细胞(表达RFP)中的预定基因组位点。通过流式细胞仪，将转染后细胞中的GFP阴性细胞(左，gated)或RFP阴性细胞(右，gated)分选到96孔板中，每个孔一个细胞。CHO-CTL(CHO-K1)，T31-GFP，CHO-puro，Puro-RFP作为阴性对照。(B)流式分析mGFP突变成GFP的表达情况。检测的其中一次流式图显示在左边，三次独立实验的GFP表达百分比(代表AID突变效率)统计图显示在右边。
图7.Logistic标准曲线；将纯化后已知浓度的TNF-Fc抗体以倍数递增稀释，然后加入到ELISA板中，并和待检测的样品同时测OD450nm。将抗体浓度和荧光读数OD450nm进行曲线拟合，建立Logistic模拟标准曲线，计算出来的公式为y＝a/(1+b×exp(-cx))，a＝-1.03962998892E-001，b＝-1.95583736177E+000，c＝2.20329064057E-001。
具体实施方式
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例一、材料与方法
1、细胞培养
CHO-K1细胞及利用CHO-K1构建的一系列细胞都使用含有10％胎牛血清(Hyclone)、100U/mL双抗的PRMI-1640培养基，于37℃，5％的CO2培养箱中培养。CHO/dhFr-(二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞)使用含10％胎牛血清(Hyclone)、100U/mL双抗、0.1mM次黄嘌呤和0.016mM胸腺嘧啶的IMDM培养基，于37℃，5％的CO2培养箱中培养。
人293F细胞使用FreeStyleTM293Expression Medium培养基，于37℃，5％的CO2培养箱，120rpm转速下摇瓶培养。
2、细胞转染与细胞系的建立
为了构建特定位点整合的稳定细胞系，CHO-K1细胞提前一天种到6孔板中，第二天等细胞扩增到60％-80％满度的时候，与500ng供体质粒和500ng CRISPR/Cas9质粒共转染，详细转染步骤按照LipofectamineTM 2000(Invitrogen)说明书进行。转染24小时后，转染的细胞种到10cm盘中并在250μg/mL的hygromycin B(Invitrogen)抗生素中进行筛选培养。两周后，筛选后存活的细胞经过流式细胞仪，将只有GFP高表达、没有RFP表达的细胞分选下来。分选后的细胞放到10cm盘中继续培养。扩增到80％满度的时候，通过流式细胞仪将GFP表达最高的细胞分选到96孔板中，每个孔一个细胞。培养7天左右，用荧光显微镜挑选出GFP发强荧光，RFP不发荧光的克隆株进行进一步分析。
通过双重组酶框式替换将目的基因插入到细胞基因组预定位置。在基因组中带有可替换表达框的细胞株提前一天种到6孔板中，第二天等细胞扩增到60％-80％满度的时候，与500ng交换质粒和2μg重组酶表达质粒共转染。转染后种到10cm盘中并持续培养7天，然后收集细胞进行流式检测和分选。
3、流式检测与分选
将用于检测或分选的细胞用胰酶消化大约3分钟，然后用带有血清的培养基中和，离心收集消化下来的细胞。再用预冷的Opti-MEM无血清培养基(Invitrogen)洗一次，然后用含标记抗体的预冷Opti-MEM重悬细胞，4℃放置30min，再用预冷的Opti-MEM洗一次，最后用预冷的Opti-MEM重悬细胞，进行流式检测或分选。
4、质粒构建
本发明中构建的质粒如下：
(1)CRISPR/Cas9质粒的构建：crRNA通过设计软件(CRISPR Design Tool)来设计。设计好后，采用引物合成的方式合成正反单链引物，经过退火变性从而互补结合成双链DNA，然后插入到px260a质粒的BbsI酶切位点。最后构建成px260a-E_site，px260a-I_site，px260a-T_site 3个分别靶向E位点，I位点和T位点的CRISPR/Cas9质粒。
(2)供体质粒的构建：供体质粒(pDonor-MCS)包含两个多克隆位点，分4步构建。一，构建RFP表达框(RFP_EC)质粒。首先从质粒pCDFGL扩增出pCMV-FRT-GFP-Loxp-BGHpA片段，插入到T载体(Takara)中。然后，将RFP基因插入到T-pCMV-FRT-GFP-Loxp-BGHpA中的HindIII和XhoI酶切位点之间(RFP两边的酶切位点为HindIII和SalI)，构建成为T-pCMV-RFP-BGHpA。最后将T-pCMV-RFP-BGHpA中的HindIII酶切位点突变掉。二，构建GFP表达框(GFP_EC)质粒。首先将pCMV-FRT-GFP-Loxp-BGHpA片段插入到pUC19的EcoRI和SalI酶切位点之间。然后将其中的BamHI、HindIII、EcoRV、XhoI酶切位点突变掉，构建成pUC19-pCMV-FRT-GFP-Loxp-BGHpA。三，构建潮霉素抗性基因表达框(hygro_EC)。首先从pCDFGL中扩增出sv40ori-hygromycin-sv40pA表达框，插入到T载体中。然后将潮霉素抗性基因中的EcoRI酶切位点在不改变编码氨基酸的情况下突变掉。四，组装成供体质粒pDonor-MCS(pUC19-MCS1-GFP_EC-hygro_EC-MCS2-RFP_EC)。按顺序的将RFP表达框(SalI-RFP_EC-HindIII)，GFP表达框(MCS1-GFP_EC：EcoRI-EcoRV-AgeI-ClaI-HpaI-BstBI-XhoI-GFP_EC-KpnI),潮霉素表达框(hygro_EC-MCS2：BglII-hygro_EC-BamHI-PacI-NotI-SwaI-AseI-BglII)插入到pUC19质粒中的SalI&HindIII,EcoRI&KpnI之间，及BamHI单酶切位点内。最后将同源臂1和同源臂2分别插入到MCS1和MCS2中，构建成针对E，I，T位点的3个供体质粒，分别命名为pDonor-E_site，pDonor-I_site，pDonor-T_site。
(3)双重组酶表达质粒和交换质粒构建：双重组酶表达质粒(pF2AC)和交换质粒pFRT-RFP-LoxP(pFRL)，pFRT-TNF-LoxP(pFAb1L)；交换质粒pFRT-HMGB1-LoxP(pFAb2L)的构建是通过将SP-HMGB1-His(signal peptide-anti HMGB1 svFc-6His tag)片段插入到pFAb1L中的EcoRI和XhoI酶切位点之间。交换质粒pFRT-mGFP-LoxP(pFmGL)的构建是通过将mGFP插入到pFRL中的HindIII和XhoI酶切位点之间。交换质粒pFRT-TNF-Fc-LoxP(pFAb1FcL)的构建是通过将TNF-Fc融合表达抗体基因片段插入到pFRL中的HindIII和XhoI酶切位点之间。
(4)mAID表达质粒的构建。将mAID基因插入到pcDNA3.1/hygro(+)质粒中的HindIII和XbaI酶切位点之间，构建pcDNA3.1-mAID。
(5)TNF-Fc表达质粒的构建。将TNF-Fc融合表达抗体基因插入到pCEP4质粒中的HindIII和XhoI酶切位点之间，构建成pCEP4-TNF-Fc。
实施例2、用于蛋白展示的CHO细胞系的构建
本发明中，将一个可替换表达框插入CHO细胞基因组内的一个特定位点，从而构建一个单拷贝基因的高表达细胞株。该细胞株可以将任何抗体基因或其他基因快速的替换到基因组中，实现抗体基因的高转录和表达并将抗体展示在CHO细胞膜表面以便对抗体进行亲和力成熟。
本发明中，选择CHO细胞基因组的YWHAE基因作为可替换表达框的定点插入位置，选择在YWHAE基因的三个位点进行可替换表达框的基因定点插入。这三个位点分别是E位点(exon1)，I位点(intron，在外显子3和外显子4之间)和T位点(在YWHAE基因终止密码子后面)，如图1所示。
所插入的可替换表达框包括启动子、两个重组酶识别位点、目的基因以及终止子，本实施例中选择GFP可替换表达框，可替换的表达框从5’端到3’端依次包括CMV启动子、重组酶识别位点FRT、目的基因GFP、重组酶识别位点Loxp、BGH pA终止子；在本实施方式中，所述FRT的序列为GAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTC，所述Loxp的序列为ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT。
如图1所示，利用CRISPR技术和同源重组修复介导的可替换表达框定点插入这个系统需要两个质粒，一个是供体质粒，另一个是CRISPR/Cas9质粒。在供体质粒中，在可替换表达框两边加入了两个限制性核酸内切酶多克隆位点(MCS1和MCS2)，这两个多克隆位点可以使两个同源臂(HR1和HR2)方便的插入到供体质粒中。同源臂是根据基因组插入位点两边附近的序列设计的，大小在1000bp左右。可替换表达框和潮霉素抗性基因表达框放在两个同源臂之间。在可替换表达框内，FRT和LoxP序列在GFP基因周围。当该可替换表达框定点插入到基因组后，目的DNA片段可以通过双RMCE替换掉GFP，从而实现目的DNA的转录和表达。为了检测可替换表达框随机插入事件，我们将一个RFP表达框放到了HR2的后面。如果经过转染、长时间培养后的CHO细胞发出红色荧光，说明该细胞含有随机插入的现象，可通过流式筛选排除这些细胞，以提高获得基因单拷贝细胞的概率。我们分别在5’端和3’端设计了两对交错PCR引物(5’/3’junction PCR primers)，分别是HR1-out&HR1-in，HR2-in&HR2-out。通过这两对引物来检测细胞基因组是否在预设的位点插入了可替换表达框。同时，我们设计了另外两对引物，分别是Random-P1&Random-P2和Random-P3&Random-P4，进一步来鉴定随机插入事件。如果能P出目的条带，说明有随机插入的现象。CRISPR/Cas9质粒包含Cas9蛋白表达框和一个U6启动子启动的sgRNA转录框。20bp的靶向序列可以通过BbsI酶切位点克隆到该质粒中。如果在上述T位点插入表达框，在同源臂的同源重组交换下，上述表达框会替换YWHAE基因终止密码子后面第1320位至第1525位的碱基区域。
CHO-K1细胞与供体质粒和靶向T位点的CRISPR/Cas9质粒共转染，转染后的细胞经过潮霉素的筛选。两周后，长起来的细胞通过流式细胞仪检测，发现有4种细胞，只发GFP荧光的，只发RFP荧光的，GFP和RFP同时发光的及不发荧光的。将只发绿色荧光的细胞分选下来，提取基因组并用5’/3’交错PCR鉴定，结果显示细胞的基因组中都可以扩增出目的条带。分选到的单克隆经过扩增培养，提取基因组，经过5’/3’交错PCR检测，发现克隆株都有阳性目的条带，说明克隆株都在T位点整合了可替换表达框。最终结果显示，我们在T位点获得了具有高表达GFP且表达均一的克隆株，其基因组中的可替换表达框都是单拷贝，可以用于RMCE实验，细胞株命名为CHO-K1-T。
采用同样的方法，我们在E位点和I位点也获得了具有高表达GFP且表达均一的克隆株，其基因组中的可替换表达框都是单拷贝，细胞株分别命名为CHO-K1-E和CHO-K1-I。
实施例3、双重组酶介导的目的基因框式替换
为了检测获得的CHO-K1-T细胞株能否进行双重组酶介导的框式替换及相应的蛋白表达情况(在接下来的实施方式中，CHO-K1-T细胞株也可以用T31还代替)。我们通过RMCE的方式将克隆株里面的GFP基因分别替换成RFP基因，anti-TNF-αScFv抗体基因和anti-HMGB1 ScFv抗体基因。然后通过流式细胞仪将RFP表达或抗体展示的细胞分选下来。分选的细胞经过培养扩增，收集用于流式分析，代表性结果如图2所示。
如图2所示，CHO-K1-T中的GFP基因可以成功的替换成目的基因，表达或展示相应的蛋白而不再继续表达GFP基因。替换成功的细胞提取基因组并设计引物(RMCE-P1/P2)将替换的基因扩增出来测序，结果发现插入的目的基因序列正确。因此证明T位点获得的克隆株可以正确的进行RMCE。
对于E位点和I位点，我们采用相同的方法对CHO-K1-E和CHO-K1-I细胞系克隆株进行了anti-TNF-α抗体基因替换，但在转染后，细胞生长变得缓慢甚至大部分死亡，没有替换成功。流式结果显示，没有对应的细胞团(抗体展示但GFP不继续表达)出现。综合结果说明E位点和I位点不适合可替换表达框的有效替换。
用于抗体亲和力成熟的细胞株在进化过程中需要长时间的培养，因此构建的抗体高表达细胞株需要稳定表达并持续展示在细胞膜表面。为了检测分析T位点的蛋白表达稳定性，我们将插入GFP的CHO-K1-T细胞株和插入anti-TNF-αScFv抗体基因的CHO-K1-T细胞株从液氮冻存状态下复苏并在无抗生素加压筛选的培养基中连续培养6周。每7天就用流式细胞仪检测一次GFP表达水平和抗体展示水平，查看蛋白表达是否稳定。如图3A，第一次检测定义为0天(细胞复苏后第3天)，最后一次检测定义为42天(细胞复苏后第45天)。从流式图中可以看出，在0天和42天，细胞株的GFP表达峰和抗体展示峰都很窄，十分均一，说明T位点是比较好的位点，能够保证CHO-K1-T克隆株表达稳定。每7天的GFP阳性细胞占比和抗体展示阳性细胞占比在折线图3B详细标明。在这7次流式检测中，所有的CHO-K1-T细胞克隆株都是GFP表达阳性，其中第一次和第七次检测中GFP高表达的细胞团占99％以上。T31-TNF细胞株中抗体展示的细胞都占98％以上。因此，我们可以得出结论，在T位点中的基因可以稳定表达至少42天。
实施例4、CHO-K1-T细胞株蛋白表达和展示水平的分析
先前，我们通过随机整合的方式构建了一个细胞株，命名为CHO-puro，该细胞株里包含一个可替换表达框(表达puromycin抗性蛋白)，可以将目的基因替换到预设的位点，实现蛋白高表达(具体可参见中国专利申请201410803422.2)。为了检测CHO-K1-T细胞株的蛋白表达水平能否超过CHO-puro克隆株，我们通过RMCE的方式将CHO-K1-T细胞株里面的GFP基因和CHO-puro里面的puromycin抗性基因替换成GOI(gene of interest)，从而比较GOI的表达水平。我们选择了3个GOI，分别是RFP基因，anti-TNF-αScFv抗体基因和anti-HMGB1ScFv抗体基因。
如图4所示，用RFP基因分别替换掉CHO-K1-T和CHO-puro细胞里面的相应基因。RFP替换质粒pFRL和重组酶表达质粒pF2AC共转染CHO-K1-T细胞和CHO-puro细胞。然后通过流式细胞仪将只发红色荧光的细胞分选下来，分别命名为T31-RFP和Puro-RFP。分选的细胞经过培养扩增，收集用于流式分析和qRT-PCR分析，进而检测RFP的表达水平和mRNA转录水平。如图5A，T31-RFP细胞的RFP荧光强度(73467±1557)显著高于Puro-RFP细胞的RFP荧光强度(18700±200)。T31-RFP细胞的CV值也显著小于Puro-RFP细胞的CV值，说用T31-RFP细胞株蛋白表达更均一。如图5B，T31-RFP细胞中的RFP的转录水平是Puro-RFP细胞的2.3倍。
我们采用相同的方法将anti-TNF-αScFv抗体基因和anti-HMGB1 ScFv抗体基因替换到CHO-K1-T和CHO-puro细胞里面的相应基因。最终获得的细胞分别命名为T31-TNF，Puro-TNF，T31-HMGB1和Puro-HMGB1。经过流式分析和qRT-PCR分析，如图5。T31-TNF细胞的抗体展示水平高于Puro-TNF细胞，T31-TNF细胞的抗体转录水平则显著高于Puro-TNF。T31-HMGB1细胞的抗体展示水平和转录水平都显著高于Puro-HMGB1。除此之外，T31-TNF细胞和T31-HMGB1细胞的CV值也显著低于Puro-TNF细胞和Puro-HMGB1细胞。综合上述，CHO-K1-T细胞株的蛋白展示水平和转录水平都高于CHO-puro细胞，且蛋白表达更均一。
实施例5、CHO-K1-T细胞株AID诱导的突变能力分析
AID诱导的突变效率可以通过一个带有突变GFP(mGFP)的报告质粒来评估。这个mGFP基因中间加入了一个翻译提前终止的TAG终止密码子，TAG周围的序列在不改变氨基酸的情况下突变成AID易识别的序列(hotspot)。当终止密码子TAG被AID突变，单碱基替换变成TAC或TAT后，GFP蛋白将会得到表达并发出荧光。因此我们可以通过这个转换成GFP+的细胞百分比来测量AID的突变效率。
在本发明中，我们将mGFP基因放到CHO-K1-T细胞的T位点和Puro-RFP细胞的随机位点从而替换掉之前的GFP基因或者RFP基因。这样我们可以通过引入AID酶在细胞内检测T位点和随机位点的AID突变效率。我们用交换质粒pFmGFPL和重组酶质粒pF2AC共转染CHO-K1-T细胞和Puro-RFP细胞。转染3天后，收集培养的细胞用来流式检测和分选。如图6A，CHO-K1-T细胞中的GFP阴性细胞和Puro-RFP细胞中的RFP阴性细胞是成功替换成mGFP的细胞，我们将它们分别分选到96孔板中，每个孔一个细胞。分选的单克隆经过培养后提取基因组DNA。从CHO-K1-T GFP阴性克隆中选了8个，从Puro-RFP RFP阴性克隆中选了9个进行PCR鉴定并测序。结果显示，CHO-K1-T GFP阴性克隆中所有的8个，Puro-RFP RFP阴性克隆中的6个在预定位点成功准确的插入了mGFP基因。我们随机各选取了一个进行下一步研究，分别命名为T31-mGFP和Puro-mGFP。因此，我们成功获得了稳定表达mGFP用来检测AID突变效率的细胞模型。该模型细胞中可以表达mGFP的基因存在于CHO-K1-T细胞的T位点或者是CHO-puro细胞的随机位点。T31-mGFP和Puro-mGFP单克隆细胞在6孔板中转染相同量的mAID表达质粒。一天后，转染的细胞接种到10cm盘中，并在G418筛选培养基中培养。转染七天后，细胞通过流式细胞仪来检测GFP表达的情况(图6B)。H31-mGFP细胞中GFP发光的细胞占比是0.0237±0.0015％，Puro-mGFP细胞中GFP发光的细胞占比是0.0120±0.0010％，通过比较，我们发现CHO-K1-T细胞的T位点的AID突变效率显著高于CHO-puro细胞的随机位点。
实施例6、CHO-K1-T细胞株抗体分泌研究
在本实施方式中，将anti-TNF-α单链抗体和Fc片段融合(简称TNF-Fc)构建成可分泌抗TNF-α的抗体质粒。然后将TNF-Fc基因替换掉CHO-K1-T细胞中T位点的GFP基因，构建可分泌抗体的高表达细胞株。我们用交换质粒pFAb1FcL和重组酶质粒pF2AC共转染CHO-K1-T细胞。转染3天后，收集培养的细胞用来流式检测和分选。结果显示，CHO-K1-T细胞中的GFP阴性细胞是成功替换成TNF-Fc的细胞，我们将它们分选到96孔板中，每个孔一个细胞。等细胞长起来后，从96孔板中取上清进行ELISA鉴定。一共分析了94株单克隆。其中荧光读数OD450nm﹤0.1的有5株，2﹤OD450nm﹤3的有2株，OD450nm﹥3的有87株。我们从中挑选了OD450nm最高的12株单克隆，提取细胞基因组进行PCR鉴定，并将PCR产物测序，发现这12株单克隆都在T位点准确整合了TNF-Fc抗体基因。这意味着这12株克隆成功将GFP基因替换成抗体基因，最终构建成可分泌TNF-Fc抗体的克隆株。
为了检测可分泌TNF-Fc抗体克隆株的抗体表达水平，我们选取了一株克隆，命名为S13，并将S13分别以20w个细胞/每孔和30w个细胞/每孔种到6孔板中。20w个细胞/每孔的培养2天收集上清(标记为N1)，30w个细胞/每孔的培养3天收集上清(标记为N2)。然后采用标准曲线法通过ELISA测定分泌的TNF-Fc抗体浓度。标准曲线如图7所示，经ELISA测定，结果如下，N1稀释100倍后，OD450nm＝2.832；N2稀释200倍后，OD450nm＝2.910。经过公式计算得出，N1：抗体浓度为216.8mg/L，Qp为16.5pg/cell/day；N2：抗体浓度为690.6mg/L。这些结果表明我们获得了可分泌抗体的高表达细胞株。而且该细胞株的构建十分简便和快速，可应用于抗体的分泌表达。
本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。
Claims (9)
1.一种可用于蛋白展示和表达的CHO细胞，所述CHO细胞的基因组中整合有表达框，其特征在于，所述表达框包括启动子、第一重组酶识别序列、目的基因、第二重组酶识别序列、终止子，所述表达框替换CHO细胞基因组的YWHAE基因的终止密码子之后的第1320位至第1525位的碱基区域。
2.根据权利要求1所述的可用于蛋白展示和表达的CHO细胞，其特征在于，所述第一重组酶选自重组酶Flpo或iCre，所述第二重组酶选自重组酶Flpo或iCre。
3.根据权利要求2所述的可用于蛋白展示和表达的CHO细胞，其特征在于，所述第一重组酶识别序列选自FRT或Loxp，所述第二重组酶识别序列选自FRT或Loxp。
4.根据权利要求1所述的可用于蛋白展示和表达的CHO细胞，其特征在于，所述启动子选自CMV启动子，所述终止子选自BGH pA终止子。
5.根据权利要求1所述的可用于蛋白展示和表达的CHO细胞，其特征在于，所述目的基因选自荧光标记基因或抗体基因。
6.根据权利要求1所述的可用于蛋白展示和表达的CHO细胞，其特征在于，所述CHO细胞为CHO-K1细胞。
7.权利要求1-6任一所述的可用于蛋白展示和表达的CHO细胞在蛋白展示中的应用。
8.权利要求1-6任一所述的可用于蛋白展示和表达的CHO细胞在蛋白进化或蛋白分泌中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述蛋白进化为抗体进化，所述蛋白分泌为抗体分泌，所述表达框中的目的基因选自抗体基因。
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| 基于AID酶与哺乳动物细胞展示技术的抗PD-1抗体体外进化研究;王师;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20170315;全文 * |
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