CN109468323B - 人工合成的内含子、哺乳动物细胞重组表达载体、哺乳动物宿主细胞、表达方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种人工合成的内含子、哺乳动物细胞重组表达载体、哺乳动物宿主细胞、表达方法及其应用，属于生物技术领域。本发明利用人工合成的内含子，构建哺乳动物细胞重组表达载体，可以增强转录产物的稳定性，进而提高外源基因的表达量，降低哺乳动物细胞重组蛋白的生产成本。

Description

人工合成的内含子、哺乳动物细胞重组表达载体、哺乳动物宿 主细胞、表达方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种人工合成的内含子、哺乳动物细胞重组表达载体、哺乳动物宿主细胞、表达方法及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

重组蛋白在细菌、真核微生物、昆虫细胞等宿主中的表达虽然能获得较高的产量，但是这些表达系统缺少类似于哺乳动物细胞的翻译后蛋白质修饰机制的功能，例如准确的N型糖基化和O型糖基化等，这会导致表达的重组蛋白缺少生物活性或因折叠错误而产生包涵体。与其他系统相比，哺乳动物表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的糖基化等多种翻译后加工功能，正因为这些优势的存在使得表达产物在分子结构、理化性质和生物学功能方面非常接近于天然的高等生物蛋白质分子。

外源蛋白质在哺乳动物细胞中的表达量受很多因素的影响，如表达载体的调控元件、转录和翻译控制因子、转基因拷贝数、mRNA的稳定性、外源基因在染色体上的整合位点、重组蛋白对宿主细胞的潜在毒性和宿主细胞的基因组偏好性等。真核生物基因的内含子在真核生物基因表达调控中起着重要的作用，是转基因研究中提高外源基因表达的重要元件之一。内含子能促进转录的起始或延伸、增加mRNA在核内的稳定性。

申请公布号为CN 105793415A的中国发明专利申请公开了CHO细胞的合成启动子、使用转录因子结合位点模块生产合成启动子的方法，但是目前并未见内含子元件对哺乳动物细胞转基因表达影响的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种人工合成的内含子，该人工合成的内含子可以增强转录产物的稳定性，进而提高哺乳动物宿主细胞中外源蛋白的分泌表达。

本发明还提供一种哺乳动物细胞重组表达载体，该重组表达载体含上述人工合成的内含子，可以提高外源蛋白质的表达水平。

另外，本发明提供一种哺乳动物宿主细胞，该哺乳动物宿主细胞含上述哺乳动物细胞重组表达载体，可以提高哺乳动物宿主细胞中外源蛋白的分泌表达。

此外，本发明还提供一种哺乳动物细胞表达外源蛋白的表达方法，通过该方法能够提高目的蛋白表达水平，降低生产成本。

最后，本发明提供一种人工合成的内含子、哺乳动物细胞重组表达载体、或者哺乳动物宿主细胞在提高哺乳动物细胞重组蛋白表达水平中的应用。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种人工合成的内含子，所述人工合成的内含子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该人工合成的内含子可以成倍提高外源蛋白在哺乳动物细胞的表达量。

一种哺乳动物细胞重组表达载体，所述哺乳动物细胞重组表达载体含有上述人工合成的内含子的核苷酸序列。该哺乳动物细胞重组表达载体可以使EGFP基因表达量提高3～5倍，使阿达木抗体表达量提高1～2倍，进而降低了哺乳动物细胞生产重组蛋白的成本。

上述人工合成的内含子的核苷酸序列位于哺乳动物细胞重组表达载体启动子的下游。内含子是真核基因的外显子间隔序列，因此在构建表达载体时内含子位于启动子下游。

上述哺乳动物细胞重组表达载体启动子为CMV、SV40、EF-1α、CAG中的任意一种。上述启动子是哺乳动物细胞重组表达载体常用的启动子。

一种哺乳动物宿主细胞，所述哺乳动物宿主细胞由上述哺乳动物细胞重组表达载体转染得到。该哺乳动物宿主细胞通过大规模培养可获得高表达量的外源蛋白质。

上述哺乳动物宿主细胞为CHO、HEK293、BHK或SP2/O。所述哺乳动物宿主细胞为研究动物细胞表达系统的常用细胞，其培养方式简单，易于大规模培养。

一种哺乳动物细胞表达外源蛋白的表达方法，包括以下步骤：

(1)构建包含哺乳动物来源蛋白质序列以及如SEQ ID NO.1所示的人工合

成的内含子的核苷酸序列的重组表达载体；

(2)将重组表达载体转入哺乳动物宿主细胞中；

(3)培养步骤(2)中的哺乳动物宿主细胞，表达目的蛋白。

该方法操作简便，成本低，通过该方法获得的目的蛋白表达量成倍提升，还可以增强转录产物的稳定性。

上述的人工合成的内含子、哺乳动物细胞重组表达载体、或者哺乳动物宿主细胞在提高哺乳动物来源蛋白表达量的应用。该应用可以提高外源蛋白的产量。

附图说明

图1为本发明试验例1中人工合成的内含子片段的重组表达载体与对照载体平均EGFP表达量对比图；

图2为本发明试验例2中人工合成的内含子片段的重组表达载体与对照载体平均阿达木表达量对比图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施方式作进一步说明，但不构成对本发明的任何限制。除所列举的实施例外，还可以有其他的实施方式，但是凡采用等同替换或等效变换获得的技术方案，均落在本发明要求的保护范围内。

实施例及试验例中所用的质粒小提试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司(货号：CW0500S)，无缝克隆试剂盒购自碧云天生物技术有限公司(货号：D7010S)，工具酶、培养基等均为市售商品；pIRES-Neo、pEGFP-C1载体购自Clontech生物公司；下述实施例中人工合成的内含子由通用生物基因(安徽)有限公司完成合成；下述实施例、试验例中的宿主细胞均以CHO细胞为例。

人工合成的内含子的实施例

本实施例的人工合成的内含子的核苷酸序列如下所示：

GTGAGTTTGGGGACCCTTGATTGTTCTTTCTTTTTCGCTATTGTAAAATTCATGTTATATGGAGGGGGCAAAGTTTTCAGGGTGTTGTTTAGAATGGGAAGATGTCCCTTGTATCACCATGGACCCTCATGATAATTTTGTTTCTTTCACTTTCTACTCTGTTGACAACCATTGTCTCCTCTTATTTTCTTTTCATTTTCTGTAACTTTTTCGTTAAACTTTAGCTTGCATTTGTAACGAATTTTTAAATTCACTTTTGTTTATTTGTCAGATTGTAAGTACTTTCTCTAATCACTTTTTTTTCAAGGCAATCAGGGTATATTATATTGTACTTCAGCACAGTTTTAGAGAACAATTGTTATAATTAAATGATAAGGTAGAATATTTCTGCATATAAATTCTGGCTGGCGTGGAAATATTCTTATTGGTAGAAACAACTACATCCTGGTCATCATCCTGCCTTTCTCTTTATGGTTACAATGATATACACTGTTTGAGATGAGGATAAAATACTCTGAGTCCAAACCGGGCCCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGATCGAGC。(SEQ ID NO.1)

哺乳动物细胞重组表达载体的实施例

本实施例为含人工合成的内含子的实施例中的内含子重组表达载体的构建，包括以下步骤：

(1)EGFP基因扩增

参照pEGFP-C1载体的Enhanced green fluorescent protein(EGFP)基因序列(GenBank：U55763.1，第613～1410位碱基)设计上游引物P-F和下游引物P-R，引物的5′端分别引入EcoRI、BamHI酶切位点，引物序列如下所示(下划线处为酶切位点)：

P-F：5′-CCGGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3′；

P-R：5′-CTAGGATCCTTACTAGATCCGGTGGATCC-3′。

以pEGFP-C1质粒(购自美国Clontech公司)为模板，使用引物P-F、P-R扩增EGFP基因。PCR反应体系如下表1所示。

表1 PCR反应体系

反应程序：95℃预变性3min；94℃变性40s，58℃退火30s，72℃延伸40s，共30个循环；72℃延伸3min；4℃保存。

琼脂糖凝胶电泳回收PCR扩增产物，纯化后送生物公司测序验证。结果表明，扩增出的DNA片段与GenBank公开的EGFP序列完全一致。

(2)构建含人工合成的内含子的表达载体

采用无缝克隆试剂盒将pIRES-Neo载体的内含子核苷酸序列替换为本发明的人工合成的内含子的实施例中的内含子核苷酸序列(SEQ ID NO.1)构成新的表达载体；用SmaI/PacI酶对新的表达载体进行双酶切验证，酶切体系为：CutSmart Buffer 2μL，先加入SmaI酶0.5μL(浓度10U/μL)，质粒DNA 1.23μL(浓度0.81μg/μL)，补足水至20μL。充分混匀后，25℃孵育3h，再加入BamHI酶0.5μL(浓度10U/μL)，充分混匀后，37℃孵育3h。核酸电泳验证，酶切条带大小正确的质粒，进行测序验证，构建正确的表达载体，命名为pIRES-1。

(3)构建含EGFP序列和表达载体pIRES-1的重组表达载体

用EcoRI/BamHI双酶切EGFP的PCR扩增产物(经测序验证正确的序列)，同时用EcoRI/BamHI双酶切上述表达载体pIRES-1的DNA，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的EGFP序列片段和表达载体pIRES-1的DNA。

EGFP序列的酶切体系为：10×K buffer 2μL，10U/μL EcoRI、BamHI酶各0.5μL，1.289μg/μL EGFP扩增产物0.78μL，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育6h。

表达载体pIRES-1的酶切体系为：10×K buffer 2μL，10U/μL EcoRI、BamHI酶各0.5μL，0.81μg/μL pIRES-1的DNA 1.23μL，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育3h。

用T4连接酶连接酶切后的EGFP序列片段和pIRES-1。

表达载体pIRES-1的连接体系为：2×Quick Ligation Buffer 10μL，pIRES-1的线性DNA 200ng，酶切后的EGFP序列片段87.2ng，350U/μL的T4连接酶1μL，补足水至20μL，16℃连接过夜。

将连接产物加入大肠杆菌(E.coli)JM109感受态细菌悬液中转化，取100μL转化菌液接种在含有氨苄青霉素的LB固体培养板上，37℃培养过夜，挑取单菌落摇菌继代培养。提取细菌质粒并用EcoRI/BamHI双酶切，酶切体系为：10×Kbuffer 2μL，10U/μL的EcoRI、BamHI酶各0.5μL，载体DNA 1.23μL(浓度0.81μg/μL)，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育3h。核酸电泳验证，选取酶切鉴定正确的质粒，进行测序验证，最后获得正确的重组表达载体，命名为pIRES-E1。

哺乳动物宿主细胞的实施例

本实施例哺乳动物宿主细胞的实施例，包括以下步骤：

CHO细胞于37℃、5％CO₂条件下，在含10％灭活胎牛血清的DMEM培养基中培养。在6孔板内接种CHO细胞(3×10⁶/孔)。铺板培养24h后细胞达到约90％融合度，将哺乳动物细胞重组表达载体的实施例中的重组表达载体pIRES-E1转染进入CHO细胞中，转染24h后，用浓度为800μg/mL的G418筛选2周出现阳性克隆时，将浓度为800μg/mL的G418更换为400μg/mL浓度的G418稳定培养1个月，即得哺乳动物宿主细胞CHO。

哺乳动物来源蛋白质的表达方法的实施例

本实施例哺乳动物来源蛋白质的表达方法，包括以下步骤：

(1)构建包含EGFP基因序列以及人工合成的内含子的实施例中的内含子的核苷酸序列的重组表达载体，构建方法和上述哺乳动物细胞重组表达载体的实施例的构建方法相同；

(2)将重组表达载体转染进入哺乳动物宿主细胞CHO中，转染方法和上述哺乳动物宿主细胞的实施例中的转染方法相同；

(3)培养CHO细胞，表达目的蛋白。

人工合成的内含子、哺乳动物细胞重组表达载体、哺乳动物宿主细胞在提高哺乳动物细胞重组蛋白表达水平中的应用的实施例

本实施例重组表达载体pIRES-E1的构建方法与哺乳动物细胞重组表达载体的实施例中重组表达载体pIRES-E1的构建方法完全相同；哺乳动物宿主细胞CHO的转染方法与哺乳动物宿主细胞的实施例中哺乳动物宿主细胞CHO的转染方法完全相同，将转染后的宿主细胞CHO进行流式细胞检测，报告基因EGFP的表达量。

人工合成的内含子的对比例1

本对比例的人工合成的内含子的核苷酸序列如下所示：

GGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTATCGAGC。(SEQ ID NO.2)

人工合成的内含子的对比例2

本对比例的人工合成的内含子的核苷酸序列如下所示：

GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGATCGAGC。(SEQID NO.3)

哺乳动物细胞重组表达载体的对比例1

本对比例采用无缝克隆试剂盒将pIRES-Neo载体的内含子核苷酸序列替换为人工合成的内含子的对比例1中的内含子核苷酸序列(SEQ ID NO.2)构成新的表达载体；用SmaI/PacI酶对新的表达载体进行双酶切验证，取酶切验证正确的载体再进行测序验证，构建正确的表达载体，命名为pIRES-1′。

本对比例的哺乳动物细胞重组表达载体的构建方法同哺乳动物细胞重组表达载体的实施例，仅将pIRES-1替换为pIRES-1′，构建正确的重组表达载体命名为pIRES-E1′。

哺乳动物细胞重组表达载体的对比例2

本对比例采用无缝克隆试剂盒将pIRES-Neo载体的内含子核苷酸序列替换为人工合成的内含子的对比例2中的内含子核苷酸序列(SEQ ID NO.3)构成新的表达载体；用SmaI/PacI酶对新的表达载体进行双酶切验证，取酶切验证正确的载体再进行测序验证，构建正确的表达载体，命名为pIRES-2′。

本对比例的哺乳动物细胞重组表达载体的构建方法同哺乳动物细胞重组表达载体的实施例，仅将pIRES-1替换为pIRES-2′，构建正确的重组表达载体命名为pIRES-E2′。

哺乳动物宿主细胞的对比例1

本对比例的哺乳动物宿主细胞与哺乳动物宿主细胞的实施例中的哺乳动物宿主细胞的区别仅在于，将哺乳动物宿主细胞的实施例中的重组表达载体pIRES-E1替换为哺乳动物细胞重组表达载体的对比例1中的重组表达载体pIRES-E1′。

哺乳动物宿主细胞的对比例2

本对比例的哺乳动物宿主细胞与哺乳动物宿主细胞的实施例中的哺乳动物宿主细胞的区别仅在于，将哺乳动物宿主细胞的实施例中的重组表达载体pIRES-E1替换为哺乳动物细胞重组表达载体的对比例2中的重组表达载体pIRES-E2′。

试验例1

本试验例将哺乳动物细胞重组表达载体的实施例中的重组表达载体pIRES-E1、哺乳动物细胞重组表达载体的对比例1中的重组表达载体pIRES-E1′、哺乳动物细胞重组表达载体的对比例2中的重组表达载体pIRES-E2′分别转染进入CHO细胞，具体步骤如下：

(1)细胞转染

CHO细胞于37℃、5％CO₂条件下，在含10％灭活胎牛血清的DMEM培养基中培养。在6孔板内接种CHO细胞(3×10⁶/孔)。铺板培养24h后细胞达到约90％融合度。试验共分为5组：①正常CHO细胞组；②对照组-转染对照载体pIRES；③转染重组表达载体pIRES-E1；④转染重组表达载体pIRES-E1′；⑤转染重组表达载体pIRES-E2′。以Lip3000

为转染试剂，将各试验组载体转染进入CHO细胞中。

(2)稳定转染细胞系的筛选

转染24h后，再将各试验组载体分别转染培养于24孔板(500μL/well)的CHO细胞中(CHO的细胞个数约为2×10⁶个)，用浓度为800μg/mL的G418筛选2周出现阳性克隆时，将浓度为800μg/mL的G418更换为400μg/mL浓度的G418稳定培养1个月，然后收集各试验组细胞进行流式细胞检测。

(3)EGFP表达检测

流式细胞检测报告基因EGFP的表达量，结果如图1所示，与对照载体pIRES相比，含本发明人工合成的内含子序列的重组表达载体pIRES-E1的EGFP表达量提高了5.2倍，pIRES-E1′表达量提高了3.1倍，pIRES-E2′的EGFP表达量提高了3.7倍。

试验例2

本试验例中阿达木抗体重链或轻链的合成由通用生物基因(安徽)有限公司完成合成。

1、含阿达木抗体的重组表达载体的构建

用EcoRI/BamHI双酶切阿达木重链或轻链序列的PCR扩增产物(经测序验证正确的序列)，同时用EcoRI/BamHI分别双酶切EGFP表达量较好的重组表达载体pIRES-E1对应的表达载体pIRES-1和pIRES-E2′对应的表达载体pIRES-2′的DNA。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的阿达木重链或轻链序列片段和pIRES-1、pIRES-2′的线形质粒DNA。

阿达木重链或轻链序列的双酶切体系为：阿达木重链或轻链序列片段10μL(1μg/μL)，10×NE Buffer 2.1 3μL，EcoRI/BamHI酶(10U/μL)各1.0μL，补足水至30μL；酶切条件为：37℃，酶切3min。

pIRES-1的双酶切体系为：pIRES-1 5μL(1μg/μL)，10×NE Buffer 2.1 2μL，EcoRI/BamHI(10U/μL)各0.5μL，补足水至20μL；酶切条件为：37℃，酶切3min。

pIRES-2′的双酶切体系为：pIRES-2′5μL(1μg/μL)，10×NE Buffer 2.1 2μL，EcoRI/BamHI(10U/μL)各0.5μL，补足水至20μL；酶切条件为：37℃，酶切3min。

取酶切后的阿达木重链或轻链序列片段和pIRES-1、pIRES-2′线形质粒DNA(摩尔比5:1)，使用NEB公司^TM的连接试剂盒，25℃连接5min。将连接产物加入到大肠杆菌(E.coli)JM109菌株感受态细胞悬液中转化，取150μL转化菌液接种到含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜，挑取单菌落继代培养。提取表达载体并进行双酶切(EcoRI/BamHI)验证，取酶切验证正确的载体进行测序验证，最后获得正确的表达载体，含表达载体pIRES-1、pIRES-2′的重组表达载体分别命名为pIRES-P1、pIRES-P2′。

2、细胞转染及稳定转染细胞系的筛选

(1)细胞转染

CHO细胞于37℃、5％CO₂条件下，在含10％灭活胎牛血清的DMEM培养基中培养。在6孔板内接种CHO细胞(3×10⁶/孔)。铺板培养24h后细胞达到约90％融合度。试验共分为4组：①正常CHO细胞组；②对照组-转染对照载体pIRES；③转染重组表达载体pIRES-P1；④转染重组表达载体pIRES-P2′。以Lip3000

为转染试剂，将各试验组载体共转染进入CHO细胞中。

(2)稳定转染细胞系的筛选

载体共转染培养于24孔板(500μL/well)的CHO细胞中(CHO的细胞个数约2×10⁶个)，用浓度为800μg/mL的G418筛选2周，当阳性克隆出现时，换浓度为400μg/mL的G418稳定培养2周后，在120mL摇瓶中悬浮30mL，每毫升接种细胞量为50～60万个，摇床转速设置为120rpm，悬浮培养第7天收集培养液上清。

3、阿达木抗体表达量检测

用ELISA试剂盒检测阿达木抗体表达量。结果见图2，与对照载体相比，本发明的人工合成的内含子对应的重组表达载体pIRES-P1使阿达木抗体的表达量提高了1.7倍，哺乳动物细胞重组表达载体的对比例2对应的重组表达载体pIRES-P2′使阿达木抗体的表达量提高了1.3倍。

<110> 新乡医学院、河南普诺易生物制品研究院有限公司

<120> 人工合成的内含子、哺乳动物细胞重组表达载体、哺乳动物宿主细胞、表达方法及其应用

<160> 5

<170> SIPO Sequence Listing 1.0

<211> 560

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtgagtttgg ggacccttga ttgttctttc tttttcgcta ttgtaaaatt catgttatat 60

ggagggggca aagttttcag ggtgttgttt agaatgggaa gatgtccctt gtatcaccat 120

ggaccctcat gataattttg tttctttcac tttctactct gttgacaacc attgtctcct 180

cttattttct tttcattttc tgtaactttt tcgttaaact ttagcttgca tttgtaacga 240

atttttaaat tcacttttgt ttatttgtca gattgtaagt actttctcta atcacttttt 300

tttcaaggca atcagggtat attatattgt acttcagcac agttttagag aacaattgtt 360

ataattaaat gataaggtag aatatttctg catataaatt ctggctggcg tggaaatatt 420

cttattggta gaaacaacta catcctggtc atcatcctgc ctttctcttt atggttacaa 480

tgatatacac tgtttgagat gaggataaaa tactctgagt ccaaaccggg cccctctgct 520

aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cagatcgagc 560

<211> 949

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggtaagtgcc gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt 60

gccttgaatt acttccacct ggctgcagta cgtgattctt gatcccgagc ttcgggttgg 120

aagtgggtgg gagagttcga ggccttgcgc ttaaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt 180

tgaggcctgg cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg 240

tctcgctgct ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct 300

ttttttctgg caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat ctgcacactg gtatttcggt 360

ttttggggcc gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg 420

gggcctgcga gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc 480

tctggtgcct ggcctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg 540

gtcggcacca gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctg cagggagctc 600

aaaatggagg acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac aaaggaaaag 660

ggcctttccg tcctcagccg tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg cgccgtccag 720

gcacctcgat tagttctcga gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg gggaggggtt 780

ttatgcgatg gagtttcccc acactgagtg ggtggagact gaagttaggc cagcttggca 840

cttgatgtaa ttctccttgg aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt tcattctcaa 900

gcctcagaca gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag gtatcgagc 949

<211> 140

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtaagtatca aggttacaag acaggtttaa ggagaccaat agaaactggg cttgtcgaga 60

cagagaagac tcttgcgttt ctgataggca cctattggtc ttactgacat ccactttgcc 120

tttctctcca cagatcgagc 140

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<221>上游引物P-F

<400> 4

ccggaattca tggtgagcaa gggcgaggag 30

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<221>上游引物P-R

<400> 5

ctaggatcct tactagatcc ggtggatcc 29

Claims (6)

1.一种哺乳动物细胞重组表达载体，其特征在于：所述哺乳动物细胞重组表达载体含有目的基因和如SEQ ID NO.1所示人工合成的内含子的核苷酸序列；所述内含子插入到目的基因的下游；所述目的基因表达EGFP或阿达木抗体；所述重组表达载体的出发载体为pIRES-Neo，将pIRES-Neo载体的内含子核苷酸序列替换为序列如SEQ ID NO.1所示的人工合成的内含子。

2.根据权利要求1所述的哺乳动物细胞重组表达载体，其特征在于：所述哺乳动物细胞重组表达载体启动子为CMV、SV40、EF-1α、CAG中的任意一种。

3.一种哺乳动物宿主细胞，其特征在于：所述哺乳动物宿主细胞由权利要求1或2所述的哺乳动物细胞重组表达载体转染得到。

4.根据权利要求3所述的哺乳动物宿主细胞，其特征在于：所述哺乳动物宿主细胞为CHO、HEK293、BHK或SP2/O。

5.一种哺乳动物细胞表达外源蛋白的表达方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）构建包含哺乳动物来源蛋白质序列以及如SEQ ID NO.1所示的人工合成的内含子的核苷酸序列的重组表达载体；所述内含子插入到哺乳动物来源蛋白质序列的下游；所述哺乳动物来源蛋白质序列表达EGFP或阿达木抗体；所述重组表达载体的出发载体为pIRES-Neo；将pIRES-Neo载体的内含子核苷酸序列替换为序列如SEQ ID NO.1所示的人工合成的内含子；

（2）将重组表达载体转入哺乳动物宿主细胞中；

（3）培养步骤（2）中的哺乳动物宿主细胞，表达目的蛋白。

6.如权利要求1所述的哺乳动物细胞重组表达载体、或者如权利要求3所述的哺乳动物宿主细胞在提高哺乳动物细胞重组蛋白表达水平中的应用。

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