CN117757788A - 3’UTR-4及其在提高蛋白表达量与mRNA疫苗制备中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了3’UTR‑4及其在提高蛋白表达量与mRNA疫苗制备中的应用。本发明公开的3’UTR‑4为序列表中SEQ ID NO.8的第2494‑2558位所示的单链RNA分子。本发明的3’UTR‑4序列构建在萤火虫荧光素酶报告基因及绿色荧光蛋白基因或者编码新冠刺突蛋白的基因的下游后可以明显提高蛋白质的表达量。由此可见，3’UTR‑4序列可以用于蛋白质生产及新型mRNA药物分子设计中，以提高目的蛋白的表达量。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，3’UTR-4及其在提高蛋白表达量与mRNA疫苗制备中的应用。
背景技术
基于中心法则，DNA中的遗传信息通过信使RNA(messenger RNA,mRNA)传递给蛋白。mRNA的表达能力与非编码区(untranslated region，UTR)序列有着紧密的联系，其中3’非翻译区(3’UTR)可通过调节mRNA的稳定性与翻译的效率来调节蛋白质的表达水平。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高蛋白的表达量。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种RNA分子，该RNA分子名称为3’UTR-4，其为下述(a1)或(a2)：
(a1)序列表中SEQ ID NO.8的第2494-2558位所示的单链RNA分子；
(a2)将SEQ ID NO.8的第2494-2558位经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID NO.8的第2494-2558位具有相同功能的单链RNA分子。
上述(a2)中的RNA分子，为与(a1)具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的单链RNA分子。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。
本发明还提供了与3’UTR-4相关的生物材料(记为生物材料1)，所述生物材料1为下述B1)至B3)中的任一种：
B1)转录3’UTR-4的DNA分子；
B2)含有B1)所述DNA分子的重组载体；
B3)含有B1)所述DNA分子的重组微生物、或含有B2)所述重组载体的重组微生物。
上述生物材料1中，B1)所述DNA分子可为SEQ ID NO.7的第2941-3005位。
本发明还提供了一种成套RNA分子，所述成套RNA分子由3’UTR-4与名称为5’UTR的RNA分子组成，所述5’UTR为SEQ ID NO.2的第4-48位或SEQ ID NO.15的第4-73位所示的单链RNA分子。
所述成套RNA分子可用于生产蛋白质、或制备mRNA疫苗。
本发明还提供了一种成套产品，所述成套产品由所述生物材料1和与所述5’UTR相关的生物材料(记为生物材料2)组成，所述生物材料2为下述C1)至C3)中的任一种：
C1)转录所述5’UTR的DNA分子；
C2)含有C1)所述DNA分子的重组载体；
C3)含有C1)所述DNA分子的重组微生物、或含有C2)所述重组载体的重组微生物。
上述成套产品中，：C1)所述DNA分子可为SEQ ID NO.1的第451-495位或SEQ IDNO.14的第451-520位。
所述成套产品可用于生产蛋白质、或制备mRNA疫苗。
本发明还提供了一种一种制备蛋白质的方法，所述方法包括1)或2)：
1)在翻译目的蛋白质的mRNA的3’末端连接3’UTR-4，得到重组RNA；使所述重组RNA表达，即得到目的蛋白质；
2)在翻译目的蛋白质的mRNA的3’末端连接3’UTR-4、5’末端连接所述5’UTR，得到重组RNA；使所述重组RNA表达，即得到目的蛋白质；
3)在目的蛋白质编码基因的3’末端连接转录3’UTR-4的DNA，得到重组DNA；使所述重组DNA表达，即得到目的蛋白质；
4)在目的蛋白质编码基因的3’末端连接转录3’UTR-4的DNA、5’末端连接转录所述5’UTR的DNA，得到重组DNA；使所述重组DNA表达，即得到目的蛋白质。
上述方法1)与2)中，所述使所述重组RNA表达可通过将所述重组RNA转染细胞实现。
转录3’UTR-4的DNA可为SEQ ID NO.7的第2941-3005位。转录所述5’UTR的DNA可为SEQ ID NO.1的第451-495位或SEQ ID NO.14的第451-520位。
在本发明的一个实施例中，所述目的蛋白质为萤火虫荧光素酶(Fireflyluciferase,Fluc)和/或绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)。
在本发明的另一个实施例中，所述目的蛋白质为新冠病毒(SARS-COV-2)刺突蛋白(Spike,S)。
所述细胞可为动物细胞、植物细胞或微生物细胞。所述动物细胞可为哺乳动物细胞，如HEK-293T细胞。
3’UTR-4，或所述生物材料1，或所述成套RNA分子，或所述成套产品的下述任一应用：
X1)在生产蛋白质中的应用；
X2)在制备生产蛋白质产品中的应用；
X3)在制备mRNA疫苗中的应用。
本发明筛选出一条可使目标蛋白大量表达的新型3’UTR序列。此3’UTR序列构建在Fluc报告基因及GFP基因或新冠病毒S蛋白编码序列的下游后可以明显提高蛋白质的表达量，本发明的3’UTR序列在现有的mRNA药物中未见报道，未来可以应用在新型mRNA药物分子设计中。
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
附图说明
图1: (A)线性化质粒检测。质粒pNR021(包含对照3’UTR-BNT)、pNR034(包含3’UTR-1)、pNR035(包含3’UTR-2)、pNR036(包含3’UTR-3)、pNR037(包含3’UTR-4)或pNR038(包含3’UTR-5)与BsaI酶切线性化并回收后的产物通过琼脂糖凝胶电泳分析。(B)加帽后的mRNA序列示意图(上)及琼脂糖凝胶电泳分析结果(下)。不同的加帽后mRNA帽子结构后5’-UTR序列固定为5’UTR-BNT，编码区表达Fluc和GFP蛋白,3’-UTR序列分别为3’UTR-BNT(对照序列)、3’UTR-1、3’UTR-2、3’UTR-3、3’UTR-4或3’UTR-5。
图2: HEK-293T细胞未转染mRNA(mock)或分别转染不同序列的加帽后mRNA：包含阳性对照3’UTR-BNT、3’UTR-1、3’UTR-2、3’UTR-3、3’UTR-4和3’UTR-5。转染16小时后，通过观察绿色荧光的强度来比较GFP的表达量(A)，并检测萤火虫荧光素酶(Fluc)的活性(B)。标尺：200μm；M＝百万(million,106)。
图3: 3’UTR-4对新冠S蛋白表达水平的影响。(A)S蛋白mRNA序列示意图。帽子结构后5’-UTR序列固定为5’UTR-3，编码区表达SARS-CoV-2S蛋白。3’-UTR序列为对照序列3’UTR-BNT或候选序列3’UTR-2及3’UTR-4。(B)线性化质粒检测。质粒pNR043(包含3’UTR-BNT)、pNR053(包含3’UTR-2)或pNR054(包含3’UTR-4)与BsaI酶切线性化并回收后的产物通过琼脂糖凝胶电泳分析。(C)加帽后的mRNA琼脂糖凝胶电泳分析。不同的加帽后mRNA分别包含序列3’UTR-BNT、3’UTR-2或3’UTR-4。(D)3’-UTR序列对S蛋白表达水平的影响。HEK-293T细胞未转染(mock)或转染不同3’-UTR序列的表达S蛋白的mRNA，转染24小时后裂解细胞，并通过蛋白免疫印迹(western blot)检测S蛋白以及内参蛋白α-tubulin的表达水平。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
序列表中，SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.12中的T均表示U，SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19中的T均表示m1Ψ。
实施例1、3’UTR-4可以提高Fluc与GFP的蛋白表达量
本实施例通过生信方法选取5条天然存在的3’UTR序列(分别记为3’UTR-1、3’UTR-2、3’UTR-3、3’UTR-4、3’UTR-5)，并通过实验筛选出有利于上游目的蛋白表达的3’UTR序列。为此，发明人将5条3’UTR序列分别构建在一种可同时表达Fluc和GFP质粒的下游，Fluc和GFP通过自剪切多肽T2A连接成一个开放阅读框,表达的融合蛋白Fluc-T2A-GFP通过蛋白酶切成两个独立的蛋白Fluc和GFP，通过比较荧光素酶催化的化学发光水平和GFP绿色荧光强度获得较优的3’UTR序列。此外，还设置了一条阳性对照3’UTR(BNT162b2(复必泰)3’UTR)，下文记为3’UTR-BNT，其DNA序列为序列表中SEQ ID NO.11的第2935-3229位。
1.线性化质粒模板制备
搭载了Fluc-GFP及候选3’UTR或阳性对照3’UTR的质粒(即pNR034、pNR035、pNR036、pNR037、pNR038、pNR021)由金斯瑞合成，其序列依次为序列表中SEQ ID NO.1、3、5、7、9、11。质粒通过BsaI(近岸蛋白)酶切进行线性化后，用SV Gel and PCR Clean-Up System胶回收试剂盒(Promega)纯化，即得到线性化质粒。质粒及其线性化产物通过琼脂糖凝胶电泳分析，线性化质粒大小与理论值一致(图1中A)。
其中，SEQ ID NO.1为转录Fluc-GFP3’UTR-1mRNA的DNA序列，SEQ ID NO.1的第431-450位为T7启动子序列，第451-495位为5’UTR-BNT的DNA序列，第502-2934位为Fluc-GFP融合蛋白的编码序列，第2941-3013位为3’UTR-1的DNA序列。Fluc-GFP3’UTR-1mRNA的序列为SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.2的第4-48位为5’UTR-BNT的序列，第2494-2566位为3’UTR-1的序列。
SEQ ID NO.3为转录Fluc-GFP3’UTR-2mRNA的DNA序列，SEQ ID NO.3的第431-450位为T7启动子序列，第451-495位为5’UTR-BNT的DNA序列，第502-2934位为Fluc-GFP融合蛋白的编码序列，第2941-3022位为3’UTR-2的DNA序列。Fluc-GFP3’UTR-2mRNA的序列为SEQID NO.4，SEQ ID NO.4的第4-48位为5’UTR-BNT的序列，第2494-2575位为3’UTR-2的序列。
SEQ ID NO.5为转录Fluc-GFP3’UTR-3mRNA的DNA序列，SEQ ID NO.5的第431-450位为T7启动子序列，第451-495位为5’UTR-BNT的DNA序列，第502-2934位为Fluc-GFP融合蛋白的编码序列，第2941-3034位为3’UTR-3的DNA序列。Fluc-GFP3’UTR-3mRNA的序列为SEQID NO.6，SEQ ID NO.6的第4-48位为5’UTR-BNT的序列，第2494-2587位为3’UTR-3的序列。
SEQ ID NO.7为转录Fluc-GFP3’UTR-4mRNA的DNA序列，SEQ ID NO.7的第431-450位为T7启动子序列，第451-495位为5’UTR-BNT的DNA序列，第502-2934位为Fluc-GFP融合蛋白的编码序列，第2941-3005位为3’UTR-4的DNA序列。Fluc-GFP3’UTR-4mRNA的序列为SEQID NO.8，SEQ ID NO.8的第4-48位为5’UTR-BNT的序列，第2494-2558位为3’UTR-4的序列。
SEQ ID NO.9为转录Fluc-GFP3’UTR-5mRNA的DNA序列，SEQ ID NO.9的第431-450位为T7启动子序列，第451-495位为5’UTR-BNT的DNA序列，第502-2934位为Fluc-GFP融合蛋白的编码序列，第2941-3028位为3’UTR-5的DNA序列。Fluc-GFP3’UTR-5mRNA的序列为SEQID NO.10，SEQ ID NO.10的第4-48位为5’UTR-BNT的序列，第2494-2581位为3’UTR-5的序列。
SEQ ID NO.11为转录Fluc-GFP3’UTR-BNT mRNA的DNA序列，SEQ ID NO.11的第431-450位为T7启动子序列，第451-495位为5’UTR-BNT的DNA序列，第502-2934位为Fluc-GFP融合蛋白的编码序列，第2935-3229位为3’UTR-BNT的DNA序列。Fluc-GFP3’UTR-BNTmRNA的序列为SEQ ID NO.12，SEQ ID NO.12的第4-48位为5’UTR-BNT的序列，第2488-2782位为3’UTR-BNT的序列。
pNR034、pNR035、pNR036、pNR037、pNR038、pNR021均能表达SEQ ID NO.13所示的Fluc-T2A-GFP蛋白序列。SEQ ID NO.13的第1-550位为Fluc蛋白的序列，第551-571位为T2A的序列，第572-809位为GFP蛋白的序列。
2.体外转录及加帽
以步骤1所得线性化质粒为模板，依照HiScribe T7 High Yield RNA SynthesisKit(NEB)说明书进行体外转录反应。37℃反应3小时后，加入DNaseI(近岸蛋白)37℃反应15min去除残留DNA模板。反应结束后，通过氯化锂(Thermo)沉淀回收转录后的未加帽的mRNA。最后通过加帽试剂盒Cap 1Capping System(近岸蛋白)进行加帽反应。加帽产物通过氯化锂沉淀回收,得到带Cap1帽的mRNA。
所得Fluc-GFP3’UTR-1mRNA，Fluc-GFP3’UTR-2mRNA，Fluc-GFP3’UTR-3mRNA，Fluc-GFP3’UTR-4mRNA，Fluc-GFP3’UTR-5mRNA，Fluc-GFP3’UTR-BNT mRNA可按照上述方法制备得到，也可以直接合成得到。
为了初步确认mRNA产物的质量，发明人对其进行了琼脂糖凝胶电泳分析。结果显示，加帽后的mRNA产物条带单一，即mRNA质量较高(图1中B)。
3.细胞内荧光素酶及GFP表达量检测
制备好的加帽的mRNA通过MessengerMAXTM(Thermo)转染到HEK-293T细胞，转染16小时后，通过荧光显微镜观察转染mRNA后细胞内绿色荧光强度，并通过ONE-GloTM EX Luciferase Assay System试剂盒(Promega)测定该细胞内荧光素酶活性。
结果显示，转染含有3’UTR-4的mRNA的细胞绿色荧光信号最强(图2中A)。同样，转染含有3’UTR-4的mRNA的细胞内荧光素酶活性最高，是阳性对照3’UTR mRNA(3’UTR-BNT)转染细胞内荧光素酶活性的1.5倍(3.29x106/2.20x106)(图2中B)。。
结合荧光素酶的表达检测结果与GFP的表达观察结果，3’UTR-4可提高上游目标蛋白的表达水平。
实施例2、3’UTR-4可以提高新冠病毒S蛋白的表达量
为了进一步确认3’UTR-4的翻译效率，本实施例进一步分析了阳性对照序列(3’UTR-BNT)、3’UTR-2和3’UTR-4序列对新冠病毒刺突蛋白(Spike,S)的表达水平的影响。所构mRNA示意图见图3中A。
1.线性化质粒模板制备
搭载了S蛋白及候选3’UTR序列的质粒(即pNR043、pNR053和pNR054)由金斯瑞合成及克隆，其序列为序列表中SEQ ID NO.14、16、18。质粒通过BsaI(近岸蛋白)酶切进行线性化后，用SV Gel and PCR Clean-Up System胶回收试剂盒(Promega)纯化，即得到线性化质粒。质粒及其线性化产物通过琼脂糖凝胶电泳分析，线性化质粒大小与理论值一致(图3中B)。
其中，SEQ ID NO.14为转录S 3’UTR-2mRNA的DNA序列，SEQ ID NO.14的第431-450位为T7启动子序列，第451-520位为5’UTR-3的DNA序列，第530-4354位为S蛋白的编码序列，第4361-4442位为3’UTR-2的DNA序列。S3’UTR-2mRNA的序列为SEQ ID NO.15，SEQ ID NO.15的第4-73位为5’UTR-3的序列，第3914-3995位为3’UTR-2的序列。
SEQ ID NO.16为转录S 3’UTR-4mRNA的DNA序列，SEQ ID NO.16的第431-450位为T7启动子序列，第451-520位为5’UTR-3的DNA序列，第530-4354位为S蛋白的编码序列，第4361-4425位为3’UTR-4的DNA序列。S 3’UTR-4mRNA的序列为SEQ ID NO.17，SEQ ID NO.17的第4-73位为5’UTR-3的序列，第3914-3978位为3’UTR-4的序列。
SEQ ID NO.18为转录S 3’UTR-BNT mRNA的DNA序列，SEQ ID NO.18的第431-450位为T7启动子序列，第451-520位为5’UTR-3的DNA序列，第530-4354位为S蛋白的编码序列，第4355-4649位为3’UTR-BNT的DNA序列。S 3’UTR-BNT mRNA的序列为SEQ ID NO.19，SEQ IDNO.19的第4-73位为5’UTR-3的序列，第3908-4202位为3’UTR-BNT的序列。
pNR053、pNR054、pNR043均能表达SEQ ID NO.20所示的S蛋白。
2.体外转录及加帽
以步骤1所得线性化质粒为模板，依照HiScribe T7 High Yield RNA SynthesisKit(NEB)说明书进行体外转录反应，其中尿嘧啶(UTP)替换为1-甲基假尿嘧啶(m1ψ)。37℃反应3小时后，加入DNaseI(近岸蛋白)37℃反应15min去除残留DNA模板。反应结束后，通过氯化锂(Thermo)沉淀回收转率后的未加帽的mRNA。最后通过加帽试剂盒Cap 1CappingSystem(近岸蛋白)进行加帽反应。加帽产物通过氯化锂沉淀回收,得到带Cap1帽的mRNA。
所得S 3’UTR-2mRNA，S 3’UTR-4mRNA，S 3’UTR-BNT mRNA可按照上述方法制备得到，也可以直接合成得到。
为了初步确认mRNA产物的质量，发明人对其进行了琼脂糖凝胶电泳分析。结果显示，加帽后的mRNA产物条带单一(图3中C)。
3.细胞内S蛋白表达量检测
制备好的加帽的mRNA通过Transfection Kit(Mirus)转染到HEK-293T细胞，转染24小时后，通过western blot检测胞内S蛋白的表达水平。S蛋白检测抗体为SARS-COV-2刺突蛋白S1亚基的多克隆抗体SARS-CoV-2(2019-nCoV)Spike Antibody(SinoBiological),内参抗体为α-Tubulin Mouse Monoclonal Antibody(proteintech)。
结果显示与空白对照(Mock)相比，所有样品均检测到了全长S蛋白与S1蛋白亚基。其中3’UTR-2和3’UTR-4表达水平均略高于阳性对照，其中3’UTR-4表达水平更高(图3中D)。
综上，实施例1和实施例2的实验结果表明3’UTR-4可提高上游目标蛋白的表达水平。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (9)
1.RNA分子，为下述(a1)或(a2)：
(a1)序列表中SEQ ID NO.8的第2494-2558位所示的单链RNA分子；
(a2)将SEQ ID NO.8的第2494-2558位经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID NO.8的第2494-2558位具有相同功能的单链RNA分子。
2.与权利要求1所述RNA分子相关的生物材料，为下述B1)至B3)中的任一种：
B1)转录权利要求1所述RNA分子的DNA分子；
B2)含有B1)所述DNA分子的重组载体；
B3)含有B1)所述DNA分子的重组微生物、或含有B2)所述重组载体的重组微生物。
3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：B1)所述DNA分子为SEQ ID NO.7的第2941-3005位。
4.成套RNA分子，由权利要求1所述的RNA分子与名称为5’UTR的RNA分子组成，所述5’UTR为SEQ ID NO.2的第4-48位或SEQ ID NO.15的第4-73位所示的单链RNA分子。
5.成套产品，由权利要求2或3所述的生物材料和与权利要求4中所述5’UTR相关的生物材料组成，所述与所述5’UTR相关的生物材料，为下述C1)至C3)中的任一种：
C1)转录权利要求4中所述5’UTR的DNA分子；
C2)含有C1)所述DNA分子的重组载体；
C3)含有C1)所述DNA分子的重组微生物、或含有C2)所述重组载体的重组微生物。
6.根据权利要求5所述的成套产品，其特征在于：C1)所述DNA分子为SEQ ID NO.1的第451-495位或SEQ ID NO.14的第451-520位。
7.一种制备蛋白质的方法，包括1)或2)：
1)在翻译目的蛋白质的mRNA的3’末端连接权利要求1所述RNA分子，得到重组RNA；使所述重组RNA表达，即得到目的蛋白质；
2)在翻译目的蛋白质的mRNA的3’末端连接权利要求1所述RNA分子、5’末端连接权利要求4中所述5’UTR，得到重组RNA；使所述重组RNA表达，即得到目的蛋白质；
3)在目的蛋白质编码基因的3’末端连接转录权利要求1所述RNA分子的DNA，得到重组DNA；使所述重组DNA表达，即得到目的蛋白质；
4)在目的蛋白质编码基因的3’末端连接转录权利要求1所述RNA分子的DNA、5’末端连接转录权利要求4中所述5’UTR的DNA，得到重组DNA；使所述重组DNA表达，即得到目的蛋白质。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：1)与2)中，所述使所述重组RNA表达通过将所述重组RNA转染细胞实现。
9.权利要求1所述RNA分子，或权利要求2或3所述生物材料，或权利要求4所述成套RNA分子，或权利要求5或6所述成套产品的下述任一应用：
X1)在生产蛋白质中的应用；
X2)在制备生产蛋白质产品中的应用；
X3)在制备mRNA疫苗中的应用。
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