NO323277B1 - Ekspresjonsokende sekvenselementer (EASE) for eukaryote ekspresjonssystemer - Google Patents

Ekspresjonsokende sekvenselementer (EASE) for eukaryote ekspresjonssystemer Download PDF

Info

Publication number
NO323277B1
NO323277B1 NO19983102A NO983102A NO323277B1 NO 323277 B1 NO323277 B1 NO 323277B1 NO 19983102 A NO19983102 A NO 19983102A NO 983102 A NO983102 A NO 983102A NO 323277 B1 NO323277 B1 NO 323277B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
expression
nucleotides
dna
protein
ease
Prior art date
Application number
NO19983102A
Other languages
English (en)
Other versions
NO983102D0 (no
NO983102L (no
Inventor
Arvia E Morris
Chi-Chang Lee
James N Thomas
Original Assignee
Immunex Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Immunex Corp filed Critical Immunex Corp
Publication of NO983102D0 publication Critical patent/NO983102D0/no
Publication of NO983102L publication Critical patent/NO983102L/no
Publication of NO323277B1 publication Critical patent/NO323277B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/30—Vector systems having a special element relevant for transcription being an enhancer not forming part of the promoter region
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Control Of Indicators Other Than Cathode Ray Tubes (AREA)
  • Amplifiers (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Error Detection And Correction (AREA)

Description

OMRADE FOR OPPFINNELSEN
Foreliggende oppfinnelse omfatter DNA-sekvenselementer som øker ekspresjonen av rekombinante proteiner i eukaryote celler.
BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN
Utviklingen av ekspresjonssystemer for produksjon av rekombinante proteiner er viktig for utvikling av en gitt proteinkilde for anvendelse ved forskning eller terapeutisk anvendelse. Ekspresjonssystemer er utviklet for både prokaryote celler, slik som E. coli og for eukaryote celler, deriblant både gjær (dvs. Saccharomyces, Pichia og Kluyveromyces spp) og pattedyrceller. Ekspresjon i pattedyrceller er ofte foretrukket for fremstilling av terapeutiske proteiner, ettersom det er mer sannsynlig at posttranslasjonelle modifiseringer i slike ekspresjonssystemer ligner mer på de funnet hos et pattedyr enn typene av posttranslasjonelle modifiseringer som er til stede i mikrobielle (prokaryote) ekspresjonssystemer.
Transkripsjon av eukaryote gener reguleres ved hjelp av forskjellige cis- og trans-virkende regulatoriske elementer (beskrevet av Dillon og Grosveld, Trends Genet. 9:134; 1993). To av de best karakteriserte cis-elementer er promoterer og enhancere. Promoterer er DNA-sekvenser som ligger umiddelbart 5' i forhold til den kodende sekvens til genet og omfatter flere bindingsseter for trans-virkende transkripsjonsfaktorer, som danner det basale transkripsjonsapparat. Enhancere er også omfattet av flere bindingsseter for trans-virkende transkripsjonsfaktorer, men kan finnes langt oppstrøms eller nedstrøms for kodende sekvenser eller selv i intron. Disse elementer kan også virke på en orienteringsuavhengig måte. Aktivitetene til promoterer og enhancere kan påvises til transiente ekspresjonssystemer og kan inneholde elementer som kan eller kan ikke være spesifikke; de er sårbare for posisjonsvirkninger når de studeres i stabile cellelinjer eller transgene dyr.
En annen kategori av cis-regulatoriske elementer er de som er antatt å regulere kromatinstrukturen, deriblant lokuskontrollområder (LCR) (Grosveld F., et al., Cell 51:975, 1987), matriksbindende områder (MAR; Phi-Van et al., Mol Cell Biol 10:2302; 1980). scaffold-bindende områder (SAR; Gasser og Laemmli, Trends Genet 3:16, 1987), og insulatorelementer (Kellum og Schedl, Cell 64:941, 1991). Disse elementer ligner enhancere ved at de har evnen til å virke over lange avstander, men er unike ved at deres virkning kun er påviselig i stabile transformerte cellelinjer eller transgene dyr. LCR'er er også forskjellig fra enhancere ved at de er posisjons- og orienteringsavhengige, og er aktive på en vevsspesifikk måte. I tillegg er LCR og SAR-sekvenser kjennetegnet ved A-bokser, T-bokser og topoisomerase II-seter, som det ikke er vanlig å finne i en enhancer- eller promotersekvenser. (Gasser og Laemmli, supra/Klehr D., et al. Biochemistry 30:1264, 1991).
Interne ribosominnføringsseter (IRES) er en annen type regulatorisk element som kan finnes i flere viruser og celle-RNA (beskrevet i McBratney et al. Current opinion in cell Biology 5:961, 1993). IRES er anvendbare ved forsterkning av translasjon av et annet genprodukt i en bicistron.eukaryot ekspresjonskassett (Kaufman R.J., et al., Nucleic Acid Res 19:4485, 1991) .
Flere vektorer er tilgjengelige for ekspresjon i pattedyrverter, som ikke holder ulike kombinasjoner av cis- og i enkelte tilfeller trans-regulatoriske elementer for å oppnå høye nivåer av rekombinant protein i løpet av en minimal tidsramme. Til tross for tilgjengeligheten av flere slike vektorer er imidlertid ekspresjonsnivået av et rekombinant protein oppnådd i pattedyrsystemer imidlertid ofte lavere enn det som erholdes med et mikrobielt ekspresjonssystem. Utvikling av en transformert cellelinje som uttrykker høye nivåer av et ønsket protein krever dessuten tidkrevende kloning og amplifisering. Følgelig er det et behov ifølge teknikkens stand for å raffinere og forbedre ekspresjon i pattedyrceller og å identifisere elementet som kan øke ekspresjonen av rekombinante proteiner og fremme anvendelsen av pattedyrceller ved rekombinant proteinproduksjon.
OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN
Nye transkripsjonsregulatoriske sekvenser, ekspresjonsøkende sekvenselementer (EASE) som fremmer høy ekspresjon av rekombinante proteiner i pattedyrvertsceller i løpet av en kort tidsperiode er beskrevet. En utførelsesform av oppfinnelsen omfatter et ekspresjonsøkende sekvenselement (EASE) som fremmer høy ekspresjon av rekombinante proteiner i pattedyrvertsceller i løpet av en kort tidsperiode, som ikke er aktiv i transiente ekspresjonssystemer, som ikke fremviser DNA-karakteristika som koder for et protein og som ikke fremviser nukleotidsekvenskrakteristika funnet i LCR, MAR eller SAR. I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen omfatter et EASE, som ble erholdt fra kinesisk hamsterovarie (CHO)-cellegenomisk DNA, proksimalt for et unikt integreringssete for et rekombinant humant protein.
I en mest foretrukket utførelsesform omfatter oppfinnelsen isolert ekspresjonsøkende sekvenselement (EASE), karakterisert ved at det er utvalgt fra gruppen bestående av DNA omfattende nukleotidene 1 til 14507, nukleotidene 5980 til 14507, nukleotidene 8671 til 14507, nukleotidene 8671 til 10515, nukleotidene 9277 til 10515, nukleotidene 8672 til 12273, nukleotidene 10100 til 14923 i SEKV. ID NR: 1, fragmenter av ovennevnte DNA omfattende nukleotidene 8671 til 9276 i SEKV. ID NR: 1 og med ekspresjonsøkende aktivitet,' DNA som er komplementære til ovennevnte DNA, DNA som er minst ca. 80 % identisk med nukleotidsekvensen til ovennevnte DNA og som har ekspresjonsøkende aktivitet og kombinasjoner av ovennevnte DNA som har ekspresjonsøkende aktivitet. I en utførelsesform er EASE-DNA'et ligert til et DNA omfattende nukleotidene 14290 til 14507 i SEKV. ID NR: 1; alternativt er EASE-DNA'et ligert til et DNA omfattende nukleotidene 12592 til 14507 i SEKV ID NR: 1.
Ekspresjonsvektorer omfattende det nye EASE har evnen til å transformere CHO-celler til å gi høy ekspresjon av rekombinante proteiner. En annen utførelse av oppfinnelsen omfatter således en ekspresjonsvektor omfattende et EASE. I en foretrukket utførelsesform omfatter ekspresjonsvektoren dessuten en eukaryot promoter/enhancer som driver ekspresjonen av et protein av interesse. I en mest foretrukket utførelsesform omfatter ekspresjonsvektoren et dicistront plasmid hvori et første ekson koder for genet av interesse og et annet ekson koder for en amplifiserbar dominerende selekterbar markør. En foretrukket markør er dihydrofolatreduktase (DHFR); andre amplifiserbare markører er også egnet for anvendelse i ekspresjonsvektorene ifølge oppfinnelsen. Ekspresjonsvektorene kan dessuten omfatte en ØRRET-sekvens mellom de to eksonene.
Pattedyrvertsceller kan transformeres med ekspresjonsvektorene ifølge oppfinnelsen og vil således produsere store mengder av rekombinant protein i løpet av en kort tidsperiode. Følgelig tilveiebringer en annen utførelsesform av oppfinnelsen en pattedyrvertscelle transformert med ekspresjonsvektoren ifølge oppfinnelsen. I en mest foretrukken utførelsesform er vertscellene CHO-celler.
Oppfinnelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte for å erholde et rekombinant protein omfattende transformasjon av en vertscelle med en ekspresjonsvektor ifølge oppfinnelsen, dyrking av den transformerte vertscelle under betingelser som fremmer ekspresjon av proteinet og utvinning av proteinet. I en foretrukket anvendelse av oppfinnelsen utvelges transformerte vertscellelinjer ved hjelp av to seleksjonstrinn, det første for å selektere for celler som uttrykker den dominerende amplifiserbare markør og det andre trinn for høye ekspresjonsnivåer og/eller amplifisering av markørgenet i tillegg til genet av interesse. I en mest foretrukken utførelsesform er seleksjons- eller amplifikasjonsmiddelet metotrexat, en hemmer av DHFR som er vist å forårsake amplifisering av endogene DHFR-gener og transfekterte DHFR-sekvenser.
Dessuten tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for identifisering av ytterligere ekspresjonsøkende sekvenselementer, f.eks. fra andre transformerte cellelinjer, slike cellelinjer vil gi høye ekspresjonsnivåer som ikke skyldes høyt genkopiantall. Teknikkene ifølge oppfinnelsen vil være anvendbare for identifisering og isolering av slik EASE i tillegg til EASE til stede i ikke-transformerte celler (f.eks. ved hjelp av hybridiseringsstudier eller sekvensanalyser).
KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE
Figur 1 viser innskudd av forskjellige lengder avledet fra 2A5-3-CHO-genomisk DNA. Figur IA er et restriksjonskart av TNFrFc-integrasjonssete klonet inn i en kloningsvektor, AFixII, som beskrevet i eksempel 1; restriksjonsseter anvendt for subkloning er vist. Innskuddet tilsvarer nukleotidene 1 til 14507 i SEKV. ID NR: 1. Figur IB oppsummerer innskuddene som er klonet inn i pGEMl, avledet fra fagklonen vist i figur IA, som beskrevet i eksempel 7. Den tykke sorte linjen er CMV-promoteren, boksen med prikker er den tredelte adenovirusledersekvensen, de skraverte boksene på venstre side er det TNFrFc-kodende område og det mindre skraverte område er sekvensen som koder for DHFR. Relativt til SEKV. ID NR: 1 tilsvarer innskuddet i PG8.5 nukleotidene 5980 til 14507; det i PG5.7 tilsvarende nukleotidene 8671 til 14507; det i PG5.7AS tilsvarer nukleotidene 8671 til 10515 ligert til nukleotidene 12592 til 14507; det i PG.2SE1.8 tilsvarer nukleotidene 8671 til 10515 ligert til nukleotidene 14290 til 14507; det i PG.2SH1.2 tilsvarer nukleotidene 9277 til 10515 ligert til nukleotidene 14291 til 14507; det i PG.2.2 tilsvarer nukleotidene 12269 til 14507; og innskuddet i PG.2 tilsvarer nukleotidene 14290 til 14507.
DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN
Søkeren har isolert og definert nye sekvenselementer som kan øke ekspresjonen av rapportproteiner to til åtte ganger i stabile celleforråd når de settes inn i en ekspresjonsvektor. Et slikt sekvenselement ble identifisert ved kloning av integreringssete til en unik ekspresjonskassett som kodet for rekombinant dimert tumornekrosefaktorreseptor/immunglobulin-Fc-fusjonsprotein (TNFrFc) fra genomisk DNA fra en cellelinje som uttrykker dette protein i en stor mengde. Sekvenselementene ifølge oppfinnelsen ser ut til å kode for en ny funksjon, ettersom den ekspresjonsforsterkende aktivitet ikke ligner tidligere karakteriserte cis-virkende elementer, slik som promoterer, enhancere, lokuskontrollområder, scaffold-bindende områder eller matriks-bindende områder. I tillegg ser det ut til at sekvenselementene ikke inneholder noen åpne leserammer (ORF), noe som gjør det usannsynlig at de koder for et nytt trans-aktivatorprotein. Søkeren kaller disse nye sekvenselementer for "ekspresjonsøkende sekvenselementer"
(EASE).
Fysiologisk og funksjonell karakterisering av EASE
EASE-aktivitet ble påvist i 14,5kb av CHO-genomisk DNA 5' for en unikt integrasjonssete for TNFeFc-kodende sekvenser fra genomet fra en cellelinje som uttrykker dette protein i et stort nivå (kalt 2A5-3). Ekspresjonsvektorer inneholdende dette isolerte 14,5kb område og kortere fragmenter derav hadde evnen til å transformere DXBll-CHO-celler til å gi høye ekspresjonsnivåer av rekombinante proteiner i en sekvens på >50 %. Kartleggingsstudier viste, at >50 % av aktiviteten var lokalisert i et l,8kb område i DNA'et, fra nukleotid 8671 til nuklebtid 10515 i SEKV. ID NR: 1. I tillegg ser det ut til at en sekvensnukleotid 8671 til nukleotid 9276 i SEKV. ID NR: 1 (604bp EcoRl til Hpal-fragment) ut til å være viktig for aktivitet, ettersom ekspresjonsforsterkningen reduseres kraftig dersom dette område ikke er til stede i vektoren. EASE ifølge oppfinnelsen kan øke ekspresjonen av et rekombinant protein drevet av et promoter/enhancerområde til hvilket det er bundet.
Dessuten kan ytterligere fragmenter fra 14,5kb CHO genomisk DNA som fremviser EASE-aktivitet identifiseres som beskrevet heri, det kan også lignende EASE-motiver fra andre celletyper eller fra andre integreringsseter i transformerte celler. I tillegg er det kjent ifølge teknikkens stand at påfølgende prosessering av DNA-fragmenter fremstilt ved hjelp av restriksjonsenzymkløyving kan resultere i fjerning av ytterligere nukleotider fra endene av fragmentene. DNA-fragmentene beskrevet ifølge oppfinnelsen omfatter således også fragmenter som slutter innen fem basepar fra nukleotidene som er oppramset.
Andre kombinasjoner av fragmentene beskrevet heri kan også utvikles, f.eks. sekvenser som omfatter flere kopier av EASE beskrevet heri, eller sekvenser avledet ved kombinering av foreliggende EASE med andre nukleotidsekvenser for å oppnå optimale kombinasjoner av regulatoriske elementer. Slike kombinasjoner kan bindes kontinuerlig eller arrangeres for å tilveiebringe optimal avstand mellom EASE og andre regulatoriske områder. Likeledes kan orienteringen til et EASE i en vektor optimaliseres for å tilveiebringe høye proteinekspresj onsnivåer.
EASE beskrevet heri ble isolert fra kinesisk hamsterovarie (CHO)-celler. Det er forventet at homologe ekspresjonsøkende elementer er til sted fra andre pattedyrarter i tillegg til i cellelinjer avledet fra andre vevstyper, som kan isoleres ved hjelp av teknikker som er vel kjent ifølge teknikkens stande, f.eks. ved hjelp av hybridiserings- eller PCR-baserte teknikker på tvers av arter. I tillegg kan forandringer gjøres i nukleotidsekvensen vist i SEKV. ID NR: 1 ved hjelp av setedirigert eller tilfeldige mutageneseteknikker som er kjent ifølge teknikkens stand. De resulterende EASE-varianter kan så testes med hensyn til EASE-aktivitet som beskrevet heri. DNA som er minst ca. 80 % identisk, mer foretrukket minst 90 % identisk, i nukleotidsekvens med SEKV. ID NR: 1 eller fragmenter med EASE-aktivitet kan isoleres ved hjelp av vanlige forsøk og er forventet å ha EASE-aktivitet. For EASE-fragmenter refererer prosentvis likhet seg til andelen likhet sammenlignet med den native referansesekvens som er funnet i EASE-fragmentet. Følgelig er også EASE-homologer og EASE-varianter omfattet av oppfinnelsen.
Uttrykket av rekombinante proteiner drives av en egnet eukaryot promoter/enhåncer og EASE ifølge oppfinnelsen.
Celler transfekteres med et plasmid som er selektert under lav stringens med hensyn til den dominerende selekterbare markør og selekteres så på ny ved høyere stringens, f.eks. ved anvendelse av metotrexat (MTX), en hemmer av DHFR i seleksjonsmediet. Den første seleksjonen gir positive transformanter (dvs. DHFR<+->transformanter med hensyn til metotrexat-seleksjonen), og den andre seleksjon i transformanter som uttrykker høye nivåer av genet av interesse.
Innføring av en IRES-sekvens inn i vektorene inneholdende et EASE kan være fordelaktig for å fremme ekspresjon av enkelte proteiner. IRES-sekvensen ser ut til å stabilisere uttrykket av genet av interesse under høyt seleksjonspress (Kaufman et al. 1991, supra). For proteiner som prosesseres godt av cellen er EASE-sekvensen ikke nødvendig for å oppnå høye ekspresjonsnivåer.
Cellepopulasjoner som uttrykker høye nivåer av rekombinant protein kan utvikles i løpet av fem til seks uker ved anvendelse av en totrinns seleksjonsfremgangsmåte som beskrevet heri. Det absolutte høye ekspresjonsnivå vil variere med det enkelte protein, avhengig av hvor godt proteinet prosesseres av cellen. Søkeren har observert stabile celleforråd som uttrykker minst ca. 0,2ug/l0<6> celler/dag, og i mange tilfeller mer enn ca. 12ug/l0<6> celler/dag ved anvendelse av ulike cytokiner og cytokine reseptorer. Tiden som kreves for å oppnå dette proteinekspresjonsnivå var nesten halvparten av det som ble observert for lignende transformasjoner utført ved anvendelse av vektorer uten EASE. Videre er celleforråd utstyrt med EASE stabile over tid og kan behandles som cellelinjer for de fleste formål. Kloningstrinn kan forsinkes til senere i utviklingsprosessen enn det som er vanlig for rekombinante proteiner. Med et ytterligere kloningstrinn er det mulig å utvikle cellelinjer som uttrykker mer enn ca. 24ug/10<6 >celler/dag.
Transfeksjonsforsøk viste at EASE funnet i disse DNA-sekvenser har enkelte karakteristika til tidligere beskrevne cis-virkende elementer, men faller ikke inn under tidligere beskrevne definisjoner. I likhet med LCR-, MAR- og SAR-sekvenser påvises ikke EASE-aktivitet ved transiente analyser. Til forskjell fra disse sekvenser er det sjelden å finne elementer som A-bokser T-bokser eller topoisomerase to-seter i EASE (Klehr et al., supra). Ettersom EASE-aktivitet ikke påvises ved transiente analyser ser disse også ut til å være forskjellig fra promoter- og enhancerelementer som påvises ved disse metoder.
Ekspresjon av rekombinante proteiner
Rekombinante ekspresjonsvektorer omfatter syntetisk eller cDNA-avledede DNA-fragmenter som koder for proteinet operativt bundet til egnede transkripsjonene eller translasjonene regulatoriske elementer avledet fra pattedyr-, virus- eller insektgener. Slike regulatoriske elementer omfatter en transkripsjonen promoter, en sekvens som koder for egnede mRNA ribosomale bindingsseter og sekvenser som kontrollerer termineringen av transkripsjon og translasjon, som beskrevet i detalj nedenfor. Pattédyrekspresjonsvektorer kan også omfatte utranskriberte elementer slik som en replikasjonsorigo, en egnet promoter og enhancer bundet til genet som uttrykkes eller andre 5' eller 3' flankerende utranskriberte sekvenser, 5' eller 3' utranslaterte sekvenser, slik som nødvendige ribosombindingsseter, et polyadenyleringssete, spleisedonor og -akseptorseter og transkripsjonene termineringssekvenser. Et replikasjonsorigo som overfører evnen til replikasjon i en vert og et selekterbart gen for å fremme påvisning av transformanter kan også innføres.
DNA-områder er operativt bundet når de er funksjonelt knyttet til hverandre. F.eks. er DNA for et signalpeptid (sekretorisk leder) operativt bundet til DNA for et polypeptid dersom det uttrykkes som en forløper som deltar i sekresjonen av polypeptidet; en promoter er operativt bundet til en kodende sekvens dersom den kontrollerer transkripsjonen av sekvensen; eller et ribosombindende sete er operativt bundet til en kodende sekvens dersom det er posisjonert slik at translasjon tillates. Generelt menes det med operativt bundet tilstøtende og når det gjelder sekretoriske ledere, tilstøtende og i leseramme.
De transkripsjonene og translasjonene kontrollsekvenser i ekspresjonsvektorer som anvendes ved tranformasjon av vertebrate celler kan tilveiebringes ved hjelp av viruskilder. F.eks. er vanlig anvendte promoterer og enhancere avledet fra polyoma, adenovirus 2, apevirus 40 (SV40) og human cytomegalovirus. Virale genomiske promoterer, kontroll- og/eller signalsekvenser kan anvendes for å drive ekspresjonen, forutsatt at slike kontrollsekvenser er kompatible med den valgte vertscelle. Vektorer kan f.eks. konstrueres som beskrevet av Okayama og Berg { Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983). Cellulære promoterer som ikke stammer fra virus kan også anvendes (dvs. p-globin og EF-la-promoterer), avhengig av celletype hvorved det rekombinante protein uttrykkes av.
DNA-sekvenser avledet fra SV40 virusgenom, f.eks. SV40 replikasjonsorigo, tidlig og sen promoter, enhancer, splice og polyadenyleringsseter kan anvendes for å tilveiebringe de andre genetiske elementer som er krevet for ekspresjon av en heterolog DNA-sekvens. De tidlige og sene promoterer er særlig anvendbare ettersom disse lett kan erholdes fra viruset i form av et fragment som også inneholder SV40-virusreplikasjonsorio (Fiers et al., Nature 273:113, 1978). Mindre eller større SV40-fragmenter kan også anvendes forutsatt at sekvensen på omtrent 250 bp, som strekker seg fra Hind-III-sete til Bg/I-sete lokalisert i virusreplikasjonsorigo er inkludert.
Dicistrone ekspresjonsvektorer anvendt for ekspresjon av flere transkripter er beskrevet tidligere (Kim S.K. og Wold B.J. Cell 42:129, 1985; Kaufman et al. 1991, supra). pCAVDHFR er et derivat av pCD302 (Mosley et al Cell 1989) inneholdende den kodende sekvens for DHFR fra mus (Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1:854, 1981). pCDE-vektoren er en avledning av pCAVDHFR inneholdende det murine encefalomyokarditt-virus interne ribosomale innføringssete (nukleotidene 260 til 824; Jang og Wimmer, Genes and Dev. 4:1560, 1990) klonet mellom den tredelte adenoviruslederen og den kodende DHFR-cDNA-sekvens. Andre typer ekspresjonsvektorer kan også anvendes i kombinasjon med EASE ifølge oppfinnelsen, f.eks. de beskrevet i U.S. patent 4 634 665 (Axel et al.) og 4 656 134 (Ringold et al.).
Vertsceller
Transformerte vertsceller er celler som er transformert eller transfektert med ekspresjonsvektorer som er konstruert ved anvendelse av rekombinante DNA-teknikker og som inneholder sekvenser som koder for rekombinante proteiner. Uttrykte proteiner vil fortrinnsvis være sekretert i kultursupernatanten, avhengig av valgt DNA, men kan deponeres i cellemembranen. Ulike pattedyrcelledyrkningssystemer kan anvendes for å uttrykke rekombinante proteiner. Eksempler på egnede pattedyrvertscellelinjer omfatter C0S-7-linjene fra apenyreceller, beskrevet av Gluzman (Cell 23:175, 1981), og andre cellelinjer med evnen til å uttrykke en egnet vektor, deriblant f.eks. CV-l/EBNA (ATCC CRL 10478), L-celler, C127, 3T3, kinesisk hamsterovarie (CHO), HeLa og BHK-cellelinjer.
En vanlig anvendt cellelinje er DHFR-CHO-celler som er autotrofe med hensyn til glysin, tymidin og hypoxantin og som kan transformeres til DHFR+-fenotypen ved anvendelse av DHFR-cDNA som en amplifiserbar dominerende markør. En slik DHFR"-CHO-cellelinje, DXB11, ble beskrevet av Urlaub og Chasin { Proe. Nati. Acad. Sei. USA 77:4216, 1980). Andre cellelinjer utviklet for spesifikk seleksjon eller amplifikasjonssystemer vil også være anvendbare med EASE.
Fremstilling av transformerte pattedyrceller
Flere transformasjonsmetoder er kjent ifølge teknikkens stand og er beskrevet i Kaufman, R.J., Meth. Enzymology 185:537 (1988). Den valgte transformasjonsmetode vil være avhengig av vertscelletypen og egenskapene til genet av interesse og kan velges ut fra forsøksrutine. De grunnleggende behov for enhver slik fremgangsmåte er først å introdusere DNA som koder for proteinet av interesse inn i en egnet vertscelle og så å identifisere og isolere vertscellene som har innført det heterologe DNA på en stabil måte slik at det kan uttrykkes.
En vanlig valgt fremgangsmåte for introduksjon av heterologt DNA er kalsiumfosfatpresipitering, f.eks. som beskrevet av Wigler et al. { Proe. Nati. Acad. Sei. USA 77:3567, 1980) . DNA som er introdusert inn i en vertscelle ved hjelp av denne fremgangsmåte gjennomgår sjelden rearrangering, noe som gjør denne fremgangsmåte anvendbar for kotransfeksjon av uavhengige gener.
Polyetylenindusert fusjon av bakterieprotoplaster med pattedyrceller (Schaffner et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 77:2163, 1980) er en anvendbar fremgangsmåte for introduksjon av heterologt DNA. Protoplastfusjonsfremgangsmåter gir sjelden flere kopier av plasmid-DNA'et som er integrert inn i pattedyrvertscellegenomet; denne teknikk krever imidlertid at seleksjons- og amplifikasjonsmarkøren er på samme plasmid som genet av interesse.
Elektroporering kan også anvendes for å introdusere DNA direkte inn i cytoplasmaet til en vertscelle, f.eks. som
beskrevet av Potter et al. { Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81:7161, 1988) eller Shigekawa og Dowér { BioTechniques 6:742, 1988). Til Forskjell fra protoplastfusjon trenger ikke seleksjonsmarkøren og genet av interesse å være på samme plasmid ved elektroporering.
I den senere tid er flere reagenser som er anvendbare for introduksjon av heterologt DNA inn i pattedyrceller beskrevet. Disse omfatter "Lipofektin" reagens og "Lipofektamin"-reagens (Gibco BRL. Gaithersburg, MD. Begge disse reagenser er kommersielt tilgjengelige reagenser anvendt for å danne lipid-nucleinsyrekomplekser (eller liposomer) som, når anvendt i dyrkede celler, letter opptak av nukleinsyren inn i cellene.
En fremgangsmåte for amplifisering av genet av interesse er også ønskelig for ekspresjon av det rekombinante protein og omfatter vanligvis anvendelse av en seleksjonsmarkør, beskrevet i Kaufman, R.J., supra). Motstandsdyktighet mot cytotoksiske medikamenter er kjennetegnende de som oftest anvendes som en seleksjonsmarkør og kan være resultatet av enten et dominerende trekk (dvs. kan anvendes uavhengig av vertscelletype) eller et resisivt trekk (dvs. anvendbar i spesifikke vertscelletyper som mangler aktiviteten det selekteres for). Flere amplifiserbare markører er egnet for anvendelse i ekspresjonsvektorene ifølge oppfinnelsen (f.eks. som beskrevet i Maniatis, Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1989; S 16.9-16.14)
Anvendbare selekterbare markører for genamplifisering i medikamentresistente pattedyrceller er vist i tabell 1 i Kaufman, R.J., supra, og omfatter DHFR-MTX-resistens, P-glykoprotein- og multippel medikamentresistens (MDR), ulike lipofile cytotoksiske midler (dvs. adriamycin, colchicin, vincristin) og adenosindeaminase (ADA)-Xyl-A eller adenosin og 2'-deoksykoformycin.
Andre dominante selekterbare markører omfatter mikrobielt avledede antibiotikaresistensgener, f.eks. neomycin, kanamycin eller hygromycinresistens. Disse seleksjonsmarkører er imidlertid ikke vist å være amplifiserbare (Kaufman, R.J., supra). Flere egnede seleksjonssystemer eksisterer for pattedyrverter (Maniatis supra, s 16.9-16.15. Ko-transfeksjonsfremgangsmåter ved anvendelse av to dominante selekterbare markører er også beskrevet (Okayama og Berg, Afol. Cell Biol. 5:1136, 1985).
Ved en særlig anvendbar seleksjons- og amplifikasjonsmetode gjøres det anvendelse av DHFR-MTX-resistens. MTX er en hemmer av DHFR som er vist å forårsake amplifisering av endogene DHFR-gener (Alt F.W., et al., Journal of Biological Chemistry 253:1357, 1978) og transfekterte DHFR-sekvenser (Wigler M., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 77:3567, 1980) . Celler transformeres med DNA inneholdende genet av interesse i en ekspresjonskassett, bundet eller ubundet til DHFR-genet i en annen ekspresjonskassett. De to genene kan også være i en dicistron ekspresjonsenhet (Kaufman et al, 1991 supra og Kaufman R.J., et al., EMBO J 6:1987). Transformerte celler dyrkes i medium inneholdende suksessivt høyere mengder av MTX, noe som fører til høyere ekspresjon av DHFR-genet, i tillegg til genet av interesse.
Anvendbare regulatoriske elementer, beskrevet tidligere, kan også innføres i plasmidene som anvendes for å transformere pattedyrceller. Den valgte transformasjonsmetode og elementene utvalgt for anvendelse deri vil være avhengig av anvendt vertscelletype. Fagfolk på området kjenner til flere ulike fremgangsmåter og vertsceller og kan velge et egnet system for ekspresjon av et ønsket protein, basert på kravene ved celledyrkningssystemene.
Den relevante kjente teknikk ved alle referanser beskrevet heri er spesifikt innført méd referanse. Følgende eksempler er ment å illustrere spesifikke utførelsesformer og ikke å begrense rammen av oppfinnelsen.
EKSEMPLER
Eksempel 1; Screening av genomisk bibliotek og subkloning En transformert CHO-cellelinje (kalt 2A5-3-cellelinjen) som uttrykket høye nivåer av et immunglobulin-Fc-fusjonsprotein omfattende det ekstracellulære domene av reseptoren for tumornekrosefaktor på 80 Kd (TNFrFc; Mohler et al., J". Immunol. 151:1548, 1993; U.S. patent 5 395 760, innlevert 7. mars 1995, begge innført med referanse) ble utvalgt for fremstilling av et genomisk bibliotek ettersom Southern blot analyser indikerte at det høye uttrykket av TNFrFc-ekspresjon observert for denne cellelinje drives av et enkelt innskudd av en ekspresjonskassett som koder for TNFrFc. DNA ble isolert fra disse celler, partielt kløyvd med Mbol og klonet inn i en lambda, FIX II-kloningsvektor (Stratagene custom genomic library; Stratagene La Jolla, CA) for å danne et bibliotek. p80 TNF-reseptorkodende sekvens, sammen med 14,4kb av cellulære flankerende sekvenser ble klonet fra biblioteket som beskrevet nedenfor.
For å screene biblioteket ble omtrent 2xl0<4 >plakkdannende enheter (pfu) tillatt å dannes per 250cm plate. Plakk ble overført til nitrocellulosemembraner (Schleicher og Schuell, Keene, NH) og lysert ved anvendelse av standard metoder supplert av stratagen. Filtrene ble hybridisert med tilfeldig primede Noti PvuII DNA-fragment som kodet for en celleoverflatedel av p80 TNF-reseptor ekstracellulært domene (Mohler et al. supra) . Hybridiseringer ble utført ved 63°C i hybridiseringsbuffer [(10 X Denhardts oppløsning (maniatis supra, s 9.49), 0,05M Tris pH 7,5, IM NaCl, 0,1 % natriumpyrofosfat, 1 % SDS, 4ug/ml laksesperma DNA]. Filtere ble vasket på følgende måte: innledningsvis vask i 0,1 % SDS, 0,1 % SSC (maniatis supra, B.13) ved 42 °C i 30 minutter, etterfulgt av to ytterligere vasker i samme oppløsning i 60 minutter ved 63 °C. De to siste vasker var ved 63 °C i 60 minutter ved anvendelse av 0,1 % SDS og 0,01 % SSC. En enkel positiv rekombinant klon ble identifisert etter screening av ca. 4xl0<5> rekombinanter. Denne klon, som ble kalt 2A5-3 A, ble anvendt for all senere analyse. Nukleotidsekvensen til CHO-genomisk DNA fra denne klon er vist i SEKV. ID NR: 1. 2A5-3 X ble deponert i American Type Culture Collection, Rockville MD, under betingelsene ifølge Budapest traktaten 4. januar 1996 med aksesjonsnr. 97411.
Eksempel 2; Southern blotting
Genkopiantall ble målt ved anvendelse av Souther blot teknikk. Totalt celle-DNA fra den egnede cellelinje ble fremstilt ved anvendelse av tidligere beskrevne fremgangsmåter (Mitchell P.J., et al. Mol Cell Biol 6:425, 1986). Etter kløyving av DNA med egnede enzymer under betingelser beskrevet av produsenten (New England Biolabs, Beverley, MA, eller Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) ble DNA kjørt på en 1 % TAE (tris-acetatbufret) agarose gel, f.eks. som beskrevet i (Maniatis supra, s. 6.20) Etter elektroforese ble DNA overført til zetaprob-filtere og hybridisert under betingelser anbefalt av produsenten (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). Filtere ble vasket med 0,1 % SDS og 0,1XSSC tre ganger i 30 minutter hver. Den første vask ble utført ved 37 °C og de etterfølgende vasker ble utført ved 63 °C. Prober ble fremstilt ved anvendelse av tilfeldig primingsett (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). For blot ble TNFr-sekvenser påvist ved anvendelse av samme probe som beskrevet for bibliotekscreeningen. Likeledes vil prober avledet fra området med DNA som koder for ethvert annet protein av interesse (eller fragment derav) vil være anvendbart i en Southern blot teknikk for å måle genkopiantall.
Eksempel 3; Vevskultur
Dihydrofolatreduktase (DHFR)-manglende kinesisk hamsterovarie (CHO)-celler DXB11 (Chasin og Urlaub, supra)-celler ble opprettholdt i Dulbeccos minimalessensielle medium og F12 (DMEM:F12) supplert med 7,5 % føtalt bovint serum (FBS; Hyclone, Logan, UT; eller Sigma, St. Louis, MO), 2mML-glutamin, 90uM tymidin (T), 90uM hypoksantin (H) og 120uM glysin (G). For DHFR-seleksjonsstudier og metotrexatseleksjoner ble celler dyrket i DMEM:F12 som manglet GHT og tilført 7,5 % dialysert FBS, 6mM L-glutamin og ImM asparagin. For metotrexatseleksjoner ble metotrexat (MTX; Lederle Laboratories, Pearl River, NY) tilført til seleksjonsmediet i egnede konsentrasjoner. Når neomycinseleksjonen ble anvendt ble 400ug/ml G418 (Gibco, Grand Island, NY) tilført mediet. Cellene ble transfektert ved anvendelse av kalsiumfosfattransfeksjon (Wigler et al. supra) eller "Lipofectamin"-transfeksjon som anbefalt av produsenten (Gibco BRL, Gaithersbourg, MD).
Eksempel 4: Enzymbundet immunabsorpsjonanalyse ( ELISA)
Produksjon av rekombinante proteiner kan måles ved hjelp av enhver analyse egnet for påvisning av det ønskede protein, deriblant bindingsanalyser, inhiberingsanalyser og biologiske analyser. En særlig anvendbar analyse er antistoff-sandwich enzymbundet immunabsorpsjonsanalyse (ELISA), som er vel kjent ifølge teknikkens stand (f.eks. tilpasninger av teknikkene beskrevet i Engvall et al., Immunochem. 8:871, 1971 og i U.S. patent 4 703 004). Ved denne analyse immobiliseres et første antistoff som er spesifikt for et protein av interesse
(vanligvis et monoklonalt antistoff) på et substrat (som oftest en mikrotiterplate med 96 brønner), deretter tilsettes en prøve inneholdende proteinet og inkuberes. En fortynningsserie av en kjent proteinkonsentrasjon tilføres også og inkubere for å gi en standardkurve. Etter et vasketrinn for å fjerne ubundete proteiner og andre bestanddeler tilsettes et annet antistoff mot proteinet. Det andre antistoffet er rettet mot en annen epitope på proteinet og kan enten være et monoklonalt antistoff eller et polyklonalt antistoff.
Et konjugerende reagens omfattende et antistoff som binder til det andre antistoffet konjugert til et enzym, slik som pepperrotperoksidase (HRP) tilsettes, enten etter det andre vasketrinnet for å fjerne ubundet protein eller samtidig med at det andre antistoffet tilsettes. Etter en tilstrekkelig inkuberingsperiode fjernes ubundet konjugatreagens ved hjelp av vasking og en fremkallingsoppløsning inneholdende substratet for enzymkonjugatet tilsettes platen, noe som forårsaker utvikling av farge. Optisk tetthetsavlesninger ved riktig bølgelengde gir numeriske verdier for hver brønn. Verdiene for prøven sammenlignes med standardkurveverdiene, noe som fører til at nivåene til det ønskede protein kvantifiseres.
For å kvantifisere trimer CD40-ligand ble en CD40L ELISA ved anvendelse av to monoklonale antistoffer (MAb) utviklet. Et antistoff ble rettet mot et oligomeriserende zipperdomene til stede på det timere protein og det andre antistoff ble rettet mot den humane CD40-liganddelen av molekylet. Det første MAb ble absorbert på plater over natten og peroksidasen (HRP) konjugert til det andre antistoff ble tilsatt etter et vasketrinn. Ved flere forsøk ble mengder mellom 0,78 og 50 ng/ml CD40L påvist.
En lignende ELISA ble anvendt for å kvantifisere rekombinant humant tumor nekrosefaktor-reseptorfusjonsprotein (TNFrFc) ved denne ELISA ble to monoklonale antistoffer mot ulike epitoper av TNFrFc anvendt. Igjen ble det første MAb absorbert på plater over natten og peroksidasen (HRP) konjugert til det andre antistoff ble tilsatt etter et vasketrinn. Ved flere forsøk ble mengder mellom 0,78 og 50 ng/ml TNFrFc påvist.
For påvisning av rekombinant Flt-3-ligand (FLt-3L) ble noe forskjellig ELISA anvendt, der det ble anvendt et monoklonalt antistoff og et polyklonalt antiserum fra kanin. Som beskrevet tidligere ble MAb absorbert på plater over natten, en oppløsning inneholdende både det polyklonale anti-Flt-3L og peroksidasen (HRP) konjugert til det andre antistoff (eselantikaninimmunglobulin) tilsatt etter det første vasketrinn for å fjerne ubundete proteiner. Ved flere forsøk ble mengder mellom 1,56 og 100 ng/ml Flt-3L påvist.
Eksempel 5; Sekvensering og databasesøk.
DNA ble sekvensert ved anvendelse av "shotgun"-sekvensering som beskrevet tidligere (Bankier, Meth Mol Biol 23:47, 1993) eller "primer walking" ved anvendelse av ABI Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing-settet på en automatisert DNA-sekvenserer (modell 373a; Applied Biosystems, Foster City, CA). 2A5-3 A.-DNA ble karakterisert ved utførelse av flere ulike typer dataanalyser.
(a) Sammensettnings analyse
2Af-3-A-sekvensen ble skannet for å finne områder med et stort innhold av A+T ved anvendelse av en kombinasjon av tre dataprogrammer tilgjengelige fra Wisconsin^Package fra Genetics Computer Group (Program Manual for Wisconsin Package, versjon
8, september 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) Kalt SIMPLIFY, WINDOW og STATPLOT. For å søke etter områder med høyt A+T-innhold ble et rullende vindu .på 50 basepar rullet over 2A5-3-A-sekvensen med økning på et basepar og den prosentvise andel av A+T innen vinduet ble plottet. Områder av interesse var de med et gjennomsnittlig A+T-innhold over 70 %. Et område med >200 basepar med >70 % A+T-innhold ble funnet mellom de to Swal-setene (nukleotidene 10517 til 12591 i SEKV. ID NR: 1). Dette område så ikke ut til å være viktig for EASE-aktiviteten (se eksemplene 7 og 8).
(b) Transkripsjonsøkende motiver
Et søk etter tre kjente transkripsjonsøkende motiver ved anvendelse av GCG-programmotiver: "Topo-II"
[GTNWAYATTNATNNR], "T-boks" [ATATTT/AATATT], og "A-boks"
[AATAAAYAAA] (Klehr et al. supra). Dette program skanner over en sekvens på en lineær måte for å finne eksakte likheter til hvert spesifisert angitt motiv. For hvert motiv ble
degenereringer angitt med symboler ved anvendelse av navnsettingsreglene til International Union of Biochemistry (IUB). Ingen "topo-II-bokser" ble funnet i 14,5kb av CHO-DNA i 2A5-3-A-DNA'et. To "A-bokser" og 26 "T-bokser" ble funnet spredt ut over dette CHO-DNA-område. Ingen av disse motiver ble funnet i EcoRl til Hpal-fragmentet med antatt EASE-aktivitet.
(c) Sekvensdatabasesøk etter likhet
Databasesøk av genbank DNA-sekvensdatabaser og swissprot og PIR-proteinsekvensdatabaser ble utført ved anvendelse av BLAST-algoritmen fra Altschul et atl (J". Mol. Biol. 215:403; 1990). Denne algoritme var optimalisert for å finne segmenter med lokal likhet uten innsetting av gap i oppstillingen. BLAST-søk i både 2A5-3-A-DNA-sekvensen og en dynamisk proteintranslasjon i alle seks leserammen viste ingen signifikante likheter med noen kjente transkripsjons-aktiveringssekvenser.
(d) Analyse av kodende sekvens
Dataprogrammet GRAIL (Uberbacher, E.C., og Mural, R.J., Proe. Nati Acad. Sei. USA 88:11261; 1991) et nøytralt nettverk basert på gen-gjenkjenningssystemer ble anvendt for å skanne 2A5-3-A-sekvensen for mulige kodende områder. Et GRAIL-søk evaluerer det kodende potensiale til en DNA-sekvens innen et rullende vindu på 100 bp. For å unngå skjevhet ble søk for potensielle kodende områder utført både med og uten hensyn til ytterligere genomiske trekk (f.eks. spleiseforeninger og translasjonsstarter). Resultatene av GRAIL-søkene indikerte ingen områder med høyt proteinkodende potensiale innen 2A5-3 A-sekvensen.
Eksempel 6; Ekspresjon av proteiner ved anvendelse av klonede sekvenser
Formålet med dette forsøk var å bestemme om omliggende sekvenser til TNFrFc-integreringssetet i CHO-cellelinjen 2A5-3 kunne gi høy ekspresjon av dette protein når den var tilfeldig integrert i DXBll-celler. Dette integrasjonssete ble klonet som beskrevet i eksempel 1 og DXBll-CHO-celler ble kotransfektert med enten 5ug 2A5-3 A-DNA eller 5 ug av et kontrollplasmid, og lug pSV3NE0 (denne ekspresjonsvektor inneholder G418-resistensmarkørgenet avledet fra SV40-promoteren)-DNA ved anvendelse av kalsiumfosfat-tr ans f ormas jon. Kontrollceller ble transformert med en ekspresjonsvektor for TNFrFc kalt pCAVDHFRpSO bestående av CMV-promotor-enhanceren som driver ekspresjon av en dicistron, der det første intron er en sekvens som TNFrFc og det andre intron koder for murin DHFR. pCAVDHFRp80 er plasmidet som ble anvendt for å konstruere 2a5-3-cellelinjen. Etter en 48 timers restitusjonsperiode ble celler delt 1:3 eller 1:2 i 10 cm skåler med medium inneholdende 400 ug/mg G418. Etter syv til ni dagers seleksjon i G418-inneholdende medium ble resistente kolonier påvist og 24 forråd inneholdende en til tre kolonier ble selektert og sådd på plater med 24 brønner.
Når cellene nådde konfluens ble mediet byttet til medium som manglet GHT for å selektere for DHFR+-celler. Åtte av de dobbeltselekterte forråd ble analysert med hensyn til spesifikk produktivitet av TNFrFc ved hjelp av ELISA som beskrevet i eksempel 5, og det ble funnet at 40 % av forrådene hadde ekspresjonsnivåer på 75 % eller høyere sammenlignet med den opphavlige cellelinje (se tabell 1 nedenfor).
<*>1: Opphavelig cellelinje (positiv kontroll); ;2-9: celleforråd transformert med 2A5-3-A; ;10-12: celleforråd transformert med CAVDHFRTNFrp80 (negativ kontroll) ;<*>BR: under målbar verdi
Tre av disse forråd ble målt i 10 omganger og det ble funnet at ekspresjonen forble høyere eller lik det til den opphavelige cellelinje, som vist i tabell 2 nedenfor.
Dette eksperiment ble repetert ved å gjøre en andre kotransfeksjon og lignende resultater ble erholdt. Ved begge kotransfeksjonsforsøk ble en reduksjon i spesifikk produksjon ettersom forrådene ble overført observert, mest sannsynlig som følge av det faktum at i den blandende cellepopulasjon av forråd overgrodde raskere groende celler som produserte lavere mengder av rekombinant protein i saktere voksne celler som produserte mer. Selv ved reduksjonen i spesifikk produksjon oppretthold alle celleforråd produksjonsnivåer som var høyere eller lik den til opphavelige cellelinje. Resultatene viste at 2A5-3A-DNA-innskudd kan gi ekspresjon av et indikatorprotein som er i nærheten av den opphavelige cellelinje i en høy frekvens (>40 %) ved tilfeldig integrering inn i DXB11-CH0-celie-DNA.
Eksempel 7: Identifisering av fragmenter med EASE- aktivitet
I en annen serie kotransfeksjonsforsak ble det påvist at kortere segmenter av 2A5-3-A-DNA kunne gi høy ekspresjon av rekombinante proteiner, men med lavere frekvens enn 2A5-3-A. Ulike deler av faginnskuddet ble subklonet inn i bluescriptll (Strategene, La Jolla, CA) eller pGEM-llZf(-) (Promega, Madison, WI) for sekvensering og restriksjonskartlegging, ved anvendelse av vanlige restriksjonsenzymkutteteknikker og legering (se figur 1). For proteinekspresjonsstudier ble ulike innskudd avledet fra fagklonen vist i figur IA og subklonet inn i pGEMl (Promega Madison, WI). Restriksjonsseter anvendt for subkloning er indikert i restriksjonskartet vist i figur IA.
DXBllCHO-celler ble transfektert med 0,2ug TNFrFc-kodende sekvenser for hvert TNFrFc ekspresjonsplasmid og 0,lug pSV3neo ved anvendelse av "Lipofectamin"-reagenset (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Etter en periode på 48 timer ble cellene delt 1:4 eller 1:40 i G418 selektivt medium. Kolonier ble synlige etter en periode på 7-10 dager, på dette tidspunkt ble mediet byttet til -H eller -GHT DHFR-selektivt medium. Etter seleksjonen i 10-13 dager i DHFR-selektivt medium ble forråd på 1-3 kolonier plukket og dyrket i 24 brønnersplater. Det ble tatt prøver av kulturene ved konfluens og høyekspresjonsfrekvensen ble målt (see tabell 3). Det ble funnet at høy ekspresjon kunne oppnås med vektorer inneholdende minst et EcoRl til Swal fragment på 2,8kb, 3,9kb fra CMV-promotoren og en sekvens på l,9kb umiddelbart 5' for DMC-promoteren (PG5.7AS). Plasmider inneholdende større mengder av innskudd (PG8.5 og PG5.7) var også effektive med hensyn til å øke ekspresjonen.
Et lignende sett av ekspresjonsplasmider omfattende DNA som koder for den ekstracellulære del av Flt-3-ligand (Lyman et al., Blood 83:2795, 1994 og USSN 08/242,545, 5 innlevert 11. mai 1994) ble fremstilt og testet som beskrevet ovenfor. Som observert for TNFrFc kunne høye ekspresjonsnivåer oppnås med PG5.7AS-vektoren, men ikke med PG2.2-vektoren eller PG.2-vektoren. Resultatene fra disse forsøk viste at høy frekvens av høyrekombinant proteinekspresjon er ikke proteinspesifikk og at EcoRl til Swal-båndet på l,8kb er essensielt for denne aktivitet.
Ytterligere fragmenter ble behandlet og testet med hensyn til ekspresjonsøkende aktivitet. Konstruksjonen PG3.6 omfattende et EcoRI-fragment representert av nukleotidene 8672 til 12273 i SEKV. ID NR: ble ligert til nukleotidene 14290 til 14507 på en lignende måte som konstruksjonene PG.2SE1.8 og PG.2SH1.2. En lignende konstruksjon ble også fremstilt fra et Bbsl-fragment representert ved nukleotidene 10100 til 14293 i SEKV. ID NR: 1. Begge disse konstruksjoner viste ekspresjonsøkende aktivitet, som var sammenlignbar med den til konstruksjonen PG5.7. En konstruksjon kalt PG3.8 bestående av et BamHI-fragment (nukleotidene 2221-5984) ligert til nukleotidene 14290 til 14507 i SEKV. ID NR: 1 viste ingen aktivitet.
Resultatene av disse forsøk viste at området av 2A5-3- A-DNA med ekspresjonsøkende aktivitet ligger primært mellom nukleotidene 5980 (BamHI-sete i figur 1) og 14290 (Bbsl-sete i figur 1). Ytterligere forsøk ved anvendelse av SV40-promoter/enhanceren viste at ekspresjonsøkende aktivitet ikke var promoteravhengig. I tillegg ble også EASE-inneholdende konstruksjoner introdusert med hell inn i celler ved hjelp av elektroporering og disse viste ekspresjonsøkende aktivitet. Ekspresjonsøkende aktivitet ble imidlertid ikke observert når EASE-inneholdende konstruksjoner ble transfektert inn i en apecellelinje (noe som tyder på muligheten av enten arts- eller celletypespesifisitet for EASE i SEKV. ID NR: 1.
Eksempel 8: Sammenligning av spesifikk produktivitet
For mer nøyaktig å kvantifisere uttrykket fra kloner transfektert med plasmider inneholdende kortere lengder av integreringssete-DNA og sammenligning av disse med kloner avledet fra transfeksjon med fag-DNA ble den spesifikke produktivitet av de tre høyest uttrykkende forråd transformert med PG5.7ASTNFrFc-konstruksjonen og de tre høyest uttrykkende forråd transformert med fag-DNA'et sammenlignet (tabell 4). I dette forsøk ble det funnet at ekspresjonsnivået for alle seks forråd ikke var signifikant forskjellig ved sammenligning ved anvendelse av en standard T-test(p=0,14).
Disse resultater sammen med frekvensdata vist i tabell 3 tyder på at PG5.7AS-vektoren inneholder all sekvensinformasjon som er nødvendig for høynivåekspresjon.
Eksempel 9; Karakterisering av EASE
For ytterligere karakterisering av den ekspresjonsøkende aktivitet funnet i de 2A5-3-A-avledede ekspresjonsvektorer ble en kolonidannende analyse utført. Her ble 0,16ug DHFR-kodende sekvenser fra plasmidene PG8.5, PG5.7AS,OG.2SE1.8, PG.2SH1.2 og PG.2 transfektert inn i DXB11-celler ved anvendelse av "Lipofectamin". Etter en 48 timers ekspresjonsperiode ble celler utplatet med en lxlO<4 >celler/plate i -GHT-medium inneholdende ulike konsentrasjoner MTX. Etter ni til elleve dager ble platene fiksert med metanol og farget med metylenblått for kolonidannelse. Større kolonidannelse ble påvist med plasmidene PG8.5, PG5.7AS og PG.2SE1.8 sammenlignet med plasmidene PG.2SH1.2 og PG.2-plasmid ved OnM og 10nM MTX (se tabell 5).
Disse data indikerer at EcoRl til Swal-fragmentet på l,8kb i PG.2E1.8 er viktig for EASE-funksjonen. Dessuten er Hpal til EcoRl-fragmentet på 0,6kb i dette område viktig for EASE-aktivitet (sammenligning av resultatene med PG.2SH1.2 og PG.2). Plasmider med lengre lengder av CHO-genomisk DNA, dvs. PG8.5 og PG5.7AS ga større kolonidannelse ved økt selektivt press (25nM og 50 nM MTX) ved sammenligning med plasmid PG.2SE1.8. Denne forskjellige kolonidannelse ved høyere selektivt press tyder på at tilstedeværelsen av lengre områder av CHO-genomisk DNA i plasmid gir høyere frekvens av høyekspresjon enn kortere områder av CHO-genomisk DNA.
Eksempel 10; Transient ekapresjonsanalyser Transient ekspresjonsanalyser ble utført for å bestemme om den ekspresjonsøkende aktivitet virker i likhet med en klassisk enhancer eller promoter, noe som kan øke ekspesjonen i transient uttrykt ikke-kromosomalt DNA. Plasmid PG8.5 og plasmid PG2.2, der den første er vist å ha EASE-aktivitet, mens den siste ikke hadde dette (som vist i eksempel 7), ble transient transfektert inn i CHO-celler ved anvendelse av en "Lipofectamin"-teknikk som beskrevet tidligere. Etter 48 timer ble supernatanter oppsamlet og testet med hensyn til TNFrFc-uttrykk ved anvendelse av ELISA som tidligere beskrevet. I motsetning til det stabile ekspresjonseksperiment i eksempel 7 ga disse to plasmider samme ekspresjonsnivå av rekombinant TNFrFc i den transiente ekspesjonsanalyse (se tabell 6).
Disse data viste at EASE-funksjonen krever kromosomal integrering som er forskjellig fra tidligere kjente enhancere og/eller promotere.
Eksempel 11; Reduksjon av tid som kreves for proteinproduksjon
Flt-3L ble uttrykt i CHO-celler ved anvendelse av tre ulike ekspresjonsvektorer, pCDE (se "ekspresjon av rekombinante proteiner"), PG.5.7 og PG5.7I. Vektoren PG5.7I er et derivat av PG5.7 som inneholder IRES fra murin encefalomyokarditisvirus klonet mellom den tredelte adenoviruslederen og DHFR-cDNA i PG5.7. DXBll-CHO-celler ble transfektert med de tre Flt-3L-ekspresjonsplasmidene beskrevet ovenfor ved anvendelse av "Lipofectamin"-metoden og selektert for DHFR-uttrykk i -GHT-medium. DHFR<+->kolonier ble så samlet og utplatet i OnM, 25nM, 50 nM og lOOnM MTX og tillatt å gro til konfluens hvorved tidsspesifikke produktiviteter av forråd transfektert med hver konstruksjon ble bestemt. Ekspresjonen fra hver konstruksjon var lik på hvert MTX-nivå, imidlertid var tiden som var krevet for fullføring av analysen kun fire til fem uker for celleforråd laget med PG5.7I-vektor sammenlignet med syv til åtte uker som var krevet for pCDE og PG5.7-vektoerene.
Denne trend (å erholde lignende ekspresjonsnivåer over kortere tidsperioder når EASE er til stede) er observert med mange ulike proteiner, minst tre uttrykt i pCDE-vektoren og mer en seks uttrykt i PG5.71-vektoren. Generelt tar det to til fem uker kortere tid å produsere rekombinant protein ved anvendelse av ekspresjonsvektorer inneholdende.EASE- og IRES-sekvenser sammenlignet med lignende ekspresjonsvektorer inneholdende IRES-sekvensen alene. Dessuten er celleforrådene utviklet med EASE mer stabile over tid og kan behandles som cellelinjer for de fleste formål. Det var mulig å forsinke kloningstrinn inntil mye senere i utviklingsprosessen noe som ga en betydelig fordel for å erholde store mengder rekombinante proteiner i løpet av en kort tidsperiode.
Eksempel 12; Anvendelse av EASE ved
ekspresjon i produksjonsskala
Rekombinant HuCD40L ble uttrykt i CHO-celler for fremstilling ved anvendelse av PG5.71-vektoren. Her ble DNA som kodet for en trimer form av huCD40L klonet inn i PG5.7I-vektoren og DNA fra det resulterende CD40L ekspresjonsplasmid ble transfektert inn i CHO-celler ved anvendelse av "Lipofectamin". Celler ble først selektert for DHFR<+->fenotypen, så samlet og selektert i 5OnM MTX. Celler som vokste i 50 nM MTX ble klonet ved anvendelse av en soft agarkloningsmetode (Gibson et al., BioTechniques 15:594, 1993). Atten kolonier ble plukket og screenet med hensyn til spesifikk produktivitet av huCD40L og to cellelinjer ble selektert for
suspensjonstilpasning og produksjonsrunder i
bioreaktormedsatstilføring. Under to produksjonsrunder på 10 og.
8 dager der det ble anvendt i hvert tilfelle en av cellelinjene (50-B4-linjen) ga cellene en gjennomsnittlig spesifikk produktivitet på henholdsvis ca. 24 og 25 ug/106 celler/dag. De endelige titere var 1,02 og 1,09 g/L ved ELISA for henholdsvis 10 dagers runder og 8 dagers runder. Dette eksempel viser at anvendelse av denne vektor ved produksjonsutvikling utgjorde en forbedring ifølge teknikkens stand ettersom høye nivåer av rekombinant proteinekspresjon ble oppnådd i et skalerbart format med minimum av screening (18 cellelinjer ble screenet) og seleksjonstrinn (to trinn).

Claims (17)

1. Isolert ekspresjonsøkende sekvenselement (EASE), karakterisert ved at det er utvalgt fra gruppen bestående av DNA omfattende nukleotidene 1 til 14507, nukleotidene 5980 til 14507, nukleotidene 8671 til 14507, nukleotidene 8671 til 10515, nukleotidene 9277 til 10515, nukleotidene 8672 til 12273, nukleotidene 10100 til 14923 i SEKV. ID NR: 1, fragmenter av ovennevnte DNA omfattende nukleotidene 8671 til 9276 i SEKV. ID NR: 1 og med ekspresjonsøkende aktivitet, DNA som er komplementære til ovennevnte DNA, DNA som er minst ca. 80 % identisk med nukleotidsekvensen til ovennevnte DNA og som har ekspresjonsøkende aktivitet og kombinasjoner av ovennevnte DNA som har ekspresjonsøkende aktivitet.
2. EASE ifølge krav 1, karakterisert ved at den er utvalgt fra gruppen bestående av DNA som i det vesentlige omfatter nukleotidene 1 til 14507, nukleotidene 5980 til 14507, nukleotidene 8671 til 14507, nukleotidene 8671 til.10515, nukleotidene 9277 til 10515, nukleotidene .8672 til 12273 og nukleotidene 10100 til 14923 i SEKV. ID NR: 1.
3. EASE ifølge krav 2, karakterisert ved at det er ligert til et DNA omfattende nukleotidene 14290 til 14507 eller nukleotidene 12592 til 14507 i SEKV. ID NR: 1.
4. Ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den omfatter EASE ifølge krav 1.
5 . Ekspresj onsvektor, karakterisert ved at den omfatter EASE ifølge krav 2.
6. Ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den omfatter EASE ifølge krav 3.
7. Ekspresjonsvektor ifølge krav 6, karakterisert ved at den er et dicistront. plasmid hvori et første ekson koder for et protein av interesse og et annet ekson koder for en amplifiserbar, dominant, selekterbar markør.
8. Ekspresjonsvektor ifølge krav 7, karakterisert ved at den amplifiserbare dominant selekterbare markør er dihydrofolatreduktase (DHFR).
9. Ekspresjonsvektor ifølge krav 8, karakterisert ved at den dessuten omfatter en interne ribosominnføringsseter IRES-sekvens mellom de to eksonene.
10. Kinesisk hamster ovarie(CHO)-celle, karakterisert ved at den er transformert.med en ekspresjonsvektor ifølge krav 7.
11. CHO-celle, karakterisert ved at den er transformert med en ekspresjonsvektor ifølge krav 8.
12. CHO-celle, karakterisert ved at den er transformert med en ekspresjonsvektor ifølge krav 9.
13. Fremgangsmåte for å erholde et rekombinant protein, karakterisert ved at den omfatter dyrkning av en transformert vertscelle ifølge krav 10 under betingelser som fremmer ekspresjon av proteinet, og utvinning av proteinet.
14. Fremgangsmåte for å erholde et rekombinant protein, karakterisert ved at den omfatter dyrkning av en transformert vertscelle ifølge krav 11 under betingelser som fremmer ekspresjon av proteinet, og utvinning av proteinet.
15. Fremgangsmåte for å erholde et rekombinant protein, karakterisert ved at den omfatter dyrkning av en transformert vertscelle ifølge krav 12 under betingelser som fremmer ekspresjon av proteinet, og utvinning av proteinet.
16. Et stabilt forråd av CHO-celler, karakterisert ved at de er transformert med en ekspresjonsvektor ifølge ethvert av kravene 7, 8 eller 9.
17. Fremgangsmåte for å erholde et rekombinant protein, karakterisert ved at den omfatter dyrkning av et stabilt forråd av CHO-celler ifølge krav 16 under betingelser som fremmer ekspresjon av proteinet, og utvinning av proteinet.
NO19983102A 1996-01-11 1998-07-03 Ekspresjonsokende sekvenselementer (EASE) for eukaryote ekspresjonssystemer NO323277B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US58650996A 1996-01-11 1996-01-11
PCT/US1997/000483 WO1997025420A1 (en) 1996-01-11 1997-01-10 Expression augmenting sequence elements (ease) for eukaryotic expression systems

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO983102D0 NO983102D0 (no) 1998-07-03
NO983102L NO983102L (no) 1998-09-08
NO323277B1 true NO323277B1 (no) 2007-02-26

Family

ID=24346030

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO19983102A NO323277B1 (no) 1996-01-11 1998-07-03 Ekspresjonsokende sekvenselementer (EASE) for eukaryote ekspresjonssystemer

Country Status (14)

Country Link
US (3) US6027915A (no)
EP (1) EP0873405B1 (no)
JP (1) JP3495375B2 (no)
KR (1) KR19990077015A (no)
AT (1) ATE275628T1 (no)
AU (1) AU708981B2 (no)
CA (1) CA2241174C (no)
DE (1) DE69730592T2 (no)
DK (1) DK0873405T3 (no)
ES (1) ES2227669T3 (no)
NO (1) NO323277B1 (no)
NZ (1) NZ330926A (no)
PT (1) PT873405E (no)
WO (1) WO1997025420A1 (no)

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6596514B2 (en) * 1996-01-11 2003-07-22 Immunex Corporation Expression augmenting sequence elements (EASE) for eukaryotic expression systems
DK0873405T3 (da) * 1996-01-11 2005-01-17 Immunex Corp Ekspressionsforøgende sekvenselementer (EASE) til eukaryote ekspressionssystemer
EP0951551B9 (en) 1996-12-23 2012-12-26 Immunex Corporation Ligand for receptor activator of nf-kappa b, ligand is member of tnf superfamily
US6521419B1 (en) 1998-09-22 2003-02-18 Kanakaraju Koduri Expression vectors containing hot spot for increased recombinant protein expression in transfected cells
US6800457B2 (en) 1998-09-22 2004-10-05 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors containing hot spot for increased recombinant protein expression in transfected cells
ES2252070T3 (es) * 1999-10-13 2006-05-16 Immunex Corporation Vectores y procedimientos para la expresion de proteinas recombinantes.
JP2003535037A (ja) 1999-12-23 2003-11-25 ザイモジェネティクス，インコーポレイティド 炎症を治療する方法
KR100450266B1 (ko) * 2002-01-16 2004-09-30 주식회사 엘지생명과학 유전자 발현 동물세포 제조용 바이시스트로닉 벡터 및이를 포함하는 세포주 그리고 이를 이용한 항체단백질의생산방법
AU2003228383A1 (en) * 2002-04-09 2003-10-27 Global Biotech Inc. Human tissue urokinase type plasminogen activator production
US20040110295A1 (en) * 2002-05-28 2004-06-10 Maxygen, Inc., A Delaware Corporation Nucleic acid vectors
JP2005031812A (ja) * 2003-07-08 2005-02-03 Toshiba Corp 画像形成装置およびその制御方法
KR100807312B1 (ko) 2005-10-22 2008-02-28 (주)리즈바이오텍 재조합 인간 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질-3의 생산정제 방법
US20080124760A1 (en) * 2006-07-26 2008-05-29 Barbara Enenkel Regulatory Nucleic Acid Elements
EP2500414A1 (en) 2006-09-13 2012-09-19 Abbott Laboratories Cell culture improvements
MY185872A (en) 2006-09-13 2021-06-14 Abbvie Inc Cell culture improvements
NZ580378A (en) 2007-03-30 2012-11-30 Abbott Lab Recombinant expression vector elements (reves) for enhancing expression of recombinant proteins in host cells
EP2328908A4 (en) 2008-08-28 2012-11-28 Univ New York State Res Found TREATMENT OF AMYLOIDOSES BASED ON MYELIN BASED PROTEIN AND FRAGMENTS THEREOF
WO2010023787A1 (ja) * 2008-08-29 2010-03-04 東洋紡績株式会社 遺伝子発現安定化エレメント
AU2009319772A1 (en) 2008-11-26 2010-06-03 Centocor Research & Development, Inc. Compositions and methods for regulating collagen and smooth muscle actin expression by SERPINE2
WO2010147462A2 (en) 2009-06-15 2010-12-23 Cellagenics B.V. Novel stringent selectable markers
BR112012031694A2 (pt) * 2010-06-15 2016-02-16 Cellagenics B V fragmento de ácido nucleíco, construto de ácido nucleíco, vetor de expressão, célula hospedeira, método de geração de uma célula hospedeira para a expressão de um produto gênico de interesse, e, método de expresão de um produto de gene de interesse
KR101599138B1 (ko) 2014-06-17 2016-03-03 한국생명공학연구원 재조합 단백질 발현 증진을 위한 유전자 절편을 포함하는 벡터 및 이의 용도
WO2016003368A1 (en) * 2014-07-01 2016-01-07 Agency For Science, Technology And Research Optimized vectors for the production of recombinant proteins
WO2020068631A1 (en) * 2018-09-24 2020-04-02 Merck Sharp & Dohme Corp. Expression vectors for eukaryotic expression systems
JP7441840B2 (ja) 2018-12-10 2024-03-01 アムジエン・インコーポレーテツド 変異したｐｉｇｇｙｂａｃトランスポザーゼ
US20220073945A1 (en) 2018-12-21 2022-03-10 Merck Sharp & Dohme Corp. Expression vectors for eukaryotic expression systems
AU2020288407A1 (en) * 2019-06-07 2021-12-16 Biocon Biologics Limited Mammalian expression vectors
TW202233660A (zh) 2020-10-30 2022-09-01 美商安進公司 過表現胰島素樣生長因子受體突變體以調節ｉｇｆ補充
EP4267717A1 (en) 2020-12-22 2023-11-01 Amgen Inc. Cell culture method
UY39807A (es) 2021-06-10 2022-12-30 Amgen Inc VARIANTES GENOMODIFICADAS DE LA NRG-1 CON UNA SELECTIVIDAD MEJORADA FRENTE AL ErbB4 PERO NO FRENTE A
TW202328442A (zh) 2021-09-10 2023-07-16 美商安進公司 平臺宿主對ｉｇｆ—培養基之適應

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3730246A1 (de) * 1987-09-09 1989-06-01 Boehringer Mannheim Gmbh Expressionsvektor und verfahren zur expression von heterologen proteinen in saeugerzellen
DK0873405T3 (da) * 1996-01-11 2005-01-17 Immunex Corp Ekspressionsforøgende sekvenselementer (EASE) til eukaryote ekspressionssystemer

Also Published As

Publication number Publication date
NZ330926A (en) 1999-11-29
US6027915A (en) 2000-02-22
JP3495375B2 (ja) 2004-02-09
ES2227669T3 (es) 2005-04-01
NO983102D0 (no) 1998-07-03
ATE275628T1 (de) 2004-09-15
US6312951B1 (en) 2001-11-06
PT873405E (pt) 2005-01-31
US6309841B1 (en) 2001-10-30
CA2241174A1 (en) 1997-07-17
DE69730592D1 (de) 2004-10-14
EP0873405A4 (en) 2001-10-17
JP2000503205A (ja) 2000-03-21
DE69730592T2 (de) 2005-09-29
EP0873405B1 (en) 2004-09-08
NO983102L (no) 1998-09-08
AU708981B2 (en) 1999-08-19
CA2241174C (en) 2006-09-12
KR19990077015A (ko) 1999-10-25
WO1997025420A1 (en) 1997-07-17
EP0873405A1 (en) 1998-10-28
DK0873405T3 (da) 2005-01-17
AU1697397A (en) 1997-08-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO323277B1 (no) Ekspresjonsokende sekvenselementer (EASE) for eukaryote ekspresjonssystemer
CA2005016C (en) Dna fragment containing promoter region for human polypeptide chain elongation factor-1.alpha. and expression plasmid containing the dna fragment
US9944934B2 (en) Inducible eukaryotic expression system
Damke et al. [24] Tightly regulated and inducible expression of dominant interfering dynamin mutant in stably transformed HeLa cells
KR101183764B1 (ko) 프로모터
US6306605B1 (en) Methods for making recombinant cells
US7745189B2 (en) Regulatable growth of filamentous fungi
JP2001186897A (ja) 相同組換え法を用いてのタンパク質の生成
EA010863B1 (ru) Отбор клеток-хозяев, экспрессирующих белок на высоких уровнях
US6743622B2 (en) Homologous recombination antibody expression system for murine cells
Pieper et al. Regulation of vimentin expression in cultured epithelial cells
Jones et al. Regulation of adenovirus transcription by an E1a gene in microinjected Xenopus laevis oocytes
Yoshikawa et al. Flow cytometry: an improved method for the selection of highly productive gene‐amplified CHO cells using flow cytometry
Gourdji et al. The rat prolactin gene: a target for tissue-specific and hormone-dependent transcription factors
JPH07250689A (ja) タンパク質−タンパク質相互作用を検出するためのペリプラズム膜結合系
JP6960409B2 (ja) プロモーター
Ko et al. An auto-inducible vector conferring high glucocorticoid inducibility upon stable transformant cells
Stacey et al. Rescue of type I collagen-deficient phenotype by retroviral-vector-mediated transfer of human pro alpha 1 (I) collagen gene into Mov-13 cells
Kulke et al. Biological properties of the deer papillomavirus E5 gene in mouse C127 cells: growth transformation, induction of DNA synthesis, and activation of the platelet-derived growth factor receptor
CN102239261A (zh) 人工染色体载体
CN104975018B (zh) 一种新型增强子及其应用
Reik et al. Enhanced protein production by engineered zinc finger proteins
US11618904B2 (en) Promoter with an enriched Cytosine-Guanine dinucleotide region, vectors, cellular lines, method for producing recombinant protein
CN114561430B (zh) 人源化细胞瞬时表达用表达载体、表达系统、构建方法及其应用
CN102203286B (zh) 免疫球蛋白编码核酸的测定

Legal Events

Date Code Title Description
MM1K Lapsed by not paying the annual fees