ES2227669T3 - Elementos de secuencia que aumentan la expresion (ease) para sistemas de expresion de eurocariotas. - Google Patents
Elementos de secuencia que aumentan la expresion (ease) para sistemas de expresion de eurocariotas.Info
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Abstract
SE DESCRIBEN SECUENCIAS DE NUCLEOTIDOS QUE PUEDEN MEJORAR LA EXPRESION DE PROTEINAS RECOMBINANTES DE DOS A OCHO VECES EN REUNIONES DE CELULAS ESTABLES CUANDO SE ENCUENTRAN PRESENTES EN UN VECTOR DE EXPRESION.
Description
Elementos de secuencia que aumentan la expresión
(EASE) para sistemas de expresión de eucariotas.
La presente invención se refiere a elementos de
secuencia de ADN que aumentan la expresión de proteínas
recombinantes en células eucariotas.
El desarrollo de los sistemas de expresión para
la producción de proteínas recombinantes es importante para
desarrollar una fuente de una proteína dada para uso en la investigación o terapéutico. Los sistemas de expresión se han desarrollado tanto para células procariotas, tales como E. coli, como para células eucariotas, que incluyen tanto levaduras (es decir, Saccharomyces, Pichia y Kluyveromyces spp) como células de mamíferos. Frecuentemente, se prefiere la expresión en células de mamíferos para fabricar proteínas terapéuticas, ya que es más probable que las modificaciones postraduccionales en tales sistemas de expresión se asemejen más a las encontradas en un mamífero que al tipo de modificaciones postraduccionales que suceden en los sistemas de expresión microbianos (procarióticos).
desarrollar una fuente de una proteína dada para uso en la investigación o terapéutico. Los sistemas de expresión se han desarrollado tanto para células procariotas, tales como E. coli, como para células eucariotas, que incluyen tanto levaduras (es decir, Saccharomyces, Pichia y Kluyveromyces spp) como células de mamíferos. Frecuentemente, se prefiere la expresión en células de mamíferos para fabricar proteínas terapéuticas, ya que es más probable que las modificaciones postraduccionales en tales sistemas de expresión se asemejen más a las encontradas en un mamífero que al tipo de modificaciones postraduccionales que suceden en los sistemas de expresión microbianos (procarióticos).
La transcripción de los genes eucarióticos se
regula mediante una diversidad de elementos de regulación que
actúan en cis y trans (revisado por Dillon y Grosveld, Trends
Genet. 9: 134; 1993). Dos de los mejor caracterizados elementos en
cis son los promotores y los intensificadores. Los promotores son
secuencias de ADN dispuestas inmediatamente a 5' de la secuencia
codificante del gen y abarcan múltiples sitios de unión para
factores de transcripción que actúan en trans, formando el aparato
de transcripción basal. Los intensificadores también están
compuestos de múltiples sitios de unión para factores de
transcripción que actúan en trans pero pueden encontrarse alejados
cadena arriba o cadena abajo de las secuencias codificantes o
incluso dentro de los intrones. Estos elementos también pueden
actuar de una manera independiente de la orientación. Las
actividades de los promotores y los intensificadores pueden
detectarse en sistemas de expresión transitoria y contienen
elementos que pueden ser o no específicos de tejido; son
vulnerables a los efectos de posición cuando se estudian en líneas
celulares estables o animales transgénicos.
Otra categoría de elementos reguladores en cis
son aquellos que se cree que regulan la estructura de la cromatina
incluyendo las regiones de control del locus (LCR) (Grosveld F., y
col., Cell 51: 975, 1987), las regiones de unión a la matriz (MAR;
Phi-Van y col., Mol Cell Biol 10: 2302; 1980), las
regiones de unión al andamiaje (SAR; Passer y Laemmli, Trends
Genet. 3: 16, 1987), y los elementos de aislamiento (Kellum y
Schedl, Cell 64: 941, 1991). Estos elementos son similares a los
intensificadores porque son capaces de actuar a largas distancias
pero son únicos porque sus efectos son solamente detectables en
células transformadas de una manera estable o animales transgénicos.
Los LCR también son distintos a los intensificadores porque son
dependientes de la posición y la orientación y son activos de una
manera específica de tejido. Además, las secuencias LCR y SAR se
caracterizan por sus cajas A, cajas T y sitios de topoisomerasa II,
que no se encuentran típicamente en las secuencias de los
intensificadores o promotores (Passer y Laemmli, supra; Klehr
D., y col., Biochemistry 30: 1264, 1991).
Los sitios internos de entrada del ribosoma
(IRES) son otro tipo de elementos reguladores que pueden
encontrarse en diversos ARN víricos y celulares (revisado por
McBratney y col., Current Opinión in Cell Biology 5: 961, 1993). Los
IRES son útiles para intensificar la traducción de un segundo
producto génico en un módulo de expresión bicistrónico de
eucariotas (Kaufman R.J., y col., Nucleic Acids Res. 19:4485,
1991).
Están disponibles diversos vectores para la
expresión en hospedadores de mamíferos, que contienen, cada uno de
ellos, diversas combinaciones de elementos reguladores en cis y en
algunos casos en trans para conseguir altos niveles de proteínas
recombinantes, en el mínimo tiempo. Sin embargo, a pesar de la
disponibilidad de numerosos de tales vectores, el nivel de expresión
de una proteína recombinante conseguido en los sistemas de
mamíferos es frecuentemente bajo con respecto al obtenido en los
sistemas de expresión microbianos. Por otra parte, el desarrollo de
una línea celular transformada que exprese altos niveles de una
proteína deseada requiere, frecuentemente, mucho tiempo para clonar
y amplificar. De acuerdo con esto, hay una necesidad en la técnica
para refinar y mejorar la expresión en las células de mamíferos y
para identificar elementos que puedan aumentar la expresión de las
proteínas recombinantes y facilitar el uso de las células de
mamíferos en la producción de proteínas recombinantes.
Se describen secuencias reguladoras de la
transcripción novedosas, elementos de secuencia que aumentan la
expresión (EASE), que facilitan una alta expresión de las proteínas
recombinantes en células hospedadoras de mamíferos en un corto
periodo de tiempo. Una realización de la invención es un elemento de
secuencia que aumenta la expresión (EASE), que facilita una alta
expresión de proteínas recombinantes en células hospedadoras de
mamíferos en un corto periodo de tiempo, que no es activo en
sistemas de expresión transitoria, que no muestra características
de las moléculas de ADN que codifican una proteína y que no muestra
las características de la secuencia de nucleótidos encontradas en
los LCR, MAR o SAR. Una realización preferida de la invención es un
EASE, que fue obtenido a partir de ADN genómico de las células del
ovario del hámster chino (CHO), que está próximo a un sitio de
integración único para una proteína de mamífero recombinante.
En una realización más preferida de la invención,
el EASE se selecciona del grupo constituido por moléculas de ADN
que comprenden los nucleótidos 1 a 14.507, nucleótidos 5980 a
14.507, nucleótidos 8671 a 14.507, nucleótidos 8671 a 10.515,
nucleótidos 9277 a 10.515, nucleótidos 8672 a 12.273, nucleótidos
10.100 a 14293 de la SEQ ID Nº: 1, fragmentos de las moléculas de
ADN anteriores que tienen actividad de aumento de la expresión,
moléculas de ADN complementarias a las moléculas de ADN anteriores,
moléculas de ADN que son, al menos, aproximadamente, idénticas en
el 80% de la secuencia de nucleótidos a las moléculas de ADN
anteriores y que tienen actividad de aumento de la expresión y
combinaciones de las moléculas de ADN anteriores que tienen
actividad de aumento de la expresión. En una realización, el ADN
del EASE se liga a un ADN que comprende los nucleótidos 14.290 a
14.507 de la SEQ ID Nº: 1; de un modo alternativo, el ADN del EASE
se liga a un ADN que comprende los nucleótidos 12.592 a 14.507 de
la SEQ ID Nº: 1.
Los vectores de expresión que comprenden los EASE
novedosos son capaces de transformar células CHO para una expresión
alta de las proteínas recombinantes. De este modo, otra realización
de la invención es un vector de expresión que comprende un EASE. En
una realización preferida, el vector de expresión comprende
adicionalmente un promotor / intensificador eucariótico que controla
la expresión de una proteína de interés. En una realización más
preferida, el vector de expresión consiste en un plásmido
bicistrónico en el que un primer exón codifica el gen de interés y
un segundo exón codifica un marcador de selección dominante y
amplificable. Un marcador preferido es la reductasa del
dihidrofolato (DHFR); también son adecuados otros marcadores
amplificables para el uso en los vectores de expresión de la
invención. El vector de expresión puede comprender adicionalmente
una secuencia IRES entre los dos exones.
Las células hospedadoras de mamíferos pueden
transformarse con los vectores de expresión de la invención y
producirán altos niveles de proteínas recombinantes en un corto
periodo de tiempo. De acuerdo con esto, otra realización de la
invención proporciona una célula hospedadora de mamífero
transformada con el vector de expresión de la invención. En una
realización más preferida, las células hospedadoras son células
CHO.
La invención también proporciona un método para
obtener una proteína recombinante, que comprende trasformar una
célula hospedadora con un vector de expresión de la invención,
cultivar la célula hospedadora transformada en condiciones que
promuevan la expresión de la proteína y recuperar la proteína. En
una aplicación preferida de esta invención, las líneas celulares
hospedadoras transformadas se seleccionan con dos etapas de
selección, la primera para seleccionar las células que expresan el
marcador dominante amplificable y la segunda etapa para seleccionar
altos niveles de expresión y/o amplificación del gen marcador así
como del gen de interés. En una realización más preferida, el
agente de selección o amplificación es metotrexato, un inhibidor de
la DHFR que se ha mostrado que provoca la amplificación de genes
endógenos de la DHFR y de secuencias de la DHFR transfectadas.
Por otro lado, la invención proporciona un método
para identificar elementos adicionales de secuencia que aumentan la
expresión, por ejemplo, a partir de otras líneas celulares
transformadas. Tales líneas celulares mostrarán altos niveles de
expresión no atribuibles a un número alto de copias génicas. Las
técnicas de la invención serán útiles para identificar y aislar
tales EASE, así como EASE presentes en células sin transformar (por
ejemplo, mediante estudios de hibridación o de análisis de
secuencia).
La figura 1 representa insertos de diversas
longitudes derivados a partir del ADN genómico
2A5-3 de las CHO. La figura 1A es un mapa de
restricción del sitio de integración del TNFrFc clonado en un
vector de clonación, \lambdaFixII, como se describe en el ejemplo
1; los sitios de restricción usados para la subclonación son los
indicados. El inserto corresponde a los nucleótidos 1 a 14.507 de
la SEQ ID Nº 1. La figura 1B recoge los insertos clonados en el
pGEM1, derivados del clon fágico representado en la figura 1A, como
se describe en el ejemplo 7. La línea negra gruesa es el promotor
del CMV, la caja punteada es la secuencia líder tripartita del
adenovirus, las cajas rayadas hacia la izquierda son la región
codificante del TNFrFc y la raya pequeña es la secuencia
codificante de la DHFR. En relación a la SEQ ID Nº: 1, el inserto en
el PG8.5 corresponde a los nucleótidos 5980 a 14.507; el del PG5.7
corresponde a los nucleótidos 8671 a 14.507; el del PG5.7\DeltaS
corresponde a los nucleótidos 8671 a 10.515 ligados a los
nucleótidos 12.592 a 14.507; el del PG.2SE1.8 corresponde a los
nucleótidos 8671 a 10.515 ligados a los nucleótidos 14.290 a
14.507; el del PG.2SH1.2 corresponde a los nucleótidos 9277 a 10.515
ligados a los nucleótidos 14.291 a 14.507; el del PG.2.2
corresponde a los nucleótidos 12269 a 14507 y el del PG.2
corresponde a los nucleótidos 14.290 a 14.507.
Los autores han aislado e identificado elementos
de secuencia novedosos que pueden mejorar la expresión de proteínas
indicadoras de dos a ocho veces en conjuntos de células estables
cuando se insertan en un vector de expresión. Uno de tales
elementos de secuencia se identificó clonando el sitio de
integración de un módulo de expresión único que codifica la
proteína de fusión del receptor dimérico recombinante del factor de
necrosis tumoral y el Fc de inmunoglobulina (TNFrFc) a partir de
ADN genómico de una línea celular que expresa esta proteína en un
alto nivel. Parece que los elementos de secuencia de la invención
codifican una función novedosa, porque la actividad de
intensificación de la expresión no se comporta como la de los
elementos que actúan en cis caracterizados previamente tales como
promotores, intensificadores, regiones de control del locus,
regiones de unión al andamiaje o regiones de unión a la matriz.
Además, parece que los elementos de secuencia no contienen ninguna
fase de lectura abierta (ORF), haciéndose improbable que codifiquen
una proteína activadora en trans novedosa. Los autores se refieren
a estos elementos de secuencia novedosos como "elementos de
secuencia que aumentan la expresión" (EASE).
La actividad de los EASE se identificó en 14,5 kb
de ADN genómico de las CHO situado a 5' respecto a un sitio de
integración único de las secuencias que codifican el TNFrFc a
partir del genoma de una línea celular que expresaba esta proteína
a un alto nivel (denominada 2A5-3). Los vectores de
expresión que contenían esta región aislada de 14,5 kb y fragmentos
más pequeños de la misma fueron capaces de transformar células CHO
DXB11 hasta altos niveles de expresión de las proteínas
recombinantes a una frecuencia de >50%. Los estudios de
cartografía indicaron que >50% de la actividad se localiza en una
región de 1,8 kb del ADN, del nucleótido 8671 al nucleótido 10.515
de la SEQ ID Nº: 1. Además, parece que una secuencia del nucleótido
8671 al nucleótido 9276 de la SEQ ID Nº: 1 (el fragmento
EcoRI-Hpa I de 604 pb) es esencial para la actividad
ya que la intensificación de la expresión se reduce mucho si esta
región no está presente en un vector. El EASE de la invención puede
mejorar la expresión de una proteína recombinante controlada por
una región promotora / intensificadora a la que esté unida.
Por otro lado, pueden identificarse fragmentos
adicionales del ADN genómico de las CHO de 14,5 kb que muestren
actividad EASE tal como se describe en el presente documento así
como motivos EASE similares de otros tipos de células o de otros
sitios de integración en células transformadas. Además, se conoce en
la técnica que la elaboración subsecuente de los fragmentos de ADN
preparados mediante digestión con enzimas de restricción puede dar
como resultado la eliminación de nucleótidos adicionales de los
extremos de los fragmentos. De este modo, los fragmentos de ADN
descritos y reivindicados en el presente documento también incluyen
los fragmentos que terminan dentro de los cinco pares de bases de
los nucleótidos enumerados.
También pueden desarrollarse otras combinaciones
de los fragmentos descritos en el presente documento, por ejemplo,
secuencias que incluyan múltiples copias de los EASE descritos en
el presente documento o secuencias derivadas mediante combinación
de los EASE descritos con otras secuencias de nucleótidos para
conseguir combinaciones óptimas de los elementos reguladores. Tales
combinaciones pueden unirse adyacentemente o disponerse para
proporcionar un espaciado óptimo de los fragmentos EASE (es decir,
mediante la introducción de nucleótidos "espaciadores" entre
los elementos). Los elementos reguladores también pueden disponerse
para proporcionar un espaciado óptimo de los EASE de otras regiones
reguladoras. De un modo similar, la orientación de un EASE en un
vector puede optimizarse para proporcionar altos niveles de
expresión de la proteína.
El EASE descrito en el presente documento se
aisló a partir de células del ovario del hámster chino (CHO). Se
espera que existan elementos que aumentan la expresión homólogos en
células de otras especies de mamíferos así como en líneas celulares
derivadas de otros tipos de tejidos y que puedan aislarse mediante
técnicas bien conocidas en la técnica, por ejemplo, mediante
hibridación cruzada de especies o técnicas a base de PCR. Además,
se pueden hacer cambios en la secuencia de nucleótidos indicada en
la SEQ ID Nº: 1 mediante técnicas de mutagénesis dirigida o
aleatoria que se conocen en la técnica. Seguidamente, las variantes
del EASE resultante pueden analizarse en su actividad EASE tal como
se describe en el presente documento. Las moléculas de ADN que son,
al menos, aproximadamente, idénticas en el 80%, más
preferentemente, al menos, aproximadamente, idénticas en el 90%, de
la secuencia de nucleótidos con respecto a la SEQ ID Nº: 1 o los
fragmentos de las mismas que tienen actividad EASE se aíslan
mediante experimentos ordinarios y se espera que tengan actividad
EASE. Para los fragmentos del EASE el porcentaje de identidad se
refiere a la porción de la secuencia natural de referencia que se
encuentra en el fragmento EASE. De acuerdo con esto, los homólogos
de los EASE y las variantes de los EASE también quedan abarcados
por la
invención.
invención.
La expresión de las proteínas recombinantes está
controlada por un promotor / intensificador eucariótico apropiado y
por el EASE de la invención. Las células se transfectan con un
plásmido seleccionado en condiciones de baja estrictez con respecto
al marcador seleccionable dominante y, seguidamente, se selecciona
de nuevo en condiciones de alta estrictez, por ejemplo, mediante el
uso de metotrexato (MTX), un inhibidor de la DHFR, en el medio de
selección. La primera selección proporciona transformantes
positivos (es decir, transformantes DHFR^{+} en el caso de la
selección por metotrexato) y la segunda selección proporciona
transformantes que expresan altos niveles del gen de interés.
La inclusión de una secuencia IRES en los
vectores que contienen un EASE puede ser beneficiosa para
intensificar la expresión de algunas proteínas. Parece que la
secuencia IRES estabiliza la expresión del gen de interés bajo
presión selectiva alta (Kaufman y col., 1991, supra). Para
las proteínas que son bien elaboradas por las células, la secuencia
IRES no es necesaria para conseguir altos niveles de expresión.
Las poblaciones celulares que expresan altos
niveles de la proteína recombinante pueden desarrollarse en cinco a
siete semanas usando un protocolo de selección en dos etapas tal
como se describe en el presente documento. El nivel absoluto de
expresión alta variará con la proteína específica, dependiendo de
cómo de bien sea elaborada la proteína por la célula. Los autores
han observado conjuntos de células estables que expresan, al menos,
aproximadamente, 0,2 \mug / 10^{6} células / día y en muchos
casos más de, aproximadamente, 12 \mug / 10^{6} células / día,
usando una diversidad de citoquinas y receptores de citoquinas. El
tiempo requerido para conseguir este nivel de expresión de
proteínas fue casi la mitad del observado en las trasformaciones
similares hechas usando vectores sin el EASE. Por otro lado, los
conjuntos de células desarrollados con el EASE son estables a lo
largo del tiempo y pueden tratarse como líneas celulares para la
mayoría de los fines. Las etapas de clonado pueden retrasarse en el
procedimiento del desarrollo hasta más tarde que lo acostumbrado
para las proteínas recombinantes. Con una etapa de clonado
adicional, es posible desarrollar líneas celulares que expresen más
de, aproximadamente, 24 \mug / 10^{6} células / día.
Los experimentos de transfección demuestran que
el EASE encontrado en estas secuencias de ADN tiene algunas
características de las descritas previamente para los elementos que
actúan en cis pero no cae dentro de las definiciones previamente
descritas. De un modo similar a las secuencias LCR, MAR y SAR, la
actividad EASE no se detecta en ensayos transitorios. Sin embargo,
al contrario que en estas secuencias, el EASE no tiene cajas A, ni
cajas T ni sitios de la topoisomerasa II, que se encuentran
típicamente en estos elementos (Klehr y col., supra). Ya que
la actividad EASE no se detecta en los ensayos transitorios, parece
ser distinta a la de los elementos promotores e intensificadores
que se detectan con estos métodos.
Los vectores de expresión recombinantes incluyen
fragmentos de ADN sintéticos o derivados de ADNc que codifican la
proteína, unidos operativamente a elementos reguladores de la
traducción y la transcripción adecuados de genes de mamíferos, de
virus o de insectos. Tales elementos reguladores incluyen un
promotor de la transcripción, una secuencia que codifique sitios de
unión para el ribosoma en el ARNm adecuados y secuencias que
controlen la terminación de la transcripción y la traducción, tal
como se describe en detalle más adelante. Los vectores de expresión
de mamíferos también pueden comprender elementos que no se
transcriben tales como un origen de replicación, un promotor e
intensificador adecuados unidos al gen a ser expresado, otras
secuencias que no se transcriben de los flancos 5' ó 3', secuencias
que no se traducen de 5' ó 3' tales como sitios de unión al
ribosoma necesarios, un sitio de poliadenilación, sitios donadores y
aceptadores del procesamiento y secuencias de terminación de la
transcripción. También pueden incorporarse un origen de replicación
que confiera la capacidad de replicación en un hospedador y un gen
para la selección para facilitar el reconocimiento de los
transformantes.
Las regiones de ADN están unidas operativamente
cuando están funcionalmente relacionadas una con otra. Por ejemplo,
el ADN para un péptido señal (conductor para la secreción) está
operativamente unido al ADN para un polipéptido si se expresa en
forma de un precursor que participa en la secreción del polipéptido;
un promotor está operativamente unido a una secuencia codificante
si controla la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión
para ribosomas está operativamente unido a una secuencia
codificante si está dispuesto de forma que permita la traducción.
Generalmente, operativamente unido significa contiguo y, en el caso
de los conductores para secreción, contiguo y en fase de
lectura.
Las secuencias de control de la transcripción y
la traducción en los vectores de expresión a usar en la
transformación de células de vertebrados pueden proporcionarse a
partir de fuentes víricas. Por ejemplo, los promotores e
intensificadores normalmente usados derivan del poliomavirus,
adenovirus 2, virus de simios 40 (SV40) y citomegalovirus. Los
promotores genómicos víricos y las secuencias de señalización y/o
control pueden utilizarse para controlar la expresión, con la
condición de que tales secuencias de control sean compatibles con
la célula hospedadora elegida. Los vectores de ejemplo pueden
construirse tal como describen Okayama y Berg (Mol. Cell. Biol., 3:
280, 1983). También pueden usarse promotores celulares que no sean
víricos (es decir, promotores de la \beta-globina
y del EF-1\alpha), dependiendo del tipo celular en
el que se exprese la proteína recombinante.
Pueden usarse secuencias de ADN que deriven del
genoma del virus SV40, por ejemplo, el origen del SV40, el promotor
temprano y tardío, el intensificador y los sitios de procesamiento
y poliadenilación para proporcionar los otros elementos genéticos
requeridos para la expresión de una secuencia de ADN heteróloga.
Los promotores temprano y tardío son particularmente útiles porque
ambos se obtienen fácilmente a partir del virus en forma de un
fragmento que también contiene el origen de replicación del virus
SV40 (Fiers y col., Nature 273: 113, 1978). También pueden usarse
fragmentos del SV40 más pequeños o más grandes con la condición de
que se incluya la secuencia de aproximadamente 250 pb que se
extiende desde el sitio HindIII hacia el sitio BglII localizado en
el origen de replicación del virus.
Los vectores de expresión bicistrónicos usados
para la expresión de múltiples transcritos se han descrito
previamente (Kim S.K. y Wold B.J., Cell 42: 129, 1985; Kaufman y
col., 1991, supra). El pCAVDHFR es un derivado del pCD302
(Mosley y col., Cell, 1989) que contiene la secuencia codificante de
la DHFR de ratón (Subramani y col., Mol. Cell. Biol., 1: 854,
1981). El vector pCDE es un derivado del pCAVDHFR que contiene el
sitio de entrada interna del ribosoma del virus de la
encefalomiocarditis murina (nucleótidos 260 a 824; Jang y Wimmer,
Genes and Dev., 4: 1560, 1990) clonado entre el líder tripartito del
adenovirus y la secuencia de ADNc codificante de la DHFR. También
pueden ser útiles otros tipos de vectores de expresión en
combinación con el EASE de la invención, por ejemplo, los descritos
en las patentes de Estados Unidos Nº 4.634.665 (Axel y col.) y
4.656.134 (Ringold y col.).
Las células hospedadoras transformadas son
células que han sido transformadas o transfectadas con vectores de
expresión construidos usando técnicas del ADN recombinante y que
contienen proteínas recombinantes codificadas en secuencias.
Preferentemente, las proteínas expresadas se secretarán al
sobrenadante del cultivo, dependiendo del ADN seleccionado, pero
pueden depositarse en la membrana celular. Pueden emplearse
diversos sistemas de cultivo de las células de mamíferos para
expresar las proteínas recombinantes. Los ejemplos de líneas
celulares hospedadoras de mamíferos adecuadas incluyen las líneas
COS-7 de las células de riñón de mono, descritas
por Gluzman (Cell 23: 175, 1981) y otras líneas celulares capaces
de expresar un vector apropiado incluyendo, por ejemplo, las líneas
celulares CV-1/EBNA (ATCC CRL 10.478), células L,
C127, 3T3, de ovario de hámster chino (CHO), HeLa y BHK.
Una línea celular usada normalmente es la CHO
DHFR^{-} que es auxótrofa para la glicina, timidina e hipoxantina
y que puede transformarse en el fenotipo DHFR^{+} usando ADNc de
la DHFR como marcador dominante amplificable. Tal línea celular CHO
DHFR^{-}, DXB11, fue descrita por Urlaub y Chasin (Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 77: 4216, 1980). También pueden ser útiles con el
EASE de la invención otras líneas celulares desarrolladas para
esquemas específicos de selección o amplificación.
Se conocen en la técnica diversos protocolos de
transformación que se revisan en Kaufman, R.J., Meth. Enzymology
185: 537 (1988). El protocolo de transformación elegido dependerá
del tipo de la célula hospedadora y de la naturaleza del gen de
interés y puede elegirse en base a la experimentación ordinaria. Los
requerimientos básicos de cualquier protocolo de este tipo son
primero introducir el ADN codificante de la proteína de interés en
una célula hospedadora adecuada y, seguidamente, identificar y
aislar las células hospedadoras que hayan incorporado el ADN
heterólogo de una manera estable y que se pueda expresar.
Un método usado normalmente para introducir ADN
heterólogo es el de la precipitación de fosfato cálcico descrito,
por ejemplo, por Wigler y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:
3567, 1980). El ADN introducido en una célula hospedadora por este
método sufre, frecuentemente, reordenaciones, haciendo este
procedimiento útil para la cotransfección de genes
independientes.
Otro método útil para introducir ADN heterólogo
es el de la fusión inducida por polietileno de protoplastos
bacterianos con células de mamífero (Schaffner y col., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 77: 2163, 1980). Los protocolos de fusión de
protoplastos proporcionan, frecuentemente, múltiples copias del ADN
plasmídico integradas en el genoma de la célula hospedadora de
mamífero; sin embargo, esta técnica requiere que el marcador de
selección y amplificación esté en el mismo plásmido que el gen de
interés.
La electroporación también puede usarse para
introducir ADN directamente en el citoplasma de una célula
hospedadora, por ejemplo, como describe Potter y col. (Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 81: 7161, 1988) o Shigekawa y Doler (Biotechniques
6: 742, 1988). Al contrario que en la fusión de protoplastos, la
electroporación no requiere que el marcador de selección y el gen
de interés estén en el mismo plásmido.
Más recientemente, se han descrito diversos
reactivos útiles para la introducción de ADN heterólogo en una
célula de mamífero. Estos incluyen el reactivo Lipofectin® y el
reactivo Lipofectamine^{TM} (Gibco BRL, Gainthersburg, MD). Ambos
reactivos son reactivos comercialmente disponibles usados para
formar complejos lípido-ácido nucleico (o liposomas) que, cuando se
aplican a las células en cultivo, facilitan la absorción del ácido
nucleico por las
células.
células.
También es deseable un método para amplificar el
gen de interés para la expresión de la proteína recombinante y, de
un modo típico, implica el uso de un marcador de selección
(revisados por Kaufman, R.J., supra). La resistencia a los
fármacos citotóxicos es la característica más frecuentemente usada
como marcador de selección y puede ser el resultado de una
característica dominante (es decir, puede usarse independientemente
del tipo de célula hospedadora) o una característica recesiva (es
decir, útil en tipos particulares de células hospedadoras que son
deficientes en cualquier actividad para la que se selecciona). Son
adecuados diversos marcadores amplificables para usar en los
vectores de expresión de la invención (por ejemplo, los que se
describen en Maniatis, Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory, NY, 1989; páginas
16.9-16.14).
Se muestran en la tabla 1 de Kaufman, R.J.,
supra, marcadores de selección útiles para la amplificación
génica en células de mamífero resistentes a fármacos e incluyen la
resistencia DHFR-MTX, glucoproteína P y la
multirresistencia a fármacos (MDR) - diversos agentes citotóxicos
lipófilos (es decir, adriamicina, colchicina, vincristina) y la
desaminasa de la adenosina
(ADA)-Xyl-A o adenosina y
2'-desoxicoformicina.
Otros marcadores de selección dominantes incluyen
genes de resistencia a antibióticos derivados de microorganismos,
por ejemplo, la resistencia a la neomicina, kanamicina o
higromicina. Sin embargo, no se ha mostrado que estos marcadores de
selección sean amplificables (Kaufman, R.J., supra). Existen
diversos sistemas de selección adecuados para los hospedadores de
mamíferos (Maniatis supra, págs.
16.9-16.15). Se han descrito protocolos de
cotransfección que emplean dos marcadores de selección dominantes
(Okayama y Berg, Mol. Cell. Biol., 5: 1136, 1985).
Un esquema particularmente útil de selección y
amplificación utiliza la resistencia DHFR-MTX. El
MTX es un inhibidor de la DHFR que se ha mostrado que provoca la
amplificación de los genes endógenos de la DHFR (Alt F.W., y col.,
Journal of Biological Chemistry 253: 1357, 1978) y de las secuencias
de la DHFR transfectadas (Wigler M., y col., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 77: 3567, 1980). Las células se transforman con ADN que
contiene el gen de interés en un módulo de expresión, unido o no al
gen DHFR en un segundo módulo de expresión. Los dos genes también
pueden estar en una unidad de expresión bicistrónica (Kaufman y
col., 1991, supra y Kaufman R.J., y col., EMBO J 6: 187,
1987). Las células transformadas se dejan crecer en medio que
contiene cantidades sucesivamente mayores de MTX, dando como
resultado una expresión mayor del gen DHFR así como del gen de
interés.
También pueden incluirse elementos reguladores
útiles, descritos previamente, en los plásmidos usados para
transformar las células de mamífero. El protocolo de transformación
elegido y los elementos seleccionados para usar en el presente
documento, dependerán del tipo de célula hospedadora usada. Los
expertos en la técnica son conscientes de los numerosos protocolos
y células hospedadoras diferentes y pueden seleccionar un sistema
de expresión apropiado para una proteína deseada en base a los
requerimientos de sus sistemas de cultivo de células.
Las descripciones relevantes de todos los
antecedentes enumerados en el presente documento se incorporan
específicamente como referencia. Los siguientes ejemplos tienen la
intención de ilustrar realizaciones particulares y no limitan el
alcance de la invención.
Se seleccionó una línea celular CHO transformada
(designada como línea celular 2A5-3) que expresaba
altos niveles de una proteína de fusión con el Fc de
inmunoglobulinas que comprende el dominio extracelular del receptor
de 80 kDa del factor de necrosis tumoral (TNFrFc; Moler y col., J.
Immunol. 151: 1548, 1993; patente de Estados Unidos Nº 5.395.760,
expedida el 7 de marzo de 1995; la descripción de las cuales se
incorpora como referencia) para la preparación de una genoteca
genómica ya que el análisis de transferencia de Southern indicó que
la alta expresión del TNFrFc observada en esta línea celular está
controlada por una integración única de un módulo de expresión que
codifica el TNFrFc. Se aisló el ADN a partir de estas células, se
digirió parcialmente con MboI y se clonó en un vector de clonación
\lambda FIX II (genoteca genómica de encargo de Stratagene;
Stratagene La Jolla, CA) para formar una genoteca. Se clonaron la
secuencia que codifica el receptor p80 del TNF, junto con 14,4 kb de
las secuencias celulares que lo flanquean, a partir de la genoteca
como se describe más adelante.
Para rastrear la genoteca se permitió que se
formaran, aproximadamente, 2 x 10^{4} unidades formadoras de
calvas (pfu) por placa de 250 cm. Las calvas se transfirieron a
membranas de nitrocelulosa (Schleicher and Schuell, Keene, NH) y se
lisaron usando protocolos estándar suministrados por Stratagene. Los
filtros se sometieron a sondas marcadas por cebado aleatorio del
fragmento de ADN NotI-PvuII que codifica una
porción de la superficie celular del dominio extracelular del
receptor p80 del TNF (Moler y col., supra). Las hibridaciones
se realizaron a 63ºC en tampón de hibridación [(solución de
Denharts 10 X (Maniatis supra pág. 9.49), Tris 0,05 M, pH
7,5, NaCl 1 M, pirofosfato sódico 0,1%, SDS 1%, ADN de esperma de
salmón 4 \mug / ml]. Se lavaron los filtros como sigue: lavado
inicial en SDS 0,1%, SSC 0,1% (Maniatis supra, B.13) a 42ºC
durante 30 minutos, seguido de dos lavados adicionales en la misma
solución durante 60 minutos a 63ºC. Los dos lavados finales fueron
a 63ºC durante 60 minutos usando SDS 0,1% y SSC 0,01%. Se
identificó un único clon recombinante positivo después del rastreo
de, aproximadamente, 4 x 10^{5} recombinantes. Este clon, que fue
designado 2A5-3 \lambda, se usó en todos los
análisis subsecuentes. La secuencia de nucleótidos del ADN genómico
de las CHO de este clon se muestra en la SEQ ID Nº 1. El
2A5-3 \lambda se depositó en la colección
americana de cultivos tipo, Rockville MD, bajo los términos del
tratado de Budapest el 4 de enero de 1996 y el número de acceso
proporcionado fue 97.411.
El número de copias génicas se controló usando la
técnica de transferencia de Southern. Se preparó ADN celular total
de las líneas celulares apropiadas usando los métodos previamente
descritos (Mitchell P.J., y col., Mol. Cell Biol., 6: 425, 1986).
Después de la digestión del ADN con las enzimas apropiadas en las
condiciones descritas por los proveedores (New England Biolabs,
Beverly, MA o Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN), el ADN se
separó en geles de agarosa en TAE (tamponado con
Tris-acetato) 1%, por ejemplo, como se describe
(Maniatis supra, pág. 6.20). Después de la electroforesis,
se transfirió el ADN a filtros Zetaprobe y se sometió a hibridación
en las condiciones recomendadas por el proveedor
(Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). Los filtros se
lavaron con el SDS 0,1% y SSC 0,1 X tres veces durante 30 minutos
cada vez. El primer lavado se realizó a 37ºC y los dos lavados
subsecuentes se hicieron a 63ºC. Las sondas se prepararon usando
los juegos de cebado aleatorio (Boehringer Mannheim, Indianápolis,
IN). Para las trasferencias, las secuencias del TNFr se detectaron
usando la misma sonda que la descrita para el rastreo de la
genoteca. De un modo similar, las sondas derivadas a partir de la
región del ADN codificante de cualquier otra proteína de interés (o
fragmento de la misma) serán útiles en la técnica de transferencia
de Southern para controlar el número de copias génicas.
Se mantuvieron células DXB11 (Chasin y Urlaub,
supra) de ovario de hámster chino (CHO) deficientes en la
reductasa del dihidrofolato (DHFR) en medio mínimo esencial de
Dulbecco y F12 (DMEM:F12) complementado con suero bovino fetal 7,5%
(FBS; Hyclone, Logan, UT; o Sigma, St. Louis, MO),
L-glutamina 2 mM, timidina (T) 90 \muM,
hipoxantina (H) 90 \muM y glicina (G) 120 \muM. Para los
estudios de selección de la DHFR y las selecciones con metotrexato
las células se cultivaron en DMEM:F12 sin GHT y complementado con
FBS 7,5% dializado, L-glutamina 6 mM y asparagina 1
mM. Para las elecciones con metotrexato se añadió metotrexato (MTX;
Lederle Laboratories, Peral River, NY) al medio de selección en las
concentraciones apropiadas. Cuando se empleaba la selección con
neomicina se añadieron 400 \mug / ml de G418 (Gibco, Grand Island,
NY) al medio. Las células se transfectaron usando la transfección
con fosfato cálcico (Wigler y col., supra) o la transfección
con Lipofectamine^{TM} tal como recomienda el proveedor (Gibco
BRL, Gaithersburg, MD).
La producción de proteínas recombinantes puede
controlarse mediante cualquier ensayo adecuado para detectar la
proteína deseada, incluyendo ensayos de unión, ensayos de
inhibición y ensayos biológicos. Un ensayo particularmente útil es
el enzimoinmunoensayo en sándwich de anticuerpos (ELISA), que es
bien conocido en la técnica (por ejemplo, las adaptaciones de las
técnicas se describen en Engvall y col., Immunochem., 8: 871, 1971
y en la patente de Estados Unidos Nº 4.703.004). En este ensayo, se
inmoviliza un primer anticuerpo específico para una proteína de
interés (normalmente un anticuerpo monoclonal) sobre un sustrato
(más frecuentemente, una placa de microvaloración de 96 pocillos) y,
seguidamente, se añade una muestra que contiene la proteína y se
incuba. También se añade una serie de diluciones de concentración
conocida de la proteína y se incuba para proporcionar una curva
patrón. Después de una etapa de lavado para eliminar las proteínas
sin unir y otras sustancias, se añade un segundo anticuerpo a la
proteína. El segundo anticuerpo está dirigido contra un epítopo
diferente de la proteína y puede ser un anticuerpo monoclonal o bien
un anticuerpo policlonal.
Se añade el reactivo de conjugación que comprende
un anticuerpo, que se une al segundo anticuerpo, conjugado con una
enzima tal como la peroxidasa de rábano (HRP) o bien después de una
segunda etapa de lavado para eliminar la proteína sin unir o bien
al mismo tiempo que se añade el segundo anticuerpo. Después de un
periodo adecuado de incubación, se elimina el reactivo de
conjugación sin unir mediante lavado y se añade a la placa una
solución de revelado que contiene el sustrato de la enzima
conjugada, provocando que el color se desarrolle. La lectura de la
densidad óptica a la longitud de onda correcta proporciona valores
numéricos para cada pocillo. Los valores de la muestra se comparan
con los valores de la curva patrón lo que permite la cuantificación
de los niveles de la proteína deseada.
Para cuantificar el ligando del CD40 trimérico se
desarrolló un ELISA de CD40L usando dos anticuerpos monoclonales
(MAb). Un anticuerpo se dirigió contra un dominio de
oligomerización en cremallera presente en la proteína trimérica y el
segundo anticuerpo se dirigió contra la porción del ligando del
CD40 humano de la molécula. El primer MAb se absorbió en las placas
toda una noche y el segundo anticuerpo con peroxidasa (HRP)
conjugada se añadió después de una etapa de lavado. En diversos
experimentos se detectaron cantidades entre 0,78 y 50 ng / ml
de
CD40L.
CD40L.
Se usó un ELISA similar para cuantificar la
proteína recombinante de fusión del receptor del factor de necrosis
tumoral humano (TNFrFc). En este ELISA, se usaron dos anticuerpos
monoclonales contra diferentes epítopos del TNFrFc. De nuevo, el
primer MAb se absorbió en las placas toda una noche y el segundo
anticuerpo con oxidasa (HRP) conjugada se añadió después de una
etapa del lavado. En diversos experimentos se detectaron cantidades
entre 0,78 y 50 ng / ml de TNFrFc.
Para detectar el ligando recombinante del
Flt-3 (Flt-3L) se usó un ELISA de
algún modo diferente, empleando un anticuerpo monoclonal y un
antisuero policlonal de conejo. Como se describe previamente, el
Mab se absorbió en las placas toda una noche. Se añadió una
solución que contenía tanto el
anti-Flt-3L policlonal como el
segundo anticuerpo con peroxidasa (HRP) conjugada (inmunoglobulina
anti-conejo de burro) después de la primera etapa de
lavado para eliminarlas proteínas sin unir. En diversos
experimentos se detectaron cantidades entre 1,56 y 100 ng / ml
de
Flt-3L.
Flt-3L.
El ADN se secuenció usando la secuenciación a
ciegas tal como se describe previamente (Bankier, Meth Mol Biol 23:
47, 1993) o el traslado del cebador usando el kit de secuenciación
cíclica ABI Taq DyeDeoxy Terminator en un secuenciador automático
de ADN (modelo 373a; Applied Biosystems, Foster City, CA). El ADN
del 2A5-3 \lambda se caracterizó realizando
diversos tipos diferentes de análisis por ordenador.
La secuencia 2A5-3 \lambda se
recorrió buscando regiones de alto contenido en A+T usando una
combinación de tres programas para ordenador suministrados en el
paquete de Wisconsin del grupo de genética por ordenador (manual del
programa del paquete de Wisconsin, versión 8, septiembre de 1994,
grupo de genética por ordenador, Science Drive 575, Madison,
Wisconsin, EE.UU. 53.711), a saber SIMPLIFY, WINDOW y STATPLOT.
Para buscar las regiones de alto contenido en A+T se hizo pasar una
ventana corrediza de 50 pb a lo largo de la secuencia del
2A5-3 \lambda en incrementos de un par de bases y
se representó el porcentaje de A+T dentro de la ventana. Las áreas
de interés fueron aquellas en las que la media del contenido A+T
era constantemente, aproximadamente, el 70%. Se encontró una región
con >200 pb con >70% de contenido A+T entre los dos sitios
SwaI (nucleótidos 10.517 a 12.591 de la SEQ ID Nº 1). No parecía
que esta región fuese importante para la actividad EASE (véanse los
ejemplos 7 y 8).
Se realizó una búsqueda de tres motivos de
intensificación de la transcripción conocidos usando el programa
del GCG MOTIFS: "Topo-II" [GTNWAYATTNATNNR],
"caja T" [ATATTT/AATATT] y "caja A" [AATAAAYAAA] (Klehr y
col., supra). Este programa examina una secuencia a
consultar de un modo lineal buscando una correspondencia exacta con
cada motivo de entrada especificado. Para cada motivo, se designaron
las degeneraciones con símbolos que usan las convenciones de
denominación de la unión internacional de bioquímica (IUB). No se
encontraron "cajas topo-II" en el ADN del
2A5-3 \lambda del ADN de 14,5 kb de las CHO. Se
encontraron dos "cajas A" y 26 "cajas T" dispersadas a lo
largo de esta región del ADN de las CHO. No se encontró ninguno de
estos motivos en el fragmento de 604 pb EcoRI-HpaI
requerido para la actividad EASE.
Se realizaron búsquedas en las bases de datos
GenBank de secuencias de ADN y en las bases de datos SwissProt y
PIR de secuencias de proteínas usando el algoritmo BLAST de
Altschul y col. (J. Mol. Biol. 215: 403, 1990). Este algoritmo está
optimizado para encontrar segmentos de similitud local sin espacios
vacíos insertados en el alineamiento. Las búsquedas con BLAST tanto
en la secuencia del ADN del 2A5-3 \lambda como en
la traducción dinámica de la proteína en todas las seis fases de
lectura no fueron capaces de producir correspondencias
significativas con ninguna secuencia de activación de la
transcripción conocida.
Se usó el programa de ordenador GRAIL
(Uberbacher, E.C. y Mural, R.J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:
11.261, 1991), un sistema de reconocimiento de genes a base de
redes neuronales, para examinar la secuencia del
2A5-3 \lambda buscando potenciales regiones
codificantes. La búsqueda del GRAIL evalúa el potencial de
codificación de una secuencia de ADN dentro de una ventana de 100
pb corrediza. Para evitar el sesgo, las búsquedas de las potenciales
regiones codificantes se realizaron con y sin respecto a
características genómicas adicionales (por ejemplo, uniones de
procesamiento e inicios de traducción). Los resultados de las
búsquedas con GRAIL no señalaron ninguna región de alta
potencialidad codificante de proteínas dentro de la secuencia del
2A5-3 \lambda.
El fin de este experimento fue determinar si las
secuencias que rodean al sitio de integración del TNFrFc en la
línea celular CHO 2A5-3 podrían conferir alta
expresión a esta proteína cuando se integra aleatoriamente en las
células DXB11. Este sitio de integración se clonó como se describe
en el ejemplo 1 y las células CHO DXB11 se cotransfectaron con 5
\mug del ADN del 2A5-3 \lambda o bien con 5
\mug de un plásmido control y con 1 \mug de ADN del pSV3NEO
(este vector de expresión contiene el gen marcador de resistencia a
G418 controlado por el promotor del SV40) usando la trasformación
con fosfato cálcico. Las células control se transformaron con un
vector de expresión del TNFrFc denominado pCAVDHFRp80 que consiste
en la expresión controlada por el promotor / intensificador del CMV
de un mensaje bicistrónico en el que el primer intrón es la
secuencia codificante del TNFrFc y el segundo intrón codifica la
DHFR murina. El pCAVDHFRp80 es el plásmido que se usó para
construir la línea celular 2A5-3. Después de un
periodo de recuperación de 48 horas se dividieron las células a 1.3
ó 1.2 en placas de 10 cm con medio que contenía G418 400 \mug /
ml. después de siete a nueve días de selección en el medio que
contenía G418, se detectaron las colonias resistentes, se
seleccionaron 24 conjuntos que consistían en una a tres colonias y
se sembraron en placas de 24 pocillos.
Cuando las células alcanzaron la confluencia, se
cambió el medio por medio sin GHT para seleccionar células
DHFR^{+}. Se analizaron ocho de los conjuntos doblemente
seleccionados en su productividad específica de TNFrFc mediante
ELISA tal como se describe en el ejemplo 5 y se encontró que el 40%
de los conjuntos tenía niveles de expresión del 75% o más con
respecto a la línea celular parental (véase la tabla 1 más
adelante).
\hskip2mm* 1: línea celular parental (control positivo);
\hskip2mm2-9: conjuntos de células transformadas con 2A5-3 \lambda;
\hskip2mm10-12: conjuntos de células transformadas con CAVDHFRTNFrp80 (control negativo)
\hskip2mm** BR: por debajo del intervalo
Tres de estos conjuntos se controlaron a lo largo
de 10 pases y se encontró que la expresión permanecía mayor o igual
a la de la línea parental, tal como se muestra en la tabla 2 más
adelante.
Este experimento se repitió haciendo una segunda
cotransfección y se obtuvieron resultados similares. En ambos
experimentos de cotransfección, se observó un descenso en la
producción específica a medida que los conjuntos se subcultivaban
muy probablemente debido al hecho de que, en la población celular
mezclada de los conjuntos, las células de más rápido crecimiento
que producen menores cantidades de la proteína recombinante
sobrepasarán las células de crecimiento más lento y de más alta
productividad. Incluso con el descenso en la producción específica,
todos los conjuntos de las células mantuvieron niveles de producción
mayores o iguales que el de la línea celular parental. Los
resultados indican que el inserto de ADN del 2A5-3
\lambda puede conferir la expresión de una proteína indicadora
cerca de la de la línea celular parental a una alta frecuencia
(\geq40%) cuando se integra aleatoriamente en el ADN celular de
las CHO DXB11.
En una segunda serie de experimentos de
cotransfección, se determinó que fragmentos más cortos del ADN del
2A5-3 \lambda pueden conferir una alta expresión
de las proteínas recombinantes pero con una frecuencia menor que en
el caso del 2A5-3 \lambda. Se subclonaron
diversas porciones del inserto fágico en el bluescriptII
(Stratagene, La Jolla, CA), o en el pGEM-11Zf(-)
(Promega, Madison, WI) para cartografiar mediante secuenciación y
restricción, usando técnicas estándar de corte con enzimas de
restricción y ligación (véase la figura 1). Para los estudios de
expresión de la proteína, se hicieron derivar diversos insertos del
clon del fago mostrado en la figura 1A y se subclonaron en el pGEM1
(Promega, Madison, WI). Los sitios de restricción usados para la
subclonación se indican en el mapa de restricción presentado en la
figura 1A.
Las células CHO DXB11 se transfectaron con 0,2
\mug de las secuencias que codifican el TNFrFc para cada plásmido
de expresión del TNFrFc y con 0,1 \mug del pSV3neo usando el
reactivo de Lipofectamine^{TM} (Gigco BRL, Gaithersburg, MD).
Después de un periodo de 48 horas, las células se dividieron a 1:4 ó
1:40 en medio con G418 para la selección. Las colonias se hicieron
visibles en un periodo de tiempo de 7-10 días,
punto en el que se cambió el medio por un medio -H o -GHT para la
selección de DHFR. Después de la selección durante
10-13 días en medio para la selección de DHFR, se
picaron y se sembraron conjuntos de 1-3 colonias en
recipientes de 24 pocillos. Se tomaron muestras de los cultivos en
confluencia y se registró la frecuencia de expresión alta (véase la
tabla 3). Se encontró que la expresión alta podía conseguirse con
vectores que contenían como mínimo un fragmento
EcoRI-SwaI de 2,8 kb situado a 3,9 kb a partir del
promotor del CMV y una secuencia de 1,9 kb situada inmediatamente a
5' del promotor del CMV (PG5.7\DeltaS). Los plásmidos que
contenían cantidades más grandes del inserto (PG8.5 y PG5.7)
también fueron eficaces a la hora de intensificar la expresión.
Se preparó un conjunto similar de plásmidos de
expresión que comprendían el ADN que codifica la porción
extracelular del ligando del Flt-3 (Lyman y col.,
Blood 83: 2795, 1994 y documento USSN 08/242.545, expedido el 11 de
mayo de 1994) y se analizó como se describe anteriormente. Tal como
se observó para el TNFrFc pueden conseguirse altos niveles de
expresión con el vector PG5.7\DeltaS pero no con el vector PG2.2
o el vector PG.2. Los resultados de estos experimentos indican que
la alta frecuencia de expresión alta de la proteína recombinante no
es específica de la proteína y que la banda
EcoRI-SwaI de 1,8 kb es esencial para esta
actividad.
Se prepararon fragmentos adicionales y se
analizaron en su actividad de aumento de la expresión. La
construcción PG3.6 comprendía un fragmento EcoRI, representado por
los nucleótidos 8672 a 12.273 de la SEQ ID Nº: 1; este fue ligado a
los nucleótidos 14.290 a 14.507 de una manera similar a las
construcciones PG.2SE1.8 y PG.2SH1.2. También se prepara una
construcción similar a partir del fragmento BbsI representado por
los nucleótidos 10.100 a 14.293 de la SEQ ID Nº: 1. Ambas
construcciones mostraron una actividad de aumento de la expresión
que fue comparable a la de la construcción PG5.7. Una construcción,
denominada PG3.8, que consistía en un fragmento BamHI (nucleótidos
2221-5984) ligado a los nucleótidos 14.290 a 14.507
de la SEQ ID Nº: 1, no mostraba actividad.
Los resultados de estos experimentos indican que
la región del ADN del 2A5-3 \lambda que nuestra
actividad de aumento de la expresión está comprendida
principalmente entre los nucleótidos 5980 (el sitio BamHI en la
figura 1) y el 14.290 (el sitio BbsI de la figura 1). Los
experimentos adicionales usando el promotor / intensificador del
SV40 demostraron que la actividad de aumento de la expresión no era
dependiente del promotor. Adicionalmente, también se introdujeron
exitosamente en células construcciones que contenían EASE mediante
electroporación y mostraron actividad de aumento de la expresión.
Sin embargo, la actividad de aumento de la expresión no se observó
cuando las construcciones que contenían EASE se transfectaron en
una línea celular de mono (Vero), indicando la posibilidad de
especificidad dependiente de especie o de tipo celular para el EASE
de la SEQ ID Nº: 1.
Para cuantificar de un modo más exacto la
expresión a partir de los clones transfectados con los plásmidos
que contienen longitudes más cortas del ADN del sitio de
integración y compararla con la de los clones que derivan de la
transfección con el ADN del fago, se comparó la productividad
específica de los tres conjuntos de mayor expresión transformados
con la construcción PG5.7\DeltaSTNFrFc con la de los tres
conjuntos de mayor expresión transformados con el ADN del fago
(tabla 4). En este experimento se encontró que el nivel de
expresión de todos los seis conjuntos no fue significativamente
diferente cuando se comparaba usando una prueba T estándar (p =
0,14).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados, tomados junto con los datos de
la frecuencia mostrados en la tabla 3, indican que el vector
PG5.7\DeltaS contiene toda la información de secuencia necesaria
para la expresión a un alto nivel.
Para caracterizar adicionalmente la actividad de
intensificación de la expresión encontrada en los vectores de
expresión derivados del 2A5-3 \lambda, se realizó
un ensayo de formación de colonias. En este, las células DXB11 se
transfectaron con 0,16 \mug de secuencias codificantes de la DHFR
de los plásmidos PG8.5, PG5.7\DeltaS, PG.2SE1.8, PG.2SH1.2 y PG.2
usando Lipofectamine^{TM}. Después de un periodo de expresión de
48 horas las células se sembraron a 1 x 10^{4} células / placa en
medio -GHT que contenía diversas concentraciones de MTX. Después de
nueve a once días, se fijaron las placas con metanol y se tiñeron
con azul de metileno para la formación de colonias. Se detectó más
formación de colonias con los plásmidos PG8.5, PG5.7\DeltaS y
PG2SE1.8 en comparación con los plásmidos PG.2SH1.2 y PG.2 a 0 nM y
10 nM de MTX (véase la tabla 5).
Estos datos indican que el fragmento
EcoRI-SwaI de 1,8 kb contenido en el PG.2E1.8 es
esencial para la función EASE. Por otro lado, el fragmento
HpaI-EcoRI de 0,6 kb contenido en esta región es
crítico para la actividad EASE (compárense los resultados con
PG.2SH1.2 y PG.2). Los plásmidos con longitudes mayores del ADN
genómico de las CHO, es decir, PG8.5 y PG5.7\DeltaS, proporcionan
más formación de colonias a una presión selectiva aumentada (25 nM
y 50 nM de MTX) cuando se compara con el plásmido PG.2SE1.8. Esta
formación de colonias diferencial a una presión selectiva mayor
indica que la presencia de extensiones mayores del ADN genómico de
las CHO en un plásmido confiere una frecuencia mayor de expresión
alta que las extensiones más cortas del ADN genómico de las
CHO.
Se hicieron ensayos de expresión transitoria para
determinar si la actividad de aumento de la expresión actúa como un
intensificador o promotor clásico que puede incrementar la
expresión en ADN no cromosómico expresado transitoriamente. Se
transfectaron transitoriamente células CHO con el plásmido PG8.5 y
el plásmido PG2.2, de los que se había mostrado que el primero de
los cuales tenía actividad EASE mientras que el último no (tal como
se demostró en el ejemplo 7), usando una técnica con
Lipofectamine^{TM} tal como se describe previamente. Después de
48 horas, se recogieron los sobrenadantes y se analizaron en su
expresión de TNFrFc usando ELISA tal como se describe previamente.
En contraste con el experimento de expresión estable del ejemplo 7,
estos dos plásmidos proporcionaron el mismo nivel de expresión del
TNFrFc recombinante en el ensayo de expresión transitoria (véase la
tabla 6).
Estos datos indican que la función EASE requiere
la integración en el cromosoma al contrario que los
intensificadores y/o promotores conocidos previamente.
Se expresó el Flt-3L en células
CHO usando tres diferentes vectores de expresión, pCDE (véase
"expresión de proteínas recombinantes"), PG5.7 y PG5.7I. El
vector PG5.7I es un derivado del PG5.7 que contiene el IRES del
virus de la encefalomiocarditis murina clonado entre el líder
tripartito del adenovirus y el ADNc de la DHFR del PG5.7. Se
transfectaron células CHO DXB11 con los tres plásmidos de expresión
del Flt-3L descritos anteriormente usando el método
con Lipofectamine^{TM} y se seleccionaron respecto a la expresión
de DHFR en medio -GHT. Seguidamente, se mezclaron las colonias
DHFR^{+}, se sembraron en MTX 0 nM, 25 nM, 50 nM y 100 nM y se
permitió que crecieran hasta su confluencia, punto en el que se
determinó la productividad específica de los conjuntos
transfectados con cada una de las construcciones. La expresión de
cada construcción fue similar en cada concentración de MTX, sin
embargo, el tiempo requerido para completar el análisis fue sólo de
cuatro a cinco semanas para los conjuntos de células hechos con el
vector PG5.7I en comparación con las siete a ocho semanas
requeridas en los vectores pCDE y PG5.7.
Esta tendencia (el obtener similares niveles de
expresión en periodos de tiempo más cortos cuando el EASE está
presente) se ha observado con muchas proteínas diferentes, al menos
tres expresadas en el vector pCDE y más de seis expresadas con el
vector PG5.7I. En general, lleva de dos a cinco semanas menos el
producir una proteína recombinante usando vectores de expresión que
contienen secuencias EASE e IRES en comparación con los vectores de
expresión similares que contienen la secuencia IRES sola. Por otro
lado, los conjuntos de células desarrollados con el EASE fueron
estables a lo largo del tiempo y pudieron tratarse como líneas
celulares para la mayoría de los fines. Fue posible retrasar las
etapas de clonación hasta mucho más tarde en los procedimientos de
desarrollo lo que proporciona una ventaja significativa para
obtener grandes cantidades de proteínas recombinantes en un periodo
de tiempo corto.
El HuCD40L recombinante se expresó en células CHO
para la fabricación usando el vector PG5.7I. Aquí, se clonó el ADN
que codifica una forma trimérica del HuCD40L en el vector PG5.7I y
se transfectaron células CHO con el ADN del plásmido de expresión
del CD40L resultante usando Lipofectamine^{TM}. Las células se
seleccionaron primero según el fenotipo DHFR^{+}, seguidamente, se
mezclaron y se seleccionaron en MTX 50 nM. Las células que se
dejaron crecer en MTX 50 nM se clonaron usando un método de
clonación en agar blando (Gibson y col., Biotechniques 15: 594,
1993). Se picaron 18 colonias, se rastrearon en busca de la
productividad específica de HuCD40L, se seleccionaron dos líneas
celulares para la adaptación en suspensión y la producción se
desarrolló en biorreactores discontinuos y alimentados. Durante dos
desarrollos de producción de 10 y 8 días cada uno usando una de las
líneas celulares (la línea 50-B4), las células
mantuvieron una media de productividad específica de,
aproximadamente, 24 y 25 \mug / 10^{6} células / día,
respectivamente. Las valoraciones finales fueron 1,02 y 1,09 g /
litro mediante ELISA, para el desarrollo de 10 días y para el
desarrollo de 8 días, respectivamente. Este ejemplo muestra que el
uso de este vector en el desarrollo de la fabricación representa una
mejora en la técnica ya que se consiguen altos niveles de expresión
de proteína recombinante en un formato a escala con un mínimo de
rastreo (18 líneas celulares rastreadas) y de etapas de selección
(dos etapas).
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (I)
- SOLICITANTE: Morris, Arvia E. Lee, Chi-Chang Thomas, James N.
\vskip0.800000\baselineskip
- (II)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Expression Augmenting Sequence Elements
\vskip0.800000\baselineskip
- (III)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 1
\vskip0.800000\baselineskip
- (IV)
- DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A.
- DESTINATARIO: Immunex Corporation
\vskip0.500000\baselineskip
- B.
- CALLE: 51 University Street
\vskip0.500000\baselineskip
- C.
- CIUDAD: Seattle
\vskip0.500000\baselineskip
- D.
- ESTADO: WA
\vskip0.500000\baselineskip
- E.
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- F.
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 98101
\vskip0.800000\baselineskip
- (V)
- FORMA INFORMÁTICA LEGIBLE:
\vskip0.500000\baselineskip
- A.
- SOPORTE INFORMÁTICO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- B.
- ORDENADOR: Apple Power Macintosh
\vskip0.500000\baselineskip
- C.
- SISTEMA OPERATIVO: Apple Operating System Software 7.5.5
\vskip0.500000\baselineskip
- D.
- PROGRAMA: Microsoft word for Power Macintosh, version 6.0.1
\vskip0.800000\baselineskip
- (VI)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- A.
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- B.
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 10 de enero DE 1997
\vskip0.500000\baselineskip
- C.
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (VII)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- A.
- NÚMERO DE SOLICITUD: USSN 08/586.509
\vskip0.500000\baselineskip
- B.
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 11 de enero de 1996
\vskip0.500000\baselineskip
- C.
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (VIII)
- INFORMACIÓN DEL EXPEDIENTE DEL AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- A.
- NOMBRE: Perkins, Patricia Anne.
\vskip0.500000\baselineskip
- B.
- NÚMERO DE REGISTRO: 34.693
\vskip0.500000\baselineskip
- C.
- NÚMERO DE EXPEDIENTE DE REFERENCIA: 2841-WO
\vskip0.800000\baselineskip
- (IX)
- INFORMACIÓN PARA LA TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- A.
- TELÉFONO: (206) 587-0430
\vskip0.500000\baselineskip
- B.
- TELEFAX: (206) 233-0644
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 1.
\vskip0.800000\baselineskip
- (I)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A.
- LONGITUD: 14507 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- B.
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- C.
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- D.
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (II)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (III)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (IV)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (VI)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- A.
- ORGANISMO: Hámster chino
\vskip0.800000\baselineskip
- (VII)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- B.
- CLON: SECUENCIA DE CHO 2A5-3 \lambda.
\vskip0.800000\baselineskip
- (XI)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (11)
1. Un elemento de secuencia que aumenta la
expresión (EASE) aislado, seleccionado del grupo constituido por
moléculas de ADN que comprenden los nucleótidos 1 a 14.507,
nucleótidos 5980 a 14.507, nucleótidos 8671 a 14.507, nucleótidos
8671 a 10.515, nucleótidos 9277 a 10.515, nucleótidos 8672 a 12.273,
nucleótidos 10.100 a 14.293 de la SEQ ID Nº: 1, fragmentos de las
moléculas de ADN anteriores que tienen actividad de aumento de la
expresión, moléculas de ADN complementarias a las de ADN
anteriores, moléculas de ADN que son, al menos, aproximadamente,
idénticas en el 80% de la secuencia de nucleótidos de las moléculas
de ADN anteriores y que tienen actividad de aumento de la expresión
y combinaciones de las moléculas de ADN anteriores que tienen
actividad de aumento de la expresión.
2. Un EASE de acuerdo con la reivindicación 1,
seleccionado del grupo constituido por moléculas de ADN que
consisten en los nucleótidos 1 a 14.507, nucleótidos 5980 a 14.507,
nucleótidos 8671 a 14.507, nucleótidos 8671 a 10.515, nucleótidos
9277 a 10.515, nucleótidos 8672 a 12.273 y nucleótidos 10.100 a
14.293 de la SEQ ID Nº: 1.
3. Un EASE de acuerdo con la reivindicación 2,
que está ligado a un ADN que comprende los nucleótidos 14.290 a
14.507 de la SEQ ID Nº: 1.
4. Un vector de expresión que comprende el EASE
de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3.
5. El vector de expresión de acuerdo con la
reivindicación 4, que es un plásmido bicistrónico en el que un
primer exón codifica una proteína de interés y un segundo exón
codifica un marcador seleccionable dominante y amplificable.
6. El vector de expresión de la reivindicación 5,
en el que el marcador seleccionable dominante y amplificable es la
reductasa del dihidrofolato (DHFR).
7. El vector de expresión de acuerdo con la
reivindicación 6, que comprende adicionalmente una secuencia IRES
entre los dos exones.
8. Una célula CHO transformada con un vector de
expresión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5, 6 ó
7.
9. Un método para obtener una proteína
recombinante, que comprende cultivar una célula hospedadora
transformada de acuerdo con la reivindicación 8 en las condiciones
que promuevan la expresión de la proteína y recuperar la
proteína.
10. Un conjunto estable de células CHO
transformadas con un vector de expresión de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 5, 6 ó 7.
11. Un método para obtener una proteína
recombinante, que comprende cultivar un conjunto estable de células
CHO de acuerdo con la reivindicación 10 en las condiciones que
promuevan la expresión de la proteína y recuperar la proteína.
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