CN115023422A - 糖基化多肽 - Google Patents

糖基化多肽 Download PDF

Info

Publication number
CN115023422A
CN115023422A CN202080095266.2A CN202080095266A CN115023422A CN 115023422 A CN115023422 A CN 115023422A CN 202080095266 A CN202080095266 A CN 202080095266A CN 115023422 A CN115023422 A CN 115023422A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
glycosylated polypeptide
antibody
polypeptide
kifunensine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080095266.2A
Other languages
English (en)
Inventor
马库斯·O·伊姆霍夫
帕鲁尔·古普塔
艾德里安·布莱克本
希拉里·梅特卡夫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fresenius Kabi Deutschland GmbH
Original Assignee
Fresenius Kabi Deutschland GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fresenius Kabi Deutschland GmbH filed Critical Fresenius Kabi Deutschland GmbH
Publication of CN115023422A publication Critical patent/CN115023422A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及kifunensine用于增加糖基化多肽的唾液酸化的用途，其中将产生糖基化多肽的细胞与kifunensine接触。还提供了用于增加糖基化多肽的唾液酸化和生产糖基化多肽的相关方法，以及糖基化多肽和包含其的药物组合物，及其在医药中的用途。

Description

糖基化多肽
本发明涉及糖基化多肽及其生产。
多肽(如治疗性多肽)的糖基化谱是一个重要的特征，它可以影响：通过半衰期变化的生物活性；通过改变折叠对抗原或底物的亲和力；和抗体依赖性细胞毒性(ADCC，负责抗体治疗效果的机制之一)。重组多肽的糖基化谱受用于其生产的细胞系和各种细胞培养参数的影响，包括例如pH、温度、细胞培养基组成和培养持续时间。
多肽糖基化的调节与上市的治疗性多肽特别相关，因为糖基化水平(如甘露糖基化和/或唾液酸化水平)会影响治疗效用和安全性。此外，在生物类似化合物的框架中，重组多肽的糖基化谱的控制是至关重要的，因为所述重组多肽的糖基化谱必须与参考产品的糖基化谱相当。特定聚糖结构的富集是工艺开发过程中的挑战之一。
聚糖的末端唾液酸化对于治疗性多肽是特别重要的，由于体内半衰期缩短，去唾液酸化的糖基化多肽表现出降低的治疗功效。
迄今为止，唾液酸化主要通过以下方式来进行操纵：(i)非选择性细胞培养添加剂；或(ii)唾液酸化中所涉及的关键酶的表达受到调节的转基因细胞系。
非选择性细胞培养添加剂包括相关的过渡金属辅因子。所述金属辅因子可以通过调节糖基化途径的酶来调节多肽的糖基化谱。例如，已显示锰在尿苷和半乳糖存在的情况下增强N-连接聚糖的唾液酸化。虽然过渡金属的使用已得到广泛认可，但它们特异性的缺乏意味着需要进行严格的表征，以确定在不影响其他参数(如细胞活力)的情况下达到所需水平的每种特定聚糖结构所需的精确培养基组成。
表达改变水平的唾液酸转移酶(其将唾液酸转移到多糖链上，包括在糖基化多肽上发现的那些)的工程化细胞已被用于影响所得多肽的唾液酸化。这些细胞系需要大量、耗时的开发，并且可能仅可用于生产特定的糖基化多肽或糖基化多肽类别。
因此，尽管近年来该领域取得了许多方法学进展，但仍需要用于调节多肽糖基化(特别是唾液酸化)的改进培养条件和方法。
本发明克服了上述的一个或多个问题。
本发明的发明人已经发现了kifunensine增加糖基化多肽的唾液酸化。鉴于kifunensine的甘露糖苷酶抑制活性，唾液酸化的增加是完全出乎意料的，因为通常认为甘露糖苷酶活性是唾液酸化必需的。甘露糖苷酶处理聚糖以除去甘露糖，从而实现半乳糖基化；末端唾液酸化的底物。换言之，唾液酸化就是依赖于被kifunensine抑制的途径，因此与发明人的发现相反，可以预期的是使用kifunensine将导致唾液酸化降低。
在一个方面中，本发明提供了kifunensine用于增加糖基化多肽的唾液酸化的用途，其中将产生糖基化多肽的细胞与kifunensine接触。
在相关方面中，本发明提供了用于增加糖基化多肽的唾液酸化的方法，该方法包括：
a.提供产生糖基化多肽的细胞；和
b.将细胞接触kifunensine，由此增加由细胞产生的糖基化多肽的唾液酸化。
在另一个方面中，本发明提供一种用于生产唾液酸化增加的糖基化多肽的方法，该方法包括：
a.提供产生糖基化多肽的细胞；和
b.将细胞接触kifunensine，由此产生唾液酸化增加的糖基化多肽。
有利地，本发明的发明人已经发现了使用单一试剂kifunensine可以容易地操纵糖基化多肽的甘露糖基化和唾液酸化，而无需改变例如所用的细胞系。
如本文使用的术语“kifunensine”是指(5R,6R,7S,8R,8aS)-6,7,8-三羟基-5-(羟甲基)-1,5,6,7,8,8a-六氢咪唑[1,2-a]吡啶-2,3-二酮及其药理活性盐、衍生物或类似物。优选地，术语“kifunensine”仅指(5R,6R,7S,8R,8aS)-六氢-6,7,8-三羟基-5-(羟甲基)-咪唑并[1,2-a]吡啶-2,3-二酮。Kifunensine的化学文摘社登记号(CAS No.)为109944-15-2。
在一个实施方案中，kifunensine的“药理活性盐、衍生物或类似物”是与kifunensine呈现相似功能特性的产品。优选地，所述药理活性盐、衍生物或类似物抑制甘露糖苷酶I。kifunensine的药理活性盐、衍生物或类似物与kifunensine相比时可以呈现出提高的甘露糖苷酶I抑制活性或可以呈现出至少50％(例如至少60％、70％、80％或90％)的kifunensine的甘露糖苷酶I抑制活性。
Kifunensine是一种最初从放线菌Kitasatosporia kifuense分离的生物碱，是一种公认的α-甘露糖苷酶I(甘露糖基寡糖1,2-α-甘露糖苷酶[EC 3.2.1.113])的抑制剂。这种酶催化来自N-连接聚糖的末端α-1,2-连接的甘露糖残基的水解。因此，Kifunensine对α-甘露糖苷酶I的抑制作用可用于在培养的哺乳动物细胞中制备高甘露糖糖蛋白。
如本文所用的，术语“糖基化多肽”是指与至少一种多糖(“聚糖”)缀合的多肽。在糖基化多肽上发现的主要碳水化合物部分是岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、N-乙酰半乳糖胺(“GalNAc”)、N-乙酰葡糖胺(“GlcNAc”)、木糖和唾液酸。聚糖的性质可能会影响它们所缀合的蛋白质的三维结构和稳定性。在天然存在的糖基化多肽中发现的聚糖结构分为两大类：“N-连接的聚糖”(在真核细胞中发现的主要形式)和“O-连接的聚糖”。在真核细胞中表达的多肽通常包含N-聚糖。N-连接的糖蛋白的糖基的加工发生在内质网的管腔中，并在高尔基体中继续进行。这些N-连接的聚糖与多肽一级结构中的天冬酰胺残基在含有氨基酸序列天冬酰胺-X-丝氨酸/苏氨酸(其中“X”是除脯氨酸和天冬氨酸之外的任何氨基酸残基)的位点缀合。N-聚糖在包含糖的分支(也称为“分叉”)的数量以及所述分支的性质方面不同，其(除了核心结构之外)可以包括例如甘露糖、GlcNAc、半乳糖、GalNaC、岩藻糖和/或唾液酸(包括N-乙酰神经氨酸，在人体细胞中发现的主要唾液酸)。对于标准糖生物学命名的综述，参见Essentials of Glycobiology，1999，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ISBN-10:0-87969-559-5，其通过引用并入本文。
根据本发明的糖基化多肽优选是与包含唾液酸残基的聚糖缀合的多肽。因此，在优选实施方案中，糖基化多肽是唾液酸化多肽。在一个实施方案中，本发明的糖基化多肽可以是在非重组条件下(例如，在体内内源性)表达时唾液酸化的多肽。
如本文所用的，术语“唾液酸化”是指将唾液酸残基添加到糖基化多肽上发现的聚糖结构上。类似地，“唾液酸化”也可以指包含唾液酸的聚糖与多肽的缀合。唾液酸最常见于聚糖的末端位置。唾液酸化可显著影响这些多肽的安全性和有效性。特别地，一些生物药物的体内半衰期与多糖唾液酸化的程度相关。此外，唾液酸化模式可以是制造过程中产品一致性的非常有用的衡量标准。在哺乳动物表达系统中产生的生物药物中发现的两种主要类型的唾液酸残基是N-乙酰神经氨酸(NANA)和N-羟乙酰神经氨酸(NGNA)。这些通常作为连接于N-和O-连接聚糖的非还原性末端的半乳糖残基的末端结构出现。
糖基化多肽可以来自任何合适的来源。例如，所述多肽可以是真核或原核多肽。在一个实施方案中，本发明的糖基化多肽是真核多肽，优选哺乳动物糖基化多肽，例如人或鼠糖基化多肽。在特别优选的实施方案中，糖基化多肽是人糖基化多肽。
在其他实施方案中，糖基化多肽可以是包含来自多个来源的多肽序列的嵌合体，例如，包括人和鼠序列。
在一个实施方案中，糖基化多肽是重组糖基化多肽，如重组抗体或其抗原结合部分，优选重组抗体。
糖基化多肽可以适当地是治疗性蛋白质。具有实际或潜在治疗用途的蛋白质是本领域技术人员已知的。作为非限制性实例，糖基化多肽可以是抗体或抗体的抗原结合部分(如人抗体或其抗原结合部分、人源化抗体或其抗原结合部分、嵌合抗体或其抗原结合部分、双特异性抗体或其抗原结合部分)、激素(如促红细胞生成素(EPO)、甲状旁腺激素、生长激素、胰岛素或胰高血糖素)、Fc-融合多肽、白蛋白融合多肽(例如，在融合伴侣与白蛋白融合的情况中)、酶或细胞因子。
在一个实施方案中，糖基化多肽是Fc-融合多肽。Fc-融合多肽是本领域已知的并且描述于Czajkowsky等(2012)，4(10)，1015-1028，其通过引用并入本文中。Fc融合多肽包含(或由其组成)与融合伴侣连接的免疫球蛋白Fc结构域。所述融合伴侣可以是目的多肽(或肽)，如配体、抗原、“诱饵”(用于鉴定结合伴侣，例如在阵列中)、胞外结合结构域或受体，或治疗性多肽。有利地，认为Fc结构域增加融合伴侣的血浆半衰期并使Fc-融合体能够与免疫细胞上的Fc-受体(FcR)相互作用；这一特征对于它们在肿瘤疗法和疫苗中的应用尤为重要。作为非限制性实例，Fc-融合多肽可以是阿巴西普(abatacept)、阿非西普(afilbercept)、阿法西普(alefacept)、贝拉西普(belatacept)、依他奈普(etarnecept)或利洛西普(rilonacept)。
优选，本发明的糖基化多肽是抗体或其抗原结合部分。
术语“抗体(antibody)”及其复数形式“抗体(antibodies)”尤其包括多克隆抗体、亲和纯化的多克隆抗体、单克隆抗体和抗原结合部分/片段，如F(ab')2、Fab蛋白水解片段和单链可变区片段(scFv)。因此，在一个实施方案中，本文的抗体是抗体的抗原结合部分。还包括基因工程化的完整抗体或片段，如嵌合抗体、人源化抗体、人或完全人抗体、scFv和Fab片段，以及合成的抗原结合肽和多肽。
术语“人源化”免疫球蛋白(或“人源化抗体”)是指包含人框架区和来自非人(通常是小鼠或大鼠)免疫球蛋白的一个或多个CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人免疫球蛋白称为“供体”，而提供框架的人免疫球蛋白称为“受体”。人源化可以通过将非人CDR移植到人框架和恒定区上，或通过将整个非人可变结构域整合到人恒定区上(嵌合)来进行。恒定区不是必需存在的，但如果存在，它们必须与人免疫球蛋白恒定区基本相同，即至少约85-90％，优选约95％或更多相同。因此，如果需要调节效应子功能，可能除了CDR和重链恒定区中的少数残基外，人源化免疫球蛋白的所有部分与天然人免疫球蛋白序列的相应部分基本相同。通过人源化抗体，可以延长生物半衰期，并降低对人类给药后产生不良免疫反应的可能性。
术语“完全人”免疫球蛋白(或“完全人”抗体)是指包含人框架区和人CDR的免疫球蛋白。恒定区不是必需存在的，但如果存在，它们必须与人免疫球蛋白恒定区基本相同，即至少约85-90％，优选约95％或更多相同。因此，如果需要调节效应子功能或药代动力学特性，可能除了重链恒定区中的几个残基外，完全人免疫球蛋白的所有部分与天然人免疫球蛋白序列的相应部分基本相同。在一些情况下，可以在CDR、框架区或恒定区内引入氨基酸突变，以提高结合亲和力和/或降低免疫原性和/或提高抗体的生化/生物物理特性。
术语“重组抗体”(或“重组免疫球蛋白”)是指通过重组技术产生的抗体。用于产生抗体的重组宿主细胞包括重组原核和真核细胞；优选哺乳动物宿主细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(包括CHO-S细胞或CHO-k1细胞)。因此，术语“重组抗体”是指在重组(例如哺乳动物)细胞中产生的抗体。由于重组DNA技术在抗体产生中的相关性，人们不必局限于天然抗体中发现的氨基酸序列；可以重新设计抗体以获得所需的特性。可能的变化有很多，范围从例如可变结构域或恒定区的仅一个或几个氨基酸的改变到完全重新设计。通常，恒定区的改变是为了提高、降低或改变特征，如补体固定(例如补体依赖性细胞毒性，CDC)、与Fc受体的相互作用和其他效应子功能(例如抗体依赖性细胞毒性，ADCC)、药代动力学特性(例如结合新生儿Fc受体；FcRn)。进行可变结构域中的改变以提高抗原结合特征。除了抗体外，免疫球蛋白还可以多种其他形式存在，包括例如单链或Fv、Fab和(Fab')2，以及双抗体、线性抗体、多价或多特异性杂合抗体。
术语“抗体部分”或“抗体片段”是指完整或全长链或抗体的片段，通常是结合区或可变区。所述部分或片段应保持完整链/抗体的至少一种活性，即它们是“功能性部分”或“功能性片段”。如果它们保持至少一种活性，则它们优选保持靶结合特性。抗体部分(或抗体片段)的实例包括但不限于“单链Fv”、“单链抗体”、“Fv”或“scFv”。这些术语是指包含来自重链和轻链的可变结构域但缺少恒定区的抗体片段，所有这些都在单个多肽链内。通常，单链抗体在VH和VL结构域之间进一步包含多肽接头，这使其能够形成允许抗原结合的所需结构。在特定实施方案中，单链抗体也可以是双特异性的和/或人源化的。“Fab片段”由一条轻链以及一条重链的可变结构域和CH1结构域组成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。含有一条轻链和一条重链并在CH1和CH2结构域之间含有恒定区更多一部分的“Fab'片段”使得可以在两条重链之间形成链间二硫键，称为F(ab')2分子。“F(ab')2”含有两条轻链和两条重链，两条重链在CH1和CH2结构域之间含有恒定区的一部分，使得在两条重链之间形成链间二硫键。
本发明的多肽可以是全长抗体或其片段。优选地，本发明的多肽是包含(或由其组成)存在于全长抗体(例如，可获自哺乳动物，如人或小鼠)中的每个抗体区域/结构域的全长抗体。所述抗体可以包含(或由其组成)两条重链和两条轻链，其中重链各自包含(或由其组成)VH结构域、CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域，并且轻链各自包含(或由其组成)CL结构域和VL结构域。
在优选实施方案中，根据本发明的抗体是单克隆抗体(或其抗原结合部分)。
在一个实施方案中，抗体是包含Fab、F(ab)2或单链可变片段(scFv)或由Fab、F(ab)2或单链可变片段(scFv)组成的抗原结合部分。
根据本发明，抗体或其抗原结合部分属于任何Ig类型，例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分可以是阿达木单抗(adalimumab)、阿昔单抗(abciximab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维单抗(avelumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、贝伐单抗(bevacizumab)、布达鲁单抗(brodalumab)、赛妥珠单抗(certolizumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、达雷妥尤单抗(daratumumab)、达利珠单抗(daclizumab)、地诺单抗(denosumab)、度匹鲁单抗(dupilumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、依库珠单抗(eculizumab)、依法珠单抗(efalizumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、戈利木单抗(golimumab)、古塞库单抗(guselkumab)、伊布单抗(ibritumomab)、英夫利昔单抗(infliximab)、艾克珠单抗(ixekizumab)、莫罗单抗(muromonab)-CD3、那他珠单抗(natalizumab)、纳武单抗(nivolumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、帕利珠单抗(palivizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、雷珠单抗(ranibizumab)、利桑珠单抗(risankizumab)、利妥昔单抗(rituximab)、苏金单抗(secukinumab)、替拉珠单抗(tildrakizumab)、托珠单抗(tocilizumab)、托西莫单抗(tositumomab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、优特克单抗(ustekinumab)或维多珠单抗(vedolizumab)。
在其中糖基化多肽是抗体的一些实施方案中，糖基化多肽是IgG1抗体或IgG2抗体。有利地，本发明人已经显示了通过将产生所述抗体的细胞与kifunensine接触来增加IgG1和IgG2抗体的唾液酸化。
本发明的抗体或其抗原结合部分可以结合一种或多种抗原，优选同时结合。例如，抗体可以结合两种抗原(双特异性抗体)或三种抗原(三特异性抗体)。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合部分结合具有已知或潜在治疗意义的抗原，如疾病相关抗原。作为非限制性实例，抗体或其抗原结合部分可以结合疾病(例如癌症、炎性疾病、自身免疫疾病、心血管疾病或眼科疾病)的起始、发展、进展或恶化中所涉及的抗原。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合部分是结合细胞因子或其受体的抗体或其抗原结合部分，例如，结合白细胞介素-6(IL-6)、IL-6受体(例如WO 2019/043096中描述的托珠单抗(tacilizumab))、肿瘤坏死因子α(TNFα)、TNFα受体、白细胞介素12(IL-12)、IL-12受体、白细胞介素23(IL-23)、IL-23受体、白细胞介素17(IL-17)、IL-17受体、白细胞介素17A(IL-17A)或IL-17A受体中的一种或多种的抗体或其抗原结合部分。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分是抗IL-12和/或抗IL-23抗体。例如，抗-IL-12和/或抗-IL-23抗体或其抗原结合部分可以是优特克单抗(ustekinumab)、古塞库单抗(guselkumab)、替拉珠单抗(tildrakizumab)或利桑珠单抗(risankizumab)。在一个优选的实施方案中，抗-IL-12和抗-IL-23抗体是优特克单抗(ustekinumab)。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分是抗IL-17抗体或抗IL-17受体抗体。例如，抗IL-17抗体可以是苏金单抗(secukinumab)或艾克珠单抗(ixekizumab)，抗IL-17受体抗体可以是布达鲁单抗(brodalumab)。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分是抗TNFα抗体。例如，抗TNFα抗体或其抗原结合部分可以是戈利木单抗(golimumab)、阿达木单抗、依那西普或赛妥珠单抗。在优选的实施方案中，抗TNFα抗体或其抗原结合部分是戈利木单抗(golimumab)。
在一些实施方案中，抗TNFα抗体或其抗原结合部分包含与SEQ ID NO:1具有至少70％序列同一性的重链。例如，抗TNFα抗体或其抗原结合部分可包含与SEQ ID NO:1具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链。优选地，抗TNFα抗体或其抗原结合部分包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:1(更优选由其组成)。
在一些实施方案中，抗TNFα抗体或其抗原结合部分包含与SEQ ID NO:2具有至少70％序列同一性的轻链。例如，抗TNFα抗体或其抗原结合部分可包含与SEQ ID NO:2具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链。优选地，抗TNFα抗体或其抗原结合部分包含轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:2(更优选由其组成)。
在一些实施方案中，抗TNFα抗体或其抗原结合部分包含与SEQ ID NO:1具有至少70％序列同一性的重链和与SEQ ID NO:2具有至少70％序列同一性的轻链。优选地，抗TNFα抗体或其抗原结合部分包含与SEQ ID NO:1具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链和与SEQ ID NO:2具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链。甚至更优选地，抗TNFα抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:1(更优选地由其组成)和所述轻链包含SEQ ID NO:2(更优选地由其组成)。
在一些实施方案中，抗TNFα抗体或其抗原结合部分包含与SEQ ID NO:1的相应VH序列具有至少70％同一性的重链可变区(VH)。优选地，抗TNFα抗体或其抗原结合部分包含与SEQ ID NO:1的相应VH序列具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的VH。甚至更优选地，抗TNFα抗体或其抗原结合部分包含VH，其包含(更优选地由其组成)SEQ ID NO:1的相应VH序列。
在一些实施方案中，抗TNFα抗体或其抗原结合部分包含与SEQ ID NO:2的相应VL序列具有至少70％序列同一性的轻链可变区(VL)。优选地，抗TNFα抗体或其抗原结合部分包含与SEQ ID NO:2的相应VL序列具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的VL。甚至更优选地，抗TNFα抗体或其抗原结合部分包含VL，其包含(更优选地由其组成)SEQ ID NO:1的相应VL序列。
在一些实施方案中，抗TNFα抗体或其抗原结合部分包含与SEQ ID NO:1的相应重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3序列具有至少70％序列同一性的重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3序列。优选地，抗TNFα抗体或其抗原结合部分包含与SEQ ID NO:1的相应重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3序列具有至少序列80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3序列。甚至更优选地，抗TNFα抗体或其抗原结合部分包含重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3，其包含(更优选地由其组成)SEQ ID NO:1的相应重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3序列。
在一些实施方案中，抗TNFα抗体或其抗原结合部分包含与由SEQ ID NO:2定义的相应轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3序列具有至少70％序列同一性的轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3序列。优选地，抗TNFα抗体或其抗原结合部分包含与SEQ ID NO:2的相应轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3序列具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3序列。甚至更优选地，抗TNFα抗体或其抗原结合部分包含轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3，其包含(更优选地由其组成)SEQ ID NO:2的相应轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3序列。
在一些实施方案中，抗TNFα抗体或其抗原结合部分包含由SEQ ID NO:1的相应重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3序列组成的重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3序列，以及由SEQID NO:2的相应轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3序列组成的轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3。
在其他实施方案中，抗体或其抗原结合部分是结合核因子-κB配体的受体激活因子(RANKL)、受体酪氨酸蛋白激酶ErbB-2(HER2)、受体酪氨酸蛋白激酶ErbB-3(HER3)、血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF-A、B-淋巴细胞抗原CD20(CD20)、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性死亡配体1(PD-L1)的抗体或其抗原结合部分。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分是抗RANKL抗体或其抗原结合部分。示例性抗RANKL抗体或其抗原结合部分是地诺单抗(denosumab)。
在一些实施方案中，抗RANKL抗体或其抗原结合部分包含与SEQ ID NO:3具有至少70％序列同一性的重链。例如，抗RANKL抗体或其抗原结合部分可包含与SEQ ID NO:3具有至少80％，90％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的重链。优选地，抗RANKL抗体或其抗原结合部分包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:3(更优选由其组成)。
在一些实施方案中，所述抗RANKL抗体或其抗原结合部分包含与SEQ ID NO:4具有至少70％序列同一性的轻链。例如，抗RANKL抗体或其抗原结合部分可包含与SEQ ID NO:4具有至少80％，90％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的轻链。优选地，抗RANKL抗体或其抗原结合部分包含轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:4(更优选由其组成)。
在一些实施方案中，抗RANKL抗体或其抗原结合部分包含与SEQ ID NO:3具有至少70％序列同一性的重链和与SEQ ID NO:4具有至少70％序列同一性的轻链。优选地，抗RANKL抗体或其抗原结合部分包含与SEQ ID NO:3具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链和与SEQ ID NO:4具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链。甚至更优选地，抗RANKL抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:3(更优选由其组成)和所述轻链包含SEQ ID NO:4(更优选由其组成)。
在一些实施方案中，抗RANKL抗体或其抗原结合部分包含与SEQ ID NO:3的相应VH序列具有至少70％同一性的重链可变区(VH)。优选地，抗RANKL抗体或其抗原结合部分包含与SEQ ID NO:3的相应VH序列具有至少80％，90％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的VH。甚至更优选地，抗RANKL抗体或其抗原结合部分包含VH，其包含(更优选由其组成)SEQ ID NO:3的相应VH序列。
在一些实施方案中，抗RANKL抗体或其抗原结合部分包含与SEQ ID NO:4的相应VL序列具有至少70％序列同一性的轻链可变区(VL)。优选地，抗RANKL抗体或其抗原结合部分包含与SEQ ID NO:4的相应VL序列具有至少80％，90％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的VL。甚至更优选地，抗RANKL抗体或其抗原结合部分包含VL，其包含(更优选由其组成)SEQ ID NO:4的相应VL序列。
在一些实施方案中，抗RANKL抗体或其抗原结合部分包含与SEQ ID NO:3的相应重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3序列具有至少70％序列同一性的重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3序列。优选地，抗RANKL抗体或其抗原结合部分包含与SEQ ID NO:3的相应重链CDR1，重链CDR2和重链CDR3序列具有至少80％，90％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的重链CDR1，重链CDR2和重链CDR3序列。甚至更优选地，抗RANKL抗体或其抗原结合部分包含重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3，其包含(更优选由其组成)SEQ ID NO:3的相应重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3序列。
在一些实施方案中，抗RANKL抗体或其抗原结合部分包含与SEQ ID NO:4定义的相应轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3序列具有至少70％序列同一性的轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3序列。优选地，抗RANKL抗体或其抗原结合部分包含与SEQ ID NO:4的相应轻链CDR1，轻链CDR2和轻链CDR3序列具有至少80％，90％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的轻链CDR1，轻链CDR2和轻链CDR3序列。甚至更优选地，抗RANKL抗体或其抗原结合部分包含轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3，其包含(更优选由其组成)SEQ ID NO:4的相应轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3序列。
在一些实施方案中，抗RANKL抗体或其抗原结合部分包含由SEQ ID NO:3的相应重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3序列组成的重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3序列，以及由SEQID NO:4的相应轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3序列组成的轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3。
VH或VL通常含有三个CDR和四个框架区(FR)，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。对于任何给定的重链或轻链序列，本领域普通技术人员可以容易地鉴定分别构成CDR和FR(以及因此可变区)的氨基酸，因为它们已经以各种不同的方式定义(参见“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，Kabat，E.等，U.S.Department of Health and Human Services，(1983)；以及Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.，196:901-917(1987))。
在糖基化多肽是激素的实施方案中，激素可以是具有已知或潜在治疗应用的任何激素。在一些实施方案中，激素是人激素。在一些实施方案中，激素是促红细胞生成素(EPO)、甲状旁腺激素、生长激素、胰岛素、胰高血糖素、促卵泡激素、促黄体激素或绒毛膜促性腺激素。在一个实施方案中，糖基化多肽是调节红细胞生成的激素。优选地，激素是EPO。
在糖基化多肽是细胞因子的实施方案中，细胞因子可以是具有已知或潜在治疗应用的任何细胞因子。在一些实施方案中，细胞因子是人细胞因子。在一个实施方案中，细胞因子是干扰素(IFN)，例如IFNα2a、IFNα2b、IFNβ1a、IFNβ1b、IFNγ1b。
在一个实施方案中，糖基化多肽包含至少一个N-连接的聚糖。N-连接的聚糖可以是至少单触角、双触角、三触角或四触角的。在一个实施方案中，N-连接的聚糖是双触角聚糖。
在本发明的糖基化多肽是抗体或其抗原结合部分(优选抗体)的实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分(优选抗体)可包含至少一个与抗体的Fc部分和/或其可变区(例如重链可变区和/或轻链可变区)缀合的N-连接聚糖。优选地，抗体包含至少一个与抗体的Fc部分缀合的N-连接聚糖。
将产生糖基化多肽的细胞与kifunensine接触增加了所述多肽的唾液酸化。因此，通过实施本发明的方法或用途，所得糖基化多肽呈现出增加的唾液酸化。
术语“增加的唾液酸化”涵盖与每个多肽分子缀合的唾液酸基团的数目的增加和/或具有与其缀合的唾液酸的多肽分子(例如在本发明的方法/用途中产生的)的数目的增加。优选地，术语“增加的唾液酸化”涵盖与每个多肽分子缀合的唾液酸基团的数目的增加以及具有与其缀合的唾液酸的多肽分子(例如在本发明的方法/用途中产生的)的数目的增加。唾液酸是与糖基化多肽缀合的聚糖的成分。与每个多肽分子缀合的唾液酸基团的数目和/或与具有与其缀合的唾液酸的多肽分子的数目在本文中可称为“唾液酸化水平”。
当与相同条件下(例如，使用相同细胞系)但其中细胞未与kifunensine接触产生的相同糖基化多肽的唾液酸化相比时，唾液酸化增加。因此，为了确定唾液酸化何时增加，本领域技术人员可以将根据本发明的方法或用途产生的多肽的唾液酸化水平与相同条件下(例如，使用相同细胞系)但其中细胞未与kifunensine接触产生的相同糖基化多肽的唾液酸化水平进行比较。
唾液酸化水平可以方便地表示为％唾液酸化水平。在一个实施方案中，当与相同条件下(例如，使用相同细胞系)但其中细胞未与kifunensine接触产生的相同糖基化多肽的唾液酸化相比时，唾液酸化增加至少0.2％(优选0.5％)。在一个实施方案中，当与相同条件下(例如，使用相同细胞系)但其中细胞未与kifunensine接触产生的相同糖基化多肽的唾液酸化相比时，唾液酸化增加至少1％(优选1.5％)。优选地，当与相同条件下(例如，使用相同细胞系)但其中细胞未与kifunensine接触产生的相同糖基化多肽的唾液酸化相比时，唾液酸化增加至少2％。
在一个实施方案中，唾液酸化的增加是统计学上显著的。
在一个实施方案中，糖基化多肽是具有与其Fc部分缀合的聚糖的抗体。优选地，抗体Fc部分的唾液酸化增加和/或在所述Fc部分具有唾液酸化的抗体的数目增加。
在一些实施方案中，本发明的方法或用途可包括分析糖基化多肽的糖基化(优选唾液酸化)的进一步步骤。用于测量/表征糖基化(特别是唾液酸化水平)的方法是本领域技术人员熟知的。聚糖分析通常涉及从糖基化多肽释放聚糖(例如，酶促地)，使用液相色谱分离各个聚糖并检测它们的存在或不存在和/或组成。为了检测聚糖，通常在分析之前用荧光标签标记它们，例如2-氨基苯甲酰胺(2-AB)或2-氨基苯甲酸(2-AA)。在一个实施方案中，通过液相色谱和荧光检测测定糖基化/唾液酸化水平。优选地，液相色谱是亲水相互作用色谱(HILIC)。
质谱法也可用于分析糖基化/唾液酸化水平。质谱法可以直接在糖基化多肽上进行，或者聚糖可以从多肽中释放(例如，酶促地)并分离，并分别分析它们的结构。分离的聚糖通常通过液相色谱-质谱法分析，如HILIC-质谱法或基质辅助激光解吸电离(MALDI)-质谱法。在一个实施方案中，通过HILIC-质谱法测定糖基化/唾液酸化水平。质谱法可以是基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱法。在一些实施方案中，通过质谱法分析糖基化/唾液酸化水平，而没有先前的色谱步骤。
本发明的方法和用途包括将细胞与kifunensine接触。细胞合适地是细胞培养物的一部分。细胞可以以任何合适的方式接触，只要由所述细胞产生的糖基化多肽的唾液酸化增加即可。
合适的条件(如时间)可以由技术人员来确定，例如可以通过测量和比较不同条件下的唾液酸化水平来凭经验确定最佳条件。在一个实施方案中，细胞可以与kifunensine接触至少2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或70小时。在其它实施方案中，细胞可以与kifunensine接触至少5天。优选地，细胞可以接触至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25天。甚至更优选地，细胞可以与kifunensine接触至少15天。在一个实施方案中，细胞与kifunensine接触20天。
在一些实施方案中，细胞与浓度基本上抑制甘露糖苷酶I活性的kifunensine接触。本文中使用的术语“基本上”是指与未接触kifunensine的相同细胞的甘露糖苷酶I活性相比时，细胞的甘露糖苷酶I活性被抑制至少50％、60％、70％、80％、90％或被完全抑制。测定甘露糖苷酶I活性的方法是本领域已知的。
在一些实施方案中，细胞与浓度基本上不抑制甘露糖苷酶I活性的kifunensine接触。本文中使用的表述“基本上不抑制”是指接触kifunensine的细胞具有未接触kifunensine的相同细胞的甘露糖苷酶I活性的至少80％。优选地，接触kifunensine的细胞具有未接触kifunensine的相同细胞的甘露糖苷酶I活性的至少90％(例如至少95％、96％、97％、98％或99％)。
在一个实施方案中，可将产生糖基化多肽的细胞与包含kifunensine的溶液接触。溶液优选是培养基。换句话说，kifunensine可以存在于用于培养细胞的培养基中。术语“培养基”旨在包括适合于维持细胞的活力，并且优选进一步促进细胞的生长和分裂的任何培养基。典型的基础培养基含有可用于细胞代谢的必需成分，例如氨基酸、脂质、碳源、维生素和矿物盐。DMEM(Dulbeccos’改良Eagles培养基)、RPMI(Roswell Park MemorialInstitute Medium)或培养基F12(Ham'sF12培养基)是市售培养基的实例。或者，培养基可以是“化学成分确定的培养基(medium)”或“化学成分确定的培养基(cultrue medium)”，其中所有组分可以根据化学式描述并且以已知浓度存在。化学成分确定的培养基可以是专有培养基，完全在内部开发，或可商购获得。培养基可以不含蛋白质和/或不含血清，并且可以补充任何其他化合物，如氨基酸、盐、糖、维生素、激素或生长因子，这取决于培养中细胞的需要。
在一个实施方案中，将细胞与包含少于1mM的kifunensine的溶液接触。
在一个实施方案中，将细胞与包含浓度为750nM或更低、500nM或更低、250nM或更低或150nM或更低的kifunensine的溶液接触。
在一个实施方案中，将细胞与包含浓度为至少25nM、30nM、40nM、50nM、60nM或70nM的kifunensine的溶液接触。
在一个实施方案中，将细胞与包含浓度为25-950nM，例如30-750nM或30-250nM的kifunensine的溶液接触。在一个实施方案中，将细胞与包含浓度为30-150nM的kifunensine的溶液接触。优选地将细胞与包含浓度为35-75nM，更优选40-65nM或40-60nM，或甚至更优选约50nM的kifunensine的溶液接触。
在一个实施方案中，细胞与浓度对细胞活力没有显著影响的kifunensine接触。术语“细胞活力”可以指活细胞总数与培养物中细胞数量之间的比率。
细胞可以在细胞培养期间的任何时间与kifunensine接触。在一个实施方案中，在产生糖基化多肽前，将细胞与kifunensine接触。作为非限制性实例，细胞可以在接种到培养容器中后立即与kifunensine接触。在一些实施方案中，kifunensine将存在于加入了细胞的培养基中。当本发明采用诱导型表达系统用于生产糖基化多肽时，在生产前接触可能是特别有利的。
在一些实施方案中，将kifunensine加入其中存在细胞(例如，其中细胞生长)的培养基中。在一个实施方案中，一旦达到一定的细胞密度，细胞培养物将与kifunensine接触。术语“细胞密度”是指给定体积的培养基中的细胞数。在一些实施方案中，细胞密度为约1百万活细胞(vc)/ml或更高，例如约2百万、约3百万、约4百万vc/ml或约5百万vc/ml时，将细胞培养物与kifunensine接触。优选地，细胞密度为约2.5至5百万vc/ml时，将细胞培养物与kifunensine接触。甚至更优选地，细胞密度为约3至4百万vc/ml时，使细胞培养物与kifunensine接触。
在另一个实施方案中，在产生糖基化多肽期间(例如，一旦糖基化多肽的表达开始)，将细胞与kifunensine接触。
在一个实施方案中，在补料分批培养系统中培养细胞。术语“补料分批培养”旨在包括使细胞生长的方法，其中存在推注或连续补料培养基补充以补充消耗的营养物。这种细胞培养技术具有获得大约大于10×106至30×106个细胞/ml的高细胞密度的潜力，这取决于培养基制剂、细胞系和其他细胞生长条件。双相培养条件可以通过本领域技术人员熟知的各种补料策略和培养基配制来产生和维持。
在其中在补料分批培养系统中培养细胞的一个实施方案中，将细胞与包含kifunensine的补料培养基接触。在另一个实施方案中，细胞在整个生产阶段与包含kifunensine的补料培养基接触多次。在一些实施方案中，细胞在接种到生产生物反应器中后立即与kifunensine接触。术语“接种”旨在涵盖将细胞引入培养容器(例如通常用于生产重组糖基化多肽的生产生物反应器)中的过程。
在另一个实施方案中，在灌注培养系统中培养细胞。灌注培养是其中细胞培养物接收新鲜灌注补料培养基同时除去用过的培养基的培养。灌注可以是连续的、逐步的、间歇的或其组合。灌注速率可以是每天小于一个工作体积至许多工作体积。优选地，细胞保留在培养物中，并且去除的用过的培养基基本上不含细胞或具有比培养物显著少的细胞。灌注可以通过许多细胞保留技术完成，包括离心、沉降或过滤(参见例如Voisard等(2003)，Biotechnol Bioteng，30；82(7)，751-65)。根据本发明，糖基化多肽可以由细胞分泌到培养基(例如生长培养基)中，并在应用一种或多种上述细胞保留技术后在整个培养期间从上清液中提取。或者，分泌的多肽也可以在培养期间保留，并随后在培养结束时提取。
在其中细胞在灌注培养系统中培养的一个实施方案中，细胞在整个生产阶段与包含kifunensine的灌注补料培养基连续接触。
能够产生包含唾液酸化的糖基化多肽的任何细胞均可用于本发明。细胞可以是细胞系，例如永生化细胞系。细胞在本文中可称为“宿主细胞”。本领域技术人员将理解，本发明的细胞表达多肽，然后通过细胞糖基化。
用于本发明的细胞可以是真核细胞。合适的真核细胞可包括哺乳动物细胞(例如HEK293细胞或HeLa细胞)、酵母细胞(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)或昆虫细胞(例如杆状病毒感染的昆虫细胞)。
用于本发明的细胞可以选自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、骨髓瘤细胞系(例如，NS0、Sp2/0)、HeLa细胞、HEK 293细胞、Cos细胞、3T3细胞、PER.C6细胞、S2细胞、Sf9细胞、Sf21细胞、大肠杆菌细胞、酿酒酵母细胞和巴斯德毕赤酵母细胞。技术人员可以选择最适合于产生目的糖基化多肽的细胞类型。根据本发明也可以使用嵌合或杂交细胞。
在一个实施方案中，细胞是人细胞、非人灵长类动物细胞或啮齿动物细胞，例如鼠细胞、仓鼠细胞或人细胞。优选地，细胞是Sp2/0或CHO细胞。
用于本发明的细胞包含编码本发明多肽的核酸。本发明的核酸可以包含在用于在宿主细胞中表达的载体中。因此，本发明还提供了包含本发明的核酸的载体和宿主细胞。载体可以包含与本发明的核酸可操作地连接的启动子，并且可以进一步包含终止子。在一些实施方案中，包含编码本发明多肽的核酸的载体还包含编码选择性标记的核酸。术语“选择性标记”旨在涵盖当引入细胞时赋予适于选择所得细胞的性状的核酸序列。编码选择性标记的核酸是本领域技术人员熟知的，例如编码谷氨酰胺合成酶、二氢叶酸还原酶(DHFR)或嘌呤霉素N-乙酰转移酶的基因。或者，选择性标记可以编码如WO2008/148881中所述的Puro-DHFR融合蛋白。在本发明的多肽包含两条或更多条多肽链(例如，抗体重链和轻链)的情况下，本发明可以使用两种或更多种载体。
本发明的核酸分子可以使用本领域已知的任何合适的方法制备。在一个实施方案中，可以使用化学合成技术制备核酸分子。或者，可以使用分子生物学技术制备本发明的核酸分子。
本发明的DNA构建体可以在计算机上设计，且随后通过常规DNA合成技术合成。
根据待采用的最终宿主细胞表达系统，任选地针对密码子偏倚修饰上述核酸序列信息。
术语“核苷酸序列”和“核酸”在本文中同义使用。优选地，核苷酸序列是DNA序列。
可以分离根据本发明产生的糖基化多肽。分离由细胞产生的糖基化多肽的方法是本领域已知的。因此，在一个实施方案中，用途或方法可包括分离糖基化多肽的步骤。
分离的多肽可以不含替代多肽或细胞物质，例如基本上不含任何替代多肽或细胞物质。换句话说，当本发明的多肽构成存在的总多肽的至少90％时，优选当本发明的多肽构成存在的总多肽的至少95％、98％或99％(更优选地至少99.9％)时，融合多肽可以被认为是“分离的”。分离可以使用本领域已知的任何合适的方法来实现，如任何合适的纯化方法，例如色谱法。合适的方法可包括亲和色谱、离子交换(例如阳离子或阴离子交换)色谱和免疫亲和色谱。在一些实施方案中，本发明的多肽可以进一步包含有助于纯化的标签，如His-标签，其可以随后例如通过在标签和多肽之间工程化的切割位点(如TEV切割位点)除去。
在一个实施方案中，由细胞产生的糖基化多肽可以由细胞分泌到培养基中，并因此可以通过在过滤或不过滤的情况下收获培养基以除去细胞和其他固体材料来分离糖基化多肽。或者，糖基化多肽可以被细胞保留(例如，在细胞内或与细胞表面结合)，并且糖基化多肽可以通过裂解细胞来分离，例如通过玻璃珠的物理破坏和/或暴露于高pH条件并随后过滤。
除了增加的唾液酸化水平之外，本发明的多肽的特征还在于增加的甘露糖基化。术语“增加的甘露糖基化”涵盖与每个多肽分子缀合的甘露糖基团的数目的增加和/或具有与其缀合的甘露糖的多肽分子(例如在本发明的方法/用途中产生的)的数目的增加。优选地，术语“增加的甘露糖基化”涵盖与每个多肽分子缀合的甘露糖基团的数目的增加和具有与其缀合的甘露糖的多肽分子(例如在本发明的方法/用途中产生的)的数目的增加。甘露糖是与糖基化多肽缀合的聚糖的组分。与每个多肽分子缀合的甘露糖基团的数目和/或具有与其缀合的甘露糖的多肽分子的数目在本文中可以称为“甘露糖基化水平”。
当与在相同条件下(例如，使用相同的细胞系)但其中细胞未接触kifunensine产生的相同糖基化多肽的甘露糖基化相比时，甘露糖基化可以增加。因此，为了确定甘露糖基化何时增加，本领域技术人员可以将根据本发明的方法或用途产生的多肽的甘露糖基化水平与相同条件下(例如，使用相同的细胞系)但其中细胞未接触kifunensine产生的相同糖基化多肽的甘露糖基化水平进行比较。
甘露糖基化水平可以方便地表示为％甘露糖基化水平。在一个实施方案中，当与相同条件下(例如，使用相同的细胞系)但其中细胞未接触kifunensine产生的相同糖基化多肽的甘露糖基化相比时，甘露糖基化增加至少5％、10％、20％、30％、40％或50％。
在一个实施方案中，甘露糖基化的增加是统计学上显著的。
本发明的方法或用途优选在体外进行。
在一个方面中，本发明提供了通过本发明的方法可获得的糖基化多肽。
如本文所用的术语“可获得的”还涵盖术语“获得的”。在一个实施方案中，术语“可获得的”意指获得的。
通过本发明的方法可获得的糖基化多肽可具有期望的糖基化谱，例如，与参考糖基化多肽的糖基化谱相同或紧密匹配的糖基化谱。在一个实施方案中，通过本发明的方法可获得的糖基化多肽包含增加的唾液酸化和增加的甘露糖基化。在一个实施方案中，通过本发明的方法可获得的糖基化多肽与不存在kifunensine的情况下在相同条件下产生的相同糖基化多肽糖基化多肽相比包含增加的唾液酸化和增加的甘露糖基化。
本发明的糖基化多肽可以采用药物组合物的形式。因此，在一个方面中，本发明还提供了药物组合物，其包含：本发明的糖基化多肽；和药学上可接受的载体、赋形剂和/或盐。药学上可接受的载体、赋形剂和/或盐可有助于将糖基化多肽加工成适于给药的制剂。
口服制剂可以包括适于口服给药剂量的本领域已知的的药学上可接受的载体。此类载体使得组合物能够配制成适合于受试者摄取的片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等。
口服使用的制剂可以通过以下方式获得：将活性化合物与固体赋形剂组合，任选地研磨所得混合物，并且如果需要，在添加合适的另外的化合物后加工颗粒混合物，以获得片剂或糖衣丸芯。合适的赋形剂包括碳水化合物或蛋白质填充剂，如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇；来自玉米、小麦、水稻、马铃薯或其他植物的淀粉；纤维素，如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素钠；和树胶，包括阿拉伯胶和黄蓍胶；以及蛋白质，如明胶和胶原蛋白。如果需要，可以加入崩解剂或增溶剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或其盐。
糖衣丸芯可以具有合适的包衣，如浓缩的糖溶液，其还可以含有阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇、二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可以将染料或颜料加入到片剂或糖衣丸包衣中用于产品鉴定或表征活性化合物的量。
用于口服使用的制剂包括由明胶制成的推入配合胶囊，以及由明胶和包衣(如甘油或山梨糖醇)制成的软密封胶囊。推入配合胶囊可以含有与填充剂或粘合剂(如乳糖或淀粉)、润滑剂(例如滑石或硬脂酸镁)和任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性成分化合物可以溶解或悬浮在合适的液体中，如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇，含有或不含稳定剂。
用于肠胃外施用的制剂包括活性化合物的水溶液。对于注射，本发明的制剂可以采取水溶液的形式，优选在生理上相容的缓冲液中，如汉克氏溶液、林格氏溶液或生理缓冲盐水。水性悬浮液注射剂可含有增加悬浮液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。另外，活性化合物的悬浮液可以制成适当的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油，如芝麻油，或合成的脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。任选地，悬浮液还可以含有合适的稳定剂或增加化合物溶解度的物质，以允许制备高度浓缩的溶液。
对于局部或鼻腔给药，可以在制剂中使用适合于待渗透的特定屏障的渗透剂。
在一个方面中，本发明提供了用于药物中的本发明的糖基化多肽或药物组合物。本发明还提供了本发明的糖基化多肽或药物组合物在制备药物中的用途。本发明还提供了一种治疗方法，包括向受试者施用本发明的糖基化多肽或药物组合物。
在一个方面中，本发明提供了用于治疗癌症、炎性病症、自身免疫病症、心血管病症或眼科病症的糖基化多肽或药物组合物。在相关方面中，提供了糖基化多肽或药物组合物在制备用于治疗癌症、炎性病症、自身免疫病症、心血管病症或眼科病症的药物中的用途。同样，提供了一种治疗癌症、炎性病症、自身免疫病症、心血管病症或眼科病症的方法，该方法包括向受试者施用本发明的糖基化多肽或药物组合物。
“受试者”可以是哺乳动物，如人或其他动物。优选，“受试者”意指人类受试者。
如本文所用的术语“病症”还涵盖“疾病”。在一个实施方案中，病症是疾病。
如本文所用的术语“治疗(treat)”或“治疗(treating)”涵盖预防性治疗(例如预防病症的发作)以及矫正性治疗(治疗已经患有病症的受试者)。优选地，如本文所用的“治疗(treat)”或“治疗(treating)”意指矫正性治疗。
如本文所用的术语“治疗(treat)”或“治疗(treating)”是指病症和/或其症状。
因此，本发明的糖基化多肽或药物组合物可以以治疗有效量或预防有效量施用于受试者。
“治疗有效量”是糖基化多肽或药物组合物的任何量，当单独或组合施用于受试者以治疗所述病症(或其症状)时，其足以实现病症或其症状的这种治疗。
“预防有效量”是当单独或组合施用于受试者时抑制或延迟病症(或其症状)的发作或复发的糖基化多肽或药物组合物的任何量。在一些实施方案中，预防有效量完全预防病症的发作或复发。“抑制”发作意指降低病症发作(或其症状)的可能性，或完全预防发作。
本发明的糖基化多肽或药物组合物的施用可以口服或肠胃外完成。
在特别优选的实施方案中，肠胃外施用制剂。肠胃外递送的方法包括局部、动脉内、肌内、皮下、髓内、鞘内、心室内、静脉内、腹膜内或鼻内施用。
最佳剂量将由临床医生确定。待施用的精确剂量可以根据诸如受试者的年龄、性别和体重、施用的方法和制剂以及待治疗的病症的性质和严重程度等因素而变化。可以考虑其他因素，例如饮食、施用时间、受试者的状况、药物组合和反应敏感性。有效的治疗方案可以由负责治疗的临床医生确定。可以给予一次或多次施用，并且通常在一系列至少三次、五次或更多次施用后观察到益处。可能需要重复施用以维持组合物的有益效果。
治疗可以通过任何有效的途径施用，如通过皮下注射，尽管可以使用的替代途径包括肌内或病灶内注射、口服、气溶胶、肠胃外、局部或通过栓剂。
治疗可以作为液体制剂施用，尽管可以使用其他制剂。例如，治疗可以与合适的药学上可接受的载体混合，并且可以配制成用于口服、局部或肠胃外施用的合适组合物中的固体(片剂、丸剂、胶囊、颗粒等)。最优选地，皮下施用制剂。
涉及本发明的各种用途的实施方案旨在等同地应用于方法、糖基化多肽、药物组合物、治疗用途/方法，反之亦然。
序列同源性
可以使用多种序列比对方法中的任一种来确定同一性百分比，包括但不限于全局方法、局部方法和杂交方法，如，例如，分段逼近法。确定同一性百分比的方案是本领域技术人员范围内的常规程序。全局方法从分子的开始到结束比对序列，并通过将各个残基对的得分相加并通过施加空位罚分来确定最佳比对。非限制性方法包括例如CLUSTAL W，参见，例如Julie D.Thompson等，CLUSTAL W：Improving the Sensitivity of ProgressiveMultiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting，Position-Specific GapPenalties and Weight Matrix Choice，22(22)Nucleic Acids Research 4673-4680(1994)；和迭代细化，参见，例如Osamu Gotoh，Significant Improvement in Accuracy ofMultiple Protein.Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed byReference to Structural Alignments,264(4)J.MoI.Biol.823-838(1996)。局部方法通过鉴定由所有输入序列共享的一个或多个保守基序来比对序列。非限制性方法包括例如匹配框，参见，例如Eric Depiereux和Ernest Feytmans，Match-Box：A Fundamentally NewAlgorithm for the Simultaneous Alignment of Seumber Protein Sequences，8(5)CABIOS 501-509(1992)；Gibbs取样，参见，例如C.E.Lawrence等，Detecting SubtleSequence Signals：A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment，262(5131)Science 208-214(1993)；Align-M，参见，例如Ivo van Walle等，Align-M-A NewAlgorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences，20(9)Bioinformatics:1428-1435(2004)。
因此，通过常规方法确定序列同一性百分比。参见，例如，Altschul等，Bull.Math.Bio.48:603-16，1986以及Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-19，1992。简而言之，使用空位开放罚分10、空位扩展罚分1和如下所示的Henikoff和Henikoff(同上)的“blosum 62”评分矩阵(氨基酸由标准单字母代码表示)比对两个氨基酸序列以优化比对评分。
两个或更多个核酸或氨基酸序列之间的“序列同一性百分比”是序列共有的相同位置的数目的函数。因此，％同一性可以计算为相同核苷酸/氨基酸的数目除以核苷酸/氨基酸的总数，乘以100。序列同一性％的计算还可以考虑空位的数量，以及需要引入以优化两个或更多个序列的比对的每个空位的长度。序列比较和两个或更多个序列之间的同一性百分比的确定可以使用本领域技术人员熟悉的特定数学算法(如BLAST)进行。
用于确定序列同一性的比对评分
Figure BDA0003775045020000231
Figure BDA0003775045020000241
然后将同一性百分比计算为：
相同匹配的总数/[较长序列的长度加上为了比对两个序列引入较长序列中的空位数]×100
基本上同源的多肽的特征在于具有一个或多个氨基酸取代、缺失或添加。这些变化优选具有次要的性质，即保守性氨基酸取代(参见下文)和不显著影响多肽的折叠或活性的其他取代；小的缺失，通常为1至约30个氨基酸；和小的氨基末端或羧基末端延伸，如氨基末端或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸残基，多达约20-25个残基的小接头肽，或亲和标签。
保守性氨基酸取代：
碱性：精氨酸
赖氨酸
组氨酸
酸性：谷氨酸
天冬氨酸
极性：谷氨酰胺
天冬酰胺
疏水性：亮氨酸
异亮氨酸
缬氨酸
芳香族：苯丙氨酸
色氨酸
酪氨酸
小的：甘氨酸
丙氨酸
丝氨酸
苏氨酸
甲硫氨酸
除了20种标准氨基酸之外，非标准氨基酸(如4-羟基脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)可以取代本发明多肽的氨基酸残基。有限数量的非保守性氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可以取代多肽氨基酸残基。本发明的多肽还可以包含非天然存在的氨基酸残基。
非天然存在的氨基酸包括但不限于反式-3-甲基脯氨酸、2,4-亚甲基-脯氨酸、顺式-4-羟基脯氨酸、反式-4-羟基-脯氨酸、N-甲基甘氨酸、别苏氨酸、甲基-苏氨酸、羟基-乙基半胱氨酸、羟基乙基高半胱氨酸、硝基-谷氨酰胺、高谷氨酰胺、哌啶酸、叔亮氨酸、正缬氨酸、2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。几种方法是本领域已知用于将非天然存在的氨基酸残基掺入蛋白质中。例如，可以采用体外系统，其中使用化学氨基酰化的抑制子tRNA抑制无义突变。用于合成氨基酸和氨基酰化tRNA的方法是本领域已知的。含有无义突变的质粒的转录和翻译在包含大肠杆菌S30提取物和市售酶和其他试剂的无细胞系统中进行。通过色谱法纯化蛋白质。参见，例如，Robertson等，J.Am.Chem.Soc.113，2722，1991；Ellman等，Methods Enzymol.202:301，1991；Chung等，Science 259：806-9,193；和Chung等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10145-9，1993)。在第二种方法中，通过显微注射突变的mRNA和化学氨基酰化的抑制子tRNAs在非洲爪蟾卵母细胞中进行翻译(Turcatti等，J.Biol.Chem.271:19991-8，1996)。在第三种方法中，在不存在待置换的天然氨基酸(例如苯丙氨酸)和存在所需的非天然存在的氨基酸(例如2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸或4-氟苯丙氨酸)的情况下培养大肠杆菌细胞。将非天然存在的氨基酸掺入多肽中以代替其天然对应物。参见，Koide等，Biochem.33:7470-6，1994。天然存在的氨基酸残基可以通过体外化学修饰转化成非天然存在的种类。化学修饰可以与定点诱变组合以进一步扩大取代范围(Wynn和Richards，Protein Sci.2:395-403，1993)。
有限数量的非保守性氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸、非天然存在的氨基酸和非天然氨基酸可以取代本发明多肽的氨基酸残基。
本发明的多肽中的必需氨基酸可以根据本领域已知的程序鉴定，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells，Science 244：1081-5,1989)。生物相互作用的位点也可以通过结构的物理分析来确定，如通过诸如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记的技术结合推定的接触位点氨基酸的突变来确定。参见，例如de Vos等，Science 255:306-12,199 2；Smith等，J.Mol.Biol.224:899-904，1992；Wlodaver等，FEBS Lett.309:59-64，1992。还可以从与本发明多肽的相关组分(例如，易位或蛋白酶组分)的同源性分析推断必需氨基酸的身份。
可以使用已知的诱变和筛选方法进行和测试多个氨基酸取代，如Reidhaar-Olson和Sauer(Science 241:53-7,1988)或Bowie和Sauer(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-6,1989)公开的那些。简言之，这些作者公开了用于同时随机化多肽中的两个或更多个位置，选择功能性多肽，然后对诱变的多肽进行测序以确定每个位置处可允许的取代谱的方法。可以使用的其他方法包括噬菌体展示(例如，Lowman等，Biochem.30:10832-7，1991；Ladner等，美国专利号5,223,409；Huse，WIPO公开WO 92/06204)和区域定向诱变(Derbyshire等，Gene 46:145，1986；Ner等，DNA7:127，1988)。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。Singleton等，Dictionary of Microbiologyand Molecular Biology，第20版，John Wiley and Sons，New York(1994)和Hale&Marham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY，Harper Perennial，NY(1991)为技术人员提供了本公开中使用的许多术语的通用词典。
本公开不受本文公开的示例性方法和材料的限制，并且与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料可用于实践或测试本公开的实施方案。数值范围包括限定该范围的数字。除非另有说明，否则任何核酸序列均以5'至3'方向从左到右书写；氨基酸序列分别以氨基至羧基方向从左至右书写。
本文提供的标题不是对本公开的各个方面或实施方案的限制。
氨基酸在本文中使用氨基酸名称、三字母缩写或单字母缩写来提及。如本文使用的，术语“蛋白质”包括蛋白质、多肽和肽。如本文使用的，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。在本公开和权利要求中，可以使用氨基酸残基的常规单字母和三字母代码。氨基酸的字母代码根据IUPACIUB生物化学命名联合委员会(JCBN)定义。还应当理解，由于遗传密码的简并性，多肽可以由多于一个核苷酸序列编码。
术语的其他定义可以出现在整个说明书中。在更详细地描述示例性实施方案之前，应当理解，本公开不限于所描述的特定实施方案，并且因此可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制，因为本公开的范围将仅由所附权利要求限定。
在提供数值范围的情况下，应当理解，除非上下文另有明确规定，否则还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值，至下限单位的十分之一。在所述范围内的任何所述值或中间值与所述范围内的任何其他所述值或中间值之间的每个较小范围都包含在本公开内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在该范围内或排除在该范围外，并且其中任一限值、没有限值或两个限值都包括在较小范围内的每个范围也包括在本公开内，受制于所述范围内的任何具体排除的限值。在所述范围包括限值中的一个或两个的情况下，排除那些所包括的限值中的任一个或两个的范围也包括在本公开中。
必须注意，除非上下文另有明确规定，否则如本文和所附权利要求书中所用的，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数指代物。因此，例如，提及“一个粒细胞”包括多个这样的候选物质，并且提及“该粒细胞”包括提及一个或多个粒细胞及其本领域技术人员已知的等同物，等等。
提供本文所讨论的出版物仅仅是因为它们在本申请的提交日之前的公开内容。本文中的任何内容都不应被解释为承认这些出版物构成所附权利要求的现有技术。
附图简述
现在将参考以下附图和实施例仅通过举例的方式来描述本发明的实施方案。
图1显示了在补充有3、6、9或12μg/L kifunensine的Sp2/0细胞中产生的IgG1单克隆抗体的唾液酸化百分比。
图2显示了在补充有30、40、50或60nM kifunensine的CHO细胞中产生的IgG2单克隆抗体的唾液酸化百分比。
序列表
SEQ ID NO:1-戈利木单抗重链IgG1(氨基酸位置306处的单个糖基化位点以粗体 和下划线显示)
Figure BDA0003775045020000281
SEQ ID NO:2-戈利木单抗轻链
Figure BDA0003775045020000282
SEQ ID NO:3-地诺单抗重链IgG2(氨基酸位置298处的单个糖基化位点以粗体和 下划线显示)
Figure BDA0003775045020000283
Figure BDA0003775045020000291
SEQ ID NO:4-地诺单抗轻链(κ)
Figure BDA0003775045020000292
实施例
实施例1
kifunensine对Sp2/0细胞产生的人IgG1抗体唾液酸化的影响
将用编码SEQ ID NO:1和2(其分别对应于人抗TNFαIgG1单克隆抗体戈利木单抗的重链和轻链)的表达载体转染的鼠Sp2/0细胞在灌注生物反应器中在标准操作参数下培养30天。为了检查kifunensine对所得IgG1的唾液酸化水平的影响，灌注培养物补充有3、6、9或12μg/L kifunensine(对应于13nM、26nM、39nM或52nM)。对照培养物也维持在相同条件下，尽管不存在kifunensine。在补充有kifunensine的任何培养物中均未观察到对细胞活力的显著影响。
在培养第18天，从灌注生物反应器中取出样品，并通过聚糖分析确定IgG1抗体的唾液酸化百分比。简言之，首先使用蛋白A色谱纯化抗体，然后从抗体酶促释放聚糖，用2-氨基苯甲酰胺荧光标记，并使用基于亲水性相互作用色谱(HILIC)的方法分析。如图1所示，在补充有6μg/L及以上，特别是9和12μg/Lkifunensine的培养物中，与对照相比，唾液酸化的增加是明显的。用12μg/Lkifunensine(～52nM)观察到峰值唾液酸化水平。
实施例2
kifunensine对CHO细胞中产生的人IgG2抗体的Fc-聚糖唾液酸化的影响
使用标准补料分批方法在生物反应器中培养用编码SEQ ID NO:3和4(其分别对应于人抗RANKL IgG2单克隆抗体地诺单抗的重链和轻链)的表达载体转染的CHO细胞。为了检查kifunensine对所得IgG2的Fc-聚糖唾液酸化水平的影响，在培养的第3天向培养物补充30、40、50或60nM kifunensine。对照培养物也维持在相同条件下，尽管不存在kifunensine。在补充有kifunensine的任何培养物中均未观察到对细胞活力的显著影响。
在第20天，从生物反应器中取出样品，并如实施例1中所述的确定了IgG2抗体的Fc-聚糖唾液酸化百分比。如图2所示，当补充>40nM kifunensine时，与对照相比，Fc-聚糖唾液酸化的增加是明显的。在补充60nM kifunensine的培养物中观察到峰值Fc-聚糖唾液酸化。
实施例3
kifunensine对CHO细胞中产生的EPO唾液酸化的影响
将用编码重组人EPO的表达载体(UniProt登录号P01588，序列版本1，条目版本195)转染的CHO细胞在灌注生物反应器中在标准操作参数下培养18天。从第0天起，培养基补充有12μg/L kifunensine。
在整个生产阶段收获培养期间产生的重组人EPO，并且在培养期结束时，获得样品以确定糖基化谱。与在没有kifunensine的培养物中产生的重组人EPO相比，所得的重组人EPO具有增加的甘露糖基化和唾液酸化。
条款
1.kifunensine用于增加糖基化多肽的唾液酸化的用途，其中将产生糖基化多肽的细胞与kifunensine接触。
2.一种增加糖基化多肽唾液酸化的方法，该方法包括：
a.提供产生糖基化多肽的细胞；和
b.将细胞与kifunensine接触，从而增加由细胞产生的糖基化多肽的唾液酸化。
3.一种产生唾液酸化增加的糖基化多肽的方法，该方法包括：
a.提供产生糖基化多肽的细胞；和
b.将细胞与kifunensine接触，从而产生唾液酸化增加的糖基化多肽。
4.根据条款1的用途或根据条款2或3的方法，还包括分离糖基化多肽。
5.根据前述任一项条款的用途或方法，其中在细胞产生糖基化多肽前，将细胞与kifunensine接触。
6.根据条款1-4任一项的用途或方法，其中在细胞产生糖基化多肽期间将细胞与kifunensine接触。
7.根据前述任一项条款的用途或方法，其中将细胞与包含浓度为约30-150nM的kifunensine的溶液(例如培养基)接触。
8.根据前述任一项条款的用途或方法，其中将细胞与包含浓度为约35-75nM的kifunensine的溶液(例如培养基)接触。
9.根据前述任一项条款的用途或方法，其中将细胞与包含浓度为约40-60nM的kifunensine的溶液(例如培养基)接触。
10.根据前述任一项条款的用途或方法，其中将细胞与包含浓度为约50nM的kifunensine的溶液(例如培养基)接触。
11.根据前述任一项条款的用途或方法，其中糖基化多肽的特征在于增加的甘露糖基化。
12.根据前述任一项条款的用途或方法，其中糖基化多肽是重组糖基化多肽。
13.根据前述任一项条款的用途或方法，其中糖基化多肽是人糖基化多肽。
14.根据前述任一项条款的用途或方法，其中糖基化多肽是抗体、抗体的抗原结合部分、激素、Fc融合多肽、白蛋白融合多肽、酶或细胞因子。
15.根据条款14的用途或方法，其中Fc融合多肽是阿巴西普(abatacept)、阿非西普(afilbercept)、阿法西普(alefacept)、贝拉西普(belatacept)、依他奈普(etarnecept)或利洛西普(rilonacept)。
16.根据条款14的用途或方法，其中激素是促红细胞生成素、甲状旁腺激素、生长激素、胰岛素、胰高血糖素、促卵泡激素、促黄体激素或绒毛膜促性腺激素。
17.根据前述任一项条款的用途或方法，其中糖基化多肽是单克隆抗体或其抗原结合部分。
18.根据前述任一项条款的用途或方法，其中糖基化多肽是IgG1抗体或其抗原结合部分，或IgG2抗体或其抗原结合部分。
19.根据条款17或18的用途或方法，其中抗体或其抗原结合片段是阿达木单抗(adalimumab)、阿昔单抗(abciximab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维单抗(avelumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、贝伐单抗(bevacizumab)、布达鲁单抗(brodalumab)、赛妥珠单抗(certolizumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、达雷妥尤单抗(daratumumab)、达利珠单抗(daclizumab)、地诺单抗(denosumab)、度匹鲁单抗(dupilumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、依库珠单抗(eculizumab)、依法珠单抗(efalizumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、戈利木单抗(golimumab)、古塞库单抗(guselkumab)、伊布单抗(ibritumomab)、英夫利昔单抗(infliximab)、艾克珠单抗(ixekizumab)、莫罗单抗(muromonab)-CD3、那他珠单抗(natalizumab)、纳武单抗(nivolumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、帕利珠单抗(palivizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、雷珠单抗(ranibizumab)、利桑珠单抗(risankizumab)、利妥昔单抗(rituximab)、苏金单抗(secukinumab)、替拉珠单抗(tildrakizumab)、托珠单抗(tocilizumab)、托西莫单抗(tositumomab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、优特克单抗(ustekinumab)或维多珠单抗(vedolizumab)。
20.根据前述任一项条款的用途或方法，其中糖基化多肽包含至少一个N-连接的聚糖。
21.根据前述任一项条款的用途或方法，其中糖基化多肽是抗体，并且其中其Fc部分包含至少一个N-连接的聚糖。
22.根据条款20或21的用途或方法，其中N-连接的聚糖是双触角聚糖。
23.根据前述任一项条款的用途或方法，其中细胞是哺乳动物细胞。
24.根据前述任一项条款的用途或方法，其中细胞是啮齿动物细胞、人细胞或非人灵长类动物细胞。
25.根据前述任一项条款的用途或方法，其中细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或鼠骨髓瘤细胞(Sp2/0)。
26.可通过根据条款2-25任一项的方法获得的糖基化多肽，任选地其中糖基化多肽包含增加的唾液酸化和增加的甘露糖基化。
27.一种药物组合物，其包含根据条款26所述的糖基化多肽和药学上可接受的载体、赋形剂、辅助剂和/或盐。
28.根据条款26的糖基化多肽或根据条款27的药物组合物，其用于医药中。
上述说明书中提及的所有出版物均通过引用并入本文。本发明所述的方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的，而没有脱离本发明的范围和精神。尽管已经结合具体的优选实施方案描述了本发明，但是应当理解，所要求保护的本发明不应不适当地限于这些具体实施方案。实际上，对于生物化学和生物技术或相关领域的技术人员显而易见的用于实施本发明的所述模式的各种修改都旨在落入所附权利要求的范围内。
序列表
<110> 德国费森尤斯卡比有限公司(FRESENIUS KABI DEUTSCHLAND GMBH)
<120> 糖基化多肽
<130> P60912WO
<150> EP 19215729.5
<151> 2019-12-12
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 戈利木单抗重链IgG1
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Met Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Lys Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Gly Ile Ala Ala Gly Gly Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Gly
100 105 110
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
130 135 140
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
145 150 155 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
165 170 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
180 185 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
195 200 205
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
210 215 220
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
225 230 235 240
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
245 250 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
260 265 270
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
275 280 285
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
290 295 300
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
305 310 315 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
325 330 335
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
340 345 350
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
355 360 365
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
370 375 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
385 390 395 400
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
405 410 415
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
420 425 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
435 440 445
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455
<210> 2
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 戈利木单抗轻链
<400> 2
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 3
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 地诺单抗重链IgG2
<400> 3
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Thr Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Pro Gly Thr Thr Val Ile Met Ser Trp Phe Asp Pro Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys
210 215 220
Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 4
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 地诺单抗轻链（κ）
<400> 4
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Gly Arg
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Phe Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215

Claims (15)

1.kifunensine用于增加糖基化多肽的唾液酸化的用途，其中将产生糖基化多肽的细胞与kifunensine接触。
2.一种增加糖基化多肽唾液酸化的方法，该方法包括：
a.提供产生糖基化多肽的细胞；和
b.将细胞与kifunensine接触，从而增加由细胞产生的糖基化多肽的唾液酸化。
3.一种生产唾液酸化增加的糖基化多肽的方法，该方法包括：
a.提供产生糖基化多肽的细胞；和
b.将细胞与kifunensine接触，从而产生唾液酸化增加的糖基化多肽。
4.根据权利要求1的用途或根据权利要求2或3的方法，还包括分离糖基化多肽。
5.根据前述任一项权利要求的用途或方法，其中在细胞产生糖基化多肽之前将细胞与kifunensine接触，或者其中在细胞产生糖基化多肽期间将细胞与kifunensine接触。
6.根据前述任一项权利要求的用途或方法，其中将细胞与包含浓度为约30-150nM、35-75nM或40-60nM的kifunensine的溶液(例如培养基)接触，优选地其中将细胞与包含浓度为约50nM的kifunensine的溶液(例如培养基)接触。
7.根据前述任一项权利要求的用途或方法，其中糖基化多肽的特征在于增加的甘露糖基化。
8.根据前述任一项权利要求的用途或方法，其中糖基化多肽是重组糖基化多肽，优选其中糖基化多肽是人糖基化多肽，和/或其中糖基化多肽是抗体、抗体的抗原结合部分、激素、Fc融合多肽、白蛋白融合多肽、酶或细胞因子。
9.根据权利要求8的用途或方法，其中Fc融合多肽是阿巴西普(abatacept)、阿非西普(afilbercept)、阿法西普(alefacept)、贝拉西普(belatacept)、依他奈普(etarnecept)或利洛西普(rilonacept)，或其中激素是促红细胞生成素、甲状旁腺激素、生长激素、胰岛素、胰高血糖素、促卵泡激素、促黄体激素或绒毛膜促性腺激素。
10.根据前述任一项权利要求的用途或方法，其中糖基化多肽是单克隆抗体或其抗原结合部分，和/或其中糖基化多肽是IgG1抗体或其抗原结合部分，或IgG2抗体或其抗原结合部分，优选地其中抗体或其抗原结合片段是阿达木单抗(adalimumab)、阿昔单抗(abciximab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维单抗(avelumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、贝伐单抗(bevacizumab)、布达鲁单抗(brodalumab)、赛妥珠单抗(certolizumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、达雷妥尤单抗(daratumumab)、达利珠单抗(daclizumab)、地诺单抗(denosumab)、度匹鲁单抗(dupilumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、依库珠单抗(eculizumab)、依法珠单抗(efalizumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、戈利木单抗(golimumab)、古塞库单抗(guselkumab)、伊布单抗(ibritumomab)、英夫利昔单抗(infliximab)、艾克珠单抗(ixekizumab)、莫罗单抗(muromonab)-CD3、那他珠单抗(natalizumab)、纳武单抗(nivolumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、帕利珠单抗(palivizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、雷珠单抗(ranibizumab)、利桑珠单抗(risankizumab)、利妥昔单抗(rituximab)、苏金单抗(secukinumab)、替拉珠单抗(tildrakizumab)、托珠单抗(tocilizumab)、托西莫单抗(tositumomab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、优特克单抗(ustekinumab)或维多珠单抗(vedolizumab)。
11.根据前述任一项权利要求的用途或方法，其中糖基化多肽包含至少一个N-连接的聚糖，和/或其中糖基化多肽是抗体，并且其中其Fc部分包含至少一个N-连接的聚糖，优选地其中N-连接的聚糖是双触角聚糖。
12.根据前述任一项权利要求的用途或方法，其中细胞是哺乳动物细胞，优选地其中细胞是啮齿动物细胞、人细胞或非人灵长类动物细胞，更优选地其中细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或鼠骨髓瘤细胞(Sp2/0)。
13.根据权利要求2-12任一项方法可获得的糖基化多肽，任选地其中糖基化多肽包含增加的唾液酸化和增加的甘露糖基化。
14.一种药物组合物，其包含根据权利要求13的糖基化多肽和药学上可接受的载体、赋形剂、辅助剂和/或盐。
15.根据权利要求13的糖基化多肽或根据权利要求14的药物组合物，其用于医药中。
CN202080095266.2A 2019-12-12 2020-12-11 糖基化多肽 Pending CN115023422A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP19215729.5 2019-12-12
EP19215729 2019-12-12
PCT/EP2020/085741 WO2021116398A1 (en) 2019-12-12 2020-12-11 Glycosylated polypeptides

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115023422A true CN115023422A (zh) 2022-09-06

Family

ID=69104220

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080095266.2A Pending CN115023422A (zh) 2019-12-12 2020-12-11 糖基化多肽

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20230049145A1 (zh)
EP (1) EP4073067A1 (zh)
CN (1) CN115023422A (zh)
WO (1) WO2021116398A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112021022682A2 (pt) 2019-05-14 2022-02-22 Provention Bio Inc Métodos e composições para prevenir diabetes do tipo 1

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
IL99552A0 (en) 1990-09-28 1992-08-18 Ixsys Inc Compositions containing procaryotic cells,a kit for the preparation of vectors useful for the coexpression of two or more dna sequences and methods for the use thereof
JP5677837B2 (ja) 2007-06-07 2015-02-25 メルク セローノ ソシエテ アノニム Ｐｕｒｏ−ｄｈｆｒ四機能性マーカー、及びタンパク質の生産におけるその使用
US11377485B2 (en) * 2009-12-02 2022-07-05 Academia Sinica Methods for modifying human antibodies by glycan engineering
EP2409989A1 (en) * 2010-07-19 2012-01-25 International-Drug-Development-Biotech Method to improve glycosylation profile for antibody
GB201201314D0 (en) * 2012-01-26 2012-03-07 Isis Innovation Composition
WO2019043096A1 (en) 2017-08-30 2019-03-07 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh METHOD FOR PURIFYING IL-6 ANTI-RECEPTOR ANTIBODIES

Also Published As

Publication number Publication date
WO2021116398A1 (en) 2021-06-17
US20230049145A1 (en) 2023-02-16
EP4073067A1 (en) 2022-10-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230064544A1 (en) Anti-ctla4 monoclonal antibody or its antigen binding fragments, pharmaceutical compositions and uses
CN112166123B (zh) 抗紧密连接蛋白18.2抗体
KR101818274B1 (ko) 개선된 특성을 갖는 항체의 제조 방법
EP3511346A1 (en) Anti-ctla4 and anti-pd-1 bifunctional antibody, pharmaceutical composition thereof and use thereof
US20160215061A1 (en) Fc CONTAINING POLYPEPTIDES HAVING INCREASED BINDING TO FcGammaRIIB
US20160237156A1 (en) Immunoglobulin fusion proteins and compositions thereof
KR20160095113A (ko) 항-Siglec-8 항체 및 그의 사용 방법
US20140286946A1 (en) Method for preparing antibodies having improved properties
CN102933600A (zh) 分泌异源多肽的方法和组合物
US20220242970A1 (en) Glycan-based antibody-drug conjugates
AU2016342036B2 (en) Methods and compositions for treating systemic mastocytosis
KR20200015511A (ko) 염증성 위장 장애를 치료하기 위한 방법 및 조성물
CA3055438A1 (en) Multispecific antibody constructs binding to muc1 and cd3
US20220267413A1 (en) Methods For The Treatment Of Neurodegeneration
EP2753645A1 (en) Caninised antibodies and method for the production of same
JP2024045612A (ja) 慢性蕁麻疹を処置するための方法および組成物
CN115023422A (zh) 糖基化多肽
US20140112910A1 (en) Modified glycoproteins
US11118208B2 (en) Methods for modulating protein galactosylation profiles of recombinant proteins using peracetyl galactose
US20220348654A1 (en) AGLYCOSYLATED ANTIBODY Fc REGION FOR TREATING CANCER
US20190233535A1 (en) IFN-Gamma-Inducible Regulatory T Cell Convertible Anti-Cancer (IRTCA) Antibody and Uses Thereof
US20230220098A1 (en) Therapeutic drug for polycythemia
RU2670889C1 (ru) Способ контроля гликозилирования рекомбинантного гликопротеина
KR20230124971A (ko) 세포 배양 중 분비된 재조합 발현 단백질에서 시스테인잔기의 산화 수준을 감소시키는 방법
NZ733430A (en) A method for controlling glycosylation of recombinant glycoprotein

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination