JPH07274967A - アンチセンスｒｎａを発現するベクター - Google Patents
アンチセンスｒｎａを発現するベクターInfo
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- JPH07274967A JPH07274967A JP6073162A JP7316294A JPH07274967A JP H07274967 A JPH07274967 A JP H07274967A JP 6073162 A JP6073162 A JP 6073162A JP 7316294 A JP7316294 A JP 7316294A JP H07274967 A JPH07274967 A JP H07274967A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 アンチセンスＲＮＡの発現により遺伝子抑制
を行うことを目的とする。 【構成】 チミジンキナーゼプロモータによるｍＲＮＡ
発現のリードスルーを利用することを特徴とする、アン
チセンスＲＮＡを発現させるための方法、並びにそのた
めのベクター及び、ＣＤ４、ＣＤ４５の発現を抑制する
アンチセンスＲＮＡを発現するベクターに関する。
を行うことを目的とする。 【構成】 チミジンキナーゼプロモータによるｍＲＮＡ
発現のリードスルーを利用することを特徴とする、アン
チセンスＲＮＡを発現させるための方法、並びにそのた
めのベクター及び、ＣＤ４、ＣＤ４５の発現を抑制する
アンチセンスＲＮＡを発現するベクターに関する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は遺伝子工学の分野に属す
る。詳細には、本発明はあらゆるＤＮＡを発現させる方
法、並びに遺伝子の発現を抑制するための方法及びその
ためのベクターに関する。さらに詳しくは、遺伝子発現
を抑制するために導入されるアンチセンスＲＮＡを発現
するための方法及びそのためのベクターに関するもので
あり、特にＣＤ４又はＣＤ４５を抑制するアンチセンス
ＲＮＡを発現するベクターに関する。なお、本明細書に
て使用している、遺伝子又はＤＮＡ配列に関して「発
現」とは、その遺伝子又はＤＮＡ配列がmＲＮＡに転写
され、そのmＲＮＡが翻訳されてタンパク質を生成する
工程を意味する。また、ＲＮＡ又はアンチセンスＲＮＡ
に関して「発現」とはＤＮＡ配列の情報に基づいてＲＮ
Ａ又はアンチセンスＲＮＡが転写される工程を意味す
る。
る。詳細には、本発明はあらゆるＤＮＡを発現させる方
法、並びに遺伝子の発現を抑制するための方法及びその
ためのベクターに関する。さらに詳しくは、遺伝子発現
を抑制するために導入されるアンチセンスＲＮＡを発現
するための方法及びそのためのベクターに関するもので
あり、特にＣＤ４又はＣＤ４５を抑制するアンチセンス
ＲＮＡを発現するベクターに関する。なお、本明細書に
て使用している、遺伝子又はＤＮＡ配列に関して「発
現」とは、その遺伝子又はＤＮＡ配列がmＲＮＡに転写
され、そのmＲＮＡが翻訳されてタンパク質を生成する
工程を意味する。また、ＲＮＡ又はアンチセンスＲＮＡ
に関して「発現」とはＤＮＡ配列の情報に基づいてＲＮ
Ａ又はアンチセンスＲＮＡが転写される工程を意味す
る。
【０００２】
【従来技術】遺伝子機能の解析のため、あるいは遺伝子
治療への応用のために、遺伝子の発現を抑制する種々の
方法が盛んに研究されている。遺伝子の発現を抑制する
方法の１つとして、アンチセンスＲＮＡを用いる方法が
ある。アンチセンスＲＮＡによる遺伝子発現の抑制は種
々行われており[例えば、幡野ら、臨床免疫,２１,１６
３３(１９８９)]、そのメカニズムは以下のとおりであ
る。あるタンパク質をコードするＤＮＡ配列は相補的な
二本鎖ＤＮＡから構成され、その一方の鎖はセンス鎖、
他方の鎖はアンチセンス鎖と呼ばれる。センス鎖とは発
現される鎖、即ちmＲＮＡに転写されさらにタンパク質
に翻訳される鎖であり、アンチセンス鎖とはそのセンス
鎖に相補的な鎖である。アンチセンス鎖は天然では転写
されず、翻訳もされない。しかし、アンチセンス鎖ＤＮ
Ａであっても、それを適当なプロモータを持つ発現ベク
ターにつなぎ、得られた発現ベクターを適当な細胞に導
入すれば、人為的に転写させることができる。このよう
にして生成される転写体は「アンチセンスＲＮＡ」と呼
ばれる。このアンチセンスＲＮＡはもともと内在するセ
ンスＲＮＡと相補的であるため、お互いで二重鎖を形成
し、その結果センスＲＮＡからのタンパク質への翻訳が
起こらなくなり、結果的にそのタンパク質は発現されな
い。このアンチセンスＲＮＡは相補構造を持っていない
mＲＮＡとは二重鎖を形成しないため、その抑制はその
アンチセンスＲＮＡに関連する遺伝子に特異的なものと
なる。
治療への応用のために、遺伝子の発現を抑制する種々の
方法が盛んに研究されている。遺伝子の発現を抑制する
方法の１つとして、アンチセンスＲＮＡを用いる方法が
ある。アンチセンスＲＮＡによる遺伝子発現の抑制は種
々行われており[例えば、幡野ら、臨床免疫,２１,１６
３３(１９８９)]、そのメカニズムは以下のとおりであ
る。あるタンパク質をコードするＤＮＡ配列は相補的な
二本鎖ＤＮＡから構成され、その一方の鎖はセンス鎖、
他方の鎖はアンチセンス鎖と呼ばれる。センス鎖とは発
現される鎖、即ちmＲＮＡに転写されさらにタンパク質
に翻訳される鎖であり、アンチセンス鎖とはそのセンス
鎖に相補的な鎖である。アンチセンス鎖は天然では転写
されず、翻訳もされない。しかし、アンチセンス鎖ＤＮ
Ａであっても、それを適当なプロモータを持つ発現ベク
ターにつなぎ、得られた発現ベクターを適当な細胞に導
入すれば、人為的に転写させることができる。このよう
にして生成される転写体は「アンチセンスＲＮＡ」と呼
ばれる。このアンチセンスＲＮＡはもともと内在するセ
ンスＲＮＡと相補的であるため、お互いで二重鎖を形成
し、その結果センスＲＮＡからのタンパク質への翻訳が
起こらなくなり、結果的にそのタンパク質は発現されな
い。このアンチセンスＲＮＡは相補構造を持っていない
mＲＮＡとは二重鎖を形成しないため、その抑制はその
アンチセンスＲＮＡに関連する遺伝子に特異的なものと
なる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】遺伝子発現を抑制する
ために用いられるアンチセンスＲＮＡの発現効率はその
発現に用いられるプロモータやアンチセンスＲＮＡを得
ようとするセグメント部分のＤＮＡ配列及びその長さ等
により異なる[幡野ら、前掲]。従って、効率的な抑制効
果を得るためには、抑制しようとする遺伝子の発現抑制
に有用なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ配列に
応じた発現ベクターが必要であった。
ために用いられるアンチセンスＲＮＡの発現効率はその
発現に用いられるプロモータやアンチセンスＲＮＡを得
ようとするセグメント部分のＤＮＡ配列及びその長さ等
により異なる[幡野ら、前掲]。従って、効率的な抑制効
果を得るためには、抑制しようとする遺伝子の発現抑制
に有用なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ配列に
応じた発現ベクターが必要であった。
【０００４】アンチセンスＲＮＡを用いた遺伝子発現の
抑制に関する種々の試みがなされているものの、上記の
ような問題点があるため、実際に抑制された遺伝子の数
はそれ程多くない。抑制しようとする遺伝子の１つにＣ
Ｄ４がある。ＣＤ４は免疫細胞であるＴ細胞のうち、ヘ
ルパー／インデューサー細胞にのみ発現される細胞表面
抗原であるが、Ｔ細胞抗原受容体による抗原認識やヒト
免疫不全ウイルスの感染等に重要な役割を果たしている
ことが判っており、このＣＤ４発現を抑制することは、
ＣＤ４の機能の研究やＡＩＤＳの治療の研究に重要な知
見を与えるものとして期待される。
抑制に関する種々の試みがなされているものの、上記の
ような問題点があるため、実際に抑制された遺伝子の数
はそれ程多くない。抑制しようとする遺伝子の１つにＣ
Ｄ４がある。ＣＤ４は免疫細胞であるＴ細胞のうち、ヘ
ルパー／インデューサー細胞にのみ発現される細胞表面
抗原であるが、Ｔ細胞抗原受容体による抗原認識やヒト
免疫不全ウイルスの感染等に重要な役割を果たしている
ことが判っており、このＣＤ４発現を抑制することは、
ＣＤ４の機能の研究やＡＩＤＳの治療の研究に重要な知
見を与えるものとして期待される。
【０００５】ＣＤ４遺伝子の抑制を行った例として、相
同組換えによる報告がある[ラヘムトラ他,ネーチャー,
３５３,１８０(１９９１)]。その研究の価値は高く評価
されるものの、相同組換えという方法の性格上、ＣＤ４
の発現抑制が完全に行われてしまう。他方、アンチセン
スＲＮＡによる抑制では、遺伝子の発現は１００％抑制
されることはないため(幡野ら、前掲)、ＣＤ４の低発現
等の場合の研究にはアンチセンスＲＮＡによる抑制が必
要となる。別に、ＣＤ４５遺伝子発現の抑制が試みられ
ている。ＣＤ４５は白血球で特異的に発現される膜蛋白
質であり、その構造から考えて何らかの受容体であろう
と予想されているが、そのリガンドは不明である。しか
し、ＣＤ４５はＴ細胞の活性化に関与していると考えら
れており、種々研究がなされている。ＣＤ４５発現の抑
制に関して、ＣＤ４５の発現が失われた変異株を化学物
質により得たという報告がある[ピンゲル他、セル,５
８,１０５５(１９８９)]。しかし、ＣＤ４の抑制に関し
て述べたように、この方法によってはＣＤ４５の低発現
モデルが得られないこと、さらに、突然変異がＣＤ４５
の遺伝子のみに起こったのかどうか不明であるという問
題があり、特異的なアンチセンスＲＮＡによるＣＤ４５
発現の抑制が必要となる。
同組換えによる報告がある[ラヘムトラ他,ネーチャー,
３５３,１８０(１９９１)]。その研究の価値は高く評価
されるものの、相同組換えという方法の性格上、ＣＤ４
の発現抑制が完全に行われてしまう。他方、アンチセン
スＲＮＡによる抑制では、遺伝子の発現は１００％抑制
されることはないため(幡野ら、前掲)、ＣＤ４の低発現
等の場合の研究にはアンチセンスＲＮＡによる抑制が必
要となる。別に、ＣＤ４５遺伝子発現の抑制が試みられ
ている。ＣＤ４５は白血球で特異的に発現される膜蛋白
質であり、その構造から考えて何らかの受容体であろう
と予想されているが、そのリガンドは不明である。しか
し、ＣＤ４５はＴ細胞の活性化に関与していると考えら
れており、種々研究がなされている。ＣＤ４５発現の抑
制に関して、ＣＤ４５の発現が失われた変異株を化学物
質により得たという報告がある[ピンゲル他、セル,５
８,１０５５(１９８９)]。しかし、ＣＤ４の抑制に関し
て述べたように、この方法によってはＣＤ４５の低発現
モデルが得られないこと、さらに、突然変異がＣＤ４５
の遺伝子のみに起こったのかどうか不明であるという問
題があり、特異的なアンチセンスＲＮＡによるＣＤ４５
発現の抑制が必要となる。
【０００６】
【発明の詳しい説明】本発明の１つの目的は、チミジン
キナーゼプロモータ、Ｅcogpt遺伝子の構造遺伝子、チ
ミジンキナーゼ（ＴＫ）のポリＡシグナル及び所望のＤ
ＮＡ配列をこの順序で配列させたＤＮＡ配列を含有する
ベクターである。本発明ベクターにはＴＫのポリＡシグ
ナルが付加されているにもかかわらず、挿入されるＤＮ
Ａ配列は転写されることが意外にも見いだされた。当初
は、本発明のベクターにはＴＫのポリＡシグナルが存在
するため、それよりも下流に位置する挿入ＤＮＡ配列は
転写されないと予想された。しかし、実際には、本発明
ベクターを用いれば、ＴＫプロモータによってＥcogpt
遺伝子だけでなく、その下流に位置するＤＮＡ配列まで
も転写された。この挿入ＤＮＡ配列はＥcogpt遺伝子のm
ＲＮＡへの転写のリードスルー（読み過ごし転写）によ
って転写されたと考えられた。なお、Ｅcogpt遺伝子と
は、ＸＧＰＲＴ（キサンチン−グアニンホスホリボシル
トランスフェラーゼ）をコードする大腸菌の遺伝子であ
り、Mulligan, R.C. & Berg, P., Science 209, 1422-1
427(1980)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 78, 2072-2076(1
981)に記載されている。
キナーゼプロモータ、Ｅcogpt遺伝子の構造遺伝子、チ
ミジンキナーゼ（ＴＫ）のポリＡシグナル及び所望のＤ
ＮＡ配列をこの順序で配列させたＤＮＡ配列を含有する
ベクターである。本発明ベクターにはＴＫのポリＡシグ
ナルが付加されているにもかかわらず、挿入されるＤＮ
Ａ配列は転写されることが意外にも見いだされた。当初
は、本発明のベクターにはＴＫのポリＡシグナルが存在
するため、それよりも下流に位置する挿入ＤＮＡ配列は
転写されないと予想された。しかし、実際には、本発明
ベクターを用いれば、ＴＫプロモータによってＥcogpt
遺伝子だけでなく、その下流に位置するＤＮＡ配列まで
も転写された。この挿入ＤＮＡ配列はＥcogpt遺伝子のm
ＲＮＡへの転写のリードスルー（読み過ごし転写）によ
って転写されたと考えられた。なお、Ｅcogpt遺伝子と
は、ＸＧＰＲＴ（キサンチン−グアニンホスホリボシル
トランスフェラーゼ）をコードする大腸菌の遺伝子であ
り、Mulligan, R.C. & Berg, P., Science 209, 1422-1
427(1980)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 78, 2072-2076(1
981)に記載されている。
【０００７】本発明は、天然では転写されないアンチセ
ンス鎖の転写にこの発見を応用したものである。本発明
のベクターではリードスルーが起こるため、挿入するＤ
ＮＡ配列の長さや挿入部位にかかわらず、安定にアンチ
センスＲＮＡを転写させることができ、従ってあらゆる
遺伝子の発現を抑制することが可能となる。また、余分
な長さのＲＮＡがアンチセンスＲＮＡに結合されていて
も、目的の遺伝子の発現を抑制することは可能である。
あるいは逆に、目的の遺伝子アンチセンスＲＮＡの一部
であっても転写させることができ、種々のレベルの目的
遺伝子低発現モデルを得るうえで有益なものになると考
えられる。
ンス鎖の転写にこの発見を応用したものである。本発明
のベクターではリードスルーが起こるため、挿入するＤ
ＮＡ配列の長さや挿入部位にかかわらず、安定にアンチ
センスＲＮＡを転写させることができ、従ってあらゆる
遺伝子の発現を抑制することが可能となる。また、余分
な長さのＲＮＡがアンチセンスＲＮＡに結合されていて
も、目的の遺伝子の発現を抑制することは可能である。
あるいは逆に、目的の遺伝子アンチセンスＲＮＡの一部
であっても転写させることができ、種々のレベルの目的
遺伝子低発現モデルを得るうえで有益なものになると考
えられる。
【０００８】従来のアンチセンスＲＮＡを用いる遺伝子
発現抑制においては、使用するプロモータの種類によっ
ては低コピー数の転写体(トランスクリプト)しか形成さ
れず、遺伝子の発現抑制が充分に起こらない場合があっ
た。しかし、本発明の場合は、ＴＫプロモータからのリ
ードスルーが起こるため、充分な転写体の量を保証で
き、アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡをそのまま
ベクターに挿入しても充分な遺伝子抑制効果を得ること
ができる。しかし、さらに従来から行われているよう
に、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子の下流にアンチセンス
ＲＮＡをコードするＤＮＡをつなぎ、メソトレキセート
を用いて高コピー数とし、さらに抑制効果を高めること
もできる。ジヒロド葉酸還元酵素遺伝子はメソトレキセ
ートにより遺伝子重複することが知られているので、ジ
ヒドロ葉酸還元酵素遺伝子の下流にアンチセンスＲＮＡ
をコードするＤＮＡ配列をつなぎ、メソトレキセートの
存在下で遺伝子導入した細胞を選別すれば、ジヒドロ葉
酸還元酵素−アンチセンスＲＮＡの重複を起こし、高コ
ピーの転写体を得ることができるのである。
発現抑制においては、使用するプロモータの種類によっ
ては低コピー数の転写体(トランスクリプト)しか形成さ
れず、遺伝子の発現抑制が充分に起こらない場合があっ
た。しかし、本発明の場合は、ＴＫプロモータからのリ
ードスルーが起こるため、充分な転写体の量を保証で
き、アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡをそのまま
ベクターに挿入しても充分な遺伝子抑制効果を得ること
ができる。しかし、さらに従来から行われているよう
に、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子の下流にアンチセンス
ＲＮＡをコードするＤＮＡをつなぎ、メソトレキセート
を用いて高コピー数とし、さらに抑制効果を高めること
もできる。ジヒロド葉酸還元酵素遺伝子はメソトレキセ
ートにより遺伝子重複することが知られているので、ジ
ヒドロ葉酸還元酵素遺伝子の下流にアンチセンスＲＮＡ
をコードするＤＮＡ配列をつなぎ、メソトレキセートの
存在下で遺伝子導入した細胞を選別すれば、ジヒドロ葉
酸還元酵素−アンチセンスＲＮＡの重複を起こし、高コ
ピーの転写体を得ることができるのである。
【０００９】本発明の別の目的は、アンチセンスＲＮＡ
を発現する本発明ベクターを作成するための出発プラス
ミドである、ＴＫプロモータ及びＥcogpt遺伝子を含有
する親ベクターを提供することである。リードスルーの
利用によってアンチセンスＲＮＡを発現するベクターを
作成するために使用される親ベクターpＢＧＭＴＧは、
１３．５kbp のサイズを有し、以下の断片から構成され
る： ・０．２kbpのサイズを有するＴＫプロモータ断片 ・０．７kbpのサイズを有するＥcogpt遺伝子断片 ・０．２kbpのサイズを有するＴＫのポリＡシグナルを
含む断片 ・０．７kbpのサイズを有するメタロチオネインプロモ
ータ断片 ・１．２kbpのサイズを有するラビットβグロビンのス
プライスサイトとポリＡシグナルを含む断片 ・２．７kbpのサイズを有するヒトβグロビン断片 ・５．６kbpのサイズを有するウシパピローマウイルス
の６９％断片 ・２．１kbpのサイズを有するpＢＲ３２２由来の断片 この親ベクターの制限部位及び機能地図を添付の図１に
示す。
を発現する本発明ベクターを作成するための出発プラス
ミドである、ＴＫプロモータ及びＥcogpt遺伝子を含有
する親ベクターを提供することである。リードスルーの
利用によってアンチセンスＲＮＡを発現するベクターを
作成するために使用される親ベクターpＢＧＭＴＧは、
１３．５kbp のサイズを有し、以下の断片から構成され
る： ・０．２kbpのサイズを有するＴＫプロモータ断片 ・０．７kbpのサイズを有するＥcogpt遺伝子断片 ・０．２kbpのサイズを有するＴＫのポリＡシグナルを
含む断片 ・０．７kbpのサイズを有するメタロチオネインプロモ
ータ断片 ・１．２kbpのサイズを有するラビットβグロビンのス
プライスサイトとポリＡシグナルを含む断片 ・２．７kbpのサイズを有するヒトβグロビン断片 ・５．６kbpのサイズを有するウシパピローマウイルス
の６９％断片 ・２．１kbpのサイズを有するpＢＲ３２２由来の断片 この親ベクターの制限部位及び機能地図を添付の図１に
示す。
【００１０】本発明の親ベクターｐＢＧＭＴＧは、実施
例１に詳細に説明するようにして調製することができ
る。簡単に説明すれば、プラスミドpdＢＰＶ−１(Sarve
r,N. et al., Proc.Natl Acad.Sci.USA, 79, 7147-7151
(1982))のｐＭＬ２を含有する２．６kbpのＢamＨＩ−
ＢamＨＩ断片とプラスミドpＸ１(Waguer,M.J. et al.,
Proc.Natl Acad.Sci.USA, 78, 1441-1445 (1981))のＨ
ＳＶ−１ ＰＯＨＴ３ ＴＫ遺伝子(ＴＫプロモーター及
びポリＡシグナルを含む)を含有する２．１kbpのＢamＨ
Ｉ−ＢamＨＩ断片とを連結し、プラスミドpdＭＬ２ＴＫ
を作成する。次に、プラスミドpＭＤＳＧ(Lee,F. et a
l., Nature, 294, 228-232 (1981))由来のＢamＨＩ−Ｂ
amＨＩ断片２．２kbpをプラスミドpＵＣ１８(東洋紡績
(株))のＢamＨＩ部位に挿入し、プラスミドpＵＣ−Ｅco
gptＩを作成する。
例１に詳細に説明するようにして調製することができ
る。簡単に説明すれば、プラスミドpdＢＰＶ−１(Sarve
r,N. et al., Proc.Natl Acad.Sci.USA, 79, 7147-7151
(1982))のｐＭＬ２を含有する２．６kbpのＢamＨＩ−
ＢamＨＩ断片とプラスミドpＸ１(Waguer,M.J. et al.,
Proc.Natl Acad.Sci.USA, 78, 1441-1445 (1981))のＨ
ＳＶ−１ ＰＯＨＴ３ ＴＫ遺伝子(ＴＫプロモーター及
びポリＡシグナルを含む)を含有する２．１kbpのＢamＨ
Ｉ−ＢamＨＩ断片とを連結し、プラスミドpdＭＬ２ＴＫ
を作成する。次に、プラスミドpＭＤＳＧ(Lee,F. et a
l., Nature, 294, 228-232 (1981))由来のＢamＨＩ−Ｂ
amＨＩ断片２．２kbpをプラスミドpＵＣ１８(東洋紡績
(株))のＢamＨＩ部位に挿入し、プラスミドpＵＣ−Ｅco
gptＩを作成する。
【００１１】プラスミドpdＭＬ２ＴＫよりＴＫ遺伝子の
構造遺伝子を含有するＢglII−ＳmaＩ断片(１．２kbp)
を除去し、得られた残余部分をプラスミドpＵＣ−Ｅcog
ptＩのＥcogptが含まれるＢglII−ＤraＩ断片(０．６kb
p)と連結し、プラスミドpＭＬ２ＴＧを作成する。プラ
スミドpＭＬ２ＴＧ１由来の１．１kbp ＢamＨＩ−Ｂam
ＨＩ断片をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ(ベーリンガーマン
ハイム山之内(株))により平滑末端化し、他方プラスミ
ドpＢＭＧＮeo(Karasuyama,H. et al., Eur.J.Immuno
l., 18, 97-104(1988))のＨindIIIによる部分切断とＸb
aＩによる切断とによって得られる１２．３kbp断片を同
様にＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化し、得ら
れた両者の平滑末端断片を連結し、プラスミドpＢＧＭ
ＴＧを作成する。
構造遺伝子を含有するＢglII−ＳmaＩ断片(１．２kbp)
を除去し、得られた残余部分をプラスミドpＵＣ−Ｅcog
ptＩのＥcogptが含まれるＢglII−ＤraＩ断片(０．６kb
p)と連結し、プラスミドpＭＬ２ＴＧを作成する。プラ
スミドpＭＬ２ＴＧ１由来の１．１kbp ＢamＨＩ−Ｂam
ＨＩ断片をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ(ベーリンガーマン
ハイム山之内(株))により平滑末端化し、他方プラスミ
ドpＢＭＧＮeo(Karasuyama,H. et al., Eur.J.Immuno
l., 18, 97-104(1988))のＨindIIIによる部分切断とＸb
aＩによる切断とによって得られる１２．３kbp断片を同
様にＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化し、得ら
れた両者の平滑末端断片を連結し、プラスミドpＢＧＭ
ＴＧを作成する。
【００１２】次いで、この親ベクターに目的遺伝子の発
現を抑制するアンチセンスＲＮＡコード化配列を挿入
し、アンチセンスＲＮＡ発現ベクターを作成する。以下
に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、こ
れらは本発明の単なる例示であって、本発明の範囲の限
定を意図するものではない。なお、以下の実施例中、制
限酵素を用いる遺伝子等の切断、及びＴ４ＤＮＡリガー
ゼを用いる遺伝子断片の連結は、特に断らない限り、そ
れぞれの酵素の製造元の教示に従って行っている。
現を抑制するアンチセンスＲＮＡコード化配列を挿入
し、アンチセンスＲＮＡ発現ベクターを作成する。以下
に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、こ
れらは本発明の単なる例示であって、本発明の範囲の限
定を意図するものではない。なお、以下の実施例中、制
限酵素を用いる遺伝子等の切断、及びＴ４ＤＮＡリガー
ゼを用いる遺伝子断片の連結は、特に断らない限り、そ
れぞれの酵素の製造元の教示に従って行っている。
【実施例】実施例１ 親ベクターｐＢＧＭＴＧの組立て プラスミドpdＢＰＶ−１(Sarver,N. et al., Proc.Natl
Acad.Sci.USA, 79, 7147-7151 (1982))１μgをＴris−
ＨＣl １０mＭ、ＭgＣl2 ５mＭ、ＮaＣl １００mＭ、２
−メルカプトエタノール１mＭの緩衝液中でＢamＨＩ ２
Ｕによって切断した後、pＭＬ２を含有する２．６kbpの
ＢamＨＩ−ＢamＨＩ断片を１％アガロースゲルにより分
子量マーカーを用いて分離した。他方、プラスミドpＸ
１(Waguer,M.J. et al., Proc.Natl Acad.Sci.USA, 78,
1441-1445 (1981))１μgを同様の緩衝液中でＢamＨＩ
２Ｕによって切断した後、ＨＳＶ−１ ＰＯＨＴ３ ＴＫ
遺伝子(ＴＫプロモーター及びポリＡシグナルを含む)を
含有する２．１kbpのＢamＨＩ−ＢamＨＩ断片を分子量
マーカーを用いて１％アガロースゲルにより分離した。
次いで、プラスミドpdＢＰＶ−１由来の上記２．６kbp
のＢamＨＩ−ＢamＨＩ断片とプラスミドpＸ１由来の上
記２．１kbpのＢamＨＩ−ＢamＨＩ断片とを５０mＭ Ｔr
is−ＨＣl、１０mＭ ＭgＣl2、２０mＭ ＤＴＴ、１mＭ
ＡＴＰの緩衝液中、５ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼと共に２
０℃にて２時間反応させて再度連結した。得られたプラ
スミドの中から、分子量マーカーとともに、全長及びＢ
amＨＩ１Ｕで切断した断片をアガロースゲルで分離し、
全長４.７kbp、ＢamＨＩ−ＢamＨＩ断片が２.６kbp及び
２.１kbpである所望のプラスミドを入手し、それをpＭ
Ｌ２ＴＫと命名した。
Acad.Sci.USA, 79, 7147-7151 (1982))１μgをＴris−
ＨＣl １０mＭ、ＭgＣl2 ５mＭ、ＮaＣl １００mＭ、２
−メルカプトエタノール１mＭの緩衝液中でＢamＨＩ ２
Ｕによって切断した後、pＭＬ２を含有する２．６kbpの
ＢamＨＩ−ＢamＨＩ断片を１％アガロースゲルにより分
子量マーカーを用いて分離した。他方、プラスミドpＸ
１(Waguer,M.J. et al., Proc.Natl Acad.Sci.USA, 78,
1441-1445 (1981))１μgを同様の緩衝液中でＢamＨＩ
２Ｕによって切断した後、ＨＳＶ−１ ＰＯＨＴ３ ＴＫ
遺伝子(ＴＫプロモーター及びポリＡシグナルを含む)を
含有する２．１kbpのＢamＨＩ−ＢamＨＩ断片を分子量
マーカーを用いて１％アガロースゲルにより分離した。
次いで、プラスミドpdＢＰＶ−１由来の上記２．６kbp
のＢamＨＩ−ＢamＨＩ断片とプラスミドpＸ１由来の上
記２．１kbpのＢamＨＩ−ＢamＨＩ断片とを５０mＭ Ｔr
is−ＨＣl、１０mＭ ＭgＣl2、２０mＭ ＤＴＴ、１mＭ
ＡＴＰの緩衝液中、５ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼと共に２
０℃にて２時間反応させて再度連結した。得られたプラ
スミドの中から、分子量マーカーとともに、全長及びＢ
amＨＩ１Ｕで切断した断片をアガロースゲルで分離し、
全長４.７kbp、ＢamＨＩ−ＢamＨＩ断片が２.６kbp及び
２.１kbpである所望のプラスミドを入手し、それをpＭ
Ｌ２ＴＫと命名した。
【００１３】次に、制限酵素ＢamＨＩ ２Ｕを用いてプ
ラスミドpＭＤＳＧ(Lee,F. et al.,Nature, 294, 228-2
32 (1981))１μgをＴris−ＨＣl １０mＭ、ＭgＣl2 ５m
Ｍ、ＮaＣl １００mＭ、２−メルカプトエタノール１m
Ｍの緩衝液中で切断し、ＢamＨＩ−ＢamＨＩ断片２．２
kbpを１％アガロースゲルにて分子量マーカーを用いて
分離した。他方、プラスミドpＵＣ１８(東洋紡績(株))
１μgを同様の緩衝液中にてＢamＨＩ ２Ｕで切断し、次
いでプラスミドpＭＤＳＧ由来のＢamＨＩ−ＢamＨＩ断
片２．２kbpを、５０mＭ Ｔris−ＨＣl、１０mＭ ＭgＣ
l2、２０mＭ ＤＴＴ、１mＭ ＡＴＰの緩衝液中、５Ｕの
Ｔ４ＤＮＡリガーゼによりプラスミドpＵＣ１８の唯一
のＢamＨＩサイトに挿入し、プラスミドpＵＣ−Ｅcogpt
Ｉを作成する。ここでは、分子量マーカーとともに、全
長及びＢamＨＩ１Ｕで切断した断片をアガロースゲルで
分離し、得られたプラスミドの中から全長４.９kbp、Ｂ
amＨＩ−ＢamＨＩ断片が２.７kbp及び２.２kbpである所
望のプラスミドを入手することで、プラスミドpＵＣ−
ＥcogptＩを作成した。
ラスミドpＭＤＳＧ(Lee,F. et al.,Nature, 294, 228-2
32 (1981))１μgをＴris−ＨＣl １０mＭ、ＭgＣl2 ５m
Ｍ、ＮaＣl １００mＭ、２−メルカプトエタノール１m
Ｍの緩衝液中で切断し、ＢamＨＩ−ＢamＨＩ断片２．２
kbpを１％アガロースゲルにて分子量マーカーを用いて
分離した。他方、プラスミドpＵＣ１８(東洋紡績(株))
１μgを同様の緩衝液中にてＢamＨＩ ２Ｕで切断し、次
いでプラスミドpＭＤＳＧ由来のＢamＨＩ−ＢamＨＩ断
片２．２kbpを、５０mＭ Ｔris−ＨＣl、１０mＭ ＭgＣ
l2、２０mＭ ＤＴＴ、１mＭ ＡＴＰの緩衝液中、５Ｕの
Ｔ４ＤＮＡリガーゼによりプラスミドpＵＣ１８の唯一
のＢamＨＩサイトに挿入し、プラスミドpＵＣ−Ｅcogpt
Ｉを作成する。ここでは、分子量マーカーとともに、全
長及びＢamＨＩ１Ｕで切断した断片をアガロースゲルで
分離し、得られたプラスミドの中から全長４.９kbp、Ｂ
amＨＩ−ＢamＨＩ断片が２.７kbp及び２.２kbpである所
望のプラスミドを入手することで、プラスミドpＵＣ−
ＥcogptＩを作成した。
【００１４】プラスミドpＭＬ２ＴＫ １μgをＴris−Ｈ
Ｃl １０mＭ、ＭgＣl2 １０mＭ、ＮaＣl ５０mＭ、ＤＴ
Ｅ（ジチオエリスリトール）１mＭ中にてＢglII ２Ｕに
て切断した後、Ｔris−アセテート３３mＭ、Ｍg−アセ
テート１０mＭ、Ｋ−アセテート６６mＭ、ＤＴＴ ０．
５mＭ中にてＳmaＩ ５Ｕで切断し、得られた断片を１％
アガロースゲルにて精製してＴＫ遺伝子の構造遺伝子を
含有するＢglII−ＳmaＩ断片(１．２kbp)を除去する。
得られた残余部分と、先に作成したプラスミドpＵＣ−
ＥcogptＩ１μgをＴris−ＨＣl１０mＭ、ＭgＣl2 １０m
Ｍ、ＮaＣl ５０mＭ、ＤＴＥ １mＭ中にてＢglII２Ｕ及
びＤraＩ ５Ｕを用いて切断した後１％アガロースゲル
にて精製して得られるＥcogptが含まれるＢglII−Ｄra
Ｉ断片(０．６kbp)とを、５０mＭ Ｔris−ＨＣl、１０m
Ｍ ＭgＣl2、２０mＭ ＤＴＴ、１mＭＡＴＰの緩衝液中
で５ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、プラスミド
pＭＬ２ＴＧを作成する。ここでは、得られたプラスミ
ドの中から、分子量マーカーとともに、全長及びＢamＨ
Ｉ１Ｕで切断した断片をアガロースゲルで分離し、全長
４.１kbp、ＢamＨＩ−ＢamＨＩ断片が１.５kbp及び２.
６kbpである所望のプラスミドを入手することで、プラ
スミドpＭＬ２ＴＧを作成した。
Ｃl １０mＭ、ＭgＣl2 １０mＭ、ＮaＣl ５０mＭ、ＤＴ
Ｅ（ジチオエリスリトール）１mＭ中にてＢglII ２Ｕに
て切断した後、Ｔris−アセテート３３mＭ、Ｍg−アセ
テート１０mＭ、Ｋ−アセテート６６mＭ、ＤＴＴ ０．
５mＭ中にてＳmaＩ ５Ｕで切断し、得られた断片を１％
アガロースゲルにて精製してＴＫ遺伝子の構造遺伝子を
含有するＢglII−ＳmaＩ断片(１．２kbp)を除去する。
得られた残余部分と、先に作成したプラスミドpＵＣ−
ＥcogptＩ１μgをＴris−ＨＣl１０mＭ、ＭgＣl2 １０m
Ｍ、ＮaＣl ５０mＭ、ＤＴＥ １mＭ中にてＢglII２Ｕ及
びＤraＩ ５Ｕを用いて切断した後１％アガロースゲル
にて精製して得られるＥcogptが含まれるＢglII−Ｄra
Ｉ断片(０．６kbp)とを、５０mＭ Ｔris−ＨＣl、１０m
Ｍ ＭgＣl2、２０mＭ ＤＴＴ、１mＭＡＴＰの緩衝液中
で５ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、プラスミド
pＭＬ２ＴＧを作成する。ここでは、得られたプラスミ
ドの中から、分子量マーカーとともに、全長及びＢamＨ
Ｉ１Ｕで切断した断片をアガロースゲルで分離し、全長
４.１kbp、ＢamＨＩ−ＢamＨＩ断片が１.５kbp及び２.
６kbpである所望のプラスミドを入手することで、プラ
スミドpＭＬ２ＴＧを作成した。
【００１５】プラスミドpＭＬ２ＴＧ１μgをＴris−Ｈ
Ｃl １０mＭ、ＭgＣl2 ５mＭ、ＮaＣl １００mＭ、２−
メルカプトエタノール１mＭの緩衝液中でＢamＨＩ ２Ｕ
により切断した後、１．５kbp ＢamＨＩ−ＢamＨＩ断片
を１％アガロースゲルにより分子量マーカーを使用し、
分離する。得られた１．１kbp ＢamＨＩ−ＢamＨＩ断片
に１６．６mＭ (ＮＨ4)2ＳＯ4、６７mＭ Ｔris−ＨＣ
l、６．７mＭ ＭgＣl2、１０mＭ２−メルカプトエタノ
ール、６．７μＭ ＥＤＴＡの緩衝液中、各３３μＭのd
ＡＴＰ、dＣＴＰ、dＧＴＰ、dＴＴＰを加え、その断片
をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ(ベーリンガーマンハイム山
之内(株))５Ｕにより平滑末端化する。他方、プラスミ
ドpＢＭＧＮeo(Karasuyama,H. et al., Eur.J.Immuno
l., 18, 97-104 (1988))１μgをＴris−ＨＣl １０m
Ｍ、ＭgＣl2 ５mＭ、ＮaＣl １００mＭ、２−メルカプ
トエタノール１mＭの緩衝液中にてＨindIII １Ｕで部分
切断し（反応時間１０分）、続けてＴris−ＨＣl ５０m
Ｍ、ＭgＣl2 １０mＭ、ＮaＣl １００mＭ、ＤＴＥ １m
Ｍ中にてＸbaＩ２Ｕで切断し、次いで１％アガロースゲ
ルにて分子量マーカーを使用して精製し、得られた１
２．３kbp断片を上記と同様にＴ４ＤＮＡポリメラーゼ
により平滑末端化した。このようにして得られた平滑末
端化した両断片を５０mＭ Ｔris−ＨＣl、１０mＭ Ｍg
Ｃl2、２０mＭ ＤＴＴ、１mＭＡＴＰの緩衝液中にて５
ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼによって連結し、プラスミドp
ＢＧＭＴＧを作成する。ここでは、得られたプラスミド
の中から、分子量マーカーとともに、ＢglII１Ｕで切断
した断片をアガロースゲルで分離し、ＢglII断片が２.
３kbpである所望のプラスミドを入手することで、プラ
スミドpＢＧＭＴＧを作成した。このプラスミドを含有
する大腸菌Ｅ.coli ｐＢＧＭＴＧは１９９４年３月１６
日に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４２３３の下、工業技術
院生命工学技術研究所に寄託されている。
Ｃl １０mＭ、ＭgＣl2 ５mＭ、ＮaＣl １００mＭ、２−
メルカプトエタノール１mＭの緩衝液中でＢamＨＩ ２Ｕ
により切断した後、１．５kbp ＢamＨＩ−ＢamＨＩ断片
を１％アガロースゲルにより分子量マーカーを使用し、
分離する。得られた１．１kbp ＢamＨＩ−ＢamＨＩ断片
に１６．６mＭ (ＮＨ4)2ＳＯ4、６７mＭ Ｔris−ＨＣ
l、６．７mＭ ＭgＣl2、１０mＭ２−メルカプトエタノ
ール、６．７μＭ ＥＤＴＡの緩衝液中、各３３μＭのd
ＡＴＰ、dＣＴＰ、dＧＴＰ、dＴＴＰを加え、その断片
をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ(ベーリンガーマンハイム山
之内(株))５Ｕにより平滑末端化する。他方、プラスミ
ドpＢＭＧＮeo(Karasuyama,H. et al., Eur.J.Immuno
l., 18, 97-104 (1988))１μgをＴris−ＨＣl １０m
Ｍ、ＭgＣl2 ５mＭ、ＮaＣl １００mＭ、２−メルカプ
トエタノール１mＭの緩衝液中にてＨindIII １Ｕで部分
切断し（反応時間１０分）、続けてＴris−ＨＣl ５０m
Ｍ、ＭgＣl2 １０mＭ、ＮaＣl １００mＭ、ＤＴＥ １m
Ｍ中にてＸbaＩ２Ｕで切断し、次いで１％アガロースゲ
ルにて分子量マーカーを使用して精製し、得られた１
２．３kbp断片を上記と同様にＴ４ＤＮＡポリメラーゼ
により平滑末端化した。このようにして得られた平滑末
端化した両断片を５０mＭ Ｔris−ＨＣl、１０mＭ Ｍg
Ｃl2、２０mＭ ＤＴＴ、１mＭＡＴＰの緩衝液中にて５
ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼによって連結し、プラスミドp
ＢＧＭＴＧを作成する。ここでは、得られたプラスミド
の中から、分子量マーカーとともに、ＢglII１Ｕで切断
した断片をアガロースゲルで分離し、ＢglII断片が２.
３kbpである所望のプラスミドを入手することで、プラ
スミドpＢＧＭＴＧを作成した。このプラスミドを含有
する大腸菌Ｅ.coli ｐＢＧＭＴＧは１９９４年３月１６
日に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４２３３の下、工業技術
院生命工学技術研究所に寄託されている。
【００１６】実施例２ ＣＤ４の発現を抑制するベクターの組立て 前記プラスミドpＭＤＳＧ１μgをＴris−ＨＣl １０m
Ｍ、ＭgＣl2 ５mＭ、ＮaＣl １００mＭ、２−メルカプ
トエタノール１mＭ中でＨindIII ２Ｕにて切断した後、
Ｔris−ＨＣl １０mＭ、ＭgＣl2 １０mＭ、ＮaＣl ５０
mＭ、ＤＴＥ １mＭ中にてＢglII ２Ｕで切断し、ＤＨＦ
Ｒ遺伝子を含有するＨindIII−ＢglII断片(０．８kbp)
を１％アガロースゲルにて分子量マーカーを用いて分離
した。同様に切断し精製した前記ｐＵＣ１８のＨindIII
−ＢglII断片に上記のＤＨＦＲ遺伝子を含有するＨindI
II−ＢglII断片(０．８kbp)を５０mＭ Ｔris−ＨＣl、
１０mＭ ＭgＣl2、２０mＭ ＤＴＴ、１mＭ ＡＴＰの緩
衝液中、５ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結させ、プ
ラスミドｐＵＣＤ２を作成する。ここでは、得られたプ
ラスミドの中から、分子量マーカーとともに、ＨindII
I、ＢglII各１Ｕで切断した断片をアガロースゲルで分
離し、ＨindIII−ＢglII断片が２.７kbp、０.８kbpであ
る所望のプラスミドを入手することで、プラスミドｐＵ
ＣＤ２を作成した。
Ｍ、ＭgＣl2 ５mＭ、ＮaＣl １００mＭ、２−メルカプ
トエタノール１mＭ中でＨindIII ２Ｕにて切断した後、
Ｔris−ＨＣl １０mＭ、ＭgＣl2 １０mＭ、ＮaＣl ５０
mＭ、ＤＴＥ １mＭ中にてＢglII ２Ｕで切断し、ＤＨＦ
Ｒ遺伝子を含有するＨindIII−ＢglII断片(０．８kbp)
を１％アガロースゲルにて分子量マーカーを用いて分離
した。同様に切断し精製した前記ｐＵＣ１８のＨindIII
−ＢglII断片に上記のＤＨＦＲ遺伝子を含有するＨindI
II−ＢglII断片(０．８kbp)を５０mＭ Ｔris−ＨＣl、
１０mＭ ＭgＣl2、２０mＭ ＤＴＴ、１mＭ ＡＴＰの緩
衝液中、５ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結させ、プ
ラスミドｐＵＣＤ２を作成する。ここでは、得られたプ
ラスミドの中から、分子量マーカーとともに、ＨindII
I、ＢglII各１Ｕで切断した断片をアガロースゲルで分
離し、ＨindIII−ＢglII断片が２.７kbp、０.８kbpであ
る所望のプラスミドを入手することで、プラスミドｐＵ
ＣＤ２を作成した。
【００１７】マウスのＣＤ４のcＤＮＡが組込まれてい
るプラスミドpcd−Ｌ３Ｔ４．２５(Littman,DR. et a
l., Nature, 325, 453-455 (1987))１μｇをＴris−Ｈ
Ｃl １０mＭ、ＭgＣl2 １０mＭ、ＤＴＥ １mＭ中でＫpn
Ｉ ５Ｕにより切断し、ＫpnＩ−ＫpnＩ断片（０．５kb
p，＋３２４から−２００）を１％アガロースゲルによ
って分子量マーカーを使用して分離し、それを同様にＫ
pnＩで切断し精製したｐＵＣＤ２（１μg）のＤＨＦＲ
遺伝子の下流に存在する唯一のＫpnＩサイトに、５０m
Ｍ Ｔris−ＨＣl、１０mＭ ＭgＣl2、２０mＭ ＤＴＴ、
１mＭ ＡＴＰの緩衝液中にて５ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ
により挿入する。次いで、得られた各クローン０．１μ
gを用い、Ｔris−ＨＣl１０mＭ、ＭgＣｌ2 ５mＭ、Ｎa
Ｃl １００mＭ、２−メルカプトエタノール１mＭの緩衝
液中にてＨindIII１Ｕ及びＸhoＩ１Ｕで切断し、１％ア
ガロースゲルにて電気泳動を行い、ＣＤ４遺伝子を含有
するＫpnＩ断片が逆向きになっているＤＨＦＲ遺伝子と
結合しているものを、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩで切
断した断片が約１．４kbpであるものとして選択する
（なお、同じ向きに結合している場合は、ＨindIII及び
ＸhoＩ断片は約０.８kbpとなる）。
るプラスミドpcd−Ｌ３Ｔ４．２５(Littman,DR. et a
l., Nature, 325, 453-455 (1987))１μｇをＴris−Ｈ
Ｃl １０mＭ、ＭgＣl2 １０mＭ、ＤＴＥ １mＭ中でＫpn
Ｉ ５Ｕにより切断し、ＫpnＩ−ＫpnＩ断片（０．５kb
p，＋３２４から−２００）を１％アガロースゲルによ
って分子量マーカーを使用して分離し、それを同様にＫ
pnＩで切断し精製したｐＵＣＤ２（１μg）のＤＨＦＲ
遺伝子の下流に存在する唯一のＫpnＩサイトに、５０m
Ｍ Ｔris−ＨＣl、１０mＭ ＭgＣl2、２０mＭ ＤＴＴ、
１mＭ ＡＴＰの緩衝液中にて５ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ
により挿入する。次いで、得られた各クローン０．１μ
gを用い、Ｔris−ＨＣl１０mＭ、ＭgＣｌ2 ５mＭ、Ｎa
Ｃl １００mＭ、２−メルカプトエタノール１mＭの緩衝
液中にてＨindIII１Ｕ及びＸhoＩ１Ｕで切断し、１％ア
ガロースゲルにて電気泳動を行い、ＣＤ４遺伝子を含有
するＫpnＩ断片が逆向きになっているＤＨＦＲ遺伝子と
結合しているものを、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩで切
断した断片が約１．４kbpであるものとして選択する
（なお、同じ向きに結合している場合は、ＨindIII及び
ＸhoＩ断片は約０.８kbpとなる）。
【００１８】選択された上記プラスミド１μｇを５０m
Ｍ Ｔris−ＨＣl、１０mＭ ＭgＣl2、１００mＭ ＮaＣ
ｌ、１mＭ ＤＴＥ中にてＨindIII２Ｕ及びＥcoＲＩ２Ｕ
を用いて切断した後、ＣＤ遺伝子およびＤＨＦＲ遺伝子
を含有する１.４kbpのＨindIII−ＥcoＲＩ断片を１％ア
ガロースゲルにて分子量マーカーにより分離し、それ
を、１６．６mＭ (ＮＨ4)2ＳＯ4、６７mＭ Ｔris−ＨＣ
l、６．７mＭ ＭgＣl2、１０mＭ２−メルカプトエタノ
ール、６．７μＭ ＥＤＴＡの緩衝液中にて各３３μＭ
のdＡＴＰ、dＣＴＰ、dＧＴＰ、dＴＴＰを加えてＴ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼによって平滑末端化し、さらに実施例
１にて調製したｐＢＧＭＴＧ１μｇを５０mＭ Ｔris−
ＨＣl、１０mＭ ＭgＣｌ2、１００mＭ ＮaＣl、１mＭＤ
ＴＥ中にてＸbaＩ２Ｕ及びＳalＩ２Ｕで切断し、１％ア
ガロースゲル上で大きいほうの断片を分離した後、同様
にＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し、次いで５０
mＭ Ｔris−ＨＣl、１０mＭ ＭgＣl2、２０mＭ ＤＴ
Ｔ、１mＭ ＡＴＰ中で５ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼにより
両者を連結させ、５０mＭＴris−ＨＣl、１０mＭＭgＣl
2、１００mＭＮaＣl、１mＭ ＤＴＥ中でＮotＩ２Ｕ及び
ＸhoＩ２Ｕで切断し、１％アガロースゲルにて電気泳動
を行い、Ｅcogpt遺伝子−ＤＨＦＲ遺伝子−アンチセン
スＣＤ４遺伝子の順に並んでいるものを、ＮotＩ及びＸ
hoＩで切断した断片が約５．５kbpであるものとして選
択し（分子量マーカー使用）、プラスミドpＤＡＡＳ５
００ＴＫＧを作成する。
Ｍ Ｔris−ＨＣl、１０mＭ ＭgＣl2、１００mＭ ＮaＣ
ｌ、１mＭ ＤＴＥ中にてＨindIII２Ｕ及びＥcoＲＩ２Ｕ
を用いて切断した後、ＣＤ遺伝子およびＤＨＦＲ遺伝子
を含有する１.４kbpのＨindIII−ＥcoＲＩ断片を１％ア
ガロースゲルにて分子量マーカーにより分離し、それ
を、１６．６mＭ (ＮＨ4)2ＳＯ4、６７mＭ Ｔris−ＨＣ
l、６．７mＭ ＭgＣl2、１０mＭ２−メルカプトエタノ
ール、６．７μＭ ＥＤＴＡの緩衝液中にて各３３μＭ
のdＡＴＰ、dＣＴＰ、dＧＴＰ、dＴＴＰを加えてＴ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼによって平滑末端化し、さらに実施例
１にて調製したｐＢＧＭＴＧ１μｇを５０mＭ Ｔris−
ＨＣl、１０mＭ ＭgＣｌ2、１００mＭ ＮaＣl、１mＭＤ
ＴＥ中にてＸbaＩ２Ｕ及びＳalＩ２Ｕで切断し、１％ア
ガロースゲル上で大きいほうの断片を分離した後、同様
にＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し、次いで５０
mＭ Ｔris−ＨＣl、１０mＭ ＭgＣl2、２０mＭ ＤＴ
Ｔ、１mＭ ＡＴＰ中で５ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼにより
両者を連結させ、５０mＭＴris−ＨＣl、１０mＭＭgＣl
2、１００mＭＮaＣl、１mＭ ＤＴＥ中でＮotＩ２Ｕ及び
ＸhoＩ２Ｕで切断し、１％アガロースゲルにて電気泳動
を行い、Ｅcogpt遺伝子−ＤＨＦＲ遺伝子−アンチセン
スＣＤ４遺伝子の順に並んでいるものを、ＮotＩ及びＸ
hoＩで切断した断片が約５．５kbpであるものとして選
択し（分子量マーカー使用）、プラスミドpＤＡＡＳ５
００ＴＫＧを作成する。
【００１９】上記と同様にして、ＣＤ４のcＤＮＡ中の
−３３から−２００を含むプラスミドｐＤＡＡＳ２１０
ＴＫＧ、＋１５８２から＋１０７０を含むプラスミドp
ＤＡＡＳstop５１０ＴＫＧ、及び＋２７３６から＋２３
０６を含むｐＤＡＡＳ３’３６０ＴＫＧも作成した。
−３３から−２００を含むプラスミドｐＤＡＡＳ２１０
ＴＫＧ、＋１５８２から＋１０７０を含むプラスミドp
ＤＡＡＳstop５１０ＴＫＧ、及び＋２７３６から＋２３
０６を含むｐＤＡＡＳ３’３６０ＴＫＧも作成した。
【００２０】実施例３ ＣＤ４５の発現を抑制するベクターの組立て ＤＮＡ合成機(Applied Biosystems, 391 DNA Synthesiz
er)により合成した合成ＤＮＡ２４マー（ＣＴＡＧＡＧ
ＴＣＧＡＣＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴＣＣＣ）及び合成ＤＮ
Ａ２４マー（ＴＣＧＡＧＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＧＴ
ＣＧＡＣＴ）各１μgを７０mＭ Ｔris−ＨＣl、１０mＭ
ＭgＣｌ2、５mＭ ＤＴＴの緩衝液中に入れ、ＡＴＰ５
mＭの存在下にてＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを反応
させ、熱を加えた後ゆっくりと徐冷することにより両Ｄ
ＮＡをアニールさせ、二本鎖ＤＮＡにする。プラスミド
ｐＢＳＩＩＫＳ＋（Stratagene２１２２０７）１μgを
５０mＭ Ｔris−ＨＣl、１０mＭ ＭgＣl2、１００mＭ
ＮaＣl、１mＭ ＤＴＥ中でＸhoＩ５Ｕ及びＸbaＩ５Ｕに
て切断した後１％アガロースゲルで精製して大きい方の
断片を入手し、そのＸbaＩ−ＸhoＩ間に上記二本鎖ＤＮ
Ａを、５０mＭＴris−ＨＣl、１０mＭＭgＣl2、２０mＭ
ＤＴＴ、１mＭＡＴＰ中、５ＵのＴ４リガーゼを用いて
挿入する。得られた断片をさらに５０mＭ Ｔris−ＨＣ
l、１０mＭ ＭgＣl2、１００mＭ ＮaＣl、１mＭ ＤＴＥ
中にてＨindIII５Ｕ及びＢamＨＩ５Ｕにより切断し、１
％アガロースゲルで精製して得られるＨindIII−ＢamＨ
Ｉ断片（小さい方の断片）が除かれたものに、前記プラ
スミドｐＵＣＤ２のＨindIII−ＢglII断片(０．８kbp)
を挿入して、プラスミドｐＸＸＤＨを作成する。ここで
は、得られたプラスミド０.１μgを用い、１０mＭＴris
−ＨＣl、１０mＭＭgＣl2、１mＭ ＤＴＥ中でＳacＩ１
Ｕ及びＫpnＩ１Ｕにて切断した後、分子量マーカーとと
もにアガロースゲルで分離し、ＳacＩ−ＫpnＩ断片が
２.９kbp、０.８kbpのものを選別することで、プラスミ
ドｐＸＸＤＨを作成した。
er)により合成した合成ＤＮＡ２４マー（ＣＴＡＧＡＧ
ＴＣＧＡＣＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴＣＣＣ）及び合成ＤＮ
Ａ２４マー（ＴＣＧＡＧＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＧＴ
ＣＧＡＣＴ）各１μgを７０mＭ Ｔris−ＨＣl、１０mＭ
ＭgＣｌ2、５mＭ ＤＴＴの緩衝液中に入れ、ＡＴＰ５
mＭの存在下にてＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを反応
させ、熱を加えた後ゆっくりと徐冷することにより両Ｄ
ＮＡをアニールさせ、二本鎖ＤＮＡにする。プラスミド
ｐＢＳＩＩＫＳ＋（Stratagene２１２２０７）１μgを
５０mＭ Ｔris−ＨＣl、１０mＭ ＭgＣl2、１００mＭ
ＮaＣl、１mＭ ＤＴＥ中でＸhoＩ５Ｕ及びＸbaＩ５Ｕに
て切断した後１％アガロースゲルで精製して大きい方の
断片を入手し、そのＸbaＩ−ＸhoＩ間に上記二本鎖ＤＮ
Ａを、５０mＭＴris−ＨＣl、１０mＭＭgＣl2、２０mＭ
ＤＴＴ、１mＭＡＴＰ中、５ＵのＴ４リガーゼを用いて
挿入する。得られた断片をさらに５０mＭ Ｔris−ＨＣ
l、１０mＭ ＭgＣl2、１００mＭ ＮaＣl、１mＭ ＤＴＥ
中にてＨindIII５Ｕ及びＢamＨＩ５Ｕにより切断し、１
％アガロースゲルで精製して得られるＨindIII−ＢamＨ
Ｉ断片（小さい方の断片）が除かれたものに、前記プラ
スミドｐＵＣＤ２のＨindIII−ＢglII断片(０．８kbp)
を挿入して、プラスミドｐＸＸＤＨを作成する。ここで
は、得られたプラスミド０.１μgを用い、１０mＭＴris
−ＨＣl、１０mＭＭgＣl2、１mＭ ＤＴＥ中でＳacＩ１
Ｕ及びＫpnＩ１Ｕにて切断した後、分子量マーカーとと
もにアガロースゲルで分離し、ＳacＩ−ＫpnＩ断片が
２.９kbp、０.８kbpのものを選別することで、プラスミ
ドｐＸＸＤＨを作成した。
【００２１】次に同様にＤＮＡ合成機により、合成ＤＮ
Ａ３３マー（ＡＧＡＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＴ
ＴＴＧＡＧＧＴＣＴＧＣＣＴＴ）及び２７マー（ＧＡＧ
ＣＴＣＧＡＧＴＡＧＧＡＡＡＣＴＴＧＣＴＣＣＣＣＡ）
を製造し、それらをプライマーとして使用し、マウスの
ＣＤ４５のcＤＮＡが組込まれているプラスミドｐＬy−
５・Ｔ４(Raschke W.C. et al., Proc.Natl Acad.Sci.U
SA, 84, 161-165 (1987))の構造遺伝子＋１８から＋３
７１までをＰＣＲにより複製する。各プライマー０．８
μg、ｐＬy−５・Ｔ４ ０．２μg、dＡＴＰ、dＣＴＰ、
dＧＴＰ、dＴＴＰ各２mＭを加えた１００mＭＴris−Ｈ
Ｃl、５００mＭＫＣｌ、１５mＭＭgＣｌ２の緩衝液中
に、５ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼを加え、９５℃１
分、５５℃１分、７２℃１分の反応を３０回繰り返し
た。ＰＣＲにより複製した二本鎖ＤＮＡを５０mＭ Ｔri
s−ＨＣl、１０mＭ ＭgＣl2、１００mＭ ＮaＣl、１mＭ
ＤＴＥ中でＳalＩ５Ｕ及びＸhoＩ５Ｕにて切断したの
ち、１％アガロースゲルで精製した。他方、前記プラス
ミドｐＸＸＤＨを５０mＭ Ｔris−ＨＣl、１０mＭ Ｍg
Ｃl2、１００mＭ ＮaＣl、１mＭ ＤＴＥ中でＸhoＩ５
Ｕにて切断し１％アガロースゲルで精製し、得られた唯
一のＸhoＩサイトに、５０mＭ Ｔris−ＨＣl、１０mＭ
ＭgＣl2、２０mＭ ＤＴＴ、１mＭ ＡＴＰ中にて５Ｕの
Ｔ４リガーゼにより上記切断二本鎖ＤＮＡを挿入する。
得られたプラスミドから、ＤＨＦＲ遺伝子の下流に逆方
向にＣＤ４５のＤＮＡが組込まれているものを選択する
に当たり、各クローン０．１μgをＴris−ＨＣl ５０m
Ｍ、ＭgＣl2 １０mＭ、ＮaＣl １００mＭ、ＤＴＥ１mＭ
中にてＸbaＩ１Ｕ、ＸhoＩ１Ｕで切断し、１％アガロー
スゲルにて電気泳動を行うことによって、ＸbaＩ及びＸ
hoＩで切断した約１．２kbpの断片のあるものとして選
択し（正方向に組込まれたものは０.８kbpの断片とな
る）、プラスミドｐＤＨＡＳ３５０を作成する。
Ａ３３マー（ＡＧＡＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＴ
ＴＴＧＡＧＧＴＣＴＧＣＣＴＴ）及び２７マー（ＧＡＧ
ＣＴＣＧＡＧＴＡＧＧＡＡＡＣＴＴＧＣＴＣＣＣＣＡ）
を製造し、それらをプライマーとして使用し、マウスの
ＣＤ４５のcＤＮＡが組込まれているプラスミドｐＬy−
５・Ｔ４(Raschke W.C. et al., Proc.Natl Acad.Sci.U
SA, 84, 161-165 (1987))の構造遺伝子＋１８から＋３
７１までをＰＣＲにより複製する。各プライマー０．８
μg、ｐＬy−５・Ｔ４ ０．２μg、dＡＴＰ、dＣＴＰ、
dＧＴＰ、dＴＴＰ各２mＭを加えた１００mＭＴris−Ｈ
Ｃl、５００mＭＫＣｌ、１５mＭＭgＣｌ２の緩衝液中
に、５ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼを加え、９５℃１
分、５５℃１分、７２℃１分の反応を３０回繰り返し
た。ＰＣＲにより複製した二本鎖ＤＮＡを５０mＭ Ｔri
s−ＨＣl、１０mＭ ＭgＣl2、１００mＭ ＮaＣl、１mＭ
ＤＴＥ中でＳalＩ５Ｕ及びＸhoＩ５Ｕにて切断したの
ち、１％アガロースゲルで精製した。他方、前記プラス
ミドｐＸＸＤＨを５０mＭ Ｔris−ＨＣl、１０mＭ Ｍg
Ｃl2、１００mＭ ＮaＣl、１mＭ ＤＴＥ中でＸhoＩ５
Ｕにて切断し１％アガロースゲルで精製し、得られた唯
一のＸhoＩサイトに、５０mＭ Ｔris−ＨＣl、１０mＭ
ＭgＣl2、２０mＭ ＤＴＴ、１mＭ ＡＴＰ中にて５Ｕの
Ｔ４リガーゼにより上記切断二本鎖ＤＮＡを挿入する。
得られたプラスミドから、ＤＨＦＲ遺伝子の下流に逆方
向にＣＤ４５のＤＮＡが組込まれているものを選択する
に当たり、各クローン０．１μgをＴris−ＨＣl ５０m
Ｍ、ＭgＣl2 １０mＭ、ＮaＣl １００mＭ、ＤＴＥ１mＭ
中にてＸbaＩ１Ｕ、ＸhoＩ１Ｕで切断し、１％アガロー
スゲルにて電気泳動を行うことによって、ＸbaＩ及びＸ
hoＩで切断した約１．２kbpの断片のあるものとして選
択し（正方向に組込まれたものは０.８kbpの断片とな
る）、プラスミドｐＤＨＡＳ３５０を作成する。
【００２２】このプラスミドｐＤＨＡＳ３５０(１μg)
を５０mＭＴris−ＨＣl、１０mＭ ＭgＣl2、１００mＭ
ＮaＣl、１mＭ ＤＴＥの緩衝液中にてＸbaＩ５Ｕ及びＸ
hoＩ５Ｕで切断した後１％アガロースゲルで精製し、そ
のプラスミドからＤＨＦＲ遺伝子及びアンチセンスＲＮ
ＡをコードするＤＮＡが含まれるＸbaＩ−ＸhoＩ断片
(１．２kbp)を分離する。他方、実施例１にて調製した
プラスミドpＢＧＭＴＧ１μgを５０mＭ Ｔris−ＨＣl、
１０mＭ ＭgＣl2、１００mＭ ＮaＣl、１mＭ ＤＴＥ中
でＸbaＩ５Ｕ及びＳalＩ５Ｕで切断した後１％アガロー
スゲルで精製し、メタロチオネインプロモータを除去し
たＸbaＩ−ＳalＩサイトに、５０mＭ Ｔris−ＨＣｌ、
１０mＭ ＭgＣl2、２０mＭ ＤＴＴ、１mＭ ＡＴＰ中に
て５ＵのＴ４リガーゼにより上記ＸbaＩ−ＸhoＩ断片を
挿入し、プラスミドｐＤＡＳ４５ＴＫＧを作成する。こ
こでは、得られたプラスミド１μgを用い、５０mＭ Ｔr
is−ＨＣl、１０mＭ ＭgＣl2、１００mＭ ＮaＣl、１m
Ｍ ＤＴＥの緩衝液中にてＸbaＩ５Ｕ及びＸhoＩ５Ｕで
切断した後、分子量マーカーとともに１％アガロースゲ
ルで分離し、１.２kbpの断片のあるものを選択すること
により、プラスミドｐＤＡＳ４５ＴＫＧを作成した。同
様にして、ＣＤ４５のcＤＮＡ中の＋１８から＋１６１
を含むプラスミドｐＤＡＳ４５２ＴＫＧを作成する。
を５０mＭＴris−ＨＣl、１０mＭ ＭgＣl2、１００mＭ
ＮaＣl、１mＭ ＤＴＥの緩衝液中にてＸbaＩ５Ｕ及びＸ
hoＩ５Ｕで切断した後１％アガロースゲルで精製し、そ
のプラスミドからＤＨＦＲ遺伝子及びアンチセンスＲＮ
ＡをコードするＤＮＡが含まれるＸbaＩ−ＸhoＩ断片
(１．２kbp)を分離する。他方、実施例１にて調製した
プラスミドpＢＧＭＴＧ１μgを５０mＭ Ｔris−ＨＣl、
１０mＭ ＭgＣl2、１００mＭ ＮaＣl、１mＭ ＤＴＥ中
でＸbaＩ５Ｕ及びＳalＩ５Ｕで切断した後１％アガロー
スゲルで精製し、メタロチオネインプロモータを除去し
たＸbaＩ−ＳalＩサイトに、５０mＭ Ｔris−ＨＣｌ、
１０mＭ ＭgＣl2、２０mＭ ＤＴＴ、１mＭ ＡＴＰ中に
て５ＵのＴ４リガーゼにより上記ＸbaＩ−ＸhoＩ断片を
挿入し、プラスミドｐＤＡＳ４５ＴＫＧを作成する。こ
こでは、得られたプラスミド１μgを用い、５０mＭ Ｔr
is−ＨＣl、１０mＭ ＭgＣl2、１００mＭ ＮaＣl、１m
Ｍ ＤＴＥの緩衝液中にてＸbaＩ５Ｕ及びＸhoＩ５Ｕで
切断した後、分子量マーカーとともに１％アガロースゲ
ルで分離し、１.２kbpの断片のあるものを選択すること
により、プラスミドｐＤＡＳ４５ＴＫＧを作成した。同
様にして、ＣＤ４５のcＤＮＡ中の＋１８から＋１６１
を含むプラスミドｐＤＡＳ４５２ＴＫＧを作成する。
【００２３】試験例１ アンチセンスＲＮＡによるＣＤ４発現の抑制 Ｔ細胞ハイブリドーマＥ４４(Sakato N. et al., Immun
ology 71, 153-157 (1990))を１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ
１６４０培養液［ギブコ］５ml を用いて５０％全面成
長の状態にまで培養し、遠心により回収してＯpti−Ｍ
ＥＭＩ培養液［ギブコ］３ml を用いて２回洗浄する。
次いで、その同じ培養液１．５ml 中に再度懸濁する。
実施例２により調製したプラスミドｐＤＡＳ５００ＴＫ
Ｇ １０μgをエタノール沈澱させ、乾燥後、５０μl の
水に溶解させる。これとリポフェクチン(ギブコ)４０μ
l を水１０μlで希釈したものとを混合し、用意したＴ
細胞ハイブリドーマＥ４４細胞溶液に滴下してトランス
フェクションを行い、１６時間ＣＯ2インキュベータ内
で培養する。
ology 71, 153-157 (1990))を１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ
１６４０培養液［ギブコ］５ml を用いて５０％全面成
長の状態にまで培養し、遠心により回収してＯpti−Ｍ
ＥＭＩ培養液［ギブコ］３ml を用いて２回洗浄する。
次いで、その同じ培養液１．５ml 中に再度懸濁する。
実施例２により調製したプラスミドｐＤＡＳ５００ＴＫ
Ｇ １０μgをエタノール沈澱させ、乾燥後、５０μl の
水に溶解させる。これとリポフェクチン(ギブコ)４０μ
l を水１０μlで希釈したものとを混合し、用意したＴ
細胞ハイブリドーマＥ４４細胞溶液に滴下してトランス
フェクションを行い、１６時間ＣＯ2インキュベータ内
で培養する。
【００２４】トランスフェクションを行った細胞溶液に
２０％ＦＣＳ−Ｏpti−ＭＥＭ［ギブコ］１．５mlを加
え、さらに２４時間培養する。遠心により細胞を回収
し、１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培養液２４ml中に
懸濁し、１mlずつ２４ウェルプレートにまき、２４時間
培養する。各ウェルに１mlの選択培地(１．６μg／mlマ
イコフェノール酸、５００μg／mlザンチン、３０μg／
mlハイポキサンチン、２０μg／mlチミジン、４μg／ml
アミノプテリン、１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培養
液）を加え、以後３日毎に半量の培地を選択培地（０．
８μg／mlマイコフェノール酸、２５０μg／mlザンチ
ン、１５μg／mlハイポキサンチン、１０μg／mlチミジ
ン、２μg／mlアミノプリテン）と交換する。同様に、
ｐＤＡＡＳ２１０ＴＫＧ、ｐＤＡＡＳstop５１０ＴＫ
Ｇ、及びｐＤＡＡＳ３’３６０ＴＫＧを用いてトランス
フェクションを行った。
２０％ＦＣＳ−Ｏpti−ＭＥＭ［ギブコ］１．５mlを加
え、さらに２４時間培養する。遠心により細胞を回収
し、１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培養液２４ml中に
懸濁し、１mlずつ２４ウェルプレートにまき、２４時間
培養する。各ウェルに１mlの選択培地(１．６μg／mlマ
イコフェノール酸、５００μg／mlザンチン、３０μg／
mlハイポキサンチン、２０μg／mlチミジン、４μg／ml
アミノプテリン、１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培養
液）を加え、以後３日毎に半量の培地を選択培地（０．
８μg／mlマイコフェノール酸、２５０μg／mlザンチ
ン、１５μg／mlハイポキサンチン、１０μg／mlチミジ
ン、２μg／mlアミノプリテン）と交換する。同様に、
ｐＤＡＡＳ２１０ＴＫＧ、ｐＤＡＡＳstop５１０ＴＫ
Ｇ、及びｐＤＡＡＳ３’３６０ＴＫＧを用いてトランス
フェクションを行った。
【００２５】１０日後にマイコフェノール酸耐性のコロ
ニーが出現し始め、これらのコロニーを各ウェル毎に増
殖させ、ラット抗−マウスＣＤ４抗体（ＧＫ−１．５）
−ＦＩＴＣ標識抗−ラット抗体により染色し、ＦＡＣＳ
（ＦＡＣＳcan，ベクトンディッキンソン）によりトラ
ンスフェクトしたＥ４４細胞のＣＤ４発現率を測定し
た。各トランスフェクタント細胞のうち、ＣＤ４発現率
が低下していたのはｐＤＡＳ５００ＴＫＧのみであり、
そのトランスフェクト細胞の発現率はトランスフェクト
していないＥ４４細胞の１／１０であった。Ｅ４４細胞
は通常ＣＤ４以外のＣＤ３及びＴＣＲを発現するが、上
記のアンチセンスＲＮＡが導入された細胞では、ＣＤ３
及びＴＣＲの発現率はもとのＥ４４細胞と比較して低下
しておらず、ＣＤ４のみが特異的に抑制されていること
が確認された。また、このアンチセンスＲＮＡをコード
するＤＮＡの代わりにセンスＤＮＡを組込んだｐＤＳ５
００ＳＧＢをトランスフェクトした細胞ではＣＤ４、Ｃ
Ｄ３、ＴＣＲの何れもその発現が抑制されていなかっ
た。次に、ＣＤ４の抑制が確認できた、プラスミドｐＤ
ＡＳ５００ＴＫＧをトランスフェクトした細胞のＲＮＡ
を抽出し、ＣＤ４のアンチセンスＲＮＡ鎖に相補する放
射標識プローブを用いてノーザンブロットを行った。実
施例２にて調製したベクターに挿入したアンチセンスＲ
ＮＡをコードするＤＮＡ断片は約５００bp長であるが、
このノーザンブロットでは、ＣＤ４アンチセンスＲＮＡ
を含む２．７kbpのmＲＮＡがフィルム感光によって確認
された。このことは、本実施例におけるＣＤ４アンチセ
ンスＲＮＡがＥcogpt遺伝子ＲＮＡのリードスルーとし
て発現されたことを示している。
ニーが出現し始め、これらのコロニーを各ウェル毎に増
殖させ、ラット抗−マウスＣＤ４抗体（ＧＫ−１．５）
−ＦＩＴＣ標識抗−ラット抗体により染色し、ＦＡＣＳ
（ＦＡＣＳcan，ベクトンディッキンソン）によりトラ
ンスフェクトしたＥ４４細胞のＣＤ４発現率を測定し
た。各トランスフェクタント細胞のうち、ＣＤ４発現率
が低下していたのはｐＤＡＳ５００ＴＫＧのみであり、
そのトランスフェクト細胞の発現率はトランスフェクト
していないＥ４４細胞の１／１０であった。Ｅ４４細胞
は通常ＣＤ４以外のＣＤ３及びＴＣＲを発現するが、上
記のアンチセンスＲＮＡが導入された細胞では、ＣＤ３
及びＴＣＲの発現率はもとのＥ４４細胞と比較して低下
しておらず、ＣＤ４のみが特異的に抑制されていること
が確認された。また、このアンチセンスＲＮＡをコード
するＤＮＡの代わりにセンスＤＮＡを組込んだｐＤＳ５
００ＳＧＢをトランスフェクトした細胞ではＣＤ４、Ｃ
Ｄ３、ＴＣＲの何れもその発現が抑制されていなかっ
た。次に、ＣＤ４の抑制が確認できた、プラスミドｐＤ
ＡＳ５００ＴＫＧをトランスフェクトした細胞のＲＮＡ
を抽出し、ＣＤ４のアンチセンスＲＮＡ鎖に相補する放
射標識プローブを用いてノーザンブロットを行った。実
施例２にて調製したベクターに挿入したアンチセンスＲ
ＮＡをコードするＤＮＡ断片は約５００bp長であるが、
このノーザンブロットでは、ＣＤ４アンチセンスＲＮＡ
を含む２．７kbpのmＲＮＡがフィルム感光によって確認
された。このことは、本実施例におけるＣＤ４アンチセ
ンスＲＮＡがＥcogpt遺伝子ＲＮＡのリードスルーとし
て発現されたことを示している。
【００２６】試験例２ アンチセンスＲＮＡによるＣＤ４５の発現の抑制 Ｔ細胞ハイブリドーマ３ＤＯ−５４．８(White J. et a
l., Immunology 130,1033-1037 (1983))を５０％全面成
長した状態まで培養し、遠心により回収してＲＰＭＩ１
６４０培養液［ギブコ］５ml で２回洗浄する。得られ
たペレットをＲＰＭＩ１６４０で濃度５×１０5／mlに
調整する。実施例３で得たプラスミドｐＤＡＳ４５ＴＫ
Ｇ ２０μgをエタノール沈澱し、乾燥後、水５０μl に
溶解させる。これとリポフェクチン（ギブコ）４０μl
を水１０μlで希釈したものとを混合し、上記の細胞溶
液２ml(１×１０6)に滴下して、インキュベータ内で６
時間放置する。１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培養液
２０ml に上記のトランスフェクションした細胞溶液を
加え、インキュベータ内で４８時間培養する。細胞を遠
心により回収し、１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０にて
洗浄後、２５mlの選択培地(０．１μg／mlマイコフェノ
ール酸、２５０μg／mlザンチン、１５μg／mlハイポキ
サンチン、１０μg／mlチミジン、２μg／mlアミノプテ
リン、１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培養液）中に懸
濁し、９６ウェルプレートの各ウェルに２００μlずつ
添加し、１週間培養する。各ウェルの培養液の半量を新
鮮な１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０と交換し、以後３
日毎に培養液半量を交換する。同様にしてｐＤＡＳ４５
２ＴＫＧのトランスフェクションを行った。
l., Immunology 130,1033-1037 (1983))を５０％全面成
長した状態まで培養し、遠心により回収してＲＰＭＩ１
６４０培養液［ギブコ］５ml で２回洗浄する。得られ
たペレットをＲＰＭＩ１６４０で濃度５×１０5／mlに
調整する。実施例３で得たプラスミドｐＤＡＳ４５ＴＫ
Ｇ ２０μgをエタノール沈澱し、乾燥後、水５０μl に
溶解させる。これとリポフェクチン（ギブコ）４０μl
を水１０μlで希釈したものとを混合し、上記の細胞溶
液２ml(１×１０6)に滴下して、インキュベータ内で６
時間放置する。１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培養液
２０ml に上記のトランスフェクションした細胞溶液を
加え、インキュベータ内で４８時間培養する。細胞を遠
心により回収し、１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０にて
洗浄後、２５mlの選択培地(０．１μg／mlマイコフェノ
ール酸、２５０μg／mlザンチン、１５μg／mlハイポキ
サンチン、１０μg／mlチミジン、２μg／mlアミノプテ
リン、１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培養液）中に懸
濁し、９６ウェルプレートの各ウェルに２００μlずつ
添加し、１週間培養する。各ウェルの培養液の半量を新
鮮な１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０と交換し、以後３
日毎に培養液半量を交換する。同様にしてｐＤＡＳ４５
２ＴＫＧのトランスフェクションを行った。
【００２７】トランスフェクション後２週間でコロニー
が出現し始め、これらのコロニーを増殖させた後、マウ
ス抗−マウスＣＤ４５抗体、ＦＩＴＣ標識アンチ抗−抗
体（カッペル社）により染色した。同様に、トランスフ
ェクションしていない３ＤＯ−５４．８細胞も染色し、
対照として用いた。ＦＡＣＳにより両者を比較すること
で、トランスフェクトした３ＤＯ−５４．８のＣＤ４５
発現を評価した。トランスフェクトした細胞のうち、ｐ
ＤＡＳ４５２ＴＫＧのトランスフェクタント細胞のＣＤ
４５発現率の変化はなかったが、ｐＤＡＳ４５ＴＫＧの
トランスフェクタント細胞のＣＤ４５発現は、トランス
フェクトしていない対照細胞の２５％の発現率でしかな
かった。
が出現し始め、これらのコロニーを増殖させた後、マウ
ス抗−マウスＣＤ４５抗体、ＦＩＴＣ標識アンチ抗−抗
体（カッペル社）により染色した。同様に、トランスフ
ェクションしていない３ＤＯ−５４．８細胞も染色し、
対照として用いた。ＦＡＣＳにより両者を比較すること
で、トランスフェクトした３ＤＯ−５４．８のＣＤ４５
発現を評価した。トランスフェクトした細胞のうち、ｐ
ＤＡＳ４５２ＴＫＧのトランスフェクタント細胞のＣＤ
４５発現率の変化はなかったが、ｐＤＡＳ４５ＴＫＧの
トランスフェクタント細胞のＣＤ４５発現は、トランス
フェクトしていない対照細胞の２５％の発現率でしかな
かった。
【００２８】
【発明の効果】本発明のベクターを使用すれば、利用す
るアンチセンスＲＮＡのコード化配列の部位や長さにか
かわらず、安定に転写させることができ、センスＤＮＡ
の発現を抑制することが可能となる。従って、本発明は
遺伝子機能の解析や遺伝子治療の応用等の評価を行うう
えで有用である。さらに、ＣＤ４及びＣＤ４５を抑制す
るアンチセンスＲＮＡを発現する本発明のベクターによ
り、免疫細胞の機能解析や免疫疾患の治療への応用が可
能になる。
るアンチセンスＲＮＡのコード化配列の部位や長さにか
かわらず、安定に転写させることができ、センスＤＮＡ
の発現を抑制することが可能となる。従って、本発明は
遺伝子機能の解析や遺伝子治療の応用等の評価を行うう
えで有用である。さらに、ＣＤ４及びＣＤ４５を抑制す
るアンチセンスＲＮＡを発現する本発明のベクターによ
り、免疫細胞の機能解析や免疫疾患の治療への応用が可
能になる。
【図１】 アンチセンスＲＮＡを発現するための親ベク
ター、ｐＢＧＭＴＧの制限部位及び機能地図である。
ター、ｐＢＧＭＴＧの制限部位及び機能地図である。
【符号の説明】 １ チミジンキナーゼプロモータ断片 ２ Ｅcogpt断片 ３ チミジンキナーゼのポリＡシグナルを含む断片 ４ メタロチオネインプロモータ断片 ５ ウサギβグロビンのスプライスサイト断片 ６ ウサギβグロビンのポリＡシグナルを含む断片 ７ ヒトβグロビン断片 ８ ウシパピローマウイルスの６９％断片 ９ ｐＢＲ３２２由来の断片
Claims (9)
- 【請求項１】 チミジンキナーゼプロモータ、Ｅcogpt
遺伝子の構造遺伝子、チミジンキナーゼのポリＡシグナ
ル及び所望のＤＮＡ配列をこの順序で配列させたＤＮＡ
配列を含有しているベクターを使用することを特徴とす
る、当該所望のＤＮＡ配列を転写させる方法。 - 【請求項２】 所望のＤＮＡ配列がアンチセンス鎖であ
る請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 チミジンキナーゼプロモータ、Ｅcogpt
遺伝子の構造遺伝子、チミジンキナーゼのポリＡシグナ
ル及び所望のＤＮＡ配列をこの順序で配列させたＤＮＡ
配列を含有するベクター。 - 【請求項４】 所望のＤＮＡ配列がある構造遺伝子のア
ンチセンス鎖のすべて又はその一部である請求項３に記
載のベクター。 - 【請求項５】 所望のＤＮＡ配列がＣＤ４の発現を抑制
するＣＤ４コード化配列のアンチセンス鎖のすべて又は
その一部である請求項３に記載のベクター。 - 【請求項６】 所望のＤＮＡ配列がマウスＣＤ４コード
化配列の＋３２４から−２００に相当するアンチセンス
ＲＮＡをコードするＤＮＡである請求項５に記載のベク
ター。 - 【請求項７】 所望のＤＮＡ配列がＣＤ４５の発現を抑
制するＣＤ４５コード化配列のアンチセンス鎖のすべて
又はその一部である請求項３に記載のベクター。 - 【請求項８】 所望のＤＮＡ配列がマウスＣＤ４５コー
ド化配列の＋３７１から＋１８に相当するアンチセンス
ＲＮＡをコードするＤＮＡである請求項７に記載のベク
ター。 - 【請求項９】 図１に示されるベクターpＢＧＭＴＧ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6073162A JPH07274967A (ja) | 1994-04-12 | 1994-04-12 | アンチセンスｒｎａを発現するベクター |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6073162A JPH07274967A (ja) | 1994-04-12 | 1994-04-12 | アンチセンスｒｎａを発現するベクター |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07274967A true JPH07274967A (ja) | 1995-10-24 |
Family
ID=13510202
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6073162A Pending JPH07274967A (ja) | 1994-04-12 | 1994-04-12 | アンチセンスｒｎａを発現するベクター |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07274967A (ja) |
-
1994
- 1994-04-12 JP JP6073162A patent/JPH07274967A/ja active Pending
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