KR100369418B1 - 포유동물발현용완전히손상된공통코작서열 - Google Patents

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Abstract

본 명세서에서는 가장 대표적으로는, 발현 벡터의 일부인 전사 카셋트의 우성 선별 마커와 함께 사용되는 완전히 손상된 공통 코작 서열을 개시한다. 이들 벡터들은 가장 대표적으로는 포유동물 발현 시스템 중에서 단백질의 발현에 이용된다. 본 명세서에서 정의되고 개시되고 청구된 "완전히 손상된 공통 코작"은 상기 서열(I)을 포함한다. 서열 (I)에서, "x"는 아데닌(A), 구아닌(G), 사이토신(C) 또는 티민(T)/우라실(U)로 이루어진 군 중에서 선택된 뉴클레오티드이고, "Py"는 피리미딘 뉴클레오티드, 즉 C 또는 T/U이고, "ATG"는 아미노산 메티오닌을 코딩하는 코돈, 소위 "개시" 코돈이고, -3 및 +1은 ATG를 기준으로 한 방향 기준 점 즉, -3은 ATG로부터 3개의 뉴클레오티드 상류를 나타내는 것이고, +1은 ATG로부터 1개의 뉴클레오티드 하류를 나타내는 것이다. 우성 선별 마커는 추가로 개시된 인공 인트론 영역을 추가로 포함한다.

Description

포유동물 발현용 완전히 손상된 공통 코작 서열
37 C.F.R. § 1.74(d)/(e) 저작권 공고 (Copyright Notice)
본 특허 문헌의 내용 중 일부는 저작권 보호를 받는 소재를 포함한다. 특허 및 상표국 특허 파일 또는 기록에 나타나 있는 바와 같이 저작권자는 특허 문헌 또는 특허 내용 중의 누군가에 의한 전재를 반대하지 않으나, 어쨌든 저작권의 모든 권리를 소유한다.
관련 출원
본 특허 문헌은 1992년 11월 13일에 출원되어 계류 중인 미합중국 특허 출원 제07/977,691호의 일부 계속 출원이다. 본 특허 문헌은 1992년 11월 13일에 출원되어(계류중) 미합중국 특허 출원 번호 제07/978,891호를 갖는 "THERAPEUTIC APPLICATION OF CHIMERIC ANTIBODY TO HUMAN B LYMPHOCYTE RESTRICTED DIFFERENTIATION ANTIGEN FOR TREATMENT OF B CELL LYMPHOMA" 및 본건과 동시에 출원되어 미합중국 특허 출원 번호 제호를 갖는 "THERAPEUTIC APPLICATION OF CHIMERIC AND RADIOLABLED ANTIBODIES TO HUMAN B LYMPHOCYTE RESTRICTED DIFFERENTIATION ANTIGEN FOR TREATMENT OF B CELL LYMPHOMA"와 관련된다. 본 특허 문헌은 1992년 7월 10일에 출원되고 제목이 "RECOMBINANT ANTIBODIES FOR HUMAN THERAPY"인 양도된 미합중국 특허 출원 번호 제07/912,292호와 관련된다. 이들 문헌들은 본 명세서에서 참고 문헌으로 인용된다.
주지하는 바와 같이, 생물공학 산업의 출현으로 대량의 단백질의 생산이 가능하게 되었다. 단백질은 모든 생물 세포의 필수 구성 성분이고, 20개의 천연 발생 아미노산들의 조합물을 포함한다. 각각의 아미노산 분자는 3개의 데옥시리보핵산("DNA") 분자들의 배열("코돈")에 의해 정의되며("코딩되고"), 일련의 DNA 분자들("DNA 거대분자")은 본질적으로 청사진에 의해 특성화되는 아미노산들의 특정 서열들의 생산을 위한 상기 청사진을 제공한다. 이 과정에 깊이 관여하는 것은 리보핵산("RNA")으로, 3가지 유형의 RNA(메신저 RNA(mRNA), 전달 RNA(tRNA) 및 리보솜 RNA) 는 DNA에 의해 코딩된 정보를 예를 들면 단백질로 전환시킨다. 따라서, 유전 정보는 일반적으로 DNA→RNA→단백질로 전달된다.
재조합 RNA 기술을 포함하는 대표적인 전략에 따르면, 목적하는 단백질 물질("cDNA")을 코딩하는 DNA 서열은 동정되어, 천연의 원(源)으로부터 단리되거나 또는 합성에 의해 제조된다. 유전 물질의 이러한 조각을 조작함으로써, 이들의 말단은 2중 가닥 DNA의 작은 환상 분자 절편 내로 라이게이션되거나 또는 "꼭 끼워넣어지도록" 만들어진다. 이러한 환상 분자를 전형적으로 "DNA 발현 벡터" 또는 간단히 "벡터"라고 말한다. 벡터와 유전 물질의 조합물은 "플라스미드"로 말해질 수 있고, 이 플라스미드는 원핵생물 숙주 (즉, 자연계 중의 박테리아) 중에서 원핵생물 숙주 복제물을 자율적 환상 DNA로 하여 복제될 수 있다. 그 후, 환상 DNA 플라스미드는 단리되어 진핵생물 숙주 (즉, 자연계 중의 포유동물)내로 도입되고, 플라스미드 DNA가 혼입된 숙주 세포가 선별된다. 일부 플라스미드 벡터가 포유동물 세포들 중에서 자율적 환상 DNA 분자로서 복제될 수 있는 반면(예를 들면, 엡스타인바르(Epstein Barr) 바이러스("EBV") 및 보바인 파필로마(Bovine Papilloma) 바이러스("BPV") 기재 벡터), DNA 벡터를 포함하는 대부분의 바이러스 및 RNA 레트로바이러스 벡터를 포함하는 모든 플라스미드는 세포 DNA 내로 삽입되어 진핵생물 숙주 세포의 세포 DNA가 복제될 때 플라스미드 DNA도 또한 복제된다. 따라서, 진핵 세포가 성장하고 분화됨에 따라, 목적하는 단백질 물질의 생산("발현")을 이끌어내는 삽입된 플라스미드를 함유하는 세포들도 증가하였다. 플라스미드를 함유하는 숙주 세포들에게 바람직한 성장 조건을 가함으로써, 상당한 양의 숙주, 즉 목적하는 단백질이 생산되었다. 대표적으로, 중국산 명주쥐 난소("CHO") 세포주가 진핵생물 숙주 세포로서 이용되고, 대장균(E. coli)가 원핵생물 숙주 세포로서 이용된다.
벡터는 상기에서 결정적인 역할을 한다. 즉, 벡터의 조작은 cDNA가 어디에 삽입되는지에 대한 가변성, cDNA가 실제로 벡터내에 적절하게 삽입되었는 지를 결정하는 방법, 유전 물질의 발현이 발생하거나 또는 발생하지 않는 조건 등을 가능하게 하였다. 그러나, 대부분의 벡터 조작은 하나의 목표, 즉 원하는 유전자 생성물, 예를 들면 목적하는 단백질의 발현의 증가를 위한 것이다. 다시 말하지만, 대부분의 벡터 조작은 "개선된" 벡터가 "개선되지 않은" 벡터와 비교하여 상당히 많은 양으로 유전자 생성물의 생산을 가능하게 하도록 행해진다. 따라서, 한 벡터의 특정 특징/양상/특성들이 다른 벡터의 특징/양상/특성들과 유사한 것 같더라도, 종종 조작의 전반적 목표의 결과인 목적하는 유전자 생성물의 생산의 향상을 관찰할 필요가 있다.
한 "개선된" 벡터가 일군의 환경에 바람직한 특성들을 포함하더라도, 이들특성들이 다른 환경 하에서도 반드시 바람직하지는 않다. 그러나, 모든 벡터에 바람직한 한가지 특성이 있는데, 그것은 증가된 효율, 즉 목적하는 단백질의 생산량을 증가시키는 동시에 이 단백질의 충분량을 생성하지 못하는, 스크리닝해야 하는 숙주세포들의 수를 감소시키는 능력이다. 이러한 증가된 효율은 제조 원가의 절감 및 기술자가 목적하는 단백질을 발현하는 살아있는 콜로니를 스크리닝하는데 소요하는 시간의 감소를 비롯하여 몇가지 바람직한 잇점들을 가질 수 있다. 따라서, 바람직하며, 당 업계의 기술 상태를 상당히 진전시키는 것은 바로 상기와 같은 효율성을 갖는 발현 벡터이다.
발명의 요약
본 발명은 이들 및 다른 요구사항을 충족시킨다. 본 명세서에서 개시되는 것은, 가장 대표적으로는 발현 벡터의 일부인 전사 카셋트의 우성 선별 마커, 바람직하게는 천연의 인트론 삽입 영역 또는 인공의 인트론 삽입 영역 및 상기 삽입 영역내에 위치하는 DNA에 의해 코딩되는 목적하는 유전자 생성물 1종 이상을 포함하는 우성 선별 마커와 함께 사용되는, 완전히 손상된 공통 코작(코작) 서열이다.
본 명세서에 사용된 "우성 선별 마커"는 유전자 서열 또는 이 유전자 서열에 의해 코딩되는 단백질이고, 우성 선별 마커에 의해 코딩되는 단백질의 발현은 우성 선택 마커를 포함하는 발현 벡터로 트랜스펙션된 숙주 세포가 이 단백질을 함유하지 않는 숙주 세포를 죽일 수 있는 선별 방법에서 살아남을 수 있게 한다. 본 명세서에 사용된 "전사 카셋트"는 단백질 생성물을 코딩하는 DNA(예를 들면, 우성 선별 마커) 및 숙주 세포에서 단백질 생성물의 생산에 필요한 유전 요소(즉, 프로모터,전사 시작 부위, 폴리아데닐화 영역 등)이다. 이들 벡터들은 가장 바람직하게는 숙주 세포 DNA 내로의 벡터의 통합이 일어나는 포유동물 발현 시스템 중의 단백질의 발현에 이용된다. 유리하게는, 상기 완전히 손상된 공통 코작 서열의 사용은 생존 콜로니의 수를 상당히 감소시키는 동시에 이러한 생존 콜로니에 의해 발혀되는 단백질의 양을 상당히 증가시킴으로써 단백질 발현 효율을 향상시킨다. 본 명세서에서 사용된 "천연 인트론 삽입 영역"은 목적하는 유전자 생성물을 코딩하는 DNA의 삽입에 이용될 수 있는 유전자, 이 경우에는 대표적으로 우성 선별 마커 내에 천연적으로 존재하는 DNA 영역이고, "인공 인트론 삽입 영역"은 목적하는 유전자 생성물을 코딩하는 DNA의 삽입에 이용될 수 있는 유전자(역시, 가장 대표적으로 우성 선별 마커) 내에서 선택적으로 생성되는 DNA 영역이다. 인스트론 위치에 관한 정보는 문헌 [Abrams, J. M. 등, "Intronic Positioning Maximizes Co-expression and Co-amplification of Nonselectable Heterologous Genes", J. Bio. Chem., 264124:14016 (1989년)] 및 미합중국 특허 제5,043,270호에 기재되어 있고, 이 2개의 문헌은 모두 본 명세서에서 참고 문헌으로 인용된다.
본 명세서에서 정의되고, 개시되며 청구된 "완전히 손상된 공통 코작"은 하기 서열을 포함한다.
여기서,
"x"는 아데닌(A), 구아닌(G), 사이토신(C) 또는 티민(T)/우라실(U)로 이루어진 군 중에서 선택된 뉴클레오티드이고,
"Py"는 피리미딘 뉴클레오티드, 즉 C 또는 T/U이고,
"ATG"는 아미노산 메티오닌을 코딩하는 코돈, 소위 "개시" 코돈이고,
-3 및 +1은 ATG를 기준으로 한 방향 기준 점 즉, -3은 ATG로부터 3개의 뉴클레오티드 상류를 나타내는 것이고, +1은 ATG로부터 1개의 뉴클레오티드 하류를 나타내는 것이다.
바람직하게는, 완전히 손상된 공통 코작은 발현 벡터의 일부인 전사 카셋트의 우성 선별 마커부의 번역을 개시하는 메티오닌 개시 코돈부이다. 바람직한 우성 선별 마커에는, 헤르페스 단순 바이러스 티미딘 키나제, 아데노신 데아미나제, 아스파라긴 합성효소, 살모넬라(Salmonella) 히스 D 유전자, 크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제, 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라제가 있으나 이들로 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는, 우성 선별 마커는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제이다.
본 발명의 특히 바람직한 실시태양에서는, 적어도 1개의 프레임외 개시 코돈(즉, ATG)이 완전히 손상된 공통 코작 개시 코돈의 상류에 위치하며, 상류 개시 코돈과 완전히 손상된 공통 코작 개시 코돈 사이에는 프레임내 중지 코돈이 위치하지 않는다. 본 명세서에서 사용된 용어 "중지 코돈"은 코딩된 물질의 번역이 종료되도록 아미노산을 코딩하지 않는 코돈을 나타내는 것으로, 여기에는 구체적으로는 전통적 중지 코돈 TAA, TAG 및 TGA가 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "프레임내(in-frame)" 및 "프레임외(out fo-frame)"는 완전히 손상된 공통 코작 개시 코돈을 기준으로 한다. 예를 들면, 하기 서열
에서 밑줄친 부분은 대표적인 완전히 손상된 공통 코작(여기서, "x"는 뉴클레오티드를 나타냄)이고, 코돈 GAC, CAT 및 GCC는 ATG 개시 코돈에 대해 "프레임내" 코돈들이다. 윗줄친 뉴클레오티드는 완전히 손상된 공통 코작 개시 코돈의 상류인 "프레임외" 개시 코돈을 나타낸다. 바람직하게는, 프레임외 개시 코돈은 완전히 손상된 공통 코작 개시 코돈의 약 1000개의 뉴클레오티드 상류 이내, 보다 바람직하게는 완전히 손상된 공통 코작 개시 코돈의 약 350개의 뉴클레오티드 상류 이내, 가장 바람직하게는 완전히 손상된 공통 코작 개시 코돈의 약 50개의 뉴클레오티드 상류 이내에 있다. 바람직하게는, 프레임외 개시 코돈은 공통 코작의 일부이다. 예로서, 상기한 서열은 이 기준을 만족한다. 즉, -5 뉴클레오티드는 푸린(G)이고, 뉴클레오티드 -6, -7 및 -8은 프레임외 개시 코돈(ATG)을 코딩하고, 뉴클레오티드 -11은 푸린(A)이다.
추가로, 2차 구조(소위 "스템-루우프(stem-loop)" 또는 "헤어핀(hairpin)") 내의 완전히 손상된 공통 코작 사용은 유리하게 우성 선별 마커에 의해 코딩되는 단백질의 번역의 손상을 실행할 수 있다. 상기 실시태양에서, 완전히 손상된 공통 코작의 개시 코돈은 가장 바람직하게는 스템 루프 내에 위치한다.
본 명세서에 개시된 본 발명의 이러한 면들을 포함하는 특히 바람직한 발현 벡터는 "TCAE" 및 "ANEX" 및 "NEOSPLA" 벡터로 언급되며, 특히 바람직한 벡터들은ANEX 1, ANEX 2 및 NEOSPLA 3F로 언급된다.
본 명세서에 개시된 본 발명의 이들 및 다른 면들은 하기 부분에서 더욱 상세하게 설명된 것이다.
제1도는 공통 코작 및 몇개의 특히 바람직한 완전히 손상된 공통 코작 서열의 관련부를 나타내고,
제2도는 생쥐/인체 키메릭 면역글로불린을 발현하도록 디자인된 벡터 TCAE 5.2 및 ANEX 1 (TCAE 12)을 나타내는 도면으로, 여기서 면역글로불린 유전자들은 우성 선별 마커로서 네오마이신 포스포트랜스퍼라제를 사용하여 세로로 나란히 배치되고,
제3도는 벡터 TCAE 5.2 및 ANEX 1을 이용한 단백질 발현 정도를 비교하는 히스토그램이고,
제4도는 생쥐/인체 키메릭 면역글로불린을 발현하도록 디자인된 벡터 ANEX 2를 나타내는 도면으로, 여기서 면역글로불린 유전자들을 우성 선별 마커로서 네오마이신 포스포트랜스퍼라제를 사용하여 세로로 나란히 배치되고,
제5도는 벡터 TCAE 5.2, ANEX 1 및 ANEX 2를 이용한 단백질 발현 정도를 비교하는 히스토그램이고,
제6도는 생쥐/인체 키메릭 면역글로불린을 발현하도록 디자인된 NEOSPLA 벡터를 나타내는 도면이고,
제7A, 7B 및 7C도는 벡터 TCAE 5.2 대 NEOSPLA3F (7A), ANEX 2 대 NEOSPLA3F(7B) 및 GK-NEOSPLA3F 대 NEOSPLA3F (7C)를 이용한 단백질 발현 정도를 비교하는 히스토그램이다.
바람직한 실시태양의 상세한 설명
본 명세서에서는, 가장 바람직하게는 포유동물 발현 벡터내에 혼입된 우성 선별 마커의 번역 및 개시를 손상시키고, 바람직하게는 목적하는 유전자 생성물을 코딩하는 서열과 상호연결되지만 반드시 그럴 필요는 없는 핵산 서열 배열을 개시한다. 바람직하게는, 우성 선별 마커는 1개 이상의 천연 또는 인공 인트론 삽입 영역 및 상기 1개 이상의 인트론 내에 위치하는 DNA에 의해 코딩되는 1개 이상의 목적하는 유전자 생성물을 포함한다. 상기 배열은 세포 당 트랜스펙션된 동량의 플라스미드 DNA로부터 얻은 생존 콜로니의 수를 감소시키면서 각 클론 내에 발현된 유전자 생성물의 양을 증가시킴으로써 목적하는 유전자 생성물의 발현 효율을 증가시키는 효과를 갖는다.
시간의 단축과 표상적인 효율을 위해서, 본 특허 내용중 이 부분의 촛점은 주로 생쥐/인체 키메릭 면역글로불린 발현 벡터 내로 혼입된 특정 우성 선별 마커, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제에 관한 것이다. 하지만, 본 명세서에서 개시한 본 발명이 이들 특정 시스템으로 한정하기 위한 것이 아니므로 이들로 한정되는 것으로 생각해서는 안된다. 반대로, 개시된 본 발명은 벡터 DNA가 숙주 세포 DNA 내로 삽입된 전체 포유동물 발현 시스템에 적용할 수 있다.
대량의 단백질을 생산시키는 포유동물 세포주 (즉, "생산 세포주")를 생성시키기 위해 당업계의 숙련인에 의해 이용되는 가장 바람직한 방법들 중의 하나는 가장 바람직하게는 외인성 DNA가 삽입된 세포의 선별을 가능하게 하는 "우성 선별 마커"로 언급되는 내약물성 유전자를 사용하여 원하는 유전자 생성물을 코딩하는 DNA(즉 "외인성 DNA")의 무작위 삽입을 포함한다. 다시 말하면, 예를 들면 내약물성 유전자를 비롯한 외인성 DNA를 적절하게 포함하는 세포들은 대응 약물에 대한 내성을 유지한다. 가장 바람직하게는 이어서 역시 내약물성, 예를 들면 데히드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자의 경우 메토트렉세이트(MTX)에 대한 내성을 코딩하는 인접 유전자("증폭 유전자")를 증폭시킴으로써 트랜스펙션된 세포 내에 원하는 유전자 생성물을 코딩하는 DNA를 상호 증폭시킨다. 증폭 유전자는 우성 선별 마커 유전자와 동일하거나 또는 별개의 유전자일 수 있다(당업계의 숙련인이 알고있는 바와 같이, "트랜스펙션"은 전형적으로 포유동물 숙주 세포 내로의 플라스미드 도입 방법 또는 상태를 설명하기 위해 이용되는 반면, "형질전환"은 전형적으로 박테리아 숙주 세포 내로의 플라스미드 도입 방법 또는 상태를 설명하기 위해 이용된다).
당업계에서는 2가지의 증폭 방법이 대표적으로 사용된다. 첫째 방법은 트랜스펙션되고 내약물성인 세포(각 세포는 내약물성을 코딩하는 유전자의 1개 이상의 삽입을 포함함)들의 전체 집단을 증폭시키는 것이고, 두번째 방법은 단일의 세포로부터 유래된 각각의 클론들을 증폭시키는 것이다. 각각의 방법은 특유의 잇점들을 갖는다.
제1 방법에 관해서는, 개개의 클론들에 비해 전체 집단을 증폭시키는 것이 다소 "더 용이하다"(전형적으로는 적절한 설명인 "숏건(shotgun)"법으로언급된다). 왜냐하면, 개개의 클론들의 증폭은 초기에 목적하는 유전자 생성물을 "대량" 즉 최저의 검출가능한 발현량보다 (대표적으로) 3배 많은 양으로 분비하는 1개 또는 2개의 "그레일(grail)" 콜로니를 단리시키기 위해 수백개의 단리된 포유동물 콜로니(각각 단일의 세포로부터 유래되며, 대부분은 발현 플라스미드의 단일 복제 삽입물임)들을 스크리닝하는 것을 포함하기 때문이다. 이들 세포들은 또한 종종 발현 플라스미드의 단지 1개의 복제 삽입을 갖는 것으로 밝혀졌다. 추가로, 개개의 클론들의 증폭은 트랜스펙션된 모든 세포들의 증폭에 비해 더 적은 증폭된 유전자 카피를 함유하는 세포주를 생성시킨다(대표적으로는, 10-20 대 500-1000).
제2 방법에 관해서는, 개개의 클론들을 증폭시키는 것으로부터 유도된 생산 세포주는 대표적으로 내약물성 및 외인성 유전자 생성물에 대한 유전자를 포함하는 콜로니들을 선별하는데 사용되는 약물의 양을 감소시킨다(즉, 메토트렉세이트와 DHFR의 경우에는 5nM 대 1 μM). 또한 개개의 클론들은 대표적으로 보다 짧은 기간내에 단리될 수 있다(3-6 개월 대 6-9 개월).
따라서, 이상적으로는 2가지 방법들의 확실한 잇점들을 합해야 한다. 이것은 스크리닝해야 하는 콜로니의 수를 감소시키고 이들 콜로니에 의해 분비되는 생성물의 양을 증가시키는 것을 포함한다. 본 발명은 이러한 과제를 달성하였다.
당업계의 숙련인이 인식하고 있는 바와 같이, 플라스미드 DNA의 우성 선별 마커의 DNA가 숙주 세포의 세포 DNA 내에 삽입되는 위치는 우성 선별 마커 단백질의 발현량을 결정한다. 우성 선별 마커 DNA와 상호 연결되거나 또는 그의 근처에 위치하는 목적하는 단백질을 코딩하는 유전자의 발현은 우성 선별 마커 단백질의발현에 비례한다. 특정의 이론으로 하고자 함은 아니지만, 본 발명자들은, 포유 동물 세포 내의 외인성 DNA의 삽입을 선별하는데 사용되는 유전자(즉, 우성 선별 마커)를 이 우성 선별 마커의 번역이 손상되도록 디자인하는 경우, 우성 선별 마커의 유전자 생성물의 과잉 생산에 의해 상기 손상을 극복할 수 있는 플라스미드들만이 예를 들면 약물 스크리닝 방법에서 살아남을 수 있다고 가정하였다. 외인성 DNA를 우성 선별 마커와 결합시킴으로써, 우성 선별 마커의 유전자 생성물의 과잉 생산은 또한 관련 외인성 DNA로부터 유래된 유전자 생성물의 과잉 생산을 야기시킨다. 이러한 가정된 방법에 따르면, 우성 선별 마커 유전자의 번역의 손상이 필요하며 이러한 손상을 위한 수단은 유전자의 공통 코작(코작)부였다.
수백개의 척추동물 mRNAs를 비교하여, 마릴린 코작(Marilyn 코작)은 문헌 ["Possible role of flanking nucleotides in recognition of the AUG initiator codon by eukaryotic ribosomes," Nuc. Acids, Res. 9:5233-5252(1981년)] 및 문헌 ["Compilation and analysis of sequences upstream from the Translational start site in eukaryotic mRNAs," Nuc. Acids Res. 12:857-872(1984년)]에서 보다 고등 진핵생물에서 번역을 개시하는 하기의 "공통" 서열을 제시하였다:
(당 업계의 통상의 숙련인들이 알고 있는 바와 같이, 우라실 U는 RNA에서 데옥사 뉴클레오티드 티민 T를 대신한다). "공통 코작"으로 언급되는 이 서열에서, 가장 빈번히 나타나는 뉴클레오티드는 위에서 대문자로 나타낸 푸린 A 및 G이고,돌연변이 분석을 통해 이들 2개의 위치가 개시에 가장 강한 영향을 미친다는 것을 확인하였다(예를 들면, 코작, M. "Effects of intercistronic length on the efficiency of reinitiation of eukaryotic ribosomes," Mol. Cell Bio, 7/10: 3438-3445(1987년) 참조). 코작은 또한 공통 코작의 상류 서열 중의 교체가 번역을 행할 수 있다고 확정하였다. 예를 들면, 코작은 문헌["Influences of mRNA secondary structure on initiation by eukaryotic ribosomes," PNAS 83: 2850-2854(1986년)]에서, 프레프로인 슐린을 코딩하는 몇몇 플라스미드들 중에서 공통 코작으로부터 상류의 2차 헤어핀 구조 영역의 "인공적" 도입을 기재하였는데, 이것은 안정한 스템 루우프 구조가 프레프로인슐린 유전자의 번역을 억제하여 프로인슐린의 수율을 85-95%까지 감소시킨다는 것을 실험적으로 측정하였다.
놀랍게도, 본 발명자는 푸린 A(ATG 개시 코돈에 대해 -3) 및 C(+1)를 피리미딘으로 변화시킴으로써 상당한 번역 손상이 가능하다는 것을 발견하였다. 즉, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자에 대한 공통 코작에 대해 이러한 교체(하기에서 상세히 기술됨)를 행했을 때, G418 내성 콜로니의 수를 상당히 감소시켰으나, 각각의 G418 내성 클론에 의해 발현된 유전자 생성물의 양을 상당히 증가시켰다. 당업계의 숙련인이 인식하고 있는 바와 같이, 이것은 스크리닝해야 하는 콜로니가 보다 작고, 생존하는 대부분의 콜로니들이 통상적으로 얻어지는 것보다 상당히 많은 생성물을 생산하여 발현 시스템의 효율을 증가시키는 효과를 갖는다. 따라서 발명자가 가정한 이론의 확인이 실험적으로 측정되었다.
나타낸 바와 같이, 본 발명에서 "공통 코작"은 하기 서열을 포함하고,
"부분적으로 손상된 공통 코작"은 하기 서열을 포함하며,
개시하고 청구한 "완전히 손상된 공통 코작은 하기 서열을 포함한다.
상기에서, "x"은 아데닌(A), 구아닌(G), 사이토신(C) 또는 티민(T)(RNA의 경우에는 우라실(U))로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드이고, "P"는 푸린, 즉 A 또는 G이고, "Py"는 피리미딘, 즉 C또는 T/U이고, ATG는 아미노산 메티오닌(Met)을 코딩하는 통상의 개시 코돈이고, 수치는 ATG 코돈에 대한 상대값, 즉 음의 수는 ATG의 "상류"을 나타내고 양의 수는 ATG의 "하류"을 나타내며, 부분적으로 손상된 공통 코작의 경우에는 -3 또는 +1 뉴클레오티드 중 1개만이 피리미딘이어야 한다. 예를 들면 -3이 피리미딘이 경우 +1은 푸린이어야 하며, -3이 푸린인 경우 +1은 피리미딘이어야 한다. 가장 바람직하게는, 완전히 손상된 공통 코작은 바람직하게는 (필수적이진 않음) 목적하는 유전자 생성물을 코딩하는 외인성 DNA와 상호연결된 우성 선별 마커의 번역 개시 부위와 결합된다. 본 명세서에서 사용된 "뉴클레오티드"는 천연 및 합성 데옥시- 및 리보뉴클레오티드 뿐만 아니라 (포스페이트 주쇄의 개질, 예를 들면 메틸 포스페이트, 포스포로티오에이트 및 포스포라미다이트 외에 3'OH, 5'OH, 당 및(또는) 헤테로시클릭 염기가 개질된) 개질된 데옥시- 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 것을 의미한다.
우성 선별 마커의 유전자 서열에 관한 정보는 바람직하게는 알려져 있으나,
전체 서열 대신에 우성 선별 마커의 번역 개시 부위에서의 핵산 서열(또는 아미노산 서열)에 관한 정보는 반드시 알려져 있어야 한다. 다시 말하면, 공통 또는 부분적으로 손상된 코작 중에서 변화를 행하기 위해서는 그의 서열을 반드시 알아야 한다. 공통 또는 부분적으로 손상된 공통 코작을 완전히 손상된 공통 코작 서열로 변화시키는 것은, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 위치 지정 돌연변이유발 및 프라이머-기재 증폭(예를 들면 PCR)에 의한 돌연변이를 비롯한 당 업계의 숙련인에게 공지된 각종 방법들에 의해 달성될 수 있으나, 가장 바람직하게는, 상기 변화는 프라이머 기재 증폭에 의한 돌연변이를 통해 달성된다. 이러한 선호성은 주로 과제를 수행하는데 있어서의 비교적 "용이함"과 함께 이와 관련된 효능에 기초한다. 용이한 제공을 위해, 상기 완전히 손상된 공통 코작으로의 변화를 수행하기 위한 가장 바람직한 수단을 설명한다.
본질적으로, 프라이머-기재 증폭에 의한 돌연변이는 증폭 방법 그 자체의 힘에 의존하는데, PCR이 통상적으로 사용되기 때문에 여기에 촛점을 둔다. 그러나, 다른 프라이머-기재 증폭 기술(예를 들면 리가제 사슬 반응 등)도 사용할 수 있다. 2개의 PCR 프라이머들("돌연변이 프라이머") 중의 하나는 생성되는 증폭된 DNA 생성물이 목적하는 우성 선별 마커를 포함하는 전사 카셋트 내에 완전히 손상된 공통 코작을 포함하도록 만드는 서열을 포함하고, 나머지 PCR 프라이머는 우성 선별 마커의 다른 영역, 우성 선별 마커를 포함하는 전사 카셋트 또는 전사 카셋트를 포함하는 벡터에 상보적인 것이다. 예로서, 공통 코작을 포함하는 우성 선별 마커에 대해 상보적인 것은 하기 서열(서열 확인 번호: 1)을 가질 수 있다.
완전히 손상된 공통 코작을 생성시키기 위해, 돌연변이 프라이머는 하기 서열(서열 확인 번호:2)을 가질 수 있다(편의상, 비교하기 위해 서열 확인 번호:1을 돌연변이 프라이머 위에 위치시켰다).
명백한 바와 같이, 프라이머에서는 상보성이 부족하다("*"표 참조), PCR 반응에 과량의 돌연변이 프라이머를 사용함으로써, 공통 코작을 포함하는 서열이 증폭될 때, 생성되는 증폭된 DNA 생성물은 돌연변이를 포함하여 증폭된 DNA 생성물이 증폭됨에 따라 완전히 손상된 공통 코작이 증폭 생성물 내에 포함되도록 돌연변이가 우세해진다.
돌연변이 프라이머에는 2가지 기준이 요구되는데, 첫째로, 그의 길이는 목적물과의 하이브리드 형성이 일어나도록 충분해야 한다. 잘 알려진 바와 같이, 돌연변이 프라이머는 목적물에 100 % 상보적이지 않다. 따라서, 필요한 하이브리드 형성을 보장하기 위해 충분한 수의 상보성 염기가 필요하다. 바람직하게는, 돌연변이 프라이머의 길이는 약 15 내지 약 60개의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 18내지 약 40개의 뉴클레오티드이지만 보다 길거나 짧은 길이도 가능하다(돌연변이 프라이머가 또한 프레임외 개시 코돈 또는 2차 구조를 포함하는데 사용되는 경우, 돌연변이 프라이머의 길이는 대응적으로 증가된다) 둘째로, 목적물에 대한 돌연변이 프라이머의 비는 약 250:1 내지 약5000:1 보다 바람직하게는 약 400:1 내지 약 2500:1 및 가장 바람직하게는 약 500:1 내지 약 1000:1이다.
PCR 반응의 파라미터들은 당업계의 숙련인의 기술 범위내이기 때문에 반응의 세부 사항에 관한 구체적 설명은 하지 않는다. 숙련된 기술자는 이러한 유형의 돌연변이가 PCR 기술을 사용하여 행해질 수 있는 방법을 쉽게 알 수 있으며, 상기한 내용은 상세한 개발에 대항하는 설명을 제공하는 수단으로 제공되었다.
나타낸 바와 같이, 완전히 손상된 공통코작은 발현 벡터의 일부를 이루는 전사 카셋트 내로 혼입된 우성 선별 마커의 번역 개시 부위와 결합되는 것이 가장 바람직하다. 바람직한 우성 선별 마커에는 헤르페스 단순 바이러스 티미딘 키나제, 아데노신 데아미나제, 아스파라긴 합성효소, 살모넬라 히스 D 유전자, 크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 ("XGPRT"), 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라제("NEO")가 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는, 우성 선별 마커는 NEO이다.
우성 선별 마커 헤르페스 단순 바이러스 티미딘 키나제는 하기의 부분적으로 손상된 공통 코작을 갖는 것으로 보고되었다:
(Heller, S., "Insertional Activities of a Promotorless Thymidine kinase Gene." Mol. & Cell, Bio. 8/8: 3218-3302 제4도, 뉴클레오티드 764 참조), +1 푸린(G)를 피리미딘(C 또는 T/U)으로 변화시킴으로써, 상기 정의한 완전히 손상된 코작이 생성된다(헤르페스 단순 바이러스 티미딘 키나제의 -3은 피리미딘임), +1 푸린을 피리미딘으로 변화시키는 것은 또한 코딩되는 아미노산을 알라닌(GCT)으로부터 프롤린(CCT) 또는 세린(TCT)으로 변화시키는 효과를 갖는데, 뉴클레오티드들에 대한 변화로인해 보존성(conservative) 아미노산 변화가 야기되는 것이 바람직하다. 따라서, 알라닌으로부터 세린으로의 변화가 알라닌으로부터 프롤린으로의 변화보다는 보존성 아미노산 변화이기 때문에 TCT로의 변화를 행하는 것이 바람직하다.
히스티디놀 데히드로게나제는 다른 우성 선별 마커이다(Hartmen, S.C. 및 Mμlligan, R.C., "Two dominant acting selectable markers for gene transfer studies in mammalian cells," PNAS 85:8047-8051 (1988년) 참조), 살모넬라 티피뮤늄의 히스 D 유전자는 다음의 부분적으로 손상된 공통 코작을 갖는다:
-3이 푸린이므로, 피리미딘(C 또는 T/U)으로의 -3의 변화는 완전히 손상된 공통 코작을 야기시키는데, 알려진 바와 같이, 이들 뉴클레오티드들은 개시 코돈의 상류이기 때문에 이러한 변화가 아미노산 번역에 미치는 영향은 없다.
하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제는 다른 우성 선별 마커인데, hph 유전자에 대해 보고된 서열(Gritz, L. 및 Davies, J., "Plasmid encoded hygromycin Bresistance: the sequence of hygromycin B phosphotransferase gene and its expressing in Escherichia coli and Succharomyces cerevisiae" Gene 25:179-188, 1983년 참조)은 공통 코작이임을 보여준다.
-3 및 +1이 푸린이므로 -3 및 +1의 피리미딘으로의 변화는 완전히 손상된 공통 코작을 생성시킨다(이것은 다음과 같이 코딩된 아미노산을 생성시킨다: +1에서 C로 - 글루타민; +1에서 T로 - 중지 코돈. 이 코돈은 개시 코돈의 하류이기 때문에 중지 코돈 TAA로의 변화는 이루어지지 않아야 한다).
XGPRT는 다른 우성 선별 마커이다. 보고된 XGPRT의 부분적으로 손상된 공통 코작은 하기 서열을 갖는다.
(Mμlligan, R.C. 및 Berg, P., "Factors governing the expression of a bacterial gene in mammalian cells." Mol. & Cell Bio. 1/5:449-459 (1981년), 제6도 참조). +1 푸린을 피리미딘으로 변화시킴으로써, 완전히 손상된 공통 코작이 생성되며, 코딩된 아미노산 (AGC-세린)에 대한 효과는 다음과 같다: CGC-아르기닌; TGC-시스테인.
아데노신 데아미나제 (ADA)도 또한 우성 선별 마커로서 사용될 수 있다. 아데노신 데아미나제에 대해 보고된 공통 코작 서열은 다음과 같다:
(Yeung, C.Y. 등., "Identification of functional murine adenosine deaminase cDNA clones by complementation in Echerichia coli," J. Bio. Chem. 260/18:10299-10307(1985년), 제3도 참조). -3 및 +1 푸린을 피리미딘으로 변화시킴으로써, 완전히 손상된 공통 코작 서열을 생성시킨다. GCC(알라닌)에 대응하는 아미노산은 프롤린(CCC) 또는 세린(TCC)로 변화되나, 이러한 변화의 보존성 때문에 세린으로의 변화가 바람직하다.
아스파라긴 합성효소에 대한 보고된 부분적으로 손상된 공통 코작은 다음과
같다.
문헌[Andrμlis, I.L. et al., "Isolation of human cDNAs for asparagine synthetase and expression in Jensen rat sarcoma cells," Mol. Cell. Bio. 7/7: 2435-2443 (1987)]에 기재되어 있다. +3 푸린을 피리미딘으로 변화시키면 완전히 손상된 공통 코작이 형성된다,
네오마이신 포스포트랜스퍼라제에 대한 부분적으로 손상된 공통 코작 (상류의 프레임외 개시 코돈을 포함함)은 다음과 같다.
+1 푸린을 피리미딘으로 변화시키면 완전히 손상된 공통 코작을 형성하는 효과를 갖게 된다 (코딩된 아미노산 이소로이신, ATT에 대한 변화는 다음과 같다: CTT-로이신 및 TTT-페닐알라닌, 로이신으로의 변화는 보존 특성으로 인해 바람직하다).
상기한 바는 의도적인 것이 아니고, 제한하려는 것도 아니며, 오히려 본 발명의 명세서에서 몇몇 공지된 우성 선별 마커의 보고된 공통 코작 서열 또는 부분적으로 손상된 공통 코작 서열에서의 변화와 동등한 예를 제공하기 위한 것이다.
알 수 있는 바와 같이, 가장 바람직한 우성 선별 마커는 NEO이다. NEO에 대한 특히 바람직한 완전히 손상된 공통 서열은 다음과 같다:
여기서, x는 뉴클레오티드이고, 서열 확인 번호. 3이 가장 바람직하며, xx는 바람직하게는 CC이다.
완전히 손상된 공통 코작 서열을 포함할 지도 모르고 포함하지 않을 지도 모르는 다른 전사 카셋트는 본 발명에 기재되고 청구된 완전히 손상된 공통 코작을 함유하는 전사 카셋트를 포함하는 벡터로 삽입될 수 있으며, 그러한 "다른 전사 카셋트"는 통상적으로 유전자 생성 억제의 "향상", "확대" 또는 "조절"을 가능케 하는데 이용된다. 예를 들면, 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자를 가진 외인성 DNA의 동시 트랜스펙션이 예시적인 것이다. 그러한 세포에 존재하는, DHFR의 경쟁적 억제제인 안티폴레이트 약물 메토트렉세이트(MTX)의 농도를 증가시킴으로써, DHFR 유전자의 증폭을 통해 DHFR 생성이 증가될 수 있다. 유리하게는, 광범위한 양의 플랭킹 외인성 DNA가 증폭될 것이므로 발현가능한 DHFR 유전자와 함께 선형으로 삽입된 외인성 DNA도 또한 과도 발현될 것이다. 또한, 발현의 조절을 가능케 하는 전사 카셋트도 이용 가능하다. 예를 들면, 라우스 육종 바이러스 (Rous sarcoma virus) LTR(T 항원에 의한 피드백 억제에 대해 민감하지 않음)의 영향하에 SV40ts 변이 거대 T 항원 유전자를 위치시킴으로써 유도되는 온도 민감성 COS 세포가 기재되어 있다[227 Science 23-28 (1985)]. 이러한 세포는 33 ℃에서 SV40 ori로부터의 복제를 지지하지만, 40 ℃에서는 그렇지 않으며 트랜스픽션된 SV40 ori-함유 벡터의 카피 수를 조절할 수 있도록 한다. 상기한 바는 의도적인 것이 아니고, 제한하려는 것도 아니며, 오히려 기재된 완전히 손상된 공통 코작을 포함하는 발현 벡터에 삽입될 수 있는 카셋트의 유형을 예시하기 위한 것이다. 당업계의 숙련인은 이용가능하고 이롭게 활용할 수 있는, 발현 시스템의 대상에 관한 다른 특정 유형의 전사 카셋트를 결정하는 능력을 갖고 있을 것이다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 특히 바람직한 실시태양에서, 적어도 하나의 프레임외 개시 코돈 (즉, ATG)은 프레임외 개시 코돈 및 완전히 손상된 공통 코작 개시 코돈 사이에 위치되는 중지 코돈 없이, 완전히 손상된 공통 코작 개시 코돈의 상류에 위치한다. 프레임외 개시 코돈의 목적은 사실상 우성 선별 마커의 번역을 더 손상시키는 것이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "중지 코돈"이란 용어는 "넌센스 코돈", 즉 중지 코돈의 영역에서 코딩된 물질의 번역이 종결되도록 20개의 천연 아미노산 중 하나를 코딩하지 않는 코돈을 의미한다. 이러한 정의에는 특히 전형적인 중지코돈 TAA, TAG 및 TGA가 포함된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "프레임외"이란 용어는 완전히 손상된 공통 코작 개시 코돈에 관한 것이다. 이 기술 분야에서 알 수 있는 바와 같이, 프레임내 모든 서열에 대한 임의의 DNA 거대 분자(또는 RNA 거대 분자)에는 프레임외 2개의 서열이 존재한다. 따라서, 예를 들면 완전히 손상된 공통 코작을 포함하는 다음의 서열에 대하여
프레임내 코돈은 트리플렛, 예를 들면 gcA, TGc, cAT 및 Ggc에 의해 분리되며, 프레임외 코돈으로는 예를 들면 cAT, ATG, Gcc, ccA, ATG 및 TGg를 들 수가 있다. 따라서, (대문자로 표시되고 밑줄 쳐진) 2개의 개시 코돈은 완전히 손상된 공통 코작의 개시 코돈에 관한 프레임외 것이다.
그러한 프레임외 개시 코돈이 이용될 때, 그것은 완전히 손상된 공통 코작 개시 코돈의 상류 약 1000개의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 완전히 손상된 공통 코작 개시 코돈의 상류 약 350개의 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 완전히 손상된 공통 코작 개시 코돈의 상류 약 50개의 뉴클레오티드 이내에 드는 것이 바람직하다.
인식할 수 있는 바와 같이, 상류 서열을 조작하여 (가장 바람직하게는) 상기 증폭 프로토콜의 유형에 사용된 돌연변이 프라이머를 이용하여 완전히 손상된 공통 코작 개시 코돈의 상류에 프레임외 서열 적어도 하나를 위치시킬 수 있다.
2차 구조(즉 스템-루프 또는 헤어핀)내에 위치하는 완전히 손상된 공통 코작 개시 코돈을 이용함으로써 우성 선별 마커에 의해 코딩된 단백질의 번역을 유리하게 손상시킬 수 있다. 그러한 실시태양에서는, 이 개시 코돈이 스템 루프 2차 구조의 스템내에 위치하는 것이 바람직하다. 그러한 실시태양의 개략적인 예에서 보면, 완전히 손상된 공통 코작의 개시 코돈은 다음과 같이 위치된다:
(2차 구조의 일부가 아닌 프레임외 개시 코돈도 나타나 있다.) 인식할 수 있는 바와 같이, 스템 루프내에서 스템에 따른 상보성은 정의에 의하면 통상적으로 요구되지 않는다. 그중에서도 특히 그러한 2차 구조를 서열에 도입하는 것에 관한 예시적인 방법 뿐만 아니라 2차 구조 안정성에 관한 정보에 대해서는 문헌[코작, PNAS, 1986 상기 참조]을 참조하면 된다.
알 수 있는 바와 같이, 천연 인트론 상입 영역 또는 인공 인트론 삽입 영역을 가진 우성 선별 마커가 이용되고 적어도 하나의 목적하는 유전자 생성물이 이 영역내에 삽입되는 것이 바람직하다. 어떤 특별한 이론을 이루길 희망하는 것은 아니지만, 본 발명자는 그러한 배열이 발현 효율을 증가시키는 것으로 가정하였는데, 그 이유는 우성 선별 마커에 관한 선별 과정에서 살아남는 생존가능한 콜로니의 수가 감소할 것이고, 선별 과정에서 살아남는 콜로니는 정의에 의하면 생존을 위해필요한 단백질을 발현시킬 것이며, 그와 관련하여 목적하는 유전자 생성물은 발현될 가능성이 더 많을 것이다. 또한 가정되는 바와 같이, 인트론 삽입 영역내의 목적하는 유전자 생성물로부터 전사되는 RNA는 우성 선별 마커의 전사의 완결(RNA의 연장)을 방해하므로, 우성 선별 마커가 세포 DNA 내에 통합되는 위치는 더 많은 양의 RNA가 초기에 전사되는 위치일 것이다.
인식할 수 있는 바와 같이, 원핵 단백질은 통상적으로 스플라이스(splice) 및 인트론을 포함하지 않는다. 그러나, 발현 벡터 기술에 바람직한 우성 선별 마커의 대부분은 원핵 생물계로부터 유도된다. 따라서, 원핵 생물 유도된 우성 선별 마커가 이용될 때, 바람직하게는 목적하는 유전자 생성물을 포함하는 인트론을 삽입시키기 위한 위치를 형성하도록 유전자 내에 인공 스플라이스를 형성시킬 필요가 있다. 다음의 법칙이 원핵 생물 유전자의 스플라이스 부위의 선별을 위해 제공되지만, 그들은 진핵 생물 유전자에도 쉽게 이용될 수 있음을 알아야 한다.
진핵 세포에서의 메신저 RNA 전구체의 스플라이싱을 위한 일반적인 메카니즘은 본 명세서에 참고로 인용한 문헌[Sharp, Philip A. "Splicing of Messenger RNA Precursors" Science, 235: 736-771 (1987)]에 요약되어 기술되어 있다(특히 제1도 참조), 샤프(Sharp)에 따르면, 스플라이스에 필요한 핵산 서열에 최소한 4가지 특징이 있다: (a) 5' 스플라이스 공여체; (b) 3' 스플라이스 억셉터; (c) 분지점, 및 (d) 폴리피리미딘 트랙. 5' 스플라이스 공여체에 대한 공통 서열은 다음과 같은 것으로 보고되어 있으며,
3' 스플라이스 억셉터에 대한 것은 NCAG/G(여기서, "/"는 스플라이스 부위를 나타내는 기호임)이며, 이것은 본 명세서에 참고로 인용한 문헌[Mount, S.M. "A Catalogue of Splice Junction Sequences" Nuc. Acids. Res. 10/2: 459-472 (1992)]에 기술되어 있다. 분지점, 즉, 5' 스플라이스 공여체와 올가미 모양을 형성하는 위치에 대한 공통 서열은 PyNPyPAPy인 것으로 보고되어 있으며, 포유동물 RNA 스플라이싱에 대해 보고된 바람직한 분지점은 TACTAAC인 것으로 문헌[Zhuang, Y. et al., "UACUAAC is the preferred branch site for mammalian mRNA splicing" PNAS 86: 2752:2756 (1989)]에 기술되어 있다. 통상적으로, 분지점은 5'-스플라이스 공여체로부터 적어도 약 70 내지 약 80개 염기쌍 정도 떨어져 있다(이 거리에 대한 상한값은 한정되어 있지 않음). 폴리피리미딘 트랙은 통상적으로 약 15 내지 약 30 염기쌍이며, 가장 통상적으로는 분지점 및 3' 스플라이스 억셉터에 의해 한정된다.
상기한 것은 천연 스플라이싱 메카니즘에 대한 특성에 의해 부여되는 특징의 설명이다. 5' 스플라이스 공여체 및 분지점 사이의 염기쌍의 수에 대한 정확한 상한값이 없기 때문에, 목적하는 유전자 생성물은 천연 인트론이 우성 선별 마커내에 존재하는 상황에서 이 영역내에 삽입되는 것이 바람직하다. 그러나, 알 수 있는 바와 같이, 그러한 인트론은 바람직한 우성 선별 마커의 대부분에 존재하지 않으며,그것만으로 인공 인트론은 바람직하게는 이러한 마커와 함께 이용된다.
인공 인트론을 생성시키기 위하여, "스플라이스 공여체:스플라이스 억셉터" 부위는 우성 선별 마커의 코딩 영역내에 위치해야 한다. 샤프와 마운트에 따르면, 다음의 서열이 스플라이스 공여체:스플라이스 억셉터 부위로서 기능하는 것이 가장 바람직하다-CAGG(GG 영역에서 발생하는 인공 스플라이스를 가짐) 바람직한 서열은 AAGG이다.
가장 바람직한 서열 CAGG에 대해서 보면, 다음의 코돈 및 아미노산이 인공 인트론 삽입 영역의 발생을 위한 우성 선별 마커의 코딩 영역내에 위치할 수 있다.
(인식할 수 있는 바와 같이, 생존가능한 아미노산 잔기를 결정하는 동일한 방법이 AAGG의 바람직한 서열에 이용될 수 있다). 스플라이스 공여체:스플라이스 억셉터 부위의 유도를 위한 가장 바람직한 코돈 그룹은 A 그룹이다. 일단, 이러한 아미노산 서열이 위치하면, 인공 인트론 삽입 영역의 발생을 위한 생존 가능한 지점이 한정될 수 있다.
바람직한 NEO 우성 선별 마커에 대해서 보면, 아미노산 잔기 Gln Asp(코돈 그룹 A)는 NEO의 위치 51 및 52에 위치하고 아미노산 잔기 Ala Arg(코돈 그룹 C)는위치 172 및 173에 위치한다(인식할 수 있는 바와 같이, 다중 인공 인트론 영역이 이용될 수 있음), NEO의 잔기 50-53에 대해서 보면, 핵산 및 아미노산 서열은 다음과 같다.
따라서, 인공 인트론 삽입 영역은 NEO의 51 및 52 사이에 형성될 수 있다. 이 영역은 가장 바람직하게는 분지점, 폴리피리미딘 트랙을 포함하며, 바람직하게는 목적하는 유전자 생성물의 삽입을 위한 영역, 즉 효소 분해에 대해 변경가능한 영역을 포함한다.
인공 인트론 삽입 영역을 위해서는 2가지 특징이 중요하다. 5' 스플라이스 부위(예를 들면, CAG에 인접함)의 첫번째 2개의 핵산 잔기는 가장 바람직하게는 GT이며, 3' 스플라이스 부위(예를 들면, G에 인접함)의 첫번째 2개의 핵산 잔기는 가장 바람직하게는 AG이다.
상기 정의한 기준을 이용하면 인공 인트론 삽입 영역은 NEO의 아미노산 잔기 51 및 52 사이에 있다.
(이러한 인공 인트론 삽입 영역을 형성하는 방법에 관한 상세한 것은 다음의 실시예 부분에 기재되어 있다). Not I 부위는 목적하는 유전자 생성물이 삽입될 수있는 영역으로서 형성된다. 그러므로, 삽입시에, 목적하는 유전자 생성물은 NEO의 아미노산 잔기 51 및 52 사이에 위치하여 NEO 전달 중에, 목적하는 유전자 생성물이 "스플라이스-아웃"될 것이다.
숙주 세포주는 가장 바람직하게는 포유 동물의 것이며, 당업계의 숙련인은 그안에서 발현될 목적하는 유전자 생성물에 가장 적합한 특정 숙주 세포주를 우선적으로 결정하는 능력을 갖고 있을 것이다. 숙주 세포주의 예로는, 이것으로 제한되는 것은 아니지만, DG44 및 DXB11(중국산 햄스터 난소 세포주, DHFR 마이너스), HELA (인간 자궁 경부 종양), CV1(원숭이 신장 라인), COS(SV40 T 항원을 가진 CV1의 유도체), R1610(중국산 햄스터 섬유아세포), BALBC/3T3(생쥐 섬유아세포), HAK(햄스터 신장 라인), SP2/0(생쥐 골수종), P3x63-Ag3.653(생쥐 골수종), BFA-1clBPT(소 내피 세포), RAJI (인간 임파구 세포) 및 293(인간 신장)을 들 수가 있다. 숙주 세포주는 통상적으로는 상업국, 아메리칸 티슈 컬쳐 콜렉션 또는 공개된 문헌으로부터 입수가능하다.
바람직한 숙주 세포주는 DG44 또는 SP2/0이다[Urland, G. 등, "Effect of gamma rays and the dihydrofolate reductase locus: deletions and inversions." Som. Cell & Mol. Gen. 12/6: 555-566 (1986) and Shμlman, M. et al., "A better cell line for making hybridomas secreting specific antibodies." Nature 276: 269(1978) 참조]. 가장 바람직한 숙주 세포주는 DG44이다. 플라스미드의 숙주 세포로의 트랜스펙션은 당업계에서 이용되는 임의의 기술에 의해 이루어질 수 있다. 이 기술에는, 제한되는 것은 아니지만, 트랜스펙션(전기 영동 및 전기 천공법을포함), 봉입된 DNA와의 세포 융합, 현미 주사 및 완전 바이러스에 의한 감염을 들 수가 있다[Ridgway, A.A.G. "Mammalian Expression Vectors." Chapter 24.2, pp. 470-472 Vectors, Rodriguez and Denhardt, Eds. (Butterworths, Boston, MA 1988 참조). 가장 바람직하게는, 숙주로의 플라스미드 도입은 전기 천공법을 이용한 것이다.
다음의 실시예는 의도적인 것은 아니며, 또한 본 발명을 제한하는 것으로 간주되어서도 안되며, 이 실시예는 본 명세서에 기재된 본 발명의 실시태양의 이용성을 증명하려는 것이다. 기재된 완전히 손상된 공통 코작 서열은 상기한 바와 같이 넓게 이용되는 것으로 의도된다. 그러나, 표상적인 효율을 위해, 완전히 손상된 공통 코작 서열의 특히 바람직한 실시태양의 예시적인 용도는 하기하는 바와 같이 탠덤(tandem) 키메릭 항체 발현 벡터(본 명세서에서 또한 항체 발현 벡터로서 언급됨)와 관련하여 이용될 수 있다.
I. 탠덤 키메릭 항체 발현("TCAE") 벡터
B세포 임파구는 다분화 성능 간세포로부터 발생하며 개체 발생을 통하여 완전히 성숙된 항체 분비 혈장 세포로 진행된다. 당업계에서 "CD20"으로 불리우는 인체 B 임파구-제한된 분화 항원 Bp35는 35,000 달톤의 세포 표면 비글리코실화된 인단백질이며, CD20은 세포질 μ 중쇄의 발현 직전에 초기의 pre-B 세포 발달 중에 발현된다. CD20은 혈장 세포 분화 단계까지 일정하게 발현된다. CD20 분자는 세포 주기 개시 및 분화에 필요한 활성화 프로세스의 단계를 조절한다. CD20은 종양성 B세포 상에서 발현되기 때문에, CD20은 B 세포 림프종 및 백혈병의 치료를 위한 유망한 표적을 제공한다. CD20 항원은 조혈 조직 종양의 입수용이성 및 면역 효과 인자 메카니즘을 통한 용해에 대한 감도로 인해 항-CD20 항체 매개된 요법에 대한 표적으로서 특히 적합하다. 항-CD20 항체 매개된 요법은 특히 본 발명과 동시에 출원되어 동시 계류중인 미합중국 특허 출원 제07/978,891호 및 제호에 기재되어 있다. 이용된 항체는 포유 동물 세포에서 높은 수준으로 발현된 생쥐/인간 키메릭 항-CD20 항체("키메릭 항-CD20")이다. 이러한 항체는 본 명세서에 기재된 벡터, 즉 TCAE 5.2; ANEX 1; ANEX 2; GKNEOSPLA3F; 및 NEOSPLA3F를 이용하여 유도된다(추가의 벡터, TCAE 8은 키메릭 항 CD20 항체를 유도하는데 이용되며, TCAE 8은 NEO 번역 출발 부위가 부분적으로 손상된 공통 코작인 것을 제외하고는 TCAE 5.2와 동일하다. TCAE 8은 본 명세서와 함께 출원되어 동시 계류 중인 특허 출원 명세서에 기재되어 있다).
공동 양도된 미합중국 특허 출원 제07/912,292호에는 특히 인간/동반구 원숭이 키메릭 항체가 기재되어 있으며, 본 명세서에 기재된 본 발명의 실시태양은 벡터 TCAE 6 중의 인간/짧은 꼬리 원숭이 키메릭 항-CD4 항체가 기재되어 있다(미합중국 특허 출원 제07/912,292호의 제6도 참조). TCAE 6은 TCAE 5.2와 실질적으로 동일하며, TCAE 6은 인간 람다 불변 영역을 포함하는 반면, TCAE 5.2는 인간 카파 불변 영역을 포함한다. TCAE 5.2 및 ANEX 1(그 명세서에는 TCAE 12로 칭함)은 인간/동반구 원숭이 키메릭 항체와 관련하여 이용될 수 있는 벡터로서 기재되어 있다. TCAE 5.2 및 ANEX 1에 관하여 미합중국 특허 출원 제07/912,292호에 기재된 비교 데이타는 키메릭 항 CD20항체의 발현에 관한 것이다.
TCAE 5.2는 벡터 RLDN10b의 유도체인 벡터 CLDN으로부터 유도된 것이다(253 Science 77-91, 1991 참조), RLDN10b는 벡터 TND의 유도체이다(7 DNA 651-661, 1988 참조), 벡터 "계통 라인"은 다음과 같다: TDN → RLDN10b → CLDN → TCAE 5.2 → ANEX 1 ("→"기호의 사용은 의도적이 아니며, 또한 한 벡터로부터 다음 벡터로의 변화를 이루는데 필요한 노력을 나타내는 것으로서 간주되어서는 안되며, 반대로 CLDN으로부터 TCAE 5.2를 생성하는데 필요한 단계의 수와 복잡성은 광범위한 것이다).
TND는 인간 조직 플라스미노겐 활성화 인자의 고도의 발현을 위한 것이다. RLDN10b는 다음과 같이 TND와 다르다; 디히드로폴레이트 리덕타제 ("DHFR") 전사 카셋트(프로모터, 생쥐 DHFR cDNA, 및 폴리아데닐화 영역을 포함)는 조직 플라스미노겐 활성화 인자 카셋트("t-PA 발현 카셋트")와 네오마이신 포스포트랜스퍼라제("NEO 카셋트") 사이에 위치하여 세가지 모든 카셋트가 직렬로 동일한 전사방향에 있도록 한다. 이 TND 벡터는 메토트렉세이트, MTX에 대한 반응에 있어서 DHFR 유전자 증폭에 대한 선별 전에 DHFR, NEO 및 t-PA 유전자를 보유하는 세포에 대해 G418에 의한 선별을 가능하게 한다. DHFR 유전자의 앞에 있는 프로모터는 생쥐 베타 글로빈 주요 프로모터로 변화된다(3 Mol. Cell Bio. 1246-1254, 1983 참조). 마지막으로, t-PA cDNA는 폴리링커로 대체되어 목적하는 다른 유전자가 폴리링커에 삽입될 수 있도록 한다. TND 벡티의 3가지 모든 진핵 생물 전사 카셋트(t-PA, DHFR, NEO)는 제한 엔도뉴클레아제 Not I에 의한 분해에 의해 박테리아플라스미드 DNA(pUC19 유도체)로부터 분리될 수 있다.
CLDL은 다음과 같이 RLDN10b와 다르다. 폴리링커의 앞에 위치한 라우스 LTR은 -581에 있는 Spe I 부위로부터 -16에 있는 Sst I 부위까지 인간 사이토메갈로바이러스 이른 초기 유전자 프로모터 인헨서 ("CMV")(41 Cell 521, 1985)에 의해 대체된다(이러한 숫자는 Cell 문헌으로부터 인용한 것이다).
이름에서 나타나는 바와 같이, TCAE 벡터는 키메릭 항체의 고도의 발현을 위해 제조된 것이다. TCAE 5.2는 다음과 같이 CLDN과 다르다.
A. TCAE 5.2는 세 개(3)에 대립되는 것으로서의 네 개의(4) 전사 카셋트를 포함하고, 이들은 일렬, 즉, 가변 영역이 없는 인간의 면역글로불린 경쇄(輕鎖); 가변영역이 없는 인간의 면역글로불린 중쇄(重鎖); DHFR; 및 NEO 순으로 존재한다. 각각의 전사 카셋트는 그 자신의 진핵 프로모터 및 폴리아데닐라틴 영역(TCAE 5.2 벡터의 개략도인 제2도를 참조)을 포함한다. 면역글로불린 중쇄 전방의 CMV 프로모터/촉진제는 -350의 Nhe I 위치로부터 -16의 Sst I 위치에까지(이 번호는 상기의 세포(Cell) 참고 문헌으로부터 유래)의 경쇄 전방의 프로모터/촉진제의 절형(truncated) 버젼이다.
구체적으로는,
1) 인간의 면역글로불린 경쇄 불변 영역은 PCR 반응에 의한 cDNA의 증폭으로부터 유도된다. TCAE 5.2에서, 이것은 인간의 면역글로불린 경쇄 카파 불변 영역(카바트 번호, 아미노산 108-214, 알로타입 Km 3) 및 인간의 면역글로불린 중쇄 감마 1 불변 영역(카바트 번호, 아미노산 114-478, 알로타입 Gmla, Gmlz)이었다. 경쇄는 정상의 인간의 혈액(아이디이씨 파마슈티칼스 코포레이션(IDEC Pharmaceuticals Corporation), 미합중국 캘리포니아주 라 졸라 소재)으로부터 단리되었고; 그로부터 얻은 RNA는 차후에 PCR 기법을 사용하여 증폭된 cDNA를 합성하는 데에 사용되었다(프라이머는 공통 카바트를 통하여 유도된다). 중쇄는 RNA로부터 제조된 cDNA로부터(PCR을 통해) 단리되었고, RNA는 사람 IgG1 벡터로 형질감염된 세포에서 유래했다(PCR 기법을 사용)(참조: 3 Prot. Eng. 531, 1990; 벡터 pNV162). 카바트 내의 공통 아미노산 서열을 맞추기 위하여, 즉 아미노산 225를 발린으로부터 알라닌으로(GTT에서 GCA로) 변경시키고 아미노산 287을 메티오닌으로부터 리신으로(ATG에서 AAG로) 변경시키기 위하여, 단리된 인간 IgG1 내에서 두 개의 아미노산을 변경시켰다.
2) 인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 카셋트는 면역글로불린 쇄의 분비를 위한 합성 시그널 서열들을 포함한다;
3) 인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 카셋트는 전이(transitional) 판독 프레임을 보존하고 면역글로불린 쇄 중에 통상적으로 발견되는 아미노산을 변경하지 않는, 경쇄 및 중쇄 면역글로불린 가변 영역을 삽입시키는 특이적 DNA 제한 위치들을 포함한다;
4) DHFR 카셋트는 그 자신의 진핵 프로모터(생쥐의 베타 글로빈 주요 프로모터, "BETA") 및 폴리아데닐화 영역(소 성장 호르몬 폴리아데닐화, "BGH")을 포함하였다;
5) NEO 카셋트는 그 자신의 진핵 프로모터(BETA) 및 폴리아데닐화 영역(SV40초기 폴리아데닐화, "SV")을 포함하였다.
TCAE 5.2 및 NEO 카셋트에 있어서, 코작 영역은 공통 코작이었다(상류 Cla I 위치 서열 번호 7을 포함):
ANEX 1(참고 문헌의 경우에서 이미 TCAE 12로 명명됨)은 NEO 카셋트에서 코작 영역이 완전히 손상된 것을 제외하고는 TCAE 5.2와 동일하다(서열 번호:8):
공동 양도된 참고 문헌의 경우에서 개시된 바와 같이, 완전히 손상된 공통 코작 이용의 영향은 놀랄만하였는데: TCAE 5.2에 비해, 세포 당 트랜스픽션된 동량의 플라스미드 DNA로부터 ANEX1 G418 저항 콜로니 수가 상당히 감소했고(8-배)(두번의 전기천공으로부터의 258 개이고 여섯 번의 전기천공으로부터의 98 개); 각각의 ANEX 1 클론에서 발현된 상호연결된 유전자 생성물의 양의 상당한 증가가 있었다. 제3도의 히스토그램을 참고하면(공동 양도된 참고 문헌의 경우 제16도), 258 개의 콜로니들은 번역 출발 위치에서의 공통 코작을 갖는 네오마이신 포르포트랜스퍼라제를 함유하는 DNA 25 ㎍의 2 번의 전기천공으로부터 유도되었다. 이들 콜로니들 중 201 개는 어떤 탐지가능한 유전자 생성물도 발현하지 않았고(키메릭 면역글로불린 25 ng/ml 미만), 단지 8 개의 콜로니만이 100 ng/ml 이상 발현되었다. 다시, 제3도를 참고하면, 98 개의 콜로니들은 번역 출발 위치에서 완전히 손상된 공통 코작을 갖는 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제를 함유하는 DNA 25 ㎍의 ANEX 1에 대한 6 번의 전기천공으로부터 유도되었다(6 번의 전기천공은 통계적인 비교값을 얻기 위하여 사용되었는데; 이는 TCAE 5.2에 있어서는 단위 전기천공이 약 129 개의 콜로니를 발생시키는 반면 ANEX 1에 대한 단위 진기천공은 약 16 개의 콜로니를 발생시킨다). ANEX 1 콜로니 중 8 개는 어떤 탐지가능한 유전자 생성물도 발현시키지 않는 반면(25 ng/ml 미만), 이들 콜로니 중의 62 개는 100 ng/ml 보다 더 많이 발현시켰고; 이들 62 개의 콜로니 중에서 거의 23 개는 250 ng/ml(23 %) 이상 발현시켰으며, 6 개는 1000 ng/ml(6 %) 보다 더 많이 발현시켰다.
상기의 증거는, 특히, 다음과 같다: 1) TCAE 5.2 및 ANEX 1 사이의 상이함은 NEO 유전자의 코작 번역 출발 위치에 한정되기 때문이고, 목적 유전자 생성물(키메릭 항-CD20 항체)이 NEO 유전자에 공동-결합되어 있기 때문이어서, 유추되는 결론은 결과에서의 상기한 상이점은 단순히 코작 번역 출발 위치에서의 상이함 때문이라는 것이다; 2) 완전히 손상된 공통 코작을 우성 형질 선별 번호와 함께 사용하면 생존가능한 콜로니를 상당히 적게 만든다는 것을 실험적으로 확인하였다; 3) 완전히 손상된 공통 코작을 목적하는 유전자 생성물에 상호연결된 우성 선별 마커와 함께 사용하면 발현된 유전자 생성물의 양을 상당히 증가시킨다는 것을 실험적으로 확인하였다. 그리하여, 스크리닝되는 콜로니의 수는 감소된 반면, 발현된 유전자 생성물의 양은 증가했다.
II. 프레임외 출발 서열의 영향
개념적으로, ANEX 1의 우성 선별 마커의 번역 개시의 추가 손상을 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 개시 코돈의 적어도 1 개의 프레임외 ATG 개시 코돈 상류를 사용함으로써 일으킬 수 있다. 한 단계 더 나아가, 그의 아미노산 줄기 내에 neo 코돈이 혼입된 2 차 구조("헤어핀" 구조)를 이용하는 것은 번역 개시를 더 방해할 것으로 예측된다. 따라서, 프레임외 개시 코돈/완전히 손상된 공통 코작이 고려되는 경우에, 이 영역은 상기 2 차 구조의 가능성이 증가되도록 배치되었다.
상기한 바와 같이, ANEX 1 벡터 중의 neo 개시 코돈을 위한 코작 영역은:
ANEX 1과 동일하지만 신규 개시 코돈에 대한 상기-확인된 변경이 가해진 벡터에 대한 바람직한 서열은 ANEX 2로서 언급되고 다음과 같다(서열 번호:9):
(프레임외 개시 코돈에 밑줄그었다.) ANEX 2의 완전히 손상된 공통 코작은 ANEX 1의 그것과 동일하다. 주된 차이점은 상류 프레임외 개시 코돈의 산입이다.가능한 차이점은 이 서열을 포함한 2차 구조를 형성하고 다음과 같다:
진하게 표시한 서열, ATG는 상류 프레임외 개시 코돈이고; 2 차 구조의 "루프" 부분은 CLA I 위치이며; "T"와 "C"(이탤릭체 및 진하게 표시) 사이의 서열은 완전히 손상된 공통 코작의 개시 코돈(밑줄)이다.
이 변화를 달성하기 위하여. PCR 단편을 Xho I(5520)로부터 Cla 1(5901)까지의 ANEX 1의 항-CD20 중으로 클로닝시켰다; 참조, 제4도. 프라이머는 다음과 같았다:
3'-프라이머 489(서열 번호:10):
프라이머 489의 위쪽에 선을 그은 부분은 Cla I 위치이고, 아랫쪽에 선을 그은 부분은 완전히 손상된 공통 코작 번역 출발 위치이다.
5'-프라이머 488(서열 번호.11):
프라이머 485의 위쪽에 선을 그은 부분은 Xho I 위치이다.
이들 프라이머들은 ABI 391 PCR MATETMDNA 합성기(Applied Biosystems, 미합중국 캘리포니아주 포스터 시티 소재)를 사용하여 제조되었다. 포스포라미드화물은 크루아켐(Cruachem)(스코틀랜드 글라스고우 소재): dA(bz) - 제품 제20-8120-21번; dG(ibu) - 제품 제20-8110-21번; dC(bz) - 제품 제20-8130-21번, T - 제품 제20-8100-21번으로부터 얻었다.
이들 프라이머들을 사용한 PCR 반응의 조건들은 다음과 같다: 대장균(E. coli)균주 GM48(ATCC로부터 얻음)에서 증식시킨 플라스미드의 TCAE 5.2 중의 항-CD20 2 λ(마이크로리터)를 탈이온수 77 λ, 프라이머 488(64 pmole) 2 λ; 및 프라이머 489(56 pmole) 4 λ와 혼합하였다. 이어서, 변성 단계(94 ℃, 5 분) 및 재생 단계(54 ℃, 5 분)를 수행하였다. 이어서, 5 mn dNTPS(프로메가(프로메가), 미합중국 위스콘신주 마디슨 소재: dATP, 제품 제U1201번; dCTP, 제품 제U1221번, dGTP, 제품 제U1211번; dTTp, 제품 제U1231번) 4 λ, Pfu DNA 폴리머라아제(스트라타겐(Stratagen), 미합중국 캘리포니아주 라 졸라 소재, 제품 제600135번, 2.5 U/ml) 1 λ 및 광유 오버레이(overlay) 50 λ를 거기에 가하고, 72 ℃, 2 분, 94 ℃, 1 분; 54 ℃, 1 분으로 이루어진 각각의 사이클을 사용하여 30 사이클을 수행하였다. 이 혼합물의 10 μl(λ)를 아가로오스 겔 전기영동으로 분석하고(결과는 나타내지 않음); 단일 밴드를 약 400 염기 쌍에서 찾아내었다.
라이게이션을 위하여 PCR 생성물 및 벡터를 다음과 같이 제조하였다: 대장균 박테리아 균주 GM48에서 성장시킨 ANEX 1 플라스미드 중의 항-CD20을 다음과 같이 Cla 1 및 Xho 1로 소화시켰다: ANEX 1 중의 항-CD20의 20 λ를 10XNEB4 완충액(뉴 잉글랜드 바이오랩(New England Biolap), 미합중국 메사추세스주 버클리 소재; 이후로 NEB로 칭함) 10 λ; Cla 1 5 λ(NEB, 제품 제197 S번, 60u); 및 탈이온수 64 λ와 혼합하였다. 이 혼합물을 37 ℃에서 하룻밤 인큐베이션시킨 다음 Xho 1 5 λ(NEB, 제품 제146 S번, 100 u)를 가하고 37 ℃에서 2 시간 동안 인큐베이션시켰다. 생성된 물질은 여기서 "Cla 1/Xho 1 절단 ANEX 1"로 칭한다. 약 400 개의 염기쌍 PCR 단편을 제조하고 다음과 같이 Cla 1 및 Xho 1로 소화시켰다: PCR 단편 90 λ를 3 M NaOAc 10 λ; 10 % 황산 도데실 나트륨(SDS) 1 λ; 및 페닐/CHCl3/이소아밀 90 λ와 혼합하였다. 이 혼합물을 30 초 동안 볼텍싱시킨 다음 1 분 동안 스피닝시켰다(1700 RPM). 수층을 스핀 칼럼에 걸어 총 혼합물 85 λ를 얻었다. 이 혼합물에 10XNEB4 10 λ, 소 혈청 알부민 1 λ(BSA, 100X; NEB), Cla 1 2 λ(24 u) 및 Xho 1 2 λ(40 u)를 가하였다. 이 혼합물을 37 ℃에서 2 시간 동안 인큐베이션시켰다. 생성된 물질은 여기서 "Cla 1/Xho 1 절단 PCR 488/489"로 칭한다. Cla 1/Xho 1 절단 ANEX 1 및 Cla 1/Xho 1 절단 PCR 488/489 모두를 아가로오스 겔 전기영동으로 분석하고, 생성된 밴드를 겔 상의 동일한 적절한 위치에서 관찰하였다(결과는 나타내지 않음).
Cla 1/Xho 1 절단 PCR 488/489 및 Cla 1/Xho 1 절단 ANEX 1의 라이게이션을 다음과 같이 수행하였다: tRNA(시그마(Sigma), 미합중국 미주리주 세인루이스 소재, 제품 제R-8508번) 1 λ를 10 % SDS 1 λ; 3 M NaOAc 10 λ; Cla 1/Xho 1 절단 PCR 488/489 45 λ(약 22.5 ng); 0.75 λ 트리스-히드록시메틸 아미노메탄 에틸렌디아민 테트라아세트산(TE) 중의 Cla 1/Xho 1 절단 ANEX 1(약 32 ng)의 1:4 희석액(0.25 λ); 및 TE 42 λ와 혼합하였다. 이 혼합물에 페닐/CHCl3/이소아밀 90 λ를 가한 다음, 30 초 동안 볼텍싱시키고 1 분 동안 스피닝시켰다(1700 RPM). 수층을 새 튜브로 옮기고, 100 % EtOH(-20 ℃) 270 λ를 가하고 10 분 동안 스피닝시킨 후(13,000 RPM) 다시 100 % EtOH(-20 ℃) 270 λ를 가하고 추가로 1 분 스핀시켰다(13,000 RPM). 이 혼합물을 SpeedVACTM중에서 건조시키고 TE 17 λ, 리가아제 완충액 2 λ(프로메가, T4 DNA 리가아제 장치, 제품 제M180번) 및 리가아제 1 λ(프로메가 리가아제 장치) 중에서 재현탁시켰다. 이 라이게이션 혼합물을 14 ℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션시켰다. 라이게이션 혼합물 20 μl(20 λ)를 3 M NaOAc 10 λ, 10 % SDS 1 λ, TE 69 λ, 및 페닐/CHCl3/이소아밀 90 λ와 혼합하였다. 이 혼합물을 30 초 동안 볼텍싱시키고 1 분 동안 스피닝시켰다(1700 RPM). 수층을 새 튜브에 옮기고 100 % EtOH(-20 ℃) 270 λ를 거기에 가하고 10 분 동안 회전시켰다(1700 RPM). 이 혼합물을 SpeedVACTM중에서 건조시키고 TE 20 λ 중에서재현탁시켰다. 상기 현탁된 혼합물 10 μl를 제조자의 지시에 따라 대장균 X-L1 blueTM(스트라타겐, 미합중국 캘리포니아주 라 졸라 소재) 중에서 형질전환시켰다. 10 개의 박테리아 콜로니로 암피실린(ampicillin)(50 ㎍/ml; 시그마, 제품 제A-9393번)를 포함하는 LB 배양액(LB Broth)(기브코 비알엘(지브코 비알엘), 미합중국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재, 제품 제M27950B번)을 접종시켰다. 제조자의 지시에 따라 프로메가 DNA 정화계(제품 제PRA7100번)를 사용하여 10개의 배양물로부터 플라스미드를 단리하였고; 이들 플라스미드는 상기 충분도에 따라 ANEX 2 벡터를 포함할 수 있다.
ANEX 2는 neo 출발 위치(neo 개시 코돈에 대해 -9 내지 -13)의 상류에 Hinf 1 위치("GAATC")를 포함하고; ANEX 1은 이 Hinf I 위치를 포함하지 않는다. 예상되는 ANEX 2 및 상기 정제된 ANEX 1 표준을 함유하는 정제된 플라스미드를 다음과 같이 Hinf 1 소화시켰다: 각각의 단리물 2 λ를 Hinf I 소화 완충액 8 λ(10 x NEB2 완충액 15 λ, Hinf I 15 λ(NEB, 제품 제155S번, 10μ/λ); 및 H2O 90 λ)과 혼합하였다. 이 혼합물을 37 ℃에서 3 시간 동안 인큐베이션시키고 각각의 단리물을 아가로오스 겔 전기영동을 통하여 분석하였는데(결과는 나타내지 않음); 밴드 9개는 ANEX 1 표준과 실질적으로 동일하였지만, 1 개는 밴드 패턴에서 다소 상이함을 보였다. 이 단일 단리물에 있어서, 첫 두 개의 밴드는 1692 및 670 kB이었고, ANEX 1 Hinf I 소화 생성물에 있어서는, 첫 세 개의 밴드는 1691, 766 및 670 kB이었다. 단일 단리물에 대한 766 kB에서의 밴드가 없는 것은 ANEX 1로의 목적하는 변화가상기 벡터 중으로 혼입되면서 거기에 Hinf I 위치가 없기 때문이었다. 이 벡터는 "ANEX 2(G1, K) 내의 항-CD20"라고 칭하였는데 일반적으로 본 발명자는 ANEX 2로 언급한다.
ANEX 2에서의 항-CD20의 전기천공을 다음과 같이 수행하였다: ANEX 2DNA(400 ㎍)의 항-CD20 240 μl(240 λ)를 10 X NEB2 완충액 100 λ; Stu I 100 λ(NEB, 제품 제187S번, 1000 u); 및 TE 560 λ와 혼합하고 37 ℃에서 2 시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서 이 혼합물을 8 개의 스핀 칼럼(각각 125 λ)상에 배치한 다음, 10 X Not I 완충액 110 λ(NEB); 100 X BSA 10 λ, 및 Not I 20 λ(NEB, 제품 제189S번, 800u)를 가하였다. 이 혼합물을 37 ℃에꺼 3 시간 동안 인큐베이션시키고, 3 M NaOAc 120 λ 및 10 % SDS 12 λ를 가하였다. 이 혼합물을 2 개의 볼텍싱 튜브로 옮기고 페닐/CHCl3/이소아밀 500 λ를 각각에 가하고, 30 초 볼텍싱시키고 1 분 동안 스피닝시켰다(1700 RPM). 튜브로부터 수층을 제거하여 3 개의 튜브로 분리하고, 각각의 튜브에 -20 ℃ 100 % ETOH를 가하고 10 분 동안 스피닝시켰다(13,000 RPM). 이어서, -20 ℃ 70 % ETOH를 각각의 튜브에 가하고 1 분 동안 스피닝시켰다(13,000 RPM). 이어서, 튜브를 Speed VACTM 중에 배치하여 건조시키고 멸균 후드 중에서 TE 100 λ 내에 내용물을 재현탁시켰다. 재현탁 DNA 5 μl (5 λ)를 탈이온수(1:200 희석) 995 λ와 혼합하였다, 광학 밀도 측정계(OD=260)에 걸어 존재하는 DNA을 측정하면 0.75 ㎍/λ로 나타났다. 전기천공에 DNA 25 ㎍을 이용하기 위하여, DNA 1:200의 희석액 32 λ를 사용하였다(여기에 사용된 25 ㎍은 상기 실시에 1의 TCAE 5.2 및 ANEX 1에 사용된 DNA의 양임). DNA1:200 희석액은 정식으로 "Stu 1, TE 중의 ANEX 2(25 ㎍)의 Not I cut 항-CD20"으로 칭해졌는데, 일반적으로 "ANEX 2의 항-CD20"으로 언급된다.
사용되는 숙주 세포는 DG44 CHO("CHO")이었다(상기 문헌 Urlaub, G. Somatic Cell, 1986 위의 책). 6.6 x 105세포/ml(84 %) 100 ml를 1000 RPM에서 2분 동안 스피닝시켰다. 이들을 50 ml 슈크로오스 완충 용액으로 세척하고, 1000 RPM에서 5 분 동안 회전시킨 다음 이 물질을 슈크로오스 완충 용액 4.5 ml 중에서 재현탁시켰다. 이어서, 세포의 수를 계산하고, CHO 세포 0.4 ml(4.0 x 106세포)를 BTX 멸균기, 일회용 전기천공 크벳 중에서 ANEX 2의 항-CD20 32 λ와 혼합하였다. 전기천공 장치를 다음과 같이 하였다: 210 볼트, 400 마이크로파라데이 용량; 13 옴 저항; BTX 600TM전기 세포 조작기(BTX, 미합중국 캘리포니아주 산디에고 소재)을 사용함 9 번의 전기천공을 수행하였다; 실제 시간 동안 유도된 실제 전압은 다음과 같았다: 1-199 V, 4.23 msec; 2-188 V, 4.57 msec; 3-189 V, 4.24 msec, 4-200 V; 4.26 msec, 5-200 V, 4.26 msec; 6-199 V, 4.26 msec; 7-189 V, 4.59 msec; 8-189 V, 4.57 msec; 9-201 V, 4.24 msec. 실시예 1에서 나타낸 바와 같이, 수행된 전기천공의 수의 차이는 세 개의 조건, TCAE 5.2, ANEX 1 및 ANEX 2; 각각을 위하여 통계학적으로 중요한 생존 콜로니의 수를 달성할 필요에 기인하였고; 각각의 전기천공(25 ㎍)을 위하여 사용된 DNA의 양은 각각 동일하고 동일한 수의 세포가 전기천공되었다.
이어서, 전기천공 물질을 G418 성장 배지(히포산틴 및 티미딘이 없는 CHO-S-SFM II (지브코, 미합중국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재, 형 번호 91-0456PK) 및 50 μM 히포산틴 및 8 μM 티미딘) 20 ml와 혼합하였다. 혼합물을 온화하게 교반하고, 단위 웰 당 혼합물 200 μl를 96-웰 플레이트로 평판 배양하고, 9회 전기천공 각각에 대해 한 개의 플레이트를 사용했다. 전기천공 후, 2일부터 17일까지 각각의 웰 150 μl를 제거하고 G418 400 μl/mg을 함유하는 새로운 G418 성장 배지 150 μl를 거기에 가하였다. 콜로니를 25 일째에 분석하였다.
121 개의 콜로니는 항-CD20 항체(즉, 전기천공 당 13 콜로니)를 발현하였다. 이들 중에서, 63(52 %)개가 단백질 250 ㎍/ml 이상 발현하였고; 63 개 중 콜로니의 20 개(16,5%)가 단백질 1000 ㎍/ml 이상 발현하였다, 121 개의 콜로니 중의 단지 5개(4.1 %)가 단백질 25 ㎍/ml 미만을 발현하였다. 제5도는 벡터 TCAE 5.2, ANEX 1 및 ANEX 2에서부터 유도된 콜로니에 대한 단백질의 발현을 비교하는 히스토그램을 제공한다.
상기 데이타는, 그 중에서도, ANEX 1 및 ANEX 2에서와 같이, 우성 선별 마커의 번역 개시와 관련된 완전히 손상된 공통 코작의 상류에 적어도 1 개의 프레임외 개시 코돈의 이용은 상호연결된 유전자 생성물을 발현시키는 생존 콜로니의 수를 감소시키고 발현된 상호연결된 유전자 생성물의 양을 상당히 증가시킨다는 것을 나타낸다.
III. 우성 선별 마커의 적어도 1 개의 인공 내부 삽입 영역 내로의 목적하는 유전자 생성물 삽입의 영향
ANEX 2 벡터를 만드는 데에 있어서, ANEX 2의 NEO 코딩 영역의 아미노산 잔기 51과 52 사이에 인공 스플라이스를 생성하고 거기에 항-CD 20 코딩 영역을 삽입하였다. 이러한 벡터 2개를 생성하였다: 첫번째 것은, NEO 번역 개시 코돈을 위해 공통 코작 서열을 포함하지만, 프레임외 개시 코돈은 포함하지 않는 "GKNEOSPLA3F"로 일컬어지는 것이고; 두번째 것은 완전히 손상된 공통 코작 및 프레임외 개시 코돈을 포함하는 "NEOSPLA3F"로 일컬어지는 것이다.
GKNEOSPLA3F 및 NEOSPLA3F 모두는 NEO의 아미노산 잔기 51과 52 사이에 하기의 인공 내부 서열을 포함한다.
밑줄친 부분은 Not I 효소로 소화시키기 위해 변경가능한 서열을 나타내고; 항-CD20에 대한 코딩 영역이 이 영역 내에 삽입되었다.
어떤 특수한 이론으로 선이 그어지길 원하지는 않지만, 본 발명자는 발현 동안에 우성 선택 마커(예, NEO 유전자)의 인공 내부 삽입 영역 내로의 목적하는 유전자 생성물의 산입은 개시된 GKNEOSPA3F 및 NEOSPLA3F 벡터, 항-CD20 항체의 경우에, 생성되는 생존 콜로니의 수를 상당히 감소시킬 것이라는 것을 가정한다. 이것을 두 가지 점에서 예측된다: 첫째, 전사가능하고 항체 코딩 영역을 완전히 이을 수 있으며 NEO를 완전히 번역할 수 있는 이들 벡터들은 G418 저항성일 것이고; 둘째, 각각의 항체 카셋트가 그 자신의 프로모터 및 폴리아데닐화 영역을 갖기 때문에, 항체의 전사 및 번역은 NEO의 번역과는 무관하다.
GKNEOSPLA3F 및 NEOSPLA3F 벡터는 다음 방법으로 제작된다.
ANEX 2 중의 항-CD20을 Not I 및 Xho I로 하기와 같이 소화시켜 1503 bp NEO 카셋트 DNA 단편(제4도의 "Not I 7023" 및 "Xho I 5520" 사이 참조)를 단리시켰다: ANEX 2 중의 항-CD20 10 μl를 탈이온 H2O("dH2O") 6 μl, Not I 효소(NEB 제품 제189S번) 1 μl, 10xNot I 소화 완충액(NEB, 효소가 제공됨) 2 μl, 및 Xho I 효소(위스콘신주 매디슨 소재의 프로메가 제품 제R4164번) 1 μl와 혼합하였다. 이 소화 혼합물을 37 ℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 생성된 소화시킨 DNA를 0.8% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 크기 분별시키고, 1503에 이동한 바람직한 단편을 GlassMAXTM방법(뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재의 지브코 비알엘 제품 제15590-011번)에 의해 단리시켜 pBluescript SK (-) 플라스미드 DNA(스트라타겐, 캘리포니아주 라 졸라 소재)에 삽입하였다.
pBluescript SK (-)를 먼저 제조하고, ANEX 2 중의 항-CD20에 대한 상기와 동일한 조건을 사용하여 Not I 및 Xho I로 이중 소화시킴으로써 NEO 카셋트를 수용하였다. 이어서, 소화시킨 pBluescript SK (-)를 dH2O 70 μl, tRNA(미저리주 세인트 루이스 소재의 Sigma 제품 제R-8508번) 2 μl, 3M NaOAc 10 μl, 및 100% EtOH 300 μl를 -20 ℃에서 첨가하여 에탄올 침전시킴으로써 수집하였다. 이것을 13,000 rpm에서 10분간의 스핀을 수행하여 상층액은 버리고, 70% EtOH로 세척하여 액체는 버리고, SpeedVACTM중에서 건조시키고, 1xTE 20 μl에 재현탁시켰다.
하기한 바와 같이, NEO 카셋트 DNA 단편을 제조된 pBluescript SK (-) 벡터로 라이게이션시켰다: NEO 단편 DNA 10 μl를 dH2O 6 μl, 절단한 PBluescript SK (-) 벡터 DNA 1 μl, 10x라이게이션 완충액(프로메가 제품, 효소가 제공됨) 2 μl, 및 T-4 DNA 리가아제(프로메가 제품 제M1801번) 1μl와 혼합한 후, 14 ℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 라이게이션된 DNA를 pBluescript SK (-) 벡터 DNA의 제조를 위해 상기에 설명한 바와 같은 에탄올 침전에 의해 수집하였다.
재현탁시킨 라이게이션된 DNA 10 μl를 대장균 XL-1 BlueTM(스트라타겐)으로 제조자의 지시에 따라 변형시켰다. 10개의 세균 콜로니로 암피실린(50 ㎍/ml; Sigma 제품 제A-9393번)을 포함하는 LB 배양액(지브코 비알엘 제품 제M27950B번)을 접종하였다. 플라스미드를 프로메가 DNA 정제계(제품 제PR-A7100번)을 사용하여 제조자의 지시에 따라 10개의 콜로니로부터 단리시켰다. 이러한 플라스미드는 상술한 충분도에 따라 BlueNEO+라 불리는 플라스미드를 포함할 수 있다.(BlueNEO+는 하기 방법으로 충분히 확인되었다.)
BlueNEO+는 NEO 카셋트 단편 DNA를 pBluescript SK (-) 벡터로 라이게이션시킬 때 변형된 Not I 제한 인지 서열을 함유한다. 이 부위는 하기와 같이 파괴하였다: BlueNEO+ DNA 1 μl를 dH2O 16 μl, 10xNot I 효소 완충액(NEB) 2 μl, 및 Not I 효소(NEB) 1 μl와 혼합하였다. 이것을 37 ℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 소화시킨 DNA를 스핀 컬럼 분별에 의해 정제하여 최종 부피가 15 μl가 되게 하였다. Not I로 소화시킨 DNA 15 μl를 5xKlenow 완충액(20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM MgCl2) 4 μl 및 DNA 폴리머라제 I 라르게(Klenow) 단편(프로메가 제품제M2201번) 1 μl와 혼합함으로써 "평활 말단(blunt-ended)"를 만들었다. 이 혼합물을 실온에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 평활 말단 DNA를 스핀 컬럼 분별에 의해 정제하여 최종 부피가 15 μl가 되게 하였다.
평활 말단 DNA의 라이게이션은 최종 DNA를 1xTE에 재현탁시키는 것을 제외하고는, NEO 카셋트 단편 DNA의 pBluescript SK (-) 벡터로의 라이게이션과 유사한 방법으로 수행하였다.
라이게이션시킨 후, DNA 17 μl를 10xNot I 소화 완충액 2 μl 및 Not I 효소(NEB) 1 μl와 혼합함으로써 DNA를 제2 제한 소화시켰다. 소화는 37 ℃에서 60분 동안 진행시켰다. 소화시킨 후, 혼합물을 스핀 컬럼 분별에 의해 정제시켜 최종 부피가 15 μl가 되게 하였다.
정제시킨 DNA 10 μl를 대장균 XL-1 BlueTM(스트라타겐)으로 제조자의 지시에 따라 변형시켰다. 10개의 세균 콜로니로 암피실린(50 ㎍/ml; Sigma)을 포함하는 LB 배양액(지브코 비알엘)을 접종하였다. 플라스미드를 프로메가 DNA 정제계를 사용하여 제조자의 지시에 따라 10개의 콜로니로부터 단리시켰다. 이러한 플라스미드는 상술한 충분도에 따라 BlueNEO-라 불리는 플라스미드를 포함할 수 있다(BlueNEO-는 하기 방법으로 충분히 확인되었다.)
BlueNEO-는 아미노산 잔류물 51 및 52를 위한 코돈에 걸쳐있는 유일한 Pst I 제한 부위를 포함한다. BlueNEO-를 Pst I로 하기와 같이 소화시켰다: dH2O 15 μl, BlueNEO- DNA 1 μl, 소화 완충액 3(NEB) 2 μl 및 Pst I 효소(NEB 제품 제 140S번) 2 μl를 함유하는 혼합물을 형성하였다. 이 혼합물을 37 ℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 소화시킨 DNA를 스핀 컬럼 분별에 의해 정제하였다. 이어서, 하기 5'
확인 번호 제12번)의 합성 올리고뉴클레오티트를 BlucNEO-의 Pst I 부착 말단(cohesive end)에 라이게이션시켰으며, 그의 상보성 서열은 5'
열 확인 번호 제13번)이다. 이러한 링커를 삽입하여 공통 5' 스플라이스 공여 위치(라이게이션에 의함), 그 뒤에 Not I 부위, 그 뒤에 합성 폴리피리미딘 트랙, 그 뒤에 공통 3' 스플라이스 수용점을 상기 지정된 바와 같이 생성하였다.
라이게이션은 Pst I 선형화 BlueNEO- DNA 2 μl 및 어닐링된 상보성 올리고뉴클레오티드 14 μl를 사용한다는 것을 제외하고는, NEO 카셋트의 pBluescript SK (-)로의 라이게이션을 위해 상기 설명한 바와 동일하게 수행하였다.
전술한( 및 하기의) 합성 올리고뉴클레오티드는 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems) 391 PCR MATE (상표) DNA 합성기(Applied Biosystems, 캘리포니아주 포스터 시티 소재)를 사용하여 화학적으로 합성하였다. 합성을 위한 모든 시약들은 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems)로부터 구입하였다.
라이게이션시킨 DNA를 pBluescript SK (-) 벡터 DNA의 제조를 위해 상기 설명한 바와 같은 에탄올 침전에 의해 수집하였다.
재현탁시킨 라이게이션된 DNA 10 μl를 대장균 XL-1 BlueTM(스트라타겐)으로 제조자의 지시에 따라 변형시켰다. 10개의 세균 콜로니로 암피실린(50 ㎍/ml; Sigma)을 포함하는 LB 배양액(지브코 비알엘)을 접종하였다. 플라스미드를 프로메가 DNA 정제계를 사용하여 제조자의 지시에 따라 10개의 콜로니로부터 단리시켰다. 이러한 플라스미드는 상술한 충분도에 따라 NEOSPLA 및(또는) NEOSPLA-라 불리는 플라스미드를 포함할 수 있다.
스플라이스 접합 링커 배향의 측정은 Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit(오하이오주 클리브랜드 소재의 United States Biochemical 제품 제70770번)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 헥산 시퀀싱에 의해 수행하였다. 6개의 독립 플라스미드 단리물 내에서 링커 배향을 측정한 후, NEOSPLA를 동정한 결과 삽입시킨 스플라이스 접합 서열이 NEO 전사의 방향에 대해 전진 배향이었다.
dH2O 15 μl, NEOSPLA DNA 1 μl, 10x소화 완충액 D(프로메가 제품, 효소가 제공됨) 2 μl, 및 Xho I 효소(프로메가 제품 제R6161번) 2 μl를 함유하는 혼합물을 형성함으로써 NEOSPLA를 Xho I로 소화시켰다. 이 혼합물을 37 ℃에서 3시간 동안 소화시킨 후, 스핀 컬럼 분별에 의해 DNA 정제를 수행하였다. 하기와 같은 서열 5'TCGATTAATTAA 3'(서열 확인 번호 제14번)를 갖는 자기 상보성 합성 올리고뉴클레오티드를 이 부위에 라이게이션시켰다. 이 서열을 삽입함으로써 Xho I 부위는 Pac I 제한 부위(상기 서열 확인 번호 제14번 중에서 밑줄친 부분)로 효과적으로 변한다.
라이게이션은 Xho I 선형화 NEOSPLA DNA 2 μl 및 어닐링된 상보성 올리고뉴클레오티드 14 μl(175 피코몰)를 사용한다는 것을 제외하고는, NEO 카셋트의 pBluescript SK (-)로의 라이게이션을 위해 상기 설명한 바와 동일하게 수행하였다.
라이게이션은 DNA를 pBluescript SK (-) 벡터 DNA의 제조를 위해 상기 설명한 바와 같이 에탄올 침전에 의해 수집하였다.
재현탁시킨 라이게이션은 DNA 10 μl를 대장균 XL-1 BlueTM(스트라타겐)으로 제조자의 지시에 따라 변형시켰다. 10개의 세균 콜로니로 암피실린(50 ㎍/ml; Sigma)을 포함하는 LB 배양액(지브코 비알엘)을 접종하였다. 플라스미드를 프로메가 DNA 정제계를 사용하여 제조자의 지시에 따라 10개의 콜로니로부터 단리시켰다. 이러한 플라스미드는 상술한 충분도에 따라 NEOSPLA3이라 불리는 플라스미드를 포함할 수 있다.(NEOSPLA3는 하기 방법으로 충분히 확인되었다.)
ANEX 2(G1,K) 중의 항-CD20은 항-CD20 경쇄 및 중쇄 면역글로불린 카셋트를 함유하며, DHFR 카셋트는 5' 단부에서 Not I 부위에 의해 경계가 그어지고, 3' 단부에서 Xho I 부위에 의해 경계가 그어진다. dH2O 15 μl, ANEX 2(G1,K) DNA중의 항-CD20 1 μl, 10x소화 완충액 D(프로메가 제품, 효소가 제공됨) 2 μl, 및 Xho I 효소(프로메가 제품 제R6161번) 2 μl를 함유하는 혼합물을 형성함으로써 ANEX 2(G1,K) 중의 항-CD20을 Xho I로 소화시켰다. 이 혼합물을 37 ℃에서 3시간 동안 소화시킨 후, 스핀 컬럼 분별에 의해 DNA 정제를 수행하였다. 하기와 같은 서열5'TCGAAGCGGCCGCT 3"(서열 확인 번호 제15번)를 갖는 자기 상보성 합성 올리고뉴클레오티드를 이 부위에 라이게이션시켰다. 이 서열을 삽입함으로써 Xho I 부위는 Not I 제한 부위(상기 서열 확인 번호 제14번 중에서 밑줄친 부분)로 효과적으로 변한다.
라이게이션은 ANEX 2 DNA 중의 Xho I 선형화 항-CD20 2 μl 및 어닐링된 상보성 올리고뉴클레오티드 14 μl(175 피코몰)를 사용한다는 것을 제외하고는, NEO 카셋트의 pBluescript SK (-)로의 라이게이션을 위해 상기 설명한 바와 동일하게 수행하였다.
라이게이션시킨 DNA를 pBluescript SK (-) 벡터 DNA의 제조를 위해 상기 설명한 바와 같이 에탄올 침전에 의해 수집하였다.
재현탁시킨 라이게이션된 DNA 10 μl를 대장균 XL-1 BlueTM(스트라타겐)으로 제조자의 지시에 따라 변형시켰다. 10개의 세균 콜로니로 암피실린(50 ㎍/ml; Sigma 제품 제A-9393번)을 포함하는 LB 배양액(지브코 비알엘 제품 제M27950B)을 접종하였다. 플라스미드를 프로메가 DNA 정제계(제품 제PR-A7100번)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 10개의 콜로니로부터 단리시켰다. 이러한 플라스미드는 상술한 충분도에 따라 ANEX 2(G1,K)A중의 항-CD20이라 불리는 플라스미드를 포함할 수 있다. (이것은 하기 방법으로 충분히 확인되었다.)
dH2O 6 μl, ANEX 2(G1,K) 중의 항-CD20 10 μl, 10xNot I 소화 완충액(NEB, Not I 효소가 제공됨) 2 μl, 및 Not I 효소(NEB) 1 μl를 함유하는 혼합물을 형성함으로써 ANEX 2(G1,K)A 중의 항-CD20을 Not I 및 Xho I로 소화시켰다. 이 혼합물을 37 ℃에서 3시간 동안 소화시킨 후, 0.8% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 크기 분별시키고, 5515 염기쌍에 이동한 바람직한 단편을 ClassMAXTM방법에 의해 단리시켜 NEOSPLA3에 삽입하였다.
NEOSPLA3를 먼저 제조하고, dH2O 16 μl, 10xNot I 소화 완충액(NEB) 2 μl, 및 Not I 효소(NEB) 1 μl를 함유하는 혼합물을 사용하여 Not I으로 DNA 1 μl를 소화시켜서 항-CD20을 수용하고, 37 ℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 소화시킨 DNA를 스핀 컬럼 분별에 의해 정제하여 최종 부피 15 μl가 되게 하였다.
하기한 바와 같이, 제조된 NEOSPLA3 벡터로 항-CD20 DNA 단편을 라이게이션시켰다: 항-CD20 단편 DNA 10 μl를 dH2O 6 μl, 절단된 NEOSPLA3 벡터 DNA 1 μl, 10x라이게이션 완충액(프로메가, 효소가 제공됨) 2 μl, 및 T-4 DNA 리가아제(프로메가) 1 μl와 혼합한 후, 14 ℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 라이게이션된 DNA를 pBluescript SK (-) 벡터 DNA의 제조를 위해 상기에 설명된 바와 같은 에탄올 침전에 의해 수집하였다.
재현탁시킨 라이게이션된 DNA 10 μl를 대장균 XL-1 BlueTM(스트라타겐)으로 제조자의 지시에 따라 변형시켰다. 10개의 세균 콜로니로 암피실린(50 ㎍/ml; Sigma)을 포함하는 LB 배양액(지브코 비알엘)을 접종하였다. 플라스미드를 프로메가 DNA 정제계를 사용하여 제조자의 지시에 따라 10개의 콜로니로부터 단리시켰다.이러한 플라스미드는 상술한 충분도 및 NEO 전사와 관련하여 삽입시킨 단편의 상대적인 배향에 따라 NEOSPLA3F 중의 항-CD20 및 NEOSPLA3R 중의 항-CD20이라 불리는 플리-스미드를 포함할 수 있다.
항-CD20 카셋트 삽입 배향의 측정은 NEB 완충액 1 중의 KpnI 및 SpeI(NEB 제품 제1335번) 및 아세테이트화 BSA를 사용하여 하기와 같이 이중 소화시킴으로써 수행하였다; DNA 4 μl, NEB 완충액 (1) 2 μl, Kpn I 1 μl, Spe I 1 μl, BSA 2 μl 및 dH2O 10 μl를 함유하는 혼합물을 형성하였다. 이 혼합물을 37 ℃에서 2시간 동안 소화시킨 후, 0.8% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 크기 분별시켰다. 6개의 독립 플라스미드 단리물 내에서 항-CD20 삽입 배향을 측정한 후, NEOSPLA3F 중의 항-CD20의 배향을 동정한 결과 삽입시킨 서열이 NEO 전사의 방향에 대해 전진 배향이었다.
5515 bp 항-CD20 단편은 SV40 원점, 키메릭성 생쥐 인간 면역글로불린 경쇄 전사성 카셋트, 키메릭성 생쥐 인간 면역글로불린 중쇄 전사성 카셋트, 및 쥐의 디히드로폴레이트 환원효소 전사성 카셋트를 함유한다(제4도 참조).
dH2O 14 μl, NEOSPLA3F 중의 항-CD20 1 μl, 10x소화 완충액 1(NEB, 효소가 제공됨) 2 μl, 10x아세틸화 BSA(NEB, Kpn I 효소가 제공됨) 2 μl, Kpn 1 효소 1 μl와 Stu I 효소(각각, NEB 제품 번호 제142S번과 제187S번)를 함유하는 혼합물을 형성함으로써 NEOSPLA3F 중의 항-CD20을 Kpn I과 Stu I로 이중 소화시켰다. 이 혼합물을 37 ℃에서 3시간 동안 소화시킨 후, 0.8% 아가로오스 겔 전기영동에 의해크기 분별시키고, 9368 염기쌍에 이동한 바람직한 단편을 GlassMAXTM방법에 의해 단리시켰다.
DNA의 PCR 단편을 TCAE 5.2로부터 발생시켰다. 하기 2개의 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 PCR 반응에 사용하였다.
서열 확인 번호 제16번의 밑줄친 부분은 Kpn I 부위를 나타내고, 서열 확인 번호 제17번 중의 밑줄친 부분은 Stu I 부위를 나타낸다.
PCR 생성물을 Kpn I 및 Stu I로 소화시킨 후, NEOSPLA3F 중에 제조된 항-CD20으로 라이게이션시켰다.
하기한 바와 같이, 627 bp 단편을 NEOSPLA3F 중에 제조된 항-CD20으로 라이게이션시켰다: NEOSPLA3F 중의 항-CD20 2 μl, SDS 1 μl, tRNA(Sigma) 1 μl, 3M 아세트산나트륨(pH 4.5) 11 μl를 혼합하였다. 혼합물을 페놀/클로로포름 이소아밀로 추출한 후, 에탄올(빙냉) 270 μl를 첨가함으로써 DNA를 침전시키고, 이것을 13,000 rpm에서 10분 동안 스피닝시켰다. 70% ETOH로 세척한 후, DNA를 TE 16 μl에 재현탁시키고, PCR 단편 DNA 10 μl를 dH2O 6 μl, NEOSPLA3F 벡터 DNA 중의 절단한 항-CD20 1 μl, 10x라이게이션 완충액(프로메가, 효소가 제공됨) 2 μl, 및T-4 DNA 리가아제(프로메가 제품)와 혼합시킨 후, 14 ℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 라이게이션시킨 DNA를 pBluescript SK (-) 벡터 DNA의 제조를 위해 상기 설명한 바와 같은 에탄올 침전에 의해 수집하였다.
재현탁시킨 라이게이션된 DNA 10 μl를 대장균 XL-1 BlueTM(스트라타겐)으로 제조자의 지시에 따라 변형시켰다. 10개의 세균 콜로니로 암피실린(50 ㎍/ml; Sigma 제품 제A-9393번)을 포함하는 LB 배양액(지브코 비알엘 제품 제M27950B번)을 접종하였다. 플라스미드를 프로메가 DNA 정제계(제품 제PR-A7100번)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 10개의 콜로니로부터 단리시켰다. 이러한 플라스미드는 상술한 충분도에 따라 GKNEOSPLA3F 중의 항-CD20라 불리는 플라스미드를 포함할 수 있다. (GKNEOSPLA3F 대 NEOSPLA3F의 상이한 영역의 서열 측정을 기준으로 확인하였다.)
신규 플라스미드는 NEOSPLA3F 중의 항-CD20과 상이하며, NEO 유전자에 대한 그의 코작 서열은 GKNEOSPLA3F 중의 항-CD20에 대해서는
이다.
TCAE 5 벡터(공통 코작을 갖는 NEO 포함); ANEX 2 벡터(완전 손상된 코작 및프레임에서 벗어난 상류 출발 서열을 갖는 NEO 포함); NEOPLA3F(항-CD20을 NEO의 아미노산 51과 52 사이에 인공 인트론 삽입 영역을 거쳐 삽입시켰고, NEO는 완전 손상된 코작 및 프레임에서 벗어난 상류 출발 서열을 가짐) 및 GKNEOSPLA3F(항-CD20을 NEO의 아미노산 51과 52 사이에 인공 인트론 삽입 영역을 거쳐 삽입시켰고, NEO는 공통 코작를 가짐) 중의 항-CD20의 발현을 비교 분석하였다.
각 플라스미드(TCAE 5 및 ANEX 2 중의 항-CD20은 Not I로, NEOSPLA3F 중의 항-CD20은 Pac I로, GKNEOSPLA3F 중의 항-CD20은 Pac I 및 Kpn I로 소화시킴) 25 ㎍을 4x106CHO 세포로 전기천공하였고, 이러한 소화는 세균 중의 플라스미드를 성장시키는데 사용되는 DNA로부터 포유동물 세포에 발현된 유전자를 분리하는데 이용하였다. 소화시킨 후, DNA를 EtOH 침전시키고, 이들을 건조시키고, DNA를 농도 1 ㎍/μl에서 멸균 TE에 재현탁시켰다. 전기천공 조건은 230 볼트를 사용하고, 전기천공시킨 후 세포 및 DNA의 혼합물을 멸균된 일회용 전기천공 큐벳중 및 실온에서 10분 동안 방치시켰다는 것을 제외하고는, 실시예 II에 기재된 바와 동일하였다.
전기천공시킨 후, 세포를 표 I에 나타낸 바와 같이 G418 내성 콜로니의 예상 빈도(예비 실험으로부터 유도함, 데이타는 나타내지 않음)를 기준으로 96 웰 플레이트에 평판 배양시켰다.
표 I
비교 발현
(세포에 2일, 5일, 7일, 9일, 12일, 14일, 18일, 22일, 26일, 30일 및 34일에 매질을 함유하는 G418을 공급하였고, 콜로니로부터의 상층액을 면역글로불린 생산에 대해 평가 분석하였으며, 콜로니는 18일, 22일, 26일, 30일 및 34일에 웰 전면에 발생하였다.
제7A 내지 7C도는 히스토그램 결과 및 특정 수준의 발현에서 콜로니의 백분율에 대한 증명을 제공한다.
본 명세서에 제공되는 실시예는 특정 벡터, 완전 손상된 공통 코작 서열, 우성 선별 마커, 전사 카셋트 및(또는) 발현 단백질에 제한되는 것이 아니다. 완전 손상된 공통 코작 및 이들의 용도는 ANEX 1 및 ANEX 2 벡터에만 제한되는 것이 아니다. 유사하게, 바람직하게 완전 손상된 코작 서열 및 벡터는 실질적으로 또는 은연중에 허용된 것은 결코 아니고, 이들은 단지 본 발명자가 부여한 서열 및 벡터이다. 본 발명자는 응용 특허법하에 완전히 보호받는다. 완전 손상된 코작 서열에 혼입되는 바람직한 벡터는 본 발명은 이러한 벡터를 포함하는 플라스미드를 지정함으로써 이러한 벡터의 청구 목적상 ANEX 1 및 ANEX 2에서 동정하였고, 항-CD20은 특허 방법상 미생물의 기탁을 국제적으로 승인하기 위한 부다페스트 조약의 보호하에 American Type Cμlture Collection(ATCC, 미합중국 20852, 메릴랜드주, 로크빌, 파크론 드라이브 12301 소재)에 기탁하였다. 플라스미드를 1992년 11월 9일에 ATCC가 시험하였고, 상기 일자에 생존력이 있음을 측정하였다. ATCC는 이 플라스미드를 기탁 목적상 하기와 같은 ATCC 기탁 번호, 69120[TCAE 12(ANEX 1) 중의 항-CD20] 및 69118[ANEX 2(G1,K) 중의 항-CD20]를 지정하였고, 이 플라스미드를 대장균으로 변형시켰다.
본 발명을 그의 특정 바람직한 실시태양과 관련하여 상당히 상세하게 설명하였지만, 본 발명의 교시 영역 내의 다른 실시태양도 가능하다. 따라서, 명세서 또는 첨부된 특허 청구의 범위 중 어느 것도 명세서에 함유된 특정 실시태양의 설명으로 제한되는 것은 아니고, 그렇게 이해되어서도 안된다.

Claims (21)

  1. 번역 개시 시작부위가 T(-3) CCATGC(+1) TT인, 포유동물 단백질을 코딩하는 유전자가 포함되어 있는 인공 인트론 삽입 영역을 포함하는 1개 이상의 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 우성 선별 마커를 포함하는, 재조합 데옥시리보핵산 기술에 의해 상기 포유동물 단백질을 발현시키기 위한 발현 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 번역 개시 시작부위 서열이 2차 구조 내에 위치하는 발현 벡터.
  3. 제1항에 있어서, 상기 번역 개시 시작부위 서열이 상기 시작부위의 ATG 개시 코돈으로부터 약 1000개의 뉴글레오티드 이내에 프레임외(out-of-frame) 개시 코돈을 1개 이상 추가로 포함하되, 단 상기 1000개의 뉴클레오티드 내에 프레임내(in-frame) 중지 코돈은 위치하지 않는 발현 벡터.
  4. 제1항에 있어서, 상기 번역 개시 시작부위 서열이 상기 시작부위의 ATG 개시 코돈으로부터 약 350개의 뉴클레오티드 이내에 프레임외 개시 코돈을 1개 이상 추가로 포함하되, 단 상기 350개의 뉴클레오티드 내에 프레임내 중지 코돈은 위치하지 않는 발현 벡터.
  5. 제1항에 있어서, 상기 번역 개시 시작부위 서열이 상기 시작부위의 ATG 개시 코돈으로부터 약 50개의 뉴클레오티드 이내에 프레임외 개시 코돈을 1개 이상 추가로 포함하되, 단 상기 50개의 뉴클레오티드 내에 프레임내 중지 코돈은 위치하지 않는 발현 벡터.
  6. 제3, 4 또는 5항에 있어서, 상기 프레임외 개시 코돈이 공통 코작(kozak) 서열의 일부인 발현 벡터.
  7. 제5항에 있어서, 상기 프레임외 개시 코돈 및 상기 번역 개시 시작부위 서열이 모두 2차 구조의 일부로서 포함되는 발현 벡터.
  8. 제3,4 또는 5항에 있어서, 상기 번역 개시 시작부위 서열은 2차 구조의 일부이고, 상기 프레임외 개시 코돈은 상기 2차 구조의 일부가 아닌 발현 벡터.
  9. 번역 개시 시작부위가 T(-3) CCATGC(+1) TT인 핵산 서열에 의해 코딩되는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 우성 선별 마커.
  10. 제9항에 있어서, 상기 번역 개시 시작부위 서열이 2차 구조 내에 위치하는 우성 선별 마커.
  11. 제9항에 있어서, 상기 번역 개시 시작부위 서열이 상기 시작부위의 ATG 개시 코돈으로부터 약 1000개의 뉴클레오티드 이내에 프레임외 개시 코돈을 1개 이상 추가로 포함하되, 상기 1000개의 뉴클레오티드 내에 프레임내 중지 코돈은 위치하지 않는 우성 선별 마커.
  12. 제9항에 있어서, 상기번역 개시 시작부위 서열이 상기 시작부위의 ATG 개시 코돈으로부터 약 350개의 뉴클레오티드 이내에 프레임외 개시 코돈을 1개 이상 추가로 포함하되, 상기 350개의 뉴클레오티드 내에 프레임내 중지 코돈은 위치하지 않는 우성 선별 마커.
  13. 제9항에 있어서, 상기 번역 개시 시작부위 서열이 상기 시작부위의 ATG 개시 코돈으로부터 약 50개의 뉴클레오티드 이내에 프레임외 개시 코돈을 1개 이상 추가로 포함하되, 상기 50개의 뉴클레오티드 내에 프레임내 중지 코돈은 위치하지 않는 우성 선별 마커.
  14. 제11,12 또는 13항에 있어서, 상기 프레임외 개시 코돈이 공통 코작 서열의 일부인 우성 선별 마커.
  15. 제13항에 있어서, 상기 프레임외 개시 코돈 및 상기 번역 개시 시작부위 서열이 모두 2차 구조의 일부로서 포함되는 우성 선별 마커.
  16. 제11,12 또는 13항에 있어서, 상기 번역 개시 시작부위 서열은 2차 구조의 일부이고, 상기 프레임외 개시 코돈은 상기 2차 구조의 일부가 아닌 우성 선별 마커.
  17. ANEX 1 (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기타 번호 69120 내에 포함됨) 및 ANEX 2 (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 69118 내에 포함됨)로 이루어진 군으로부터 선택된 발현 벡터.
  18. 제1항 기재의 발현 벡터를 포함하는 플라스미드.
  19. 제18항에 있어서, 포유동물 숙주 세포의 세포 데옥시리보핵산 내에 통합된 플라스미드.
  20. 제19항에 에 있어서, 상기 숙주 세포가 DG44, DXB11, CV1, COS, R1610, SP2/0, P3x633-Ag8.653, BFA-1c1BPT, RAJI 및 293으로 이루어진 군으로부터 선택된 플라스미드.
  21. 제9항에 있어서, 인공 인트론 삽입 영역을 추가로 포함하는 우성 선별 마커.
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