CN114072173A - 以联合施用il-6抑制剂和ccr2抑制剂为特征的泌尿系统癌症治疗剂 - Google Patents
以联合施用il-6抑制剂和ccr2抑制剂为特征的泌尿系统癌症治疗剂 Download PDFInfo
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Abstract
提供了用于泌尿系统癌症，特别是具有赖氨酸(K)特异性脱甲基酶6A(KDM6A)功能降低的泌尿系统癌症的治疗剂和治疗方法，所述治疗剂和方法的特征在于抑制IL‑6活性和CCR2/CCL2活性两者。
Description
技术领域
本发明涉及用于泌尿系统癌症，特别是具有赖氨酸(K)-特异性脱甲基酶6A(KDM6A)功能降低的泌尿系统癌症的治疗剂，该药物的特征在于联合施用IL-6抑制剂和CCR2抑制剂。
背景技术
膀胱癌是尿路上皮细胞的恶性肿瘤，随着人口老龄化其发病率呈上升趋势。早期浅表癌可通过膀胱肿瘤的经尿道切除术治疗，但其特征是容易复发。此外，晚期肌肉浸润性癌症(muscle invasive cancer)和转移性病例的预后并未得到改善，需要基于分子病理学的新治疗方法。
UTX(广泛转录的三角形四肽重复X染色体(ubiquitously transcribedtetratricopeptide repeat X chromosome)，也称为赖氨酸(K)特异性脱甲基酶6A(KDM6A))是组蛋白H3K27的脱甲基酶，其功能丧失突变已在各种人类肿瘤中报道(非专利文献1)。在突变中，膀胱癌最为常见，前列腺癌和阴茎癌的比例也很高，UTX功能缺陷被认为与泌尿领域的肿瘤发病密切相关(非专利文献2和非专利文献3)。
至于显示Utx参与膀胱癌发病的文章，存在着使用携带Utx突变的人膀胱癌细胞系移植到免疫缺陷小鼠中的实验模型的报道(非专利文献4)；然而，这是使用培养细胞进行异种移植的结果，并且很难说它是反映体内Utx功能缺陷的模型。迄今为止，还没有报道关注于膀胱癌并使用遗传修饰技术对膀胱特异性Utx缺陷(UtxΔ/Δ)小鼠进行生产和分析的研究。
IL-6是一种细胞因子，也称为B细胞刺激因子2(BSF2)或干扰素β2。它被发现是参与B淋巴细胞活化的分化因子(非专利文献5)，后来被发现是一种影响各种细胞功能的多功能细胞因子(非专利文献6)。已有报道IL-6诱导T淋巴细胞的成熟(非专利文献7)。
CCL2是一种与先天免疫、Th2效应反应、CD4+T细胞分化等相关的趋化因子，也称为CC-趋化因子配体2、单核细胞趋化蛋白1和MCP-1(非专利文献8)。已知CCR2为CCL2的受体。
迄今为止，已有报道在体外阻断在小鼠膀胱癌MB49细胞悬浮培养后获得的成球细胞(sphere-forming cell)(sMB49)中的IL-6，导致成球MB49细胞的浸润能力降低。(非专利文献9)。
此外，已有报道对患有侵袭性乳腺癌的小鼠施用抗IL-6抗体和抗CCL2抗体可抑制癌症浸润并延长存活时间(非专利文献10)。
然而，IL-6抑制剂和CCR2抑制剂联合使用对膀胱癌的治疗效果尚未见报道。
[引用列表]
[非专利文献]
[非专利文献1]van Haaften等人Nature Genetics，第41卷，第5期，2009
[非专利文献2]Van der Meulen等人Epigenetics，第9卷，第5期，2014
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[非专利文献9]Annals of Surgical Oncology，2018年11月，第25卷，第12期，第3518-3526页
[非专利文献10]Nature，第515卷，6，2014，130-133
发明内容
技术问题
本发明是鉴于上述情况而完成的。本发明的一个目的是提供用于泌尿系统癌症的新型治疗剂。
解决方案
本发明人进行了专门研究以解决上述问题。结果，本发明人发现对于泌尿系统癌症，特别是具有赖氨酸(K)特异性脱甲基酶6A(KDM6A)功能降低的泌尿系统癌症，可以通过抑制CCL2/CCR2活性和IL-6活性两者来显著抑制肿瘤生长。
本发明基于这样的发现，具体包括以下内容。
[1]一种包含IL-6抑制剂的用于泌尿系统癌症的治疗剂和/或预防剂，其中所述药剂用于与CCR2抑制剂联合施用。
[2]一种包含CCR2抑制剂的用于泌尿系统癌症的治疗剂和/或预防剂，其中所述药剂用于与IL-6抑制剂联合施用。
[3]一种用于泌尿系统癌症的治疗剂和/或预防剂，其包含IL-6抑制剂和CCR2抑制剂的组合。
[4][1]至[3]中任一项所述的治疗剂和/或预防剂，其中，所述IL-6抑制剂为抗IL-6抗体或抗IL-6受体抗体。
[5][4]的治疗剂和/或预防剂，其中所述抗IL-6抗体和所述抗IL-6受体抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
[6][1]至[5]中任一项的治疗剂和/或预防剂，其中所述CCR2抑制剂是CCL2抑制剂。
[7][1]至[6]中任一项的治疗剂和/或预防剂，其中所述CCR2抑制剂是抗CCL2抗体或丙帕锗。
[8][7]的治疗剂和/或预防剂，其中所述CCL2抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
[9][1]至[8]中任一项的治疗剂和/或预防剂，其中所述癌症是膀胱癌、前列腺癌或肾癌。
[10][1]至[9]中任一项的治疗剂和/或预防剂，其中所述癌症是膀胱癌。
[11][1]至[10]中任一项的治疗剂和/或预防剂，其中所述癌症是具有降低的赖氨酸(K)特异性脱甲基酶6A(KDM6A)表达或功能的癌症。
[12][1]至[11]中任一项所述的治疗剂和/或预防剂，其中，所述癌症是具有KDM6A基因突变的癌症。
[13][12]的治疗剂和/或预防剂，其中所述KDM6A基因突变是功能丧失突变。
[14][1]至[13]中任一项的治疗剂和/或预防剂，其中所述癌症是具有降低的p53表达或功能的癌症。
[15][1]至[14]中任一项的治疗剂和/或预防剂，其中所述癌症是在p53基因中具有突变的癌症。
[16][1]至[10]中任一项的治疗剂和/或预防剂，其用于施用于被确定具有降低的KDM6A功能、降低的KDM6A表达和/或KDM6A基因突变的个体。
[17][1]至[10]和[16]中任一项的治疗剂和/或预防剂，其用于施用于被确定具有降低的p53表达、降低的p53功能和/或p53基因突变的个体。
本发明还包括以下实施方案。
[18]IL-6抑制剂，其用于与CCR2抑制剂联合治疗和/或预防泌尿系统癌症。
[19]CCR2抑制剂，其用于与IL-6抑制剂联合治疗和/或预防泌尿系统癌症。
[20]IL-6抑制剂和CCR2抑制剂的组合，其用于治疗和/或预防泌尿系统癌症。
[21]一种治疗和/或预防泌尿系统癌症的方法，所述方法包括向个体施用有效量的IL-6抑制剂和向个体施用有效量的CCR2抑制剂。
[22]一种治疗和/或预防泌尿系统癌症的方法，所述方法包括向个体施用有效量的IL-6抑制剂和CCR2抑制剂的组合。
[23]IL-6抑制剂在制造用于泌尿系统癌症的治疗剂和/或预防剂中的用途，所述治疗剂和/或预防剂用于与CCR2抑制剂联合施用。
[24]CCR2抑制剂在制造用于泌尿系统癌症的治疗剂和/或预防剂中的用途，所述治疗剂和/或预防剂用于与IL-6抑制剂联合施用。
[25]IL-6抑制剂和CCR2抑制剂的组合在制造用于泌尿系统癌症的治疗剂和/或预防剂中的用途。
[26][18]至[25]中任一项的抑制剂、组合、治疗方法、预防方法或用途，其中所述IL-6抑制剂是抗IL-6抗体或抗IL-6受体抗体。
[27][26]的抑制剂、组合、治疗方法、预防方法或用途，其中所述抗IL-6抗体和抗IL-6受体抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
[28][18]至[27]中任一项的抑制剂、组合、治疗方法、预防方法或用途，其中所述CCR2抑制剂是CCL2抑制剂。
[29][18]至[27]中任一项的抑制剂、组合、治疗方法、预防方法或用途，其中所述CCR2抑制剂是抗CCL2抗体或丙帕锗。
[30][29]的抑制剂、组合、治疗方法、预防方法或用途，其中所述抗CCL2抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
[31][18]至[30]中任一项的抑制剂、组合、治疗方法、预防方法或用途，其中所述癌症是膀胱癌、前列腺癌或肾癌。
[32][18]至[31]中任一项的抑制剂、组合、治疗方法、预防方法或用途，其中所述癌症是膀胱癌。
[33][18]至[32]中任一项的抑制剂、组合、治疗方法、预防方法或用途，其中所述癌症是具有降低的赖氨酸(K)特异性脱甲基酶6A(KDM6A)表达或功能的癌症。
[34][18]至[33]中任一项的抑制剂、组合、治疗方法、预防方法或用途，其中所述癌症是具有KDM6A基因突变的癌症。
[35][34]的抑制剂、组合、治疗方法、预防方法或用途，其中所述KDM6A基因突变是功能丧失突变。
[36][18]至[35]中任一项的抑制剂、组合、治疗方法、预防方法或用途，其中所述癌症是具有降低的p53表达或功能的癌症。
[37][18]至[36]中任一项的抑制剂、组合、治疗方法、预防方法或用途，其中所述癌症是在p53中具有基因突变的癌症。
[38][18]至[32]中任一项的抑制剂、组合、治疗方法、预防方法或用途，其用于施用于被确定具有降低的KDM6A功能、降低的KDM6A表达和/或KDM6A基因突变的个体。
[39][18]至[32]和[38]中任一项的抑制剂、组合、治疗方法、预防方法或用途，其用于施用于被确定具有降低的p53表达、降低的p53功能和/或p53基因突变的个体。
技术效果
本发明提供用于泌尿系统癌症的新型治疗剂。
附图说明
在图1中，A示出了在施用N-丁基-N-(4-羟丁基)亚硝胺(nitorosamine)(BBN)10周后，对照小鼠(Utx+/+，p53+/-小鼠)和UtxΔ/Δ，p53+/-小鼠的膀胱中正常组织(正常)，发育异常至原位癌(发育异常～CIS)，和浸润到肌肉层的癌症(肌肉浸润性癌症)的比例。图1的B是示出从被施用BBN的UtxΔ/Δ，p53+/-小鼠的膀胱收集的组织切片的苏木精-伊红染色结果的照片。图中的箭头表示浸润到肌肉层的癌症。
图2示出了使用从BBN施用4周的对照Utx+/+小鼠和UtxΔ/Δ小鼠的尿路上皮中提取的RNA，通过KEGG进行的转录组分析和途径分析的结果。在图2中，A是对照小鼠和UtxΔ/Δ小鼠的途径比较结果图，其中显示了与对照小鼠相比在UtxΔ/Δ小鼠中显示表达增强的途径。在图2中，B示出了对照小鼠和UtxΔ/Δ小鼠之间“细胞因子-细胞因子受体相互作用”途径中142个基因表达的比较结果。
图3中，A为使用抗UTX抗体或抗β-肌动蛋白抗体通过蛋白质印迹法分析源自小鼠膀胱癌细胞系MBT2的Utx表达株(EV克隆)和Utx缺陷株(KO克隆)中UTX蛋白表达的结果的照片。在图3中，B是示出在肿瘤移植小鼠中丙帕锗和/或MR16-1的施用时间表的图。图3的C和D是表示将Utx表达株(C)或Utx缺陷株(D)移植入C3H小鼠后得到的肿瘤的肿瘤体积(估计肿瘤体积)和肿瘤重量(肿瘤重量)的图。
具体实施方案
本发明的一个非限制性方面提供用于泌尿系统癌症的治疗剂或预防剂(也表示为用于治疗或预防泌尿系统癌症的药物组合物)和用于泌尿系统癌症的联合疗法，所述药剂和疗法的特征在于抑制IL-6活性和CCR2/CCL2活性两者。在该方面的一个实施方案中，泌尿系统癌症是膀胱癌、前列腺癌、肾癌或阴茎癌。在该方面的一个实施方案中，泌尿系统癌症是具有赖氨酸(K)特异性脱甲基酶6A(KDM6A)表达降低的癌症或具有KDM6A功能降低的癌症，并且任选地，它是在KDM6A基因中具有突变(例如，功能丧失突变)的癌症。在该方面的一个实施方案中，泌尿系统癌症是在p53中具有突变的泌尿系统癌症。在该方面的一个实施方案中，与单独用IL-6抑制剂或CCR2抑制剂治疗相比，联合使用IL-6抑制剂和CCR2抑制剂在治疗或预防泌尿系统癌症中产生协同作用。
在上述方面的一个实施方案中，提供了一种与CCR2抑制剂联合施用的用于泌尿系统癌症的治疗剂或预防剂，所述药剂包含IL-6抑制剂作为活性成分。在该实施方案中，包含IL-6抑制剂的泌尿系统癌症治疗剂或预防剂与CCR2抑制剂同时、分别或依次施用。这些抑制剂的剂型可以相同或不同。例如，两者可以有不同的剂型，每一种剂型都是胃肠外制剂、注射剂、滴注剂和静脉滴注剂中的任意一种但不相同；或者，两者可以具有相同的剂型，为胃肠外制剂、注射剂、滴注剂和静脉滴注剂中的任意一种。该实施方案可以表示为IL-6抑制剂，其用于与CCR2抑制剂联合治疗或预防泌尿系统癌症；一种治疗或预防泌尿系统癌症的方法，所述方法包括施用IL-6抑制剂和施用CCR2抑制剂；或IL-6抑制剂在制造用于与CCR2抑制剂联合施用的用于泌尿系统癌症的治疗剂或预防剂中的用途。
在上述方面的另一个实施方案中，提供了用于与IL-6抑制剂联合施用的用于泌尿系统癌症的治疗剂或预防剂，所述药剂包含CCR2抑制剂作为活性成分。在该实施方案中，包含CCR2抑制剂的用于泌尿系统癌症的治疗剂或预防剂与IL-6抑制剂同时、分别或依次施用。这些抑制剂的剂型可以相同或不同。例如，两者可以有不同的剂型，每一种都是胃肠外制剂、注射剂、滴注剂、静脉滴注剂中的任意一种但不相同；或者，两者可以具有相同的剂型，为胃肠外制剂、注射剂、滴注剂和静脉滴注剂中的任意一种。该实施方案可以表示为CCR2抑制剂，其用于与IL-6抑制剂联合用于治疗或预防泌尿系统癌症；一种治疗或预防泌尿系统癌症的方法，所述方法包括向个体施用有效量的IL-6抑制剂和向个体施用有效量的CCR2抑制剂；CCR2抑制剂在制造用于与IL-6抑制剂联合施用的用于泌尿系统癌症的治疗剂或预防剂中的用途。
在上述方面的其他实施方案中，提供了一种用于泌尿系统癌症的治疗剂或预防剂，所述药剂包含IL-6抑制剂和CCR2抑制剂的组合作为活性成分。该实施方案可以表示为IL-6抑制剂和CCR2抑制剂的组合，其用于治疗或预防泌尿系统癌症；一种治疗或预防泌尿系统癌症的方法，所述方法包括向个体施用有效量的IL-6抑制剂和CCR2抑制剂的组合；IL-6抑制剂和CCR2抑制剂的组合在制造用于泌尿系统癌症的治疗剂或预防剂中的用途。
本发明的“IL-6抑制剂”是阻断IL-6的信号转导，抑制IL-6的生物学活性的物质。IL-6抑制剂优选为对与IL-6、IL-6受体和gp130中的任一种结合具有抑制作用的物质。
本发明的IL-6抑制剂的示例包括但不特别限于抗IL-6抗体、抗IL-6受体抗体、抗gp130抗体、IL-6变体、可溶性IL-6受体变体、或IL-6或IL-6受体的部分肽，以及显示类似活性的低分子量物质。本发明的IL-6抑制剂的示例可以优选地是IL-6受体识别抗体。
IL-6通过细胞上的两种蛋白质传递其生物活性。其中之一是IL-6受体，它是一种与IL-6结合的配体结合蛋白，其分子量约为80kD(非专利文献4和5)。IL-6受体以可溶性IL-6受体形式存在，除了在细胞膜上表达的膜结合形式以外，主要由其胞外区组成并穿透细胞膜。
另一种是非配体结合膜蛋白gp130，其分子量约为130kDa，参与信号转导。IL-6的生物学活性通过IL-6和IL-6受体形成IL-6/IL-6受体复合物，随后该复合物与gp130结合而被传递到细胞中(Taga,T.等人，Cell(1989)58，573-581)。
本发明中的“CCR2抑制剂”是阻断CCL2、CCL7或CCL8的信号转导的物质；抑制CCL2、CCL7和/或CCL8的生物活性；并且包括CCL2抑制剂、CCL7抑制剂和CCL8抑制剂。本发明中的“CCL2抑制剂”是阻断CCL2信号转导，并阻断CCL2生物活性的物质。
本发明的CCL2抑制剂的示例包括但不特别限于抗CCL2抗体、针对CCR2(其为CCL2的受体)的抗体(抗CCR2抗体)和与CCR2结合并阻断CCL2的信号转导的低分子量物质。本发明的CCL2抑制剂的示例可以优选是抗CCL2抗体和结合CCR2并阻断CCL2的信号转导的低分子量物质(例如丙帕锗)。
CCL2是一种与先天免疫、Th2效应反应、CD4+T细胞分化等相关的趋化因子，也称为CC-趋化因子配体2、单核细胞趋化蛋白1和MCP-1(Paul,WE,Fundamental Immunology，第5版，Lippincott Williams&Wilkins，(Philadelphia，2003)第801-840页)。已知CCL2通过趋化因子受体CCR2结合并转导信号。CCR2是一种在多种细胞(包括单核细胞、T细胞、B细胞和嗜碱性粒细胞)上表达的7跨膜G蛋白偶联受体。
本发明的抗体的来源没有特别限定，但是优选哺乳动物，更优选人。
本发明中使用的抗IL-6抗体、抗IL-6受体抗体、抗gp130抗体、抗CCL2抗体和抗CCR2抗体可以使用已知方法作为多克隆抗体或单克隆抗体获得。对于本发明中使用的抗IL-6抗体、抗IL-6受体抗体、抗gp130抗体、抗CCL2抗体和抗CCR2抗体，特别优选来源于哺乳动物的单克隆抗体。来源于哺乳动物的单克隆抗体包括由杂交瘤产生的那些和由使用基因工程方法用含有抗体基因的表达载体转化的宿主产生的那些。通过与IL-6结合，这种抗IL-6抗体抑制IL-6与IL-6受体的结合，并阻断IL-6生物活性向细胞中的转导。
这种IL-6抗体的示例包括MH166抗体(Matsuda，T.等人，Eur.J.Immunol.(1988)18,951-956)和SK2抗体(Sato，K.等人，The abstracts of the 21st Annual Meeting ofthe Japanese Society for Immunology(1991)21，166)。作为本发明中使用的各种抗体的一个示例，以下描述抗IL-6抗体的制造方法等。基本上，可以使用相同的步骤和已知的技术生产其他抗体(也可以参考日本专利号9067399、JP-A(公开)H05276986、WO03048083、US20040047860、US20913003和WO2006/125202的教导来生产抗CCL2抗体)。
基本上，产生抗IL-6抗体的杂交瘤可以使用如下已知技术产生。具体地，可以通过使用IL-6作为致敏性抗原通过常规免疫方法进行免疫，通过常规细胞融合方法将得到的免疫细胞与已知亲本细胞融合，然后使用常规筛选方法筛选产生单克隆抗体的细胞来产生杂交瘤。
具体而言，可以如下产生抗IL-6抗体。用作用于获得抗体的致敏性抗原的人IL-6可以通过，例如，使用在Eur.J.Biochem(1987)168，543-550；J.Immunol.(1988)140，1534-1541；和Agr.Biol.Chem.(1990)54，2685-2688中公开的IL-6基因/氨基酸序列来获得。
在用插入有IL-6基因序列的已知表达载体系统转化合适的宿主细胞后，使用已知方法从宿主细胞内部或培养上清液中纯化靶IL-6蛋白。这种纯化的IL-6蛋白可以用作致敏性抗原。或者，IL-6蛋白和另一种蛋白的融合蛋白可以用作致敏性抗原。
本发明中使用的抗IL-6受体抗体可以使用已知方法作为多克隆抗体或单克隆抗体获得。对于本发明中使用的抗IL-6受体抗体，特别优选来源于哺乳动物的单克隆抗体。来源于哺乳动物的单克隆抗体包括由杂交瘤产生的那些和由使用基因工程方法用含有抗体基因的表达载体转化的宿主产生的那些。通过与IL-6受体结合，该抗体抑制IL-6与IL-6受体的结合，并阻断IL-6生物活性转导到细胞中。
这种抗体的示例包括MR16-1抗体(Tamura,T.等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90,11924-11928)、PM-1抗体(Hirata,Y.等人，J.Immunol.(1989)143,2900-2906)、AUK12-20抗体、AUK64-7抗体和AUK146-15抗体(国际专利申请公开号WO 92-19759)。其中，PM-1抗体作为优选的针对人IL-6受体的单克隆抗体的示例列出，并且MR16-1抗体作为优选的针对小鼠IL-6受体的单克隆抗体的示例列出。
基本上，产生抗IL-6受体单克隆抗体的杂交瘤可以使用以下已知技术产生。具体而言，可以通过使用IL-6受体作为致敏性抗原通过常规免疫方法进行免疫，通过常规细胞融合方法将得到的免疫细胞与已知亲本细胞融合，然后使用常规筛选方法筛选产生单克隆抗体的细胞来产生杂交瘤。
具体而言，可以如下制备抗IL-6受体抗体。用作用于获得抗体的致敏性抗原的人IL-6受体或小鼠IL-6受体可以通过，例如使用分别在欧洲专利申请公开号EP 325474和日本专利申请公开号(JP-A)H03-155795(未审查、公开的日本专利申请)中公开的IL-6受体基因和/或氨基酸序列来获得。
IL-6受体蛋白有两种类型：一种在细胞膜上表达，另一种从细胞膜分离(可溶性IL-6受体)(Yasukawa,K.等人，J.Biochem.(1990)108，673-676)。可溶性IL-6受体基本上由结合在细胞膜上的IL-6受体的胞外区组成，并且与膜结合型IL-6受体的不同之处在于它没有跨膜区或既没有跨膜区又没有胞内区。任何IL-6受体都可以用作IL-6受体蛋白，只要它可以用作生产本发明中待使用的抗IL-6受体抗体的致敏性抗原即可。
在用插入有IL-6受体基因序列的已知表达载体系统转化合适的宿主细胞后，使用已知方法从宿主细胞内部或从培养上清液中纯化靶IL-6受体蛋白。这种纯化的IL-6受体蛋白可以用作致敏性抗原。或者，表达IL-6受体或IL-6受体蛋白与另一种蛋白的融合蛋白的细胞可以用作致敏性抗原。
本发明中使用的抗gp130抗体可以使用已知方法作为多克隆抗体或单克隆抗体获得。对于本发明中使用的抗gp130抗体，特别优选来源于哺乳动物的单克隆抗体。来源于哺乳动物的单克隆抗体包括由杂交瘤产生的那些和由使用基因工程方法用含有抗体基因的表达载体转化的宿主产生的那些。通过与gp130结合，该抗体抑制IL-6/IL-6受体复合物与gp130的结合，并阻断IL-6生物活性转导到细胞中。
这种抗体的示例包括AM64抗体(JP-A(公开)H03-219894)、4B11和2H4抗体(US5571513)，以及B-S12和B-P8抗体(JP-A(公开)H08-291199))。
基本上，产生抗gp130单克隆抗体的杂交瘤可以使用以下已知技术产生。具体而言，可以通过使用gp130作为致敏性抗原通过常规免疫方法进行免疫，通过常规细胞融合方法将得到的免疫细胞与已知亲本细胞融合，然后使用常规方法筛选产生单克隆抗体的细胞来产生杂交瘤。
具体而言，单克隆抗体可以如下产生。例如，用作获得抗体的致敏性抗原的gp130可以通过使用欧洲专利申请公开号EP 411946中公开的gp130基因和/或氨基酸序列来获得。
在用插入有gp130基因序列的已知表达载体系统转化合适的宿主细胞后，使用已知方法从宿主细胞内部或从培养上清液中纯化靶gp130蛋白。这种纯化的gp130蛋白可以用作致敏性抗原。或者，gp130表达细胞或gp130蛋白与另一种蛋白的融合蛋白可用作致敏性抗原。
用致敏性抗原免疫的哺乳动物没有特别限制，但优选考虑与用于细胞融合的亲本细胞的相容性来选择。通常，使用啮齿动物，例如小鼠、大鼠和仓鼠。
根据已知方法用致敏性抗原免疫动物。通常，通过例如将致敏性抗原腹膜内或皮下注射到哺乳动物进行免疫。具体而言，优选将致敏性抗原在磷酸盐缓冲盐水(PBS)、生理盐水等中稀释或悬浮至适当体积，并根据需要将其与适量的常规佐剂(例如弗氏完全佐剂)混合并乳化，然后每4小时至21天多次施用于哺乳动物。也可以使用合适的载体与致敏性抗原一起进行免疫。
在以这种方式对哺乳动物进行免疫，并确认所需抗体的血清水平已增加后，从哺乳动物中取出免疫细胞并进行细胞融合。特别优选脾细胞作为进行细胞融合的免疫细胞。
来自哺乳动物的骨髓瘤细胞用作与免疫细胞融合的亲本细胞。迄今为止，各种已知的细胞系，例如P3X63Ag8.653(Kearney,JF等人，J.Immunol(1979)123，1548-1550)、P3X63Ag8U.1(Current Topics inMicrobiology and Immunology(1978)81，1-7)、NS-1(Kohler,G.和Milstein,C.,Eur.J.Immunol.(1976)6,511-519)、MPC-11(Margulies,DH等人，Cell(1976)8,405-415)、SP2/0(Shulman,M.等人，Nature(1978)276,269-270)、F0(deSt.Groth,SF等人，J.Immunol.Methods(1980)35,1-21)、S194(Trowbridge,IS,J.Exp.Med.(1978)148,313-323)和R210(Galfre,G.等人，Nature(1979)277,131-133)是适当使用的。
基本上，上述免疫细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合可以根据已知方法，例如Milstein等人(Kohler,G.和Milstein,C.,Methods Enzymol.(1981)73,3-46)的方法进行。
更具体地，细胞融合例如在细胞融合促进剂的存在下在常规营养培养基中进行。例如，使用聚乙二醇(PEG)或仙台病毒(HVJ)作为融合促进剂，如果需要，还可以加入诸如二甲基亚砜的佐剂以提高融合效率。
所使用的免疫细胞与骨髓瘤细胞的比例优选为例如对于每个骨髓瘤细胞1至10个免疫细胞。用于细胞融合的培养基是例如适用于骨髓瘤细胞系增殖的RPMI1640或MEM培养基。也可以使用用于此类细胞培养的其他常规培养基。此外，还可以组合使用血清补充剂，例如胎牛血清(FCS)。
对于细胞融合，通过将预定量的上述免疫细胞和骨髓瘤细胞在上述培养基中彻底混合，加入预热至约37℃，通常浓度为30％至60％(w/v)的PEG溶液(例如，具有平均分子量约1,000至6,000的PEG溶液)然后将它们混合来形成目标融合细胞(杂交瘤)。然后，通过重复依次加入适当的培养基和离心除去上清液的操作，可以除去不适合杂交瘤生长的细胞融合剂等。
杂交瘤是通过在通用选择培养基，例如HAT培养基(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养基)中培养来选择的。在HAT培养基中培养持续足够长的时间，通常从几天到几周，以杀死目标杂交瘤以外的细胞(未融合细胞)。然后，执行标准的有限稀释方法来筛选和克隆产生目标抗体的杂交瘤。
除了通过用抗原免疫非人动物获得杂交瘤外，还可以通过用所需抗原蛋白或抗原表达细胞体外致敏人淋巴细胞并将致敏的B淋巴细胞与诸如U266的人骨髓瘤细胞融合(参见日本专利申请公开号(JP-B)H01-59878(已审查、已批准的日本专利申请公开待异议))来获得对所需抗原或抗原表达细胞具有结合活性的所需人抗体。此外，可以将抗原或抗原表达细胞施用于具有人抗体基因库(a repertoire of human antibody genes)的转基因动物，然后可以按照上述方法获得所需的人抗体(参见，国际专利申请公开号WO 93/12227、WO92/03918、WO 94/02602、WO 94/25585、WO 96/34096和WO 96/33735)。
如此制备的产生单克隆抗体的杂交瘤可以在常规培养基中继代培养并在液氮中长期保存。
为了从杂交瘤中获得单克隆抗体，可以采用以下方法：按照常规方法培养杂交瘤并以培养上清液的形式获得抗体或通过将它们施用于相容的哺乳动物来增殖杂交瘤并从腹水中获得抗体；等等。前者方法适用于获得高纯度抗体，后者方法适用于大规模抗体生产。
例如，可以通过JP-A(公开)H03-139293中公开的方法制备产生抗IL-6受体抗体的杂交瘤。这样的制备可以通过将产生PM-1抗体的杂交瘤注射到BALB/c小鼠的腹腔中，获得腹水，然后从腹水中纯化PM-1抗体来进行；或通过在适当的培养基(例如含有10％胎牛血清和5％BM-Condimed H1的RPMI 1640培养基(Boehringer Mannheim)；杂交瘤SFM培养基(GIBCO-BRL)；或PFHM-II培养基(GIBCO-BRL))中培养杂交瘤，然后从培养上清液中纯化PM-1抗体来进行。
重组抗体可用作本发明的单克隆抗体，其中重组抗体是使用基因重组技术通过从杂交瘤克隆抗体基因，将基因插入合适的载体，然后将载体引入宿主而产生的(参见，例如，Borrebaeck,CAK和Larrick,JW，THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES，由MACMILLANPUBLISHERS LTD在英国出版，1990)。
更具体地说，编码抗体可变(V)区的mRNA从产生目标抗体的细胞例如杂交瘤中分离。可以通过根据已知方法，例如胍超速离心法(Chirgwin,JM等人，Biochemistry(1979)18,5294-5299)和AGPC方法(Chomczynski,P.等人，Anal.Biochem.(1987)162,156-159)制备总RNA并使用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)等制备mRNA来分离mRNA。或者，可以使用QuickPrep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)直接制备mRNA。
使用逆转录酶从获得的mRNA合成抗体V区cDNA。可以使用AMV ReverseTranscriptase First-strand cDNA Synthesis Kit等合成cDNA。此外，为了合成和扩增cDNA，可以使用利用5'-Ampli FINDER RACE Kit(Clontech)的5'-RACE方法(Frohman,MA等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1988)85,8998-9002；Belyavsky,A.等人，Nucleic AcidsRes.(1989)17,2919-2932)和PCR。从获得的PCR产物中纯化目标DNA片段，然后与载体DNA连接。然后，使用上述方法制备重组载体，并引入大肠杆菌(Escherichia coli)等中，然后选择其菌落以制备所需的重组载体。目标DNA的碱基序列通过诸如双脱氧法的已知方法进行确认。
当获得编码目标抗体的V区的DNA时，将该DNA与编码所需抗体的恒定区(C区)的DNA连接，并插入到表达载体中。或者，可以将编码抗体V区的DNA插入包含抗体C区DNA的表达载体中。
如下所述，为了生产本发明中使用的抗体，将抗体基因插入到表达载体中，使其在诸如增强子和启动子的表达调控区的控制下表达。然后，可以通过用该表达载体转化宿主细胞来表达抗体。
在本发明中，例如，可以使用人工修饰的重组抗体，例如嵌合抗体、人源化抗体或人抗体，例如以降低对人的异种抗原性(heteroantigenicity)。这些修饰抗体可以使用已知方法制备。
嵌合抗体可以通过将编码如上获得的抗体V区的DNA与编码人抗体C区的DNA连接，将其插入表达载体中，并将该载体引入宿主以产生嵌合抗体来获得(参见，欧洲专利申请公开号EP 125023；国际专利申请公开号WO 92-19759)。该已知方法可用于获得对本发明有用的嵌合抗体。
人源化抗体也称为重构(reshaped)人抗体或制成人型抗体。它们是通过将来自非人类哺乳动物(例如，小鼠)的抗体的互补决定区(CDR)移植到人抗体的CDR中来产生的。这种基因重组的一般方法也是已知的(参见欧洲专利申请公开号EP125023、国际专利申请公开号WO 92-19759)。
更具体地，设计用于将小鼠抗体的CDR与人抗体的构架区(FR)连接的DNA序列是通过PCR从所产生的以在其末端包含重叠部分的几种寡核苷酸合成的。将得到的DNA与编码人抗体C区的DNA连接，插入表达载体，将表达载体引入宿主，以产生人源化抗体(参见欧洲专利申请公开号EP 239400，国际专利申请公开号WO 92-19759)。
选择通过CDR待连接的人抗体FR，使得CDR形成令人满意的抗原结合位点。抗体可变区的构架区内的氨基酸可根据需要进行置换，以便重构人抗体的CDR形成适当的抗原结合位点(Sato,K.等人，Cancer Res.(1993)53,851-856)。
人抗体C区用于嵌合和人源化抗体。人抗体C区的示例包括Cγ，并且例如可以使用Cγ1、Cγ2、Cγ3或Cγ4。此外，为了提高抗体的稳定性或其产量，可以修饰人抗体C区。
嵌合抗体由来源于非人类哺乳动物的抗体的可变区和来源于人抗体的C区组成；人源化抗体由来源于非人类哺乳动物的抗体的CDR和来源于人抗体的构架区和C区组成。它们在人体内的抗原性降低，因此它们可用作用于本发明的抗体。
用于本发明的抗IL-6受体抗体的人源化抗体的优选具体示例包括人源化PM-1抗体(参见，国际专利申请公开号WO 92-19759)。
此外，除了上述获得人抗体的方法之外，使用人抗体文库通过淘选获得人抗体的技术也是已知的。例如，人抗体的可变区可以通过噬菌体展示法在噬菌体表面表达为单链抗体(scFv)，然后可以选择抗原结合噬菌体。通过分析所选噬菌体的基因，可以确定编码与抗原结合的人抗体可变区的DNA序列。一旦揭示了与抗原结合的scFv的DNA序列，就可以制备包含该序列的合适的表达载体以获得人抗体。这些方法是已知的，并且可以使用公开文本WO 92/01047、WO 92/20791、WO93/06213、WO 93/11236、WO 93/19172、WO 95/01438和WO95/15388作为参考。
如上所述构建的抗体基因可以根据已知方法表达。当使用哺乳动物细胞时，可以通过使用其中将常用的有效启动子基因、待表达的抗体基因和抗体基因3'侧(下游)的polyA信号可操作地连接在一起的DNA或通过使用包含所述DNA的载体来表达抗体基因。启动子/增强子的示例包括人巨细胞病毒即时早期启动子/增强子。
此外，可用于表达用于本发明的抗体的其他启动子/增强子包括来自逆转录病毒、多瘤病毒、腺病毒、猿猴病毒40(SV40)等的病毒启动子/增强子；和哺乳动物细胞来源的启动子/增强子，例如人延伸因子1α(HEF1α)。
该表达可以很容易地执行，例如，当使用SV40启动子/增强子时按照Mulligan等人(Mulligan,R.C.等人，Nature(1979)277,108-114)的方法进行，或当使用HEF1α启动子/增强子时，按照Mizushima等人(Mizushima,S.和Nagata S.,Nucleic Acids Res.(1990)18,5322)的方法进行。
当使用大肠杆菌时，可以通过将常用的有效启动子基因、抗体分泌信号序列和待表达的抗体基因可操作地连接来表达抗体基因。启动子的示例包括lacZ启动子和araB启动子。可以根据Ward等人(Ward,E.S.等人，Nature(1989)341,544-546；Ward,E.S.等人，FASEBJ.(1992)6,2422-2427)的方法使用lacZ启动子；可以根据Better等人(Better,M.等人,Science(1988)240,1041-1043)的方法使用araB启动子。
当抗体被产生到大肠杆菌的周质中时，pel B信号序列(Lei,S.P.等人，J.Bacteriol.(1987)169,4379-4383)可用作抗体分泌的信号序列。分离被产生到周质中的抗体，然后适当地重新折叠待使用的抗体结构(参见例如WO 96/30394)。
作为复制起点，可以使用源自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒(BPV)等的那些。此外，为了增加宿主细胞系统中的基因拷贝数，表达载体可以包含氨基糖苷磷酸转移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等，作为选择标记。
可以使用任何生产系统来制备用于本发明的抗体。用于抗体制备的生产系统包括体外和体内生产系统。体外生产系统包括使用真核细胞的系统或使用原核细胞的系统。
当使用真核细胞时，生产系统包括使用动物细胞、植物细胞或真菌细胞的生产系统。这样的动物细胞包括(1)哺乳动物细胞，例如CHO、COS、骨髓瘤、幼仓鼠肾(BHK)、HeLa和Vero；(2)两栖动物细胞，例如非洲爪蟾属(Xenopus)卵母细胞；和(3)昆虫细胞，例如sf9、sf21和Tn5。已知的植物细胞包括源自普通烟草(Nicotiana tabacum)的细胞，其可在愈伤组织中培养。已知的真菌细胞包括诸如酵母菌(Saccharomyces)(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))的酵母和诸如曲霉(Aspergillus)(例如黑曲霉(Aspergillus niger)的霉菌真菌。
当使用原核细胞时，生产系统包括使用细菌细胞的系统。已知的细菌细胞包括大肠杆菌和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
通过转化将目标抗体基因引入这些细胞，然后在体外培养转化的细胞，可以获得抗体。根据已知方法培养细胞。例如，可以使用DMEM、MEM、RPMI 1640或IMDM作为培养基，并且可以组合使用血清补充剂，例如胎牛血清(FCS)。或者，可以将引入了抗体基因的细胞转移到动物的腹腔等内，以便在体内产生抗体。
同时，体内生产系统包括使用动物的系统或使用植物的系统。使用动物时，生产系统包括使用哺乳动物或昆虫的生产系统。
可以使用的哺乳动物包括山羊、猪、绵羊、小鼠和牛(Vicki Glaser，SPECTRUMBiotechnology Applications，1993)。此外，可以使用的昆虫包括蚕。当使用植物时，可以使用烟草(tobacco)等。
将抗体基因引入这些动物或植物中，在动物或植物体内产生抗体，然后回收。例如，抗体基因可以通过将其插入至编码在乳汁中独特产生的蛋白质(例如山羊β酪蛋白)的基因的中间来制备为融合基因。将包含融合基因(其包含插入的抗体基因)的DNA片段注射到山羊胚胎中，然后将胚胎引入雌性山羊。所需的抗体是从接受胚胎的山羊所生的转基因山羊或其后代产生的乳汁中获得的。适当时，转基因山羊可被给予激素以增加它们产生的含有所需抗体的乳汁的体积(Ebert,K.M.等人，Bio/Technology(1994)12,699-702)。
当使用蚕时，用插入了目标抗体基因的杆状病毒感染蚕，并从这些蚕的体液中获得所需的抗体(Maeda,S.et al.,Nature(1985)315,592-594)。此外，在使用烟草时，将目标抗体基因插入到诸如pMON530的植物表达载体中，将该载体引入到诸如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的细菌中。这种细菌被用来感染烟草，例如普通烟草(Nicotiana tabacum)，然后从这种烟草的叶子中获得所需的抗体(Julian,K.-C.Ma等人，Eur.J.Immunol.(1994)24，131-138)。
当使用如上所述的体外或体内生产系统生产抗体时，可以将编码抗体重链(H链)和轻链(L链)的DNA插入单独的表达载体中，然后用载体将宿主进行共转化。或者，可以将H链编码DNA和L链编码DNA插入单个表达载体中以转化宿主(参见国际专利申请公开号WO94-11523)。
本发明中使用的抗体可以是抗体片段或其修饰产物，只要它们可以适用于本发明即可。例如，抗体片段包括Fab、F(ab’)2、Fv和单链Fv(scFv)，其中H和L链的Fv通过适当的接头连接。
具体地，通过用诸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶的酶处理抗体，或者通过构建编码这些抗体片段的基因并将它们引入表达载体然后在合适的宿主细胞中表达载体来产生抗体片段(参见，例如，Co,M.S.等人，J.Immunol.(1994)152,2968-2976；Better,M.&Horwitz,A.H.,Methods in Enzymology(1989)178,476-496；Plueckthun,A.&Skerra,A.,Methodsin Enzymology(1989)178,497-515；Lamoyi,E.,Methods in Enzymology(1989)121,652-663；Rousseaux,J.等人，Methods in Enzymology(1989)121,663-666；和Bird,R.E.等人，TIBTECH(1991)9,132-137)。
通过连接抗体的H链V区和L链V区可以获得scFv。在该scFv中，H链V区和L链V区通过接头连接，优选通过肽接头连接(Huston,JS等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85,5879-5883)。scFv中H链和L链的V区可以源自上述任何抗体。用于连接V区的肽接头包括例如由12至19个氨基酸残基组成的任意单链肽。
编码scFv的DNA可以通过以下来获得：使用限定DNA部分末端的引物对通过PCR来扩增编码模板序列中所需氨基酸序列的DNA部分(其中编码H链或H链V区的DNA和编码上述抗体的L链或L链V区的DNA用作模板)，然后用编码肽接头部分的DNA和限定接头的两端的引物对进一步扩增扩增的DNA部分，以便它可以连接到每个H和L链。
一旦制备了scFv编码DNA，就可以根据常规方法获得包含该DNA表达载体和用该表达载体转化的宿主。另外，scFv可以通过使用宿主按照常规方法获得。
与上述类似，抗体片段可以通过获得它们的基因，表达它们，然后使用宿主来产生。如本文所用，“抗体”包括此类抗体片段。
与诸如聚乙二醇(PEG)的各种分子结合的抗体也可用作修饰抗体。如本文所用，“抗体”包括此类修饰抗体。这些修饰抗体可以通过对获得的抗体进行化学修饰来获得。这样的方法在本领域中已经建立。
如上产生和表达的抗体可以从细胞内部或外部或从宿主中分离，然后纯化至均质。用于本发明的抗体可以通过亲和层析进行分离和纯化。用于亲和层析的柱包括蛋白A柱和蛋白G柱。用于蛋白A柱的载体包括HyperD、POROS和Sepharose F.F.。可以不受限制地使用用于分离和/或纯化普通蛋白质的其他方法。
例如，用于本发明的抗体可以通过适当选择和结合除上述亲和层析之外的层析、过滤、超滤、盐析、透析等来分离和纯化。层析的示例包括离子交换层析、疏水层析和凝胶过滤。这些层析可应用于高效液相色谱法(HPLC)。或者，可以使用反相HPLC。
如上所述获得的抗体的浓度可以通过吸光度测量、ELISA等来确定。具体地，当使用吸光度测量时，可以通过用PBS(-)适当稀释抗体溶液，在280nm处测量其吸光度，并通过使用换算系数1.35OD/1mg/ml计算浓度来确定浓度。或者，当使用ELISA时，浓度可以如下确定。具体来说，将用0.1M碳酸氢盐缓冲液(pH 9.6)稀释至1μg/ml的100μl山羊抗人IgG(TAG)添加到96孔板(Nunc)中，并在4℃下孵育过夜以固定抗体。封闭后，加入100μl用于本发明的适当稀释的抗体或包含抗体的适当稀释的样品，或作为标准的人IgG(CAPPEL)，并将板在室温下孵育1小时。
洗涤后，加入100μl的5,000x稀释的碱性磷酸酶标记的抗人IgG(BIO SOURCE)，并将板在室温下孵育1小时。再次洗涤后，加入底物溶液，孵育板，并使用MICROPLATE READERModel 3550(Bio-Rad)测量405nm处的吸光度以计算目标抗体的浓度。
本发明中使用的IL-6变体是对IL-6受体具有结合活性且不传递IL-6生物学活性的物质。也就是说，IL-6变体与IL-6竞争结合IL-6受体，但不传递IL-6生物活性，从而阻断IL-6介导的信号转导。
IL-6变体是通过置换IL-6的氨基酸序列中的氨基酸残基而引入突变来产生的。可以使用IL-6变体所源自的任何IL-6，但考虑到抗原性等，优选人IL-6。
更具体地，通过使用已知的分子建模程序例如WHATIF(Vriend等人，J.Mol.Graphics(1990)8,52-56)由IL-6的氨基酸序列预测IL-6的二级结构，并进一步评估置换的氨基酸残基对整个分子的影响来进行氨基酸置换。在确定了待置换的合适的氨基酸残基后，通过常用的PCR方法使用包含编码人IL-6基因的核苷酸序列以引起氨基酸置换的载体作为模板来引入突变，从而获得编码IL-6变体的基因。如果需要，将该基因插入到合适的表达载体中，并且可以按照上述重组抗体的表达、生产和纯化方法获得IL-6变体。
IL-6变体的具体示例公开于Brakenhoff等人，J.Biol.Chem.(1994)269,86-93；Savino等人，EMBO J.(1994)13,1357-1367；WO 96-18648；和WO 96-17869。
用于本发明的IL-6或IL-6受体的部分肽是分别对IL-6受体或IL-6具有结合活性并且不传递IL-6生物学活性的物质。即，IL-6或IL-6受体的部分肽结合并捕获IL-6受体或IL-6，从而特异性地抑制IL-6与IL-6受体的结合。结果，IL-6的生物活性不被传递，从而阻断了IL-6介导的信号转导。
IL-6或IL-6受体的部分肽是由IL-6或IL-6受体氨基酸序列的区域的全氨基酸序列或其参与IL-6和IL-6受体之间结合的部分组成的肽。这种肽通常由10至80个，优选20至50个，更优选20至40个氨基酸残基组成。
IL-6或IL-6受体的部分肽可以通过指定参与IL-6和IL-6受体结合的IL-6或IL-6受体氨基酸序列的区域，并对指定的区域的全氨基酸序列或其部分应用诸如基因工程技术和肽合成方法的普遍已知的方法来产生。
为了通过基因工程方法制备IL-6或IL-6受体的部分肽，将编码所需肽的DNA序列插入表达载体中，然后通过应用上述表达、生产和纯化重组抗体的方法获得肽。
为了通过肽合成法来生产IL-6或IL-6受体的部分肽，可以使用诸如固相合成法、液相合成法的通常使用的肽合成法。
具体地，可以根据“The sequel of Development of Pharmaceuticals(ZokuIyakuhin no Kaihatsu)，第14卷，Peptide Synthesis(ed.Haruaki Yajima,1991,Hirokawa Shoten)”中描述的方法合成肽。作为固相合成方法，可以采用以下方法等：将与待合成肽的C末端对应的氨基酸结合到不溶于有机溶剂的支持物上，然后通过交替重复以下反应来延伸肽链：将其中α-氨基和支链官能团被适当保护基保护的氨基酸在C端向N端方向一次一个进行缩合的反应；以及从树脂结合的氨基酸或肽的α-氨基上去除保护基团的反应来延伸肽链。固相肽合成根据所用保护基的类型，大致分为Boc法和Fmoc法。
在如上合成目标肽后，进行肽链从支持物的脱保护反应和裂解反应。对于肽链的裂解反应，Boc法一般使用氟化氢或三氟甲磺酸，Fmoc法一般使用TFA。例如，在Boc方法中，受保护的肽结合树脂在苯甲醚存在下用氟化氢处理。然后，通过去除保护基团并从其支持物上裂解肽来回收肽。通过冷冻干燥回收的肽，可以获得粗肽。在Fmoc方法中，肽链从支持物的脱保护反应和裂解反应可以在TFA等中通过与上述那些类似的操作进行。
获得的粗肽可以通过应用HPLC进行分离和纯化。可以使用水-乙腈溶剂系统在最佳条件下进行洗脱，该系统通常用于蛋白质纯化。收集对应于所得色谱图的峰的级分并冷冻干燥。经由质谱分析、氨基酸组成分析、氨基酸序列分析等通过分子量分析来鉴定以这种方式纯化的肽级分。
IL-6的部分肽和IL-6受体的具体示例公开于JP-A(公开)H02-188600、JP-A(公开)H07-324097、JP-A(公开)H08-311098和美国专利公开号US5210075。
本发明中使用的抗体可以是结合诸如聚乙二醇(PEG)、放射性物质和毒素的各种分子的缀合抗体。这样的缀合抗体可以通过对获得的抗体进行化学修饰来获得。在该领域中已经建立了抗体修饰的方法。因此，本文所用的术语“抗体”包括此类缀合抗体。
本发明的“抗体”包括翻译后修饰的那些。翻译后修饰包括但不限于通过焦谷氨酰化(pyroglutamylation)化将重链或轻链N-末端谷氨酰胺或谷氨酸修饰成焦谷氨酸。
本发明的“抗IL-6受体抗体”的优选示例包括托珠单抗(其是人源化抗IL-6受体IgG1抗体)，通过修饰托珠单抗的恒定区和可变区而产生的人源化抗IL-6受体抗体，以及与托珠单抗所结合的相同表位结合的抗体。
具体示例包括含有SEQ ID NO：1的重链可变区(托珠单抗的重链可变区)和SEQ IDNO：2的轻链可变区(托珠单抗的轻链可变区)的抗体，以及含有SEQ ID NO：5的重链可变区(SA237的重链可变区)和SEQ ID NO：6的轻链可变区(SA237的轻链可变区)的抗体。
更具体地，示例包括含有SEQ ID NO：3的重链(托珠单抗的重链)和SEQ ID NO：4的轻链(托珠单抗的轻链)的抗体，以及含有SEQ ID NO：7的重链(SA237的重链)和SEQ ID NO：8的轻链(SA237的轻链)的抗体。
此类抗体可以根据WO2010/035769、WO2010/107108、WO2010/106812等中描述的方法获得。具体地，可以使用本领域技术人员已知的基因重组技术，基于上述抗IL-6受体抗体的序列生产抗体(参见，例如，Borrebaeck CAK和Larrick JW,THERAPEUTIC MONOCLONALANTIBODIES，由MACMILLAN PUBLISHERS LTD在英国出版，1990)。重组抗体可以通过从杂交瘤或抗体产生细胞(例如抗体产生致敏的淋巴细胞)中克隆编码抗体的DNA，将DNA插入适当的载体中，并将该载体引入宿主(宿主细胞)中以产生抗体来获得。
可以使用通常用于抗体纯化的分离和纯化方法来分离和纯化此类抗体，但不限于此。例如，可以通过适当地选择和组合柱层析、过滤、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂提取、蒸馏、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦、透析、重结晶等来分离和纯化抗体。
“结合至参考抗体的相同表位的抗体”是指在竞争测定中阻断参考抗体与其抗原的结合达50％或更多的抗体，反之，在竞争测定中参考抗体阻断抗体与其抗原的结合达50％或更多。具体地，“结合至参考抗体的相同表位的抗体”是指在竞争测定中阻断参考抗体与其抗原的结合达60％或更多、70％或更多、80％或更多或90％或更多的抗体。
在另一方面，竞争测定可用于鉴定与托珠单抗竞争结合IL-6受体的抗体。在某些实施方案中，此类竞争性抗体结合至托珠单抗所结合的相同表位(例如，线性或构象表位)。在Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols”in Methods in Molecular Biology第66卷(Humana Press，Totowa，NJ)中提供了用于映射(mapping)抗体所结合的表位的详细示例性方法。
在示例性竞争测定中，固定化的IL-6受体在包含与IL-6受体结合的第一标记抗体(例如托珠单抗)和第二未标记抗体的溶液中孵育，所述第二未标记抗体正在测试其与第一抗体竞争结合IL-6受体的能力。第二抗体可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，固定化的IL-6受体在包含第一标记抗体但不包含第二未标记抗体的溶液中孵育。在允许第一抗体与IL-6受体结合的条件下孵育后，去除过量的未结合抗体，并测量与固定化的IL-6受体相关联的标记的量。如果测试样品中与固定化的IL-6受体相关联的标记的量相对于对照样品显著减少，则表明第二抗体与第一抗体竞争结合IL-6受体。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual ch.14(冷泉港实验室，纽约州冷泉港)。
本发明中的“抗CCL2抗体”的示例包括但不限于日本专利号9067399、JP-A(公开)H0527698、WO03048083、US20040047860、US20060039913和WO2006/125202中描述的抗体。更具体的示例包括ABN912和CNT0888(卡芦单抗(carlumab))。这些抗体可以根据日本专利号9067399、JP-A(公开)H05276986、WO03048083、US20040047860、US20060039913和WO2006/12520中描述的方法使用任何已知技术生产。
当CCR2抑制剂为低分子量物质时，该物质的示例包括但不限于丙帕锗(3-氧甲锗烷基丙酸聚合物)(3-oxygermylpropionic acid polymer)、INCB3344、RS-504393或WO2006/187393中描述的物质。
本发明的治疗剂或预防剂可以通过与合适的药学上可接受的载体、赋形剂等混合(如果需要)来配制以制备冻干制剂或溶液制剂。合适的药学上可接受的载体和赋形剂包括例如无菌水、生理盐水、稳定剂、辅料(excipient)、抗氧化剂(例如抗坏血酸)、缓冲剂(例如磷酸盐、柠檬酸盐、组氨酸和其他有机酸)、防腐剂、表面活性剂(PEG和吐温)、螯合剂(例如EDTA)和粘合剂。还可以含有其他低分子量多肽，诸如血清白蛋白、明胶、免疫球蛋白的蛋白质，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、蛋氨酸、精氨酸、赖氨酸的氨基酸，诸如多糖、单糖的糖类和碳水化合物，和诸如甘露醇、山梨醇的糖醇。制备注射用水溶液时，可使用生理盐水和含有葡萄糖和其他佐剂例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化钠的等渗溶液；并且可以组合使用适当的增溶剂例如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇和PEG)和非离子表面活性剂(例如聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20、泊洛沙姆188和HCO-50)。通过将透明质酸酶混合到制剂中，可以皮下施用更大的流体体积(Expert Opin.Drug Deliv.2007年7月；4(4)：427-40)。此外，注射器可以预先填充有本发明的药物组合物。溶液制剂可以根据WO2011/090088中描述的方法制备。
如果需要，本发明的治疗剂或预防剂可以封装在微胶囊(例如由羟甲基纤维素、明胶和聚(甲基丙烯酸甲酯)制成的微胶囊)中，或掺入胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中(参见，例如，“Remington's PharmaceuticalScience第16版”，Oslo编辑(1980))。制备作为控释药物制剂的药物制剂的方法也是已知的，并且这些方法可以应用于本发明的治疗剂或预防剂(Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.15:267-277(1981)；Langer,Chemtech.12:98-105(1982)；美国专利号3,773,919；欧洲专利申请公开号EP 58,481；Sidman等人，Biopolymers 22:547-556(1983)；133,988)。
当包含低分子量物质作为活性成分时，本发明的治疗剂或预防剂可以通过与适当的药学上可接受的载体等混合来制备，并配制成片剂、胶囊、颗粒、粉剂、或药丸。
药学上可接受的载体等的示例包括但不限于糖类，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；黄蓍胶粉；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，例如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物性油，例如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油、植物油和可可油；多元醇，例如丙二醇、甘油、山梨醇、甘露醇、聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，例如吐温；保湿剂，例如卵磷脂；着色剂；香料；压片剂；稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐水溶液；和磷酸盐缓冲溶液。
本发明的治疗剂可以通过任何合适的途径施用于患者。例如，在一段时间内，它可以通过推注(bolus injection)或通过连续输注静脉内、肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、经皮、皮下、皮内、关节内、舌下、滑膜内、口服、通过吸入、局部或外部施用于患者。
剂量可以在例如每剂量每1kg体重0.0001mg至100mg活性成分的范围内选择。或者，例如，当对人类患者施用时，每个患者的活性成分可以在每1kg体重0.001mg至1000mg的范围内选择。对于以抗体为活性成分的IL-6抑制剂或CCR2抑制剂，单次剂量的量优选为例如每1kg体重约0.01mg至50mg。
联合疗法和药物组合物
在本发明的非限制性实施方案中，本发明的联合疗法提供了抑制细胞增殖、抑制肿瘤重量、抑制肿瘤体积、治疗癌症或预防癌症的方法，每种方法包括施用有效量的IL-6抑制剂和CCR2抑制剂。在几个实施方案中，与使用IL-6抑制剂或CCR2抑制剂的单一疗法相比，本发明的联合疗法对于抑制细胞增殖、抑制肿瘤重量、抑制肿瘤体积、治疗癌症或预防癌症是高度有效的。在另一个实施方案中，本发明的联合疗法具有抑制细胞增殖、抑制肿瘤重量、抑制肿瘤体积、治疗癌症或预防癌症的协同效应或累加效应。
在几个实施方案中，本发明中的术语“有效量”是指IL-6抑制剂和/或CCR2抑制剂在个体中治疗或预防疾病(在本发明中，特别是泌尿系统癌症)有效的剂量。例如，如果IL-6抑制剂是抗体，则例如每1至10周一次，优选每1至8周一次，或更优选每1至4周一次，对于单次施用以例如，在每1kg体重0.0001mg至1000mg，优选0.001mg至100mg，或更优选0.01至50mg的范围内的剂量施用所述抗体，但施用不限于此。如果CCR2抑制剂是抗CCL2抗体，则例如每1至10周一次，优选每1至8周一次，或更优选每1至4周一次，对于单次施用以在每1kg体重0.0001mg至1000mg，优选0.001mg至100mg，或更优选0.01mg至50mg的范围内的剂量施用所述抗体，但施用不限于此。如果CCR2抑制剂是与CCR2结合并阻断CCL2信号的低分子量物质，则对于单次给药，例如，在每天每1公斤体重0.01mg至40mg，或优选每天每1公斤体重0.25毫克至10毫克的范围内每天施用该物质。如果CCR2抑制剂是丙帕锗，丙帕锗以例如每天20至40mg，或优选每天30mg的范围施用，该量被给予例如分成两至四次分剂量，或优选地三次分剂量，但施用不限于此。
本发明中的上述泌尿系统癌症没有特别限制，但优选膀胱癌。
在若干实施方案中，本发明中的“治疗(treatment)/治疗(treating)/治疗(therapeutic)”是指本发明的联合疗法抑制泌尿器官中肿瘤生长、减少癌细胞数量、抑制癌细胞增殖、减小肿瘤体积、降低肿瘤重量，抑制癌细胞转移，或改善个体中因癌症引起的各种症状。此外，在若干实施方案中，本发明中的“预防(prevention)/预防(preventing)/预防(prophylactic)”是指抑制由于已经减少的癌细胞的再增殖(repopulation)而导致的癌细胞数量的增加，抑制增殖已被抑制的癌细胞的再增殖，抑制缩小的肿瘤尺寸再次变大，或防止因局部治疗而在宏观上消失(或已治愈)的癌症在宏观上再现。
在几个实施方案中，本发明的联合疗法提供了通过使用IL-6抑制剂来增强CCR2抑制剂在用CCR2抑制剂治疗或预防癌症中的治疗或预防效果的方法。在另一个实施方案中，本发明的联合疗法提供了通过使用CCR2抑制剂来增强IL-6抑制剂在用IL-6抑制剂治疗或预防癌症中的治疗或预防效果的方法。在本文中，治疗或预防效果的增强是指，例如，治疗的有效率的增加，用于治疗所施用的IL-6抑制剂或CCR2抑制剂的量的减少，和/或用IL-6抑制剂或CCR2抑制剂治疗的周期的缩短，但不限于此。在另一个实施方案中，本发明的联合疗法提供了延长个体无进展生存期的方法，该方法包括施用有效量的IL-6抑制剂和CCR2抑制剂。
在几个实施方案中，本发明的联合疗法包括施用IL-6抑制剂和CCR2抑制剂。IL-6抑制剂和CCR2抑制剂可以通过本领域已知的任何合适的方法施用。例如，IL-6抑制剂和CCR2抑制剂可以平行(即同时)或相继(即在不同时间点)施用。在若干实施方案中，当IL-6抑制剂和CCR2抑制剂相继(即在不同的时间点)施用时，IL-6抑制剂和CCR2抑制剂的施用之间的间隔没有特别限制，间隔可以通过综合考虑诸如施用途径和剂型的因素来确定。该间隔例如为0至168小时，优选0至72小时，更优选0至24小时，以及甚至更优选0至12小时，但不限于此。
在几个实施方案中，同时施用IL-6抑制剂和CCR2抑制剂。在几个实施方案中，IL-6抑制剂以间隔(即，间歇地)施用。在几个实施方案中，IL-6抑制剂在施用CCR2抑制剂之前施用。在几个实施方案中，IL-6抑制剂在施用CCR2抑制剂之后施用。
在几个实施方案中，CCR2抑制剂以间隔(即，间歇地)施用。在几个实施方案中，在施用IL-6抑制剂之前施用CCR2抑制剂。在几个实施方案中，在施用IL-6抑制剂之后施用CCR2抑制剂。
在几个实施方案中，本文已知或描述的IL-6抑制剂和CCR2抑制剂可用于本发明的上述联合疗法。
在几个实施方案中，除了使用IL-6抑制剂和CCR2抑制剂的联合疗法之外，还可以进行另外的疗法。在几个实施方案中，添加到本发明的联合疗法中的疗法可以包括施用另外的IL-6抑制剂和/或CCR2抑制剂。
本发明的非限制性实施方案提供用于抑制细胞增殖的药剂(用于抑制细胞增殖的药剂)、用于抑制癌症细胞或含有癌症细胞的肿瘤组织的体积或重量的药剂、以及用于癌症的治疗剂或预防剂(在下文中，统称为本发明的药物组合物等)，其各自包含IL-6抑制剂、CCR2抑制剂或IL-6抑制剂和CCR2抑制剂的组合。在几个实施方案中，本发明的药物组合物可用于本发明的联合疗法。在几个实施方案中，由于IL-6抑制剂和CCR2抑制剂的联合使用，与使用IL-6抑制剂或CCR2抑制剂的单一疗法相比，本发明的药物组合物对于抑制细胞增殖、抑制癌症细胞或含有癌症细胞的肿瘤组织的体积或重量、或治疗或预防癌症是高度有效的。在另一个实施方案中，本发明的药物组合物由于IL-6抑制剂和CCR2抑制剂的联合使用而在抑制细胞增殖、抑制癌症细胞或含有癌症细胞的肿瘤组织的体积或重量、或治疗或预防癌症方面具有协同效应或累加效应。
在几个实施方案中，“包含IL-6抑制剂和CCR2抑制剂的组合”的根据本发明的药物组合物是指在疾病(特别是本发明中的泌尿系统癌症)的治疗或预防中将IL-6抑制剂和CCR2抑制剂组合用于同时、分开或顺序施用的药物组合物。例如，本发明的药物组合物可以以包含IL-6抑制剂和CCR2抑制剂二者的组合制剂的形式提供。或者，例如，作为本发明的药物组合物，可以分别提供含有IL-6抑制剂的药剂和含有CCR2抑制剂的药剂，并且这些药剂可以同时或顺序使用。泌尿系统癌症没有特别限制，但优选膀胱癌。
在几个实施方案中，本发明提供与CCR2抑制剂联合使用的药物组合物，该组合物包含IL-6抑制剂作为活性成分。
在几个实施方案中，本发明提供与IL-6抑制剂联合使用的药物组合物，该组合物包含CCR2抑制剂作为活性成分。
在几个实施方案中，本发明提供了通过将IL-6抑制剂与CCR2抑制剂联合使用来增强CCR2抑制剂在使用CCR2抑制剂的癌症治疗中的治疗效果的药物组合物。
在几个实施方案中，本发明提供了通过将CCR2抑制剂与IL-6抑制剂联合使用来增强IL-6抑制剂在癌症治疗中的治疗效果的药物组合物。
在几个实施方案中，本发明提供了IL-6抑制剂和/或CCR2抑制剂用于生产包含IL-6抑制剂和/或CCR2抑制剂作为活性成分的药物组合物的用途。
在本发明中，“包含IL-6抑制剂和/或CCR2抑制剂作为活性成分”是指“包含IL-6抑制剂和/或CCR2抑制剂作为主要活性组分”，并不限制IL-6抑制剂和/或CCR2抑制剂的含量。
KDM6A是一种组蛋白修饰蛋白，其基因位于X染色体上。已知KDM6A通过JmjC结构域促进三甲基化/二甲基化组蛋白H3(H3K27)第27位赖氨酸残基的脱甲基，通过称为三角形四肽重复(tetratricopeptide repeat)(TPR)的蛋白质相互作用结构域结合混合谱系白血病3(MLL3，KMT2C)或混合谱系白血病4(MLL4，KMT2D)(它们是组蛋白甲基化酶)，并作为与Set1相关的蛋白质的复合物(COMPASS)样复合物(它是一种蛋白质复合物)的组分在组蛋白H3(H3K4)第4位赖氨酸残基的甲基化中发挥作用。H3K27甲基化是转录抑制组蛋白标记，H3K4甲基化是转录促进组蛋白标记，并且KDM6A被认为通过上述功能促进靶基因的转录激活。
在上述方面的一个实施方案中，本发明提供一种用于治疗或预防泌尿系统癌症的药物组合物(用于泌尿系统癌症的治疗剂或预防剂)，该药物组合物包含IL-6抑制剂、CCR2抑制剂或IL-6抑制剂和CCR2抑制剂的组合，其中所述药物组合物用于施用于个体，其中所述个体已通过以下步骤而被选择：评估从个体(例如泌尿系统癌症患者)获得的生物样品中存在或不存在降低的KDM6A功能、降低的KDM6A表达和/或KDM6A基因突变(优选功能丧失突变)，并且在个体具有降低的KDM6A功能、降低的KDM6A表达和/或KDM6A基因突变(优选功能丧失突变)时，选择所述个体作为用药物组合物治疗或预防的反应者。
在另一个实施方案中，本发明提供用于治疗或预防泌尿系统癌症的IL-6抑制剂、CCR2抑制剂或IL-6抑制剂和CCR2抑制剂的组合，其中IL-6抑制剂、CCR2抑制剂，或IL-6抑制剂和CCR2抑制剂的组合用于施用于个体，其中所述个体已通过以下步骤而被选择：评估从个体(例如，泌尿系统癌症患者)获得的生物样品中存在或不存在降低的KDM6A功能、降低的KDM6A表达和/或KDM6A基因突变(优选功能丧失突变)，并在个体具有降低的KDM6A功能、降低的KDM6A表达和/或KDM6A基因突变(优选功能丧失突变)时，选择所述个体作为治疗或预防的反应者。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗或预防泌尿系统癌症的方法，该方法包括向个体(例如泌尿系统癌症患者)施用有效量的IL-6抑制剂和向个体施用有效量的CCR2抑制剂的步骤，或施用IL-6抑制剂和CCR2抑制剂的组合的步骤，其中治疗或预防泌尿系统癌症的方法包括以下步骤：评估从个体获得的生物样品存在或不存在降低的KDM6A功能、降低的KDM6A表达和/或KDM6A基因突变(优选功能丧失突变)，并在个体具有降低的KDM6A功能、降低的KDM6A表达和/或KDM6A基因突变(优选功能丧失突变)时，选择所述个体作为治疗或预防的反应者。评估步骤和选择步骤优选在施用步骤之前进行。
在这些实施方案中，可以评估个体中降低的p53表达、降低的p53功能和/或p53突变是否存在，并且具有降低的p53表达、降低的p53功能和/或p53突变的个体可以被选为治疗或预防的反应者。评估p53突变存在与否的方法是本领域已知的。
在本发明中，可以检查降低的KDM6A功能、降低的KDM6A表达、KDM6A基因突变和KDM6A基因功能丧失突变，例如，通过使用针对KDM6A的抗体将从泌尿系统癌症患者收集的样品免疫染色，或通过对从患者收集的样品进行蛋白质印迹法或外显子测序方法。
例如，作为使用针对KDM6A抗体进行免疫染色的结果，当KDM6A蛋白表达与KDM6A阳性对照(例如，从不具有KDM6A功能降低、不具有KDM6A表达降低、不具有KDM6A基因突变或不具有KDM6A基因功能丧失突变的患者采集的生物样品)相比显著降低时可以确定KDM6A功能降低，KDM6A表达降低，KDM6A基因具有突变，或KDM6A基因具有功能丧失突变。
在本发明中，KDM6A功能的降低包括KDM6A功能缺陷和KDM6A的失活。
在本发明中，KDM6A表达的降低包括KDM6A蛋白表达的显著降低和KDM6A蛋白表达的缺失。
在本发明中，KDM6A基因的突变包括KDM6A基因的功能丧失突变。具体的突变包括无义突变、移码突变、剪接突变和缺失。
p53基因是一种抑癌基因，具有诸如调节DNA修复和细胞周期、诱导细胞凋亡的功能，并且在多种癌症中均观察到p53基因突变。突变型p53蛋白具有长的半衰期并在细胞内积累；因此，p53抗体出现在血清中(Lowe SW,Bodis S,McClatchey A等人：p53 status andthe effect of cancer therapy in vivo.Science 266:807-810,1994)。因此，通过ELIZA方法测量血清中的p53抗体被认为有助于发现与p53基因突变相关的癌症(Shimada H、Ochiai T，Nomura F等人：Titration of serum p53 antibodies in 1085patients withvarious types of malignant tumors.Cancer 97:682-689,2003)，自2007年11月以来，该测量已被批准作为食道癌、结直肠癌和乳腺癌的肿瘤标记物测试用于医疗保险范围。
在本发明中，p53功能降低包括p53功能缺陷和p53的失活。
在本发明中，p53表达降低包括p53蛋白表达的显著降低和未检测到p53蛋白表达。
在本发明中，p53基因突变的具体示例包括错义突变、无义突变、移码突变和缺失。
实施例
接下来，将参考实施例具体描述本发明，但本发明不限于以下实施例。
制备并分析在膀胱上皮中特异性缺乏UTX(UtxΔ/Δ)的小鼠，以研究UTX(KDM6A)缺失在膀胱癌中的参与。UtxΔ/Δ小鼠的膀胱上皮中证实了Utx缺失，但长期观察后未观察到膀胱中的肿瘤发病，并且单独的UTX缺陷被认为不足以导致膀胱癌的发病。
膀胱癌中最常见的突变基因是p53，已知Utx缺失和p53突变经常共存(The CancerGenome Atlas Research Network，Nature 2014,第507卷，第315-322页)。因此，将UtxΔ/Δ小鼠与p53杂合小鼠杂交以产生UtxΔ/Δ，p53+/-小鼠。有趣的是，在长期观察UtxΔ/Δ，p53+/-小鼠后，发现原位癌(CIS)的发病，表明Utx缺失与p53突变协同参与膀胱癌的发病。
此外，由于暴露于诸如吸烟的诱变剂被认为对膀胱癌的发病很重要，因此将作为实验性膀胱癌诱导剂的N-丁基-N-(4-羟丁基)亚硝胺(BBN)施用于小鼠。结果，施用10周后，约60％的对照Utx+/+，p53+/-小鼠表现出发育异常至原位癌(Dysplasia to CIS)，而100％的UtxΔ/Δ，p53+/-小鼠表现出发育异常至原位癌的发病(图1A)并且一些进一步进展为浸润到肌肉层的癌症(肌肉浸润性癌症)(图1B)。这些结果表明Utx缺失和p53突变增强了膀胱癌的易感性，而这与诱变剂协同作用，允许进展为晚期癌症。从基因突变的积累和环境诱变剂的影响的角度来看，我们的小鼠可能是产生的第一个人类膀胱肿瘤的体内模型。
为了分析UTX缺失在膀胱癌的发病中的参与，我们在BBN施用4周后从对照Utx+/+小鼠和UtxΔ/Δ小鼠的膀胱中收集尿路上皮，提取RNA，并通过KEGG进行转录组分析和途径分析。结果，UtxΔ/Δ小鼠的膀胱上皮中增强最多的途径是“细胞因子-细胞因子受体相互作用”(图2A；粗框)，此外，观察到“MAPK途径”和“JAK-STAT途径”的增强。这些结果表明，UTX缺失激活了膀胱上皮中的细胞因子途径，导致细胞内信号系统如MAPK和JAK-STAT的激活。此外，研究了在“细胞因子-细胞因子受体相互作用”途径中表达增强的基因，发现表达最高的是趋化因子CCL2，其次是细胞因子IL6(图2B；粗体字母)。
因此，进行了基于模型的治疗实验以研究是否可以通过抑制这些细胞因子和趋化因子的功能来抑制膀胱癌的进展。MBT2是从小鼠系C3H建立的膀胱癌肿瘤株。我们通过将空载体(EV)和Utx敲除(KO)载体引入MBT2，构建了表达Utx的株(EV克隆)和Utx缺陷的株(KO克隆)(图3A)。这些克隆被移植到同基因(syngeneic)的C3H小鼠中，在7天的移植物植入期后，动物接受仅使用赋形剂，仅使用丙帕锗(CCL2受体CCR2的抑制剂，每天以0.005％的浓度将抑制剂与饲料混合施用)、仅使用MR16-1(针对小鼠IL6受体的中和抗体，每周3次以每只动物100μg腹内注射)，以及丙帕锗和MR16-1的联合使用(组合)处理。
结果，如图3C所示，对于由Utx表达株移植产生的EV肿瘤，与单独的赋形剂相比，任何一种治疗方法都没有显示出显著的治疗效果；然而，如图3D所示，对于由Utx缺陷株移植引起的KO肿瘤，发现使用丙帕锗和MR16-1(组合)的联合疗法可显著抑制肿瘤重量。
这些结果表明，在Utx缺陷型膀胱癌中，通过抑制CCL2/CCR2活性和IL6活性两者可以显著抑制肿瘤生长。
至于显示Utx参与膀胱癌的发病的文章，存在着使用携带Utx突变的人膀胱癌细胞系移植到免疫缺陷小鼠中的实验模型的报道(Deer Lee等人Sci Trans.Med 2017)；然而，这是使用培养细胞进行异种移植的结果，并且很难说它是反映体内Utx功能缺陷的模型。迄今为止，关注于膀胱癌且利用遗传修饰技术对膀胱特异性Utx缺陷(UtxΔ/Δ)小鼠进行生产和分析的研究尚未见报道，与本发明相关的研究和技术可以认为是独创的。
工业实用性
本发明提供用于泌尿系统癌症，特别是具有降低的赖氨酸(K)-特异性脱甲基酶6A(KDM6A)功能的泌尿系统癌症的新型治疗剂。
Claims (15)
1.一种包含IL-6抑制剂的用于泌尿系统癌症的治疗剂和/或预防剂，其中所述药剂用于与CCR2抑制剂联合施用。
2.一种包含CCR2抑制剂的用于泌尿系统癌症的治疗剂和/或预防剂，其中所述药剂用于与IL-6抑制剂联合施用。
3.一种用于泌尿系统癌症的治疗剂和/或预防剂，包含IL-6抑制剂和CCR2抑制剂的组合。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的治疗剂和/或预防剂，其中所述IL-6抑制剂是抗IL-6抗体或抗IL-6受体抗体。
5.根据权利要求4所述的治疗剂和/或预防剂，其中所述抗IL-6抗体和抗IL-6受体抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的治疗剂和/或预防剂，其中所述CCR2抑制剂是CCL2抑制剂。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的治疗剂和/或预防剂，其中所述CCR2抑制剂是抗CCL2抗体或丙帕锗。
8.根据权利要求7所述的治疗剂和/或预防剂，其中所述CCL2抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的治疗剂和/或预防剂，其中所述癌症是膀胱癌、前列腺癌或肾癌。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的治疗剂和/或预防剂，其中所述癌症是膀胱癌。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的治疗剂和/或预防剂，其中所述癌症是具有降低的赖氨酸(K)特异性脱甲基酶6A(KDM6A)表达或功能的癌症。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的治疗剂和/或预防剂，其中所述癌症是具有KDM6A基因突变的癌症。
13.根据权利要求12所述的治疗剂和/或预防剂，其中所述KDM6A基因突变是功能丧失突变。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的治疗剂和/或预防剂，其中所述癌症是具有降低的p53表达或功能的癌症。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的治疗剂和/或预防剂，其中所述癌症是在p53基因中具有突变的癌症。
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