CN103476410A

CN103476410A - 联合疗法

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Publication number: CN103476410A
Application number: CN2012800046165A
Authority: CN
Inventors: K·D·G·福莱格; E·麦考尔; J·威廉姆斯
Original assignee: Dimerix Bioscience Pty Ltd
Current assignee: Dimerix Bioscience Pty Ltd
Priority date: 2011-01-11
Filing date: 2012-01-11
Publication date: 2013-12-25
Anticipated expiration: 2032-01-11
Also published as: EP4215194A1; IL227414A0; JP2020122015A; US11382896B2; US20130289084A1; EP2663304A4; JP2014505049A; US20160243127A1; US20220323418A1; AU2012206945A1; CA2821985C; US20180000826A1; CA2821985A1; US10058555B2; CN103476410B; CN107899012A; US12083102B2; ZA201305897B; US20200046685A1; EP2663304A1

Abstract

本发明涉及一种药物组合物，其包含：a)至少一种血管紧张素受体阻断剂或其药学上可接受的盐，以及b)至少一种趋化因子受体途径抑制剂或其药学上可接受的盐。本发明还涉及一种药物组合物，其包含：a)至少一种血管紧张素受体阻断剂或其药学上可接受的盐；以及b)至少一种抑制除趋化因子受体以外的趋化因子受体途径成分的趋化因子受体途径抑制剂或其药学上可接受的盐。描述了包含所述药物组合物的口服持续释放药物组合物，以及包含所述药物组合物的可注射的持续释放药物组合物。本发明进一步涉及包含所述药物组合物的用于肺或鼻递送的片剂、胶囊、可注射混悬剂和组合物。还描述了评估所述药物组合物的功效的方法；评估所述药物组合物的抑制或部分抑制活性的方法；治疗、改善或预防病状或疾病的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的所述药物组合物；以及所述药物组合物在制备用于治疗疾病的剂型中的用途。

Description

联合疗法

发明领域

本发明涉及一种联合疗法，其包含至少一种趋化因子受体途径抑制剂和至少一种血管紧张素受体阻断剂。

背景技术

蛋白质在细胞中不以孤立的形式起作用，而是以稳定的或瞬时的复合物形式起作用，蛋白质-蛋白质相互作用是蛋白质功能的重要决定因素（Auerbach等，(2002),Proteomics2:611-623）。此外，蛋白质和蛋白质复合物与其它细胞成分如DNA、RNA和小分子相互作用。理解参与这些相互作用的个体蛋白质以及它们的相互作用二者对于更好地理解生物学过程是重要的。

Allen（Allen,S.等(2007)Annual Review Immunology25:787-820）报道的趋化因子的主要生理功能是调节“常规免疫监视、炎症和发展期间的细胞迁移(cell migration during routine immune surveillance,inflammation and development)”。趋化因子响应于促炎性细胞因子而被释放，并且选择性地结合至介导对趋化因子的生理反应的G蛋白-偶联受体大家族。趋化因子最初称为趋化细胞因子。

因为发现趋化因子系统在人类免疫缺陷病毒(HIV)感染和获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的发病机制中发挥着不可或缺的作用，因此已尽很大努力去了解所涉及的一种（多种）潜在机制以便开发潜在的干预策略(Lusso,P.(2006)EMBO Journal25:447-456)。此外，与包括哮喘在内的特定病状相关的任何有害免疫反应几乎无一例外地由趋化因子系统功能失调引起。也已证明，动脉粥样硬化的发病机制牵涉到趋化因子信号途径，巨噬细胞浸润到动脉病变中直接导致这种异常炎性病症(Boisvert,W.(2004)Trends in Cardiovascular Medicine14:161-165)。

慢性炎性疾病的动物模型研究已证明，用拮抗剂抑制MCP-1（单核细胞趋化蛋白-1，也称为单核细胞化学趋向蛋白-1，单核细胞趋化和活化因子(MCAF)及趋化因子（C-C基元）配体2(CCL2)）与CCR2（趋化因子（C-C基元）受体2）之间的结合能抑制炎性应答。MCP-1与CCR2之间的相互作用牵涉到（参见Rollins B J(1996)Mol,Med.Today,2:198；及Dawson J等，(2003)Expert Opin.Ther.Targets,7(1):35-48）炎性疾病病理，例如葡萄膜炎、动脉粥样硬化、类风湿关节炎、多发性硬化症、克罗恩氏病、肾炎、器官同种异体移植物排斥、纤维性肺、肾功能不全、糖尿病和糖尿病并发症、糖尿病肾病变、糖尿病视网膜病变、糖尿病性视网膜炎、糖尿病微血管病变、结核病、肉样瘤病、侵入性葡萄球菌性皮肤化脓、白内障手术后的炎症、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、慢性荨麻疹、过敏性哮喘、牙周病、牙周炎、龈炎、齿龈疾病、舒张性心肌病变、心脏梗死、心肌炎、慢性心脏衰竭、血管狭窄、再狭窄、再灌注病症、肾小球肾炎、实体瘤和癌症、慢性淋巴细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、多发性骨髓瘤、恶性骨髓瘤、何杰金氏病以及膀胱癌、乳癌、子宫颈癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌或胃癌。

用MCP-1拮抗剂（MCP-1的抗体或可溶性灭活片段）抑制单核细胞迁移已被证明能抑制关节炎、哮喘和葡萄膜炎的发展。丙帕锗（3-氧基甲锗烷基丙酸聚合物），已用作对抗慢性肝炎的治疗剂的分子，也已被证明通过似乎需要糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白，例如CD55、CD59和CD16的机制特异性地抑制由MCP-1引起的单核细胞的体外趋化性迁移(Yokochi,S.(2001)Journal of Interferon and CytokineResearch21:389-398)。

MCP-1和CCR2敲除(KO)小鼠都展现出单核细胞向炎性病变处的浸润显著减少。此外，此种KO小鼠可抵抗实验性过敏性脑脊髓炎（EAE，人MS模型）、蟑螂过敏原诱导的哮喘、动脉粥样硬化和葡萄膜炎的发展。类风湿关节炎和克罗恩氏病患者在用TNF-α拮抗剂（例如单克隆抗体和可溶性受体）以与MCP-1表达及浸润性巨噬细胞数量减少相关的剂量水平治疗期间得到改善。

MCP-1已牵涉到季节性和慢性过敏性鼻炎的发病机制，并且在大多数尘螨过敏患者的鼻粘膜中被发现。还已发现MCP-1在体外诱导组胺从嗜碱粒细胞释放。在过敏性病状期间，过敏原和组胺都已被证明能触发（即上调）患有过敏性鼻炎的人的鼻粘膜中的MCP-1和其它趋化因子的表达，揭示此类患者中存在正反馈回路。

肾脏疾病与由以肾脏巨噬细胞积聚为特征的慢性炎症相关联。糖尿病性肾脏产生单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1/CCL2)已经被确认为影响由糖尿病肾病变引起的肾脏疾病中的巨噬细胞积聚的主要因素（参见Tesch GH(2008)MCP-1/CCL2:a new diagnostic marker andtherapeutic target for progressive renal injury in diabetic nephropathy AmJ Physiol Renal Physiol294:697-701）。在各种动物模型中，抑制CCR2和/或抑制特定CCR2途径和/或抑制CCR2配体MCP-1已被证明能减轻肾脏损害（参见，Tesch(2008)上文；Rao V等(2006)Role forMacrophage Metalloelastase in Glomerular Basement MembraneDamage Associated with Alport Syndrome,American Journal ofPathology,Vol.169(1)32-46；Kang YS(2010)CCR2antagonismimproves insulin resistance,lipid metabolism,and diabetic nephropathyin type2diabetic mice Kidney International78,883-894；Kitagawa K(2004)Blockade of CCR2Ameliorates Progressive Fibrosis in Kidney,American Journal of Pathology,Vol.165(1)237-246；Park J(2008)MCP-1/CCR2system is involved in high glucose-induced fibronectin andtype IV collagen expression in cultured mesangial cells,Am J PhysiolRenal Physiol295:F749-F757）。

Tesch(2008)指出特异性靶向MCP-1已被证明是抑制包括糖尿病肾病变在内的肾脏疾病的动物模型的有效治疗；然而，此类疗法在人糖尿病肾病变中尚未得到验证。包括CCR2的小分子拮抗剂（INCB3344，丙帕锗，RS-504393）的治疗已被证明能抑制小鼠的多发性硬化症、肾缺血再灌注损伤、输尿管阻塞和糖尿病肾病变模型及大鼠关节炎模型中的炎症；CCR2的工程化生物拮抗剂也被证明是有效的；用表达截短灭活形式的MCP-1的载体转染的细胞的皮下输注已被发现能抑制小鼠狼疮性肾炎模型中的肾炎症发展。类似地，肌肉转染7ND（MCP-1突变体）减轻了小鼠的肾缺血再灌注损伤、狼疮性肾炎和糖尿病肾病变模型中的肾炎症。用于炎性疾病的趋化因子单药疗法的人试验迄今为止还没有导致药品审批。Anders A-J等考虑了单一趋化因子拮抗剂治疗在疾病治疗中无效的原因，并且对包括单一趋化因子介质冗余和趋化因子受体的表达模式可变化在内的可能解释进行讨论（参见Anders A-J等(2009)Questions about Chemokine andChemokine receptor Antagonism in Renal Inflammation,Nephron ExpNephrol2010;114:e33-e38）。因此，在本领域中需要对由于CCR2途径引起的疾病的有效治疗。

肾素-血管紧张素系统(RAS)在交感神经系统和流体体内平衡中发挥重要的作用。肾素是肾脏分泌的蛋白质水解酶，其介导血管紧张素I(AngI)从球蛋白前体，血管紧张素原形成（Rang,H.P.等，Pharmacology：第3版，1995，Churchill Livingstone,Edinburgh,UK.出版）。除了为第二酶，即将AngI转化为高活性血管紧张素II(AngII)的血管紧张素转化酶(ACE)提供底物以外，AngI本身似乎几乎不具有生理重要性。然而，应注意，AngII可由替代的非ACE-依赖性机制产生。AngII可继而被氨肽酶代谢为AngIII。

AngII是极其强效的血管收缩剂，因此它在心脏疾病和高血压发病机制的背景下得到广泛研究(Ramasubbu,K.(2007)CardiologyClinics25:573-580)。

慢性肾疾病是死亡率和发病率的主要原因，但是促进其进展的基本细胞事件仍然是未知的，导致炎症、缺氧和细胞外基质(ECM)沉积增加的促炎性介质可能是肾衰竭的主要原因(Gilbert(1999)Kidney Int56:1627-1637,1999)。这些病理学事件伴有蛋白尿和肾小球滤过率(GFR)下降，最终导致终末期肾衰竭。虽然血管紧张素转换酶抑制剂(ACEi)和血管紧张素受体阻断剂现在被视为慢性肾疾病的一线治疗并且已清楚地被证明能赋予肾脏保护作用，但是慢性肾疾病仍然是进行性的病症，其最终导致肾衰竭。在合作研究组试验(Lewis(1993).The effect of angiotensin converting enzyme inhibition on diabeticnephropathy.New England Journal of Medicine329:1456-1462)中，卡托普利(captopril)治疗虽然延缓肾衰竭，但是未能遏制绝大多数患者的糖尿病病变的进展。与临床环境相反，肾脏保护剂的实验研究大多显示常用糖尿病肾病变模型中的肾结构和功能异常得到完全改善。糖尿病Ren-2大鼠和肾大部分切除(STNx)模型的主要优势是，如在人中观察到的，ACEi或血管紧张素受体阻断剂减弱但没有阻止肾衰竭的发展(Kelly(1998)Kidney Int54:343-352，及Kelly(2000)Kidney Int57:1882-1894)。此外，糖尿病Ren-2大鼠和STNx模型可用于研究具有在合并的ACEi或血管紧张素受体阻断剂的背景下进一步改善肾疾病进展的前景的潜力的另外的疗法。

肾素-血管紧张素系统(RAS)，即参与血压控制、电解质体内平衡及细胞生长和死亡的荷尔蒙级联，存在于肾脏的两个主要部位中：肾小球和近端肾小管。RAS已牵涉到肾脏疾病的进展，因为阻断这种系统减弱了人和实验性糖尿病中的蛋白尿及肾小球和肾小管间质疾病Lewis(1993)。RAS阻断剂的肾脏保护作用已归结于它们降低肾小球压的能力(Zatz(1985)Predominance of hemodynamic rather thanmetabolic factors in the pathogenesis of diabetic nephropathy.PNAS82:5963-5967)。然而，人们已经认识到，血管紧张素II的局部增加可通过它的促进细胞生长的性质诱导硬化和炎症(Wolf(1993)Angiotensin II as a renal growth factor.J Am Soc Nephrol3:1531-1540)。在各种肾小球疾病研究中有充分的证据证明，Ang II通过上调诸如转化生长因子-β(TGF-β)的其它生长因子(Ruiz Ortega(1994)Involvement of angiotensin II and endothelin in matrix protein productionand renal sclerosis.J Hypertens Suppl.12:S51-S58)来发挥细胞损伤作用。实际上，肾脏产生这些生长因子并且Ang II使这些生长因子增加，从而诱导细胞增殖、细胞周期阻滞，和死亡、细胞表型和ECM积聚的改变（Kelly(1998)、Kelly(2000)和Kelly(2002)）。虽然有证据表明Ang II通过上调生长因子来诱导多种应答，但是很少有研究描述在糖尿病环境下Ang II是如何促进生长因子活化的(Naito(2004)Am JPhysiol Renal Physiol286:F278-F287)。

血管紧张素受体阻断剂厄贝沙坦(irbesartan)（AT₁R，商品名

SanofiAventis）在管理患有高血压的患者的糖尿病肾病变中的功效已在以下两个大型(n>500)随机、双盲、安慰剂对照的跨国试验中加以评价：IRMA2（高血压患者的厄贝沙坦微量白蛋白尿2型糖尿病(Irbesartan Microalbuminuria Type2Diabetes in HypertensivePatients))(Parving(2001)N Engl J Med345(12):870-8和IDNT（厄贝沙坦糖尿病肾病变试验(Irbesartan Diabetic Nephropathy Trial)）Lewis(2001)N Engl J Med345(12):851-60)。

为了对抗AngII在患有高血压的患者中的有害的血管收缩作用[终末期肾疾病的发病]，已开发出干预AngII信号传导水平的治疗策略。特别地，抑制ACE的活性从而阻止AngI转化为AngII的化合物及特异性地阻断血管紧张素受体(ATR)的活化的化合物已被用于此类病状的治疗中(Matchar,D.B.(2008)Annals of Internal Medicine148:16-29)。

发明人已证明血管紧张素受体与趋化因子受体家族成员异聚化(WO2010/108232)。发明人已证明趋化因子受体与血管紧张素受体缔合为趋化因子受体/血管紧张素受体异二聚体/异低聚体。发明人已证明CCR2与AT1R缔合为CCR2/AT1R异二聚体/异低聚体。

血管紧张素和CCR2信号传导途径先前已被证明能相互作用。例如：CCR2受体的缺乏减弱血管紧张素II对血管病理的影响（Daugherty A(2010)Clin Sci(Lond).118(11):681-9；Ishibachi M(2004)Arteriosclerosis,Thrombosis,and Vascular Biology24；Tieu(2011)Aortic Adventitial Fibroblasts Participate in Angiotensin-lnducedVascular Wall Inflammation and Remodelling J Vasc Res48(3)261-272）。

此外，诱导MCP-1表达的血管紧张素II随着年龄增加，导致MCP-1及其受体CCR2上调。这种上调还可以发生在各种疾病中。(Spinetti G(2004)Arterioscler Thromb Vasc Biol24(8):1397-402)。

血管紧张素受体阻断剂已被证明能抑制MCP-1和CCR2的表达(Dai(2007)British Journal of Pharmacology152,1042-1048)。

发明人已惊讶地发现，血管紧张素受体阻断剂与趋化因子受体途径抑制剂一起施用克服了现有技术的一些或所有缺陷。

前述讨论仅意欲使本发明容易理解。它不应被解读为以任何方式限制本发明的以下描述的范围或应用，它也不应被解读为承认所讨论的任何信息属于在优先权日时适当领域的技术人员的公知常识。

发明概述

本发明提供了一种药物组合物，其包含：

a)至少一种血管紧张素受体阻断剂或其药学上可接受的盐，以及

b)至少一种趋化因子受体途径抑制剂或其药学上可接受的盐。

所述药物组合物可任选地进一步包含药学上可接受的载体。

在一方面，所述药物组合物抑制或部分地抑制抑制蛋白募集。

在另一方面，所述药物组合物抑制或部分地抑制肌醇磷酸产生。

本发明进一步提供了一种治疗、改善或预防病状或疾病的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的(i)血管紧张素受体阻断剂与(ii)趋化因子受体途径抑制剂的组合。

在一方面，趋化因子受体途径抑制剂抑制或部分地抑制除趋化因子受体以外的蛋白质，更优选地，所述抑制剂为通过靶向糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白如CD55、CD59和CD16来阻断MCP-1诱导的单核细胞的迁移和活化及趋化性迁移的试剂。优选地，趋化因子受体途径抑制剂为丙帕锗。替代地，趋化因子受体途径抑制剂为RS504393。

优选地，血管紧张素受体阻断剂为厄贝沙坦。

本发明还考虑了包含至少一种血管紧张素受体阻断剂或其药学上可接受的盐，及至少一种趋化因子受体途径抑制剂或其药学上可接受的盐的药物组合物在制备用于治疗疾病的剂型中的用途。

所述药物组合物可任选地进一步包含药学上可接受的载体。

附图简述

图1：示出有关如实施例1中所描述的，与未经处理的动物和用单独的血管紧张素受体阻断剂厄贝沙坦(Irb)处理的动物相比较，当用血管紧张素受体阻断剂厄贝沙坦(Irb)与丙帕锗(PPG)（趋化因子受体途径抑制剂）（低剂量）的组合处理时在终末器官肾疾病的肾大部分切除(STNx)模型中获得的蛋白尿水平的改善的条形图。

图2：示出有关如实施例2中所描述的，与未经处理的动物、用单独的PPG处理的动物和用单独的血管紧张素受体阻断剂厄贝沙坦(Irb)处理的动物相比较，当用血管紧张素受体阻断剂厄贝沙坦(Irb)与丙帕锗(PPG)（趋化因子受体途径抑制剂）（高剂量）的组合处理时在终末器官肾疾病的肾大部分切除(STNx)模型中获得的蛋白尿水平的改善的条形图。

图3：示出从实施例1中所描述的终末器官肾疾病的肾大部分切除(STNx)模型中获取的组织切片的代表性相衬图像，其示出获自以下的肾样品：未经处理的动物或对照动物(A)；单独的STNx(B)；STNx和丙帕锗(C)；STNx和厄贝沙坦(D)；及STNx和厄贝沙坦的组合(E)。肾小球中被染成深棕色的细胞代表足细胞。

图4：示出有关如实施例2中所描述的，与未经处理的动物、用单独的PPG处理的动物和用单独的厄贝沙坦（血管紧张素受体阻断剂）处理的动物相比较，当用血管紧张素受体阻断剂厄贝沙坦(Irb)与丙帕锗(PPG)（趋化因子受体途径抑制剂）（高剂量）的组合处理时在终末器官肾疾病的肾大部分切除(STNx)模型中获得的足细胞数量的改善的条形图。

图5：示出指示如用配体诱导的BRET衡量及在实施例3中所描述的AT1R和CCR2阻断对β-抑制蛋白2募集的影响的条形图。用为β-抑制蛋白2-Venus和指示的受体：CCR2-Rluc8（顶图）、AT1R-Rluc8（中间图）或AT1R-Rluc8及未标识的CCR2（底图）编码的质粒瞬时转染HEK293FT细胞。转染后48h，使用细胞在活细胞中产生激动剂诱导的BRET信号。对于这一点，首先将细胞与厄贝沙坦(10μΜ)、RS504393(10μΜ)或二者组合一起在37℃下预温育30分钟或者不进行此种预温育。然后用100nM AngII、MCP-1或二者一起在37℃下刺激细胞30分钟或者不进行此种刺激，并测量BRET信号。数据表示为一式三份执行的三组独立实验的平均值±SEM。

图6：示出指示如实施例4中所描述的AT1R和CCR2阻断对肌醇磷酸产生的影响的条形图。用为缺乏（顶图）和存在（底图）未标识CCR2的AT1R-Rluc8和β-抑制蛋白2-Venus编码的质粒瞬时转染HEK293FT细胞。转染后48h，使用细胞产生激动剂诱导的肌醇(1)磷酸(IP1)产生测量值。对于这一点，首先将细胞与厄贝沙坦(10μΜ)、RS504393(10μΜ)或二者组合一起在37℃下预温育30分钟或者不进行此种预温育。然后用100nM AngII、MCP-1或二者一起在37℃下刺激细胞30分钟或者不进行此种刺激，并测量IP1产生。数据归一化为相对于表达单独的AT1R的细胞中AngII诱导的IP1产生的百分比。数据表示为一式三份执行的三组独立实验的平均值±SEM。

图7：示出指示如用配体诱导的BRET衡量及在实施例5中所描述的AT1R和CCR2阻断对β-抑制蛋白2募集的影响的条形图。用为缺乏（顶图）和存在（底图）血凝素(HA)-标识的AT1R的CCR2-Rluc8和β-抑制蛋白2-Venus编码的质粒瞬时转染HEK293FT细胞。转染后48h，使用细胞在活细胞中产生激动剂诱导的BRET信号。对于这一点，首先将细胞与厄贝沙坦(10μΜ)、EXP3174（氯沙坦的活性代谢物；10μΜ）、RS504393(10μΜ)，或者厄贝沙坦与RS504393或EXP3174与RS504393的组合一起在37℃下预温育30分钟或者不进行此种预温育。然后用100nM AngII、MCP-1或二者一起在37℃下刺激细胞30分钟或者不进行此种刺激，并测量BRET信号。

图8：示出指示如实施例6中所描述的AT1R和CCR2阻断对肌醇磷酸产生的影响的条形图。用为缺乏（顶图）和存在（底图）未标识CCR2的AT1R-Rluc8和β-抑制蛋白2-Venus编码的质粒瞬时转染HEK293FT细胞。转染后48h，使用细胞产生激动剂诱导的肌醇(1)磷酸(IP1)产生测量值。对于这一点，首先将细胞与EXP3174（氯沙坦的活性代谢物；10μΜ）、RS504393(10μΜ)或二者组合一起在37℃下预温育30分钟或者不进行此种预温育。然后用100nM AngII、MCP-1或二者一起在37℃下刺激细胞30分钟或者不进行此种刺激，并测量IP1产生。数据表示为诱导的IP1（任意单位）。

图9：示出指示如用配体诱导的BRET衡量及在实施例7中描述的就Gα_i1偶联而言在缺乏和存在活化的AT1R的情况下活化CCR2的影响的剂量反应曲线。用为缺乏（顶图）和存在（底图）血凝素(HA)-标识的AT1R的Gαi1-Rluc8和CCR2-YFP编码的质粒瞬时转染HEK293FT细胞。转染后48h，使用细胞，在活细胞中在各种浓度的MCP-1的存在下或在存在100nM MCP-1的情况下在各种浓度的AngII的存在下产生激动剂诱导的BRET信号数据。

缩写

ACE 血管紧张素转换酶

ACEi 血管紧张素转换酶抑制剂

AIDS 获得性免疫缺陷综合症

AngI 血管紧张素I肽

AngII 血管紧张素II肽

AngIII 血管紧张素III肽

AT₁R 血管紧张素1型受体

AT₂R 血管紧张素2型受体

barr β-抑制蛋白

BP 血压

CCL2 趋化因子（C-C基元）配体2

CCR CC趋化因子受体

DOP δ阿片

GFR 肾小球过滤率

GPCR G蛋白偶联受体

HIV 人类免疫缺陷病毒

KOP κ阿片

LPO 外侧视前区

MCP-1 单核细胞趋化蛋白-1，也称为单核细胞化

学趋向蛋白-1

NPY 神经肽Y

STNx 肾大部分切除

发明描述

综述

本文引用的所有出版物，包括专利和专利申请，不论是在上文还是在下文中引用的，都据此以引用的方式完整地并入。然而，引用本文提到的出版物是为了描述和公开在所述出版物中报道并且可与本发明结合使用的方案、试剂和载体。本文中任何内容都不应理解为承认没有权利通过在先发明而使本发明早于此类公开物。

如在本文及所附权利要求书中使用的，单数形式“一个（种）”和“该（所述）”包括复数形式，除非上下文另外清楚地指明。因此，例如，提及的“一种蛋白”包括多种此类蛋白，并且提及“一种分析物”是提及一种或多种分析物，等等。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管可以使用与本文所述的那些相似或等价的任何材料和方法来实施或检验本发明，但是现在描述优选的材料和方法。

本文描述的本发明可以包括一个或多个数值（例如，尺寸、浓度等）的范围。数值范围应理解为包括在该范围内的所有数值，包括限定该范围的数值，以及邻近该范围、与紧邻限定该范围边界的数值的数值产生相同或基本相同的结果的数值。

在本说明书全文中，除非上下文另外需要，否则措辞“包含(comprise)”或变化形式，例如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”应理解为暗示包括所陈述的整数，或整数组，但是并不排除任何其它的整数或整数组。

发明详述

最近的研究已经表明，G蛋白偶联受体(GPCR)不仅可充当单体，而且可充当导致配体结合、信号传导和内吞作用发生改变的同二聚体和异二聚体和/或同低聚体和异低聚体（也称为同聚体和异聚体）（Rios等(2000)Pharmacol.Ther.92:71-87）。充当特定受体的激动剂或拮抗剂的药物的疗效因此可能取决于这种受体的结合伴侣。可能期望将药物作用限制于由特定受体二聚体或低聚体介导的细胞应答。

具有不同异二聚体库的不同组织的实例已被报道。例如，6'胍基纳曲吲哚(6'guanidinoaltrindole)，熟知的κ阿片(KOP)受体配体的类似物，已被鉴定为具有作为脊柱选择性止痛剂的功效的δ阿片-κ阿片(DOP-KOP)异二聚体选择性激动剂，从而得到DOP-KOP异二聚体在脊髓中表达而不在脑中表达的结论（Waldhoer,M.等(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA102:9050-9055）。因此，包含至少一种与至少一种血管紧张素受体亚单位缔合的趋化因子受体亚单位的异二聚体或异低聚体受体代表新药物靶标。

与6'胍基纳曲吲哚的情况一样，已知的配体可表现出不同的触发异二聚体受体的能力，这可揭露现有分子的新应用：

-Hilairet S等2003(J.Biol.Chem.278:23731-23737)最近已证明CB1拮抗剂通过经由CB1/OxR1异聚体对起作用来抑制食欲。

-已证明促生长素抑制素SSTR5受体将与多巴胺D2受体异聚化（Rocheville M.等(2000)Science288:154-157）。

-血管紧张素和CCR2信号传导途径最近已被证明相互作用。例如，CCR2受体的缺乏减弱血管紧张素II对血管病理的影响（Daugherty A(2010)Clin Sci(Lond).118(11):681-9；Ishibachi M(2004)Arteriosclerosis,Thrombosis,and Vascular Biology24）。

-发明人已证明血管紧张素受体与趋化因子受体家族成员杂聚化(WO2010/108232)。

虽然这些实例示出受体的功能性相互作用，但是它们没有鉴定可提供改进的治疗结果的联合疗法的具体制剂。

药物组合物

优选地，联合疗法将通过趋化因子受体途径和血管紧张素受体起作用。本发明因此提供了一种药物组合物，其包含：

a)至少一种血管紧张素受体阻断剂或其药学上可接受的盐；以及

所述药物组合物可任选地进一步包含药学上可接受的载体。

措辞“趋化因子受体”应理解为至少包括G蛋白偶联CC趋化因子受体(CCR)，包括：CC趋化因子受体1(CCR1)、CC趋化因子受体2(CCR2)、CC趋化因子受体3(CCR3)、CC趋化因子受体4(CCR4)、CC趋化因子受体5(CCR5)、CC趋化因子受体6(CCR6)、CC趋化因子受体7(CCR7)、CC趋化因子受体8(CCR8)、CC趋化因子受体9(CCR9)、CC趋化因子受体10(CCR10)。措辞“趋化因子受体”还应理解为包括G蛋白偶联CXC趋化因子受体(CXCR)，包括：CXC趋化因子受体1(CXCR1)、CXC趋化因子受体2(CXCR2)、CXC趋化因子受体3(CXCR3)、CXC趋化因子受体4(CXCR4)、CXC趋化因子受体5(CXCR5)、CXC趋化因子受体6(CXCR6)和CXC趋化因子受体7(CXCR7)。短语“趋化因子受体”应进一步理解为包括G蛋白偶联XC趋化因子受体1(XCR1)。措辞“趋化因子受体”应进一步理解为包括G蛋白偶联CX3趋化因子受体(CX₃CR1)。措辞“趋化因子受体”应进一步理解为包括G蛋白偶联CCX-CKR趋化因子受体(CCX-CKR)。措辞“趋化因子受体”应进一步理解为包括G蛋白偶联D6趋化因子受体(D6)。措辞“趋化因子受体”应进一步理解为包括G蛋白偶联DARC/Duffy趋化因子受体(DARC)。该趋化因子受体列表是根据Allen（Allen,S.等(2007)Chemokine:Receptor Structure,Interactions and Antagonism.Annual Review Immunology25:787-820）的综述编制的。最后，措辞“趋化因子受体”应进一步理解为包括任何新发现的CCR/CXCR/XCR/CX₃CR/CCX-CKR/D6/DARC家族成员。

趋化因子受体可选自包含以下的组：CC趋化因子受体1(CCR1)、CC趋化因子受体2(CCR2)、CC趋化因子受体3(CCR3)、CC趋化因子受体4(CCR4)、CC趋化因子受体5(CCR5)、CC趋化因子受体6(CCR6)、CC趋化因子受体7(CCR7)、CC趋化因子受体8(CCR8)、CC趋化因子受体9(CCR9)、CC趋化因子受体10(CCR10)、CXC趋化因子受体1(CXCR1)、CXC趋化因子受体2(CXCR2)、CXC趋化因子受体3(CXCR3)、CXC趋化因子受体4(CXCR4)、CXC趋化因子受体5(CXCR5)、CXC趋化因子受体6(CXCR6)和CXC趋化因子受体7(CXCR7)、G蛋白偶联XC趋化因子受体1(XCR1)、G蛋白偶联CX3趋化因子受体(CX₃CR1)、G蛋白偶联CCX-CKR趋化因子受体(CCX-CKR)、G蛋白偶联D6趋化因子受体(D6)、G蛋白偶联DARC/Duffy趋化因子受体(DARC)，及CCR/CXCR/XCR/CX₃CR/CCX-CKR/D6/DARC趋化因子受体。

措辞“趋化因子受体途径”应理解为至少包括由上文所列趋化因子受体触发的途径中的任何一种。优选地，趋化因子受体途径为由包括CC趋化因子受体2(CCR2)在内的G蛋白偶联CC趋化因子受体(CCR)触发的途径。

如本文所用的术语“除趋化因子受体以外的趋化因子受体途径成分”应理解为包括由上文所列趋化因子受体中的一种或多种触发的上文所列途径中的任何一种途径的成分，其中所述成分本身不是如上文所列的趋化因子受体。优选地，所述成分是蛋白质，例如，但不限于转导或信号传导蛋白。趋化因子受体途径成分可与触发趋化因子受体直接相互作用。替代地，趋化因子受体途径成分可经由蛋白-蛋白相互作用或复合物形成与触发趋化因子受体间接相互作用。替代地，趋化因子受体途径成分可经由诸如本领域中已知的信号传导级联与触发趋化因子受体间接相互作用。

措辞“趋化因子受体途径抑制剂”意欲包括抑制或部分地抑制与上文所列趋化因子受体相关联的途径中的任何一种途径的任何化合物或试剂，包括抑制除趋化因子受体本身以外的趋化因子受体途径成分的化合物或试剂。例如，所述抑制剂可抑制或部分地抑制与趋化因子受体缔合的蛋白质，或者可在趋化因子受体本身之前和/或之后抑制化合物或途径步骤。优选地，趋化因子受体途径抑制剂为CCR2拮抗剂、CCR2逆激动剂或CCR2负性别构调节剂。

趋化因子受体途径抑制剂可选自包含以下的组：直接CCR2拮抗剂、逆CCR2激动剂、负性别构CCR2调节剂；间接CCR2拮抗剂、间接逆CCR2激动剂，及间接负性别构CCR2调节剂。

更优选地，该措辞包括抑制或部分地抑制与MCP-1和/或CCR2相关联的趋化因子受体途径中的任一种途径的任何抑制剂，其包括直接CCR2和/或MCP-1拮抗剂、逆激动剂或负性别构调节剂；或通过在不同的水平上阻断这些途径来间接起作用的拮抗剂、逆激动剂或负性别构调节剂。

更具体来说，该措辞包括丙帕锗（3-氧基甲锗烷基丙酸聚合物），已用作对抗慢性肝炎的治疗剂的分子，也已被证明通过似乎需要糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白，例如CD55、CD59和CD16的机制特异性地抑制由MCP-1引起的单核细胞的体外趋化性迁移(Yokochi,S.(2001)Journal of Interferon and Cytokine Research21:389-398)。丙帕锗还被称为3-[(2-羧乙基-氧代甲锗烷基)氧基-氧代甲锗烷基]丙酸，普洛脉宁(proxigermanium)、Ge-132、双(2-羧乙基锗)倍半氧化物(CEGS)、2-羧乙基锗倍半氧烷(2-carboxyethylgermasesquioxane)、SK-818、有机锗、锗倍半氧化物、3,3'-(1,3-二氧代-1,3-二锗烷氧烷二基)双丙酸、3-氧基甲锗烷基丙酸聚合物、聚-反式-(2-羧乙基)锗倍半氧烷、普洛脉宁、瑞帕锗(repagermanium)和Serocion。丙帕锗具有下式：

该措辞还包括RS504393。RS504393具有下式：

本发明因此还提供了一种药物组合物，其包含：

b)至少一种抑制除趋化因子受体以外的趋化因子受体途径成分的趋化因子受体途径抑制剂或其药学上可接受的盐。

药物组合物可任选地进一步包含药学上可接受的载体。

在一个优选实施方案中，趋化因子受体途径抑制剂选自由以下组成的组：

(i)趋化因子受体或除趋化因子受体以外的趋化因子受体途径成分的拮抗剂；

(ii)趋化因子受体或除趋化因子受体以外的趋化因子受体途径成分的逆激动剂；

(iii)趋化因子受体或除趋化因子受体以外的趋化因子受体途径成分的负性别构调节剂；

靶向除趋化因子受体以外的趋化因子受体途径成分的趋化因子受体途径抑制剂的更具体的实例可以为阻断与MCP-1诱导的单核细胞的迁移和活化及趋化性迁移相关联的途径的试剂。此类可被靶向的因子包括糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白，更具体地，CD55、CD59和CD16。

趋化因子受体的已知拮抗剂包括：RS504393、RS102895、MLN-1202(Millennium Pharmaceuticals)、INCB3344、INCB3284和INCB8696(Incyte Pharmaceuticals)、MK-0812(Merck)、CCX140(ChemoCentryx)、PF-4136309(Pfizer)、BMS-741672(Bristol-MyersSquibb)；Repertaxin(CXCR2)、TAK-779(CCR5)、TAK-220(CCR5)、TAK-652(CCR5)、AK692(CCR5)、CMPD167(CCR5)、BX-471(CCR1)、AMD3100(CXCR4)、AMD11070(CXCR4)、FC131(CXCR4)、MLN3897(CCR1)、CP-481715(CCR1)、GW-873140(CCR5)。趋化因子受体途径抑制剂可选自包含以下的组：RS504393、RS102895、MLN-1202、INCB8696、MK-0812、CCX140、PF-4136309、BMS-741672；Repertaxin(CXCR2)、TAK-779(CCR5)、TAK-220(CCR5)、TAK-652(CCR5)、AK692(CCR5)、CMPD167(CCR5)、BX-471(CCR1)、AMD3100(CXCR4)、AMD11070(CXCR4)、FC131(CXCR4)、MLN3897(CCR1)、CP-481715(CCR1)，和GW-873140(CCR5)。

在一个优选的实施方案中，趋化因子受体途径抑制剂为趋化因子受体的拮抗剂。在一个优选实施方案中，趋化因子受体途径抑制剂选自由以下组成的组：RS504393、RS102895、MLN-1202(MillenniumPharmaceuticals)、INCB3344、INCB3284、INCB8696(IncytePharmaceuticals)、MK-0812(Merck)、CCX140(ChemoCentryx)、PF-4136309(Pfizer)、BMS-741672(Bristol-Myers Squibb)；Repertaxin(CXCR2)、TAK-779(CCR5)、TAK-220(CCR5)、TAK-652(CCR5)、AK692(CCR5)、CMPD167(CCR5)、BX-471(CCR1)、AMD3100(CXCR4)、AMD11070(CXCR4)、FC131(CXCR4)、MLN3897(CCR1)、CP-481715(CCR1)和GW-873140(CCR5)。在一个优选实施方案中，趋化因子受体途径抑制剂不为RS102895。

在一个优选实施方案中，趋化因子受体途径抑制剂为丙帕锗（还被称为双(2-羧乙基锗)倍半氧化物(CEGS)、有机锗、锗倍半氧化物、3,3'-(1,3-二氧代-1,3-二锗烷氧烷二基)双丙酸、3-氧基甲锗烷基丙酸聚合物、聚-反式-(2-羧乙基)锗倍半氧烷、普洛脉宁、瑞帕锗和Serocion）。

在一个优选实施方案中，趋化因子受体途径抑制剂抑制MCP-1诱导的单核细胞的体外趋化性迁移。在另一个优选实施方案中，趋化因子受体途径抑制剂通过需要糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白，例如CD55、CD59和CD16的机制抑制MCP-1诱导的单核细胞的体外趋化性迁移。在另一个优选实施方案中，趋化因子受体途径抑制剂使复合物CCR2/CD55和/或CCR2/CD59和/或CCR2/CD16稳定化。趋化因子受体途径抑制剂可以为肽、多肽，或小化学实体。例如，趋化因子受体途径抑制剂可以为蛋白、结合蛋白或抗体。

趋化因子受体途径抑制剂可通过靶向一种或多种选自包含CD55、CD59和CD16的组的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白来抑制MCP-1诱导的单核细胞的迁移和活化及趋化性迁移。趋化因子受体途径抑制剂可使复合物CCR2/CD55和/或CCR2/CD59和/或CCR2/CD16稳定化。

丙帕锗为趋化因子受体途径抑制剂，但是它不抑制MCP-1结合并且似乎靶向糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白，例如CD55、CD59和CD16。（Yokochi(2001)Journal of Interferon and Cytokine Research21:389-398；Yamada(2004)The Journal of Immunology172:3869-3875）。丙帕锗抑制由MCP-1引起的单核细胞的体外趋化性迁移（Yokuchi(2001)Journal of Interferon and Cytokine Research21:389-398）。

本发明提供了一种药物组合物，其包含：

b)丙帕锗或其药学上可接受的盐。

本发明提供了一种药物组合物，其包含：

b)RS504393，或其药学上可接受的盐。

关键补体调节剂CD55（衰变加速因子）和CD59（保护素）都为GPI-锚定质膜蛋白（Yokochi(2001)Journal of Interferon andCytokine Research21:389-398；Yamada(2004)The Journal ofImmunology172:3869-3875）。补体抑制剂的调节有缺陷及CD55和CD59的水平降低已出现在包括以下的许多疾病状态中：

i)肾脏疾病和肾缺血再灌注损伤(Yamada(2004)CriticalProtection from Renal Ishemia Reperfusion Injury by CD55and CD59,The Journal of Immunology172:3869-3875)；

ii)糖尿病，其中补体抑制剂的调节有缺陷及CD55和CD59的水平降低可视为糖尿病的主要影响及糖尿病血管中补体活化的机制之一，其中这些GPI-锚定补体抑制剂的选择性减少揭示糖尿病对这些分子的合成或加工中的常见调控步骤的影响。已经提出，导致糖尿病患者的CD59和CD55水平减少的机制可以为细胞或组织特异性的机制(Zhang(2002)Diabetes51:3499-3504)。

iii)大血管疾病(Ma(2009)Chinese medical journal,122(18)2123-2128)；

iv)黄斑变性(Bora(2007)The Journal of Immunology,178(3)1783-1790；及Ma K(2010)Invest Ophthalmol Vis Sci.Dec;51(12):6776-83.Epub2010Aug)

措辞“血管紧张素受体”或“ATR”应理解为意指血管紧张素受体1(AT1R;AT₁R)或血管紧张素受体2(AT2R;AT₂R)，为G蛋白偶联受体。在一个优选实施方案中，它们类似于Porrello等(Porrello,E.R.等(2009)Frontiers in Bioscience,14:958-972)描述的被血管紧张素II(AngII)和/或血管紧张素III(AngIII)活化的那些。“血管紧张素受体”或“ATR”应进一步理解为包括新发现的血管紧张素受体家族成员。

措辞“血管紧张素受体阻断剂”应理解为意指可抑制或部分地抑制ATR活化的试剂或化合物。这包括针对ATR的拮抗剂、逆激动剂和负性别构调节剂。优选地，血管紧张素受体阻断剂阻断AT1R。

如本文所用的术语“抑制”意指当与参考物相比较时低于检测限的降低。该措辞包括阻断、延缓或阻碍某一作用从而阻止不期望的结果。

如本文所用的术语“部分地抑制”意指当与参考物相比较时在检测限内的任何降低。该措辞包括阻断、延缓或阻碍某一作用从而阻止不期望的结果。

抑制或部分抑制可使用本文所陈述的体外方法测量，并且包括但不限于使用诸如本领域中已知的生物化学或细胞测定评估由MCP-1引起的单核细胞的体外趋化性迁移，以及测量肌醇磷酸产生、细胞外调节激酶(ERK)磷酸化、cAMP产生；无标记技术（例如使用阻抗、光折射或电荷再分配）；使用邻近报告系统或其它途径的G蛋白偶联；β-抑制蛋白募集或介导的信号传导；基于转录因子的报告系统；使用荧光标记显微可视化；使用抗体评估受体细胞定位（例如酶联免疫吸附测定）及荧光活化细胞分选术。

抑制或部分抑制可使用本文所陈述的体内方法测量，并且包括但不限于通过例如经由自动分析器测量血浆肌酐和尿素来进行肾功能的系列测量；测量蛋白尿，例如经由放射免疫测定测量白蛋白尿；及GFR（单次激发同位素技术(single shot isotopic technique)）；经由例如用于评估肾小球和心肌肥厚、肾小球硬化和/或纤维化和/或足细胞变化和/或的光学显微术(LM)评估终点，例如肾和/或心脏和/或眼部结构；使用免疫组织化学测量基质沉积程度和促纤维化生长因子及其活性的调节；评估收缩压、胰岛素空腹血浆葡萄糖的调节、血红蛋白A1c的调节；以及根据诸如本领域中已知的常规测定使用分子生物学技术评估肾和心脏和眼部结构。抑制或部分抑制可由如根据上文所提及的终点中的一个或多个衡量的肾和/或心脏和/或眼部结构的质量改进(qualitative improvement)来指示。

如本文在本发明药物组合物上下文中使用的术语“组分”意指血管紧张素受体阻断剂或趋化因子受体途径抑制剂。

在一个优选实施方案中，血管紧张素受体阻断剂选自由以下组成的组：

a)血管紧张素受体拮抗剂；

b)血管紧张素受体逆激动剂；或

c)血管紧张素受体负性别构调节剂。

在进一步的优选实施方案中，血管紧张素受体阻断剂选自由以下组成的组：CGP-42112A（AT₂R拮抗剂；Sigma#C-160）、依普沙坦(Eprosartan)（AT₁R；商品名

Abbott Laboratories USA）、氯沙坦(Losartan)（AT₁R；商品名

Merck&Co）、缬沙坦(Valsartan)（AT₁R；商品名

Novartis）、替米沙坦(Telmisartan)(AT₁R，商品名Boehringer Ingelheim)、厄贝沙坦（AT₁R，商品名

SanofiAventis）、坎地沙坦(Candesartan)（AT₁R，商品名

AstraZenica）、奥美沙坦(Olmesartan)（AT₁R，商品名

Daiichi Sankyo Inc）、PD123319(AT₂R,Tocris)、ZD-7115(AT₁R)、沙拉新(Saralasin)((Sar¹-Ala⁸)AngII)、Sarthran((Sar¹-Thr⁸)AngII)和DuP753(AT₁R)。举例来说，血管紧张素受体阻断剂可为厄贝沙坦。血管紧张素受体阻断剂可选自包含以下的组：CGP-42112A(AT₂R拮抗剂)、依普沙坦(AT₁R)、氯沙坦(AT₁R)、缬沙坦(AT₁R)、替米沙坦(AT₁R)、厄贝沙坦(AT₁R)、坎地沙坦(AT₁R)、奥美沙坦(AT₁R)、PD123319(AT₂R)、ZD-7115(AT₁R)、沙拉新((Sar¹-Ala⁸)AngII)、Sarthran((Sar¹-Thr⁸)AngII)和DuP753(AT₁R)。

厄贝沙坦是血管紧张素II受体拮抗剂，它还被称为2-丁基-3-({4-[2-(2H-1,2,3,4-四唑-5-基)苯基]苯基}甲基)-1,3-二氮杂螺[4.4]壬-1-烯-4-酮。厄贝沙坦具有下式：

在一个优选实施方案中，血管紧张素受体阻断剂不为奥美沙坦。在另一个优选实施方案中，血管紧张素受体阻断剂不为奥美沙坦，并且趋化因子受体途径抑制剂不为RS102895。在另一个优选实施方案中，血管紧张素受体阻断剂为奥美沙坦，并且趋化因子受体途径抑制剂为丙帕锗。在另一个优选实施方案中，血管紧张素受体阻断剂为奥美沙坦，并且趋化因子受体途径抑制剂为靶向除趋化因子受体以外的趋化因子受体途径成分的趋化因子受体途径抑制剂。

奥美沙坦为血管紧张素II受体拮抗剂，它还被称为(5-甲基-2-氧代-2H-1,3-间二氧杂环戊烯-4-基)甲基4-(2-羟基丙烷-2-基)-2-丙基-1-({4-[2-(2H-1,2,3,4-四唑-5-基)苯基]苯基}甲基)-1H-咪唑-5-甲酸酯。

奥美沙坦具有下式：

本发明因此还提供了一种药物组合物，其包含：

a)奥美沙坦或其药学上可接受的盐；以及

本发明因此还提供了一种药物组合物，其包含：

b)丙帕锗或其药学上可接受的盐。

本发明因此还提供了一种药物组合物，其包含：

a)奥美沙坦或其药学上可接受的盐；以及

b)丙帕锗或其药学上可接受的盐。

本发明因此还提供了一种药物组合物，其包含：

a)厄贝沙坦或其药学上可接受的盐；以及

本发明进一步提供了一种药物组合物，其包含：

a)厄贝沙坦或其药学上可接受的盐；以及

b)RS504393，或其药学上可接受的盐。

本发明进一步提供了一种药物组合物，其包含：

a)厄贝沙坦或其药学上可接受的盐；以及

在一个优选实施方案中，所述药物组合物的总功效大于血管紧张素受体阻断剂或趋化因子受体途径抑制剂在施用任一组分而未施用另一组分时的功效。因而，组合的组合物可以单一剂量施用，包括以亚治疗剂量施用，或以经常小于可作为单一化合物施用的这两种组分的任一组分的单一剂量施用。

优选地，所述药物组合物的总功效大于血管紧张素受体阻断剂和趋化因子受体途径抑制剂在施用任一组分而未施用另一组分时的功效的总和。更优选地，当同时或相继施用血管紧张素受体阻断剂和趋化因子受体途径抑制剂时，观察到功效的协同效应。

替代地，所述药物组合物的总功效等于血管紧张素受体阻断剂和趋化因子受体途径抑制剂在施用任一组分而未施用另一组分时的功效的总和。作为这个替代方案的进一步的优选实施方案，当同时或相继施用血管紧张素受体阻断剂和趋化因子受体途径抑制剂时，观察到功效的相加效应。

在进一步的替代方案中，所述药物组合物的总功效小于血管紧张素受体阻断剂和趋化因子受体途径抑制剂在施用任一组分而未施用另一组分时的功效的总和。在进一步的实施方案中，虽然组合的功效小于血管紧张素受体阻断剂和趋化因子受体途径抑制剂在施用一种组分而未施用另一组分时的功效的总和，但是所述治疗提供比单独施用的血管紧张素受体阻断剂或趋化因子受体途径抑制剂的单一治疗的功效高的功效。

优选这两种组分在同一时间同时施用（例如作为一起服用的两种片剂，或作为用每一组分调配的单一片剂）或相继施用（例如，一种片剂服用之后服用另一种片剂）。每一组分的剂量可一起服用（同时），或相继地相隔数秒、数分钟、数天、数周或数个月服用。

治疗方法

本发明进一步提供了一种治疗、改善或预防病状或疾病的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的(i)血管紧张素受体阻断剂与(ii)趋化因子受体或其下游途径的抑制剂（趋化因子受体途径抑制剂）的组合。

在本发明方法中使用的趋化因子受体或其下游途径的抑制剂（趋化因子受体途径抑制剂）和血管紧张素受体阻断剂可选自上文所讨论的那些。

优选地，待治疗或预防的病状或疾病为肾脏疾病，更具体地，选自由以下组成的组的疾病：肾脏中的纤维化病症、由糖尿病肾病变引起的慢性肾脏疾病、肾功能不全（糖尿病性和非糖尿病性），及肾衰竭病状，其包括糖尿病肾病变、肾小球肾炎、硬皮病、肾小球硬化、原发性肾脏疾病的蛋白尿及肾血管性高血压。

本发明方法可用于治疗或预防选自由以下组成的组的病状：心血管疾病，包括，（急性和慢性）充血性心脏衰竭、左心室功能不全和肥厚型心肌病变、糖尿病心肌病变、室上性和室性心律失常、心房颤动或心房扑动、心肌梗死及其后遗症，动脉粥样硬化、心绞痛（不论是不稳定型或稳定型）、心脏衰竭、心绞痛、糖尿病、继发性醛固酮症、原发性和继发性肺高醛固酮症、原发性肺性高血压、糖尿病视网膜病变、黄斑变性、眼部病症、胰岛素抵抗、其它血管病症的管理，所述其它血管病症例如偏头痛、雷诺氏病(Raynaud's disease)、管腔增生(luminal hyperplasia)、认知功能障碍（例如阿尔茨海默氏症(Alzheimer's)）、中风、高血钾、子痫前期、结节病、HIV感染和AIDS发病机制、缺血再灌注损伤、动脉粥样化形成、慢性阻塞性肺疾病、哮喘和过敏性肾疾病、类风湿关节炎。

一般来说，一系列与趋化因子有关的疾病可用本发明方法治疗，包括与趋化因子产生增加或减少，和/或细胞对趋化因子的应答增加或减少有关的疾病。与趋化因子有关的疾病还应该理解为意指其中趋化因子受体显示出异常特征，为特定病原体的靶标或者为药物干预靶标的病状。以下列表提供了与趋化因子有关的疾病的一些实例：

-HIV感染和AIDS发病机制

-缺血再灌注损伤；

-动脉粥样化形成；

-慢性阻塞性肺疾病；

-哮喘和过敏；

-肾疾病

-类风湿关节炎

然而，应理解，措辞“与趋化因子有关的干预”和措辞“与趋化因子有关的疾病”不局限于此。

一系列与血管紧张素有关的疾病也可用本发明方法治疗，包括与血管紧张素产生增加或减少，和/或细胞对血管紧张素的应答增加或减少有关的疾病。下面列出被提出源于失调的血管紧张素系统或者可潜在地使用基于血管紧张素的干预治疗的许多病状。

-慢性心脏衰竭；

-动脉粥样硬化/缺血；

-高血压；

-高血钾；

-子痫前期；

-糖尿病；

-糖尿病视网膜病变；

-结节病；

-阿尔茨海默氏病

待治疗或预防的病状或疾病可为选自包含以下的组的疾病：肾脏中的纤维化病症、由糖尿病肾病变引起的慢性肾脏疾病、肾功能不全、肾衰竭病状、糖尿病肾病变、肾小球肾炎、硬皮病、肾小球硬化、原发性肾脏疾病的蛋白尿、肾血管性高血压、心血管疾病、慢性心脏衰竭、高血压、充血性心脏衰竭、左心室功能不全、肥厚型心肌病变、糖尿病心肌病变、室上性和室性心律失常、心房颤动、心房扑动、心肌梗死及其后遗症、动脉粥样硬化、心绞痛、心脏衰竭、心绞痛、继发性醛固酮症、原发性和继发性肺高醛固酮症、原发性肺性高血压、糖尿病视网膜病变、黄斑变性、眼部病症、胰岛素抵抗、血管病症、偏头痛、雷诺氏病、管腔增生、认知功能障碍、阿尔茨海默氏病、中风、高血钾、子痫前期、结节病、糖尿病、糖尿病视网膜病变、HIV感染、AIDS发病机制、缺血再灌注损伤、动脉粥样化形成、慢性阻塞性肺疾病、哮喘、过敏性肾疾病，及类风湿关节炎。

在一方面，趋化因子受体途径抑制剂抑制或部分地抑制除趋化因子受体以外的蛋白质，更优选地，所述抑制剂为通过靶向糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白，例如CD55、CD59和CD16来阻断MCP-1诱导的单核细胞的迁移和活化及趋化性迁移的试剂。更优选地，趋化因子受体途径抑制剂为丙帕锗。

虽然不希望受任何特定作用模式限制，但在一个优选实施方案中，当趋化因子受体抑制剂在趋化因子受体与血管紧张素受体缔合的情况下与趋化因子受体相互作用或调节趋化因子受体下游途径时具有较高的亲和力和/或效力和/或功效。例如，趋化因子受体和血管紧张素受体可缔合为趋化因子受体/血管紧张素受体异二聚体/异低聚体。在进一步的优选实施方案中，当将趋化因子受体抑制剂与血管紧张素受体阻断剂同时或相继施用给受试者时，组合的亲和力、效力和/或功效大于当趋化因子受体抑制剂不与血管紧张素受体阻断剂组合施用（不论同时施用，还是相继施用）时所获得的亲和力、效力和/或功效。在甚至进一步的优选实施方案中，当将趋化因子受体抑制剂与血管紧张素受体阻断剂组合施用给受试者（不论同时施用，还是相继施用）时获得协同效应（如用亲和力、效力和/或功效衡量的）。

虽然不希望受任何特定作用模式限制，但是在一个优选实施方案中，当血管紧张素受体阻断剂在血管紧张素受体与趋化因子受体缔合的情况下与血管紧张素受体相互作用时具有较高的亲和力和/或效力和/或功效。例如，趋化因子受体和血管紧张素受体可缔合为趋化因子受体/血管紧张素受体异二聚体/异低聚体。在进一步的优选实施方案中，当将血管紧张素受体阻断剂与趋化因子受体抑制剂同时或相继施用给受试者时，组合的亲和力、效力和/或功效大于当血管紧张素受体阻断剂不与趋化因子受体抑制剂组合施用（不论同时或相继施用）时所获得的亲和力、效力和/或功效。在甚至进一步的优选实施方案中，当将血管紧张素受体阻断剂与趋化因子受体抑制剂组合施用给受试者（不论同时或相继施用）时获得协同效应（如用亲和力、效力和/或功效衡量的）。

药剂的制备

本发明还提供了包含至少一种血管紧张素受体阻断剂或其药学上可接受的盐，及至少一种趋化因子受体途径抑制剂或其药学上可接受的盐的药物组合物在制备用于治疗疾病的剂型中的用途。所述药物组合物可任选地进一步包含药学上可接受的载体。

剂型、制剂和施用

本发明提供的剂型可进一步包含含有本发明药物组合物的小瓶、盒、容器、片剂或胶囊，其附有将该剂型施用给受试者用以治疗、改善或预防疾病的给药说明书。

本发明化合物的剂量水平将通常为约0.5mg/千克体重至约20mg/千克体重的数量级，其中优选的剂量范围介于约0.5mg/千克体重/天至约10mg/千克体重/天之间（每位患者每天约0.5g至约3g）。用于制备单次剂型的可与载体材料组合的每种活性成分的量将随着待治疗宿主和具体施用模式而变化。例如，供人口服施用的制剂可含有约5mg至1g的每种活性化合物，及可在总组合物的约5%至95%之间变化的适当且方便的量的载体材料。剂量单位形式一般将含有介于约5mg至500mg之间的活性成分。

优选地，血管紧张素受体阻断剂以介于50mg/天至500mg/天的剂量提供。甚至更优选地，趋化因子受体途径抑制剂以介于150mg/天至300mg/天的剂量提供。例如，血管紧张素受体阻断剂为厄贝沙坦并且以300mg/天的剂量施用。

优选地，趋化因子受体途径抑制剂以介于5mg/天至2000mg/天的剂量提供。甚至更优选地，趋化因子受体途径抑制剂以介于5mg/天至50mg/天的剂量提供。例如，趋化因子受体途径抑制剂为丙帕锗并且以30mg/天的剂量提供。

该剂型可包含约5mg至1g血管紧张素受体阻断剂或其药学上可接受的盐，及约5mg至1g趋化因子受体途径抑制剂或其药学上可接受的盐。该剂型可包含介于约50mg至500mg之间的血管紧张素受体阻断剂的每日剂量。血管紧张素受体阻断剂可为厄贝沙坦，并且该剂型可包含约300mg的厄贝沙坦的每日剂量。该剂型还可包含介于约5mg至50mg之间的趋化因子受体途径抑制剂的每日剂量。趋化因子受体途径抑制剂可为丙帕锗并且该剂型可包含约30mg的丙帕锗的每日剂量。

然而，应理解，对于任何特定患者的具体剂量水平将取决于多种因素，包括所采用的具体化合物的活性、年龄、体重、总体健康状况、性别、饮食、施用时间、施用途径、排泄速率、药物组合及经受治疗的特定疾病的严重性。

在各种方面，本发明药剂可通过注射施用，或制备成用于经口、肺、鼻施用或任何其它施用形式。优选地，该药剂可例如通过静脉内、皮下、肌肉内、眶内、眼内、心室内、颅内、囊内、脊柱内、脑池内、腹膜内、颊、直肠、阴道、鼻内施用或通过气溶胶施用。

施用模式在一方面至少适合于药剂被制备的形式。用于最有效应答的施用模式在一方面凭经验确定，下述施用方式作为实例给出，而不以任何方式限制本发明组合物的递送方法。所有以上制剂都是制药工业中常用的，并且是具有适当资格的从业者普遍已知的。

在某些方面，本发明药剂可包括药学上可接受的无毒赋形剂和载体，并且可通过任何肠胃外技术，例如皮下、静脉内和腹膜内注射施用。另外，该制剂可任选地含有一种或多种佐剂。如本文所用的“药物载体”是用于递送化合物至受试者的药学上可接受的溶剂、悬浮剂、赋形剂或媒介物。该载体可以为液体或固体，并且根据所考虑的施用方式加以选择。

适合于注射使用的药物形式任选地包括无菌水溶液（当可溶于水时）或分散体及用于即时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。替代地，本发明化合物在某些方面封装在脂质体中并且以可注射溶液形式递送以帮助它们穿过细胞膜的转运。替代地或另外地，此类制剂含有自组装孔结构的组分以促进穿过细胞膜的转运。该载体在各个方面均为溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇（例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等）、它们的合适的混合物，及植物油。例如而非限制性地，通过使用诸如卵磷脂的包衣、在分散体情况下通过维持所需粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可注射组合物的延长吸收在某些方面通过在组合物中使用延迟吸收的试剂如单硬脂酸铝和明胶来实现。

本发明还提供了一种可注射的持续释放药物组合物，其包含治疗有效的根据本发明的药物组合物及释放阻滞剂。释放阻滞剂可为例如单硬脂酸铝和明胶。

无菌可注射溶液通过如下方式制备：将需要量的活性化合物，当需要时，与各种上文列举的其它成分一起掺入在合适的溶剂中，然后过滤灭菌。一般来说，分散体通过将各种经灭菌的活性成分和来自上文列举的其它成分的所需其它成分掺入到含有基本分散介质的无菌媒介物中来制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备在某些方面包括而不限于真空干燥和冷冻干燥技术，所述真空干燥和冷冻干燥技术从先前无菌过滤的活性成分外加任何另外的所需成分的溶液制备活性成分外加任何另外的所需成分的粉末。

本文中考虑使用口服固体剂型，其一般地描述于Martin,Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版（1990Mack PublishingCo.Easton PA18042）第89章中，其以引用的方式并入本文。固体剂型包括片剂、胶囊、丸剂、锭剂或糖锭、扁囊剂或小丸剂。此外，可使用脂质体或类蛋白包封调配本发明组合物（如，例如，美国专利第4,925,673号中所报道的类蛋白微球体）。可以使用脂质体包封并且可用多种聚合物对脂质体进行衍生化（例如，美国专利第5,013,556号）。治疗剂的可能的固体剂型由Marshall描述于Modern Pharmaceutics，第10章，Banker和Rhodes编辑，(1979)中，其以引用的方式并入本文。一般来说，制剂将包括作为本发明的一部分描述的化合物（或其化学修饰形式），及允许针对胃环境提供保护并且允许生物活性材料在肠中释放的惰性成分。

对于本发明的趋化因子受体途径抑制剂或血管紧张素受体阻断剂，释放位置可以为胃、小肠（十二指肠、空肠，或回肠），或大肠。本领域技术人员可以获得在胃中不溶解，而将在十二指肠或肠内其它地方释放所述材料的制剂。在一方面，所述释放将避免胃环境的有害影响，通过对组合物进行保护或通过在胃环境之外，例如在肠中释放所述化合物来避免胃环境的有害影响。

本发明进一步提供了一种口服持续释放药物组合物，其包含治疗有效的根据本发明的药物组合物及释放阻滞剂。

在本发明的一方面，释放阻滞剂为水溶性、水溶胀性和/或水不溶性聚合物。特别地，水溶性聚合物选自包含以下的组：乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、肠溶衣；及半透膜。在本发明的另一方面，释放阻滞剂为非聚合型释放阻滞剂。更具体地，非聚合型释放阻滞剂为氢化蓖麻油。可根据本领域中已知的常规程序，将本发明组合物磨碎或造粒并压制成片剂或包封到胶囊中。

为了确保完全的耐胃液能力，使用对至少pH5.0不可渗透的包衣。用作肠溶衣的较常见的惰性成分的实例为乙酸-1,2,4-苯三酸纤维素(CAT)、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(HPMCP)、HPMCP50、HPMCP55、聚乙酸乙烯邻苯二甲酸酯(PVAP)、丙烯酸树脂(Eudragit)L30D、Aquateric、邻苯二甲酸乙酸纤维素(CAP)、Eudragit L、EudragitS，和虫胶(Shellac)。这些包衣可作为混合膜使用。

也可以在片剂上使用包衣或包衣混合物，其不是意欲针对胃进行保护。这包括而不限于糖包衣，或者使得片剂较容易吞咽的包衣。示例性胶囊由用于递送干燥治疗剂，即，粉剂的硬壳（如明胶）组成；对于液体形式，可使用软明胶壳。扁囊剂的壳材料在某些方面为厚淀粉或其它可食用的纸。对于小丸剂、糖锭、模制片剂或片剂研制剂，可考虑而不限于湿法块化技术。

如本文所用的术语“持续释放”意指在口服摄入后经历相对延长的时间逐渐但连续或持续释放治疗化合物含量。所述释放可在药物组合物从胃传递之后一直持续到药物组合物到达肠和到达肠后。措辞“持续释放”还意指延迟释放，其中治疗化合物的释放在药物组合物到达胃后没有立即开始，而是延迟一段时间，例如一直延迟到药物组合物到达肠时。在到达肠后，pH的增加然后可触发治疗化合物从药物组合物中释放。

尽管本文所用的术语“释放阻滞剂”意指当口服摄入时减慢治疗化合物从药物组合物中释放的速率的物质。释放阻滞剂可为聚合物或非聚合物。可根据数种持续释放体系中的任一种使用释放阻滞剂，所述数种持续释放体系包括例如扩散体系、溶解体系和/或渗透体系。

在某些方面，治疗剂作为约1mm粒度的细粒或团粒的形式的微细多颗粒包括在制剂中。在某些方面，用于胶囊施用的材料的制剂为粉剂、轻微压缩的栓塞(plug)或甚至为片剂。在一方面，治疗剂可通过压制制备。

着色剂和调味剂可任选地包括在内。例如，可以调配化合物（例如，而非限制性地，通过脂质体或微球体包封），然后进一步将其包含在可食用产品，例如含有着色剂和调味剂的冷藏饮料中。

在一方面，用惰性材料稀释或增加治疗剂的体积。这些稀释剂可包括碳水化合物，尤其甘露醇、α-乳糖、无水乳糖、纤维素、蔗糖、修饰葡聚糖和淀粉。也可以任选地使用某些无机盐作为填料，包括三磷酸钙、碳酸镁和氯化钠。一些可商购获得的稀释剂为Fast-Flo、Emdex、STA-Rx1500、Emcompress和Avicell。

在其它实施方案中，在制成固体剂型的治疗剂的制剂中包括崩解剂。用作崩解剂的材料包括但不限于淀粉，包括基于淀粉的市售崩解剂Explotab。还考虑了淀粉羟乙酸钠、安伯莱特(Amberlite)、羧甲基纤维素钠、超支链淀粉(ultramylopectin)、藻酸钠、明胶、橙皮、酸性羧甲基纤维素、天然海绵和膨润土。另一种形式的崩解剂为不溶性阳离子交换树脂。粉末状树胶也任选地用作崩解剂及用作粘合剂，并且这些包括而不限于诸如琼脂、梧桐胶(Karaya)或黄蓍胶的粉末状树胶。海藻酸和其钠盐也可用作崩解剂。

考虑用粘合剂使治疗化合物结合在一起从而形成硬片剂，粘合剂包括而不限于来自天然产物的材料，例如阿拉伯胶、黄蓍胶、淀粉和明胶。其它粘合剂包括而不限于甲基纤维素(MC)、乙基纤维素(EC)和羧甲基纤维素(CMC)。考虑在醇溶液中使用聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)和羟丙基甲基纤维素(HPMC)来使治疗剂成为颗粒。

在治疗剂的制剂中可任选地包括抗摩擦剂以防止调配过程期间的粘着。可任选地使用润滑剂作为介于治疗剂与模壁之间的层，这些润滑剂可包括但不限于：硬脂酸，包括其镁和钙盐，聚四氟乙烯(PTFE)，液体石蜡，植物油和蜡。也可使用示例性可溶性润滑剂，例如包括月桂基硫酸钠、月桂基硫酸镁、具有多种分子量的聚乙二醇，及Carbowax4000和6000。

可任选地加入助流剂，其可改善调配期间化合物的流动性质并且帮助压制期间的重排。助流剂可包括而不限于淀粉、滑石、火成二氧化硅和水合硅铝酸盐。

为了帮助治疗剂溶解到水性环境中，在某些实施方案中可加入表面活性剂作为湿润剂。表面活性剂可包括，例如而不限于阴离子去污剂，例如月桂基硫酸钠、磺基琥珀酸二辛酯钠和磺酸二辛酯钠。可任选地使用阳离子去污剂，其包括而不限于苯扎氯铵或苄索氯铵。可作为表面活性剂包括在制剂中的潜在非离子型去污剂的列表为聚桂醇400，聚氧乙烯40硬脂酸酯，聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60，甘油单硬脂酸酯，聚山梨醇酯40、60、65和80，蔗糖脂肪酸酯，甲基纤维素和羧甲基纤维素。当使用时，这些表面活性剂可单独地或作为不同比例的混合物存在于所述化合物的制剂中。

潜在地增强化合物的摄取的添加剂为，例如而不限于脂肪酸油酸、亚油酸和亚麻酸。

控制释放制剂可能是理想的。也考虑了该制剂。在某些方面，可将化合物掺入到允许通过扩散或浸出机制释放的惰性基质，即树胶中。在一些方面，也可将缓慢变性的基质掺入到制剂中。这种治疗剂的控制释放的另一种形式是通过基于Oros治疗系统(Alza Corp.)的方法，即，将药物封装在半透性膜中，该膜允许水进入并且将药物从由于渗透效应形成的单个小开口中推出。一些肠溶衣也具有延迟释放作用。

在其它方面，可使用材料混合物提供最佳膜包衣。膜包衣可在，例如而非限制性地，盘状涂布器中或在流化床中或通过压制包衣法进行。

本文还考虑了经肺递送化合物。在这些方面，化合物可在吸入时被递送到哺乳动物的肺中并且穿过肺上皮内衬进入血流。

考虑在本发明的实践中使用设计用于经肺递送治疗产品的各种各样的机械装置，包括但不限于喷雾器、定量吸入器，和粉末吸入器，它们都是本领域技术人员熟知的。

适合于本发明实践的可商购获得的装置的一些具体实例为，例如而不限于由Mallinckrodt,Inc.,St.Louis,Missouri制造的Ultravent喷雾器；由Marquest Medical Products,Englewood,Colorado制造的Acorn II喷雾器；由Glaxo Inc.,Research Triangle Park,North Carolina制造的Ventolin定量吸入器；及由Fisons Corp.,Bedford,Massachusetts制造的Spinhaler粉末吸入器。

所有此类装置都需要使用适合于分配化合物的制剂。通常，每种制剂是所采用装置的类型所特有的，并且除了可用于治疗的常用稀释剂、佐剂和/或载体之外，还可涉及合适的抛射剂材料的使用。此外，考虑使用脂质体、微囊剂或微球体，包括复合物，或者其它类型的栽体。

适合于与喷射或超声喷雾器一起使用的制剂将通常包含悬浮于水中的化合物。该制剂在一方面还可包括缓冲剂和简单的糖（例如，用于蛋白质稳定化和渗透压调节）。在一个实施方案中，喷雾器制剂还可以含有表面活性剂，以减少或者防止在形成气溶胶过程中由于溶液的雾化引起的表面诱导的化合物聚集。

在一方面，用于与定量吸入器装置一起使用的制剂将一般包含细碎的粉末，其含有借助于表面活性剂悬浮在抛射剂中的化合物。抛射剂可以为用于这个目的的任何常规材料，例如而不限于氯氟烃、氢氯氟烃、氢氟烃或者烃，包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇，和1,1,1,2-四氟乙烷，或者它们的组合。合适的表面活性剂包括而不限于山梨糖醇酐三油酸酯和大豆卵磷脂。油酸也可以在某些方面用作表面活性剂。

用于从粉末吸入器装置分配的制剂将包含含有所述化合物的细碎的干燥粉剂，并且还可包括促进粉剂从装置分散的量，例如，按重量计为制剂的50%至90%的增量剂，例如而不限于乳糖、山梨醇、蔗糖或甘露醇。在某些实施方案中，所述一种（多种）化合物被制备成颗粒形式，其平均粒度小于10微米，最优选0.5至5微米，以便最有效地递送至远端肺。

还考虑了化合物的鼻递送。鼻递送允许在向鼻子施用治疗产品后蛋白质直接通过血流，而不必使所述产品沉积在肺中。用于鼻递送的制剂包括使用例如而不限于葡聚糖或环状葡聚糖(cyclodextran)的那些制剂。.

应理解，在某些方面，本发明药剂可作为单次剂量方案给予，或者优选地，以多次剂量方案给予。多次剂量方案是这样的方案，其中主要递送过程可利用1至10个独立剂量，任选地在此后根据维持或加强治疗的需要在后续时间间隔给予其它剂量。该给药方案将也至少部分地根据个体需要及从业者的判断来确定。

本发明因而提供了一种包含本发明药物组合物的片剂、包含本发明药物组合物的胶囊和包含本发明药物组合物的可注射混悬剂，及包含本发明药物组合物的用于肺递送的组合物。

评估药物组合物的功效

在本发明的另一方面，提供了一种评估本发明药物组合物的功效的方法，其中所述方法包括选自包括以下的组的步骤：经由体外生物化学或细胞测定评估由MCP-1引起的单核细胞的体外趋化性迁移；测量肌醇磷酸产生、细胞外调节激酶(ERK)磷酸化或cAMP产生；使用无标记技术，例如使用阻抗、光折射或电荷再分配测量组合物的效果；使用邻近报告系统或其它途径测量G蛋白偶联；测量β-抑制蛋白募集或介导的信号传导；使用基于转录因子的报告系统测量组合物的效果；利用体外生物化学或细胞技术测量细胞定位，例如使用荧光标记显微可视化、使用抗体（例如酶联免疫吸附测定）和荧光活化细胞分选术；例如经由自动分析器测量指示肾功能的体内血浆肌酐和尿素水平；测量蛋白尿水平，经由放射免疫测定测量白蛋白尿水平；测量GFR（单次激发同位素技术）；经由光学显微术(LM)评估肾和/或心脏和/或眼部或其它组织结构；评估肾小球和/或心肌肥厚、肾小球硬化和/或纤维化的存在和/或程度；评估基质沉积的程度、评估促纤维化生长因子及其活性的调节；评估肾和/或心脏结构和/或眼部结构和/或其它组织结构；及评估收缩压、胰岛素空腹血浆葡萄糖的调节，和/或血红蛋白A1c的调节。

在本发明的进一步方面，提供了一种评估本发明药物组合物的抑制或部分抑制活性的方法，其中抑制或部分抑制由如用以下的一个或多个衡量的肾和/或心脏和/或眼部和/或其它组织结构的质量改进来指示：血浆肌酐和尿素的水平；蛋白尿的水平、白蛋白尿的水平；GFR（使用单次激发同位素技术）；肾和/或心脏和/或眼部结构的完整性；基质沉积的程度；促纤维化生长因子活性的调节；使用光学显微术(LM)评估的肾小球和/或心肌肥厚、肾小球硬化和/或纤维化；使用免疫组织化学测量的基质沉积的程度和促纤维化生长因子及其活性的调节；及使用分子生物技术评估的肾和/或心脏和/或眼部结构。

现通过仅参考下列非限制性实施例来进一步描述本发明。然而，应理解，下列实施例仅是说明性的，而不能以任何方式视为对上述发明的综述的限制。

实施例

实施例1–在STNx模型中蛋白尿减少（低剂量丙帕锗）

肾大部分切除(STNx)手术

动物

六周龄的体重200-250g的雄性斯普拉-道来氏(Sprague-Dawley)(SD)大鼠来源于Animal Resources Centre(Western Australia)。本动物研究是在动物伦理委员会(Animal Ethics Committee)（圣文森医院(StVincent's Hospital)和澳大利亚国家健康与医学研究基金会(NationalHealth and Medical Research Foundation of Australia)）的批准下进行的。所有大鼠都接受正常大鼠食物（合格的啮齿类食物#5002，LabDiet，USA）并自由饮水。所有动物都圈养在稳定环境中，该环境被维持在22±1℃下，从早上6点开始12-小时的光亮/黑暗循环。在St Vincent's Experimental Surgical Unit的手术室中执行STNx手术。所有手术程序都修改自先前描述的那些（Gilbert,R.E.,L.L.Wu等(1999)."Pathological expression of renin and angiotensin II in the renaltubule after subtotal nephrectomy.Implications for the pathogenesis oftubulointerstitial fibrosis."Am J Pathol155(2):429-40.；Kelly,D.J.,A.J.Edgley等(2009)."Protein kinase C-beta inhibition attenuates theprogression of nephropathy in non-diabetic kidney disease."Nephrol Dial Transplant24(6):1782-90.；Kelly,D.J.,C.Hepper等(2003)."Vascularendothelial growth factor expression and glomerular endothelial cell lossin the remnant kidney model."Nephrol Dial Transplant18(7):1286-92.；Wu,L.,A.Cox等(1997)."Transforming growth factorβ1and renalinjury following subtotal nephrectomy in the rat:Role of therenin-angiotensin system."Kidney Int51:1553-1567.）

术前护理

手术的前一天下午，给大鼠称重并通过经口灌胃给予大鼠一剂抗生素（氧四环素，30mg/kg）作为预防。然后让大鼠禁食过夜。

手术护理

·麻醉

在Perspex塑料盒中用与氧气混合的2.5%异氟烷诱导麻醉。

大鼠麻醉后，将大鼠背部置于热板（维持在37℃）上，然后将面罩放在大鼠鼻子和嘴上以递送异氟烷，用1-2%异氟烷/97%氧气以1ml/100g体重的潮气量维持麻醉。

·备皮

使用剪毛刀剃刮大鼠腹部从胸骨到骨盆区区域的毛。剃刮区域用含有洗必泰(Chlorhexidine)的酒精70%以圆周运动洗涤3次，在切口点（中线）开始并向外清洗。

·手术

将有小孔的盖布放在切口部位上，并用23号手术刀刀片制作从胸骨下方10mm处到生殖器上方10mm处的皮肤切口。然后暴露出肌肉层，并用组织钳提起肌肉层以允许沿腹白线（沿中线连接肌肉层的筋膜）切开。肌肉层的这种提起防止肠意外地被尖锐工具损害。

一旦使用手术刀刀片在肌肉层中制作出小孔，就使用细剪刀完成切口的制作。在这两种切口制作完成后，将纱布放在包围切口部位的盖布上，并使用0.9%生理盐水润湿纱布。使用润湿的棉签，找出左肾并将其提到纱布上。在显微镜下，然后使用齿镊和棉签将脂肪从肾盂上剥离，从而暴露出就在进入肾脏之前的肾动脉分支。然后使用精细镊通过钝性剥离分离出肾动脉的各个分支(3-4)。然后让4.0丝从动脉下穿过直至分离出足够的动脉以使血流不能到达2/3肾脏，从而使这个区域不再起作用。一旦确定没有出血并且1/3肾脏仍起作用，便将该肾脏放回腹部中。

然后暴露出右肾并去除肾小囊。使用4.0丝在肾盂处给肾脏打结，从而将整个肾脏和输尿管结扎。在一侧打三个结，将该丝穿到另一侧并再在另一侧打三个结。然后切出该肾脏。当确定没有出血时，将血管残端放回腹部中。然后可重新检查左肾以确保颜色变化充分并且剩余1/3肾脏仍起作用。在不产生任何损害的情况下检查左和右输尿管，然后将2.0ml0.9%生理盐水放入大鼠腹部中以帮助大鼠重新获得水，以防在腹腔打开时有体液损失。

·伤口闭合

然后使用5.0可溶解的缝合线（PGA-聚羟乙酸缝合线）以连续的针脚缝合肌肉层。然后以连续的针脚用4.0丝缝合皮肤。用含有洗必泰的酒精70%清洗该区域以除去皮肤上的任何血液。然后除去麻醉面罩并将Op-site喷雾剂（组织喷雾剂）喷洒到切口部位上以添加保护不受感染的额外屏障。当大鼠开始从麻醉中清醒过来时，皮下给予0.03mg/kg剂量的丁丙诺啡(Buprenorphine)(Temgesic)。

·恢复期

然后让大鼠在维持在37℃的热板上恢复。

术后护理

手术后，用饮水瓶及在其旁边的水瓶给予5%葡萄糖溶液以便给予大鼠饮用一种或另一种的选择。还将食物放在盒子底部以方便食用。术后12至24小时，如果大鼠没有进食或饮水，则皮下施用丁丙诺啡。术后24至48小时，如果大鼠出现情绪低落、不愿动弹，或者处于缩成一团的状态，则这可能是肾衰竭的结果。在这种情况下，使用过度剂量的戊巴比妥钠(pentobarbitone sodium)(120mg/kg ip)剔除该大鼠。

每隔4周，使用非侵入式血压(NIBP)控制器和Powerlab(ADinstruments,NSW,Australia)经由尾套体积描记法测定预热清醒大鼠的收缩压(SBP)。

假手术

对照大鼠将接受假手术，其由以下组成：如上所述的那样行剖腹术及在不剥离肾动脉的情况下操纵两个肾脏，之后闭合伤口。

研究设计和程序

在手术后14天开始处理

长期（12周）

·未经处理的组

组1、2 未经处理：对照、糖尿病

·单药剂组

组3 STNx+厄贝沙坦(ARB)（10mg/kg/天）

·组合组

组4 STNx+厄贝沙坦（10mg/kg/天）/丙帕锗（3mg/kg/天）

每组n=16只大鼠

临床参数

按照用于动物研究的标准方案每隔一段时间（每4周）进行收缩压(SBP)和临床参数的系列测量（Kelly DJ,Wilkinson-Berka JL,T.J.A，等：A new model of progressive diabetic renal impairment in thetransgenic(mRen-2)27rat.Kidney Int.54:343-352,1998）。

肾和心脏功能（主要终点）

按照用于动物研究的标准方案（Kelly等，1998），通过测量血浆肌酐和尿素（自动分析器）、白蛋白尿（放射免疫测定，每4周）和GFR（单次激发同位素技术，4和12周）来进行肾功能的系列测量。

未来实验-肾和心脏结构（次要终点）

可执行的进一步实验包括评估诸如肾和心脏结构的次要终点。例如，可使用光学显微术(LM)测量肾小球和心肌肥厚、肾小球硬化和纤维化。可使用免疫组织化学测量基质沉积的程度和促纤维化生长因子及其活性的调节。还可使用分子生物学评估肾和心脏结构。

统计学考虑

使用ANOVA用Fishers事后检验在动物组之间进行比较。计算出动物使用的合理性为每组n=16只大鼠（n=8用于组织学研究，n=8用于分子生物学研究）。p<0.05的值被认为具有统计显著性。在将数据对数转化并将几何平均值×/÷容许因子之后分析白蛋白尿。

如图1中所示，与未经处理的STNx动物和用单独的血管紧张素受体阻断剂(STNx+Irb)处理的动物相比较，当用血管紧张素受体阻断剂与低剂量丙帕锗(STNx+Irb+PPG)的组合处理动物时在终末器官肾疾病的肾大部分切除(STNx)模型中蛋白尿水平得到改善。

实施例2–在STNx模型中蛋白尿减少（高剂量丙帕锗）

如实施例1中所描述，但进行以下处理：

研究设计和程序

手术后14天开始处理。

长期（12周）

·未经处理的组

组1、2 未经处理：对照、糖尿病

·单药剂组

组3 STNx+厄贝沙坦(ARB)（10mg/kg/天）或STNx+丙帕锗（30mg/kg/天）

·组合组

组4 STNx+厄贝沙坦（10mg/kg/天）/丙帕锗（30mg/kg/天）

每组n=16只大鼠

如图2中所示，与未经处理的STNx动物、用单独的高剂量丙帕锗(STNx+PPG)处理的STNx动物，及用单独的血管紧张素受体阻断剂(STNx+Irb)处理的STNx动物相比较，当用血管紧张素受体阻断剂与高剂量丙帕锗的组合(STNx+PPG+Irb)处理动物时在终末器官肾疾病的肾大部分切除(STNx)模型中蛋白尿水平得到改善。

从上述终末器官肾疾病的肾大部分切除(STNx)模型获取组织切片，并根据标准程序进行染色以检测肾小球中的足细胞。通过相衬显微术评估组织切片。图3示出肾样品的肾小球中的被染成深棕色的细胞（足细胞），所述肾样品获自未经处理的对照动物(A)、未经处理的STNx动物(B)、用丙帕锗处理的STNx动物(C)、用厄贝沙坦处理的STNx动物(D)，及用丙帕锗与厄贝沙坦的组合处理的STNx动物(E)。图4示出所检测足细胞数目的改进的条形图。可看出，用厄贝沙坦与丙帕锗的组合处理的动物的足细胞水平高于接受终末器官肾疾病的肾大部分切除(STNx)模型的未经处理的动物及用单独的丙帕锗或厄贝沙坦处理的STNx动物的足细胞水平。

实施例3–在HEK293FT细胞经由瞬时转染共表达AT1R和CCR2后，对这两种受体的联合抑制相对于对任一单独受体的抑制而言在更高的程度上阻断抑制蛋白募集。

通过将RS504393与厄贝沙坦组合使用来调查CCR2与AT1R体外抑制的组合作用。

图5示出AT1R和CCR2阻断对β-抑制蛋白2募集的影响。用为β-抑制蛋白2-Venus和指示的受体：CCR2-Rluc8（顶图）、AT1R-Rluc8（中间图），或AT1R-Rluc8和未标识CCR2（底图）编码的质粒瞬时转染HEK293FT细胞。

转染后24h，在HEPES缓冲的不含酚红的含5%FCS的完全培养基中收获细胞，并将其加入到聚-L-赖氨酸包被的白色96-孔板中。转染后48h，将该板与30μΜ EnduRen(Promega)一起在37℃,5%CO₂下温育2小时以确保达到底物平衡。

首先将细胞与厄贝沙坦(10μΜ)、RS504393(10μΜ)或二者组合一起在37℃下预温育30分钟或者不进行此种预温育。然后用100nMAngII、MCP-1或二者一起在37℃下刺激细胞30分钟或者不进行此种刺激，并测量BRET信号。

通过在激动剂加入之前和之后在400-475nm和520-540nm处测量连续光发射(sequential light emission)来在活细胞中执行BRET的检测。通过将经媒介物处理的细胞样品的520-540nm发射与400-475nm发射的比率从用配体（配体诱导的BRET）处理的相同细胞第二等分试样的相同比率中减去来计算BRET信号。数据表示为一式三份执行的三组独立实验的平均值±SEM。

如图5（顶图）中所示，在CCR2-Rluc8与β-抑制蛋白2-Venus之间，10μΜ RS504393显著降低MCP-1-诱导的BRET信号，而厄贝沙坦则没有此种作用。这两种拮抗剂的组合没有显著改变RS504393的抑制作用（图5：顶图）。相反，在共表达AT1R-Rluc8和β-抑制蛋白2-Venus的细胞中，10μΜ厄贝沙坦显著阻断AngII-诱导的BRET反应，而RS504393则没有此种作用，并且正如所预期的，它们的组合没有给出任何不同的效果（图5：中间图）。

然而，在共表达AT1R-Rluc8、β-抑制蛋白2-Venus和未标识CCR2的细胞中，其中AngII和MCP-1诱导的BRET都有不同程度的增加，厄贝沙坦似乎显著阻断AngII诱导的BRET，但没有显著阻断MCP-1诱导的BRET（图5：底图）。类似地，RS504393部分地阻断MCP-1促进的BRET信号，但没有部分地阻断AngII-促进的BRET信号（图5：底图）。重要地，这两种拮抗剂的组合将BRET反应降低至比利用任一单独的独立拮抗剂观察到的水平低的水平，从而为作为联合受体抑制的结果对受体介导的细胞应答，在这种情况下，β-抑制蛋白募集具有较大的抑制作用提供体外证据。

实施例4–在HEK293FT细胞经由瞬时转染共表达AT1R和CCR2后，对这两种受体的联合抑制相对于对任一单独受体的抑制而言在更高的程度上阻断肌醇磷酸信号传导。

将RS504393与厄贝沙坦组合使用来调查CCR2与AT1R体外抑制的组合作用。

图6示出AT1R和CCR2阻断对肌醇磷酸产生的影响。用为缺乏（顶图）和存在（底图）未标识CCR2的AT1R-Rluc8和β-抑制蛋白2-Venus编码的质粒瞬时转染HEK293FT细胞。转染后48h，利用IP-One Tb试剂盒(Cisbio Bioassays,Bagnol sur Ceze,France)使用细胞产生激动剂诱导的肌醇(1)磷酸(IP1)产生测量值。

首先将细胞与厄贝沙坦(10μΜ)、RS504393(10μΜ)或二者组合一起在37℃下预温育30分钟或者不进行此种预温育。然后再将细胞在含有100nM AngII、MCP-1或二者的刺激缓冲液（10mM HEPES，pH7.4，1mM CaCl₂，0.5mM MgCl₂，4mM KCl，146mM NaCl，5.5mM葡萄糖，及50mM LiCl）中在37℃下温育30分钟。然后通过加入先前稀释在含有1%Triton X-100的裂解缓冲液中的

测定试剂，铽穴合物-标记的抗-IP1抗体和d2-标记的IP1类似物来裂解细胞。将该试验物在室温下温育1小时，并分别在于340nm、620nm和665nm处激发后50μs，使用EnVision2102多标记读板仪(PerkinElmer)测量铽穴合物荧光和时间分辨FRET信号。

数据归一化为相对于表达单独AT1R的细胞中AngII-诱导的IP1产生的百分比。数据表示为一式三份执行的三组独立实验的平均值±SEM。

如图6（顶图）中所示，10μΜ厄贝沙坦显著消除表达AT1R-Rluc8的细胞中AngII-诱导的IP1产生，而RS504393则没有此种作用。在缺乏CCR2共表达的情况下，厄贝沙坦与RS504393的组合没有显著改变厄贝沙坦的作用，表明该拮抗剂具有特异性。

在共表达AT1R-Rluc8和CCR2的细胞中，除了AngII-介导的IP1反应之外，MCP-1还似乎刺激部分IP1反应（图6：底图）。有趣地，厄贝沙坦部分地减少MCP-1-诱导的IP1产生，并且显著地抑制AngII诱导的反应（图6：底图）。相比之下，RS504393对AngII-诱导的IP1产生的影响很小，但显著地且选择性地抑制MCP-1-诱导的IP1反应（图6：底图）。更有趣地，这两种拮抗剂的组合显著消除MCP-1和AngII促进的IP1产生，因为这两种受体同时被抑制（图6：底图）。综合起来，这些数据清楚地指示MCP-1-依赖性IP1反应经由CCR2的特异性并且暗示AT1R和CCR2的活化都是此种反应所需要的。此外，这些调查结果为作为联合受体抑制的结果对受体介导的细胞应答，在这种情况下肌醇磷酸产生具有较大的抑制作用提供进一步的体外证据。

实施例5-在HEK293FT细胞经由瞬时转染共表达AT1R和CCR2后，对这两种受体的联合抑制相对于对任一单独受体的抑制而言在更高的程度上阻断抑制蛋白募集，如使用标识与未标识受体的相反取向并使用这两种不同的AngII拮抗剂中的任一种观察到的。

通过将RS504393与厄贝沙坦或EXP3174（氯沙坦活性代谢物）组合使用来调查CCR2和AT1R体外抑制的组合作用。

图7示出AT1R和CCR2阻断对β-抑制蛋白2募集的影响。用为缺乏（顶图）和存在（底图）血凝素(HA)-标识的AT1R的CCR2-Rluc8和β-抑制蛋白2-Venus编码的质粒瞬时转染HEK293FT细胞。

首先将细胞与厄贝沙坦(10μΜ)、EXP3174（氯沙坦活性代谢物；10μΜ）、RS504393(10μΜ)，或者厄贝沙坦与RS504393或EXP3174与RS504393的组合一起在37℃下预温育30分钟或者不进行此种预温育。然后用100nM AngII、MCP-1或二者一起在37℃下刺激细胞30分钟或者不进行此种刺激，并测量BRET信号。

通过在激动剂加入之前和之后在400-475nm和520-540nm处测量连续光发射来在活细胞中执行BRET的检测。通过将经媒介物处理的细胞样品的520-540nm发射与400-475nm发射的比率从用配体（配体诱导的BRET）处理的相同细胞第二等分试样的相同比率中减去来计算BRET信号。

如图7（顶图）中所示，在共表达CCR2-Rluc8和β-抑制蛋白2-Venus的细胞中，100nM AngII没有影响。10μΜRS504393显著地阻断MCP-1-诱导的BRET反应，而厄贝沙坦和EXP3174都没有此种作用，并且正如所预期的，它们的组合没有给出任何不同的效果（图7：顶图）。

然而，在共表达CCR2-Rluc8、β-抑制蛋白2-Venus和HA-标识的AT1R的细胞中，其中AngII和MCP-1诱导的BRET有不同程度的增加，RS504393显著地抑制MCP-1-诱导的BRET，但没有显著地抑制AngII-诱导的BRET（图7：底图）。类似地，厄贝沙坦或EXP3174部分地阻断AngII-促进的BRET信号，但没有部分地阻断MCP-1-促进的BRET信号（图7：底图）。然而，值得注意的是，在用MCP-1和AngII组合处理的情况下，尽管用RS504393处理，但仍然存在相当大的BRET信号。重要地，厄贝沙坦或EXP3174与RS504393的组合将BRET反应降低至比利用任一单独的独立拮抗剂观察到的水平低的水平，从而为作为联合受体抑制的结果对受体介导的细胞应答，在这种情况下，β-抑制蛋白募集具有较大的抑制作用提供体外证据。

实施例6-在HEK293FT细胞经由瞬时转染共表达AT1R和CCR2后，对这两种受体的联合抑制相对于对任一单独受体的抑制而言在更高的程度上阻断肌醇磷酸信号传导，如利用另一种AngII拮抗剂EXP3174，氯沙坦的活性代谢物证明的。

将RS504393与EXP3174组合使用来调查CCR2与AT1R体外抑制的组合作用。

图8示出AT1R和CCR2阻断对肌醇磷酸产生的影响。用为缺乏（顶图）和存在（底图）未标识CCR2的AT1R-Rluc8和β-抑制蛋白2-Venus编码的质粒瞬时转染HEK293FT细胞。转染后48h，利用IP-One Tb试剂盒(Cisbio Bioassays,Bagnol sur Ceze,France)使用细胞产生激动剂-诱导的肌醇(1)磷酸(IP1)产生测量值。

首先将细胞与EXP3174(10μΜ)、RS504393(10μΜ)或二者组合一起在37℃下温育30分钟。然后再将细胞在含有100nM AngII、MCP-1或二者的刺激缓冲液（10mM HEPES，pH7.4，1mM CaCl₂，0.5mM MgCl₂，4mM KCl，146mM NaCl，5.5mM葡萄糖，和50mMLiCl）中在37℃下温育30分钟。然后通过加入先前稀释在含有1%Triton X-100的裂解缓冲液中的

测定试剂，铽穴合物-标记的抗-IP1抗体和d2-标记的IP1类似物来裂解细胞。将该试验物在室温下温育1小时，并分别在于340nm、620nm和665nm处激发后的50μs，使用EnVision2102多标记读板仪(PerkinElmer)测量铽穴合物荧光和时间分辨FRET信号。数据表示为诱导的IP1（任意单位）。IP-One Tb试剂盒是一种竞争测定，所以IP1的诱导导致绝对测定信号减小。因此，诱导的IP1（任意单位）由从基础测定信号中减去配体诱导的测定信号而得出。

如图8（顶图）中所示，10μΜEXP3174消除表达AT1R-Rluc8的细胞中AngII-诱导的IP1产生，而RS504393则没有此种作用。在缺乏CCR2共表达的情况下，EXP3174与RS504393的组合没有显著改变EXP3174的作用，表明该拮抗剂具有特异性。

在共表达AT1R-Rluc8和CCR2的细胞中，除了AngII-介导的IP1反应之外，MCP-1还似乎刺激部分IP1反应（图8：底图）。EXP3174显著地抑制AngII诱导的反应（图8：底图）。相比之下，RS504393对AngII-诱导的IP1产生的影响很小，但显著地且选择性地抑制MCP-1-诱导的IP1反应（图8：底图）。更有趣地，这两种拮抗剂的组合显著地消除MCP-1和AngII促进的IP1产生，因为这两种受体同时被抑制（图8：底图）。这些调查结果为作为联合受体抑制的结果对受体介导的细胞应答，在这种情况下肌醇磷酸产生具有较大的抑制作用提供进一步的体外证据。

实施例7-AT1R的特异性活化以剂量依赖性方式抑制MCP-1-介导的与Gαi1的偶联，从而为AT1R调节CCR2功能提供体外证据并且为除了抑制AngII之外还要抑制CCR2提供进一步的理论基础。

图9示出指示如用配体诱导的BRET衡量的就Gαi1偶联而言在缺乏和存在活化的AT1R的情况下活化CCR2的影响的剂量反应曲线。用为缺乏（顶图）和存在（底图）血凝素(HA)-标识的AT1R的Gα_i1-Rluc8和CCR2-YFP编码的质粒瞬时转染HEK293FT细胞。转染后48h，使用细胞，在活细胞中在各种浓度的MCP-1的存在下或在存在100nM MCP-1的情况下在各种浓度的AngII的存在下产生激动剂-诱导的BRET信号数据。

在加入BRET底物后，通过在激动剂加入之前和之后在400-475nm和520-540nm处测量连续光发射来在活细胞中执行BRET的检测。通过将经媒介物处理的细胞样品的520-540nm发射与400-475nm发射的比率从用配体（配体诱导的BRET）处理的相同细胞第二等分试样的相同比率中减去来计算BRET信号。CCR2的活化导致BRET比率减小，指示活化导致预先与CCR2组装在一起的Gαi1蛋白的构象发生变化，如最近针对PAR1-Gαi1相互作用描述的(Ayoub MA,Trinquet E,Pfleger KDG and Pin JP(2010)Differential associationmodes of the thrombin receptor PARI with Gαi1,Gα12andβ-arrestin1.FASEB J24:3522-3535)。因此，该数据已表示为‘BRET变化（相对于对照的%）’，使得利用1μΜMCP-1观察到的BRET信号变化被指定为100%，而BRET信号无变化被指定为0%。

MCP-1以剂量依赖性方式改变分别与Gαi1和CCR2融合的Rluc8与YFP之间的距离和/或取向，指示受体活化及与Gαi1-介导的信号传导偶联。在缺乏AT1R共表达的情况下，增加AngII的剂量没有改变所观察到的MCP-1-诱导的BRET信号变化（图9：顶图）。相比之下，当AT1R被共表达时，AngII以剂量依赖性方式抑制MCP-1-诱导的BRET信号变化（图9：底图）。

本实施例提供了AngII抑制MCP-1-诱导的CCR2对Gαi1偶联的活化的证据。因此，使用AngII拮抗剂单独地阻断AngII预期将去除对MCP-1-诱导的Gαi1信号传导的这种抑制。用CCR2途径抑制剂与AngII拮抗剂组合处理预期将阻止被AT1R阻断恶化的CCR2-介导的Gαi1的活化。

因此，本实施例提供了支持使用CCR2途径抑制剂与AT1R拮抗剂的组合的理论基础的进一步的体外证据。

Claims

1.一种药物组合物，其包含：

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述趋化因子受体途径抑制剂抑制或部分地抑制趋化因子受体。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的药物组合物，其中所述趋化因子受体选自包含以下的组：CC趋化因子受体1(CCR1)、CC趋化因子受体2(CCR2)、CC趋化因子受体3(CCR3)、CC趋化因子受体4(CCR4)、CC趋化因子受体5(CCR5)、CC趋化因子受体6(CCR6)、CC趋化因子受体7(CCR7)、CC趋化因子受体8(CCR8)、CC趋化因子受体9(CCR9)、CC趋化因子受体10(CCR10)、CXC趋化因子受体1(CXCR1)、CXC趋化因子受体2(CXCR2)、CXC趋化因子受体3(CXCR3)、CXC趋化因子受体4(CXCR4)、CXC趋化因子受体5(CXCR5)、CXC趋化因子受体6(CXCR6)和CXC趋化因子受体7(CXCR7)、G蛋白偶联XC趋化因子受体1(XCR1)、G蛋白偶联CX3趋化因子受体(CX₃CR1)、G蛋白偶联CCX-CKR趋化因子受体(CCX-CKR)、G蛋白偶联D6趋化因子受体(D6)、G蛋白偶联DARC/Duffy趋化因子受体(DARC)，及CCR/CXCR/XCR/CX₃CR/CCX-CKR/D6/DARC趋化因子受体。

4.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述趋化因子受体途径抑制剂选自包含以下的组：直接CCR2拮抗剂、逆CCR2激动剂、负性别构CCR2调节剂；间接CCR2拮抗剂、间接逆CCR2激动剂，及间接负性别构CCR2调节剂。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的药物组合物，其中所述趋化因子受体途径抑制剂选自包含以下的组：RS504393、RS102895、MLN-1202、INCB8696、MK-0812、CCX140、PF-4136309、BMS-741672；Repertaxin(CXCR2)、TAK-779(CCR5)、TAK-220(CCR5)、TAK-652(CCR5)、AK692(CCR5)、CMPD167(CCR5)、BX-471(CCR1)、AMD3100(CXCR4)、AMD11070(CXCR4)、FC131(CXCR4)、MLN3897(CCR1)、CP-481715(CCR1)，和GW-873140(CCR5)。

6.一种药物组合物，其包含：

b)至少一种抑制除所述趋化因子受体以外的趋化因子受体途径成分的趋化因子受体途径抑制剂或其药学上可接受的盐。

7.根据权利要求6所述的药物组合物，其中所述趋化因子受体途径抑制剂抑制或部分地抑制除所述趋化因子受体以外的趋化因子受体途径成分。

8.根据权利要求6或权利要求7所述的药物组合物，其中所述趋化因子受体途径抑制剂选自由以下组成的组：

(i)趋化因子受体或除所述趋化因子受体以外的趋化因子受体途径成分的拮抗剂；

(ii)趋化因子受体或除所述趋化因子受体以外的趋化因子受体途径成分的逆激动剂；

(iii)趋化因子受体或除所述趋化因子受体以外的趋化因子受体途径成分的负性别构调节剂；

9.根据权利要求1或权利要求6至8所述的药物组合物，其中所述趋化因子受体途径抑制剂通过靶向一种或多种选自包含CD55、CD59和CD16的组的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白来抑制MCP-1诱导的单核细胞的迁移和活化及趋化性迁移。

10.根据权利要求1或权利要求6至8中任一项所述的药物组合物，其中所述趋化因子受体途径抑制剂使复合物CCR2/CD55和/或CCR2/CD59和/或CCR2/CD16稳定化。

11.根据权利要求1或权利要求6至9中任一项所述的药物组合物，其中所述趋化因子受体途径抑制剂为丙帕锗。

12.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述血管紧张素受体阻断剂抑制或部分地抑制所述血管紧张素受体的活化。

13.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述血管紧张素受体为血管紧张素受体1(AT1R;AT₁R)或血管紧张素受体2(AT2R;AT₂R)。

14.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述血管紧张素受体阻断剂选自包含以下的组：

a)血管紧张素受体拮抗剂；

b)血管紧张素受体逆激动剂；或

c)血管紧张素受体负性别构调节剂。

15.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述血管紧张素受体阻断剂选自包含以下的组：CGP-42112A（AT₂R拮抗剂）、依普沙坦(AT₁R)、氯沙坦(AT₁R)、缬沙坦(AT₁R)、替米沙坦(AT₁R)、厄贝沙坦(AT₁R)、坎地沙坦(AT₁R)、奥美沙坦(AT₁R)、PD123319(AT₂R)、ZD-7115(AT₁R)、沙拉新((Sar¹-Ala⁸)AngII)、Sarthran((Sar¹-Thr⁸)AngII)和DuP753(AT₁R)。

16.一种药物组合物，其包含：

a)奥美沙坦或其药学上可接受的盐；以及

17.一种药物组合物，其包含：

b)丙帕锗或其药学上可接受的盐。

18.一种药物组合物，其包含：

a)奥美沙坦或其药学上可接受的盐；以及

b)丙帕锗或其药学上可接受的盐。

19.一种药物组合物，其包含：

a)厄贝沙坦或其药学上可接受的盐；以及

20.一种药物组合物，其包含：

a)厄贝沙坦或其药学上可接受的盐；以及

21.一种药物组合物，其包含：

b)RS504393，或其药学上可接受的盐。

22.一种药物组合物，其包含：

a)厄贝沙坦或其药学上可接受的盐；以及

b)RS504393，或其药学上可接受的盐。

23.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物的总功效大于所述血管紧张素受体阻断剂或所述趋化因子受体途径抑制剂在施用任一组分而未施用另一组分时的功效。

24.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物的总功效大于所述血管紧张素受体阻断剂和所述趋化因子受体途径抑制剂在施用任一组分而未施用另一组分时的功效的总和。

25.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物的总功效等于所述血管紧张素受体阻断剂和所述趋化因子受体途径抑制剂在施用任一组分而未施用另一组分时的功效的总和。

26.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物的总功效小于所述血管紧张素受体阻断剂和所述趋化因子受体途径抑制剂在施用任一组分而未施用另一组分时的功效的总和。

27.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中组合的功效小于所述血管紧张素受体阻断剂和所述趋化因子受体途径抑制剂在施用任一组分而未施用另一组分时的功效的总和，并且所述治疗提供比单独施用的血管紧张素受体阻断剂或所述趋化因子受体途径抑制剂的单一治疗的功效高的功效。

28.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其进一步包含药学上可接受的载体。

29.一种评估根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物的功效的方法，其中所述方法包括选自包括以下的组的步骤：经由体外生物化学或细胞测定评估由MCP-1引起的单核细胞的体外趋化性迁移；测量肌醇磷酸产生、细胞外调节激酶(ERK)磷酸化或cAMP产生；使用无标记技术，包括使用阻抗、光折射或电荷再分配，来测量所述组合物的效果；使用邻近报告系统测量G蛋白偶联；测量β-抑制蛋白募集或介导的信号传导；使用基于转录因子的报告系统测量所述组合物的效果；经由体外生物化学或细胞技术测量细胞定位，包括使用荧光标记的显微可视化、酶联免疫吸附测定、通过荧光活化细胞分选术分选细胞的应用；测量指示肾功能的体内血浆肌酐和尿素水平，包括使用自动分析器进行测量；经由放射免疫测定测量白蛋白尿水平；测量GFR（单次激发同位素技术）；经由光学显微术(LM)评估肾和心脏结构；评估肾小球和/或心肌肥厚、肾小球硬化和/或纤维化的存在和/或程度；评估基质沉积的程度、评估促纤维化生长因子及其活性的调节；评估肾和心脏结构；及评估收缩压。

30.一种评估根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物的抑制或部分抑制活性的方法，其中所述抑制或部分抑制由如用以下的一个或多个衡量的肾和/或心脏和/或眼部和/或其它组织结构的质量改进来指示：血浆肌酐和尿素的水平；白蛋白尿的水平、蛋白尿的水平；GFR（使用单次激发同位素技术）；肾和/或心脏和/或眼部结构的完整性；基质沉积的程度；促纤维化生长因子活性的调节；肾小球和/或心肌肥厚、肾小球硬化和/或纤维化；基质沉积的程度和促纤维化生长因子及其活性的调节；及肾和/或心脏和/或眼部结构。

31.一种治疗、改善或预防病状或疾病的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的(i)血管紧张素受体阻断剂与(ii)趋化因子受体途径抑制剂的组合。

32.一种治疗、改善或预防病状或疾病的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至28中任一项所述的药物组合物。

33.根据权利要求31或权利要求32所述的治疗方法，其中所述待治疗或预防的病状或疾病为选自包含以下的组的疾病：肾脏中的纤维化病症、由糖尿病肾病变引起的慢性肾脏疾病、肾功能不全、肾衰竭病状、糖尿病肾病变、肾小球肾炎、硬皮病、肾小球硬化、原发性肾脏疾病的蛋白尿、肾血管性高血压、心血管疾病、慢性心脏衰竭、高血压、充血性心脏衰竭、左心室功能不全、肥厚型心肌病变、糖尿病心肌病变、室上性和室性心律失常、心房颤动、心房扑动、心肌梗死及其后遗症、动脉粥样硬化、心绞痛、心脏衰竭、心绞痛、继发性醛固酮症、原发性和继发性肺高醛固酮症、原发性肺性高血压、糖尿病视网膜病变、胰岛素抵抗、血管病症、偏头痛、雷诺氏病、管腔增生、认知功能障碍、阿尔茨海默氏病、中风、高血钾、子痫前期、结节病、糖尿病、黄斑变性、HIV感染、AIDS发病机制、缺血再灌注损伤、动脉粥样化形成、慢性阻塞性肺疾病、哮喘、过敏性肾疾病，及类风湿关节炎。

34.根据权利要求31至33中任一项所述的治疗方法，其中当所述趋化因子受体抑制剂在所述趋化因子受体与所述血管紧张素受体缔合的情况下与所述趋化因子受体相互作用或调节所述趋化因子受体下游途径时具有较高的亲和力和/或效力和/或功效。

35.根据权利要求31至33中任一项所述的治疗方法，其中当将所述趋化因子受体抑制剂与血管紧张素受体阻断剂同时或相继施用给受试者时，组合的亲和力、效力和/或功效大于当所述趋化因子受体抑制剂不与所述血管紧张素受体阻断剂组合施用时所获得的亲和力、效力和/或功效。

36.根据权利要求31至33中任一项所述的治疗方法，其中当所述血管紧张素受体阻断剂在所述血管紧张素受体与所述趋化因子受体缔合的情况下与所述血管紧张素受体相互作用时具有较高的亲和力和/或效力和/或功效。

37.根据权利要求31至33中任一项所述的治疗方法，其中当将所述血管紧张素受体阻断剂与所述趋化因子受体抑制剂同时或相继施用给受试者时，组合的亲和力、效力和/或功效大于当所述血管紧张素受体阻断剂不与所述趋化因子受体抑制剂组合施用时所获得的亲和力、效力和/或功效。

38.一种包含至少一种血管紧张素受体阻断剂或其药学上可接受的盐，及至少一种趋化因子受体途径抑制剂或其药学上可接受的盐的药物组合物在制备用于治疗疾病的剂型中的用途。

39.根据权利要求1至28中任一项所述的药物组合物在制备用于治疗疾病的剂型中的用途。

40.根据权利要求39所述的用途，其中所述剂型包含约5mg至1g的所述血管紧张素受体阻断剂或其药学上可接受的盐，及约5mg至1g的所述趋化因子受体途径抑制剂或其药学上可接受的盐。

41.根据权利要求39或权利要求40所述的用途，其中所述剂型包含介于约50mg至500mg之间的血管紧张素受体阻断剂的每日剂量。

42.根据权利要求39至41中任一项所述的用途，其中所述血管紧张素受体阻断剂为厄贝沙坦，并且其中所述剂型包含约300mg的厄贝沙坦的每日剂量。

43.根据权利要求39至42中任一项所述的用途，其中所述剂型包含介于约5mg至50mg之间的趋化因子受体途径抑制剂的每日剂量。

44.根据权利要求39至43中任一项所述的用途，其中所述趋化因子受体途径抑制剂为丙帕锗并且其中所述剂型包含约30mg的丙帕锗的每日剂量。

45.根据权利要求38至44中任一项所述的用途，其中所述药物组合物进一步包含药学上可接受的载体。

46.一种口服持续释放药物组合物，其包含治疗有效的根据权利要求1至28中任一项所述的药物组合物及释放阻滞剂。

47.根据权利要求46所述的口服持续释放药物组合物，其中所述释放阻滞剂选自包含以下的组：乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、氢化蓖麻油、肠溶衣，及半透膜。

48.一种可注射的持续释放药物组合物，其包含治疗有效的根据权利要求1至28中任一项所述的药物组合物及释放阻滞剂。

49.根据权利要求48所述的可注射的持续释放药物组合物，其中所述释放阻滞剂为单硬脂酸铝或明胶。

50.一种片剂，其包含根据权利要求1至28中任一项所述的药物组合物。

51.一种胶囊，其包含根据权利要求1至28中任一项所述的药物组合物。

52.一种可注射混悬剂，其包含根据权利要求1至28中任一项所述的药物组合物。

53.一种用于肺或鼻递送的组合物，其包含根据权利要求1至28中任一项所述的药物组合物。

54.一种用于眼部递送的组合物，其包含根据权利要求1至28中任一项所述的药物组合物。