JP2023518395A - 指向性ゲノム編集のための方法及び組成物 - Google Patents
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Abstract
本明細書では、標的核酸の編集効率を増加させるための組成物及び方法が提供される。組成物は、ガイド核酸、Ｃａｓ９ニッカーゼ、又は逆転写酵素を含み得る。逆転写酵素は、Ｃａｓ９ニッカーゼに融合され得る。逆転写酵素は、Ｃａｓ９ニッカーゼとヘテロ二量体化し得る。逆転写酵素は、ガイド核酸に結合し得る。逆転写酵素は、処理能力を増加させるように操作され得る。ガイド核酸は、配列の合成又は編集を容易にするように操作され得る。ガイド核酸、Ｃａｓ９ニッカーゼ、及び逆転写酵素は、ＡＡＶベクター内に適合するように操作され得る。ガイド核酸は、遺伝子編集を改善するためにガイド核酸上の別の領域に結合する領域を含み得る。【選択図】図１９Ａ
Description
相互参照
本出願は、２０２０年３月１９日に出願された米国仮出願第６２／９９２，０３２号、２０２０年７月２３日に出願された米国仮出願第６３／０５５，８２９号、及び２０２１年２月２４日に出願された米国仮出願第６３／１５３，１６１号の利益を主張し、これらの全ては参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年３月１９日に出願された米国仮出願第６２／９９２，０３２号、２０２０年７月２３日に出願された米国仮出願第６３／０５５，８２９号、及び２０２１年２月２４日に出願された米国仮出願第６３／１５３，１６１号の利益を主張し、これらの全ては参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
配列表の参照による組み込み
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。当該ＡＳＣＩＩコピーは、２０２１年３月１６日に作成され、５６３８５－７０１＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔという名前であり、６０９，５５４バイトのサイズである。
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。当該ＡＳＣＩＩコピーは、２０２１年３月１６日に作成され、５６３８５－７０１＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔという名前であり、６０９，５５４バイトのサイズである。
標的核酸内に二本鎖切断を導入するＣａｓ指向性ゲノム編集技術は、頻繁に、ｐ５３の配列転座、挿入、欠失、及びＤＮＡ損傷修復の活性化、細胞周期停止、又はアポトーシス機能を含む望ましくない生成物をもたらす。一本鎖切断を導入する編集技術は、許容される変異の種類及びサイズにおいて限定され得るか、又は限定された編集効率を有し得る。正確性、効率、及び汎用性を向上させたゲノム編集技術についての必要性が存在する。
様々な態様において、本開示は、低いデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）濃度を有し、ＤＮＡポリメラーゼを含む細胞内で遺伝子編集効率を増加させる方法であって、この方法が、ベースラインｄＮＴＰ濃度と比較して、細胞内のｄＮＴＰ濃度を増加させることを含む、方法を提供する。様々な態様において、細胞内のｄＮＴＰ濃度を増加させることは、細胞内のデオキシヌクレオチド三リン酸トリホスホヒドロラーゼを阻害することを含む。様々な態様において、デオキシヌクレオチド三リン酸トリホスホヒドロラーゼは、ＳＡＭドメイン及びＨＤドメイン含有タンパク質１（ＳＡＭＨＤ１）を含む。様々な態様において、ＳＡＭＨＤ１を阻害することは、ＳＡＭＨＤ１をＶｐｘタンパク質と接触させること、又はＶｐｘタンパク質を細胞内で発現させることを含む。様々な態様において、ＳＡＭＨＤ１を阻害することは、ＳＡＭＨＤ１をＢＧＬＦ４タンパク質と接触させること、又はＢＧＬＦ４タンパク質を細胞内で発現させることを含む。様々な態様において、ＳＡＭＨＤ１を阻害することは、ＳＡＭＨＤ１をコードするｍＲＮＡを、ｍＲＮＡにハイブリダイズするマイクロＲＮＡ若しくはｓｉＲＮＡと接触させること、又はマイクロＲＮＡ若しくはｓｉＲＮＡを細胞内で発現させることを含む。様々な態様において、ＳＡＭＨＤ１を阻害することは、ＳＡＭＨＤ１を小分子ＳＡＭＨＤ１阻害剤と接触させることを含む。様々な態様において、細胞内のｄＮＴＰ濃度を増加させることは、ヌクレオシド又はヌクレオチド（例えば、ｄＮ、ｄＮＭＰ、又はＮＴＰ）を細胞に投与することを含む。様々な態様において、細胞にｄＮＴＰを投与することは、細胞を含む対象にヌクレオシド又はヌクレオチドを投与することを含む。様々な態様において、投与は、経口であるか、又は注射による。様々な態様において、細胞内のｄＮＴＰ濃度を増加させることは、ｄＮＴＰ合成酵素を細胞に送達することを含む。様々な態様において、ｄＮＴＰ合成酵素は、キナーゼを含む。様々な態様において、キナーゼは、ヌクレオシドキナーゼ、デオキシヌクレオシドキナーゼ、デオキシヌクレオシド一リン酸キナーゼ、又はデオキシヌクレオチド二リン酸キナーゼを含む。様々な態様において、ＤＮＡポリメラーゼは、逆転写酵素を含む。様々な態様において、細胞は、Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼ、ガイド核酸、又はそれらの組み合わせを更に含む。様々な態様において、低いｄＮＴＰ濃度は、非分裂細胞内に見出されるｄＮＴＰ濃度を含む。様々な態様において、低いｄＮＴＰ濃度は、活性化末梢血単核細胞内に見出されるｄＮＴＰ濃度未満である。様々な態様において、低いｄＮＴＰ濃度は、１マイクロモル未満のｄＮＴＰ濃度を含む。様々な態様において、ｄＮＴＰ濃度を増加させることは、ベースラインｄＮＴＰ測定値と比較して、ｄＮＴＰ濃度を、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、又はそれ以上増加させることを含む。様々な態様において、ｄＮＴＰ濃度は、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）濃度、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）濃度、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）濃度、若しくはデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）濃度、又はそれらの任意の組み合わせを含む。
様々な態様において、本開示は、本明細書に記載される組成物又は本明細書に記載されるガイド核酸を発現する細胞内でＶｐｘタンパク質を発現させることを含む、ゲノム編集効率を増加させる方法を提供する。
様々な態様において、本開示は、細胞内のｄＮＴＰ濃度を増加させることによってゲノム編集効率を増加させる方法を提供する。様々な態様において、本開示は、Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼ、逆転写酵素、及びガイド核酸を発現する細胞内でＳＡＭＨＤ１を阻害することを含む、ゲノム編集効率を増加させる方法を提供する。様々な態様において、本開示は、Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼ、逆転写酵素、及びガイド核酸を発現する細胞内でｄＮＴＰ濃度を増加させること（例えば、ＳＡＭＨＤ１を阻害することによって）を含む、ゲノム編集効率を増加させる方法を提供する。
いくつかの態様において、ＳＡＭＨＤ１を阻害することは、Ｖｐｘタンパク質を細胞内で発現させることを含む。いくつかの態様において、ＳＡＭＨＤ１を阻害することは、細胞内でＳＡＭＨＤ１に対するマイクロＲＮＡを発現させることを含む。いくつかの態様において、ＳＡＭＨＤ１を阻害することは、細胞を小分子ＳＡＭＨＤ１阻害剤で処理することを含む。
様々な態様において、本開示は、Ｃａｓニッカーゼ及び逆転写酵素を含む組成物であって、Ｃａｓニッカーゼ及び逆転写酵素は、別個のポリペプチド鎖であり、Ｃａｓニッカーゼ及び逆転写酵素は、Ｃａｓ－逆転写酵素ヘテロ二量体を形成する、組成物を提供する。
いくつかの態様において、Ｃａｓ－逆転写酵素ヘテロ二量体は、Ｃａｓニッカーゼに融合した第１のヘテロ二量体ドメインと、逆転写酵素に融合した第２のヘテロ二量体ドメインと、を含み、第１のヘテロ二量体ドメインは、第２のヘテロ二量体ドメインに結合して、ヘテロ二量体を形成する。いくつかの態様において、第１のヘテロ二量体ドメインは、ロイシンジッパーであり、第２のヘテロ二量体ドメインは、ロイシンジッパーである。いくつかの態様において、逆転写酵素は、配列番号３～配列番号２２のうちのいずれか１つのものに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、又はその断片を含む。いくつかの態様において、逆転写酵素は、Ｃａｓニッカーゼに融合した非長末端反復レトロトランスポーザブル（ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ）エレメントからのドメインを含む。いくつかの態様において、逆転写酵素は、Ｃａｓニッカーゼに融合した細菌性グループＩＩイントロンからの配列を含む。いくつかの態様において、逆転写酵素は、Ｃａｓニッカーゼに融合したレトロウイルスｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質からのドメインを含む。
本明細書に開示されるのは、Ｃａｓニッカーゼと、逆転写酵素と、を含む、組成物であり、Ｃａｓニッカーゼ及び逆転写酵素は、別個のポリペプチド鎖を含み、Ｃａｓニッカーゼ及び逆転写酵素は、ヘテロ二量体化するように操作されていない。
様々な態様において、本開示は、Ｃａｓニッカーゼと、逆転写酵素と、ガイド核酸と、を含む、組成物であって、第１のポリペプチドは、Ｃａｓニッカーゼを含み、第２のポリペプチドは、逆転写酵素を含み、ガイド核酸は、Ｃａｓニッカーゼ及び逆転写酵素に結合する、組成物を提供する。
いくつかの態様は、Ｃａｓニッカーゼと複合体を形成するガイド核酸を含み、複合体形成時に、Ｃａｓニッカーゼは、標的核酸中の標的部位に一本鎖切断を導入することができる。いくつかの態様において、標的核酸は、ＣＦＴＲ核酸、ＵＳＨ２Ａ核酸、ＡＢＣＡ４核酸、ＡＴＰ７Ｂ核酸、又はＨＴＴ核酸を含む。
いくつかの態様において、逆転写酵素は、ｍｃｐペプチドを含む。いくつかの態様において、逆転写酵素は、ループ領域を含む。いくつかの態様において、ループ領域は、２ａループ又は３ａループである。いくつかの態様において、ループ領域は、２ａループである。いくつかの態様において、ループ領域は、３ａループである。いくつかの態様において、ガイド核酸は、ＭＳ２ヘアピンを含む。
様々な態様において、本開示は、配列番号３～配列番号２２のうちのいずれか１つのものに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、又はＣａｓニッカーゼに融合したそれらの断片を有する逆転写酵素を含む、組成物を提供する。
様々な態様において、本開示は、Ｃａｓニッカーゼに融合した非長末端反復レトロトランスポーザブルエレメントからのドメインを含む逆転写酵素を含む、組成物を提供する。
様々な態様において、本開示は、Ｃａｓニッカーゼに融合した細菌性グループＩＩイントロンからの配列を含む逆転写酵素を含む、組成物を提供する。
様々な態様において、本開示は、Ｃａｓニッカーゼに融合したレトロウイルスｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質からのドメインを含む逆転写酵素を含む、組成物を提供する。
いくつかの態様において、組成物は、Ｃａｓニッカーゼと複合体を形成するガイド核酸と、逆転写酵素と、を含み、複合体形成時に、Ｃａｓニッカーゼは、標的核酸中の標的部位に一本鎖切断を導入することができる。いくつかの態様において、組成物は、Ｃａｓニッカーゼ又は逆転写酵素に融合した核局在化シグナルを含む。いくつかの態様において、逆転写酵素は、切断された逆転写酵素である。いくつかの態様において、逆転写酵素は、天然の逆転写酵素と比較して増加した処理能力を有する。いくつかの態様において、逆転写酵素は、ｍｌｖＲＴと比較して増加した処理能力を有する。いくつかの態様において、逆転写酵素は、ｍｌｖＲＴと比較して標的配列におけるより長いウィンドウ長を編集する。いくつかの態様において、逆転写酵素は、ｍｌｖＲＴと比較して減少した免疫原性を有する。いくつかの態様において、逆転写酵素は、ｍｌｖＲＴと比較して細胞への送達が改善されている。いくつかの態様において、逆転写酵素は、単一の結合事象において、２０個以上、４０個以上、４５個以上、５０個以上、６０個以上、８１個以上、１００個以上、５００個以上、又は１０００個以上のヌクレオチドを重合する。
様々な態様において、本開示は、Ｃａｓニッカーゼ及び逆転写酵素、又はＣａｓニッカーゼ及び逆転写酵素をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む組成物であって、Ｃａｓニッカーゼ及び逆転写酵素のうちの少なくとも一部は、少なくとも２つの別個のポリペプチド鎖に含まれる、組成物を提供する。いくつかの態様において、少なくとも２つの別個のポリペプチド鎖は、互いに結合するヘテロ二量体ドメインを含む別個のポリペプチド鎖を含む。いくつかの態様において、少なくとも２つの別個のポリペプチド鎖は、互いに結合するインテインを含む別個のポリペプチド鎖を含み、Ｃａｓニッカーゼは、アミノ酸位置１０３０に、又はアミノ酸位置１０３０の後に変異を含み、変異は、システイン、スレオニン、アラニン、若しくはセリンに対する点変異、又はシステイン、スレオニン、アラニン、若しくはセリンの挿入を含む。いくつかの態様において、少なくとも２つの別個のポリペプチド鎖は、互いに結合するヘテロ二量体ドメインを含む別個のポリペプチド鎖を含む。いくつかの態様において、別個のポリペプチド鎖は、ヘテロ二量体ドメインを含む融合タンパク質を含む。いくつかの態様において、ヘテロ二量体ドメインは、ロイシンジッパー、ＰＤＺドメイン、ストレプトアビジン及びストレプトアビジン結合タンパク質、フォルドン（ｆｏｌｄｏｎ）ドメイン、疎水性ポリペプチド、Ｃａｓニッカーゼに結合する抗体、若しくは逆転写酵素に結合する抗体、又はそれらの１つ以上の結合断片を含む。いくつかの態様において、ヘテロ二量体ドメインは、第１のヘテロ二量体ドメイン及び第２のヘテロ二量体ドメインを含み、Ｃａｓニッカーゼは、第１のヘテロ二量体ドメインを含み、逆転写酵素は、第２のヘテロ二量体ドメインを含む。いくつかの態様において、第１のヘテロ二量体ドメインは、Ｃａｓニッカーゼのアミノ又はカルボキシ末端に融合され、第２のヘテロ二量体ドメインは、逆転写酵素のアミノ又はカルボキシ末端に融合される。いくつかの態様において、第１のヘテロ二量体ドメインは、第１のロイシンジッパーを含み、第２のヘテロ二量体ドメインは、第２のロイシンジッパーを含む。いくつかの態様において、少なくとも２つの別個のポリペプチド鎖は、互いに結合するインテインを含む別個のポリペプチド鎖を含み、Ｃａｓニッカーゼは、アミノ酸位置１０３０に、又はアミノ酸位置１０３０の後に変異を含み、変異は、システイン、スレオニン、アラニン、若しくはセリンに対する点変異、又はシステイン、スレオニン、アラニン、若しくはセリンの挿入を含む。いくつかの態様において、点変異は、システインに対するものであるか、又は挿入は、システインのものである。いくつかの態様において、点変異は、スレオニンに対するものであるか、又は挿入は、スレオニンのものである。いくつかの態様において、点変異は、アラニンに対するものであるか、又は挿入は、アラニンのものである。いくつかの態様において、点変異は、セリンに対するものであるか、又は挿入は、セリンのものである。いくつかの態様において、変異は、点変異を含み、点変異は、アミノ酸位置Ｄ１０７９、Ｄ１１２５、Ｄ１１３０、Ｇ１１３３、Ａ１１４０、Ｉ１１６８、Ｓ１１７３、Ｄ１１８０、Ｇ１１８６、Ｌ１２０３、Ｒ１２１２、又は前述のアミノ酸位置のうちのいずれか２つによって定義される範囲にある。いくつかの態様において、変異は、点変異を含み、点変異は、アミノ酸位置Ｄ１０７９、Ｄ１１２５、Ｄ１１３０、Ｇ１１３３、Ａ１１４０、Ｉ１１６８、Ｓ１１７３、Ｄ１１８０、Ｇ１１８６、Ｌ１２０３、又はＲ１２１２にある。いくつかの態様において、変異は、挿入変異を含み、挿入変異は、アミノ酸位置Ｄ１０７９、Ｄ１１２５、Ｄ１１３０、Ｇ１１３３、Ａ１１４０、Ｉ１１６８、Ｓ１１７３、Ｄ１１８０、Ｇ１１８６、Ｌ１２０３、Ｒ１２１２、又は前述のアミノ酸位置のうちのいずれか２つによって定義される範囲のすぐ上流又は下流にある。いくつかの態様において、変異は、挿入変異を含み、挿入変異は、アミノ酸位置Ｄ１０７９、Ｄ１１２５、Ｄ１１３０、Ｇ１１３３、Ａ１１４０、Ｉ１１６８、Ｓ１１７３、Ｄ１１８０、Ｇ１１８６、Ｌ１２０３、又はＲ１２１２のすぐ上流又は下流にある。いくつかの態様において、インテインは、第１のインテイン及び第２のインテインを含み、Ｃａｓニッカーゼは、第１のインテインを含む第１のセグメント、並びに変異及び第２のインテインを含む第２のセグメントを含む。いくつかの態様は、Ｃａｓニッカーゼ又は逆転写酵素に結合するガイド核酸を含む。いくつかの態様において、複合体のＣａｓニッカーゼは、標的核酸中の標的部位に一本鎖切断を導入する。いくつかの態様において、Ｃａｓニッカーゼは、Ｃａｓ９ニッカーゼ又はそのバリアントを含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ニッカーゼ又はそのバリアントは、Ｓ．Ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ニッカーゼ又はそのバリアントを含む。いくつかの態様において、逆転写酵素は、Ｍｏｌｏｎｅｙ白血病ウイルス逆転写酵素（ｍｌｖＲＴ）又はそのバリアントを含む。いくつかの態様において、逆転写酵素は、位置Ｐ５１、Ｓ６７、Ｑ８４、Ｌ１３９、Ｑ２２１、Ｖ２２３、Ｔ１９７、Ｄ６５３、Ｔ６６４、Ｌ６７１、Ｌ４３５、Ｈ２０４、又はＤ５２４に点変異を含む。いくつかの態様において、逆転写酵素は、Ｐ５１Ｌ、Ｓ６７Ｒ、Ｑ８４Ａ、Ｌ１３９Ｐ、Ｑ２２１Ｒ、Ｖ２２３Ａ、Ｖ２２３Ｍ、Ｔ１９７Ａ、Ｄ６５３Ｎ、Ｔ６６４Ｎ、Ｌ６７１Ｐ、Ｌ４３５Ｇ、Ｈ２０４Ｒ、又はＤ５２４Ａを含む点変異を含む。いくつかの態様において、逆転写酵素は、アミノ酸位置Ｑ８４、Ｌ１３９、Ｑ２２１、Ｖ２２３、Ｔ６６４、又はＬ６７１に点変異を含む。いくつかの態様において、逆転写酵素は、Ｓ６７Ｒ、Ｑ８４Ａ、Ｌ１３９Ｐ、Ｑ２２１Ｒ、Ｖ２２３Ａ、Ｖ２２３Ｍ、Ｔ６６４Ｎ、Ｌ６７１Ｐ、又はＤ５２４Ａを含む点変異を含む。いくつかの態様において、組成物は、Ｃａｓニッカーゼ及び逆転写酵素を含み、少なくとも２つの別個のポリペプチド鎖は、２つの別個のポリペプチド鎖である。いくつかの態様において、組成物は、Ｃａｓニッカーゼ及び逆転写酵素を含み、少なくとも２つの別個のポリペプチド鎖は、Ｃａｓニッカーゼの第１の部分を含む第１のポリペプチド鎖、並びにＣａｓニッカーゼの第２の部分及び逆転写酵素を含む第２のポリペプチド鎖を含む。いくつかの態様は、Ｃａｓニッカーゼ及び逆転写酵素をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、Ｃａｓニッカーゼ及び逆転写酵素をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドは、Ｃａｓニッカーゼの第１の部分をコードする第１のポリヌクレオチド、並びにＣａｓニッカーゼの第２の部分及び逆転写酵素をコードする第２のポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様は、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのアデノ随伴ウイルスを含む。いくつかの態様において、組成物は、細胞によって産生される。
様々な態様において、本開示は、Ｃａｓニッカーゼ及び逆転写酵素、又はＣａｓニッカーゼ及び逆転写酵素をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む組成物であって、Ｃａｓニッカーゼ及び逆転写酵素のうちの少なくとも一部は、別個のポリペプチド鎖に含まれる、組成物を提供する。いくつかの態様において、Ｃａｓニッカーゼ又は逆転写酵素は、第１のロイシンジッパーを含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ニッカーゼは、Ｓ．Ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ニッカーゼ、又はそのバリアント、及びアミノ酸位置Ｄ１０７９、Ｄ１１２５、Ｄ１１３０、Ｇ１１３３、Ａ１１４０、Ｉ１１６８、Ｓ１１７３、Ｄ１１８０、Ｇ１１８６、Ｌ１２０３、若しくはＲ１２１２に点変異、又はアミノ酸位置Ｄ１０７９、Ｄ１１２５、Ｄ１１３０、Ｇ１１３３、Ａ１１４０、Ｉ１１６８、Ｓ１１７３、Ｄ１１８０、Ｇ１１８６、Ｌ１２０３、若しくはＲ１２１２のすぐ上流若しくは下流の挿入変異を含む。いくつかの態様において、逆転写酵素は、Ｍｏｌｏｎｅｙ白血病ウイルス逆転写酵素（ｍｌｖＲＴ）、又はそのバリアント、及びアミノ酸位置Ｑ８４、Ｌ１３９、Ｑ２２１、Ｖ２２３、Ｔ６６４、又はＬ６７１に点変異を含む。いくつかの態様において、別個のポリペプチド鎖は、ヘテロ二量体ドメインを含む。いくつかの態様において、Ｃａｓニッカーゼ及び逆転写酵素は、Ｃａｓニッカーゼに融合した第１のヘテロ二量体ドメインと、逆転写酵素に融合した第２のヘテロ二量体ドメインと、を含む、ヘテロ二量体を形成し、第１のヘテロ二量体ドメインは、第２のヘテロ二量体ドメインに結合して、ヘテロ二量体を形成する。いくつかの態様において、第１のヘテロ二量体ドメインは、第１のロイシンジッパーを含む。いくつかの態様において、第２のヘテロ二量体ドメインは、第２のロイシンジッパーを含む。いくつかの態様において、逆転写酵素は、配列番号３～配列番号２２若しくは配列番号４０～配列番号８０のうちのいずれか１つのものに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、又はその断片を含む。いくつかの態様において、逆転写酵素は、Ｃａｓニッカーゼの一部に融合した非長末端反復レトロトランスポーザブルエレメントからのドメイン、Ｃａｓニッカーゼの一部に融合した細菌性グループＩＩイントロンからの配列、又はＣａｓニッカーゼの一部に融合したレトロウイルスｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質からのドメインを含む。いくつかの態様は、Ｃａｓニッカーゼ又は逆転写酵素に結合するガイド核酸を含む。いくつかの態様において、複合体のＣａｓニッカーゼは、標的核酸中の標的部位に一本鎖切断を導入する。いくつかの態様において、ガイド核酸はヘアピンを含む。いくつかの態様において、ヘアピンは、ＭＳ２ヘアピンを含む。いくつかの態様において、逆転写酵素は、ヘアピン結合ドメインを含む修飾逆転写酵素を含む。いくつかの態様において、逆転写酵素は、ＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）ペプチドを含む修飾逆転写酵素を含む。いくつかの態様において、逆転写酵素は、ループ領域を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ニッカーゼは、Ｃａｓ９ニッカーゼのＣ末端半分における点変異又は挿入変異を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ニッカーゼのＣ末端半分における点変異は、システイン、セリン、スレオニン、若しくはアラニンに対するか、又は挿入変異は、システイン挿入セリン挿入、スレオニン挿入、又はアラニン挿入である。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ニッカーゼは、Ｃａｓ９ニッカーゼのＣ末端半分における点変異を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ニッカーゼは、Ｃａｓ９ニッカーゼのＣ末端半分における挿入変異を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ニッカーゼは、第１のインテインを含む第１のセグメントと、点変異又は挿入変異及び第２のインテインを含む第２のセグメントと、を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ニッカーゼは、Ｓ．Ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ニッカーゼ又はそのバリアントを含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ニッカーゼは、アミノ酸位置Ｄ１０７９、Ｄ１１２５、Ｄ１１３０、Ｇ１１３３、Ａ１１４０、Ｉ１１６８、Ｓ１１７３、Ｄ１１８０、Ｇ１１８６、Ｌ１２０３、若しくはＲ１２１２に点変異、又はアミノ酸位置Ｄ１０７９、Ｄ１１２５、Ｄ１１３０、Ｇ１１３３、Ａ１１４０、Ｉ１１６８、Ｓ１１７３、Ｄ１１８０、Ｇ１１８６、Ｌ１２０３、若しくはＲ１２１２のすぐ上流若しくは下流の挿入変異を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓニッカーゼ又は逆転写酵素は、核局在化シグナルを含む。いくつかの態様において、逆転写酵素は、切断された逆転写酵素である。いくつかの態様において、逆転写酵素は、ｍｌｖＲＴ又はそのバリアントを含む。いくつかの態様において、逆転写酵素は、アミノ酸位置Ｑ８４、Ｌ１３９、Ｑ２２１、Ｖ２２３、Ｔ６６４、又はＬ６７１に点変異を含む。いくつかの態様において、逆転写酵素は、Ｐ５１Ｌ、Ｓ６７Ｒ、Ｑ８４Ａ、Ｌ１３９Ｐ、Ｑ２２１Ｒ、Ｖ２２３Ａ、Ｖ２２３Ｍ、Ｔ１９７Ａ、Ｄ６５３Ｎ、Ｔ６６４Ｎ、Ｌ６７１Ｐ、Ｌ４３５Ｇ、Ｈ２０４Ｒ、又はＤ５２４Ａを含む点変異を含む。いくつかの態様において、逆転写酵素は、Ｓ６７Ｒ、Ｑ８４Ａ、Ｌ１３９Ｐ、Ｑ２２１Ｒ、Ｖ２２３Ａ、Ｖ２２３Ｍ、Ｔ６６４Ｎ、Ｌ６７１Ｐ、又はＤ５２４Ａを含む点変異を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓニッカーゼ及び逆転写酵素は、別個のポリペプチド鎖を含む。いくつかの態様において、組成物は、細胞によって産生される。いくつかの態様は、Ｃａｓニッカーゼ及び逆転写酵素をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様は、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのアデノ随伴ウイルスを含む。
様々な態様において、本開示は、標的核酸の第１の領域に逆相補的なスペーサーと、Ｃａｓニッカーゼに結合するように構成された足場と、標的核酸内に挿入される配列をコードする逆転写酵素鋳型と、標的核酸の第２の領域に逆相補的な第１の鎖プライマー結合部位と、含む、ガイド核酸を提供する。
いくつかの態様において、ガイド核酸は、逆転写酵素鋳型の領域の配列を含む第２の鎖プライマーを更に含む。いくつかの態様において、標的核酸の第１の領域は、標的核酸の第１の鎖上にあり、標的核酸の第２の領域は、標的核酸の第２の鎖上にある。いくつかの態様において、標的核酸の第１の領域の全て又は一部は、標的核酸の第２の領域の全て又は一部に逆相補的である。いくつかの態様において、ガイド核酸は、ガイド核酸の３’末端において切断可能な配列を更に含む。いくつかの態様において、切断可能な配列は、リボザイム切断可能な配列である。いくつかの態様において、切断可能な配列は、ｔＲＮＡ切断可能な配列である。いくつかの態様において、第１の鎖プライマー結合部位は、標的核酸の第２の領域にハイブリダイズするように構成され、逆転写酵素鋳型は、標的核酸の第２の領域の３’末端からの逆転写のための鋳型として機能するように構成される。いくつかの態様において、第２の鎖プライマーは、逆転写酵素鋳型に逆相補的な鋳型からの転写のためのプライマーとして機能するように構成される。いくつかの態様において、第１の合成鎖は、第２の鎖プライマーからの第２の鎖の合成のための鋳型として機能する。いくつかの態様において、逆転写酵素鋳型領域の領域にハイブリダイズするＶｅｌｃｒｏ領域。
様々な態様において、本開示は、本明細書に記載されるガイドを含む第１のガイド核酸と、第２のガイド核酸と、を含む、組成物を提供する。
いくつかの態様において、第２のガイド核酸は、本明細書に記載されるガイドを含む。いくつかの態様において、第１のガイド核酸は、第１のＣａｓニッカーゼに結合し、第２のガイド核酸は、第２のＣａｓニッカーゼに結合する。いくつかの態様において、第１のガイド核酸の第１のスペーサーは、第１のＣａｓニッカーゼに結合し、第２のガイド核酸の第２のスペーサーは、第２のＣａｓニッカーゼに結合し、第１のガイド核酸の第１の足場は、第２のＣａｓニッカーゼに結合し、第２のガイド核酸の第２の足場は、第１のＣａｓニッカーゼに結合する。いくつかの態様において、第１のガイド核酸は、第１のリンカーを含み、第２のガイド核酸は、第２のリンカーを含み、第１のリンカーは、第２のリンカーにハイブリダイズする。
様々な態様において、本開示は、標的核酸の第１の領域に逆相補的なスペーサーと、Ｃａｓヌクレアーゼに結合するように構成された足場と、標的核酸に挿入される配列をコードする逆転写酵素鋳型と、標的核酸の第２の領域に逆相補的な第１の鎖プライマー結合部位と、ｉ．ｇＲＮＡ位置決めシステム（ＧＰＳ）領域及びＧＰＳ領域にハイブリダイズするＧＰＳ結合部位、ｉｉ．標的核酸中のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を破壊する逆転写酵素鋳型の修飾、ｉｉｉ．標的核酸中の同じ塩基の少なくとも４つの連続したヌクレオチドのトラックを破壊する逆転写酵素鋳型の修飾、又はｉｖ．逆転写酵素鋳型の領域の配列を含む第２の鎖プライマーのうちの少なくとも１つと、を含む、ガイド核酸を提供する。様々な態様において、本開示は、標的核酸の第１の領域に逆相補的なスペーサーと、Ｃａｓヌクレアーゼに結合するように構成された足場と、標的核酸に挿入される配列をコードする逆転写酵素鋳型と、標的核酸の第２の領域に逆相補的な第１の鎖プライマー結合部位と、ｉ．ｇＲＮＡ位置決めシステム（ＧＰＳ）領域及びＧＰＳ領域にハイブリダイズするＧＰＳ結合部位、ｉｉ．標的核酸中の同じ塩基の少なくとも４つの連続したヌクレオチドのトラックを破壊する逆転写酵素鋳型の修飾、又はｉｉｉ．逆転写酵素鋳型の領域の配列を含む第２の鎖プライマーのうちの少なくとも１つと、を含む、ガイド核酸を提供する。いくつかの態様は、第２の鎖プライマーを含む。いくつかの態様において、第２の鎖プライマーは、逆転写酵素鋳型に逆相補的な鋳型からの転写のためのプライマーとして機能するように構成される。いくつかの態様において、第１の合成鎖は、第２の鎖プライマーからの第２の鎖の合成のための鋳型として機能する。いくつかの態様において、標的核酸の第１の領域は、標的核酸の第１の鎖上にあり、標的核酸の第２の領域は、標的核酸の第２の鎖上にある。いくつかの態様において、標的核酸の第１の領域の全て又は一部は、標的核酸の第２の領域の全て又は一部に逆相補的である。いくつかの態様は、ガイド核酸の３’末端におけるリボザイム切断可能な配列を含む。いくつかの態様は、ガイド核酸の３’末端におけるｔＲＮＡ切断可能な配列を含む。いくつかの態様において、第１の鎖プライマー結合部位は、標的核酸の第２の領域にハイブリダイズするように構成され、逆転写酵素鋳型は、標的核酸の第２の領域の３’末端からの逆転写のための鋳型として機能するように構成される。いくつかの態様は、ＧＰＳ領域及びＧＰＳ結合部位を含む。いくつかの態様において、ＧＰＳ領域及びＧＰＳ結合部位はともに、ガイド核酸上の別の領域に結合して、ガイド核酸の立体構造変化に影響を与え、遺伝子編集を改善する、ガイド核酸の領域を含む。いくつかの態様において、ＧＰＳ領域及びＧＰＳ結合部位のハイブリダイゼーションは、ガイド核酸を立体構造的に変化させ、ＧＰＳ領域又はＧＰＳ結合部位を有しないガイド核酸と比較して編集効率を改善する。いくつかの態様において、逆転写酵素鋳型領域は、ＧＰＳ結合部位を含む。いくつかの態様において、ＧＰＳ結合部位は、第１の鎖プライマー結合部位の５’である。いくつかの態様において、ＧＰＳ結合部位は、第１の鎖プライマー結合部位の３’である。いくつかの態様において、ＧＰＳ領域は、逆転写酵素鋳型の５’である。いくつかの態様において、ＧＰＳ領域は、逆転写酵素鋳型の３’である。いくつかの態様において、ＧＰＳ領域は、足場の５’である。いくつかの態様において、ＧＰＳ領域は、５～１００ヌクレオチド長である。いくつかの態様において、ＧＰＳ結合部位は、ＧＰＳ領域に対して少なくとも５０％相補的である。いくつかの態様において、標的核酸は、ＣＦＴＲ核酸、ＵＳＨ２Ａ核酸、ＡＢＣＡ４核酸、ＡＴＰ７Ｂ核酸、又はＨＴＴ核酸を含む。いくつかの態様において、スペーサーは、配列番号９６～１１９のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％同一の核酸配列を含む。いくつかの態様は、標的核酸中のＰＡＭ配列を破壊する逆転写酵素鋳型の修飾を含む。いくつかの態様において、ＰＡＭ配列は、Ｃａｓヌクレアーゼによって認識される２～６塩基対の核酸配列を含む。いくつかの態様において、標的核酸中のＰＡＭ配列を破壊する逆転写酵素鋳型の修飾は、修飾を有しないガイド核酸と比較して遺伝子編集を改善する。いくつかの態様は、標的核酸中の同じ塩基の少なくとも４つの連続したヌクレオチドのトラックを破壊する逆転写酵素鋳型の修飾を含む。いくつかの態様において、同じ塩基の少なくとも４つの連続したヌクレオチドのトラックは、ポリＡトラックを含む。いくつかの態様において、標的核酸中の同じ塩基の少なくとも４つの連続したヌクレオチドのトラックを破壊する逆転写酵素鋳型の修飾は、修飾を有しないガイド核酸と比較して遺伝子編集を改善する。いくつかの態様において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓニッカーゼを含む。いくつかの態様において、ガイド核酸は、ガイドＲＮＡを含む。いくつかの態様は、ガイド核酸を含む組成物を細胞に送達することを含む、遺伝子編集方法を含む。いくつかの態様において、組成物は、ガイド核酸を含むウイルスベクターを含む。いくつかの態様は、第２のガイド核酸上のＧＰＳ結合部位にハイブリダイズするＧＰＳ領域を含む。
様々な態様において、本開示は、本明細書に記載される組成物、又は本明細書に記載されるガイド核酸を発現する細胞に、Ｏｒｆ１ｐを送達することを含む、ゲノム編集効率を増加させる方法を提供する。
様々な態様において、本開示は、本明細書に記載される組成物、又は本明細書に記載されるガイド核酸をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸を提供する。
様々な態様において、本開示は、本明細書に記載される核酸を含むウイルスベクターを提供する。
様々な態様において、本開示は、本明細書に記載される組成物、本明細書に記載されるガイド核酸、本明細書に記載される核酸、又は本明細書に記載されるウイルスベクターを含む、細胞を提供する。
いくつかの態様において、細胞は原核細胞である。いくつかの態様において、細胞は真核細胞である。
いくつかの態様において、本開示は、インテイン触媒作用を可能にするか、又は改善する１つ以上の点変異又は挿入変異を含む、Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼを含む、組成物を提供する。様々な態様において、本開示は、Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼを含む組成物であって、Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼが、Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼのＣ末端半分に位置するシステイン点変異を含む、組成物を提供する。様々な態様において、本開示は、Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼを含む組成物であって、Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼが、Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼのＣ末端半分に位置する挿入変異（例えば、システイン挿入変異）を含む、組成物を提供する。点変異は、システイン点変異、セリン点変異、スレオニン点変異、又はアラニン点変異であり得る。挿入変異は、システイン挿入変異、セリン挿入変異、スレオニン挿入変異、又はアラニン挿入変異であり得る。
いくつかの態様において、Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ニッカーゼである。いくつかの態様において、Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼは、Ｓ．Ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９である。いくつかの態様において、点変異は、Ｓ．Ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９のＤ１０７９、Ｄ１１２５、Ｄ１１３０、Ｇ１１３３、Ａ１１４０、Ｉ１１６８、Ｓ１１７３、Ｄ１１８０、Ｇ１１８６、Ｌ１２０３、又はＲ１２１２に位置する。いくつかの態様において、挿入変異は、Ｓ．Ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９のＤ１０７９、Ｄ１１２５、Ｄ１１３０、Ｇ１１３３、Ａ１１４０、Ｉ１１６８、Ｓ１１７３、Ｄ１１８０、Ｇ１１８６、Ｌ１２０３、又はＲ１２１２のすぐ上流にある。いくつかの態様において、システイン点変異は、Ｓ．Ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９のＳ１１７３Ｃ、Ｄ１０７９Ｃ、又はＤ１１８０Ｃに位置する。いくつかの態様において、システイン挿入変異は、Ｓ．Ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９の１１７３Ｃ、１０７９Ｃ、又は１１８０Ｃに位置する。いくつかの態様において、Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼは、配列番号８５～配列番号８７又は配列番号９０～配列番号９２のうちのいずれか１つの配列を含む。
いくつかの態様において、Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼは、２つ以上のセグメントとして発現される。いくつかの態様において、２つ以上のセグメントのうちの第１のセグメントは、Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼのＮ末端部分及び第１のインテインを含み、２つ以上のセグメントのうちの第２のセグメントは、Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼのＣ末端部分及び第２のインテインを含む。いくつかの態様において、システイン点変異は、Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼのＣ末端部分のＮ末端に位置する。いくつかの態様において、システイン挿入変異は、Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼのＣ末端部分のＮ末端に位置する。いくつかの態様において、第１のインテインは、Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼのＮ末端部分のＣ末端に融合され、第２のインテインは、Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼのＣ末端部分のＮ末端に融合される。いくつかの態様において、第１のセグメントは、配列番号９０の配列を含み、第２のセグメントは、配列番号９１の配列を含む。２つ以上のセグメントのうちの第２のセグメントは、Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼのＣ末端部分に融合した逆転写酵素を含み得る。逆転写酵素は、Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼのＣ末端部分のＣ末端に融合したＮ末端を含み得る。逆転写酵素は、ｍｌｖＲＴ、又はそのバリアントを含み得る。
本明細書に開示されるのは、ゲノム編集効率を最適化する方法であって、低いｄＮＴＰ濃度でその触媒効率を増加させるように修飾される（例えば、ｄＮＴＰに対するそのＫｍを減少させるように修飾される）、Ｍｏｌｏｎｅｙ白血病ウイルス逆転写酵素（ｍｌｖＲＴ）を用いてゲノム編集を実施することを含む、方法である。本明細書に開示されるのは、限定的なｄＮＴＰ条件においてゲノム編集効率を最適化する方法であって、逆転写酵素の位置２２１又は２２３に点変異を含む、Ｍｏｌｏｎｅｙ白血病ウイルス逆転写酵素（ｍｌｖＲＴ）、又はそのバリアントを用いてゲノム編集を実施することを含む、方法である。ｍｌｖＲＴ又はそのバリアントは、位置２２１に点変異を含み得る。位置２２１における点変異は、Ｑ２２１Ｒを含み得る。ｍｌｖＲＴ又はそのバリアントは、位置２２３に点変異を含み得る。位置２２３における点変異は、Ｖ２２３Ａを含み得る。位置２２３における点変異は、Ｖ２２３Ｍを含み得る。
Ｃａｓニッカーゼ及びＲＴは、ポリヌクレオチドによってコードされ得る。本明細書に開示されるのは、ポリヌクレオチドを含むＡＡＶである。Ｃａｓニッカーゼ及びＲＴのうちの少なくとも一部は、別個のＡＡＶ内に包含され得るか、又は含まれ得る。本明細書に開示されるのは、Ｃａｓ又はＣａｓ９成分をコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１のＡＡＶと、ＲＴ成分をコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２のＡＡＶと、を含む、ＡＡＶである。ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＤＪ／８、ＡＡＶ－Ｒｈ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、ＡＡＶ－ｒｅｔｒｏ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ８－ＰＨＰ．ｅＢ、若しくはＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｓ、又はそれらの組み合わせを含み得る。
本明細書に開示されるのは、改善された逆転写酵素（ＲＴ）をスクリーニング又は識別するための方法であって、細胞内で、ＳＡＭＨＤ１を過剰発現させるか、又は変異体ＳＡＭＨＤ１の残基のリン酸化を防止するように変異した変異体ＳＡＭＨＤ１を発現させることと、細胞内のＲＴ活性を識別することと、ＲＴ活性に基づいて、ＲＴを改善されたＲＴとして識別することと、を含む、方法である。
本明細書に開示されるのは、スペーサー、所望の編集を含む逆転写酵素鋳型、及びプライマー結合部位を含む、ＲＮＡ又はポリヌクレオチドを含むシステムであって、プライマー結合部位が、スペーサーによって標的化若しくは結合された核酸の領域のいずれの部分も含まない核酸、又はスペーサーによって標的化若しくは結合された核酸に逆相補的な核酸に結合する、システムである。
本明細書に開示されるのは、標的核酸の第１の領域に逆相補的なスペーサーと、Ｃａｓヌクレアーゼに結合するように構成された足場と、標的核酸に挿入される配列をコードする逆転写酵素鋳型と、第１の領域のいずれの部分も含まず、かつ第１の領域の逆相補体のいずれの部分も含まない、標的核酸の領域に結合する第１の鎖プライマー結合部位と、第２のガイド核酸上のＧＰＳ結合部位にハイブリダイズするＧＰＳ領域と、を含む、第１のガイド核酸を含む、システムである。本明細書に開示されるのは、標的核酸の第１の領域に逆相補的なスペーサーと、Ｃａｓヌクレアーゼに結合するように構成された足場と、標的核酸に挿入される配列をコードする逆転写酵素鋳型と、第１の領域のいずれの部分も含まず、かつ第１の領域の逆相補体のいずれの部分も含まない、標的核酸の領域に結合する第１の鎖プライマー結合部位と、を含む、第１のガイド核酸を含む、システムである。いくつかの態様は、第２のガイド核酸上のＧＰＳ結合部位にハイブリダイズするＧＰＳ領域を含む。いくつかの態様は、第２のガイド核酸を含む。第２のガイド核酸は、ＧＰＳ結合部位を含み得る。いくつかの態様において、第２のガイド核酸は、標的核酸の別の領域に逆相補的な第２のスペーサーを含む。第２のガイド核酸は、プライマー結合部位をゲノムフラップに近接又は接触させることができる。
参照による組み込み
本明細書において言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各個々の刊行物、特許、又は特許出願が引用により援用されることが具体的かつ個別に示されたときと同程度に、本明細書において引用により援用される。
本明細書において言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各個々の刊行物、特許、又は特許出願が引用により援用されることが具体的かつ個別に示されたときと同程度に、本明細書において引用により援用される。
本開示の新規特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に述べられる。本開示の原理が利用される例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明、及び付属の図面を参照することにより、本開示の特徴及び利点のより良好な理解が得られる。
本明細書には、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを使用した正確かつ効率的なゲノム編集のための方法及び組成物が開示されている。デアミナーゼに連結されたＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）を含むＣａｓ９ベースの塩基エディタは、遷移変異（例えば、Ａ～Ｇ又はＣ～Ｔ）の実行に限定され得る。逆転写酵素（ＲＴ）（例えば、Ｍｏｌｏｎｅｙ白血病ウイルスＲＴ）に連結されたｎＣａｓ９を含む他のＣａｓ９ベースのエディタ（例えば、「プライムエディタ」）は、小さな挿入、欠失、又は単一ヌクレオチド変化に限定され得る。本明細書には、ゲノム編集の効率、汎用性、精度、及び送達性を改善するための、Ｃａｓニッカーゼ及び逆転写酵素構築物、操作されたガイド核酸、並びにそれらの使用方法が提供される。
本明細書に記載される方法及び組成物は、Ｃａｓ９及びＲＴを分割、二量体化、又は同時発現することを含み得る。Ｃａｓ９及びＲＴの分割、二量体化、又は同時発現は、ＡＡＶパッケージングを可能にし得る。Ｃａｓ９及びＲＴの分割、二量体化、又は同時発現は、編集効率を増加させ得る。
本明細書に記載されるのは、ＡＡＶ送達可能な正確な編集成分である。いくつかの実施形態は、Ｃａｓ９成分及びＲＴ成分を送達するＡＡＶ粒子を含む。ＡＡＶを有するＣａｓ＋ＲＴシステムを送達するための様々な例が提供される。提供される例は、典型的なＡＡＶ運搬能力（例えば、約４．５ｋｂ）内に適合するように正確な編集成分を得る以前の困難を克服し得る。
編集効率を改善する点変異又は挿入変異などの変異も提供される。例えば、Ｃａｓニッカーゼ又はＲＴ（例えば、点変異又は挿入変異）が含まれる。いくつかの実施形態は、アミノ酸変異を有するゲノム編集のためのｍｌｖＲＴを含む。
ニッキングＣａｓ９及び逆転写酵素
本明細書には、Ｃａｓニッカーゼを含む組成物が提供される。本明細書には、逆転写酵素を含む組成物が提供される。本明細書には、Ｃａｓニッカーゼ及び逆転写酵素を含む組成物が提供される。Ｃａｓニッカーゼ及び逆転写酵素のうちの少なくとも一部は、別個のポリペプチド鎖に含まれ得る。Ｃａｓニッカーゼ及び逆転写酵素は、完全に別個のポリペプチド鎖にあり得る。いくつかの実施形態は、Ｃａｓニッカーゼの機能的断片を含む。いくつかの実施形態は、逆転写酵素の機能的断片を含む。
本明細書には、Ｃａｓニッカーゼを含む組成物が提供される。本明細書には、逆転写酵素を含む組成物が提供される。本明細書には、Ｃａｓニッカーゼ及び逆転写酵素を含む組成物が提供される。Ｃａｓニッカーゼ及び逆転写酵素のうちの少なくとも一部は、別個のポリペプチド鎖に含まれ得る。Ｃａｓニッカーゼ及び逆転写酵素は、完全に別個のポリペプチド鎖にあり得る。いくつかの実施形態は、Ｃａｓニッカーゼの機能的断片を含む。いくつかの実施形態は、逆転写酵素の機能的断片を含む。
Ｃａｓニッカーゼ及び逆転写酵素は、Ｃａｓ－逆転写酵素ヘテロ二量体を形成し得る。Ｃａｓ－逆転写酵素ヘテロ二量体は、第１のヘテロ二量体ドメインを含み得る。第１のヘテロ二量体ドメインは、Ｃａｓニッカーゼに融合され得る。Ｃａｓ逆転写酵素ヘテロ二量体は、第２のヘテロ二量体ドメインを含み得る。第２のヘテロ二量体ドメインは、逆転写酵素に融合され得る。第１のヘテロ二量体ドメインは、第２のヘテロ二量体ドメインに結合し得る。この結合は、Ｃａｓ－逆転写酵素ヘテロ二量体を形成し得る。第１のヘテロ二量体ドメインは、ロイシンジッパーを含み得る。第２のヘテロ二量体ドメインは、ロイシンジッパーを含み得る。第１又は第２のヘテロ二量体ドメインは、ロイシンジッパー以外のヘテロ二量体ドメイン、例えば、本明細書に記載されるＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ又はＳｐｙＴａｇ部分を含み得る。
本明細書には、Ｃａｓプログラマブルヌクレアーゼを含む操作された構築物が提供される。Ｃａｓプログラマブルヌクレアーゼは、Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼを含み得る。本明細書には、Ｃａｓニッカーゼを含む操作された構築物が提供される。Ｃａｓプログラマブルヌクレアーゼは、Ｃａｓニッカーゼを含み得る。Ｃａｓニッカーゼは、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）を含み得る。Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼは、ｎＣａｓ９を含み得る。Ｃａｓニッカーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメインを変異させることによって生成され得る。Ｃａｓニッカーゼは、二本鎖切断ではなく一本鎖を作製し得る。
本明細書には、逆転写酵素（ＲＴ）を含む操作された構築物が提供される。本明細書には、Ｃａｓニッカーゼ及びＲＴを含む操作された構築物が提供される。本明細書には、Ｃａｓ９ニッカーゼ及びＲＴを含む操作された構築物が提供される。ｎＣａｓ９は、標的核酸の標的部位に一本鎖切断（ＳＳＢ）を導入することができる。逆転写酵素は、標的部位に挿入される配列の逆転写を触媒することができる。いくつかの実施形態において、ｎＣａｓ９－ＲＴ構築物は、ｎＣａｓ９－ＲＴ構築物に融合され得る。融合したｎＣａｓ９－ＲＴ構築物は、単一のポリペプチド鎖にｎＣａｓ９及び逆転写酵素を含み得る。いくつかの実施形態において、ｎＣａｓ９－ＲＴ構築物は、分割ｎＣａｓ９－ＲＴ構築物であり得る。分割ｎＣａｓ９－ＲＴ構築物は、第１のポリペプチド鎖にｎＣａｓ９及び第２のポリペプチド鎖に逆転写酵素を含み得る。分割ｎＣａｓ９－ＲＴ構築物のｎＣａｓ９及び逆転写酵素は、同時発現される場合、ヘテロ二量体を形成し得る。いくつかの実施形態において、第１の二量体化ドメインは、ｎＣａｓ９のＮ末端に位置し得る。いくつかの実施形態において、第１の二量体化ドメインと二量体化する第２の二量体化ドメインは、逆転写酵素のＣ末端に位置し得る。いくつかの実施形態において、第１の二量体化ドメインは、ｎＣａｓ９のＣ末端に位置し得る。いくつかの実施形態において、第１の二量体化ドメインと二量体化する第２の二量体化ドメインは、逆転写酵素のＮ末端に位置し得る。第１の二量体化ドメインは、ロイシンジッパー、ＦＫＢＰ、ＦＲＢ、カルシニューリンＡ、ＣｙＰ－Ｆａｓ、ＧｙｒＢ、ＧＡＩ、ＧＩＤ１、ＳＮＡＰタグ、Ｈａｌｏタグ、Ｂｃｌ－ｘＬ、Ｆａｂ、又はＬＯＶドメインを含み得る。第２の二量体化ドメインは、ロイシンジッパー、ＦＫＢＰ、ＦＲＢ、カルシニューリンＡ、ＣｙＰ－Ｆａｓ、ＧｙｒＢ、ＧＡＩ、ＧＩＤ１、ＳＮＡＰタグ、Ｈａｌｏタグ、Ｂｃｌ－ｘＬ、Ｆａｂ、又はＬＯＶドメインを含み得る。二量体化は、誘導され得るか、又は自発的であり得る。二量体化は、化学的又は光学的に誘導され得る。配列番号１は、Ｃ末端にロイシンジッパーを含むｎＣａｓ９の例を提供する。配列番号２は、Ｎ末端にロイシンジッパーを含む逆転写酵素の例を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示の構築物は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含み得る。本明細書に記載される組成物は、Ｃａｓニッカーゼに融合した核局在化シグナルを含み得る。いくつかの実施形態において、ＮＬＳに融合したＣａｓニッカーゼは、配列番号１３８に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一の配列を含む。本明細書に記載される組成物は、ＲＴに融合した核局在化シグナルを含み得る。いくつかの実施形態において、ＮＬＳに融合したＲＴは、配列番号９５に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一の配列を含む。
逆転写酵素は、非長末端反復レトロトランスポーザブルエレメントからのドメインを含み得る。非長末端反復レトロトランスポーザブルエレメントは、Ｃａｓニッカーゼの一部に融合され得る。逆転写酵素は、細菌性グループＩＩイントロンからの配列を含み得る。細菌性グループＩＩイントロンは、Ｃａｓニッカーゼの一部に融合され得る。逆転写酵素は、レトロウイルスｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質からのドメインを含み得る。レトロウイルスｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質からのドメインは、Ｃａｓニッカーゼの一部に融合され得る。
二量体化は、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ又は関連システムを使用して達成され得る。例えば、ＲＴは、ＳｐｙＴａｇ部分にコンジュゲートされ得、Ｃａｓニッカーゼは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ部分にコンジュゲートされ得る。代替的に、Ｃａｓニッカーゼは、ＳｐｙＴａｇ部分にコンジュゲートされ得、ＲＴは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ部分にコンジュゲートされ得る。ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒシステムを使用する二量体化は、二量体化分子間の共有結合を含み得る（例えば、Ｃａｓニッカーゼは、ＳｐｙＴａｇ及びＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ部分を介してＲＴに共有結合によりコンジュゲートされ得る。ＳｐｙＴａｇ又はＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ部分にコンジュゲートされたＣａｓニッカーゼは、第１のＡＡＶにおいて提供され得る。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ又はＳｐｙＴａｇ部分にコンジュゲートされたＲＴは、第２のＡＡＶにおいて提供され得る。
様々な逆転写酵素が、本開示の組成物及び方法と一致する。本明細書に開示される逆転写酵素は、ｇｅｏｂａｃｉｌｕｓ ｓｔｅｒｅｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＲＴ（ＧｓＩ－ＩＩＣＲＴ、配列番号３）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｒｅｃｔａｌｅ ＲＴ（ＥｒＲＴ、配列番号４）、マラソンＲＴ（配列番号５）、ＢｍＲ２ＲＴ（配列番号６）、Ｒ２ポリタンパク質からのアミノ酸１１６～１０１６（Ｒ２（１１６～１０１６）、配列番号７）、ＢｍＲ２ｅｎ－ＲＴ（配列番号８）、ヒトＬ１ＲＴ（配列番号９）、ヒトＬ１ｅｎ－ＲＴ（配列番号１０）、マウスＬ１ＲＴ（配列番号１１）、ｌｔｒＡ（配列番号１２）、ｍｌｖＲＴ５Ｍ（配列番号１３）、ｍｌｖＲＴ５Ｍ（配列番号４０）、ｍｌｖＲＴ（配列番号１４）、ＸＭＲＶ３ＶＰ３５ＲＴ（配列番号１５）、ｇａｌｖＲＴ（配列番号１６）、ｓｆｖＲＴ（配列番号１７）、ｆｏａｍｖＲＴ（配列番号１８）、ＨＩＶＰ６６（配列番号１９）、ＨＩＶＰ５１（配列番号２０）、ｒｓｖＡｌｐｈａ（配列番号２１）、又はｒｓｖＢｅｔａ（配列番号２２）であり得る。本開示の転写酵素は、Ｎ末端メチオニンを含み得るか、又は本開示の転写酵素は、Ｎ末端メチオニンを欠失し得る。例えば、逆転写酵素は、Ｎ末端メチオニンが除去された、配列番号３～配列番号６、配列番号８～配列番号１２、配列番号１７、配列番号１８、又は配列番号４０～配列番号８０のうちのいずれか１つに対応する配列を有し得る。別の例において、逆転写酵素は、Ｎ末端にメチオニンが付加された、配列番号７、配列番号１３～配列番号１６、又は配列番号１９～配列番号２２のうちのいずれか１つに対応する配列を有し得る。逆転写酵素は、配列番号３～配列番号２２若しくは配列番号４０～配列番号８０のうちのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、１００％、若しくはそれらの間の任意のパーセンテージの配列同一性を有する配列、又はその断片を含み得る。
本明細書には、配列番号３～配列番号２２又は配列番号４０～配列番号８０のうちのいずれか１つのものに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、その断片を有する逆転写酵素を含む、組成物が開示される。逆転写酵素又はその断片は、Ｃａｓニッカーゼに融合され得る。いくつかの実施形態は、Ｃａｓニッカーゼに融合され得る、非長末端反復レトロトランスポーザブルエレメントからのドメインを含む逆転写酵素を含む、組成物を含む。いくつかの実施形態は、Ｃａｓニッカーゼに融合され得る、細菌性グループＩＩイントロンからの配列を含む、逆転写酵素を含む。いくつかの実施形態は、Ｃａｓニッカーゼに融合され得る、レトロウイルスｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質からのドメインを含む逆転写酵素を含む。逆転写酵素は切断され得る。
限定的なｄＮＴＰ条件においてゲノム編集効率を最適化する方法が開示される。この方法は、Ｍｏｌｏｎｅｙ白血病ウイルス逆転写酵素（ｍｌｖＲＴ）、又はそのバリアントを用いてゲノム編集を行うことを含み得る。ｍｌｖＲＴなどの本明細書に記載されるＲＴは、点変異などの変異を含み得る。点変異は、逆転写酵素の位置２２１にあり得る。ｍｌｖＲＴ又はそのバリアントは、位置２２１に点変異を含み得る。位置２２１における点変異は、Ｑ２２１Ｒを含み得る。点変異は、逆転写酵素の位置２２３にあり得る。ｍｌｖＲＴ又はそのバリアントは、位置２２３に点変異を含み得る。位置２２３における点変異は、Ｖ２２３Ａを含み得る。位置２２３における点変異は、Ｖ２２３Ｍを含み得る。
いくつかの実施形態は、ゲノム編集効率を最適化する方法であって、低いｄＮＴＰ濃度でその触媒効率を増加させるように修飾される、Ｍｏｌｏｎｅｙ白血病ウイルス逆転写酵素（ｍｌｖＲＴ）を用いてゲノム編集を実施することを含む、方法を含む。例えば、ｍｌｖＲＴは、ｄＮＴＰに対するそのＫｍを減少させるように修飾され得る。
本開示の逆転写酵素は、１つ以上の変異を含み得る。例えば、逆転写酵素は、参照逆転写酵素配列（例えば、配列番号８１）に対して１つ以上の変異を含み得る。いくつかの実施形態において、逆転写酵素における点変異は、点変異を欠く参照配列と比較して、Ｃａｓ９－ＲＴ構築物の編集効率を増加させ得る。逆転写酵素は、配列番号８１と比較して、Ｄ２００Ｎ、ｌ６０３Ｗ、Ｔ３３０Ｐ、Ｔ３０６Ｋ、Ｗ３１３Ｆ、Ｙ８Ｈ、Ｐ５１Ｌ、Ｓ５６Ａ、Ｓ６７Ｒ、Ｅ６９Ｋ、Ｑ８４Ａ、Ｆ１５５Ｙ、Ｔ１９７Ａ、Ｈ２０４Ｒ、Ｔ２４６Ｅ、Ｎ２４９Ｄ、Ｅ２８６Ｒ、Ｑ２９１Ｉ、Ｒ３０１Ｌ、Ｅ３０２Ｋ、Ｆ３０９Ｎ、Ｍ３２０Ｌ、Ｌ４３５Ｇ、Ｄ５２４Ａ、Ｄ５２４Ｇ、Ｄ５２４Ｎ、Ｅ５６２Ｄ、Ｋ５７１Ｒ、Ｄ５８３Ｎ、Ｙ５８６Ｓ、Ｈ５９４Ｑ、Ｈ６３８Ｇ、Ｄ６５３Ｎ、Ｔ６６４Ｎ、Ｌ６７１Ｐ、Ｑ２２１Ｒ、Ｖ２２３Ａ、Ｖ２２３Ｍ、又はそれらの組み合わせに対応する１つ以上の変異を含み得る。逆転写酵素は、アミノ酸位置Ｑ８４、Ｌ１３９、Ｑ２２１、Ｖ２２３、Ｔ６６４、Ｌ６７１、Ｄ５２４、Ｐ５１、又はＳ６７における１つ以上の変異（例えば、点変異）を含み得る。逆転写酵素は、Ｑ８４Ａ、Ｌ１３９Ｐ、Ｑ２２１Ｒ、Ｖ２２３Ａ、Ｖ２２３Ｍ、Ｔ６６４Ｎ、Ｌ６７１Ｐ、Ｄ５２４Ａ、Ｐ５１Ｌ、又はＳ６７Ｒに対応する１つ以上の変異（例えば、点変異）を含み得る。１つ以上の変異は、配列番号８１又は本明細書で特定される別の配列に関するものであり得る。１つ以上の変異は、配列番号８１又は本明細書で特定される別の配列に対して、アミノ酸配列に関して、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、又は少なくとも９９％同一であり得る。いくつかの実施形態において、逆転写酵素は、Ｄ２００Ｎ、ｌ６０３Ｗ、Ｔ３３０Ｐ、Ｔ３０６Ｋ、及びＷ３１３Ｆ（例えば、配列番号１３又は配列番号４０）に対応する変異を含み得る。いくつかの実施形態において、逆転写酵素は、Ｄ２００Ｎ、ｌ６０３Ｗ、Ｔ３３０Ｐ、Ｔ３０６Ｋ、及びＷ３１３Ｆに対応する変異、並びに１つ以上の更なる変異（例えば、配列番号４１～配列番号８０）を含み得る。
ＲＴは、図１４Ｂに含まれる１つ以上の変異を含み得る。例えば、ＲＴは、位置５１、６７、８４、１３９、１９７、２０４、４３５、５２４、６５３、６６４、若しくは６７１、又はそれらの組み合わせにおける変異を含み得る。ＲＴは、位置Ｐ５１、Ｓ６７、Ｑ８４、Ｌ１３９、Ｑ２２１、Ｖ２２３、Ｔ１９７、Ｄ６５３、Ｔ６６４、Ｌ６７１、Ｌ４３５、Ｈ２０４、若しくはＤ５２４、又はそれらの組み合わせにおける変異を含み得る。ＲＴは、位置５１、６７、８４、１３９、１９７、２０４、４３５、５２４、６５３、６６４、及び６７１における変異を含み得る。この変異は、少なくとも１つの点変異を含み得る。少なくとも１つの点変異は、Ｐ５１Ｌ、Ｓ６７Ｒ、Ｑ８４Ａ、Ｌ１３９Ｐ、Ｑ２２１Ｒ、Ｖ２２３Ａ、Ｖ２２３Ｍ、Ｔ１９７Ａ、Ｄ６５３Ｎ、Ｔ６６４Ｎ、Ｌ６７１Ｐ、Ｌ４３５Ｇ、Ｈ２０４Ｒ、若しくはＤ５２４Ａ、又はそれらの組み合わせであり得る。ＲＴは、位置５１に変異を含み得る。位置５１における変異は、Ｐ５１Ｌを含み得る。ＲＴは、位置６７に変異を含み得る。位置６７における変異は、Ｓ６７Ｒを含み得る。ＲＴは、位置８４に変異を含み得る。位置８４における変異は、Ｑ８４Ａを含み得る。ＲＴは、位置１３９に変異を含み得る。位置１３９における変異は、Ｌ１３９Ｐを含み得る。ＲＴは、位置１９７に変異を含み得る。位置１９７における変異は、Ｔ１９７Ａを含み得る。ＲＴは、位置２０４に変異を含み得る。位置２０４における変異は、Ｈ２０４Ｒを含み得る。ＲＴは、位置４３５に変異を含み得る。位置４３５における変異は、Ｌ４３５Ｇを含み得る。ＲＴは、位置５２４に変異を含み得る。位置５２４における変異は、Ｄ５２４Ａを含み得る。ＲＴは、位置６５３に変異を含み得る。位置６５３における変異は、Ｄ６５３Ｎを含み得る。ＲＴは、位置６６４に変異を含み得る。位置６６４における変異は、Ｔ６６４Ｎを含み得る。ＲＴは、位置６７１に変異を含み得る。位置６７１における変異は、Ｌ６７１Ｐを含み得る。ＲＴは、例えば、当該変異の１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個、又はそれ以上を含み得る。ＲＴは、ｍｌｖＲＴを含み得る。ＲＴは、ｍｌｖＲＴ５Ｍを含み得る。１つ以上の変異を有するＲＴは、本明細書に提供されるＲＴ配列に関して１つ以上の変異を含み得る。１つ以上の変異は、１つ以上の変異を有しない組成物と関連して、本明細書に記載される組成物の編集効率を増加させ得る。変異は、挿入変異であってもよく、又は挿入変異を含んでもよい。逆転写酵素は、Ｐ５１、Ｓ６７、Ｑ８４、Ｌ１３９、Ｑ２２１、Ｖ２２３、Ｔ１９７、Ｄ６５３、Ｔ６６４、Ｌ６７１、Ｌ４３５、Ｈ２０４、若しくはＤ５２４、又はそれらの組み合わせのすぐ上流（例えば、アミノ末端方向）の挿入変異を含む。逆転写酵素は、Ｐ５１、Ｓ６７、Ｑ８４、Ｌ１３９、Ｑ２２１、Ｖ２２３、Ｔ１９７、Ｄ６５３、Ｔ６６４、Ｌ６７１、Ｌ４３５、Ｈ２０４、若しくはＤ５２４、又はそれらの組み合わせのすぐ下流（例えば、カルボキシ末端方向）の挿入変異を含む。挿入変異は、点変異について本明細書に開示されるアミノ酸の挿入を含み得、点変異はアミノ酸に対するものである。
いくつかの実施形態において、逆転写酵素は、位置Ｐ５１、Ｓ６７、Ｑ８４、Ｌ１３９、Ｔ１９７、Ｄ２００、Ｈ２０４、Ｑ２２１、Ｖ２２３、Ｔ３０６、Ｗ３１３、Ｔ３３０、Ｌ４３５、Ｄ５２４、Ｄ６５３、Ｔ６６４、Ｌ６７１、若しくはＬ６００、又はそれらの組み合わせに点変異を有する。いくつかの実施形態において、逆転写酵素は、位置Ｐ５１、Ｓ６７、Ｑ８４、Ｌ１３９、Ｑ２２１、Ｖ２２３、Ｔ１９７、Ｄ６５３、Ｔ６６４、Ｌ６７１、Ｌ４３５、Ｈ２０４、若しくはＤ５２４、又はそれらの組み合わせに点変異を有する。いくつかの実施形態において、逆転写酵素は、位置Ｑ８４、Ｌ１３９、Ｑ２２１、Ｖ２２３、Ｔ６６４、若しくはＬ６７１、又はそれらの組み合わせに点変異を有する。
いくつかの実施形態において、逆転写酵素は、Ｐ５１Ｌ、Ｓ６７Ｒ、Ｑ８４Ａ、Ｌ１３９Ｐ、Ｔ１９７Ａ、Ｄ２００Ｎ、Ｈ２０４Ｒ、Ｑ２２１Ｒ、Ｖ２２３Ａ、Ｖ２２３Ｍ、Ｔ３０６Ｋ、Ｗ３１３Ｆ、Ｔ３３０Ｐ、Ｌ４３５Ｇ、Ｄ５２４Ａ、Ｄ６５３Ｎ、Ｔ６６４Ｎ、Ｌ６７１Ｐ、若しくはＬ６０３Ｗ、又はそれらの組み合わせを含む点変異を有する。いくつかの実施形態において、逆転写酵素は、Ｐ５１Ｌ、Ｓ６７Ｒ、Ｑ８４Ａ、Ｌ１３９Ｐ、Ｑ２２１Ｒ、Ｖ２２３Ａ、Ｖ２２３Ｍ、Ｔ１９７Ａ、Ｄ６５３Ｎ、Ｔ６６４Ｎ、Ｌ６７１Ｐ、Ｌ４３５Ｇ、Ｈ２０４Ｒ、若しくはＤ５２４Ａ、又はそれらの組み合わせを含む点変異を有する。いくつかの実施形態において、逆転写酵素は、Ｓ６７Ｒ、Ｑ８４Ａ、Ｌ１３９Ｐ、Ｑ２２１Ｒ、Ｖ２２３Ａ、Ｖ２２３Ｍ、Ｔ６６４Ｎ、Ｌ６７１Ｐ、若しくはＤ５２４Ａ、又はそれらの組み合わせを含む点変異を有する。
本開示の逆転写酵素は、ループ領域（例えば、２ａループ又は３ａループ）を含み得る。本開示の逆転写酵素は、２０以上、４０以上、４５以上、５０以上、６０以上、８１以上、１００以上、５００以上、１０００以上、２０００以上、３０００以上、４０００以上、５０００以上、６０００以上、７０００以上、８０００以上、９０００以上、又は１０，０００以上のヌクレオチドの編集配列を転写し得る。本開示の逆転写酵素は、最大約２０、最大約４０、最大約４５、最大約５０、最大約６０、最大約８１、最大約１００、最大約５００、最大約１０００、最大約２０００、最大約３０００、最大約４０００、最大約５０００、最大約６０００、最大約７０００、最大約８０００、最大約９０００、又は最大約１０，０００のヌクレオチドの編集配列を転写し得る。本開示の逆転写酵素は、２０～１０，０００のヌクレオチドの編集配列を転写し得る。
本開示の逆転写酵素は、増加した処理能力を有し得る。処理能力は、単一の結合事象において逆転写酵素によって触媒されるホスホジエステル結合の数によって決定され得る。処理能力は、天然の逆転写酵素と比較され得る。逆転写酵素は、ｍｌｖＲＴと比較して増加した処理能力を含み得る。処理能力が増加した逆転写酵素は、標的核酸の標的部位におけるより長い配列を編集し得る。例えば、処理能力が増加した逆転写酵素は、プログラマブルヌクレアーゼの編集ウィンドウ長を増加させ得る。逆転写酵素は、ｍｌｖＲＴと比較して標的配列におけるより長いウィンドウ長を編集し得る。処理能力が増加した逆転写酵素は、挿入配列を含み得る。いくつかの実施形態において、処理能力を増加させる挿入は、ドメイン２と３との間、又はドメイン３と４との間の逆転写酵素に挿入され得る。処理能力が増加した逆転写酵素は、欠失を含み得る。例えば、処理能力が増加した逆転写酵素は、ＲＮａｓｅドメインを欠いていてもよく、又は接続ドメインを欠いていてもよい。処理能力が増加した逆転写酵素は、単一の結合事象において、２０以上、４０以上、４５以上、５０以上、６０以上、８１以上、１００以上、５００以上、１０００以上、２０００以上、３０００以上、４０００以上、５０００以上、６０００以上、７０００以上、８０００以上、９０００以上、又は１０，０００以上のホスホジエステル結合を触媒し得る。処理能力が増加した逆転写酵素は、単一の結合事象において、最大約２０、最大約４０、最大約４５、最大約５０、最大約６０、最大約８１、最大約１００、最大約５００、最大約１０００、最大約２０００、最大約３０００、最大約４０００、最大約５０００、最大約６０００、最大約７０００、最大約８０００、最大約９０００、又は最大約１０，０００のホスホジエステル結合を触媒し得る。
いくつかの実施形態において、逆転写酵素は、標的核酸の標的部位においてｍｌｖＲＴよりも長い配列を編集する。逆転写酵素は、プログラマブルヌクレアーゼの編集ウィンドウ長を増加させ得る。標的部位においてより長い配列を編集する逆転写酵素は、挿入配列を含み得る。いくつかの実施形態において、挿入は、ドメイン２と３との間、又はドメイン３と４との間の標的部位においてより長い配列を編集する逆転写酵素に挿入される。標的部位においてより長い配列を編集する逆転写酵素は、欠失を含み得る。例えば、標的部位においてより長い配列を編集する逆転写酵素は、ＲＮａｓｅドメインを欠いていてもよいか、又は接続ドメインを欠いていてもよい。標的部位においてより長い配列を編集する逆転写酵素は、単一の結合事象において、２０以上、４０以上、４５以上、５０以上、６０以上、８１以上、１００以上、５００以上、１０００以上、２０００以上、３０００以上、４０００以上、５０００以上、６０００以上、７０００以上、８０００以上、９０００以上、又は１０，０００以上のホスホジエステル結合を触媒し得る。標的部位においてより長い配列を編集する逆転写酵素は、単一の結合事象において、最大約２０、最大約４０、最大約４５、最大約５０、最大約６０、最大約８１、最大約１００、最大約５００、最大約１０００、最大約２０００、最大約３０００、最大約４０００、最大約５０００、最大約６０００、最大約７０００、最大約８０００、最大約９０００、又は最大約１０，０００のホスホジエステル結合を触媒し得る。いくつかの実施形態において、標的部位においてより長い配列を編集する逆転写酵素は、本明細書に記載される増加した処理能力も有する。
本開示の逆転写酵素は、小さな逆転写酵素であり得る。小さな逆転写酵素は、より大きな逆転写酵素と比較して、改善された細胞への送達を有し得る。逆転写酵素は、ｍｌｖＲＴと比較して、改善された細胞への送達を含み得る。小さな逆転写酵素は、より大きな逆転写酵素と比較して、改善された細胞内の発現を有し得る。小さな逆転写酵素は、約４００以下、約４２０以下、約４２７以下、約４４０以下、約４５０以下、約５００以下、約５５０以下、約５６０以下、約５９９以下、約６００以下、約６５０以下、約６７７以下、約６８２以下、約７００以下、約７５０以下、約７６１以下、約７６２以下、約８００以下、約８５０以下、約９００以下、約９０１以下、約９５０以下、約１０００以下、約１１００以下、約１１１４以下、約１２００以下、約１２７５以下、約１２８１以下、又は約１３００以下のアミノ酸残基を含み得る。本開示の構築物は、小さな逆転写酵素、二量体化領域、局在化領域、又はそれらの組み合わせを含み得る。小さな逆転写酵素は、処理能力を増加させることができ、標的部位におけるより長い配列を編集でき、又はそれらの組み合わせであってもよい。
本開示の逆転写酵素は、Ｍｏｌｏｎｅｙ白血病ウイルスの逆転写酵素と比較して減少した免疫原性を有し得る。免疫原性が減少した逆転写酵素はまた、小さな逆転写酵素であってもよく、処理能力が増加してもよく、標的部位においてより長い配列を編集してもよく、又はそれらの任意の組み合わせであってもよい。
本明細書には、Ｃａｓニッカーゼ又はＣａｓ９プログラマブルヌクレアーゼを含む組成物が開示される。本開示と一致するＣａｓニッカーゼ又はＣａｓ９プログラマブルヌクレアーゼの例には、ＳｐＣａｓ９（配列番号３２）、ＳａＣａｓ９（配列番号３３）、ＣｊＣａｓ９（配列番号３４）、ＧｅｏＣａｓ９（配列番号３５）、ＨｐａＣａｓ９（配列番号３６）、及びＮｍｅＣａｓ９（配列番号３７）が含まれる。いくつかの実施形態において、Ｃａｓニッカーゼは、配列番号３２～３７のうちのいずれか１つに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一の配列を含む。本開示のＣａｓ９プログラマブルヌクレアーゼは、天然のＣａｓ９プログラマブルヌクレアーゼに対する変異、挿入、欠失、又は切断を含み得る。
Ｃａｓニッカーゼは、変異を含み得る。変異は、インテイン触媒作用を可能にし得るか、又は改善し得る。変異は、挿入変異であり得る。変異は、点変異であり得る。Ｃａｓニッカーゼは、システイン点変異を含み得る。システイン点変異は、ＣａｓニッカーゼのＣ末端半分に位置し得る。本明細書に記載されるＣａｓ９は、Ｃａｓ９のＣ末端半分におけるシステイン点変異を含み得る。システイン点変異は、Ｃａｓニッカーゼのアミノ酸位置５７４の後の任意の場所に位置し得る。変異は、Ｓ．Ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ニッカーゼ内にあり得る。システイン点変異は、Ｓ１１７３を含み得る。システイン点変異は、Ｄ１０７９を含み得る。システイン点変異は、Ｄ１１８０を含み得る。
Ｃａｓ９ニッカーゼ（Ｓ．Ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ニッカーゼ）は、点変異を含み得る。点変異は、インテイン触媒作用を可能にし得る。点変異は、インテイン触媒作用を改善し得る。いくつかの実施形態において、点変異は、システイン点変異、セリン点変異、スレオニン点変異、又はアラニン点変異を含む。いくつかの実施形態において、点変異は、システイン点変異を含む。いくつかの実施形態において、点変異は、セリン点変異を含む。いくつかの実施形態において、点変異は、スレオニン点変異を含む。いくつかの実施形態において、点変異は、アラニン点変異を含む。いくつかの実施形態において、点変異は、Ｄ１０７９に位置する。いくつかの実施形態において、点変異は、Ｄ１１２５に位置する。いくつかの実施形態において、点変異は、Ｄ１１３０に位置する。いくつかの実施形態において、点変異は、Ｇ１１３３に位置する。いくつかの実施形態において、点変異は、Ａ１１４０に位置する。いくつかの実施形態において、点変異は、Ｉ１１６８に位置する。いくつかの実施形態において、点変異は、Ｓ１１７３に位置する。いくつかの実施形態において、点変異は、Ｄ１１８０に位置する。いくつかの実施形態において、点変異は、Ｇ１１８６に位置する。いくつかの実施形態において、点変異は、Ｌ１２０３に位置する。いくつかの実施形態において、点変異は、Ｒ１２１２に位置する。いくつかの実施形態において、点変異は、Ｓ．Ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９のＤ１０７９、Ｄ１１２５、Ｄ１１３０、Ｇ１１３３、Ａ１１４０、Ｉ１１６８、Ｓ１１７３、Ｄ１１８０、Ｇ１１８６、Ｌ１２０３、又はＲ１２１２に位置する。
Ｃａｓ９ニッカーゼ（Ｓ．Ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ニッカーゼ）は、挿入変異を含み得る。挿入変異は、インテイン触媒作用を可能にし得る。挿入変異は、インテイン触媒作用を改善し得る。いくつかの実施形態において、挿入変異は、システイン挿入変異、セリン挿入変異、スレオニン挿入変異、又はアラニン挿入変異を含む。いくつかの実施形態において、挿入変異は、システイン挿入変異を含む。いくつかの実施形態において、挿入変異は、セリン挿入変異を含む。いくつかの実施形態において、挿入変異は、スレオニン挿入変異を含む。いくつかの実施形態において、挿入変異は、アラニン挿入変異を含む。いくつかの実施形態において、挿入変異は、アミノ酸位置１０７９に位置する。いくつかの実施形態において、挿入変異は、アミノ酸位置１１２５に位置する。いくつかの実施形態において、挿入変異は、アミノ酸位置１１３０に位置する。いくつかの実施形態において、挿入変異は、アミノ酸位置１１３３に位置する。いくつかの実施形態において、挿入変異は、アミノ酸位置１１４０に位置する。いくつかの実施形態において、挿入変異は、アミノ酸位置１１６８に位置する。いくつかの実施形態において、挿入変異は、アミノ酸位置１１７３に位置する。いくつかの実施形態において、挿入変異は、アミノ酸位置１１８０に位置する。いくつかの実施形態において、挿入変異は、アミノ酸位置１１８６に位置する。いくつかの実施形態において、挿入変異は、アミノ酸位置１２０３に位置する。いくつかの実施形態において、挿入変異は、アミノ酸位置１２１２に位置する。いくつかの実施形態において、挿入変異は、Ｓ．Ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９のＤ１０７９、Ｄ１１２５、Ｄ１１３０、Ｇ１１３３、Ａ１１４０、Ｉ１１６８、Ｓ１１７３、Ｄ１１８０、Ｇ１１８６、Ｌ１２０３、又はＲ１２１２の直前に位置する。
Ｃａｓニッカーゼは、配列番号８５～配列番号８７又は配列番号９０～配列番号９２のうちのいずれか１つの配列を含み得る。いくつかの実施形態において、Ｃａｓニッカーゼは、配列番号８５～配列番号８７又は配列番号９０～配列番号９２のうちのいずれか１つに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一の配列を含む。Ｃａｓニッカーゼは、２つ以上のセグメントとして発現され得る。システイン点変異は、ＣａｓニッカーゼのＣ末端部分のＮ末端に位置し得る。第１のセグメントは、配列番号９０の配列を含み得る。
本明細書には、ヘテロ二量体化ドメインを含まないＣａｓニッカーゼ及び逆転写酵素を含む組成物が開示される。例えば、Ｃａｓニッカーゼ及び逆転写酵素は、ヘテロ二量体化するように操作することはできない。しかしながら、Ｃａｓニッカーゼ及び逆転写酵素は、当該操作又はヘテロ二量体化ドメインなしでヘテロ二量体化し、核酸編集を行ってもよい。Ｃａｓニッカーゼ及び逆転写酵素は、別個のポリペプチド鎖を含み得る。
本明細書には、Ｃａｓニッカーゼ及び逆転写酵素、又はＣａｓニッカーゼ及び逆転写酵素をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む組成物であって、Ｃａｓニッカーゼ及び逆転写酵素のうちの少なくとも一部が、少なくとも２つの別個のポリペプチド鎖に含まれ、少なくとも２つの別個のポリペプチド鎖が、互いに結合するヘテロ二量体ドメインを含む別個のポリペプチド鎖を含む、組成物が開示される。別個のポリペプチド鎖は、ヘテロ二量体ドメインを含む融合タンパク質を含み得る。ヘテロ二量体ドメインは、別個のポリペプチド鎖に融合され得る。ヘテロ二量体ドメインは、別個のポリペプチド鎖のアミノ末端又はカルボキシ末端に融合され得る。ヘテロ二量体ドメインは、ロイシンジッパーを含み得る。ヘテロ二量体ドメインは、ＰＤＺドメインを含み得る。ヘテロ二量体ドメインは、ストレプトアビジンを含み得る。ヘテロ二量体ドメインは、ストレプトアビジン結合タンパク質を含み得る。ヘテロ二量体ドメインは、フォルドンドメインを含み得る。ヘテロ二量体ドメインは、疎水性ポリペプチドを含み得る。ヘテロ二量体ドメインは、抗体を含み得る。ヘテロ二量体ドメインは、ノブ、ホール、ロイシンジッパー、コイルドコイル、又は静電相互作用を形成することができる極性アミノ酸残基を含み得る。ヘテロ二量体ドメインは、ＩｇＭ（ＭＨＤ２）又はＩｇＥ（ＥＨＤ２）の重鎖ドメイン２（ＣＨ２）、免疫グロブリンＦｃ領域、ＩｇＧ又はＩｇＡの重鎖ドメイン３（ＣＨ３）、ＩｇＭ又はＩｇＥの重鎖ドメイン４（ＣＨ４）、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、ロイシンジッパーモチーフ、バルナーゼ－バルスター（ｂａｒｎａｓｅ－ｂａｒｓｔａｒ）二量体、ミニ抗体、又はＺＩＰミニ抗体のうちのいずれかを含み得る。ヘテロ二量体ドメインは、フィブリチンフォルドンドメインを含み得る。ヘテロ二量体ドメインは、ロイシンジッパー、フォルドンドメイン、断片Ｘ、コラーゲンドメイン、２Ｇ１２ ＩｇＧホモ二量体、ミトコンドリア抗ウイルスシグナル伝達タンパク質ＣＡＲＤフィラメント、心臓ホスホランバン膜貫通ペンタマー、副甲状腺ホルモン二量体化ドメイン、グリコホリンＡ膜貫通、ＨＩＶ Ｇｐ４１三量体化ドメイン、又はＨＰＶ４５がんタンパク質Ｅ７ Ｃ末端二量体ドメインを含み得る。ヘテロ二量体ドメインは、Ｆｃドメインを含み得る。ヘテロ二量体ドメインは、ロイシンジッパードメイン、ＰＳＤ９５－Ｄｌｇｌ－ｚｏ－１（ＰＤＺ）ドメイン、ストレプトアビジン、ストレプトアビジン結合タンパク質（ＳＢＰ）、ｍＴＯＲのＦＫＢＰ結合ドメイン（ＦＲＢ）、シクロフィリン－Ｆａｓ融合タンパク質（ＣｙＰ－Ｆａｓ）、カルシニューリンＡ（ＣＮＡ）及びＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）、Ｓｎａｐタグ、Ｈａｌｏタグ、ＰＹＬ、又はＡＢＩを含み得る。ヘテロ二量体ドメインは、本明細書に記載されるヘテロ二量体ドメインの結合断片を含み得る。
インテイン技術を使用した分割Ｃａｓ９構築物の発現
いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９構築物（例えば、Ｃａｓ９－ＲＴ）は、１つ以上のインテインに融合した１つ以上のエクステインとして分割構築物として発現され得る。インテイン技術を使用して、タンパク質を２つ以上の短いペプチドセグメント（エクステイン）として発現させることによって、大きなタンパク質を細胞内に送達することができる。各エクステインは、インテインペプチド（例えば、Ｎｐｕ Ｃインテイン又はＮｐｕ Ｎインテイン）との融合物として発現され得る。インテインは、２つ以上のエクステインの融合物を自己触媒し得、その対応するエクステインからのインテインの切除を自己触媒し得る。この結果は、第２のエクステインに融合した第１のエクステインを含み、インテインを欠くタンパク質複合体であり得る。インテインは、エクステインのＮ末端に位置し得るか、又はインテインは、エクステインのＣ末端に位置し得る。エクステインは、インテインに隣接して配置された（例えば、エクステインのＣ末端に融合したインテインを有するエクステインのＣ末端に）システイン残基を含み得る。Ｃａｓニッカーゼは、２つ以上のセグメントとして発現され得る。Ｃａｓニッカーゼセグメントの第１は、ＣａｓニッカーゼのＮ末端部分を含み得る。Ｃａｓニッカーゼの第１のセグメントは、第１のインテインを含み得る。Ｃａｓニッカーゼの第２のセグメントは、ＣａｓニッカーゼのＣ末端部分を含み得る。Ｃａｓニッカーゼの第２のセグメントは、第２のインテインを含み得る。インテインは、ＣａｓニッカーゼのＮ末端部分のＣ末端に融合され得る。インテインは、ＣａｓニッカーゼのＣ末端部分のＮ末端に融合され得る。
いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９構築物（例えば、Ｃａｓ９－ＲＴ）は、１つ以上のインテインに融合した１つ以上のエクステインとして分割構築物として発現され得る。インテイン技術を使用して、タンパク質を２つ以上の短いペプチドセグメント（エクステイン）として発現させることによって、大きなタンパク質を細胞内に送達することができる。各エクステインは、インテインペプチド（例えば、Ｎｐｕ Ｃインテイン又はＮｐｕ Ｎインテイン）との融合物として発現され得る。インテインは、２つ以上のエクステインの融合物を自己触媒し得、その対応するエクステインからのインテインの切除を自己触媒し得る。この結果は、第２のエクステインに融合した第１のエクステインを含み、インテインを欠くタンパク質複合体であり得る。インテインは、エクステインのＮ末端に位置し得るか、又はインテインは、エクステインのＣ末端に位置し得る。エクステインは、インテインに隣接して配置された（例えば、エクステインのＣ末端に融合したインテインを有するエクステインのＣ末端に）システイン残基を含み得る。Ｃａｓニッカーゼは、２つ以上のセグメントとして発現され得る。Ｃａｓニッカーゼセグメントの第１は、ＣａｓニッカーゼのＮ末端部分を含み得る。Ｃａｓニッカーゼの第１のセグメントは、第１のインテインを含み得る。Ｃａｓニッカーゼの第２のセグメントは、ＣａｓニッカーゼのＣ末端部分を含み得る。Ｃａｓニッカーゼの第２のセグメントは、第２のインテインを含み得る。インテインは、ＣａｓニッカーゼのＮ末端部分のＣ末端に融合され得る。インテインは、ＣａｓニッカーゼのＣ末端部分のＮ末端に融合され得る。
エクステイン－インテイン融合物をコードする核酸配列は、送達ベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター）に適合し得る。いくつかの実施形態において、インテインに融合したペプチドセグメントエクステインをコードするベクターが、細胞に送達され得る。いくつかの実施形態において、エクステイン－インテイン融合物は、細胞内で発現され得る。第１のエクステイン－インテイン融合ペプチドは、１つ以上の追加のエクステイン－インテイン融合ペプチドに融合され得、インテインは、インテインを欠く大きなタンパク質構築物を生成するために切除され得る。いくつかの実施形態において、タンパク質は、エクステイン融合及びインテイン切除を容易にするためにシステイン残基を導入するための点変異を含み得る。いくつかの実施形態において、本開示のＣａｓ９－ＲＴは、２つ以上のエクステイン－インテイン融合ペプチドとして発現され得る。いくつかの実施形態において、本開示のＣａｓ９（例えば、配列番号３２～配列番号３７又は配列番号８４～配列番号８７）は、本開示の逆転写酵素（例えば、配列番号３～配列番号２２又は配列番号４０～配列番号８０）と併せて、２つ以上のエクステイン－インテイン融合ペプチドとして発現されて、Ｃａｓ９－ＲＴ融合物を生成し得る。例えば、Ｃａｓ９－ＲＴは、ｎＣａｓ９（１～１１７２）－Ｎｐｕ Ｎインテインを含む第１のＣａｓ９－ＲＴエクステイン融合物、及びＮｐｕ Ｃインテイン－ｎＣａｓ９（１１７３～１３６８）－ｍｌｖＲＴ５Ｍを含む第２のＣａｓ９－ＲＴエクステイン融合物として発現され得る。ｎＣａｓ９（１～１１７２）は、ニッキングＣａｓ９の残基１～１１７２（例えば、配列番号８４～配列番号８７のうちのいずれか１つの残基１～１１７２）に対応し得る。ｎＣａｓ９（１１７３～１３６８）は、位置１１７３にシステインを有するニッキングＣａｓ９の残基１１７３～１３６８（例えば、配列番号８６の残基１～１１７２）に対応し得る。ｍｌｖＲＴ５Ｍは、５つの点変異（例えば、配列番号１３又は配列番号４０）を含む逆転写酵素に対応し得る。セグメントは、配列番号９１の配列を含み得る。セグメントは、Ｃａｓニッカーゼに融合した逆転写酵素（例えば、ＣａｓニッカーゼのＣ末端部分）を含み得る。逆転写酵素は、ＣａｓニッカーゼのＣ末端部分のＣ末端に融合したＮ末端を含み得る。逆転写酵素は、ｍｌｖＲＴ、又はそのバリアントを含み得る。
ガイド核酸
本明細書には、プログラマブルヌクレアーゼ（例えば、ｎＣａｓ９）を標的核酸に誘導するガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）が提供される。本開示のガイド核酸は、標的核酸の標的部位に挿入される核酸配列の合成を促進し得る。本開示のガイド核酸は、標的核酸の標的部位における核酸配列の編集を促進し得る。
本明細書には、プログラマブルヌクレアーゼ（例えば、ｎＣａｓ９）を標的核酸に誘導するガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）が提供される。本開示のガイド核酸は、標的核酸の標的部位に挿入される核酸配列の合成を促進し得る。本開示のガイド核酸は、標的核酸の標的部位における核酸配列の編集を促進し得る。
いくつかの実施形態において、本開示のガイド核酸は、標的核酸の第１の領域に逆相補的なスペーサー、Ｃａｓニッカーゼに結合するように構成された足場、標的核酸（ＲＴＴ）に組み込まれる配列をコードする逆転写酵素鋳型、標的核酸の第２の領域に逆相補的な第１の鎖プライマー結合部位、逆転写酵素鋳型の領域の配列を含む第２の鎖プライマー、又はそれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、標的核酸の第１の領域は、標的核酸の第１の鎖上にあり、標的核酸の第２の領域は、標的核酸の第２の鎖上にある。いくつかの実施形態において、標的核酸の第１の領域の全て又は一部は、標的核酸の第２の領域の全て又は一部に逆相補的である。いくつかの実施形態において、第１の鎖プライマー結合部位は、標的核酸の第２の領域にハイブリダイズするように構成される。いくつかの実施形態において、逆転写酵素鋳型は、標的核酸の第２の領域の３’末端からの逆転写のための鋳型として機能するように構成される。いくつかの実施形態において、第２の鎖プライマーは、逆転写酵素鋳型に逆相補的な鋳型からの転写のためのプライマーとして機能するように構成される。いくつかの実施形態において、第１の合成鎖は、第２の鎖プライマーからの第２の鎖の合成のための鋳型であり得る。
本開示のガイド核酸は、ＲＴＴを含み得る。このようにして、挿入される核酸配列は、ＰＡＭに変異を有し得る。これは、すでに挿入された核酸配列の再編集を防止することができる。ＲＴＴは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を破壊する修飾を含み得る。ＲＴＴは、１つ以上のＰＡＭ配列を破壊する２つ以上の修飾を含み得る。修飾は、ＰＡＭ配列と部分的に相補的である配列を含み得る。修飾は、ＰＡＭ配列とのミスマッチを含み得る。ＰＡＭ配列は、標的核酸において破壊され得る。標的核酸は、破壊の前に天然に存在するＰＡＭ配列を含み得る。ＰＡＭ配列は、２～６塩基対の核酸配列を含み得る。ＰＡＭ配列の例は、５’－ＮＧＧ－３’である。ＰＡＭ配列の他の例には、５’－ＴＴＴＮ－３’又は５’－ＹＴＮ－３’が含まれる。これらのＰＡＭ配列のいずれも、ＲＴＴ中で修飾され得る。このような修飾のいくつかの例には、挿入、欠失、又は点変異が含まれ得る。ＰＡＭ配列は、Ｃａｓニッカーゼによって認識され得る。修飾又は破壊されたＰＡＭ配列は、一部の場合、Ｃａｓニッカーゼによって認識されない場合がある。この修飾は、ゲノム内のＰＡＭを破壊又は除去する配列を含み得る。
逆転写酵素鋳型は、ゲノム内のモノヌクレオチドトラックを破壊する修飾を含み得る。修飾は、モノヌクレオチドトラックと部分的に相補的である配列を含み得る。修飾は、モノヌクレオチドトラックとのミスマッチを含み得る。逆転写酵素鋳型は、ゲノム内の１つ以上のモノヌクレオチドトラックを破壊する２つ以上の修飾を含み得る。修飾は、ゲノム内のモノヌクレオチドトラックを破壊又は除去する配列を含み得る。ガイド核酸は、標的核酸内の同じ塩基の少なくとも４つの連続したヌクレオチドのうちの１つ以上のトラックを排除する逆転写酵素鋳型内の１つ以上の修飾を含み得る。
標的核酸は、ポリＡトラック又は長いポリＡトラックを含み得る。ＲＴＴは、長いポリＡトラックを含み得る。ＲＴＴに修飾を導入してポリＡトラックを破壊すると、編集効率が改善し得る。いくつかの実施形態において、ＲＴＴは、同じヌクレオチド塩基である少なくとも４つの連続したヌクレオチドのトラックを排除又は修飾する１つ以上の修飾を更に含む。逆転写酵素鋳型における１つ以上の修飾は、標的核酸中の同じ塩基の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも４つの連続したヌクレオチド）のうちの１つ以上のトラックを排除し得る。ＲＴＴは、４つ以上の連続したＡヌクレオチドを排除する修飾を含み得る。ＲＴＴは、４つ以上の連続したＴヌクレオチドを排除する修飾を含み得る。ＲＴＴは、４つ以上の連続したＧヌクレオチドを排除する修飾を含み得る。ＲＴＴは、４つ以上の連続したＣヌクレオチドを排除する修飾を含み得る。ＲＴＴは、４つ以上の連続したＵヌクレオチドを排除する修飾を含み得る。ＲＴＴは、３個以上の連続したヌクレオチドを排除する修飾を含み得、３個以上の連続したヌクレオチドは全て、互いに同じ核酸塩基を含む。ＲＴＴは、４個以上の連続したヌクレオチドを排除する修飾を含み得、４個以上の連続したヌクレオチドは全て、互いに同じ核酸塩基を含む。ＲＴＴは、５個以上の連続したヌクレオチドを排除する修飾を含み得、５個以上の連続したヌクレオチドは全て、互いに同じ核酸塩基を含む。ＲＴＴは、６個以上の連続したヌクレオチドを排除する修飾を含み得、６個以上の連続したヌクレオチドは全て、互いに同じ核酸塩基を含む。ＲＴＴは、７個以上の連続したヌクレオチドを排除する修飾を含み得、７個以上の連続したヌクレオチドは全て、互いに同じ核酸塩基を含む。ＲＴＴは、８個以上の連続したヌクレオチドを排除する修飾を含み得、８個以上の連続したヌクレオチドは全て、互いに同じ核酸塩基を含む。ＲＴＴは、同じ塩基を含む、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上の連続したヌクレオチドを排除する修飾を含み得る。ＲＴＴは、連続して同じ塩基を含む連続したヌクレオチドをもはや含まないように、連続して同じ塩基を含む、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上の連続したヌクレオチドを修飾する修飾を含み得る。
修飾は、非修飾ガイド核酸に関する変異を含み得る。変異は、サイレント変異であり得る。一部の場合、変異は、サイレント変異ではない。
ガイド核酸は、遺伝子編集を改善するためにガイド核酸上の別の領域にそれ自体が結合する領域を含み得る。本開示のガイド核酸は、Ｖｅｌｃｒｏ領域を含み得る。Ｖｅｌｃｒｏ領域は、「Ｖｅｌｃｒｏ結合部位」と称されるガイド核酸の別の領域に結合するガイド核酸の領域を含み得る。例えば、Ｖｅｌｃｒｏ領域は、遺伝子編集を改善するためにガイド核酸の別の領域に結合するガイド核酸の領域を含み得る。Ｖｅｌｃｒｏ結合部位へのＶｅｌｃｒｏ領域の結合は、ガイド核酸の構造を変化させ得る。Ｖｅｌｃｒｏ結合部位へのＶｅｌｃｒｏ領域の結合によるガイド核酸の変化した構造は、遺伝子編集を改善し得る。ガイド核酸は、ｇＲＮＡ位置決めシステム（ＧＰＳ）を含み得る。Ｖｅｌｃｒｏ領域又はＧＰＳは、ｇＲＮＡの領域（例えば、Ｖｅｌｃｒｏ結合部位又はＧＰＳ結合部位）にハイブリダイズし得る。Ｖｅｌｃｒｏ領域又はＧＰＳは、逆転写酵素鋳型の領域にハイブリダイズし得る。「Ｖｅｌｃｒｏ」及び「ＧＰＳ」は、互換的に使用され得る。例えば、「Ｖｅｌｃｒｏ領域」は、「ＧＰＳ領域」と称されてもよく、若しくはその逆であってもよく、又は「Ｖｅｌｃｒｏ結合部位」は、「ＧＰＳ結合部位」と称されてもよく、若しくはその逆であってもよい。Ｖｅｌｃｒｏ領域は、逆転写酵素鋳型領域の領域にハイブリダイズし得る。Ｖｅｌｃｒｏ領域を含むｇＲＮＡは、第２の鎖プライマーを含み得る。Ｖｅｌｃｒｏ領域を含むｇＲＮＡは、スペーサー、足場領域、Ｖｅｌｃｒｏ領域、ＲＴ鋳型、ＳＳＰ、リボザイム、又はそれらの組み合わせを含み得る。例えば、Ｖｅｌｃｒｏ領域を含むｇＲＮＡは、スペーサー、足場領域、Ｖｅｌｃｒｏ領域、ＲＴ鋳型、ＳＳＰ、及びリボザイムを含み得る。Ｖｅｌｃｒｏ領域を含むｇＲＮＡは、スペーサー、足場領域、ＲＴ鋳型、Ｖｅｌｃｒｏ領域、ＳＳＰ、リボザイム、又はそれらの組み合わせを含み得る。例えば、Ｖｅｌｃｒｏ領域を含むｇＲＮＡは、スペーサー、足場領域、ＲＴ鋳型、Ｖｅｌｃｒｏ領域、ＳＳＰ、及びリボザイムを含み得る。Ｖｅｌｃｒｏ領域を含むｇＲＮＡは、スペーサー、足場領域、ＲＴ鋳型、Ｖｅｌｃｒｏ領域、ＳＳＰ、リボザイム、若しくはプライマー結合部位（ＰＢＳ）、又はそれらの組み合わせを含み得る。例えば、Ｖｅｌｃｒｏ領域を含むｇＲＮＡは、スペーサー、足場領域、ＲＴ鋳型、Ｖｅｌｃｒｏ領域、ＳＳＰ、リボザイム、及びＰＢＳを含み得る。Ｖｅｌｃｒｏ領域を含むｇＲＮＡの例は、図８Ａ及び図８Ｂ、並びに図１２Ａ及び図１２Ｂに示される。Ｖｅｌｃｒｏ領域は、標的部位において標的核酸に挿入される核酸配列の逆転写を促進し得る。
ＧＰＳ領域を含むガイド核酸は、ガイドＲＮＡを含み得る。ＧＰＳ領域を含むガイド核酸は、ガイドＲＮＡ以外のガイド核酸を含み得る。ＧＰＳ結合部位を含むガイド核酸は、ガイドＲＮＡを含み得る。ＧＰＳ結合部位を含むガイド核酸は、ガイドＲＮＡ以外のガイド核酸を含み得る。
Ｖｅｌｃｒｏ領域は、合成であり得る。Ｖｅｌｃｒｏ結合部位は、合成であり得る。Ｖｅｌｃｒｏ領域及びＶｅｌｃｒｏ結合部位は、ｇＲＮＡに挿入され得る。例えば、合成Ｖｅｌｃｒｏ結合部位は、ｇＲＮＡ内のＲＴ鋳型のｇＲＮＡ５’に含まれ得る。
いくつかの実施形態において、本明細書には、Ｖｅｌｃｒｏ領域又はＶｅｌｃｒｏ結合部位が開示される。いくつかの実施形態において、核酸は、Ｖｅｌｃｒｏ領域を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のウイルスベクター（例えば、アデノウイルス）は、Ｖｅｌｃｒｏ領域を含む核酸を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、Ｖｅｌｃｒｏ領域を含む核酸を含む。いくつかの実施形態において、ガイド核酸は、Ｖｅｌｃｒｏ領域を含む。Ｖｅｌｃｒｏ領域は、Ｖｅｌｃｒｏ結合部位にハイブリダイズし得る。いくつかの実施形態において、Ｖｅｌｃｒｏ結合部位は、Ｖｅｌｃｒｏ領域に逆相補的である。いくつかの実施形態において、Ｖｅｌｃｒｏ結合部位は、Ｖｅｌｃｒｏ領域に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％逆相補的である。いくつかの実施形態において、Ｖｅｌｃｒｏ結合部位は、Ｖｅｌｃｒｏ領域に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％逆相補的である。いくつかの実施形態において、Ｖｅｌｃｒｏ結合部位は、Ｖｅｌｃｒｏ領域に対して、少なくとも５０％逆相補的である。いくつかの実施形態において、Ｖｅｌｃｒｏ結合部位は、Ｖｅｌｃｒｏ領域に対して、少なくとも６０％逆相補的である。いくつかの実施形態において、Ｖｅｌｃｒｏ結合部位は、Ｖｅｌｃｒｏ領域に対して、少なくとも７０％逆相補的である。いくつかの実施形態において、Ｖｅｌｃｒｏ結合部位は、Ｖｅｌｃｒｏ領域に対して、少なくとも８０％逆相補的である。いくつかの実施形態において、Ｖｅｌｃｒｏ結合部位は、Ｖｅｌｃｒｏ領域に対して、少なくとも９０％逆相補的である。いくつかの実施形態において、Ｖｅｌｃｒｏ結合部位は、Ｖｅｌｃｒｏ領域に対して、１００％逆相補的である。いくつかの実施形態において、逆転写酵素鋳型領域は、Ｖｅｌｃｒｏ結合部位を含む。いくつかの実施形態において、Ｖｅｌｃｒｏ結合部位は、プライマー結合部位（例えば、第１の鎖プライマー結合部位、又は第２の鎖プライマー結合部位）の３’である。いくつかの実施形態において、Ｖｅｌｃｒｏ結合部位は、プライマー結合部位の５’である。いくつかの実施形態において、Ｖｅｌｃｒｏ領域は、逆転写酵素鋳型の３’である。いくつかの実施形態において、Ｖｅｌｃｒｏ領域は、逆転写酵素鋳型の５’である。いくつかの実施形態において、Ｖｅｌｃｒｏ領域は、足場の５’である。いくつかの実施形態において、Ｖｅｌｃｒｏ領域は、足場の３’である。いくつかの実施形態において、足場は、標的核酸（例えば、ＣＦＴＲ核酸、ＵＳＨ２Ａ核酸、ＡＢＣＡ４核酸、ＡＴＰ７Ｂ核酸、又はＨＴＴ核酸）に相補的である。いくつかの実施形態において、合成Ｖｅｌｃｒｏ配列は、足場と、ＰＢＳの後に挿入される合成Ｖｅｌｃｒｏ結合部位に逆相補的である配列に結合するＲＴＴとの間に挿入される。いくつかの実施形態において、Ｖｅｌｃｒｏ領域は、別のＶｅｌｃｒｏ領域に結合する。いくつかの実施形態において、Ｖｅｌｃｒｏ領域は、スペーサー配列のＰＡＭ近位２０ヌクレオチドではないガイド核酸の領域にハイブリダイズする。
いくつかの実施形態において、Ｖｅｌｃｒｏ結合部位は、Ｖｅｌｃｒｏ領域に対して部分的に逆相補的である。完全な相補性は、一部の場合、切断されたＡＡＶゲノムに寄与し得るので、いくつかのバルジ又は不完全な相補性を導入することは、ＡＡＶパッケージングを破壊することなくＧＰＳの利点を保持するのに役立ち得る。ＡＡＶゲノムパッケージングは、一部の場合、二次構造によって破壊され得る。ＧＰＳは、破壊的な二次構造を導入し得る。したがって、ＧＰＳとＧＰＳ結合部位との間の相補性の程度を低減させることは、ＧＰＳによるＡＡＶパッケージングの破壊を排除する経路を提供する。いくつかの実施形態において、Ｖｅｌｃｒｏ結合部位は、Ｖｅｌｃｒｏ領域に対して、５０％未満、５５％未満、６０％未満、６５％未満、７０％未満、７５％未満、８０％未満、８５％未満、９０％未満、９１％未満、９２％未満、９３％未満、９４％未満、９５％未満、９６％未満、９７％未満、９８％未満、９９％未満、又は１００％未満、逆相補的である。いくつかの実施形態において、Ｖｅｌｃｒｏ結合部位は、Ｖｅｌｃｒｏ領域に対して、８０％未満、８５％未満、９０％未満、９１％未満、９２％未満、９３％未満、９４％未満、９５％未満、９６％未満、９７％未満、９８％未満、９９％未満、又は１００％未満、逆相補的である。いくつかの実施形態において、Ｖｅｌｃｒｏ結合部位は、Ｖｅｌｃｒｏ領域に対して、７０％未満、逆相補的である。いくつかの実施形態において、Ｖｅｌｃｒｏ結合部位は、Ｖｅｌｃｒｏ領域に対して、８０％未満、逆相補的である。いくつかの実施形態において、Ｖｅｌｃｒｏ結合部位は、Ｖｅｌｃｒｏ領域に対して、９０％未満、逆相補的である。いくつかの実施形態は、本明細書に開示される任意の２つのパーセンテージによって定義される逆相補性の範囲を含む。
Ｖｅｌｃｒｏ領域の非限定的な例示的な構成は、図２６に示される。ＧＰＳ領域は、ガイド核酸内の任意の構成であり得る。ＧＰＳ領域は、ガイド核酸の５’末端にあり得る。ＧＰＳ領域は、スペーサーに対して５’であり得る。ＧＰＳ領域は、スペーサーに対して５’であってもよく、スペーサーに隣接していてもよい。ＧＰＳ領域は、足場に対して５’であり得る。ＧＰＳ領域は、足場に対して５’であってもよく、足場に隣接していてもよい。ＧＰＳ領域は、ＲＴＴに対して５’であり得る。ＧＰＳ領域は、ＲＴＴに対して５’であってもよく、ＲＴＴに隣接していてもよい。ＧＰＳ領域は、ＰＢＳに対して５’であり得る。ＧＰＳ領域は、ＰＢＳに対して５’であってもよく、ＰＢＳに隣接していてもよい。ＧＰＳ領域は、ガイド核酸の３’末端にあり得る。ＧＰＳ領域は、スペーサーに対して３’であり得る。ＧＰＳ領域は、スペーサーに対して３’であってもよく、スペーサーに隣接していてもよい。ＧＰＳ領域は、足場に対して３’であり得る。ＧＰＳ領域は、足場に対して３’であってもよく、足場に隣接していてもよい。ＧＰＳ領域は、ＲＴＴに対して３’であり得る。ＧＰＳ領域は、ＲＴＴに対して３’であってもよく、ＲＴＴに隣接していてもよい。ＧＰＳ領域は、ＰＢＳに対して３’であり得る。ＧＰＳ領域は、ＰＢＳに対して３’であってもよく、ＰＢＳに隣接していてもよい。ＧＰＳ領域は、足場内にあり得る。ＧＰＳ領域は、ＲＴＴ内にあり得る。ＧＰＳ領域は、ＰＢＳ内にあり得る。いくつかの実施形態は、第２のＧＰＳ領域を含む。第２のＧＰＳ領域は、上記のいずれの位置であってもよい。第２のＧＰＳ領域は、第２のＧＰＳ結合部位にハイブリダイズし得る。ＧＰＳ領域は、第２のＧＰＳ領域にハイブリダイズし得る。
ＧＰＳ領域は、ある長さのヌクレオチドを含み得る。例えば、ＧＰＳ領域は、５～１００ヌクレオチド長、又は約５～１００ヌクレオチド長であり得る。ＧＰＳ領域は、１０～５０ヌクレオチド長、又は約１０～５０ヌクレオチド長であり得る。ＧＰＳ領域は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、若しくは１００、若しくはそれ以上のヌクレオチド、又は前述の数字のうちの任意の２つによって定義されるヌクレオチドの範囲を含み得る。ＧＰＳ領域は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、又は少なくとも１００のヌクレオチドを含み得る。一部の場合、ＧＰＳ領域は、５以下、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下、５０以下、５５以下、６０以下、６５以下、７０以下、７５以下、８０以下、８５以下、９０以下、９５以下、又は１００以下のヌクレオチドを含む。ＧＰＳ領域は、２０ヌクレオチド長であり得る。ＧＰＳ領域は、約２０ヌクレオチド長であり得る。
ＧＰＳ領域は、ＧＰＳ結合部位にハイブリダイズし得る。ＧＰＳ領域は、ＧＰＳ結合部位に相補的であり得る。ＧＰＳ領域は、ＧＰＳ結合部位に対して１００％相補的であり得る。ＧＰＳ領域は、ＧＰＳ結合部位に対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％相補的であり得る。ＧＰＳ領域は、ＧＰＳ結合部位に対して、５０％未満、６０％未満、７０％未満、８０％未満、８５％未満、９０％未満、９１％未満、９２％未満、９３％未満、９４％未満、９５％未満、９６％未満、９７％未満、９８％未満、又は９９％未満、相補的であり得る。
ＧＰＳ領域は、ＧＰＳ結合部位の一部に対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％相補的であり得る。この部分は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、又は少なくとも１００のヌクレオチドを含み得る。この部分は、５未満、１０未満、１５未満、２０未満、２５未満、３０未満、３５未満、４０未満、４５未満、５０未満、５５未満、６０未満、６５未満、７０未満、７５未満、８０未満、８５未満、９０未満、９５未満、又は１００未満のヌクレオチドを含み得る。
ＧＰＳ領域は、ＧＰＳ結合部位の一部（又は第２の部分）に対して、５０％未満、６０％未満、７０％未満、８０％未満、８５％未満、９０％未満、９１％未満、９２％未満、９３％未満、９４％未満、９５％未満、９６％未満、９７％未満、９８％未満、９９％未満、又は１００％相補的であり得る。この部分（又は第２の部分）は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、又は少なくとも１００のヌクレオチドを含み得る。この部分（又は第２の部分）は、５未満、１０未満、１５未満、２０未満、２５未満、３０未満、３５未満、４０未満、４５未満、５０未満、５５未満、６０未満、６５未満、７０未満、７５未満、８０未満、８５未満、９０未満、９５未満、又は１００未満のヌクレオチドを含み得る。
いくつかの例において、ＧＰＳ領域は、ＧＰＳ結合部位の５～１０ヌクレオチドに相補的である。いくつかの例において、ＧＰＳ領域は、ＧＰＳ結合部位の５～１０ヌクレオチドに対して、少なくとも８０％相補的である。いくつかの例において、ＧＰＳ領域は、ＧＰＳ結合部位の１１～１００ヌクレオチドに対して相補的である。いくつかの例において、ＧＰＳ領域は、ＧＰＳ結合部位の１１～１００ヌクレオチドに対して、少なくとも８０％相補的である。
いくつかの実施形態において、本開示のｇＲＮＡは、例えば、図１３Ａに示される自己切断リボザイムを含み得る。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡの第２の鎖プライマー領域は、第１の合成鎖上に位置する鋳型領域に対して１００％の配列相補性を含み得る。いくつかの実施形態において、第２の鎖プライマーの転写は、ｇＲＮＡの３’末端及び第２の鎖プライマーの３’においてポリ－Ｕ配列（例えば、ＵＵＵＵＵ）を生成し得る。第２の鎖プライマーの３’にすぐ隣接するポリ－Ｕ配列の存在は、第２の鎖プライマーの機能を阻害し得る。リボザイム配列は、第２の鎖プライマーの３’にすぐ隣接するポリ－Ｕ配列の形成を防止するためにｇＲＮＡに含まれ得る。リボザイムは、ｇＲＮＡからそれ自体を自己触媒的に切断し得る。いくつかの実施形態において、リボザイムは、第２の鎖プライマーの３’に位置し得る。第２の鎖プライマーの３’に位置するリボザイムは、ｇＲＮＡからそれ自体を自己触媒的に切断し、ポリ－Ｕ配列を有しないインタクトな第２の鎖プライマーを残し得る。第２の鎖プライマーのリボザイム（例えば、ＨＤＶリボザイム）３’の包含により、第２の鎖プライマーの機能を阻害する第２の鎖プライマーの３’にすぐ隣接するポリ－Ｕ配列を形成することなく、鋳型に対する第２の鎖プライマーの１００％相補性が可能になり得る。いくつかの実施形態において、自己切断リボザイムを含むｇＲＮＡは、第２の鎖プライマーの３’に位置する自己切断リボザイム配列を有し得る。いくつかの実施形態において、リボザイム（例えば、ＨＤＶリボザイム）は、リボザイムの自己触媒切断後にｇＲＮＡの３’末端に２’３’環状リン酸を残し得る。２’３’環状リン酸は、第２の鎖プライマーの機能を阻害し得る。２’３’環状リン酸は、ポリヌクレオチドキナーゼを使用して３’ヒドロキシルに変換され得る。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドキナーゼは、ｇＲＮＡを発現する細胞内に存在する内因性ポリヌクレオチドキナーゼである。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドキナーゼは、外因的に発現される。
いくつかの実施形態において、ｔＲＮＡは、リボザイムの代わりにｇＲＮＡに融合して、第２の鎖プライマーの３’にすぐ隣接するポリ－Ｕ配列の形成を防止し得る。いくつかの実施形態において、ｔＲＮＡは、第２の鎖プライマーの３’に位置し得る。ＲＮａｓｅ Ｐ酵素は、ｇＲＮＡ配列の残りからｔＲＮＡを切断し得る。いくつかの実施形態において、ＲＮａｓｅ Ｐは、第２の鎖プライマーの３’末端からｔＲＮＡを切断し、第２の鎖プライマーの３’末端に３’ヒドロキシルを残し得る。いくつかの実施形態において、ＲＮａｓｅ Ｐは、ｇＲＮＡを発現する細胞内に存在する内因性ＲＮａｓｅ Ｐである。いくつかの実施形態において、ＲＮａｓｅ Ｐは外因的に発現される。いくつかの実施形態において、ｔＲＮＡを含むｇＲＮＡは、第２の鎖プライマーの３’に位置するｔＲＮＡ配列を有し得る。ｔＲＮＡは、ＲＮａｓｅ Ｐによって認識される任意のｔＲＮＡに対応する配列を有し得る。いくつかの実施形態において、ｔＲＮＡは、配列番号９４の配列を含み得る。
ガイド核酸は、スペーサーを含み得る。スペーサーは、標的核酸の第１の領域に逆相補的であり得る。ガイド核酸は、足場を含み得る。足場は、Ｃａｓニッカーゼに結合し得る。ガイド核酸は、逆転写酵素鋳型を含み得る。逆転写酵素鋳型は、標的核酸に挿入される配列をコードし得る。ガイド核酸は、第１の鎖プライマー結合部位を含み得る。第１の鎖プライマー結合部位は、標的核酸の第２の領域に逆相補的であり得る。ガイド核酸は、第２の鎖プライマーを含み得る。第２の鎖プライマーは、逆転写酵素鋳型の領域の配列を含み得る。
いくつかの実施形態において、本明細書には、足場を含むガイド核酸が開示される。足場は、ヌクレアーゼに結合し得る。足場は、Ｃａｓヌクレアーゼに結合し得る。足場は、ニッカーゼを結合し得る。足場は、Ｃａｓニッカーゼに結合し得る。足場は、Ｓ．Ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ヌクレアーゼに結合し得る。足場は、Ｓ．Ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ニッカーゼに結合し得る。足場は、足場核酸配列を含み得る。足場核酸配列は、配列番号１３９の配列を含み得る。足場核酸配列は、配列番号１３９の配列に対して、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、又は少なくとも９５％同一である配列を含み得る。
いくつかの実施形態において、本明細書には、ガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）が開示される。ガイド核酸は、伸長を含み得る。伸長は、ガイド核酸の５’末端にあり得る。伸長は、ガイド核酸の３’末端にあり得る。ガイド核酸は、伸長を含む足場を含み得る。伸長は、足場の３’末端上にあり得る。伸長は、逆転写酵素鋳型を含み得る。伸長は、プライマー結合部位を含み得る。伸長は、逆転写酵素鋳型及びプライマー結合部位を含有し得る。伸長のプライマー結合部位は、ヌクレアーゼ又はニッカーゼによって生成されたゲノムフラップにハイブリダイズし得る。伸長は、Ｖｅｌｃｒｏ領域を使用して配向され得る。伸長は、Ｖｅｌｃｒｏ結合部位を使用して配向され得る。伸長は、Ｖｅｌｃｒｏ領域及びＶｅｌｃｒｏ結合部位を使用して配向され得る。伸長は、Ｖｅｌｃｒｏ領域を含み得る。Ｖｅｌｃｒｏ領域（及び例えば、Ｖｅｌｃｒｏ結合部位へのＶｅｌｃｒｏ領域の結合）は、プライマー結合部位をゲノムフラップの近くに空間的に配向し得る。伸長は、Ｖｅｌｃｒｏ結合領域を含み得る。ガイド核酸は、伸長の外側にＶｅｌｃｒｏ領域を含み得る。ガイド核酸は、伸長の外側にＶｅｌｃｒｏ結合領域を含み得る。
標的核酸の第１の領域は、標的核酸の第１の鎖上にあり得る。標的核酸の第２の領域は、標的核酸の第２の鎖上にあり得る。標的核酸の第１の領域の全ては、標的核酸の第２の領域の全てに逆相補的であり得る。標的核酸の第１の領域の全ては、標的核酸の第２の領域の一部に逆相補的であり得る。標的核酸の第１の領域の一部は、標的核酸の第２の領域の全てに逆相補的であり得る。標的核酸の第１の領域の一部は、標的核酸の第２の領域の一部に逆相補的であり得る。
ガイド核酸は、切断可能な配列を含み得る。切断可能な配列は、ガイド核酸の３’末端にあり得る。切断可能な配列は、ガイド核酸の５’末端にあり得る。切断可能な配列は、リボザイム切断可能な配列を含み得る。切断可能な配列は、ｔＲＮＡ切断可能な配列を含み得る。ｇＲＮＡは、ＨＤＶリボザイムなどの自己切断リボザイムを含み得る。リボザイムは、第２の鎖プライマー（ＳＰＰ）の３’であり得る。ｔＲＮＡ（例えば、ヒトグルタミン酸ｔＲＮＡ）は、リボザイムの代わりにＳＰＰの後に組み込まれ得、これは、リボザイムよりも編集効率を増加させ得る。
第１の鎖プライマー結合部位は、標的核酸の第２の領域にハイブリダイズし得る。逆転写酵素鋳型は、逆転写のための鋳型として機能し得る。逆転写は、標的核酸の第２の領域の３’末端からであり得る。第２の鎖プライマーは、鋳型からの転写のためのプライマーとして機能し得る。鋳型は、逆転写酵素鋳型に逆相補的であり得る。第１の合成鎖は、第２の鎖プライマーからの第２の鎖の合成のための鋳型として機能し得る。
第２の鎖プライマー（ＳＰＰ）は、ｇＲＮＡに含まれ得る。ＳＰＰ、約１０～３０又は約１５～２５ヌクレオチド長であり得る。ＳＰＰは、約２０ヌクレオチド長であり得る。例えば、２０ヌクレオチドのＳＰＰを含むと、編集の効率が増加し得る（例えば、２倍、又は約２０％～約４０％）。ＳＰＰは、２０、４０、若しくは６０ヌクレオチド長、又は前述のヌクレオチド数のうちのいずれかによって定義されるヌクレオチド長の範囲であり得る。いくつかの実施形態は、第１の鎖に相補的な所望の編集を有する核酸（例えば、ＤＮＡ）鎖を含む。これにより、ＲＴが第１の鎖を鋳型として使用することが可能になり得る。ＳＰＰの末端３ヌクレオチドは、第１の鎖に相補的であり得る。ＳＰＰは、編集部位に対して３’である第１の鎖の一部にハイブリダイズし得る。ＳＰＰは、二次構造を除去し、それによって編集効率を増加させるようにコードされ得る。
本明細書に記載される組成物は、第１のガイド核酸を含み得る。組成物は、第２のガイド核酸を含み得る。第２のガイド核酸は、本明細書に記載されるガイド核酸を含み得る。第１のガイド核酸は、第１のＣａｓニッカーゼに結合し得る。第２のガイド核酸は、第２のＣａｓニッカーゼに結合し得る。第１のガイド核酸の第１のスペーサーは、第１のＣａｓニッカーゼに結合し得る。第２のガイド核酸の第２のスペーサーは、第２のＣａｓニッカーゼに結合し得る。第１のガイド核酸の第１の足場は、第２のＣａｓニッカーゼに結合し得る。第２のガイド核酸の第２の足場は、第１のＣａｓニッカーゼに結合し得る。第１のガイド核酸は、第１のリンカーを含み得る。第２のガイド核酸は、第２のリンカーを含み得る。第１のリンカーは、第２のリンカーにハイブリダイズし得る。
ガイド核酸は、ｇＲＮＡ２．０を含み得る。ガイド核酸は、１３ヌクレオチドのＰＢＳを含み得る。ガイド核酸は、１０～１５ヌクレオチドのＰＢＳを含み得る。ガイド核酸は、１３ヌクレオチドのＲＴＴを含み得る。ガイド核酸は、１０～１５ヌクレオチドのＲＴＴを含み得る。ＲＴＴは、標的核酸と比較して変異をコードし得る。
いくつかの実施形態において、本明細書には、第１及び第２のガイド核酸が開示される。いくつかの実施形態において、第１のガイド核酸は逆転写酵素鋳型（ＲＴＴ）を含む。いくつかの実施形態において、第２のガイド核酸は、逆転写酵素鋳型を含む。第１及び第２のガイド核酸の逆転写酵素鋳型は、少なくとも部分的に相補的であり得る。いくつかの実施形態において、第２のガイド核酸の逆転写酵素鋳型の一部は、第１のガイド核酸の逆転写酵素鋳型の一部に相補的である。いくつかの実施形態において、第２のガイド核酸の逆転写酵素鋳型は、第１のガイド核酸の逆転写酵素鋳型の一部に相補的である。いくつかの実施形態において、第２のガイド核酸の逆転写酵素鋳型の一部は、第１のガイド核酸の逆転写酵素鋳型に相補的である。いくつかの実施形態において、第２のガイド核酸の逆転写酵素鋳型は、第１のガイド核酸の逆転写酵素鋳型に相補的である。いくつかの実施形態において、第２のガイド核酸の逆転写酵素鋳型は、第１のガイド核酸の逆転写酵素鋳型の少なくとも一部に相補的（又は少なくとも部分的に相補的）である。第１及び第２のガイド核酸の逆転写酵素鋳型は、第２のｇＲＮＡの逆転写酵素鋳型の一部が、第１のｇＲＮＡの逆転写酵素鋳型の一部に逆相補的である、重複二重伸長ｆＲＮＡ’ｓ（ＯＤＥＧ）を含み得る。相補的である部分は、少なくとも５個の核酸、少なくとも１０個の核酸、少なくとも２０個の核酸、少なくとも３０個の核酸、少なくとも４０個の核酸、少なくとも５０個の核酸、少なくとも６０個の核酸、少なくとも７０個の核酸、少なくとも８０個の核酸、少なくとも９０個の核酸、少なくとも１００個の核酸、又はそれ以上の核酸を含み得る。相補的な部分は、一部の場合、５個以下の核酸、１０個以下の核酸、２０個以下の核酸、３０個以下の核酸、４０個以下の核酸、５０個以下の核酸、６０個以下の核酸、７０個以下の核酸、８０個以下の核酸、９０個以下の核酸、１００個以下の核酸、又はそれ以下の核酸を含み得る。
ガイド核酸は、ｇＲＮＡ位置決めシステム（ＧＰＳ）を含み得る。ＧＰＳは、ガイド核酸の一部に結合するＲＮＡ配列を含み得る。これにより、ＰＢＳはｇＲＮＡの５’末端と近接し得る。ＧＰＳのＲＮＡ配列は、１０、１５、２０、２５、若しくはそれ以上のヌクレオチド長、又は前述の整数のうちの任意の２つによって定義されるヌクレオチド長の範囲であり得る。ＧＰＳを使用する利点は、長いＲＴＴ（例えば、少なくとも２０、５０、又は１００ヌクレオチドのＲＴＴ）を使用するときの編集効率の増加を含み得る。
ＧＰＳのＲＮＡ配列は、約２０ヌクレオチド長であり得る。ＧＰＳのＲＮＡ配列は、ＲＴＴの一部にハイブリダイズし得る。ＧＰＳのＲＮＡ配列がハイブリダイズするＲＴＴの部分は、１０、１５、２０、２５、若しくはそれ以上のヌクレオチド長、又は前述の整数のうちの任意の２つによって定義されるヌクレオチド長の範囲であり得る。ＧＰＳのＲＮＡ配列がハイブリダイズするＲＴＴの部分は、約２０ヌクレオチドであり得る。ＧＰＳのＲＮＡ配列がハイブリダイズするＲＴＴの部分は、ＧＰＳと同じ若しくはほぼ同じ長さであるように、又はその逆であるように設計され得る。
ＧＰＳは、バージョン１のＧＰＳを含み得る。ガイド核酸は、ＲＴＴの５’に挿入されたＲＮＡ配列を含み得る。ＲＮＡ配列は、ＲＴＴとハイブリダイズし得る。ＲＮＡ配列は、ＲＴＴの３’領域とハイブリダイズし得る。
ＧＰＳは、バージョン２のＧＰＳを含み得る。ガイド核酸は、ＰＢＳの３’に挿入されたＲＮＡ配列を含み得る。ＲＮＡ配列は、ＲＴＴとハイブリダイズし得る。ＲＮＡ配列は、ＲＴＴの５’部分とハイブリダイズし得る。
一部の場合、ガイド核酸は、１つのガイド核酸、又は１つの種類のガイド核酸を含む。一部の場合、ガイド核酸は、１つのガイド核酸のみを含むか、又は１つの種類のガイド核酸のみを含む。一部の場合、ガイド核酸は、２つ以上のガイド核酸、又は２つ以上の種類のガイド核酸を含む。一部の場合、ガイド核酸は、２つのガイド核酸、又は２つの種類のガイド核酸を含む。一部の場合、ガイド核酸は、２つのガイド核酸のみを含むか、又は２つの種類のガイド核酸のみを含む。
本開示のいくつかの態様は、単一ガイド核酸システムを含む。一部の場合、単一ガイド核酸システムは、編集を含まない元のゲノム鎖を効率的に置換しない所望の編集を含むフラップを生成し得る。ゲノムへの伸長フラップのハイブリダイゼーションを促進するための組成物又は方法は、それを置き換えることを意図するゲノム鎖の近傍に、伸長フラップの３’末端を固定し得る。ＧＰＳアシストリーチオーバー（ＧＰＳ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｒｅａｃｈｏｖｅｒ）ｇＲＮＡ（ＧＡＲＧ）は、これを可能にし得る。ＧＡＲＧは、伸長したフラップを固定し得る。ＧＡＲＧは、伸長したフラップの３’端を固定し得る。いくつかの実施形態において、ガイド核酸は、ＧＡＲＧを含む。
ＧＡＲＧの例を図３２に示す。図３２は、標的核酸の第１の領域を標的とするスペーサー、及びＧＰＳ動員ガイド（ＧＰＳ－ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ ｇｕｉｄｅ）（ＧＲＧ）と呼ばれる、異なるガイドによって標的とされるゲノムの第２の領域にハイブリダイズするプライマー結合部位を含むＧＡＲＧを示す。ＧＡＲＧは、ＧＲＧの一部であるＧＰＳ結合部位にハイブリダイズするように設計されたＧＰＳ成分を含む。いくつかの実施形態において、ガイド核酸は、ＧＲＧを含む。いくつかの実施形態は、ＧＡＲＧ及びＧＲＧを含むシステムを含む。このシステムは、本明細書に記載されるものなどの他の遺伝子編集成分を含み得る。
ガイド核酸は、ＧＡＲＧを含み得る。ＧＡＲＧは、スペーサーを含み得る。ＧＡＲＧのスペーサーは、標的核酸の第１の領域に結合し得る。ＧＡＲＧのスペーサーは、標的核酸の第１の領域に逆相補的であり得る。ＧＡＲＧは、ＲＴＴを含み得る。ＲＴＴは、標的核酸に挿入される配列をコードし得る。ＧＡＲＧは、足場を含み得る。足場は、Ｃａｓヌクレアーゼに結合し得るか、又はＣａｓヌクレアーゼに結合するように構成され得る。ＧＡＲＧは、プライマー結合部位（例えば、第１のプライマー結合部位）を含み得る。ＧＡＲＧのプライマー結合部位は、スペーサーによって標的化若しくは結合される核酸、又はスペーサーによって標的化若しくは結合される核酸に逆相補的な核酸の領域のいずれの部分も含まない標的核酸の領域に結合し得る。ＧＡＲＧのプライマー結合部位は、ＧＡＲＧのスペーサーに相補的な標的核酸の第１の領域のいずれの部分も含まず、かつ第１の領域の逆相補体のいずれの部分も含まない標的核酸の領域に結合し得る。ＧＡＲＧのプライマー結合部位は、標的核酸の第２の領域に結合し得る。ＧＡＲＧのプライマー結合部位は、標的核酸の第２の領域に逆相補的であり得る。ＧＡＲＧは、ＧＲＧ結合部位を含み得る。ＧＲＧ結合部位は、第２のガイド核酸（ＧＡＲＧが第１のガイド核酸を含む場合）に結合し得る。第２のガイド核酸は、ＧＲＧを含み得る。ＧＲＧ結合部位は、ＧＲＧに結合し得る。ＧＲＧ結合部位は、ＧＲＧの一部に逆相補的であり得る。ＧＲＧ結合部位に逆相補的であるＧＲＧの部分は、ＧＡＲＧ結合部分と称され得る。ＧＡＲＧは、ＧＰＳ領域を含み得る。ＧＲＧ結合部位は、ＧＰＳ領域であり得る。ＧＲＧは、ＧＰＳ結合部位を含み得る。ＧＡＲＧ結合部分は、ＧＰＳ結合部位であり得る。第２のガイド核酸は、プライマー結合部位をゲノムフラップと近接させることができる。第２のガイド核酸は、プライマー結合部位をゲノムフラップと接触させることができる。第２のガイド核酸は、プライマー結合部位をゲノムフラップと近接させることができる。ＧＰＳ領域及びＧＰＳ結合部位の包含は、ＧＡＲＧの末端を、ゲノムフラップに結合し得る場所に引き寄せ得る。ＧＡＲＧは、ＤＮＡなどの核酸によってコードされ得る。ＧＡＲＧの成分のうちのいずれも、ＧＲＧに含まれ得る。ＧＲＧは、ＤＮＡなどの核酸によってコードされ得る。ＧＡＲＧ及びＧＲＧは、同じ核酸によって、又は別個の核酸によってコードされる。ＧＡＲＧ、又はＧＡＲＧをコードする核酸は、ＡＡＶなどのウイルス粒子に包含され得る。ＧＲＧ、又はＧＲＧをコードする核酸は、ＡＡＶなどのウイルス粒子に包含され得る。ＧＡＲＧ及びＧＲＧは、同じウイルス粒子、又は別個のウイルス粒子に包含され得る。
いくつかの実施形態は、二重ガイドシステムを含む。二重ガイドシステムは、ＧＡＲＧ及びＧＲＧを含み得る。いくつかの実施形態は、ＧＡＲＧ及びＧＲＧを含む組成物を含む。いくつかの実施形態は、ＧＡＲＧ及びＧＲＧを使用する方法、又はＧＡＲＧ及びＧＲＧを用いて遺伝子を編集する方法を含む。
いくつかの実施形態は、細胞にＧＡＲＧ及びＧＲＧを投与することを含む、遺伝子を編集する方法を含む。いくつかの実施形態は、細胞にＧＡＲＧ及びＧＲＧを発現する１つ以上の核酸を投与することを含む、遺伝子を編集する方法を含む。いくつかの実施形態は、細胞にＧＡＲＧ及びＧＲＧを発現させることを含む、遺伝子を編集する方法を含む。いくつかの実施形態は、ＧＲＧを含む細胞にＧＡＲＧを発現させるか、又は投与することを含む、遺伝子を編集する方法を含む。いくつかの実施形態は、ＧＡＲＧを含む細胞にＧＲＧを発現させるか、又は投与することを含む、遺伝子を編集する方法を含む。いくつかの実施形態は、遺伝子編集酵素を含む細胞においてＧＡＲＧ又はＧＲＧを発現させることを含む、遺伝子を編集する方法を含む。いくつかの実施形態は、遺伝子編集酵素を含む細胞においてＧＡＲＧ及びＧＲＧを発現させることを含む、遺伝子を編集する方法を含む。いくつかの実施形態は、遺伝子編集酵素を含む細胞にＧＡＲＧ又はＧＲＧを投与することを含む、遺伝子を編集する方法を含む。いくつかの実施形態は、遺伝子編集酵素を含む細胞にＧＡＲＧ及びＧＲＧを投与することを含む、遺伝子を編集する方法を含む。投与することは、細胞を含む対象に行われてもよい。
いくつかの態様において、本明細書には、スペーサー、所望の編集を含む逆転写酵素鋳型、及びプライマー結合部位を含むＲＮＡ（又はポリヌクレオチド）を含む、組成物又はシステムであって、プライマー結合部位が、別個のＲＮＡによって標的化される核酸に結合する、組成物又はシステムが開示される。本明細書には、スペーサー、所望の編集を含む逆転写酵素鋳型、及びプライマー結合部位を含む、ＲＮＡ又はポリヌクレオチドを含むシステムであって、プライマー結合部位が、スペーサーによって標的化若しくは結合された核酸の領域のいずれの部分も含まない核酸、又はスペーサーによって標的化若しくは結合された核酸に逆相補的な核酸に結合する、システムが開示される。
ゲノム編集のための組成物
本開示の組成物は、標的部位における標的核酸の効率的な編集を促進し得る。本開示の組成物は、ガイド核酸、ｎＣａｓ９、及び逆転写酵素を含み得る。本開示の組成物は、ガイド核酸、ｎＣａｓ９、逆転写酵素、又はそれらの組み合わせをコードする配列を含み得る。ｎＣａｓ９及び逆転写酵素は、融合ｎＣａｓ９－ＲＴ構築物であり得る。ｎＣａｓ９及び逆転写酵素は、分割ｎＣａｓ９－ＲＴ構築物であり得る。本開示の組成物は、標的核酸を含む細胞に導入され、それによって標的核酸を編集し得る。いくつかの実施形態において、組成物の１つ以上の成分をコードする配列（例えば、プラスミド）は、標的核酸を含む細胞に導入され得る。組成物の１つ以上の成分は、細胞内で発現され得る。いくつかの実施形態において、本開示の組成物は、第１のガイド核酸、第１のｎＣａｓ９ｓ、第１の逆転写酵素、第２のガイド核酸、第２のｎＣａｓ９ｓ、及び第２の逆転写酵素を含み得る。いくつかの実施形態において、第１のガイド核酸は、第１のｎＣａｓ９に結合し、第２のガイド核酸は、第２のｎＣａｓ９に結合する。いくつかの実施形態において、第１のガイド核酸の第１のスペーサーは、第１のｎＣａｓ９に結合し、第２のガイド核酸の第２のスペーサーは、第２のｎＣａｓ９に結合し、第１のガイド核酸の第１の足場は、第２のｎＣａｓ９に結合し、第２のガイド核酸の第２の足場は、第１のｎＣａｓ９に結合する。いくつかの実施形態において、第１のガイド核酸は、第１のリンカーを含み、第２のガイド核酸は、第２のリンカーを含む。いくつかの実施形態において、第１のリンカーは、第２のリンカーにハイブリダイズする。
本開示の組成物は、標的部位における標的核酸の効率的な編集を促進し得る。本開示の組成物は、ガイド核酸、ｎＣａｓ９、及び逆転写酵素を含み得る。本開示の組成物は、ガイド核酸、ｎＣａｓ９、逆転写酵素、又はそれらの組み合わせをコードする配列を含み得る。ｎＣａｓ９及び逆転写酵素は、融合ｎＣａｓ９－ＲＴ構築物であり得る。ｎＣａｓ９及び逆転写酵素は、分割ｎＣａｓ９－ＲＴ構築物であり得る。本開示の組成物は、標的核酸を含む細胞に導入され、それによって標的核酸を編集し得る。いくつかの実施形態において、組成物の１つ以上の成分をコードする配列（例えば、プラスミド）は、標的核酸を含む細胞に導入され得る。組成物の１つ以上の成分は、細胞内で発現され得る。いくつかの実施形態において、本開示の組成物は、第１のガイド核酸、第１のｎＣａｓ９ｓ、第１の逆転写酵素、第２のガイド核酸、第２のｎＣａｓ９ｓ、及び第２の逆転写酵素を含み得る。いくつかの実施形態において、第１のガイド核酸は、第１のｎＣａｓ９に結合し、第２のガイド核酸は、第２のｎＣａｓ９に結合する。いくつかの実施形態において、第１のガイド核酸の第１のスペーサーは、第１のｎＣａｓ９に結合し、第２のガイド核酸の第２のスペーサーは、第２のｎＣａｓ９に結合し、第１のガイド核酸の第１の足場は、第２のｎＣａｓ９に結合し、第２のガイド核酸の第２の足場は、第１のｎＣａｓ９に結合する。いくつかの実施形態において、第１のガイド核酸は、第１のリンカーを含み、第２のガイド核酸は、第２のリンカーを含む。いくつかの実施形態において、第１のリンカーは、第２のリンカーにハイブリダイズする。
第１のガイド核酸及び第２のガイド核酸を含む組成物は、配列の合成又は編集を促進し得る。第１のガイド核酸及び第２のガイド核酸を含む組成物は、標的部位における標的核酸の編集を促進し得る。第１のガイド核酸及び第２のガイド核酸を含む組成物は、２つの単一ガイドシステムであり得る。第１のガイド核酸及び第２のガイド核酸を含む組成物は、二重ガイドシステムであり得る。２つの単一ガイドシステムにおいて、各ｇＲＮＡは異なるｎＣａｓ９に結合し、２つのｇＲＮＡは、それぞれ、逆転写酵素鋳型領域を含む。二重ガイドシステムにおいて、各ｇＲＮＡは、異なるｎＣａｓ９に結合し得る。２つの単一ガイドシステムにおいて、ｇＲＮＡの１つのみが、逆転写酵素鋳型領域を含み得る。２つの単一ガイドシステムにおいて、第２のガイドは、反対側の鎖をニックし得る。二重ガイドシステムにおいて、ｇＲＮＡの１つのみが、逆転写酵素鋳型領域を含み得る。二重ガイドシステムにおいて、第２のガイドは、反対側の鎖をニックし得る。二重ガイド複合体において、第１のｇＲＮＡのスペーサーは、第１のｎＣａｓ９に結合し得、第２のｇＲＮＡのスペーサーは、第２のｎＣａｓ９に結合し得、第１のｇＲＮＡの足場は、第２のｎＣａｓ９に結合し得、第２のｇＲＮＡの足場は、第１のｎＣａｓ９に結合し得る。
ガイド核酸は、Ｃａｓニッカーゼと複合体を形成し得る。ガイド核酸は、逆転写酵素と複合体を形成し得る。複合体形成時に、Ｃａｓニッカーゼは、標的核酸内の標的部位に一本鎖切断を導入し得る。
標的核酸のいくつかの非限定的な例には、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）核酸、ウシェリン（ｕｓｈｅｒｉｎ）（ＵＳＨ２Ａ）核酸、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー４（ＡＢＣＡ４）核酸、ウィルソン病タンパク質（ＡＴＰ７Ｂ）核酸、又はハンチンチン（ＨＴＴ）核酸が含まれる。いくつかの実施形態において、標的核酸は、ＣＦＴＲ遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、標的核酸は、ＵＳＨ２Ａ遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、標的核酸は、ＡＢＣＡ４遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、標的核酸は、ＡＴＰ７Ｂ遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、標的核酸は、ＨＴＴ遺伝子を含む。
本明細書には、Ｃａｓニッカーゼ、逆転写酵素、及びガイド核酸を含む組成物が開示される。第１のポリペプチドは、Ｃａｓニッカーゼを含み得る。第２のポリペプチドは、逆転写酵素を含み得る。ガイド核酸は、Ｃａｓニッカーゼに結合し得る。ガイド核酸は、逆転写酵素に結合し得る。
ＲＴは、ＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）ペプチドを含み得る。一部の場合、ＲＴは、ＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）ペプチドを含まない。例えば、組成物は、ＲＷａ１を含み得る。ガイド核酸は、ＭＳ２ヘアピンを含み得る。一部の場合、ガイド核酸は、ＭＳ２ヘアピンを含まない。ＭＣＰペプチドは、ガイド核酸中のＭＳ２ヘアピンに結合し得る。ＭＳ２ヘアピンは、ｇＲＮＡ足場とＲＴＴとの間であり得る。これにより、ＲＴがｇＲＮＡと密接に近接し、編集が可能になり得る。ＭＣＰペプチド及びＭＳ２ヘアピンを使用する利点は、ＲＴ及びＣａｓニッカーゼ（又はそれらの一部）を分離し、それらをＡＡＶベクター内に適合させることである。ＭＣＰペプチド及びＭＳ２ヘアピンは、必要ではない場合がある。ＭＣＰペプチド又はＭＳ２ヘアピンを含む組成物は、例えば、細胞内にトランスフェクトされたときに、少なくとも約３％又は４％の編集効率を有し得る。ＭＣＰペプチド又はＭＳ２ヘアピンを含む組成物は、例えば、細胞内にトランスフェクトされたときに、少なくとも約１０％又は１５％の編集効率を有し得る。
ＲＴ及びＣａｓニッカーゼは、ロイシンジッパーを含み得る。例えば、組成物は、ＲＷｂ１を含み得る。ロイシンジッパーを含む組成物は、例えば、細胞にトランスフェクトされたときに、少なくとも約３５％又は４０％の編集効率を有し得る。ロイシンジッパーを含む組成物は、例えば、細胞内に形質導入されたときに、少なくとも約３％又は４％の編集効率を有し得る。ロイシンジッパーを使用する利点は、ＲＴとＣａｓニッカーゼ（又はそれらの一部）を分離し、それらをＡＡＶベクター内に適合させることである。しかしながら、ロイシンジッパーは必要ではない場合がある。
ＲＴ又はＣａｓニッカーゼは、例えば、インテイン分割を使用して分割され得る。一部の場合、ＲＴ及びＣａｓニッカーゼは、インテイン分割を用いて分割されない。インテイン分割を使用する例は、ＲＷｃ１である。分割は、Ｃａｓニッカーゼの残基１１７２と１１７３との間であり得る。分割ＲＴ又はＣａｓニッカーゼを使用する組成物は、例えば、細胞内にトランスフェクトされたときに、少なくとも約２５％又は３０％の編集効率を有し得る。ＲＷｃ１又は同様の分割方法を使用する利点は、ＲＴ又はＣａｓニッカーゼをコードする核酸配列を有するＡＡＶベクター内に適合するように許容され得る調節エレメントなどの追加のヌクレオチド配列のためのより多くの空間を可能にし得ることであり得る。例えば、分割方法は、ＡＡＶ内に適合するように、追加のヌクレオチド配列のために、約５００、６００、又は７００（又は前述の整数のうちのいずれかによって定義される範囲）のより多くのヌクレオチドを可能にし得る。
ＲＴ又はＣａｓニッカーゼは、別個であり、一緒に結合しなくてもよい。非結合ＲＴ及びＣａｓニッカーゼを使用する例は、ＲＷｄ１である。
本開示の組成物は、タンパク質複合体又はタンパク質複合体をコードする配列を含み得る。タンパク質複合体は、保護タンパク質複合体を含み得る。タンパク質複合体は、ガイド核酸の脱アミノ化又は分解を防止し得る。例えば、保護複合体は、ヒトＯｒｆ１ｐ（配列番号３８）又はマウスＯｒｆ１ｐ（配列番号３９）であり得る。
ゲノム編集効率を増加させる方法が本明細書に開示される。この方法は、細胞にＯｒｆ１ｐを送達することを含み得る。細胞は、本明細書に記載される組成物又はガイド核酸を発現し得る。
本明細書には、本明細書に記載される組成物又はガイド核酸をコードするヌクレオチド配列を含む核酸が開示される。本明細書には、核酸を含むウイルスベクターが開示される。本明細書には、本明細書に記載される組成物を含む細胞が開示される。本明細書には、本明細書に記載される核酸を含む細胞が開示される。本明細書には、本明細書に記載されるガイド核酸を含む細胞が開示される。本明細書には、本明細書に記載されるウイルスベクターを含む細胞が開示される。細胞は、原核細胞であり得る。細胞は、真核細胞であり得る。
いくつかの実施形態は、細胞内のｄＮＴＰ濃度などのｄＮＴＰ濃度を増加させることによってゲノム編集効率を増加させる方法を含む。ＳＡＭＨＤ１を阻害すると、ｄＮＴＰ濃度が増加し得る。ｄＮＴＰを投与すると、細胞内のｄＮＴＰ濃度が増加し得る。いくつかの実施形態は、細胞内のＳＡＭＨＤ１を阻害することを含む、ゲノム編集効率を増加させる方法を含む。いくつかの実施形態は、対象又は細胞にｄＮＴＰを投与することを含む、ゲノム編集効率を増加させる方法を含む
いくつかの実施形態において、本開示の組成物は、本開示のＣａｓ９構築物（例えば、分割Ｃａｓ９－ＲＴ構築物）の編集効率を増加させるための、タンパク質、タンパク質をコードする核酸、又は非コード核酸を含み得る。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９構築物の編集効率を増加させるための、タンパク質、タンパク質をコードする核酸、又は非コード化核酸は、ＳＡＭＨＤ１のｄＮＴＰ切断活性を阻害するタンパク質若しくは核酸、又はＳＡＭＨＤ１のｄＮＴＰ切断活性を阻害するタンパク質をコードする核酸を含み得る。例えば、ＳＡＭＨＤ１のｄＮＴＰ切断活性を阻害する核酸は、ＳＡＭＨＤ１転写産物を分解するマイクロＲＮＡを含み得る。
いくつかの実施形態は、ベースラインｄＮＴＰ濃度と比較して、細胞内のｄＮＴＰ濃度を増加させることを含む。いくつかの実施形態において、ｄＮＴＰ濃度は、ベースラインｄＮＴＰ測定値と比較して、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、若しくはそれ以上、又は前述のパーセンテージのうちのいずれか２つによって定義されるパーセンテージの範囲、増加する。いくつかの実施形態において、ｄＮＴＰ濃度は、ベースラインｄＮＴＰ測定値と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％増加する。いくつかの実施形態において、ｄＮＴＰ濃度は、ベースラインｄＮＴＰ測定値と比較して、５％以下、１０％以下、１５％以下、２０％以下、２５％以下、３０％以下、４０％以下、５０％以下、６０％以下、７０％以下、８０％以下、９０％以下、１００％以下、増加する。
様々な態様において、低いｄＮＴＰ濃度は、０．５マイクロモル、０．６マイクロモル、０．７マイクロモル、０．８マイクロモル、０．９マイクロモル、１．０マイクロモル、若しくは１．１マイクロモル、又は前述のｄＮＴＰ濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲のｄＮＴＰ濃度を含む。様々な態様において、低いｄＮＴＰ濃度は、約０．５マイクロモル、約０．６マイクロモル、約０．７マイクロモル、約０．８マイクロモル、約０．９マイクロモル、約１．０マイクロモル、若しくは約１．１マイクロモル、又は前述のｄＮＴＰ濃度のうちのいずれか２つによって定義される範囲のｄＮＴＰ濃度を含む。様々な態様において、低いｄＮＴＰ濃度は、約１．１マイクロモル未満のｄＮＴＰ濃度を含む。様々な態様において、低いｄＮＴＰ濃度は、約１．０マイクロモル未満のｄＮＴＰ濃度を含む。様々な態様において、低いｄＮＴＰ濃度は、約０．９マイクロモル未満のｄＮＴＰ濃度を含む。様々な態様において、低いｄＮＴＰ濃度は、約０．８マイクロモル未満のｄＮＴＰ濃度を含む。様々な態様において、低いｄＮＴＰ濃度は、約０．７マイクロモル未満のｄＮＴＰ濃度を含む。様々な態様において、低いｄＮＴＰ濃度は、約０．６マイクロモル未満のｄＮＴＰ濃度を含む。様々な態様において、低いｄＮＴＰ濃度は、約０．５マイクロモル未満のｄＮＴＰ濃度を含む。様々な態様において、低いｄＮＴＰ濃度は、約０．９マイクロモルを超えるｄＮＴＰ濃度を含む。様々な態様において、低いｄＮＴＰ濃度は、約０．８マイクロモルを超えるｄＮＴＰ濃度を含む。様々な態様において、低いｄＮＴＰ濃度は、約０．７マイクロモルを超えるｄＮＴＰ濃度を含む。様々な態様において、低いｄＮＴＰ濃度は、約０．６マイクロモルを超えるｄＮＴＰ濃度を含む。様々な態様において、低いｄＮＴＰ濃度は、約０．５マイクロモルを超えるｄＮＴＰ濃度を含む。様々な態様において、低いｄＮＴＰ濃度は、約０．４マイクロモルを超えるｄＮＴＰ濃度を含む。
様々な態様において、本開示は、低いデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）濃度を有し、ＤＮＡポリメラーゼを含む細胞内で遺伝子編集効率を増加させる方法であって、方法が、ベースラインｄＮＴＰ濃度と比較して、細胞内のｄＮＴＰ濃度を増加させることを含む、方法を提供する。様々な態様において、細胞内のｄＮＴＰ濃度を増加させることは、細胞内のデオキシヌクレオチド三リン酸トリホスホヒドロラーゼを阻害することを含む。様々な態様において、デオキシヌクレオチド三リン酸トリホスホヒドロラーゼは、ＳＡＭドメイン及びＨＤドメイン含有タンパク質１（ＳＡＭＨＤ１）を含む。様々な態様において、ＳＡＭＨＤ１を阻害することは、ＳＡＭＨＤ１をＶｐｘタンパク質と接触させること、又はＶｐｘタンパク質を細胞内で発現させることを含む。様々な態様において、ＳＡＭＨＤ１を阻害することは、ＳＡＭＨＤ１をＢＧＬＦ４タンパク質と接触させること、又はＢＧＬＦ４タンパク質を細胞内で発現させることを含む。様々な態様において、ＳＡＭＨＤ１を阻害することは、ＳＡＭＨＤ１をコードするｍＲＮＡを、ｍＲＮＡにハイブリダイズするマイクロＲＮＡ若しくはｓｉＲＮＡと接触させること、又はマイクロＲＮＡ若しくはｓｉＲＮＡを細胞内で発現させることを含む。様々な態様において、ＳＡＭＨＤ１を阻害することは、ＳＡＭＨＤ１を小分子ＳＡＭＨＤ１阻害剤と接触させることを含む。様々な態様において、細胞内のｄＮＴＰ濃度を増加させることは、ｄＮＴＰを細胞に投与することを含む。様々な態様において、ｄＮＴＰを細胞に投与することは、細胞を含む対象にｄＮＴＰを投与することを含む。様々な態様において、細胞内のｄＮＴＰ濃度を増加させることは、ヌクレオシド又はヌクレオチドを細胞に投与することを含む。ヌクレオシド又はヌクレオチドは、デオキシヌクレオシド（ｄＮ）、デオキシヌクレオシド一リン酸（ｄＮＭＰ）、又はヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）を含み得る。一部の場合、ヌクレオシド又はヌクレオチドは、ｄＮＴＰではないか、又はｄＮＴＰを含まない。様々な態様において、ヌクレオシド又はヌクレオチドを細胞に投与することは、細胞を含む対象にヌクレオシド又はヌクレオチドを投与することを含む。様々な態様において、投与は、経口であるか、又は注射による。様々な態様において、細胞内のｄＮＴＰ濃度を増加させることは、ｄＮＴＰ合成酵素を細胞に送達することを含む。様々な態様において、ｄＮＴＰ合成酵素は、キナーゼを含む。様々な態様において、キナーゼは、ヌクレオシドキナーゼ、デオキシヌクレオシドキナーゼ、デオキシヌクレオシド一リン酸キナーゼ、又はデオキシヌクレオチド二リン酸キナーゼを含む。様々な態様において、ＤＮＡポリメラーゼは、逆転写酵素を含む。ＤＮＡポリメラーゼは、遺伝子編集のために適合され得る。ＤＮＡポリメラーゼは、遺伝子編集ポリメラーゼであり得る。ＤＮＡポリメラーゼは、組換えＤＮＡポリメラーゼであり得る。いくつかの実施形態は、ＤＮＡポリメラーゼを細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態は、細胞内でＤＮＡポリメラーゼを発現させることを含む。様々な態様において、細胞は、Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼ、ガイド核酸、又はそれらの組み合わせを含むか、又は更に含む。いくつかの実施形態は、Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼを細胞内に導入すること、又は細胞内でＣａｓ９プログラマブルヌクレアーゼを発現させることを含む。いくつかの実施形態は、ガイド核酸を細胞内に導入すること、又は細胞内でガイド核酸を発現させることを含む。Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼは、ＤＮＡポリメラーゼの一部であり得るか、又はＤＮＡポリメラーゼと会合し得る。様々な態様において、低いｄＮＴＰ濃度は、非分裂細胞内に見出されるｄＮＴＰ濃度を含む。様々な態様において、低いｄＮＴＰ濃度は、活性化末梢血単核細胞内に見出されるｄＮＴＰ濃度未満である。様々な態様において、低いｄＮＴＰ濃度は、１マイクロモル未満のｄＮＴＰ濃度を含む。様々な態様において、ｄＮＴＰ濃度を増加させることは、ベースラインｄＮＴＰ測定値と比較して、ｄＮＴＰ濃度を、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、又はそれ以上増加させることを含む。様々な態様において、ｄＮＴＰ濃度は、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）濃度、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）濃度、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）濃度、若しくはデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）濃度、又はそれらの任意の組み合わせを含む。
様々な態様において、本開示は、低いデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）濃度を有する細胞内で遺伝子編集効率を増加させる方法であって、細胞内のｄＮＴＰ濃度を増加させることを含み、細胞は、Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼ、逆転写酵素、及びガイド核酸を含む、方法を提供する。様々な態様において、本開示は、低いデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）濃度を有する細胞内で遺伝子編集効率を増加させる方法であって、低いｄＮＴＰ濃度において効率的な触媒作用のために修飾された遺伝子編集酵素と細胞を接触させること、又は細胞内で遺伝子編集酵素を発現させることを含む、方法を提供する。いくつかの態様において、細胞内のｄＮＴＰ濃度を増加させることは、細胞内のＳＡＭＨＤ１を阻害することを含む。いくつかの態様において、ＳＡＭＨＤ１を阻害することは、ＳＡＭＨＤ１をＶｐｘタンパク質と接触させること、又はＶｐｘタンパク質を細胞内で発現させることを含む。いくつかの態様において、ＳＡＭＨＤ１を阻害することは、ＳＡＭＨＤ１をコードするｍＲＮＡを、ｍＲＮＡにハイブリダイズするマイクロＲＮＡ若しくはｓｉＲＮＡと接触させること、又はマイクロＲＮＡ若しくはｓｉＲＮＡを細胞内で発現させることを含む。いくつかの態様において、ＳＡＭＨＤ１を阻害することは、ＳＡＭＨＤ１を小分子ＳＡＭＨＤ１阻害剤と接触させることを含む。いくつかの態様において、細胞内のｄＮＴＰ濃度を増加させることは、ｄＮＴＰを細胞に投与することを含む。いくつかの態様において、細胞内のｄＮＴＰ濃度を増加させることは、ｄＮＴＰ合成酵素を細胞に送達することを含む。いくつかの態様において、ｄＮＴＰ合成酵素は、デオキシヌクレオシド二リン酸（ｄＮＤＰ）キナーゼを含む。いくつかの態様において、遺伝子編集酵素は、Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼ又は逆転写酵素を含む。いくつかの態様において、逆転写酵素は、位置Ｑ８４、Ｌ１３９、Ｑ２２１、Ｖ２２３、Ｔ６６４、又はＬ６７１に点変異を導入することによって修飾される。いくつかの実施形態において、この方法は、ｄＮＴＰ濃度を測定することを更に含む。いくつかの実施形態は、ｄＮＴＰ濃度を増加させた後にｄＮＴＰ濃度を測定すること、及びベースラインｄＮＴＰ濃度と比較した増加を決定することを含む。
いくつかの実施形態は、ｄＮＴＰ濃度の増加を決定することを得ることを含む。いくつかの実施形態は、ｄＮＴＰ濃度を測定することを含む。いくつかの実施形態において、ｄＮＴＰ濃度は、吸光度アッセイ、比色アッセイ、又は酵素結合免疫吸着アッセイなどのアッセイを使用して測定される。いくつかの実施形態は、ベースラインｄＮＴＰ濃度を測定することを含む。いくつかの実施形態において、ベースラインｄＮＴＰ濃度は、吸光度アッセイ、比色アッセイ、又は酵素結合免疫吸着アッセイなどのアッセイを使用して測定される。
本明細書には、ゲノム編集効率を増加させる方法が開示される。この方法は、細胞内のＳＡＭＨＤ１を阻害することを含み得る。細胞は、Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼを発現し得る。細胞は、Ｃａｓニッカーゼを発現し得る。細胞は、逆転写酵素を発現し得る。細胞は、ガイド核酸を発現し得る。ＳＡＭＨＤ１を阻害する例には、細胞を、ＳＡＭＨＤ１阻害剤、例えば、小分子ＳＡＭＨＤ１阻害剤で処理することが含まれ得る。ＳＡＭＨＤ１を阻害する例には、細胞内でＳＡＭＨＤ１に対するマイクロＲＮＡを発現させることが含まれ得る。
編集効率を増加させるためのタンパク質は、Ｖｐｘタンパク質（例えば、配列番号８２、配列番号８３、又は配列番号９３）であり得る。Ｖｐｘは、一部の場合、レンチウイルスタンパク質である。Ｖｐｘは、一部の場合、編集効率を増加させる（例えば、ＳＡＭＨＤ１を阻害することによって）ために使用され得る免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）タンパク質である。Ｖｐｘタンパク質は、細胞内のｄＮＴＰの利用可能性を増加させることによって、Ｃａｓ９－ＲＴ構築物の編集効率を増加させることができる。例えば、Ｖｐｘタンパク質は、ＳＡＭＨＤ１のｄＮＴＰ切断活性を阻害し、それによって細胞内のｄＮＴＰの利用可能性を増加させることができる。いくつかの実施形態において、Ｖｐｘタンパク質は、細胞内で、本開示のＣａｓ９－ＲＴ構築物と同時発現され得る。Ｖｐｘタンパク質で発現されるＣａｓ９－ＲＴ構築物は、Ｖｐｘタンパク質の不在下でのＣａｓ９－ＲＴ構築物と比較して、編集効率が増加し得る。Ｖｐｘペプチドは、Ｈｉｖ２－ｒｏｄ Ｖｐｘ（例えば、配列番号８２）であり得る。いくつかの実施形態において、Ｖｐｘタンパク質は、その独自のコード配列として発現され得る。いくつかの実施形態において、Ｖｐｘタンパク質は、逆転写酵素と同じコード配列で発現され得る。例えば、Ｖｐｘタンパク質は、ｐ２ａ自己切断ペプチド（例えば、配列番号８３）によって分離された逆転写酵素と同じコード配列で発現され得る。いくつかの実施形態において、Ｖｐｘタンパク質は、Ｖｐｘ ＲＨ－２－１ Ｄ８タンパク質（例えば、配列番号９３）であり得る。いくつかの実施形態において、Ｖｐｘタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質と同じコード配列で発現され得る。ＳＡＭＨＤ１を阻害することは、細胞内でＶｐｘタンパク質を発現させることを含み得る。
本明細書には、細胞内でＶｐｘタンパク質を発現させることを含む、ゲノム編集効率を増加させる方法が開示される。細胞は、本明細書に記載される組成物を発現し得る。細胞は、本明細書に記載されるガイド核酸を発現し得る。
いくつかの実施形態は、ＳＡＭＨＤ１などのデオキシヌクレオチド三リントリホスホヒドロラーゼ（ｄＮＴＰａｓｅ）を阻害することによって、細胞内のｄＮＴＰ濃度を増加させるか、又は遺伝子編集を改善する方法を含む。いくつかの実施形態は、ＳＡＭＨＤ１を阻害するための組成物に関する。Ｖｐｘタンパク質を使用して、ＳＡＭＨＤ１を阻害することができる。ＢＧＬＦ４タンパク質を使用して、ＳＡＭＨＤ１を阻害することができる。ＢＧＬＦ４はＳＡＭＨＤ１をリン酸化し、それによってＳＡＭＨＤ１のｄＮＴＰａｓｅ活性を阻害することができる。ＢＧＬＦ４は、一部の場合、エプスタイン－バールウイルス（ＥＢＶ）によりコードされたプロテインキナーゼである。ＥＢＶによりコードされたプロテインキナーゼが、編集効率を増加させる（例えば、ＳＡＭＨＤ１を阻害することによって）ために使用され得る。ＳＡＭＨＤ１を阻害するための組成物は、小分子ＳＡＭＨＤ１阻害剤を含み得る。小分子ＳＡＭＨＤ１阻害剤は、ｐｐｐＣＨ２ｄＵ、又はその塩を含み得る。小分子ＳＡＭＨＤ１阻害剤は、ｄＧＭＰＮＰＰ、又はその塩を含み得る。
本明細書には、細胞内のヌクレオシド又はヌクレオチド（例えば、ｄＮＴＰ）の濃度を増加させることによってゲノム編集効率を増加させる方法が開示される。細胞は、Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼを発現し得る。細胞は、Ｃａｓニッカーゼを発現し得る。細胞は、逆転写酵素を発現し得る。細胞は、ガイド核酸を発現し得る。細胞内のｄＮＴＰの濃度を増加させる例は、細胞にヌクレオチド又はヌクレオシドを送達することを含む。細胞内のヌクレオシド又はヌクレオチドの濃度を増加させることは、ヌクレオシド又はヌクレオチドを細胞に送達することを含み得る。次いで、ヌクレオチド又はヌクレオシドは、細胞内でｄＮＴＰに変換され得る。ヌクレオシド又はヌクレオチドの送達は、経口送達又は注射を含み得る。ヌクレオシド又はヌクレオチドのｄＮＴＰへの変換は、内因性キナーゼによるリン酸化によるものであり得るか、又は合成、例えば、内因性サルベージ経路によるものであり得る。この方法は、ヌクレオチド又はヌクレオシドを細胞に送達し、ヌクレオチド又はヌクレオシドを受け取らなかった細胞と比較して、細胞内のｄＮＴＰの濃度を増加させることを含み得る。細胞内のｄＮＴＰの濃度の増加は、本明細書に開示される組成物を含む細胞内の編集効率の増加をもたらし得る。
本明細書には、限定的なｄＮＴＰ濃度において良好に動作するＲＴ変異体についてスクリーニングするためにＳＡＭＨＤ１過剰発現を使用することを含む、方法が開示される。ＳＡＭＨＤ１又はＳＡＭＨＤ１のリン酸化不可能な変異体を過剰発現するように修飾された細胞内の改善されたＲＴをスクリーニング又は同定するための方法も開示される。いくつかの実施形態は、細胞内のＳＡＭＨＤ１を過剰発現することを含む。いくつかの実施形態は、細胞内の変異体ＳＡＭＨＤ１の残基のリン酸化を防止するように変異した変異体ＳＡＭＨＤ１を発現させることを含む。いくつかの実施形態は、細胞内のＲＴ活性を識別することを含む。いくつかの実施形態は、ＲＴ活性に基づいてＲＴを改善されたＲＴとして識別することを含む。いくつかの実施形態は、改善された逆転写酵素（ＲＴ）をスクリーニング又は識別するための方法であって、細胞内で、ＳＡＭＨＤ１を過剰発現させるか、又は変異体ＳＡＭＨＤ１の残基のリン酸化を防止するように変異した変異体ＳＡＭＨＤ１を発現させることと、細胞内のＲＴ活性を識別することと、ＲＴ活性に基づいて、ＲＴを改善されたＲＴとして識別することと、を含む、方法を含む。
正確な編集成分を送達するためのＡＡＶ及び方法
本明細書には、Ｃａｓニッカーゼ、逆転写酵素（ＲＴ）、又はガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）などの正確な編集成分が記載されている。ニッカーゼ及びＲＴは、ポリヌクレオチドによってコードされ得る。ポリヌクレオチドは、ＡＡＶによって送達され得る。ニッカーゼ及びＲＴをコードするポリヌクレオチドは、ＡＡＶ内に適合するように操作され得る。本明細書には、ニッカーゼ及びＲＴを操作してＡＡＶ内に適合させるための例が提供される。例えば、ニッカーゼ及びＲＴは、二量体化するように操作され得る。ニッカーゼ及びＲＴは、同時発現され得る。ニッカーゼは、インテインシステムを使用して分割され得る。ニッカーゼの一部は、ＲＴとの融合タンパク質として組み合わせることができる。例示的な二量体化、同時発現及び分割インテインシステムの目標は、４．５ｋｂの担持容量を含むＡＡＶを使用してゲノム編集成分を送達することができることである。
本明細書には、Ｃａｓニッカーゼ、逆転写酵素（ＲＴ）、又はガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）などの正確な編集成分が記載されている。ニッカーゼ及びＲＴは、ポリヌクレオチドによってコードされ得る。ポリヌクレオチドは、ＡＡＶによって送達され得る。ニッカーゼ及びＲＴをコードするポリヌクレオチドは、ＡＡＶ内に適合するように操作され得る。本明細書には、ニッカーゼ及びＲＴを操作してＡＡＶ内に適合させるための例が提供される。例えば、ニッカーゼ及びＲＴは、二量体化するように操作され得る。ニッカーゼ及びＲＴは、同時発現され得る。ニッカーゼは、インテインシステムを使用して分割され得る。ニッカーゼの一部は、ＲＴとの融合タンパク質として組み合わせることができる。例示的な二量体化、同時発現及び分割インテインシステムの目標は、４．５ｋｂの担持容量を含むＡＡＶを使用してゲノム編集成分を送達することができることである。
図２４は、ｎＣａｓ９及びｍｃｐ－ｍｌｖＲＴ５ｍを発現するプラスミドを、ｍｓ２ヘアピンを含むｇＲＮＡ、及び含まないｇＲＮＡを有するＨＥＫ２９３Ｔ－ＢＦＰ細胞内で同時トランスフェクトした場合、同じＢＦＰからＧＦＰへの編集効率が達成されたことを示す。したがって、同じ細胞内の融合していない非二量体化ｎＣａｓ９及び逆転写酵素の同時発現は、編集をもたらし得る。したがって、効率的な編集を達成するために、ＮＬＳ－ｎＣａｓ９（配列番号１３８）及びｍｌｖＲＴ５ｍ－ＮＬＳ（配列番号９５）を別個のＡＡＶから同時発現させることができる。したがって、同じ細胞内の融合していない非二量体化Ｃａｓニッカーゼ及び逆転写酵素の同時発現は、編集をもたらし得る。したがって、Ｃａｓニッカーゼ及びＲＴは、効率的な編集を達成するために、別個のＡＡＶから同時発現され得る。同様に、Ｃａｓニッカーゼ及び二量体化するように操作されたＲＴは、効率的な編集を達成するために別個のＡＡＶから同時発現され得る。
Ｃａｓニッカーゼ及びＲＴは、ポリヌクレオチドによってコードされ得る。Ｃａｓニッカーゼ及びＲＴは、２つの別個のポリヌクレオチドによってコードされ得るか、又は一方の部分が他方のポリヌクレオチドに含まれ得る（例えば、本明細書に記載されるように）。１つ以上のＡＡＶが、ポリヌクレオチドを含み得る。Ｃａｓニッカーゼ及びＲＴのうちの少なくとも一部が、別個のＡＡＶ内に包含され得るか、又は含まれ得る。Ｃａｓニッカーゼ及びＲＴのうちの一部が、別個のＡＡＶ内に包含され得るか、又は含まれ得る。Ｃａｓニッカーゼ及びＲＴのうちの全てが、別個のＡＡＶ内に包含され得るか、又は含まれ得る。
一部の場合、Ｃａｓニッカーゼ及び逆転写酵素を含む組成物が含まれ、Ｃａｓニッカーゼ及び逆転写酵素のうちの少なくとも一部が、別個のポリペプチド鎖に含まれ、Ｃａｓニッカーゼ及び逆転写酵素が、Ｃａｓ逆転写酵素ヘテロ二量体を形成する。別個のポリペプチド鎖は、別個のポリヌクレオチドによってコードされ得る。別個のポリヌクレオチドは、ＡＡＶなどの別個のウイルスベクターに含まれ得る。別個のポリヌクレオチドは、別個のウイルスベクターの２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個に分けられ得る。別個のポリヌクレオチドは、別個のウイルスベクターの２個に分けられ得る。別個のポリヌクレオチドは、別個のウイルスベクターの少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、又は少なくとも１０個に分けられ得る。別個のポリヌクレオチドは、別個のウイルスベクターの２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、６個以下、７個以下、８個以下、９個以下、又は１０個以下に分けられ得る。別個のポリヌクレオチドは、別個のウイルスベクターの２個以下に分けられ得る。別個のポリヌクレオチドは、別個のウイルスベクターの３個以下に分けられ得る。別個のポリヌクレオチドは、別個のウイルスベクターの４個以下に分けられ得る。
別個のポリヌクレオチドは、別個のＡＡＶゲノム内に適合するのに十分な短さであり得る（例えば、それぞれ約４５００ｂｐ未満）。例えば、別個のポリヌクレオチドは、それぞれ、図１９Ａに記載されるサイズ程度であり得る。別個のポリヌクレオチドは、それぞれ、図１９Ａに記載されるサイズ程度よりも小さいか、又は以下であり得る。別個のポリヌクレオチドは、それぞれ、図１９Ａに記載されるサイズよりも小さいか、又は約１０％未満以下であるか、又は大きくてもよい。別個のポリヌクレオチドは、それぞれ、約４５００ｂｐ未満であり得る。別個のポリヌクレオチドは、図１９Ａにおけるサイズのいずれかを含む範囲、又は図１９Ａにおけるサイズ程度を含む範囲などの、様々なポリヌクレオチドサイズを含み得る。
一部の場合、ＡＡＶは、第１のＡＡＶを含む。第１のＡＡＶは、本明細書に記載されるＣａｓニッカーゼなどのＣａｓ又はＣａｓ成分をコードし得る、第１のポリヌクレオチドを含み得る。ＡＡＶは、本明細書に記載されるＲＴなどのＲＴをコードする第２のポリヌクレオチドを含み得る、第２のＡＡＶを含み得る。
ＡＡＶの例には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＤＪ／８、ＡＡＶ－Ｒｈ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、ＡＡＶ－ｒｅｔｒｏ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ８－ＰＨＰ．ｅＢ、若しくはＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｓ、又はそれらの組み合わせが含まれ得る。ＡＡＶの例には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、又はＡＡＶ１２などの血清型が含まれ得る。ＡＡＶの例には、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＤＪ／８、ＡＡＶ－Ｒｈ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、ＡＡＶ－ｒｅｔｒｏ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ８－ＰＨＰ．ｅＢ、又はＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｓなどの偽型が含まれ得る。
ＡＡＶは、ＡＡＶゲノムを含み得る。ＡＡＶゲノムは、ｐＣＭＶ－ＮＬＳ－ｎＳｐＣａｓ９（１～１１７２）－ＮｐｕＮ－ｃＭｙｃＮＬＳ－４８ｐＡ、又はそれらの成分の任意の組み合わせを含み得る。ｐＣＭＶ－ＮＬＳ－ｎＳｐＣａｓ９（１～１１７２）－ＮｐｕＮ－ｃＭｙｃＮＬＳ－４８ｐＡを含むＡＡＶゲノムは、配列番号１４２の配列を含み得る。ＡＡＶゲノムは、配列番号１４２の配列に対して、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、又は少なくとも９５％同一の配列を含み得る。
ＡＡＶゲノムは、ｐＣＭＶ－ＮｐｕＣ－ｎＳｐＣａｓ９（１１７３～１３６８；Ｓ１１７３Ｃ）－ｍｌｖＲＴ１４Ｍ－ＳＶ４０ ＮＬＳ－Ｐ２Ａ－ＶＰＸｒｈ２１－４８ｐＡ－ｐＵ６－ｕｓｈ２ａ－ｇＲＮＡ、又はそれらの成分の任意の組み合わせを含み得る。ｐＣＭＶ－ＮｐｕＣ－ｎＳｐＣａｓ９（１１７３～１３６８；Ｓ１１７３Ｃ）－ｍｌｖＲＴ１４Ｍ－ＳＶ４０ ＮＬＳ－Ｐ２Ａ－ＶＰＸｒｈ２１－４８ｐＡ－ｐＵ６－ｕｓｈ２ａ－ｇＲＮＡを含むＡＡＶゲノムは、配列番号１４３の配列を含み得る。ＡＡＶゲノムは、配列番号１４３の配列に対して、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、又は少なくとも９５％同一の配列を含み得る。ＡＡＶは、Ｕｓｈｅｒ症候群の治療、又はＵＳＨ２Ａ変異体の修復に有用であり得る。ＡＡＶは、Ｕｓｈｅｒ症候群を有する対象に投与され得る。
ＡＡＶを対象に投与した後、対象におけるゲノム編集が、測定又は評価され得る。ＡＡＶを１つ以上の細胞に投与した後、１つ以上の細胞におけるゲノム編集が、測定又は評価され得る。ゲノム編集は、配列決定によって測定又は評価され得る。ゲノム編集は、アッセイによって測定又は評価され得る。アッセイは、対象又は細胞において編集されたゲノムを測定又は同定することを含み得る。アッセイは、対象又は細胞において編集されたゲノムから得られたＲＮＡを測定又は同定することを含み得る。アッセイは、対象又は細胞において編集されたゲノムから得られたタンパク質を測定又は同定することを含み得る。アッセイのいくつかの例には、ハイブリダイゼーションアッセイ、イムノアッセイ、比色アッセイ、蛍光アッセイ、又は質量分析が含まれる。
いくつかの実施形態は、標的遺伝子座におけるＤＮＡ分子のヌクレオチド配列に１つ以上の変化を導入するための方法であって、ＤＮＡ分子を、プログラマブルヌクレアーゼ及び標的遺伝子座にプログラマブルヌクレアーゼを標的とするガイド核酸と接触させることを含む、方法を含む。プログラマブルヌクレアーゼは、逆転写酵素と複合体を形成し得る。
正確な編集成分を使用した治療方法
いくつかの実施形態は、本明細書に記載される方法又は組成物を使用した遺伝性障害の治療を含む。例えば、いくつかの実施形態は、本明細書に記載される遺伝子編集成分を含むか、又はコードする１つ以上の核酸を投与することを含む。例えば、ウイルスベクターを使用して、投与された核酸を送達してもよい。
いくつかの実施形態は、本明細書に記載される方法又は組成物を使用した遺伝性障害の治療を含む。例えば、いくつかの実施形態は、本明細書に記載される遺伝子編集成分を含むか、又はコードする１つ以上の核酸を投与することを含む。例えば、ウイルスベクターを使用して、投与された核酸を送達してもよい。
投与は、注射を含み得る。投与は、核酸を含む組成物の投与を含み得る。投与は、ウイルスベクターを含む組成物の投与を含み得る。組成物は、医薬組成物を含み得る。組成物は、医薬組成物を含み得る。医薬組成物は、水、緩衝液、又は生理食塩水などの担体を含み得る。医薬組成物は、リポソームを含み得る。
投与は、それを必要とする対象に対してであり得る。例えば、投与は、遺伝的障害を有する対象に対してであり得る。対象は、脊椎動物であり得る。対象は、哺乳動物であり得る。対象は、ヒトであり得る。いくつかの実施形態において、投与は、対象における疾患を引き起こす遺伝子変異を修正する。いくつかの実施形態において、投与は、対象の細胞における疾患を引き起こす遺伝子変異を修正する。
遺伝性障害のいくつかの非限定的な例には、アデノシンデアミナーゼ欠損症、アルファー１アンチトリプシン欠損症、嚢胞性線維症、筋ジストロフィー（例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー）、ガラクトース血症、ヘモクロマトーシス、ハンチントン病、メープルシロップ尿疾患、マルファン症候群、神経線維腫症（例えば、１型）、先天性爪肥厚症、フェニルケトン尿症、重症複合免疫不全症、鎌状赤血球症、スミス・レムリ・オピッツ症候群、又はテイ－サックス病が含まれる。いくつかの実施形態において、遺伝性障害は、嚢胞性線維症、スターガルト病、アッシャー症候群、又はハンチントン病を含む。いくつかの実施形態において、遺伝性障害は、嚢胞性線維症を含む。いくつかの実施形態において、遺伝性障害は、スターガルト病を含む。いくつかの実施形態において、遺伝性障害は、アッシャー症候群を含む。いくつかの実施形態において、遺伝性障害は、ハンチントン病を含む。いくつかの実施形態において、遺伝性障害は、心臓病、高血圧、アルツハイマー病、関節炎、糖尿病、がん、又は肥満などの多遺伝子性障害を含む。
二本鎖切断を用いないＡＡＶ送達可能な正確な編集
概要
ゲノムを正確に編集する能力は、ヘルスケア、農業、又は生物科学に大きな影響を及ぼす可能性があり、正確なゲノム編集は遺伝性疾患を治療する可能性がある。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、二本鎖切断を標的とする能力を民主的にしているが、外来の相同ＤＮＡを使用した有毒な二本鎖切断（ＤＳＢ）部位での相同性指向性修復（ＨＤＲ）の非効率性のために、正確な配列改変の生成は困難であった。プライムエディタは、ＨＤＲに依存することなく多用途の正確な編集を可能にしたが、遺伝子送達ビヒクルアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）とともに送達されるには大きすぎる成分を利用し得、限られた編集ウィンドウ長を有し得、効率的な編集を達成するために両方の鎖を切断し得るか、又は非分裂細胞において限定された効率を有し得る。本明細書では、Ｒｅｗｒｉｔｅｒと呼ばれる一連のツールでこれらの制限を克服した。Ｒｅｗｒｉｔｅｒの分割システムは、２つのＡＡＶゲノム内に遺伝子編集成分を送達するための４つのモジュールアーキテクチャを提供し得る。Ｒｅｗｒｉｔｅｒの最適化された逆転写酵素及びガイドＲＮＡ位置決めシステム（ＧＰＳ）は、１つの一本鎖切断のみを生成しながら、編集効率及び編集ウィンドウ長を増加させることができる。最後に、Ｒｅｗｒｉｔｅｒの抗制限因子は、非分裂細胞における編集を促進する。Ｒｅｗｒｉｔｅｒは、６５ヌクレオチドウィンドウ内で７５％の編集を達成し、これは、ＤＳＢを生成することなく、哺乳動物細胞における標的多ヌクレオチド変化についての現在までに報告されている最高の効率である。最後に、検出可能なオフターゲット変異を有しない遺伝性難聴及び失明を有する患者において一般的に変異したゲノム部位を正確に編集するＲｅｗｒｉｔｅｒ成分が開発された。
概要
ゲノムを正確に編集する能力は、ヘルスケア、農業、又は生物科学に大きな影響を及ぼす可能性があり、正確なゲノム編集は遺伝性疾患を治療する可能性がある。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、二本鎖切断を標的とする能力を民主的にしているが、外来の相同ＤＮＡを使用した有毒な二本鎖切断（ＤＳＢ）部位での相同性指向性修復（ＨＤＲ）の非効率性のために、正確な配列改変の生成は困難であった。プライムエディタは、ＨＤＲに依存することなく多用途の正確な編集を可能にしたが、遺伝子送達ビヒクルアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）とともに送達されるには大きすぎる成分を利用し得、限られた編集ウィンドウ長を有し得、効率的な編集を達成するために両方の鎖を切断し得るか、又は非分裂細胞において限定された効率を有し得る。本明細書では、Ｒｅｗｒｉｔｅｒと呼ばれる一連のツールでこれらの制限を克服した。Ｒｅｗｒｉｔｅｒの分割システムは、２つのＡＡＶゲノム内に遺伝子編集成分を送達するための４つのモジュールアーキテクチャを提供し得る。Ｒｅｗｒｉｔｅｒの最適化された逆転写酵素及びガイドＲＮＡ位置決めシステム（ＧＰＳ）は、１つの一本鎖切断のみを生成しながら、編集効率及び編集ウィンドウ長を増加させることができる。最後に、Ｒｅｗｒｉｔｅｒの抗制限因子は、非分裂細胞における編集を促進する。Ｒｅｗｒｉｔｅｒは、６５ヌクレオチドウィンドウ内で７５％の編集を達成し、これは、ＤＳＢを生成することなく、哺乳動物細胞における標的多ヌクレオチド変化についての現在までに報告されている最高の効率である。最後に、検出可能なオフターゲット変異を有しない遺伝性難聴及び失明を有する患者において一般的に変異したゲノム部位を正確に編集するＲｅｗｒｉｔｅｒ成分が開発された。
本明細書には、Ｒｅｗｒｉｔｅｒ、ガイドＲＮＡ位置決めシステム（ＧＰＳ）を使用してゲノムと隣接する規定された二本鎖ＤＮＡを合成するための最適化された逆転写酵素を標的とする操作されたＣａｓ９ニッカーゼを利用する二重ＡＡＶ送達可能なシステム、第２の鎖プライマー、及び非分裂細胞における効率的な編集を提供する抗制限因子を使用して、相同性指向性修復又は二本鎖切断を用いずに多用途、効率的かつ正確なゲノム編集のための組成物及び方法が記載される。Ｒｅｗｒｉｔｅｒは、６５ヌクレオチドウィンドウ内に最大５４％の効率で複合体配列変化を導入した。このシステムの利点は、嚢胞性線維症又はアッシャー症候群などの遺伝性障害を引き起こす変異を修正するために使用され得ることである。アッシャー症候群における遺伝的欠陥の修正は、難聴又は失明を予防又は治療するために使用され得る。Ｒｅｗｒｉｔｅｒの安全性、効率性、正確性、及び汎用性は、疾患の治療、食品の改善、又は基本的な生物学的研究の推進に使用され得る。
導入
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ゲノムＤＮＡ内に標的化された二本鎖切断を作製するための直接的なアプローチを提供し得る。しかしながら、ゲノム標的の配列を正確に変化させることは、相同性指向性修復の非効率性、二本鎖切断の有毒性、及び相同ドナーＤＮＡの送達の課題により困難であった。ＤＳＢは、標的遺伝子を超えて伸長する、長い、不正確な欠失を引き起こす可能性があり、染色体全体の除去を引き起こすことさえあり得る。追加的に、ゲノムエディタ自体をコードするベクターは、ＤＳＢの部位に意図せずに組み込まれ得る。最後に、単一のＤＳＢでさえ、ｐ５３経路を活性化することができ、これはアポトーシスにつながる可能性がある。ＣＲＩＳＰＲ誘導ヌクレオチドデアミナーゼ、又は塩基エディタは、二本鎖切断を回避することができ、相同性指向性修復に依存しなくてもよいが、全ての置換のサブセットを作製することに限定され得、ゲノム及びトランスクリプトームのオフターゲット変異を引き起こす可能性がある。プライム編集は、Ｃａｓ９切断部位のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）近位側の３０ヌクレオチド（ｎｔ）ウィンドウ内に挿入、欠失、及び複雑な配列変化を導入するための、より正確かつ多用途のアプローチであり得る。プライムエディタ（ＰＥ）は、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の３’伸長におけるプライマー結合部位（ＰＢＳ）にハイブリダイズし得るゲノムフラップを生成する、ニッキングＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ｎＳｐＣａｓ９）を含み得る。ｎＳｐＣａｓ９に融合される５つの点変異（ｍｌｖＲＴ５Ｍ）を含むＭｏｌｏｎｅｙ白血病ウイルス逆転写酵素は、ゲノムフラップをプライマーとして利用して、ｇＲＮＡの３’伸長にも含まれるＲＴ鋳型（ＲＴＴ）の配列に従って所望の編集を含むＤＮＡ鎖を合成し得る。編集効率は、他方の鎖をニックする第２のｇＲＮＡを発現させることによって増加させることができる。残念ながら、ＰＥは一般的にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）とともに送達するには大きすぎた。追加的に、ＰＥは、非分裂細胞における限定された効率に悩まされる場合があり、両方の鎖をニックするときに意図しない挿入若しくは欠失を生じ得るか、又は単一の構築物で修正することができる病原性変異の数を制限し得、編集部位の近くでＰＡＭが利用可能であることを必要とし得る短い編集ウィンドウ長を有し得る。本明細書には、一部の場合、Ｒｅｗｒｉｔｅｒと呼ばれる遺伝子編集システムであって、二本鎖切断を生成することなく、分裂及び非分裂細胞においてプライムエディタよりも高い効率で、より大きなウィンドウ内に任意の種類の変異を導入し得る、遺伝子編集システムが記載される。これは、ＡＡＶとともに送達される成分を使用して行われ得る。
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ゲノムＤＮＡ内に標的化された二本鎖切断を作製するための直接的なアプローチを提供し得る。しかしながら、ゲノム標的の配列を正確に変化させることは、相同性指向性修復の非効率性、二本鎖切断の有毒性、及び相同ドナーＤＮＡの送達の課題により困難であった。ＤＳＢは、標的遺伝子を超えて伸長する、長い、不正確な欠失を引き起こす可能性があり、染色体全体の除去を引き起こすことさえあり得る。追加的に、ゲノムエディタ自体をコードするベクターは、ＤＳＢの部位に意図せずに組み込まれ得る。最後に、単一のＤＳＢでさえ、ｐ５３経路を活性化することができ、これはアポトーシスにつながる可能性がある。ＣＲＩＳＰＲ誘導ヌクレオチドデアミナーゼ、又は塩基エディタは、二本鎖切断を回避することができ、相同性指向性修復に依存しなくてもよいが、全ての置換のサブセットを作製することに限定され得、ゲノム及びトランスクリプトームのオフターゲット変異を引き起こす可能性がある。プライム編集は、Ｃａｓ９切断部位のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）近位側の３０ヌクレオチド（ｎｔ）ウィンドウ内に挿入、欠失、及び複雑な配列変化を導入するための、より正確かつ多用途のアプローチであり得る。プライムエディタ（ＰＥ）は、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の３’伸長におけるプライマー結合部位（ＰＢＳ）にハイブリダイズし得るゲノムフラップを生成する、ニッキングＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ｎＳｐＣａｓ９）を含み得る。ｎＳｐＣａｓ９に融合される５つの点変異（ｍｌｖＲＴ５Ｍ）を含むＭｏｌｏｎｅｙ白血病ウイルス逆転写酵素は、ゲノムフラップをプライマーとして利用して、ｇＲＮＡの３’伸長にも含まれるＲＴ鋳型（ＲＴＴ）の配列に従って所望の編集を含むＤＮＡ鎖を合成し得る。編集効率は、他方の鎖をニックする第２のｇＲＮＡを発現させることによって増加させることができる。残念ながら、ＰＥは一般的にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）とともに送達するには大きすぎた。追加的に、ＰＥは、非分裂細胞における限定された効率に悩まされる場合があり、両方の鎖をニックするときに意図しない挿入若しくは欠失を生じ得るか、又は単一の構築物で修正することができる病原性変異の数を制限し得、編集部位の近くでＰＡＭが利用可能であることを必要とし得る短い編集ウィンドウ長を有し得る。本明細書には、一部の場合、Ｒｅｗｒｉｔｅｒと呼ばれる遺伝子編集システムであって、二本鎖切断を生成することなく、分裂及び非分裂細胞においてプライムエディタよりも高い効率で、より大きなウィンドウ内に任意の種類の変異を導入し得る、遺伝子編集システムが記載される。これは、ＡＡＶとともに送達される成分を使用して行われ得る。
ＡＡＶ内に適合する正確なエディタ
プライムエディタ及び分割インテインプライムエディタは、標的部位に多くの種類の変異を導入し得るが、それらのコード配列だけでは、ＡＡＶの４．５キロベース（ｋｂ）の担持容量に適合するには大きすぎ得る（図１９Ａ）。わずか２つのＡＡＶゲノム内に送達され得る成分を用いた正確な編集の利点を提供するために、Ｒｅｗｒｉｔｅｒ ａ１（「ＲＷａ１」又は「ＲＷ１Ｍ」）を開発した。ＲＷａ１は、ｍｌｖＲＴ５Ｍに融合したＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）ペプチド、及びＭＣＰペプチドが特異的に結合し得るＭＳ２ヘアピンを含むｇＲＮＡと同時発現したｎＣａｓ９を含み得る。ＲＷ１Ｍは、ｎＳｐＣａｓ９が結合したｇＲＮＡにＭＳ２ヘアピンを組み込み、ｍｌｖＲＴ５Ｍに融合したＭＳ２結合ペプチド（ＭＢＰ）を動員し得る。ＲＷ１Ｍは、１つのＡＡＶにおけるｎＳｐＣａｓ９の送達、並びに別のＡＡＶにおけるＭＢＰ－ｍｌｖＲＴ５Ｍ及びｇＲＮＡの送達を可能にし得る（図２７）。
プライムエディタ及び分割インテインプライムエディタは、標的部位に多くの種類の変異を導入し得るが、それらのコード配列だけでは、ＡＡＶの４．５キロベース（ｋｂ）の担持容量に適合するには大きすぎ得る（図１９Ａ）。わずか２つのＡＡＶゲノム内に送達され得る成分を用いた正確な編集の利点を提供するために、Ｒｅｗｒｉｔｅｒ ａ１（「ＲＷａ１」又は「ＲＷ１Ｍ」）を開発した。ＲＷａ１は、ｍｌｖＲＴ５Ｍに融合したＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）ペプチド、及びＭＣＰペプチドが特異的に結合し得るＭＳ２ヘアピンを含むｇＲＮＡと同時発現したｎＣａｓ９を含み得る。ＲＷ１Ｍは、ｎＳｐＣａｓ９が結合したｇＲＮＡにＭＳ２ヘアピンを組み込み、ｍｌｖＲＴ５Ｍに融合したＭＳ２結合ペプチド（ＭＢＰ）を動員し得る。ＲＷ１Ｍは、１つのＡＡＶにおけるｎＳｐＣａｓ９の送達、並びに別のＡＡＶにおけるＭＢＰ－ｍｌｖＲＴ５Ｍ及びｇＲＮＡの送達を可能にし得る（図２７）。
図２７に示すように、ＰＥ２を含む編集システムは、５点変異（ｍｌｖＲＴ５Ｍ）を含有するＭｏｌｏｎｅｙ白血病ウイルス逆転写酵素に融合したニッキングＣａｓ９（ｎＣａｓ９）を含み得る。ＰＥ２に使用されるガイドＲＮＡは、逆転写酵素鋳型（ＲＴＴ）配列及びプライマー結合部位（ＰＢＳ）配列を含有する足場配列の３’末端上の伸長を含み得る。ｎＣａｓ９は、まず、ＰＢＳとハイブリダイズするゲノムフラップを放出する非標的鎖をニックし得る。次いで、ｍｌｖＲＴ５Ｍは、ＲＴＴを逆転写することによってゲノムフラップを伸長し得る。分割ＰＥ２を含む編集システムは、Ｎｐｕ分割インテインを利用し、ともに触媒的にスプライシングする２つのＯＲＦを発現して、ｎＣａｓ９－ｍｌｖＲＴ５Ｍ融合タンパク質を形成し得る。Ｒｅｗｒｉｔｅｒ １Ｍ（ＲＷ１Ｍ）を含む編集システムは、ｎＣａｓ９、ｍｌｖＲＴ５Ｍに融合したＭＳ２結合ペプチド（ＭＢＰ）、及びＭＢＰが特異的に結合するＭＳ２ヘアピンを含有するｇＲＮＡを利用することができる（図２７：左：ＭＳ２ヘアピンは、ｇＲＮＡ足場内に挿入され得る；中央：ＭＳ２ヘアピンは、ｇＲＮＡ足場とＲＴＴとの間に挿入され得る；右：ＭＳ２ヘアピンは、ＰＢＳの後に挿入され得る）。ＲＷ１Ｌを含む編集システムは、ヘテロ二量体化ロイシンジッパーを利用して、ｎＣａｓ９及びｍｌｖＲＴ５Ｍを共局在化し得る。ＲＷ１Ｉを含む編集システムは、Ｎｐｕインテインにより分割されて、それぞれがＡＡＶ内に適合するＯＲＦを使用してｎＣａｓ９－ｍｌｖＲＴ５Ｍタンパク質を産生することができる新規変異体ｎＣａｓ９を利用することができる。ＲＷ１Ｎを含む編集システムは、いかなる操作された動員成分も含まないｎＣａｓ９及びｍｌｖＲＴ５Ｍを同時発現することができる。
ＢＦＰを安定して発現するＨＥＫ２９３細胞株を使用して正確な編集効率を決定し、これは、特異的な３ヌクレオチド（ｎｔ）変異を導入することによってＧＦＰに編集され得る。第１のタンパク質成分を発現するプラスミド（ｎＳｐＣａｓ９）、第２のタンパク質成分を発現する第２のプラスミド（ＭＢＰ－ｍｌｖＲＴ５Ｍ）、及びｇＲＮＡを発現する第３のプラスミドを、ＨＥＫ２９３細胞株に一過性に同時トランスフェクトした。Ｃａｓ９結合足場内にＭＳ２ヘアピン挿入物を含み、ＰＡＭ部位を除去し、ＧＦＰ変異を導入することを意図した＋２ ＡＴＧＧからＣＡＴＡ変異をコードする１３ｎｔのＰＢＳ及び１３ｎｔのＲＴＴで更に修飾された、ｇＲＮＡ２．０とのＲＷａ１を発現するプラスミド（ｎＣａｓ９及びＭＣＰ－ｍｌｖＲＴ５Ｍ）の同時トランスフェクションにより、ＰＥ２での１９％と比較して、３．７％のＧＦＰ＋細胞が得られた（図１１Ｂ）。ＭＳ２ヘアピンをゲノムフラップの部位に近づけて挿入すると、ＰＢＳは、動員されたＭＢＰ－ｍｌｖＲＴ５Ｍによる逆転写の開始を促進し得る。未修飾ｇＲＮＡ足場とＲＴＴとの間にＭＳ２ヘアピンを挿入することにより、ＲＷａ１の編集効率は１５．５％に増加した。
Ｒｅｗｒｉｔｅｒ ｂ１（「ＲＷｂ１」又は「ＲＷ１Ｌ」）は、２つのＡＡＶゲノム内に編集成分を送達するための代替的なアプローチであり得る。編集成分は、ｍｌｖＲＴ５Ｍ（ＬＺ２－ｍｌｖＲＴ５Ｍ）のＮ末端に融合した別のロイシンジッパーとヘテロ二量体化するロイシンジッパーに融合したｎＣａｓ９（ｎＳｐＣａｓ９－ＬＺ１）を含み得る（図１９Ａ）。ＲＷｂ１を発現するプラスミド（ｎＳｐＣａｓ９－ＬＺ１及びＬＺ２－ｍｌｖＲＴ５Ｍ）並びに＋２ ＡＴＧＧからＣＡＴＡ変異をコードする１３ｎｔのＰＢＳ及び１３ｎｔのＲＴＴを含むｇＲＮＡ２．０の同時トランスフェクションにより、３８％のＧＦＰ＋細胞が得られた（図１１Ｂ）。図１１Ｂに示すように、ＰＥ２と、Ｃａｓ９結合足場内にＭＳ２ヘアピン挿入物を含有し得、ＰＡＭ部位を除去し、ＧＦＰ変異を導入することを意図した＋２ ＡＴＧＧからＣＡＴＡ変異をコードする１３ｎｔのＰＢＳ及び１３ｎｔのＲＴＴで更に修飾された、ｇＲＮＡ２．０とによりトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞は、１９％の編集効率をもたらした。同じｇＲＮＡを有するＲＷａ１は、３．７％のＧＦＰ＋細胞をもたらした。未修飾ｇＲＮＡ足場とＲＴＴとの間にＭＳ２ヘアピンを挿入することにより、ＲＷａ１の編集効率は１５．５％に増加した。ＲＷｂ１並びに＋２ ＡＴＧＧからＣＡＴＡ変異をコードする１３ｎｔのＰＢＳ及び１３ｎｔのＲＴＴを含むｇＲＮＡ２．０構築物は、３８％のＧＦＰ＋細胞をもたらした。ＲＷ１Ｌは、２つのＡＡＶゲノム内に編集成分を送達するための代替設計として開発された。ＲＷ１Ｌは、ｍｌｖＲＴ５Ｍ（ＬＺ２－ｍｌｖＲＴ５Ｍ）のＮ末端に融合した相補的ロイシンジッパーとヘテロ二量体化するロイシンジッパー１７に融合したｎＳｐＣａｓ９（ｎＳｐＣａｓ９－ＬＺ１）を含み得る。ＲＷ１Ｍとの直接の比較を可能にするために、ＲＷ１Ｌを、最初に、ＲＷ１Ｍのために構築されたｇＲＮＡ２．０足場を含有する同じｇＲＮＡで試験した（ただし、ｇＲＮＡ２．０におけるＭＳ２ヘアピンは、必ずしもＲＷ１Ｌの成分と相互作用するとは予想されなかった）。
ＲＷａ１及びＲＷｂ１は、それぞれ、ＡＡＶパッケージングに許容されるサイズ制限内の２つのポリペプチドを含み得るが、ｎＳｐＣａｓ９及びｎＳｐＣａｓ９－ＬＺ１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のサイズは、発現を制御するために含まれ得る調節エレメントの長さを限定し得る。一部の場合、Ｎｐｕ Ｃ末端エクステインの第１の残基としてのシステインに対する可能性のある必要性により、分割プライムエディタ２は、ｎＳｐＣａｓ９における最もＣ末端のシステインであるＣｙｓ５７４において、ｎＳｐＣａｓ９－ｍｌｖＲＴ５Ｍを２つの断片に分割するためのインテインを含み得る。ｎＳｐＣａｓ９の残基７００と１２５０との間に適切なインテインフランキング配列を導入することができる場合、２つのインテイン含有ＯＲＦを有する修飾されたｎＳｐＣａｓ９－ｍｌｖＲＴ５Ｍ融合タンパク質を、ＲＷａ１及びＲＷｂ１がそうでなければ許容し得るよりも多くの調節エレメントのための余地を有する２つの組換えＡＡＶゲノム内にコードすることができると考えられた。システイン置換（一部の場合、インテイン触媒作用を提供する）及びｍｌｖＲＴ５Ｍを含むｎＳｐＣａｓ９のＣ末端断片に融合したＮｐｕ Ｃ末端インテインと対になったＮｐｕ Ｎ末端インテインに融合したｎＳｐＣａｓ９のＮ末端断片をコードする構築物のパネルを試験した。Ｓｅｒ１１７３Ｃｙｓ ｎＳｐＣａｓ９－ｍｌｖＲＴ５Ｍ変異体を、残基１１７２と１１７３（ｎＣａｓ９（１～１１７２）－ＮｐｕＮ及びｎＣａｓ９（１１７３～１３６８；Ｓ１１７３Ｃ）－ｍｌｖＲＴ５Ｍ；「ＲＷｃ１」又は「ＲＷ１Ｉ」と名付けられた）との間で分割すると、ＰＥ２よりも約２倍高い編集効率が得られた（２９％対１５％、図１９Ｂ）。
標準的なｇＲＮＡ足場を使用すると、ＲＷａ１、ＲＷｂ１、及びＲＷｃ１は全て、４０％を超える編集効率をもたらすことが見出された（図１９Ｃ）。驚くべきことに、ＭＳ２ヘアピンを含有しないｇＲＮＡと、ｎＣａｓ９及びＭＣＰ－ｍｌｖＲＴ５Ｍ構築物との同時発現により、ＭＳ２ヘアピンを含むｇＲＮＡと比較してほぼ同じ編集効率がもたらされ、ＲＴをｎＣａｓ９の部位に動員又は融合させることが、必ずしも必要でなくてもよいか、又はｎＣａｓ９及びＲＴを単に同時発現させることが効率的な編集をもたらし得ることが示された。ｍｌｖＲＴを能動的に動員しなかった構築物は、Ｒｅｗｒｉｔｅｒ ｄ１（「ＲＷｄ１」又は「ＲＷ１Ｎ」）と呼ばれた。ＡＡＶ送達の文脈において、ＲＷｃ１は、最大約６７０ｎｔの調節エレメントを収容し得るので、使用することができる。各ウイルスについて２．８×１０５のＭＯＩで２つの別個のＡＡＶ２構築物にパッケージ化されたＲＷｃ１を用いてＢＦＰを発現するＨＥＫ２９３細胞を形質導入すると、７４．８％のＧＦＰ＋細胞が得られた（図１９Ｄ）。
ＲｅｗｒｉｔｅｒのＡＡＶ媒介性送達を実証するために、５８４ｎｔのＣＭＶプロモーターを収容したＲＷ１ＩのＮ末端タンパク質成分を、ＲＷ１ＩのＣ末端タンパク質成分（ＣＭＶプロモーターによっても駆動される）と、Ｕ６プロモーターによって駆動される、ＢＦＰをＧＦＰに変換するｇＲＮＡとの両方を別個のＡＡＶ２ベクターにパッケージングしながら、ＡＡＶ２ベクターにパッケージングした。各ウイルスについて２．８×１０５ＶＧ／細胞のＭＯＩでのＢＦＰ発現ＨＥＫ２９３細胞の同時に行われたＡＡＶ同時形質導入により、７４．８％のＧＦＰ＋細胞がもたらされた。
結果は、ＲＷ１Ｍ、ＲＷ１Ｌ、ＲＷ１Ｉ、又はＲＷ１Ｎが、異なるｇＲＮＡ間で異なる編集効率を有し得ることを示したため、いくつかの実施形態は、所与のｇＲＮＡで効率を最大化するためにいくつかのアーキテクチャをスクリーニングすることを含む。ＲＷ１Ｉは、両方のＡＡＶゲノム上の調節エレメントのための最も多くの余地を提供し得る一方で、ＲＷ１Ｌ及びＲＷ１Ｎは、第２のＡＡＶゲノム内の複数のｇＲＮＡカセットを収容し得る。ＲＷ１Ｎは、驚くべきことに、プラスミドトランスフェクションを使用するときに他のアーキテクチャと同様の編集効率を提供したが、これは、能動的動員についての必要性の可能性を排除するのに十分に高いタンパク質成分の細胞内濃度を必要とし得る。したがって、一部の場合、ＲＷ１Ｎは、代替の送達戦略及び発現レベルを伴う高い編集効率を提供しない場合がある。
ＲＮＡ伸長再配向
ガイドＲＮＡ伸長の空間的再配向は、編集効率又はウィンドウ長を増加させ得る。編集ウィンドウ長を増加させることは、所与の変異の効率的な編集のためのより多くのｇＲＮＡをスクリーニングすることを可能にし得るか、又は単一のｇＲＮＡでより多くの病原性変異を修正し得る。追加的に、プライムエディタ３ｂは、ＲＴによって生成された配列に結合し、反対側の鎖をニックする第２のｇＲＮＡを発現させることによって編集効率を増加させ、それによってＲＴ合成された編集のニック媒介性ミスマッチ修復を回避し得る。プライムエディタ３ｂアプローチは、一部の場合、プライムエディタの限定された編集ウィンドウ長内にＰＡＭ部位を有する標的部位に限定され得る。編集ウィンドウ長を増加させるには、ＲＴＴの長さを増加させる必要があり得る。Ｒｅｗｒｉｔｅｒ及びＰＥの編集効率は、より長いＲＴＴを使用する場合、ＰＢＳ及びゲノムフラップのハイブリダイゼーション速度によって限定され得ると仮定した。ＲＴＴの長さを増加させることができれば、ｇＲＮＡ足場の一部の逆転写の頻度の低下に影響を及ぼす可能性があり、これは、不注意にも、足場鋳型化された配列のゲノム内への望ましくない挿入をもたらす可能性があることも予測された。ｇＲＮＡの３’伸長に導入して、ＲＴＴの長さにかかわらず、ＰＢＳをゲノムフラップの近くに空間的に配向し得る、ｇＲＮＡ位置決めシステム（ＧＰＳ）と本明細書で呼ばれるＲＮＡ成分を設計した。ＧＰＳバージョン１（Ｖ１）は、ＲＴＴの３’領域とハイブリダイズし得る、ＲＴＴの挿入された５’のＲＮＡ配列を含み得、かつ／又はＧＰＳバージョン２（Ｖ２）は、ＲＴＴの５’部分とハイブリダイズし得る、ＰＢＳの挿入された３’のＲＮＡ配列であり得る（図２０Ａ）。コンピューターによるＲＮＡフォールディング分析は、ＧＰＳ Ｖ１及びＶ２が、ＰＢＳを意図されるようにｇＲＮＡの３’伸長の５’末端に近づけることを予測した（図１２Ｂ）。ＲＮＡフォールディング分析は、ＧＰＳ Ｖ１及びＶ２が、ｇＲＮＡの３’伸長の構造を変化させて、ＰＢＳをｇＲＮＡ足場に近づけ得ることを予測した。
ガイドＲＮＡ伸長の空間的再配向は、編集効率又はウィンドウ長を増加させ得る。編集ウィンドウ長を増加させることは、所与の変異の効率的な編集のためのより多くのｇＲＮＡをスクリーニングすることを可能にし得るか、又は単一のｇＲＮＡでより多くの病原性変異を修正し得る。追加的に、プライムエディタ３ｂは、ＲＴによって生成された配列に結合し、反対側の鎖をニックする第２のｇＲＮＡを発現させることによって編集効率を増加させ、それによってＲＴ合成された編集のニック媒介性ミスマッチ修復を回避し得る。プライムエディタ３ｂアプローチは、一部の場合、プライムエディタの限定された編集ウィンドウ長内にＰＡＭ部位を有する標的部位に限定され得る。編集ウィンドウ長を増加させるには、ＲＴＴの長さを増加させる必要があり得る。Ｒｅｗｒｉｔｅｒ及びＰＥの編集効率は、より長いＲＴＴを使用する場合、ＰＢＳ及びゲノムフラップのハイブリダイゼーション速度によって限定され得ると仮定した。ＲＴＴの長さを増加させることができれば、ｇＲＮＡ足場の一部の逆転写の頻度の低下に影響を及ぼす可能性があり、これは、不注意にも、足場鋳型化された配列のゲノム内への望ましくない挿入をもたらす可能性があることも予測された。ｇＲＮＡの３’伸長に導入して、ＲＴＴの長さにかかわらず、ＰＢＳをゲノムフラップの近くに空間的に配向し得る、ｇＲＮＡ位置決めシステム（ＧＰＳ）と本明細書で呼ばれるＲＮＡ成分を設計した。ＧＰＳバージョン１（Ｖ１）は、ＲＴＴの３’領域とハイブリダイズし得る、ＲＴＴの挿入された５’のＲＮＡ配列を含み得、かつ／又はＧＰＳバージョン２（Ｖ２）は、ＲＴＴの５’部分とハイブリダイズし得る、ＰＢＳの挿入された３’のＲＮＡ配列であり得る（図２０Ａ）。コンピューターによるＲＮＡフォールディング分析は、ＧＰＳ Ｖ１及びＶ２が、ＰＢＳを意図されるようにｇＲＮＡの３’伸長の５’末端に近づけることを予測した（図１２Ｂ）。ＲＮＡフォールディング分析は、ＧＰＳ Ｖ１及びＶ２が、ｇＲＮＡの３’伸長の構造を変化させて、ＰＢＳをｇＲＮＡ足場に近づけ得ることを予測した。
ＧＰＳはまた、Ｖｅｌｃｒｏと称されることもある。同様に、Ｖｅｌｃｒｏは、ＧＰＳと称されることがある。ＧＰＳには、Ｖｅｌｃｒｏ又はＶｅｌｃｒｏの成分が含まれ得る。Ｖｅｌｃｒｏには、ＧＰＳ又はＧＰＳの成分が含まれ得る。
ＲＷｂ１と、１０７ｎｔのＲＴＴを含むガイドＲＮＡとの同時トランスフェクションにより、１４％のＧＦＰ＋細胞がもたらされ、これは、より短い１３ｎｔのＲＴＴを使用して達成された３８％よりも有意に低かったため、ＲＴＴ長を増加させて編集ウィンドウを拡大することは、編集効率を低下させ得ることが確認された。２０ｎｔのＧＰＳ Ｖ２を追加すると、編集効率が２７．４％増加した。ＧＰＳ Ｖ１は編集効率を１４％から２４．８％に増加させた。ＧＰＳ Ｖ１を使用して、ＧＰＳ配列の逆転写及びゲノム挿入を引き起こすことができる。ＰＢＳの２０ｎｔのＧＰＳ Ｖ２、３’の使用は、編集効率を２７．４％に増加させ、ＧＰＳ配列のゲノム挿入についての可能性を有しない。ＧＰＳ Ｖ２が進められ、ＧＰＳ Ｖ２成分を使用するＲｅｗｒｉｔｅｒシステムは、「Ｒｅｗｒｉｔｅｒ ２．０」と称されることがあり、又は「ｇ」（例えば、「ＲＷ１Ｉ＿ｇ」）と示され得る。次に、１２９ｎｔの鋳型を使用したニック部位からの３ｎｔ変異６５ｎｔの導入は、ＧＰＳ Ｖ２を組み込むことによって４倍増加したことが見出された（図２０Ｂ）。標的部位のアミノ酸配列を維持しながら逆転写を阻害し得る二次構造を除去するためにＲＴＴを再コードすることによって、この編集を行う効率を２１％に増加させた。最後に、様々な長さ及び結合部位のＧＰＳのパネルを生成し、ＲＴＴの最初の２０ｎｔにハイブリダイズした２０ｎｔのＧＰＳは、セットの中で最高の編集効率をもたらした（図１２Ｄ）。ＲＴＴの最初の２０ｎｔにハイブリダイズした２０ｎｔのＧＰＳは、様々な長さ及び結合部位のＧＰＳ Ｖ２のパネルの中で最高の編集効率をもたらした。変異率データを、３つの生物学的に独立した試料からの平均±１標準偏差として示す。
第２の鎖合成
次に、第１の合成鎖に相補的な所望の編集を含む第２の鎖のＤＮＡを合成することにより、編集効率を更に増加させることができると仮定した。第２の鎖プライマー（ＳＳＰ）を導入した。ＳＳＰは、逆転写酵素が第１の合成鎖を第２の鎖合成のための鋳型として使用することを可能にし得る（図１３Ａ）。ＳＳＰは、３’ｇＲＮＡ伸長の３’末端に挿入され得る。ＳＳＰは、編集部位の３’である第１の合成鎖の一部にハイブリダイズし得る。ＰＢＳがフラップにハイブリダイズし、第１の鎖が逆転写された後、ＳＳＰは第１の合成鎖にハイブリダイズし得、逆転写酵素が第１の合成鎖を第２の鎖合成のための鋳型として使用することを可能にする。
次に、第１の合成鎖に相補的な所望の編集を含む第２の鎖のＤＮＡを合成することにより、編集効率を更に増加させることができると仮定した。第２の鎖プライマー（ＳＳＰ）を導入した。ＳＳＰは、逆転写酵素が第１の合成鎖を第２の鎖合成のための鋳型として使用することを可能にし得る（図１３Ａ）。ＳＳＰは、３’ｇＲＮＡ伸長の３’末端に挿入され得る。ＳＳＰは、編集部位の３’である第１の合成鎖の一部にハイブリダイズし得る。ＰＢＳがフラップにハイブリダイズし、第１の鎖が逆転写された後、ＳＳＰは第１の合成鎖にハイブリダイズし得、逆転写酵素が第１の合成鎖を第２の鎖合成のための鋳型として使用することを可能にする。
ＳＳＰは、編集部位の３’である第１の合成鎖の一部にハイブリダイズし得る。ＳＳＰの開始からｇＲＮＡの３’末端までの領域が、第１の合成鎖に相補的であることを可能にするために、自己切断性肝炎デルタウイルス（ＨＤＶ）リボザイムをＳＳＰの３’に導入した。最初に試験したのは、ＳＳＰがＰＥ２の編集効率を改善できるかどうかであった。２０ｎｔのＳＳＰは、４０ｎｔ又は６０ｎｔのＳＳＰよりも優れた性能を有することが見出された（図１３Ｂ）。２０ｎｔのＳＳＰは、４０ｎｔ及び６０ｎｔのＳＳＰよりも優れた性能を有した。ニック部位から最大６ｎｔ及び３６ｎｔをハイブリダイズした２０ｎｔのＳＳＰを組み込むと、ＳＳＰなしと比較して編集効率が約２倍増加した。ニック部位から最大５５ｎｔまでハイブリダイズした２０ｎｔのＳＳＰは、編集効率を改善しなかった。これは、ＲＴＴのより遠位の部分の逆転写の効率が低いために、ＳＳＰ結合部位の利用可能性が限定されることに起因すると予測された。このＳＳＰ技術を利用したシステムは、Ｒｅｗｒｉｔｅｒ ３．０と名付けた。次いで、編集効率を更に増加させるために、Ｒｅｗｒｉｔｅｒ ２．０を使用してＶｅｌｃｒｏの後にＳＳＰを挿入することができ、約４１％の編集をもたらすことが見出された（Ｒｅｗｒｉｔｅｒ ３．２；図２１）。また、ＳＳＰの末端３ｎｔが、第１の合成鎖に相補的でない場合、ＳＳＰがもたらした効率の増加は無効になったことが実証された。
ＨＤＶリボザイムは、３’末端上に２’３’環状リン酸を残し得、逆転写は、３’ヒドロキシルを使用してプライマーからの合成を開始し得るため、ヒトポリヌクレオチドキナーゼなどの内因性酵素は、２’３’環状リン酸を３’ヒドロキシルに変換し得る。ＨＤＶリボザイムの代わりにＳＳＰの後にｔＲＮＡを組み込むことは、ｔＲＮＡのＲＮａｓｅ Ｐ切断後の３’ヒドロキシルのより迅速な生成をもたらす可能性があると予測された。ヒトグルタミン酸ｔＲＮＡを組み込むことにより、編集効率が５０．９％に統計的に有意に増加した。標的部位のアミノ酸配列を維持しながら逆転写を阻害する可能性のある二次構造を除去するためにＲＴＴを再コードすることによって、ニックから６５ｎｔの編集を行う効率をわずかに増加させた。
ｍｌｖＲＴの操作
ＰＥ２は、インビトロで逆転写酵素活性を改善することが報告されたＰＥ１のｍｌｖＲＴに変異を導入することによって開発された。ＰＥ２で使用されるｍｌｖＲＴは、処理能力、熱安定性、基質親和性を増加させるか、又はＲＮａｓｅＨ活性を調節する変異を組み込むことによって更に改善され得る。したがって、インビトロでｍｌｖＲＴ活性を改善し得るｍｌｖＲＴにおける３１の変異をスクリーニングした（図１４Ａ）。５つの変異は、編集において統計的に有意に増加した。ｍｌｖＲＴ５Ｍの上にこれらの変異を組み合わせた効果を試験して、編集効率の潜在的な増加を決定した。９つの変異をｍｌｖＲＴ５Ｍに付加することにより、編集効率を、ｍｌｖＲＴ５Ｍでは約４３％から、ｍｌｖＲＴ１４Ｍでは約５４％に増加させた（図１４Ｂ）。ｍｌｖＲＴ１４Ｍを組み込むシステムは、「Ｒｅｗｒｉｔｅｒ ４」又は「Ｒｅｗｒｉｔｅｒ ２」（例えば、「ＲＷ２Ｉ＿ｇ」）と称されることがある。
ＰＥ２は、インビトロで逆転写酵素活性を改善することが報告されたＰＥ１のｍｌｖＲＴに変異を導入することによって開発された。ＰＥ２で使用されるｍｌｖＲＴは、処理能力、熱安定性、基質親和性を増加させるか、又はＲＮａｓｅＨ活性を調節する変異を組み込むことによって更に改善され得る。したがって、インビトロでｍｌｖＲＴ活性を改善し得るｍｌｖＲＴにおける３１の変異をスクリーニングした（図１４Ａ）。５つの変異は、編集において統計的に有意に増加した。ｍｌｖＲＴ５Ｍの上にこれらの変異を組み合わせた効果を試験して、編集効率の潜在的な増加を決定した。９つの変異をｍｌｖＲＴ５Ｍに付加することにより、編集効率を、ｍｌｖＲＴ５Ｍでは約４３％から、ｍｌｖＲＴ１４Ｍでは約５４％に増加させた（図１４Ｂ）。ｍｌｖＲＴ１４Ｍを組み込むシステムは、「Ｒｅｗｒｉｔｅｒ ４」又は「Ｒｅｗｒｉｔｅｒ ２」（例えば、「ＲＷ２Ｉ＿ｇ」）と称されることがある。
低いｄＮＴＰ濃度の克服
ＰＥ又はＲｅｗｒｉｔｅｒのいくつかの実施形態などの逆転写酵素を使用してＤＮＡを重合するゲノムエディタは、ｄＮＴＰを基質として使用することができる。したがって、非分裂細胞又はゆっくりと分裂する細胞（網膜及び肺など）に特徴的な低いｄＮＴＰ濃度は、培養中の急速に分裂する細胞における編集と比較して、障壁をもたらす可能性が考えられる。ＳＡＭＨＤ１は、細胞ｄＮＴＰ濃度を制御し得るトリホスホヒドロラーゼである。非分裂細胞において、ＳＡＭＨＤ１は、ｄＮＴＰを加水分解し得る。周期細胞において、サイクリン依存性キナーゼ１（ＣＤＫ１）は、ＳＡＭＨＤをリン酸化し得る。これは、ｄＮＴＰ加水分解を阻害し得る。これは、より高いｄＮＴＰ濃度につながり得る。ＳＡＭＨＤ１ Ｔ５９２Ａ変異体（「ＳＡＭＨＤ１Ｐ－」又は「ＳＡＭＨＤ１（Ｔ５９２Ａ）」）は、一部の場合、リン酸化され得ず、したがって、ＣＤＫ１の存在に関係なく、ｄＮＴＰプールを枯渇させ得る。ＶＰＸは、分解のためにＳＡＭＨＤ１を特異的に標的とするためにＨＩＶ－２によって発現される小さなタンパク質であり得る。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内の非分裂細胞及びゆっくりと分裂する細胞のより低いｄＮＴＰ濃度は、ＳＡＭＨＤ１ｐ－を発現させることによってモデル化され得ることが予測された（図１５Ａ）。
ＰＥ又はＲｅｗｒｉｔｅｒのいくつかの実施形態などの逆転写酵素を使用してＤＮＡを重合するゲノムエディタは、ｄＮＴＰを基質として使用することができる。したがって、非分裂細胞又はゆっくりと分裂する細胞（網膜及び肺など）に特徴的な低いｄＮＴＰ濃度は、培養中の急速に分裂する細胞における編集と比較して、障壁をもたらす可能性が考えられる。ＳＡＭＨＤ１は、細胞ｄＮＴＰ濃度を制御し得るトリホスホヒドロラーゼである。非分裂細胞において、ＳＡＭＨＤ１は、ｄＮＴＰを加水分解し得る。周期細胞において、サイクリン依存性キナーゼ１（ＣＤＫ１）は、ＳＡＭＨＤをリン酸化し得る。これは、ｄＮＴＰ加水分解を阻害し得る。これは、より高いｄＮＴＰ濃度につながり得る。ＳＡＭＨＤ１ Ｔ５９２Ａ変異体（「ＳＡＭＨＤ１Ｐ－」又は「ＳＡＭＨＤ１（Ｔ５９２Ａ）」）は、一部の場合、リン酸化され得ず、したがって、ＣＤＫ１の存在に関係なく、ｄＮＴＰプールを枯渇させ得る。ＶＰＸは、分解のためにＳＡＭＨＤ１を特異的に標的とするためにＨＩＶ－２によって発現される小さなタンパク質であり得る。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内の非分裂細胞及びゆっくりと分裂する細胞のより低いｄＮＴＰ濃度は、ＳＡＭＨＤ１ｐ－を発現させることによってモデル化され得ることが予測された（図１５Ａ）。
図１５Ｂは、ＳＡＭＨＤ１ｐ－の低下した編集効率の２．７倍でＲｅｗｒｉｔｅｒ ３．２（「ＲＷ１Ｌ＿ｇ」とも称されることがある）を同時トランスフェクトすることによって、ｄＮＴＰ濃度が、一部の場合、ゲノム編集について限定的であり得るという考えを支持することを示す。ＳＡＭＨＤ１（Ｔ５９２Ａ）を同時発現させると、編集効率は２．７倍低下した。ｍｌｖＲＴ５Ｍへのいくつかの変異は、ＳＡＭＨＤ１（Ｔ５９２Ａ）の存在下で編集効率のいくつかを回復させた。いくつかの変異は、ｄＮＴＰのｍｌｖＲＴのＫｍを低下させる可能性がある。Ｒｅｗｒｉｔｅｒにいくつかのそのような変異を導入することにより、ニックから離れたＳＡＭＨＤ１Ｐ－ ２－ｎｔの存在下での編集効率のいくつかが回復した。これらの変異のうちの１つであるＶ２２３Ａは、効率を低下させないことが確認された。Ｖ２２３Ａを組み込んだ構築物を、Ｒｅｗｒｉｔｅｒ ５．０と名付けた（図１５Ｃ）。Ｖ２２３Ａ変異をｍｌｖＲＴ５Ｍに導入しても、ニックから６５ｎｔの編集を導入する効率は低下しなかった（Ｒｅｗｒｉｔｅｒ ５）。
非分裂及びゆっくりと分裂する細胞における編集効率を増加させるための相補的アプローチとして、ＶＰＸを用いた。ＶＰＸは、小さなＨＩＶ－２タンパク質であり得る。ＶＰＸは、分解のためにＳＡＭＨＤ１を特異的に標的とし得る。（ＲＯＤ ＨＩＶ－２単離物からの）ＶＰＸＲＯＤ及びＳＡＭＨＤ１ｐ－の同時発現は、ＶＰＸを有しないＳＡＭＨＤ１ｐ－を発現させることによって引き起こされる編集効率の低下を完全に逆転させた（図１５Ｄ）。ＳＡＭＨＤ１ｐ－誘発性の編集効率の低下は、変異がニックから６５ｎｔに導入されたときに更により劇的であった。ほぼゼロの効率は、ｄＮＴＰの組み込みごとに、ＤＮＡ合成効率の配合低下に起因し得る。ＶＰＸＲＯＤの同時発現は、ＳＡＭＨＤ１ｐ－を発現させずに観察された効率の７８％に編集効率を回復させた（Ｒｅｗｒｉｔｅｒ ５．１）。
ＳＡＭＨＤ１ｐ－の存在下でニックから６５ｎｔの変異を導入する効率を完全に回復させたＨＩＶ－２臨床単離物ＲＨ２－１（ＶＰＸＲＨ２－１）から、ＶＰＸのバリアントを同定した（Ｒｅｗｒｉｔｅｒ ５．２；図１５Ｅ）。図１５Ｅの変異率データを、３つの生物学的に独立した試料からの平均±１標準偏差として示す。ＶＰＸＲＨ２－１はまた、ＳＡＭＨＤ１（Ｔ５９２Ａ）を、ＲＷ２Ｉ及びニックから２ｎｔの変異を導入し得るｇＲＮＡと同時発現させるときにＶＰＸＲＯＤよりも優れており、６４％の編集効率をもたらし（図１５Ｆ）、また、ＲＷ２Ｉ＿ｇ及びニックから６５ｎｔの変異を導入するｇＲＮＡでも優れていた（図２３）。ＶＰＸＲＨ２－１を組み込んだＲｅｗｒｉｔｅｒシステムは、「＿ｖ」（例えば、「ＲＷ２Ｉ＿ｇｖ」）と指定され得る。
ｄＮＴＰの濃度を増加させることは、細胞内の編集効率を増加させるための更なる相補的アプローチであり得る。この方法は、ヌクレオチド又はヌクレオシドを細胞に送達し、ヌクレオチド又はヌクレオシドを受け取らなかった細胞と比較して、細胞内のｄＮＴＰの濃度を増加させることを含み得る。細胞内のｄＮＴＰの濃度の増加は、本明細書に開示される組成物を含む細胞内の編集効率の増加をもたらし得る。一部の場合、ｄＮＴＰは、対象（例えば、細胞を含む対象）に投与される。いくつかの実施形態において、ｄＮＴＰを細胞に投与することは、細胞を含む対象にｄＮＴＰを投与することを含む。ｄＮＴＰの投与は、経口投与を含み得る。ｄＮＴＰの投与は、注射によるものであり得る。
嚢胞性線維症変異又は他の疾患変異の修正
嚢胞性線維症についての小分子療法は、汗塩化物、肺合併症率、及び強制呼気量の完全な機能回復に満たないことが示されている。追加的に、ＣＦＴＲ遺伝子における嚢胞性線維症（ＣＦ）を引き起こす変異の大部分は、これらの小分子によって治療可能ではない場合がある。ＣＦＴＲ遺伝子の機能的コピーを患部細胞に送達することは、ＣＦ患者のＣＦＴＲ遺伝子型に関係なく、任意のＣＦ患者を治療することができる。しかしながら、ＣＦを治療するための遺伝子療法アプローチは、ＣＦＴＲ発現の一過性及び合成的調節、並びにＡＡＶの限定されたパッケージング能力によって限定されており、これは、不完全な活性を示す切断されたＣＦＴＲの使用を必要とし得る。ＣＦＴＲ編集に関するいくつかのデータを図２９Ｂ及び図２９Ｃに示す。
嚢胞性線維症についての小分子療法は、汗塩化物、肺合併症率、及び強制呼気量の完全な機能回復に満たないことが示されている。追加的に、ＣＦＴＲ遺伝子における嚢胞性線維症（ＣＦ）を引き起こす変異の大部分は、これらの小分子によって治療可能ではない場合がある。ＣＦＴＲ遺伝子の機能的コピーを患部細胞に送達することは、ＣＦ患者のＣＦＴＲ遺伝子型に関係なく、任意のＣＦ患者を治療することができる。しかしながら、ＣＦを治療するための遺伝子療法アプローチは、ＣＦＴＲ発現の一過性及び合成的調節、並びにＡＡＶの限定されたパッケージング能力によって限定されており、これは、不完全な活性を示す切断されたＣＦＴＲの使用を必要とし得る。ＣＦＴＲ編集に関するいくつかのデータを図２９Ｂ及び図２９Ｃに示す。
代替として、ＣＦを引き起こす変異を編集して、その自然調節エレメントによって制御されるＣＦＴＲ活性を回復させることは、長期的かつ潜在的に治癒的な療法を提供し得る。したがって、本明細書に記載される方法及び組成物のいくつかの実施形態を使用して、ＣＦを治療することができる。いくつかの実施形態は、変異体ＣＦＴＲ遺伝子を修正するように構成される本明細書に記載されるゲノム編集成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、又は１つ以上のポリヌクレオチドを含むアデノウイルスなどの１つ以上のウイルスを、それを必要とする対象（例えば、ＣＦを有する対象）に投与することを含む。このような成分の例には、ＣＦＴＲ核酸の領域に逆相補的であるスペーサーを含むガイドＲＮＡが含まれる。スペーサーは、配列番号９６の核酸配列を含む。スペーサーは、配列番号９６に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一の核酸配列を含み得る。スペーサーは、配列番号９７の核酸配列を含む。スペーサーは、配列番号９７に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一の核酸配列を含み得る。スペーサーは、配列番号９８の核酸配列を含む。スペーサーは、配列番号９８に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一の核酸配列を含み得る。スペーサーは、配列番号９９の核酸配列を含む。スペーサーは、配列番号９９に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一の核酸配列を含み得る。スペーサーは、配列番号１００の核酸配列を含む。スペーサーは、配列番号１００に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一の核酸配列を含み得る。スペーサーは、配列番号１０１の核酸配列を含む。スペーサーは、配列番号１０１に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一の核酸配列を含み得る。スペーサーは、配列番号１０２の核酸配列を含む。スペーサーは、配列番号１０２に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一の核酸配列を含み得る。スペーサーは、配列番号１０３の核酸配列を含む。スペーサーは、配列番号１０３に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一の核酸配列を含み得る。スペーサーは、配列番号１０４の核酸配列を含む。スペーサーは、配列番号１０４に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一の核酸配列を含み得る。スペーサーは、配列番号１０５の核酸配列を含む。スペーサーは、配列番号１０５に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一の核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、投与は、対象におけるＣＦの治療パラメータを改善する。
同様に、本明細書に記載される方法及び組成物のいくつかの実施形態を使用して、他の疾患を治療することができる。疾患を引き起こす変異を編集して、標的遺伝子内の正しい配列を復元することは、疾患を有する対象に長期的かつ潜在的に治癒的な療法を提供し得る。いくつかの実施形態は、変異体標的遺伝子を修正するように構成される本明細書に記載されるゲノム編集成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、又は１つ以上のポリヌクレオチドを含むアデノウイルスなどの１つ以上のウイルスを、それを必要とする対象（例えば、疾患を有する対象）に投与することを含む。このような成分の例には、標的核酸の領域に逆相補的であるスペーサーを含むガイドＲＮＡが含まれる。このようなスペーサーのいくつかは、表１に含まれる。スペーサーは、表１のスペーサーに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは１００％同一の核酸配列、又は相補配列を含み得る。一部の場合、スペーサーは、類似の配列を含むが、Ｔの代わりにＵを含む。いくつかの実施形態において、投与は、対象における疾患の治療パラメータを改善する。
本明細書に記載される方法及び組成物のいくつかの実施形態を使用して、アッシャー症候群を治療することができる。アッシャー症候群を引き起こす変異を編集して、ＵＳＨ２Ａを復元することは、アッシャー症候群を有する対象に長期的かつ潜在的に治癒的な療法を提供し得る。いくつかの実施形態は、変異体ＵＳＨ２Ａ遺伝子を修正するように構成される本明細書に記載されるゲノム編集成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、又は１つ以上のポリヌクレオチドを含むアデノウイルスなどの１つ以上のウイルスを、それを必要とする対象（例えば、アッシャー症候群を有する対象）に投与することを含む。このような成分の例には、ＵＳＨ２Ａ核酸の領域に逆相補的であるスペーサーを含むガイドＲＮＡが含まれる。スペーサーは、配列番号１０６の核酸配列を含む。スペーサーは、配列番号１０６に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一の核酸配列を含み得る。スペーサーは、配列番号１０７の核酸配列を含む。スペーサーは、配列番号１０７に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一の核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、投与は、対象におけるアッシャー症候群の治療パラメータを改善する。いくつかの実施形態において、ゲノム編集成分は、図２５Ｂに示される変異を修正する。ＵＳＨ２Ａ編集に関連するいくつかのデータを図２９Ａに示す。
ＵＳＨ２Ａ．１スペーサーを使用して、図２５Ａ及び図２５Ｂのデータを生成した。図２５Ａのデータについて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＰＢＳ、ＲＴＴ、又はＧＰＳの様々な配列を使用してＲＷ２Ｉでトランスフェクトした。編集効率は、意図された２２９８Ｔ＞Ｃ変異を有する読み取りの割合として示される。１５ｎｔのＰＢＳ、５２ｎｔのＲＴＴ、及び２０ｎｔのＧＰＳは、２２％の編集をもたらした。同様の実験も、編集効率が表１に含まれる場合に実施した。図２５Ｂのデータについて、１５ｎｔのＰＢＳ、５２ｎｔのＲＴＴ、２０ｎｔのＧＰＳ構築物によって生成された最も頻度の高い変異対立遺伝子は、ＲＴＴにおいてコードされた２２９８Ｔ＞Ｃ及び２３１６Ｃ＞Ａの両方の変異を含有した（１８．８％）。更に読み取りのうちの７．１％が、２３１６Ｃ＞Ａ ＰＡＭ破壊変異単独又は標的２２９８Ｔ＞Ｃ変異単独のいずれかによって表された。低頻度のアデニン挿入も標的配列内のポリＡトラクトに沿って検出された。示されるデータは、３つの生物学的に独立した試料からの平均±１標準偏差を含む。
本明細書に記載される方法及び組成物のいくつかの実施形態を使用して、スターガルト病を治療することができる。スターガルト病を引き起こす変異を編集して、ＡＢＣＡ４を復元することは、スターガルト病を有する対象に長期的かつ潜在的に治癒的な療法を提供し得る。いくつかの実施形態は、変異体ＡＢＣＡ４遺伝子を修正するように構成される本明細書に記載されるゲノム編集成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、又は１つ以上のポリヌクレオチドを含むアデノウイルスなどの１つ以上のウイルスを、それを必要とする対象（例えば、スターガルト病を有する対象）に投与することを含む。このような成分の例には、ＡＢＣＡ４核酸の領域に逆相補的であるスペーサーを含むガイドＲＮＡが含まれる。スペーサーは、配列番号１０８の核酸配列を含む。スペーサーは、配列番号１０８に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一の核酸配列を含み得る。スペーサーは、配列番号１０９の核酸配列を含む。スペーサーは、配列番号１０９に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一の核酸配列を含み得る。スペーサーは、配列番号１１０の核酸配列を含む。スペーサーは、配列番号１１０に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一の核酸配列を含み得る。スペーサーは、配列番号１１１の核酸配列を含む。スペーサーは、配列番号１１１に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一の核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、投与は、対象におけるスターガルト病の治療パラメータを改善する。ＡＢＣＡ４編集に関連するいくつかのデータを図２９Ｄ～２９Ｆに示す。
本明細書に記載される方法及び組成物のいくつかの実施形態を使用して、ウィルソン病を治療することができる。ウィルソン病を引き起こす変異を編集して、ＡＴＰ７Ｂを復元することは、ウィルソン病を有する対象に長期的かつ潜在的に治癒的な療法を提供し得る。いくつかの実施形態は、変異体ＡＴＰ７Ｂ遺伝子を修正するように構成される本明細書に記載されるゲノム編集成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、又は１つ以上のポリヌクレオチドを含むアデノウイルスなどの１つ以上のウイルスを、それを必要とする対象（例えば、ウィルソン病を有する対象）に投与することを含む。このような成分の例には、ＡＴＰ７Ｂ核酸の領域に逆相補的であるスペーサーを含むガイドＲＮＡが含まれる。スペーサーは、配列番号１１２の核酸配列を含む。スペーサーは、配列番号１１２に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一の核酸配列を含み得る。スペーサーは、配列番号１１３の核酸配列を含む。スペーサーは、配列番号１１３に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一の核酸配列を含み得る。スペーサーは、配列番号１１４の核酸配列を含む。スペーサーは、配列番号１１４に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一の核酸配列を含み得るスペーサーは、配列番号１１５の核酸配列を含む。スペーサーは、配列番号１１５に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一の核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、投与は、対象におけるウィルソン病の治療パラメータを改善する。
本明細書に記載される方法及び組成物のいくつかの実施形態を使用して、ハンチントン病を治療することができる。ハンチントン病を引き起こす変異を編集して、ＨＴＴを復元することは、ハンチントン病を有する対象に長期的かつ潜在的に治癒的な療法を提供し得る。いくつかの実施形態は、変異体ＨＴＴ遺伝子を修正するように構成される本明細書に記載されるゲノム編集成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、又は１つ以上のポリヌクレオチドを含むアデノウイルスなどの１つ以上のウイルスを、それを必要とする対象（例えば、ハンチントン病を有する対象）に投与することを含む。このような成分の例には、ＨＴＴ核酸の領域に逆相補的であるスペーサーを含むガイドＲＮＡが含まれる。スペーサーは、配列番号１１６の核酸配列を含む。スペーサーは、配列番号１１６に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一の核酸配列を含み得る。スペーサーは、配列番号１１７の核酸配列を含む。スペーサーは、配列番号１１７に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一の核酸配列を含み得る。スペーサーは、配列番号１１８の核酸配列を含む。スペーサーは、配列番号１１８に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一の核酸配列を含み得るスペーサーは、配列番号１１９の核酸配列を含む。スペーサーは、配列番号１１９に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一の核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、投与は、対象におけるハンチントン病の治療パラメータを改善する。
本明細書には、伸長を含むガイド核酸が開示される。伸長は、ＨＴＴを編集するための伸長核酸配列を含み得る。ＨＴＴを編集するための伸長核酸配列は、配列番号１４０の配列を含み得る。ＨＴＴを編集するための伸長核酸配列は、配列番号１４０の配列に対して、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、又は少なくとも９５％同一である配列を含み得る。伸長は、ＧＰＳ領域を含み得る。伸長は、ＧＰＳ領域を含まない場合がある。ＧＰＳ領域を含む伸長の伸長配列の例は、配列番号１４１に含まれる。ＨＴＴを編集するための伸長核酸配列は、配列番号１４１の配列を含み得る。ＨＴＴを編集するための伸長核酸配列は、配列番号１４１の配列に対して、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、又は少なくとも９５％同一である配列を含み得る。
アッシャー症候群遺伝子の書き換え
アッシャー症候群は、難聴及び視力低下を併発する最も一般的な遺伝性原因であり得る。補聴器及び耳インプラントは、一部のアッシャー患者の難聴を治療することができるが、その視力低下は現在治療できない。おそらくアッシャー症候群を引き起こす最も一般的な変異は、ＵＳＨ２Ａ遺伝子における単一ヌクレオチド欠失、２２９９ｄｅｌＧである。機能的ＵＳＨ２Ａの送達を伴う遺伝子療法は、典型的なＡＡＶ及びレンチウイルスパッケージング容量を超えるＵＳＨ２Ａ ｃＤＮＡサイズ（１５．６ｋｂ）によって他の方法で妨げられ得、そうでなければ塩基エディタは、ヌクレオチド挿入を行うことができない可能性があるため、Ｒｅｗｒｉｔｅｒは、アッシャー症候群を有する患者に治療的治療を提供するためのアプローチを提供し得る。
アッシャー症候群は、難聴及び視力低下を併発する最も一般的な遺伝性原因であり得る。補聴器及び耳インプラントは、一部のアッシャー患者の難聴を治療することができるが、その視力低下は現在治療できない。おそらくアッシャー症候群を引き起こす最も一般的な変異は、ＵＳＨ２Ａ遺伝子における単一ヌクレオチド欠失、２２９９ｄｅｌＧである。機能的ＵＳＨ２Ａの送達を伴う遺伝子療法は、典型的なＡＡＶ及びレンチウイルスパッケージング容量を超えるＵＳＨ２Ａ ｃＤＮＡサイズ（１５．６ｋｂ）によって他の方法で妨げられ得、そうでなければ塩基エディタは、ヌクレオチド挿入を行うことができない可能性があるため、Ｒｅｗｒｉｔｅｒは、アッシャー症候群を有する患者に治療的治療を提供するためのアプローチを提供し得る。
ＵＳＨ２Ａ中の２２９９Ｇ領域を書き換えるための成分を提供した。ニックから２３ｎｔのＲＴＴにおいてコードされた２２９８Ｔ＞Ｃサイレント変異のインストールメントを定量することによって、野生型ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における編集効率を決定した。２２９９ＧはＲＴＴによってコードされるが、野生型ＨＥＫ２９３Ｔ細胞はすでに２２９９Ｇを含有するため、２２９８Ｔ＞Ｃも代用変異として含まれた。また、意図された編集が達成された後に、ｎＳｐＣａｓ９が標的部位をニックし続けることを防止することを意図した、ニックから５ｎｔのＲＴＴにおける２３１６Ｃ＞Ａ ＰＡＭ無効化サイレント変異をコードした。
２２パーセントの編集は、ＲＷ２Ｉシステムにおける１５ｎｔのＰＢＳ、５２ｎｔのＲＴＴ、及び２０ｎｔのＧＰＳの使用によって達成された（図２５Ａ）。図２５Ａのデータについて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＰＢＳ、ＲＴＴ、及びＧＰＳの異なる配列を使用してＲＷ２Ｉでトランスフェクトした。編集効率は、意図された２２９８Ｔ＞Ｃ変異を有する読み取りの割合として示される。１５ｎｔのＰＢＳ、５２ｎｔのＲＴＴ、及び２０ｎｔのＧＰＳは、２２％の編集をもたらした。
９、１１、１３、及び１５ｎｔのＰＢＳ長を試験し、３２、３４、３６、５２、及び５６ｎｔのＲＴＴ長を評価し、２０ｎｔのＧＰＳを５２及び５６ｎｔのＲＴＴ構築物に含めた。ＧＰＳを含まない構築物の全ては、６．３％未満の編集をもたらしたが、対照的に、５２ｎｔのＲＴＴ及び２０ｎｔのＧＰＳを有する構築物は、９ｎｔのＰＢＳを用いた場合の約６．５％から１５ｎｔのＰＢＳを用いた場合の２２％の増加を伴う、最も高い編集効率をもたらした。これらの結果は、ＧＰＳがニック部位から２３ｎｔ近くまで編集を導入する効率を大幅に改善することができることを示している。インシリコで予測されたオフターゲットゲノム部位のスペーサーの上位５つのディープシークエンシングを行い、Ｒｅｗｒｉｔｅｒ成分をトランスフェクトすることによって導入された編集は検出されなかった。
次に、１５ｎｔのＰＢＳ、５２ｎｔのＲＴＴ、及び２０ｎｔのＧＰＳ構築物によって生成された対立遺伝子バリアントの種類を分析したところ、最も頻度の高いバリアントは、２２９８Ｔ＞Ｃ及び２３１６Ｃ＞Ａ変異の両方を含有し（１８．８％）、続いて２３１６Ｃ＞Ａ変異のみを含有し（３．９％）、次いで２２９８Ｔ＞Ｃ変異のみを含有した（３．２％）ことが見出された（図２５Ｂ）。図２５Ｂは、１５ｎｔのＰＢＳ、５２ｎｔのＲＴＴ、２０ｎｔのＧＰＳ構築物によって生成された最も頻度の高い変異対立遺伝子が、ＲＴＴにおいてコードされた２２９８Ｔ＞Ｃ及び２３１６Ｃ＞Ａ変異の両方を含むことを示す（１８．８％）。更に読み取りのうちの７．１％が、２３１６Ｃ＞Ａ ＰＡＭ破壊変異単独又は標的２２９８Ｔ＞Ｃ変異単独のいずれかによって表された。低頻度のアデニン挿入も標的配列内のポリＡトラクトに沿って検出された。いくつかの追加の態様に関するいくつかのデータを図２８に示す。
ＰＡＭを破壊するＲＴＴ内の変異をコードすることは、編集効率を増加させ得る。ＰＡＭを破壊するＲＴＴ内の変異をコードすることは、編集精度を増加させ得る。ＰＡＭ部位を破壊するＲＴＴ内の配列をコードすることにより、編集の効率が増加し、望ましくない欠失が減少することが見出された（図２５Ｃ及び図２５Ｇ）。
プライムエディタの場合と同様に、ｎＳｐＣａｓ９又は足場配列挿入事象によって生成された検出可能なインデルは存在しなかった。アデニン挿入を含有する２つの対立遺伝子が、意図された２２９８Ｔ＞Ｃ及び２３１６Ｃ＞Ａ変異に加えて、それぞれ、０．４％及び０．２％の頻度で逆転写された領域内で同定された。アデニン挿入のそれぞれは、ポリＡトラクトの末端にあり、ＲＴ媒介性ゲノム編集アプローチが、ＲＮＡ鋳型のモノヌクレオチドトラクト上で希少なフレームシフト変異を合成することができることを潜在的に示す。ＲＴＴ内のポリＡトラックの１つを、サイレント２３０７Ａ＞Ｇ変異で破壊することにより、そのポリＡトラック内のアデニンの望ましくない挿入が排除されたことが見出された（図２５Ｅ）。また、２２９８Ｔ＞Ｃ編集効率は、ＲＴＴ長を５４ｎｔに増加させることにより、４１．６％に増加したことも見出された（図２５Ｆ）。最後に、サイレントｐａｍ破壊２３１６Ｃ＞Ａ変異を含まないことが、２２９８Ｔ＞Ｃ編集を２倍にする効率を低下させたことが見出された（図２５Ｇ）。図２５Ａ～２５Ｇのいずれかに示されるグラフデータは、３つの生物学的に独立した試料からの平均±１標準偏差を含み；ＮＳ＝有意ではない（Ｐ＜０．０５；両側スチューデントｔ検定）；ＮＤ＝検出されない。
図２５Ｅ及び図３０に示すように、連続ヌクレオチド（例えば、４＋連続ヌクレオチド）のトラックを分解するために、ＲＴＴにおいて変異がコードされ得る。望ましくない挿入は、同じ塩基を含有する少なくとも４個の連続したヌクレオチドのトラック上で観察された。逆転写酵素は、ＲＴＴにおけるその鋳型配列と比較して、これらのモノヌクレオチドトラック上で希少な挿入を行っていると考えられた。モノヌクレオチドトラックを分解する変異を、同じ塩基の３個以下の連続ヌクレオチドのトラックに組み込むことにより、望ましくない挿入がもはや検出されなくなることが発見された。図２５Ｅの実施例に示されるように、ＲＴＴのポリＡトラック内のサイレント２３０７Ａ＞Ｇ変異をコードすることなく、読み取りのほぼ０．５％は、位置２３０５に望ましくないＡ挿入を含有した。ＲＴＴで検出されなかった望ましくない挿入は、同じ塩基のＲＴＴのポリＡトラックにサイレント２３０７Ａ＞Ｇ変異を含み、ＲＴＴにおいてコードされていない望ましくない編集を排除する
アッシャー症候群のデータのハイライトには以下が含まれる。ＧＰＳは、編集効率を約４倍改善し、オフターゲット効果は観察されず、ＵＳＨ２Ａに望ましくない変異は生じず、４０％を超える編集効率が達成された。
図３１Ａ～３１Ｂは、ｈｔｔ遺伝子においてトリヌクレオチド反復の正確な短縮が達成されたことを示し、ハンチントン病などの疾患を治療するために本明細書に記載されるいくつかのシステム及び方法の適用可能性を実証する。
考察
Ｒｅｗｒｉｔｅｒなどの編集システムは、所与のＣａｓ９標的部位の約７０ｎｔ内にヌクレオチド置換、挿入、欠失、又は複合体配列変化を導入するための標的化された効率的な技術を含み得る。加えて、ＲｅｗｒｉｔｅｒをＡＡＶ内にパッケージングする能力は、幅広い遺伝性疾患を治療するために、安全で組織特異的な送達を可能にすることを約束する。
Ｒｅｗｒｉｔｅｒなどの編集システムは、所与のＣａｓ９標的部位の約７０ｎｔ内にヌクレオチド置換、挿入、欠失、又は複合体配列変化を導入するための標的化された効率的な技術を含み得る。加えて、ＲｅｗｒｉｔｅｒをＡＡＶ内にパッケージングする能力は、幅広い遺伝性疾患を治療するために、安全で組織特異的な送達を可能にすることを約束する。
正確なゲノム編集は、従来的にはＤＳＢの生成に依存しており、このＤＳＢは、一部の場合、染色体全体の喪失を引き起こしさえし得る遺伝毒性病変である。Ｒｅｗｒｉｔｅｒは、通常は比較的無害な修飾である１つの一本鎖ニックのみを生成することによって、いくつかのＤＳＢに関連する安全性の懸念を回避し得る。追加的に、Ｒｅｗｒｉｔｅｒの送達可能性及び安全性は、ＤＳＢを生成することなく、ヒト細胞における標的化された多ヌクレオチド編集に関してこれまで報告された最高の効率である、最大６４％の編集を達成したため、効率性の代償として得られない場合がある。
ＧＰＳは、ｇＲＮＡ伸長の三次構造を制御することによって編集効率及びウィンドウ長を改善し得る新規の成分を、Ｒｅｗｒｉｔｅｒプラットフォーム内に含み得る。ＧＰＳは、編集部位に直接隣接するＰＡＭを必要とする制約を軽減することができ、単一の構築物での複数の病原性変異の修正を可能にし得る。例えば、視力低下につながる第２の最も一般的なＵＳＨ２Ａ変異は、２２７６Ｇ＞Ｔであり得、これは、最も一般的な変異、２２９９ｄｅｌＧからの２３ｎｔであり得る。いくつかの実施形態は、これらの変異のうちの１つを有する患者を治療することができるｇＲＮＡの使用を含む。
ｍｌｖＲＴ変異体のスクリーニングは、より効率的なｍｌｖＲＴ１４Ｍの同定をもたらし、この成分を更に最適化する可能性を強調した。ｍｌｖＲＴ１４Ｍ変異体の不偏ライブラリーを、プールされたフォーマットにおいてＢＦＰからＧＦＰへの変換アッセイによりスクリーニングして、編集を改善し得る。おそらくＳＡＭＨＤ１（Ｔ５９２Ａ）の過剰発現を通じて、低いｄＮＴＰ濃度のＲＴのライブラリーをスクリーニングすることは、ｄＮＴＰが、非分裂細胞を編集するためにＶＰＸの可能性のある必要性を排除するのに十分に低いＫＭを有するバリアントを同定し得る。
非分裂細胞における正確な編集は、従来的に大きな課題であった。ＳＡＭＨＤ１によって引き起こされる編集の制限に対抗するためにＶＰＸを使用して本明細書で提供される結果は、光受容体及びニューロンなどの臨床的に関連する有糸分裂後細胞、又は多くの臓器を構成するゆっくりと分裂する細胞を編集するための経路を提供する。編集のための潜在的な制限因子としてのＳＡＭＨＤ１の同定を考慮すると、ＳＡＭＨＤ１阻害小分子を評価して、細胞ｄＮＴＰ濃度の一過性の増加を提供することができる。
ＡＡＶ送達時に、ＤＳＢを生成せずにヒト細胞のゲノムにおいて標的化された複雑な配列変化を正確に生成することができる第１のシステムとして、Ｒｅｗｒｉｔｅｒを使用して、機能ゲノム研究を進め、ヒト疾患を治療することができる。
方法
一般的な方法：Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）をＤＮＡ増幅のために使用した。ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから得た。プラスミドは、ゴールデンゲートアセンブリ法によって構築した。哺乳動物細胞実験のためのベクターを、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｌｕｓ ｍｉｄｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）又はＺｙｍｏＰＵＲＥ ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して精製した。
一般的な方法：Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）をＤＮＡ増幅のために使用した。ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから得た。プラスミドは、ゴールデンゲートアセンブリ法によって構築した。哺乳動物細胞実験のためのベクターを、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｌｕｓ ｍｉｄｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）又はＺｙｍｏＰＵＲＥ ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して精製した。
一般的な哺乳動物細胞培養：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１６）を培養し、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）及び抗生物質－抗真菌薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（ＤＭＥＭ＋）を補充したダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で継代した。細胞を、５％ＣＯ２で３７℃にて培養した。
トランスフェクション：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、９６ウェルポリ－ｄ－リジンコーティングプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上に播種した。播種の約２４時間後、培地をＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で交換し、各ウェルを、製造業者のプロトコルに従って０．８ｕｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び４００ｎｇの全プラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。培地を、トランスフェクションの６～８時間後にＤＭＥＭ＋で置き換えた。
ＡＡＶパッケージング、収集、及び形質導入：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、Ｒｅｐ／Ｃａｐプラスミド、アデノウイルス遺伝子を含有するヘルパープラスミド、及び反転末端反復に隣接するパッケージングのための意図されたカーゴを含有する移入プラスミドの３つのプラスミドの同時トランスフェクションによって、ＡＡＶを産生するための三重トランスフェクション方法に供した。トランスフェクションは、２５，０００の平均分子量を有する分枝状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Ｓｉｇｍａ ４０８７２７）を使用して行った。トランスフェクションから３日後、細胞を収集し、ＡＡＶｐｒｏ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｍａｘｉ（Ｔａｋａｒａ ６６６６）を使用して精製した。精製したＡＡＶストックの力価を、ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して、ＣＦＸ９６リアルタイムシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）でのｑＰＣＲによって決定した。ＢＦＰ発現ＨＥＫ２９３細胞を、等しい数のＡＡＶ－Ａ及びＡＡＶ－Ｂウイルス粒子と同時形質導入し、ＢＦＰ対ＧＦＰの編集を、フローサイトメトリーによる形質導入の９６～１２０時間後に決定した。
フローサイトメトリー：トランスフェクションの４８時間後、培地を除去し、０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）で細胞を剥離した。トリプシンをＤＭＥＭ＋で中和し、懸濁細胞を丸底９６ウェルプレート中に配置した。Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトモータ（ＴｈｅｒｍｏｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ウェル当たり３０，０００個の細胞の蛍光を分析した。
ハイスループットゲノムＤＮＡ配列決定：目的のゲノム部位をゲノムＤＮＡ試料から増幅し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ上で配列決定した。Ｉｌｌｕｍｉｎａフォワード及びリバースアダプターを含む増幅プライマーを、目的のゲノム領域を増幅するために第１ラウンドのＰＣＲ（ＰＣＲ１）のために使用した。ＰＣＲ１反応（２５μｌ）を、０．５μＭの各フォワード及びリバースプライマー、１μｌのゲノムＤＮＡ抽出物及び１２．５μｌのＰｈｕｓｉｏｎ Ｕ Ｇｒｅｅｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘで行った。ＰＣＲ反応は以下のように実行した。２分間９８℃、次いで［１０秒間９８℃、２０秒間６１℃、及び３０秒間７２℃］の３０サイクル、続いて２分間の最終７２℃の伸長。独自のＩｌｌｕｍｉｎａバーコードプライマー対を、二次ＰＣＲ反応（ＰＣＲ２）において各試料に添加した。具体的には、２５μｌの所与のＰＣＲ２反応は、０．５μＭの各独自のフォワード及びリバースＩｌｌｕｍｉｎａバーコード化プライマー対、１μｌの精製されていないＰＣＲ１反応混合物、及び１２．５μｌのＰｈｕｓｉｏｎ Ｕ Ｇｒｅｅｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ２ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを含有した。バーコード化ＰＣＲ２反応は以下のように実行した。２分間９８℃、次いで［１０秒間９８℃、２０秒間６１℃、及び３０秒間７２℃］の１２サイクル、続いて２分間の最終７２℃の伸長。ＰＣＲ産物を、１．５％アガロースゲル中の電気泳動によって分析的に評価した。ＰＣＲ２産物（共通アンプリコンによってプールした）を、４０μｌの水で溶出するＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、１．５％アガロースゲルで電気泳動によって精製した。ＤＮＡ濃度を、蛍光測定定量（Ｑｕｂｉｔ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）又はｑＰＣＲ（ＫＡＰＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ－Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって測定し、製造業者のプロトコルに従ってＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ機器上で配列決定した。ＭｉＳｅｑ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して配列決定リードを逆多重化した。
ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２４３を使用して、参照配列に対するアンプリコン配列のアラインメントを行った。全てのプライム編集収率定量化について、プライム編集効率を、（インデルを含有しない所望の編集を伴う読み取り数）／（総読み取り数）のパーセンテージとして計算した。点変異編集の定量化のために、ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２を、「インデル読み取りを破棄する（ｄｉｓｃａｒｄ＿ｉｎｄｅｌ＿ｒｅａｄｓ）」をオンにして標準モードで実行した。次いで、点変異の導入のためのプライム編集を、以下のように明示的に計算した。（破棄していない読み取りにおける指定された点変異の頻度）Å～（破棄していない読み取り数）／（全読み取り）。挿入又は欠失編集のために、ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２を、所望の対立遺伝子を、予想される対立遺伝子（ｅフラグ）として使用し、「インデル読み取りを破棄する（ｄｉｓｃａｒｄ＿ｉｎｄｅｌ＿ｒｅａｄｓ）」をオンにして、ＨＤＲモードで実行した。編集収率を以下のように計算した。（ＨＤＲアラインされた読み取り数）／（全読み取り）。インデル収率を以下のように計算した。（読み取りを含むインデル数）／（全読み取り）。
トランスフェクションから３６時間後、０．０５％トリプシンで細胞を剥離し、沈降させ、ＰＢＳで洗浄し、再び沈降させた。細胞ペレットを、１０ｕｌのＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）中に再懸濁し、６５℃で６分間インキュベートした。次に、試料を１５秒間ボルテックスし、９８℃で２分間インキュベートした。１０ｕｌのヌクレアーゼ非含有水を各試料に添加した。４ｕｌの試料を、Ｑ５ポリメラーゼ及び目的のゲノム領域を増幅するように設計したＩｌｌｕｍｉｎａアダプターを含有するプライマーを有するＰＣＲのための鋳型として使用した。次いで、試料を、Ｅｘｏ－ＣＩＰ（ＮＥＢ）で３７℃にて１時間処理した。ＤＮＡ濃度を、Ｑｕｂｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で測定し、試料を、Ａｍｐｌｉｃｏｎ－ＥＺサービスを使用した配列決定のためにＧｅｎｅｗｉｚに送った。ＰＥ－Ａｎａｌｙｚｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｅｔ／ｐｅ－ａｎａｌｙｚｅｒ）を使用して、ハイスループット配列決定データを分析した。任意のゲノム編集成分で形質導入されなかった対照試料中の最高頻度バリアントを検出閾値として設定し、この頻度未満の任意のバリアントを破棄した。２２９８Ｔ＞Ｃ変異を導入する効率を、（２２９８Ｔ＞Ｃ変異のみを含有する読み取り数＋２２９８Ｔ＞Ｃ及び２３１６Ｃ＞Ａ変異のみを含有する読み取り数）／（検出閾値を超える頻度で存在した対立遺伝子の読み取りの総数）として明示的に計算した。
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての専門用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈により明らかにそうではないと指示されない限り、複数の参照を含む。本明細書における「又は」へのいずれかの言及は、特に明記しない限り、「及び／又は」を包含することを意図する。
「少なくとも」、「より大きい」又は「以上」という用語が、一連の２つ以上の数値における第１の数値に先行する場合、「少なくとも」、「より大きい」又は「以上」という用語は、その一連の数値における数値の各々に適用される。例えば、１、２、又は３以上は、１以上、２以上、又は３以上と等価である。
「より多くない」、「未満」、「以下」、又は「多くても」という用語が、一連の２つ以上の数値における第１の数値に先行する場合、「より多くない」、「未満」、又は「以下」、又は「多くても」という用語は、その一連の数値における数値の各々に適用される。例えば、３、２、又は１以下は、３以下、２以下、又は１以下と等価である。
値が範囲として記載される場合、そのような開示は、そのような範囲内の全ての可能な部分範囲、及び特定の数値又は特定の部分範囲が明示的に記載されているかどうかにかかわらず、そのような範囲内に含まれる特定の数値の開示を含むことが理解される。
以下の実施例は、本明細書に記載されるデバイス、方法、システム、及びキットの範囲に対する例示であり、非限定的である。
実施例１
ゲノム編集効率アッセイ
この実施例は、ゲノム編集効率アッセイを記載する。ゲノム編集構築物の正確な編集率は、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）遺伝子を編集して、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を生成する頻度を測定することによって決定した。具体的には、ゲノム的に組み込んだＢＦＰ遺伝子を有する３０，０００個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するＤＭＥＭ中中で、９６ウェルポリ－ｄ－リジン処理プレートに播種した。１２～２４時間後、培地を、ｏｐｔｉ－ｍｅｍ培地で置き換えた。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を使用して、ゲノム編集成分をコードするプラスミドをトランスフェクトした。合計４００ナノグラムのプラスミドＤＮＡを含有する２５マイクロリットルのｏｐｔｉ－ｍｅｍを、０．８マイクロリットルのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を含有する２５マイクロリットルのｏｐｔｉ－ｍｅｍに加えた。２０分後、５０マイクロリットルの混合物を、細胞を含有するウェルに滴加した。６時間後、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭで培地を置き換えた。ＧＦＰ及びＢＦＰレベルを、３６～６０時間後にＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーターを使用して測定した。
ゲノム編集効率アッセイ
この実施例は、ゲノム編集効率アッセイを記載する。ゲノム編集構築物の正確な編集率は、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）遺伝子を編集して、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を生成する頻度を測定することによって決定した。具体的には、ゲノム的に組み込んだＢＦＰ遺伝子を有する３０，０００個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するＤＭＥＭ中中で、９６ウェルポリ－ｄ－リジン処理プレートに播種した。１２～２４時間後、培地を、ｏｐｔｉ－ｍｅｍ培地で置き換えた。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を使用して、ゲノム編集成分をコードするプラスミドをトランスフェクトした。合計４００ナノグラムのプラスミドＤＮＡを含有する２５マイクロリットルのｏｐｔｉ－ｍｅｍを、０．８マイクロリットルのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を含有する２５マイクロリットルのｏｐｔｉ－ｍｅｍに加えた。２０分後、５０マイクロリットルの混合物を、細胞を含有するウェルに滴加した。６時間後、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭで培地を置き換えた。ＧＦＰ及びＢＦＰレベルを、３６～６０時間後にＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーターを使用して測定した。
実施例２
分割ｎＣａｓ９逆転写酵素構築物の編集効率
この実施例は、分割ｎＣａｓ９逆転写酵素構築物の編集効率を記載する。融合ｎＣａｓ９－ｍｌｖＲＴ又は分割ｎＣａｓ９－ＲＴ及びｇＲＮＡのいずれかをコードするプラスミドを調製し、実施例１に記載されるようにトランスフェクトした。各構築物の編集効率を測定した。図１は、ｎＣａｓ９及びＭｏｌｏｎｅｙ白血病ウイルスＲＴ（ｍｌｖＲＴ）を含む融合Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）逆転写酵素（ＲＴ）構築物（「ｎＣａｓ９－ｍｌｖＲＴ」）、並びに分割ｎＣａｓ９－ＬＺ１及びＬＺ２－ｍｌｖＲＴ構築物（「ｍｌｖＲＴ分割スティッチ」）の編集効率を示す。分割スティッチは、Ｒｅｗｒｉｔｅｒ（例えば、ＲＷｂ１）と称されてもよく、又はその逆も同様である。一部の場合、分割スティッチは、Ｒｅｗｒｉｔｅｒ（例えば、ＲＷｂ１）又はＲｅｗｒｉｔｅｒ成分を含み得る。一部の場合、Ｒｅｗｒｉｔｅｒは、分割スティッチ又は分割スティッチ成分を含み得る。ｍｌｖＲＴ分割スティッチは、Ｒｅｗｒｉｔｅｒの成分の例（例えば、ＲＷｂ１）であり得る。分割ｎＣａｓ９－ＬＺ１及びＬＺ２－ｍｌｖＲＴ構築物は、別個のポリペプチド鎖上にｎＣａｓ９－ＬＺ１（配列番号１、ＮＬＳ－ＳｐＣａｓ９（Ｈ８４０Ａ）－ＮＬＳ－ＥＥ１２ＲＲ３４５Ｌ（ロイシンジッパー））及びＬＺ２－ｍｌｖＲＴ（配列番号２、ＲＲ１２ＥＥ３４５Ｌ（ロイシンジッパー）－ｍｌｖＲＴｖ（ｎＣａｓ９－ｍｌｖＲＴ（Ｄ２００Ｎ、Ｌ６０３Ｗ、Ｔ３０６Ｋ、Ｗ３１３Ｆ、Ｔ３３０Ｐ）－ＮＬＳ）を含む。ｎＣａｓ９－ＬＺ１は、ロイシンジッパーを介して、ｍｌｖＲＴ（配列番号１３）及びＮ末端ロイシンジッパー（配列番号２４）を含むＬＺ２－ｍｌｖＲＴとヘテロ二量体化する、ＳｐＣａｓ９（配列番号３２）及びＣ末端ロイシンジッパー（配列番号２３）を含む。ｎＣａｓ９－ｍｌｖＲＴ構築物の概略図は、図の上部に提供される。分割ｎＣａｓ９－ＬＺ１及びＬＺ２－ｍｌｖＲＴ構築物は、融合ｎＣａｓ９－ＲＴ構築物（約２１％の効率）のほぼ２倍の改善された編集効率（約３８％の効率）を示した。
分割ｎＣａｓ９逆転写酵素構築物の編集効率
この実施例は、分割ｎＣａｓ９逆転写酵素構築物の編集効率を記載する。融合ｎＣａｓ９－ｍｌｖＲＴ又は分割ｎＣａｓ９－ＲＴ及びｇＲＮＡのいずれかをコードするプラスミドを調製し、実施例１に記載されるようにトランスフェクトした。各構築物の編集効率を測定した。図１は、ｎＣａｓ９及びＭｏｌｏｎｅｙ白血病ウイルスＲＴ（ｍｌｖＲＴ）を含む融合Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）逆転写酵素（ＲＴ）構築物（「ｎＣａｓ９－ｍｌｖＲＴ」）、並びに分割ｎＣａｓ９－ＬＺ１及びＬＺ２－ｍｌｖＲＴ構築物（「ｍｌｖＲＴ分割スティッチ」）の編集効率を示す。分割スティッチは、Ｒｅｗｒｉｔｅｒ（例えば、ＲＷｂ１）と称されてもよく、又はその逆も同様である。一部の場合、分割スティッチは、Ｒｅｗｒｉｔｅｒ（例えば、ＲＷｂ１）又はＲｅｗｒｉｔｅｒ成分を含み得る。一部の場合、Ｒｅｗｒｉｔｅｒは、分割スティッチ又は分割スティッチ成分を含み得る。ｍｌｖＲＴ分割スティッチは、Ｒｅｗｒｉｔｅｒの成分の例（例えば、ＲＷｂ１）であり得る。分割ｎＣａｓ９－ＬＺ１及びＬＺ２－ｍｌｖＲＴ構築物は、別個のポリペプチド鎖上にｎＣａｓ９－ＬＺ１（配列番号１、ＮＬＳ－ＳｐＣａｓ９（Ｈ８４０Ａ）－ＮＬＳ－ＥＥ１２ＲＲ３４５Ｌ（ロイシンジッパー））及びＬＺ２－ｍｌｖＲＴ（配列番号２、ＲＲ１２ＥＥ３４５Ｌ（ロイシンジッパー）－ｍｌｖＲＴｖ（ｎＣａｓ９－ｍｌｖＲＴ（Ｄ２００Ｎ、Ｌ６０３Ｗ、Ｔ３０６Ｋ、Ｗ３１３Ｆ、Ｔ３３０Ｐ）－ＮＬＳ）を含む。ｎＣａｓ９－ＬＺ１は、ロイシンジッパーを介して、ｍｌｖＲＴ（配列番号１３）及びＮ末端ロイシンジッパー（配列番号２４）を含むＬＺ２－ｍｌｖＲＴとヘテロ二量体化する、ＳｐＣａｓ９（配列番号３２）及びＣ末端ロイシンジッパー（配列番号２３）を含む。ｎＣａｓ９－ｍｌｖＲＴ構築物の概略図は、図の上部に提供される。分割ｎＣａｓ９－ＬＺ１及びＬＺ２－ｍｌｖＲＴ構築物は、融合ｎＣａｓ９－ＲＴ構築物（約２１％の効率）のほぼ２倍の改善された編集効率（約３８％の効率）を示した。
図１１Ａは、プライムエディタ２システム（「ＰＥ２」、上部）、分割プライムエディタ２システム（「分割ＰＥ２」、中央）、及び２つのロイシンジッパーを有する分割スティッチ構築物（「分割スティッチ」、下部）のドメイン配置を示す。右側は、ガイド核酸と複合体化された２つのロイシンジッパー（ＬＺ１及びＬＺ２）によって連結されたＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）及び逆転写酵素（ＲＴ）を含む、分割スティッチ構築物の構造概略図である。分割スティッチ分割ｎＣａｓ９－ＬＺ１及びＬＺ２－ｍｌｖＲＴ構築物は、別個のポリペプチド鎖上にｎＣａｓ９－ＬＺ１（配列番号１、ＮＬＳ－ＳｐＣａｓ９（Ｈ８４０Ａ）－ＮＬＳ－ＥＥ１２ＲＲ３４５Ｌ（ロイシンジッパー））及びＬＺ２－ｍｌｖＲＴ（配列番号２、ＲＲ１２ＥＥ３４５Ｌ（ロイシンジッパー）－ｍｌｖＲＴｖ（ｎＣａｓ９－ｍｌｖＲＴ（Ｄ２００Ｎ、Ｌ６０３Ｗ、Ｔ３０６Ｋ、Ｗ３１３Ｆ、Ｔ３３０Ｐ）－ＮＬＳ）を含む。
実施例３
逆転写酵素動員に対するｇＲＮＡヘアピン挿入物の効果
この実施例は、編集効率に対するｇＲＮＡヘアピン挿入物の効果を記載する。融合ｎＣａｓ９－ｍｌｖＲＴ又は分割ｎＣａｓ９－ＲＴ並びにｍｃｐ－ＲＴ及びｇＲＮＡのいずれかをコードするプラスミドを調製し、実施例１に記載されるようにトランスフェクトした。融合ｎＣａｓ９－ＲＴの編集効率を、ｐｅｇＲＮＡの存在下で測定した。分割ｎＣａｓ９－ＲＴの編集効率を、足場内に埋め込まれたヘアピン（ｇＲＮＡ２．０）又は足場の後に位置する様々な長さのヘアピン（１×長いＭＳ２、１×短いＭＳ２、又は２×短いＭＳ２）のいずれかを有する、３つの異なるｇＲＮＡの存在下で測定した。図２は、融合ｎＣａｓ９－ＲＴ構築物（「ｎＣａｓ９－ｍｌｖＲＴ」）、並びにｎＣａｓ９及び逆転写酵素（配列番号２７）に融合したｍｃｐペプチドを含む、分割ｎＣａｓ９及びｍｃｐ－ｍｌｖＲＴ構築物（「ｍｃｐ－ｍｌｖＲＴｖ」）の編集効率を示す。ｍｃｐペプチドは、ＭＳ２ ＲＮＡヘアピンと相互作用する。分割ｎＣａｓ９及びｍｃｐ－ｍｌｖＲＴ構築物の効率を、ｇＲＮＡ２．０（配列番号３１）、長いＭＳ２ヘアピンを有するｇＲＮＡ（配列番号２８）、「ｇＲＮＡ－１×長いＭＳ２」）、短いＭＳ２ヘアピンを有するｇＲＮＡ（配列番号２９、「ｇＲＮＡ－１×短いＭＳ２」）、又は２つの短いＭＳ２ヘアピンを有するｇＲＮＡ（配列番号３０、「ｇＲＮＡ－２×短いＭＳ２」）を含む異なるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）構築物で試験した。１×長いＭＳ２ヘアピンを有するｇＲＮＡ及び１×短いＭＳ２ヘアピンを有するｇＲＮＡは、ｇＲＮＡ ２．０よりも改善した編集効率を示した。
逆転写酵素動員に対するｇＲＮＡヘアピン挿入物の効果
この実施例は、編集効率に対するｇＲＮＡヘアピン挿入物の効果を記載する。融合ｎＣａｓ９－ｍｌｖＲＴ又は分割ｎＣａｓ９－ＲＴ並びにｍｃｐ－ＲＴ及びｇＲＮＡのいずれかをコードするプラスミドを調製し、実施例１に記載されるようにトランスフェクトした。融合ｎＣａｓ９－ＲＴの編集効率を、ｐｅｇＲＮＡの存在下で測定した。分割ｎＣａｓ９－ＲＴの編集効率を、足場内に埋め込まれたヘアピン（ｇＲＮＡ２．０）又は足場の後に位置する様々な長さのヘアピン（１×長いＭＳ２、１×短いＭＳ２、又は２×短いＭＳ２）のいずれかを有する、３つの異なるｇＲＮＡの存在下で測定した。図２は、融合ｎＣａｓ９－ＲＴ構築物（「ｎＣａｓ９－ｍｌｖＲＴ」）、並びにｎＣａｓ９及び逆転写酵素（配列番号２７）に融合したｍｃｐペプチドを含む、分割ｎＣａｓ９及びｍｃｐ－ｍｌｖＲＴ構築物（「ｍｃｐ－ｍｌｖＲＴｖ」）の編集効率を示す。ｍｃｐペプチドは、ＭＳ２ ＲＮＡヘアピンと相互作用する。分割ｎＣａｓ９及びｍｃｐ－ｍｌｖＲＴ構築物の効率を、ｇＲＮＡ２．０（配列番号３１）、長いＭＳ２ヘアピンを有するｇＲＮＡ（配列番号２８）、「ｇＲＮＡ－１×長いＭＳ２」）、短いＭＳ２ヘアピンを有するｇＲＮＡ（配列番号２９、「ｇＲＮＡ－１×短いＭＳ２」）、又は２つの短いＭＳ２ヘアピンを有するｇＲＮＡ（配列番号３０、「ｇＲＮＡ－２×短いＭＳ２」）を含む異なるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）構築物で試験した。１×長いＭＳ２ヘアピンを有するｇＲＮＡ及び１×短いＭＳ２ヘアピンを有するｇＲＮＡは、ｇＲＮＡ ２．０よりも改善した編集効率を示した。
図１１Ｂは、異なるｇＲＮＡを用いた図１１Ａに示した構築物の編集効率を示す。編集効率を、ＢＦＰをＧＦＰに変換するように編集した細胞の割合（ＧＦＰ＋％）として測定した。編集効率を、ｇＲＮＡ２．０（配列番号３１）、長いＭＳ２ヘアピンを有するｇＲＮＡ（配列番号２８）、「ｇＲＮＡ－１×長いＭＳ２」）、短いＭＳ２ヘアピンを有するｇＲＮＡ（配列番号２９、「ｇＲＮＡ－１×短いＭＳ２」）、又は２つの短いＭＳ２ヘアピンを有するｇＲＮＡ（配列番号３０、「ｇＲＮＡ－２×短いＭＳ２」）を含む異なるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）構築物で試験した。分割スティッチ構築物（この例ではＲＷｂ１）は、プライムエディタ２（ＰＥ２）構築物よりも改善した編集効率を示した。
実施例４
逆転写酵素処理能力を増加させた分割ｎＣａｓ９－ＲＴ構築物
この実施例は、逆転写酵素処理能力を増加させた分割ｎＣａｓ９－ＲＴ構築物を記載する。実施例２に記載される分割ｎＣａｓ９－ＲＴ構築物を更に操作して、逆転写酵素ポリメラーゼ機能の処理能力を増加させた。処理能力を増加させた逆転写酵素は、実施例２に提供される逆転写酵素よりも単一の結合事象において多くの連続したホスホジエステル結合の形成を触媒することができた。処理能力の増加により、より長い鋳型配列の逆転写が促進され、ゲノムの標的部位における、より長い配列の編集が可能になり得る。処理能力が増加した逆転写酵素を有する３つの分割ｎＣａｓ９－ＲＴ構築物の編集効率を試験した。
逆転写酵素処理能力を増加させた分割ｎＣａｓ９－ＲＴ構築物
この実施例は、逆転写酵素処理能力を増加させた分割ｎＣａｓ９－ＲＴ構築物を記載する。実施例２に記載される分割ｎＣａｓ９－ＲＴ構築物を更に操作して、逆転写酵素ポリメラーゼ機能の処理能力を増加させた。処理能力を増加させた逆転写酵素は、実施例２に提供される逆転写酵素よりも単一の結合事象において多くの連続したホスホジエステル結合の形成を触媒することができた。処理能力の増加により、より長い鋳型配列の逆転写が促進され、ゲノムの標的部位における、より長い配列の編集が可能になり得る。処理能力が増加した逆転写酵素を有する３つの分割ｎＣａｓ９－ＲＴ構築物の編集効率を試験した。
図３は、転写処理能力が増加した修飾逆転写酵素を含む、異なる分割ｎＣａｓ９－ＲＴ構築物の編集効率を示す。ｇｅｏｂａｃｉｌｕｓ ｓｔｅｒｅｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＧｓＩ－ＩＩＣＲＴ、配列番号３）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｒｅｃｔａｌｅ（ＥｒＲＴ、配列番号４）、及びＲ２ポリタンパク質（Ｒ２（１１６～１０１６）、配列番号７）からのアミノ酸１１６～１０１６のいずれかからのｎＣａｓ９及び逆転写酵素を含む構築物を試験した。図１及び図２で使用したｍｌｖＲＴ逆転写酵素と比較した、ＧｓＩ－ＩＩＣＲＴ逆転写酵素（「ＳｔｉｔｃｈＲＴ」）の概略図が示される。分割スティッチＲ２（１１６～１０１６）は、試験した転写処理能力が増加した修飾逆転写酵素を含む、３つの分割ｎＣａｓ９及びＲＴ構築物の最も高い編集効率を示した。
実施例５
一本鎖切断における編集効率を増加させるためのｇＲＮＡ
この実施例は、一本鎖切断における編集効率を増加させるためのｇＲＮＡを記載する。ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの３’末端に第２の鎖プライマーを組み込むことによって、一本鎖切断における編集効率を増加させるように設計した。第２の鎖プライマーは、新たに合成した第１の鎖を鋳型として使用して、第２の鎖の合成をプライミングした。第２の鎖合成のプライミングにより、二本鎖切断を形成することなく、一本鎖切断の部位への合成配列の挿入が促進された。二本鎖切断の形成は、望ましくない生成物の形成率を増加させ得る。
一本鎖切断における編集効率を増加させるためのｇＲＮＡ
この実施例は、一本鎖切断における編集効率を増加させるためのｇＲＮＡを記載する。ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの３’末端に第２の鎖プライマーを組み込むことによって、一本鎖切断における編集効率を増加させるように設計した。第２の鎖プライマーは、新たに合成した第１の鎖を鋳型として使用して、第２の鎖の合成をプライミングした。第２の鎖合成のプライミングにより、二本鎖切断を形成することなく、一本鎖切断の部位への合成配列の挿入が促進された。二本鎖切断の形成は、望ましくない生成物の形成率を増加させ得る。
図４Ａは、本開示の操作されたｇＲＮＡを使用したゲノム編集のための方法を示す（「Ｓｔｉｔｃｈ Ｇｕｉｄｅ」）。一部の場合、Ｓｔｉｔｃｈ Ｇｕｉｄｅは、Ｒｅｗｒｉｔｅｒ（例えば、Ｒｅｗｒｉｔｅｒ ３．０、Ｒｅｗｒｉｔｅｒ ３．１、又はＲｅｗｒｉｔｅｒ ３．２）又はＲｅｗｒｉｔｅｒ成分を含み得る。一部の場合、Ｒｅｗｒｉｔｅｒは、Ｓｔｉｔｃｈ Ｇｕｉｄｅ又はＳｔｉｔｃｈ Ｇｕｉｄｅ成分を含み得る。ｇＲＮＡと複合体化したｎＣａｓ９－ＲＴ構築物は、標的部位へのｇＲＮＡのスペーサーのハイブリダイゼーションによって標的核酸の標的部位に動員される。ｎＣａｓ９は、標的部位における標的核酸の鎖をニックする。ｇＲＮＡの第１の鎖プライマー結合部位は、ニックのフラップ５’にハイブリダイズする。ＲＴは、ｇＲＮＡの逆転写酵素鋳型領域を鋳型として使用して、フラップの３’末端から重合する。ｇＲＮＡの３’末端における第２の鎖プライマー（「第２の鎖プライマー」）は、新たに合成されたＤＮＡ鎖の３’末端にハイブリダイズする。４～３００ｂｐの第２の鎖プライマー領域は、第２のＤＮＡ鎖の合成のためのＲＮＡプライマーとして機能する。ＲＴは、新たに合成されたＤＮＡ鎖を鋳型として使用して、ｇＲＮＡの３’末端から重合する。ｇＲＮＡの３’末端上のリボザイムは、第２の鎖プライマー配列のｇＲＮＡ３’を切断する。新たに合成された二本鎖ＤＮＡは、ニック部位において標的核酸に組み込まれ得る。
図４Ｂは、ｐｅｇＲＮＡ ｇＲＮＡ又はＳｔｉｔｃｈ Ｇｕｉｄｅ ｇＲＮＡを使用したｎＣａｓ９－ＲＴ構築物の編集効率を示す。ｐｅｇＲＮＡ及びＳｔｉｔｃｈ Ｇｕｉｄｅ ｇＲＮＡの概略図が左側に示される。Ｓｔｉｔｃｈ Ｇｕｉｄｅ ｇＲＮＡに第２の鎖プライマーを含めることは、第２の鎖プライマーを欠くｐｅｇＲＮＡと比較して編集効率を改善した。このアッセイでは、融合ｎＣａｓ９－ｍｌｖＲＴｖ構築物を使用した。
第２のアッセイでは、分割ｎＣａｓ９－ＲＴ構築物の編集効率に対する第２の鎖プライマー長及び結合部位の効果を試験した。第２の鎖プライマーの長さ、並びに一本鎖切断の位置に対する第２の鎖プライマーの結合位置を変化させた。図５Ａは、第１の鎖プライマー結合部位の５’末端の３’の６ｎｔ、３６ｎｔ、又は５５ｎｔ（「ニックからのｎｔ」）のいずれかに配置された、長さが２０ヌクレオチド（ｎｔ）、４０ｎｔ、又は６０ｎｔの第２の鎖プライマー（ＳＳＰ）を含む異なるｇＲＮＡを有する融合ｎＣａｓ９－ＲＴ構築物（「ｎＣａｓ９－ｍｌｖＲＴｖ」）の編集効率を示す。第２の鎖プライマーを欠くｇＲＮＡを対照として試験した。全てのｇＲＮＡ配列は、ｈｄｖリボザイム（配列番号２５）を含む。図５Ｂは、第１の鎖プライマー結合部位の５’末端の３’の６ｎｔ、３６ｎｔ、又は５５ｎｔ（「ニックからのｎｔ」）のいずれかに配置された、長さが２０ヌクレオチド（ｎｔ）、４０ｎｔ、又は６０ｎｔの第２の鎖プライマー（ＳＳＰ）を含む異なるｇＲＮＡを有するｎＣａｓ９－ＲＴ（「ｎＣａｓ９－Ｒ２（１１６～１０１６）」）の編集効率を示す。第２の鎖プライマーを欠くｇＲＮＡを対照として試験した。ｎＣａｓ９－ｍｌｖＲＴｖ並びにｎＣａｓ９及びＲ２構築物の両方において、より短い（例えば、２０ｎｔ）第２の鎖プライマーを有するｇＲＮＡは、より長い第２の鎖プライマーを有する他のｇＲＮＡと比較して改善された編集効率を示した。
実施例６
編集を改善するための二重ガイドシステム
この例は、編集を改善するための二重ガイドシステムを記載する。近接する反対側の鎖上の２つの標的部位を標的とする２つのｇＲＮＡを含む二重ガイドシステムを細胞内に導入する。各ｇＲＮＡは、それぞれの標的部位にｎＣａｓ９－ＲＴコントラクトを動員し、各標的部位での一本鎖切断を促進する。２つのｇＲＮＡは、送達を改善し、２つの標的部位への共局在化を確実にするために融合される。
編集を改善するための二重ガイドシステム
この例は、編集を改善するための二重ガイドシステムを記載する。近接する反対側の鎖上の２つの標的部位を標的とする２つのｇＲＮＡを含む二重ガイドシステムを細胞内に導入する。各ｇＲＮＡは、それぞれの標的部位にｎＣａｓ９－ＲＴコントラクトを動員し、各標的部位での一本鎖切断を促進する。２つのｇＲＮＡは、送達を改善し、２つの標的部位への共局在化を確実にするために融合される。
図６は、ｎＣａｓ９－ＲＴを有する２つのｇＲＮＡ系を使用したゲノム編集の４つのスキームを示す。２つのガイドがそれぞれ編集された鎖を生成する、２つの単一ガイドシステムにおいて（左上）、各ｇＲＮＡは異なるｎＣａｓ９に結合し、２つのｇＲＮＡはそれぞれ逆転写酵素鋳型領域及びプライマー結合部位（ＰＢＳ）領域を含む。第２のガイドが反対側の鎖をニックする、２つの単一ガイドシステムにおいて（右上）、各ｇＲＮＡは異なるｎＣａｓ９に結合し、ｇＲＮＡのうちの１つのみが逆転写酵素鋳型領域及びプライマー結合部位（ＰＢＳ）領域を含む。２つのガイドがそれぞれ逆転写酵素鋳型領域及びプライマー結合部位（ＰＢＳ）領域を含む二重ガイド複合体システムにおいて（左下）、第１のｇＲＮＡのスペーサーは第１のｎＣａｓ９に結合し、第２のｇＲＮＡのスペーサーは第２のｎＣａｓ９に結合し、第１のｇＲＮＡの足場は第２のｎＣａｓ９に結合し、第２のｇＲＮＡの足場は第１のｎＣａｓ９に結合し、２つのｇＲＮＡはそれぞれ逆転写酵素鋳型領域及びＰＢＳ領域を含む。第２のガイドが反対側の鎖をニックする二重ガイド複合体システムにおいて（右下）、第１のｇＲＮＡのスペーサーは第１のｎＣａｓ９に結合し、第２のｇＲＮＡのスペーサーは第２のｎＣａｓ９に結合し、第１のｇＲＮＡの足場は第２のｎＣａｓ９に結合し、第２のｇＲＮＡの足場は第１のｎＣａｓ９に結合し、ｇＲＮＡの１つのみが逆転写酵素鋳型領域を含む。
図７は、遺伝子編集の効率を増加させるための方法を示す。第２のガイドが反対側の鎖をニックする２つの単一ガイドシステム、又は第２のガイドが反対側の鎖をニックする二重ガイド複合体システムにおいて、反対側の鎖上のニックは、新たに合成されたＤＮＡの標的核酸への組み込みを促進する。第２のガイドは、第１の新たに合成された鎖内の領域に逆相補的なフラップを生成する。第１の合成鎖は、第２の鎖合成のための鋳型として機能する。
青色蛍光タンパク質をコードする標的核酸に終止コドンを導入することによって、２つのｇＲＮＡ系の編集効率を測定した。成功した編集が、ＢＦＰ蛍光の欠如によって識別されたことを除いて、実施例１に記載されるようにアッセイを行った。図１０は、図７に示すような２つのｇＲＮＡ系の編集効率を示す。ＢＦＰについて陰性の細胞のパーセント（「％ＢＦＰ－」）によって測定されるように、編集効率を、細胞のみ（ｇＲＮＡなし）、単一のｇＲＮＡ（３’伸長を欠くｇＲＮＡ２、スタブを有しないｇＲＮＡ１、スタブを有するｇＲＮＡ１）、及び２つのｇＲＮＡ（スタブを有しないｇＲＮＡ１とｇＲＮＡ２、並びにスタブを有するｇＲＮＡ１及びｇＲＮＡ２）について測定した。２つのｇＲＮＡ系は、単一のｇＲＮＡ系と比較して編集効率を増加させた。２つのｇＲＮＡ系のｇＲＮＡ１におけるスタブの存在は、ｇＲＮＡ１におけるスタブを欠く２つのｇＲＮＡ系と比較して、編集効率を増加させた。
実施例７
編集を改善するためのｇＲＮＡ Ｖｅｌｃｒｏ
この実施例は、編集を改善するためのｇＲＮＡ Ｖｅｌｃｒｏを記載する。Ｖｅｌｃｒｏ領域を含むｇＲＮＡは、ｇＲＮＡと、標的核酸中のニックの５’に形成されたフラップとの相互作用を促進することにより、鎖形成の効率を改善した。Ｖｅｌｃｒｏ領域を、逆転写酵素鋳型領域の５’又は第１の鎖プライマービニング部位の３’のいずれかに配置した。ｇＲＮＡ Ｖｅｌｃｒｏ挿入は、実施例２～実施例５に提供される単一ガイドシステム、又は実施例６に提供される二重ガイドシステムと適合性があった。
編集を改善するためのｇＲＮＡ Ｖｅｌｃｒｏ
この実施例は、編集を改善するためのｇＲＮＡ Ｖｅｌｃｒｏを記載する。Ｖｅｌｃｒｏ領域を含むｇＲＮＡは、ｇＲＮＡと、標的核酸中のニックの５’に形成されたフラップとの相互作用を促進することにより、鎖形成の効率を改善した。Ｖｅｌｃｒｏ領域を、逆転写酵素鋳型領域の５’又は第１の鎖プライマービニング部位の３’のいずれかに配置した。ｇＲＮＡ Ｖｅｌｃｒｏ挿入は、実施例２～実施例５に提供される単一ガイドシステム、又は実施例６に提供される二重ガイドシステムと適合性があった。
図８Ａは、３’伸長ガイドＲＮＡ内に逆相補領域を作製することにより、プライマー結合部位及びフラップのハイブリダイゼーション速度を加速させるためのＶｅｌｃｒｏ領域を含むｇＲＮＡを示す。Ｖｅｌｃｒｏ領域は、第１の鎖プライマー結合部位のｇＲＮＡ５’領域に逆相補的である逆転写酵素鋳型領域の５’に配置された５～２００ヌクレオチドを含む。図８Ｂは、３’伸長ガイドＲＮＡ内に逆相補領域を作製することにより、プライマー結合部位及びフラップのハイブリダイゼーション速度を加速させるためのＶｅｌｃｒｏ領域を含むｇＲＮＡを示す。Ｖｅｌｃｒｏ領域は、逆転写酵素鋳型領域の５’領域に逆相補的である第１の鎖プライマー結合部位の３’に位置する５～１００ヌクレオチドを含む。
図１２Ａは、標的核酸のフラップに対するプライマー結合部位（ＰＢＳ）のハイブリダイゼーション速度を加速させるための、Ｖｅｌｃｒｏ領域を有しない（左）又は有する（中央及び右）ｇＲＮＡ構築物を示す。Ｖ１配置において、Ｖｅｌｃｒｏ領域は、ｇＲＮＡの５’末端又はその付近に位置することができ、プライマー結合部位のｇＲＮＡ５’領域（「Ｖｅｌｃｒｏ Ｖ１」、中央）にハイブリダイズすることができる。Ｖ２配置において、Ｖｅｌｃｒｏ領域は、プライマー結合部位の３’に位置することができ、ｇＲＮＡの５’末端又はその付近の領域（「Ｖｅｌｃｒｏ Ｖ２」、右）にハイブリダイズすることができる。
図１２Ｂは、図１２Ａに提供されるｇＲＮＡ構築物の予測される三次元構造を示す。Ｖｅｌｃｒｏ領域を欠くｇＲＮＡを左側に示す。Ｖｅｌｃｒｏ Ｖ１領域又はＶｅｌｃｒｏ Ｖ２領域を含むｇＲＮＡを、それぞれ、中央及び右側のパネルに示す。
図９Ａは、図８Ａ及び図８Ｂに示すように、Ｖｅｌｃｒｏ領域を含むｇＲＮＡ構築物を有するｎＣａｓ９－ＬＺ１及びＬＺ２－ｍｌｖＲＴｖ構築物の編集効率を示す。編集効率は、Ｖｅｌｃｒｏ領域を欠くｇＲＮＡ（「Ｖｅｌｃｒｏなし」）、１、５、若しくは１０ｎｔのギャップ長を有する、逆転写酵素鋳型領域の５’に位置する１５ｎｔのＶｅｌｃｒｏ領域（図８Ａに示すように「Ｖ１」）、又は長さが１０若しくは２０ｎｔのいずれかの第１の鎖プライマー結合部位の３’に位置するＶｅｌｃｒｏ領域（図８Ｂに示すように「Ｖ２」）を使用して比較した。ｇＲＮＡは、１０７ヌクレオチドＲＴ鋳型、及び１３ヌクレオチドプライマー結合部位を含有した。ニックの２ヌクレオチドの３’から開始するＡＴＧＧ配列がＣＡＴＡに変異するように編集を行った。図９Ｂは、図８Ａ及び図８Ｂに示すように、Ｖｅｌｃｒｏ領域を含むｇＲＮＡ構築物を有するｎＣａｓ９－ＬＺ１及びＬＺ２－Ｒ２（１１６～１０１６）構築物の編集効率を示す。編集効率は、Ｖｅｌｃｒｏ領域を欠くｇＲＮＡ（「Ｖｅｌｃｒｏなし」）、Ｖｅｌｃｒｏ結合部位の末端とプライマー結合部位の開始との間の１、５、若しくは１０ｎｔのギャップ長を有する、逆転写酵素鋳型領域の５’に位置する１５ｎｔのＶｅｌｃｒｏ領域（図８Ａに示すように「Ｖ１」）、又は長さが１０若しくは２０ｎｔのいずれかの第１の鎖プライマー結合部位の３’に位置するＶｅｌｃｒｏ領域（図８Ｂに示すように「Ｖ２」）を使用して比較した。両方のｎＣａｓ９－ＲＴ構築物では、Ｖｅｌｃｒｏ領域を含むある特定のｇＲＮＡは、編集効率を増加させた。特に、１ｎｔのギャップ及び２０ｎｔのＶｅｌｃｒｏ ｇＲＮＡを有するＶ１ Ｖｅｌｃｒｏ ｇＲＮＡは、ｎＣａｓ９－ｍｌｖＲＴｖ構築物において編集効率を改善し、１０ｎｔのギャップ及び２０ｎｔのＶ２ Ｖｅｌｃｒｏ ｇＲＮＡを有するＶ１ Ｖｅｌｃｒｏ ｇＲＮＡは、ｎＣａｓ９－Ｒ２構築物において編集効率を改善した。
図１２Ｃは、１２９ヌクレオチドＲＴ鋳型、及び１３ヌクレオチドプライマー結合部位、及び２０ヌクレオチドＶｅｌｃｒｏ領域を有するｇＲＮＡの編集効率を示す。ニックの６５ヌクレオチドの３’から開始するＡＴＧ配列がＣＡＴに変異するように編集を行った。元のｇＲＮＡ（「元のコード」）又は二次構造を除去するためにＲＴ鋳型内のサイレント変異で再コードされたｇＲＮＡ（「再コード」）について編集効率を比較した。サイレント変異を使用した二次構造の除去は、元のＲＴ鋳型と比較して編集効率を改善した。追加的に、Ｖｅｌｃｒｏ領域を含むｇＲＮＡの使用は、ニッキング部位から６５ヌクレオチドの距離での効率的な編集を可能にした。
図１２Ｄは、異なる長さのＶｅｌｃｒｏ配列を有するｇＲＮＡの編集効率を示す。各ｇＲＮＡは、左側の概略図に示すように、５’から３’の順に、ＲＴ鋳型、プライマー結合部位、及びＶｅｌｃｒｏ領域を含有した。編集効率を、ＧＦＰ陽性であった細胞のパーセント（ＧＦＰ＋％）として測定した。ｇＲＮＡは、１２９ヌクレオチドＲＴ鋳型、１３ヌクレオチドプライマー結合部位を有した。ニックの６５ヌクレオチドの３’から開始するＡＴＧ配列がＣＡＴに変異するように編集を行った。ギャップがない３’末端に位置する２０ヌクレオチドのＶｅｌｃｒｏ領域を有するｇＲＮＡは、試験した他のｇＲＮＡよりも高い編集効率を示した。
実施例８
編集システム送達を改善するための保護複合体の同時送達
この実施例は、本明細書で提供される編集システムの送達を改善するための保護複合体の同時発現を記載する。本明細書で提供されるｎＣａｓ９－ＲＴ構築物及び本明細書で提供されるｇＲＮＡが細胞に送達される。ｎＣａｓ９－ＲＴ及びｇＲＮＡは、保護タンパク質複合体をコードするオープンリーディングフレーム配列と同時発現される。保護タンパク質複合体は細胞内で発現され、ｇＲＮＡの分解又は脱アミノ化を防止し、それによって編集システムの送達を改善する。オープンリーディングフレーム配列は、ヒトＯｒｆ１ｐ（配列番号３８）又はマウスＯｒｆ１ｐ（配列番号３９）である。
編集システム送達を改善するための保護複合体の同時送達
この実施例は、本明細書で提供される編集システムの送達を改善するための保護複合体の同時発現を記載する。本明細書で提供されるｎＣａｓ９－ＲＴ構築物及び本明細書で提供されるｇＲＮＡが細胞に送達される。ｎＣａｓ９－ＲＴ及びｇＲＮＡは、保護タンパク質複合体をコードするオープンリーディングフレーム配列と同時発現される。保護タンパク質複合体は細胞内で発現され、ｇＲＮＡの分解又は脱アミノ化を防止し、それによって編集システムの送達を改善する。オープンリーディングフレーム配列は、ヒトＯｒｆ１ｐ（配列番号３８）又はマウスＯｒｆ１ｐ（配列番号３９）である。
実施例９
Ｖｅｌｃｒｏ領域及び第２の鎖プライマーを有するｇＲＮＡによる編集効率の改善
この実施例は、Ｖｅｌｃｒｏ領域及び第２の鎖プライマーを有するｇＲＮＡによる編集効率の改善を記載する。ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの３’末端に第２の鎖プライマー及び第２の鎖プライマーの５’にＶｅｌｃｒｏ領域を組み込むことによって、一本鎖切断における編集効率を増加させるように設計された。第２の鎖プライマーは、新たに合成した第１の鎖を鋳型として使用して、第２の鎖の合成をプライミングした。第２の鎖合成のプライミングにより、二本鎖切断を形成することなく、一本鎖切断の部位への合成配列の挿入が促進された。Ｖｅｌｃｒｏ領域は、ｇＲＮＡと、標的核酸中のニックの５’に形成されたフラップとの相互作用を促進することにより、鎖形成の効率を改善した。
Ｖｅｌｃｒｏ領域及び第２の鎖プライマーを有するｇＲＮＡによる編集効率の改善
この実施例は、Ｖｅｌｃｒｏ領域及び第２の鎖プライマーを有するｇＲＮＡによる編集効率の改善を記載する。ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの３’末端に第２の鎖プライマー及び第２の鎖プライマーの５’にＶｅｌｃｒｏ領域を組み込むことによって、一本鎖切断における編集効率を増加させるように設計された。第２の鎖プライマーは、新たに合成した第１の鎖を鋳型として使用して、第２の鎖の合成をプライミングした。第２の鎖合成のプライミングにより、二本鎖切断を形成することなく、一本鎖切断の部位への合成配列の挿入が促進された。Ｖｅｌｃｒｏ領域は、ｇＲＮＡと、標的核酸中のニックの５’に形成されたフラップとの相互作用を促進することにより、鎖形成の効率を改善した。
図１３Ａは、ｐｅｇＲＮＡ、並びにＶｅｌｃｒｏ領域及び第２の鎖プライマーを含むスティッチｇＲＮＡ（上）、並びにスティッチｇＲＮＡを使用したゲノム編集方法（下）の概略図を示す。ｇＲＮＡと複合体化したｎＣａｓ９－ＲＴ構築物は、標的部位へのｇＲＮＡのスペーサーのハイブリダイゼーションによって標的核酸の標的部位に動員される。ｎＣａｓ９は、標的部位における標的核酸の鎖をニックする。ｇＲＮＡの第１の鎖プライマー結合部位は、ニックのフラップ５’にハイブリダイズする。ＲＴは、ｇＲＮＡの逆転写酵素鋳型領域を鋳型として使用して、フラップの３’末端から重合する。ｇＲＮＡの３’末端における第２の鎖プライマー（「第２の鎖プライマー」）は、新たに合成されたＤＮＡ鎖の３’末端にハイブリダイズする。４～２００ｂｐの第２の鎖プライマー領域は、第２のＤＮＡ鎖の合成のためのＲＮＡプライマーとして機能する。ＲＴは、新たに合成されたＤＮＡ鎖を鋳型として使用して、ｇＲＮＡの３’末端から重合する。ｇＲＮＡの３’末端上のリボザイムは、第２の鎖プライマー配列のｇＲＮＡ３’を切断する。新たに合成された二本鎖ＤＮＡは、ニック部位において標的核酸に組み込まれ得る。
図１３Ｂは、ニッキング部位から様々な距離でハイブリダイズする、様々な長さのｇＲＮＡの第２の鎖プライマー（ＳＳＰ）の編集効率を示す。ニックから６、３６、又は５５ヌクレオチドに位置する第２の鎖プライマーの２０、４０、又は６０ヌクレオチド（ｎｔ）長を試験した。編集効率を、ＧＦＰ陽性であった細胞のパーセント（ＧＦＰ＋％）として測定した。
図１３Ｃは、Ｖｅｌｃｒｏ領域又は第２の鎖プライマーを有しない（「ｖｅｌｃｒｏなし、ＳＳＰなし」）、１９ヌクレオチドのＶｅｌｃｒｏ領域を有する（「１９ｎｔ ｖｅｌｃｒｏ」）、又は１９ヌクレオチドのＶｅｌｃｒｏ領域及び２０ヌクレオチドの第２の鎖プライマーの両方を有する（「１９ｎｔ ｖｅｌｃｒｏ、２０ｎｔ ＳＳＰ」）、ｇＲＮＡの編集効率を示す。Ｖｅｌｃｒｏ領域及び第２の鎖プライマーを欠くｇＲＮＡ、又はＶｅｌｃｒｏ領域を含有するが、第２の鎖プライマーを含有しないｇＲＮＡと比較して、Ｖｅｌｃｒｏ領域及び第２の鎖プライマーの両方を含有するｇＲＮＡを使用した場合、編集効率が増加した。Ｖｅｌｃｒｏ領域及び第２の鎖プライマーの両方を含有するｇＲＮＡを使用して達成された編集効率は、単一のニックから５４％であり、これは、単一のニックからの編集効率についての５０％の予測限界より高かった。
実施例１０
編集効率を増加させるための逆転写酵素タンパク質操作
この実施例は、編集効率を増加させるための逆転写酵素タンパク質操作を記載する。編集効率を改善するために、ｍｌｖＲＴ構築物内で点変異を作製した。変異させた構築物を使用して編集効率を測定した。
編集効率を増加させるための逆転写酵素タンパク質操作
この実施例は、編集効率を増加させるための逆転写酵素タンパク質操作を記載する。編集効率を改善するために、ｍｌｖＲＴ構築物内で点変異を作製した。変異させた構築物を使用して編集効率を測定した。
図１４Ａは、ｍｌｖＲＴ逆転写酵素における変異についてのスクリーニングの結果及びそれらが編集効率に及ぼす影響を示す。５つの点変異（Ｄ２００Ｎ、ｌ６０３Ｗ、Ｔ３３０Ｐ、Ｔ３０６Ｋ、及びＷ３１３Ｆ、配列番号４０）を含有する参照ｍｌｖＲＴ構築物において変異を作製した。アミノ酸残基は、Ｎ末端メチオニン（例えば、配列番号１４）を欠くｍｌｖＲＴ構築物と比較してカウントされる。配列番号４０と比較して、Ｙ８Ｈ、Ｐ５１Ｌ、Ｓ５６Ａ、Ｓ６７Ｒ、Ｅ６９Ｋ、Ｑ８４Ａ、Ｆ１５５Ｙ、Ｔ１９７Ａ、Ｈ２０４Ｒ、Ｔ２４６Ｅ、Ｎ２４９Ｄ、Ｅ２８６Ｒ、Ｑ２９１Ｉ、Ｒ３０１Ｌ、Ｅ３０２Ｋ、Ｆ３０９Ｎ、Ｍ３２０Ｌ、Ｌ４３５Ｇ、Ｄ５２４Ａ、Ｄ５２４Ｇ、Ｄ５２４Ｎ、Ｅ５６２Ｄ、Ｋ５７１Ｒ、Ｄ５８３Ｎ、Ｙ５８６Ｓ、Ｈ５９４Ｑ、Ｈ６３８Ｇ、Ｄ６５３Ｎ、Ｔ６６４Ｎ、又はＬ６７１Ｐの単一点変異（それぞれ、配列番号４１～配列番号７０）を含有するｍｌｖＲＴ構築物を試験した。編集効率を、ＧＦＰ陽性であった細胞のパーセント（ＧＦＰ＋％）として測定した。８５ヌクレオチドのＲＴ鋳型、１３ヌクレオチドのプライマー結合部位、１ヌクレオチドのギャップ、１９ヌクレオチドのＶｅｌｃｒｏ領域、及び２０ヌクレオチドの第２の鎖プライマーを有するｇＲＮＡを使用して編集を行い、ニックの２ヌクレオチドの３’から開始するＡＴＧＧ配列がＣＡＴＡに変異するように部位を編集した。Ｑ８４Ａ（配列番号４６）、Ｔ１９７Ａ（配列番号４８）、Ｄ６５３Ｎ（配列番号６８）、Ｔ６６４Ｎ（配列番号６９）、又はＬ６７１Ｐ（配列番号７０）を含有する変異体は、配列番号４０と比較して有意に増加した編集効率を示した。
図１４Ｂは、ｍｌｖＲＴ逆転写酵素における変異の組み合わせに関するスクリーニングの結果及びそれらが編集効率に及ぼす影響を示す。５つの点変異（Ｄ２００Ｎ、ｌ６０３Ｗ、Ｔ３３０Ｐ、Ｔ３０６Ｋ、及びＷ３１３Ｆ、配列番号４０）を含有する参照ｍｌｖＲＴ構築物において変異を作製した。アミノ酸残基は、Ｎ末端メチオニン（例えば、配列番号１４）を欠くｍｌｖＲＴ構築物と比較してカウントされる。配列番号４０と比較して、Ｔ１９７Ａ及びＤ６５３Ｎ；Ｔ１９７Ａ及びＴ６６４Ｎ；Ｔ１９７Ａ及びＬ６７１Ｐ；Ｔ１９７Ａ、Ｄ６５３Ｎ、Ｔ６６４Ｎ及びＬ６７１Ｐ；又はＰ５１Ｌ、Ｓ６７Ｒ、Ｔ１９７Ａ、Ｈ２０４Ｒ、Ｌ４３５Ｇ、Ｄ５２４Ａ、Ｄ６５３Ｎ、Ｔ６６４Ｎ及びＬ６７１Ｐ（それぞれ、配列番号７１～配列番号７５）を含有するｍｌｖＲＴ構築物を試験した。編集効率を、ＧＦＰ陽性であった細胞のパーセント（ＧＦＰ＋％）として測定した。８５ヌクレオチドのＲＴ鋳型、１３ヌクレオチドのプライマー結合部位、１９ヌクレオチドのＶｅｌｃｒｏ領域、及び２０ヌクレオチドの第２の鎖プライマーを有するｇＲＮＡを使用して編集を行い、ニックの２ヌクレオチドの３’から開始するＡＴＧＧ配列がＣＡＴＡに変異するように部位を編集した。Ｐ５１Ｌ、Ｓ６７Ｒ、Ｔ１９７Ａ、Ｈ２０４Ｒ、Ｌ４３５Ｇ、Ｄ５２４Ａ、Ｄ６５３Ｎ、Ｔ６６４Ｎ及びＬ６７１Ｐ点変異（配列番号７５）を含有する構築物は、試験した構築物の最高の編集効率を示した。
図１５Ｃは、ｍｌｖＲＴ逆転写酵素構築物の編集効率を示す。５つの点変異（Ｄ２００Ｎ、ｌ６０３Ｗ、Ｔ３３０Ｐ、Ｔ３０６Ｋ、及びＷ３１３Ｆ、配列番号４０）を含有する参照ｍｌｖＲＴ構築物において変異を作製した。アミノ酸残基は、Ｎ末端メチオニン（例えば、配列番号１４）を欠くｍｌｖＲＴ構築物と比較してカウントされる。配列番号４０と比較して、Ｖ２２３Ａ、Ｖ２２３Ｍ、Ｑ２２１Ｒ及びＶ２２３Ａ、又はＱ２２１Ｒ及びＶ２２３Ｍ（それぞれ、配列番号７７～配列番号８０）を含有するｍｌｖＲＴ構築物を試験した。編集効率を、ＧＦＰ陽性であった細胞のパーセント（ＧＦＰ＋％）として測定した。１２９ヌクレオチドのＲＴ鋳型、１３ヌクレオチドのプライマー結合部位、１９ヌクレオチドのＶｅｌｃｒｏ領域、及び２０ヌクレオチドの第２の鎖プライマーを有するｇＲＮＡを使用して編集を行い、ニックの６５ヌクレオチドの３’から開始するＡＴＧ配列がＣＡＴに変異するように部位を編集した。Ｖ２２３Ａ点変異は、ニッキング部位と比較した距離において編集効率を増加させた。
実施例１１
編集効率を増加させるためのｄＮＴＰの利用可能性の増加
この実施例は、Ｃａｓ９－ＲＴ構築物の編集効率を増加させるために、細胞内のｄＮＴＰの利用可能性を増加させるための方法を記載する。細胞内の低い編集効率に寄与し得る１つの要因は、ｄＮＴＰの限定された利用可能性である。図１５Ａは、編集効率を増加させるために、細胞内のｄＮＴＰの利用可能性を増加させる方法を示す。ＣＤＫ１を欠く非分裂細胞において、非リン酸化ＳＡＭＨＤ１はｄＮＴＰを切断し、細胞内で利用可能なｄＮＴＰを減少させる。分裂細胞において、ＣＤＫ１はＳＡＭＨＤ１をリン酸化し、ＳＡＭＨＤ１がｄＮＴＰを切断することを防止し、細胞内のｄＮＴＰの利用可能性の増加をもたらす。ＳＡＭＨＤ１における単一の点変異（Ｔ５９２Ａ）は、ＣＤＫ１によるＳＡＭＨＤ１のリン酸化を防止し、構成的に活性なＳＡＭＨＤ１及び細胞内のｄＮＴＰの利用可能性の低下をもたらす。Ｔ５９２Ａ変異体ＳＡＭＨＤ１を使用して、図１５Ｂ、図１５Ｄ、及び図１５Ｅに示されるアッセイにおいて低いｄＮＴＰ環境を誘導した。Ｖｐｘの添加はＳＡＭＨＤ１を阻害し、細胞内のｄＮＴＰの利用可能性の増加をもたらす。低い細胞ｄＮＴＰが編集効率に及ぼす影響を試験するために、構成的に活性なＳＡＭＨＤ１をＣａｓ９－ＲＴ構築物と同時発現させ、編集効率を測定した。
編集効率を増加させるためのｄＮＴＰの利用可能性の増加
この実施例は、Ｃａｓ９－ＲＴ構築物の編集効率を増加させるために、細胞内のｄＮＴＰの利用可能性を増加させるための方法を記載する。細胞内の低い編集効率に寄与し得る１つの要因は、ｄＮＴＰの限定された利用可能性である。図１５Ａは、編集効率を増加させるために、細胞内のｄＮＴＰの利用可能性を増加させる方法を示す。ＣＤＫ１を欠く非分裂細胞において、非リン酸化ＳＡＭＨＤ１はｄＮＴＰを切断し、細胞内で利用可能なｄＮＴＰを減少させる。分裂細胞において、ＣＤＫ１はＳＡＭＨＤ１をリン酸化し、ＳＡＭＨＤ１がｄＮＴＰを切断することを防止し、細胞内のｄＮＴＰの利用可能性の増加をもたらす。ＳＡＭＨＤ１における単一の点変異（Ｔ５９２Ａ）は、ＣＤＫ１によるＳＡＭＨＤ１のリン酸化を防止し、構成的に活性なＳＡＭＨＤ１及び細胞内のｄＮＴＰの利用可能性の低下をもたらす。Ｔ５９２Ａ変異体ＳＡＭＨＤ１を使用して、図１５Ｂ、図１５Ｄ、及び図１５Ｅに示されるアッセイにおいて低いｄＮＴＰ環境を誘導した。Ｖｐｘの添加はＳＡＭＨＤ１を阻害し、細胞内のｄＮＴＰの利用可能性の増加をもたらす。低い細胞ｄＮＴＰが編集効率に及ぼす影響を試験するために、構成的に活性なＳＡＭＨＤ１をＣａｓ９－ＲＴ構築物と同時発現させ、編集効率を測定した。
図１５Ｂは、細胞内のｄＮＴＰの利用可能性を減少させるための、構成的に活性なＳＡＭＨＤ１（ＳＡＭＨＤ１（Ｔ５９２Ａ））の存在下又は不在下におけるｍｌｖＲＴ逆転写酵素構築物の編集効率を示す。５つの点変異（Ｄ２００Ｎ、ｌ６０３Ｗ、Ｔ３３０Ｐ、Ｔ３０６Ｋ、及びＷ３１３Ｆ、配列番号４０）を含有する参照ｍｌｖＲＴ構築物において変異を作製した。アミノ酸残基は、Ｎ末端メチオニン（例えば、配列番号１４）を欠くｍｌｖＲＴ構築物と比較してカウントされる。配列番号４０と比較して、Ｑ２２１Ｒ、Ｖ２２３Ａ、Ｖ２２３Ｍ、Ｑ２２１Ｒ及びＶ２２３Ａ、又はＱ２２１Ｒ及びＶ２２３Ｍ（それぞれ、配列番号７６～配列番号８０）を含有するｍｌｖＲＴ構築物を試験した。編集効率を、ＧＦＰ陽性であった細胞のパーセント（ＧＦＰ＋％）として測定した。８５ヌクレオチドのＲＴ鋳型、１３ヌクレオチドのプライマー結合部位、１９ヌクレオチドのＶｅｌｃｒｏ領域、及び２０ヌクレオチドの第２の鎖プライマーを有するｇＲＮＡを使用して編集を行い、ニックの２ヌクレオチドの３’から開始するＡＴＧＧ配列がＣＡＴＡに変異するように部位を編集した。構成的に活性なＳＡＭＨＤ１の発現は、試験した全ての構築物の編集効率を低下させた。
構成的に活性なＳＡＭＨＤ１を発現する細胞における編集効率を救うために、Ｖｐｘペプチド（配列番号８２）も細胞内で発現させた。図１５Ｄは、ＳＡＭＨＤ１を阻害するために、細胞内で、Ｖｐｘ（配列番号８２）を有する又は有しない、ｄＮＴＰの利用可能性を減少させるための、構成的に活性なＳＡＭＨＤ１（ＳＡＭＨＤ１（Ｔ５９２Ａ））の存在下又は不在下におけるｍｌｖＲＴ逆転写酵素の編集効率を示す。編集効率を、ＧＦＰ陽性であった細胞のパーセント（ＧＦＰ＋％）として測定した。８５ヌクレオチドのＲＴ鋳型、１３ヌクレオチドのプライマー結合部位、１９ヌクレオチドのＶｅｌｃｒｏ領域、及び２０ヌクレオチドの第２の鎖プライマーを有するｇＲＮＡを使用して編集を行い、ニックの２ヌクレオチドの３’から開始するＡＴＧＧ配列がＣＡＴＡに変異するように部位を編集した。
図１５Ｅは、ＳＡＭＨＤ１を阻害するために、細胞内で、Ｖｐｘ（配列番号８２）を有する又は有しない、ｄＮＴＰの利用可能性を減少させるための、構成的に活性なＳＡＭＨＤ１（ＳＡＭＨＤ１（Ｔ５９２Ａ））の存在下又は不在下におけるｍｌｖＲＴ逆転写酵素の編集効率を示す。編集効率を、ＧＦＰ陽性であった細胞のパーセント（ＧＦＰ＋％）として測定した。１２９ヌクレオチドのＲＴ鋳型、１３ヌクレオチドのプライマー結合部位、１９ヌクレオチドのＶｅｌｃｒｏ領域、及び２０ヌクレオチドの第２の鎖プライマーを有するｇＲＮＡを使用して編集を行い、ニックの６５ヌクレオチドの３’から開始するＡＴＧ配列がＣＡＴに変異するように部位を編集した。細胞内でのＶｐｘの発現は、構成的に活性なＳＡＭＨＤ１を発現する細胞、及び構成的に活性なＳＡＭＨＤ１を発現しない細胞の両方において編集効率を増加させた。追加的に、Ｖｐｘは、ニッキング部位からの短い距離の部位（図１５Ｄ）及びニッキング部位からの長い距離（図１５Ｅ）において編集効率を増加させた。
実施例１２
スプリットＣａｓ９構築物の細胞発現のためのインテイン
この実施例は、Ｃａｓ９構築物の細胞発現のためのインテインの使用を記載する。第１のアッセイでは、ニッキングＣａｓ９（ｎＣａｓ９）点変異のスクリーニングを行って、ｎＣａｓ９のＣ末端部分における、システイン残基の置換を導く位置を識別した。システイン点変異を、ロイシンジッパーを介して連結されたｎＣａｓ９－ＲＴ構築物との関連でスクリーニングした。システインを、ｎＣａｓ９のＣ末端部分に異なる点で挿入して、ｎＣａｓ９及び逆転写酵素複合配列の中央に向かって配置されたシステイン残基を有する構築物を生成した。システイン残基は、挿入されたシステインまでのＮ末端からのＣａｓ９タンパク質の一部、並びに挿入されたシステインから、及びそれを含み、Ｃ末端までのＣａｓ９タンパク質の一部のそれぞれに加えて、逆転写酵素が、インテイン融合物として発現したときにＡＡＶベクターに適合するのに十分に小さいように配置された。ロイシンジッパー連結ｎＣａｓ９－ＲＴシステイン変異体の編集効率を比較した。
スプリットＣａｓ９構築物の細胞発現のためのインテイン
この実施例は、Ｃａｓ９構築物の細胞発現のためのインテインの使用を記載する。第１のアッセイでは、ニッキングＣａｓ９（ｎＣａｓ９）点変異のスクリーニングを行って、ｎＣａｓ９のＣ末端部分における、システイン残基の置換を導く位置を識別した。システイン点変異を、ロイシンジッパーを介して連結されたｎＣａｓ９－ＲＴ構築物との関連でスクリーニングした。システインを、ｎＣａｓ９のＣ末端部分に異なる点で挿入して、ｎＣａｓ９及び逆転写酵素複合配列の中央に向かって配置されたシステイン残基を有する構築物を生成した。システイン残基は、挿入されたシステインまでのＮ末端からのＣａｓ９タンパク質の一部、並びに挿入されたシステインから、及びそれを含み、Ｃ末端までのＣａｓ９タンパク質の一部のそれぞれに加えて、逆転写酵素が、インテイン融合物として発現したときにＡＡＶベクターに適合するのに十分に小さいように配置された。ロイシンジッパー連結ｎＣａｓ９－ＲＴシステイン変異体の編集効率を比較した。
図１６は、ニッキング活性のために修飾され、ロイシンジッパーを介して逆転写酵素に連結されたＣａｓ９構築物の編集効率を示す。Ｓ．Ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（「ＳｐＣａｓ９」）構築物は、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）を産生するためにＨ８４０Ａ変異を含有した。システイン残基を、Ｄ１０７９Ｃ、Ｓ１１７３Ｃ、又はＤ１１８０ＣのいずれかでＣａｓ９ニッカーゼに導入して、Ｃａｓ９を分割インテインＣａｓ９（ｉＣａｓ９）に分割して、エクステイン－インテイン融合物として発現させることを可能にした。Ｈ８４０Ａ及びＤ１０７９Ｃ（ロイシンジッパーを有する配列番号８５）、Ｈ８４０Ａ及びＳ１１７３Ｃ（ロイシンジッパーを有する配列番号８６）、又はＨ８４０Ａ及びＤ１１８０Ｃ（ロイシンジッパーを有する配列番号８７）点変異を含有し、ｍｌｖＲＴ５Ｍ（ロイシンジッパーを有する配列番号４０）に連結されたロイシンジッパーＣａｓ９構築物を試験した。Ｈ８４０Ａ変異を含有したが、ｍｌｖＲＴ５Ｍ（ロイシンジッパーを有する配列番号４０）に連結した更なるシステイン（ロイシンジッパーを有する配列番号８４）を含有しないＣａｓ９ニッカーゼを対照として使用した。編集効率を、ＧＦＰ陽性であった細胞のパーセント（ＧＦＰ＋％）として測定した。８５ヌクレオチドのＲＴ鋳型、１３ヌクレオチドのプライマー結合部位、１９ヌクレオチドのＶｅｌｃｒｏ領域、及び２０ヌクレオチドの第２の鎖プライマーを有するｇＲＮＡを使用して編集を行い、ニックの２ヌクレオチドの３’から開始するＡＴＧＧ配列がＣＡＴＡに変異するように部位を編集した。
第２のアッセイでは、第１のアッセイで識別したシステイン点変異を利用して、分割インテインＣａｓ９構築物を生成した。２つのエクステイン－インテイン融合物として発現される、識別されたＳ１１７３Ｃ変異を含むｎＣａｓ９－ＲＴ融合物の編集効率を試験した。ｎＣａｓ９－ＲＴ融合物は、ｍｌｖＲＴ５Ｍ（配列番号４０）に融合したＳ１１７３Ｃ点変異（配列番号８６）を有するｎＣａｓ９を含有した。融合タンパク質の第１のセグメントは、第１のプラスミドベクターにおいて第１のインテイン融合物であるｎＣａｓ９（１～１１７２）－Ｎｐｕ Ｎインテイン（配列番号９０）として発現させ、融合タンパク質の第２のセグメントは、第２のプラスミドベクターにおいて発現される第２のインテイン融合物であるＮｐｕ Ｃインテイン－ｎＣａｓ９（Ｓ１１７３Ｃを有する１１７３～１３６８）－ｍｌｖＲＴ５Ｍ（配列番号９１）として発現させた。インテインドメインの自己触媒活性は、ｎＣａｓ９（１～１１７２）エクステインをｎＣａｓ９（Ｓ１１７３Ｃを有する１１７３～１３６８）－ｍｌｖＲＴ５Ｍエクステインに融合させ、Ｎｐｕ Ｎ（配列番号８８）及びＮｐｕ Ｃ（配列番号８９）インテインを切除して、融合ｎＣａｓ９（Ｓ１１７３Ｃ）－ｍｌｖＲＴ５Ｍ構築物（配列番号９２）を形成した。分割インテインｎＣａｓ９構築物の編集効率を、ニッキング部位に対する２つの位置で試験した。
図１７Ａは、ニッキング活性のために修飾され、逆転写酵素に融合され、２つのエクステイン－インテイン融合タンパク質として発現される分割インテインＣａｓ９（ｉＣａｓ９）Ｓ１１７３Ｃ構築物の編集効率を示す。ｎＣａｓ９－ＲＴ構築物のＮ末端領域は、ｎＣａｓ９（１～１１７２）－Ｎｐｕ Ｎインテイン（配列番号９０）として発現し、ｎＣａｓ９－ＲＴ構築物のＣ末端領域は、Ｎｐｕ Ｃインテイン－ｎＣａｓ９（Ｓ１１７３Ｃを有する１１７３～１３６８）－ｍｌｖＲＴ５Ｍ（配列番号９１）として発現した。分割インテインＣａｓ９－ＲＴ構築物（右の棒グラフ）の編集効率を、ロイシンジッパー分割Ｃａｓ９構築物（配列番号１及び配列番号２、左の棒グラフ）と比較した。編集効率を、ＧＦＰ陽性であった細胞のパーセント（ＧＦＰ＋％）として測定した。８５ヌクレオチドのＲＴ鋳型、１３ヌクレオチドのプライマー結合部位、１９ヌクレオチドのＶｅｌｃｒｏ領域、及び２０ヌクレオチドの第２の鎖プライマーを有するｇＲＮＡを使用して編集を行い、ニックの２ヌクレオチドの３’から開始するＡＴＧＧ配列がＣＡＴＡに変異するように部位を編集した。
図１７Ｂは、ニッキング活性のために修飾され、逆転写酵素に融合され、２つのエクステイン－インテイン融合タンパク質として発現される分割インテインＣａｓ９（ｉＣａｓ９）Ｓ１１７３Ｃ構築物の編集効率を示す。ｎＣａｓ９－ＲＴ構築物のＮ末端領域は、ｎＣａｓ９（１～１１７２）－Ｎｐｕ Ｎインテイン（配列番号９０）として発現し、ｎＣａｓ９－ＲＴ構築物のＣ末端領域は、Ｎｐｕ Ｃインテイン－ｎＣａｓ９（Ｓ１１７３Ｃを有する１１７３～１３６８）－ｍｌｖＲＴ５Ｍ（配列番号９１）として発現した。分割インテインＣａｓ９－ＲＴ構築物（右の棒グラフ）の編集効率を、ロイシンジッパー分割Ｃａｓ９構築物（配列番号１及び配列番号２、左の棒グラフ）と比較した。編集効率を、ＧＦＰ陽性であった細胞のパーセント（ＧＦＰ＋％）として測定した。８５ヌクレオチドのＲＴ鋳型、１３ヌクレオチドのプライマー結合部位、１９ヌクレオチドのＶｅｌｃｒｏ領域、及び２０ヌクレオチドの第６５の鎖プライマーを有するｇＲＮＡを使用して編集を行い、ニックの２ヌクレオチドの３’から開始するＡＴＧ配列がＣＡＴに変異するように部位を編集した。
結果は、分割インテインＣａｓ９－ＲＴ融合構築物が、ロイシンジッパー分割Ｃａｓ９構築物と比較して堅牢な編集効率を示したことを示した。
実施例１３
編集効率を改善するためのｇＲＮＡの３’修飾
この実施例は、編集効率を改善するためのｇＲＮＡの３’修飾を記載する。鋳型領域に１００％相補的であり、３’末端に位置する第２の鎖プライマーを有するｇＲＮＡは、プライミング機能を阻害する、第２の鎖プライマーの３’にすぐ隣接したポリ－Ｕ配列で転写され得る。この問題を解決するために、第２の鎖プライマーの３’に位置する切断可能なＲＮＡ配列を有するｇＲＮＡを開発して、第２の鎖プライマーの３’末端にポリ－Ｕ配列を形成することを防止した。ＨＤＶ自己切断リボザイム又は第２の鎖プライマーの３’に位置するｔＲＮＡのいずれかを有するｇＲＮＡを試験した。
編集効率を改善するためのｇＲＮＡの３’修飾
この実施例は、編集効率を改善するためのｇＲＮＡの３’修飾を記載する。鋳型領域に１００％相補的であり、３’末端に位置する第２の鎖プライマーを有するｇＲＮＡは、プライミング機能を阻害する、第２の鎖プライマーの３’にすぐ隣接したポリ－Ｕ配列で転写され得る。この問題を解決するために、第２の鎖プライマーの３’に位置する切断可能なＲＮＡ配列を有するｇＲＮＡを開発して、第２の鎖プライマーの３’末端にポリ－Ｕ配列を形成することを防止した。ＨＤＶ自己切断リボザイム又は第２の鎖プライマーの３’に位置するｔＲＮＡのいずれかを有するｇＲＮＡを試験した。
ＨＤＶ自己切断リボザイムは、ｇＲＮＡの３’末端からそれ自体を自己触媒的に切断し、第２の鎖プライマーをポリ－Ｕ配列なしに残した。ＨＤＶリボザイムは、第２の鎖プライマーのプライマー伸長を阻害した第２の鎖プライマーの３’末端に２’３’環状リン酸を残した。内因性ポリヌクレオチドキナーゼは、２’３’環状リン酸を３’ＯＨに変換して、プライマー伸長を可能にした。ｔＲＮＡを、内因性ＲＮａｓｅ Ｐによって第２の鎖プライマーの３’末端から切断し、ポリ－Ｕ配列及びプライマー伸長可能な３’ＯＨを有しない第２の鎖プライマーを残した。
図１８は、第２の鎖プライマーの３’にすぐ隣接した、ｇＲＮＡの３’末端にＨＤＶリボザイム（左の棒グラフ）又はｔＲＮＡ（右の棒グラフ）のいずれかを含むｇＲＮＡの存在下でのロイシンジッパーＣａｓ９－ＲＴ構築物の編集効率を示す。ロイシンジッパーＣａｓ９－ＲＴ構築物を、ｎＣａｓ９－ＬＺ１（配列番号１）及びＬＺ２－ｍｌｖＲＴ５Ｍ（配列番号２）として発現させ、ロイシンジッパーを介して連結した。ｔＲＮＡは、配列番号９４に対応する配列を有した。８５ヌクレオチドのＲＴ鋳型、１３ヌクレオチドのプライマー結合部位、１９ヌクレオチドのＶｅｌｃｒｏ領域、２０ヌクレオチドの第２の鎖プライマー、及び第２の鎖プライマーのＨＤＶリボザイム又はｔＲＮＡ３’のいずれかを有するｇＲＮＡを使用して編集を行い、ニックの２ヌクレオチドの３’から開始するＡＴＧＧ配列がＣＡＴＡに変異するように部位を編集した。
実施例１４
ＧＰＳアシストリーチオーバーｇＲＮＡ（ＧＡＲＧ）及びＧＰＳ動員ガイド（ＧＲＧ）
ＧＰＳアシストリーチオーバーｇＲＮＡ（ＧＡＲＧ）は、例えば、単一ガイド核酸システムが、編集を含まないゲノム鎖を十分に置換しない所望の編集を含有するフラップを別様で生成する場合に、遺伝子編集効率を改善し得る。ＧＡＲＧは、ゲノムへの伸長フラップのハイブリダイゼーションを促進するために有用であり得、それを置き換えることを意図するゲノム鎖の近傍に、伸長フラップの３’末端を固定し得る。図３３は、二重ガイドシステムからのデータを示す。２つの別個のＧＡＲＧを試験し、哺乳動物細胞の標的核酸における遺伝子編集の成功をもたらした。したがって、ＧＡＲＧ及びＧＲＧを含む二重ガイドシステムを用いる方法は、哺乳動物細胞などの細胞において正確なゲノム編集をもたらし得る。
ＧＰＳアシストリーチオーバーｇＲＮＡ（ＧＡＲＧ）及びＧＰＳ動員ガイド（ＧＲＧ）
ＧＰＳアシストリーチオーバーｇＲＮＡ（ＧＡＲＧ）は、例えば、単一ガイド核酸システムが、編集を含まないゲノム鎖を十分に置換しない所望の編集を含有するフラップを別様で生成する場合に、遺伝子編集効率を改善し得る。ＧＡＲＧは、ゲノムへの伸長フラップのハイブリダイゼーションを促進するために有用であり得、それを置き換えることを意図するゲノム鎖の近傍に、伸長フラップの３’末端を固定し得る。図３３は、二重ガイドシステムからのデータを示す。２つの別個のＧＡＲＧを試験し、哺乳動物細胞の標的核酸における遺伝子編集の成功をもたらした。したがって、ＧＡＲＧ及びＧＲＧを含む二重ガイドシステムを用いる方法は、哺乳動物細胞などの細胞において正確なゲノム編集をもたらし得る。
本開示の好ましい実施形態が本明細書に示され、記載されているが、そのような実施形態が例としてのみ提供されることは、当業者には明白であろう。本開示から逸脱することなく、多数の変形、変更、及び置換がここで当業者に想起されるであろう。本明細書に記載される本開示の実施形態に対する様々な代替案が、本開示の実施において用いられ得ることは理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は、本開示の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲及びそれらの等価物の範囲内の方法及び構造が、それらによって包含されることが意図される。
Claims (131)
- 低いデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）濃度を有し、遺伝子編集のためのＤＮＡポリメラーゼを含む細胞内で遺伝子編集効率を増加させる方法であって、前記方法が、
ベースラインｄＮＴＰ濃度と比較して、前記細胞内の前記ｄＮＴＰ濃度を増加させることを含む、方法。 - 前記細胞内の前記ｄＮＴＰ濃度を増加させることが、前記細胞内のデオキシヌクレオチド三リン酸トリホスホヒドロラーゼを阻害することを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記デオキシヌクレオチド三リン酸トリホスホヒドロラーゼが、ＳＡＭドメイン及びＨＤドメイン含有タンパク質１（ＳＡＭＨＤ１）を含む、請求項２に記載の方法。
- ＳＡＭＨＤ１を阻害することが、前記ＳＡＭＨＤ１をＶｐｘタンパク質と接触させること、又は前記Ｖｐｘタンパク質を前記細胞内で発現させることを含む、請求項３に記載の方法。
- ＳＡＭＨＤ１を阻害することが、前記ＳＡＭＨＤ１をＢＧＬＦ４タンパク質と接触させること、又は前記ＢＧＬＦ４タンパク質を前記細胞内で発現させることを含む、請求項３に記載の方法。
- ＳＡＭＨＤ１を阻害することが、前記ＳＡＭＨＤ１をコードするｍＲＮＡを、前記ｍＲＮＡにハイブリダイズするマイクロＲＮＡ若しくはｓｉＲＮＡと接触させること、又は前記マイクロＲＮＡ若しくはｓｉＲＮＡを前記細胞内で発現させることを含む、請求項３に記載の方法。
- ＳＡＭＨＤ１を阻害することが、前記ＳＡＭＨＤ１を小分子ＳＡＭＨＤ１阻害剤と接触させることを含む、請求項３に記載の方法。
- 前記細胞内の前記ｄＮＴＰ濃度を増加させることが、前記細胞にヌクレオシド又はヌクレオチドを投与することを含み、前記ヌクレオシド又はヌクレオチドが、任意選択的に、デオキシヌクレオシド（ｄＮ）、デオキシヌクレオシド一リン酸（ｄＮＭＰ）、又はヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記細胞にヌクレオシド又はヌクレオチドを投与することが、前記細胞を含む対象に前記ヌクレオシド又はヌクレオチドを投与することを含む、請求項８に記載の方法。
- 前記投与が、経口であるか、又は注射による、請求項９に記載の方法。
- 前記細胞内の前記ｄＮＴＰ濃度を増加させることが、ｄＮＴＰ合成酵素を前記細胞に送達することを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記ｄＮＴＰ合成酵素が、キナーゼを含む、請求項１１に記載の方法。
- 前記キナーゼが、ヌクレオシドキナーゼ、デオキシヌクレオシドキナーゼ、デオキシヌクレオシド一リン酸キナーゼ、又はデオキシヌクレオチド二リン酸キナーゼを含む、請求項１２に記載の方法。
- 前記ＤＮＡポリメラーゼが、逆転写酵素を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記細胞が、Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼ、ガイド核酸、又はそれらの組み合わせを更に含む、請求項１に記載の方法。
- 前記低いｄＮＴＰ濃度が、非分裂細胞内に見出されるｄＮＴＰ濃度を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記低いｄＮＴＰ濃度が、活性化末梢血単核細胞内に見出されるｄＮＴＰ濃度未満である、請求項１に記載の方法。
- 前記低いｄＮＴＰ濃度が、１マイクロモル未満のｄＮＴＰ濃度を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記ｄＮＴＰ濃度を前記増加させることが、前記ベースラインｄＮＴＰ測定値と比較して、前記ｄＮＴＰ濃度を、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、又はそれ以上、増加させることを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記ｄＮＴＰ濃度が、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）濃度、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）濃度、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）濃度、若しくはデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）濃度、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
- Ｃａｓニッカーゼ及び逆転写酵素を含む組成物であって、前記Ｃａｓニッカーゼ及び前記逆転写酵素のうちの少なくとも一部が、別個のポリペプチド鎖に含まれ、前記Ｃａｓニッカーゼ及び前記逆転写酵素が、Ｃａｓ－逆転写酵素ヘテロ二量体を形成する、組成物。
- 前記Ｃａｓ－逆転写酵素ヘテロ二量体が、前記Ｃａｓニッカーゼに融合した第１のヘテロ二量体ドメインと、前記逆転写酵素に融合した第２のヘテロ二量体ドメインと、を含み、前記第１のヘテロ二量体ドメインが、前記第２のヘテロ二量体ドメインに結合して、前記Ｃａｓ－逆転写酵素ヘテロ二量体を形成する、請求項２１に記載の組成物。
- 前記第１のヘテロ二量体ドメインが、ロイシンジッパーであり、前記第２のヘテロ二量体ドメインが、ロイシンジッパーである、請求項２２に記載の組成物。
- 前記逆転写酵素が、配列番号３～配列番号２２若しくは配列番号４０～配列番号８０のうちのいずれか１つのものに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、又はその断片を含む、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記逆転写酵素が、前記Ｃａｓニッカーゼの一部に融合した非長末端反復レトロトランスポーザブル（ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ）エレメントからのドメインを含む、請求項２１～２４のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記逆転写酵素が、前記Ｃａｓニッカーゼの一部に融合した細菌性グループＩＩイントロンからの配列を含む、請求項２１～２４のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記逆転写酵素が、前記Ｃａｓニッカーゼの一部に融合したレトロウイルスｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質からのドメインを含む、請求項２１～２４のいずれか一項に記載の組成物。
- Ｃａｓニッカーゼと、逆転写酵素と、ガイド核酸と、を含む、組成物であって、第１のポリペプチドが、前記Ｃａｓニッカーゼを含み、第２のポリペプチドが、前記逆転写酵素を含み、前記ガイド核酸が、前記Ｃａｓニッカーゼ及び前記逆転写酵素に結合する、組成物。
- 前記逆転写酵素が、ｍｃｐペプチドを含む、請求項２１～２８のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記逆転写酵素が、ループ領域を含む、請求項２１～２９のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ループ領域が、２ａループ又は３ａループである、請求項３０に記載の組成物。
- 前記ガイド核酸が、ＭＳ２ヘアピンを含む、請求項２８～３１のいずれか一項に記載の組成物。
- 配列番号３～配列番号２２若しくは配列番号４０～配列番号８０のうちのいずれか１つのものに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、又はＣａｓニッカーゼに融合したその断片を有する逆転写酵素を含む、組成物。
- Ｃａｓニッカーゼに融合した非長末端反復レトロトランスポーザブルエレメントからのドメインを含む逆転写酵素を含む、組成物。
- Ｃａｓニッカーゼに融合した細菌性グループＩＩイントロンからの配列を含む逆転写酵素を含む、組成物。
- Ｃａｓニッカーゼに融合したレトロウイルスｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質からのドメインを含む逆転写酵素を含む、組成物。
- Ｃａｓニッカーゼと、逆転写酵素と、を含む、組成物であって、前記Ｃａｓニッカーゼ及び前記逆転写酵素が、別個のポリペプチド鎖を含み、前記Ｃａｓニッカーゼ及び逆転写酵素が、ヘテロ二量体化するように操作されていない、組成物。
- 前記Ｃａｓニッカーゼと複合体を形成するガイド核酸を含み、複合体形成時に、前記Ｃａｓニッカーゼが、標的核酸中の標的部位に一本鎖切断を導入することができる、請求項２１～３７のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記標的核酸が、ＣＦＴＲ核酸、ＵＳＨ２Ａ核酸、ＡＢＣＡ４核酸、ＡＴＰ７Ｂ核酸、又はＨＴＴ核酸を含む、請求項２１～３８のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記Ｃａｓニッカーゼ又は前記逆転写酵素に融合した核局在化シグナルを含む、請求項２１～３９のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記逆転写酵素が、切断された逆転写酵素である、請求項２１～４０のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記逆転写酵素が、天然の逆転写酵素と比較して増加した処理能力を有する、請求項２１～４１のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記逆転写酵素が、ｍｌｖＲＴと比較して増加した処理能力を有する、請求項２１～４２のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記逆転写酵素が、ｍｌｖＲＴと比較して標的配列におけるより長いウィンドウ長を編集する、請求項２１～４３のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記逆転写酵素が、ｍｌｖＲＴと比較して減少した免疫原性を有する、請求項２１～４４のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記逆転写酵素が、ｍｌｖＲＴと比較して細胞への送達が改善されている、請求項２１～４５のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記逆転写酵素が、単一の結合事象において、２０個以上、４０個以上、４５個以上、５０個以上、６０個以上、８１個以上、１００個以上、５００個以上、又は１０００個以上のヌクレオチドを重合する、請求項２１～４６のいずれか一項に記載の組成物。
- ガイド核酸であって、
標的核酸の第１の領域に逆相補的なスペーサーと、
Ｃａｓニッカーゼに結合するように構成された足場と、
前記標的核酸に挿入される配列をコードする逆転写酵素鋳型と、
前記標的核酸の第２の領域に逆相補的な第１の鎖プライマー結合部位と、を含む、ガイド核酸。 - 前記逆転写酵素鋳型の領域の配列を含む第２の鎖プライマーを更に含む、請求項４８に記載のガイド核酸。
- 前記標的核酸の前記第１の領域が、前記標的核酸の第１の鎖上にあり、前記標的核酸の前記第２の領域が、前記標的核酸の第２の鎖上にある、請求項４８又は４９に記載のガイド核酸。
- 前記標的核酸の前記第１の領域のうちの全て又は一部が、前記標的核酸の前記第２の領域のうちの全て又は一部に逆相補的である、請求項４８～５０のいずれか一項に記載のガイド核酸。
- 前記ガイド核酸の３’末端に切断可能な配列を更に含む、請求項４８～５１のいずれか一項に記載のガイド核酸。
- 前記切断可能な配列が、リボザイム切断可能な配列である、請求項５２に記載のガイド核酸。
- 前記切断可能な配列が、ｔＲＮＡ切断可能な配列である、請求項５２に記載のガイド核酸。
- 前記第１の鎖プライマー結合部位が、前記標的核酸の前記第２の領域にハイブリダイズするように構成され、前記逆転写酵素鋳型が、前記標的核酸の前記第２の領域の３’末端からの逆転写のための鋳型として機能するように構成される、請求項４８～５４のいずれか一項に記載のガイド核酸。
- 前記第２の鎖プライマーが、前記逆転写酵素鋳型に逆相補的な鋳型からの転写のためのプライマーとして機能するように構成される、請求項４８～５５のいずれか一項に記載のガイド核酸。
- 第１の合成鎖が、前記第２の鎖プライマーからの第２の鎖の合成のための鋳型として機能する、請求項４８～５６のいずれか一項に記載のガイド核酸。
- Ｖｅｌｃｒｏ結合部位にハイブリダイズするＶｅｌｃｒｏ領域を更に含む、請求項４８～５７のいずれか一項に記載のガイド核酸。
- 前記Ｖｅｌｃｒｏ結合部位が、前記Ｖｅｌｃｒｏ領域に対して１００％逆相補的であり、前記Ｖｅｌｃｒｏ結合部位が、前記Ｖｅｌｃｒｏ領域に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、逆相補的であり、かつ／又は前記Ｖｅｌｃｒｏ結合部位が、前記Ｖｅｌｃｒｏ領域に対して、５５％以下、６０％以下、６５％以下、７０％以下、７５％以下、８０％以下、８５％以下、９０％以下、９１％以下、９２％以下、９３％以下、９４％以下、９５％以下、９６％以下、９７％以下、９８％以下、９９％以下、逆相補的である、請求項５８に記載のガイド核酸。
- 前記逆転写酵素鋳型領域が、前記Ｖｅｌｃｒｏ結合部位を含む、請求項５８又は５９に記載のガイド核酸。
- 前記Ｖｅｌｃｒｏ結合部位が、前記第１の鎖プライマー結合部位の３’である、請求項５８又は５９に記載のガイド核酸。
- 前記Ｖｅｌｃｒｏ領域が、前記逆転写酵素鋳型の３’である、請求項４８～６１のいずれか一項に記載のガイド核酸。
- 前記Ｖｅｌｃｒｏ領域が、前記足場の５’である、請求項４８～６２のいずれか一項に記載のガイド核酸。
- 前記標的核酸が、ＣＦＴＲ核酸、ＵＳＨ２Ａ核酸、ＡＢＣＡ４核酸、ＡＴＰ７Ｂ核酸、又はＨＴＴ核酸を含む、請求項４８～６３のいずれか一項に記載のガイド核酸。
- 前記スペーサーが、配列番号９６～１１９のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％同一の核酸配列を含む、請求項４８～６４のいずれか一項に記載のガイド核酸。
- 請求項２８～３２又は３７～６５のいずれか一項に記載のガイドを含む第１のガイド核酸、及び第２のガイド核酸を含む、組成物。
- 前記第２のガイド核酸が、請求項２８、３２若しくは３７、又は４８～６５のいずれか一項に記載のガイド核酸を含む、請求項６６に記載の組成物。
- 前記第２のガイド核酸の前記逆転写酵素鋳型が、前記第１のガイド核酸の前記逆転写酵素鋳型のうちの少なくとも一部に相補的（又は少なくとも部分的に相補的）である、請求項６７に記載の組成物。
- 前記第１のガイド核酸が、第１のＣａｓニッカーゼに結合し、前記第２のガイド核酸が、第２のＣａｓニッカーゼに結合する、請求項６６～６８のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第１のガイド核酸の第１のスペーサーが、第１のＣａｓニッカーゼに結合し、前記第２のガイド核酸の第２のスペーサーが、第２のＣａｓニッカーゼに結合し、前記第１のガイド核酸の第１の足場が、前記第２のＣａｓニッカーゼに結合し、前記第２のガイド核酸の第２の足場が、前記第１のＣａｓニッカーゼに結合する、請求項６６～６８のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第１のガイド核酸が、第１のリンカーを含み、前記第２のガイド核酸が、第２のリンカーを含み、前記第１のリンカーが、前記第２のリンカーにハイブリダイズする、請求項６６～６８又は７０のいずれか一項に記載の組成物。
- 請求項２１～４７若しくは６６～７１のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項３８～４５のいずれか一項に記載のガイド核酸を発現する細胞に、Ｏｒｆ１ｐを送達することを含む、ゲノム編集効率を増加させる方法。
- 請求項２１～４７若しくは６６～７１のいずれか一項に記載の組成物をコードするか、又は請求項４８～６５のいずれか一項に記載のガイド核酸を含む、１つ以上の核酸。
- 請求項７３に記載の核酸を含む、ウイルスベクター。
- 請求項２１～４７若しくは６６～７１のいずれか一項に記載の組成物、請求項４８～６５のいずれか一項に記載のガイド核酸、請求項７３に記載の核酸、又は請求項７４に記載のウイルスベクターを含む、細胞。
- 前記細胞が、原核細胞である、請求項７２に記載の方法又は請求項７５に記載の細胞。
- 前記細胞が、真核細胞である、請求項７２に記載の方法又は請求項７５に記載の細胞。
- 細胞内でＶｐｘタンパク質を発現させることを含む、ゲノム編集効率を増加させる方法。
- 前記細胞が、請求項２１～４７若しくは６６～７１のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項４８～６５のいずれか一項に記載のガイド核酸を発現する、請求項７８に記載の方法。
- 細胞内のｄＮＴＰ濃度を増加させることによってゲノム編集効率を増加させる方法、例えば、細胞内のＳＡＭＨＤ１を阻害することを含む、ゲノム編集効率を増加させる方法。
- 前記細胞が、Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼ、逆転写酵素、及びガイド核酸を発現する、請求項８０に記載の方法。
- ＳＡＭＨＤ１を阻害することが、前記細胞内でＶｐｘタンパク質を発現させることを含む、請求項８０又は８１に記載の方法。
- ＳＡＭＨＤ１を阻害することが、前記細胞内でＳＡＭＨＤ１に対するマイクロＲＮＡを発現させることを含むか、又は前記細胞を小分子ＳＡＭＨＤ１阻害剤で処理することを含む、請求項８０又は８１に記載の方法。
- インテイン触媒作用を可能にするか、又は改善する１つ以上の点変異又は挿入変異を含む、Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼを含む、組成物。
- 前記Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼが、前記Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼのＣ末端半分に位置する点変異若しくは挿入変異を含むか、又は前記点変異若しくは挿入変異が、前記Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼのアミノ酸位置５７４の後の任意の場所に位置する、請求項８４に記載の組成物。
- 前記点変異が、システイン点変異、セリン点変異、スレオニン点変異、若しくはアラニン点変異を含むか、又は前記挿入変異が、システイン挿入変異、セリン挿入変異、スレオニン挿入変異、若しくはアラニン挿入変異を含む、請求項８５に記載の組成物。
- 前記点変異が、システイン点変異を含むか、又は前記挿入変異が、システイン挿入変異を含む、請求項８５に記載の組成物。
- 前記Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼが、Ｃａｓ９ニッカーゼである、請求項８４～８７のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼが、Ｓ．Ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９である、請求項８４～８８のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記点変異が、前記Ｓ．Ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９のＤ１０７９、Ｄ１１２５、Ｄ１１３０、Ｇ１１３３、Ａ１１４０、Ｉ１１６８、Ｓ１１７３、Ｄ１１８０、Ｇ１１８６、Ｌ１２０３、若しくはＲ１２１２に位置するか、又は前記挿入変異が、前記Ｓ．Ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９のＤ１０７９、Ｄ１１２５、Ｄ１１３０、Ｇ１１３３、Ａ１１４０、Ｉ１１６８、Ｓ１１７３、Ｄ１１８０、Ｇ１１８６、Ｌ１２０３、若しくはＲ１２１２のすぐ上流に位置する、請求項８９に記載の組成物。
- 前記Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼが、配列番号８５～配列番号８７又は配列番号９０～配列番号９２のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項８４～９０のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼが、２つ以上のセグメントとして発現される、請求項８４～９１のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記２つ以上のセグメントのうちの第１のセグメントが、前記Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼのＮ末端部分及び第１のインテインを含み、前記２つ以上のセグメントのうちの第２のセグメントが、前記Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼのＣ末端部分及び第２のインテインを含む、請求項９２に記載の組成物。
- 前記システイン点変異が、前記Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼの前記Ｃ末端部分のＮ末端に位置する、請求項９３に記載の組成物。
- 前記第１のインテインが、前記Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼの前記Ｎ末端部分のＣ末端に融合され、前記第２のインテインが、前記Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼの前記Ｃ末端部分の前記Ｎ末端に融合される、請求項９３又は９４に記載の組成物。
- 前記第１のセグメントが、配列番号９０の配列を含み、前記第２のセグメントが、配列番号９１の配列を含む、請求項９３～９５のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記２つ以上のセグメントのうちの前記第２のセグメントが、前記Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼの前記Ｃ末端部分に融合した逆転写酵素を含む、請求項９３～９６のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記逆転写酵素が、前記Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼの前記Ｃ末端部分のＣ末端に融合したＮ末端を含む、請求項９７に記載の組成物。
- 前記逆転写酵素が、ｍｌｖＲＴ、又はそのバリアントを含む、請求項９７又は９８に記載の組成物。
- ゲノム編集効率を最適化する方法であって、低いｄＮＴＰ濃度でその触媒効率を増加させるように修飾される（例えば、ｄＮＴＰに対するそのＫｍを減少させるように修飾される）、Ｍｏｌｏｎｅｙ白血病ウイルス逆転写酵素（ｍｌｖＲＴ）を用いてゲノム編集を実施することを含む、方法。
- 限定的なｄＮＴＰ条件においてゲノム編集効率を最適化する方法であって、逆転写酵素の位置２２１又は２２３に点変異を含む、Ｍｏｌｏｎｅｙ白血病ウイルス逆転写酵素（ｍｌｖＲＴ）、又はそのバリアントを用いてゲノム編集を実施することを含む、方法。
- 前記ｍｌｖＲＴ又はそのバリアントが、位置２２１に点変異を含む、請求項１００又は１０１に記載の方法。
- 位置２２１の前記点変異が、Ｑ２２１Ｒを含む、請求項１０２に記載の方法。
- 前記ｍｌｖＲＴ又はそのバリアントが、位置２２３に点変異を含む、請求項１００又は１０１に記載の方法。
- 位置２２３の前記点変異が、Ｖ２２３Ａを含む、請求項１０４に記載の方法。
- 位置２２３の前記点変異が、Ｖ２２３Ｍを含む、請求項１０４に記載の方法。
- 前記逆転写酵素が、位置Ｐ５１、Ｓ６７、Ｑ８４、Ｌ１３９、Ｑ２２１、Ｖ２２３、Ｔ１９７、Ｄ６５３、Ｔ６６４、Ｌ６７１、Ｌ４３５、Ｈ２０４、又はＤ５２４に点変異を含む、請求項２１～４７又は６６～７１のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記逆転写酵素が、Ｐ５１Ｌ、Ｓ６７Ｒ、Ｑ８４Ａ、Ｌ１３９Ｐ、Ｑ２２１Ｒ、Ｖ２２３Ａ、Ｖ２２３Ｍ、Ｔ１９７Ａ、Ｄ６５３Ｎ、Ｔ６６４Ｎ、Ｌ６７１Ｐ、Ｌ４３５Ｇ、Ｈ２０４Ｒ、又はＤ５２４Ａを含む点変異を含む、請求項２１～４７又は６６～７１のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記逆転写酵素が、アミノ酸位置Ｑ８４、Ｌ１３９、Ｑ２２１、Ｖ２２３、Ｔ６６４、又はＬ６７１に点変異を含む、請求項２１～４７又は６６～７１のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記逆転写酵素が、Ｓ６７Ｒ、Ｑ８４Ａ、Ｌ１３９Ｐ、Ｑ２２１Ｒ、Ｖ２２３Ａ、Ｖ２２３Ｍ、Ｔ６６４Ｎ、Ｌ６７１Ｐ、又はＤ５２４Ａを含む点変異を含む、請求項２１～４７又は６６～７１のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記Ｃａｓニッカーゼ及びＲＴが、ポリヌクレオチドによってコードされる、請求項２１～４７のいずれか一項に記載の組成物。
- 請求項１１１に記載のポリヌクレオチドを含む、ＡＡＶ。
- 前記Ｃａｓニッカーゼ及びＲＴのうちの少なくとも一部が、別個のＡＡＶによって包含される、請求項１１２に記載のＡＡＶ。
- Ｃａｓニッカーゼのうちの少なくとも一部をコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１のＡＡＶと、逆転写酵素をコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２のＡＡＶと、を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）。
- 前記ＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＤＪ／８、ＡＡＶ－Ｒｈ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、ＡＡＶ－ｒｅｔｒｏ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ８－ＰＨＰ．ｅＢ、若しくはＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｓ、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１１２～１１４のいずれか一項に記載のＡＡＶ。
- 前記Ｃａｓニッカーゼ及び前記逆転写酵素が、互いにヘテロ二量体を形成する、請求項１１４又は１１５に記載のＡＡＶ。
- 前記第１又は第２のポリヌクレオチドが、前記Ｃａｓニッカーゼ及び前記逆転写酵素に結合して、複合体を形成するガイド核酸を更にコードし、前記複合体の前記Ｃａｓニッカーゼが、標的核酸中の標的部位に一本鎖切断を導入する、請求項１１４～１１６のいずれか一項に記載のＡＡＶ。
- 前記Ｃａｓニッカーゼが、Ｓ．Ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ニッカーゼなどのＣａｓ９ニッカーゼを含み、前記逆転写酵素が、ｍｌｖＲＴ、又はそのバリアントを含み、前記逆転写酵素が、Ｐ５１、Ｓ６７、Ｑ８４、Ｌ１３９、Ｑ２２１、Ｖ２２３、Ｔ１９７、Ｄ６５３、Ｔ６６４、Ｌ６７１、Ｌ４３５、Ｈ２０４、又はＤ５２４に点変異を含む、請求項１１４～１１７のいずれか一項に記載のＡＡＶ。
- 前記点変異が、Ｐ５１Ｌ、Ｓ６７Ｒ、Ｑ８４Ａ、Ｌ１３９Ｐ、Ｑ２２１Ｒ、Ｖ２２３Ａ、Ｖ２２３Ｍ、Ｔ１９７Ａ、Ｄ６５３Ｎ、Ｔ６６４Ｎ、Ｌ６７１Ｐ、Ｌ４３５Ｇ、Ｈ２０４Ｒ、又はＤ５２４Ａを含む、請求項１１８に記載のＡＡＶ。
- 前記Ｃａｓ９ニッカーゼが、Ｓ．Ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ニッカーゼを含み、前記逆転写酵素が、ｍｌｖＲＴ、又はそのバリアントを含み、前記逆転写酵素が、Ｐ５１、Ｓ６７、Ｑ８４、Ｌ１３９、Ｑ２２１、Ｖ２２３、Ｔ１９７、Ｄ６５３、Ｔ６６４、Ｌ６７１、Ｌ４３５、Ｈ２０４、又はＤ５２４のすぐ上流の挿入変異を含む、請求項１１４～１１９のいずれか一項に記載のＡＡＶ。
- 請求項１１４～１２０のいずれか一項に記載の第１又は第２のＡＡＶを含む組成物を、対象又は細胞に投与することを含む、ゲノムを編集する方法。
- 請求項１１２～１２０のいずれか一項に記載のＡＡＶを含む組成物を、対象又は細胞に投与することを含む、ゲノムを編集する方法。
- 前記対象又は細胞内のゲノム編集を測定することを更に含む、請求項１２１又は１２２に記載の方法。
- 低いデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）濃度を有する細胞内の遺伝子編集効率を増加させる方法であって、
前記細胞を、前記低いｄＮＴＰ濃度において効率的な触媒作用のために修飾された遺伝子編集酵素と接触させること、又は前記遺伝子編集酵素を前記細胞内で発現させること、を含む、方法。 - 前記遺伝子編集酵素が、位置Ｑ８４、Ｌ１３９、Ｑ２２１、Ｖ２２３、Ｔ６６４、又はＬ６７１に点変異を導入することによって修飾される逆転写酵素を含む、請求項１２４に記載の方法。
- 改善された逆転写酵素（ＲＴ）をスクリーニング又は識別するための方法であって、
細胞内で、ＳＡＭＨＤ１を過剰発現させるか、又は変異体ＳＡＭＨＤ１の残基のリン酸化を防止するように変異した変異体ＳＡＭＨＤ１を発現させることと、
前記細胞内のＲＴ活性を識別することと、
前記ＲＴ活性に基づいて、前記ＲＴを改善されたＲＴとして識別することと、を含む、方法。 - スペーサー、所望の編集を含む逆転写酵素鋳型、及びプライマー結合部位を含む、ＲＮＡ又はポリヌクレオチドを含むシステムであって、前記プライマー結合部位が、前記スペーサーによって標的化若しくは結合された核酸の領域のいずれの部分も含まない核酸、又は前記スペーサーによって標的化若しくは結合された前記核酸に逆相補的な前記核酸に結合する、システム。
- システムであって、
第１のガイド核酸であって、
標的核酸の第１の領域に逆相補的なスペーサーと、
Ｃａｓヌクレアーゼに結合するように構成された足場と、
前記標的核酸に挿入される配列をコードする逆転写酵素鋳型と、
前記第１の領域のいずれの部分も含まず、かつ前記第１の領域の逆相補体のいずれの部分も含まない、前記標的核酸の領域に結合する第１の鎖プライマー結合部位と、
第２のガイド核酸上のＧＰＳ結合部位にハイブリダイズするＧＰＳ領域と、を含む、第１のガイド核酸を含む、システム。 - 前記ＧＰＳ結合部位を含む前記第２のガイド核酸を更に含む、請求項１２８に記載のシステム。
- 前記第２のガイド核酸が、前記標的核酸の別の領域に逆相補的な第２のスペーサーを含む、請求項１２９に記載のシステム。
- 前記第２のガイド核酸が、前記プライマー結合部位をゲノムフラップと近接させる、請求項１２９又は１３０に記載のシステム。
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