DE69923983T2

DE69923983T2 - Expressionsvektoren die 'hot spots'für eine verstärkte rekombinante proteinexpression in transfizierten zellen enthalten

Info

Publication number: DE69923983T2
Application number: DE69923983T
Authority: DE
Inventors: Kanakaraju Koduri; T. John MILLER; Pallaiah Thammana
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1998-09-22
Filing date: 1999-09-07
Publication date: 2006-04-06
Anticipated expiration: 2019-09-08
Also published as: JP4480893B2; DE69923983D1; CA2344699A1; JP2002526071A; ES2237943T3; AU6137599A; EP1115852B1; IL141878A0; AU762274B2; US6521419B1; ATE290073T1; EP1115852A1; EP1115852A4; WO2000017337A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Entwicklung von Expressionssystemen zur Produktion von rekombinanten Proteinen ist zur Bereitstellung einer Quelle für ein gegebenes Protein in der Forschung oder therapeutischen Verwendung wichtig. Expressionssysteme sind sowohl für prokaryontische Zellen wie E. coli als auch für eukaryontische Zellen, die sowohl Hefe als auch Säugerzellen einschließen, entwickelt worden. Expression in Säugerzellen, zum Beispiel Zellen aus dem Ovar des chinesischen Hamsters (oder „CHO"-Zellen), wird oft für die Herstellung therapeutischer Proteine bevorzugt, da post-translationale Änderungen in solchen Expressionssystemen denen ähnlicher sind, die in menschlichen Proteine produzierenden Zellen gefunden werden, als die Art der post-translationalen Änderungen, die in mikrobiellen (prokaryontischen) Expressionssystemen auftreten.
Transkription von eukaryontischen Genen wird von einer Reihe von cis- oder trans-agierenden Regulationselementen reguliert (Dillon et al. (1993) Trends Genet. 9: 134). Zwei der am besten untersuchten cis-Elemente sind Promotoren und Enhancer. Promotoren sind DNA-Sequenzen, unmittelbar 5' der Codierungssequenz des Gens gelegen, und umfassen zahlreiche Bindungsstellen für trans-agierende Transkriptionsfaktoren, die die Basis des Transkriptionsapparates bilden. Enhancer bestehen ebenfalls aus zahlreichen Bindungsstellen für trans-agierende Transkriptionsfaktoren, können jedoch weit stromaufwärts oder stromabwärts der codierenden Sequenzen oder sogar innnerhalb von Introns gefunden werden. Diese Elemente können auch in einer von der Orientierung unabhängigen Weise agieren. Aktivitäten von Promotoren und Enhancern können in vorübergehenden Expressionssystemen nachgewiesen werden, und sie enthalten Elemente, die spezifisch oder nicht spezifisch für ein Gewebe sein können.
Eine andere Kategorie von cis-agierenden Regulationselementen sind jene, von denen man annimmt, dass sie die Chromatinstruktur regulieren, einschließlich der Locus-Kontrollregionen („LCRs") (Grosveld et al. (1987) Cell 51: 975), Matrix-Anhangsregionen („MARs") (Phi-Van et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10: 2302), Gerüst-Anhangsregionen („SARs") (Gasser & Laemmli (1987) Trends Genet. 3: 16), Isolationselemente (Kellum & Schedl (1991) Cell 64: 941) und Kernmatrix-Assoziations-DNAs (Bode, J. et al. (1992) Science 255: 195). MARs und SARs sind Enhancern in der Eigenschaft ähnlich, dass sie über große Entfernungen wirken, aber einzigartig darin, dass ihre Wirkungen nur in stabil transformierten Zelllinien oder transgenen Tieren nachgewiesen werden können. LCRs unterscheiden sich von Enhancern auch darin, dass sie von Position und Orientierung abhängig sind und in einer gewebespezifischen Weise aktiv sind.
Rekombinante Expressionsplasmide, die ein Gen von Interesse umfassen, das das gesamte oder einen Teil eines gewünschten Proteins codiert, werden routinemäßig verwendet, um stabile CHO-Zellen oder Transfektome zu erzeugen, die das gewünschte rekombinante Protein exprimieren. Diese rekombinanten Plasmide integrieren sich nach dem Zufallsprinzip in das Genom der Wirtszelle, die rekombinante Proteine exprimiert. Jedoch ist die Häufigkeit von Transfektomen, die das stabil integrierte rekombinante Gen tragen und die in der Lage sind, ein gewünschtes rekombinantes Protein in hohem Maße zu produzieren, recht gering. Gewöhnlich muss eine große Zahl von stabil transfizierten Säuger-Transfektomen durchmustert werden, um Clone zu identifizieren, die die rekombinierten Proteine in hohem Maße exprimieren. Man nimmt allgemein an, dass dies auf die Wirkungen der genomischen Umgebung (Hot Spots) und der Anzahl der Kopien des Plasmids zurückzuführen ist, besonders im Hinblick auf den großen Umfang des Säuger-Genoms und der Tatsache, dass nur 0,1% der genomischen DNA transkriptional aktive Sequenzen enthalten (Little (1993) Nature 366: 204). Es ist sehr unwahrscheinlich, dass die gegenwärtige Technik der zufälligen Integration des Plasmids in das Genom von CHO-Zellen zu der Insertion eines rekombinanten Gens in einen transkriptionalen Hot Spot führen wird, der zur Gen-Amplifikation in der Lage ist, welche zu Gen-Expression in hohem Maße führen würde.
Expression steigernde Sequenzen sind offengelegt worden, um die Expression von rekombinanten Proteinen zu erhöhen (Morris, A. et al. Expression augmenting elements (EASE) for eukaryotic expression systems: WO 97/25420). Eine Steigerung der Häufigkeit von Zelllinien, die rekombinante Gene in hohem Maße exprimieren, würde eine wesentlich größere Menge an in hohem Maße Protein exprimierenden Transfektomen liefern, aus der ausgewählt werden kann. Diese Aufgabe kann durch die Erzeugung von homologen rekombinanten Plasmiden, die auf einen transkriptionalen Hot Spot gerichtet sind, und der Bereitstellung eines Verfahrens zur Selektion solcher Transfektome gelöst werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Neue Sequenzen zur Regulation der Transkription, hierin als HIRPE (Hot Spot for Increased Recombinant Protein Expression, Hot Spot für erhöhte rekombinante Proteinexpression) bezeichnet, die erhöhte Expression von rekombinanten Proteinen in Säuger-Wirtszellen erleichtern, werden offenbart. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist ein HIRPE, der aus genomischer DNA von CHO-Zellen gewonnen wurde.
Die vorliegende Erfindung offenbart einen HIRPE einer genomischen Stelle aus dem CHO-Genom, der zur hohen Expression rekombinanter Gene in der Lage ist. Diese Stellen enthalten Sequenz-Elemente, die Herkunft der Replikation, Gen-Amplfikation und MARs im Säugergenom definieren. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der HIRPE aus einer Gruppe ausgewählt, umfassend: (a) DNAs, umfassend die Nucleotide 1 bis 5006 der SEQ ID NR: 1; (b) Fragmente der SEQ ID NR: 1, die HIRPE-Aktivität aufweisen; (c) Nucleotidsequenzen, die komplementär zu (a) und/oder (b) sind; (d) Nucleotidsequenzen, die mindestens etwa 80%, mehr bevorzugt etwa 90% und noch mehr bevorzugt etwa 95% in der Nucleotidsequenz identisch zu (a), (b) und/oder (c) sind und die HIRPE-Aktivität zeigen; und (e) Kombinationen der vorstehenden Nucleinsäuresequenzen, die HIRPE-Aktivität aufweisen.
Expressionsvektoren, die den neuen HIRPE umfassen, sind in der Lage, CHO-Zellen zu transformieren, um Expression von rekombinanten Proteinen zu erhöhen. Daher ist eine andere Ausführungsform der Erfindung ein Expressionsvektor, der einen HIRPE umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Expressionsvektor darüber hinaus einen eukaryontischen Promotor/Enhancer, der die Expression des gesamten oder eines Teils des Proteins von Interesse lenkt. Zwei oder mehr Expressionsvektoren können verwendet werden, um eine Zelle (z.B. eine CHO-Zelle) zu transfizieren, wobei jeder Vektor eine Nucleinsäuresequenz enthält, die verschiedene Polypeptide codiert, welche sich (bei Expression) vereinigen, um das gewünschte Protein zu bilden. In einer mehr bevorzugten Ausführungsform umfasst der Expressionsvektor ein Plasmid, worin ein erstes Exon ein Gen von Interesse codiert und ein zweites Exon eine amplifizierbare, dominante, selektierbare Markierung codiert. Eine bevorzugte Markierung ist Dihydrofolat-Reduktase („DHFR"); andere amplifizierbare Markierungen sind ebenso für die Verwendung in den Expressionsvektoren der Erfindung geeignet.
Wirtszellen von Säugern können mit den Expressionsvektoren der vorliegenden Erfindung transformiert werden, um große Mengen an rekombinantem Protein zu erzeugen. Daher liefert eine weitere Ausführungsform der Erfindung eine Wirtszelle eines Säugers, die mit einem Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung transformiert ist. Ebenfalls innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung befinden sich Wirtszellen von Säugern, die mit zwei Expressionsvektoren transformiert sind, wobei jeder dieser beiden Expressionsvektoren eine Untereinheit eines Polypeptids codiert, die sich bei Coexpression zu einem gewünschten Protein mit biologischer Aktivität vereinigen. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform sind die Wirtszellen CHO-Zellen.
Die Erfindung liefert auch ein Verfahren zum Erhalt eines rekombinanten Proteins, das die Transformation einer Wirtszelle mit einem Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung, Kultivierung der transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression des Proteins fördert, und Gewinnung des Proteins umfasst. In einer bevorzugten Anwendung der Erfindung werden transformierte Wirtszellen in zwei Selektionsschritten selektiert, wobei mit dem ersten Schritt Zellen selektiert werden, die die dominante, amplifizierbare Markierung exprimieren, und mit dem zweiten auf hohe Expressionsspiegel und/oder Amplifikation sowohl des Markierungsgens als auch des Gens von Interesse selektiert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das rekombinante Protein CTLA4-Ig oder eine Variante hiervon wie etwa Substitutions-, Additions- und Deletionsvarianten der Aminosäuresequenz, um verschiedene Formen eines CTLA4-Ig-Moleküls zu erhalten. Für einen ausführlichen Überblick über CTLA4 und CTLA4-Fusionsproteine (z.B. CTLA4-Ig) vgl. WO 93/00431.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1 zeigt die Clonierung der CTLA4-Ig-Integrationsstelle in die elterliche CTLA4-Ig exprimierende Zelllinie, hierin als Zelllinie „P" bezeichnet. 1A zeigt eine Southern-Blot-Analyse, in der ein 5,5 kB großes EcoRI-Fragment das natürliche Chromosom sowohl in der DG44-Wirtszelllinie als auch in der P-CHO-Zelllinie darstellt. Die 8,0 kB- und 10,0 kB-Banden der Spur 2 stellen die umgelagerten linken bzw. rechten flankierenden Regionen dar. 1B zeigt, dass die clonierten EcoRI-Fragmente, die die linke flankierende (Linie 1) und die rechte flankierende (Linie 2) Region der Integrationsstelle der Zelllinie P enthalten, mit EcoRI-gespaltener genomischer DNA der P-Zelllinie zusammen wandern.
2 stellt die molekulare Organisation der CTLA4-Ig-Integrationsstelle in Zelllinie P dar. Sie zeigt eine 5,0 kB große genomische Sequenz, die beide Enden des CTLA4-Ig-Gens flankiert; ein A-T-reiches Motiv; MAR ähnliche Sequenz (Matrix-assoziierte Regionen); und Alu ähnliche Sequenz.
3 stellt ein schematisches Diagramm des homologen Insertions-Rekombinationsvektors pTV(I) dar.
4 stellt ein schematisches Diagramm des homologen Ersatz-Rekombinationsvektors pTV(R) dar.
5 zeigt eine Southern-Blot-Analyse, die Stellen-spezifische Integration in Transfektome bestätigt, die den Insertions-Rekombinationsvektor pTV(I) enthalten.
6 zeigt eine Southern-Blot-Analyse, die Stellen-spezifisches Ansteuern in Transfektomen bestätigt, die den Ersatz-Rekombinationsvektor pTV(R) enthalten. Der Blot zeigt eine Bande für 3,5 kB in allen 5 Clonen, die nahe legt, dass der Ersatzvektor eine ähnliche genomische Stelle ansteuert.
7 zeigt eine Diagramm-Darstellung der LFR- und RFR-Fragmente, die durch Southern-Blot-Analyse und Kartierung mit Restriktionsenzymen analysiert wurden.
8 stellt die Wirkung der A-T-reichen Motivregion auf rekombinante Genexpression dar. Die Figur gibt CTLA4-Ig-Expression in μg/ml für die ersten vier Transfektome an, die entweder die gesamte Länge der Nucleinsäuresequenz mit 5 kB enthalten; 1,6 kB der Nucleinsäuresequenz (welche das A-T-reiche Motiv einschließt); oder eine 1,4 kB große Region, die das A-T-reiche Motiv nicht umschließt.
9 stellt die Oligonucleotide dar, die verwendet wurden, um den HIRPE der vorliegenden Erfindung zu erhalten.
10 zeigt, dass der HIRPE der vorliegenden Erfindung die Expression von CTLA4-Ig verstärkt.
11 zeigt, dass die Insertions- und Ersatzvektoren ähnliche Ergebnisse erzeugen.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Die Patentanmelder haben neue Sequenzelemente isoliert und identifiziert, die in stabilen Zell-Pools die Expression von Reporter-Proteinen um das Zwei- bis Zehnfache verbessern können, wenn sie in einen Expressionsvektor inseriert sind. Wir bezeichnen diese neuen Sequenzelemente als HIRPE (Hot Spot for Increased Recombinant Protein Expression, Hot Spot für erhöhte rekombinante Proteinexpression).
Ein DNA-Clon, der ein Nucleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung enthält, wurde bei der American Type Culture Collection („ATCC") (10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209) am 25. August 1998 unter der ATCC-Hinterlegungs-/Zugangsnummer 203153 hinterlegt. Die hierin zitierte(n) Hinterlegungen) wird (werden) nach den Regeln des Budapester Vertrags für die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für Zwecke von Patentverfahren aufrecht erhalten. Diese Hinterlegung findet lediglich als Annehmlichkeit für Fachleute auf dem Gebiet statt und ist keine Erlaubnis, dass eine Hinterlegung unter 35 U.S.C. § 112 erforderlich ist. Die Sequenz der Polynucleotide, die in den hinterlegten Materialien enthalten ist, ist hierin durch Bezugnahme eingeschlossen und ist in dem Fall eines Konfliktes mit einer hierin gegebenen Beschreibung von Sequenzen maßgebend. Eine Lizenz kann erteilt werden, um die hinterlegte Materialien herzustellen, zu verwenden oder zu verkaufen, und keine solche Lizenz wird hierdurch bewilligt.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Identifizierung einer Integrationsstelle für ein rekombinantes Protein in einem CHO-Wirtszellengenom und die Konstruktion von homologen Rekombinationsvektoren, um die hohe Expression von rekombinanten Genen in CHO-Zellen zu erreichen. Genauer betrifft die vorliegende Erfindung die Identifizierung einer Integrationsstelle für CTLA4-Ig in dem CHO-DG44-Wirtszellengenom.
HIRPE-Aktivität wurde in flankierenden Regionen an beiden Enden eines Gens identifiziert, das ein Protein von Interesse codiert. Wie nachstehend genau beschrieben wird, wurden die flankierenden Regionen abgetrennt und sequenziert, um die neue HIRPE-Sequenz, die hierin offenbart wird, zu bestimmen. Die zum Erhalten der HIRPE-Sequenz verwendeten DNA-Primer sind detailliert dargestellt (9). Die neue HIRPE-Sequenz der vorliegenden Erfindung umfasst die nachstehende Nucleinsäuresequenz (SEQ ID NR: 1):
Zusätzlich umfasst die vorliegende Erfindung Fragmente der SEQ ID NR: 1, die ebenfalls HIRPE-Aktivität aufweisen. Ein bevorzugtes Beispiel eines Fragments, das in der vorliegenden Erfindung von Nutzen ist, ist eine 1,6 kB große Sequenz, die die Nucleotide 3050 bis 4676 der SEQ ID NR: 1 umfasst.
Expressionsvektoren, die die isolierte 5,0 kB große Sequenz (SEQ ID NR: 1) und kürzere Fragmente hiervon umfassen, waren in der Lage, CHO-Zellen zu transformieren und führten zu Protein-Expression in hohem Maße. Der vorliegende neue HIRPE ist nützlich, um die Expression eines rekombinanten Proteins zu verbessern, die durch eine Promotor/Enhancer-Region, mit der das Protein verbunden ist, gesteuert wird.
Darüber hinaus können sowohl zusätzliche Fragmente der SEQ ID NR: 1, die HIRPE-Aktivität aufweisen, identifiziert werden, als auch ähnliche HIRPE-Motive aus anderen Zelltypen oder von anderen Integrationsstellen in transformierten Zellen. Zusätzlich ist auf dem Fachgebiet bekannt, dass anschließende Prozessierung von DNA-Fragmenten, die durch Spaltung mit Restriktionsenzymen hergestellt werden, zur Entfernung von zusätzlichen Nucleotiden von den Enden der Fragmente führen kann.
Andere Kombinationen von Fragmenten der SEQ ID NR: 1 können ebenfalls entwickelt werden, zum Beispiel Sequenzen, die vielfache Kopien der gesamten oder eines Teils der SEQ ID NR: 1 umfassen. Solche Kombinationen können unmittelbar angrenzend verknüpft oder angeordnet werden, um optimale Abstände der Fragmente zu erhalten. Zusätzlich befinden sich innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung Expressionsvektoren, die die Sequenz der SEQ ID NR: 1, angeordnet mit darin eingefügten Insertionssequenzen umfassen (z.B. Insertion eines Gens, das ein gewünschtes Protein an einer bestimmten ausgewählten Stelle in der SEQ ID NR: 1 codiert).
Der hierin offenbarte HIRPE wurde aus CHO-Zellen isoliert. Es wird erwartet, dass homologe Sequenzen, die die Expression rekombinanter Proteine steigern, sowohl in Zellen anderer Säugerarten als auch in Zelllinien, die von anderen Gewebetypen abstammen, vorhanden sind und mit Hilfe von Techniken, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, zum Beispiel durch Hybridisierung verschiedener Arten oder durch Techniken, die auf PCR basieren, isoliert werden können. Zusätzlich können Veränderungen in der in SEQ ID NR: 1 dargestellten Nucleotidsequenz oder in Nucleotid 3050 bis 4676 der SEQ ID NR: 1 durch stellengerichtete oder zufällige Mutagenese-Techniken, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, herbeigeführt werden. Die entstandenen HIRPE-Varianten können dann, wie hierin beschrieben, auf HIRPE-Aktivität untersucht werden. DNAs, die mindestens zu etwa 80%, mehr bevorzugt zu etwa 90% und mehr bevorzugt zu etwa 95% in der Nucleotidsequenz mit der SEQ ID NR: 1 identisch sind, oder Fragmente hiervon, die HIRPE-Aktivität aufweisen, sind durch Routine-Versuchsanordnung isolierbar, und es wird erwartet, dass sie HIRPE-Aktivität aufweisen. Für Fragmente der SEQ ID NR: 1 bezeichnet die prozentuale Identität jenen Anteil der ursprünglichen Referenz-Sequenz, der in dem Fragment gefunden wird. Dem zufolge werden Homologe der offenbarten HIRPE-Sequenz und Varianten hiervon ebenfalls von der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
Rekombinante Expressionsvektoren umschließen synthetische oder von cDNA stammende DNA-Fragmente, die ein Protein codieren, funktionell gebunden an geeignete transkriptionale oder translationale Regulationselemente, die von Säuger-, Virus- oder Insektengenen stammen. Solche Regulationselemente können einen transkriptionalen Promotor, eine Sequenz, die geeignete ribosomale mRNA-Bindungsstellen codiert, und Sequenzen, die die Termination von Transkription und Translation codieren, einschließen. Expressionsvektoren von Säugern können auch nicht transkribierte Elemente umfassen, wie etwa einen Ursprung für Replikation, einen geeigneten Promotor und Enhancer, gebunden an das zu exprimierende Gen, andere 5'- oder 3'-flankierende nicht transkribierte Sequenzen, nicht translatierte 5'- oder 3'-Sequenzen wie etwa notwendige Ribosomen-Bindungsstellen, eine Polyadenylierungsstelle, Stellen für Spleiß-Donoren und -Akzeptoren und transkriptionale Terminationssequenzen. Ein Replikationsursprung, der die Fähigkeit zur Replikation in einer Wirtszelle trägt, und ein selektierbares Gen, das die Erkennung von Transformanten erleichtert, können ebenfalls eingeschlossen sein.
DNA-Regionen sind funktionell miteinander verbunden, wenn sie miteinander funktionsfähig in Beziehung stehen. Zum Beispiel ist ein Promotor funktionell mit einer Codierungssequenz verbunden, wenn er die Transkription der Sequenz kontrolliert; oder eine Ribosom-Bindungsstelle ist funktionell mit einer Codierungssequenz verbunden, wenn es so positioniert ist, dass es Translation ermöglicht. Transktiptionale und translationale Kontrollsequenzen in Expressionsvektoren, die zur Transformation von Zellen verwendet werden, sind auf dem Fachgebiet bekannt.
Transformierte Wirtszellen sind Zellen, die mit Expressionsvektoren, die mit Hilfe rekombinanter DNA-Techniken konstruiert worden sind, transformiert oder transfiziert worden sind und die Sequenzen beinhalten, die vollständige oder einen Teil rekombinanter Proteine codieren. Exprimierte Proteine werden in Abhängigkeit von der ausgewählten DNA bevorzugt in den Überstand der Zellkultur sekretiert, können aber auch in der Zellmembran abgelegt werden. Zahlreiche Kultursysteme für Säugerzellen können verwendet werden, um rekombinantes Protein zu exprimieren, alle sind auf dem Fachgebiet gut bekannt, zum Beispiel COS-Linien von Nierenzellen von Affen, CHO-Zellen, HeLa-Zellen und BHK-Zelllinien.
Eine häufig verwendete Zelllinie ist die DHFR^–-CHO-Zelllinie, die auxotroph für Glycin, Thymidin und Hypoxanthin ist und unter Verwendung von DHFR-cDNA als einer amplifizierbaren dominanten Markierung in den DHFR⁺-Phänotyp transformiert werden kann. Eine solche bekannte DHFR^–-CHO-Zelllinie ist DKXB11 (Urlaub et al., (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216). Andere Zelllinien, die für spezifische Selektions- oder Amplifikationsschemata entwickelt wurden, werden ebenfalls mit dem neuen HIRPE der vorliegenden Erfindung nützlich sein.
Mehrere Transformationsprotokolle sind auf dem Fachgebiet bekannt und werden im Überblick z.B. von Kaufmann et al., (1988) Meth. Enzymology 185: 537 dargestellt. Die Auswahl des Transformationsprotokolls wird vom Typ der Wirtszelle und der Natur des interessierenden Gens abhängen und kann auf Routine-Versuchsanordnung basierend ausgewählt werden. Grundlegende Erfordernisse eines jeden solchen Protokolls sind zunächst, DNA, die ein Protein von Interesse codiert, in eine geeignete Wirtszelle einzuführen und dann Wirtszellen, die die DNA auf stabile, exprimierbare Weise eingebaut haben, zu identifizieren und zu isolieren. Beispiele für Verfahren, die zur Einführung von DNA, die ein Protein von Interesse codiert, nützlich sind, können bei Wigler et. al., (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567; Schaffner (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 2163; Potter et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 7161 und Shigekawa (1988) BioTechniques 6: 742 gefunden werden.
Ein Verfahren zur Amplifikation des Gens von Interesse ist ebenfalls für die Expression des rekombinanten Proteins wünschenswert und beinhaltet typischerweise die Verwendung einer Selektionsmarkierung. Resistenz gegen cytotoxische Wirkstoffe ist das am meisten als Selektionsmarkierung verwendete Kennzeichen und kann das Ergebnis eines dominanten Merkmals sein (d.h. es kann unabhängig vom Typ der Wirtszelle verwendet werden), oder es ist ein rezessives Merkmal (d.h. nützlich in bestimmten Typen von Wirtszellen, denen irgendeine Aktivität fehlt, auf die selektiert wird). Verschiedene amplifizierbare Markierungen sind für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet (zum Beispiel wie von Maniatis, Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1989) beschrieben). Nützliche selektierbare Markierungen für die Genamplifikation in Wirkstoff-resitstenten Säugerzellen umschließen DHFR-MTX (Methotrexat)-Resistenz (Alt et al., (1978) J. Biol. Chem. 253: 1357; Wigler et. al., (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567 und andere Markierungen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind (ein Überblick wird zum Beispiel von Kaufmann et. al., (1988) Meth. Enzymology 185: 537 gegeben).
Die nachstehenden Beispiele sollen eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erläutern und begrenzen den Rahmen der Erfindung in keiner Weise.
Beispiel 1: Identifizierung des HIRPE der vorliegenden Erfindung
Die CHO-Zelllinie P ist eine Zelllinie, die das Protein CTLA4-Ig in hohem Maße exprimiert. Diese Zelllinie wurde unter Verwendung des am meisten bevorzugten Verfahrens zur Produktion von Säuger-Zelllinien einschließlich zufälliger Integration ausgewählt. Das säugerstämmige Expressionsplasmid, das verwendet wurde, um die Zelllinie P zu erzeugen, ist ein modifiziertes pCDNA3-Plasmid (von Invitrogen, Inc. zu beziehen). Das DHFR-Gen wurde in diesen Vektor eingefügt, um als eine dominante Selektionsmarkierung zu dienen. Die rekombinante Gen-Expressionskassette in diesem Plasmid wird von CMV-Promotor und BGH-Polyadenylierungssequenz gesteuert. Die Analyse der genomischen DNA der Zelllinie P legte nahe, dass die Zelllinie viele Kopien der stabil integrierten Plasmid-DNA aufweist. Diese Amplifikation der Plasmid-DNA zog die Co-Amplifikation der DNA, die das CTLA4-Ig-Gen codiert, nach sich, was zu einer Zelllinie mit hoher Expression von CTLA4-Ig führte.
Fachleute auf dem Gebiet der Erzeugung von CHO-Transfektomen unter Verwendung von Zufallsintegrationsvektoren erkennen, dass Vektoren, die ein DHFR-Gen als eine Selektionsmarkierung enthalten, sich in einen transkriptionalen Hot spot integrieren und die Anzahl der Genkopien erfolgreich amplifizieren müssen, um eine in hohem Maße exprimierende Zelllinie zu erzeugen. Der Prozentsatz an transfizierten Zellen, die das Gen ausreichend amplifizieren, ist erwartungsgemäß gering, denn Hinweise aus der Literatur legen nahe, dass genomische Stellen, die zur Gen-Amplifikation in der Lage sind, im Genom von Säugern selten sind. (Robbins (1981) Cell 23: 29); McArthur (1991) J. Biol. Chem. 266: 6000). Die genomische Stelle, die der Integrationsstelle des CTLA4-Ig-Plasmids in der Zelllinie P benachbart ist, stellte eine dieser einzigartigen Stellen mit den für Genamplifikation und hohe transkriptionale Aktivität notwendigen Elementen dar.
Die Konstruktion von homologen Rekombinationsvektoren zur Lieferung von rekombinanten Genen an die genomische Stelle, die dem CTLA4-Ig-Gen in CHO-Zellen benachbart ist, erforderte die Clonierung der flankierenden genomischen DNA der Zelllinie P und Insertion des clonierten Fragments in einen geeigneten eukaryontischen Expressionsvektor unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind (vgl. z.B. Yarnold et. al. (1994) Cancer Research 54: 506; Adair (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 4574; Smith et. al., (1989) J. Mol. Bio. 213: 415). Diese Aufgabe wurde bewältigt, indem zunächst die Größe der mit Hilfe von EcoRI erzeugten DNA-Fragmente, die die Integrationsstelle flankierten, kartiert wurde, anschließend eine genomische CHO-Bibliothek in E. coli konstruiert wurde und individuelle Plasmid-DNA, die die genomischen Fragmente enthielt, isoliert wurde.
Eine Southern-Blot-Analyse ermöglichte die Kartierung der CTLA4-Ig-Integrationsstelle in CHO-Zellen (7). Die Patentanmelder verwendeten ein bekanntes, „DNA-Walking" genanntes Verfahren mit Hilfe der Southern-Blot-Analyse, um die CTLA4-Ig-Integrationsstelle in der CHO-Zelllinie P zu analysieren. Im DNA-Walking-Verfahren wurde eine bekannte Plasimd-DNA-Sequenz verwendet, um unbekannte genomische CHO-DNA, die die Plasmidsequenz flankierte, zu charakterisieren. Zur Analyse der CTLA4-Ig-Integrationsstelle wurden etwa zehn Mikrogramm genomischer CHO-DNA mit 100 Einheiten des EcoRI-Restriktionsenzyms (New England Biolabs) gespalten. Die mittels Restriktionsenzymen gespaltene genomische DNA wurde der Agarosegel-Elektrophorese auf 0,7% Agarosegelen bei 15 Volt über 12 Stunden unterworfen. Dieser Prozess trennt die DNA nach Molekulargröße auf, wobei sich DNA mit hohem Molekulargewicht oben befindet.
Die in die Agarosegele eingeschlossene genomische DNA wurde in 0,4 M NaOH über etwa 30 Minuten denaturiert und für 90 Minuten auf eine 0,45 Mikrometer-Nitrocellulosemembran (Boehringer und Mannaheim) unter Verwendung eines Vacuum-Blotters (BioRad) übertragen. Der aus dem Blotverfahren erhaltene Filter wurde in 2 × SSPE-Pufferlösung neutralisiert, und die DNA wurde unter Verwendung eines UV-Quervernetzungsapparates (Stratagene auf Stellung C3 für 20 Sekunden) mit der Membran quervernetzt. Die in der Southern-Blot-Analyse verwendete 1,2 kB große Hybridisierungssonde war ein PCR-Fragment, das unter Verwendung des Markierungs-Kits von Boehringer-Mannheim mit Digoxigenin markiert worden war. Das PCR-Fragment stammte vom bakteriellen beta-Lactamase-Gen und wurde unter Verwendung der nachstehenden Oligonucleotid-Primer hergestellt: Vorwärts gerichteter Primer:
Die mit Digoxigenin markierte DNA wurde mit Hilfe des Chemolumineszenz-Nachweis-Kits (Boehringer Mannheim) nachgewiesen. Der Nitrocellulosefilter mit der genomischen DNA wurde mit fünf Mikrolitern der Hybridisierungssonde in 5 ml Eazy-Hybridisierungspufferlösung (Boehringer Mannheim) über 16 Stunden bei 68°C hybridisiert. Der Filter wurde zweimal in 2 × SSC bei 65°C für 30 Minuten gewaschen, und der Filter wurde mit Hilfe des Chemolumineszenztest-Kits (Boehringer Mannheim) über 5 Minuten entwickelt. Diese Southern-Blot-Analyse ergab eine 7,5 kB große Linke Flankierende genomische CHO-Region („LFR" für linke flankierende Region), die mit der beta-Lactamase-Sonde hybridisierte. Die Restriktionskartierung des 7,5 kB großen Fragmentes ergab, dass es eine 2,5 kB große Plasmid-DNA mit dem beta-Lactamase-Gen und eine 5,0 kB große genomische CHO-DNA umfasste. In ähnlicher Weise wurde die mit EcoRI gespaltene genomische CHO-DNA in Southern-Blot-Analysen mit Plasmid-DNA als Sonde untersucht, die das 0,9 kB große CTLA4-Ig-Gen als eine Hybridisierungssonde enthielt, die unter Verwendung der PCR-Reaktion erzeugt wurde (PCR-Primer: Vorwärts gerichteter Primer:
Die Herstellung der mit Digoxigenin markierten Hybridisierungssonde und die Hybridisierungsbedingungen stimmten exakt mit den vorstehend beschriebenen Bedingungen überein. Da die Hybridisierungssonde, die zur Untersuchung der rechten flankierenden Region verwendet wurde, jedoch vom CTLA4-Ig-Gen (anstatt vom beta-Lactamase-Gen) stammte, ergab die Southern-Blot-Analyse eine Bande für eine 10,0 kB große Rechte Flankierende Region („RFR"). Dieses Hybrid-DNA-Fragment umfasste eine 5,0 kB große Plasmid-DNA (CTLA4-Ig und dhfr-Gen) und ein 5,0 kB großes Fragment aus genomischer CHO-DNA (7).
Auf der Southern-Blot-Analyse basierend wurde die genomische DNA der CHO-Zelllinie P verwendet, um die 7,5 und 10,0 kB großen flankierenden genomischen Fragmente zu clonieren. Genomische CHO-DNA wurde aus 1 × 10⁸ CHO-Zellen isoliert, die in 200 ml Serum-freiem PFCHO-Medium gezüchtet wurden. Nach Zentrifugation wurde der Zell-Niederschlag zur Isolierung der genomischen DNA unter Verwendung eines Kits zur DNA-Extraktion (Stratagene Inc.) weiter behandelt. Dieses Verfahren ergab 10 mg vollständiger genomischer DNA.
Zur Anreicherung von EcoRI-gespaltener genomischer CHO-DNA, die die flankierenden genomischen Sequenzen umfasste, wurde 1 mg der genomischen DNA mit 1000 Einheiten des EcoRI-Enzyms (New England Biolabs #101S – 20 Einheiten/Mikroliter) bei 37°C über 6 Stunden gespalten. Die Spaltung mit EcoRI wurde durch Phenol-Extraktion und Ethanol-Fällung beendet. Der Ethanol-Niederschlag wurde in 200 Mikrolitern Wasser wieder gelöst, und es wurde eine Agarosebett-Elektrophorese in Tris-Acetat-Pufferlösung bei konstanter Spannung (50 V) durchgeführt (Life Technologies-Elektrophorese-Einheit Modell 250). Die nach Größe aufgetrennte genomische DNA wurde auf DNA mit einem Molekulargewicht im Bereich zwischen 6,0 und 12,0 kB angereichert und unter Verwendung des QIAEX-Kits zur Gel-Extraktion (Qiagen Inc. # 20021) aus dem Gel zurück extrahiert. Dieses Verfahren ergab 26 Mikrogramm EcoRI-gespaltene, nach Größe angereicherte CHO-DNA-Fragmente.
Ein Mikrogramm genomischer DNA mit den EcoRI-Enden wurde in ein auf ähnliche Weise gespaltenes bakterielles Plasmid (pSTKN) inseriert, das ein Kanamycin-Phosphotransferase-Gen enthielt, das Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Kanamycin übertrug. Die T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) wurde verwendet, um die genomische und die Plasmid-DNAs zu verbinden und die genomische CHO-Bibliothek zu erzeugen. Die verbundene genomische CHO-DNA wurde unter Verwendung einer Elektroporationsausstattung (Bio-Rad #) in E. coli (XL1 Blue MRF' Stratagene Inc., # 200230) transformiert, um die genomische CHO-Bibliothek in E. coli zu erzeugen.
Um die 7,5 kB große linke flankierende Region zu clonieren, nutzten wir den Vorteil der Anwesenheit eines beta-Lactamase-Gens, das Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Ampicillin überträgt. Die E. coli-Zellen, die die genomische Bibliothek enthielten, wurden direkt auf Clone durchmustert, die gegen zwei Antibiotika resistent waren (amp^R und Kn^R); die amp^R wurde durch das LFR-Fragment, und die Kn^R wurde durch das bakterielle Plasmid (pSTKN) beigesteuert. Dieses Verfahren ergab acht bakterielle Clone, die gegen beide Antibiotika resistent waren. Schnelle DNA-Analyse der Plasmid-DNA dieser Clone ergab erwartungsgemäß Plasmide mit einem 7,5 kB großen EcoRI-Fragment, das erwartungsgemäß die Anwesenheit des LFR-Fragmentes anzeigte.
Clonierung der 10,0 kB großen rechten flankierenden Region verwendete herkömmliche molekularbiologische Techniken der Kolonie-Hybridisierung mit Hilfe eines mit P³² markierten CTLA4-Ig-Gens (DNA) als eine Hybridisierungssonde. Das Verfahren der Kolonie-Hybridisierung wird im Molecular Cloning Laboratory Manual (Cold Spring Harbor) beschrieben. Die radioaktiv markierte (γ-P³²dCTP)', für das CTLA4-Ig-Gen spezifische Hybridisierungssonde wurde unter Verwendung eines Nick-Translationskits, bezogen von Amersham Life Science (#N5000), hergestellt. Etwa eine Million E. coli-Clone wurden durchmustert, um sechs mögliche Clone zu isolieren, die das 10 kB große Fragment enthielten. Erneute Durchmusterung der möglichen Clone in einer zweiten Runde der Kolonie-Hybridisierung erzeugte nur zwei positive Clone. Die Plasmid-DNA von zwei positiven Clonen wurde unter Verwendung der schnellen Minilysat-Plasmid-DNA-Isolation (wie von Maniatis, Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1989) beschrieben) isoliert. Beide Clone erzeugten das erwartete 10,0 kB große EcoRI-Fragment, was die erfolgreiche Clonierung des RFR-Fragmentes anzeigte.
Ein Vergleich eines Spaltungsmusters der 7,5 kB und 10,0 kB großen genomischen Clone durch Restriktionsenzym ergab DNA-Banden mit gewöhnlichen Größen, was auf die Verdopplung der genomischen DNA an der Stelle der Plasmid-Integration hindeutete. Dies wurde durch DNA-Sequenzanalyse mit Hilfe eines automatischen DNA-Sequenziergeräts (Applied Biosystems – PRISM 310 Genetic Analyzer) bestätigt. Diese beiden Ergebnisse legten nahe, dass die linken und die rechten flankierenden Sequenzen identisch sind und durch DNA-Verdopplung an der Integrationsstelle entstanden sind (2). Diese Sequenzen werden hierin als FGSs (Flanking Genomic Sequences – Flankierende Genomische Sequenzen) bezeichnet.
DNA-Sequenzanalyse der 5,0 kB großen genomischen DNA ergab mehrere einzigartige Eigenschaften. Eine Suche nach DNA-Homologie mit der der GCG-Wisconsin-Software zur DNA-Sequenz-Datenanalyse legte nahe, dass die Sequenz einen transkriptionalen Hot Spot darstellt. Die clonierte FGS enthält ein DNA-Motiv, das einer in Hefe- und CHO-Zellen gefundenen Autonomen Konsensus-Replikationssequenz (ARS für Autonome Replikationssequenz) ähnlich ist (Sohn et al., (1996) Journal of Bacteriology 78(15): 4420; Mark et al., (1990) J. Mol. Biol. 211: 19). Die FGS enthalten auch Motive, die denen der MARs ähnlich sind, die gewöhnlich in transkriptionalen Hot Spots gefunden werden (Harmutt et al., (1995) Biochemistry 34: 4108). Mit dieser Information, dass die clonierte DNA ein transkriptionaler Hot Spot der CHO-Zellen ist, fuhren wir fort, homologe Rekombinationsvektoren zu erzeugen.
Man nimmt an, dass Integration von exogener DNA in das Genom von Säugern in den meisten Fällen durch einen Prozess eintritt, der mit DNA-Bruch an zufälligen Stellen im Zielgenom verbunden ist. Kürzlich wurden Modelle sowohl für endogene Gen-Amplifikation als auch die Amplifikation von heterologer transfizierter DNA aufgestellt. Ein Bestandteil dieser Modelle ist die Beteiligung einer langen inversen Verdopplung an der Stelle der Integration als ein erster Schritt bei der Gen-Amplifikation (Heartlein, M. W. et al. (1988) Nucleic Acid Research 17(4): 1697–1716; Passananti, C. et al., (1987) EMBO J. 6: 1697–1703). Ein wesentlicher Bestandteil dieses Modells ist die Integration der Plasmid-DNA in ein A-T-reiches repetitives Element im Genom der Wirtszelle als eine Vorstufe zur Bildung der inversen Wiederholung und anschließenden Gen-Amplifikation.
Das Vorkommen von inverser Verdopplung an der Stelle der CTLA4-Ig-Integration in der Zelllinie P und das Vorkommen von drei getrennten repetitiven Elementen in der HIRPE-Sequenz stehen im Einklang mit dem aufgestellten Modell. Das Vorkommen von repetitiven Elementen in HIRPE in einem homologen Insertions-Rekombinationsvektor könnte die Bildung von inverser Wiederholung und die Gen-Amplifikation, die zu hoher Expression notwendig ist, erleichtern.
Beispiel 2: Rekombinationsvektoren
Homologe Rekombination wird als ein machtvolles Werkzeug zur genetischen Manipulation in Hefe angesehen, da es genaue, stellenspezifische Gen-Integration und Expression des Gens von Interesse erlaubt (Orr-Weaver, T. L. et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78(10): 6354–8). Mögliche Anwendung homologer Rekombinationstechnik in kultivierten Säugerzellen wird jedoch von den illegitimen Rekombinationsereignissen und dem Fehlen von geeigneten Selektionstechniken überdeckt. Homologe Insertion eines rekombinanten Gens in einen Hot Spot erlaubt, die erhöhte Häufigkeit von Zelllinien mit hoher Expression von rekombinantem Protein zu untersuchen. Dieses Konzept ist in einer vorausgehenden Veröffentlichung als ein Beispiel dafür beschrieben worden, wie ein homologes Rekombinationssystem zur Expression von Antikörpern für murine Zellen erzeugt werden kann (Gregory et al., WO 95/17516).
Die vorliegende Erfindung unterscheidet sich jedoch von dem, was auf dem Fachgebiet bekannt ist, durch seine breitere Anwendbarkeit auf alle rekombinanten Gene, die Auswahl der genomischen CHO-Stelle, der Fähigkeit, die clonierten rekombinanten Gene beständig zu amplifizieren und durch die Erzeugung einer genomischen Verdopplung an der Stelle der Plasmid-Integration.
Wie vorstehend beschrieben, sind die homologen Rekombinationsvektoren eukaryontische Expressionsvektoren, die die notwendigen Elemente zur Transkription und Translation von Genen zu Proteinen beinhalten. Die hierin beschriebenen homologen Rekombinationsvektoren sind nochmals veränderte Vektoren, die von dem Vektor pcDNA3 (Invitrogen Inc.) abstammen und das DHFR-Gen als die dominante Selektionsmarkierung enthalten. Dieser Expressionsvektor kann in die CHO-Wirtszellen DG44- und DUKXB11-Zellen, denen das Enzym Dihydrofolat-Reduktase fehlt, eingeführt werden, und Transfektome werden gegen den Hintergrund durch Ergänzung der Funktion des DHFR-Gens selektiert (Methotrexat-Stoffwechsel in mutierten Ovar-Zellen des chinesischen Hamsters, denen Dehydrofolat-Reduktase fehlt (Joannon, P. et al., (1987) Biochem-Pharmacol. 36(7): 1091; Urlaub et al., (1980) Proc. natl. Acad. Sci. USA 77: 4216).
Der homologe Insertions-Rekombinationsvektor, als pTV(I) bezeichnet, umfasste die gesamte 5,0 kB große clonierte genomische DNA mit der HIRPE-Sequenz (SEQ ID NR: 1) (3). Dieses genomische Fragment wurde mit einer Not I-Restriktionsstelle an dem 5'-Ende und bündigem glattendigen 3'-Ende wieder hergestellt und in einen pcDNA/DHFR/CTLA4-Ig-Expressionsvektor cloniert, der zuvor mit kompatiblen Restriktionsenzymen gespalten worden war. Der resultierende homologe Vektor pTV(I) enthielt die genomische CHO-DNA am 5'-Ende des rekombinanten CTLA4-IG-Gens (3). Die Plasmid-DNA wurde unter Verwendung des Midi-Plasmid-Isolations-Kits, zu beziehen durch QUIAGEN Inc., gereinigt. Das pTV(I)-Plasmid wurde mit dem EcoRI-Restriktionsenzym linearisiert und in CHO-DG44-Zellen durch Elektroporese eingeführt.
Nach einer kurzen Erholungszeit (72 Stunden) in PFCHO-Medium (JRH Biosciences, Serum-frei, Protein-frei # 14602-79P), das Nucleoside (Hypoxanthin 16 μg/ml und Thymidin 0,2 μg/ml) enthielt, wurden die Zellen in PFCHO-Medium ohne Nucleoside und in einem Medium, das 5% dialysiertes fötales Kälberserum mit 20 nM Methotrexat enthielt, selektiert. Die Zellen wurden auf zehn Platten mit 96 Vertiefungen (960 Vertiefungen) verteilt. Nach einer dreiwöchigen Inkubationszeit waren in einem ELISA-Test etwa 120 Transfektome positiv für Expression von CTLA4-Ig. Sechs Clone (5%) erzeugten die primären CTLA4-Ig-Protein-Titer von mehr als fünf Mikrogramm/ml (Tabelle I). Die besten sechs Clone wurden in T-75-Gewebekulturflaschen vermehrt, und genomische CHO-DNA wurde für die Southern-Blot-Analyse unter Verwendung eines Isolations-Kits für genomische DNA, von Stratagene Inc. zu beziehen, hergestellt.
Herkömmliche Expressionsvektoren (z.B. pcDNA3/Neo^R und pcDNA/dhfr) ergaben Transfektome mit den höchsten Titern für CTLA4-Ig-Protein von 5 Mikrogramm/ml (μg/ml). Bei Transfektomen, die mehr als 5 μg/ml produzierten, galt die HIRPE-Sequenz als erfolgreich eingebaut und erhöhte Expression zeigend. Da 5 μg/ml der beste Proteintiter ist, den man mit einem herkömmlichen Expressionsvektor erlangen kann, wird jedes Transfektom, das mehr als 5 μl/ml eines gewünschten Proteins, z.B. des CTLA4-Ig-Proteins, in primären Titern exprimiert, als signifikant und eine „Erhöhung" der Expression darstellend angesehen.
Tabelle I
Die sechs Clone in der vorstehenden Tabelle 1 stellen die besten CTLA4-Ig produzierenden Transfektome dar, die unter Verwendung des Insertions-Zielvektors pTV(I) erzeugt wurden. Alle sechs in Tabelle I aufgeführten Clone enthalten die 5,0 kB große genomische DNA. Die vier fett gedruckten Clone zeigen an, dass die genomische DNA von diesen Clonen durch Southern-Blot-Analysen untersucht wurden. Die Clone 2C5 und die 2F2-Clone (nicht fett gedruckt) wurden nicht durch Southern-Blot-Analysen untersucht. NB bedeutet „Nicht Bestimmt" und wurde verwendet, um Clone zu kennzeichnen, die nicht durch Southern-Blot-Analysen untersucht wurden.
In unseren Kontroll-Transfektionen unter Verwendung von (pcDNA/dhfr) fanden wir keine Transfektome, die CTLA4-Ig-Titer von 5 μg/ml oder mehr exprimierten. Herkömmliche, bei uns vorhandene Zufalls-Integrationsvektoren produzierten 1/1000 Transfektome, die das gewünschte Protein, das heißt CTLA4-Ig, in Titern von 5 μl/ml produzierten; basierend auf dieser Zahl kann man vorhersagen, dass die Häufigkeit von Hochproduzenten bei Verwendung von Zufalls-Integrationsvektoren etwa 1/1000 (0,1%) beträgt. Die hierin gezeigten Daten zeigen, dass homologe Rekombinationsvektoren, die den HIRPE der vorliegenden Erfindung umfassen, im Vergleich zu herkömmlichen Kontrollvektoren die Häufigkeit von 0,1% (Kontrollen) auf 5% erhöhen, Transfektome mit hohen Titern für rekombinantes Protein zu erhalten. Dies stellt gegenüber Zufalls-Integrationsvektoren eine 50-fache Erhöhung der Häufigkeit, einen Hochproduzenten zu erhalten, dar.
Southern-Blot-Analyse wurde verwendet, um bei vier unabhängigen Transfektomen die Integrationsstelle für das pTV(I)-Plasmid zu erforschen. Die genomische DNA der Transfektome wurde auf Folgendes untersucht: (a) ähnliches Muster von DNA-Banden zwischen Clonen, was Stellen-spezifisches Ansteuern eines Ziels vermuten ließ; und (b) die Anwesenheit eines Drei-Banden-Musters als Nachweis für die Bildung von inverser Wiederholung an der Stelle der Integration. Genomische DNA wurde unter Verwendung des Genomic DNA Isolation Kit von Stratagene, Inc., aus vier unterschiedlichen Transfektomen hergestellt. Etwa zehn Mikogramm genomischer CHO-DNA wurden mit Kpn I-Restriktionsenzym über 12 Stunden bei 37°C gespalten. Die mit Kpn I gespaltene genomische DNA wurde mittels 0,7% Agarosebett-Gelelektrophorese bei 15 V über 16 Stunden aufgetrennt. Die im Gel eingebettete genomische DNA wurde mit 0,4 M NaOH denaturiert und mit Hilfe eines Bio-Rad Vakuum-Blotters auf einen 0,45 Mikron-Nitrocellulosefilter übertragen.
PCR-Amplifikation wurde verwendet, um zwei Hybridisierungssonden von 200 Bp bzw. 500 Bp aus verschiedenen Regionen der 5,0 kB großen genomischen DNA zu erzeugen. Die Hybridisierungssonde mit 200 Bp wurde mit Hilfe der PCR-Primer
CTAGCCTGCCTCACAAGCTTG (SEQ ID NR: 6)
und
GAGTCAGCCTGAGATACATAG (SEQ ID NO: 7)
erzeugt. In ähnlicher Weise wurde die 500 Bp große Hybridisierungssonde mit Hilfe der PCR-Primer
GCATTTCAGCZTGGTTGGCTAGC (SEQ ID NO: 8)
und
GGACTTCATGTCTTCTCTCCTGC (SEQ ID NO: 9)
erzeugt. Wie vorstehend in Beispiel 1 beschrieben, enthalten die Hybridisierungssonden mit Digoxigenin markiertes UTP (Boehringer Mannheim) und sie werden durch den Chemolumineszenz-Nachweis (Boehringer Mannheim) nachgewiesen. Die beiden Hybridisierungssonden wurden in gleichen Volumina vermischt und unter Verwendung ähnlicher Hybridisierungsbedingungen, wie vorstehend beschrieben (Beispiel 1), an Nitrocellulose hybridisiert. Southern-Blot-Analyse der genomischen DNA der Eltern-Zelllinie P, die mit EcoRI gespalten und mit den vermischten Hybridisierungssonden (200 Bp und 500 BP) hybridisiert worden war, erzeugte drei EcoRI-DNA-Banden. Diese Ergebnisse legen nahe, dass zwei der EcoRI-Banden das Ergebnis der Bildung einer inversen Wiederholung an der Stelle der Integration sind, und die dritte Bande ist das ungestörte genomische Homolog. Fachleute auf dem Gebiet können das Muster der drei DNA-Banden als eine Referenzmarkierung verwenden, um andere erzeugte Transfektome zu analysieren, indem der selbe Expressionsvektor zum Nachweis Stellen-spezifischer Integration verwendet wird.
Southern-Blot-Analyse der genomischen DNA der ersten vier Produzenten, die den pTV(I)-Vektor (IAI, 3C3, 3C11 und 6B8) enthielten und mit EcoRI gespalten wurden, erzeugten ein Drei-Banden-Muster, das drei der vier analysierten Clone gemein haben. Die Anwesenheit des Drei-Banden-Musters in den neuen Transfektomen stimmt mit der Bildung einer inversen Wiederholung an der Stelle der Plasmid-Integration überein. Zweitens legt die Anwesenheit eines Drei-Banden-Musters von identischer Größe in diesen Transfektomen nahe, dass homologe Rekombinationsvektoren unabhängig voneinander auf eine identische Stelle im CHO-Genom gerichtet waren, wobei eine hohe Expression eines rekombinanten Gens erzeugt wurde (5). Die Southern-Blot-Analyse legt darüber hinaus nahe, dass der 5,0 kB große HIRPE Motive enthält, die die Bildung von inversen Wiederholungen und Gen-Amplifikation induzieren, was zu hoher Expression führt.
Zufällige Plasmidintegration ist der bevorzugte Modus der Integration bei CHO-Zellen (> 99%). Ereignisse homologer Rekombination in CHO-Zellen liegen unter 0,1–0,3% (Thomas et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 615). Die Ereignisse zufälliger Integration erfordern allgemein keine umfangreiche DNA und könnten möglicherweise die gesamte DNA des Plasmids (einschließlich der 5,0 kB großen genomischen DNA) als ein Substrat verwenden. Wenn ein solches Ereignis auftritt, kann der Expressionsvektor pTV(I) an einer Stelle integrieren, die sich von der homologen Stelle unterscheidet. In der vorliegenden Anmeldung legt die Southern-Blot-Analyse nahe, dass der neue Vektor der Anmelder gegen eine überwältigende Überzahl in einer Mehrheit hoch produzierender Clone an einer einzigen genomischen Stelle in CHO-Zellen integriert.
Um unabhängig zu bestätigen, dass das pTV(I)-Plasmid beständig CHO-Transfektome mit hohen Titern für rekombinantes Protein erzeugt, wurde eine zweite Transfektion des pTV(I)-Plasmids in die CHO-DG44-Zelllinie durchgeführt. Die Ergebnisse der zweiten Transfektion werden nachstehend in Tabelle II dargestellt. Die Ergebnisse der zweiten Transfektion bestätigen, dass der pTV(I)-Vektor beständig über Integration an einer bevorzugten Stelle Transfektome mit hohen Titern für rekombinantes Protein erzeugt. Die fett gedruckten Clone in Tabelle II zeigen an, dass sie anschließend durch Southern-Blot-Analysen untersucht wurden, um Stellen-spezifische Integration darzustellen. „NB" bedeutet nicht untersucht.
Tabelle II
Während der Sequenzierung der 5,0 kB großen genomischen DNA stießen wir auf ein A-T-reiches Motiv, das zu 70% A-T-reich war, welches sich möglicherweise auf Grund von sterischen Hinderungen in einer PCR-Reaktion mit Digoxigenin markiertem dTTP (Desoxynucleosidtriphosphat) nicht amplifizieren ließ. Übereinstimmend enthalten hoch exprimierte Gene in Genomen von Säugern cis-agierende Elemente, die überwiegend A-T-reich sind (Mehta (1996) J. Biol. Chem. 271(52): 33616). Dies führte zu der Bewertung des A-T-reichen Motivs in der 5,0 kB großen genomischen CHO-DNA als ein cis agierendes Element, das Expression eines rekombinanten Gens stromabwärts erhöht. Wir konstruierten zwei isogene Insertionsvektoren pTV(I)/1,6 (die Nucleotide 3050 bis 4676 der SEQ ID NR: 1 umfassend) und pTV(I)/1,4 (die Nucleotide 3050 bis 4485 der SEQ ID NR: 1 umfassend) unter Verwendung von PCR-Amplifikation und Clonierung des gewünschten Produktes in den Vektor, der das CTLA4-Ig-Gen als das Test-Gen (gewünschtes Gen) und das DHFR-Gen als die positive Selektionsmarkierung enthielt. Wie hierin beschrieben, wurde der Vektor pTV(I)/1,4, der 1435 Nucleotide der 5,0 kB großen genomischen DNA umfasste, mit Hilfe der PCR-Primer
AGCCTATCTCCATTCGTCA (SEQ ID NO: 10)
und
CCGCCGAATTCATGTCTGTGTTCCTGTTAGTG (SEQ ID NO: 11)
erzeugt. Der Vektor pTV(I)/1,6 (1626 Nucleotide der 5,0 kB großen genomischen DNA umfassend) wurde in der PCR-Reaaktion mit den PCR-Primern
AGCCTATCTCCATTCGTCA (SEQ ID NO: 12)
und
CCGCCGAATTCAACCACATGGTGGCTCACAA (SEQ ID NO: 13)
erzeugt. Die aus der PCR stammenden Fragmente wurden in den selben vorstehend beschriebenen Expressionsvektor cloniert, der das CTLA4-Ig-Reportergen und die dhfr-Selektionsmarkierung enthielt. Diese beiden neuen Vektoren haben das gleiche 5'-Ende, wie sie mit dem gewöhnlichen vorwärts gerichteten Primer erzeugt werden, während das 3'-Ende des 1,4 kB großen HIRPE etwa 200 Bp kürzer ist als der 1,6 kB große HIRPE. Bei der Transformation in die CHO-DG44-Zellen erzeugten beide Vektoren etwa 120 Transfektome, die in einem ELISA-Test positiv für die Expression des CTLA4-Ig-Proteins waren (Symington et al., (1993) J. Immunol. 150(4): 1286). Wurden jedoch die Titer für CTLA4-Ig der vier reproduzierten Clone in jeder Klasse miteinander verglichen, exprimierten die Transfektome, die den Vektor pTV(I)/1,6 enthielten, etwa viermal höhere Titer für das CTLA4-Ig-Protein, während die Transfektome, die den Vektor pTV(I)/1,4 enthielten, die Expression des CTLA4-Ig-Proteins nicht signifikant verbesserten (vgl. 8). Aus diesen Ergebnissen wurde geschlossen, dass das 200 Bp große A-T-reiche Motiv in der 5,0 kB großen genomischen DNA als ein cis-agierendes Element wirkt, das Expression eines rekombinanten Gens in CHO-Zellen erhöht.
Die nachstehende Beschreibung stellt die Vorteile von homologen Replacement-Vektoren und die Herstellung eines Replacement-Vektors pTV(R), der die 5,0 kB große genomische DNA enthält, im Einzelnen dar. Homologe Rekombination zwischen eingeführter und chromosomaler DNA unter Verwendung von Replacement-Vektoren wird weithin verwendet, um fremde DNA in Säugerzellen einzuführen. Es gibt viele Variablen, die homologe Rekombination in CHO-Zellen beeinflussen, einschließlich, aber nicht hierauf begrenzt, der genetischen Stelle, der Menge der homologen Sequenz und der positiven Selektionskassette. Obgleich die Replacement-Vektoren eine fünf- bis zehnfach niedrigere Häufigkeit homologer Rekombination aufweisen, besitzen sie den Vorteil der stabilen Integration der Insertion (rekombinantes Gen), während die fremden Plasmidsequenzen während des Rekombinationsereignisses ausgeschnitten werden. Dies steht im Gegensatz zu dem Insertionsvektor (pTV(I)), bei dem die gesamte Plasmidsequenz inseriert wird. Darüber hinaus werden Replacement-Vektoren wegen der allgemein anerkannten Anreicherungsverfahren für Stellen-spezifische Integration bevorzugt, die bei dem Replacement-Vektor anwendbar ist (Hasty et al., (1991) Mol. Cell. Bio. 11: 4509). Schließlich liefert der Replacement-Vektor in Verbindung mit dem HSV-tk-Gen das am häufigsten benutzte Anreicherungsverfahren, das zur Isolation von Transfektomen verwendet wird, die auf homologer Rekombination beruhen (Zheing et al., (1990) Nature 344: 170).
Das Nucleosid-Analog Acyclovir tötet selektiv Säugerzellen, die das HSV-Thymidinkinase („HSV-tk")-Gen exprimieren. Das HSV-tk wandelt Acyclovir in eine phosphorylierte Form um, die für die Zelle toxisch ist. Als ein Ergebnis werden nur jene Zellen getötet, die HSV-tk exprimieren, und nicht die normalen CHO-Zellen. Das HSV-tk-Gen wird strategisch im Replacement-Vektor in einer Region platziert, die das HSV-tk-Gen im Anschluss an die homologe Rekombination deletiert, während bei allen anderen Rekombinationsereignissen (Zufallsintegrationen) das Gen behalten wird. Als ein Ergebnis überleben Transfektome, die aus Ereignissen homologer Rekombination entstehen, die Selektion durch Acyclovir, während andere Transfektom-Klassen getötet werden (Evrard et al., (1996) Cell. Biol. Toxicol. 12(4–6): 345).
Der pTV(R)-Vektor enthält eine 1,6 kB große genomische DNA, die die A-T-reiche Region enthält, am 5'-Ende der Expressionskassette für CTLA4-Ig und das 2,2 kB große flankierende genomische Fragment am 3'-Ende der DHFR-Selektionsmarkierung (4). Die Clonierung der genomischen DNA in zwei Teile wird durchgeführt, indem mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion zwei neue Restriktionsstellen geschaffen werden, ein Verfahren, dass Fachleuten auf dem Gebiet der rekombinanten DNA-Technik vertraut ist. Der Replacement-Vektor wurde entworfen, um das HSV-tk-Gen in den aus homologer Rekombination stammenden Transfektomen abzutrennen, während die illegitimen Rekombinanten das aktive HSV-tk-Gen beibehalten. Als Ergebnis werden alle illegitimen Rekombinanten, die das aktive HSV-tk-Gen behalten, selektiv durch den Inhibitor Acyclovir getötet und den aus einer Stellen-spezifischen Rekombination stammenden Clonen ist es selektiv möglich zu wachsen (Pfizer et al., (1987) Am. J. Cancer 40: 114; Davidson et al., (1981) Virology 113: 9).
Die Strategie der selektiven Anreicherung von Stellen-spezifischen Rekombinanten ergab die erwarteten Ergebnisse, und 10% aller erzeugten Transfektome, die den Replacement-Vektor verwendeten, überlebten die Selektion. Elektroporation des pTV(R)-Vektors in die CHO-Zelllinie DG44 erzeugte 860 Transfektome, die die erste Runde der Selektion mit 20 nM Methotrexat überlebten. Nach der zweiten Selektion mit 1,0 mM Acyclovir überlebten jedoch nur noch 94 Transfektome (10%). Die Transfektome, die die doppelte Selektion überlebten, waren auf Stellen-spezifische Rekombinationsereignisse zurückzuführen. Alle 94 Transfektome wurden auf Titer des CTLA4-Ig-Proteins durchmustert. Die ersten sechs Transfektome mit den höchsten Titern für das CTLA4-Ig-Protein werden in der nachstehenden Tabelle III dargestellt.
Tabelle III
Die genomische DNA der sechs Transfektome (d.h. IC9, 2B11, 3D5, 4F4, 5C4 und 6F1) wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt. Die genomische DNA wurde mit dem Bsp 1201-Restriktionsenzym gespalten und der Southern-Blot-Analyse unterworfen, wobei die 200 Bp und 500 Bp großen, durch PCR erzeugten Hybridisierungssonden, die im vorstehenden Abschnitt beschrieben wurden, verwendet wurden. Die Agarose-Gelbett-Elektrophorese und die Hybridisierungsbedingungen einschließlich der Waschungsbedingungen waren identisch mit den vorstehend beschriebenen Bedingungen. Das Muster der DNA-Banden aller sechs analysierten Clone zeigte ein identisches Zwei-Banden-Muster mit Banden von 3,5 kB beziehungsweise 2,7 kB (6). Aus diesen Ergebnissen wurde geschlossen, dass die 2,7 kB-DNA-Bande das unbeschädigte genomische Homolog darstellt, und dass die 3,5 kB große DNA eine Hybrid-Bande ist, die das Plasmid und die genomische DNA enthält, die die Integrationsstelle im CHO-Genom darstellt. Die Anwesenheit eines gewöhnlichen 3,5 kB großen Hybrid-Fragmentes aus allen sechs analysierten Transfektomen weist darauf hin, dass homologe Replacement-Vektoren selektiv an einer spezifischen Stelle im CHO-Genom integriert werden. Darüber hinaus blieb die Proteinproduktion hoch, nachdem die Anzahl der erzeugten Transfektome mit Hilfe des HSV-tk-Gens in den Replacement-Vektoren, die das HIRPE-Gen der vorliegenden Erfindung (SEQ ID NR: 1) oder ein Fragment hiervon (Nucleotide 3050 bis 4676 der SEQ ID NR: 1) enthielten, reduziert worden war.
Die vorstehende Offenlegung zeigt, dass die vorliegende Erfindung einen einzigartigen und zuverlässigen Weg eröffnet, um die Expression rekombinanter Proteine zu erhöhen. Mit Verwendung der von den Erfindern mitgeteilten HIRPE-Sequenz (SEQ ID NR: 1) oder einem Fragment der SEQ ID NR: 1, das HIRPE-Aktivität aufweist (bevorzugt das in SEQ ID NR: 2 dargestellte Fragment) können Fachleute auf dem Gebiet nicht nur den Prozentsatz von erfolgreich transfizierten Zellen erhöhen, sondern sie können auch die Expression in diesen transfizierten Zellen erhöhen.
Obwohl die vorliegende Erfindung einigermaßen genau durch Illustration und Beispiel zum Zwecke der Klarheit und Verständlichkeit beschrieben worden ist, wird offensichtlich sein, dass gewisse Änderungen und Modifikationen innerhalb des Rahmens der anhängenden Ansprüche durchgeführt werden können.

Claims

Isoliertes Nucleinsäuremolekül umfassend eine Nucleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) dem Nucleinsäuremolekül enthalten in ATCC-Hinterlegungsnummer 203153; (b) einem Fragment von SEQ ID NR: 1, wobei das Fragment die Expression eines rekombinanten Proteins von Interesse steigern kann, wenn das Nucleinsäurefragment in einen Expressionsvektor eingebaut ist; (c) Nucleinsäuresequenzen, die zu mindestens 80% identisch sind in der Nucleotidsequenz zu (a) oder (b), wobei die Nucleinsäuresequenzen die Expression eines rekombinanten Proteins von Interesse steigern können, wenn die Nucleinsäuresequenzen in einen Expressionsvektor eingebaut sind; und dem Komplementär zu einem der Punkte (a) bis (c).
Expressionsvektor, der die Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 1 umfasst.
Expressionsvektor nach Anspruch 2, der weiterhin einen selektierbaren Marker umfasst.
Expressionsvektor nach Anspruch 2 oder 3, der weiterhin eine Nucleinsäuresequenz umfasst, die das Gesamte oder einen Teil eines Proteins von Interesse codiert.
Expressionsvektor nach Anspruch 4, wobei das Protein von Interesse CTLA4-Ig oder eine Variante davon ist.
Wirtszelle, die mit dem Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 2 bis 5 transformiert ist.
Zelle nach Anspruch 6, die eine CHO-Zelle ist.
Verfahren zum Erhalt eines rekombinanten Proteins, das die Züchtung einer transformierten Wirtszelle nach Anspruch 6 oder 7 unter Bedingungen, welche die Expression des Proteins fördern und die Gewinnung des Proteins umfasst.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Protein ein CTLA4-Ig-Molekül ist.
Verwendung eines in 9 gezeigten Oligonucleotids zur Gewinnung einer Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 1.