JP2011507512A - タンパク質の製造のための酵母株 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は分子生物学の分野に関する。特に、本発明は、形質転換された発現系からのタンパク質産生の改善に使用される新規選択遺伝子に関する。
近年、出芽酵母ピチア・パストリス(Pichia pastoris)は、学術的および商業的に関心のある異種タンパク質の発現のための、人気のある生物となっている(Cereghinoら,Curr.Opin.Biotechnol.4:329−332(2002);CereghinoおよびCregg,FEMS Microbiol.Rev.24:45−66(2000))。ピチア・パストリス(P.pastoris)グリコシル化装置を遺伝的に修飾し、複合型ヒトグリカンで修飾された異種糖タンパク質を発現させることが可能であることが最近示された(Choiら,Proc.Natl.Acad.Sci.100:5022−5027(2003);Hamiltonら,Science 301:1244−1246(2003);Bobrowiczら,Glycobiology 14:757−766(2004);Hamilton,Science,313:1441−1443(2006))。しかし、形質転換ピチア・パストリス(P.pastoris)細胞系のような形質転換細胞における、より高い細胞産生を達成するための方法および物質に対する需要が依然として存在する。
本発明は、組換えタンパク質を発現させるための発現系としての酵母または糸状菌のような下等真核細胞の使用のための方法および物質を提供する。
本明細書中で特に定められていない限り、本発明に関して用いる科学技術用語および表現は、当業者に一般に理解されている意義を有するものとする。さらに、文脈に矛盾しない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載の生化学、酵素学、分子細胞生物学、微生物、遺伝学ならびにタンパク質および核酸の化学およびハイブリダイゼーションに関して用いる名称、ならびにそれらの技術は、当技術分野においてよく知られており一般に用いられているものである。一般に、本発明の方法および技術は、特に示さない限り、当技術分野でよく知られている通常の方法に従い、ならびに本明細書中に引用され記載されている種々の全般的およびより具体的な参考文献に記載されているとおりに行われる。例えば、Sambrookら,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989);Ausubelら,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992,and Supplements to 2002);HarlowおよびLane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990);Taylor and Drickamer,Introduction to Glycobiology,Oxford Univ.Press(2003);Worthington Enzyme Manual,Worthington Biochemical Corp.,Freehold,NJ;Handbook of Biochemistry:Section A Proteins,Vol I,CRC Press(1976);Handbook of Biochemistry: Section A Proteins,Vol II,CRC Press(1976);Essentials of Glycobiology,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1999)を参照されたい。本明細書に記載の全ての刊行物、特許および他の参考文献の全体を、参照により本明細書に組み入れることとする。
本発明は、組換えペプチド、タンパク質または機能性核酸を発現させるための発現系としての下等真核細胞、例えば酵母または糸状菌の使用のための方法および物質を提供する。1つの態様においては、該方法は、下等真核細胞の、より遅く成長するade2栄養要求性株を入手または構築し、プロモーターに連結されたADE2マーカー遺伝子またはオープンリーディングフレーム(ORF)をコードする核酸および関心のある組換えタンパク質または機能性核酸を発現する核酸を含みade2栄養要求性株のゲノム内に組込まれうる組込みベクターを該細胞内に導入することを含む、組換えタンパク質を発現させるための方法を提供し、ここで、該組込みベクターは該ade2栄養要求性株のゲノム内に組込まれ、該ADE2は該栄養要求性株をアデニンに関して原栄養性にし、該組換えペプチド、タンパク質または機能性核酸が発現される。該組換え宿主細胞は、代謝産物アデニンを欠く培地において選択されるが、代謝産物アデニンを欠く培地において、または代謝産物アデニンを含む培地において維持されうる。一般に、ADE2マーカーを喪失しうる組換え宿主細胞(復帰変異体)は、より遅く成長し、該組換え細胞が成長するにつれて経時的に喪失するであろう。経時的な復帰変異体の喪失は、該組換え宿主細胞が、代謝産物アデニンを含む培地において成長するか又は代謝産物アデニンを欠く培地において成長するかに無関係に生じるであろう。
組換えDNAの実施には大腸菌(Escherichia coli)株DH5αを使用した。酵母株の構築には野生型ピチア・パストリス(P.pastoris)株NRRL−Y 11430を使用した(ATCC#76273)。EXTAQ(TaKaRa)、Taq Poly(Promega)またはPfu Turbo(登録商標)(Stratagene,La Jolla,CA)を使用して、供給業者の推奨に従い、PCR反応を行った。制限および修飾酵素はNew England Biolabs(Beverly,MA)から入手した。酵母株は、YPD(1% 酵母エキス、2% ペプトン、2% デキストロースおよび1.5% 寒天)または合成規定培地(1.4% 酵母窒素塩基、2% デキストロース、4×10−5% ビオチンおよび1.5% 寒天)(適宜補足されたもの)において成長させた。酵母の形質転換は、記載されているとおりに(Nettら,2005)、エレクトロポレーションにより行った。4〜20% プレキャストTRIS−SDSゲルおよびMini PROTEAN 3セル(Biorad)を製造業者の説明に従い使用して、クーマシーゲルおよびウエスタンブロットを行った。検出のための一次抗体は以下のものであった:ヤギ抗ヒトIgG(Fc)#31413(Pierce)(Herceptin用、1:10000希釈)、抗ヒトEPO #sc7956(Santa Cruz Biotechnology)(1:500希釈)、抗GBAウサギポリクローナル(特製)(Rockland Immunochemicals,Inc.)(1:500希釈)。
Claims (33)
- (a)栄養要求性選択マーカータンパク質をコードする内因性遺伝子が宿主細胞のゲノムから除去された該宿主細胞と、
(b)組込みベクター[該組込みベクターは、
(1)弱いプロモーター、減衰化内因性もしくは異種プロモーター、潜在性プロモーター、トランケート化内因性もしくは異種プロモーターに機能的に連結された又はプロモーターを伴わない、該栄養要求性選択マーカータンパク質をコードする内因性遺伝子の機能に相補的な機能をコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を有する核酸、
(2)関心のあるペプチド、タンパク質および/または機能性核酸をコードする核酸を含む1以上の発現カセットの挿入のための挿入部位を有する核酸、ならびに
(3)相同組換えによる該宿主細胞のゲノムの特定の位置への該組込みベクターの挿入を導く標的化核酸を含む]とを含む発現系。 - 該栄養要求性選択マーカータンパク質が、ADE、URAおよびLYSよりなる群から選ばれる遺伝子によりコードされている、請求項2記載の発現系。
- 該栄養要求性選択マーカータンパク質がADE1遺伝子によりコードされている、請求項2記載の発現系。
- 該栄養要求性選択マーカータンパク質がADE2遺伝子によりコードされている、請求項2記載の発現系。
- 該組込みベクターが、前記の1以上の異種ペプチドまたはタンパク質をコードする1以上の発現カセットの挿入のための複数の挿入部位を含む、請求項2記載の発現系。
- 該組込みベクターが2以上の発現カセットを含む、請求項2記載の発現系。
- 該組込みベクターが、それらの発現カセット間に相同DNA配列をほとんど又は全く含まない、請求項6記載の発現系。
- 該組込みベクターが、モノクローナル抗体の軽鎖をコードする第1発現カセットと、モノクローナル抗体の重鎖をコードする第2発現カセットとを含む、請求項6記載の発現系。
- 該宿主細胞が下等真核生物である、請求項2記載の発現系。
- 該宿主細胞が、ピチア・パストリス(Pichia pastoris)、ピチア・フィンランディカ(Pichia finlandica)、ピチア・トレハロフィラ(Pichia trehalophila)、ピチア・コクラメ(Pichia koclamae)、ピチア・メンブラネファシエンス(Pichia membranaefaciens)、ピチア・ミヌタ(Pichia minuta)[オガタエア・ミヌタ(Ogataea minuta)、ピチア・リンドネリ(Pichia lindneri)]、ピチア・オプンチエ(Pichia opuntiae)、ピチア・テルモトレランス(Pichia thermotolerans)、ピチア・サリクタリア(Pichia salictaria)、ピチア・グエルクウム(Pichia guercuum)、ピチア・ピエペリ(Pichia pijperi)、ピチア・スティプティス(Pichia stiptis)、ピチア・メタノリカ(Pichia methanolica)、ピチア属種(Pichia sp.)、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロミセス属種(Saccharomyces sp.)、ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、クライベロミセス属種(Kluyveromyces sp.)、クライベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)、トリコデルマ・レエセイ(Trichoderma reesei)、クリソスポリウム・ルクノウェンセ(Chrysosporium lucknowense)、フザリウム属種(Fusarium sp.)、フザリウム・グラミネウム(Fusarium gramineum)、フザリウム・ベネナツム(Fusarium venenatum)、フィスコミトレラ・パテンス(Physcomitrella patens)およびニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)よりなる群から選ばれる種のものである、請求項9記載の発現系。
- 該宿主細胞がピチア・パストリス(Pichia pastoris)である、請求項2記載の発現系。
- ピチア・パストリス(Pichia pastoris)細胞が、混合型または複合型N−グリカンを有する糖タンパク質を産生しうるよう修飾されている、請求項11記載の発現系。
- 関心のある組換えペプチド、タンパク質および/または核酸を宿主細胞において発現させるための方法であって、
(a)栄養要求性選択マーカータンパク質をコードする内因性遺伝子が宿主細胞のゲノムから除去されている該宿主細胞を準備し、
(a)組込みベクター[該組込みベクターは、
(1)弱いプロモーター、減衰化内因性もしくは異種プロモーター、潜在性プロモーター、トランケート化内因性もしくは異種プロモーターに機能的に連結された又はプロモーターを伴わない、該栄養要求性選択マーカータンパク質をコードする内因性遺伝子の機能に相補的な機能をコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含む核酸、
(2)関心のあるペプチド、タンパク質および/または機能性核酸をコードする核酸を含む1以上の発現カセットを有する核酸、ならびに
(3)相同組換えによる該宿主細胞のゲノムの特定の位置への該組込みベクターの挿入を導く標的化核酸を含む]で該宿主細胞を形質転換することを含んでなり、
ここで、該形質転換宿主細胞が、関心のある組換えペプチド、タンパク質および/または核酸を産生する、方法。 - 該栄養要求性選択マーカーが、ADE、URAおよびLYSよりなる群から選ばれる遺伝子によりコードされている、請求項14記載の方法。
- 該栄養要求性選択マーカータンパク質がADE1遺伝子によりコードされている、請求項14記載の方法。
- 該栄養要求性選択マーカータンパク質がADE2遺伝子によりコードされている、請求項14記載の方法。
- 該組換えベクターが、前記の1以上の異種ペプチドまたはタンパク質をコードする1以上の発現カセットの挿入のための複数の挿入部位を含む、請求項13記載の方法。
- 該組換えベクターが2以上の発現カセットを含む、請求項13記載の方法。
- 該組換えベクターが、それらの発現カセット間に相同DNA配列をほとんど又は全く含まない、請求項18記載の方法。
- 該組換えベクターが、モノクローナル抗体の軽鎖をコードする第1発現カセットと、モノクローナル抗体の重鎖をコードする第2発現カセットとを含む、請求項18記載の方法。
- 該宿主細胞が下等真核生物である、請求項13記載の方法。
- 該宿主細胞が、ピチア・パストリス(Pichia pastoris)、ピチア・フィンランディカ(Pichia finlandica)、ピチア・トレハロフィラ(Pichia trehalophila)、ピチア・コクラメ(Pichia koclamae)、ピチア・メンブラネファシエンス(Pichia membranaefaciens)、ピチア・ミヌタ(Pichia minuta)[オガタエア・ミヌタ(Ogataea minuta)、ピチア・リンドネリ(Pichia lindneri)]、ピチア・オプンチエ(Pichia opuntiae)、ピチア・テルモトレランス(Pichia thermotolerans)、ピチア・サリクタリア(Pichia salictaria)、ピチア・グエルクウム(Pichia guercuum)、ピチア・ピエペリ(Pichia pijperi)、ピチア・スティプティス(Pichia stiptis)、ピチア・メタノリカ(Pichia methanolica)、ピチア属種(Pichia sp.)、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロミセス属種(Saccharomyces sp.)、ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、クライベロミセス属種(Kluyveromyces sp.)、クライベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)、トリコデルマ・レエセイ(Trichoderma reesei)、クリソスポリウム・ルクノウェンセ(Chrysosporium lucknowense)、フザリウム属種(Fusarium sp.)、フザリウム・グラミネウム(Fusarium gramineum)、フザリウム・ベネナツム(Fusarium venenatum)、フィスコミトレラ・パテンス(Physcomitrella patens)およびニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)よりなる群から選ばれる種のものである、請求項21記載の方法。
- 該宿主細胞がピチア・パストリス(Pichia pastoris)である、請求項13記載の方法。
- ピチア・パストリス(Pichia pastoris)細胞が、混合型または複合型N−グリカンを有する糖タンパク質を産生しうるよう修飾されている、請求項23記載の方法。
- ピチア・パストリス(Pichia pastoris)のADE2遺伝子を含んでなる単離された核酸。
- 該核酸が、Ade2pタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む、請求項25記載の核酸。
- 該核酸が、配列番号60に示すヌクレオチド127−ヌクレオチド1,815の核酸配列に対して95%の同一性を有するヌクレオチド配列を有する、請求項26記載の核酸。
- 請求項27記載の核酸を含んでなるベクター。
- 内因性ADE2遺伝子の欠失もしくは破壊、またはADE2遺伝子もしくはAde2pを非機能性にする任意の他の修飾を含んでなるピチア・パストリス(Pichia pastoris)細胞。
- ADE2オープンリーディングフレームを含むベクターが、該内因性ADE2遺伝子が位置していた位置以外のピチア・パストリス(Pichia pastoris)ゲノム内の位置に組込まれている、請求項29記載のピチア・パストリス(Pichia pastoris)。
- 配列番号61に示すアミノ酸配列に対して95%の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチド。
- (a)Ade2pをコードする内因性ADE2遺伝子がピチア・パストリス(Pichia pastoris)宿主細胞のゲノムから除去されている該ピチア・パストリス(Pichia pastoris)宿主細胞と、
(b)組込みベクター[該組込みベクターは、
(1)Ade2pをコードする核酸、
(2)関心のある1以上の異種ペプチド、タンパク質および/または機能性核酸をコードする核酸を含む1以上の発現カセットの挿入のための挿入部位を有する核酸、ならびに
(3)相同組換えによる該宿主細胞のゲノムの特定の位置への該組込みベクターの挿入を導く標的化核酸を含む]とを含む発現系。 - 関心のある異種ペプチド、タンパク質および/または核酸を発現する組換えピチア・パストリス(Pichia pastoris)宿主細胞の製造方法であって、
(a)Ade2pをコードする内因性ADE2遺伝子が該宿主細胞のゲノムから除去されている該宿主細胞を準備し、
(a)組込みベクター[該組込みベクターは、
(1)Ade2pをコードする核酸、
(2)関心のある1以上の異種ペプチド、タンパク質および/または機能性核酸をコードする核酸を含む1以上の発現カセットを有する核酸、ならびに
(3)相同組換えによる該宿主細胞のゲノムの特定の位置への該組込みベクターの挿入を導く標的化核酸を含む]で該宿主細胞を形質転換することを含んでなり、
ここで、該形質転換宿主細胞が、関心のある組換えペプチド、タンパク質および/または核酸を産生する、製造方法。
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