JP2011115182A - 酵母への安定な遺伝子組み込みのためのura5遺伝子および方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】宿主ゲノムへの異種配列の安定な遺伝子組み込みが可能な酵母株を作製および選択するための方法もまた提供される。別の局面において、本発明は、P.pastoris URA5遺伝子のコード配列、P.pastoris URA5遺伝子のコード配列の縮重改変体である核酸配列、ならびに関連する核酸配列およびフラグメントからなる群より選択される核酸配列の破壊、欠失、または変異を含む宿主細胞を提供する。
【選択図】なし
Description
本発明は酵母中で単離される新規な遺伝子に関する。本発明はまた、酵母ゲノムへの安定な遺伝子組み込みのために特に有用であるプラスミドに関する。本発明はまた、異種タンパク質の発現における新規な酵母株、および新規な株を生成する方法に関する。
Pichia pastorisなどの酵母株は異種タンパク質の産生のために一般的に使用される。P.pastorisは、ペルオキシソーム生合成(Gouldら、Yeast 8:613−628(1992))、自食作用(TuttleおよびDunn、J.Cell Sci.108:25−35(1995);Sakaiら、J.Cell.Biol.141:625−636(1998))、および分泌経路のオルガネラの組織化および生合成(Rossaneseら、J.Cell Biol.145:69−81(1999))の研究のための評判のよいモデル系になっている。単純なDNA形質転換系の開発(Creggら、Mol.Cell.Biol.5:3376−3385(1985))および選択マーカー遺伝子の利用可能性は、上記の実験を実行する際に非常に重要である。現在、生合成マーカー遺伝子ADE1、ARG4、HIS4、およびURA3は、形質転換された細胞について、選択するための対応する独立栄養性宿主株と合わせて使用される。Lun Cereghinoら、Gene 263:159−169(2001)。形質転換体を同定するためのドミナントな選択マーカーの使用もまた可能であるが、マーカーは、薬物Zeocinに対する耐性を付与するStreptoalloteichus hindustanusからのShble遺伝子(Higginsら、Methods Mol.Biol.103:41−53(1998))、薬物ブラスチシジンに対する耐性を付与するAspergillus terreusからのブラスチシジンSデアミナーゼ遺伝子(Kimuraら、Mol.Gen.Genet.242:121−129(1994))に限定される。
本発明は、P.pastoris URA5遺伝子、P.pastoris SEC65遺伝子のフラグメント、およびP.pastoris SCS7遺伝子のフラグメントのコード配列;これらの配列の縮重改変体である核酸配列;ならびに関連する核酸配列およびフラグメントからなる群より選択される核酸配列を含むか、またはこれらの配列からなる単離されたポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、これらの単離されたポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞を提供する。
本明細書において他に定義されない限り、本発明に関連して使用される科学的用語および技術的用語は、当業者によって共通して理解される意味を有するべきである。さらに、文脈によって他に必要とされない限り、単数形は複数形を含むべきであり、複数形の用語は単数形を含むべきである。一般的に、本明細書に記載される生化学、酵素学、分子生物学および細胞生物学、微生物学、遺伝学およびタンパク質および核酸化学およびハイブリダイゼーションの技術と関連して使用される命名法は、周知でありかつ当該分野において一般的に使用される。本発明の方法および技術は、他に示されない限り、一般的に当該分野において周知であり、かつ本明細書を通して引用されかつ議論される種々の一般的な参考文献およびより特定の参考文献従来的な方法に従って実行される。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989);Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992、および2002への補遺);HarlowおよびLane、Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990);TaylorおよびDrickamer、Introduction to Glycobiology,Oxford Univ.Press(2003);Worthington Enzyme Manual,Worthington Biochemical Corp.,Freehold,NJ;Handbook of Biochemistry:Section A Proteins,第I巻、CRC Press(1976);Handbook of Biochemistry:Section A Proteins,第II巻、CRC Press(1976);Essentials of Glycobiology,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1999)を参照のこと。
予測値:10(デフォルト);フィルター:seg(デフォルト);コスト対オープンギャップ:11(デフォルト);コスト対エクステンドギャップ:1(デフォルト);最大アラインメント:100(デフォルト);ワードサイズ:11(デフォルト);記述の数:100(デフォルト);ペナルティーマトリックス:BLOWSUM62。
本発明は、P.pastorisからのURA5遺伝子およびその改変体を含む単離された核酸分子を提供する。酵素オロチン酸−ホスホリボシルトランスフェラーゼ(OPRTase、EC2.4.2.10)をコードする、この遺伝子についての全長核酸配列は、図1において記載されるように同定および配列決定された。クローニングされたゲノム配列(配列番号1)の中には、オロチン酸−ホスホリボシルトランスフェラーゼについてのコード配列(配列番号2)が含まれている。このコードされたアミノ酸配列は、図1(配列番号3)においてもまた示されている。URA5遺伝子は、再利用可能な、選択可能な、かつ対抗選択可能なマーカーとして特に有用である。
する核酸分子を提供する。上記に定義したように、および当該分野で周知であるように、ストリンジェントなハイブリダイゼーションは、特定の条件のセットの下での特異的DNAハイブリッドのための熱融解点(Tm)よりも約25℃下で実行され、ここで、Tmとは、標的配列の50%が完全にマッチしたプローブにハイブリダイズする温度である。ストリンジェントな洗浄は、特定の条件のセットの下で、特異的DNAハイブリッドのためのTmよりも約5℃低い温度で実行される。
別の実施形態において、P.pastoris URA5遺伝子の単離において有用な縮重オリゴヌクレオチドが提供される。これらのオリゴヌクレオチドは、P.pastoris URA5遺伝子の異なる部分を増幅することが可能である。これらは、S.cerevisiae URA10遺伝子の一部に結合し得、かつこれを増幅し得る。これらのオリゴヌクレオチドがP.pastorisにおいてURA5遺伝子を増幅するのみであることは、この生物がURA10遺伝子を有していないことを示唆する。このオリゴヌクレオチドは、図3に示されるように、URA5遺伝子の位置にアニールする。このようなオリゴヌクレオチドはまた、ハイブリダイゼーションおよび増幅実験において有用である。
本明細書にさらに記載されるような、上記の本明細書の核酸分子を含むベクター(発現ベクターを含む)もまた提供される。第1の実施形態において、このベクターは、上記の単離された核酸分子を含む。代替的な実施形態において、本発明のベクターは、1つ以上の発現制御配列に作動可能に連結された上記の核酸分子を含む。従って、本発明のベクターは、オロチン酸−ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドを発現するために使用され得る。
本発明の別の局面に従って、本発明の核酸分子によってコードされる単離されたポリペプチド(ムテイン、対立遺伝子改変体、フラグメント、誘導体、およびアナログを含む)が提供される。1つの実施形態において、単離されたポリペプチドは、配列番号3、5、または7に対応するポリペプチド配列を含む。本発明の代替的な実施形態において、単離されたポリペプチドは、配列番号3、5、または7に対して少なくとも65%同一であるポリペプチド配列を含む。好ましくは、本発明の単離されたポリペプチドは、配列番号3、5、または7に対して少なくとも70%、75%、または80%の同一性を有する。より好ましくは、この同一性は85%、90%、または95%であるが、配列番号3、5、または7に対する同一性は、98%、99%、99.9%、またはなおより高くであり得る。
本発明の別の局面において、本発明の核酸分子またはベクターで形質転換した宿主細胞、およびその子孫が提供される。本発明のある実施形態において、これらの細胞は、ベクター上に本発明の核酸配列を有する。これらのベクターは自由に複製するベクターであってもよいが、そうである必要はない(以下を参照のこと)。本発明の他の実施形態において、核酸は、宿主細胞のゲノムに組み込まれている。好ましい実施形態において、本発明の宿主細胞は、本発明の単離された核酸の破壊、欠失、または変異を用いる組換えによって変異されており、その結果、宿主細胞中のオロチン酸−ホスホリボシルトランスフェラーゼの活性が、変異を欠く宿主細胞と比較して減少している。本発明の宿主細胞は、好ましくは、Pichia pastorisまたはPichia methanolicaであるが、他の宿主細胞、とりわけ酵母細胞もまた、本発明の範囲に含まれる。
別の局面において、本発明は、本発明の単離されたポリペプチドおよびその誘導体、または本発明の単離された核酸によってコードされる1つ以上のポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体(そのフラグメントおよび誘導体を含む)を提供する。本発明の抗体は、そのネイティブなコンホメーションあるポリペプチド上に存在するものとして、またはある場合において、変性したときのポリペプチド上に存在するもの(例えば、SDS中での可溶化によって)としてのいずれかで、このようなポリペプチドまたはポリフラグメントの直鎖状エピトープ、不連続エピトープ、またはコンホメーション的エピトープについて特異的であり得る。本発明によって提供される有用な抗体フラグメントの中には、Fab、Fab’、Fv、F(ab’)2、および単鎖抗体Fvフラグメントがある。
本発明の別の実施形態に従って、宿主細胞のゲノムへの異種核酸配列の遺伝子組み込みのための方法が提供される。この実施形態の1つの局面において、オロチン酸−ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする宿主遺伝子は、本明細書に開示されたP.pastoris URA5遺伝子由来の、破壊され、欠失され、またはさもなくば変異された核酸配列の導入によって破壊される。従って、点変異、再配列、挿入、または好ましくは欠失(「マークされた欠失」を含む、ここで、異種選択可能配列は置換された欠失されたURA5配列を有する)を有する破壊された宿主細胞が提供される。URA5遺伝子が破壊され、かつ結果的にオロチン酸−ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を欠く宿主細胞は、異種配列が標的化された組み込みによって宿主細胞ゲノムに導入され得る、本発明のさらなる実施形態のための適切な宿主細胞として働く。
本発明の別の局面において、異種核酸配列が、オロチン酸−ホスホリボシルトランスフェラーゼ(OPT)活性を欠く(すなわち、Ura5−)酵母宿主細胞に導入される。この方法を使用して導入される異種核酸配列は、P.pastoris OPT活性をコードする核酸配列に連結される(好ましくは、ベクター上で)。コンピテントUra5−宿主細胞へのベクターの形質転換の債に、本発明のOPT−コード配列に連結された異種配列を含む細胞が、ウラシル付加の非存在下で増殖する能力に基づいて選択され得る。
(一般的な材料および方法)
Escherichia coli株DH5α(Invitrogen,Carlsbad,CA)を、組換えDNA研究のために使用した。P.pastoris株NRRL Y−11430(野生型)およびJC308(ade1 arg4 his4 ura3)(Lin Cereghinoら、Gene 263:159−169(2001))を、酵母株の構築のために使用した。PCR反応を、ExTaq(TaKaRa,Madison,WI)、Taq Poly(Promega,Madison,WI)、またはPfu Turbo(Stratagene,Cedar Creek,TX)のいずれかを使用して、供給業者の推奨に従って実行した。制限酵素および修飾酵素は、New England Biolabs(Beverly,MA)またはPromegaから入手した。
いくつかのストラテジーが、P.pastoris URA5遺伝子をクローニングおよび同定するために使用され得る。好ましい方法は、種々の酵母種における遺伝子の整列の保存と組み合わせて、既存のS.cerevisiae URA5遺伝子の配列相同性を使用する工程を包含する。2種の遺伝子、URA5およびSEC65は、少なくとも4種の酵母種:S.cerevisiae、K.lactis、C.albicans、およびY.lipolyticaにおいて互いに反対の配向で隣接して配置されている。SanchezおよびDominguez、Yeast 18:807−813(2001)。これらの遺伝子の各々によってコードされるタンパク質配列は、これらおよび他の微生物中で知られており(図2)、これらの配列は、例えば、CODEHOPストラテジーを使用して、縮重プライマーを設計した。Roseら、Nucleic Acids Res 26:1628−1635(1998)。URA5−1(図3)(配列番号23)およびSec65−1
縮重プライマーを、CODEHOPストラテジーを使用して設計した。Roseら、Nucleic Acids Res 26:1628−1635(1998)。URA5−1(配列番号23)はコード鎖の縮重型であり、アミノ酸27をコードするコドンから開始する。URA5−2(配列番号24)はアミノ酸66をコードするコドンから開始するコード鎖の縮重型である。URA5−3(配列番号25)は、URA5−2の部分相補物である。URA5−4(配列番号26)はアミノ酸105をコードするコドンから開始するコード鎖の縮重型である。URA5−5(配列番号27)はURA5−4の部分的相補物である。URA5−6(配列番号28)はコード鎖の縮重型であり、アミノ酸130をコードするコドンで開始するコード鎖のセグメントにハイブリダイズするように設計されている。オリゴヌクレオチドによって結合されるURA5中の配列および位置を図3に図示する。
(P.pastoris URA5遺伝子の破壊)
クローニングされたURA5遺伝子を、遺伝子特異的プライマーとともに使用して、P.pastorisのゲノムからのURA5遺伝子を破壊するための構築物を生成し得る。破壊されたURA5遺伝子を有する宿主細胞を、以下のようにP.pastoris URA5破壊カセットを使用して作製した。
(P.pastorisの安定な遺伝子修飾のためのベクターのセットの構築)
Pichia pastorisにおける安定な遺伝子置き換えのために有用なベクターのセットを以下に記載するように構築した。高コピー数ベクター pUC19(Yanisch−Perronら、Gene 33:103−119(1985))に基づいて、一連のモジュラープラスミドをアセンブルした。これは、数回の単純なサブクローニング工程の後で、P.pastoris遺伝子を、強力なP.pastoris GAPDHプロモーターの制御下で、目的の異種遺伝子と置き換えるために使用され得る。プラスミドpJN266(図4)は、P.pastoris KEXI遺伝子の5’領域および3’領域に相同である2つのフラグメントからなる。これらのセグメントは、P.pastoris GAPDHプロモーター、S.cerevisiaeCYCI転写終結発現カセット(「CYC1 TT」)およびS.cerevisiae URA3栄養要求性マーカーカセットに隣接する。このプラスミドのすべての領域にマルチプル制限サイトが隣接し、そして個々に置換され得る。この発現カセットは、異種遺伝子の挿入のための複数のクローニング部位を含む。
プラスミド構築の第1の段階は、ノックアウトされる遺伝子の5’領域および3’領域についてのスペースホルダーとして、P.pastorisのKEX1遺伝子のDNA領域を含むユニバーサルプラスミドのセット(Boehmら、Yeast 15:563−572(1999))を作製する工程を含んだ。このプラスミドはまた、栄養要求性マーカーおよび外因性遺伝子の挿入のためのマルチプルクローニングサイトを有する発現カセットのためのスペースホルダーとして、細菌の直接反復配列(Alaniら、Genetics 116:541−545(1987))に隣接された、S.cerevisiae URA3遺伝子を含んだ。
(対抗染色可能なマーカーのP.pastoris OCH1遺伝子および再生の破壊)
プラスミドpJN329(URA3)を使用する株JC308(ade1、arg4、his4、ura3)(Lin Cereghinoら、Gene 263:159−169(2001)におけるP.pastoris OCH1の破壊は、Choiら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100:5022−5027(2003)に記載されている(これは、その全体が参照として本明細書に援用される)。
Claims (39)
- 単離されたポリヌクレオチドであって:
(a)配列番号2;
(b)配列番号2の縮重改変体である核酸配列;
(c)配列番号2に対して少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.9%同一である核酸配列;
(d)配列番号3のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列;
(e)配列番号3に対して少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.9%同一であるポリペプチドをコードする核酸配列;
(f)配列番号2に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列;および
(g)少なくとも60の連続するヌクレオチド長である、(a)〜(f)のいずれか1つのフラグメントを含む核酸配列
からなる群より選択される核酸配列を含むか、またはその配列からなる、ポリヌクレオチド。 - 前記核酸配列がオロチン酸−ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 前記核酸配列が直接反復配列によって隣接される、請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- さらに目的の配列を含む、請求項3に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 前記目的の配列がポリペプチドをコードする、請求項4に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 前記核酸配列および前記目的の配列が1つ以上の発現制御配列を含む、請求項5に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 単離されたポリヌクレオチドであって:
(a)配列番号4;
(b)配列番号4の縮重改変体である核酸配列;
(c)配列番号4に対して少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.9%同一である核酸配列;
(d)配列番号5のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列;
(e)配列番号5に対して少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.9%同一であるポリペプチドをコードする核酸配列;
(f)配列番号4に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列;および
(g)少なくとも60の連続するヌクレオチド長である、(a)〜(f)のいずれか1つのフラグメントを含む核酸配列
からなる群より選択される核酸配列を含むか、またはその配列からなる、ポリヌクレオチド。 - 単離されたポリヌクレオチドであって:
(a)配列番号6;
(b)配列番号6の縮重改変体である核酸配列;
(c)配列番号6に対して少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.9%同一である核酸配列;
(d)配列番号7のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列;
(e)配列番号7に対して少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.9%同一であるポリペプチドをコードする核酸配列;
(f)配列番号6に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列;および
(g)少なくとも60の連続するヌクレオチド長である、(a)〜(f)のいずれか1つのフラグメントを含む核酸配列
からなる群より選択される核酸配列を含むか、またはその配列からなる、ポリヌクレオチド。 - 請求項1、7、または8に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
- 前記核酸配列がオロチン酸−ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドを発現する、請求項9に記載のベクター。
- pJN266、pJN395、pJN396、pJN398、およびpJN407からなる群より選択されるベクター。
- 単離されたポリペプチドであって:
(a)配列番号3;
(b)配列番号3に対して少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.9%同一であるポリペプチド配列;
(c)少なくとも20の連続するアミノ酸長である、(a)〜(b)のいずれか1つのフラグメントを含むポリペプチド配列
からなる群より選択されるポリペプチド配列を含むか、またはその配列からなる、ポリペプチド。 - 前記ポリペプチドがオロチン酸−ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有する、請求項12に記載の単離されたポリペプチド。
- 単離されたポリペプチドであって:
(a)配列番号5;
(b)配列番号5に対して少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.9%同一であるポリペプチド配列;
(c)少なくとも20の連続するアミノ酸長である、(a)〜(b)のいずれか1つのフラグメントを含むポリペプチド配列
からなる群より選択されるポリペプチド配列を含むか、またはその配列からなる、ポリペプチド。 - 単離されたポリペプチドであって:
(a)配列番号7;
(b)配列番号7に対して少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.9%同一であるポリペプチド配列;
(c)少なくとも20の連続するアミノ酸長である、(a)〜(b)のいずれか1つのフラグメントを含むポリペプチド配列
からなる群より選択されるポリペプチド配列を含むか、またはその配列からなる、ポリペプチド。 - 異種アミノ酸配列に融合された、請求項12、14、または15に記載の単離されたポリペプチドを含む融合タンパク質。
- 前記異種アミノ酸配列が検出可能な部分である、請求項16に記載の融合タンパク質。
- 請求項1、7、または8に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、Pichia pastoris、Pichia finlandica、Pichia trehalophila、Pichia koclamae、Pichia membranaefaciens、Pichia opuntiae、Pichia thermotolerans、Pichia salictaria、Pichia guercuum、Pichia pijperi、Pichia stiptis、Pichia methanolica、Pichia sp.、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces sp.、Hansenula polymorpha、Kluyveromyces sp.、Kluyveromyces lactis、Candida albicans、Aspergillus nidulans、Aspergillus niger、Aspergillus oryzae、Trichoderma reesei、Chrysosporium lucknowense、Fusarium sp.、Fusarium gramineum、Fusarium venenatum、およびNeurospora crassaからなる群より選択される、請求項18に記載の宿主細胞。
- 宿主細胞であって:
(a)配列番号2;
(b)配列番号2の縮重改変体である核酸配列;
(c)配列番号2に対して少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.9%同一である核酸配列;
(d)配列番号3のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列;
(e)配列番号3に対して少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.9%同一であるポリペプチドをコードする核酸配列;
(f)配列番号2に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列;および
(g)少なくとも60の連続するヌクレオチド長である、(a)〜(f)のいずれか1つのフラグメントを含む核酸配列
からなる群より選択される核酸配列の破壊、欠失、または変異を含み、該宿主細胞は、該破壊、欠失または変異を有さない宿主細胞と比較して、該核酸配列によりコードされるポリペプチドの活性が減少していることにより特徴付けられる、宿主細胞。 - 前記宿主細胞が、Pichia pastoris、Pichia finlandica、Pichia trehalophila、Pichia koclamae、Pichia membranaefaciens、Pichia opuntiae、Pichia thermotolerans、Pichia salictaria、Pichia guercuum、Pichia pijperi、Pichia stiptis、Pichia methanolica、Pichia sp.、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces sp.、Hansenula polymorpha、Kluyveromyces sp.、Kluyveromyces lactis、Candida albicans、Aspergillus nidulans、Aspergillus niger、Aspergillus oryzae、Trichoderma reesei、Chrysosporium lucknowense、Fusarium sp.、Fusarium gramineum、Fusarium venenatum、およびNeurospora crassaからなる群より選択される、請求項20に記載の宿主細胞。
- 1つ以上の目的の配列をさらに含む、請求項20に記載の宿主細胞。
- 前記目的の配列が1種以上のグリコシル化酵素をコードする、請求項22に記載の宿主細胞。
- 前記グリコシル化酵素が、グリコシダーゼ、マンノシダーゼ、ホスホマンノシダーゼ、ホスファターゼ、ヌクレオチド糖トランスポーター、マンノシルトランスフェラーゼ、N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、UDP−N−アセチルグルコサミントランスポーター、ガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、およびタンパク質マンノシルトランスフェラーゼからなる群より選択される、請求項23に記載の宿主細胞。
- 前記目的の配列が1種以上の治療タンパク質をコードする、請求項22に記載の宿主細胞。
- 前記治療タンパク質が、ヒトプラスミノーゲンのkringleドメイン、エリスロポエチン、サイトカイン、凝固因子、可溶性IgEレセプターα鎖、IgG、IgGフラグメント、IgM、ウロキナーゼ、チマーゼ、尿素トリプシンインヒビター、IGF結合タンパク質、上皮成長因子、成長ホルモン放出因子、アネキシンV融合タンパク質、アンギオスタチン、血管内皮増殖因子−2、骨髄前駆細胞阻害因子−1、オステオプロテゲリン、α−1抗トリプシン、DNaseII、およびα−フェトプロテインからなる群より選択される、請求項25に記載の宿主細胞。
- 請求項12、14、または15に記載の単離されたポリペプチドに選択的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体。
- 宿主細胞中への異種核酸配列の遺伝子組み込みのための方法であって:
(a)配列番号2;
(b)配列番号2の縮重改変体である核酸配列;
(c)配列番号2に対して少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.9%同一である核酸配列;
(d)配列番号3のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列;
(e)配列番号3に対して少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.9%同一であるポリペプチドをコードする核酸配列;
(f)配列番号2に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列;および
(g)少なくとも60の連続するヌクレオチド長である、(a)〜(f)のいずれか1つのフラグメントを含む核酸配列
からなる群より選択される配列に由来する、破壊、欠失、または変異された核酸配列の導入によって、オロチン酸−ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする宿主遺伝子を破壊する工程を包含する、方法。 - オロチン酸−ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を欠く宿主細胞中への異種核酸配列の遺伝子組み込みのための方法であって:
(a)配列番号2;
(b)配列番号2の縮重改変体である核酸配列;
(c)配列番号2に対して少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.9%同一である核酸配列;
(d)配列番号3のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列;
(e)配列番号3に対して少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.9%同一であるポリペプチドをコードする核酸配列;
(f)配列番号2に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列;および
(g)少なくとも60の連続するヌクレオチド長である、(a)〜(f)のいずれか1つのフラグメントを含む核酸配列
からなる群より選択される、オロチン酸−ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性をコードする配列と連結して目的の配列を宿主細胞に導入する工程を包含する、方法。 - 異種核酸配列が安定に組み込まれる、請求項29に記載の方法。
- オロチン酸−ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性をコードする配列が直接反復配列によって隣接される、請求項29に記載の方法。
- 目的の配列がポリペプチドをコードする、請求項29に記載の方法。
- 前記ポリペプチドがグリコシル化酵素である、請求項32に記載の方法。
- 前記グリコシル化酵素が、グリコシダーゼ、マンノシダーゼ、ホスホマンノシダーゼ、ホスファターゼ、ヌクレオチド糖トランスポーター、マンノシルトランスフェラーゼ、N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、UDP−N−アセチルグルコサミントランスポーター、ガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、およびタンパク質マンノシルトランスフェラーゼからなる群より選択される、請求項33に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが治療タンパク質である、請求項32に記載の方法。
- 前記治療タンパク質が、ヒトプラスミノーゲンのkringleドメイン、エリスロポエチン、サイトカイン、凝固因子、可溶性IgEレセプターα鎖、IgG、IgGフラグメント、IgM、ウロキナーゼ、チマーゼ、尿素トリプシンインヒビター、IGF結合タンパク質、上皮成長因子、成長ホルモン放出因子、アネキシンV融合タンパク質、アンギオスタチン、血管内皮増殖因子−2、骨髄前駆細胞阻害因子−1、オステオプロテゲリン、α−1抗トリプシン、DNase II、およびα−フェトプロテインからなる群より選択される、請求項35に記載の方法。
- オロチン酸−ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性の損失について対抗選択する工程をさらに包含する、請求項31に記載の方法。
- 前記対抗選択が5−フルオロオロチン酸に対する増殖についてである、請求項37に記載の方法。
- 前記異種核酸配列が宿主細胞のOCH1遺伝子座に導入される、請求項29に記載の方法。
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