CN111850017A - 一种基于ura3基因的表达载体及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本申请提供了一种基于URA3基因的表达载体及其构建方法，所述载体依次包括URA3同源臂、强启动子、多克隆位点、终止子、URA3同源臂或URA3启动子或URA3终止子，所述构建方法包括提取目标物种DNA；设计引物对其扩增获得URA3同源臂、强启动子、终止子、URA3同源臂或URA3启动子元件或URA3终止子元件；获得其他元件；重组酶连接多个元件一步获得完整载体。

Description

一种基于URA3基因的表达载体及其构建方法

技术领域

本发明属于分子生物学中的表达载体领域，具体地，本申请提供了一种基于URA3基因的快速构建表达载体及其构建方法。

背景技术

表达载体(Expression vectors)是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件如启动子、终止子等，使目的基因能够在宿主里表达的载体，表达载体是基因工程中必不可少的工具。市面上已经有多种商品化的表达载体可供选购，例如novagen Corporation的用于大肠杆菌蛋白表达的pET系列载体、Invitrogen Corporation的用于毕赤酵母蛋白表达的pPICZ系列载体、CLONTECH Laboratories,Inc的用于哺乳类动物细胞的pDsRed1、pEYFP系列载体等等，这些表达载体的主要问题在于其只适用于少数常见物种细胞，一旦遇到不常见的物种没有相应的商品化表达载体时就必须采用传统的载体构建方法专门构建载体。

传统的载体构建方法在使多个DNA元件片段按照一定的顺序拼接成为完整载体时，需要小心选择酶切位点，还要经过繁复多次酶切、连接DNA片段的操作，有时还需要构建多个中间载体和辅助载体，具体操作和专业知识掌握上对构建人员都有较高的要求，因此寻找简单、高效、快捷的表达载体构建方法具有重要的现实意义。

发明内容

URA3基因编码乳清苷5-磷酸脱羧酶(orotidine 5'-phosphate decarboxylase)，在生物的RNA嘧啶核苷酸的合成过程中，该酶能催化其中的一个关键的反应。一旦乳清苷5-磷酸脱羧酶失活，那么生物就会缺乏嘧啶核苷酸而无法生长，除非在培养基中加入尿苷或尿嘧啶。5-FOA(5-氟乳清酸)作为一种负筛选药物，当细胞能表达URA3基因编码的乳清苷5-磷酸脱羧酶，可以使5-FOA生成对细胞有毒性的物质5氟尿嘧啶，因此正常野生型细胞在含5-FOA的培养基上会停止生长甚至死亡。如果向营养缺陷菌株中转化进URA3基因，这些营养缺陷株便能生长(阳性选择)，相反，如果你向培养基中加入5-FOA(5-氟乳清酸)，那么正常野生型细胞的乳清苷5-磷酸脱羧酶能将5-FOA转化为有毒物质5氟尿嘧啶(自杀性抑制物)，导致细胞死亡(阴性选择)。正是因为URA3基因能进行阳性选择和阴性选择，它成为了一个遗传的标记物，广泛应用于细菌和许多种真菌的基因转化以及其它遗传实验中。

发明人利用上述原理，提出了一种基于URA3基因的快速构建表达载体的方法，对于给定的生物，只需要知道它的URA3基因DNA序列或部分序列，即可快速的构建出其表达载体供研究所需：利用URA3基因的启动子上游5’端序列和下游3’终止子序列构建同源重组臂，然后利用强启动子和终止子替换原来URA3基因，构建新的表达元件组合，并在强启动子和终止子之间添加多克隆位点(MCS)以方便外源基因的重组插入，将这些DNA片段与大肠杆菌复制原点和抗性基因DNA片段(该DNA片段不会整合到目标宿主的基因组中)共同构建成新的表达载体，外源基因可以通过酶切重组到多克隆位点上构建成工程质粒，再将该工程质粒转化到该物种的细胞中，通过同源重组整合到该物种原来的URA3基因的位置上，则原来的URA3基因被替换成强启动子-外源基因-终止子，将其用含有5-FOA和尿嘧啶的筛选培养基进行培养，缺失URA3基因的阳性克隆得以生长，原来野生型的就被5-FOA杀死，因此就可以得到能表达外源基因蛋白的阳性克隆子，整个筛选过程无需任何抗生素的参与。

所得到的阳性克隆子必须在含有适量尿嘧啶的培养基中才能正常生长因此具有自我限制特性，如果阳性克隆子不小心泄露到野外环境也会很快因为没有足够的尿嘧啶而死亡，避免了目标基因在自然界的扩散，具有可靠的生物安全性。

本申请的构建方法采用的是重组酶将所有的载体元件DNA一步成环，可以实现多个片段的高效无缝拼接，一步直接生成目标载体，使得整个构建载体过程快速高效省时省力。

该载体除了可以用于表达工业用蛋白、食品用蛋白外，也可以表达各种RNA如siRNA、circRNA、miRNA等，还可用于表达各种药用多肽如抗体、疫苗、多肽类激素、细胞因子、治疗用的酶等。

一方面，本申请提供了一种基于URA3基因的表达载体，依次包括URA3同源臂或URA3启动子、强启动子、多克隆位点、终止子、URA3同源臂或URA3终止子。

进一步地，所述基于URA3基因的表达载体，依次包括URA3同源臂或URA3启动子、强启动子、多克隆位点、终止子、URA3同源臂或URA3终止子、大肠杆菌复制原点、抗性基因。

进一步地，所述基于URA3基因的表达载体中，URA3同源臂或URA3终止子或URA3启动子、强启动子、终止子来源于含有URA3的生物物种。

进一步地，所述酵母为乳酸克鲁维酵母。

进一步地，强启动子和终止子为LAC4启动子和LAC4终止子。

另一方面，本申请提供了上述基于URA3基因的表达载体的构建方法，包括：提取目标物种DNA；设计引物对其扩增获得URA3同源臂或URA3启动子、强启动子、终止子、URA3同源臂或URA3终止子元件；获得其他元件；连接个元件获得载体。

进一步地，所述目标物种为含有URA3的生物物种。

进一步地，通过重组酶一步连接各元件成环。

进一步地，所述目标物种为乳酸克鲁维酵母GG799，扩增URA3同源臂或URA3启动子、强启动子、终止子、URA3同源臂或URA3终止子的引物序列为SEQ ID NO.1-4、7-10。

进一步地，获得其他元件的步骤为使用序列为SEQ ID NO.5和11的引物从PMD19T质粒DNA中扩增出pUC原点和氨苄青霉素抗性基因元件。

另一方面，本申请提供了上述基于URA3基因的表达载体及其构建方法在基因工程中的应用。

进一步地，应用为在蛋白及RNA表达中的应用

本申请的技术方案适合针对各种具有URA3基因的生物细胞构建载体，包括但不限于真核细胞如各种动物细胞、原生生物细胞、植物细胞、真菌、酵母菌，原核细胞如真细菌、放线菌、古细菌、衣原体、支原体、立克次氏体，具体如里氏木霉，乳酸乳球菌，哺乳类细胞等。

本申请中的大肠杆菌复制原点、抗性基因可选用各种已知的原点和抗性基因，包括但不限于氨苄青霉素抗性基因、链霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、红霉素抗性基因、四环素抗性基因、氯霉素抗性基因、潮霉素抗性基因。

本申请的表达载体及其构建方法可用于各种基因工程操作，包括但不限于各种产物的发酵生产、动植物品种培育、分子生物学诊断、基因治疗。

本申请中DNA提取、扩增和连接步骤以及相应验证等步骤所使用的试剂可选用单独提供或以试剂盒形式提供的，各品牌或自制的已知可用试剂。

附图说明

图1：目标载体pKU的结构示意图及同源重组到基因组的原理示意图，其中(A)为利用重组酶将DNA片段一步反应生成载体示意图；(B)为pKU载体结构图，目标载体包含以下元件：i)5'URA3同源臂；ii)LAC4启动子；iii)多克隆位点(MCS)；iv)LAC4终止子；v)the 3'URA3同源臂/URA3终止子；vi)大肠杆菌中复制的PUC原点；vii)氨苄青霉素抗性基因(AMP)；(C)pKU载体同源重组到基因组的URA3基因位置的原理示意图；

图2：乳酸克鲁维酵母GG799gDNA的电泳结果图，其中M为10000Marker；1为乳酸克鲁维酵母GG799gDNA；

图3：pKU载体和其5个DNA元件片段电泳图，其中M1为2000Marker；1为乳酸克鲁维酵母LAC4启动子基因DNA片段；2为乳酸克鲁维酵母LAC4终止子基因DNA片段；3为乳酸克鲁维酵母URA3启动子部分DNA片段；4为乳酸克鲁维酵母URA3终止子部分DNA片段；5为来自PMD19T的元件(PUC原点和AMP抗性基因)DNA片段；6为pKU质粒DNA；M2为10000Marker；

图4：pKU-mCherry质粒AflII and BamHI双酶切电泳图，其中M1为2000Marker；1为mCherry基因DNA片段；2为pKU-mCherry质粒DNA；3为AflII和BamHI双酶切的pKU-mCherry质粒DNA；M2为10000Marker；

图5：含有pKU-mCherry重组质粒的乳酸克鲁维酵母GG799在激光共聚焦显微镜下的观测图(激发光587nm)，其中1为587nm激发光光源下拍摄结果；2为普通光源下拍摄结果；3为587nm激发光光源与普通光源下拍摄结果的合并图；A为GG799出发菌株；B为含有pKU-Mcherry GG799阳性重组菌(放大倍数：63×)；

图6：来自不同的gDNA模板的PCR扩增产物电泳结果，其中M为5000Marker；1为乳酸克鲁维酵母对照菌gDNA为模板的PCR产物，2为pKU-mcherry转化乳酸克鲁维酵母GG799酵母阳性克隆菌落gDNA为模板的PCR产物；

图7：来自不同的菌株的提取蛋白的Western Blotting结果，其中为彩虹245plus广谱蛋白Marker；1为乳酸克鲁维酵母GG799对照菌；2为pKU-mcherry转化乳酸克鲁维酵母GG799酵母阳性重组菌。

图8：用于乳酸乳球菌的载体结构图；

图9：乳酸乳球菌中蛋白的Western Blotting结果；

图10：用于里氏木霉的载体结构图；

图11：里氏木霉中蛋白的Western Blotting结果。

实施例

实施例1实验用材料和基本方法

菌株质粒和试剂

大肠杆菌JM109，由本实验室保存；乳酸克鲁维酵母GG799购自NEB公司；克隆载体pMD-19T购自上海宝生物公司；pLVX-IRES-mCherry质粒由本实验室保存；限制性内切酶AflII、BamHI购自Takara公司；DNA Marker和T₄DNA连接酶购自Takara公司；质粒抽提试剂盒和切胶回收试剂盒购自Omega公司；pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit购自北京全式金生物技术有限公司；mCherry基因来自pLVX-IRES-mCherry质粒，用jcat在线工具进行酵母密码子优化，并在mCherry的C端加入6X his-tag蛋白标签，序列交给深圳华大基因科技公司合成DNA；表1所示的本实验所用引物均在深圳华大基因科技公司合成。

表1所用引物列表

所用到的数据库和生物软件:

GenBank数据库：www.ncbi.nlm.nih.gov；PCR引物设计及基因编码序列分析软件：Primer premier 5；基因和蛋白序列比对软件：DNAssist version 3.0；

所用到的培养基:

(1)大肠杆菌LB培养基(液体)：10g Trypeptone，5g Yeast extract，10g NaCl，加去离子水至950ml，用5M NaOH调pH至7.2，定容至1000ml，高压灭菌(121℃，20min)后使用(固体培养基需要加入1.5％琼脂)。(2)酵母YPD培养基：蛋白胨20g，酵母提取物10g，0.2％adenine hemisurfate15ml，加去离子水定容至900ml，调pH至6.5，定容至950ml，经高压灭菌后冷却至55℃，加入40％无菌葡萄糖50ml至终浓度为2％(固体培养基需要加入1.5％琼脂)。(3)5-FOA培养基：Ammonium Sulfate 5.0g；Yeast nitrogen base without aminoacid(YNB)1.7g；Dextrose 20g；5-FOA 1.0g；Uracil 20mg；定容至1L，过滤除菌(固体培养基需要加入1.5％琼脂)。

方法概述

根据本方法构建的乳酸克鲁维酵母的表达载体命名为pKU，pKU表达载体各部分的来源如下：(1)Lac4启动子和Lac4终止子序列的获得:采用表达水平高的乳酸克鲁维酵母Lac4基因(Kluyveromyces lactis beta-D-galactosidase gene)启动子和终止子；5’与3’URA3重组臂来自乳酸克鲁维酵母URA3基因的上下游5’与3’端；(2)pMD-19T质粒为其提供了pUC原点和氨苄青霉素抗性基因的来源，令载体能够在大肠杆菌中保存以及复制。首先将各个载体片段PCR扩增出来，切胶纯化回收，然后通过重组酶将这五个片段连接起来，再转入大肠杆菌扩增，pKU载体的结构图和构造原理图见图1，根据GeneBank中Kluyveromyceslactis基因组核苷酸序列设计引物。

mCherry是一种红色荧光蛋白，mCherry以及其它大多数红色荧光蛋白来源于珊瑚(Discosoma)，经过改造的mCherry因为其颜色和单体分子的光稳定性，比其它荧光蛋白标签更优异，其最大激发光和发射光分别为587nm和610nm，将mCherry基因重组到目标载体上进行表达能对该载体的蛋白表达效果进行直观的评价。

实施例2表达载体构建过程

酵母GG799基因组DNA的提取及检验：

将冻存的酵母GG799接种于YPDA平板上，于30恒温培养3d后，挑取单菌落接种于YPDA液体培养基中，于30、250r/min条件下培养3d。将培养物置于50mL离心管中，4℃、10000g离心5min。去上清，用15ml无菌水洗涤，于4℃、10000g离心5min。去上清，置于研钵中加入液氮，将菌体研磨成细粉状后转至2.0mL离心管中。使用OMEGA的真菌基因组快速抽提试剂盒提取，操作过程按照说明书进行，得到的gDNA用1％琼脂糖电泳检测。采用OMEGA的真菌基因组快速抽提试剂盒提取的GG799基因组DNA见图2，可以看到成功提取了GG799基因组DNA。

PCR扩增Lac4的启动子和终止序列、5’与3’URA3重组臂及pUC ori与Amp抗性基因、mCherry基因：

载体pKU各个元件基因，包括Lac4启动子约1646bp，和Lac4终止子约592bp、5’URA3同源臂约637bp、3’URA3同源臂约638bp、pUC ori与Amp抗性基因长度约2692bp。通过重组酶将上述片段连接获得目的载体pKU，长度约为6256bp。

表达载体构建过程中所用到的引物列于表1，具体扩增过程如下：(1)pKU-F1和pKU-R1扩增出5’URA3重组臂DNA序列，模板为GG799基因组DNA，目标片段大小约为637bp，PCR扩增条件是：预变性94℃，5min；94℃30s，55℃50s，72℃40s，产物进行25个循环，72℃延伸7min。(2)pKU-F2和pKU-R2扩增出Lac4启动子DNA序列，模板为GG799基因组DNA，目标片段大小约为1646bp，PCR扩增条件是：预变性94℃，5min；94℃30s，55℃50s，72℃2min，产物进行25个循环，72℃延伸10min。(3)pKU-F3和pKU-R3扩增出Lac4终止子序列DNA序列，模板为GG799基因组DNA，大小约为592bp，PCR扩增条件是：预变性94℃，5min；94℃30s，55℃50s，72℃40s，产物进行25个循环，72℃延伸7min。(4)pKU-F4和pKU-R4扩增出3’URA3重组臂DNA序列，模板为GG799基因组DNA，目标片段大小约为638bp，PCR扩增条件是：预变性94℃，50s；94℃30s，55℃50s，72℃50s，产物进行25个循环，72℃延伸7min。(5)pKU-F5和pKU-R5扩增出pUC origin和Ampicillin resistance gene DNA序列，模板为PMD19T质粒DNA，目标片段大小约为2692bp，PCR扩增条件是：预变性94℃，5min；94℃30s，55℃50s，72℃3min，产物进行25个循环，72℃延伸10min。(6)mCherry-R和mCherry-F扩增出mCherry红色荧光蛋白DNA序列，模板为密码子优化的人工合成的DNA，目标片段大小约为729bp，PCR扩增条件是：预变性94℃，5min；94℃30s，55℃50s，72℃50s，产物进行25个循环，72℃延伸7min。

反应完成后分别取5μl扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，然后用凝胶成像系统照相，其余的扩增产物分别用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行纯化回收。

载体pKU的生成：

将纯化好的5个载体元件DNA片段配成等摩尔量的混合液，每个DNA片段的摩尔量均为0.1pmol/μl，将此混合液与2X的Assembly Mix反应液进行连接反应，反应体系如下：2X的Assembly Mix反应液5μl，DNA片段混合液5μl，两者混合均匀后在50℃反应15min，反应结束后冰上放置5min，然后将反应液转化入大肠杆菌JM109感受态细胞中内，铺于含50μg/mL氨苄青霉素抗性的LB平板，37℃倒置培养过夜后挑取单菌落，37℃条件下震荡培养24h，提取质粒后进行1％琼脂糖凝胶电泳，然后用凝胶成像系统照相，送往华大基因公司进行序列测定，分析载体DNA序列组成及其框架的正确性。电泳结果见图3，载体pKU各个原件基因，包括Lac4启动子约1646bp，和Lac4终止子约592bp、5‘URA3同源臂约637bp、3’URA3同源臂约638bp、pUC ori与Amp抗性基因，长度约2692bp。通过重组酶将上述片段连接获得目的载体pKU长度约为6256bp。电泳及测序结果均表明序列均正确扩增，载体pKU成功构建。

载体pKU-mCherry的构建：

pKU质粒DNA和mCherry PCR产物DNA分别进行双酶切反应，酶切体系如下：限制性内切酶AflII 1μL和BamHI 1μL；10×酶切缓冲液5μL；质粒或PCR产物DNA 30μL；无菌水(upto 50μL)；37℃水浴2h。将酶切反应产物分别进行琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，将纯化的mCherry双酶切PCR片段与纯化的pKU双酶切载体连接(20μL体系)：pKU载体DNA20ng，mCherry DNA片段50ng；10×buffer 2.0μL在冰上混合均匀；T4连接酶1μL，用无菌水补足到20μL混合均匀后短暂离心10sec，16℃水浴连接过夜，重组载体命名为pKU-mCherry，将连接好的质粒转入大肠杆菌JM109感受态细胞中，涂氨苄抗性板37℃培养过夜。将过夜培养的平板上的单菌落接种于LB液体培养基中培养，提取质粒DNA进行酶切鉴定，酶切体系如下：限制性内切酶AflII 1μL和BamHI 1μL，10×酶切缓冲液5μL；质粒DNA 30μL；无菌水(up to 50μL)；37℃水浴2h。反应完成后取5μl扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，然后用凝胶成像系统照相，部分质粒DNA送去华大基因公司进行测序。将构建好的pKU载体质粒和红色荧光蛋白mCherry的PCR产物分别用AflII和BamHI双酶切后连接，形成重组载体pKU-mCherry后转化至大肠杆菌JM109，选取阳性克隆扩大培养后提取质粒进行酶切鉴定，酶切产物的琼脂糖凝胶电泳结果见图4，在约6256bp和750bp处可见亮带，符合载体pKU及mCherry基因的长度，测序结果表明重组载体构建成功。

乳酸克鲁维酵母GG799化学感受态细胞的制备：

(1)挑取直径为2-3mm的乳酸克鲁维酵母GG799单菌落于5mlYPD液体培养基中：30℃，250rpm培养16-18小时至OD600＞1.5；接种菌液到5ml新鲜YPDA培养基中，使初始OD600为0.2-0.3；30℃,250rpm下继续培养3-5小时至OD600为0.5-0.7；(3)取1.5ml菌液3000rpm离心5分钟，弃上清。用1ml无菌水重悬菌体，3O00rpm室温再离心5分钟，弃上清。加入100μl1.1×TE/LiAc，1mlH2O重悬菌体，转移至1.5ml离心管中，5000rpm离心1分钟，弃上清，加100μl 1.1×TE/LiAc溶液轻轻重悬菌体后成为化学感受态细胞用于质粒转化。

重组质粒pKU-mCherry转化酵母GG799感受态细胞：

(1)取600μl PEG/LiCl溶液(8ml 50％PEG 4000，1ml 10×TE buffer，1ml 10×LiCl)加入100μl感受态的乳酸克鲁维酵母GG799轻轻混匀，再加入10μl(10μg)重组质粒pKU-mCherry小心摇匀，30℃孵育30min(每15min混匀一次)。(2)然后加入70μl DMSO混匀，37℃热击1小时(每15min混匀一次)；3000转离心5min，弃上清；加入1ml YPD培养基重悬菌体；然后在250转/分30℃下培养3-4小时，(3)把培养液吸取到一个无菌的EP管中，以5000转3分钟离心，去上清留沉淀，用1ml的YPD培养基充分悬起，然后再以5000转3分钟离心，去上清留沉淀，用1ml的YPD培养基充分悬起。(4)分别取10ul、50ul、100ul菌液分别涂布在5-FOA筛选平板上，倒置培养板30℃培养4天，筛选阳性的转化子。pKU-mCherry阳性转化子的鉴定：

荧光显微镜观察表达红色荧光蛋白阳性转化子：将5-FOA筛选平板上长出的阳性转化子分别转接到YPD培养基中，30℃培养，48h后于Carl Zeiss LSM800激光共聚焦显微镜下观察红色荧光蛋白在菌体中的表达情况。将重组载体pKU-MCherry转化至乳酸克鲁维酵母GG799中进行表达鉴定，对载体pKU的表达功能进行鉴定，取菌体在激光共聚焦显微镜使用587nm激发光条件下，可观察到发出明亮红色荧光的菌体，而出发菌在相同条件下无法观察到红色荧光(图5)，表明说明本文构建的表达载体pKU对插入的外源基因可进行有效的转录，并在乳酸克鲁维酵母GG799菌体中表达出相应的蛋白质。

PCR鉴定表达红色荧光蛋白阳性转化子：选取一株表达红色荧光蛋白的转化子接种于YPD培养基中扩大培养，48h后去上清，置于研钵中加入液氮，将菌体研磨成细粉状后转至2.0mL离心管中分别用于抽提基因组DNA和菌体蛋白，另取GG799出发菌株作为对照。菌体研磨粉使用OMEGA的真菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取，提取其基因组DNA作为模板，mCherry-R和mCherry-F进行PCR扩增，目标片段大小约为729bp，PCR扩增条件是：预变性94℃，5min；94℃30s，55℃50s，72℃50s，产物进行25个循环，72℃延伸7min。扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。分别以GG799出发菌株、含有pKU-mCherry阳性重组菌的基因组DNA为模板，PCR扩增mCherry基因片段，PCR的产物在1％琼脂糖凝胶电泳结果见图6，结果表明只有转化有pKU-mCherry阳性重组菌的基因组DNA含有mCherry基因片段，片段大小约在750bp左右，而GG799出发菌株则没有。

Western Blotting鉴定表达红色荧光蛋白阳性转化子：Western Blotting检测阳性转化子的mCherry红色荧光蛋白：菌体用RIPA细胞裂解液处理并离心取上清液制蛋白样，然后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，将SDS-PAGE凝胶用半干电转仪把蛋白转膜到PVDF膜上，用5％的脱脂牛奶封闭，因为目标蛋白带有6xHis tag标签，所以用偶联辣根过氧化物酶的His-Tag(D3I1O)

Rabbit mAb(HRP Conjugate)一抗孵育，以TBST稀释，稀释比例为1：1000，30℃孵育2h之后，用TBST洗膜5次，以除去未结合的一抗，然后滴加入Western blot化学发光试剂后在GE AI600多功能成像仪进行曝光，然后拍照分析。分别以GG799出发菌株、含有pKU-mCherry阳性重组菌的菌体蛋白进行了Western Blotting检测，结果表明只有含有pKU-mCherry阳性重组菌的菌体蛋白有mCherry基因的表达产物，在分子量约为30kD处有特异性反应的条带，见图7，该条带的大小与预测的目标蛋白分子量大小一致，而GG799出发菌株则没有任何条带。

实施例3将本申请的表达载体用途乳酸乳球菌和里氏木霉

将本申请表达载体进一步用于乳酸乳球菌(原核生物)和里氏木霉(丝状真菌)均获得了满意的效果，乳酸乳球菌载体结构和蛋白的Western Blotting结果见图8和9，里氏木霉载体结构和蛋白的Western Blotting效果见图10和11，可见本申请的载体完全适用于其他物种。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州华真医药科技有限公司

<120> -一种基于URA3基因的表达载体及其构建方法

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

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cggtacgcgc ggatcttcca gagattcgcg aaaagcttga tctgtagccc tcaacg 56

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<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列

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gcgacaagaa gagatagacc atggtctaga ggcgcgccgc ggggatcgac tcataaaata 60

g 61

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<212> DNA

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ctcatcgaga agcttgaaaa aaggatccac cggtctcgag cttaagaatt tatacttaga 60

taagtatgta c 71

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gactcttctt cgatgttgta tacgttggag cggccgctta tacaggaaac ttaatagaac 60

aaatc 65

<210> 5

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<212> DNA

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gctgccatga atcaaaccat gggtcgcgaa tcgtcgaacg gcaggcgtgc 50

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atcgggatcc atggtttcta agggtgaaga agac 34

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ctattttatg agtcgatccc cgcggcgcgc ctctagacca tggtctatct cttcttgtcg 60

c 61

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gtacatactt atctaagtat aaattcttaa gctcgagacc ggtggatcct tttttcaagc 60

ttctcgatga g 71

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gatttgttct attaagtttc ctgtataagc ggccgctcca acgtatacaa catcgaagaa 60

gagtc 65

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gcacgcctgc cgttcgacga ttcgcgaccc atggtttgat tcatggcagc 50

<210> 11

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cgttgagggc tacagatcaa gcttttcgcg aatctctgga agatccgcgc gtaccg 56

<210> 12

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

atcgcttaag ttagtgatgg tgatggtgat gcttgtacaa ttcgtccata ccacc 55

Claims (12)

1.一种基于URA3基因的表达载体，其依次包括URA3同源臂或URA3启动子、强启动子、多克隆位点、终止子、URA3同源臂或URA3终止子。

2.根据权利要求1的基于URA3基因的表达载体，其依次包括URA3同源臂或URA3启动子、强启动子、多克隆位点、终止子、URA3同源臂或URA3终止子、大肠杆菌复制原点、抗性基因。

3.根据权利要求1或2的基于URA3基因的表达载体，其中URA3同源臂或URA3终止子或URA3启动子、强启动子、终止子来源于含有URA3的生物物种。

4.根据权利要求3的基于URA3基因的表达载体，所述含有URA3的生物物种为乳酸克鲁维酵母。

5.根据权利要求4的基于URA3基因的表达载体，强启动子和终止子为LAC4启动子和LAC4终止子。

6.根据权利要求1-5任一项的基于URA3基因的表达载体的构建方法，包括：提取目标物种DNA；设计引物对其扩增获得URA3同源臂、强启动子、终止子、URA3同源臂或URA3终止子或URA3启动子元件；获得其他元件；连接各元件获得载体。

7.根据权利要求6的构建方法，其中所述目标物种为含有URA3的生物物种。

8.根据权利要求6或7的构建方法，其中通过重组酶一步连接各元件成环。

9.根据权利要求7或8的构建方法，其中所述目标物种为乳酸克鲁维酵母GG799，扩增URA3同源臂或URA3启动子、强启动子、终止子、URA3同源臂或URA3终止子的引物序列为SEQID NO.1-4、7-10。

10.根据权利要求9的构建方法，其中，获得其他元件的步骤为使用序列为SEQ ID NO.5和11的引物从PMD19T质粒DNA中扩增出pUC原点和氨苄青霉素抗性基因元件。

11.根据权利要求1-5任一项的基于URA3基因的表达载体或者根据权利要求6-11任一项的构建方法在基因工程中的应用。

12.根据权利要求11的应用，其为在蛋白及RNA表达中的应用。

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