JP2018033450A - タンパク質の製造のための酵母株 - Google Patents
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Abstract
【課題】工業的規模の組換え糖タンパク質の製造に有用な、形質転換細胞系の細胞生産性を増加する方法の提供。
【解決手段】（ａ）Ａｄｅ２ｐをコードする内因性ＡＤＥ２遺伝子が宿主細胞のゲノムから除去されているピチア・パストリス宿主細胞と、（ｂ）組込みベクター［組込みベクターは、（１）Ａｄｅ２ｐをコードする核酸、（２）関心のある１以上の異種ペプチド、タンパク質及び／又は機能性核酸をコードする核酸を含む１以上の発現カセットの挿入のための挿入部位を有する核酸、並びに（３）相同組換えによる宿主細胞のゲノムの特定の位置への組込みベクターの挿入を導く標的化核酸を含む］とを含む発現系。
【選択図】図１
【解決手段】（ａ）Ａｄｅ２ｐをコードする内因性ＡＤＥ２遺伝子が宿主細胞のゲノムから除去されているピチア・パストリス宿主細胞と、（ｂ）組込みベクター［組込みベクターは、（１）Ａｄｅ２ｐをコードする核酸、（２）関心のある１以上の異種ペプチド、タンパク質及び／又は機能性核酸をコードする核酸を含む１以上の発現カセットの挿入のための挿入部位を有する核酸、並びに（３）相同組換えによる宿主細胞のゲノムの特定の位置への組込みベクターの挿入を導く標的化核酸を含む］とを含む発現系。
【選択図】図１
Description
（１）発明の分野
本発明は分子生物学の分野に関する。特に、本発明は、形質転換された発現系からのタ
ンパク質産生の改善に使用される新規選択遺伝子に関する。
本発明は分子生物学の分野に関する。特に、本発明は、形質転換された発現系からのタ
ンパク質産生の改善に使用される新規選択遺伝子に関する。
（２）関連分野の説明
近年、出芽酵母ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）は、学術的お
よび商業的に関心のある異種タンパク質の発現のための、人気のある生物となっている（
Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：３２９−３３
２（２００２）；ＣｅｒｅｇｈｉｎｏおよびＣｒｅｇｇ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
．Ｒｅｖ．２４：４５−６６（２０００））。ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉ
ｓ）グリコシル化装置を遺伝的に修飾し、複合型ヒトグリカンで修飾された異種糖タンパ
ク質を発現させることが可能であることが最近示された（Ｃｈｏｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１００：５０２２−５０２７（２００３）；Ｈａｍｉｌｔｏｎら
，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：１２４４−１２４６（２００３）；Ｂｏｂｒｏｗｉｃｚら，
Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １４：７５７−７６６（２００４）；Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ，３１３：１４４１−１４４３（２００６））。しかし、形質転換ピチア・
パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞系のような形質転換細胞における、より高い細
胞産生を達成するための方法および物質に対する需要が依然として存在する。
近年、出芽酵母ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）は、学術的お
よび商業的に関心のある異種タンパク質の発現のための、人気のある生物となっている（
Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：３２９−３３
２（２００２）；ＣｅｒｅｇｈｉｎｏおよびＣｒｅｇｇ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
．Ｒｅｖ．２４：４５−６６（２０００））。ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉ
ｓ）グリコシル化装置を遺伝的に修飾し、複合型ヒトグリカンで修飾された異種糖タンパ
ク質を発現させることが可能であることが最近示された（Ｃｈｏｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１００：５０２２−５０２７（２００３）；Ｈａｍｉｌｔｏｎら
，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：１２４４−１２４６（２００３）；Ｂｏｂｒｏｗｉｃｚら，
Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １４：７５７−７６６（２００４）；Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ，３１３：１４４１−１４４３（２００６））。しかし、形質転換ピチア・
パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞系のような形質転換細胞における、より高い細
胞産生を達成するための方法および物質に対する需要が依然として存在する。
長年にわたり、多数の栄養要求性および優性選択マーカーが開発されており（Ｈｉｇｇ
ｉｎｓら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０３：４１−５３（１９９８）；Ｌｉ
ｎ Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏら，Ｇｅｎｅ ２６３：１５９−１６９（２００１）；Ｎｅｔｔ
およびＧｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｙｅａｓｔ ２０：１２７９−１２９０（２００３）；Ｎｅ
ｔｔら，Ｙｅａｓｔ ２２：２９５−３０４（２００５））、種々の用途のタンパク質発
現ベクターを構築するために使用されている。一般に、マーカー遺伝子、プラスミド上の
別の相同領域またはＡＯＸ１プロモーター断片において線状化され、適当な栄養要求性突
然変異体内に形質転換されたプラスミドを使用して、関心のある遺伝子がピチア・パスト
リス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ゲノム内に組み込まれる。その場合、該遊離ＤＮＡ末端の
相同組換えがこれらの遺伝子座内への単一交差型組込みを引き起こす。ピチア・パストリ
ス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）形質転換体は単コピーの該発現ベクターを含有するが、関心
のあるタンパク質を高レベルで発現する形質転換体を得るためには、多コピー組込み体に
関してスクリーニングすることが、しばしば望ましい。ＫａｎＲまたはＺｅｏＲのような
薬物耐性遺伝子を選択マーカーとして含有する発現ベクターを使用して、選択に使用され
る薬物のレベルを増加させることにより、多コピーの発現ベクターを含有する形質転換体
の数を増加させることが可能である。単一交差型組込みの１つの重要な欠点は、複数の組
込みコピーが相同組換えにより壊れて単コピーに戻りうることである。これは、関心のあ
るタンパク質が該細胞に対して毒性である又は該発現プラスミドの幾つかのコピーの排除
が該細胞の他の成長上の利益を有する場合、発酵中の発現反応の大規模化において特に問
題となりうる。
ｉｎｓら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０３：４１−５３（１９９８）；Ｌｉ
ｎ Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏら，Ｇｅｎｅ ２６３：１５９−１６９（２００１）；Ｎｅｔｔ
およびＧｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｙｅａｓｔ ２０：１２７９−１２９０（２００３）；Ｎｅ
ｔｔら，Ｙｅａｓｔ ２２：２９５−３０４（２００５））、種々の用途のタンパク質発
現ベクターを構築するために使用されている。一般に、マーカー遺伝子、プラスミド上の
別の相同領域またはＡＯＸ１プロモーター断片において線状化され、適当な栄養要求性突
然変異体内に形質転換されたプラスミドを使用して、関心のある遺伝子がピチア・パスト
リス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ゲノム内に組み込まれる。その場合、該遊離ＤＮＡ末端の
相同組換えがこれらの遺伝子座内への単一交差型組込みを引き起こす。ピチア・パストリ
ス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）形質転換体は単コピーの該発現ベクターを含有するが、関心
のあるタンパク質を高レベルで発現する形質転換体を得るためには、多コピー組込み体に
関してスクリーニングすることが、しばしば望ましい。ＫａｎＲまたはＺｅｏＲのような
薬物耐性遺伝子を選択マーカーとして含有する発現ベクターを使用して、選択に使用され
る薬物のレベルを増加させることにより、多コピーの発現ベクターを含有する形質転換体
の数を増加させることが可能である。単一交差型組込みの１つの重要な欠点は、複数の組
込みコピーが相同組換えにより壊れて単コピーに戻りうることである。これは、関心のあ
るタンパク質が該細胞に対して毒性である又は該発現プラスミドの幾つかのコピーの排除
が該細胞の他の成長上の利益を有する場合、発酵中の発現反応の大規模化において特に問
題となりうる。
米国特許第５，５８４，０３９号は、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａ
ｎｏｌｉｃａ）から単離された選択マーカー遺伝子ＡＤＥ２に関するものである。Ｐｉｏ
ｎｔｅｋら，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５０：３３１−３
３８（１９９８）は、シュワンニオマイセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍ
ｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）およびピチア・スチピチス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔ
ｉｐｉｔｉｓ）における新規遺伝子発現系に関するものであり、該系は、ＡＤＥ２マーカ
ーと推定複製配列とを含有するベクターを利用する。しかし、対応する遺伝子はピチア・
パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）からは未だ単離されておらず、ピチア・パストリス
（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるＡＤＥ２での形質転換の効果は未だ確認されていない
。
ｎｏｌｉｃａ）から単離された選択マーカー遺伝子ＡＤＥ２に関するものである。Ｐｉｏ
ｎｔｅｋら，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５０：３３１−３
３８（１９９８）は、シュワンニオマイセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍ
ｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）およびピチア・スチピチス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔ
ｉｐｉｔｉｓ）における新規遺伝子発現系に関するものであり、該系は、ＡＤＥ２マーカ
ーと推定複製配列とを含有するベクターを利用する。しかし、対応する遺伝子はピチア・
パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）からは未だ単離されておらず、ピチア・パストリス
（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるＡＤＥ２での形質転換の効果は未だ確認されていない
。
したがって、宿主発現系としてピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母を使
用する、異種遺伝子の形質転換、選択および発現のための改良方法が必要とされている。
用する、異種遺伝子の形質転換、選択および発現のための改良方法が必要とされている。
Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：３２９−３３２（２００２）
ＣｅｒｅｇｈｉｎｏおよびＣｒｅｇｇ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２４：４５−６６（２０００）
Ｃｈｏｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１００：５０２２−５０２７（２００３）
Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：１２４４−１２４６（２００３）
Ｂｏｂｒｏｗｉｃｚら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １４：７５７−７６６（２００４）
Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１３：１４４１−１４４３（２００６）
Ｈｉｇｇｉｎｓら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０３：４１−５３（１９９８）
Ｌｉｎ Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏら，Ｇｅｎｅ ２６３：１５９−１６９（２００１）
ＮｅｔｔおよびＧｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｙｅａｓｔ ２０：１２７９−１２９０（２００３）
Ｎｅｔｔら，Ｙｅａｓｔ ２２：２９５−３０４（２００５）
Ｐｉｏｎｔｅｋら，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５０：３３１−３３８（１９９８）
発明の概括
本発明は、組換えタンパク質を発現させるための発現系としての酵母または糸状菌のよ
うな下等真核細胞の使用のための方法および物質を提供する。
本発明は、組換えタンパク質を発現させるための発現系としての酵母または糸状菌のよ
うな下等真核細胞の使用のための方法および物質を提供する。
１つの態様においては、該方法は、下等真核細胞の、より遅く成長するａｄｅ２栄養要
求性株の構築、およびプロモーターに機能的に連結されたＡＤＥ２マーカー遺伝子または
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）および組換えタンパク質をコードする核酸を含
みａｄｅ２栄養要求性株のゲノム内に組込まれうる組込みベクターの使用に基づくもので
あり、ここで、該組込みベクターは該ａｄｅ２栄養要求性株のゲノム内に組込まれ、該Ａ
ＤＥ２は該栄養要求性株をアデニンに関して原栄養性にし、該組換えタンパク質が発現さ
れる。
求性株の構築、およびプロモーターに機能的に連結されたＡＤＥ２マーカー遺伝子または
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）および組換えタンパク質をコードする核酸を含
みａｄｅ２栄養要求性株のゲノム内に組込まれうる組込みベクターの使用に基づくもので
あり、ここで、該組込みベクターは該ａｄｅ２栄養要求性株のゲノム内に組込まれ、該Ａ
ＤＥ２は該栄養要求性株をアデニンに関して原栄養性にし、該組換えタンパク質が発現さ
れる。
したがって、（ａ）Ａｄｅ２ｐをコードする内因性ＡＤＥ２遺伝子がピチア・パストリ
ス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞のゲノムから除去されている該ピチア・
パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞と、（ｂ）組込みベクター［該
組込みベクターは、（１）Ａｄｅ２ｐをコードする核酸、（２）関心のある１以上の異種
ペプチド、タンパク質および／または機能性核酸をコードする核酸を含む１以上の発現カ
セットの挿入のための挿入部位を有する核酸、ならびに（３）相同組換えによる該宿主細
胞のゲノムの特定の位置への該組込みベクターの挿入を導く標的化核酸を含む］とを含む
発現系を提供する。
ス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞のゲノムから除去されている該ピチア・
パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞と、（ｂ）組込みベクター［該
組込みベクターは、（１）Ａｄｅ２ｐをコードする核酸、（２）関心のある１以上の異種
ペプチド、タンパク質および／または機能性核酸をコードする核酸を含む１以上の発現カ
セットの挿入のための挿入部位を有する核酸、ならびに（３）相同組換えによる該宿主細
胞のゲノムの特定の位置への該組込みベクターの挿入を導く標的化核酸を含む］とを含む
発現系を提供する。
また、異種タンパク質またはペプチドを発現する組換えピチア・パストリス（Ｐｉｃｈ
ｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞の製造方法をも提供する。ここで、該製造方法は、（
ａ）Ａｄｅ２ｐをコードする内因性ＡＤＥ２遺伝子が宿主細胞のゲノムから除去されてい
る該宿主細胞を準備し、（ａ）組込みベクター［該組込みベクターは、（１）Ａｄｅ２ｐ
をコードする核酸、（２）関心のある１以上の異種ペプチド、タンパク質および／または
機能性核酸をコードする核酸を含む１以上の発現カセットを有する核酸、ならびに（３）
相同組換えによる該宿主細胞のゲノムの特定の位置への該組込みベクターの挿入を導く標
的化核酸を含む］で該宿主細胞を形質転換することを含み、ここで、該形質転換宿主細胞
は該組換えタンパク質を産生する。
ｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞の製造方法をも提供する。ここで、該製造方法は、（
ａ）Ａｄｅ２ｐをコードする内因性ＡＤＥ２遺伝子が宿主細胞のゲノムから除去されてい
る該宿主細胞を準備し、（ａ）組込みベクター［該組込みベクターは、（１）Ａｄｅ２ｐ
をコードする核酸、（２）関心のある１以上の異種ペプチド、タンパク質および／または
機能性核酸をコードする核酸を含む１以上の発現カセットを有する核酸、ならびに（３）
相同組換えによる該宿主細胞のゲノムの特定の位置への該組込みベクターの挿入を導く標
的化核酸を含む］で該宿主細胞を形質転換することを含み、ここで、該形質転換宿主細胞
は該組換えタンパク質を産生する。
さらに、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）のＡＤＥ２遺伝子を
含む単離された核酸を提供する。特定の態様においては、該核酸は、Ａｄｅ２ｐタンパク
質をコードするオープンリーディングフレームを含み、あるいは該核酸は、ヌクレオチド
１２７〜ヌクレオチド１，８１５の配列番号６０に示されている核酸配列に対して９５％
の同一性を有するヌクレオチド配列を有する。さらに、配列番号６１に示されているアミ
ノ酸配列に対して９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを
提供する。
含む単離された核酸を提供する。特定の態様においては、該核酸は、Ａｄｅ２ｐタンパク
質をコードするオープンリーディングフレームを含み、あるいは該核酸は、ヌクレオチド
１２７〜ヌクレオチド１，８１５の配列番号６０に示されている核酸配列に対して９５％
の同一性を有するヌクレオチド配列を有する。さらに、配列番号６１に示されているアミ
ノ酸配列に対して９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを
提供する。
本出願人は更に、低い転写活性を有するプロモーターである該組込みベクター内の最小
プロモーターに栄養要求性マーカー遺伝子またはＯＲＦを機能的に連結させることが、該
栄養要求性宿主細胞のゲノム内に組込まれた該組込みベクターの十分な数のコピーを含有
する組換え宿主細胞の産生を可能にして、該細胞を原栄養性にし、該ゲノム内に組込まれ
た該組込みベクターの１コピーのみを含有する細胞において産生されるであろう量より多
量の関心のある組換えタンパク質または機能性核酸を該細胞が産生することを可能にする
ことを見出した。
プロモーターに栄養要求性マーカー遺伝子またはＯＲＦを機能的に連結させることが、該
栄養要求性宿主細胞のゲノム内に組込まれた該組込みベクターの十分な数のコピーを含有
する組換え宿主細胞の産生を可能にして、該細胞を原栄養性にし、該ゲノム内に組込まれ
た該組込みベクターの１コピーのみを含有する細胞において産生されるであろう量より多
量の関心のある組換えタンパク質または機能性核酸を該細胞が産生することを可能にする
ことを見出した。
したがって、下等真核細胞の栄養要求性株を入手または構築する方法を提供し、また、
弱いプロモーター、減衰化内因性もしくは異種プロモーター、潜在性（クリプティック）
プロモーターまたはトランケート化内因性もしくは異種プロモーターに機能的に連結され
た該栄養要求性を相補するマーカー遺伝子またはＯＲＦおよび組換えタンパク質をコード
する核酸を含み該栄養要求性株のゲノム内に組込まれうる組込みベクターを提供する。該
宿主細胞の栄養要求性を相補するよう幾つかの該組込みベクターがゲノム内に組込まれた
宿主細胞を、該栄養要求性を相補する代謝産物を欠く培地において選択し、該栄養要求性
を相補する代謝産物を欠く培地において、または該代謝産物を含有する培地において（な
ぜなら、その場合、該マーカーを含むプラスミドを含有しない細胞は、より遅く成長する
からである）、該宿主細胞を増殖させることにより維持する。
弱いプロモーター、減衰化内因性もしくは異種プロモーター、潜在性（クリプティック）
プロモーターまたはトランケート化内因性もしくは異種プロモーターに機能的に連結され
た該栄養要求性を相補するマーカー遺伝子またはＯＲＦおよび組換えタンパク質をコード
する核酸を含み該栄養要求性株のゲノム内に組込まれうる組込みベクターを提供する。該
宿主細胞の栄養要求性を相補するよう幾つかの該組込みベクターがゲノム内に組込まれた
宿主細胞を、該栄養要求性を相補する代謝産物を欠く培地において選択し、該栄養要求性
を相補する代謝産物を欠く培地において、または該代謝産物を含有する培地において（な
ぜなら、その場合、該マーカーを含むプラスミドを含有しない細胞は、より遅く成長する
からである）、該宿主細胞を増殖させることにより維持する。
もう１つの実施形態においては、（ａ）栄養要求性選択マーカータンパク質をコードす
る内因性遺伝子が宿主細胞のゲノムから除去されている該宿主細胞と、（ｂ）組込みベク
ター［該組込みベクターは、（１）弱いプロモーター、減衰化内因性もしくは異種プロモ
ーター、潜在性（クリプティック）プロモーター、トランケート化内因性もしくは異種プ
ロモーターに機能的に連結された又はプロモーターを伴わない、該栄養要求性選択マーカ
ータンパク質をコードする内因性遺伝子の機能に相補的な機能をコードするオープンリー
ディングフレーム（ＯＲＦ）を含む核酸、（２）関心のある１以上の異種ペプチド、タン
パク質および／または機能性核酸をコードする核酸を含む１以上の発現カセットの挿入の
ための挿入部位を有する核酸、ならびに（３）相同組換えによる該宿主細胞のゲノムの特
定の位置への該組込みベクターの挿入を導く標的化核酸を含む］とを含む発現系を提供す
る。
る内因性遺伝子が宿主細胞のゲノムから除去されている該宿主細胞と、（ｂ）組込みベク
ター［該組込みベクターは、（１）弱いプロモーター、減衰化内因性もしくは異種プロモ
ーター、潜在性（クリプティック）プロモーター、トランケート化内因性もしくは異種プ
ロモーターに機能的に連結された又はプロモーターを伴わない、該栄養要求性選択マーカ
ータンパク質をコードする内因性遺伝子の機能に相補的な機能をコードするオープンリー
ディングフレーム（ＯＲＦ）を含む核酸、（２）関心のある１以上の異種ペプチド、タン
パク質および／または機能性核酸をコードする核酸を含む１以上の発現カセットの挿入の
ための挿入部位を有する核酸、ならびに（３）相同組換えによる該宿主細胞のゲノムの特
定の位置への該組込みベクターの挿入を導く標的化核酸を含む］とを含む発現系を提供す
る。
さらにもう１つの実施形態においては、宿主細胞における組換えタンパク質の発現のた
めの方法を提供し、該方法は、（ａ）栄養要求性選択マーカータンパク質をコードする内
因性遺伝子が宿主細胞のゲノムから除去されている該宿主細胞を準備し、（ａ）組込みベ
クター［該組込みベクターは、（１）弱いプロモーター、減衰化内因性もしくは異種プロ
モーター、潜在性（クリプティック）プロモーター、トランケート化内因性もしくは異種
プロモーターに機能的に連結された又はプロモーターを伴わない、該栄養要求性選択マー
カータンパク質をコードする内因性遺伝子の機能に相補的な機能をコードするオープンリ
ーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む核酸、（２）関心のある１以上の異種ペプチド、タ
ンパク質および／または機能性核酸をコードする核酸を含む１以上の発現カセットの挿入
のための挿入部位を有する核酸、ならびに（３）相同組換えによる該宿主細胞のゲノムの
特定の位置への該組込みベクターの挿入を導く標的化核酸を含む］で該宿主細胞を形質転
換することを含み、ここで、該形質転換宿主細胞は該組換えタンパク質を産生する。
めの方法を提供し、該方法は、（ａ）栄養要求性選択マーカータンパク質をコードする内
因性遺伝子が宿主細胞のゲノムから除去されている該宿主細胞を準備し、（ａ）組込みベ
クター［該組込みベクターは、（１）弱いプロモーター、減衰化内因性もしくは異種プロ
モーター、潜在性（クリプティック）プロモーター、トランケート化内因性もしくは異種
プロモーターに機能的に連結された又はプロモーターを伴わない、該栄養要求性選択マー
カータンパク質をコードする内因性遺伝子の機能に相補的な機能をコードするオープンリ
ーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む核酸、（２）関心のある１以上の異種ペプチド、タ
ンパク質および／または機能性核酸をコードする核酸を含む１以上の発現カセットの挿入
のための挿入部位を有する核酸、ならびに（３）相同組換えによる該宿主細胞のゲノムの
特定の位置への該組込みベクターの挿入を導く標的化核酸を含む］で該宿主細胞を形質転
換することを含み、ここで、該形質転換宿主細胞は該組換えタンパク質を産生する。
前記実施形態の他の態様においては、該栄養要求性選択マーカータンパク質は、ＡＤＥ
、ＵＲＡおよびＬＹＳよりなる群から選ばれる遺伝子によりコードされている。さらにも
う１つの態様においては、該栄養要求性選択マーカータンパク質はＡＤＥ１遺伝子または
ＡＤＥ２遺伝子によりコードされている。
、ＵＲＡおよびＬＹＳよりなる群から選ばれる遺伝子によりコードされている。さらにも
う１つの態様においては、該栄養要求性選択マーカータンパク質はＡＤＥ１遺伝子または
ＡＤＥ２遺伝子によりコードされている。
さらに他の態様においては、該組込みベクターは、関心のある１以上の異種ペプチド、
タンパク質および／または機能性核酸をコードする１以上の発現カセットの挿入のための
複数の挿入部位を含む。さらに他の態様においては、該組込みベクターは２以上の発現カ
セットを含む。さらに他の態様においては、該組込みベクターはそれらの発現カセットの
間に相同ＤＮＡ配列をほとんど又は全く含まない。さらに他の態様においては、該組込み
ベクターは、モノクローナル抗体の軽鎖をコードする第１発現カセットと、モノクローナ
ル抗体の重鎖をコードする第２発現カセットとを含む。
タンパク質および／または機能性核酸をコードする１以上の発現カセットの挿入のための
複数の挿入部位を含む。さらに他の態様においては、該組込みベクターは２以上の発現カ
セットを含む。さらに他の態様においては、該組込みベクターはそれらの発現カセットの
間に相同ＤＮＡ配列をほとんど又は全く含まない。さらに他の態様においては、該組込み
ベクターは、モノクローナル抗体の軽鎖をコードする第１発現カセットと、モノクローナ
ル抗体の重鎖をコードする第２発現カセットとを含む。
さらに他の態様においては、該宿主細胞は下等真核生物である。さらに他の態様におい
ては、該宿主細胞は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア
・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ
（Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラメ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｏ
ｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラネファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅ
ｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・ミヌタ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ）［オガタエア・ミヌ
タ（Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ）、ピチア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄｎ
ｅｒｉ）］、ピチア・オプンチエ（Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・テルモ
トレランス（Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（
Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルクウム（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅ
ｒｃｕｕｍ）、ピチア・ピエペリ（Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スティプ
ティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔ
ｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、サッカロミセス・セレビシ
エ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス属種（Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クライベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．
）、クライベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、カン
ジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニデュラ
ンス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐ
ｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、
クリソスポリウム・ルクノウェンセ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎ
ｓｅ）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）、フザリウム・グラミネウム（Ｆ
ｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ
ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フィスコミトレラ・パテンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ
ｐａｔｅｎｓ）およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ
）よりなる群から選ばれる種のものである。さらに他の態様においては、請求項１の発現
系において、該宿主細胞は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、
または混合型もしくは複合型Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生しうるよう修飾さ
れたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞である。
ては、該宿主細胞は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア
・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ
（Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラメ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｏ
ｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラネファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅ
ｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・ミヌタ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ）［オガタエア・ミヌ
タ（Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ）、ピチア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄｎ
ｅｒｉ）］、ピチア・オプンチエ（Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・テルモ
トレランス（Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（
Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルクウム（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅ
ｒｃｕｕｍ）、ピチア・ピエペリ（Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スティプ
ティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔ
ｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、サッカロミセス・セレビシ
エ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス属種（Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クライベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．
）、クライベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、カン
ジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニデュラ
ンス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐ
ｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、
クリソスポリウム・ルクノウェンセ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎ
ｓｅ）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）、フザリウム・グラミネウム（Ｆ
ｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ
ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フィスコミトレラ・パテンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ
ｐａｔｅｎｓ）およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ
）よりなる群から選ばれる種のものである。さらに他の態様においては、請求項１の発現
系において、該宿主細胞は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、
または混合型もしくは複合型Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生しうるよう修飾さ
れたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞である。
定義
本明細書中で特に定められていない限り、本発明に関して用いる科学技術用語および表
現は、当業者に一般に理解されている意義を有するものとする。さらに、文脈に矛盾しな
い限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする
。一般に、本明細書に記載の生化学、酵素学、分子細胞生物学、微生物、遺伝学ならびに
タンパク質および核酸の化学およびハイブリダイゼーションに関して用いる名称、ならび
にそれらの技術は、当技術分野においてよく知られており一般に用いられているものであ
る。一般に、本発明の方法および技術は、特に示さない限り、当技術分野でよく知られて
いる通常の方法に従い、ならびに本明細書中に引用され記載されている種々の全般的およ
びより具体的な参考文献に記載されているとおりに行われる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅ
ｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ
ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２，ａｎｄ Ｓ
ｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ ｔｏ ２００２）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，
Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃ
ｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（２
００３）；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍａｎｕａｌ，Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔ
ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，ＮＪ；Ｈａｎｄｂｏｏ
ｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ
Ｉ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９７６）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ： Ｓｅｃｔｉｏｎ Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ ＩＩ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ
（１９７６）；Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９９）を参照され
たい。本明細書に記載の全ての刊行物、特許および他の参考文献の全体を、参照により本
明細書に組み入れることとする。
本明細書中で特に定められていない限り、本発明に関して用いる科学技術用語および表
現は、当業者に一般に理解されている意義を有するものとする。さらに、文脈に矛盾しな
い限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする
。一般に、本明細書に記載の生化学、酵素学、分子細胞生物学、微生物、遺伝学ならびに
タンパク質および核酸の化学およびハイブリダイゼーションに関して用いる名称、ならび
にそれらの技術は、当技術分野においてよく知られており一般に用いられているものであ
る。一般に、本発明の方法および技術は、特に示さない限り、当技術分野でよく知られて
いる通常の方法に従い、ならびに本明細書中に引用され記載されている種々の全般的およ
びより具体的な参考文献に記載されているとおりに行われる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅ
ｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ
ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２，ａｎｄ Ｓ
ｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ ｔｏ ２００２）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，
Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃ
ｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（２
００３）；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍａｎｕａｌ，Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔ
ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，ＮＪ；Ｈａｎｄｂｏｏ
ｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ
Ｉ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９７６）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ： Ｓｅｃｔｉｏｎ Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ ＩＩ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ
（１９７６）；Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９９）を参照され
たい。本明細書に記載の全ての刊行物、特許および他の参考文献の全体を、参照により本
明細書に組み入れることとする。
本明細書においては、酵母の染色体遺伝子を命名するための遺伝学的命名法が用いられ
ている。各遺伝子、対立遺伝子または遺伝子座は３つのイタリック体の文字により示され
ている。優性対立遺伝子は、その遺伝子記号の全文字の大文字を用いることにより示され
ており（例えば、アデニン２遺伝子に関するＡＤＥ２）、一方、小文字は劣性対立遺伝子
を示す（例えば、アデニン２の栄養要求性マーカーに関するａｄｅ２）。野生型遺伝子は
上付き「＋」により示され、突然変異体は上付き「−」により示される。記号Δは部分的
または完全な欠失を示しうる。遺伝子の挿入は、記号「：：」を用いることにより、細菌
学的命名法に準拠している。例えば、ｔｒｐ２：：ＡＲＧ２はＴＲＰ２遺伝子座における
ＡＲＧ２遺伝子の挿入を示し、この場合、ＡＲＧ２が優性（かつ機能性）であり、ｔｒｐ
２が劣性（かつ欠損性）である。遺伝子によりコードされるタンパク質は、大文字の頭文
字および通常は接尾語「ｐ」を伴う非イタリック体の関連遺伝子記号により示される。例
えば、ＡＤＥ２によりコードされるアデニン２タンパク質はＡｄｅ２ｐである。表現型は
、大文字の頭文字を伴う、遺伝子記号に対応する非イタリック体の３文字略語により示さ
れる。野生型株は「＋」上付き記号により示され、突然変異体は「−」上付き記号により
示される。例えば、Ａｄｅ２＋は野生型表現型であり、一方、Ａｄｅ２−は栄養要求性表
現型（アデニンを要するもの）である。
ている。各遺伝子、対立遺伝子または遺伝子座は３つのイタリック体の文字により示され
ている。優性対立遺伝子は、その遺伝子記号の全文字の大文字を用いることにより示され
ており（例えば、アデニン２遺伝子に関するＡＤＥ２）、一方、小文字は劣性対立遺伝子
を示す（例えば、アデニン２の栄養要求性マーカーに関するａｄｅ２）。野生型遺伝子は
上付き「＋」により示され、突然変異体は上付き「−」により示される。記号Δは部分的
または完全な欠失を示しうる。遺伝子の挿入は、記号「：：」を用いることにより、細菌
学的命名法に準拠している。例えば、ｔｒｐ２：：ＡＲＧ２はＴＲＰ２遺伝子座における
ＡＲＧ２遺伝子の挿入を示し、この場合、ＡＲＧ２が優性（かつ機能性）であり、ｔｒｐ
２が劣性（かつ欠損性）である。遺伝子によりコードされるタンパク質は、大文字の頭文
字および通常は接尾語「ｐ」を伴う非イタリック体の関連遺伝子記号により示される。例
えば、ＡＤＥ２によりコードされるアデニン２タンパク質はＡｄｅ２ｐである。表現型は
、大文字の頭文字を伴う、遺伝子記号に対応する非イタリック体の３文字略語により示さ
れる。野生型株は「＋」上付き記号により示され、突然変異体は「−」上付き記号により
示される。例えば、Ａｄｅ２＋は野生型表現型であり、一方、Ａｄｅ２−は栄養要求性表
現型（アデニンを要するもの）である。
本明細書中で用いる「ベクター」なる語は、それに連結された別の核酸を運搬しうる核
酸分子を意味すると意図される。１つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、これ
は、追加的なＤＮＡ断片が連結されうる環状二本鎖ＤＮＡループを意味する。他のベクタ
ーには、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）および酵母人工染色体（ＹＡＣ）が含まれ
る。もう１つのタイプのベクターは、追加的なＤＮＡ断片がウイルスゲノム内に連結され
うるウイルスベクターである（後記において更に詳しく説明する）。あるベクターは、そ
れが導入される宿主細胞において自律複製することが可能である（例えば、該宿主細胞内
で機能する複製起点を有するベクター）。他のベクターは宿主細胞内への導入の際に宿主
細胞のゲノム内に組込まれることが可能であり、それにより、宿主ゲノムと共に複製され
る。さらに、ある好ましいベクターは、それが機能的に連結されている遺伝子の発現を導
きうる。そのようなベクターは本明細書中では「組換え発現ベクター」（または単に「発
現ベクター」）と称される。
酸分子を意味すると意図される。１つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、これ
は、追加的なＤＮＡ断片が連結されうる環状二本鎖ＤＮＡループを意味する。他のベクタ
ーには、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）および酵母人工染色体（ＹＡＣ）が含まれ
る。もう１つのタイプのベクターは、追加的なＤＮＡ断片がウイルスゲノム内に連結され
うるウイルスベクターである（後記において更に詳しく説明する）。あるベクターは、そ
れが導入される宿主細胞において自律複製することが可能である（例えば、該宿主細胞内
で機能する複製起点を有するベクター）。他のベクターは宿主細胞内への導入の際に宿主
細胞のゲノム内に組込まれることが可能であり、それにより、宿主ゲノムと共に複製され
る。さらに、ある好ましいベクターは、それが機能的に連結されている遺伝子の発現を導
きうる。そのようなベクターは本明細書中では「組換え発現ベクター」（または単に「発
現ベクター」）と称される。
「組込みベクター」なる語は、選択マーカー遺伝子またはオープンリーディングフレー
ム（ＯＲＦ）、標的化核酸、関心のある１以上の遺伝子または核酸、および微生物自律性
ＤＮＡ複製開始部位（以下、ＤＮＡ複製起点、例えば、細菌に関してはＯＲＩと称される
）として機能する核酸配列を含有する、宿主細胞内に組込まれうるベクターを意味する。
該組込みベクターは、宿主細胞ゲノムの特異的遺伝子座内にＤＮＡの直鎖状断片を組込む
相同組換えのようなＤＮＡ組換えの過程により該ベクターが該宿主細胞ゲノム内に組込ま
れた場合にのみ、該宿主細胞内で複製されうる。例えば、該標的化核酸は該組込みベクタ
ーを該ゲノム内の対応領域へ標的化し、ついで、その部位において、それは相同組換えに
より該ゲノム内に組込まれる。
ム（ＯＲＦ）、標的化核酸、関心のある１以上の遺伝子または核酸、および微生物自律性
ＤＮＡ複製開始部位（以下、ＤＮＡ複製起点、例えば、細菌に関してはＯＲＩと称される
）として機能する核酸配列を含有する、宿主細胞内に組込まれうるベクターを意味する。
該組込みベクターは、宿主細胞ゲノムの特異的遺伝子座内にＤＮＡの直鎖状断片を組込む
相同組換えのようなＤＮＡ組換えの過程により該ベクターが該宿主細胞ゲノム内に組込ま
れた場合にのみ、該宿主細胞内で複製されうる。例えば、該標的化核酸は該組込みベクタ
ーを該ゲノム内の対応領域へ標的化し、ついで、その部位において、それは相同組換えに
より該ゲノム内に組込まれる。
「選択マーカー遺伝子」、「選択マーカー遺伝子」、「選択マーカー配列」などの語は
、該マーカー遺伝子を含有しない宿主と比べた場合の遺伝的利点を形質転換宿主にもたら
すベクター上に含有された遺伝子または核酸配列を意味する。例えば、ピチア・パストリ
ス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子はマーカー遺伝子である。なぜなら、該遺伝
子を含有する細胞がウラシルの非存在下で増殖しうることにより、その存在が選択されう
るからである。その存在は、該遺伝子を含有する細胞が５−ＦＯＡの存在下で増殖し得な
いことによっても選択されうる。選択マーカー遺伝子または配列は、正および負の両方の
選択可能性を示すことを必ずしも要しない。ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ
）由来のマーカー配列または遺伝子の非限定的な具体例には、ＡＤＥ１、ＡＤＥ２、ＡＲ
Ｇ４、ＨＩＳ４、ＬＹＳ２、ＵＲＡ５およびＵＲＡ３が含まれる。一般に、本明細書に開
示されている発現系において使用される選択マーカー遺伝子は、該宿主における栄養要求
性突然変異を相補する遺伝子産物をコードする。栄養要求性突然変異または栄養要求性は
、生物が、その成長に要求される特定の有機化合物または代謝産物を合成し得ないことを
意味する（ＩＵＰＡＣによる定義）。栄養要求体は、この特徴を示す生物であり、「栄養
要求（の）」は、対応する形容詞である。栄養要求性は原栄養性の反対語である。
、該マーカー遺伝子を含有しない宿主と比べた場合の遺伝的利点を形質転換宿主にもたら
すベクター上に含有された遺伝子または核酸配列を意味する。例えば、ピチア・パストリ
ス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子はマーカー遺伝子である。なぜなら、該遺伝
子を含有する細胞がウラシルの非存在下で増殖しうることにより、その存在が選択されう
るからである。その存在は、該遺伝子を含有する細胞が５−ＦＯＡの存在下で増殖し得な
いことによっても選択されうる。選択マーカー遺伝子または配列は、正および負の両方の
選択可能性を示すことを必ずしも要しない。ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ
）由来のマーカー配列または遺伝子の非限定的な具体例には、ＡＤＥ１、ＡＤＥ２、ＡＲ
Ｇ４、ＨＩＳ４、ＬＹＳ２、ＵＲＡ５およびＵＲＡ３が含まれる。一般に、本明細書に開
示されている発現系において使用される選択マーカー遺伝子は、該宿主における栄養要求
性突然変異を相補する遺伝子産物をコードする。栄養要求性突然変異または栄養要求性は
、生物が、その成長に要求される特定の有機化合物または代謝産物を合成し得ないことを
意味する（ＩＵＰＡＣによる定義）。栄養要求体は、この特徴を示す生物であり、「栄養
要求（の）」は、対応する形容詞である。栄養要求性は原栄養性の反対語である。
「標的化核酸」なる語は、「標的遺伝子座」と称される、宿主における特異的相同遺伝
子座内への、ベクター組込みプラスミドの相同組換えによる挿入を導くベクタープラスミ
ド上に含有された核酸を意味する。
子座内への、ベクター組込みプラスミドの相同組換えによる挿入を導くベクタープラスミ
ド上に含有された核酸を意味する。
「関心のある配列」または「関心のある遺伝子」または「関心のある核酸」なる語は、
典型的には、宿主細胞内で通常は発現されないタンパク質または機能性ＲＮＡをコードす
る核酸配列を意味する。本明細書に開示されている方法は、宿主ゲノム内に安定に組込ま
れた１以上の関心のある配列または関心のある遺伝子の効率的発現を可能にする。関心の
ある配列の非限定的な具体例には、酵素活性を有する１以上の関心のあるポリペプチド、
例えば、宿主におけるＮ−グリカン合成に影響を及ぼす酵素、例えばマンノシルトランス
フェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグ
ルコサミントランスポーター、ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル
ガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェ
ラーゼ、エリスロポエチン、サイトカイン、例えばインターフェロン−α、インターフェ
ロン−β、インターフェロン−γ、インターフェロン−ωおよび顆粒球−ＣＳＦ、凝固因
子、例えば因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸおよびヒトプロテインＣ、可溶性ＩｇＥ受容体α鎖、
ＩｇＧ、ＩｇＭ、ウロキナーゼ、キマーゼ、尿素トリプシンインヒビター、ＩＧＦ−結合
性タンパク質、上皮増殖因子、増殖ホルモン放出因子、アネキシンＶ融合タンパク質、ア
ンジオスタチン、血管内皮増殖因子−２、骨髄系前駆体抑制因子−１およびオステオプロ
テゲリンをコードする配列が含まれる。
典型的には、宿主細胞内で通常は発現されないタンパク質または機能性ＲＮＡをコードす
る核酸配列を意味する。本明細書に開示されている方法は、宿主ゲノム内に安定に組込ま
れた１以上の関心のある配列または関心のある遺伝子の効率的発現を可能にする。関心の
ある配列の非限定的な具体例には、酵素活性を有する１以上の関心のあるポリペプチド、
例えば、宿主におけるＮ−グリカン合成に影響を及ぼす酵素、例えばマンノシルトランス
フェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグ
ルコサミントランスポーター、ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル
ガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェ
ラーゼ、エリスロポエチン、サイトカイン、例えばインターフェロン−α、インターフェ
ロン−β、インターフェロン−γ、インターフェロン−ωおよび顆粒球−ＣＳＦ、凝固因
子、例えば因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸおよびヒトプロテインＣ、可溶性ＩｇＥ受容体α鎖、
ＩｇＧ、ＩｇＭ、ウロキナーゼ、キマーゼ、尿素トリプシンインヒビター、ＩＧＦ−結合
性タンパク質、上皮増殖因子、増殖ホルモン放出因子、アネキシンＶ融合タンパク質、ア
ンジオスタチン、血管内皮増殖因子−２、骨髄系前駆体抑制因子−１およびオステオプロ
テゲリンをコードする配列が含まれる。
「機能的に連結」なる語は、発現制御配列が、関心のある遺伝子もしくは配列または選
択マーカー遺伝子もしくは配列に隣接して連結されていて、該遺伝子または配列の発現を
制御すること、ならびにトランスで又は或る距離を隔てて作用する発現制御配列が、関心
のある遺伝子を制御するように連結されていることを意味する。
択マーカー遺伝子もしくは配列に隣接して連結されていて、該遺伝子または配列の発現を
制御すること、ならびにトランスで又は或る距離を隔てて作用する発現制御配列が、関心
のある遺伝子を制御するように連結されていることを意味する。
本明細書中で用いる「発現制御配列」なる語は、それが機能的に連結されているコード
配列の発現に影響を及ぼすのに必要なポリヌクレオチド配列を意味する。発現制御配列は
、核酸配列の転写、転写後事象および翻訳を制御する配列である。発現制御配列には、適
当な転写開始配列、終結配列、プロモーター配列およびエンハンサー配列；効率的なＲＮ
Ａプロセッシングシグナル、例えばスプライシングおよびポリアデニル化シグナル；細胞
質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を増強する配列（例えば、リボソーム結合部位）
；タンパク質安定性を増強する配列；ならびに望ましい場合には、タンパク質分泌を促進
する配列が含まれる。そのような制御配列の性質は宿主生物によって異なり、原核生物に
おいては、そのような制御配列には、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位および
転写終結配列が含まれる。「制御配列」なる語は、少なくとも、発現のために存在が必須
である全ての成分を含むと意図され、存在することが有利である追加的な成分、例えばリ
ーダー配列および融合相手の配列をも含みうる。
配列の発現に影響を及ぼすのに必要なポリヌクレオチド配列を意味する。発現制御配列は
、核酸配列の転写、転写後事象および翻訳を制御する配列である。発現制御配列には、適
当な転写開始配列、終結配列、プロモーター配列およびエンハンサー配列；効率的なＲＮ
Ａプロセッシングシグナル、例えばスプライシングおよびポリアデニル化シグナル；細胞
質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を増強する配列（例えば、リボソーム結合部位）
；タンパク質安定性を増強する配列；ならびに望ましい場合には、タンパク質分泌を促進
する配列が含まれる。そのような制御配列の性質は宿主生物によって異なり、原核生物に
おいては、そのような制御配列には、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位および
転写終結配列が含まれる。「制御配列」なる語は、少なくとも、発現のために存在が必須
である全ての成分を含むと意図され、存在することが有利である追加的な成分、例えばリ
ーダー配列および融合相手の配列をも含みうる。
本明細書中で用いる「組換え宿主細胞」（「発現宿主細胞」、「発現宿主系」、「発現
系」または単に「宿主細胞」）なる語は、組換えベクターが導入された細胞を意味すると
意図される。そのような用語は、その特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の後代
をも意味すると意図されると理解されるべきである。突然変異または環境の影響により、
後の世代において、ある修飾が生じうるため、そのような後代は実際には親細胞と同一で
ない可能性があるが、本明細書中で用いる「宿主細胞」なる語の範囲内に尚も含まれる。
組換え宿主細胞は、培養内で増殖した単離された細胞または細胞系であることが可能であ
り、あるいは、生きた組織または生物に存在する細胞でありうる。
系」または単に「宿主細胞」）なる語は、組換えベクターが導入された細胞を意味すると
意図される。そのような用語は、その特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の後代
をも意味すると意図されると理解されるべきである。突然変異または環境の影響により、
後の世代において、ある修飾が生じうるため、そのような後代は実際には親細胞と同一で
ない可能性があるが、本明細書中で用いる「宿主細胞」なる語の範囲内に尚も含まれる。
組換え宿主細胞は、培養内で増殖した単離された細胞または細胞系であることが可能であ
り、あるいは、生きた組織または生物に存在する細胞でありうる。
「真核生物」なる語は有核細胞または生物を意味し、昆虫細胞、植物細胞、哺乳類細胞
、動物細胞および下等真核細胞を意味する。
、動物細胞および下等真核細胞を意味する。
「下等真核細胞」なる語は、酵母、単細胞および多細胞真菌または糸状菌を含む。「酵
母」および「真菌」には、限定的なものではないが、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ
ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃ
ａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・
コクラメ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラネファシエンス（Ｐｉ
ｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・ミヌタ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｉ
ｎｕｔａ）［オガタエア・ミヌタ（Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ）、ピチア・リンドネ
リ（Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄｎｅｒｉ）］、ピチア・オプンチエ（Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕ
ｎｔｉａｅ）、ピチア・テルモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎ
ｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエル
クウム（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピチア・ピエペリ（Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊ
ｐｅｒｉ）、ピチア・スティプティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピチア・メタ
ノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．
）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
）、サッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ハンゼヌラ・ポリモ
ルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クライベロミセス属種（Ｋｌｕ
ｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、クライベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙ
ｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ
）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、ア
スペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリ
ゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏ
ｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ルクノウェンセ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏ
ｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）、
フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベ
ネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フィスコミトレラ・パテンス（Ｐ
ｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕ
ｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）が含まれる。
母」および「真菌」には、限定的なものではないが、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ
ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃ
ａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・
コクラメ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラネファシエンス（Ｐｉ
ｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・ミヌタ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｉ
ｎｕｔａ）［オガタエア・ミヌタ（Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ）、ピチア・リンドネ
リ（Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄｎｅｒｉ）］、ピチア・オプンチエ（Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕ
ｎｔｉａｅ）、ピチア・テルモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎ
ｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエル
クウム（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピチア・ピエペリ（Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊ
ｐｅｒｉ）、ピチア・スティプティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピチア・メタ
ノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．
）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
）、サッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ハンゼヌラ・ポリモ
ルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クライベロミセス属種（Ｋｌｕ
ｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、クライベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙ
ｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ
）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、ア
スペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリ
ゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏ
ｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ルクノウェンセ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏ
ｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）、
フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベ
ネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フィスコミトレラ・パテンス（Ｐ
ｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕ
ｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）が含まれる。
本明細書中で用いる「ペプチド」なる語は、短いポリペプチド、例えば、典型的には約
５０アミノ酸長未満、より典型的には約３０アミノ酸長未満のポリペプチドを意味する。
本明細書中で用いる該用語は、ポリペプチドおよびタンパク質の構造的機能、ひいては生
物学的機能を模倣した誘導体、突然変異体、類似体および模倣体を含む。
５０アミノ酸長未満、より典型的には約３０アミノ酸長未満のポリペプチドを意味する。
本明細書中で用いる該用語は、ポリペプチドおよびタンパク質の構造的機能、ひいては生
物学的機能を模倣した誘導体、突然変異体、類似体および模倣体を含む。
「ポリペプチド」なる語は、天然で生じるタンパク質および非天然で生じるタンパク質
の両方ならびにそれらの断片、突然変異体、誘導体および類似体を含む。ポリペプチドは
単量体または重合体でありうる。さらに、ポリペプチドは、１以上の異なる活性をそれぞ
れが有する多数の異なるドメインを含みうる。
の両方ならびにそれらの断片、突然変異体、誘導体および類似体を含む。ポリペプチドは
単量体または重合体でありうる。さらに、ポリペプチドは、１以上の異なる活性をそれぞ
れが有する多数の異なるドメインを含みうる。
「融合タンパク質」なる語は、異種アミノ酸配列に結合したポリペプチドまたは断片を
含むポリペプチドを意味する。融合タンパク質は、２以上の異なるタンパク質からの２以
上の所望の機能要素を含有するよう構築されうるため、有用である。融合タンパク質は、
関心のあるポリペプチドからの少なくとも１０個の連続的アミノ酸、より好ましくは少な
くとも２０または３０アミノ酸、より一層好ましくは少なくとも４０、５０または６０ア
ミノ酸、さらに好ましくは少なくとも７５、１００または１２５アミノ酸を含む。本発明
のタンパク質の全体を含む融合体が特に有用である。本発明の融合タンパク質内に含まれ
る異種ポリペプチドは少なくとも６アミノ酸長、しばしば、少なくとも８アミノ酸長、有
用なものとしては、少なくとも１５、２０および２５アミノ酸長である。融合体は、より
大きなポリペプチド、または更にはタンパク質全体、例えば緑色蛍光タンパク質（「ＧＦ
Ｐ」）、特定の有用性を有する発色団含有タンパク質をも含む。融合タンパク質は、異な
るタンパク質またはペプチドをコードする核酸配列とインフレームでポリペプチドまたは
その断片をコードする核酸配列を構築し、ついで該融合タンパク質を発現させることによ
り、組換え的に製造されうる。あるいは、融合タンパク質は、ポリペプチドまたはその断
片を別のタンパク質に架橋することにより、化学的に製造されうる。
含むポリペプチドを意味する。融合タンパク質は、２以上の異なるタンパク質からの２以
上の所望の機能要素を含有するよう構築されうるため、有用である。融合タンパク質は、
関心のあるポリペプチドからの少なくとも１０個の連続的アミノ酸、より好ましくは少な
くとも２０または３０アミノ酸、より一層好ましくは少なくとも４０、５０または６０ア
ミノ酸、さらに好ましくは少なくとも７５、１００または１２５アミノ酸を含む。本発明
のタンパク質の全体を含む融合体が特に有用である。本発明の融合タンパク質内に含まれ
る異種ポリペプチドは少なくとも６アミノ酸長、しばしば、少なくとも８アミノ酸長、有
用なものとしては、少なくとも１５、２０および２５アミノ酸長である。融合体は、より
大きなポリペプチド、または更にはタンパク質全体、例えば緑色蛍光タンパク質（「ＧＦ
Ｐ」）、特定の有用性を有する発色団含有タンパク質をも含む。融合タンパク質は、異な
るタンパク質またはペプチドをコードする核酸配列とインフレームでポリペプチドまたは
その断片をコードする核酸配列を構築し、ついで該融合タンパク質を発現させることによ
り、組換え的に製造されうる。あるいは、融合タンパク質は、ポリペプチドまたはその断
片を別のタンパク質に架橋することにより、化学的に製造されうる。
「機能性核酸」なる語は、宿主細胞内に導入され又は宿主細胞内で発現されると、タン
パク質の発現を特異的に妨げる核酸分子を意味する。一般に、機能性核酸分子は、タンパ
ク質をコードする転写産物と直接的に相互作用することにより該タンパク質の発現を軽減
する能力を有する。リボザイム、アンチセンス核酸およびｓｉＲＮＡ分子、例えばｓｈＲ
ＮＡ分子、短いＲＮＡ（典型的には４００塩基長未満）およびマイクロ−ＲＮＡ（ｍｉＲ
ＮＡ）が典型的な機能性核酸に相当する。
パク質の発現を特異的に妨げる核酸分子を意味する。一般に、機能性核酸分子は、タンパ
ク質をコードする転写産物と直接的に相互作用することにより該タンパク質の発現を軽減
する能力を有する。リボザイム、アンチセンス核酸およびｓｉＲＮＡ分子、例えばｓｈＲ
ＮＡ分子、短いＲＮＡ（典型的には４００塩基長未満）およびマイクロ−ＲＮＡ（ｍｉＲ
ＮＡ）が典型的な機能性核酸に相当する。
特に示さない限り、本明細書中で用いる全ての科学技術用語は、本発明に関連する分野
の当業者により一般に理解されているのと同じ意義を有する。典型的な方法および物質（
材料）を以下に説明するが、本明細書に記載されているものと類似または同等の方法およ
び物質も本発明の実施において使用可能であり、当業者に明らかであろう。本明細書に記
載されている全ての刊行物および他の参考文献の全体を参照により本明細書に組み入れる
こととする。矛盾する場合には、定義を含めて本明細書が優先される。該材料、方法およ
び実施例（具体例）は例示に過ぎず、限定的なものではない。
の当業者により一般に理解されているのと同じ意義を有する。典型的な方法および物質（
材料）を以下に説明するが、本明細書に記載されているものと類似または同等の方法およ
び物質も本発明の実施において使用可能であり、当業者に明らかであろう。本明細書に記
載されている全ての刊行物および他の参考文献の全体を参照により本明細書に組み入れる
こととする。矛盾する場合には、定義を含めて本明細書が優先される。該材料、方法およ
び実施例（具体例）は例示に過ぎず、限定的なものではない。
発明の詳細な説明
本発明は、組換えペプチド、タンパク質または機能性核酸を発現させるための発現系と
しての下等真核細胞、例えば酵母または糸状菌の使用のための方法および物質を提供する
。１つの態様においては、該方法は、下等真核細胞の、より遅く成長するａｄｅ２栄養要
求性株を入手または構築し、プロモーターに連結されたＡＤＥ２マーカー遺伝子またはオ
ープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする核酸および関心のある組換えタンパ
ク質または機能性核酸を発現する核酸を含みａｄｅ２栄養要求性株のゲノム内に組込まれ
うる組込みベクターを該細胞内に導入することを含む、組換えタンパク質を発現させるた
めの方法を提供し、ここで、該組込みベクターは該ａｄｅ２栄養要求性株のゲノム内に組
込まれ、該ＡＤＥ２は該栄養要求性株をアデニンに関して原栄養性にし、該組換えペプチ
ド、タンパク質または機能性核酸が発現される。該組換え宿主細胞は、代謝産物アデニン
を欠く培地において選択されるが、代謝産物アデニンを欠く培地において、または代謝産
物アデニンを含む培地において維持されうる。一般に、ＡＤＥ２マーカーを喪失しうる組
換え宿主細胞（復帰変異体）は、より遅く成長し、該組換え細胞が成長するにつれて経時
的に喪失するであろう。経時的な復帰変異体の喪失は、該組換え宿主細胞が、代謝産物ア
デニンを含む培地において成長するか又は代謝産物アデニンを欠く培地において成長する
かに無関係に生じるであろう。
本発明は、組換えペプチド、タンパク質または機能性核酸を発現させるための発現系と
しての下等真核細胞、例えば酵母または糸状菌の使用のための方法および物質を提供する
。１つの態様においては、該方法は、下等真核細胞の、より遅く成長するａｄｅ２栄養要
求性株を入手または構築し、プロモーターに連結されたＡＤＥ２マーカー遺伝子またはオ
ープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする核酸および関心のある組換えタンパ
ク質または機能性核酸を発現する核酸を含みａｄｅ２栄養要求性株のゲノム内に組込まれ
うる組込みベクターを該細胞内に導入することを含む、組換えタンパク質を発現させるた
めの方法を提供し、ここで、該組込みベクターは該ａｄｅ２栄養要求性株のゲノム内に組
込まれ、該ＡＤＥ２は該栄養要求性株をアデニンに関して原栄養性にし、該組換えペプチ
ド、タンパク質または機能性核酸が発現される。該組換え宿主細胞は、代謝産物アデニン
を欠く培地において選択されるが、代謝産物アデニンを欠く培地において、または代謝産
物アデニンを含む培地において維持されうる。一般に、ＡＤＥ２マーカーを喪失しうる組
換え宿主細胞（復帰変異体）は、より遅く成長し、該組換え細胞が成長するにつれて経時
的に喪失するであろう。経時的な復帰変異体の喪失は、該組換え宿主細胞が、代謝産物ア
デニンを含む培地において成長するか又は代謝産物アデニンを欠く培地において成長する
かに無関係に生じるであろう。
前記発明の開発において、出願人は、特定のマーカー遺伝子に関して栄養要求性である
下等真核宿主細胞内に組換えタンパク質を導入するための組込みベクターが、相補性マー
カー遺伝子またはＯＲＦをコードする核酸を該組込みベクター内に含むが、該マーカー遺
伝子またはＯＲＦが、天然プロモーターより低いレベルへとプロモーターの天然活性を軽
減する弱い、減衰化、潜在性（クリプティック）もしくはトランケート化プロモーターに
機能的に連結されている又はプロモーターが存在しない場合、該組込みベクターの２以上
のコピーが該宿主細胞のゲノム内に組込まれるならば、該宿主細胞の栄養要求性が相補さ
れうることを見出した。該組換え宿主細胞は該組込みベクターの２以上のコピーを含有し
、該組込みベクターの各コピーは転写的に活性であるため、該組換え宿主細胞は、該宿主
細胞を該栄養要求性マーカーに関して原栄養性にするのに十分な量の該マーカー遺伝子ま
たはＯＲＦを産生することが可能であり、したがって、該栄養要求性を相補しうる代謝産
物を欠く培地において成長することが可能である。該相補性マーカー遺伝子またはＯＲＦ
に連結されたプロモーターが弱ければ弱いほど、該宿主細胞のゲノム内に組込まれた組込
みベクターの、より多数のコピーが、該宿主細胞を該栄養要求性マーカーに関して原栄養
性にするのに必要とされる。該栄養要求性を相補しうる代謝産物を欠く培地における細胞
の成長または継代中に、宿主ゲノム内に組込まれた組込みベクターのコピーを喪失する宿
主細胞は、該マーカー遺伝子に関して再び栄養要求性となる。これらの新たに栄養要求性
となった宿主細胞は該培地において淘汰的に不利であり、一般に、残りの原栄養性宿主細
胞が成長し増殖し続けるにつれて、喪失する。重要なことに、該組込みベクターは、関心
のある１以上の組換えタンパク質または機能性核酸を発現する発現カセットを含有するた
め、該組込みベクターの１以上のコピーを含有する宿主細胞は、該組込みベクターを１コ
ピーしか含有しない宿主細胞において産生されるものより多量の該組換えタンパク質を産
生するであろう。
下等真核宿主細胞内に組換えタンパク質を導入するための組込みベクターが、相補性マー
カー遺伝子またはＯＲＦをコードする核酸を該組込みベクター内に含むが、該マーカー遺
伝子またはＯＲＦが、天然プロモーターより低いレベルへとプロモーターの天然活性を軽
減する弱い、減衰化、潜在性（クリプティック）もしくはトランケート化プロモーターに
機能的に連結されている又はプロモーターが存在しない場合、該組込みベクターの２以上
のコピーが該宿主細胞のゲノム内に組込まれるならば、該宿主細胞の栄養要求性が相補さ
れうることを見出した。該組換え宿主細胞は該組込みベクターの２以上のコピーを含有し
、該組込みベクターの各コピーは転写的に活性であるため、該組換え宿主細胞は、該宿主
細胞を該栄養要求性マーカーに関して原栄養性にするのに十分な量の該マーカー遺伝子ま
たはＯＲＦを産生することが可能であり、したがって、該栄養要求性を相補しうる代謝産
物を欠く培地において成長することが可能である。該相補性マーカー遺伝子またはＯＲＦ
に連結されたプロモーターが弱ければ弱いほど、該宿主細胞のゲノム内に組込まれた組込
みベクターの、より多数のコピーが、該宿主細胞を該栄養要求性マーカーに関して原栄養
性にするのに必要とされる。該栄養要求性を相補しうる代謝産物を欠く培地における細胞
の成長または継代中に、宿主ゲノム内に組込まれた組込みベクターのコピーを喪失する宿
主細胞は、該マーカー遺伝子に関して再び栄養要求性となる。これらの新たに栄養要求性
となった宿主細胞は該培地において淘汰的に不利であり、一般に、残りの原栄養性宿主細
胞が成長し増殖し続けるにつれて、喪失する。重要なことに、該組込みベクターは、関心
のある１以上の組換えタンパク質または機能性核酸を発現する発現カセットを含有するた
め、該組込みベクターの１以上のコピーを含有する宿主細胞は、該組込みベクターを１コ
ピーしか含有しない宿主細胞において産生されるものより多量の該組換えタンパク質を産
生するであろう。
したがって、多量の組換えタンパク質（ペプチドを含む）または機能性核酸を産生しう
る組換え宿主細胞を産生させるのに特に有用である方法、物質および系を提供する。した
がって、本発明が提供する方法においては、下等真核細胞の栄養要求性株を入手または構
築し、弱い、潜在性、減衰化もしくはトランケート化プロモーターに機能的に連結された
又はプロモーターを伴わない該栄養要求性を相補するマーカー遺伝子またはＯＲＦおよび
組換えタンパク質をコードする核酸を含み、該栄養要求性株のゲノム内に組込まれうる組
込みベクターを準備する。該宿主細胞の栄養要求性を相補するよう幾つかの該組込みベク
ターが該ゲノム内に組込まれている宿主細胞を、該栄養要求性を相補する代謝産物を欠く
培地において選択し、該栄養要求性を相補する代謝産物を欠く又は該栄養要求性を相補す
る代謝産物を含む培地において該宿主細胞を増殖させることにより、該宿主細胞を維持す
る。一般に、該栄養要求性マーカーを喪失しうる組換え宿主細胞（復帰変異体）は、より
遅く成長し、該組換え細胞が成長するにつれて経時的に喪失するであろう。経時的な復帰
変異体の喪失は、該組換え宿主細胞が、代謝産物アデニンを含む培地において成長するか
又は代謝産物アデニンを欠く培地において成長するかに無関係に生じるであろう。この現
象は、少なくとも、栄養要求性マーカーＡＤＥ、ＵＲＡまたはＬＹＳに関して観察されて
おり、少なくとも部分的には、該培地から該組換え宿主細胞内への該代謝産物の輸送不良
によるものであると現在考えられている。
る組換え宿主細胞を産生させるのに特に有用である方法、物質および系を提供する。した
がって、本発明が提供する方法においては、下等真核細胞の栄養要求性株を入手または構
築し、弱い、潜在性、減衰化もしくはトランケート化プロモーターに機能的に連結された
又はプロモーターを伴わない該栄養要求性を相補するマーカー遺伝子またはＯＲＦおよび
組換えタンパク質をコードする核酸を含み、該栄養要求性株のゲノム内に組込まれうる組
込みベクターを準備する。該宿主細胞の栄養要求性を相補するよう幾つかの該組込みベク
ターが該ゲノム内に組込まれている宿主細胞を、該栄養要求性を相補する代謝産物を欠く
培地において選択し、該栄養要求性を相補する代謝産物を欠く又は該栄養要求性を相補す
る代謝産物を含む培地において該宿主細胞を増殖させることにより、該宿主細胞を維持す
る。一般に、該栄養要求性マーカーを喪失しうる組換え宿主細胞（復帰変異体）は、より
遅く成長し、該組換え細胞が成長するにつれて経時的に喪失するであろう。経時的な復帰
変異体の喪失は、該組換え宿主細胞が、代謝産物アデニンを含む培地において成長するか
又は代謝産物アデニンを欠く培地において成長するかに無関係に生じるであろう。この現
象は、少なくとも、栄養要求性マーカーＡＤＥ、ＵＲＡまたはＬＹＳに関して観察されて
おり、少なくとも部分的には、該培地から該組換え宿主細胞内への該代謝産物の輸送不良
によるものであると現在考えられている。
一般的態様においては、組換え宿主細胞を特定の有機化合物に関して栄養要求性にする
が、これは、該有機化合物を産生させるのに必要な遺伝子産物または該有機化合物もしく
は代謝産物を産生させるための中間体を産生させるのに必要な遺伝子産物をコードする遺
伝子または遺伝子座を除去し又は欠失させることにより行う。ついで該栄養要求性宿主細
胞を組込みベクター［該組込みベクターは、（１）該栄養要求性を相補する選択マーカー
遺伝子または他の核酸をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む核酸
、（２）関心のある機能性核酸を発現する又は異種もしくは組換えタンパク質もしくはペ
プチドをコードする１以上のＯＲＦをコードする核酸、ならびに（３）相同組換えによる
該宿主細胞のゲノムの特定の標的位置または遺伝子座への該組込みベクターの挿入を導く
標的化配列を含む核酸を含む］で形質転換する。
が、これは、該有機化合物を産生させるのに必要な遺伝子産物または該有機化合物もしく
は代謝産物を産生させるための中間体を産生させるのに必要な遺伝子産物をコードする遺
伝子または遺伝子座を除去し又は欠失させることにより行う。ついで該栄養要求性宿主細
胞を組込みベクター［該組込みベクターは、（１）該栄養要求性を相補する選択マーカー
遺伝子または他の核酸をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む核酸
、（２）関心のある機能性核酸を発現する又は異種もしくは組換えタンパク質もしくはペ
プチドをコードする１以上のＯＲＦをコードする核酸、ならびに（３）相同組換えによる
該宿主細胞のゲノムの特定の標的位置または遺伝子座への該組込みベクターの挿入を導く
標的化配列を含む核酸を含む］で形質転換する。
該プラスミド内の標的化配列は、該宿主細胞ゲノム内の任意の配列、例えば、宿主細胞
遺伝子、宿主細胞プロモーターもしくはターミネーター配列または未知機能の配列を含み
うる。宿主細胞内へのプロモーターまたはターミネーター配列内の組込みの場合、異種も
しくは組換えタンパク質もしくはペプチドをコードする又は関心のある機能性核酸を発現
する１以上のＯＲＦの発現を調節するために使用される該発現カセット内のプロモーター
および／またはターミネーター配列は、該組込みベクターを標的位置へ標的化するための
標的化配列としても機能しうる。例えば、前記（１）または（２）の核酸は、該組込みベ
クターが標的化されるプロモーターに隣接した宿主細胞遺伝子の場合、宿主細胞プロモー
ターに機能的に連結されうる。ロール・イン（ｒｏｌｌ−ｉｎ）単一交差相同組換えによ
る該プロモーター内への該ベクターの組込みは該プロモーター配列の重複を引き起こす。
したがって、組込み後、該発現カセットは、該標的化配列を含むプロモーターに、尚も、
機能的に連結しており、該標的化配列であった該プロモーターに隣接する宿主細胞遺伝子
は尚も機能的である。したがって、該組換え宿主細胞においては、異種タンパク質、ペプ
チドまたは機能性核酸の発現は、該標的化部位に隣接する宿主細胞遺伝子の発現を損なう
ことなく生じる。
遺伝子、宿主細胞プロモーターもしくはターミネーター配列または未知機能の配列を含み
うる。宿主細胞内へのプロモーターまたはターミネーター配列内の組込みの場合、異種も
しくは組換えタンパク質もしくはペプチドをコードする又は関心のある機能性核酸を発現
する１以上のＯＲＦの発現を調節するために使用される該発現カセット内のプロモーター
および／またはターミネーター配列は、該組込みベクターを標的位置へ標的化するための
標的化配列としても機能しうる。例えば、前記（１）または（２）の核酸は、該組込みベ
クターが標的化されるプロモーターに隣接した宿主細胞遺伝子の場合、宿主細胞プロモー
ターに機能的に連結されうる。ロール・イン（ｒｏｌｌ−ｉｎ）単一交差相同組換えによ
る該プロモーター内への該ベクターの組込みは該プロモーター配列の重複を引き起こす。
したがって、組込み後、該発現カセットは、該標的化配列を含むプロモーターに、尚も、
機能的に連結しており、該標的化配列であった該プロモーターに隣接する宿主細胞遺伝子
は尚も機能的である。したがって、該組換え宿主細胞においては、異種タンパク質、ペプ
チドまたは機能性核酸の発現は、該標的化部位に隣接する宿主細胞遺伝子の発現を損なう
ことなく生じる。
該組込みベクターを宿主細胞のゲノム内にロール・イン単一交差相同組換えにより組込
むために、標的化配列が直鎖状核酸分子の末端に存在する該直鎖状核酸分子が得られるよ
う、該標的化配列内の部位において該組込みベクターを切断することにより、該ベクター
を線状化する。単一交差事象はゲノム遺伝子座の重複を招き、直列反復を生成する。これ
らの直列反復は高い組換え率を示し、該組換え宿主細胞の増殖中に該マーカーおよび発現
カセットの喪失をもたらしうるが、弱い、潜在性、減衰化もしくはトランケート化プロモ
ーターに該マーカーが機能的に連結されている又はプロモーターが存在しない本明細書に
開示されている方法は、増殖中に該宿主細胞を該マーカーに関して原栄養性にするのに十
分なコピー数の組込みベクターを維持する宿主細胞のみを確保する。好ましい態様におい
ては、該標的化配列内に１個だけ存在する制限酵素部位において該組込みベクターを線状
化する。ついで該ベクターはロール・イン単一交差相同組換えにより該標的部位内に組込
まれる。ロール・イン単一交差相同組換えは、該標的部位における該遺伝子の発現を損な
うことなく該ゲノム内への該組込みベクターの組込みを可能にする。ロール・イン単一交
差相同組換えはＮｅｔｔら，Ｙｅａｓｔ ２２：２９５−３０４（２００５）に記載され
ている。
むために、標的化配列が直鎖状核酸分子の末端に存在する該直鎖状核酸分子が得られるよ
う、該標的化配列内の部位において該組込みベクターを切断することにより、該ベクター
を線状化する。単一交差事象はゲノム遺伝子座の重複を招き、直列反復を生成する。これ
らの直列反復は高い組換え率を示し、該組換え宿主細胞の増殖中に該マーカーおよび発現
カセットの喪失をもたらしうるが、弱い、潜在性、減衰化もしくはトランケート化プロモ
ーターに該マーカーが機能的に連結されている又はプロモーターが存在しない本明細書に
開示されている方法は、増殖中に該宿主細胞を該マーカーに関して原栄養性にするのに十
分なコピー数の組込みベクターを維持する宿主細胞のみを確保する。好ましい態様におい
ては、該標的化配列内に１個だけ存在する制限酵素部位において該組込みベクターを線状
化する。ついで該ベクターはロール・イン単一交差相同組換えにより該標的部位内に組込
まれる。ロール・イン単一交差相同組換えは、該標的部位における該遺伝子の発現を損な
うことなく該ゲノム内への該組込みベクターの組込みを可能にする。ロール・イン単一交
差相同組換えはＮｅｔｔら，Ｙｅａｓｔ ２２：２９５−３０４（２００５）に記載され
ている。
該組込みベクターの重要な特徴は、該選択マーカー遺伝子または他の核酸をコードする
ＯＲＦが、その内因性完全効力プロモーターにも異種完全効力プロモーターにも機能的に
連結されておらず、弱いプロモーター、減衰化内因性もしくは異種プロモーター、潜在性
プロモーターまたはトランケート化内因性もしくは異種プロモーター（この場合、該トラ
ンケート化は該プロモーターを該天然プロモーターより低い転写活性を有するようにする
）に機能的に連結されていることである。特定の実施形態においては、該減衰化またはト
ランケート化プロモーターは、該完全効力プロモーターの活性の５０％以下である転写活
性を有する。他の実施形態においては、該減衰化またはトランケート化プロモーターは、
該完全効力プロモーターの活性の１０％以下である転写活性を有する。他の実施形態にお
いては、該減衰化またはトランケート化プロモーターは、該完全効力プロモーターの活性
の１％以下である転写活性を有する。いずれの理論にも束縛されるものではないが、一般
に、該選択マーカー遺伝子をコードするＯＲＦに隣接する核酸配列は、該選択マーカー遺
伝子の低レベルの発現を可能にするいわゆる潜在性（クリプティック）プロモーターを含
有すると考えられている。潜在性プロモーターは、少量の該選択マーカーを産生するのに
十分な、該ＯＲＦに隣接する十分な量の偽転写開始を可能にするであろう。該選択マーカ
ー遺伝子の発現は、該栄養要求性を完全に相補するのに必要なレベルより低いため、該栄
養要求性の完全相補のためには該宿主細胞内の標的配列内への該組込みベクターの多重組
込みが必要である。該栄養要求性を相補するためには複数のコピーの該組込みベクターが
該宿主細胞のゲノム内に組込まれなければならないため、関心のあるタンパク質またはペ
プチドまたは機能性核酸をコードする複数のコピーのＯＲＦが存在し、それらは全て発現
される。したがって、該宿主細胞は、そのゲノム内に組込まれた組込みベクターを１コピ
ーしか含まない宿主細胞の場合より多数の、関心のあるタンパク質またはペプチドまたは
機能性核酸をコードしうる。
ＯＲＦが、その内因性完全効力プロモーターにも異種完全効力プロモーターにも機能的に
連結されておらず、弱いプロモーター、減衰化内因性もしくは異種プロモーター、潜在性
プロモーターまたはトランケート化内因性もしくは異種プロモーター（この場合、該トラ
ンケート化は該プロモーターを該天然プロモーターより低い転写活性を有するようにする
）に機能的に連結されていることである。特定の実施形態においては、該減衰化またはト
ランケート化プロモーターは、該完全効力プロモーターの活性の５０％以下である転写活
性を有する。他の実施形態においては、該減衰化またはトランケート化プロモーターは、
該完全効力プロモーターの活性の１０％以下である転写活性を有する。他の実施形態にお
いては、該減衰化またはトランケート化プロモーターは、該完全効力プロモーターの活性
の１％以下である転写活性を有する。いずれの理論にも束縛されるものではないが、一般
に、該選択マーカー遺伝子をコードするＯＲＦに隣接する核酸配列は、該選択マーカー遺
伝子の低レベルの発現を可能にするいわゆる潜在性（クリプティック）プロモーターを含
有すると考えられている。潜在性プロモーターは、少量の該選択マーカーを産生するのに
十分な、該ＯＲＦに隣接する十分な量の偽転写開始を可能にするであろう。該選択マーカ
ー遺伝子の発現は、該栄養要求性を完全に相補するのに必要なレベルより低いため、該栄
養要求性の完全相補のためには該宿主細胞内の標的配列内への該組込みベクターの多重組
込みが必要である。該栄養要求性を相補するためには複数のコピーの該組込みベクターが
該宿主細胞のゲノム内に組込まれなければならないため、関心のあるタンパク質またはペ
プチドまたは機能性核酸をコードする複数のコピーのＯＲＦが存在し、それらは全て発現
される。したがって、該宿主細胞は、そのゲノム内に組込まれた組込みベクターを１コピ
ーしか含まない宿主細胞の場合より多数の、関心のあるタンパク質またはペプチドまたは
機能性核酸をコードしうる。
該方法を実施する際には、組込みに関して該標的配列と競合しうる選択マーカー遺伝子
配列が該栄養要求性宿主細胞内に全く存在しないことが好ましい。したがって、他の実施
形態においては、（上流および下流領域を含む）該マーカーをコードする遺伝子全体が該
ゲノムから欠失または除去されており、あるいは少なくとも、該マーカー遺伝子をコード
するオープンリーディングフレームが該ゲノムから欠失または除去されている。該組込み
ベクターが標的遺伝子座内に組込まれている安定組換え宿主細胞は、特定の有機化合物（
代謝産物）を欠く培地において該形質転換宿主細胞を培養することにより選択される。該
選択マーカー遺伝子またはＯＲＦは内因性または異種完全効力プロモーターに機能的に連
結されていないが、弱い、減衰化、潜在性プロモーターまたはトランケート化プロモータ
ーに機能的に連結されているため（あるいは特定の態様においては、プロモーターが存在
しないため）、該標的遺伝子座内に挿入された組込みベクターを１コピーのみ含有する組
換え形質転換宿主細胞は該有機化合物または代謝産物に関して原栄養性にならない。該形
質転換宿主細胞を該有機化合物または代謝産物に関して原栄養性にするためには、複数の
コピーの該組込みベクターが該宿主細胞の標的遺伝子座内に組込まれる必要がある。また
、複数のコピーの該組込みベクターが該標的遺伝子座内に組込まれる必要があるため、関
心のある遺伝子または配列によりコードされるタンパク質またはペプチドも、相当な量で
産生される。
配列が該栄養要求性宿主細胞内に全く存在しないことが好ましい。したがって、他の実施
形態においては、（上流および下流領域を含む）該マーカーをコードする遺伝子全体が該
ゲノムから欠失または除去されており、あるいは少なくとも、該マーカー遺伝子をコード
するオープンリーディングフレームが該ゲノムから欠失または除去されている。該組込み
ベクターが標的遺伝子座内に組込まれている安定組換え宿主細胞は、特定の有機化合物（
代謝産物）を欠く培地において該形質転換宿主細胞を培養することにより選択される。該
選択マーカー遺伝子またはＯＲＦは内因性または異種完全効力プロモーターに機能的に連
結されていないが、弱い、減衰化、潜在性プロモーターまたはトランケート化プロモータ
ーに機能的に連結されているため（あるいは特定の態様においては、プロモーターが存在
しないため）、該標的遺伝子座内に挿入された組込みベクターを１コピーのみ含有する組
換え形質転換宿主細胞は該有機化合物または代謝産物に関して原栄養性にならない。該形
質転換宿主細胞を該有機化合物または代謝産物に関して原栄養性にするためには、複数の
コピーの該組込みベクターが該宿主細胞の標的遺伝子座内に組込まれる必要がある。また
、複数のコピーの該組込みベクターが該標的遺伝子座内に組込まれる必要があるため、関
心のある遺伝子または配列によりコードされるタンパク質またはペプチドも、相当な量で
産生される。
タンパク質の発現のためには、下等真核生物、例えば酵母が好ましい。なぜなら、それ
らは高収率で経済的に培養可能であり、適当に修飾されると、適当なグリコシル化をもた
らしうるからである。酵母は特に、迅速な形質転換、試験タンパク質局在化法および簡便
な遺伝子ノックアウト技術を可能にする確立された遺伝的現象をもたらす。適当なベクタ
ーは、所望により、発現制御配列、例えばプロモーター、例えば３−ホスホグリセリン酸
キナーゼまたは他の解糖酵素、および複製起点、終結配列などを有する。
らは高収率で経済的に培養可能であり、適当に修飾されると、適当なグリコシル化をもた
らしうるからである。酵母は特に、迅速な形質転換、試験タンパク質局在化法および簡便
な遺伝子ノックアウト技術を可能にする確立された遺伝的現象をもたらす。適当なベクタ
ーは、所望により、発現制御配列、例えばプロモーター、例えば３−ホスホグリセリン酸
キナーゼまたは他の解糖酵素、および複製起点、終結配列などを有する。
細胞培養には、種々の酵母、例えばクライベロミセス・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）
、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉ
ｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）およびハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕ
ｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）が一般に好ましい。なぜなら、それらは高い細胞密度まで
増殖可能であり、多量の組換えタンパク質を分泌可能だからである。同様に、本発明の糖
タンパク質を工業的規模で製造するために、糸状菌、例えばアスペルギルス・ニガー（Ａ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）、
ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）などが使用されうる
。本発明における宿主細胞として有用な他の細胞には、原核細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃ
ｏｌｉ）、ならびに真核宿主細胞（培養内）、例えば下等真核細胞、植物細胞および哺乳
類細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）が含まれる。
、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉ
ｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）およびハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕ
ｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）が一般に好ましい。なぜなら、それらは高い細胞密度まで
増殖可能であり、多量の組換えタンパク質を分泌可能だからである。同様に、本発明の糖
タンパク質を工業的規模で製造するために、糸状菌、例えばアスペルギルス・ニガー（Ａ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）、
ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）などが使用されうる
。本発明における宿主細胞として有用な他の細胞には、原核細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃ
ｏｌｉ）、ならびに真核宿主細胞（培養内）、例えば下等真核細胞、植物細胞および哺乳
類細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）が含まれる。
下等真核生物、特に酵母は、グリコシル化パターンがヒト様であるか又はヒト化されて
いる糖タンパク質をそれが発現するよう、遺伝的に修飾されうる。それは、選択された内
因性グリコシル化酵素を排除すること及び／又は外因性酵素を供給すること［Ｇｅｒｎｇ
ｒｏｓｓら，ＵＳ ２００４／００１８５９０（その開示を参照により本明細書に組み入
れることとする）に記載されている］により達成されうる。例えば、宿主細胞は、糖タン
パク質上のＮ−グリカン上にマンノース残基を付加する１，６−マンノシルトランスフェ
ラーゼ活性を除去するよう、選択または操作されうる。
いる糖タンパク質をそれが発現するよう、遺伝的に修飾されうる。それは、選択された内
因性グリコシル化酵素を排除すること及び／又は外因性酵素を供給すること［Ｇｅｒｎｇ
ｒｏｓｓら，ＵＳ ２００４／００１８５９０（その開示を参照により本明細書に組み入
れることとする）に記載されている］により達成されうる。例えば、宿主細胞は、糖タン
パク質上のＮ−グリカン上にマンノース残基を付加する１，６−マンノシルトランスフェ
ラーゼ活性を除去するよう、選択または操作されうる。
米国公開出願第２００７００７２２６２号は、ＡＲＧ１、ＡＲＧ２、ＡＲＧ３、ＨＩＳ
１、ＨＩＳ２、ＨＩＳ５およびＨＩＳ６遺伝子、ならびに酵母内への安定な遺伝的組込み
のための、該遺伝子の使用方法を開示しており、米国公開出願第２００４０２２９３０６
号は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子、および
酵母における安定な遺伝的組込みのための、その使用を開示している。本明細書に記載さ
れている方法および系を実施するのに特に有用な選択マーカー遺伝子には、ＵＲＡ３、Ｕ
ＲＡ５、ＨＩＳ３、ＬＥＵ３、ＴＲＰ１、ＬＹＳ２、ＡＤＥ１およびＡＤＥ２遺伝子座が
含まれるが、これらに限定されるものではない。有用な栄養要求性宿主細胞および選択マ
ーカー遺伝子は、特定の栄養要求性が、該細胞を、対応する原栄養体と競合する能力を低
下させる又は対応する原栄養体より遅く成長するようにするものである。例えば、特に有
用な選択マーカー遺伝子は選択マーカー遺伝子ＡＤＥ１、ＡＤＥ２、ＬＹＳ２、ＵＲＡ３
およびＵＲＡ５である。
１、ＨＩＳ２、ＨＩＳ５およびＨＩＳ６遺伝子、ならびに酵母内への安定な遺伝的組込み
のための、該遺伝子の使用方法を開示しており、米国公開出願第２００４０２２９３０６
号は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子、および
酵母における安定な遺伝的組込みのための、その使用を開示している。本明細書に記載さ
れている方法および系を実施するのに特に有用な選択マーカー遺伝子には、ＵＲＡ３、Ｕ
ＲＡ５、ＨＩＳ３、ＬＥＵ３、ＴＲＰ１、ＬＹＳ２、ＡＤＥ１およびＡＤＥ２遺伝子座が
含まれるが、これらに限定されるものではない。有用な栄養要求性宿主細胞および選択マ
ーカー遺伝子は、特定の栄養要求性が、該細胞を、対応する原栄養体と競合する能力を低
下させる又は対応する原栄養体より遅く成長するようにするものである。例えば、特に有
用な選択マーカー遺伝子は選択マーカー遺伝子ＡＤＥ１、ＡＤＥ２、ＬＹＳ２、ＵＲＡ３
およびＵＲＡ５である。
ＡＤＥ１遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｍｙａｓｎｉｋｏｖら，Ｇｅｎｅ，１０９：１４３−１４７（１９
９１））、クライベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）
（Ｚｏｎｎｅｖｅｌｄおよびｖａｎ ｄｅｒ Ｚａｎｄｅｎら，Ｙｅａｓｔ，１１：８２
３−８２７（１９９５））、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）（
Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏら，Ｇｅｎｅ ２６３：１５９−１６９（２００１））を含む種々の
種の酵母および真菌からクローニングされている。ＡＤＥ１遺伝子は、ドゥ・ノボ（ｄｅ
ｎｏｖｏ）プリンヌクレオチド生合成に必要なＮ−スクシニル−５−アミノイミダゾー
ル−４−カルボキサミド リボチド（ＳＡＩＣＡＲ）シンターゼをコードしている。アデ
ニンを欠く突然変異細胞においては赤色色素が蓄積する。
ｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｍｙａｓｎｉｋｏｖら，Ｇｅｎｅ，１０９：１４３−１４７（１９
９１））、クライベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）
（Ｚｏｎｎｅｖｅｌｄおよびｖａｎ ｄｅｒ Ｚａｎｄｅｎら，Ｙｅａｓｔ，１１：８２
３−８２７（１９９５））、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）（
Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏら，Ｇｅｎｅ ２６３：１５９−１６９（２００１））を含む種々の
種の酵母および真菌からクローニングされている。ＡＤＥ１遺伝子は、ドゥ・ノボ（ｄｅ
ｎｏｖｏ）プリンヌクレオチド生合成に必要なＮ−スクシニル−５−アミノイミダゾー
ル−４−カルボキサミド リボチド（ＳＡＩＣＡＲ）シンターゼをコードしている。アデ
ニンを欠く突然変異細胞においては赤色色素が蓄積する。
ＡＤＥ２遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＪｏｎｅｓおよびＦｉｎｋ，“Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍ
ｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ
ｙｅａｓｔ”ｐｐ．１８１−２９９ ｉｎ Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ
ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｓｔｒａｔｈｅｒｎら（編）Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ
）（Ｋｕｒｔｚら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，６：１４２−１４９（１９８６））
、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）（Ｊｉｎら，Ｂｉ
ｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．６８：６５６−６２（２００４））
およびピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）（本明細書）を含む種々
の種の酵母および真菌からクローニングされている。ＡＤＥ２遺伝子は、ドゥ・ノボ（ｄ
ｅ ｎｏｖｏ）プリンヌクレオチド生合成経路内の一工程を触媒するホスホリボシル−ア
ミノイミダゾールカルボキシラーゼをコードしている。アデニンを欠く突然変異細胞にお
いては赤色色素が蓄積する。
ｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＪｏｎｅｓおよびＦｉｎｋ，“Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍ
ｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ
ｙｅａｓｔ”ｐｐ．１８１−２９９ ｉｎ Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ
ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｓｔｒａｔｈｅｒｎら（編）Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ
）（Ｋｕｒｔｚら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，６：１４２−１４９（１９８６））
、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）（Ｊｉｎら，Ｂｉ
ｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．６８：６５６−６２（２００４））
およびピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）（本明細書）を含む種々
の種の酵母および真菌からクローニングされている。ＡＤＥ２遺伝子は、ドゥ・ノボ（ｄ
ｅ ｎｏｖｏ）プリンヌクレオチド生合成経路内の一工程を触媒するホスホリボシル−ア
ミノイミダゾールカルボキシラーゼをコードしている。アデニンを欠く突然変異細胞にお
いては赤色色素が蓄積する。
他の実施形態においては、１以上の栄養要求性遺伝子を置換し又はその機能をノックア
ウトするベクターで細胞系が形質転換されうる［例えば、該細胞をアデニンに関して栄養
要求性にする、ＡＤＥ１またはＡＤＥ２遺伝子のノックアウトまたは置換（例えば、Ａｄ
ｅ１−またはＡｄｅ２−表現型を有する細胞）］。したがって、本発明は、細胞系を遺伝
的に操作して、該細胞の成長を妨げる栄養要求性突然変異を該細胞系が含有するようにす
るための方法を含む。この場合、栄養要求性突然変異を含有するこれらの細胞系は、本明
細書に教示されている選択のための宿主細胞として働くことが可能であり、ここで、所望
のタンパク質を発現する細胞が、容易に特定可能であり選択可能な表現型を与え該栄養要
求性突然変異を相補する遺伝子をも含有するよう、該宿主細胞は、該栄養要求性突然変異
を相補する遺伝子および１以上の所望の糖タンパク質をコードする組込みベクターで形質
転換されている。
ウトするベクターで細胞系が形質転換されうる［例えば、該細胞をアデニンに関して栄養
要求性にする、ＡＤＥ１またはＡＤＥ２遺伝子のノックアウトまたは置換（例えば、Ａｄ
ｅ１−またはＡｄｅ２−表現型を有する細胞）］。したがって、本発明は、細胞系を遺伝
的に操作して、該細胞の成長を妨げる栄養要求性突然変異を該細胞系が含有するようにす
るための方法を含む。この場合、栄養要求性突然変異を含有するこれらの細胞系は、本明
細書に教示されている選択のための宿主細胞として働くことが可能であり、ここで、所望
のタンパク質を発現する細胞が、容易に特定可能であり選択可能な表現型を与え該栄養要
求性突然変異を相補する遺伝子をも含有するよう、該宿主細胞は、該栄養要求性突然変異
を相補する遺伝子および１以上の所望の糖タンパク質をコードする組込みベクターで形質
転換されている。
ＡＤＥ１またはＡＤＥ２マーカーおよびａｄｅ１またはａｄｅ２栄養要求性宿主細胞を
使用する本明細書に開示されている方法は、組換えピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ
ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞を製造するのに特に有用である。なぜなら、それは、多コピ
ー選択に使用されうるピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）のための
適当なマーカーの不足に対処したものだからである。現在、主として、ゼオシンのような
優性マーカーがこの目的に使用されている。しかし、優性マーカーは顕著な欠点を有する
。例えば、発酵中、該異種遺伝子の全組込みコピーが組込まれたままであることを保証す
るために、該抗生物質を加えることはしばしば不可能である。しかし、本明細書に開示さ
れている構築物が除去されると、該細胞はアデニンを産生できなくなり、より遅い成長お
よび薄桃色の選択可能な表現型を示す。したがって、発酵中に除去される異種構築物は、
このより遅い成長に基づいて容易に選択される。
使用する本明細書に開示されている方法は、組換えピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ
ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞を製造するのに特に有用である。なぜなら、それは、多コピ
ー選択に使用されうるピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）のための
適当なマーカーの不足に対処したものだからである。現在、主として、ゼオシンのような
優性マーカーがこの目的に使用されている。しかし、優性マーカーは顕著な欠点を有する
。例えば、発酵中、該異種遺伝子の全組込みコピーが組込まれたままであることを保証す
るために、該抗生物質を加えることはしばしば不可能である。しかし、本明細書に開示さ
れている構築物が除去されると、該細胞はアデニンを産生できなくなり、より遅い成長お
よび薄桃色の選択可能な表現型を示す。したがって、発酵中に除去される異種構築物は、
このより遅い成長に基づいて容易に選択される。
開示されている系の利点は、該ゲノム内に組込まれた該宿主細胞内での発現のための所
望の遺伝子および多コピー（複数コピー）マーカーを含有する形質転換体を色により選択
することが可能であること、ならびにａｄｅ１またはａｄｅ２細胞の遅い成長により、該
ゲノム内に組込まれた１以上のコピーを含有する形質転換体が安定に保持されることであ
る。１つの態様においては、該系は、優性ゼオシン選択に基づく組換え宿主細胞を製造す
るための現在の系と比べて改良された系を得るために、該宿主細胞内での発現のための所
望の遺伝子およびプロモーターに機能的に連結されたＡＤＥ１またはＡＤＥ２オープンリ
ーディングフレーム（ＯＲＦ）のコピーを含むプラスミドの組込み、ならびにＡｄｅ１−
またはＡｄｅ２−表現型を有する株の遅い成長と共に、ａｄｅ／ＡＤＥ株の桃色／白色選
択の表現型の差を利用する。もう１つの態様においては、該系は、優性ゼオシン選択に基
づく組換え宿主細胞を製造するための現在の系と比べて改良された系を得るために、該宿
主細胞内での発現のための所望の遺伝子および弱い、減衰化または潜在性プロモーターに
機能的に連結されたＡＤＥ１またはＡＤＥ２ ＯＲＦのコピーを含むプラスミドの強制多
重組込み、ならびにＡｄｅ１−またはＡｄｅ２−表現型を有する株の遅い成長と共に、ａ
ｄｅ／ＡＤＥ株の桃色／白色選択の表現型の差を利用する。したがって、該方法および物
質は、異種タンパク質の、安定な高レベル発現に有用である。
望の遺伝子および多コピー（複数コピー）マーカーを含有する形質転換体を色により選択
することが可能であること、ならびにａｄｅ１またはａｄｅ２細胞の遅い成長により、該
ゲノム内に組込まれた１以上のコピーを含有する形質転換体が安定に保持されることであ
る。１つの態様においては、該系は、優性ゼオシン選択に基づく組換え宿主細胞を製造す
るための現在の系と比べて改良された系を得るために、該宿主細胞内での発現のための所
望の遺伝子およびプロモーターに機能的に連結されたＡＤＥ１またはＡＤＥ２オープンリ
ーディングフレーム（ＯＲＦ）のコピーを含むプラスミドの組込み、ならびにＡｄｅ１−
またはＡｄｅ２−表現型を有する株の遅い成長と共に、ａｄｅ／ＡＤＥ株の桃色／白色選
択の表現型の差を利用する。もう１つの態様においては、該系は、優性ゼオシン選択に基
づく組換え宿主細胞を製造するための現在の系と比べて改良された系を得るために、該宿
主細胞内での発現のための所望の遺伝子および弱い、減衰化または潜在性プロモーターに
機能的に連結されたＡＤＥ１またはＡＤＥ２ ＯＲＦのコピーを含むプラスミドの強制多
重組込み、ならびにＡｄｅ１−またはＡｄｅ２−表現型を有する株の遅い成長と共に、ａ
ｄｅ／ＡＤＥ株の桃色／白色選択の表現型の差を利用する。したがって、該方法および物
質は、異種タンパク質の、安定な高レベル発現に有用である。
したがって、特定の実施形態においては、該方法および系は、混合型または複合型Ｎ−
グリカンを有する糖タンパク質を産生しうる宿主細胞を使用する場合、糖タンパク質を含
む組換えタンパク質の製造に関する改善された生産性を伴う、組換え宿主細胞、非ヒト真
核宿主細胞、特に下等真核宿主細胞、例えば酵母および糸状菌宿主を含む。該組換え宿主
細胞は、栄養要求性マーカー遺伝子、例えばＡＤＥ１またはＡＤＥ２をコードする少なく
とも１つの内因性遺伝子の機能の軽減または排除により修飾される。アデニン欠損を招く
突然変異を有する細胞は非常に遅く成長し、赤みを帯びた色素を蓄積し、これは桃色のコ
ロニー（すなわち、Ａｄｅ１−またはＡｄｅ２−表現型を有する細胞）の産生をもたらす
。Ａｄｅ１−またはＡｄｅ２−表現型を有するこれらの細胞が、ＡＤＥ１またはＡＤＥ２
ＯＲＦの発現のためのプロモーターに機能的に連結されたそれぞれＡＤＥ１またはＡＤ
Ｅ２ ＯＲＦを含むプラスミドで形質転換された場合、Ａｄｅ１またはＡｄｅ２突然変異
は相補され、該細胞はアデニンに関して原栄養性となる。すなわち、該細胞はＡｄｅ１＋
またはＡｄｅ２＋表現型を有するようになる。これらの相補された組換え細胞は白色およ
び大きなコロニーサイズを示し、これは該組換え細胞の同定および選択を容易にする。あ
るいは、Ａｄｅ１−またはＡｄｅ２−表現型を有するこれらの細胞が、ＡＤＥ１またはＡ
ＤＥ２ ＯＲＦの発現のためのプロモーターに機能的に連結されていないそれぞれＡＤＥ
１またはＡＤＥ２ ＯＲＦを含むプラスミドで形質転換された場合には、Ａｄｅ１または
Ａｄｅ２突然変異は、該ゲノム内に組込まれたＡＤＥ１またはＡＤＥ２遺伝子を２コピー
以上含有する組換え細胞においてのみ相補される。
グリカンを有する糖タンパク質を産生しうる宿主細胞を使用する場合、糖タンパク質を含
む組換えタンパク質の製造に関する改善された生産性を伴う、組換え宿主細胞、非ヒト真
核宿主細胞、特に下等真核宿主細胞、例えば酵母および糸状菌宿主を含む。該組換え宿主
細胞は、栄養要求性マーカー遺伝子、例えばＡＤＥ１またはＡＤＥ２をコードする少なく
とも１つの内因性遺伝子の機能の軽減または排除により修飾される。アデニン欠損を招く
突然変異を有する細胞は非常に遅く成長し、赤みを帯びた色素を蓄積し、これは桃色のコ
ロニー（すなわち、Ａｄｅ１−またはＡｄｅ２−表現型を有する細胞）の産生をもたらす
。Ａｄｅ１−またはＡｄｅ２−表現型を有するこれらの細胞が、ＡＤＥ１またはＡＤＥ２
ＯＲＦの発現のためのプロモーターに機能的に連結されたそれぞれＡＤＥ１またはＡＤ
Ｅ２ ＯＲＦを含むプラスミドで形質転換された場合、Ａｄｅ１またはＡｄｅ２突然変異
は相補され、該細胞はアデニンに関して原栄養性となる。すなわち、該細胞はＡｄｅ１＋
またはＡｄｅ２＋表現型を有するようになる。これらの相補された組換え細胞は白色およ
び大きなコロニーサイズを示し、これは該組換え細胞の同定および選択を容易にする。あ
るいは、Ａｄｅ１−またはＡｄｅ２−表現型を有するこれらの細胞が、ＡＤＥ１またはＡ
ＤＥ２ ＯＲＦの発現のためのプロモーターに機能的に連結されていないそれぞれＡＤＥ
１またはＡＤＥ２ ＯＲＦを含むプラスミドで形質転換された場合には、Ａｄｅ１または
Ａｄｅ２突然変異は、該ゲノム内に組込まれたＡＤＥ１またはＡＤＥ２遺伝子を２コピー
以上含有する組換え細胞においてのみ相補される。
他の実施形態においては、Ａｄｅ１−またはＡｄｅ２−表現型を示す宿主細胞を使用す
る発現系における異種遺伝子の選択可能な発現のための組込みベクターを提供する。該組
込みベクターは、クローニング部位により隔てられクローニング部位に連結されたプロモ
ーター配列および転写終結配列を含む核酸を含む。関心のある１以上の所望の異種タンパ
ク質もしくはペプチドまたは機能性核酸をコードする核酸配列を、標準的な連結技術を用
いて、該プロモーターにより発現される適切な配向で該クローニング部位内に挿入する。
該組込みベクターは、好ましくは、該宿主細胞において機能性である少なくとも１つのプ
ロモーター、およびそれに続く少なくとも１つの制限部位、好ましくはマルチクローニン
グ部位、およびそれに続く、該宿主細胞において機能性である転写終結配列を含む。適当
な公知技術を用いて、所望のタンパク質またはポリペプチドをコードするヌクレオチド断
片を該組込みベクターのクローニング部位の制限部位内に連結することが可能である。該
組込みベクターは、該宿主細胞において機能性である適当な転写終結ターミネーター配列
の制御下にありうるＡＤＥ１およびＡＤＥ２よりなる群から選ばれる選択マーカーＯＲＦ
の少なくとも１つのコピーをも含む。幾つかの実施形態においては、該ＯＲＦは完全効力
同種または異種プロモーターに機能的に連結され、他の実施形態においては、該ＯＲＦは
、潜在性プロモーター、弱いプロモーター、減衰化プロモーターまたはトランケート化同
種もしくは異種プロモーター（完全効力プロモーターと比較して低下した転写活性を有す
る）に機能的に連結される。
る発現系における異種遺伝子の選択可能な発現のための組込みベクターを提供する。該組
込みベクターは、クローニング部位により隔てられクローニング部位に連結されたプロモ
ーター配列および転写終結配列を含む核酸を含む。関心のある１以上の所望の異種タンパ
ク質もしくはペプチドまたは機能性核酸をコードする核酸配列を、標準的な連結技術を用
いて、該プロモーターにより発現される適切な配向で該クローニング部位内に挿入する。
該組込みベクターは、好ましくは、該宿主細胞において機能性である少なくとも１つのプ
ロモーター、およびそれに続く少なくとも１つの制限部位、好ましくはマルチクローニン
グ部位、およびそれに続く、該宿主細胞において機能性である転写終結配列を含む。適当
な公知技術を用いて、所望のタンパク質またはポリペプチドをコードするヌクレオチド断
片を該組込みベクターのクローニング部位の制限部位内に連結することが可能である。該
組込みベクターは、該宿主細胞において機能性である適当な転写終結ターミネーター配列
の制御下にありうるＡＤＥ１およびＡＤＥ２よりなる群から選ばれる選択マーカーＯＲＦ
の少なくとも１つのコピーをも含む。幾つかの実施形態においては、該ＯＲＦは完全効力
同種または異種プロモーターに機能的に連結され、他の実施形態においては、該ＯＲＦは
、潜在性プロモーター、弱いプロモーター、減衰化プロモーターまたはトランケート化同
種もしくは異種プロモーター（完全効力プロモーターと比較して低下した転写活性を有す
る）に機能的に連結される。
もう１つの実施形態においては、異種または組換えタンパク質およびペプチドを発現さ
せるための組換え宿主細胞の構築のための方法、物質および系を提供し、ここで、該宿主
細胞をアデニンに関して栄養要求性にするために、例えば、該細胞をａｄｅ１にするため
に、ＡＤＥ１遺伝子が除去または欠失されている。そして該ａｄｅ１宿主細胞を組込みベ
クター［該組込みベクターは、（１）弱いプロモーター、減衰化内因性もしくは異種プロ
モーター、潜在性（クリプティック）プロモーター、トランケート化内因性もしくは異種
プロモーターに機能的に連結された又はプロモーターを伴わない、Ａｄｅ１ｐまたはＡｄ
ｅ１ｐ活性をコードする核酸、（２）異種または組換えタンパク質またはペプチドまたは
機能性核酸を異所的に産生するよう、関心のある遺伝子または機能性核酸をコードする１
以上の核酸、ならびに（３）相同組換えによる該宿主細胞のゲノムの特定の標的位置また
は遺伝子座への該組込みベクターの挿入を導く標的化核酸配列を含む］で形質転換する。
該組込みベクターが該標的遺伝子座内に組込まれている安定組換え宿主細胞を、アデニン
を欠く培地において該形質転換宿主細胞を培養することにより選択する。Ａｄｅ１ｐ活性
をコードする核酸は、弱い、減衰化、潜在性プロモーターまたはトランケート化プロモー
ターに機能的に連結されているため、該標的遺伝子座内に挿入された該組換えベクターを
１コピーしか含有しない組換え形質転換宿主細胞はアデニンに関して原栄養性にならない
。該形質転換宿主細胞を原栄養性にするためには、複数のコピーの該組込みベクターが該
宿主細胞の標的遺伝子座内に組込まれる必要がある。また、複数のコピーの該組込みベク
ターが該標的遺伝子座内に組込まれる必要があるため、関心のある遺伝子または配列によ
りコードされるタンパク質またはペプチドも、相当な量で産生される。
せるための組換え宿主細胞の構築のための方法、物質および系を提供し、ここで、該宿主
細胞をアデニンに関して栄養要求性にするために、例えば、該細胞をａｄｅ１にするため
に、ＡＤＥ１遺伝子が除去または欠失されている。そして該ａｄｅ１宿主細胞を組込みベ
クター［該組込みベクターは、（１）弱いプロモーター、減衰化内因性もしくは異種プロ
モーター、潜在性（クリプティック）プロモーター、トランケート化内因性もしくは異種
プロモーターに機能的に連結された又はプロモーターを伴わない、Ａｄｅ１ｐまたはＡｄ
ｅ１ｐ活性をコードする核酸、（２）異種または組換えタンパク質またはペプチドまたは
機能性核酸を異所的に産生するよう、関心のある遺伝子または機能性核酸をコードする１
以上の核酸、ならびに（３）相同組換えによる該宿主細胞のゲノムの特定の標的位置また
は遺伝子座への該組込みベクターの挿入を導く標的化核酸配列を含む］で形質転換する。
該組込みベクターが該標的遺伝子座内に組込まれている安定組換え宿主細胞を、アデニン
を欠く培地において該形質転換宿主細胞を培養することにより選択する。Ａｄｅ１ｐ活性
をコードする核酸は、弱い、減衰化、潜在性プロモーターまたはトランケート化プロモー
ターに機能的に連結されているため、該標的遺伝子座内に挿入された該組換えベクターを
１コピーしか含有しない組換え形質転換宿主細胞はアデニンに関して原栄養性にならない
。該形質転換宿主細胞を原栄養性にするためには、複数のコピーの該組込みベクターが該
宿主細胞の標的遺伝子座内に組込まれる必要がある。また、複数のコピーの該組込みベク
ターが該標的遺伝子座内に組込まれる必要があるため、関心のある遺伝子または配列によ
りコードされるタンパク質またはペプチドも、相当な量で産生される。
もう１つの実施形態においては、異種または組換えタンパク質およびペプチドを発現さ
せるための組換え宿主細胞の構築のための方法、物質および系を提供し、ここで、該宿主
細胞をアデニンに関して栄養要求性にするために、ＡＤＥ２遺伝子が除去または欠失され
ている。そして該ａｄｅ２宿主細胞を組込みベクター［該組込みベクターは、（１）弱い
プロモーター、減衰化内因性もしくは異種プロモーター、潜在性（クリプティック）プロ
モーター、トランケート化内因性もしくは異種プロモーターに機能的に連結された又はプ
ロモーターを伴わない、Ａｄｅ２ｐまたはＡｄｅ２ｐ活性をコードする核酸、（２）異種
または組換えタンパク質またはペプチドまたは機能性核酸を異所的に産生するよう、関心
のある遺伝子または機能性核酸をコードする１以上の核酸、ならびに（３）相同組換えに
よる該宿主細胞のゲノムの特定の標的位置または遺伝子座への該組込みベクターの挿入を
導く標的化核酸配列を含む］で形質転換する。該組込みベクターが該標的遺伝子座内に組
込まれている安定組換え宿主細胞を、アデニンを欠く培地において該形質転換宿主細胞を
培養することにより選択する。Ａｄｅ２ｐ活性をコードする核酸は、弱い、減衰化または
潜在性プロモーターに機能的に連結されているため、該標的遺伝子座内に挿入された該組
換えベクターを１コピーしか含有しない組換え形質転換宿主細胞はアデニンに関して原栄
養性にならない。該形質転換宿主細胞をアデニンに関して原栄養性にするためには、２コ
ピー以上の該組込みベクターが該宿主細胞の標的遺伝子座内に組込まれる必要がある。ま
た、複数のコピーの該組込みベクターが該標的遺伝子座内に組込まれる必要があるため、
関心のある遺伝子または配列によりコードされるタンパク質またはペプチドも、相当な量
で産生される。
せるための組換え宿主細胞の構築のための方法、物質および系を提供し、ここで、該宿主
細胞をアデニンに関して栄養要求性にするために、ＡＤＥ２遺伝子が除去または欠失され
ている。そして該ａｄｅ２宿主細胞を組込みベクター［該組込みベクターは、（１）弱い
プロモーター、減衰化内因性もしくは異種プロモーター、潜在性（クリプティック）プロ
モーター、トランケート化内因性もしくは異種プロモーターに機能的に連結された又はプ
ロモーターを伴わない、Ａｄｅ２ｐまたはＡｄｅ２ｐ活性をコードする核酸、（２）異種
または組換えタンパク質またはペプチドまたは機能性核酸を異所的に産生するよう、関心
のある遺伝子または機能性核酸をコードする１以上の核酸、ならびに（３）相同組換えに
よる該宿主細胞のゲノムの特定の標的位置または遺伝子座への該組込みベクターの挿入を
導く標的化核酸配列を含む］で形質転換する。該組込みベクターが該標的遺伝子座内に組
込まれている安定組換え宿主細胞を、アデニンを欠く培地において該形質転換宿主細胞を
培養することにより選択する。Ａｄｅ２ｐ活性をコードする核酸は、弱い、減衰化または
潜在性プロモーターに機能的に連結されているため、該標的遺伝子座内に挿入された該組
換えベクターを１コピーしか含有しない組換え形質転換宿主細胞はアデニンに関して原栄
養性にならない。該形質転換宿主細胞をアデニンに関して原栄養性にするためには、２コ
ピー以上の該組込みベクターが該宿主細胞の標的遺伝子座内に組込まれる必要がある。ま
た、複数のコピーの該組込みベクターが該標的遺伝子座内に組込まれる必要があるため、
関心のある遺伝子または配列によりコードされるタンパク質またはペプチドも、相当な量
で産生される。
前記実施形態のどちらにおいても、ａｄｅ１またはａｄｅ２栄養要求体は、原栄養体（
例えば、それぞれＡＤＥ１またはＡＤＥ２）、またはゲノム内への複数のコピーの該組込
みベクターの組込みにより原栄養体にされた細胞より遅く成長する。培養においては、該
標的遺伝子座内に挿入された複数のコピーの該組込みベクターを喪失する形質転換細胞お
よび復帰変異体は、複数のコピーの該組込みベクターを維持している細胞より遅く成長し
、それとの競合に負ける。また、特に、酵母ａｄｅ１またはａｄｅ２栄養要求体のような
生物は赤色または桃色であり、一方、原栄養体、またはゲノム内への２以上のコピーの該
組込みベクターの組込みにより原栄養体にされた細胞は白色である。したがって、該標的
配列内に挿入された複数のコピーの該組換えベクターを含有する組換え細胞の選択は白色
コロニーの選択に基づいたものでありうる。
例えば、それぞれＡＤＥ１またはＡＤＥ２）、またはゲノム内への複数のコピーの該組込
みベクターの組込みにより原栄養体にされた細胞より遅く成長する。培養においては、該
標的遺伝子座内に挿入された複数のコピーの該組込みベクターを喪失する形質転換細胞お
よび復帰変異体は、複数のコピーの該組込みベクターを維持している細胞より遅く成長し
、それとの競合に負ける。また、特に、酵母ａｄｅ１またはａｄｅ２栄養要求体のような
生物は赤色または桃色であり、一方、原栄養体、またはゲノム内への２以上のコピーの該
組込みベクターの組込みにより原栄養体にされた細胞は白色である。したがって、該標的
配列内に挿入された複数のコピーの該組換えベクターを含有する組換え細胞の選択は白色
コロニーの選択に基づいたものでありうる。
本発明における方法および系は、ａｄｅ１またはａｄｅ２のような栄養要求性突然変異
が施されうる任意の生物において実施可能であり、その相補は、本明細書に記載されてい
る選択可能な表現型をもたらす。該方法は、ａｄｅ１またはａｄｅ２マイナス表現型を示
す宿主細胞を、相補性Ａｄｅ１ｐまたはＡｄｅ２ｐタンパク質をコードするヌクレオチド
配列を含む組込みベクターで形質転換することを含み、それにより、所望の分泌糖タンパ
ク質をコードする組込みベクターで該宿主細胞を形質転換した場合、Ａｄｅ１−および／
またはＡｄｅ２−表現型の相補は、所望の糖タンパク質をコードする遺伝子の安定組込み
をもたらし、形質転換された組換え宿主細胞の質の改善、特に、所望の組換え糖タンパク
質の収量の増加に寄与する。
が施されうる任意の生物において実施可能であり、その相補は、本明細書に記載されてい
る選択可能な表現型をもたらす。該方法は、ａｄｅ１またはａｄｅ２マイナス表現型を示
す宿主細胞を、相補性Ａｄｅ１ｐまたはＡｄｅ２ｐタンパク質をコードするヌクレオチド
配列を含む組込みベクターで形質転換することを含み、それにより、所望の分泌糖タンパ
ク質をコードする組込みベクターで該宿主細胞を形質転換した場合、Ａｄｅ１−および／
またはＡｄｅ２−表現型の相補は、所望の糖タンパク質をコードする遺伝子の安定組込み
をもたらし、形質転換された組換え宿主細胞の質の改善、特に、所望の組換え糖タンパク
質の収量の増加に寄与する。
他の実施形態においては、本発明の宿主細胞は、該宿主細胞および／またはそれから産
生されたタンパク質もしくはペプチドが所望の特性を示すよう、そのゲノム内に他の遺伝
的操作が施される。例えば、該宿主細胞が、非常に均質なレベルの１以上の所望の糖形態
を有する組換え糖タンパク質を産生しうるよう、該宿主細胞は、例えば米国特許第７，０
２９，８７２号、米国公開出願第２００４／００１８５９０号およびＨａｍｉｌｔｏｎら
，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１３：１４４１−１４４３（２００６）に記載されている方法によ
り操作されうる。他の実施形態においては、分子シャペロンタンパク質をコードする１以
上の内因性遺伝子を欠失させ、および／または、産生すべき異種タンパク質もしくはポリ
ペプチドの種に由来する分子シャペロン遺伝子をコードする１以上の異種遺伝子で該宿主
細胞を形質転換することにより、該宿主細胞を修飾することが可能である。例えば、ピチ
ア（Ｐｉｃｈｉａ）種の宿主細胞は、内因性タンパク質ＰＤＩおよび／またはＢｉＰの除
去により修飾され、哺乳類ＰＤＩ、ＢｉＰおよび／またはＧＲＰ９４遺伝子をコードする
１以上のプラスミドで形質転換されうる。Ｃｈｏｉら（前掲）（これを参照により本明細
書に組み入れることとする）を参照されたい。
生されたタンパク質もしくはペプチドが所望の特性を示すよう、そのゲノム内に他の遺伝
的操作が施される。例えば、該宿主細胞が、非常に均質なレベルの１以上の所望の糖形態
を有する組換え糖タンパク質を産生しうるよう、該宿主細胞は、例えば米国特許第７，０
２９，８７２号、米国公開出願第２００４／００１８５９０号およびＨａｍｉｌｔｏｎら
，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１３：１４４１−１４４３（２００６）に記載されている方法によ
り操作されうる。他の実施形態においては、分子シャペロンタンパク質をコードする１以
上の内因性遺伝子を欠失させ、および／または、産生すべき異種タンパク質もしくはポリ
ペプチドの種に由来する分子シャペロン遺伝子をコードする１以上の異種遺伝子で該宿主
細胞を形質転換することにより、該宿主細胞を修飾することが可能である。例えば、ピチ
ア（Ｐｉｃｈｉａ）種の宿主細胞は、内因性タンパク質ＰＤＩおよび／またはＢｉＰの除
去により修飾され、哺乳類ＰＤＩ、ＢｉＰおよび／またはＧＲＰ９４遺伝子をコードする
１以上のプラスミドで形質転換されうる。Ｃｈｏｉら（前掲）（これを参照により本明細
書に組み入れることとする）を参照されたい。
さらに他の実施形態においては、非ヒト真核宿主細胞、下等真核宿主細胞または酵母も
しくは糸状菌宿主細胞における組換えヒトまたは哺乳類糖タンパク質の生産性を増加させ
るための方法を提供する。該方法は、混合型または複合型Ｎ−グリカンを有する糖タンパ
ク質を産生しうる、ａｄｅ１またはａｄｅ２である宿主細胞を、ＡＤＥ１またはＡＤＥ２
ＯＲＦをコードする核酸および関心のある糖タンパク質をコードする核酸を含むベクタ
ーで形質転換する工程を含む。
しくは糸状菌宿主細胞における組換えヒトまたは哺乳類糖タンパク質の生産性を増加させ
るための方法を提供する。該方法は、混合型または複合型Ｎ−グリカンを有する糖タンパ
ク質を産生しうる、ａｄｅ１またはａｄｅ２である宿主細胞を、ＡＤＥ１またはＡＤＥ２
ＯＲＦをコードする核酸および関心のある糖タンパク質をコードする核酸を含むベクタ
ーで形質転換する工程を含む。
ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＤＥ１およびＡＤＥ２遺伝
子のクローニングを以下のとおりに行った。
子のクローニングを以下のとおりに行った。
ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＤＥ１遺伝子のクローニングは既に公
開されている（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏら，前掲）。Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ
ｓ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬから得た部分的ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）
ゲノム配列を使用して、追加的な５’−および３’−配列を得た。プロモーターおよび転
写終結配列を含むピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＤＥ１オープンリーデ
ィングフレーム（ＯＲＦ）のヌクレオチド配列を配列番号５６に示す。ピチア・パストリ
ス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＤＥ１のアミノ酸配列を配列番号５７に示す。プログラム
ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１
９９０））を使用して、同じゲノム配列をサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ）ＡＤＥ２ ＯＲＦで問合せて、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ
）ＡＤＥ２ホモログ（６９％の同一性を有する５６３アミノ酸）が特定された。プロモー
ターおよび転写終結配列を含むピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＤＥ２
ＯＲＦをコードするヌクレオチド配列を配列番号６０に示す。ＡＤＥ２ ＯＲＦは、配列
番号６０に示すヌクレオチド配列のヌクレオチド１２７−１，８１５によりコードされ、
配列番号６１に示すアミノ酸配列を有する。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ）ＡＤＥ２アミノ酸配列（配列番号６２）に対するピチア・パストリス（Ｐ
．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＤＥ２アミノ酸配列（配列番号６１）のアライメントを図１に示
す。
開されている（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏら，前掲）。Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ
ｓ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬから得た部分的ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）
ゲノム配列を使用して、追加的な５’−および３’−配列を得た。プロモーターおよび転
写終結配列を含むピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＤＥ１オープンリーデ
ィングフレーム（ＯＲＦ）のヌクレオチド配列を配列番号５６に示す。ピチア・パストリ
ス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＤＥ１のアミノ酸配列を配列番号５７に示す。プログラム
ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１
９９０））を使用して、同じゲノム配列をサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ）ＡＤＥ２ ＯＲＦで問合せて、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ
）ＡＤＥ２ホモログ（６９％の同一性を有する５６３アミノ酸）が特定された。プロモー
ターおよび転写終結配列を含むピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＤＥ２
ＯＲＦをコードするヌクレオチド配列を配列番号６０に示す。ＡＤＥ２ ＯＲＦは、配列
番号６０に示すヌクレオチド配列のヌクレオチド１２７−１，８１５によりコードされ、
配列番号６１に示すアミノ酸配列を有する。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ）ＡＤＥ２アミノ酸配列（配列番号６２）に対するピチア・パストリス（Ｐ
．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＤＥ２アミノ酸配列（配列番号６１）のアライメントを図１に示
す。
ＡＤＥ１およびＡＤＥ２ノックアウトベクターおよび株の構築は以下のとおりであった
。プラスミド構築の第１工程においては、（ａ）ノックアウトすべき遺伝子の５’および
３’領域のための間隙維持体としてのピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）のＡ
ＲＧ３遺伝子（Ｎｅｔｔら，２００５，前掲）、（ｂ）栄養要求性マーカーとしてのピチ
ア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５−ブラスター（ｂｌａｓｔｅｒ）（Ｎ
ｅｔｔおよびＧｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｙｅａｓｔ ２０：１２７９−１２９０（２００３）
）、ならびに（ｃ）外来遺伝子の挿入のためのマルチクローニング部位を有する発現カセ
ットのＤＮＡ領域を含有する汎用ノックアウトプラスミドを作製した。
。プラスミド構築の第１工程においては、（ａ）ノックアウトすべき遺伝子の５’および
３’領域のための間隙維持体としてのピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）のＡ
ＲＧ３遺伝子（Ｎｅｔｔら，２００５，前掲）、（ｂ）栄養要求性マーカーとしてのピチ
ア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５−ブラスター（ｂｌａｓｔｅｒ）（Ｎ
ｅｔｔおよびＧｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｙｅａｓｔ ２０：１２７９−１２９０（２００３）
）、ならびに（ｃ）外来遺伝子の挿入のためのマルチクローニング部位を有する発現カセ
ットのＤＮＡ領域を含有する汎用ノックアウトプラスミドを作製した。
該汎用ノックアウトプラスミドの構造に適合しうるＵＲＡ５−ブラスターカセットを作
製するために、ｌａｃＺのＳａｃＩ−ＰｖｕＩＩ断片をｐＵＣ１９のＳａｃＩ−ＳｍａＩ
部位内にクローニングした。得られたプラスミドをＨｉｎｃＩＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポ
リメラーゼを使用して平滑末端化されたｌａｃＺのＳａｃＩ−ＰｖｕＩＩ断片を頭−尾配
向でこのプラスミド内に挿入してｐＧＬＹ８を得た。ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔ
ｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子の１．０ｋｂ ＤＮＡ断片を、プライマーＵｒａ５ｃｏｍｐ５
（配列番号１）およびＵｒａ５ｃｏｍｐ３（配列番号２）ならびに鋳型としての酵母株Ｎ
ＲＲＬ Ｙ−１１４３０ゲノムＤＮＡを使用して増幅し、ｐＧＬＹ８のＢａｍＨＩ−Ｘｂ
ａＩ部位内にクローニングしてｐＧＬＹ１０を得た。内部のＳａｃＩおよびＸｈｏＩ部位
を取り出すために、鋳型としてのｐＧＬＹ１０ならびにそれぞれプライマーペアＵＲＡ５
ＭＵＴ１（配列番号３）およびＵＲＡ５ＭＵＴ２（配列番号４）、ＵＲＡ５ＭＵＴ３（配
列番号５）およびＵＲＡ５ＭＵＴ４（配列番号６）、ならびにＵＲＡ５ＭＵＴ５（配列番
号７）およびＵＲＡ５ＭＵＴ６（配列番号８）を使用して、ＵＲＡ５の３つの重複断片を
増幅した。得られたＰＣＲ産物をゲル精製し、混合し、ＵＲＡ５ＭＵＴ１（配列番号３）
およびＵＲＡ５ＭＵＴ６（配列番号８）プライマーとして使用する融合ＰＣＲにおける鋳
型として使用した。ついで、得られたＰＣＲ産物をベクターｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯ（登
録商標）内にクローニングし、ＣｌａＩおよびＢｓｓＨＩＩを使用して再び取り出し、同
様にＣｌａＩおよびＢｓｓＨＩＩで消化されたｐＧＬＹ１０内にクローニングしてｐＧＬ
Ｙ１２を得た。ＳａｃＩおよびＢａｍＨＩ部位を取り出すために、ｐＧＬＹ１２をまず、
ＳａｃＩで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを使用して平滑末端化し、再連結してｐＧＬ
Ｙ１３ａを得、ついでＢａｍＨＩで切断し、平滑末端化し、再連結してｐＧＬＹ１３ｂを
得た。どちらの場合も、ｌａｃＺ−ＵＲＡ５カセットはＥｃｏＲＩおよびＳｐｈＩでの消
化により遊離されうる。
製するために、ｌａｃＺのＳａｃＩ−ＰｖｕＩＩ断片をｐＵＣ１９のＳａｃＩ−ＳｍａＩ
部位内にクローニングした。得られたプラスミドをＨｉｎｃＩＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポ
リメラーゼを使用して平滑末端化されたｌａｃＺのＳａｃＩ−ＰｖｕＩＩ断片を頭−尾配
向でこのプラスミド内に挿入してｐＧＬＹ８を得た。ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔ
ｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子の１．０ｋｂ ＤＮＡ断片を、プライマーＵｒａ５ｃｏｍｐ５
（配列番号１）およびＵｒａ５ｃｏｍｐ３（配列番号２）ならびに鋳型としての酵母株Ｎ
ＲＲＬ Ｙ−１１４３０ゲノムＤＮＡを使用して増幅し、ｐＧＬＹ８のＢａｍＨＩ−Ｘｂ
ａＩ部位内にクローニングしてｐＧＬＹ１０を得た。内部のＳａｃＩおよびＸｈｏＩ部位
を取り出すために、鋳型としてのｐＧＬＹ１０ならびにそれぞれプライマーペアＵＲＡ５
ＭＵＴ１（配列番号３）およびＵＲＡ５ＭＵＴ２（配列番号４）、ＵＲＡ５ＭＵＴ３（配
列番号５）およびＵＲＡ５ＭＵＴ４（配列番号６）、ならびにＵＲＡ５ＭＵＴ５（配列番
号７）およびＵＲＡ５ＭＵＴ６（配列番号８）を使用して、ＵＲＡ５の３つの重複断片を
増幅した。得られたＰＣＲ産物をゲル精製し、混合し、ＵＲＡ５ＭＵＴ１（配列番号３）
およびＵＲＡ５ＭＵＴ６（配列番号８）プライマーとして使用する融合ＰＣＲにおける鋳
型として使用した。ついで、得られたＰＣＲ産物をベクターｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯ（登
録商標）内にクローニングし、ＣｌａＩおよびＢｓｓＨＩＩを使用して再び取り出し、同
様にＣｌａＩおよびＢｓｓＨＩＩで消化されたｐＧＬＹ１０内にクローニングしてｐＧＬ
Ｙ１２を得た。ＳａｃＩおよびＢａｍＨＩ部位を取り出すために、ｐＧＬＹ１２をまず、
ＳａｃＩで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを使用して平滑末端化し、再連結してｐＧＬ
Ｙ１３ａを得、ついでＢａｍＨＩで切断し、平滑末端化し、再連結してｐＧＬＹ１３ｂを
得た。どちらの場合も、ｌａｃＺ−ＵＲＡ５カセットはＥｃｏＲＩおよびＳｐｈＩでの消
化により遊離されうる。
ＡＲＧ３−５’領域の１．１ｋｂ ＤＮＡ断片を、鋳型としてのピチア・パストリス（
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ゲノムＤＮＡと共にプライマーＡＲＧ３５５ＤＩＳ（配列番号９
）およびＡＲＧ３５３−２（配列番号１０）を使用するＰＣＲにより増幅し、ｐＵＣ１９
のＳａｃＩ−ＳａｌＩ部位内にクローニングした。得られたプラスミドをＢａｍＨＩおよ
びＳａｌＩで切断し、プライマーＡＲＧ３３５−２（配列番号１１）およびＡＲＧ３３３
（配列番号１２）を使用して増幅されたＡＲＧ３−３’領域の０．７ｋｂ ＤＮＡ断片を
空部位内にクローニングしてｐＧＬＹ２１を得た。該プラスミドをＢａｍＨＩで切断し、
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し、ｐＧＬＹ１３ａまたはｐＧＬＹ１３ｂからのＥ
ｃｏＲＩおよびＳｐｈＩで切断され平滑化されたｌａｃＺ−ＵＲＡ５カセットを挿入して
、それぞれプラスミドｐＧＬＹ２２ｂおよびｐＧＬＹ２３を得た。プラスミドｐＧＬＹ２
２ｂは、追加的発現カセットを伴わない該汎用ノックアウトプラスミドに相当し、一方、
ｐＧＬＹ２３を、異種遺伝子の追加的発現のためのカセットをも含有するよう更に修飾し
た。
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ゲノムＤＮＡと共にプライマーＡＲＧ３５５ＤＩＳ（配列番号９
）およびＡＲＧ３５３−２（配列番号１０）を使用するＰＣＲにより増幅し、ｐＵＣ１９
のＳａｃＩ−ＳａｌＩ部位内にクローニングした。得られたプラスミドをＢａｍＨＩおよ
びＳａｌＩで切断し、プライマーＡＲＧ３３５−２（配列番号１１）およびＡＲＧ３３３
（配列番号１２）を使用して増幅されたＡＲＧ３−３’領域の０．７ｋｂ ＤＮＡ断片を
空部位内にクローニングしてｐＧＬＹ２１を得た。該プラスミドをＢａｍＨＩで切断し、
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し、ｐＧＬＹ１３ａまたはｐＧＬＹ１３ｂからのＥ
ｃｏＲＩおよびＳｐｈＩで切断され平滑化されたｌａｃＺ−ＵＲＡ５カセットを挿入して
、それぞれプラスミドｐＧＬＹ２２ｂおよびｐＧＬＹ２３を得た。プラスミドｐＧＬＹ２
２ｂは、追加的発現カセットを伴わない該汎用ノックアウトプラスミドに相当し、一方、
ｐＧＬＹ２３を、異種遺伝子の追加的発現のためのカセットをも含有するよう更に修飾し
た。
クローニング部位としてＮｏｔＩおよびＰａｃＩを含有する発現カセットを作製するた
めに、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）のＧＡＰＤＨプロモーターを含有す
る０．５ｋｂ ＤＮＡ断片を、プライマーＧＡＰ５ＣＬＥＡＮ（配列番号１３）およびＧ
ＡＰ３ＣＬＥＡＮ（配列番号１４）ならびに鋳型としてのピチア・パストリス（Ｐ．ｐａ
ｓｔｏｒｉｓ）ゲノムＤＮＡを使用して増幅し、ｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩ部位
内にクローニングした。得られたプラスミドをＳｐｅＩおよびＳｐｈＩで切断し、プライ
マーＣＹＣ５ＣＬＥＡＮ（配列番号１５）およびＣＹＣ３ＣＬＥＡＮ（配列番号１６）な
らびに鋳型としてのサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ゲノムＤ
ＮＡを使用して増幅されＮｈｅＩおよびＳｐｈＩで切断されたサッカロミセス・セレビシ
エ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ１転写ターミネーター領域を含有する０．３ｋｂ
断片を空部位内にクローニングしてｐＧＬＹ１７を得た。該発現カセットをＢａｍＨＩ消
化により遊離させ、ｐＧＬＹ２３内にクローニングしてｐＧＬＹ２４を得た。
めに、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）のＧＡＰＤＨプロモーターを含有す
る０．５ｋｂ ＤＮＡ断片を、プライマーＧＡＰ５ＣＬＥＡＮ（配列番号１３）およびＧ
ＡＰ３ＣＬＥＡＮ（配列番号１４）ならびに鋳型としてのピチア・パストリス（Ｐ．ｐａ
ｓｔｏｒｉｓ）ゲノムＤＮＡを使用して増幅し、ｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩ部位
内にクローニングした。得られたプラスミドをＳｐｅＩおよびＳｐｈＩで切断し、プライ
マーＣＹＣ５ＣＬＥＡＮ（配列番号１５）およびＣＹＣ３ＣＬＥＡＮ（配列番号１６）な
らびに鋳型としてのサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ゲノムＤ
ＮＡを使用して増幅されＮｈｅＩおよびＳｐｈＩで切断されたサッカロミセス・セレビシ
エ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ１転写ターミネーター領域を含有する０．３ｋｂ
断片を空部位内にクローニングしてｐＧＬＹ１７を得た。該発現カセットをＢａｍＨＩ消
化により遊離させ、ｐＧＬＹ２３内にクローニングしてｐＧＬＹ２４を得た。
以下の方法でｐＧＬＹ２２ｂからＡＤＥ１ノックアウトプラスミドを構築した。プライ
マーＡＤＥ１５５Ｌ（配列番号１７）およびＡＤＥ１５３Ｌ（配列番号１８）を使用して
増幅されたＡＤＥ１−５’領域の１．８ｋｂ断片をＳａｃＩおよびＰｍｅＩで切断し、ｐ
ＧＬＹ２２ｂ内にクローニングしてｐＧＬＹ１０６４を得た。ついで、プライマーＡＤＥ
１ＫＯ３５（配列番号１９）およびＡＤＥ１３３Ｌ（配列番号２０）を使用して増幅され
たＡＤＥ１−３’領域の１．５ｋｂ断片をＳｗａＩおよびＳｐｈＩで切断し、ｐＧＬＹ１
０６４内にクローニングしてＡＤＥ１ノックアウトプラスミドｐＧＬＹ１０６５（図１Ａ
）を得た。
マーＡＤＥ１５５Ｌ（配列番号１７）およびＡＤＥ１５３Ｌ（配列番号１８）を使用して
増幅されたＡＤＥ１−５’領域の１．８ｋｂ断片をＳａｃＩおよびＰｍｅＩで切断し、ｐ
ＧＬＹ２２ｂ内にクローニングしてｐＧＬＹ１０６４を得た。ついで、プライマーＡＤＥ
１ＫＯ３５（配列番号１９）およびＡＤＥ１３３Ｌ（配列番号２０）を使用して増幅され
たＡＤＥ１−３’領域の１．５ｋｂ断片をＳｗａＩおよびＳｐｈＩで切断し、ｐＧＬＹ１
０６４内にクローニングしてＡＤＥ１ノックアウトプラスミドｐＧＬＹ１０６５（図１Ａ
）を得た。
以下の方法でｐＧＬＹ２４からＡＤＥ２ノックアウトプラスミドを構築した。ピチア・
パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＬＧ３転写ターミネーターを、プライマーＲＣＤ
５３４（配列番号２１）およびＲＣＤ５３５（配列番号２２）ならびに鋳型としてのピチ
ア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ゲノムＤＮＡを使用してＰＣＲ増幅し、Ｅｃｏ
ＲＶおよびＡｆｌＩＩで切断し、ｐＧＬＹ２４のＰｍｅＩ−ＡｆｌＩＩ部位内にクローニ
ングしてｐＧＬＹ５６６を得た。この修飾は以下のＡＤＥノックアウトプラスミドには無
関係であるが、異なる計画に使用したプラスミドを構築するために利用した。プライマー
ＡＤＥ２３５（配列番号２５）およびＡＤＥ２３３（配列番号２６）を使用して増幅され
たＡＤＥ２−３’領域の１．７ｋｂ断片をＳｗａＩおよびＳａｌＩで切断し、ｐＧＬＹ５
６６内にクローニングしてｐＧＬＹ１０７９を得た。ついで、プライマーＡＤＥ２５５Ｋ
Ｏ（配列番号２３）およびＡＤＥ２５３ＫＯ（配列番号２４）を使用して増幅されたＡＤ
Ｅ２−５’領域の１．０ｋｂ断片をＳａｃＩおよびＦｓｅＩで切断し、ｐＧＬＹ１０７９
内にクローニングしてＡＤＥ２ノックアウトプラスミドｐＧＬＹ２０５７（図１Ｂ）を得
た。
パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＬＧ３転写ターミネーターを、プライマーＲＣＤ
５３４（配列番号２１）およびＲＣＤ５３５（配列番号２２）ならびに鋳型としてのピチ
ア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ゲノムＤＮＡを使用してＰＣＲ増幅し、Ｅｃｏ
ＲＶおよびＡｆｌＩＩで切断し、ｐＧＬＹ２４のＰｍｅＩ−ＡｆｌＩＩ部位内にクローニ
ングしてｐＧＬＹ５６６を得た。この修飾は以下のＡＤＥノックアウトプラスミドには無
関係であるが、異なる計画に使用したプラスミドを構築するために利用した。プライマー
ＡＤＥ２３５（配列番号２５）およびＡＤＥ２３３（配列番号２６）を使用して増幅され
たＡＤＥ２−３’領域の１．７ｋｂ断片をＳｗａＩおよびＳａｌＩで切断し、ｐＧＬＹ５
６６内にクローニングしてｐＧＬＹ１０７９を得た。ついで、プライマーＡＤＥ２５５Ｋ
Ｏ（配列番号２３）およびＡＤＥ２５３ＫＯ（配列番号２４）を使用して増幅されたＡＤ
Ｅ２−５’領域の１．０ｋｂ断片をＳａｃＩおよびＦｓｅＩで切断し、ｐＧＬＹ１０７９
内にクローニングしてＡＤＥ２ノックアウトプラスミドｐＧＬＹ２０５７（図１Ｂ）を得
た。
以下の方法でＡＤＥ１およびＡＤＥ２ノックアウト株を構築した。既に記載されている
方法（ＮｅｔｔおよびＧｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｙｅａｓｔ ２０：１２７９−１２９０（２
００３）；Ｃｈｏｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１００：５０２２−５
０２７（２００３）；Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：１２４４−１２４
６（２００３））を用いて構築された株ＹＧＬＹ２４−３［ｕｒａ５Δ：：ＭＥＴ１６，
ｏｃｈ１Δ：：ｌａｃＺ，ｂｍｔ２Δ：：ｌａｃＺ／Ｋ１ＭＮＮ２−２，ｍｎｎ４Ｌ１Δ
：：ｌａｃＺ／ＭｍＳＬＣ３５Ａ３，ｐｎｏ１Δｍｎｎ４Δ：：ｌａｃＺ，ｍｅｔ１６Δ
：：ｌａｃＺ］をｐＧＬＹ１０６５で形質転換し、２つの桃色の形質転換体をＹＧＬＹ５
６３およびＹＧＬＹ５６４と命名した。それらのＡｄｅ１表現型は、アデニンを欠く培地
上でそれらが成長し得ないことにより確認された。これらの株は、主としてＭａｎ５Ｇｌ
ｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生しうる。
方法（ＮｅｔｔおよびＧｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｙｅａｓｔ ２０：１２７９−１２９０（２
００３）；Ｃｈｏｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１００：５０２２−５
０２７（２００３）；Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：１２４４−１２４
６（２００３））を用いて構築された株ＹＧＬＹ２４−３［ｕｒａ５Δ：：ＭＥＴ１６，
ｏｃｈ１Δ：：ｌａｃＺ，ｂｍｔ２Δ：：ｌａｃＺ／Ｋ１ＭＮＮ２−２，ｍｎｎ４Ｌ１Δ
：：ｌａｃＺ／ＭｍＳＬＣ３５Ａ３，ｐｎｏ１Δｍｎｎ４Δ：：ｌａｃＺ，ｍｅｔ１６Δ
：：ｌａｃＺ］をｐＧＬＹ１０６５で形質転換し、２つの桃色の形質転換体をＹＧＬＹ５
６３およびＹＧＬＹ５６４と命名した。それらのＡｄｅ１表現型は、アデニンを欠く培地
上でそれらが成長し得ないことにより確認された。これらの株は、主としてＭａｎ５Ｇｌ
ｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生しうる。
株ＹＧＬＹ２２７およびＹＧＬＹ２２８（ＵＲＡ５マーカー付きトリコデルマ・レエセ
イ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）１，２マンノシダーゼ発現プラスミドで形
質転換され、無関係な実験において５−ＦＯＡ上で対抗選択されたＹＧＬＹ２４−３の直
接の後代）をｐＧＬＹ２０５７で形質転換し、各株ごとに１つの桃色形質転換体を単離し
て、それぞれ、株ＹＧＬＹ１２１５およびＹＧＬＹ１２１６を得た。それらのａｄｅ２表
現型も、アデニンを欠く培地上でそれらが成長し得ないことにより確認された（結果は示
されていない）。予想どおり（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏら，前掲）、該ａｄｅ１およびａｄｅ
２株は共に、アデニンで補足された培地上でさえも、遅い成長の表現型を示した。これら
の株は、主としてＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生し
うる。
イ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）１，２マンノシダーゼ発現プラスミドで形
質転換され、無関係な実験において５−ＦＯＡ上で対抗選択されたＹＧＬＹ２４−３の直
接の後代）をｐＧＬＹ２０５７で形質転換し、各株ごとに１つの桃色形質転換体を単離し
て、それぞれ、株ＹＧＬＹ１２１５およびＹＧＬＹ１２１６を得た。それらのａｄｅ２表
現型も、アデニンを欠く培地上でそれらが成長し得ないことにより確認された（結果は示
されていない）。予想どおり（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏら，前掲）、該ａｄｅ１およびａｄｅ
２株は共に、アデニンで補足された培地上でさえも、遅い成長の表現型を示した。これら
の株は、主としてＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生し
うる。
ＡＤＥ１およびＡＤＥ２マーカー付き組込みベクターの構築は以下のとおりであった。
ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ、ＳｗａＩ、ＢａｍＨＩ、ＮｏｔＩ、ＰａｃＩ、Ａ
ｓｃＩおよびＳｆｉＩに対する部位を含有する、より適切なマルチクローニング部位を有
するベクターを、ｐＵＣ１９をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、アニール化オ
リゴＥＸＭＣＳ１（配列番号２７）およびＥＸＭＣＳ２（配列番号２８）を挿入すること
により構築して、ｐＧＬＹ１９２を得た。プライマーＣＹＣＴＴ５（配列番号２９）およ
びＣＹＣＴＴ３（配列番号３０）ならびに鋳型としてのサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ
．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ゲノムＤＮＡを使用して増幅されたサッカロミセス・セレビシ
エ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ１転写ターミネーター領域を含有する０．３ｋｂ
ＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＳｗａＩで切断し、ｐＧＬＹ１９２内にクローニングし
てｐＧＬＹ２１３を得た。ついでピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１
プロモーターを、オリゴＡＯＸ１Ｐ−５（配列番号３１）およびＡＯＸ１Ｐ−３（配列番
号３２）を使用してゲノムＤＮＡから増幅し、ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、ｐ
ＧＬＹ２１３内に連結してｐＧＬＹ２１４を得た。両ａｄｅノックアウトプラスミドは、
全ＯＲＦを除去するように設計されていたため、該プロモーター領域に代わる該プラスミ
ドの組込みのための領域を付加した。この目的のために、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａ
ｓｔｏｒｉｓ）ＴＲＰ２遺伝子を含有する１．８ｋｂ断片を、オリゴＴＲＰ２−５（配列
番号３３）およびＴＲＰ２−３改変体（配列番号３４）を使用してゲノムＤＮＡから増幅
し、ＳｆｉＩで切断し、ｐＧＬＹ２１４内にクローニングしてｐＧＬＹ２１５を得た。こ
のプラスミドは、関心のある遺伝子の付加のためのＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ、ＳｗａＩ部位
、およびトランケート化ＡＤＥマーカーの付加のためのＢａｍＨＩ、ＮｏｔＩ、ＰａｃＩ
、ＡｓｃＩ部位を含有する。
ｓｃＩおよびＳｆｉＩに対する部位を含有する、より適切なマルチクローニング部位を有
するベクターを、ｐＵＣ１９をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、アニール化オ
リゴＥＸＭＣＳ１（配列番号２７）およびＥＸＭＣＳ２（配列番号２８）を挿入すること
により構築して、ｐＧＬＹ１９２を得た。プライマーＣＹＣＴＴ５（配列番号２９）およ
びＣＹＣＴＴ３（配列番号３０）ならびに鋳型としてのサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ
．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ゲノムＤＮＡを使用して増幅されたサッカロミセス・セレビシ
エ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ１転写ターミネーター領域を含有する０．３ｋｂ
ＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＳｗａＩで切断し、ｐＧＬＹ１９２内にクローニングし
てｐＧＬＹ２１３を得た。ついでピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１
プロモーターを、オリゴＡＯＸ１Ｐ−５（配列番号３１）およびＡＯＸ１Ｐ−３（配列番
号３２）を使用してゲノムＤＮＡから増幅し、ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、ｐ
ＧＬＹ２１３内に連結してｐＧＬＹ２１４を得た。両ａｄｅノックアウトプラスミドは、
全ＯＲＦを除去するように設計されていたため、該プロモーター領域に代わる該プラスミ
ドの組込みのための領域を付加した。この目的のために、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａ
ｓｔｏｒｉｓ）ＴＲＰ２遺伝子を含有する１．８ｋｂ断片を、オリゴＴＲＰ２−５（配列
番号３３）およびＴＲＰ２−３改変体（配列番号３４）を使用してゲノムＤＮＡから増幅
し、ＳｆｉＩで切断し、ｐＧＬＹ２１４内にクローニングしてｐＧＬＹ２１５を得た。こ
のプラスミドは、関心のある遺伝子の付加のためのＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ、ＳｗａＩ部位
、およびトランケート化ＡＤＥマーカーの付加のためのＢａｍＨＩ、ＮｏｔＩ、ＰａｃＩ
、ＡｓｃＩ部位を含有する。
対応する天然プロモーターに又は該天然プロモーターの種々のトランケート化体に機能
的に連結されたＡＤＥ１ ＯＲＦを含有するＡＤＥ１マーカーカセットを以下のとおりに
構築した。完全長またはトランケート化プロモーターを有するＡＤＥ１マーカーを、３’
−オリゴとしてのオリゴＡＤＥ１−３（配列番号３５）ならびに５’−オリゴとしてのＡ
ＤＥ１−５Ｃ−ＢＡＭ（配列番号３６）、ＡＤＥ１−５−１００（配列番号３７）、ＡＤ
Ｅ１−５−１８６（配列番号３８）、ＡＤＥ１−５−２９５（配列番号３９）、ＡＤＥ１
−５−３２５（配列番号４０）およびＡＤＥ１−５０ＲＦ（配列番号４１）を使用してＰ
ＣＲ増幅して、それぞれプロモーター領域の３７０、２７６、１９１、８２、５０および
０ヌクレオチドを有する断片を得た。最初の５つの断片をＮｏｔＩおよびＡｓｃＩで切断
し、最後の断片をＰａｃＩおよびＡｓｃＩで切断し、全断片をｐＧＬＹ２１５内にクロー
ニングして、それぞれ、ＡＤＥ１マーカー付き組込みプラスミドｐＧＬＹ２２０〜ｐＧＬ
Ｙ２２５を得た（ｐＧＬＹ２２５のプラスミド地図に関しては図１Ｃを参照されたい）。
構成的タンパク質発現のためのプラスミドを作製するために、ｐＧＬＹ２２０およびｐＧ
ＬＹ２２５内のＡＯＸ１プロモーターを除去し、プライマーＧＡＰＤＨＰ−５（配列番号
４２）およびＧＡＰＤＨＰ−３（配列番号４３）を使用して増幅されたＧＡＰＤＨプロモ
ーターにより置換して、それぞれプラスミドｐＧＬＹ１０８２およびｐＧＬＹ１０８３を
得た（ｐＧＬＹ１０８３のプラスミド地図に関しては図１Ｄを参照されたい）。
的に連結されたＡＤＥ１ ＯＲＦを含有するＡＤＥ１マーカーカセットを以下のとおりに
構築した。完全長またはトランケート化プロモーターを有するＡＤＥ１マーカーを、３’
−オリゴとしてのオリゴＡＤＥ１−３（配列番号３５）ならびに５’−オリゴとしてのＡ
ＤＥ１−５Ｃ−ＢＡＭ（配列番号３６）、ＡＤＥ１−５−１００（配列番号３７）、ＡＤ
Ｅ１−５−１８６（配列番号３８）、ＡＤＥ１−５−２９５（配列番号３９）、ＡＤＥ１
−５−３２５（配列番号４０）およびＡＤＥ１−５０ＲＦ（配列番号４１）を使用してＰ
ＣＲ増幅して、それぞれプロモーター領域の３７０、２７６、１９１、８２、５０および
０ヌクレオチドを有する断片を得た。最初の５つの断片をＮｏｔＩおよびＡｓｃＩで切断
し、最後の断片をＰａｃＩおよびＡｓｃＩで切断し、全断片をｐＧＬＹ２１５内にクロー
ニングして、それぞれ、ＡＤＥ１マーカー付き組込みプラスミドｐＧＬＹ２２０〜ｐＧＬ
Ｙ２２５を得た（ｐＧＬＹ２２５のプラスミド地図に関しては図１Ｃを参照されたい）。
構成的タンパク質発現のためのプラスミドを作製するために、ｐＧＬＹ２２０およびｐＧ
ＬＹ２２５内のＡＯＸ１プロモーターを除去し、プライマーＧＡＰＤＨＰ−５（配列番号
４２）およびＧＡＰＤＨＰ−３（配列番号４３）を使用して増幅されたＧＡＰＤＨプロモ
ーターにより置換して、それぞれプラスミドｐＧＬＹ１０８２およびｐＧＬＹ１０８３を
得た（ｐＧＬＹ１０８３のプラスミド地図に関しては図１Ｄを参照されたい）。
対応する天然プロモーターに又は該天然プロモーターの種々のトランケート化体に機能
的に連結されたＡＤＥ２ ＯＲＦを含有するＡＤＥ２マーカーカセットを以下のとおりに
構築した。ＡＤＥ２マーカーカセットのためのｐＧＬＹ２１５と同等の無マーカー組込み
プラスミドを、前記と実質的に同じ方法で構築した。ｐＧＦＩ４と称されるこのプラスミ
ドとｐＧＬＹ２１５との主な相違は、それが、前記のとおりに増幅されたＧＡＰＤＨプロ
モーターを含有しており、関心のある遺伝子の付加のためのマルチクローニング部位が、
制限部位ＥｃｏＲＩ、ＲｓｒＩＩ、ＳｐｈＩ、ＳｔｕＩ、ＫｐｎＩ、ＦｓｅＩおよびＳｗ
ａＩを含有するよう、オリゴ ５オリゴＥＲＳＳＫＦＳ（配列番号４４）および３オリゴ
ＳＦＳＳＲＦ（配列番号４５）を使用して拡張されていたことであった。３’−オリゴと
してのＡＤＥ２３（配列番号４６）ならびに５’−オリゴとしてのオリゴＡＤＥ２５Ｎｏ
ｔＩ−１（配列番号４７）、ＡＤＥ２５ＮｏｔＩ−２（配列番号４８）、ＡＤＥ２５Ｎｏ
ｔＩ−３（配列番号４９）、ＡＤＥ２５ＮｏｔＩ−４（配列番号５０）およびＡＤＥ２５
’ＰａｃＩｎｅｗ（配列番号５１）を使用して、トランケート化ＡＤＥ２マーカーを増幅
して、それぞれ、プロモーター領域の１２６、８２、５１、１３および０ヌクレオチドを
有する断片を得た。最初の４つのＤＮＡ断片をＮｏｔＩおよびＡｓｃＩで切断し、最後の
ＤＮＡ断片をＰａｃＩおよびＡｓｃＩで切断し、全断片をｐＧＦＩ４内にクローニングし
て、それぞれ、ＡＤＥ２マーカー付き組込みプラスミドｐＧＬＹ２０７７〜ｐＧＬＹ２０
８１を得た。該マルチクローニング部位内のＥｃｏＲＩ部位に加えて、これらのプラスミ
ドはＡＤＥ２ ＯＲＦ内にＥｃｏＲＩ部位をも含有する。
的に連結されたＡＤＥ２ ＯＲＦを含有するＡＤＥ２マーカーカセットを以下のとおりに
構築した。ＡＤＥ２マーカーカセットのためのｐＧＬＹ２１５と同等の無マーカー組込み
プラスミドを、前記と実質的に同じ方法で構築した。ｐＧＦＩ４と称されるこのプラスミ
ドとｐＧＬＹ２１５との主な相違は、それが、前記のとおりに増幅されたＧＡＰＤＨプロ
モーターを含有しており、関心のある遺伝子の付加のためのマルチクローニング部位が、
制限部位ＥｃｏＲＩ、ＲｓｒＩＩ、ＳｐｈＩ、ＳｔｕＩ、ＫｐｎＩ、ＦｓｅＩおよびＳｗ
ａＩを含有するよう、オリゴ ５オリゴＥＲＳＳＫＦＳ（配列番号４４）および３オリゴ
ＳＦＳＳＲＦ（配列番号４５）を使用して拡張されていたことであった。３’−オリゴと
してのＡＤＥ２３（配列番号４６）ならびに５’−オリゴとしてのオリゴＡＤＥ２５Ｎｏ
ｔＩ−１（配列番号４７）、ＡＤＥ２５ＮｏｔＩ−２（配列番号４８）、ＡＤＥ２５Ｎｏ
ｔＩ−３（配列番号４９）、ＡＤＥ２５ＮｏｔＩ−４（配列番号５０）およびＡＤＥ２５
’ＰａｃＩｎｅｗ（配列番号５１）を使用して、トランケート化ＡＤＥ２マーカーを増幅
して、それぞれ、プロモーター領域の１２６、８２、５１、１３および０ヌクレオチドを
有する断片を得た。最初の４つのＤＮＡ断片をＮｏｔＩおよびＡｓｃＩで切断し、最後の
ＤＮＡ断片をＰａｃＩおよびＡｓｃＩで切断し、全断片をｐＧＦＩ４内にクローニングし
て、それぞれ、ＡＤＥ２マーカー付き組込みプラスミドｐＧＬＹ２０７７〜ｐＧＬＹ２０
８１を得た。該マルチクローニング部位内のＥｃｏＲＩ部位に加えて、これらのプラスミ
ドはＡＤＥ２ ＯＲＦ内にＥｃｏＲＩ部位をも含有する。
したがって、ｐＧＬＹ２０７７およびｐＧＬＹ２０８１においては、該ＯＲＦ内のＥｃ
ｏＲＩ部位を部位特異的突然変異誘発により除去して、それぞれ、ｐＧＬＹ２０９１およ
びｐＧＬＹ２０９２を得た（ｐＧＬＹ２０９２のプラスミド地図に関しては図１Ｅを参照
されたい）。誘導性タンパク質発現のためのプラスミドを作製するために、これらの２つ
の最後の構築物におけるＧＡＰＤＨプロモーターを除去し、前記のとおりにプライマーＡ
ＯＸ１Ｐ−５（配列番号５２）およびＡＯＸ１Ｐ−３（配列番号５３）を使用して増幅さ
れたＡＯＸ１プロモーターにより置換して、それぞれ、プラスミドｐＧＬＹ２０９３およ
びｐＧＬＹ２０９４を得た（ｐＧＬＹ２０９４のプラスミド地図に関しては図１Ｆを参照
されたい）。
ｏＲＩ部位を部位特異的突然変異誘発により除去して、それぞれ、ｐＧＬＹ２０９１およ
びｐＧＬＹ２０９２を得た（ｐＧＬＹ２０９２のプラスミド地図に関しては図１Ｅを参照
されたい）。誘導性タンパク質発現のためのプラスミドを作製するために、これらの２つ
の最後の構築物におけるＧＡＰＤＨプロモーターを除去し、前記のとおりにプライマーＡ
ＯＸ１Ｐ−５（配列番号５２）およびＡＯＸ１Ｐ−３（配列番号５３）を使用して増幅さ
れたＡＯＸ１プロモーターにより置換して、それぞれ、プラスミドｐＧＬＹ２０９３およ
びｐＧＬＹ２０９４を得た（ｐＧＬＹ２０９４のプラスミド地図に関しては図１Ｆを参照
されたい）。
タンパク質発現に対する該トランケート化マーカーの効果を試験するために、関心のあ
る種々のタンパク質を発現する幾つかのベクターを構築した。
る種々のタンパク質を発現する幾つかのベクターを構築した。
ヒトグルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）をヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）シグナル配列
に融合し、ｐＧＬＹ１０８２およびｐＧＬＹ１０８３のＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩ部位内にク
ローニングして、それぞれ、ＧＡＰＤＨ駆動ＡＤＥ１マーク付き組込みベクターｐＧＬＹ
１０８４およびｐＧＬＹ１０８５を得た。一本鎖形態の抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体Ｈ
ｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（米国特許出願第２００６０２５２０９６号）をサッカロ
ミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルファ接合因子プレ配列に融合させ
、ｐＧＬＹ１０８２およびｐＧＬＹ１０８３のＥｃｏＲＩ／ＳｗａＩ部位内にクローニン
グして、それぞれ、ＧＡＰＤＨ駆動ＡＤＥ１マーカー付き組込みベクターｐＪＮ９０４お
よびｐＪＮ９０５を得た。ヒトＣＤ４０エクトドメイン（アミノ酸２０−１９２，Ｒ．Ｊ
．Ｎｏｅｌｌｅの贈呈品；Ｌｕ，Ｌ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：４５４１４
−４５４１８（２００３））をサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
）アルファ接合因子プレプロ配列に融合させ、ｐＧＬＹ２２０およびｐＧＬＹ２２５のＥ
ｃｏＲＩ／ＫｐｎＩ部位内にクローニングして、それぞれ、ＡＯＸ１駆動ＡＤＥ１マーカ
ー付き組込みベクターｐＧＬＹ１０７３およびｐＧＬＹ１０７４を得た。ヒトＥＰＯをサ
ッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルファ接合因子プレ配列に融
合させ、ｐＧＬＹ２０９３およびｐＧＬＹ２０９４のＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩ部位内にクロ
ーニングして、それぞれ、ＡＯＸ１駆動ＡＤＥ２マーカー付き組込みベクターｐＧＬＹ２
６６３およびｐＧＬＹ２６６４を得た。
に融合し、ｐＧＬＹ１０８２およびｐＧＬＹ１０８３のＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩ部位内にク
ローニングして、それぞれ、ＧＡＰＤＨ駆動ＡＤＥ１マーク付き組込みベクターｐＧＬＹ
１０８４およびｐＧＬＹ１０８５を得た。一本鎖形態の抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体Ｈ
ｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（米国特許出願第２００６０２５２０９６号）をサッカロ
ミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルファ接合因子プレ配列に融合させ
、ｐＧＬＹ１０８２およびｐＧＬＹ１０８３のＥｃｏＲＩ／ＳｗａＩ部位内にクローニン
グして、それぞれ、ＧＡＰＤＨ駆動ＡＤＥ１マーカー付き組込みベクターｐＪＮ９０４お
よびｐＪＮ９０５を得た。ヒトＣＤ４０エクトドメイン（アミノ酸２０−１９２，Ｒ．Ｊ
．Ｎｏｅｌｌｅの贈呈品；Ｌｕ，Ｌ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：４５４１４
−４５４１８（２００３））をサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
）アルファ接合因子プレプロ配列に融合させ、ｐＧＬＹ２２０およびｐＧＬＹ２２５のＥ
ｃｏＲＩ／ＫｐｎＩ部位内にクローニングして、それぞれ、ＡＯＸ１駆動ＡＤＥ１マーカ
ー付き組込みベクターｐＧＬＹ１０７３およびｐＧＬＹ１０７４を得た。ヒトＥＰＯをサ
ッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルファ接合因子プレ配列に融
合させ、ｐＧＬＹ２０９３およびｐＧＬＹ２０９４のＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩ部位内にクロ
ーニングして、それぞれ、ＡＯＸ１駆動ＡＤＥ２マーカー付き組込みベクターｐＧＬＹ２
６６３およびｐＧＬＹ２６６４を得た。
コピー数およびタンパク質発現に対するＡＤＥマーカープロモーター長の効果を判定し
た。
た。
コピー数およびタンパク質発現に対する種々のＡＤＥマーカープロモータートランケー
ト化の効果を試験するために、本発明者らは以下の仮定をたてた。１）全組込みプラスミ
ドは同一遺伝子座（ＴＲＰ２）内に組込まれるため、マーカープロモーター強度の減少が
プラスミド組込み体自体のコピー数の増加を招くとは予想されない。２）マーカープロモ
ーター強度が或る閾値未満に低下すると、該プラスミドの単コピーのみが組込まれている
クローンは、ａｄｅマイナス表現型の遅成長表現型により、該プラスミドの複数コピーが
組込まれているクローンより遅く成長すると予想される。これは低コピークローンにおけ
る桃色の外観をも伴うはずである。３）したがって、マーカープロモーター強度の漸次低
下は、速く成長する白色クローンの数の減少、そして相対的に、遅く成長する桃色クロー
ンの数の増加を招くはずである。４）異種タンパク質の発現が形質転換体の成長に及ぼし
うる何らかの影響を排除するために、まず、空発現プラスミドを試験すべきである。
ト化の効果を試験するために、本発明者らは以下の仮定をたてた。１）全組込みプラスミ
ドは同一遺伝子座（ＴＲＰ２）内に組込まれるため、マーカープロモーター強度の減少が
プラスミド組込み体自体のコピー数の増加を招くとは予想されない。２）マーカープロモ
ーター強度が或る閾値未満に低下すると、該プラスミドの単コピーのみが組込まれている
クローンは、ａｄｅマイナス表現型の遅成長表現型により、該プラスミドの複数コピーが
組込まれているクローンより遅く成長すると予想される。これは低コピークローンにおけ
る桃色の外観をも伴うはずである。３）したがって、マーカープロモーター強度の漸次低
下は、速く成長する白色クローンの数の減少、そして相対的に、遅く成長する桃色クロー
ンの数の増加を招くはずである。４）異種タンパク質の発現が形質転換体の成長に及ぼし
うる何らかの影響を排除するために、まず、空発現プラスミドを試験すべきである。
したがって、栄養要求性ａｄｅ１株ＹＧＬＹ５６３およびＹＧＬＹ５６４を、ＢｓｐＥ
Ｉを使用してＴＲＰ２組込み領域において線状化された等量（０．２μｇ）の組込みプラ
スミドｐＧＬＹ２２０〜ｐＧＬＹ２２５で形質転換し、最少培地プレート上に塗抹した。
２３℃で５日間のインキュベーションの後、該形質転換プレートをコロニー数に関して評
価した。驚くべきことに、組込みプラスミドｐＧＬＹ２２０〜ｐＧＬＹ２２４は全て、ほ
ぼ同数のコロニーを与えた。しかし、ｐＧＬＹ２２５で形質転換された酵母株は共に、バ
ックグラウンドにおけるかろうじて視認可能な桃色形質転換体を伴う、１０％未満の数の
白色形質転換体を示した（表１を参照されたい）。該プロモータートランケート化を伴う
プラスミドは、該プロモーターの長さが減少するにつれて、より少数のコロニーを与え、
該ＯＲＦのみを含有する最も短いものはコロニーを全く与えないだろうと予想されていた
。しかし、結果は、ＣＹＣ１ターミネーター領域および該マーカーの前のマルチクローニ
ンング部位が潜在性プロモーター活性を含有し、これがバックグラウンドレベルの転写を
可能にして、場合によってはａｄｅ１栄養要求性表現型を相補するのに十分なレベルのＡ
ＤＥ１遺伝子産物を与えることを示唆している。
Ｉを使用してＴＲＰ２組込み領域において線状化された等量（０．２μｇ）の組込みプラ
スミドｐＧＬＹ２２０〜ｐＧＬＹ２２５で形質転換し、最少培地プレート上に塗抹した。
２３℃で５日間のインキュベーションの後、該形質転換プレートをコロニー数に関して評
価した。驚くべきことに、組込みプラスミドｐＧＬＹ２２０〜ｐＧＬＹ２２４は全て、ほ
ぼ同数のコロニーを与えた。しかし、ｐＧＬＹ２２５で形質転換された酵母株は共に、バ
ックグラウンドにおけるかろうじて視認可能な桃色形質転換体を伴う、１０％未満の数の
白色形質転換体を示した（表１を参照されたい）。該プロモータートランケート化を伴う
プラスミドは、該プロモーターの長さが減少するにつれて、より少数のコロニーを与え、
該ＯＲＦのみを含有する最も短いものはコロニーを全く与えないだろうと予想されていた
。しかし、結果は、ＣＹＣ１ターミネーター領域および該マーカーの前のマルチクローニ
ンング部位が潜在性プロモーター活性を含有し、これがバックグラウンドレベルの転写を
可能にして、場合によってはａｄｅ１栄養要求性表現型を相補するのに十分なレベルのＡ
ＤＥ１遺伝子産物を与えることを示唆している。
ａｄｅ２栄養要求性株ＹＧＬＹ１２１５およびＹＧＬＹ１２１６を組換えプラスミドｐ
ＧＬＹ２０７７〜ｐＧＬＹ２０８１で形質転換した場合、ある程度類似した状況が得られ
た。しかし、トランケート化ＡＤＥ２マーカーの場合には、より短いプロモーターに伴う
コロニー数の漸次減少が観察された。ＡＤＥ１の場合と同様に、天然プロモーター配列を
全く伴わずにＡＤＥ２ ＯＲＦのみを含有するベクターは、該完全プロモーター配列を伴
う構築物の場合の１０％未満の数の白色形質転換体を与えた（表１を参照されたい）。
ＧＬＹ２０７７〜ｐＧＬＹ２０８１で形質転換した場合、ある程度類似した状況が得られ
た。しかし、トランケート化ＡＤＥ２マーカーの場合には、より短いプロモーターに伴う
コロニー数の漸次減少が観察された。ＡＤＥ１の場合と同様に、天然プロモーター配列を
全く伴わずにＡＤＥ２ ＯＲＦのみを含有するベクターは、該完全プロモーター配列を伴
う構築物の場合の１０％未満の数の白色形質転換体を与えた（表１を参照されたい）。
この予想される多コピー組込みがタンパク質発現レベルにどのように影響を及ぼすのか
を試験するために、ＧＢＡ、一本鎖抗ＨＥＲ２抗体、ヒトＣＤ４０エクトドメインまたは
ヒトＥＰＯを発現するプラスミドをａｄｅ１またはａｄｅ２栄養要求性酵母株内に形質転
換した（表２を参照されたい）。形質転換体を９６ウェル深底プレート内で成長させ、適
当な炭素源を使用して発現を誘導し、ウエスタンブロットまたはクーマシーゲルによりタ
ンパク質レベルを評価した（図３および４を参照されたい）。無プロモーターＡＤＥ２
ＯＲＦをマーカーとして使用するほとんどの形質転換体の場合には、予想どおり、非常に
少数の白色形質転換体（５〜２０個）が観察された。しかし、それらのクローンの発現レ
ベルは一般に、完全ＡＤＥ２遺伝子をマーカーとして使用する形質転換から得られたクロ
ーン（これらは通常、数百個の形質転換体を与えた）より有意に高かった（図３および４
を参照されたい）。特に顕著なのは、図３Ｄにおいて星印の付いたレーンに示されている
クローンから産生されたタンパク質の量である。
を試験するために、ＧＢＡ、一本鎖抗ＨＥＲ２抗体、ヒトＣＤ４０エクトドメインまたは
ヒトＥＰＯを発現するプラスミドをａｄｅ１またはａｄｅ２栄養要求性酵母株内に形質転
換した（表２を参照されたい）。形質転換体を９６ウェル深底プレート内で成長させ、適
当な炭素源を使用して発現を誘導し、ウエスタンブロットまたはクーマシーゲルによりタ
ンパク質レベルを評価した（図３および４を参照されたい）。無プロモーターＡＤＥ２
ＯＲＦをマーカーとして使用するほとんどの形質転換体の場合には、予想どおり、非常に
少数の白色形質転換体（５〜２０個）が観察された。しかし、それらのクローンの発現レ
ベルは一般に、完全ＡＤＥ２遺伝子をマーカーとして使用する形質転換から得られたクロ
ーン（これらは通常、数百個の形質転換体を与えた）より有意に高かった（図３および４
を参照されたい）。特に顕著なのは、図３Ｄにおいて星印の付いたレーンに示されている
クローンから産生されたタンパク質の量である。
材料および方法
組換えＤＮＡの実施には大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株ＤＨ５αを使
用した。酵母株の構築には野生型ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＮＲＲ
Ｌ−Ｙ １１４３０を使用した（ＡＴＣＣ＃７６２７３）。ＥＸＴＡＱ（ＴａＫａＲａ）
、Ｔａｑ Ｐｏｌｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）またはＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ（登録商標）（Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して、供給業者の推奨に従い、ＰＣＲ
反応を行った。制限および修飾酵素はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖ
ｅｒｌｙ，ＭＡ）から入手した。酵母株は、ＹＰＤ（１％ 酵母エキス、２％ ペプトン
、２％ デキストロースおよび１．５％ 寒天）または合成規定培地（１．４％ 酵母窒
素塩基、２％ デキストロース、４×１０−５％ ビオチンおよび１．５％ 寒天）（適
宜補足されたもの）において成長させた。酵母の形質転換は、記載されているとおりに（
Ｎｅｔｔら，２００５）、エレクトロポレーションにより行った。４〜２０％ プレキャ
ストＴＲＩＳ−ＳＤＳゲルおよびＭｉｎｉ ＰＲＯＴＥＡＮ ３セル（Ｂｉｏｒａｄ）を
製造業者の説明に従い使用して、クーマシーゲルおよびウエスタンブロットを行った。検
出のための一次抗体は以下のものであった：ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）＃３１４１３（Ｐ
ｉｅｒｃｅ）（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ用、１：１００００希釈）、抗ヒトＥＰＯ ＃ｓｃ７
９５６（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（１：５００希釈）、抗
ＧＢＡウサギポリクローナル（特製）（Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓ，Ｉｎｃ．）（１：５００希釈）。
組換えＤＮＡの実施には大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株ＤＨ５αを使
用した。酵母株の構築には野生型ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＮＲＲ
Ｌ−Ｙ １１４３０を使用した（ＡＴＣＣ＃７６２７３）。ＥＸＴＡＱ（ＴａＫａＲａ）
、Ｔａｑ Ｐｏｌｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）またはＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ（登録商標）（Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して、供給業者の推奨に従い、ＰＣＲ
反応を行った。制限および修飾酵素はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖ
ｅｒｌｙ，ＭＡ）から入手した。酵母株は、ＹＰＤ（１％ 酵母エキス、２％ ペプトン
、２％ デキストロースおよび１．５％ 寒天）または合成規定培地（１．４％ 酵母窒
素塩基、２％ デキストロース、４×１０−５％ ビオチンおよび１．５％ 寒天）（適
宜補足されたもの）において成長させた。酵母の形質転換は、記載されているとおりに（
Ｎｅｔｔら，２００５）、エレクトロポレーションにより行った。４〜２０％ プレキャ
ストＴＲＩＳ−ＳＤＳゲルおよびＭｉｎｉ ＰＲＯＴＥＡＮ ３セル（Ｂｉｏｒａｄ）を
製造業者の説明に従い使用して、クーマシーゲルおよびウエスタンブロットを行った。検
出のための一次抗体は以下のものであった：ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）＃３１４１３（Ｐ
ｉｅｒｃｅ）（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ用、１：１００００希釈）、抗ヒトＥＰＯ ＃ｓｃ７
９５６（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（１：５００希釈）、抗
ＧＢＡウサギポリクローナル（特製）（Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓ，Ｉｎｃ．）（１：５００希釈）。
本発明は、例示されている実施形態に関して本明細書に記載されているが、本発明はそ
れに限定されないと理解されるべきである。通常の技量を有し本明細書中の教示を利用で
きる当業者は、その範囲内の追加的な修飾および実施形態を認識するであろう。したがっ
て、本発明は、本明細書に添付されている特許請求の範囲によってのみ限定される。
れに限定されないと理解されるべきである。通常の技量を有し本明細書中の教示を利用で
きる当業者は、その範囲内の追加的な修飾および実施形態を認識するであろう。したがっ
て、本発明は、本明細書に添付されている特許請求の範囲によってのみ限定される。
Claims (33)
- （ａ）栄養要求性選択マーカータンパク質をコードする内因性遺伝子が宿主細胞のゲノ
ムから除去された該宿主細胞と、
（ｂ）組込みベクター［該組込みベクターは、
（１）弱いプロモーター、減衰化内因性もしくは異種プロモーター、潜在性プロモ
ーター、トランケート化内因性もしくは異種プロモーターに機能的に連結された又はプロ
モーターを伴わない、該栄養要求性選択マーカータンパク質をコードする内因性遺伝子の
機能に相補的な機能をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する核酸
、
（２）関心のあるペプチド、タンパク質および／または機能性核酸をコードする核
酸を含む１以上の発現カセットの挿入のための挿入部位を有する核酸、ならびに
（３）相同組換えによる該宿主細胞のゲノムの特定の位置への該組込みベクターの
挿入を導く標的化核酸を含む］とを含む発現系。 - 該栄養要求性選択マーカータンパク質が、ＡＤＥ、ＵＲＡおよびＬＹＳよりなる群から
選ばれる遺伝子によりコードされている、請求項２記載の発現系。 - 該栄養要求性選択マーカータンパク質がＡＤＥ１遺伝子によりコードされている、請求
項２記載の発現系。 - 該栄養要求性選択マーカータンパク質がＡＤＥ２遺伝子によりコードされている、請求
項２記載の発現系。 - 該組込みベクターが、前記の１以上の異種ペプチドまたはタンパク質をコードする１以
上の発現カセットの挿入のための複数の挿入部位を含む、請求項２記載の発現系。 - 該組込みベクターが２以上の発現カセットを含む、請求項２記載の発現系。
- 該組込みベクターが、それらの発現カセット間に相同ＤＮＡ配列をほとんど又は全く含
まない、請求項６記載の発現系。 - 該組込みベクターが、モノクローナル抗体の軽鎖をコードする第１発現カセットと、モ
ノクローナル抗体の重鎖をコードする第２発現カセットとを含む、請求項６記載の発現系
。 - 該宿主細胞が下等真核生物である、請求項２記載の発現系。
- 該宿主細胞が、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・フ
ィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐ
ｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラメ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌ
ａｍａｅ）、ピチア・メンブラネファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａ
ｃｉｅｎｓ）、ピチア・ミヌタ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ）［オガタエア・ミヌタ（
Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ）、ピチア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄｎｅｒ
ｉ）］、ピチア・オプンチエ（Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・テルモトレ
ランス（Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉ
ｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルクウム（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃ
ｕｕｍ）、ピチア・ピエペリ（Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スティプティ
ス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａ
ｎｏｌｉｃａ）、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、サッカロミセス・セレビシエ（
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス属種（Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏ
ｌｙｍｏｒｐｈａ）、クライベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、
クライベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ
・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニデュランス
（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒ
ｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒ
ｙｚａｅ）、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、クリ
ソスポリウム・ルクノウェンセ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ
）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓ
ａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅ
ｎｅｎａｔｕｍ）、フィスコミトレラ・パテンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａ
ｔｅｎｓ）およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）よ
りなる群から選ばれる種のものである、請求項９記載の発現系。 - 該宿主細胞がピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）である、請求項
２記載の発現系。 - ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞が、混合型または複合型
Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生しうるよう修飾されている、請求項１１記載の
発現系。 - 関心のある組換えペプチド、タンパク質および／または核酸を宿主細胞において発現さ
せるための方法であって、
（ａ）栄養要求性選択マーカータンパク質をコードする内因性遺伝子が宿主細胞のゲノ
ムから除去されている該宿主細胞を準備し、
（ａ）組込みベクター［該組込みベクターは、
（１）弱いプロモーター、減衰化内因性もしくは異種プロモーター、潜在性プロモ
ーター、トランケート化内因性もしくは異種プロモーターに機能的に連結された又はプロ
モーターを伴わない、該栄養要求性選択マーカータンパク質をコードする内因性遺伝子の
機能に相補的な機能をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む核酸、
（２）関心のあるペプチド、タンパク質および／または機能性核酸をコードする核
酸を含む１以上の発現カセットを有する核酸、ならびに
（３）相同組換えによる該宿主細胞のゲノムの特定の位置への該組込みベクターの
挿入を導く標的化核酸を含む］で該宿主細胞を形質転換することを含んでなり、
ここで、該形質転換宿主細胞が、関心のある組換えペプチド、タンパク質および／また
は核酸を産生する、方法。 - 該栄養要求性選択マーカーが、ＡＤＥ、ＵＲＡおよびＬＹＳよりなる群から選ばれる遺
伝子によりコードされている、請求項１４記載の方法。 - 該栄養要求性選択マーカータンパク質がＡＤＥ１遺伝子によりコードされている、請求
項１４記載の方法。 - 該栄養要求性選択マーカータンパク質がＡＤＥ２遺伝子によりコードされている、請求
項１４記載の方法。 - 該組換えベクターが、前記の１以上の異種ペプチドまたはタンパク質をコードする１以
上の発現カセットの挿入のための複数の挿入部位を含む、請求項１３記載の方法。 - 該組換えベクターが２以上の発現カセットを含む、請求項１３記載の方法。
- 該組換えベクターが、それらの発現カセット間に相同ＤＮＡ配列をほとんど又は全く含
まない、請求項１８記載の方法。 - 該組換えベクターが、モノクローナル抗体の軽鎖をコードする第１発現カセットと、モ
ノクローナル抗体の重鎖をコードする第２発現カセットとを含む、請求項１８記載の方法
。 - 該宿主細胞が下等真核生物である、請求項１３記載の方法。
- 該宿主細胞が、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・フ
ィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐ
ｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラメ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌ
ａｍａｅ）、ピチア・メンブラネファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａ
ｃｉｅｎｓ）、ピチア・ミヌタ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ）［オガタエア・ミヌタ（
Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ）、ピチア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄｎｅｒ
ｉ）］、ピチア・オプンチエ（Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・テルモトレ
ランス（Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉ
ｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルクウム（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃ
ｕｕｍ）、ピチア・ピエペリ（Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スティプティ
ス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａ
ｎｏｌｉｃａ）、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、サッカロミセス・セレビシエ（
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス属種（Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏ
ｌｙｍｏｒｐｈａ）、クライベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、
クライベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ
・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニデュランス
（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒ
ｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒ
ｙｚａｅ）、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、クリ
ソスポリウム・ルクノウェンセ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ
）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓ
ａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅ
ｎｅｎａｔｕｍ）、フィスコミトレラ・パテンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａ
ｔｅｎｓ）およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）よ
りなる群から選ばれる種のものである、請求項２１記載の方法。 - 該宿主細胞がピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）である、請求項
１３記載の方法。 - ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞が、混合型または複合型
Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生しうるよう修飾されている、請求項２３記載の
方法。 - ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）のＡＤＥ２遺伝子を含んでな
る単離された核酸。 - 該核酸が、Ａｄｅ２ｐタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む、
請求項２５記載の核酸。 - 該核酸が、配列番号６０に示すヌクレオチド１２７−ヌクレオチド１，８１５の核酸配
列に対して９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する、請求項２６記載の核酸。 - 請求項２７記載の核酸を含んでなるベクター。
- 内因性ＡＤＥ２遺伝子の欠失もしくは破壊、またはＡＤＥ２遺伝子もしくはＡｄｅ２ｐ
を非機能性にする任意の他の修飾を含んでなるピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａ
ｓｔｏｒｉｓ）細胞。 - ＡＤＥ２オープンリーディングフレームを含むベクターが、該内因性ＡＤＥ２遺伝子が
位置していた位置以外のピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ゲノム
内の位置に組込まれている、請求項２９記載のピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａ
ｓｔｏｒｉｓ）。 - 配列番号６１に示すアミノ酸配列に対して９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含ん
でなる単離されたポリペプチド。 - （ａ）Ａｄｅ２ｐをコードする内因性ＡＤＥ２遺伝子がピチア・パストリス（Ｐｉｃｈ
ｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞のゲノムから除去されている該ピチア・パストリス（
Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞と、
（ｂ）組込みベクター［該組込みベクターは、
（１）Ａｄｅ２ｐをコードする核酸、
（２）関心のある１以上の異種ペプチド、タンパク質および／または機能性核酸を
コードする核酸を含む１以上の発現カセットの挿入のための挿入部位を有する核酸、なら
びに
（３）相同組換えによる該宿主細胞のゲノムの特定の位置への該組込みベクターの
挿入を導く標的化核酸を含む］とを含む発現系。 - 関心のある異種ペプチド、タンパク質および／または核酸を発現する組換えピチア・パ
ストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞の製造方法であって、
（ａ）Ａｄｅ２ｐをコードする内因性ＡＤＥ２遺伝子が該宿主細胞のゲノムから除去さ
れている該宿主細胞を準備し、
（ａ）組込みベクター［該組込みベクターは、
（１）Ａｄｅ２ｐをコードする核酸、
（２）関心のある１以上の異種ペプチド、タンパク質および／または機能性核酸を
コードする核酸を含む１以上の発現カセットを有する核酸、ならびに
（３）相同組換えによる該宿主細胞のゲノムの特定の位置への該組込みベクターの
挿入を導く標的化核酸を含む］で該宿主細胞を形質転換することを含んでなり、
ここで、該形質転換宿主細胞が、関心のある組換えペプチド、タンパク質および／また
は核酸を産生する、製造方法。
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